KR20060030006A

KR20060030006A - 부갑상선 호르몬의 동족체

Info

Publication number: KR20060030006A
Application number: KR1020057003295A
Authority: KR
Inventors: 쩡 씬 뚱
Original assignee: 소시에떼 더 콘세이유 더 레세르세 에 다플리까띠옹 시엔띠피끄, 에스.아.에스.
Priority date: 1997-01-07
Filing date: 1997-12-08
Publication date: 2006-04-07
Anticipated expiration: 2017-12-08
Also published as: KR100497709B1; HUP9904596A1; SI0948541T1; EP1645566A2; DE69739912D1; CZ301497B6; SI1645566T1; CA2276614C; ATE321784T1; EP1645566B1; ES2258286T3; HK1026215A1; PT1645566E; NO993341D0; PL191898B1; ATE471342T1; NZ336610A; EP0948541A2; AR011517A1; DK0948541T3

Abstract

부갑상선 호르몬(PTH) 또는 부갑상선 호르몬-관련 단백질(PTHrP)의 절편의 펩타이드 변형체, 아미노산 잔기 중 하나 이상이 Acc로 치환되었다.

부갑상선 호르몬,아미노산,펩타이드

Description

부갑상선 호르몬의 동족체{ANALOGS OF PARATHYROID HORMONE}

본 출원은 1997년 1월 7일에 출원된 미국 특허 출원 제 08/779,768 호의 대응 특허 출원이다.

부갑상선 호르몬("PTH")은 부갑상선 내분비선에 의해 생산되는 폴리펩타이드이다. 상기 호르몬의 성숙한 순환 형태는 84개의 아미노 산 잔기로 구성되어 있다. PTH의 생물학적 활동은 PTH의 N-말단기(예를 들어, 아미노산 잔기 1 내지 34)의 펩타이드 절편에 의해 재생산될 수 있다. 부갑상선 호르몬-관련 단백질("PTHrP")은 PTH에 대한 N-말단기 호몰로지(homology)를 갖는 139 내지 173개의 아미노산을 갖는 단백질이다. PTHrP는 일반적인 PTH/PTHrP 수용체에 대한 결합을 포함하는 PTH에 많은 생물학적 영향을 끼친다. Tregear 등, Endocrinol., 93:1349 (1983). 많은 다른 근원, 예를 들어, 인간, 소, 쥐, 닭, 으로부터 유래된 PTH 펩타이드는 특정화되어 왔다. Nissenson 등, Receptor, 3:193 (1993).

PTH는 골(骨)의 양(mass) 및 질(quality)을 모두 향상시키는 것으로 나타났다. Dempster 등, Endocrine Rev., 14:690 (1993); 및 Riggs, Amer. J. Med., 91 (Suppl. 5B): 37S (1991). 간헐적으로 투여된 PTH의 동화적인 효과는 골다공증에 걸린 남자 및 여자로서 동시에 골흡수 억제(antiresorptive) 치료를 받고 있는 사람들과 받지 않는 사람들에게서 모두 나타났다. Slovik 등., J. Bone Miner. Res., 1:377(1986); Reeve 등, Br. Med. J., 301:314(1990); 및 Hesch, R-D 등, Calcif. Tissue Int'l 44:176(1989)

발명의 요약

일 실시예에 있어서, 본 발명은 하기 식 1의 펩타이드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 특징으로 한다.

[식 1]

상기 식 1에서,

A₁은 Ser, Ala 또는 Dap;

A₃는 Ser, Thr 또는 Aib;

A₅는 Leu, Nle, Ile, Cha, β-Nal, Trp, Pal, Acc, Phe 또는 p-X-Phe(여기에 서, X는 OH, 할로겐 또는 CH₃);

A₇은 Leu, Nle, Ile, Cha, β-Nal, Trp, Pal, Acc, Phe 또는 p-X-Phe(여기에서, X는 OH, 할로겐 또는 CH₃);

A₈은 Met, Nva, Leu, Val, Ile, Cha, Acc 또는 Nle;

A₁₁은 Leu, Nle, Ile, Cha, β-Nal, Trp, Pal, Acc, Phe 또는 p-X-Phe(여기에서, X는 OH, 할로겐 또는CH₃);

A₁₂는 Gly, Acc 또는 Aib;

A₁₅는 Leu, Nle, Ile, Cha, β-Nal, Trp, Pal, Acc, Phe 또는 p-X-Phe(여기에서, X는 OH, 할로겐 또는 CH₃);

A₁₆은 Ser, Asn, Ala 또는 Aib;

A₁₇은 Ser, Thr 또는 Aib;

A₁₈은 Met, Nva, Leu, Val, Ile, Nle, Acc, Cha 또는 Aib;

A₁₉는 Glu 또는 Aib;

A₂₁은 Val, Acc, Cha 또는 Met;

A₂₂는 Acc 또는 Glu;

A₂₃은 Trp, Acc 또는 Cha;

A₂₄는 Leu, Acc 또는 Cha;

A₂₇은 Lys, Aib, Leu, hArg, Gln, Acc 또는 Cha;

A₂₈은 Leu, Acc 또는 Cha;

A₂₉는 Glu, Acc 또는 Aib;

A30은 Asp 또는 Lys;

A₃₁은 Val, Leu, Nle, Acc, Cha 또는 결손됨;

A₃₂는 His 또는 결손됨;

A₃₃은 Asn 또는 결손됨;

A₃₄는 Phe, Tyr, Amp, Aib 또는 결손됨;

R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 H, C₁ _-12 알킬, C₂ _-12 알케닐, C₇ _-20 페닐알킬, C₁₁ _-20 나프틸알킬, C₁ _-12 하이드록시알킬, C₂ _-12 하이드록시알케닐, C₇ _-20 하이드록시페닐알킬 또는 C₁₁ _-20 하이드록시나프틸알킬; 또는 R₁ 및 R₂ 중 하나 및 하나만 COE₁(여기에서, E₁은 C₁ _-12 알킬, C₂ _-12 알케닐, C₇ _-20 페닐알킬, C₁₁ _-20 나프틸알킬, C₁ _-12 하이드록시알킬, C₂ _-12 하이드록시알케닐, C₇ _-20 하이드록시-페닐알킬 또는 C₁₁ _-20 하이드록시나프틸알킬); 및

R₃는 OH, NH₂, C₁ _-12 알콕시 또는 NH-Y-CH₂-Z(여기에서 Y는 C₁ _-12 하이드로카본 부분(moiety)이고 Z는 H, OH, CO₂H 또는 CONH₂)이며;

단, A₅, A₇, A₈, A₁₁, A₁₂, A₁₅, A₁₈, A₂₁, A₂₂, A₂₃, A₂₄, A₂₇, A₂₈, A₂₉ 또는 A₃₁중 적어도 하나는 Acc이다.

