CN111281895A

CN111281895A - 用于治疗结肠炎的乳酸菌及其应用

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Publication number: CN111281895A
Application number: CN201911341928.5A
Authority: CN
Inventors: 顾青; 顾容铖; 郦萍; 刘娜娜
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-12-24
Filing date: 2019-12-24
Publication date: 2020-06-16
Also published as: CN114657083A

Abstract

本发明公开一种用于治疗结肠炎的乳酸菌及其应用，其中所述用于治疗结肠炎的乳酸菌包括植物乳杆菌ZJ316，其能够安全、有效、副作用小地治疗结肠炎。

Description

用于治疗结肠炎的乳酸菌及其应用

技术领域

本发明涉及结肠炎的治疗领域，更进一步，涉及一用于治疗结肠炎的乳酸菌及其应用。

背景技术

溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis，UC)是一种由变态反应及理化因子引起的病因复杂且具有并发结肠癌危险的肠道炎症性疾病，根据病程经过分为急性溃疡性结肠炎和慢性溃疡性结肠炎。长期以来缺乏有效的治疗措施，因而该病不仅严重危害了人体健康，还给患者带来了生活和经济上的双重压力和负担。

目前结肠炎治疗的主要方向是缓解临床症状，预防并发症发生，但还未研制出从病因根本出发治疗结肠炎的方法。药物治疗和手术治疗为现阶段最主要的结肠炎临床治疗方法。长期以来，氨基水杨酸、抗生素、糖皮质激素、免疫抑制剂、生物制剂等药物常用于缓解结肠炎。氨基水杨酸主要包括美沙拉嗪(5-氨基水杨酸)、柳氮磺胺吡啶，是治疗轻中度结肠炎的首选药物，其中，美沙拉嗪和柳氮磺胺吡啶可抑制IL-1β和TNF-α等促炎性细胞因子的表达，抑制脂氧合酶途径，清除自由基和氧化物，还能抑制NF-κB的激活，但该类药物会引起患者头痛，恶心等并发症；抗生素可以促进有益菌数量的增加，而降低致病菌的比例，尽管抗生素在调节结肠炎微生态失调中很有效，但依然存在患者会产生耐药性这一大弊端。糖皮质激素能抑制炎症和免疫反应，因此对治疗结肠炎有重要的意义，此外糖皮质激素可单独使用或与美沙拉嗪配合使用来缓解结肠炎，但其用量过高时，患者会出现水肿、高血糖、骨坏死、肌病等副作用。免疫抑制剂可用于治疗氨基水杨酸和糖皮质激素均无效、疗效欠佳或重度结肠炎患者，常用的免疫制剂主要有6-巯嘌呤、硫唑嘌呤、甲氨喋呤等，但免疫制剂长期使用会引起皮疹、肺炎、黄疸等。常用的生物制剂是英夫利昔单抗，其可通过封闭促炎效应，促进粘膜愈合和炎症细胞凋亡从而有效减轻结肠炎症状，但过多使用则会引起发烧等强烈的副作用。对于对一些严重并发症的结肠炎患者，则需要进行手术治疗，但手术治疗会带来并发完全性肠梗阻，瘘管与脓肿形成，急性穿孔或不能控制的大量出血等副作用。

目前，乳酸菌已经用于UC的临床缓解和预防，尽管其机理还未明确阐明，但乳酸菌在炎症性肠病治疗中存在的潜在功效不可否认。Shen Z.H等人研究发现乳酸菌可能是通过单核因子NF-κB信号通路，降低肿瘤坏死因子(TNF-α)，白细胞介素1(IL-1β)等促炎细胞因子水平的转录，而上调了抗炎因子IL-10的表达，从而改善IBD症状。乳酸菌进入肠道后主要与宿主肠道中的粘液层、上皮细胞和人肠相关淋巴组织三个部位发生作用。粘液层可限制共生菌结合的数量，内层是紧密的黏蛋白亚层，限制细菌的进入；肠上皮细胞则主要分泌抗菌物质来调控免疫应答；肠淋巴组织也主要起免疫应答的作用。

Riley S.A等人发现，乳酸菌中一些乳杆菌属能够产生参与免疫调节的小分子物质，其可诱导IL-10等抑炎性细胞因子表达，进而对UC患者发挥抗炎作用。另外，当乳酸菌进入肠道后，与其他微生物群落发生相互作用而结合，从而互相影响代谢作用而发挥益生作用。比如，研究发现双歧杆菌，能够通过特定的发酵途径代谢碳水化合物，产生不同比例的乙酸等其他代谢产物，从而减缓结肠炎病情。有研究报道，灌胃了德氏乳杆菌、保加利亚亚种和干酪乳杆菌的小鼠中抗炎细胞因子IL-10增加，而促炎细胞因子IL-2和IL-12的明显降低。此外，还有实验已经证实乳酸菌能够改变肠易激综合征(IBS)患者的菌群结构，降低有害菌的丰度，增加益生菌多样性。尽管益生菌在IBD等炎症性疾病中的疗效已经被证实，但其机制尚不能完全确定，仍然需要大量的研究来阐明。

综上所述，现有的治疗方法表现的差强人意，不适宜长期治疗。因此，进一步研究结肠炎发病机制并提供安全、有效的治疗方法来预防和缓解结肠炎迫在眉睫。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一用于治疗结肠炎的乳酸菌及其应用，其中所述用于治疗结肠炎的乳酸菌是植物乳杆菌ZJ316，其能够安全、有效、副作用小地治疗结肠炎。

本发明的一个目的在于提供一用于治疗结肠炎乳酸菌及其应用，其中所述植物乳杆菌ZJ316能够对DSS诱导的小鼠结肠炎具有改善作用。

本发明的一方面提供一种用于治疗结肠炎的乳酸菌，其包括：植物乳杆菌 ZJ316。

根据一个实施例所述的用于治疗结肠炎的乳酸菌，其中所述植物乳杆菌 ZJ316由婴儿粪便中筛选。

根据一个实施例所述的用于治疗结肠炎的乳酸菌，其中所述植物乳杆菌用于治疗由DSS诱导的急性和慢性结肠炎小鼠的结肠炎。

本发明的另一方面提供一种植物乳杆菌ZJ316或者含有其发酵乳的一种药物组合物的制造药物中的用途，所述药物用于治疗或预防结肠炎。

根据一个实施例所述的用途，其中所述植物乳杆菌ZJ316用于下调DSS结肠炎小鼠结肠中促炎性细胞因子表达量，并上调抑炎性细胞因子表达量。

根据一个实施例所述的用途，其中在制备发酵乳时，量取一定量的新鲜牛乳，加入提前制备好的6％的植物乳杆菌ZJ316菌悬液，再加入7％的白砂糖，搅拌均匀后，置于酸奶机发酵8-12小时。

根据一个实施例所述的用途，其中在培养植物乳杆菌ZJ316时，将-80℃甘油管冻存的植物乳杆菌ZJ316于MRS固体平板划线接种，37℃厌氧培养24h复苏，经两次传代活化后转接于MRS液体，过夜培养菌液16-18h，6000r/min离心10分钟，收集发酵上清液，菌泥用浓度为0.85％的灭菌生理盐水洗涤两次后，再用生理盐水重悬，使菌悬液活菌数达约2.5×10⁹CFU/mL。

本发明的另一方面提供一种用于治疗结肠炎的乳酸菌发酵乳，其包括：由植物乳杆菌ZJ316发酵得到植物乳杆菌ZJ316发酵乳。

根据一个实施例所述的用于治疗结肠炎的乳酸菌发酵乳，其中所述植物乳杆菌ZJ316发酵乳用于促进DSS结肠炎小鼠结肠中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸和戊酸的含量增加。

