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KR102816794B1 - 인간 및 동물의 건강을 위한 미생물 군집의 사용 - Google Patents

인간 및 동물의 건강을 위한 미생물 군집의 사용 Download PDF

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KR102816794B1
KR102816794B1 KR1020187025280A KR20187025280A KR102816794B1 KR 102816794 B1 KR102816794 B1 KR 102816794B1 KR 1020187025280 A KR1020187025280 A KR 1020187025280A KR 20187025280 A KR20187025280 A KR 20187025280A KR 102816794 B1 KR102816794 B1 KR 102816794B1
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마시모 마조라티
톰 반 더 위엘
아일세 스체어린크
피터 반 덴 아벨레
셀린 볼카
다비드 고타르디
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유니버시테이트 젠트
마이크로바이얼 리소스 매니지먼트 헬스 엔브이
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Abstract

본 발명은 바람직하게는 위장 장애(gastrointestinal disorders)의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 적어도 6개 또는 7개의 상이한 박테리아 종 및 특정 박테리아 종에 속하는 박테리아 혼합물에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 박테리아 혼합물은 상기 장애를 예방 또는 치료하기 위하여 개체에 상기 혼합물을 투여하기 전 발효조에서 함께 성장한 것이다.

Description

인간 및 동물의 건강을 위한 미생물 군집의 사용
본 발명은 바람직하게는 위장 장애(gastrointestinal disorders)의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 적어도 6개 또는 7개의 상이한 박테리아 종 및 특정 박테리아 종에 속하는 박테리아 혼합물에 관한 것이다. 보다 바람직하게는, 상기 박테리아 혼합물은 상기 장애를 예방 또는 치료하기 위하여 개체에 상기 혼합물을 투여하기 전 발효조에서 함께 성장한 것이다.
인간과 동물의 장 생태계(gut ecosystem)는 내용물의 습윤 중량 1그램당 1011개 이상의 미생물, 주로 혐기성 균을 포함하는 소위 미생물총(microbiota)으로 정착된 다양한 서식지와 대사 환경(metabolic niches)으로 구성된다(Macfarlane& Macfarlane, 1997). 인간 또는 동물의 장 내 미생물군집(gut microbiome)이 에너지 수확에 기여, 면역 시스템 조절 및 기회주의적 병원체들에 대응한 집락화 저항(colonization resistance)을 통해 인간의 건강 및 웰빙(well-being)에 결정적인 역할을 한다는 것은 오늘날 잘 알려져 있다(Fuller& Gibson, 1997; Cummings& Macfarlane, 1997). 박테리아 및 그 대사산물과 점액층 및/또는 장내 장 벽(intestinal gut wall)과의 상호작용이 중요하다는 증거가 있다(Barnett et al. 2012).
장 내 미생물군집은 일반적으로 시간이 지남에 따라 안정하지만, 그 구성은 식이 변화, 항생제 사용, 위생화(hygienization) 및 스트레스의 증가와 같은 외부 변화에 의해 변경될 수 있다. 이것은 장내세균불균형(dysbiosis)이라 불리는 위장관(gastrointestinal tract)의 불균형 상태를 초래한다(Clemente et al. 2012). 장내세균불균형은 정상적인 장 내 미생물군집 조성의 중등도(moderate) 또는 중증(severe) 파괴가 특징이며, 이로 인해 주요 미생물 종의 부족, 특정 미생물 기능의 공백 및 결과적으로 장 벽(gut wall) 활성의 조절 장애를 야기한다. 이것은 설사 또는 괴사성 장염(necrotizing enteritis)을 일으키는 병원성 미생물의 정착으로 이어질 수 있다(Sekirov et al, 2008). 이러한 질병발생의 극단적인 형태 중 하나는 전통적인 항생제 치료로는 환자 치료에 점점 더 미치지 못하는 CDAD(Clostridium difficile associated diarrhea)이다. 장내세균불균형의 또 다른 결과는 만성 염증(Willing et al, 2009) 또는 식품 알레르기를 일으키는 손상된 면역 체계(compromised immune system) 또는 증가된 장 투과성(gut permeability), 영양 흡수불량 또는 균혈증(bacteremia)일 수 있다. 미생물 기능 및 장 벽 생리에 대한 장내세균불균형의 부작용은 따라서 인간의 건강을 해칠 수 있다. 실제로는, 변비, IBS, IBD, 맹낭염(pouchitis), 대사 증후군, 비만, 당뇨, 심혈관계 질환, 정신 질환, 인지 기능 장애, 신경퇴행성 질환, 다양한 유형의 암(예를 들어, 결장암), 여성 생식 기관의 염증, CDAD, 류머티즘 또는 류머티스성 관절염은 모두 장 내 미생물 활성/조성의 변화와 관련이 있다. 그러므로 장내세균불균형이 생기면 이를 예방 또는 치료해야 한다는 것은 분명하다.
장내세균불균형이 병원균의 존재와 관련이 있을 때, 건강에 해로운 미생물을 없애는 명백한 전략은 항생제의 사용이다. 그러나, 지난 수십 년 간 폭넓은 효능을 지닌 항생제가 광범위하고 부적절하게 사용되면서 항생제 내성이 크게 증가했다(Brandl et al, 2008). 더욱이, 항생제는 중요한 기능을 수행하고 건강에 도움이 되는 토착 장 미생물(indigenous gut microorganisms)을 방해하여 장내세균불균형의 상태를 악화시킨다. 결과적으로, 지난 20년 동안 기능성 식품 연구, 특히 프리바이오틱(prebiotic) 및 프로바이오틱(probiotic) 제품의 개발이 엄청나게 증가했다. 프리바이오틱 개념은 이미 숙주에 적응된 토착 장 미생물의 식이 조절에 관한 것으로 매력적이지만(Van Loo et al, 1999), 주로 예방적 방법으로 사용된다. 치료상의 적용에서는, 심각하게 파괴된 장 내 미생물 군집은 병에 걸린 개체에서 덜 풍부하거나 결핍되어 있는 건강 증진 미생물에 유익한 기질을 제공하는 것보다는 주요 미생물 종의 도입으로부터 더 많은 이익을 얻을 것이다. 가능한 해결책은 프로바이오틱스(probiotics)라 불리는 생존 가능한, 건강 증진 미생물을 도입하는 것이다(Iannitti and Palmieri, 2010). 프로바이오틱 제품은 대부분 특정 기능을 가진 1 내지 2개의 상호 연결된 미생물 균주(주로 유산균(lactic acid) 생산 박테리아)를 포함한다. 그러나, 상부 소화관(upper digestive tract)의 가혹한 조건에서 프로바이오틱 균주의 생존은 까다로우며, 방대한 토착 미생물군집과의 경쟁은 종종 무시할 만하다. 그럼에도 불구하고, 손상된 장 생태계에 새로운 종을 도입하는 개념은 대변 세균총 이식(fecal microbial transplants, FMT)의 적용을 통해 최근 몇 년 동안 탄력이 붙고 있다(Khoruts et al, 2010). 이것은 건강한 공여자로부터 병에 걸린 환자에게 대변 세균 혼합물(fecal microbial slurry)을 옮기는 것을 수반한다. 이 세균 요법은 항생제 내성 감염 치료에 주로 적용되며 치료율이 90% 이상이다. 대변 세균총 이식은 현재 위장의 장내세균불균형(크론병(Crohn's disease), 비만, 과민성 대장 증후군)에 기인한 많은 다른 병리의 치료로도 고려된다. 대변 세균총 이식은 단일 프로바이오틱 균주가 자주 실패하는 곳에서 효율적으로 작동하는 것으로 보인다. 그러나, 성질이 제대로 특징 지어지지 않은 대변 이식(fecal transplants)에는 전염성 질병의 전염 위험 및 덜 심각하고 생명을 위협하는 병리에서 광범위하게 적용될 수 있느냐에 대한 의문 제기가 함께 딸려온다(De Vrieze 2013).
2013년 초, CDAD를 치료하는 치료제로서의 배양 가능성에 기초하여 개체로부터 분리된 미생물의 합성 혼합물의 사용에 기반한, 과학 논문 출판(Petrof et al, 2013) 및 특허 출원(WO2013037068 - Method for treatment of disorders of the gastrointestinal system)을 통해 대변 세균총 이식에 대한 대안이 이 분야에 진입하였다. 이러한 제품은 또한 QPS 기준이 준수될 때 대변 이식으로부터의 질병 전염에 대한 우려를 없앨 수 있는 알려진 미생물들의 세트로 구성되어 있다. 그러나, 미생물의 혼합이 서로 간의 상호작용 및 미생물 네트워크를 필요로 하는 기능적 지위(functional niche) 차지를 보장해 주지는 않는다. 제품 안정성, 중요한 기능의 표준화 및 성능은 따라서 보장되지 않는다.
특허 출원 WO2014145958A2(Network-based microbial compositions and methods)에는, 유효한 양의 치료용 박테리아 조성물, 복수의 분리된 박테리아 또는 정제된 박테리아 제제(bacterial preparation)를 이를 필요로 하는 포유류 개체에게 투여하는 것이 제안되어 있다. 복수의 분리된 박테리아 또는 정제된 박테리아 제제는 소위 네트워크 생태계(network ecology)를 형성할 수 있다. 이 제제에 속하는 박테리아는 게놈 정보에 기초하여 선택되며 느슨하게 집합된(loosely assembled) 균주 세트로서 포유류 개체에게 제공된다.
Becker et al. (2011)에서 군집(community)은 8가지 서로 다른 균주로 이루어진 것으로 설명된다: 아내로스티페스 카캐 ( Anaerostipes caccae ), 박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron ), 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum ), 블라우티아 프로덕타 ( Blautia product), 클로스트리듐 부티리쿰 (Clostridium butyricum ), 클로스트리듐 라모섬 (Clostridium ramosum ), 에스케리치아 콜라이 ( Escherichia coli ), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum). 상기 커뮤니티는 SIHUMIx(Simplified Human Microbiota extended)라고 불린다. 이 인공 미생물 군집은 쥐 연구에서 테스트되었으며, SIHUMIx 접종 쥐와 전통적인 인간 관련 및 무균 쥐를 비교하였다. 저자들은 상기 군집이 구성 및 기능 면에서 인간 결장과 관련된 미생물총을 대표한다고 주장한다. 상기 미생물 군집은 쥐의 나이에 따라 변화하였지만, 시간이 지남에 따라 안정한 조성물에 도달했다.
Van den Abbeele et al. (2013)은 관련된 핵심종(keystone species) 및 크로스피딩(cross-feeding) 미생물의 혼합물로 접종될 수 있는 전통적인 in vitro 발효조(fermenter)를 이용한 글리칸 분해 커뮤니티의 구축을 제안했다. 접종 및 안정화 후에, 이와 같은 특정 기능을 위한 미생물 네트워크 유닛(unit)을 대규모로 획득하고 생산할 수 있다.
마지막으로, Newton et al (1998)은 당 환원균(sulphate-reducing bacterium, SRB)인 디설포비브리오 디설퓨리칸스(Desulfovibrio desulfuricans)의 다른 장내 유기체에 대한 영향을 연구하기 위하여 혐기성 키모스텟(chemostat)을 이용해 재현 가능(reproducible)하다고 정의된 서로 다른 14가지 당분해성(saccharolytic) 및 아미노산 발효 종(즉, 비피토박테리움 롱검 ( Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 아돌레센티스 ( Bif . Adolescentis ), 비피도박테리움 수도롱검 (Bif. Pseudolongum ), 비피도박테리움 인판티스 ( Bif . Infantis ), 박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron ), 박테로이데스 불가투스 ( Bact . Vulgatus), 락토바실러스 액시도필러스 (Lactobacillus acidophilus), 엔테로코쿠스 페칼리스(Enterococcus faecalis ), 엔테로코쿠스 패시움 ( Ent . Faecium ), 에스케리치아 콜라이 ( Escherichia coli ), 클로스트리듐 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens), 클로스트리듐 부티리쿰 (Cl. Butyricum ), 클로스트리듐 이노쿰 (Cl. Innocuum), 클로스트리듐 비퍼르멘탄스 (Cl. Bifermentans ))을 포함하는 박테리아 군집을 구축하였다.
그러나, 여전히 위장 장애의 예방 또는 치료를 위해 효과적으로 사용될 수 있는 박테리아 종의 대안적이고 및 특이적인 혼합물을 만드는 것이 필요하다. 더욱이, 동일 박테리아 종의 느슨하게 집합된 혼합물 및 미리 적응되지 않은 혼합물을 투여하는 경우와 비교할 때, 사전 적응된(pre-adapted) 혼합물이 치료적으로 기능할지, 더 나쁠지 또는 더 좋을지에 대해서는 전혀 알려진 바가 없다.
본 발명은 우선 바람직하게는 위장 장애와 관련된 증상을 예방 또는 치료하기 위한 용도로 페칼리박테리움 프라우스니치이(Faecalibacterium prausnitzii), 부티리시코커스 풀리케이코럼(Butyricicoccus pullicaecorum), 로세브리아 이누리니보란스(Roseburia inulinivorans), 로세브리아 호미니스(Roseburia hominis), 아커만시아 무시니필라(Akkermansia muciniphila), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 언에어로스티페스 카캐(Anaerostipes caccae) 종에 속하는 박테리아로 필수적으로 이루어진 조성물에 관한 것이다.
즉, 상기 본 발명은 위장 장애와 관련된 증상을 예방 또는 치료하기 위하여 이를 필요로 하는 대상에게 페칼리박테리움 프라우스니치이(Faecalibacterium prausnitzii), 부티리시코커스 풀리케이코럼(Butyricicoccus pullicaecorum), 로세브리아 이누리니보란스(Roseburia inulinivorans), 로세브리아 호미니스(Roseburia hominis), 아커만시아 무시니필라(Akkermansia muciniphila), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 언에어로스티페스 카캐(Anaerostipes caccae) 종에 속하는 박테리아로 필수적으로 이루어진 조성물을 치료적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)으로 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 위장 장애가 내장 장벽 기능의 파괴, 설사, 변비, 과민성 대장 증후군, 염증성 장 질환, 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염, 셀리악 병(coeliac disease), 맹낭염(pouchitis), 점막염(mucositis), 내장 감염, 장 내 미생물총 불균형(gut microbiota dysbiosis) 및 이들의 조합인 전술한 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 위장 장애가 다음을 통해 예방 또는 치료되는 것인, 전술한 조성물에 관한 것이다: a) 장관 내에서 하나 또는 제한된 수의 유익한 박테리아의 성장 및/또는 활성을 자극, b) 장관 내에서 하나 또는 제한된 수의 병원성 박테리아의 성장 및/또는 활성을 억제, c) 소화관 표면의 점막에 비병원성 박테리아의 부착을 상대적으로 증가, d) 장의 항원, 전-염증성(pro-inflammatory), 박테리아 또는 박테리아 산물의 조절되지 않은 흡수 감소, e) 장 표면에서 항-염증성(anti-inflammatory) 활성 제공, f) 장벽 기능 증가, g) 박테리아 대사산물 생산 또는 h) a) 내지 g)의 어떠한 조합.
본 발명은 또한 상기 로세브리아 호미니스(Roseburia hominis) 종에 속하는 박테리아가 상기 조성물로부터 제거된 전술한 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 조성물에 에스케리치아 콜라이 ( Escherichia coli), 엔테로코쿠스 패시움(Ent . Faecium), 락토바실러스 뮤코세(Lactobacillus mucosae), 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium Adolescentis), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron) 및 박테로이데스 불가투스(Bacteroides Vulgatus) 종에 속하는 박테리아가 첨가된 전술한 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하나 또는 그 이상의 프리바이오틱스를 더 포함하는 전술한 조성물에 관한 것이다.
바람직한 실시 양태에서, 본 발명은 상기 박테리아가 상기 위장 장애의 예방 또는 치료를 위해 상기 조성물을 투여하기 전 발효조에서 함께 성장하는 것인 전술한 조성물에 관한 것이다.
이와 관련하여, 본 발명은 또한 상기 발효조가 위장관의 동적 시뮬레이터(dynamic simulator)인 전술한 조성물에 관한 것이다.
더욱 상세하게는 본 발명은 상기 박테리아가 다음의 균주 목록으로부터 선택된 것인 전술한 조성물에 관한 것이다: 페칼리박테리움 프라우스니치이 LMG P-29362, 페칼리박테리움 프라우스니치이 DSMZ 17677, 부티리시코커스 풀리케이코럼 LMG P-29360, 부티리시코커스 풀리케이코럼 LMG24109, 로세브리아 이누리니보란스 LMG P-29365, 로세브리아 이누리니보란스 DSMZ 16841, 로세브리아 호미니스 LMG P-29364, 로세브리아 호미니스 DSMZ 16839, 아커만시아 무시니필라 LMG P-29361, 아커만시아 무시니필라 DSMZ 22959, 락토바실러스 플란타룸 LMG P-29366, 락토바실러스 플란타룸 ZJ316, 언에어로스티페스 카캐 LMG P-29359, 언에어로스티페스 카캐 DSMZ 14662 및/또는 상기 균주들 중 적어도 하나의 16SrRNA 서열과 적어도 97%의 서열 상동성을 보이는 균주.