상기 식 1에 속하는 본 발명의 펩타이드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 예는 다음과 같다:

[Ahc⁷ ^{, 11}]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc⁷ ^{, 11}, Nle⁸ ^{, 18}, Tyr³⁴]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc¹¹]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc⁷ ^,11,15]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc⁷]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²³]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²⁴]hPTH(1-34)NH₂; [Nle⁸ ^{, 18}, Ahc²⁷]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²⁸]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc³¹]hPTH(1-34) NH₂; [Ahc²⁴ ^{, 28, 31}]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²⁴ ^, ^{28, 31}, Lys³⁰]hPTH(1-34) NH₂; [Ahc²⁸ ^{, 31}]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc¹⁵]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²⁴ ^{, 27}, Aib²⁹, Lys³⁰]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²⁴ ^{, 27}, Aib²⁹, Lys³⁰, Leu³¹]hPTH (1-34)NH₂; [Ahc⁵]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc¹²]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²⁷] hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²⁹]hPTH(1- 34)NH₂; [Ahc²⁴ ^{, 27}]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²⁴ ^{, 27}, Aib²⁹]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²⁴, Aib²⁹]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²⁷, Aib²⁹]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc¹⁸]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc⁸]hPTH (1-34)NH₂; [Ahc¹⁸ ^{, 27}, Aib²⁹]hPTH (1-34)NH₂; [Ahc¹⁸ ^{, 24, 27}, Aib²⁹] hPTH(1-34)NH₂; [Ach]²²hPTH(1-34)NH₂; 또는 [Ahc²², Aib²⁹]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²², Leu²⁷, Aib²⁹]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²⁴, Leu²⁷, Aib²⁹] hPTH(1-34)NH₂.

다른 실시예에 있어서, 본 발명은 하기 식 2의 펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 염을 특징으로 한다.

[식 2]

상기 식 2에서,

A₁은 Ala, Ser 또는 Dap;

A₃는 Ser 또는 Aib;

A₅는 His, Ile, Acc 또는 Cha;

A₇은 Leu, Cha, Nle, β-Nal, Trp, Pal, Acc, Phe 또는 p-X-Phe(여기에서, X는 OH, 할로겐 또는 CH₃);

A₈은 Leu, Met, Acc 또는 Cha;

A₁₀은 Asp 또는 Asn;

A₁₁은 Lys, Leu, Cha, Acc, Phe 또는 β-Nal;

A₁₂는 Gly, Acc 또는 Aib;

A₁₄는 Ser 또는 His;

A₁₅는 Ile, Acc 또는 Cha;

A₁₆은 Gln 또는 Aib;

A₁₇은 Asp 또는 Aib;

A₁₈은 Leu, Aib, Acc 또는 Cha;

A_l9는 Arg 또는 Aib;

A₂₂는 Phe, Glu, Aib, Acc 또는 Cha;

A₂₃은 Phe, Leu, Lys, Acc 또는 Cha;

A₂₄는 Leu, Lys, Acc 또는 Cha;

A₂₅는 His, Lys, Aib, Acc 또는 Glu;

A₂₆은 His, Aib, Acc 또는 Lys;

A₂₇은 Leu, Lys, Acc 또는 Cha;

A₂₈은 Ile, Leu, Lys, Acc 또는 Cha;

A₂₉는 Ala, Glu, Acc 또는 Aib;

A₃₀은 Glu, Leu, Nle, Cha, Aib, Acc 또는 Lys;

A₃₁은 Ile, Leu, Cha, Lys, Acc 또는 결손됨;

A₃₂는 His 또는 결손됨;

A₃₃은 Thr 또는 결손됨;

A₃₄는 Ala 또는 결손됨;

R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 H, C₁ _-12 알카닐, C₇ _-20 페닐알킬, C₁₁ _-20 나프틸알킬, C₁ _-12, 하이드옥시알킬, C₂ _-12 하이드록시알케닐, C₇ _-20 하이드록시페닐알킬 또는 C_l1-20 하이드록시나프틸알킬; 또는 R₁ 및 R₂중 하나 및 하나만 COE₁이고(여기에서 E₁은 C₁ _-12 알킬, C₂ _-12 알킬, C₂ _-12 알케닐, C₇ _-20 페닐알킬, C₁₁ _-20 나프틸알킬, C₁ _-12 하이드록시알킬, C₂ _-12 하이드록시알케닐, C₇ _-20 하이드록시페닐알킬 또는 C₁₁ _-20 하이드록시나프틸알킬); 및

R₃는 OH, NH₂, C₁ _-12 알콕시 또는 NH-Y-CH₂-Z(여기에서 Y는 C₁ _-12하이드로카본 부분(moiety)이고 Z는 H, OH, CO₂H 또는 CONH₂임)이며;

단, A₅, A₇, A₈, A₁₁, A₁₂, A₁₅, A₁₈, A₂₂, A₂₃, A₂₄, A₂₅, A₂₆, A₂₇, A₂₈, A₂₉, A₃₀, 또는 A₃₁ 중 적어도 하나는 Acc이다.

상기 식 2에 속하는 본 발명의 펩타이드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 예는 다음과 같다:

[Glu²² ^{, 25}, Leu²³ ^{, 28}, Lys²⁶ ^{, 30}, Aib²⁹, Ahc³¹]hPTHrP(1-34)NH²; [Glu²² ^{, 25}, Ahc²³, Lys^{26, 30}, Leu²⁸ ^{, 31}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 25}, Leu²³ ^{, 28, 31}, Lys²⁶ ^{, 30}, Ahc²⁷, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 25, 29}, Leu²³ ^{, 28, 31}, Lys²⁶, Ahc³⁰]hPTHrP(1-34)NH₂; [Cha²², Leu²³ ^{, 28, 31}, Glu²⁵, Lys²⁶ ^{, 30}, Ahc²⁷, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 25}, Leu²³ ^{, 28, 31}, Ahc²⁴, Lys²⁶ ^{, 30}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 29}, Leu²³ ^{, 28, 31}, Aib²⁵, Lys²⁶ ^{, 30}, Ahc²⁷]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²², Leu²³ ^{, 28, 31}, Aib²⁵ ^{, 29}, Lys²⁶ ^{, 30}, Ahc²⁷]hPTHrP(1-34)NH₂; [Ahc²², Leu²³ ^{, 28, 31}, Glu²⁵, Lys²⁶ ^{, 30}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 25}, Leu²³ ^{, 31}, Lys²⁶ ^{, 30}, Ahc²⁸, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Cha²², Ahc²³, Glu²⁵, Lys²⁶ ^{, 30}, Leu²⁸ ^{, 31}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Ahc²² ^{, 24, 27}, Leu²³ ^{, 28, 31}, Glu²⁵, Lys²⁶ ^{, 30}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Cha²², Leu²³ ^{, 28, 31}, Ahc²⁴ ^{, 27}, Glu²⁵, Lys²⁶ ^{, 30}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²², Leu²³ ^{, 28, 31}, Ahc²⁴ ^{, 27}, Lys²⁵ ^{, 26}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Ahc¹⁸ ^{, 24, 27}, Glu²², Cha²³, Lys²⁵ ^{, 26}, Leu²⁸, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²², Cha²³, Ahc²⁴, Lyc²⁵ ^{, 26}, Leu²⁸, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 25}, Leu²³ ^{, 28, 31}, Lys²⁶, Ahc²⁷, Aib²⁹, Nle³⁰]hPTHrP(1-34)NH₂; [Ser¹, Ile⁵, Cha⁷ ^{, 11}, Me^t8, Asn¹⁰, His¹⁴, Glu²² ^{, 25}, Leu²³ ^, ^{28, 31}, Lys²⁶ ^{, 30}, Ahc²⁷, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Ser¹, Ile⁵, Met⁸, Asn¹⁰, Leu¹¹ ^{, 23,} ^{28, 31}, His¹⁴, Cha¹⁵, Glu²² ^{, 25}, Lys²⁶ ^{, 30}, Ahc²⁷, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Cha²², Ahc²³, Glu²⁵, Lys²⁶ ^{, 30}, Leu²⁸ ^{, 31}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²², Ahc²³, Aib²⁵ ^{, 29}, Lys²⁶ ^, ³⁰, Leu²⁸ ^{, 31}]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 25}, Leu²³ ^{, 28, 31}, Lys²⁶ ^{, 30}, Ahc²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Cha²², Leu^{23, 28, 31}, Ahc²⁴, Glu²⁵, Lys²⁶ ^{, 30}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Cha²², Leu²³ ^{, 28, 31}, Ahc²⁴ ^{, 27}, Glu²⁵, Lys²⁶ ^{, 30}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 25}, Leu²³ ^{, 28, 31}, Ahc²⁴ ^{, 27}, Lys²⁶ ^{, 30}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Ahc²² ^{, 24, 27}, Leu²³ ^{, 28, 31}, Glu²⁵, Lys²⁶ ^, ³⁰, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Cha²², Leu²³ ^{, 28, 31}, Aib²⁵ ^{, 29}, Lys²⁶ ^{, 30}, Ahc²⁷]hPTHrP(1-34)NH₂; [Ahc²² ^{, 27}, Leu^{23, 28, 31}, Aib²⁵ ^{, 29}, Lys²⁶ ^, ³⁰]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²², Leu²³ ^{, 28, 31}, Ahc²⁴ ^{, 27}, Lys²⁵ ^{, 26, 30}, Aib²⁹]hPTHrP 1-34)NH₂; [Glu²², Leu²³ ^, ²⁸, Ahc²⁴ ^{, 27}, Lys²⁵ ^{, 26, 30}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²², Cha²³, Ahc²⁴ ^{, 27}, Lys²⁵ ^, ^{26, 30}, Leu²⁸, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 25}, Cha²³, Ahc²⁴ ^{, 27}, Lys²⁶ ^{, 30}, Leu²⁸ ^{, 31}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²², Cha²³, Ahc²⁴ ^{, 27}, Lys²⁵ ^{, 26, 30}, Leu²⁸ ^{, 31}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²², Leu²³ ^{, 28, 31}, Ahc²⁴ ^{, 27}, Lys²⁵ ^{, 26}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34) NH₂; [Glu²², Leu²³ ^{, 28}, Ahc²⁴ ^{, 27}, Lys²⁵ ^{, 26}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²², Cha²³, Ahc²⁴ ^{, 27}, Lys²⁵ ^{, 26}, Leu²⁸ ^{, 31}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34) NH₂; [Glu²², Cha²³, Ahc²⁴ ^{, 27}, Lys²⁵ ^{, 26}, Leu²⁸, Aib²⁹]hPTHrP 1-34) NH₂; [Glu²², Leu²³ ^{, 28}, Lys²⁵ ^{, 26}, Ahc²⁷, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²², Leu²³ ^{, 28, 31}, Lys^{25, 26}, Ahc²⁷, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²², Leu²³ ^{, 28, 31}, Lys²⁵ ^{, 26, 30}, Ahc²⁷, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²², Leu²³ ^{, 28}, Lys²⁵ ^{, 26, 30}, Ahc²⁷, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²², Cha²³, Ahc²⁴, Lys²⁵ ^{, 26}, Leu²⁸, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 25}, Leu²³ ^{, 28, 31}, Lys²⁶, Aib²⁹, Ahc³⁰]hPTHrP(1-34)NH₂; [Aib²² ^{, 29}, Leu²³ ^{, 28, 31}, Glu²⁵, Lys²⁶ ^{, 30}]hPTHrP(1-34)NH₂; [Cha²², Ahc²³, Glu²⁵ ^{, 29}, Lys²⁶ ^{, 30}, Leu²⁸ ^{, 31}]hPTHrP(1-34)NH₂; [Cha²², Leu²³ ^{, 28, 31}, Ahc²⁴, Glu²⁵ ^{, 29}, Lys²⁶ ^, ³⁰]hPTHrP(1-34)NH₂; [Cha²², Leu²³ ^{, 28, 31}, Glu^{25, 29}, Lys²⁶ ^{, 30}, Ahc²⁷]hPTHrP(1-34)NH₂; [Cha²², Leu²³ ^{, 31}, Glu²⁵ ^{, 29}, Lys²⁶ ^{, 30}, Ahc²⁸]hPTHrP(1-34)NH₂; [Cha²², Leu²³ ^{, 28, 31}, Glu²⁵ ^{, 29}, Lys²⁶, Ahc³⁰]hPTHrP(1-34)NH₂; [Cha²², Leu²³ ^{, 28}, Glu²⁵ ^{, 29}, Lys²⁶ ^{, 30}, Ahc³¹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 29}, Ahc²³, Aib²⁵, Lys^{26, 30}, Leu²⁸ ^, ³¹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Ahc²², Leu²³ ^{, 28, 31}, Aib²⁵, Lys²⁶ ^{, 30}, Glu²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 29}, Leu²³ ^{, 28,} ³¹, Ahc²⁴, Aib²⁵, Lys²⁶ ^{, 30}]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 29}, Leu²³ ^{, 31}, Aib²⁵, Lys²⁶ ^{, 30,}Ahc²⁸] hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 29}, Leu^{23, 28}, Aib²⁵, Lys²⁶ ^{, 30}, Ahc³¹] hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 29}, Leu²³ ^{, 28, 31}, Aib²⁵, Lys²⁶, Ahc³⁰] hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 25, 29}, Leu²³ ^{, 28, 31}, Lys²⁶, Ahc²⁷, Aib³⁰] hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 25, 29}, Leu²³ ^{, 28, 31}, Ahc²⁴, Lys²⁶, Aib³⁰] hPTHrP(1-34)NH₂; [Ahc²², Leu²³ ^{, 28, 31}, Glu²⁵ ^{, 29}, Lys²⁶, Aib³⁰] hPTHrP(1-34)NH₂; [Ahc²², Leu²³ ^{, 28}, Glu²⁵ ^{, 29}, Lys²⁶ ^{, 30,} ³¹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 25, 29}, Leu²³ ^{, 28}, Lys²⁶ ^{, 31}, Ahc³⁰]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 25, 29}, Leu²³ ^{, 28}, Lys²⁶ ^{, 30, 31}, Ahc²⁷]hPTHrP(1-34) NH₂; [Ahc²², Cha²³, Glu²⁵, Lys²⁶ ^{, 30}, Leu²⁸ ^{, 31}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Ahc²², Cha²³, Lys²⁵ ^{, 26, 30}, Leu²⁸ ^{, 31}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Ahc²², Cha²³, Lys²⁵ ^{, 26}, Leu²⁸ ^{, 31}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Ahc²², Leu²³ ^{, 28}, Lys²⁵ ^{, 26}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Ahc²², Leu²³ ^{, 28}, Arg²⁵, Lys²⁶, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Ahc²² ^{, 24}, Leu²³ ^{, 28, 31}, Glu²⁵, Lys²⁶ ^{, 30}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Ahc²² ^{, 24}, Leu²³ ^{, 28, 31}, Lys²⁵ ^{, 26, 30}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Ahc²² ^{, 24}, Leu²³ ^{, 28, 31}, Lys²⁵ ^{, 26}, Aib²⁹] hPTHrP(1-34)NH₂; [Ahc²² ^{, 24}, Leu²³ ^{, 28}, Lys²⁵ ^{, 26}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Ahc²² ^{, 24}, Leu²³ ^{, 28}, Arg²⁵, Lys²⁶, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂;

