JPH0532696A

JPH0532696A - 副甲状腺ホルモン誘導体

Info

Publication number: JPH0532696A
Application number: JP3227232A
Authority: JP
Inventors: Shizue Nakagawa; 静枝中河; Tsunehiko Fukuda; 常彦福田; Masahiro Kawase; 雅弘川瀬; Iwao Yamazaki; 巖山崎
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1990-09-28
Filing date: 1991-09-06
Publication date: 1993-02-09
Also published as: DE69130790T2; EP0477885A2; ATE175972T1; CA2052375A1; EP0477885A3; DE69130790D1; EP0477885B1; US5393869A; CA2052375C

Abstract

(57)【要約】（修正有）【構成】ヒト副甲状腺ホルモンＰＴＨ（１−３４）の
１、８、１１、１２、１３、１８、１９、２１、２３、
２５、２６、２７または３４位の１以上を他のアミノ酸
で置換した一般式〔Ｉ〕のペプチドまたはその塩。 R₁-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R₂-His-Asn-R₃-R₄-R₅-His
-Leu-Asn-Ser-R₆-R₇-Arg-R₈-Glu-R₉-Leu-R₁₀-R₁₁-R₁₂-L
eu-Gln-Asp-Val-His-Asn-R₁₃〔Ｉ〕〔R₁はSerまたはAib、R₂はMetまたは天然型の脂溶性ア
ミノ酸、R₃はLeu，Ser，Lysまたは芳香族アミノ酸、R₄
はGlyまたはD-アミノ酸、R₅はLysまたはLeu、R₆はMetま
たは天然型の脂溶性アミノ酸、R₇はGluまたは塩基性ア
ミノ酸、R₈はValまたは塩基性アミノ酸、R₉はTrpまたは
2-(1,3-ジチオラン-2-イル）Trp、R₁₀はArgまたはHis、
R₁₁はLysまたはHis、R₁₂はLys，GlnまたはLeu、R₁₃はPh
eまたはPhe-NH₂を示す〔ただし同時にR₁がSer、R₂がMe
t、R₃がLeu、R₄がGly、D-AlaまたはD-Pro、R₅がLys、R₆
がMet、R₇がGlu、R₈がVal、R₉がTrp、R₁₀がArg、R₁₁がL
ys、R₁₂がLysである場合を除く〕【効果】種々の蛋白質分解酵素への抵抗性が増し血中で
の活性持続性が上昇するなど優れたＰＴＨ誘導体を得
て、骨疾患等の有用な医薬となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はホルモンによる治療剤と
して有用な、新規副甲状腺ホルモンペプチド誘導体に関
するものである。

【０００２】

【従来の技術】副甲状腺ホルモン（PTH）は副甲状腺で
合成された後、その標的器官である骨、腎臓、腸に作用
して、主に血中カルシウムやリン酸イオンの濃度を調節
する重要な働きをしている。ＰＴＨは84個のアミノ酸か
らなるペプチドホルモンであるがその生物学的作用はＮ
末端(1-34位)のペプチドフラグメントで再現できる事が
知られている〔G.W.Tregearら、エンドクリノロジー(En
docrinology)，93 1349-1353（1973)〕。このヒト型Ｐ
ＴＨのＮ末端(1-34位)のペプチドフラグメント（ヒトＰ
ＴＨ(1-34)と略す）のアミノ酸配列は以下の通りであ
る。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn- Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser- 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH （配列番号：１）