根据一个实施例所述的用于治疗结肠炎的乳酸菌发酵乳，其中在制备时，量取一定量的新鲜牛乳，加入提前制备好的6％的植物乳杆菌ZJ316菌悬液，再加入7％的白砂糖，搅拌均匀后，置于酸奶机发酵8-12小时。

附图说明

图1示意植物乳杆菌ZJ316在不同浓度的NaCl处理下的存活率。

图2示意植物乳杆菌ZJ316在不同浓度乙醇处理下的存活率。

图3示意植物乳杆菌ZJ316在不同胆盐浓度下的存活率。

图4示意植物乳杆菌ZJ316在不同pH人工胃液下的存活率。

图5示意急性组不同组别小鼠体重动态变化。

图6示意慢性组不同组别小鼠体重动态变化。

图7示意急性组各处理组对小鼠结肠长度的影响。

图8示意慢性组各处理组对小鼠结肠长度的影响。

图9示意急性组各处理组对小鼠结肠重量的影响。

图10示意慢性组各处理组对小鼠结肠重量的影响。

图11A-11B示意急性组各处理组小鼠结肠H&E染色结果。

图12示意急性组各处理组组织损伤评分。

图13A-13C示意慢性组各处理组小鼠结肠H&E染色结果。

图14示意慢性组各处理组组织损伤评分。

图15A-15D示意急性组各处理组小鼠结肠炎性细胞因子转录水平。

图16A-16E示意慢性组各处理组对小鼠结肠细胞因子转录水平的影响。

图17A-17E示意急性组各处理组小鼠结肠中短链脂肪酸含量。

图18A-18E示意慢性组各处理组小鼠结肠中短链脂肪酸含量。

图19示意样品测序稀释曲线。

图20示意小鼠结肠微生物菌群在“门”水平上的分布情况。

图21示意小鼠结肠微生物菌群在“属”水平上的分布情况。

图22示意α多样性指数。

图23A-23B示意PCoA分析。

图24A-24B示意急性组LEfse分析。

图25A-25B示意图慢性组LEfse分析。

具体实施方式

以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。在以下描述中界定的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案以及没有背离本发明的精神和范围的其他技术方案。

本发明提供一用于治疗结肠炎的乳酸菌及其应用，所述用于治疗结肠炎的乳酸菌是由婴儿粪便中筛选得到的一种植物乳杆菌，并命名为植物乳杆菌ZJ316 (Lactobacillusplantarum ZJ316)，植物乳杆菌ZJ316为保藏菌株。

1.植物乳杆菌ZJ316的环境抗压能力和肠道耐受性

乳酸菌的生理功能与机体的生命活动息息相关，因而广泛用于食品加工行业，制造出诸多美味又健康的食品，但具有工业应用潜力的理想乳酸菌菌株必须安全可靠且能够在发酵过程中抵抗恶劣条件，如高浓度乙醇和高渗透压。动物胃肠消化道是微生物存在的主要部位之一，乳酸菌要发挥其益生作用必须能够克服动物胃肠道消化系统的强酸和胆盐环境。动物胃酸pH最低可达1.5，但进食后，pH 会急速增高，甚至超过6.0，但其pH通常介于2.5～3.5，且食物的消化时长为 1.5～4.0h。动物体内消化道不同部位的胆盐质量分数不同，但通常在0.03％～ 0.30％。乳酸菌要通过人及动物体内的各种生理屏障后，且在胃肠道环境中能维持较高的菌株存活率，才能发挥其生理功能从而有效的改善人和动物肠道健康，平衡肠道菌群。而乳酸菌的耐酸性和耐胆盐性是能否抵抗肠道环境的两个重要指标，乳酸菌耐受能力的高低直接影响其在胃肠消化道的菌株存活数量。

1.1实验菌株

本实验所用菌株为植物乳杆菌ZJ316。此菌为保藏菌株。

1.2主要试剂与耗材

蛋白胨、酵母提取物、无水葡萄糖、柠檬酸氢二铵、牛肉膏、磷酸氢二钾、乙酸钠，氯化钠、无水乙醇、七水硫酸镁、硫酸锰、吐温80和胆盐均购自杭州常青化工有限公司。

胃蛋白酶购自启真湖生物科技有限公司。

0.22μm水系/有机微孔过滤膜购自于杭州常青化工有限公司。

1.3实验仪器与设备

表1-1主要仪器与设备

1.4培养基及相关溶液配制

1.4.1培养基配制

MRS液体培养基的配制：准确称取10g蛋白胨，5g酵母提取物，20g无水葡萄糖，10g牛肉膏，2g磷酸氢二钾，2g柠檬酸氢二铵，5g乙酸钠，0.2g七水硫酸镁，0.05g硫酸锰，1mL吐温-80，用超纯水溶解并定容至1L，121℃灭菌15min。

MRS固体培养基的配制：在MRS液体培养基配方的基础上加入1％-1.5％的琼脂，用超纯水溶解并定容至1L，121℃灭菌15min。

含3％、6％、8％NaCl MRS培养基配制：在普通MRS液体培养基配方的基础上分别加入30g、60g和80g NaCl，用超纯水溶解并定容至1L，121℃灭菌 15min。

含2.5％、5％、7.5％、10％和12.5％乙醇(98％)MRS液体培养基配制：于灭菌后的普通MRS培养基中分别加入25mL、50mL、75mL、100mL和125mL 乙醇(98％)可得到相应浓度的乙醇MRS培养基。

含0.1％、0.3％和0.5％胆盐MRS培养基配制：在普通MRS液体培养基配方的基础上分别加入1g、3g和5g NaCl，用超纯水溶解并定容至1L，121℃灭菌 15min。

1.4.2其它溶液配制

0.1mol/L PBS溶液：准确称取80g NaCl，2.2g KCl，9.9g Na₂HPO₄，2.0g KH₂PO₄，加入800mL H₂O充分溶解，用HCl调pH至7.4，再定容至1L，121℃灭菌15min。

人工胃液配制：准确称取1g胃蛋白酶加入到100mL超纯水中，搅拌均匀，充分溶解后分装至四个蓝口瓶中，分别调至pH至2.0，2.5，3.0，3.5，再用滤膜过滤除菌。

1.5实验方法与内容

1.5.1菌种活化与培养

将-80℃冻存的植物乳杆菌ZJ316于MRS固体平板划线接种，37℃厌氧培养 24h复苏，经两次传代活化后转接MRS液体，过夜培养菌液16-18小时，以6000 r/min离心10分钟，弃去发酵上清液，菌泥用无菌生理盐水(0.85％)洗涤两次后，用等体积的无菌生理盐水缓冲液重悬。

1.5.2菌株耐渗透压性能测定

菌株液体培养16-18h后，4℃，6000r/min离心10min，菌泥用无菌生理盐水(0.85％)洗涤两次后，用等体积的灭菌生理盐水重悬。取重悬后的菌体悬浮液100μL接种于含不同浓度NaCl的MRS培养基中，37℃培养24h后，无菌情况下取培养液50μL，用无菌水梯度稀释，于MRS固体培养基平板上涂布，37℃培养至菌落明显出现，准确计数，每组做三个平行，以未加NaCl的MRS培养基培养的菌株作对照。

1.5.3菌株耐乙醇性能测定

菌株液体培养16-18h后，4℃，6000r/min离心10min，菌泥用无菌生理盐水(0.85％)洗涤两次后，用等体积的无菌生理盐水(0.85％)重悬。取重悬后的菌体悬浮液100μL接种于乙醇浓度分别为2.5％，5％，7.5％，10％的MRS液体培养基中，37℃培养箱培养24h，无菌情况下取培养液50μL，用无菌水梯度稀释，于MRS固体培养基平板上涂布，37℃培养至菌落明显出现，准确计数，每组做三个平行，以未加乙醇的MRS培养基培养的菌株作对照。