본 발명은 또한 상기 조성물은 직장투여 형태(rectally administrated form) 또는 경구섭취 가능한 형태(orally ingestible form)로 제형화된 약학적 조성물인 전술한 조성물에 관한 것이다.
이와 관련하여, 본 발명은 또한 상기 경구섭취 가능한 형태가 캡슐, 마이크로캡슐, 정제, 과립, 분말, 트로키(troche), 알약(pill), 현탁액 또는 시럽인 전술한 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 식품, 음료, 식품 보조제 또는 뉴트라슈티컬에 함유되는 전술한 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 보다 상세하게는 상기 조성물이 105 내지 1011 콜로니 형성 단위(colony forming units)의 박테리아를 포함하는 전술한 조성물에 관한 것이다.
도 1: 위, 소장 및 3개의 다른 결장 부위로 이루어진 SHIME® 유닛(unit)의 도식적 표현. 액체 SHIME® 영양 배지(nutritional medium) 및 췌장액(pancreatic juice)은 각각 위 및 소장을 시뮬레이션한 구획들(compartments)로 들어간다. 이 멸균된 구획들에서 정의된 체류시간(residence time)이 지나면, 부유액(suspension)은 각각 특정 pH 및 체류시간으로 특징지어진 3개의 연속된 결장 구획, 상행(Ascending), 횡행(Transverse), 하행(Descending)으로 이동한다. 이 구획들은 인간 대변 미생물총(human fecal microbiota)으로 접종되어 있다. 모든 용기(vessel)는 헤드스페이스(headspace)를 N2로 플러싱(flushing)하여 혐기성 조건이 유지되었으며, 지속적으로 교반되었고, 37℃에서 보관되었다.
도 2: 24시간 배양 동안 23개의 서로 다른 조성물에 의한 부틸산(butyrate) 생산(상단) 및 THP1 세포 존재 하에 배양된 Caco-2 세포의 트랜스-상피 전기 저항(transepithelial electrical resistance, TEER)에 미치는 영향(하단). 후자의 경우, 24시간 후 23개의 배양물로부터 수집된 샘플들은 멸균 여과되고 반투막 인서트에서 14일 동안 성장시킨 Caco-2 세포의 첨부에 24시간 동안 첨가되었고(1:5 v/v), PMA로 자극된 THP1-유래 대식세포(공배양) 위에 위치시켰다. 성장배지 단독(DMEM)을 대조군으로 사용하였다. DMEM 대조군의 TEER 감소로 측정된 바와 같이, 48시간 동안 PMA 존재 하에서 배양된 THP1 세포들은 Caco-2 세포 손상을 유도하였다. TEER 값은 공배양 전(0 h)에 측정된 값으로 표준화되었으며 초기 값에서 백분율로 표현되었다. 서로 다른 조성물의 부호는 다음과 같다: MX-Y, 여기서 X = 조성물 내 존재하는 분리균주의 수 및 Y = X 분리균주와 함께 A, B, C, 등의 특이한 조성.
도 3: 7종의 완전 조성물 또는 각 경우에서 기존 7종 중 하나가 생략된 6종의 조성물에 의한 조건화된 SHIME® 영양 배지에서의 24시간 및 48시간 배양 동안 부틸산 생산. 결과는 7종 모두로 이루어진 조성물에 대한 6종의 조성물의 각 배양물에서 검출된 부틸산 생산 백분율로 표시되었다. 조성물은 “Total”(7종 모두) 또는 “Total-X”(X는 전체 조성물에서 생략된 종)로 표시하였다. *: 24시간에서 “Total”과 비교하여 p<0.05; #: 48시간에서 “Total”과 비교하여 p<0.05.
도 4: 조건화된 SHIME® 영양 배지에서의 5일 간의 혐기성 배양 동안 조성물에 의해 생산된 부틸산, 프로피온산(propionate) 및 아세트산(Acetate)의 양(mM). 상기 조성물은 “어셈블리(Assembly)” 전략(좌측) 또는 “콜라보럼(Collaborome)” 전략(우측)에 의해 제조되었다.
도 5: “콜라보럼” 전략에 따른 조성물의 3개의 독립된 생산 사이클에서 14일 동안의 프로피온산(좌측) 및 부틸산(우측) 양(mM)의 변화. 적절한 배양 배지에서 초기 성장하고, 상기 조성물의 균주는 pH 6.15-6.4에서 단일 결장 부위로 이루어진 SHIME® 셋업(setup)에서 14일 동안 세 차례 혼합, 접종 및 배양되었다.
도 6: 대안적 “콜라보럼” 전략에 따른 조성물 제조 시, 아세트산, 프로피온산 및 부틸산의 몰%로 표현된 시간 경과에 따른 SCFA 양의 변화. 적절한 배양 배지에서 초기 성장하고, 상기 조성물의 균주는 유가 배치(fed-batch) 모드로 작동하는 단일 발효조에서 8일 동안 세 차례 혼합, 접종 및 배양되었다. 16시간의 특정 인터벌(inverval)에서, 성장 배지의 40%(v:v)를 조건화된 SHIME® 영양 배지로 교체하였다.
도 7: (ⅰ) 무균 기본 배지(sterile basal medium)(맨 위) 또는 (ⅱ) SHIME 대장 부위에서 유래된 미생물총(중간) 또는 (ⅲ) 대변 미생물총(맨 아래)이 보충된 무균 배지로 24시간 배양 동안 아세트산, 프로피온산, 부틸산 및 총 짧은-사슬 지방산(short-chain fatty acids, SCFA) 생산량(mM). “콜라보럼” 전략에 따라 제조된 조성물을 총 배양물 부피의 0% 내지 4% 및 20%로 다르게 처리하여 적용하였다.
도 8: M-SHIME®의 항생제 회복 실험(antibiotic recovery experiment)에서 아세트산(맨 위), 프로피온산(중간) 및 부틸산(맨 아래) 양(mM)의 변화. 항생제 칵테일(아목시실린(amoxicillin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 테트라시클린(tetracycline) 각각 40/40/10mg/L)의 투여를 통한 M-SHIME®-유래 결장 미생물총의 장내세균불균형에 대해서, 장내세균불균형이 일어난 미생물총을 “어셈블리” 전략 또는 “콜라보럼” 전략에 따라 제조된 상기 조성물로 5일 동안 처리하였다(day 1 = 상기 조성물 투여 시작일). 결과는 각 시점에서 SHIME의 SCFA 수준과 항생제 투여 전 값의 델타로 표현하였다.
도 9: M-SHIME®의 IBD-관련 장내세균불균형 회복 실험에서 아세트산(맨 위), 프로피온산(중간) 및 부틸산(맨 아래)의 양(mM). 3개의 독립적인 SHIME® 결장 용기는 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 환자의 배설물(fecal material)로 접종하였다. 동시에, “어셈블리” 전략 또는 “콜라보럼” 전략에 따라 제조된 상기 조성물의 단일 용량을 각각의 SHIME 결장 용기에 첨가하였다. 대조 실험으로서 상기 조성물의 투여 없이 세번째 실험을 병행하였다. 상기 조성물의 투여 1일 및 2일 후 아세트산, 프로피온산 및 부틸산이 생산되었다.
도 10: C57/BL6 마우스의 항생제 회복 실험에서 아세트산, 프로피온산, 부틸산 양(몰%)의 변화. 마우스에 표준 식이를 먹이는 대조 기간 후, 5일 동안 식수에 클린다마이신(clindamycin, 250mg/L)을 첨가함에 따라 장 내 미생물총 불균형이 유도되었다. 그 후, 마우스(n=10/그룹)에게 경구로 식염수(박테리아의 개입이 없는 대조군; 좌측), “콜라보럼” 전략에 따라 제조된 조성물(중간) 또는 “콜라보럼” 전략에 따라 제조된 확장된 조성물(우측) 중 한 가지를 5일 동안 강제 급여(위관 영양)하였다. 동일한 개입군(intervention group)에서 수득한 마우스 대변 샘플을 모으고, 아세트산, 프로피온산 및 부틸산의 양을 정량화하였다.
도 11: C57/BL6 마우스의 TNBS-유도된 대장염 실험에서 질병활성도(Disease Activity Index, DAI)의 변화 및 체중 변화. 마우스에 표준 식이를 먹이는 1주간의 순화 기간(acclimatization period) 후, 실험을 시작하였다. 각 그룹(n=9/그룹)은 경구 위관 영양법으로 5일 연속 처리되었다. 모든 처리의 예방 투여는 TNBS/50% EtOH 2mg을 직장 투여하기 하루 전에 시작하였고, TNBS 투여 이후 4일간 유지하여 마우스를 희생시켰다. 다음의 처리가 포함되었다: TNBS + 식염수 용액(비히클 TNBS 대조군); TNBS + “어셈블리” 전략에 따라 제조된 조성물 및 TNBS + “콜라보럼” 전략에 따라 제조된 조성물. 기존 그룹(TNBS 처리 없이 식염수 용액으로만 처리)은 비히클 대조군으로 포함되었다.
도 12: C57/BL6 마우스의 DSS-유도된 만성 대장염 실험에서 질병활성도의 변화. 마우스에 표준 식이를 먹이는 1주간의 순화 기간(acclimatization period) 후, 실험을 시작하였다. 각 그룹(n=9/그룹)은 경구 위관 영양법으로 8주 연속, 주당 3회 처리되었다. 모든 처리의 예방 투여는 첫번째 DSS 사이클이 시작되기 1주 전 시작하였다. 첫번째 DSS 사이클은 2주차에 시작되었으며, 2주간의 회복 기간이 뒤따르는 1주간의 DSS 투여(식수에 0.25%)를 포함하였다. 첫번째 사이클에는 이와 동일한 두번째 사이클이 이어졌다. 세번째 DSS 사이클은 1주간의 회복 기간이 뒤따르는 1주간의 DSS 투여로 이루어지고, 그 후 동물들은 희생되었다. 다음의 처리가 포함되었다: DSS + 식염수 용액(비히클 DSS 대조군); DSS + “콜라보럼” 전략에 따라 제조된 조성물. 기존 그룹(DSS 처리 없이 식염수 용액으로만 처리)은 비히클 대조군으로 포함되었다.
장 내 미생물군집(gut microbiome)은 서로 다른 개체 내에서 공존하며 서로 간에 및 숙주와 상호작용하는 수백 종의 미생물을 포함한다. 오늘날, 장 내 미생물군집이 대사 기능 및 면역 항상성(immune homeostasis) 조절을 통해 인간의 건강 및 질병에 핵심적인 역할을 한다는 것은 잘 알려져있다(Cenit et al, 2014). 몇몇 연구에서 “핵심 미생물군집(core microbiome)”을 정의하려는 시도로서 이와 같은 복잡한 장 미생물 군집(gut microbial communities)을 연구해왔으며, 이는 모든 인간 개체들이 건강한 장 내 미생물군집의 기능적 능력을 정의하는 필수적인 종(species) 또는 균주(strains)의 핵심 개수를 공유함을 의미한다(Kinross et al., 2011). 이 개념(즉, 모든 인간에는 핵심 미생물군집이 살고 있다), 장 내 미생물총의 조성물 및 기능에 대해 사용가능한 광범위한 문헌(예를 들어, 핵심 종(keystone species), 점액질(mucous) vs. 내강(luminal) 미생물총, 상부(proximal) vs. 말단(distal) 결장 박테리아, 등) 및 기능적 유전체 분석에 기반하여, 복잡한 인간 장 내 미생물군집의 주요 기능성을 다루는 미생물 후보자의 목록을 밝힐 수 있다.
본 발명은 우선 특정하고 놀라운 효과를 갖는 인간 장 내 미생물군집 박테리아 종의 하위 그룹(subgroup)에서 특정하게 선택된 것에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 위장 장애와 관련된 증상을 예방 또는 치료하기 위한 용도로 페칼리박테리움 프라우스니치이(Faecalibacterium prausnitzii), 부티리시코커스 풀리케이코럼(Butyricicoccus pullicaecorum), 로세브리아 이누리니보란스(Roseburia inulinivorans), 로세브리아 호미니스(Roseburia hominis), 아커만시아 무시니필라(Akkermansia muciniphila), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 언에어로스티페스 카캐(Anaerostipes caccae) 종에 속하는 박테리아로 필수적으로 이루어진 조성물에 관한 것이다. 용어 '필수적으로 이루어진(consisting essentially of)'은 상기 조성물이 상기 조성물의 효과(즉, 위장 장애와 관련된 증상을 예방 또는 치료)에 부정적인 영향을 끼치지 않는다면 다른 박테리아 종 및/또는 다른 성분을 포함할 수 있음을 의미한다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 조성물은 페칼리박테리움 프라우스니치이, 부티리시코커스 풀리케이코럼, 로세브리아 이누리니보란스, 로세브리아 호미니스, 아커만시아 무시니필라, 락토바실러스 플란타룸 및 언에어로스티페스 카캐 종에 속하는 박테리아를 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 본 발명의 조성물은 페칼리박테리움 프라우스니치이, 부티리시코커스 풀리케이코럼, 로세브리아 이누리니보란스, 로세브리아 호미니스, 아커만시아 무시니필라, 락토바실러스 플란타룸 및 언에어로스티페스 카캐 종에 속하는 박테리아로 이루어진다.
박테리아 종인 페칼리박테리움 프라우스니치이(Duncan et al. 2002), 부티리시코커스 풀리케이코럼(Eeckhaut et al. 2008), 로세브리아 이누리니보란스(Duncan et al. 2006), 로세브리아 호미니스(Duncan et al. 2006), 아커만시아 무시니필라(Derrien et al. 2004), 락토바실러스 플란타룸(Walter 2008) 및 언에어로스티페스 카캐(Schwiertz et al. 2002)는 당업자에게 잘 알려진 박테리아 종이다. 용어 '위장 장애와 관련된 증상'은 인간 및 동물의 건강 문제를 가리킨다. 본 발명의 조성물의 사용은 보다 상세하게는 박테리아 및 장 표면 간 상호작용의 양성 조절을 가져오는 장내세균불균형(dysbiosis)으로부터의 예방/회복으로 이어진다. 결과적으로, 장 표면의 개선된 기능이 얻어진다: 예를 들어, 장벽, 호르몬, 면역 기능. 장 표면에 대한 효과의 개시는 '동일 균주의 느슨하게 집합된(loosely assembled) 세트'와 비교하여 '사전 적응(pre-adapted)된 조성물'이 투여되었을 때 더 빨랐다(자세한 내용 참조). 본원에서 사용된 장 표면의 장벽, 호르몬 또는 면역 기능의 조절 또는 개선은 장 표면의 정상적인 항상성 특히 병원균, 항원 또는 다른 유해한 물질의 침입에 대응한 첫 번째 방어선에 대한 이의 역할 및 숙주에 전신적인 영향을 미치는 물질(예를 들어, 면역 분자, 호르몬)을 생산하는 역할에 영향을 미치는 모든 파라미터를 변경하는 것을 포함하는 의미이다. 상기 파라미터는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:
- 장관(intestinal tract) 내의 하나 또는 제한된 수의 유익한 박테리아의 성장 및/또는 활성을 자극(예를 들어, 락토바실리, 비피도박테리아, 부틸산- 또는 프로피온산- 생산 박테리아, 기타);
- 장관(intestinal tract) 내의 하나 또는 제한된 수의 병원성 박테리아의 성장 및/또는 활성을 억제;
- 소화관 표면의 점막에 비병원성 박테리아 부착의 상대적 증가;
- 장의 항원, 전-염증성(pro-inflammatory), 박테리아 또는 박테리아 산물의 조절되지 않은 흡수 감소;
- 장-연관 림프조직(gut-associated lymphoid tissue, GALT) 및 숙주 전신 면역계의 조절;
- 특정 박테리아 대사산물(예를 들어, 프로피온산, 부틸산)의 생산; 및
- 직접 또는 간접적으로 대사 항상성을 조절하는 특정 장 내 신호 분자(예를들어, 프로-글루카곤(pro-glucagon), GLP-1, GLP-2, FIAF) 생산 조절.
본 발명은 따라서 상기 위장 장애가 다음을 통해 예방 또는 치료되는 것인, 전술한 조성물에 관한 것이다: a) 장관 내에서 하나 또는 제한된 수의 유익한 박테리아의 성장 및/또는 활성을 자극, b) 장관 내에서 하나 또는 제한된 수의 병원성 박테리아의 성장 및/또는 활성을 억제, c) 소화관 표면의 점막에 비병원성 박테리아의 부착을 상대적으로 증가, d) 장의 항원, 전-염증성(pro-inflammatory), 박테리아 또는 박테리아 산물의 조절되지 않은 흡수 감소, e) 장 표면에서 항-염증성(anti-inflammatory) 활성 제공, f) 장벽 기능 증가, g) 박테리아 대사산물 생산 또는 h) a) 내지 g)의 어떠한 조합.