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ＰＴＨの生物学的作用
からして、これを医薬として用いれば種々の骨疾患等に
対する有用な医薬品となり得る事が期待されるが、ペプ
チドが有する次の様な性質がそれを困難にしている。
１．体内で種々の酵素により分解を受け易い。２．種々
の経路における体内への吸収効率が非常に低い。３．例
えば酸化等、種々の物理化学的条件に対し、不安定であ
る。この様な問題点を解決すべく、又当該ホルモンの構
造活性相関を理解すべくＰＴＨ(1-34)フラグメントにつ
いて種々の誘導体の合成がなされてきたが、それらは主
にウシＰＴＨ(1-34）に関するものであり、ヒトＰＴＨ
(1-34)に関してはその例は少ない。例えばヒトＰＴＨ(1
-34)のＣ末端ＰｈｅをPhe-NH₂に変換すると活性の上昇
が見られる（特開昭58-96052）事が知られている。しか
し、これはカルボキシルペプチダーゼによる分解が抑え
られ、その結果見かけの活性上昇が観察されたものと思
われる。また、ヒトＰＴＨ(1-34)にはＭｅｔが２残基含
まれるが、これらをＮｌｅに置換した分子では酸化によ
るホルモン活性消失が防止されることが知られている
（特開昭61-24598)。しかしＮｌｅは非天然型アミノ酸
であり、医薬としての用途を考えた場合より好ましいア
ミノ酸置換が望まれる。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者はこのような課
題を解決するために、ヒトＰＴＨ（1−34）におけるア
ミノ酸の置換を化学合成的に実施し、ヒトＰＴＨ（1−3
4）に種々の蛋白質分解酵素に対する抵抗性を考慮した
アミノ酸置換をほどこす事により、また予想される２次
元構造や、親水・疎水性もしくはイオン的環境を考慮し
たアミノ酸置換を試みる事により、当該ホルモンのレセ
プターへの親和性を高め、さらには酸、アルカリ性条
件、酸化条件等に対して不安定なアミノ酸を、活性を低
下させる事なく、これらの条件に対して安定なアミノ酸
に置換することによってこの目的が達成されることを見
出し、本発明を完成したものである。これにより効果的
に臨床応用可能なＰＴＨ類縁体を提供することに成功し
たものである。

【０００５】すなわち本発明は、 R₁-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R₂-His-Asn-R₃-R₄-R₅-His-Leu-Asn-Ser-R₆-R₇-Arg -R₈-Glu-R₉-Leu-R₁₀-R₁₁-R₁₂-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-R₁₃〔Ｉ〕〔式中R₁はSerまたはAibを、R₂はMetまたは天然型の脂
溶性アミノ酸を、R₃はLeu，Ser，Lysまたは芳香族アミ
ノ酸を、R₄はGly，またはD-アミノ酸を、R₅はLysまたは
Leuを、R₆はMetまたは天然型の脂溶性アミノ酸を、R₇は
Glu，または塩基性アミノ酸を、R₈はVal，または塩基性
アミノ酸を、R₉はTrpまたは2-(1,3-ジチオラン-2-イ
ル）Trpを、R₁₀はArgまたはHisを、R₁₁はLysまたはHis
を、R₁₂はLys，GlnまたはLeuを、R₁₃はPheまたはPhe-NH
₂を示すが、同時にR₁がSer、R₂がMet、R₃がLeu、R₄がGl
y、D-AlaまたはD-Pro、R₅がLys、R₆がMet、R₇がGlu、R₈
がVal、R₉がTrp、R₁₀がArg、R₁₁がLys、R₁₂がLysである
場合を除く〕（配列番号：２）で表されるペプチドまた
はその塩に関するものである。

【０００６】R₂，R₆における天然型の脂溶性アミノ酸と
しては天然（動物、植物または微生物）のタンパク質を
構成するアミノ酸のうち脂溶性のものをいい、具体的に
は、Leu，Ile，Val，PheおよびTrp等が挙げられる。R₃
における芳香族アミノ酸としてはPhe，β−ナフチルAl
a，TrpおよびTyr等が挙げられる。R₄におけるD-アミノ
酸としてはD-α-アミノ酸であれば、特に限定されるも
のではなく、具体的にはD-Leu，D-Ile，D-Nle，D-Val，
D-Ser，D-Ser(But)，D-Abu，D-Thr，D-Nva，D-Met，β-
ナフチル-D-Ala，D-Trp，D-Tyr，D-Lys，D-Lys(Fmoc)，
D-Phe，D-Asnなどが挙げられるが、一般に中性アミノ酸
が好ましく、例えばD-Ser，D-Leu，D-ナフチルAla，D-T
rp，D-Asn，Ｄ-Tyr等が挙げられる。R₇，R₈における塩
基性アミノ酸としてはArg，Lys，Asn，His等が挙げられ
る。これらの置換は一ケ所だけでなく、何ケ所かの置換
の組合せも可能であり、後述の実施例にあるように特に
３ケ所までの置換の組合せは実用的である。