1.5.4菌株耐人工胃胰液能力测定

菌株液体培养16-18h后，4℃，6000r/min离心10min，菌泥用无菌生理盐水(0.85％)洗涤两次后，用等体积的无菌生理盐水重悬，制成菌体悬浮液。分别接种1mL菌体悬浮液于pH为2.0、2.5、3.0和3.5人工胃液中,充分混匀后放置于37℃生化培养箱培养。在0h、2h、4h分别取样50μL，用无菌水梯度稀释，于MRS固体培养基平板上涂布，37℃培养至菌落明显出现，准确计数，每组做三个平行，以未经人工胃液处理的菌株作对照。

1.5.5菌株耐胆盐能力测定

将-80℃冻存的植物乳杆菌ZJ316于MRS固体平板划线接种，37℃厌氧培养24h复苏，经两次传代活化后转接MRS液体，过夜培养菌液16-18小时，然后按3％(v/v)接种量分别接种于含不同浓度胆盐的MRS液体培养基中，置于37℃生化培养箱培养。在0h、2h、4h分别取样50μL，用无菌水梯度稀释，于MRS 固体培养基平板上涂布，37℃培养至菌落明显出现，准确计数，每组做三个平行，每组做三个平行，以不加胆盐的培养基为对照。

1.6结果与分析

1.6.1植物乳杆菌ZJ316耐渗透压性能

耐高渗透压性能是乳酸菌株能否在商业中应用的先决条件之一。发酵过程中菌株产生乳酸，增加细胞的渗透压，将游离酸转化为盐，可防止体系中pH过度降低。由图1可知，植物乳杆菌ZJ316在NaCl浓度为3％，6％和8％时存活率分别为89.03％，69.53％和18.44％，表明植物乳杆菌ZJ316可以在高渗透压环境下可存活，且存活率较高，此结果与Masuda等人报道的大多数LAB菌株耐渗透压性能相似。

1.6.2植物乳杆菌ZJ316耐乙醇性能

在工业发酵和食品加工过程中，细菌必须克服各种物理和化学屏障，才能发挥其作用，与耐高渗透压相似，乳酸菌对乙醇的耐受性也经常作为评价其在工业应用中的指标之一。如图2所示，随着乙醇浓度的增大，植物乳杆菌ZJ316的存活率逐渐降低，当乙醇浓度为5％时，植物乳杆菌ZJ316的存活率高达71％，当乙醇浓度为10％时，植物乳杆菌ZJ316的存活率依然保持在40％左右，由此说明，植物乳杆菌ZJ316的乙醇耐受性能良好。而Masuda等人研究发现大多数LAB 菌株当乙醇浓度大于5％时，其耐受性极差，存活率很低。

1.6.3植物乳杆菌ZJ316的胆盐耐受性能

乳酸菌在动物消化道中发挥其益生效果的前提是能够耐受胃酸和胆盐并在胃肠道中定植。动物体内消化道不同部位的胆盐质量分数不同，但通常在 0.03％～0.30％范围内，且宿主肠内细菌的定殖和代谢活动通常是1-4小时，胆汁盐通过其抗菌活性影响肠道菌群。如图3所示，经浓度为0.3％胆盐处理2h和4 h后，植物乳杆菌ZJ316的存活率分别为81％和73％，当浓度为0.5％胆盐处理2 h和4h后，植物乳杆菌ZJ316存活率依然较高，分别为62％和48％。由此可得，当胆盐质量分数在0.03％～0.30％范围内时，植物乳杆菌ZJ316保持着高存活率，说明其具有较强的耐胆盐能力。

1.6.4植物乳杆菌ZJ316的耐胃酸性能

由于胃蛋白酶的低pH特性和抗菌作用，胃液被认为是乳酸菌的首要生理挑战，此外，耐酸性是选择益生菌的重要条件。动物胃酸pH最低可达1.5，当食物摄入后，pH会迅速增高，甚至超过6.0，但通常情况下其pH介于2.5～3.5之间。从图4可知，当pH范围为2.0-3.5时，随着pH的增大，菌株存活率也随之增大。在pH为2的环境中处理2h和4h时菌株存活率依然相对较高，分别为 53％和47％。植物乳杆菌ZJ316在pH为3.5的环境下保持着高存活率，孵育2h 后其存活率为96％，保持4h后，存活率为92％。由此可知植物乳杆菌ZJ316能够耐受胃酸,可以通过胃进入肠道。这与以前报道中提到的大多数乳杆菌属在pH 为3.5时表现出良好的存活率，而当pH为2时活力较低的结果相一致。

乳酸菌只有克服了苛刻的外界环境，才能确保其在工业中的利用价值。我们通过体外模拟环境抗压实验(耐盐实验和耐乙醇实验)得知植物乳杆菌ZJ316在高盐(8％)和高浓度乙醇(12.5％)环境下，依然保持着较高存活率，即植物乳杆菌ZJ316环境抗压能力强，则为工业的利用奠定了一定的基础。经过模拟动物消化道实验得知经浓度为0.5％胆盐处理2h和4h后，其存活率分别为62％和48％；在人工胃液(pH3.5)孵育2h后存活率为96％，孵育4h后，存活率为92％，则说明植物乳杆菌ZJ316具有良好的耐酸性能和耐胆盐性能。

综上所述，植物乳杆菌ZJ316具有良好的环境抗压能力，可以选用为工业所用菌株。同时植物乳杆菌ZJ316也能够克服动物消化道的苛刻环境，初步说明其在动物肠道中的产生益生作用的可能。

2.植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳对DSS诱导的小鼠结肠炎的影响

研究发现益生菌可以明显改善人体肠道中菌群紊乱现象，提升人体免疫力，保护肠道粘膜，因而对炎症性肠病的缓解和改善具有非常积极的意义。

本发明中研究了植物乳杆菌ZJ316肠道环境耐受性能，结果发现其肠道耐受性能良好。以此结果为基础，选取8周龄BALB/c雄性小鼠180只，建立了DSS 急性和慢性结肠炎模型去探究植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳对溃疡性结肠炎的改善作用，为益生菌控制和改善肠炎及其相关疾病提供了技术基础。

本发明主要从植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳对DSS诱导的小鼠结肠炎炎症表现(小鼠体重，结肠长度及重量的变化和结肠病理情况)的影响、植物乳杆菌 ZJ316及其发酵乳对DSS诱导的小鼠结肠中炎症细胞因子转录水平(IL-1β、IL-6、 IL-8、IL-10、TNF-α和TGF-β)的影响、植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳对DSS诱导的小鼠结肠中短链脂肪酸含量(乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸和戊酸)的影响和植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳对DSS诱导的小鼠结肠中肠道菌群的影响四个方面来评价植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳对DSS对诱导的小鼠急性和慢性结肠炎的治疗作用。

3实验材料与方法

3.2.1实验菌株

植物乳杆菌ZJ316(Lactobacillus plantarum ZJ316)、Lactobacillus caseistrain Shirota。两株菌株均筛选自婴儿粪便和养乐多。

3.2.2实验动物

实验所用小鼠为8周龄雄性SPF(Specific pathogen free，无特定病原体) 级BALB/c小鼠，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。小鼠饲养在温度 25±2℃、12h昼夜交替的环境下，自由饮食，普通饮食适应一周后进行实验。