[Glu²², Leu²³ ^{, 28, 31}, Ahc²⁴, Lys²⁵ ^{, 26, 30}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²², Leu²³ ^,28, 31, Ahc²⁴, Lys²⁵ ^{, 26}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH²; [Glu²², Leu²³ ^{, 28}, Ahc²⁴, Lys²⁵ ^{, 26}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²², Leu²³ ^{, 28, 31}, Ahc²⁴, Arg²⁵, Lys²⁶ ^{, 30}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²², Leu²³ ^{, 28, 31}, Ahc²⁴, Arg²⁵, Lys²⁶, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²², Leu^{23, 28}, Ahc²⁴, Arg²⁵, Lys²⁶, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²², Ahc²³, Aib²⁵ ^{, 29}, Lys²⁶ ^{, 30}, Leu²⁸ ^, ³¹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²², Ahc²³, Aib²⁵ ^{, 29}, Lys²⁶, Leu²⁸]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²², Ahc²³ ^{, 31}, Aib²⁵ ^{, 29}, Lys²⁶, Leu²⁸]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²², Leu²³ ^{, 28}, Aib²⁵ ^{, 29}, Lys^{26, 30}, Ahc³¹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²², Leu²³ ^{, 28}, Aib²⁵ ^{, 29}, Lys²⁶, Ahc³1]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 25}, Leu²³ ^{, 28}, Ahc²⁴ ^{, 31}, Lys²⁶ ^{, 30}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; 또는 [Glu²², Leu^{23, 28}, Ahc²⁴ ^{, 31}, Lys²⁵ ^{, 26}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²², Leu²³ ^{, 28, 31}, Ahc²⁴, Aib²⁵ ^, ²⁹, Lys²⁶ ^{, 30}]hPTHrP(1-34)NH₂.

본 발명은 또한 하기 식의 펩타이드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염도 특징으로 한다.

[Cha²² ^{, 23}, Glu²⁵, Lys²⁶ ^{, 30}, Leu²⁸, Aib²⁹] hPTHrP(1-34)NH₂; [Cha²² ^{, 23}, Glu²⁵, Lys^{26, 30}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 25}, Leu²³ ^{, 28, 31}, Lys²⁶, Aib²⁹, Nle³⁰]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 25}, Leu²³ ^{, 28, 30, 31}, Lys²⁶, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu^{22, 25, 29}, Leu²³ ^{, 28, 30, 31}, Lys²⁶]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 25, 29}, Leu²³ ^{, 28, 31}, Lys²⁶, Nle³⁰]hPTHrP(1-34)NH₂; [Ser¹, Ile⁵, Met⁸, Asn¹⁰, Leu¹¹ ^{, 23, 28, 31}, His¹⁴, Cha¹⁵, Glu²² ^{, 25}, Lys²⁶ ^{, 30}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 25}, Cha²³, Lys²⁶, Leu²⁸ ^{, 31}, Aib²⁹, Nle³⁰]hPTHrP (1-34)NH₂; [Cha²² ^{, 23}, Glu²⁵, Lys²⁶ ^{, 30}, Leu²⁸ ^{, 31}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Cha²², Leu²³ ^{, 28, 31}, Glu²⁵ ^{, 29}, Lys²⁶, Nle³⁰]hPTHrP(1-34)NH₂; [Cha⁷ ^{, 11, 15}]hPTHrP(1-34) NH₂; [Cha⁷ ^{, 8, 15}]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²², Cha²³, Aib²⁵ ^{, 29}, Lys²⁶ ^{, 30}, Leu²⁸ ^{, 31}]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²², Cha²³, Aib²⁵ ^{, 29}, Lys²⁶, Leu²⁸]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²², Leu^{23, 28}, Aib²⁵ ^{, 29}, Lys²⁶]hPTHrP(1-34)NH₂; [Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 25}, Cha²³, Lys²⁶, Leu²⁸ ^{, 31}, Aib²⁹, Nle³⁰]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 25}, Cha²³, Lys²⁶ ^{, 30}, Aib²⁹, Leu³¹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 25}, Leu²³ ^{, 28, 31}, Lys²⁶, Aib²⁹ ^{, 30}]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu^{22, 25}, Leu²³ ^{, 28, 31}, Lys²⁶, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 25}, Leu²³ ^{, 28, 31}, Aib²⁶ ^{, 29}, Lys³⁰] hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 25}, Cha²³, Lys²⁶ ^{, 30}, Leu²⁸ ^{, 31}, Aib²⁹] hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu²² ^{, 25}, Cha²³, Lys²⁶ ^{, 30}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34) NH₂; [Glu²² ^{, 25}, Cha²³, Lys²⁶ ^{, 30}, Leu²⁸, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; 또는 [Leu²⁷, Aib²⁹]hPTH(1-34)NH₂.

N-말단 아미노산을 제외하고, 본 명세서에서 아미노산의 모든 약어(예를 들어, Ala 또는 A_l)는 -NH-CH(R)-CO-(여기에서, R은 아미노산의 곁사슬(예를 들어 Ala에 대하여는 CH₃)의 구조를 의미한다. N-말단 아미노산에 대해서는, 상기 약어가 =N-CH(R)-CO-(여기에서, R은 아미노산의 곁사슬)의 구조를 의미한다. β-Nal, Nle, Dap, Cha, Nva, Amp, Pal, Ahc 및 Aib는 각각 다음 아미노산의 약어이다: β-(2-나프틸)알라닌, 노르레우신(norleucine), α,β-디아미노프로피온산, 사이클로헥실알라닌, 노르발린, 4-아미노-페닐알라닌, β-(3-피리디닐)알라닌, 1-아미노-1-사이클로-헥산카르복실산 및 α-아미노이소부티르산. Acc는 1-아미노-1-사이클로프로판카르복실산; 1-아미노-1-사이클로부탄카르복실산; 1-아미노-1-사이클로펜탄카르복실산; 1-아미노-1-사이클로헥산카르복실산; 1-아미노-1-사이클로헵탄카르복실산; 1-아미노-1-사이클로옥탄카르복실산; 및 1-아미노-1-사이클로노난카르복실산으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산을 의미한다. 상기 식에서, 하이드록시알킬, 하이드록시페닐-알킬 및 하이드록시나프틸알킬은 1-4개의 하이드록시 치환체를 함유할 수 있다. 또한, COE₁는 -C=O E₁을 의미한다. -C=O E₁의 예에는 아세틸 및 페닐프로피오닐이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 본 발명의 펩타이드는 또한 두 번째 괄호에(second set of bracket) 위치한 천연 서열(sequence)로(예를 들어, hPTH에서 Leu⁷에 대하여는 Ahc⁷이고 Leu¹¹에 대하여는 Ahc¹¹이다)부터 얻어진 치환된 아미노산을 갖는 다른 형태, 예를 들어, [Ahc⁷ ^{, 11}]hPTH(1-34)NH₂로 표시된다. 약어 hPTH는 인간 PTH를 의미하고, hPTHrP는 인간 PTHrP, rPTH는 렛트 PTH 및 bPTH는 소 PTH를 의미한다. 괄호(parentheses) 사이의 번호는 펩타이드에 존재하는 아미노산의 수이다(예를 들어, hPTH(1-34)는 인간 PTH에 대한 펩타이드 서열의 1 내지 34개의 아미노산이다). hPTH(1-34), hPTHrP(1-34), bPTH(1-34) 및 rPTH(1-34)의 서열은 Nissenson 등, Receptor, 3:193 (1993)에 나열되어 있다. PTH(1-34)에서 명칭 "NH₂"는 펩타이드의 C-말단이 아미드화된 것을 나타내다. 그 반면에, PTH(1-34)는 자유 산 C-말단기를 갖는다.