【０００７】本発明におけるペプチド合成はペプチド自
動合成装置によって行うことができる。基本的な合成過
程等はR.B.Merrifield〔アドバンシズ・イン・エンザイモ
ロジー（Advances in Enzymology)32，221-296(1969)〕
の方法に順じている。この方法は、カルボキシル末端の
アミノ酸を樹脂担体に共有結合させておき、α−アミノ
基の保護基の除去、保護アミノ酸の縮合を順次繰り返し
て、アミノ末端に向けてペプチド鎖を延長させ目的のア
ミノ酸配列を有する保護ペプチド樹脂を得る事をその原
理としている。各アミノ酸の縮合やα−アミノ基の保護
基の除去などは、ほぼ同一の条件でなされ、中間体の精
製も行なわない為、合成に際しては一般に高度な熟練は
要求されない。しかもこの方法は迅速であり、種々のペ
プチドを合成するに際し、非常に便利な方法である。こ
うして得られた保護ペプチド樹脂を、例えば無水フッ化
水素、トリフルオロメタンスルホン酸もしくはトリフル
オロ酢酸と種々の添加物の共存下に反応させる事によ
り、ペプチドの樹脂からの脱離と全保護基の除去を一段
階で行うことができる。得られたペプチド粗精製物は、
ペプチドまたは蛋白質を精製する公知の手段で精製する
ことができる。例えばゲル濾過、陽イオン交換、もしく
は陰イオン交換樹脂を用いるイオン交換クロマトグラフ
ィー、さらには疎水クロマトグラフィー、分配吸着クロ
マトグラフィー等、種々の原理によるカラムクロマトグ
ラフィーや高速液体クロマトグラフィーが挙げられる。
本発明のペプチドは種々の塩の形で得られる。塩として
は、例えば無機酸や、ギ酸、酢酸、酒石酸、クエン酸な
どの有機酸との塩、もしくはナトリウムやアンモニアな
どの無機塩基や、トリエチルアミン、エチルアミン、メ
チルアミン等の有機塩基との塩が挙げられる。

【０００８】本発明の一般式（Ｉ）で表わされるヒトＰ
ＴＨ（１−34）誘導体ペプチドは、骨粗鬆症治療剤、副
甲状腺機能低下症の治療剤、高血圧治療剤として用いる
ことができる。そしてその剤型としては、注射剤、経鼻
吸収剤、直腸吸収剤、膣吸収剤、経皮吸収剤もしくは点
眼剤のようなものが挙げられるが、場合により経口投与
されることもある。該ペプチドをこのような治療剤とし
て用いる場合、哺乳動物に対してその有効量が用いられ
る。一般的には１ｎｇ〜100μｇ／体重ｋｇの範囲で用
いられるが、この厳密な量については当業者によって適
宜決められるものである。このペプチドを治療剤として
用いる場合には、注意深く精製を行ない細菌や発熱物質
が存在しないように注意しなければならない。このペプ
チドを骨粗鬆症などの治療薬として用いる場合、そのま
まあるいは薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤
と混合したのち、上記注射剤、経鼻吸収剤、直腸吸収
剤、膣吸収剤、経皮吸収剤もしくは点眼剤などの剤型で
非経口的に投与することができる。投与量は成人の場
合、注射剤の場合、１回あたり50ｎｇ〜５ｍｇ、好まし
くは１〜500μｇで１〜３日に１回の投与が適当であ
る。治療剤の濃度は注射剤では10〜100μｇ／ｍｌが適
当である。

【０００９】本発明明細書において、アミノ酸などを略
号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commision on
Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分
野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記
する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合
は、特に明示しなければＬ−体を示すものとする。ＧｌｙまたはＧ：グリシンＡｌａまたはＡ：アラニンＶａｌまたはＶ：バリンＬｅｕまたはＬ：ロイシンＩｌｅまたはＩ：イソロイシンＳｅｒまたはＳ：セリンＴｈｒまたはＴ：スレオニンＣｙｓまたはＣ：システインＭｅｔまたはＭ：メチオニンＧｌｕまたはＥ：グルタミン酸ＡｓｐまたはＤ：アスパラギン酸ＬｙｓまたはＫ：リジンＡｒｇまたはＲ：アルギニンＨｉｓまたはＨ：ヒスチジンＰｈｅまたはＦ：フェニールアラニンＴｙｒまたはＹ：チロシンＴｒｐまたはＷ：トリプトファンＰｒｏまたはＰ：プロリンＡｓｎまたはＮ：アスパラギンＧｌｎまたはＱ：グルタミンＡｉｂ：アミノイソブチル酸Ｎｌｅ：ノルロイシン β−Ａｌａ：β−アラニンｈＰＴＨ：ヒトＰＴＨＦｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシカルボニ
ルＮｖａ：ノルバリンＡｂｕ：α−アミノブチリル酸