3.2.3实验试剂与耗材

表3-1实验试剂与耗材

3.2.4相关溶液配制

3.2.4.1培养基配制

3.2.4.2其它溶液配制

(1)2.5％(m/v)葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液配制：准确称取2.5g葡聚糖硫酸钠溶于100mL超纯水，并用旋涡震荡仪震荡使其彻底溶解。

(2)内标溶液配制：取2-乙基丁酸适量，用6％的磷酸溶液配制成浓度为 10μg/mL的内标溶液。

(3)乙酸对照溶液配制：精密称取乙酸20mg，用6％的磷酸溶液稀释，配制得2mg/mL的对照品储备液I。取对照品储备液I逐级稀释，制作一系列标曲溶液，精密取1mL溶液至顶空瓶，加入1mL内标溶液，密封。

(4)丙酸，丁酸，异丁酸，戊酸对照溶液配：精密量取丙酸，异丁酸，丁酸，戊酸适量，用6％的磷酸溶液稀释，配制得到2mg/mL的对照品储备液II，取对照品储备液II逐级稀释，制作一系列标曲溶液，精密量取1mL溶液至顶空瓶，加入1mL内标溶液，密封。

3.2.5实验仪器与设备

表3-2实验仪器与设备

3.2.6实验方法与内容

3.2.6.1植物乳杆菌ZJ316的培养、菌悬液和发酵上清液的制备。

将-80℃甘油管冻存的植物乳杆菌ZJ316于MRS固体平板划线接种，37℃厌氧培养24h复苏，经两次传代活化后转接于MRS液体，过夜培养菌液16-18h， 6000r/min离心10分钟，收集发酵上清液，菌泥用灭菌生理盐水(0.85％)洗涤两次后，再用生理盐水重悬，使菌悬液活菌数达约2.5×10⁹CFU/mL。

3.2.6.2 Lactobacillus casei strain Shirota的培养及菌悬液的制备。

将-80℃甘油管冻存的Lactobacillus casei strain Shirota于MRS固体平板划线接种，37℃厌氧培养48h复苏，经两次传代活化后转接MRS液体，过夜培养菌液18-20h，以8000r/min离心15分钟，弃上清，菌泥用灭菌生理盐水(0.85％) 洗涤两次后，再用生理盐水重悬，使菌悬液活菌数达约2.5×10⁹CFU/mL。

3.2.6.3植物乳杆菌ZJ316发酵乳的制备

量取一定量的新鲜牛乳，加入提前制备好的6％的植物乳杆菌ZJ316菌悬液，再加入7％的白砂糖，搅拌均匀后，置于酸奶机发酵8-12小时。发酵完毕后，放4℃冰箱中保存，备用。

3.2.6.4肠炎模型的建立、分组及给药。

正常喂食适应性培养一周后，将小鼠随机分为3组：

(1)空白对照组(Ctrl)(n＝10)：正常喂食直到实验结束。

(2)DSS急性肠炎组(n＝95)：正常饮食条件下将小鼠饮用的纯净水换成2.5％的DSS溶液连续7天，期间每隔两天换一次DSS溶液，建立小鼠急性结肠炎模型。

(3)DSS慢性肠炎组(n＝95)：正常饮食条件下将小鼠饮用的纯净水换成2.5％的DSS溶液连续7天，再换回纯净水饮用7天，以此作为一个周期，循环三个周期，建立小鼠慢性结肠炎模型^[120]。

DSS结肠炎模型建立成功后，急性肠炎组和慢性肠炎组分别分成9个小组，进行不同干预药物灌胃。

1)急性造模组(JZ)(n＝5)：造模成功后，将小鼠处死。取结肠组织保存，备用。

2)急性正常饮食组(JY)(n＝10)：造模成功后，小鼠正常饮食，持续5周，直到实验结束，将小鼠处死，取结肠组织保存，备用。

3)急性MRS组(JN)(n＝10)：造模成功后，灌胃MRS培养基200μL/10g，作为对照，持续5周，直到实验结束，将小鼠处死，取结肠组织保存，备用。

4)急性植物乳杆菌ZJ316发酵上清液组(JM)(n＝10)：造模成功后，灌胃植物乳杆菌ZJ316发酵上清液200μL/10g，作为对照，持续5周，直到实验结束，将小鼠处死，取结肠组织保存，备用。

5)急性植物乳杆菌ZJ316菌悬液组(JX)(n＝10)：造模成功后，灌胃植物乳杆菌ZJ316菌悬液200μL/10g(约2.5×10⁹CFU/mL)，持续5周，直到实验结束，将小鼠处死，取结肠组织保存，备用。

6)急性植物乳杆菌ZJ316发酵乳组(JH)(n＝10)：造模成功后，灌胃植物乳杆菌ZJ316发酵乳200μL/10g，持续5周，直到实验结束，将小鼠处死，取结肠组织保存，备用。

7)急性牛乳组(JF)(n＝10)：造模成功后，灌胃牛乳200μL/10g，作为对照，持续5周，直到实验结束，将小鼠处死，取结肠组织保存，备用。

8)急性美沙拉嗪组(JG)(n＝10)：造模成功后，灌胃美沙拉嗪(30.25mg/mL) 200μL/10g，作为阳性对照，持续5周，直到实验结束，将小鼠处死，取结肠组织保存，备用。

9)急性Lactobacillus casei strain Shirota组(JS)(n＝10)：造模成功后，灌胃干酪乳杆菌2535 200μL/10g(约2.5×10⁹CFU/mL)，作为阳性对照，持续5周，直到实验结束，将小鼠处死，取结肠组织保存，备用。

10)慢性造模组(MZ)(n＝5)：造模成功后，将小鼠处死。取结肠组织保存，备用。

11)慢性正常饮食组(MH)(n＝10)：造模成功后，小鼠正常饮食，持续5周，直到实验结束，将小鼠处死，取结肠组织保存，备用。

12)慢性MRS组(MS)(n＝10)：造模成功后，灌胃MRS培养基200μL/10g，作为对照，持续5周，直到实验结束,将小鼠处死，取结肠组织保存，备用。

13)慢性植物乳杆菌ZJ316发酵上清液组(MY)(n＝10)：造模成功后，灌胃植物乳杆菌ZJ316发酵上清液200μL/10g，作为对照，持续5周，直到实验结束，将小鼠处死，取结肠组织保存，备用。

14)慢性植物乳杆菌ZJ316菌悬液组(MQ)(n＝10)：造模成功后，灌胃植物乳杆菌ZJ316菌悬液200μL/10g(约2.5×10⁹CFU/mL)，持续5周，直到实验结束，将小鼠处死，取结肠组织保存，备用。

15)慢性植物乳杆菌ZJ316发酵乳组(MM)(n＝10)：造模成功后，灌胃植物乳杆菌ZJ316发酵乳200μL/10g，持续5周，直到实验结束，将小鼠处死，取结肠组织保存，备用。

16)慢性牛乳组(MG)(n＝10)：造模成功后，灌胃牛乳200μL/10g，作为对照，持续5周，直到实验结束，将小鼠处死，取结肠组织保存，备用。

17)慢性美沙拉嗪组(MF)(n＝10)：造模成功后，灌胃美沙拉嗪(30.25mg/mL) 200μL/10g，作为阳性对照，持续5周，直到实验结束，将小鼠处死，取结肠组织保存，备用。

18)慢性Lactobacillus casei strain Shirota组(MN)(n＝10)：造模成功后，灌胃干酪乳杆菌2535 200μL/10g(约2.5×10⁹CFU/mL)，作为阳性对照，持续5周，直到实验结束，将小鼠处死，取结肠组织保存，备用。