일반적인 위장 장애와 연관된 건강 상태는 다음을 포함하지만 -이에 제한되지 않는다-: 변비(constipation), 과민성 대장 증후군(Irritable Bowel Syndrome, IBS), 염증성 장 질환(Inflammatory Bowel Diseases, IBD), 장 내 미생물총 불균형(gut microbiota dysbiosis), 점막염(mucositis), 대사 증후군(metabolic syndrome), 비만(obesity), 당뇨(diabetes), 심혈관 질환(a cardiovascular disease), 만성 피로 증후군(chronic fatigue syndrome), 정신 질환(a mental condition), 인지 기능 장애(impaired cognitive function), 신경퇴행성 질환(a neurodegenerative disease), 암의 한 형태, 자가면역 상태, 면역 기능 손상, 류머티즘(rheumatism), 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 여성 생식 기관의 염증, 병원균에 의한 감염(박테리아, 바이러스 및 곰팡이). 신경퇴행성 질환의 예는 ALS, 치매(dementia), 알츠하이머(Alzheimer's), 파킨슨(Parkinson's) 및 헌팅턴(Huntington's) 병을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 암의 유형의 예는 폐암(lung cancer), 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 췌장암(pancreatic cancer) 및 특히 대장암(colorectal cancer)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 자가면역 질환의 예는 다발성 경화증(multiple sclerosis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 셀리악 병(celiac disease), 건선(psoriasis) 및 루푸스(lupus)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 본 발명의 조성물이 장 상피의 점막층에 대한 비병원성 박테리아의 상호작용 및/또는 활성을 증진시킨다는 관찰에 기반하여, 상기 제제는 예를 들어 장의 항원, 전-염증성(pro-inflammatory) 분자, 병원성 박테리아 또는 박테리아 산물의 조절되지 않은 흡수의 예방 또는 감소와 같은 장 표면 장벽 기능 개선에 특히 유용할 것으로 예상된다. 점막 장벽(mucosal barrier)이 손상된 그러한 징후 중 하나는 염증성 장 질환이다. 염증성 장 질환에서, 병변의 손상된 관해 해상도를 동반한 점막 손상은 이와 같은 만성 징후로 이끄는 중요한 요소 중 하나이며, 본 발명의 조성물은, 상기 징후에 이로운 효과를 가진다. 따라서 본 발명의 목적은, 손상된 장벽 기능과 관련되고 장의 항원, 전-염증성 분자, 병원성 박테리아 또는 박테리아 산물의 조절되지 않은 흡수로 특징지어지는 증상의 예방 및 치료에 대한 본 발명의 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본원에서 사용된 “만성 결장 질환(chronic colonic diseases)”이라고도 불리는 “염증성 장 질환”은, 예를 들어 염증성 장 증후군, 점막염, 위궤양(gastric ulcers), 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 대장암 및 맹낭염(pouchitis)과 같은 위장관의 서로 다른 수준에서의 지속적인 점막 염증으로 특징지어지는 모든 증상을 포함한다.
점막염은 일반적으로 구강 및 위장관의 점막 표면 내벽(mucosal surface lining)의 염증으로서 본질적으로 특징지어지고, 보통 화학요법 및 방사선 요법 또는 줄기세포 이식(stem cell transplantation)의 부작용으로 일반적으로 인식되므로, 본 발명의 조성물의 적용은 또한 상기 징후에 이로운 효과를 가진다고 예상된다. 따라서 본 발명의 목적은, 점막염과 관련된 증상의 예방 및 치료에 대한 본 발명의 조성물의 용도를 제공하는 것이다. 점막염은 위장관을 따라 어디에서나 발생할 수 있다. 구강 내에서 발생하는 경우, 일반적으로 구강 점막염(oral mucositis)이라 한다. 또한 본 발명의 조성물의 적용은 알러지 반응(allergic reactions)을 일으키는 항원의 침입에 대한 보호를 제공하며, 상기 알레르겐(allergen)은 특정 식품 물질, 화학 물질 및 다른 분자를 포함할 수 있다. 따라서 추가적인 실시 양태에서, 본 발명은 알러지 반응(예를 들어, 식품 알러지, 천식(asthma), 습진(eczema))을 유발하는 항원의 침입과 관련된 증상의 예방 또는 치료에 대한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명의 조성물은 장-연관 림프조직(GALT)뿐만 아니라 전신 면역 체계 모두에 영향을 미치는 것으로 예상된다. 다른 효과들 중에서도 이는 전-염증성 사이토카인의 발현 감소 및 면역조절 인자의 생산 증가 및 림프구(lymphocytes) 활성 개선을 가져올 수 있다. 그러므로 상기 조성물은 숙주 면역 체계의 발달 및 기능 개선에 특히 유용하다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 조성물이 상피 장벽을 조절하고 그에 따라 만성 염증을 감소시킨다는 관찰에 기반하여, 상기 조성물은 대사 항상성을 조절 및 증진시키는 데 특히 유용하다고 예상된다. 대사 항상성에 대한 상기 제제의 비-제한적 효과는 음식 섭취의 조절 및 지방 및 글루코스 대사, 인슐린 분비 및 민감성 개선 및 콜레스테롤 합성 및 대사 조절을 포함한다. 따라서 본 발명의 목적은, 음식 섭취 조절, 포만감의 유도, 체중 조절, 비만 및 제2형 당뇨와 같은 손상된 대사 항상성과 관련된 증상의 예방 또는 치료에 대한 본 발명의 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 조성물이 심혈관계 질환(CVD)의 몇몇 확립된 인과적 위험 인자를 감소시킨다는 관찰에 기반하여, 본 발명의 또 다른 측면에서 상기 조성물은 특히 CVD의 예방에 유용하다고 예상된다. CVD는 엄밀히 말하면 심혈관계에 영향을 주는 모든 질병을 지칭하나, 주로 동맥 경화증(atherosclerosis)과 관련한 질병을 지칭하는데 사용된다. 후자는 대동맥 혈관에 영향을 주는 증후군으로, 주로 대식세포 백혈구의 축적에 기인하고 저밀도의 지방단백질(lipoprotein)에 의해 촉진되는 대동맥 벽의 만성 염증 반응이다. CVD의 발달은 다단계의 메커니즘에 의존하며 명백한 인과적 위험 인자가 확인되었다. 이 인자들은 높은 LDL 콜레스테롤, 혈장 트리글리세라이드(triglycerides), 대사성 질환(비만, 당뇨, ...), 만성 염증 및 산화적 스트레스를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특히 후자의 두 인자가 가장 중요하다. 동맥 경화증은 산화적 스트레스 상황에서 자유 라디칼, 특히 산소 유리 라디칼(oxygen free radicals)에 의해 산화되는 LDL(LDL-ox)로부터 발달한다. 만성 염증의 경우에서, LDL-ox에 의해 야기된 손상에 대한 면역계의 과도한 반응은 상기 질병의 확장을 촉진시킨다. 따라서 본 발명의 목적은, CVD의 예방 또는 치료에 대한 본 발명의 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
추가적인 실시 양태에서, 점막층에 대한 정상 미생물총의 부착에 대한 본 발명의 조성물의 이로운 효과를 고려해볼 때, 상기 조성물의 적용은 점막 부착 및 병원균에 의한 침입에 대한 보호를 제공한다고 예상된다. 병원균의 예로는 탄저균(Bacillus anthracis); 바실루스 세레우스(Bacillus cereus); 백일해균(Bordetella pertussis); 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi); 브루셀라 아보투스(Brucella abortus); 브루셀라 캐니스(Brucella canis); 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis); 브루셀라 수이스(Brucella suis); 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni); 폐렴 클라미디아(Chlamydia pneumonia); 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis); 클라미디아 시타시(Chlamydophila psittaci); 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum); 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile); 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens); 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani); 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria); 장독소성대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC); 장관병원성 대장균(Enteropathogenic E. coli); E. coli O157:H7; 프랜시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis); 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza); 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori); 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila); 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans); 리스테리아 모노키토게네스(Listeria monocytogenes); 마이코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae); 결핵균(Mycobacterium tuberculosis); 폐렴 마이코플라즈마(Mycoplasma pneumonia); 임균(Neisseria gonorrhoeae); 수막구균(Neisseria meningitides); 녹농균(Pseudomonas aeruginosa); 리케차 리케차(Rickettsia rickettsia); 살모넬라 타이피(Salmonella typhi); 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium); 시겔라 소네이(Shigella sonnei); 황색포도상구균(Staphylococcus aureus); 표피포도구균(Staphylococcus epidermidis); 스타필로코커스 사프로파이티커스(Staphylococcus saprophyticus); B군연쇄상구균(Streptococcus agalactiae); 폐렴 연쇄상구균(Streptococcus pneumonia); 화농성 연쇄상구균(Streptococcus pyogenes); 매독균(Treponema pallidum); 비브리오 콜레라(Vibrio cholera); 페스트균(Yersinia pestis); 칸디다 spp.(Candida spp .); 노로바이러스(Norovirus)(Norwalk Virus); A형 간염(Hepatitis A); 천연두(smallpox), 인플루엔자, 유행성이하선염(mumps), 홍역(measles), 수두(chickenpox), 에볼라(ebola), 및 풍진(rubella)을 유발하는 바이러스가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 따라서 추가적인 실시 양태에서, 본 발명은 점막 부착 및 병원균의 침입과 관련된 증상의 예방 또는 치료; 특히 후천성 설사(acquired diarrhea) 및 여행자 설사증(traveller's diarrhea)의 예방 또는 치료에 대한 본 발명의 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 따라서 위장 장애와 관련된 증상을 예방 또는 치료하기 위하여 이를 필요로 하는 대상에게 페칼리박테리움 프라우스니치이(Faecalibacterium prausnitzii), 부티리시코커스 풀리케이코럼(Butyricicoccus pullicaecorum), 로세브리아 이누리니보란스(Roseburia inulinivorans), 로세브리아 호미니스(Roseburia hominis), 아커만시아 무시니필라(Akkermansia muciniphila), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 언에어로스티페스 카캐(Anaerostipes caccae) 종에 속하는 박테리아로 필수적으로 이루어진 조성물을 치료적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)으로 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
용어 '필요로 하는 대상(subject in need)'은 인간 또는 비-인간 동물을 가리킨다.
용어 '치료적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)'은 예방 또는 치료 효과를 발휘할 수 있는 7가지 박테리아 종의 혼합된 총 양의 최소값을 가리킨다. 7가지 박테리아 종은 다음에 나열하였다: 페칼리박테리움 프라우스니치이, 부티리시코커스 풀리케이코럼, 로세브리아 이누리니보란스, 로세브리아 호미니스, 아커만시아 무시니필라, 락토바실러스 플란타룸 및 언에어로스티페스 카캐.
그러나, “치료적으로 유효한 양”은 또한 다음의 6가지 박테리아 종의 혼합된 총 양의 최소값을 의미하는 것일 수 있다: 페칼리박테리움 프라우스니치이, 부티리시코커스 풀리케이코럼, 로세브리아 이누리니보란스, 아커만시아 무시니필라, 락토바실러스 플란타룸 및 언에어로스티페스 카캐.
최종 용도에 따라, 상기 혼합된 총 양은 각각의 7가지 박테리아 종의 동일한 양 또는 7가지 박테리아 종의 동일하지 않은 양의 결과일 수 있으며, 여기서 7가지 박테리아 종의 각 단독 종은 혼합된 총 양의 0.0001%의 최소 함량, 보다 바람직하게는 혼합된 총 양의 0.001%의 최소 함량 및 가장 바람직하게는 혼합된 총 양의 0.01%의 최소 함량을 가진다. 따라서 만약 -예를 들어- 6가지 종이 혼합된 총 양의 10.00%의 최소 함량을 가지는 경우, 일곱 번째 종은 혼합된 총 양의 40.00% 함량을 가진다. 최종 용도에 따라, 상기 혼합된 총 양은 박테리아 세포 102 내지 1014개의 일일 투여량 사이의 범위이며, 바람직하게는 박테리아 세포 103 내지 1013개의 일일 투여량 사이의 범위이며, 보다 바람직하게는 박테리아 세포 104 내지 1012개의 일일 투여량 사이의 범위이며 가장 바람직하게는 박테리아 세포 105 내지 1011개의 일일 투여량 사이의 범위이다. 본 발명은 또한 상기 로세브리아 호미니스(Roseburia hominis) 종에 속하는 박테리아가 상기 조성물로부터 제거된 전술한 조성물에 관한 것이다. 용어 '제거된(eliminated)'은 특히 실시예에서 자세히 나타낸 바와 같이 7번째 종으로서 로세브리아 호미니스 종의 첨가 또는 제거 없이 6가지 박테리아 종의 조성물을 만드는 것을 가리킨다.
본 발명은 또한 상기 조성물에 에스케리치아 콜라이 ( Escherichia coli), 엔테로코쿠스 패시움(Ent . Faecium), 락토바실러스 뮤코세(Lactobacillus mucosae), 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium Adolescentis), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron) 및 박테로이데스 불가투스(Bacteroides Vulgatus) 종에 속하는 박테리아가 첨가된 전술한 조성물에 관한 것이다.
박테리아 종인 에스케리치아 콜라이(Rath et al. 1999), 엔테로코쿠스 패시움 (Schleifer et al. 1984), 락토바실러스 뮤코세(Roos et al. 2000), 비피도박테리움 아돌레센티스(Scharek et al. 2000), 비피도박테리움 롱검(Bahaka et al. 1993), 박테로이데스 테타이오타오미크론(Scharek et al. 2000) 및 박테로이데스 불가투스(Rath et al. 1999) 는 당업자에게 잘 알려진 박테리아 종이다. 본 발명은 또한 하나 또는 그 이상의 프리바이오틱스를 더 포함하는 전술한 조성물에 관한 것이다.
용어 '프리바이오틱(prebiotic)'은 숙주의 웰빙에 기여하는 미생물(예를 들어, 박테리아)의 성장 또는 활성을 유도하는 모든 화학물질을 의미한다. 따라서, 프리바이오틱스는 장 내 미생물군집의 생물 구성에 영향을 주거나 이를 변경할 수 있다. 그러나, 원칙적으로 이는 신체의 다른 영역과도 관련이 있는 좀 더 일반적인 용어이다. 전형적인 -그러나 비-제한적인- 프리바이오틱스는 적어도 소화되지 않은 상태로 위장관 상부를 부분적으로 통과하며 기질인 것처럼 행동하여 대장에 정착한 유익한 박테리아의 성장 또는 활성을 자극하는 비-소화성 섬유 화합물이다.
바람직한 실시 양태에서, 본 발명은 상기 박테리아가 상기 위장 장애의 예방 또는 치료를 위해 상기 조성물을 투여하기 전 발효조에서 함께 성장하는 것인 전술한 조성물에 관한 것이다. 후자의 구성은 “콜라보럼 전략(Collaborome strategy)” 또는 “대안적 콜라보럼 전략(Alternative collaborome strategy)”으로도 지칭된다(자세한 내용 참조). 반면, 투여 전 상기 박테리아가 발효조에서 함께 성장하지 않은 조성물은 “어셈블리 전략(Assembly strategy)”라고 지칭된다(자세한 내용 참조).
이러한 관점에서, 본 발명은 또한 상기 발효조가 위장관의 동적 시뮬레이터(dynamic simulator)인 전술한 조성물에 관한 것이다. 이 특정한 경우에도, 후자의 구성은 “콜라보럼 전략”으로 불린다(자세한 내용 참조).
SHIME®(Simulator of the Human Microbial Ecosystem)은 총 72시간의 체류 시간으로 위, 소장 및 3개의 결장 부위(상행(Ascending), 횡행(Transverse), 및 하행(Descending) 결장)를 시뮬레이션하는 다섯 개의 이중 외피(double-jacketed) 용기(Vessel)로 구성된 인간 위장관의 동적 시험관(in vitro) 모델이다(도 1). 하루에 3회, 140mL의 SHIME® 피드(feed) 및 60mL의 췌장액을 각각 위 및 소장 구획에 첨가하였다(Van den Abbeele et al., 2010). 초기 2주 간의 안정화 기간 -미생물총이 부과된 in vitro 조건에 적응되도록 하는- 후에 분리 절차가 시작되었다. 본 발명의 선택된 미생물 균주는 따라서 위장관을 대표하는 표준화된 조건 하에 단일 단계(대안적 콜라보럼 전략) 또는 다단계 반응조 또는 위장관의 동적 시뮬레이터(예를 들어, SHIME® 또는 M-SHIME®, 콜라보럼 전략)에 접종될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본원에서 정의되고 하기에 추가적으로 나열되는 6개 또는 7개 또는 최대 14개 종에 속하는 박테리아로 필수적으로 이루어진 조성물을 포함하는 반응조에 관한 것이다:
- 페칼리박테리움 프라우스니치이, 부티리시코커스 풀리케이코럼, 로세브리아 이누리니보란스, 로세브리아 호미니스, 아커만시아 무시니필라, 락토바실러스 플란타룸 및 언에어로스티페스 카캐 종에 속하는 박테리아를 포함하는, 이루어진 또는 필수적으로 이루어진 조성물을 포함 또는
- 페칼리박테리움 프라우스니치이, 부티리시코커스 풀리케이코럼, 로세브리아 이누리니보란스, 아커만시아 무시니필라, 락토바실러스 플란타룸 및 언에어로스티페스 카캐 종에 속하는 박테리아를 포함하는, 이루어진 또는 필수적으로 이루어진 조성물을 포함 또는
- 페칼리박테리움 프라우스니치이, 부티리시코커스 풀리케이코럼, 로세브리아 이누리니보란스, 로세브리아 호미니스, 아커만시아 무시니필라, 락토바실러스 플란타룸, 언에어로스티페스 카캐 , 에스케리치아 콜라이 , 엔테로코쿠스 패시움, 락토바실러스 뮤코세, 비피도박테리움 아돌레센티스, 비피도박테리움 롱검, 박테로이데스 테타이오타오미크론 및 박테로이데스 불가투스 종에 속하는 박테리아를 포함하는, 이루어진 또는 필수적으로 이루어진 조성물을 포함
바람직한 실시 양태에서, 상기 조성물을 포함하는 반응조는 하기에 정의된 위장관을 대표하는 표준화된 조건 하에 있다.