【００１０】

【作用】ＰＴＨ(1-34)に本発明のような置換を行なうこ
とによって、種々の蛋白質分解酵素に対する抵抗性が増
し、血中での活性の持続性が得られる。これは例えば第
１位のＡｉｂ、或いは第12位のD-アミノ酸への置換で達
成された。この12位Ｇｌｙ付近はβ-ターン構造をもっ
ていると思われるが、これのD-アミノ酸、中でもD-Le
u，D-Trp，D-Valなどのかさ高いＤ−アミノ酸への置換
は、この構造の安定化に寄与し、またこの部位での蛋白
分解酵素によるペプチド鎖切断を阻止することにもなっ
ていると考えられる。また８位、18位のMetのLeuなどの
脂溶性天然アミノ酸への置換は、酸化に対する抵抗性を
増し、活性の低下ないし消失を防ぐ上で有用である。さ
らに他の部位のアミノ酸残基の置換ではＰＴＨ誘導体の
レセプターとの親和性が増し、高いＰＴＨ活性が発現さ
れている。例えば11位は本来Ｌｅｕであるが、芳香環側
鎖を有するアミノ酸、例えばＰｈｅへの置換がより好ま
しいし、25、26、27位の塩基性アミノ酸部位の置換、特
に27位のLysのGln、Leuへの置換により、また23位のTrp
の2-(1,3-ジチオラン-2-イル）Trpへの置換により高い
ＰＴＨ活性が発現されている。またＭｅｔの他の天然型
アミノ酸、例えばＬｅｕやＧｌｎへの置換は、活性を同
等もしくはそれ以上に保持し、かつ酸化反応に対して抵
抗性を有する誘導体を得る事を目的とするものである。
ここに挙げた代表的なアミノ酸置換の例は本発明を制限
するものと解釈されるべきではない。

【００１１】

【実施例】

【００１２】

【実施例１】ＰＴＨ部分ペプチド(1-34位)類縁体の合成
と精製本ペプチドの合成はメリフィールドらにより開発された
ペプチドの固相合成法(R.B.Merrifield.アドバンシズ
インエンザイモロジー(Adv.Enzymol)32巻、221-296頁
1969年)の変法に順じて行われ、自動ペプチド合成機430
Ａ(アプライドバイオシステムズ社）を用いた。保護ペ
プチド−樹脂の合成はアプライドバイオシステムズ社指
定のプロトコールを用いた。カルボキシル末端が遊離カ
ルボン酸の誘導体を得る場合には保護アミノ酸−ｐオキ
シメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂（ポリスチレ
ンー１％ジビニルベンゼン）を、またカルボキシルアミ
ドの誘導体を得る場合には４−メチルベンズヒドリル樹
脂を出発原料とし、これに遂次保護アミノ酸を縮合させ
た、縮合時に各アミノ酸のα−アミノ基を保護するた
め、三級ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）基を用い
た。側官能基保護は次のように行なった。セリンとスレ
オニンのヒドロキシル基は０−ベンジルエーテルとし
て、チロシンのヒドロキシル基又はｐ−ブロモベンジル
オキシカルボニルエスチルとして、グルタミン酸及びア
スパラギン酸のカルボキシル基はベンジルエステルとし
て、ヒスチジンのイミダゾール窒素はベンジルオキシメ
チルによって、リジンの側鎖アミノ基は２−クロルベン
ジルオキシカルボニルで、アルギニンのグアニジン官能
基はｐ−トルエンスルホニル基で、トリプトファンのイ
ンドールイミンはホルミル基で保護した。すべてのアミ
ノ酸は、アプライド・バイオシステムズジャパン社又は
バチェム・ケミカルズから入手した。