3.2.6.5指标测定

(1)实验期间小鼠体重的变化及生长活动情况。

动物实验持续期间，每周对小鼠称重一次，每只小鼠测三次体重求平均值作为当天小鼠体重，并观察小鼠生长活动情况。

(2)小鼠结肠长度测量。

实验结束后根据体重每组选出5只小鼠脱颈处死，新洁尔灭浸泡消毒后，于超净工作无菌解剖小鼠取整段结肠(盲肠末端至肛门)，测量长度。

(3)小鼠结肠重量的测定。

实验结束后根据体重每组选出5只小鼠脱颈处死，新洁尔灭浸泡消毒后，于超净工作无菌解剖小鼠取整段结肠(盲肠末端至肛门)，去除结肠粪便，然后称重。

(4)结肠石蜡切片和H&E染色及组织损伤评分。

1)结肠石蜡切片的制作

结肠石蜡切片的制作过程主要包括取样、固定、去除固定液，脱水、透明、浸蜡、修整和切片。

步骤一：取样和固定：取远端结肠1cm于10％的福尔马林中固定16-18h。

步骤二：去除固定液：然后将固定好的组织用流水冲洗24h以除去固定液。

步骤三：脱水：选择不同梯度的乙醇作为脱水剂将去除固定液的结肠组织进行脱水。70％、80％、90％、(每个梯度各30min)，95％和100％(每个梯度各20min，共进行两次)。

步骤四：透明：脱水后的结肠组织于酒精和二甲苯等比混合液中放置15min，后再浸入二甲苯I和二甲苯II各15min来完成透明工作；

步骤五：浸蜡、修整和切片：将透明后的结肠组织用EG1160石蜡包埋机(徕卡)进行石蜡包埋。将包埋好结肠组织待石蜡凝固，根据组织小块的位置对石蜡块进行修整；修整好的石蜡块采用RM2235轮转式切片机(徕卡)进行切片(4μm)。

2)结肠切片H&E染色

结肠切片H&E染色步骤主要包括展片和捞片、烤片、水化、脱水、苏木精染色、分化、漂洗、伊红复染、脱水、透明、封片，具体操作如下：

步骤一：展片和捞片：将切好的结肠切片置于45℃恒温水浴中进行展片，将展好的切片用载玻片小心地捞出；

步骤二：烤片：将切片置于37℃烘箱中过夜烘烤；

步骤三：水化：二甲苯I15min，二甲苯II 5min，二甲苯：无水乙醇(1:1) 2min

步骤四：脱水：100％乙醇I 5min，100％乙醇II 5min，80％乙醇5min，蒸馏水5min

步骤五：苏木精液染色：苏木精染色液中5min，水洗30min

步骤六：分化与漂洗：1％盐酸乙醇30s，水洗30s，蒸馏水过洗5s

步骤七：伊红复染：0.5％伊红液染色1-3min

步骤八：脱水：蒸馏水稍洗30s，80％乙醇稍洗30s，95％乙醇I1min，95％乙醇II1min，无水乙醇I 3min，无水乙醇II 3min

步骤九：透明：二甲苯I 3min，二甲苯II 3min

步骤十：封片：用中性树胶封片。

封片结束后用NIKON Eclipse Ci光学显微镜观察并拍照。成像系统为： NIKONdigital sight DS-FI2，MADE IN JAPAN，摄片倍数：25×、100×、200×。各个干预组分别选出3只对其结肠组织切片进行组织损伤评分，组织损伤评分包括炎症程度、病变深度、隐窝破坏和病变范围四个方面，具体标准见表3-3。

表3-3组织损伤评分标准

3.2.6.6结肠组织总RNA提取、反转录及实时荧光定量PCR

(1)结肠组织总RNA的提取

1)根据样本数量加1mL trizol于提前备好的无酶管中。于-80℃冰箱取出样品，插于冰上。迅速取约100mg(绿豆大小)动物组织放入Trizol溶液，做好标记。剩余组织尽快放回-80℃冰箱，所取样品于组织破碎仪以70Hz破碎90s。室温放置10分钟。

2)加入0.2mL氯仿(每1mL Trizol)，上下颠倒混匀，室温放置5min，溶液分成上下两层；

3)4℃，12000rpm离心15min；

4)小心吸取上层清液(约0.5mL)到一新的离心管中；

5)加入等体积异丙醇，轻柔颠倒混匀后室温放置10min，观察白色沉淀析出；

6)4℃，12000rpm离心10min，倒掉上清液，收集RNA沉淀；

7)加入1mL75％乙醇(无酶水稀释)洗涤RNA(上下颠倒使白色沉淀飘起)， 7500rpm离心5min4℃；

8)倒掉75％乙醇，瞬时离心，将管壁液体全部离心到管底。用白色枪头轻轻将液体全部吸走(不要吸走白色沉淀)。37℃吹干后加入20-100μL(根据沉淀量)的RNase-free或高温灭菌的DEPC水溶解；55℃放置5-10min彻底溶解RNA。

9)混匀样品后取1μL测定样品浓度以及纯度，260/280在1.8～2.1之间， 260/230在1.8-2.1之间为佳；取约1μg RNA用于琼脂糖胶电泳，检测其是否降解以及是是否有DNA污染；

10)将RNA样品于-80℃保存备用或进行下一步反转录。

(2)cDNA的制备

采用实时荧光定量PCR仪PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit将小鼠组织总RNA逆转录为cDNA，反转录体系如下：(10μL)

将上述10μL反转录体系于37℃孵育15min，完成后将cDNA置于-80℃冰箱保存备用。

(3)实时荧光定量PCR

根据要求配制实时荧光定量PCR(RT-qPCR)体系，用Bio-Rad Real-time System仪进行RT-qPCR，并通过溶解曲线和扩增曲线评估实时荧光定量PCR 数据质量。以GAPDH作为内参基因，对各个基因水平进行标准化；把急性与慢性组的空白对照组的基因水平设为1，其余各组的基因水平以相对于空白对照组表示。采用2^-ΔΔCt法对数据进行分析。RT-qPCR温度程序为：95℃ 3min， 95℃ 10sec，55℃ 10sec，72℃ 30sec共进行40个循环，所用qPCR引物序列见表3-4。

RT-qPCR体系如下(20μL)：

表3-4 RT-qPCR引物序列

3.2.6.7小鼠结肠中短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸)的测定

利用GC-MS测定各干预组小鼠结肠中短链脂肪酸的变化情况。

(1)样品处理

精密称取组织样品50mg加入1mL 6％的磷酸溶液匀浆，全部转移至20mL 顶空进样瓶中，加入1mL内标溶液，密封。

(2)气相色谱质谱条件

采用程序升温方式：起始温度80℃，以8℃/min的速率升至220℃，保持0.5 min，载气为高纯氦气，流速为1mL/min，分流比10:1，进样口温度200℃，FID 检测器温度250℃。采用静态顶空进样，孵化温度85℃，孵化时间30min，进样针温度95℃，进样体积为1mL。质谱条件：离子源温度250℃，采用选择离子监测模式：乙酸m/z＝60，丙酸m/z＝74，异丁酸m/z＝743，丁酸m/z＝60戊酸 m/z＝60，2-乙基丁酸m/z＝55。

(3)标准曲线绘制

将标曲溶液由浓度从低到高分别进样，采集提取GC-MS离子流图，记录各峰面积，绘制标准曲线。

(4)样品测定

按上述气相色谱条件分析样品，采集提取GC-MS离子流图，记录各峰面积，将各峰的峰面积比代入标曲计算样品中各成分的含量。

3.2.6.8各干预组小鼠结肠内菌群DNA提取和16S rRNA基因扩增子测序

采用(Zymo Research Corp)试剂盒提取结肠内菌群DNA。实验结束后，处死小鼠并解剖，取结肠，将新鲜的结肠组织液氮处理，用研钵研碎，然后按照试剂盒说明书进行样本DNA提取。将提取的组织总DNA用该试剂盒纯化柱纯化回收，再将纯化后的DNA用琼脂糖凝胶电泳验证，然后送北京诺禾致源生物信息科技有限公司测序。