상기 표준화된 조건을 특징 짓는 파라미터는 pH(1.5 내지 8 사이의 범위); 탄소 자원(탄수화물 또는 단백질 또는 이들의 조합)의 이용 가능성; 특정 반응조에서의 체류시간(retention time)(10분 내지 200시간의 범위); 산소 이용가능성(0 내지 8g/L의 범위); 미량영양소(micronutrients)의 이용가능성; 항생제의 존재/부존재; 담즙산 염(bile salts)의 농도(0 내지 20mM의 범위); 중금속의 존재; 면역 분자로서의 숙주 인자(host factor)의 존재. 바람직한 실시 양태에서, 표준화된 조건을 특징 짓는 상기 파라미터는 pH, 특정 반응조에서의 체류시간 및 담즙산 염(bile salts) 농도를 포함하며, 모두 앞서 본원에서 정의된 바와 같다. 콜라보럼의 복잡성에 따라, 기능적으로 안정한 콜라보럼을 얻기 위해서는 1 내지 15일이 필요하다. 평균적으로, 7 내지 14 멤버로 구성된 콜라보럼을 만들기 위해서는 기능적으로 안정한 콜라보럼을 얻기 위해 3 내지 10일이면 충분하다(환경 조건에 따라). 따라서 본원에 정의된 조성물은 pH, 특정 반응조에서의 체류시간 및 담즙산 염의 농도가 본원에 정의된 바와 같이 설정된 조건 하에서 3 내지 10일의 시간 동안 훈련 또는 배양된 후에 얻어질 수 있다. 이러한 공정은 기능적으로 안정한 조성물 또는 콜라보럼의 생산을 허용한다.
본 발명의 맥락에서, “기능적으로 안정한 콜라보럼(a functionally stable collaborome)”은 본원에서 정의된 조성물로서 적어도 3 또는 5 또는 10일 간의 배양 후에도 초기의 서로 다른 수의 박테리아 종을 여전히 포함한다.
추가적인 측면에서, 다음을 포함하는 위장관을 대표하는 표준화된 조건 하에서 작동하는 반응조가 제공된다: 1.5 내지 8의 pH 범위; 탄소 자원의 이용 가능성; 10분 내지 200시간의 체류시간(retention time); 0 내지 8g/L의 산소 이용가능성; 미량영양소(micronutrients)의 이용가능성; 항생제의 존재/부존재; 0 내지 20mM 농도의 담즙산 염(bile salts); 중금속의 존재; 면역 분자로서의 숙주 인자(host factor)의 존재. 일 실시 양태에서, 상기 반응조는 상기 표준화된 조건을 특징 짓는 파라미터로 pH, 특정 반응조에서의 체류 시간 및 담즙산 염 농도를 이전 문단에서 정의된 바와 같이 포함하는 것이다. 일 실시 양태에서, 이러한 반응조는 5 내지 20개의 상이한 박테리아 멤버, 바람직하게는 5 내지 15개의 상이한 박테리아 멤버를 포함한다. 바람직한 실시 양태에서, 이러한 조성물은 기능적으로 안정한 콜라보럼(collaborome)을 얻기 위해 이러한 반응기에서 3 내지 14일 또는 3 내지 10일간 체류한다.
본 발명은 보다 상세하게는 인간 및 동물의 건강 문제를 예방 또는 치료하고 동일 균주의 느슨하게 집합된(loosely assembled) 세트(= "어셈블리 전략")와 비교하여 보다 빠른 생물요법치료(biotherapeutic) 개시 및 높은 효율을 얻기 위해 특정한 기능적 특성을 가지고 동시에 기능하도록 사전-적응된 조성물 및 미생물 균주 세트의 용도에 관한 것이다. 이와 같이 동시에 기능하도록 사전-적응된 미생물 세트는 '콜라보럼 전략' 또는 '대안적 콜라보럼 전략'의 명칭을 갖는다.
즉, 본 발명은 바람직하게는 동일 균주의 느슨하게 집합된(loosely assembled) 세트와 비교하여 생물요법치료 개시 시간을 현저히 감소시키고 및/또는 장내세균불균형 치료 효과를 현저히 증가시키는 용도로서의 미생물 균주 세트의 사전-적응된 조성물에 관한 것이다.
용어 '생물요법치료 개시 시간을 현저히 감소(significantly decrease the time of biotherapeutic onset)'는, 사전-적응됨으로써, 미생물 세트가 동일 균주의 느슨하게 집합된(loosely assembled) 세트와 비교하여 이들의 기능성을 적어도 5% 빠르게(시간 척도 상에서), 바람직하게는 적어도 10% 빠르게, 보다 바람직하게는 20% 빠르게 및 가장 바람직하게는 적어도 30% 빠르게 발휘하는 것을 의미한다. 5% 미만의 값은 생리학적으로 관련 없는 것으로 간주되었다.
용어 '치료 효과를 현저히 증가(significantly increase the effect of treatment)'는, 사전-적응됨으로써, 미생물 세트가 이들의 기능성을 적어도 5% 높은 효능, 바람직하게는 적어도 10% 더 효율적으로, 보다 바람직하게는 20% 및 가장 바람직하게는 적어도 30% 더 효율적으로 발휘하는 것을 의미한다. 상기 효능은 미생물 세트가 설계된 종점(endpoint)에 의존한다. 가능한 기능성으로는 짧은-사슬 지방산(Short Chain Fatty Acid, SCFA) 생산; 장벽 투과성 개선; 전-염증성 사이토카인의 감소/증가; 항-염증성 사이토카인의 증가; 병원균 농도의 감소(적어도 0.5 log); 가스 생산의 감소; 특정 장벽 수용체의 자극; 등… 5% 미만의 값은 생리학적으로 관련 없는 것으로 간주되었다.
따라서, 본 발명은 보다 상세하게는 이를 필요로 하는 인간 및 동물의 장내세균불균형을 예방 또는 치료하기 위하여 치료적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)의 사전-적응된 미생물 균주 세트 조성물을 상기 인간 또는 동물에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것으로 상기 치료는 동일 균주의 느슨하게 집합된(loosely assembled) 세트와 비교하여 보다 빠른 생물요법치료(biotherapeutic) 개시 및/또는 높은 효율을 가져온다.
보다 상세하게는 본 발명은 상기 박테리아가 다음의 균주 목록에서 선택되는전술한 조성물에 관한 것이다: 페칼리박테리움 프라우스니치이 LMG P-29362, 페칼리박테리움 프라우스니치이 DSMZ 17677, 부티리시코커스 풀리케이코럼 LMG P-29360, 부티리시코커스 풀리케이코럼 LMG24109, 로세브리아 이누리니보란스 LMG P-29365, 로세브리아 이누리니보란스 DSMZ 16841, 로세브리아 호미니스 LMG P-29364, 로세브리아 호미니스 DSMZ 16839, 아커만시아 무시니필라 LMG P-29361, 아커만시아 무시니필라 DSMZ 22959, 락토바실러스 플란타룸 LMG P-29366, 락토바실러스 플란타룸 ZJ316, 언에어로스티페스 카캐 LMG P-29359, 언에어로스티페스 카캐 DSMZ 14662 및/또는 상기 균주들 중 적어도 하나의 16SrRNA 서열과 적어도 97%의 서열 상동성을 보이는 균주.
LMG P-29362, LMG P-29360, LMG P-29365, LMG P-29364, LMG P-29361, LMG P-29366 및 LMG P-29359의 접근번호(accession number)를 갖는 상기 나타낸 균주들은 BCCM/LMG Laboratorium voor Microbiologie, Universiteit Gent (UGent), K. L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent, Belgium. 에 기탁되었다.
DSMZ 17677, LMG24109, DSMZ 16841, DSMZ 16839, DSMZ 22959, ZJ316 및 DSMZ 14662의 접근번호를 갖는 상기 나타낸 균주들은 공개된 미생물 자원센터에 기탁된 것으로, 많이 기술되어 있으며 당업자에게 전 세계적으로 접근가능하다.
상기 상응하는 균주 각각의 16S rRNA 서열과 적어도 97%(즉, 97, 98, 99%)의 서열 상동성을 나타내는 상기 균주 각각의 변이체 또한 본 발명의 일부인 것이 명백하다. 이러한 서열 “상동성(homology)”을 결정하는 예는 예를 들어 Eeckhaut et al. (2008)에 기술되어 있다. 본원에서 사용된 용어 “16S rRNA”는 작은 원핵생물 리보솜 소단위체(small prokaryotic ribosomal subunit)(30S)의 구성성분인 약 1542 뉴클레오티드의 핵산 서열을 가리킨다. 상기 16S rRNA는 리보솜 단백질의 위치를 정의하는 스캐폴드(scaffoled)로 작용한다는 것이 알려져 있다. 상기 16S rRNA 서열은 고도로 보존된 서열로 알려져 있기 때문에, 일반적으로 계통 발생 연구에 사용된다. 수천가지 생물체들의 16S rRNA 서열 비교분석은 올리고뉴클레오티드 시그니처 서열의 존재를 입증하였다. 본원에서 사용된 용어 “상동성”은 핵산의 서열 유사성을 가리킨다. 예를들어, 일반적으로, 만일 두 핵산이 동일한 서열을 가지고 있다면 이들은 100% 상동성을 나타낸다. 핵산 중 하나의 뉴클레오티드 서열 변화는 상동성의 백분율을 감소시킨다. 일반적으로, 상동성의 백분율은 두 핵산 문장 사이의 동일성 정도를 정량화한다.
서열 동일성 또는 서열 상동성은 본원에서 서열들의 비교에 따라 결정되는 두 개 또는 그 이상의 아미노산(폴리펩티드 또는 단백질) 서열 또는 두 개 또는 그 이상의 핵산(폴리뉴클레오티드) 서열 간의 관계로 정의된다. 보통, 서열 상동성 또는 유사성은 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 비교된다. 당 분야에서, “동일성(identity)”은 또한 아미노산 또는 핵산 서열 간의 서열 관련성의 정도를 의미하며, 경우에 따라, 이러한 서열들의 스트링(string) 간의 매칭(match)에 의해 결정된다. 두 개의 아미노산 서열 간의 “유사성(similarity)”은 하나의 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 이의 보존된 아미노산 치환물(substitute)을 두 번째 폴리펩티드의 서열과 비교하여 결정된다. “동일성” 및 “유사성”은 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 쉽게 계산될 수 있다. 바람직한 실시 양태에서, 서열 동일성은 본원에서 확인된 서열의 전체 길이를 비교함으로써 결정된다.
동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 시험되는 서열들 간의 가장 큰 매치(match)를 제공하도록 설계되었다. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공개적으로 사용 가능한 컴퓨터 프로그램에 성문화되었다. 두 서열 간의 동일성 및 유사성을 결정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 예를 들어, BestFit, BLASTP, BLASTN, 및 FASTA(Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), NCBI 및 다른 출처로부터 공개적으로 사용 가능한 것(BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894)을 포함한다. 사용되는 가장 바람직한 알고리즘은 EMBOSS (http://www.ebi.ac.uk/emboss/align)이다. EMBOSS를 이용한 아미노산 서열 비교를 위한 바람직한 파라미터는 gap open 10.0, gap extend 0.5, Blosum 62 matrix이다. EMBOSS를 이용한 핵산 서열 비교를 위한 바람직한 파라미터는 gap open 10.0, gap extend 0.5, DNA full matrix (DNA identity matrix)이다.
선택적으로, 아미노산 유사성의 정도를 결정하는 데 있어, 당업자는 소위 “보존적(conservative)” 아미노산 치환을 고려할 수 있으며, 이는 당업자에게 명백하다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄(side chain)를 가지고 있는 잔기(residues)의 상호교환가능성을 가리킨다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 아이소류신이다; 지방족-하이드록시 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 세린 및 쓰레오닌이다; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 아스파라진 및 글루타민이다; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판이다; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 라이신, 아르지닌, 및 히스티딘이다; 및 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹은: 발린-류신-아이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르지닌, 알라닌-발린, 및 아스파라진-글루타민이다. 본원에 개시된 아미노산 서열 치환 변이체는 개시된 서열에서 적어도 하나의 잔기가 제거되고 그 자리에 다른 잔기가 삽입된 것이다. 바람직하게는, 상기 아미노산 변화는 보존적이다. 자연적으로 발생하는 각 아미노산의 바람직한 보존적 치환은 다음과 같다: Ala에서 ser; Arg에서 lys; Asn에서 gln 또는 his; Asp에서 glu; Cys에서 ser 또는 ala; Gln에서 asn; Glu에서 asp; Gly에서 pro; His에서 asn 또는 gln; Ile에서 leu 또는 val; Leu에서 ile 또는 val; Lys에서 arg; gln 또는 glu; Met에서 leu 또는 ile; Phe에서 met, leu 또는 tyr; Ser에서 thr; Thr에서 ser; Trp에서 tyr; Tyr에서 trp 또는 phe; 및, Val에서 ile 또는 leu.
16S rRNA 서열이 온라인으로, 예를 들어 GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)에 등록될 수 있고 예를 들어 Eeckhaut et al. (2008)에 기술된 바와 같이, 서열 상동성을 평가하는 데 있어 16S rRNA 서열을 참조로서 사용하기 위해 고유한 접근 번호에 기초하여 이들을 검색할 수 있다는 것은 당 분야의 숙련된 기술자에게 잘 알려져 있다. 본 조성물의 7가지 박테리아 종에 대한 16S rRNA 서열의 GenBank 접근번호를 하기에 나열하였다. 이 접근 번호들은 서열 상동성 평가를 위하여 각각의 16S rRNA 서열들을 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/에서 검색하기 위해 사용될 수 있다.
종 균주 GenBank 접근 번호(accession number)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)
로세브리아 호미니스 DSMZ 16839 AJ270482.2 (서열번호 1)
로세브리아 이누리니보란스 DSMZ 16841 AJ270473.3 (서열번호 2)
아커만시아 무시니필라 DSMZ 22959 AY271254.1 (서열번호 3)
언에어로스티페스 카캐 DSMZ 14662 AJ270487.2 (서열번호 4)
페칼리박테리움 프라우스니치이 DSMZ 17677 AJ270469.2 (서열번호 5)
락토바실러스 플란타룸 ZJ316 JN126052.1 (서열번호 6)
부티리시코커스 풀리케이코럼 LMG 24109 HH793440.1 (서열번호 7)
또한 본 발명은 상기 조성물이 직장투여 형태(rectally administrated form) 또는 경구섭취 가능한 형태(orally ingestible form)로 제형화된 약학적 조성물인 전술한 조성물에 관한 것이다. 이러한 관점에서, 본 발명은 또한 상기 경구섭취 가능한 형태는 캡슐, 마이크로캡슐, 정제, 과립, 분말, 트로키(troche), 알약(pill), 현탁액 또는 시럽인 전술한 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 식품, 음료, 식품 보조제 또는 뉴트라슈티컬에 함유되는 전술한 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 따라서 인간, 인간이 아닌 가축 또는 농장 육상 동물 또는 수상 동물을 위한 식품, 식품 보조제 또는 약제로서 사용되는 전술한 조성물에 관한 것이다. 본 조성물은 따라서 식품, 기능성 식품, 식품 보조제, 화장품, 뉴트라슈티컬 제형, 프로바이오틱 조성물 또는 약에 도입될 수 있다. 식품은 일반적으로 주로 하나 또는 그 이상의 주요영양소 단백질, 탄수화물 및 지방으로 구성된 먹을 수 있는 물질이다. 식품은 또한 하나 또는 그 이상의 비타민 또는 미네랄과 같은 미량영양소(micronutrients)를 함유할 수 있다. 또한 본원에서 사용된 용어 식품은 음료수를 포함한다. 본 조성물이 함유될 수 있는 식품의 예는 스낵 바, 시리얼, 빵(buns), 머핀, 비스킷, 케이크, 패스트리(pastries), 가공 야채, 사탕, 요거트, 음료, 식물성 오일-기반 액체, 동물성 지방-기반 액체, 냉동 과자 및 치즈를 포함하는 프로바이오틱 제형을 포함한다. 바람직한 식품은 요거트, 치즈 및 다른 유제품을 포함한다. 음료의 예는 음료수(soft beverages), 시럽, 과즙(squashes), 건식 음료 믹스 및 영양 음료를 포함한다. 뉴트라슈티컬은 질병의 예방 또는 치료를 포함하는 의학적 또는 건강상의 이익을 제공하는 것으로 여겨지는 식품 원료, 식품 보조제 또는 식품이다. 기능적 식품은 일반적으로 소비자에게 순수한 영양을 공급하는 것 이상의 건강상의 이익을 제공하는 것으로 판매되는 식품이다.