【００１３】樹脂上に全てのアミノ酸を縮合した後、保
護ペプチド樹脂を合成機から取り出し、乾燥した。ペプ
チド樹脂（１ｇ）を、ｐ−クレゾール（１ml)、1,2−エ
タンジチオール（１ml)、２−メルカプトピリジン（100
mg）を含んだ、無水フッ化水素(８ml）と、０℃で２時
間反応させた。反応終了後、フッ化水素を留去し、残留
物をジエチルエーテルで洗浄し、大部分の混合試薬を除
去した。ペプチドを３％酢酸（10ml）で抽出し、濾過に
より樹脂を除いた。濾液をセファデックスＧ−25を用い
るゲル濾過により精製した。ゲル濾過の条件は、カラム
サイズ2.8×60cm、検出波長230もしくは280nm；溶媒、3
％酢酸；流速40ml／時間であった。ペプチドを含むフラ
クションを集めて凍結乾燥し、得られた粉末標品をさら
に逆相高速液体クロマトグラフィーで精製した。カラム
ＹＭＣ−パック、Ａ−324 ODS（10×250mm）溶出溶媒
Ａ，0.1％トリフルオロ酢酸−99.9％水；溶出溶媒Ｂ，
0.1％トリフルオロ酢酸−99.9％アセトニトリル；溶出
濃度勾配プログラム、０分(90%A＋10％B)、30分(60％Ａ
＋40％Ｂ）(但し必要ならば他の溶出プログラムを用い
る事もある。）溶出速度1.6ml／分、検出波長230または
280nm。純粋な目的物を含むピーク画分を集めてバイオ
ラッドＡＧＩ×８（酢酸型、1.8×5cm）のカラムに通
し、洗液も集めアセトニトリルを留去した後、凍結乾燥
した。

【００１４】このようにして得たペプチドと、そのアミ
ノ酸分析結果ならびに逆相高速液体クロマトグラフィー
における保持時間を表１に示す。なお、表１中のａ，
ｂ，ｃは以下の通りである。ａ：４％チオグリコール酸存在下、６規定塩酸で減圧封
管中、110℃、24時間加水分解後アミノ酸分析に付し
た。カッコ内は理論値。ｂ：化合物名（末尾に何も付いていないのはカルボン酸
タイプである）：（１）(Ｌｅｕ¹⁸)ｈＰＴＨ(１−３４) （２）(Ａｉｂ¹)ｈＰＴＨ(１−３４）（３）(Ｐｈｅ¹¹)ｈＰＴＨ(１−３４) （４）(Ｄ−Ｔｒｐ¹²)ｈＰＴＨ(１−３４) （５）(Ｌｅｕ⁸)ｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂ （６）(Ｄ−Ｔｙｒ¹²)ｈＰＴＨ(１−３４)ＮＨ₂ （７）(Ｄ−Ｓｅｒ¹²)ｈＰＴＨ(１−３４)ＮＨ₂ （８）(Ｄ−Ｌｅｕ¹²)ｈＰＴＨ(１−３４)ＮＨ₂ （９）〔３−（２−ナフチル）−Ｄ−Ａｌａ¹²〕ｈＰＴ
Ｈ(１−３４)ＮＨ₂ （10）(Ｓｅｒ¹¹)ｈＰＴＨ(１−３４)ＮＨ₂ （11）(Ｐｈｅ¹¹，Ｌｅｕ¹⁸)ｈＰＴＨ(１−３４)ＮＨ₂ （12）(Ｌｅｕ⁸，Ｐｈｅ¹¹，Ｌｅｕ¹⁸)ｈＰＴＨ(１−３
４）ＮＨ₂ （13）(Ｌｙｓ¹¹)ｈＰＴＨ(１−３４)ＮＨ₂ （14）(Ｐｈｅ¹¹)ｈＰＴＨ(１−３４)ＮＨ₂ （15）(Ａｒｇ¹⁹’²¹)ｈＰＴＨ(１−３４)ＮＨ₂ （16）〔３−（２−ナフチル）−Ａｌａ¹¹〕ｈＰＴＨ
(１−３４)ＮＨ₂ （17）(Ｈｉｓ²⁶)ｈＰＴＨ(１−３４)ＮＨ₂ （18）(Ｈｉｓ²⁵)ｈＰＴＨ(１−３４) (19）(Ｇｌｎ²⁷)ｈＰＴＨ(１−３４) （20）〔Ａｒｇ¹⁹’²¹，２−（１，３−ジチオラン−２
−イル）−Ｔｒｐ²³〕ｈＰＴＨ(１−３４)ＮＨ₂ （21）(Ｌｅｕ²⁷)ｈＰＴＨ(１−３４) （22）(Ｌｙｓ¹¹)ｈＰＴＨ(１−３４) ｃ：誘導体の高速液体クロマトグラフィーによる保持時
間。分析条件：バりアン社製VISTA5000高速液体クロマ
トグラムとウォーターズ社712Ｗオートサンプラーを連
結して用いた。カラム，ＹＭＣＡ−３０３ＯＤＳ（4.6
×250mm)；溶出液Ａ，0.１％トリフルオロ酢酸−99.9％
水；溶出溶媒Ｂ，0.１％トリフルオロ酢酸−99.9％アセ
トニトリル；溶出濃度勾配プログラム，０分（80％Ａ＋
20％Ｂ），30分（50％Ａ＋50％Ｂ）；流速0.7ml／分；
検出波長280nm。