3.3数据处理及分析方法

利用SPSS 23.0统计软件和OriginPro 9.0作图软件进行数据分析和作图。组间显著性差异分析比较采用单因素方差分析法(AVOVA)，结果以means±SEM 表示，图中上标字母不同表示具有显著性差异，显著水平为P<0.05。

3.4结果及分析

3.4.1实验期间小鼠体重的动态变化及生长活动情况

小鼠体重与生长活动情况是造模成功与否，以及干预药物是否对DSS诱导的肠炎有改善作用的重要标志。小鼠适应性生长七天后，进行称重并做标记，开始造模，此时小鼠体重达到20±1.8g。造模期间，称量小鼠体重，观察小鼠粪便状况、检测粪便隐血及肉眼血便情况。造模第二天，小鼠开始出现稀便现象，毛发卷曲，懒动，体重下降。随着造模时间的推移，小鼠体重持续下降，大便不成形，且粘附于肛门，用粪便隐血试纸检测小鼠粪便，结果发现，大部分小鼠粪便隐血试纸显弱阳性，即结肠开始出血，但肉眼未观察到明显的便血现象，小鼠继续饮用DSS溶液。造模第七天，检测小鼠粪便，所有小鼠粪便隐血试纸均出现阳性现象，并且有一部分，出现了肉眼可见的便血现象，体重严重下降，则急性组造模成功，开始灌胃干预药物，实验期间，小鼠体重动态变化如图5。慢性组小鼠饮用DSS溶液七天后，则将DSS溶液换成自由饮用水，以此作为一个周期，继续造模，循环三个周期后，造模成功，造模期间，小鼠生长活动情况同急性组。造模成功后，开始灌胃干预药物,实验期间小鼠体重动态变化如图6。干预药物开始灌胃后，急性和慢性组中物乳杆菌ZJ316及其发酵乳组小鼠相对其它组而言较为活跃。

如图5可知，造模成功后，急性组小鼠体重明显降低，由第一周的20±1.8g 下降到15±2.5g，但各处理组小鼠经过灌胃干预药物后体重均呈上升局势。第八周实验结束时，空白对照组小鼠体重由第一周的20±1.8g增加到24±0.9g；植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳组相对其它组而言体重上升趋势较快，实验结束时，小鼠体重分别为23.34±1.32g和24±0.72g。两组阳性对照组美沙拉嗪组和副干酪乳杆菌2535组上升趋势较植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳组而言稍弱，但比其它干预组较快，到第八周实验结束时，小鼠体重由造模成功后的15±2.5g分别增长到 23.10±0.26g和23.01+0.10g。正常饮食组、牛乳组、植物乳杆菌ZJ316发酵上清液以及MRS组小鼠体重分别增加到21.35±0.27g、21.01±1.30g、21.21±1.35g 和21.64±1.32g。整体来看，各处理组之间小鼠体重无统计学意义(p>0.05)，但实验结束时，灌胃了植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳的小鼠体重略大于其它干预组。由此说明，植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳具有促进由DSS诱导的小鼠体重恢复的功效。M.V.

等人发现Lactobacillus casei也具有相同功效。

如图6可知，慢性组造模成功后，小鼠体重为19.9±0.80g。灌胃干预药物后，各处理组小鼠体重均呈上升趋势。跟急性组相似，实验结束时，空白对照组小鼠体重由20±1.8g增加到26.12±0.34g。植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳组小鼠体重的增幅明显要大于其它干预组，且从第十周开始，此两组小鼠体重大于空白对照组，实验结束时，体重分别为27.01±0.81g和27.11±0.61g；阳性对照组中，美沙拉嗪组和副干酪乳杆菌2535组增幅较植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳组而言稍弱，但比其它干预组上升局势较快，实验结束时两组小鼠体重分别为26.31±0.32 g和27.13±0.24g，其中副干酪乳杆菌2535组大于空白对照组；实验结束时，正常饮食组、牛乳组、植物乳杆菌ZJ316发酵上清液以及MRS组小鼠体重分别为 25.35±0.50g、25.01±0.58g、25.21±0.35g和25.21±0.33g。实验期间，各组小鼠的体重并没有显著性差异(p>0.05)，但从最终结果看出，植物乳杆菌ZJ316、副干酪乳杆菌2535及其发酵乳可能会促进小鼠的饮食，从而促进小鼠的增长。王俊通等人在植物乳杆菌ZS2058通过产共轭亚油酸改善DSS诱导小鼠结肠炎的研究程中也发现，植物乳杆菌ZS2058也可使该肠炎模型小鼠体重恢复，这与植物乳杆菌ZJ316可促进DSS结肠炎小鼠体重恢复的结果一致。

总之，植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳能够促进由DSS诱导的急性和慢性结肠炎小鼠的体重恢复。

3.4.2小鼠结肠长度的变化

DSS诱导的结肠炎会使小鼠结肠变短，因此结肠长度是表征DSS诱导的结肠炎炎症程度的指标之一。实验结束后，处死小鼠并解剖，取整段结肠，测量其长度结果如图7(急性组小鼠结肠长度)和图8(慢性组小鼠结肠长度)所示。

如图7所示，与对照组(9.62±0.41cm)相比，造模组小鼠结肠长度(4.41±0.56cm)显著下降，而各个干预组不同程度阻止了这一结肠变短的趋势。由图看出，植物乳杆菌ZJ316组与植物乳杆菌ZJ316发酵乳组均显著维持了结肠的长度，阻止了结肠变短且与空白对照组没有显著性差异，小鼠的结肠长度分别为 9.12±0.38cm和9.32±0.58cm。两组阳性对照组美沙拉嗪组和副干酪乳杆菌2535 组与空白对照组相比也没有显著性差异，即美沙拉嗪和副干酪乳杆菌2535也显著阻止了结肠变短，但其中副干酪乳杆菌2535效果不及植物乳杆菌ZJ316组及其发酵乳(P<0.05)，结肠长度分别为8.70±1.20cm和8.01±0.30cm；与造模组相比正常饮食组、牛乳组、和植物乳杆菌ZJ316发酵上清液组小鼠结肠长度均显著增加(p<0.05)，结肠长度分别为7.78±0.72cm、7.71±1.03cm、7.08±1.01cm，但与植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳组相比，小鼠结肠长度存在明显差异(P<0.05)。由此说明，植物乳杆菌ZJ316组与植物乳杆菌ZJ316发酵乳组能有效的促进DSS 急性结肠炎小鼠结肠长度恢复。

如图8所示，与正常对照组(9.62±0.41cm)相比，造模组小鼠结肠长度 (6.41±0.26cm)显著下降(p<0.05)，而除植物乳杆菌ZJ316发酵上清液组外，其它各个干预药物均不同程度阻止了这一结肠变短的趋势。可以看出，其中植物乳杆菌ZJ316与植物乳杆菌ZJ316发酵乳组均显著维持了结肠的长度，阻止了结肠变短，且与空白对照组没有显著性差异，小鼠的结肠长度分别为8.12±0.38cm 和9.01±0.58cm。两组阳性对照组美沙拉嗪组和副干酪乳杆菌2535组与空白对照组相比没有显著性差异，即美沙拉嗪和副干酪乳杆菌2535也显著阻止了结肠变短，但其中副干酪乳杆菌2535效果显著不如植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳 (p<0.05)，结肠长度分别为8.11±0.20cm和7.01±0.30cm；正常饮食组、牛乳组和MRS组小鼠结肠长度与造模组相比虽存在显著性差异，结肠长度分别为 7.58±0.12cm、7.51±0.03cm、7.46±0.31cm，但效果远不及植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳(p<0.05)；植物乳杆菌ZJ316发酵上清液组结肠长度与造模组相似，没有显著差异，结肠长度为6.41±0.01cm。由此可知，与急性组相似，植物乳杆菌ZJ316组与植物乳杆菌ZJ316发酵乳组能有效的促进DSS慢性结肠炎小鼠结肠长度恢复。