본 발명은 또한 본원에서 논의된 조성물을 포함하는 프로바이오틱을 제공한다. 프로바이오틱은 일반적으로 장 미생물총을 증진시킬 수 있는 살아있는 보충물이다. 이러한 프로바이오틱스는 특히 인간에게 제공될 수 있지만 농장 및 가축 동물 및 수생 생물에게도 제공될 수 있다. 상기 프로바이오틱은 추가적으로 인간 또는 동물의 섭취에 적합한 하나 또는 그 이상의 허용 가능한 부형제 또는 향료를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 다양한 형태, 예를 들어 정제, 캡슐 또는 분말 형태일 수 있다. 이러한 조성물에 존재할 수 있는 부형제의 예는 희석제(예를 들어, 전분, 셀룰로오스 유도체 또는 당 유도체), 안정화제(예를 들어, 실리카 또는 말토덱스트린과 같은 흡습성 부형제), 윤활제(예를 들어, 마그네슘 스테아레이트), 완충제(예를 들어, 인산 버퍼), 결합제, 코팅제, 방부제 또는 현탁제를 포함한다. 적합한 부형제는 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명은 보다 상세하게는 상기 조성물이 105 내지 1011 콜로니 형성 단위(colony forming units)의 박테리아를 포함하는 전술한 조성물에 관한 것이다.
본 명세서 및 그 청구항에 있어서, 동사 “포함하는(to comprise)” 및 이의 활용은 비-한정적인 의미로 사용되며 그 뒤에 나오는 항목들이 포함되지만, 구체적으로 언급되지 않은 항목들이 제외되는 것은 아니다. 또한, “이루어진(to consist)”은 “필수적으로 이루어진(to consist essentially of)”으로 대체될 수 있는데 이는 본원에 정의된 조성물이 구체적으로 확인된 것 이외의 추가적인 구성성분(들)을 포함할 수 있고, 상기 추가적인 구성성분(들)은 본 발명의 고유한 특성을 변화시키지 않음을 의미한다. 또한, 요소(element)의 부정관사 “a” 또는 “an”에 의한 참조는 문맥 상 하나 및 요소들 중 오직 하나만이 존재하기를 명백하게 요구하는 경우가 아니라면, 하나 이상의 요소가 존재할 수 있는 가능성을 제외시키지 않는다. 상기 부정관사 “a” 또는 “an”은 따라서 일반적으로 “적어도 하나”를 의미한다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 문헌은 그 전체로서 본원에 참고로 인용되어 있다. 하기 실시예는 단지 예시적인 목적을 위하여 제공되는 것이며, 본 발명의 목적을 어떤 식으로든 제한하려는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. 본 발명에 따른 조성물의 확립
1.1 조성물을 위한 박테리아의 분리
SHIME® 모델을 접종하기 위해 이전에 항생제 치료를 받은 적 없는 젊고, 건강한 공여자가 선택되었다. SHIME® 모델(도 1, Van den Abbeele et al., 2010)의 몇 가지 작동 파라미터를 조절함으로써, 식이섬유 발효, 담즙산 대사, 유당(lactose) 분해 등과 관련된 미생물총과 같이 인간 건강에 유익한 영향을 미치는 장 내 미생물총(gut microbiota)의 네트워크의 질을 높이고 선택할 수 있다. 섬유 분해자(degraders)(예를 들어, 비피도박테리아 , 박테로이데스), 발효성(fermentative)(예를 들어, 에스케리치아 콜라이) 또는 유당 생산자(lactate producers)(예를 들어, 락토바실리(Lactobacilli), 페디오코키(Pediococci) 및 엔테로코키(Enterococci)), 부틸산 생산자(butyrate producers)(예를 들어, 언에어로스티페스 카캐 , 부티리시코커스 풀리케이코럼 , 페칼리박테리움 프라우스니치이 , 로세브리아 호미니스 , 로세브리아 이누리니보란스 , 클로스트리듐 부티리쿰) 및 프로피온산 생산자(propionate producers)(예를 들어, 박테로이데스 테타이오타오미크론 , 박테로이데스 불가투스 , 로세브리아 이누리니보란스 , 아커만시아 무시니필라)와 같이 서로 다른 기능적 특성을 가진 박테리아 균주들을 분리하기 위해 SHIME® 셋업이 사용되었다. 이를 위해, LAMVAB(락토바실리; Hartemink et al 1997), RB(비피도박테리아; Hartemink et al. 1996), 엔테로코쿠스 배지(엔테로코키; Possemiers et al. 2004), TBX(에스케리치아 콜라이; Le Bon et al. 2010), BBE(박테로이데스 프라질리스 군(Bacteroides fragilis group); Livingston et al. 1978), 뮤신 최소 배지(Mucin minimal medium)(아커만시아; Derrien et al. 2004), M2GSC(부틸산 생산자; Barcenilla et al. 2000) 또는 유당-포함 최소 SHIME 배지(부틸산 생산자), 석신산(succinate)- 및 푸코스(fucose)- 포함 최소 SHIME 배지(프로피온산 생산자), 황산염(sulphate)-함유 최소 배지(황산염 환원제), 아라비노자일란(arabinoxylan)-함유 최소 SHIME 배지 및 혈액한천배지(Prevotella)와 같은 선택배지(selective media)가 선택되었다. SHIME 외에도, 박테리아는 동일한 전략을 사용하여 건강한 공여자로부터의 신선한 대변 샘플로부터 직접적으로 분리되었다.
실제로, SHIME의 결장 구획 또는 균질화된 대변 샘플으로부터 수집된 샘플의 10배 희석액을 제조하고 전술한 특정 배지 조성을 갖는 한천배지에 도말하였다. 배지들은 서로 다른 박테리아 군의 성장 조건을 고려하여 37℃에서 배양하였다. 배양 시, 박테리아 군 당 약 30개의 콜로니를 골라내어 적절한 조건 하에 각각의 액체 성장 배지에서 배양하였다. 하룻밤 배양된 배양액 내 짧은-사슬 지방산 농도는 Possemiers et al. (2004)에 기재된 가스 크로마토그래피를 사용하여 분석되었다. 또한, 액체 배양물의 샘플은 계통발생 분석에 사용되었다. DNA는 Possemiers et al. 2004에 기재된 바와 같이 추출되었으며 각 분리균주의 거의-모든 16S rRNA 서열은 세균 공통적인 프라이머(universal eubacterial primer) fD1 및 rD1(Weisburg et al. 1991)로 증폭되었다. 정제 시, 시퀀싱을 위해 DNA 샘플을 내보냈다. 수득한 서열들은 각 분리균주의 동정을 위해 BLAST 툴박스(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를 사용하여 기존 서열과 정렬(aligned)시켰다.
1.2 본 발명에 따른 조성물의 설계
서로 다른 박테리아 균주를 실제 기능적 미생물 네트워크로 혼합시키기 위SHIME® 반응조로부터 분리된 순수한 배양물 및 대변이 사용되었다(실시예 1.1에서 전술). 또한, 순수한 배양물은 BCCM/LMG(http://bccm.belspo.be) 및 DSMZ(www.dsmz.de)와 같은 미생물 자원센터에서 공급받았다.
짧은-사슬 지방산(short-chain fatty acids, SCFA)은 장 내 미생물총에 의한 식이 섬유 발효의 최종 산물이며 숙주 건강에 여러 가지 유익한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 생성된 주요 SCFA는 약 60:20:20 몰 비(molar ratio)의 아세트산, 부틸산 및 프로피온산이다. 아세트산은 장에서 흡수되어 숙주에 의해 에너지 기질로 사용될 수 있는 반면, 부틸산은 장 상피에서 에너지 기질로 작용하며 염증 및 결장암에 대한 보호 효과가 입증된 바 있다. 프로피온산은 부틸산과 비교하여 장에서의 유사한 국소 활성을 나타내지만, 간으로도 운반되어 긍정적인 콜레스테롤 감소 효과 및 혈당 조절에 효과를 갖는 것으로 나타났다.
SCFA의 중요하고 다양한 생리학적 역할을 고려하면, 이와 같은 장 내 미생물 기능의 파괴(예를 들어, 위장 장애에서)는 숙주 건강에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 이 실시예에서, 제일 높은 총 SCFA 생산 및 가장 흥미로운 상대적 SCFA 생산 비율을 유도할 수 있는 조성물을 설계하기 위해 스크리닝이 수행되었다. 후자의 경우, 생산된 서로 다른 SCFA 중 부틸산이 가장 흥미로운 것으로 간주되었다. 또한, 상피 및 면역 세포의 공배양(co-culture)을 통해 장벽의 견고함(integrity)에 대한 상이한 조성물의 효과를 평가하였다.
실제로, 실시예 1.1에서 전술한 분리 및 선택 단계에서 수득(“Isolate-X”로 표시)하거나 미생물 자원센터에서 주문한, 가장 흥미로운 발효 프로파일(profile)을 가진 총 20개의 분리 균주는 이의 글리세롤 스톡(stock)으로부터 회수되고 박테리아 균주의 균질현탁액을 수득하기 위하여 이들 각각의 최적 성장 조건에서 성장시켰다.
Ref. 종(Species) 균주 Ref. 종(Species) 균주
1 락토바실러스 플란타룸
(Lactobacillus plantarum) 		Isolate-1 11 페칼리박테리움 프라우스니치이 (Faecalibacterium prausnitzii) Isolate-11
2 클로스트리듐 볼티에
(Clostridium bolteae ) 		Isolate-2 12 로세브리아 이누리니보란스
( Roseburia inulinivorans) 		Isolate-12
3 디설포비브리오 디설퓨리칸스 ( Desulfovibrio desulfuricans) Isolate-3 13 루미노코커스 spp.(Ruminococcus spp .) Isolate-13
4 아커만시아 무시니필라(Akkermansia muciniphila) Isolate-4 14 락토바실러스 액시도필러스 (Lacobacillus acidophilus) Isolate-14
5 코프로코커스 spp.(Coprococcus spp .) Isolate-5 15 엔테로코쿠스 패시움(Enterococcus faecium ) Isolate-15
6 로세브리아 호미니스(Roseburia hominis ) Isolate-6 16 부티리비브리오 피브리솔벤스 (Butyrivibrio fibrisolvens) Isolate-16
7 박테로이데스 테타이오타오미크론 (Bacteroides thetaiotaomicron) Isolate-7 17 유박테리움 리모섬(Eubacterium limosum ) DSM20543
8 클로스트리듐 부티리쿰(Clostridium butyricum) Isolate-8 18 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli ) Nissle 1917
9 언에어로스티페스 카캐(Anaerostipes caccae ) Isolate-9 19 유박테리움 렉탈(Eubacterium rectale ) DSM17629
10 비피도박테리움 아돌레센티스 (Bifidobacterium adolescentis) Isolate-10 20 부티리시코커스 풀리케이코럼 (Butyricicoccus pullicaecorum) Isolate-17
98개의 개별 초기 스크리닝 실험 세트에서 분리균주들을 2 내지 10 범위의 숫자로 혼합시켰다. 각 실험에서, 발효는 KH2PO4/K2HPO4로 pH가 조절되고 질소로 플러시(flush)한 멸균된 SHIME® 영양 배지가 들어있는 무균 배양 병(sterile incubation bottles)에서 시작하였다. 그 다음, 멸균된 배지에 동일 부피의 선택된 종(species)으로 이루어진 10%(v/v)의 혼합 접종원(inoculum)을 접종하였다. 배양 병은 질소로 플러싱하여 혐기성 조건을 확실히 하였고 37℃에서 배양하였다(90rpm). 24시간 후, SCFA 생산에 대하여 샘플들을 분석하였다. 가장 높은 부틸산 생산량을 갖는 조성물을 선택하여 23개의 서로 다른 박테리아 세트와 함께 최종 실험에 사용하였다(MX-Y로 표시, 여기서 X = 조성물 내 존재하는 분리균주의 수 및 Y = X 분리균주와 함께 A, B, C, 등의 특이한 조성).
식별 번호 조성물 식별 번호
M2-A 10,12 M7-B 1,4,6,9,11,12,20
M3-A 1,9,11 M7-C 6,7,13,14,16,17,20
M4-A 1,5,10,11 M8-A 4,5,6,9,10,11,13,17
M4-B 8,10,11,17 M8-B 4,6,7,8,11,14,16,18
M4-C 9,10,11,13 M8-C 1,4,8,11,12,15,17,20
M5-A 5,8,10,13,18 M9-A 3,6,7,11,13,14,15,17,20
M5-B 6,9,10,11,18 M9-B 3,4,6,7,14,15,16,18,20
M6-A 5,6,9,10,12,14 M9-C 2,3,5,6,7,8,12,14,20
M6-B 2,4,8,11,13,19 M10-A 1,3,4,7,8,9,10,12,14,15
M6-C 1,4,9,11,12,17 M10-B 3,4,5,7,8,9,12,14,15,16,19
M6-D 1,6,11,13,16,20 M10-C 2,4,6,8,10,11,12,13,16,18
M7-A 1,3,6,9,12,16,20
이들 23가지 조합을 전술한 바와 같이 다시 배양하였다. 24시간 후, Possemiers et al. (2013)에 기재된 바와 같이 SCFA 분석 및 Caco-2와 THP1 세포의 공배양 모델을 위한 조합을 위해 샘플들을 수집하였다. 후자의 실험의 종점(endpoint)은 장벽 기능의 보호 효과를 측정하기 위한 트랜스-상피 전기 저항(Trans-Epithelial Electrical Resistance, TEER)으로 하였다.도 2는 23가지 서로 다른 조성물의 24시간의 배양 동안 얻어진 부틸산 양 및 이의 TEER 값에 대한 영향을 나타낸다. 부틸산 양과 장벽 기능에 대한 효과 모두에서 큰 차이가 관찰되었으며, 서로 다른 순위로 나타난 것처럼 가장 높은 부틸산의 양을 나타낸 조합이라고 하여 반드시 TEER 값에서 가장 높은 보호 효과를 유도하지는 않았다. 놀랍게도, 7개의 서로 다른 분리균주의 한 조성물(도 2에서 M7-B로 표시)이 24시간 후의 부틸산 양 및 특히 장벽 기능에 대한 보호 효과에서 모두 1위를 차지했다. 이 조성물에는 SHIME으로부터의 6개의 분리균주 및 인간 대변 샘플에서 수득한 하나의 배양물이 들어있다. 16S rRNA 유전자 시퀀싱 및 NCBI BLAST 데이터베이스와의 서열 비교를 통해 M7-B가 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum ), 페칼리박테리움 프라우스니치이 ( Faecalibacterium prausnitzii ), 로세브리아 이누리니보란스 (Roseburia inulinivorans ), 로세브리아 호미니스 ( Roseburia hominis ), 아커만시아 무시니필라 ( Akkermansia muciniphila ) 및 언에어로스티페스 카캐(Anaerostipes caccae)의 신규한 SHIME 분리균주 및 부티리시코커스 풀리케이코럼 ( Butyricicoccus pullicaecorum)의 신규 대변 분리균주로 구성되어 있음이 밝혀졌다. 흥미롭게도, 상기 신규 분리균주는 모두 도 2에 나타난 다른 조성물들 중 적어도 하나에 존재하지만, 다른 조성물들 중 어느 것도 부틸산 생산 및 TEER 값의 보호 면에서 동일한 효과에 이르지 못했다. 이것은 상기 관찰된 효과가 조성물에 존재하는 특정 종 하나에 관련된 것이 아니라, 7가지 박테리아의 특정 조합만이 상기 놀라운 긍정적 효과를 가져온다는 것을 보여준다.
7개의 신규 분리균주는 다음의 접근번호(accession number)로 BCCM/LMG 균주은행(Ghent Belgium)에 기탁하였다: 페칼리박테리움 프라우스니치이 LMG P-29362, 부티리시코커스 풀리케이코럼 LMG P-29360, 로세브리아 이누리니보란스 LMG P-29365, 로세브리아 호미니스 LMG P-29364, 아커만시아 무시니필라 LMG P-29361, 락토바실러스 플란타룸 LMG P-29366 및 언에어로스티페스 카캐 LMG P-29359.