본 발명의 펩타이드 각각은 대상물(예를 들어, 사람 환자 같은 포유류)에서 골의 성장을 촉진시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 단독으로 투여하거나 또는 동시에 골흡수 억제제(antiresorptive therapy)와 함께 투여하여 골다공증 및 뼈 골절을 치료하는데 유효하다.

본 발명의 펩타이드는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 제공될 수 있다. 이러한 염의 예로는 유기 산(예를 들어 아세트산, 락트산, 말레인산, 시트르산, 말린산, 아스코르빈산, 석신산, 벤조산, 메탄설폰산, 톨루엔설폰산 또는 파몬산(pamoic acid))을 사용하여 형성된 것, 무기산(예를 들어, 하이드로클로린산, 설폰산 또는 인산) 및 고분자 산(예를 들어, 탄닌산, 카르복시메틸 셀룰로즈, 폴리아틴산, 폴리글리콜린산 또는 폴리아틴-글리콜린산의 코폴리머)과 함께 형성된 염을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 펩타이드의 치료학적으로 유효한 양과 약물학적으로 허용가능한 담체 물질(예를 들어, 탄산 마그네슘, 락토오즈 또는 미셀을 형성할 수 있는 치료 화합물을 갖는 포스포리피드)은 함께 대상물에 투여(예를 들어, 경구(orally), 정맥(intravenously), 피부전달(transdermally,) 폐(pulmonarily), 질(vaginally), 피하(subcutaneously), 코(nasally), 이온삼투(iontophoretically) 또는 기관내(intratracheally)에 의해)를 위한 치료 조성물(예를 들어, 필, 정제, 캡슐 또는 지질)을 형성한다. 경구 투여되는 필, 정제 또는 캡슐은 소화되지 않고 소장으로 이동되기에 충분한 시간 동안 위에서 분비되는 위산 또는 장 효소(intestinal enzyme)로부터 활성 조성물을 보호하기 위한 물질로 코팅될 수 있다. 치료적인 조성물은 피하 또는 근육내 투여를 위한 생분해가능하거나 또는 생분해가능하지 않은 지속적인 방출 제형의 형태일 수 도 있다. 참조, 예를 들어, 미국 특허 제 3,773,919 호, 제 4,767,628 호 및 PCT 출원 번호 제 WO 94/15587 호. 연속적인 투여를 이식가능하거나 또는 외부 펌프(예를 들어 INFUSAIDTM 펌프)를 사용하여 실시할 수 도 있다. 투여는 간헐적으로 예를 들어, 하루에 한번 주사, 또는 낮은 용량, 예를 들어 지속적인 방출 제형으로 연속적으로 실시할 수 도 있다.

상술한 질병 또는 장해를 치료하기 위한 본 발명의 펩타이드의 용량은 투여 방법, 연령 및 대상물의 체중 및 치료될 대상물의 조건에 따라 달라지며, 최종적으로 담당하는 의사 또는 수의사에 의해 결정될 것이다.

또한, 본 발명의 범위 내로 의도된 것은 골 성장 등에 있어서 결함에 수반된 질병 또는 장애, 예를 들어 골다공증 또는 골절을 치료하는데 사용하기 위한 상기 식으로 표시되는 펩타이드도 본 발명의 범위 내에 포함된다.

본 발명의 다른 특징 및 장점은 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백하게 될 것이다.

실시예

본 발명의 상세한 설명

본 명세서의 설명에 기초하여, 본 발명은 가장 넓은 한도로 이용될 수 있다. 하기한 특정 실시예는 단지 예시로서 기술된 것이며, 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에 인용된 모든 문헌은 참조 문헌으로 도입된 것이다.

구조

PTH(1-34) 및 PTHrP(1-34)는 두 양염성 알파 나선형 도메인(amphophilic alpha helical domains)을 갖는 것으로 기록되어 있다. 참조, 예를 들어 Barden 등, Biochem., 32:7126 (1992). 첫 번째 α-나선은 아미노산 잔기 4부터 13 사이에 형성되는 반면에 두 번째 α-나선은 아미노산 잔기 21부터 29 사이에 형성된다. 본 발명의 일부 펩타이드는 PTH(1-34) 및 PTHrP(1-34)의 두 지역 내에 또는 근처에, 예를 들어 첫 번째 α-나선 내에 Ahc⁷ 및 Ahc¹¹ 또는 두 번째 α-나선 내에 Ahc²⁷ 및 Ahc²⁸, 하나 이상의 잔기가 Acc로 치환된 것을 함유한다.

합성

본 발명의 펩타이드는 전형적인 고상 합성법으로 제조될 수 있다. 참조, 예를 들어, Stewart, J.M 등, Solid Phase Synthesis (Pierce Chemical Co., 2d ed. 1984). 이하에, [Glu²² ^{, 25}, Leu²³ ^{, 28}, Lys²⁶ ^{, 30}, Aib²⁹, Ahc³¹]hPTH(1-34)NH₂가 어떻게 제조되는지를 설명한다. 본 발명의 다른 펩타이드는 이 기술 분야에 통상의 지식을 가진 사람에 의해 유사한 방법으로 제조될 수 있다.

1-[N-3급-부톡시카르보닐-아미노]-1-사이클로헥산-카르복실산(Boc-Ahc-OH)를 다음과 같이 합성하였다.