以上结果表明，植物乳杆菌ZJ316组与植物乳杆菌ZJ316发酵乳组能够有效的阻止由DSS引起的小鼠结肠变短，与空白对照组相比，两组之间没有显著性差异。这与Yoda K等人发现乳酸菌Lactobacillus rhamnosus GG及其发酵乳可阻止UC发生的结果相似。由图还可看出，正常饮食组没有做任何处理，但较造模组而言，结肠长度也有所恢复，可能是由于DSS所建立的结肠炎模型，小鼠有自我恢复能力。由于造模方法的不同，慢性造模组结肠长度长于急性造模组。

3.4.3小鼠结肠重量的变化

与长度一样，结肠重量也为评估DSS诱导的结肠炎炎症状态提供了一个重要的指标，Takamura T等人发现的Lactobacillus bulgaricus OLL1181能促进DSS 结肠炎小鼠结肠重量的恢复。也有研究发现，乳酸菌发酵乳也具有有改善DSS 小鼠结肠炎的作用。以此为启发，我们也研究了植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳对 DSS结肠炎小鼠结肠的影响。干预实验结束后，处死小鼠并解剖，取整段结肠，去除粪便后测量其重量。结果分别如图9(急性组小鼠结肠重量)和图10(慢性组小鼠结肠重量)所示。

如图9所示，与正常对照组(0.54±0.12g)相比，造模组小鼠结肠重量(0.22 ±0.04g)显著降低，经过一段时间的干预后，各个干预组结肠重量均有不同程度的恢复。由图看出，其中植物乳杆菌ZJ316组、植物乳杆菌ZJ316发酵乳组及两组阳性对照组(美沙拉嗪组和副干酪乳杆菌2535组)结肠重量与空白对照组相似，没有显著性差异，小鼠的结肠重量分别为0.48±0.12g和0.52±0.05g、 0.51±0.12g和0.47±0.11g；正常饮食组、牛乳组和MRS组，植物乳杆菌ZJ316 发酵上清液组与造模组相比结肠重量存在显著性差异，即正常饮食、牛乳、MRS 和植物乳杆菌ZJ316发酵上清液也可使DSS急性结肠炎小鼠结肠重量有所恢复，但其效果明显不如植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳(P<0.05)，实验结束时，结肠重量分别恢复到0.36±0.09g、0.43±0.03g、0.38±0.06g和0.41±0.02g；各干预组结肠重量恢复结果与结肠长度的维持结果保持了一致。

如图10所示，造模组小鼠结肠重量(0.34±0.04g)与正常对照组(0.43± 0.12g)相比较明显降低，降低率为79％。经过灌胃一段时间干预药物后，除正常饮食组、MRS组和植物乳杆菌ZJ316发酵上清液组外其余各个干预组结肠重量均有不同程度的恢复。由图看出，其中植物乳杆菌ZJ316组和植物乳杆菌ZJ316 发酵乳组小鼠结肠重量与空白对照组相似，没有显著性差异，小鼠的结肠重量分别为0.40±0.12g和0.41±0.05g；两组阳性对照组(美沙拉嗪组和副干酪乳杆菌2535菌悬液组)小鼠结肠重量也有所恢复，但与空白对照组相比还存在显著的差异(P<0.05)，实验结束时，结肠重量分别恢复到0.37±0.02g和0.35±0.11g；牛乳组小鼠结肠重量(0.37±0.12g)与造模组相比有一定的恢复，但与植物乳杆菌ZJ316发酵乳组相比差异显著(P<0.05)；正常饮食组、MRS和植物乳杆菌ZJ316发酵上清液组与造模组相比结肠重量不存在显著性差异(p>0.05)，即正常饮食、MRS和植物乳杆菌ZJ316发酵上清液对DSS慢性结肠炎小鼠结肠重量恢复没有效果，实验结束时，结肠重量分别0.34±0.02g、0.33±0.05g和0.34 ±0.06g；由此可得，植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳能使DSS慢性结肠炎小鼠结肠重量恢复。

综上所述，植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳能够有效的促进由DSS诱导的急性和慢性结肠炎小鼠的结肠重量恢复。

3.4.4小鼠结肠H&E病理染色观察及组织损伤评分

组织病理观察与组织损伤评分是诊断结肠炎严重程度的有效手段，因而被医学界广泛应用。本课题通过对小鼠结肠进行H&E染色来观察各处理组对小鼠结肠组织病理变化的影响。小鼠处死后，取远端结肠1cm，进行H&E染色并拍照观察，结果如图11A-11B(急性组小鼠H&E染色结果)和图13A-13C(慢性组小鼠H&E染色结果)。各干预组分别选出3只小鼠根据组织病理评分标准对其结肠组织切片进行组织损伤评分结果如图12(急性组各干预组小鼠组织损伤评分结果)和图14(急性组各干预组小鼠组织损伤评分结果)。

3.4.4.1急性组小鼠结肠H&E病理染色观察及组织损伤评分

如图11A-11B所示，空白对照组(I空白对照组)结肠上皮结构完整，绒毛结构排列紧密整齐，含有丰富的杯状细胞，隐窝排列整齐规则，腺体结构完整，未见炎症细胞浸润；由造模组H&E染色结果来看，DSS成功诱导了小鼠溃疡性结肠炎的发生(II造模组)，病变范围达到70％左右(B1红色箭头所示)，视野中肠组织可见溃疡，黏膜层局部肠腺及上皮结构完全丧失，绒毛、隐窝结构消失，黏膜层大量结缔组织增生，(B2棕色箭头所示)；并伴有大量炎性细胞浸润，(B3 黄色箭头所示)；炎症侵及黏膜下层，(B2蓝色箭头所示)；部分肠腺腔轻度扩张， (B2绿色头所示)；肠腔内可见脱落的上皮细胞，(B3黑色箭头所示)，且造模组的结肠组织损伤评分为12.50±0.57，相对于正常对照组(组织损伤评分为0) 显著升高；与造模组相比，其它各干预组均不同程度的减缓了结肠炎炎症的症状，从而减轻了DSS引起的结肠组织病变，但与空白对照组相比，各干预组任有炎症存在。其中植物乳杆菌ZJ316和植物乳杆菌ZJ316发酵乳显著减轻了DSS引起的结肠组织病变，病变范围很大程度的缩小，大部分肠上皮结构完整，存在完整的隐窝结构，保留了大量的杯状细胞，但依然有少量的炎性细胞浸润(D3红色箭头，G3黄色箭头所示)炎性细胞浸润未至黏膜下层，植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳组的组织损伤评分分别为2.25±0.75和2±0.65；两阳性对照组(美沙拉嗪组和副干酪乳杆菌2535菌悬液组)，病变范围虽有缩小，但还有部分炎性细胞浸润(I2、I3和J3蓝色箭头所示)，且浸润至粘膜下层(I3和J3黄色箭头所示)组织损伤分别为2.3±0.75和2.6±0.65；正常饮食组、MRS组、植物乳杆菌ZJ316发酵上清液组和牛乳组，病变范围依然较广，对DSS引起的结肠组织损伤改善效果弱，有较多的炎性细胞浸润(C3、E3、F1和H1黄色箭头所示)，黏膜层隐窝结构消失，上皮结构被破坏(C2、E2、F2和H2红色箭头所示)，大量的炎性细胞浸润至黏膜下层(C3、E3、F3和H3绿色箭头所示)其组织损伤评分别为5.20±0.31、5.31±0.22、7.31±0.16和5.11±0.23。