상기 7개 분리균주와 각각의 종의 존재의 필요성 간의 놀라운 시너지 효과에 대한 추가적인 실험적 증거로서, 매 회 기존 7개 분리균주로 된 조성물에서 하나의 분리균주를 제거하는 실험을 설계하였다. 실제로, 발효는 KH2PO4/K2HPO4로 pH 6.8로 조절되고 질소로 플러시(flush)한 멸균된 SHIME® 영양 배지가 들어있는 무균 배양 병(sterile incubation bottles)에서 다시 시작하였다. 그 다음, 멸균된 배지에 7개 분리균주 중 6개 분리균주의 동일 부피로 이루어진 10%(v/v)의 혼합 접종원(inoculum)을 접종하였다. 7개 분리균주의 완전 조성물을 대조군으로 하여, 총 8개의 동시 배양이 되었다. 배양 병은 질소로 플러싱하여 혐기성 조건을 확실히 하였고 37℃에서 배양하였다(90rpm). 24시간 및 48시간 후, 부틸산 생산에 대하여 샘플들을 분석하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 기존 조성물에서 하나의 종만을 제거한 경우 6종의 조성물 모두에 대하여 24시간 후 부틸산 생산량이 기존 조성물의 80% 이하로 현저히 감소하였다. 또한 배양 48시간 후, 부틸산 양이 로세브리아 호미니스를 제외한 조성물 외 6종의 조성물 모두에 대하여 현저히 감소하였다. 이는 조성물의 최대 잠재력에 도달하기 위해서는 모든 분리균주가 필수적임을 확실히 한다. 로세브리아 호미니스를 제외한 조성물만이 여전히 완전 조성물과 유사한 기능을 나타냈으므로, 페칼리박테리움 프라우스니치이 ( Faecalibacterium prausnitzii ), 부티리시코커스 풀리케이코럼 ( Butyricicoccus pullicaecorum ), 로세브리아 이누리니보란스 (Roseburia inulinivorans ), 아커만시아 무시니필라 ( Akkermansia muciniphila), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum ) 및 언에어로스티페스 카캐(Anaerostipes caccae)로 이루어진 6종 조성물의 사용이 두 번째로 가장 좋음을 예상할 수 있다.
1.3 본 발명에 따른 조성물의 제조
락토바실러스 플란타룸 , 페칼리박테리움 프라우스니치이 , 부티리시코커스 풀리케이코럼 , 로세브리아 이누리니보란스 , 로세브리아 호미니스 , 아커만시아 무시니필라 및 언에어로스티페스 카캐로 이루어진 조성물은 3가지 서로 다른 전략에 의해 제조되었다. 이 전략은 1) 조성물의 종들을 따로 성장시키고, 함께 혼합, 2) 조성물의 종들을 다단계 발효조(즉, 전술한 in vitro SHIME® 모델)에서 함께 성장시킴 및 3) 조성물의 종들을 단일 단계 발효조에서 함께 성장시킴을 포함한다.
첫번째 전략(= "어셈블리(assembly)" 전략)에서, 상기 선택된 종들은 이의 글리세롤 스톡(stock)으로부터 회수되고 박테리아 균주의 균질현탁액을 수득하기 위하여 이들 각각의 최적 성장 조건에서 성장시켰다. 이들의 기능적 활성을 평가하기 위하여, 선택된 종들의 동일 부피로 이루어진 혼합 접종원을 제조하였다. 이 접종원을 10%(v/v)로 KH2PO4/K2HPO4로 pH가 6.8로 조절된 멸균된 SHIME® 영양 배지가 들어있는 무균 배지 병에 첨가하였다. 배양 병은 질소로 플러싱하여 혐기성 조건을 확실히 하였고 37℃에서 배양하였다(90rpm). 16시간의 특정 인터벌(inverval)에서, 성장 배지의 40%(v:v)를 조건화된 SHIME® 영양 배지로 교체하였다. 조건화된 SHIME® 영양 배지는 일반 SHIME® 피드(feed)(pH2) 700mL를 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 25g/L NaHCO3, 23.6 g/L KH2PO4 및 4.7 g/L K2HPO4로 보충된 췌장액(pancreatic juice)(pH 6.8) 300mL를 첨가하여 제조되었다. 샘플들은 5일의 기간 동안 SCFA 생산에 대하여 분석되었다(도 4). 부틸산 양은 어셈블리(assembly)의 24시간 배양 시 7mM에 도달하였고, 5일 후 최대 14mM에 도달하였다.
두 번째 전략(즉, “ 콜라보럼 ( Collaborome )” 전략 또는 “상기 박테리아가 투여 전 위장관의 동적 시뮬레이터(dynamic simulator)에서 함께 성장하는” 전략)에서, 선택된 종들은 이의 글리세롤 스톡으로부터 회수되고 박테리아 균주의 균질현탁액을 수득하기 위하여 이들 각각의 최적 성장 조건에서 성장시켰다. 그 다음, pH 6.15-6.4에서 단일 결장 부위로 이루어진 SHIME® 셋업(Van den Abbeele et al., 2010)에서 상기 균주들을 세 차례(triplicate) 혼합 및 접종하였다. 기능적 콜라보럼 조성물을 제조하기 위하여 2주 간의 적응 기간이 시행되었다. 이와 같은 적응 기간의 필요 및 관련성은 선택된 종의 조성물을 배양하는 동안의 SCFA 프로파일의 변화에 의해 분명히 입증되었다(도 5). 초기에, 상기 조성물은 서로 적응하고 공급된 기질을 SCFA로 변환시킴에 있어서 활성화되기 위한 시간이 필요하다. 그러나, 접종 4일 내지 6일 후, 상기 조성물의 SCFA 생산이 안정화되기 시작하고 높은 부틸산 생산량이 측정되었다. 배양 마지막 날(day 14)에는 세 차례의 배양 각각에서 19mM에 달하는 부틸산 생산량을 가진 매우 유사하고, 안정한 강력한 활성의 기능적 조성물이 생성되었다.
안정화된 콜라보럼을 글리세롤 스톡으로 -80℃에서 동결시키고 이어서 어셈블리 전략과 동일한 방식으로 접종원으로 사용하기 위하여 해동시켰을 때, 부틸산 양은 -놀랍게도- 개별 종의 어셈블리와 동일한 배양 조건에서 빠르게 증가하고 25% 더 높은 양에 도달했다(도 4). 부틸산 양은 어셈블리의 24시간 배양 시 이미 12mM에 도달하였고 2일 후 이미 최대 19mM에 도달하였다.
세 번째 전략에서, 상기 조성물의 제조는 유가 배치(fed-batch) 모드로 작동하는 최적화된 단일 단계 발효조 접근법(즉, 대안적 “ 콜라보럼 ( Collaborome )” 전략 또는 “상기 박테리아가 투여 전 '하나의' 발효조에서 함께 성장하는” 전략)을 사용하여 시행되었다. 선택된 종들은 이의 글리세롤 스톡으로부터 회수되고 박테리아 균주의 균질현탁액을 수득하기 위하여 이들 각각의 최적 성장 조건에서 성장시켰다. 발효는 KH2PO4/K2HPO4로 pH 6.8로 조절되고 질소로 플러시(flush)한 멸균된 SHIME® 피드가 들어있는 무균 배양 병에서 시작되었다. 그 다음 멸균된 배지에 선택된 종들의 동일 부피로 이루어진 혼합 접종원 10%(v/v)을 접종하였다. 배양 병은 질소로 플러싱하여 혐기성 조건을 확실히 하였고 37℃에서 배양하였다(90rpm). 16시간의 특정 인터벌(inverval)에서, 성장 배지의 40%(v:v)를 조건화된 SHIME® 영양 배지로 교체하였다. 조건화된 SHIME® 영양 배지는 일반 SHIME® 피드(feed)(pH2) 700mL를 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 25g/L NaHCO3, 23.6 g/L KH2PO4 및 4.7 g/L K2HPO4로 보충된 췌장액(pancreatic juice)(pH 6.8) 300mL를 첨가하여 제조되었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 총 SCFA 생산량 및 조성물에 의해 생산된 SCFA의 비율은 6번의 교체 사이클 이후 안정했다. 전술한 바와 같이 동일한 전략으로 재-접종했을 때, 안정화된 콜라보럼은 어셈블리 전략에서의 동일한 종 세트와 비교하여 2일 먼저 최대화된 SCFA 생산량(아세트산/프로피온산/부틸산 비율은 약 14/12/74였다) 및 25% 더 높은 부틸산 생산으로 이끌었다.
실시예 2: 시험관 내( In vitro ) 실험
2.1 복잡한 미생물 장 군집(community)에 기능적 조성물 첨가에 따른 효과
이 실험은 기능적 조성물이 500 내지 1000 미생물 종으로 이루어져 있는 것으로 추정되는 복잡한 장 군집 구성원들 사이의 결장 기질(colonic substrates)에 대한 치열한 경쟁이 있는 혼합 미생물 장 군집(community)에 접종되었을 때 활성인 것을 입증한다. 이 문제를 다루기 위해, 락토바실러스 플란타룸 , 페칼리박테리움 프라우스니치이, 부티리시코커스 풀리케이코럼 , 로세브리아 이누리니보란스 , 로세브리아 호미니스 , 아커만시아 무시니필라 및 언에어로스티페스 카캐가 들어 있고 실시예 1.3의 콜라보럼 전략을 통해 제조된 상기 조성물을 이용하여 작은 배양 병에서 실험을 수행하였다. 점점 증가하는 농도(0, 4, 20%)의 사전 적응된(pre-adapted) 조성물을 PBS로 세척하고 3개의 서로 다른 배지에 첨가하였다:
1) 무균 기본 배지(sterile basal medium) [2g/L 펩톤(pepton), 2g/L 효모 추출물(yeast extract), 2mL/L Tween 80, 10μL/L, 비타민 K1, 500mg/L L-시스틴(cysteine) HCl, 100mg/L NaCl, 40mg/L K2HPO4, 40mg/L KH2PO4, 10 mg/L MgSO4·7H2O, 6,7mg/L CaCl2 ·2H2O, 1,5mg/L 레사주린(resazurin), 50mg/L 헤민(hemin) (50 mg/L) - pH 5.5] + 전분(starch) 6g/L
2) 기본 배지(basal medium) + 20% 대변 혼합물(slurry) (De Boever et al., 2000 에 기재된 바와 같이 제조)
3) 기본 배지(basal medium) + 완전한 미생물총이 들어 있는 20% SHIME® 결장 부유액(colon suspension)
0% 내지 4% 및 20%의 점점 증가하는 농도의 사전 적응된 부틸산 생산 컨소시엄(consortium)은 절대적인 부틸산 양의 비례적인 증가 결과를 보였다(도 7). 이는 멸균 배지에서뿐만 아니라, 대변 샘플 또는 SHIME® 결장 부위 모두에서 유래한 혼합 미생물총으로 보충된 배지에서도 관찰되었다. 이 실험은 따라서 조성물이 비-경쟁적인 결장 환경에 존재할 때만 활성인 것이 아니라, 많은 장 미생물들이 동일한 영양소에 대하여 경쟁하는 혼합 미생물총에 투여되었을 때에도 더 높은 부틸산 양을 야기함을 입증한다. 게다가, 부틸산 생산량이 증가하였을 뿐만 아니라, 프로피온산 생산량도 크게 증가하였다. 배양에서의 이와 같은 아세트산의 증가 및 감소의 조합은 상기 조성물이 일반적인 미생물 발효 프로파일을 더욱 건강에 유익한 프로파일로 조절할 수 있음을 명시한다.
2.2 항생제-유도된 불균형한( dysbiosed ) 미생물 장 군집의 대사 기능을 회복하기 위한 기능적 조성물의 효율
항생제의 사용은 장 미생물총 군집의 주요한 파괴를 야기한다고 알려져 있다. 불균형한 미생물 조성물은 병원균에 의한 감염에 더욱 취약하다는 것이 밝혀졌다. 더욱이, 염증성 장 질환과 같은 많은 위장 질환들이 불균형한 미생물 조성물과 관련이 있어, 건강한 장 내 미생물군집(gut microbiome)의 중요성을 강조한다. 장기간의 항생제 섭취 후 분류상의 조성물(taxonomic composition) 및 특히 기능성의 회복은 건강한 장 미생물 군집인 전-처리(pre-treatment) 상태에 도달하는데 보통 3개월이 걸린다(Panda et al., 2014). 항생제 처리 후 회복 시간의 감소는 따라서 심각한 감염에 대한 위험을 낮추고 전반적인 숙주 건강을 향상시킬 수 있다. 이러한 관점에서, 선택된 조성물의 관찰된 기능적 활성은 항생제-유도된 장내세균불균형(dysbiosis)에 대한 미생물 군집의 복원을 향상시키고 감염 위험을 낮추는 유망한 전략이 될 수 있다.
본 실시예에서, 항생제-유도된 장내세균불균형은 적절한 항생제를 투여하여 in vitro SHIME® 모델에서 모델링되었다. 이 실험의 목적은 기능적 조성물의 투여 시 시뮬레이션 된 장 결장 환경에서 전형적인 '건강한' 대사산물 프로파일의 회복을 평가하는 것이었다. 뿐만 아니라, 이 실험은 “어셈블리” 전략 또는 “ 콜라보럼 ” 전략(실시예 1.3 참조)에 따라 제조될 때 상기 조성물의 효율을 차별화하는 것을 목표로 하였다. 실험은 락토바실러스 플란타룸 , 페칼리박테리움 프라우스니치이 , 부티리시코커스 풀리케이코럼 , 로세브리아 이누리니보란스 , 로세브리아 호미니스 , 아커만시아 무시니필라 및 언에어로스티페스 카캐가 들어있는 조성물로 다시 수행되었다. 장 내 미생물군집(intestinal microbiome)의 완전한 기능성 프로파일을 더 잘 모방하기 위해, 이 특정 실험에서 상기 조성물은 에스케리치아 콜라이 , 엔테로코쿠스 패시움 , 락토바실러스 뮤코세 , 비피도박테리움 아돌레센티스 , 비피도박테리움 롱검 , 박테로이데스 테타이오타오미크론 및 박테로이데스 불가투스가 더 추가되었다.
실제로, SHIME® 용기(vessel)(pH 6.15-6.40)는 배설물(fecal material)로 접종되고 14일 동안 안정화되도록 두었다(M-SHIME® set up - Van den Abbeele et al., 2012). 2주 간의 통제 기간(control period) 후, SHIME®-유래된 결장 미생물총을 항생제 칵테일(아목시실린(amoxicillin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 테트라시클린(tetracycline) 각각 40/40/10mg/L)로 처리하여 장내세균불균형을 유도하였다. 1일 후, 불균형화된 미생물총을 “어셈블리” 전략 또는 “콜라보럼” 전략에 따라 제조한 상기 기능적 조성물로 5일 동안 처리하였다. 연구의 종점은 시뮬레이션 된 장 결장 환경에서 전형적인 '건강한' SCFA 대사산물 프로파일의 회복을 평가하는 것이었다. 조성물의 투여 없이, 항생제 노출 후 장 군집 대사활성의 자발적인 회복을 시뮬레이션 하기 위하여 대조군 SHIME® 용기를 포함시켰다. 결과는 각 시점에서 SHIME의 SCFA 수준과 항생제 투여 전 값의 델타로 표현하였다(도 8).
SHIME® 용기에 항생제 처리 시, 아세트산, 프로피온산 및 부틸산 생산량이 현저히 감소하는 것으로 관찰되었다. 이 발견은 장 미생물 군집의 파괴를 확인시켜 준다. 대사산물 프로파일(SCFA 생산 측면에서)의 전-처리 상태로의 회복은 5일 동안 아세트산, 프로피온산 및 부틸산의 변화로서 도 8에 나타내었다. 이는 기능성의 회복이 대조군(조성물 투여가 없음)에서 느리고 5일 이내에 아세트산 및 프로피온산의완전한 회복이 관찰되지 않음을 보여준다. 흥미롭게도, 조성물 처리는 3가지 SCFA 모두에서 대조군과 비교하여 빠른 회복을 가져왔다. 뿐만 아니라, 어셈블리 전략의 조성물이 각각 5일 및 3일 후 프로피온산 및 부틸산의 완전한 회복을 유도한 반면, 콜라보럼 전략의 조성물은 어셈블리 전략과는 대조적으로 각각 4일 및 2.5일 후 프로피온산 및 부틸산의 완전한 회복을 유도했다. 최종적으로, 콜라보럼 전략 또한 어셈블리 전략과는 대조적으로 증가된 프로피온산 및 부틸산 양과 함께 증가된 최종 활성을 가져왔다. 이 결과는 항생제-매개된 미생물 장내 불균형의 회복에 대한 조성물의 잠재력을 강조한다. 게다가, 이 발견은 콜라보럼 전략을 통한 사전적응(preadaptation)이 어셈블리 전략과 비교하여 항생제 노출 후 미생물 SCFA 생산량의 보다 효율적인 회복을 가져온다는 것을 분명히 보여준다.