1-아미노-1-사이클로헥산카르복실산(Acros Organics, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) 19.1 g(0.133몰)을 200 ㎖의 디옥산 및 100 ㎖의 물에 용해하였다. 여기에 2 N NaOH 67 ㎎을 첨가하였다. 이 용액을 얼음-물 배쓰(bath)에서 냉각하였다. 디-3급-부틸-디카보네이트 32.0g(0.147몰)을 상기 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 하루밤동안 교반하였다. 이어서, 디옥산을 가압하에서 제거하였다. 에틸 아세테이트 200 ㎖를 잔존 수용액에 가하였다. 상기 혼합물을 얼음-물 배쓰에서 냉각하였다. 수용액 층의 pH를 4 N HCl을 가하여 약 3으로 조정하였다. 유기 층을 분리하였다. 수용액층을 에틸 아세테이트로 추출하였다(1 x 100 ㎖). 두 유기층을 합하고 물로 세척하고(2 x 150 ㎖), 무수 MgSO₄로 건조하고, 여과한 후, 가압하에서 건조하도록 농축하였다. 잔류물은 에틸 아세테이트/헥산으로 재결정화하였다. 순수한 생성물 9.2 g이 얻어졌다. 수율 29 %. 다른 보호된 Acc 아미노산은 이 기술 분야에 통상의 지식을 가진 사람에 의해 유사한 방법으로 제조될 수 있다.

펩타이드는 촉진된 Boc-화학 고상 펩타이드 합성법을 촉진하도록 변형된 Applied Biosystems (Foster City, CA) 모델 430A 펩타이드 합성기상에서 합성되었다. 참조 Schnoize 등, Int. J. Peptide Protein Res., 90:180 (1992). 0.93 mmol/g의 치환체를 갖는 4-메틸벤즈-하이드릴아민(MBHA) 수지(Peninsula, Belmont, CA)를 사용하였다. 다음 곁사슬 보호기를 갖는 Boc 아미노산(Bachem, CA, Torrance, CA; Nova Biochem., LaJolla, CA)을 사용하였다: Boc-Ala-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Glu(OcHex)-OH, Boc-His(DNP)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gly-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Lys(2ClZ)-OH, Boc-Ahc-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH; 및 Boc-Aib-OH. 합성은 0.14 mmol 양으로 실시하였다. 상기 Boc기를 100 % TFA로 2 x 1분 동안 처리하여 제거하였다. Boc 아미노산(2.5 mmol)을 4 ㎖의 DMF에 용해한 HBTU(2.0 mmol)과 DIEA(1.0 ㎖)으로 예비-처리하고, 펩타이드-수지 TFA 염의 초기 중화없이 커플링하였다. 커플링 시간은 Boc-Aib-OH와 그의 다음 잔기 Boc-Leu-OH, Boc-Ahc-OH와 그의 다음 잔기 Boc-Lys(2Clz)-OH를 제외하고는 5분이었고, 이때 상기 네가지 잔기에 대한 커플링 시간은 2시간이었다.

펩타이드 사슬의 어셈블리의 끝에서, 수지를 DMF에 용해된 20 % 머캅토에탄올/10 % DIEA의 용액으로 2 x 30분 동안 처리하여 상기 His 곁사슬 상의 DNP기를 제거하였다. 이어서, N-말단 Boc기를 100 % TFA로 2 x 2 분 동안 처리하여 제거하였다. 부분적으로 탈보호된 펩타이드-수지를 DMF 및 DCM으로 세척하고 감압하에서 건조하였다. 최종 절단은 아니솔 1 ㎖와 디티오트레이톨(dithiothreitol)(24 ㎎)을 함유하는 HF 10 ㎖중에 펩타이드-수지를 0 ℃에서 75분 동안 교반하여 실시하였다. HF를 질소 흐름으로 제거하였다. 잔류물을 에테르(6 x 10 mL)로 세척하고 4N HOAc (6 x 10 mL)로 추출하였다.

상기 수성 추출물중의 펩타이드 혼합물을 역상 VydacTM C18 칼럼(Nest Group, Southborough, MA)을 사용하여 역상 제조 고압 액체 크로마토그래피(reversed-phase preparative high pressure liquid chromatography (HPLC))상에서 정제하였다. 상기 칼럼을 10 mL/분(용액 A는 0.1% 수용액 TFA; 용액 B는 0.1 % TFA를 함유하는 아세토니트릴)의 유속에서 선형 구배(linear gradient, (10 % 내지 45 %의 용액 B로 130 분 이상)를 사용하여 용출하였다. 분획을 모으고, 분석 HPLC로 확인하였다. 순수한 생성물을 함유하는 것들을 합하고 건조하도록 동결건조하 였다. 흰색 고형물 85 ㎎을 얻었다. HPLC 분석에 기초하여 순도가 > 99 %이었다. 일렉트로-스프레이 매스 스펙트로미터기(electro-spray mass spectrometer)로 분석한 분자량은 3972.4(계산분자량 3972.7와 일치)이었다.

[Cha²², Leu²³ ^{, 28, 31}, Glu²⁵, Lys²⁶ ^{, 30}, Ahc²⁷, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂의 합성 및 정제는 [Glu²² ^{, 25}, Leu²³ ^{, 28}, Lys²⁶ ^{, 30}, Aib²⁹, Ahc³¹]hPTHrP(1-34)NH₂와 동일한 방법으로 실시하였다. 보호된 아미노산 Boc-Cha-OH는 Bachem, CA으로부터 구입하였다. 최종 생성물의 순도는 > 99 %였고, 일렉트론-스프레이 매스 스펙트로미터로 측정한 분자량은 3997.2(분자량 계산값은 3996.8)였다.

상기에서 사용된 약어에 대한 명칭은 다음과 같다:Boc는 t-부틸옥시카르보닐, HF는 하이드로젠 플루오라이드, Fm은 포르밀, Xan는 크산틸, Bzl은 벤질, Tos는 토실, DNP는 2,4-디니트로페닐, DMF는 디메틸포름아마이드, DCM은 디클로로메탄, HBTU는 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸 우라늄 헥사플루오로포스페이트, DIEA는 디이소프로필에틸아민, HOAc는 아세트산, TFA는 트리플루오로아세트산, 2ClZ는 2-클로로벤질옥시카르보닐이고 OcHex는 O-사이클로헥실이다.

상기 식에서, 치환기 R₁ 및 R₂는 당해 분야에 공지된 표준 방법에 의해 N-말단 아미노산의 유리 아민에 부착될 수 있다. 예를 들어, 알킬 그룹, 예를 들어 C₁ _-12 알킬은 환원 알킬화를 사용하여 부착될 수 있다. 하이드록시알킬 그룹, 예를 들 어 C¹ ^-12 하이드록시알킬도 환원 알킬화를 사용하여 부착될 수 있으며, 이때, 유리 하이드록시 그룹은 t-부틸 에스테르로 보호한다. 아실 그룹, 예를 들어, COE₁,은 완성된 수지를 메틸렌 클로라이드 중의 유리 산 및 디이소프로필카르보디이미드 모두 3 몰 당량과 1시간 동안 혼합하고 얻어진 수지를 상기 세척 과정에서 (a) 내지 (f) 단계를 통하여 순환시켜 유리 산, 예를 들어, E₁COOH를 커플링하여 N-말단 아미노산의 유리 아민에 부착할 수 있다. 만약 상기 유리 산이 유리 하이드록시기, 예를 들어, p- 하이드록시페닐프로피온산을 함유한다면, 상기 커플링은 HOBT 3 몰 당량을 추가적으로 사용하여 실시하여야 한다.