【００１５】

【表１−１】

【００１６】

【表１−２】

【００１７】

【表１−３】

【００１８】

【表１−４】

【００１９】

【実施例２】〔Ａｒｇ¹⁹’²¹，２−（１，３−ジチオラ
ン−２−イル）−Ｔｒｐ²³〕ｈＰＴＨ(１−３４)ＮＨ₂
の合成と精製〔Ａｒｇ¹⁹’²¹〕ｈＰＴＨ(１−３４)ＮＨ₂を合成した
ペプチド樹脂（560mg）を、ｐ−クレゾール（620μl)、
エタンジチオール（620μl)、２−メルカプトピリジン
（50mg）存在下、無水フッ化水素(５ml）で、０℃、２
時間処理した。フッ化水素を留去して除いた時、残留物
を０．１％２−メルカプトエタノールを含んだエーテル
で洗浄した。これを乾燥した後、トリフルオロ酢酸(５m
l）を加えペプチドを溶解させ、樹脂をろ去した。エー
テルを加え、生じた沈殿をろ取し、エーテルで洗浄し
た。粗精製物として280mgのペプチドが得られた。これ
を逆相高速液体クロマトグラフィーで精製した。カラム
ＹＭＣ−パック、Ａ−324 ODS（10×250mm）；溶出溶媒
Ａ，0.1％トリフルオロ酢酸−99.9％水；溶出溶媒Ｂ，
0.1％トリフルオロ酢酸−99.9％アセトニトリル；溶出
濃度勾配プログラム、０分(70％A＋30％B)、40分(55％
Ａ＋45％Ｂ）；流速1.6ml／分。このクロマトグラフィ
ーで２本の大きなピーク（保持時間１７．０分および１
８．２分）が見られた。前のピーク（保持時間１７．０
分）を集め、イオン交換樹脂により酢酸塩とした後凍結
乾燥して〔Ａｒｇ¹⁹’²¹〕ｈＰＴＨ(１−３４)ＮＨ₂が
4.9mg得られた。この化合物は酸加水分解後のアミノ酸
分析で正しいアミノ酸組成値を示し、紫外吸収曲線もト
リプトファン含有ペプチドに特徴的な曲線を示した。後
のピークからは6.9mgの化合物が得られたが、この化合
物は酸加水分解後のアミノ酸分析値は正しい値を示した
が、トリプシン消化に続くアミノペプチダーゼＭ消化物
のアミノ酸分析でトリプトファンは0.28残基しか検出さ
れず、グルタミン酸も理論値よりも0.65残基少なく検出
された。又、紫外線吸収曲線では289nmにピークを、255
nmに谷を示した。この結果、この化合物ではトリプトフ
ァン側鎖が修飾されていることが予想され、以下のよう
にして、それが1,3−ジチオラン基がトリプトファン側
鎖インドールの２位炭素に結合したものであることを明
らかにすることができた。