2.3 염증성 장 질환(Inflammatory Bowel Diseases)에서 불균형화된 장 미생물 군집의 대사 기능을 회복하기 위한 기능적 조성물의 효율
염증성 장 질환(IBD)은 손상된 숙주-미생물 상호작용, 적어도 부분적으로는 장내세균불균형 상태와 관련이 있다. 후자는 예를 들어 부티릴 CoA:아세트산 CoA 트랜스퍼라제(transferase) 및 프로피온산 키나아제(kinase)의 낮은 양을 포함하는데(Vermeiren et al., FEMS 2011), 이는 균형 잡힌 SCFA 생산 능력의 생산에 부정적인 영향을 미치는 것으로 이어진다. 정상적인 장 발생 및 유지에 대한 SCFA의 중요성을 고려할 때, SCFA 생산 측면에서 미생물총 조성물 및 기능성의 회복은 IBD-관련 증상에 긍정적인 영향을 줄 수 있다. 그 점에서, 선택된 조성물의 관찰된 기능적 활성은 건강한 장벽의 회복 및 유지를 위한 기초로서 IBD 장내세균불균형에서 미생물총 군집의 회복을 증가시키는 유망한 전략이 될 수 있다.
본 실시예에서, IBD-관련된 장내세균불균형은 전술한 바와 같이(Vigsnaes et al. 2013) in vitro M-SHIME® 모델에서 모델링되었다. 이 실험의 목적은 기능적 조성물의 투여 시 시뮬레이션 된 장 결장 환경에서 SCFA 프로파일의 측면에서 미생물총의 회복을 평가하는 것이었다. 뿐만 아니라, 이 실험은 “어셈블리” 전략 또는 “ 콜라보럼 ” 전략(실시예 1.3 참조)에 따라 제조될 때 상기 조성물의 효율을 차별화하는 것을 목표로 하였다. 실험은 락토바실러스 플란타룸 , 페칼리박테리움 프라우스니치이, 부티리시코커스 풀리케이코럼 , 로세브리아 이누리니보란스 , 로세브리아 호미니스 , 아커만시아 무시니필라 및 언에어로스티페스 카캐가 들어있는 조성물로 다시 수행되었다.
실제로, SHIME® 용기(vessel)(pH 6.15-6.40)는 궤양성 대장염(Ulcerative Colitis) 환자의 배설물(fecal material)로 접종되었다(M-SHIME® set up - Van den Abbeele et al., 2012). 동시에, “어셈블리” 전략 또는 “콜라보럼” 전략에 따라 제조된 상기 조성물의 단일 용량을 각각의 SHIME 결장 용기에 첨가하였다. 대조 실험으로서 상기 조성물의 투여 없이 세번째 실험을 병행하였다. 상기 조성물의 투여 1일 및 2일 후 아세트산, 프로피온산 및 부틸산이 생산되었다.
결과를 도 9에 나타내었다: 어셈블리 전략에 따른 조성물의 투여는 1일째에 SCFA 생산(주로 아세트산 및 부틸산)의 증가를 가져왔지만, 이 효과는 2일 째 더 이상 명백하지 않았다. 이는 상기 조성물이 IBD 미생물군집 환경에서 기능적으로 활성임을 의미한다. 흥미롭게도, 프로피온산 및 부틸산 생산에 대한 효과는 콜라보럼 전략에 따른 조성물의 투여 시 IBD 대조군에 비해 프로피온산 및 부틸산 생산량이 각각 4배 및 3배로 증가하여 훨씬 더 두드러졌다. 어셈블리 전략에 따른 조성물과는 달리, 이 효과는 d2에서도 여전히 두드러졌고 낮은 아세트산 생산량(증가된 크로스피딩(cross-feeding) 및 이에 따른 네트워크 향상을 의미)과 일치했다. 이 결과는 IBD-관련 미생물 불균형의 회복에 대한 조성물의 잠재력을 강조한다. 게다가, 이 발견은 콜라보럼 전략을 통한 사전적응(preadaptation)이 어셈블리 전략과 비교하여 IBD 조건 하에서 미생물 SCFA 생산량의 보다 효율적인 회복을 가져온다는 것을 분명히 보여준다.
2.4 in vitro 시뮬레이션 분석에서 영양형 클로스트리듐 디피실 (Clostridium difficile) 의 성장을 억제하기 위한 기능성 조성물의 효율
본 실시예에서, 기능성 조성물이 장 조건 하에서 기능적으로 활성일 뿐만 아니라, 감염에 대해 장 환경을 보호할 수 있는지 여부를 평가하기 위한 목적으로 클로스트리듐 디피실 (Clostridium difficile ) 챌린지 테스트를 수행하였다. 이러한 챌린지 테스트에서, 상기 조성물은 시뮬레이션 된 장 조건 하에서 Cdif의 성장을 억제하는 능력을 평가하기 위해 영양형(vegetative) 클로스트리듐 디피실 ( Cdif ) 세포로 시험된다. 뿐만 아니라, 이 실험은 “어셈블리” 전략 또는 “ 콜라보럼 ” 전략(실시예 1.3 참조)에 따라 제조될 때 상기 조성물의 효율을 차별화하는 것을 목표로 하였다. 실험은 락토바실러스 플란타룸 , 페칼리박테리움 프라우스니치이 , 부티리시코커스 풀리케이코럼 , 로세브리아 이누리니보란스 , 로세브리아 호미니스 , 아커만시아 무시니필라 및 언에어로스티페스 카캐가 들어있는 조성물로 다시 수행되었다.
실제로, 클로스트리듐 디피실(LMG 21717T)의 글리세롤 스톡을 해동시키고 혐기성 조건을 확실히 하기 위해 질소로 플러싱한 RCM(Reinforced Clostridial Medium) 브로쓰(broth)가 들어 있는 병에 접종하였다. 상기 병을 진탕 배양기(90 rpm)에서 24시간 동안 배양하고 성장한 배양물의 10%을 다시 RCM 브로쓰에 접종하였다. 성장 24시간 후, 균질화된 C. difficile 배양물을 다음이 들어 있는 병(10% v:v)에 소분(3개로)하였다:
1) 기본 배지(basal medium) (blank);
2) 어셈블리 전략에 따른 조성물이 들어 있는 기본 배지;
3) 콜라보럼 전략에 따른 조성물이 들어 있는 기본 배지;
4) SHIME® 결장 부유액이 들어 있는 기본 배지.
병들을 진탕 배양기(90 rpm)에서 24시간 동안 배양하였다.
병들을 37℃에서 진탕 배양기(90 rpm)로 배양하였다. 일정 시점에서, 샘플을 수집하여 삼탄당인산염 이성질화효소 유전자(triose phosphate isomerase gene)의 검출 및 정량화에 기반한 qPCR 분석으로 C. difficile을 정량화하기 전에 -80℃에서 즉시 동결하였다. 이 목적을 위해, Boon et al. (2003)에 따라 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하였다. 상기 증폭 반응은 순방향 및 역방향 올리고뉴클레오타이드: 5'- TATGGACTATGTTGTAATAGGAC-3'(forward) 및 5'- CATAATATTGGGTCTATTCCTAC-3'(reverse)를 포함한다. 표준 곡선을 작성하여 PCR 산물의 절대정량(absolute quantification)을 얻었다.
이 조건화된 in vitro 시뮬레이션 분석에서, C. difficile의 성장은 기본 배지에서 배양 48시간 후 관찰되었으며, in vitro 시뮬레이션 분석에서 blank의 타당성을 확인하였다. 상기 SHIME® 결장 부유액(실제 대변 이식의 시뮬레이션으로서의)은 48시간 배양 후 가장 높은 C. difficile의 성장 억제를 나타냈다(즉, 58%). 흥미롭게도, 콜라보럼 전략에 따른 조성물에 대해서도, 약 53%의 C. difficile의 성장 억제가 나타나 비슷한 결과가 얻어졌다. 가장 낮은 효과는 어셈블리 전략에 따른 조성물이 첨가되었을 때 나타났다(즉, 23%의 성장 억제). 이 실험은 조성물에 의해 C. difficile의 성장이 현저히 억제되고 상기 억제는 콜라보럼 전략을 통한 조성물의 사전적응의 경우에 가장 두드러진다는 것을 명백히 보여준다.
2.5 장벽 기능 및 장 면역의 숙주 바이오마커에 대한 기능적 조성물의 효과
실시예 2.1 내지 2.3은 상기 조성물이 콜라보럼 전략을 통해 제조되는 경우 가장 높은 활성으로, 복잡한 장 조건 하에서 기능적으로 활성이고 장 대사산물 프로파일을 회복시킬 수 있음을 보여주었다. 이는 결국 장 상피 및 그에 따른 장벽 기능 및 국소 면역에 유리하게 영향을 미칠 수 있다.
그 가능성을 평가하기 위해, 본 실시예는 장 상피세포(enterocytes)(Caco-2 세포) 및 대식세포(macrophages)(THP1)의 확립된 공배양 세포 모델(Possemiers et al. 2013)에 대한 이전 실험으로부터 수집한 샘플의 조합을 설명한다. 이 모델에서, LPS에 의한 THP1 세포의 자극은 전-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인의 증가된 생산을 가져오고, 그에 따라 소위 '장 누수(leaky gut)' 상태를 만드는 장 세포(enterocyte) 층을 파괴하는 경향이 있다. '장 누수'에 대한 효과는 대조 조건과 비교하여, TEER[장벽 효율 측정] 및 염증성 사이토카인 생산에 대한 효과를 평가하여 측정되었다.
실제로, 샘플들은 실시예 2.3의 M-SHIME 실험으로부터 1일 째 수집하여 공배양 장 누수 모델과 혼합하였다.
2.6 조성물의 기능적 활성에 대한 균주 동일성의 변이의 영향
조성물 중 상기 7개 분리균주 간의 놀라운 시너지 효과가 균주 특이적인지 또는 동일 종의 다른 균주로도 가능한지를 평가하기 위하여, 추가적인 실험을 수행하였다. 본 실시예에서, “ 콜라보럼 ” 전략(실시예 1.3)을 통해 2개의 서로 다른 조성물이 제조되었다. 조성물 1이 실시예 1.2에 기재된 특정 분리균주를 가지고 있는 데 반해, 조성물 2는 미생물 자원센터에서 수득한 동일 종의 균주들로 구성되었다.
·조성물 1: 페칼리박테리움 프라우스니치이 LMG P-29362, 부티리시코커스 풀리케이코럼 LMG P-29360, 부티리시코커스 풀리케이코럼 LMG24109, 로세브리아 이누리니보란스 LMG P-29365, 로세브리아 호미니스 LMG P-29364, 아커만시아 무시니필라 LMG P-29361, 락토바실러스 플란타룸 LMG P-29366 및 언에어로스티페스 카캐 LMG P-29359
·조성물 2: 락토바실러스 플란타룸 ZJ316, 페칼리박테리움 프라우스니치이 DSMZ 17677, 부티리시코커스 풀리케이코럼 LMG24109, 로세브리아 이누리니보란스 DSMZ 16841, 로세브리아 호미니스 DSMZ 16839, 아커만시아 무시니필라 DSMZ 22959 및 언에어로스티페스 카캐 DSMZ 14662
실제로, 상기 선택된 종들은 이의 글리세롤 스톡(stock)으로부터 회수되고 박테리아 균주의 균질현탁액을 수득하기 위하여 이들 각각의 최적 성장 조건에서 성장시켰다. 그 후, 상기 균주들을 각각 조성물 1 및 조성물 2로 혼합하고, pH 6.15-6.4에서 단일 결장 부위로 이루어진 SHIME® 셋업(Van den Abbeele et al., 2010)에 각각 세 차례 접종되었다. 부틸산 생산 프로파일은 14일 동안 추적 관찰되었다.
흥미롭게도, 부틸산 생산의 역학(dynamics)은 초기의 강한 변동, 약 6일 후 부틸산 양의 안정화가 뒤따르며 두 조성물에서 매우 유사했다. 실험 종료 시(d14), 조성물 1의 부틸산 양은 19.3mM에 도달한 반면, 조성물 2의 양은 18.8mM이었다. 이는 실시예 1.2의 상기 조성물에서 관찰된 시너지 효과는 동일 종에서 수득된 서로 다른 균주를 사용하여 계속 얻을 수 있음을 보여준다.
실시예 3: 생체 내( In vivo ) 실험
3.1 항생제-유도된 장 미생물총 파괴 마우스 모델
본 실시예에서의 실험의 목적은 상기 기능적 조성물이 in vivo 환경에서도 항생제-유도된 장내세균불균형 후 장 미생물 군집의 대사 능력을 회복할 수 있는지 평가하기 위한 것이다.
본 실시예에서, 락토바실러스 플란타룸 , 페칼리박테리움 프라우스니치이 , 부티리시코커스 풀리케이코럼 , 로세브리아 이누리니보란스 , 로세브리아 호미니스 , 아커만시아 무시니필라 및 언에어로스티페스 카캐가 들어있는 조성물이 사용되었고 실시예 1.3의 “ 콜라보럼 ” 전략을 통해 제조되었다. 뿐만 아니라, 장 내 미생물군집의 완전한 기능성 프로파일을 더 잘 모방할 필요성을 평가하기 위해, 상기 조성물에 에스케리치아 콜라이 , 엔테로코쿠스 패시움 , 락토바실러스 뮤코세 , 비피도박테리움 아돌레센티스 , 비피도박테리움 롱검 , 박테로이데스 테타이오타오미크론 및 박테로이데스 불가투스가 더 추가되어 추가 실험을 수행하였다(“확장된 조성물(extended composition)”로 표시).
실제로, 상기 “조성물” 및 “확장된 조성물”은 콜라보럼 전략에 따라 신선하게 제조되었고, PBS로 2회 세척되었으며(혐기성 조건을 확실히 하기 위하여 혐기성 챔버에서), 100μL로 농축되어 가능한 한 빨리 마우스에게 경구 위관 영양법(oral gavage)으로 투여되었다. 적어도 5주령의 마우스(C57/BL6)를 구매하여, 병원균이 없는 상태로 유지하고 표준 식이를 공급하였다. 마우스 실험은 벨기에 겐트 대학 동물 실험 윤리위원회(Ethics Committee of Animal Trials of Ghent University, Belgium)의 승인을 받은 프로토콜에 따라 수행되었다. 항생제-유도된 장내세균불균형을 유발하기 위하여, 항생제 클린다마이신(clindamycin)을 250mg/L 농도로 식수에 첨가하였다. 항생제 투여 5일 후, 마우스의 위 내용물을 NaHCO3로 중화시키고 마우스(그룹 당 10마리의 마우스)에 다음을 경구 위관 영양법으로 5일 연속 투여하였다:
1) 식염수 용액 내 조성물;
2) 식염수 용액 내 확장된 조성물 및
3) 식염수 (대조군)
위관 영양 절차로부터 발생하는 가변성을 배제하기 위하여 기존 그룹(항생제 처리 없이 식염수로만 처리)이 대조군으로 포함되었다. 실험 도중, 대변 샘플(약 100mg/마우스)이 수집되고 향후 분석을 위해 -80℃에서 보관되었다.
동일한 그룹에서 유래된 마우스 대변 샘플 모음으로부터 얻은 SCFA 프로파일은 5일 간의 항생제 처리가 아세트산만이 남아있는 정도로 부틸산 및 프로피온산 생산을 현저히 감소시켰음을 보여준다(도 10). 도 10에 나타낸 바와 같이, 대사 기능의 자발적 회복은 느리고 마지막 항생제 처리 약 5일(d10) 후 시작되며, 반면 세가지 주요 SCFA(아세트산, 프로피온산 및 부틸산)의 몰랄 비는 심지어 전-항생제 상태로 돌아가지 않았다. 그러나 마우스가 콜라보럼 전략에 따른 상기 조성물 또는 확장된 조성물로 처리되었을 때는, 부틸산 대사의 회복은 항생제 처리 약 3일 후(d8) 이미 시작되었다. 뿐만 아니라, 두 조성물로 처리된 마우스의 대사 활성은 항생제의 최종 투여 5일 후(d10) 거의 완전한 회복을 보였고, 프로피온산 및 부틸산 모두에 대해 좋은 생산량을 보였다. 상기 확장된 조성물은 상기 조성물과 비교하여 아세트산 및 프로피온산 생산자를 더 높은 다양성으로 포함하였으며, 이는 또한 상기 실험의 d10에서 약간 상이한 발효 프로파일로 반영되었다. 결론적으로, 본 실시예는 상기 기능적 조성물이 항생제-유도된 장내세균불균형에서 장 대사 프로파일에 대한 더 빠르고 보다 강력한 회복을 얻는데 효과적이라는 in vivo 에서의 확인을 제공한다. 또한 상기 조성물 내 정밀한 종 조합의 변형은 특정 대사 프로파일로 최종 결과를 조절할 수 있게 해준다.