본 발명의 다른 펩타이드는 이 기술 분야에 통상의 지식을 가진 사람에 의해 유사한 방법으로 제조될 수 있다.

작용 어세이

A. PTH 수용체에 대한 결합

본 발명의 펩타이드의 SaOS-2(인간 골육종 세포) 상에 존재하는 상기 PTH 수용체에 대한 결합 능력을 테스트하였다. SaOS-2 세포(American Type Culture Collection, Rockville, MD; ATCC #HTB 85)를 공기에서 5 % CO₂의 습도 분위기하 37℃에서 10 % 페탈 보빈 세럼(FBS)와 2 mM 글루타민으로 보충된 RPMI 1640 배지(Sigma, St. Louis, MO)내에서 유지하였다. 상기 배지를 매번 3일 또는 4일마다 바꾸고, 상기 세포를 매주 트립신처리하여 하부배양하였다.

SaOS-2 세포를 컨플루언스(confluence)에 도달할때까지 4일 동안 유지하였 다. 상기 배지를 RPMI 1640 배지에서 5 % FBS로 바꾸고, 본 발명의 경쟁 펩타이드(competing peptide) 존재하에, 10^-11M 내지 10^-4 M 사이의 다양한 농도에서 10 x 10⁴ cpm 모노-¹²⁵I-[Nle⁸ ^,18, Tyr³⁴(3-125I)]bPTH(1-34)NH₂를 사용하여 상온에서 2시간 동안 배양하였다. 상기 세포를 얼음-냉각 PBS로 4번 세척하고 0.1 M NaOH를 사용하여 용해하고, 상기 세포에 관련된 방사능을 신틸레이션 카운터(scintillation counter)로 계산하였다. 모노-¹²⁵I-[Nle⁸ ^{, 18}, Tyr³⁴(3-125I)]bPTH(1-34)NH₂의 합성을 Goldman, M.E 등, Endocrinol., 123:1468 (1988)에 기술된 것과 같이 실시하였다.

결합 어세이를 본 발명의 다양한 펩타이드를 사용하여 실시하고, Kd 값(각 펩타이드에 대한 모노-¹²⁵I-[Nle⁸ ^{, 18}, Tyr³⁴(3-125I)]bPTH(1-34)NH₂의 결합의 반 최대 억제력(half maximal inhibition)을 계산하였다.

표 1에 나타낸 것과 같이, 테스트한 펩타이드 모두가 SaOS-2 세포 상에서 PTH 수용체에 대한 높은 결합 친화력을 갖았다.

B. 아데닐레이트 사이클라제 활성도 촉진(Stimulation of Adenylate Cyclase Activity)

SaOS-2 세포에 생물학적 반응성을 유도하기 위한 본 발명의 펩타이드 능을 측정하였다. 더욱 상세하게는, 아데닐레이트 사이클라제의 촉진을 상술한 Rodan 등, J. Clin. Invest. 72: 1511 (1983) 및 Goldman 등, Endocrinol., 123:1468 (1988). cAMP (아데노신 3',5'-모노포스페이트)에 기술된 것과 같이 합성의 정도를 측정하여 판단하였다. 24 웰 프레이트에서 컨플루언트(Confluent SAOS-2) 세포를 신선한 배지에서 0.5 μCi [³H]아데닌 (26.9 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA)을 사용하여 37℃에서 2시간 동안 배양하고, 행크 평형화된 염 용액(Hank' balanced salt solution)(Gibco, Gaithersburg, MD)을 사용하여 두 번 세척하였다. 상기 세포를 신선한 배지에서 1 mM IBMX [이소부틸메틸-크산틴, Sigma, St. Louis, MO]을 사용하여 15분 동안 처리하고, 본 발명의 펩타이드를 상기 배지에 첨가하여 5분 동안 배양하였다. 상기 반응을 1.2 M 트리클로로아세트산(TCA)(Sigma, St. Louis, MO)을 가하고, 4 N NaOH를 사용하여 시료를 중화하여 완결시켰다. cAMp를 두-컬럼 크로마토그래피 방법에 의해 분리하였다. 방사능을 신틸레이션 카운터에서 측정하였다(Liquid Scintillation Counter 2200CA, PACKARD, Downers Grove, IL).

상기 테스트한 펩타이드에 대한 각각의 EC₅₀ 값(아데닐레이트 사이클라제의 반 최대 촉진)을 계산하여 표 1에 나타내었다. 테스트된 펩타이드 모두가 조골 세포 증식(osteoblast proliferation, 예를 들어, 골 성장)에 대한 프록시멀 시그널(proximal signal)로서 생화학적 경로 표시인 아데닐레이트 사이클라제 활성 효능성 자극제인 것으로 판명되었다.

펩타이드	Kd(μM)	EC₅₀(mM)
[Glu²² ^{, 25}, Leu²³ ^{, 28}, Lys²⁶ ^{, 30}, Aib²⁹, Ahc³¹]hPTHrP(1-34)NH₂;	0.200	3.7
[Glu²² ^{, 25}, Ahc²³, Lys²⁶ ^{, 30}, Leu²⁸ ^{, 31}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂;	0.070	3.9
[Glu²² ^{, 25}, Leu²³ ^{, 28, 31}, Lys²⁶ ^{, 30}, Ahc²⁷, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂;	0.230	3.0
[Glu²² ^{, 25, 29}, Leu²³ ^{, 28, 31}, Lys²⁶, Ahc³⁰]hPTHrP(1-34)NH₂;	0.230	20
[Cha²², Leu²³ ^{, 28, 31}, Glu²⁵, Lys²⁶ ^{, 30}, Ahc²⁷, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂;	0.060	2.0
[Glu²² ^{, 25}, Leu²³ ^{, 28, 31}, Ahc²⁴, Lys²⁶ ^{, 30}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂;	0.006	0.5
[Glu²² ^{, 29}, Leu²³ ^{, 28, 3}1, Aib²⁵, Lys²⁶ ^{, 30}, Ahc²⁷]hPTHrP(1-34)NH₂;		5
[Glu²², Leu²³ ^{, 28, 31}, Aib²⁵ ^{, 29}, Lys²⁶ ^{, 30}, Ahc²⁷]hPTHrP(1-34)NH₂;		2
[Ahe²², Leu²³ ^{, 28, 31}, Glu²⁵, Lys²⁶ ^{, 30}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂		0.3
[Glu²² ^{, 25}, Leu²³ ^{, 31}, Lys²⁶ ^{, 30}, Ahe²⁸, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂		0.5
[Cha²², Ahe²³, Glu²⁵, Lys²⁶ ^{, 30}, Leu²⁸ ^{, 31}, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂		0.4

다른 실시예

본 발명을 이상 상세한 설명과 관련되어 설명하였지만, 상기한 설명은 예시적인 것으로 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니며, 첨부된 청구범위에 의해 규정되는 것으로 이해해야할 것이다. 다른 실시예, 장점 및 변형은 청구범위에 속한다.