【００２０】前記の高速液体クロマトグラフィーによ
り、保持時間18.2分のピークより得られた化合物（４m
g)を60mM炭酸水素ナトリウム緩衝液ｐＨ8.0(2.6ml)に溶
かし、ＴＰＣＫ−トリプシン（160μｇ）を加え、３７
℃、２４時間反応した後、１００℃に５分間加熱して失
活させた。反応液をｐＨ７に調整した後、アミノペプチ
ダーゼ−Ｍ（0.5mg)を加え３７℃で２４時間反応させ
た。２４時間後、更に同酵素（0.5mg)を追加し、さらに
４８時間後に緩衝液(10ml)と同酵素（１mg）を加え、以
後70時間反応させた。反応物を逆相高速液体クロマトグ
ラフィーに付し、修飾を受けたトリプトファンを分離し
た。カラム，ＹＭＣＤ−ODS−５Ｓ５ 120Ａ（20×250
mm）；溶出溶媒は上記と同じ；溶出プログラム、０分(8
0％A＋20％B)、40分(65％Ａ＋35％Ｂ）；流速，５ml／
分；280nmで検出。単離された化合物は、289nmに紫外吸
収の極大値を示した。又、４％チオグリコール酸含有６
Ｎ塩酸による加水分解後のアミノ酸分析ではトリプトフ
ァンが検出された。この化合物を高分解能ＦＡＢ−マス
スペクトル（日本電子社、ＡＸ−５０５Ｗ型二重収束質
量分析計を用いた）に付したところ、309.0734(Ｍ＋Ｈ
+）のピークが観測され、これより分子式がＣ₁₄Ｈ₁₇Ｎ₂
Ｏ₂Ｓ₂と予想された。さらに約30μｇを¹Ｈ−ＮＭＲ
（日本電子社、ＪＮＭ−ＧＸ４００を用いた）に付し
た。〔ＤＭＳＯ−ｄ₆〕，α−ＣＨ δ＝４．０６（１
Ｈ，ｄｄｌｉｋｅ），β−ＣＨ₂ ３．５４（１Ｈ，ｄ
ｄ），３．３０（１Ｈ，ｄｄ）；１−ＮＨ１０．８８
（１Ｈ）；５−ＣＨ７．５０（１Ｈ，ｄ）；６−ＣＨ
７．３０（１Ｈ，ｔｌｉｋｅ）；７−ＣＨ７．２０
（１Ｈ，ｔｌｉｋｅ）；８−ＣＨ７．６８（１Ｈ，
ｄ）；ジチオラン２ＣＨ６．１４（１Ｈ，Ｓ）；ジチ
オラン４ＣＨ₂と５ＣＨ₂３．６４（２Ｈ，ｍ）と３．
４９（２Ｈ，ｍ）。以上の結果より単離したｈＰＴＨ
(１−３４)ＮＨ₂誘導体は２３位に２−（１，３−ジチ
オラン−２−イル）−トリプトファンを含む化合物であ
ることが解った。分析結果は表１に記載した。

【００２１】

【実施例３】ＰＴＨ部分ペプチド(1-34位)類縁体の生
物活性の測定ＰＴＨ部分ペプチド（1-34位）類縁体の生物活性をシゲ
ノら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー、第263巻、第18369〜18377頁、1980年Shigenoら
〔The Journal of Biological Chemistry，263:18369-1
8377(1988)〕により報告された方法を修正して評価し
た。96穴マルチ・プレート〔ヌンクロン（Nunclon）、ヌ
ンク〕上で培養したマウス頭蓋骨由来骨芽細胞様細胞
株、MC3T3-EI細胞に、0.01，0.1，1，10あるいは100nM
の類縁体を含む、100μlの培養液〔20mMのN-2-ヒドロキ
シエチルピペラジン-Ｎ'-２-エタンスルホン酸（HEPE
S)、0.1％牛血清アルブミン（BSA）および0.5mMのイソ
ブチルメチルキサンチンを含む。Hank's液〕を加え、30
分間室温で反応させた。0.2規定度の塩酸100μｌを加え
た後、沸騰水中に２分半浸し、ＰＴＨ受容体によって産
生されたサイクリック・アデノシン・１リン酸（cAMP）
を細胞から抽出した。培養液中および細胞内の総ｃＡＭ
Ｐ測定は、市販のラジオイムノアッセイキット〔サイク
リックＡＭＰ[¹²⁵I]キット「デュポン−第一」、第一化学
薬品〕を用いて行った。標準として添加したヒトＰＴＨ
部分ペプチド（1-34位）の濃度に依存したcAMPの産生量
の増加が常に認められた。ＰＴＨ部分ペプチド（1-34
位）類縁体の生物活性については表２に示した。