3.2 TNBS 마우스 염증 모델
TNBS(2,4,6-트리니트로벤젠술폰산)(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid) 모델은 체중 감소, 피가 섞인 설사(bloody diarrhea) 및 장벽 비후(intestinal wall thickening)를 포함하는 크론병(Crohn's disease)의 몇 가지 특징을 모방하는 일반적으로 사용되는 대장염 모델이다(Scheiffele et al. 2001). 조직병리학적으로, TNBS는 CD 환자에서 발견되는 전형적인 특징인 깊은 궤양(ulcer)의 형성과 함께, 장의 반점형(patchy) 전층성 염증(transmural inflammation)을 유발한다. 이는 IBD에서 장 점막에 대한 손상의 예방 및/또는 회복 및 건강한 장벽의 유지/발달 도움에 대한 상기 기능적 조성물의 능력을 in vivo에서 평가하는 데 있어 TNBS 모델을 좋은 후보자로 만든다.
본 실시예에서, TNBS 모델 평가에 기반하여 유익한 효과를 평가하기 위하여 락토바실러스 플란타룸 , 페칼리박테리움 프라우스니치이 , 부티리시코커스 풀리케이코럼 , 로세브리아 이누리니보란스 , 로세브리아 호미니스 , 아커만시아 무시니필라 및 언에어로스티페스 카캐가 들어있는 조성물이 사용되었다. 또한, 이 실험은 “어셈블리” 전략 또는 “ 콜라보럼 ” 전략(실시예 1.3 참조)에 따라 제조될 때 상기 조성물의 효율을 차별화하는 것을 목표로 하였다. 대장염은 에탄올에 희석한 점막 민감제인 TNBS의 직장점적주입(rectal instillation)에 의하여 동물에서 유도되었다. 에탄올의 투여는 점막고유판(lamina propria)으로 TNBS 가 투과할 수 있도록 결장 내 점막 장벽을 파괴하는 데 꼭 필요하다. TNBS는 국소화된 결장 및 장 미생물 단백질을 면역 원성으로 만들고, 그에 따라 숙주의 선천(innate) 및 적응(adaptive) 면역 반응을 촉발시킨다.
실제로, 8 내지 10주령의 수컷 C57BL6/J 마우스를 20℃로 온도가 조절된 방에서 12:12-시간 명암 사이클로 사육하였다. 동물들은 물 및 사료에 대해 자유롭게 접근할 수 있었다. 케이지 효과(cage effect)를 피하기 위하여 케이지들 사이에서 마우스를 무작위 추출하였다. 순화(acclimatization) 1주 후, 상기 실험을 시작하였다. 각 그룹(n=9/그룹)은 경구 위관 영양법으로 5일 연속 처리되었다. 모든 처리의 예방 투여는 TNBS/50% EtOH 2mg을 직장 투여하기 하루 전에 시작하였고, TNBS 투여 이후 4일간 유지하고 마우스를 희생시켰다. 다음의 처리가 포함되었다:
1) TNBS + 식염수 용액 내 “어셈블리” 전략에 따라 제조된 조성물;
2) TNBS + 식염수 용액 내 “콜라보럼” 전략에 따라 제조된 조성물 및
3) TNBS + 식염수 용액(대조군).
위관 영양 절차로부터 발생하는 가변성을 배제하기 위하여 기존 그룹(TNBS 처리 없이 식염수 용액으로만 처리)이 대조군으로 포함되었다. 연구 종료 시점에서, 질병 활성도(Disease Activity)는 체중, 대변 혈액 손실(ColoScreen) 및 일반 외형(general appearance)을 측정함으로써 매일 모니터링되었다(일일 투여 전).
본 실시예의 결과를 도 11에 나타내었다. TNBS가 없는 비히클(식염수) 대조군에서는 체중 및 질병 활성도 모두에 대하여 영향이 없는 것으로 관찰된 반면, TNBS를 투여한 대조군은 d1에서 8%의 즉각적인 체중 감소 및 질병 활성도의 큰 증가를 나타냈다. 체중 감소 및 질병 활성도는 모두 연구 종료 시 부분적으로 회복되었다. 흥미롭게도, 상기 조성물의 강력한 보호 효과가 체중 감소 및 질병 활성도 모두에서 관찰된 반면, 이 보호 효과의 정도는 상기 조성물의 제조 전략에 의존하였다. 어셈블리 전략에서 초기의 경미한 보호가 d1에서 낮은 체중 감소 및 질병 활성도로 관찰된 반면, 이 보호 효과는 다음 연구 날짜들에서는 더 이상 관찰되지 않았다. 그에 반해, 비히클 대조군의 수준으로까지 질병 활성도가 회복된 것으로 나타난 것처럼, 콜라보럼 전략에 따라 제조된 조성물의 투여는 TNBS 대조군과 비교하여 d1에서 체중 감소 및 질병 활성도에 대하여 강력한 보호 효과를 가져왔으며, 연구가 끝날 때까지 더 빠르고 완전한 회복을 가져왔다. 결론적으로, 본 실시예는 상기 기능적 조성물이 TNBS-유도된 대장염의 유도 시 장 염증으로부터의 보다 빠르고 강한 회복 및 질병 활성도의 강력한 예방을 얻는데 효과적이라는 in vivo 에서의 확인을 제공한다. 더욱이, 이 발견은 콜라보럼 전략을 통한 사전적응이 어셈블리 전략과 비교하여 보다 효율적인 활성을 가져옴을 명백히 보여준다.
3.3 DSS 마우스 염증 모델
만성 DSS 모델은 체중 감소 및 피가 섞인 설사(bloody diarrhea)를 포함하는 크론병(Crohn's disease)의 몇 가지 특징을 모방하는 일반적으로 사용되는 대장염 모델이다. 조직병리학적으로, 만성 DSS 투여는 CD 환자에서 발견되는 특징인 염증성 세포의 음와 손상(crypt distortion), (하위)점막 침윤(infiltration) 및 섬유화(fibrosis)와 같은 전형적인 구조적 변화와 함께 장의 염증을 유발한다. 이는 IBD에서 장 점막에 대한 손상의 예방 및/또는 회복 및 건강한 장벽의 유지/발달 도움에 대한 상기 기능적 조성물의 능력을 in vivo 에서 평가하는 데 있어 DSS 모델을 좋은 후보자로 만든다.
본 실시예에서, 만성 DSS 모델 평가에 기반하여 유익한 평가를 평가하기 위하여 락토바실러스 플란타룸 , 페칼리박테리움 프라우스니치이 , 부티리시코커스 풀리케이코럼 , 로세브리아 이누리니보란스 , 로세브리아 호미니스 , 아커만시아 무시니필라 및 언에어로스티페스 카캐가 들어있는 조성물이 사용되었고 “콜라보럼” 전략을 통해 제조되었다(실시예 1.3 참조). 대장염은 식수 내의 DSS의 반복적 투여에 의하여 동물에서 유도되었다(0.25% 챌린지). 상기 실험은 DSS 투여 및 회복의 3 사이클과 함께 총 8주 동안 수행되었다.
실제로, 6주령의 수컷 C57BL6/J 마우스를 20℃로 온도가 조절된 방에서 12:12-시간 명암 사이클로 사육하였다. 동물들은 물 및 사료에 대해 자유롭게 접근할 수 있었다. 케이지 효과(cage effect)를 피하기 위하여 케이지들 사이에서 마우스를 무작위 추출하였다. 순화(acclimatization) 1주 후, 상기 실험을 시작하였다. 각 그룹(n=10/그룹)은 경구 위관 영양법으로 8주 연속 주당 3회 처리되었다. 첫 번째 DSS 사이클은 2주차에 시작되었으며 2주간의 회복이 뒤따르는 1주의 DSS 투여(식수에 0.25%)가 포함된다. 이 첫 번째 사이클 뒤에는 동일한 두번째 DSS 사이클이 이어졌다. 세 번째 DSS 사이클은 1주간의 회복이 뒤따르는 1주간의 DSS 투여로 이루어지며, 그 후 동물들을 희생시켰다. 다음과 같은 처리가 포함된다:
1) 비-DSS 대조군
2) DSS + 식염수 용액 내 콜라보럼 전략에 따른 조성물(3회/주) 및
3) DSS + 식염수 용액(DSS 대조군).
연구 종료 시점에서, 질병 활성도 지수(Disease Activity Index)(DAI)는 각 DSS 사이클 동안 주당 3회(일일 투여 전) 체중, 대변 혈액 손실(ColoScreen) 및 일반 외형(general appearance)을 측정함으로써 모니터링되었다. 도 12에 나타낸 바와 같이, DSS가 없는 비히클(식염수) 대조군에서는 DAI에 대하여 어떠한 효과도 관찰되지 않은 반면, DSS를 투여한 대조군은 각 투여 사이클에서 DAI의 강한 증가를 보였다. 흥미롭게도, 상기 조성물의 강력한 보호 효과(각 사이클에서 약 25% 낮은 DAI)는 질병 활성도에서 관찰되었다. 이는 상기 기능적 조성물이 DSS-유도된 대장염 유도 시 장 염증 및 질병 활성도로부터 강력한 보호 효과를 얻는데 효과적임을 추가적으로 입증한다.
3.5 점막염 모델
점막염은 항암 치료 후의 점막 손상을 설명하기 위한 임상 용어이다. 그것은 전체 위장관(gastrointestinal tract)(GT)(구강 포함) 및 비뇨-생식관(genito-urinary tract)을 걸쳐서 발생하며, 다른 점막 표면에서는 보다 적게 발생한다. 이의 중증도 및 지속 기간은 복용량 및 사용된 약물의 종류에 따라 다르다. 점막염의 중요성은 화학 요법량을 제한한다는 것이다. GI 유와 상피(crypt epithelium)는 메스꺼움 및 구토, 복통, 팽만감(distension) 및 설사, 및 점막 세포독성(cytotoxic)의 직접적 영향에 따른 설사를 포함하는 증상을 가진 화학요법 독성에 특히 취약하다. 5-플루오로우라실(5-fluorouracyl)(5FU)-유도된 장 점막염 랫트 모델은 위장관에 대한 화학요법의 영향을 평가하기 위하여 Keefe et al.에 의해 확립되었고 현재 랫트에서 화학요법-유도된 점막염을 연구하기 위하여 가장 광범위하게 사용되는 모델 중 하나이다(Keefe 2004).
본 실시예에서, 실험을 위한 기초로서 락토바실러스 플란타룸 , 페칼리박테리움 프라우스니치이 , 부티리시코커스 풀리케이코럼 , 로세브리아 이누리니보란스 , 로세브리아 호미니스 , 아커만시아 무시니필라 및 언에어로스티페스 카캐가 들어있는 조성물이 사용되었고 실시예 1.3의 “콜라보럼” 전략을 통해 제조되었다. 점막염은 5FU의 단일 복강 내 투여(intraperitoneal)를 통해 유도되었다.
실제로, 총 30마리의 랫트를 특정 시점에 따라 대조군 또는 실험군에 무작위 배정하였다. 실험 그룹의 모든 랫트는 5FU(150mg 5FU/kg BW)로 단일 복강내 투여되었다. 대조군의 랫트들은 용매 비히클(다이메틸설폭사이드)(dimethylsulphoxide)로 처리되었다. 화학요법 약물의 투여에 이어서, 사망률(mortality), 설사, 및 일반적인 임상 상태와 같은 연구 종료 시점은 24시간 마다 4회 평가되었다. 랫트의 소집단은 약물 투여 후 24, 48, 및 72시간에 사혈(exsanguination) 및 경추탈골(cervical dislocation)에 의해 희생되었다. 관심을 가진 주요 종료 시점은 체중, 설사 및 일반적인 건강 상태(wellbeing)(질병 점수)의 변화였다. 두번째 종료 시점은 장 샘플의 조직학 및 대변(stool) 및 장 점막 미생물총 분석이었다.
평가된 증상의 예방 또는 감소에 대한 상기 조성물의 효과를 평가하기 위하여, 랫트의 일부는 경구 위관 영양법으로 상기 조성물이 8일 연속 투여되었다. 예방 접종은 5FU의 투여 5일 전 시작되었고 5FU 투여 이후 또는 랫트가 희생될 때까지 3일동안 지속되었다. 대조군 동물들은 상기 조성물이 투여되지 않았다.
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Claims (18)

  1. 페칼리박테리움 프라우스니치이(Faecalibacterium prausnitzii), 부티리시코커스 풀리케이코럼(Butyricicoccus pullicaecorum), 로세브리아 이누리니보란스(Roseburia inulinivorans), 아커만시아 무시니필라(Akkermansia muciniphila), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 언에어로스티페스 카캐(Anaerostipes caccae) 종에 속하는 박테리아를 필수적으로 포함하는, 위장 장애(gastro-intestinal disorder)의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 위장 장애는 내장 장벽 기능의 파괴, 설사, 변비, 과민성 대장 증후군, 염증성 장 질환, 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염, 셀리악 병(coeliac disease), 맹낭염(pouchitis), 점막염(mucositis), 내장 감염, 장 내 미생물총 불균형(gut microbiota dysbiosis) 및 이들의 임의의 조합인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 위장 장애는 다음을 통해 예방 또는 치료되는 것인, 조성물: a) 장관 내에서 하나 또는 제한된 수의 유익한 박테리아의 성장 및/또는 활성을 자극, b) 장관 내에서 하나 또는 제한된 수의 병원성 박테리아의 성장 및/또는 활성을 억제, c) 소화관 표면의 점막에 비병원성 박테리아의 부착을 상대적으로 증가, d) 장의 항원, 전-염증성(pro-inflammatory), 박테리아 또는 박테리아 산물의 조절되지 않은 흡수 감소, e) 장 표면에서 항-염증성(anti-inflammatory) 활성 제공, f) 장벽 기능 증가, g) 프로피오네이트, 부티레이트 또는 둘 다의 생산 또는 h) a) 내지 g)의 임의의 조합.
  5. 제1항에 있어서, 로세브리아 호미니스(Roseburia hominis) 종에 속하는 박테리아를 추가로 포함하는, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물에 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 엔테로코쿠스 패시움(Ent. Faecium), 락토바실러스 뮤코세(Lactobacillus mucosae), 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium Adolescentis), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron) 및 박테로이데스 불가투스(Bacteroides Vulgatus) 종에 속하는 박테리아가 첨가된, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 프리바이오틱스를 더 포함하는, 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 박테리아는 상기 위장 장애의 예방 또는 치료를 위해 상기 조성물을 투여하기 전 발효조에서 함께 성장하는 것인, 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 발효조는 위장관의 동적 시뮬레이터(dynamic simulator)인, 조성물.
  10. 제5항에 있어서, 상기 박테리아는 다음의 균주 목록으로부터 선택된 것인, 조성물: 페칼리박테리움 프라우스니치이 LMG P-29362, 페칼리박테리움 프라우스니치이 DSMZ 17677, 부티리시코커스 풀리케이코럼 LMG P-29360, 부티리시코커스 풀리케이코럼 LMG24109, 로세브리아 이누리니보란스 LMG P-29365, 로세브리아 이누리니보란스 DSMZ 16841, 로세브리아 호미니스 LMG P-29364, 로세브리아 호미니스 DSMZ 16839, 아커만시아 무시니필라 LMG P-29361, 아커만시아 무시니필라 DSMZ 22959, 락토바실러스 플란타룸 LMG P-29366, 락토바실러스 플란타룸 ZJ316, 언에어로스티페스 카캐 LMG P-29359 및 언에어로스티페스 카캐 DSMZ 14662.
  11. 제1항 및 제3항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 직장투여 형태(rectally administrated form) 또는 경구섭취 가능한 형태(orally ingestible form)로 제형화된 약학적 조성물인, 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 경구섭취 가능한 형태는 캡슐, 마이크로캡슐, 정제, 과립, 분말, 트로키(troche), 알약(pill), 현탁액 또는 시럽인, 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 식품, 음료, 식품 보조제 또는 뉴트라슈티컬에 함유되는, 조성물.
  14. 제1항 및 제3항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 105 내지 1011 콜로니 형성 단위(colony forming units)의 박테리아를 포함하는, 조성물.
  15. 제1항 및 제3항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 반응조(reactor)로서, 상기 반응조는 다음을 포함하는, 위장관의 표준화된 조건 하에서 작동하는 반응조: 1.5 내지 8의 pH 범위; 탄소 자원의 이용 가능성; 10분 내지 200시간의 체류시간(retention time); 0 내지 8g/L의 산소 이용가능성; 미량영양소(micronutrients)의 이용가능성; 항생제의 존재/부존재; 0 내지 20mM 농도의 담즙산 염(bile salts); 중금속의 존재; 면역 분자로서의 숙주 인자(host factor)의 존재.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제15항에 있어서, 5 내지 20개의 상이한 박테리아 멤버, 또는 5 내지 15개의 상이한 박테리아 멤버의 조성물이 기능적으로 안정한 콜라보럼(collaborome)을 얻기 위해 3 내지 14일 동안 체류하는, 반응조.
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