Claims

하기 식 1의 펩타이드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염:

[식 1]

상기 식에서,

A₁은 Ser, Ala 또는 Dap;

A₃는 Ser, Thr 또는 Aib;

A₅는 Leu, Nle, Ile, Cha, β-Nal, Trp, Pal, Acc, Phe 또는 p-X-Phe(여기에서, X는 OH, 할로겐 또는 CH₃);

A₇은 Leu, Nle, Ile, Cha, β-Nal, Trp, Pal, Acc, Phe 또는 p-X-Phe(여기에서, X는 OH, 할로겐 또는 CH₃);

A₈은 Met, Nva, Leu, Val, Ile, Cha, Acc 또는 Nle;

A₁₁은 Leu, Nle, Ile, Cha, β-Nal, Trp, Pal, Acc, Phe 또는 p-X-Phe(여기 에서, X는 OH, 할로겐 또는 CH₃);

A₁₂는 Gly, Acc 또는 Aib;

A₁₅는 Leu, Nle, Ile, Cha, β-Nal, Trp, Pal, Acc, Phe 또는 p-X-Phe(여기에서, X는 OH, 할로겐 또는 CH₃);

A₁₆은 Ser, Asn, Ala 또는 Aib;

A₁₇은 Ser, Thr 또는 Aib;

A₁₈은 Met, Nva, Leu, Val, Ile, Nle, Acc, Cha 또는 Aib;

A₁₉는 Glu 또는 Aib;

A₂₁은 Val, Acc, Cha 또는 Met;

A₂₂는 Acc 또는 Glu;

A₂₃은 Trp, Acc 또는 Cha;

A₂₄는 Leu, Acc 또는 Cha;

A₂₇은 Lys, Aib, Leu, hArg, Gln, Acc 또는 Cha;

A₂₈은 Leu, Acc 또는 Cha;

A₂₉는 Glu, Acc 또는 Aib;

A₃₀은 Asp 또는 Lys;

A₃₁은 Val, Leu, Nle, Acc, Cha 또는 결손됨;

A₃₂는 His 또는 결손됨;

A₃₃은 Asn 또는 결손됨;

A₃₄는 Phe, Tyr, Amp, Aib 또는 결손됨;

R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 H, C₁ _-12 알킬, C₂ _-12 알케닐, C₇ _-20 페닐알킬, C₁₁ _-20 나프틸알킬, C₁ _-12 하이드록시알킬, C₂ _-12 하이드록시알케닐, C₇ _-20 하이드록시페닐알킬 또는 C₁₁ _-20 하이드록시나프틸알킬; 또는 R₁ 및 R₂중 하나 및 하나만 COE₁(여기에서, E₁은 C₁ _-12 알킬, C₂ _-12 알케닐, C₇ _-20 페닐알킬, C₁₁ _-20 나프틸알킬, C₁ _-12 하이드록시알킬, C₂ _-12 하이드록시알케닐, C₇ _-20 하이드록시-페닐알킬 또는 C₁₁ _-20 하이드록시나프틸알킬임); 및

R₃는 OH, NH₂, C₁ _-12 알콕시 또는 NH-Y-CH₂-Z(여기에서, Y는 C₁ _-12 하이드로카본 부분이고 Z는 H, OH, CO₂H 또는 CONH₂임)이며;

단, A₅, A₇, A₈, A₁₁, A₁₂, A₁₅, A₁₈, A₂₁, A₂₂, A₂₃, A₂₄, A₂₇, A₂₈, A₂₉ 및 A₃₁중 적어도 하나는 Acc임.
제 1 항에 있어서,

A₃는 Ser;

A₅는 Ile 또는 Acc;

A₇은 Leu, Acc 또는 Cha;

A₈은 Acc, Met, Nva, Leu, Val, Ile 또는 Nle;

A₁₁은 Leu, Acc 또는 Cha;

A₁₂는 Acc 또는 Gly;

A₁₅는 Leu, Acc 또는 Cha;

A₁₆은 Asn 또는 Aib;

A₁₇은 Ser;

A₁₈은 Acc, Met 또는 Nle;

A₂₁은 Val 또는 Acc;

A₂₇은 Lys, hArg, Acc 또는 Cha;

A₂₉는 Glu 또는 Aib;

A₃₁은 Val, Leu, Nle, Acc 또는 Cha;

A₃₂는 His;

A₃₃은 Asn;

A₃₄는 Phe, Tyr, Amp 또는 Aib인

펩타이드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염인 펩타이드.
제 2 항에 있어서,

A₅는 Ile 또는 Ahc;

A₇은 Leu, Ahc 또는 Cha;

A₈은 Ahc, Met 또는 Nle;

A₁₁은 Leu, Ahc 또는 Cha;

A₁₂는 Ahc 또는 Gly;

A₁₅는 Leu, Ahc 또는 Cha;

A₁₈은 Met 또는 Ahc;

A₂₁은 Val 또는 Ahc;

A₂₂는 Glu 또는 Ahc;

A₂₃은 Trp, Ahc 또는 Cha;

A₂₄는 Leu, Ahc 또는 Cha;

A₂₇은 Lys, hArg, Ahc 또는 Cha;

A₂₈은 Leu, Ahc 또는 Cha;

A₂₉는 Glu, Ahc 또는 Aib;

A₃₁은 Val, Leu, Nle, Ahc 또는 Cha;

R₁은 H;

R₂는 H; 및

R₃는 NH₂인

펩타이드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염.
제 3 항에 있어서,

A₇, A₁₁, A₁₅, A₂₃, A₂₄, A₂₇, A₂₈또는 A₃₁ 중 하나 이상은 Cha인 펩타이드.
제 3 항에 있어서,

A₁₆, A₁₇, A₁₉, A₂₉ 또는 A₃₄ 중 하나 이상은 Aib인 펩타이드.
제 1 항에 있어서,

상기 펩타이드는 [Ahc⁷ ^{, 11}]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc⁷ ^{, 11}, Nle⁸ ^{, 18}, Tyr³⁴]hPTH(1- 34)NH₂; [Ahc¹¹]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc⁷ ^{, 11, 15}]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc⁷]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²³]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²⁴]hPTH(1-34)NH₂; [Nle⁸ ^{, 18}, Ahc²⁷]hPTH (1-34)NH₂; [Ahc²⁸]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc³¹]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²⁴ ^{, 28, 31}]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²⁴ ^{, 28, 31}, Lys³⁰]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²⁸ ^{, 31}]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc¹⁵]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²⁴ ^{, 27}, Aib²⁹, Lys³⁰]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²⁴ ^{, 27}, Aib²⁹, Lys³⁰, Leu³¹]hPTH (1-34)NH₂; [Ahc⁵]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc¹²]hPTH(1-34)N_H2; [Ahc²⁷] hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²⁹]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²⁴ ^{, 27}]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²⁴ ^{, 27}, Aib²⁹]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²⁴, Aib²⁹]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²⁷, Aib²⁹]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc¹⁸]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc⁸]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc¹⁸ ^{, 27}, Aib²⁹]hPTH(1-34)NH₂; 또는 [Ahc¹⁸ ^{, 24, 27}, Aib²⁹]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²², Leu²⁷, Aib²⁹]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²⁴, Leu²⁷, Aib²⁹]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²²]hPTH(1-34)NH₂; [Ahc²², Aib²⁹]hPTH(1-34)NH₂인 펩타이드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염.