【００２２】表２ＰＴＨ（1-34）部分ペプチドの生物活性〔hPTH(1-34)との相対活性で表わしたもの〕ｈＰＴＨ（１−３４）１．００〔Ｌｅｕ¹⁸〕ｈＰＴＨ（１−３４）０．４〔Ａｉｂ¹〕ｈＰＴＨ（１−３４）１．７〔Ｐｈｅ¹¹〕ｈＰＴＨ（１−３４）１．１〔Ｌｅｕ⁸〕ｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂ ０．５〔Ｄ−Ｓｅｒ¹²〕ｈＰＴＨ(１−３４)ＮＨ₂ ０．８〔Ｄ−Ｌｅｕ¹²〕ｈＰＴＨ(１−３４)ＮＨ₂ ０．５〔３−（２−ナフチル）−Ｄ−Ａｌａ¹²〕ｈＰＴＨ(１−３４)ＮＨ₂ ０．９〔Ｓｅｒ¹¹〕ｈＰＴＨ(１−３４)ＮＨ₂ ０．８〔Ｌｅｕ⁸，Ｐｈｅ¹¹，Ｌｅｕ¹⁸〕ｈＰＴＨ(１−３４）ＮＨ₂ ０．９〔Ｌｙｓ¹¹〕ｈＰＴＨ(１−３４)ＮＨ₂ １．１〔Ｐｈｅ¹¹〕ｈＰＴＨ(１−３４)ＮＨ₂ １．３〔Ａｒｇ¹⁹’²¹〕ｈＰＴＨ(１−３４)ＮＨ₂ ０．９〔３−（２−ナフチル）−Ａｌａ¹¹〕ｈＰＴＨ(１−３４)ＮＨ₂ １．７〔Ｈｉｓ²⁶〕ｈＰＴＨ(１−３４)ＮＨ₂ ０．９〔Ｈｉｓ²⁵〕ｈＰＴＨ(１−３４) １．０〔Ｇｌｎ²⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４) ２．５〔Ａｒｇ¹⁹’²¹，２−（１，３−ジチオラン−２−イル）−Ｔｒｐ²³〕ｈＰＴＨ (１−３４)ＮＨ₂ １．７〔Ｌｅｕ²⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４) １．２

【００２３】

【配列表】配列番号：1 配列の長さ: 34 配列の種類: ペプチドトポロジー: 直鎖状配列の型: アミノ酸配列の特徴: 部分ペプチド配列: Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe。

【００２４】配列番号：2 配列の長さ: 34 配列の型: アミノ酸トポロジー: 直鎖状配列の種類: ペプチド配列の特徴：存在位置:1 他の情報:Xaa= Ser またはAib、存在位置:8 他の情報:Xaa= Met または脂溶性天然アミノ酸存在位置:11 他の情報:Xaa= Leu，Ser，Lysまたは芳香族アミノ酸存在位置:12 他の情報:Xaa= GlyまたはD-アミノ酸存在位置:13 他の情報:Xaa= LysまたはLeu 存在位置:18 他の情報:Xaa= Met または脂溶性天然アミノ酸存在位置:19 他の情報:Xaa= Glu または塩基性アミノ酸存在位置:21 他の情報:Xaa= Glu または塩基性アミノ酸存在位置:23 他の情報:Xaa= Trp または2-(1,3-ジチオラン-2-イル）
Trp 存在位置:25 他の情報:Xaa= Arg またはHis 存在位置:26 他の情報:Xaa= Lys またはHis 存在位置:27 他の情報:Xaa= Lys ，GlnまたはLeu 存在位置:34 他の情報:Xaa= PheまたはPhe-NH₂ 配列: Xaa Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Xaa Xaa Xaa His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Xaa Xaa Arg Xaa Glu Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Leu Gln Asp Val 20 25 30 His Asn Xaa ３４

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 37/24 ＡＥＧ 8314−4ＣＣ０７Ｋ 99:00

Claims

【特許請求の範囲】【請求項１】 R₁-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R₂-His-Asn-R₃-R₄-R₅-His-Leu-Asn-Ser-R₆-R₇-Arg -R₈-Glu-R₉-Leu-R₁₀-R₁₁-R₁₂-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-R₁₃〔Ｉ〕〔式中R₁はSerまたはAibを、 R₂はMetまたは天然型の脂溶性アミノ酸を、 R₃はLeu，Ser，Lysまたは芳香族アミノ酸を、 R₄はGly，またはD-アミノ酸を、 R₅はLysまたはLeuを、 R₆はMetまたは天然型の脂溶性アミノ酸を、 R₇はGlu，または塩基性アミノ酸を、 R₈はVal，または塩基性アミノ酸を、 R₉はTrpまたは2-(1,3-ジチオラン-2-イル）Trpを、 R₁₀はArgまたはHisを、 R₁₁はLysまたはHisを、 R₁₂はLys，GlnまたはLeuを、 R₁₃はPheまたはPhe-NH₂を示す。〔ただし、同時に、R₁
がSer、R₂がMet、R₃がLeu、R₄がGly、D-AlaまたはD-Pr
o、R₅がLys、R₆がMet、R₇がGlu、R₈がVal、R₉がTrp、R
₁₀がArg、R₁₁がLys、R₁₂がLysである場合を除く〕で表
されるペプチドまたはその塩。