综上所述，植物乳杆菌ZJ316和植物乳杆菌ZJ316发酵乳组能够有效的改善 DSS急性结肠炎小鼠结肠粘膜损坏情况。

3.4.4.2慢性组小鼠结肠H&E病理染色观察及组织损伤评分

如图13A-13C所示，与急性组相似，慢性空白对照组(I空白对照组)结肠上皮结构完整，绒毛结构排列紧密整齐，含有丰富的杯状细胞，隐窝排列整齐规则，腺体结构完整，但部分肠腺腔轻度扩张，(K3绿色头所示)，组织损伤评分为(1.6±0.4)；由造模组H&E染色结果来看，DSS成功诱导了小鼠溃疡性慢性结肠炎的发生(II造模组)，病变范围达到40％左右(L1红色箭头所示)，视野中肠组织可见溃疡，黏膜层局部肠腺及上皮结构完全丧失，绒毛、隐窝结构消失，黏膜层大量结缔组织增生，(L3棕色箭头所示)；并伴有大量炎性细胞浸润，(L3 黄色箭头所示)；炎症侵及黏膜下层，(L3蓝色箭头所示)；部分肠腺腔轻度扩张， (L3绿色头所示)；肠腔内可见脱落的上皮细胞，(L3黑色箭头所示)，且造模组的结肠组织损伤评分为11.50±0.17，相对于正常对照组(组织损伤评分为 1.5±0.01)显著升高(P<0.05)；经过一段时间的治疗药物灌胃后，各干预组均不同程度的减缓了慢性结肠炎炎症的症状，从而减轻了DSS引起的结肠组织病变，但与对照组相比，各干预组任有不同程度的炎症存在。其中植物乳杆菌ZJ316显著减轻了DSS引起的结肠组织病变，病变范围很大程度的缩小，大部分肠上皮结构完整，存在完整的隐窝结构，大量的杯状细胞排列整齐规则，但依然有部分炎性细胞浸润(N3黄色箭头所示)，炎性细胞浸润未至黏膜下层，肠腔内可见脱落的上皮细胞，(N2蓝色箭头所示)，植物乳杆菌ZJ316组织损伤评分为4.17±0.15；植物乳杆菌ZJ316发酵乳组也显著减轻了DSS引起的结肠组织病变，也可使病变范围很大程度的缩小，大量溃疡消失，视野中大部分肠上皮结构完整，存在完整的隐窝结构，大量的杯状细胞排列整齐规则，但依然有一小部分黏膜层固有层中可见较多的炎性细胞浸润(Q2黑色箭头所示)，且浸润至粘膜下层(Q2黄色箭头所示)，损伤未侵及肌层，其组织损伤评分为5.56±0.65；两阳性对照组(美沙拉嗪组和副干酪乳杆菌2535菌悬液组)，病变范围虽有缩小，但还有部分粘膜层有较多炎性细胞浸润(S1和T3蓝色箭头所示)，溃疡依然比较严重，且炎性细胞浸润至粘膜下层(S3和T2黄色箭头所示)，此外，两阳性对照组相比较，副干酪乳杆菌2535菌悬液对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎改善效果更好，组织损伤分别为6.83±1.02和5.33±0.03；正常饮食组、MRS组、植物乳杆菌ZJ316 发酵上清液组和牛乳组，病变范围依然较广(M1、Q1、P1和R1红色箭头所示)，对DSS引起的结肠组织损伤改善效果弱，有较多的炎性细胞浸润(M3、Q3、P3 和R3黄色箭头所示)，黏膜层隐窝结构消失，上皮结构被破坏(M2、Q2、P2 和R2黑色箭头所示)，大量的炎性细胞浸润至肌层(M3、Q2、P3和R3绿色箭头所示)其组织损伤评分别为8.16±0.31、6.31±1.02、8.71±0.16和8.16±0.23；

综上所述，植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳能够有效的改善DSS结肠炎小鼠结肠粘膜损坏情况，这与Matsumoto S等人发现Lactobacillus and Lactobacillus-fermentedmilk能促进DSS小鼠肠道粘膜修复的结果一致。此外，比较急性和慢性组小鼠结肠H&E病理染色及组织损伤评分结果也可看出，植物乳杆菌ZJ316和植物乳杆菌ZJ316发酵乳对DSS诱导的急性溃疡性结肠炎的改善效果更好。

3.4.5各处理组小鼠结肠中炎症细胞因子的转录水平

研究表明，炎症性肠病(IBD)发病机理与过度活跃、失衡的肠道黏膜免疫反应有很大关系，各炎性因子的转录水平能间接反映炎症的严重程度。前炎性细胞因子白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素8(IL-8)在炎症性肠病的发病中起着重要作用，其中IL-1β是一种致炎细胞因子，广泛参与动物组织破坏、水肿形成等多种病理损伤过程。IL-8能刺激中性粒细胞、T淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的趋化，从而损伤内皮细胞，使组织坏死，造成器官功能损伤^[125]。白细胞介素6 (IL-6)能与TNF-α和IL-1相互协同，产生IBD特有的炎症反应^[131]，是炎性反应的促发剂。肿瘤坏死因子(TNF-α)在IBD发病过程中是一个关键性的促炎性细胞因子，且在IBD治疗中TNF-α是关键的靶点之一。它能诱导细胞因子合成并产生级联反应，进一步促进其他促炎性细胞因子的产生，如IL-1β、IL-6和IL-8 等，最终导致组织发生炎症^[132]。白细胞介素10(IL-10)主要由Th2细胞和单核巨噬细胞产生，能够抑制前炎症细胞因子的产生，可刺激B细胞分化增殖，促进抗体生成。转化生长因子(TGF-β)主要在炎症、组织修复和胚胎发育等方面有重要的作用，能够抑制细胞因子IFN-γ和TNF-α等的产生^[133]。

本发明中分别检测了急性组各处理组小鼠结肠组织促炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8)和慢性组各处理组促炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6) 以及抑炎性细胞因子(IL-10和TGF-β)的mRAN水平的变化，来探究植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳对DSS诱导的结肠炎小鼠结肠免疫反应的影响。结果分别如图15A-15D(急性组各处理组炎症细胞因子转录水平)和16A-16E(慢性组不同处理组炎症细胞因子转录水平)所示.

注：图15A-D分别为IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的相对转录水平；

图中上标字母不同表示具有显著性差异，P<0.05。

如图15A-15D所示，整体来看，与空白对照组(IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8 转录水平分别为：0.40±0.16、2.87±0.12、1.08±0.13和0.12±0.08)相比，急性造模组小鼠结肠中促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8转录水平(2.22±0.14、 10.10±0.11、4.08±0.13和3.45±0.18)均显著升高。经过一段时间的干预药物灌胃后，各促炎性细胞因子在不同处理组中转录水平均有所不同。由图15(A)可知，植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳均下调了IL-1β转录水平(0.45±0.04和0.56±0.11)，与空白对照组(0.40±0.07)相比转录水平几乎回到正常水平(P>0.05)；两阳性对照组(美沙拉嗪组和副干酪乳杆菌2535菌悬液组)中，美沙拉嗪显著下调了 IL-1β转录水平(0.73±0.36)，与空白对照组相比没有显著性差异(P>0.05)，而副干酪乳杆菌2535虽然也可使IL-1β转录水平(1.08±0.12)有所下调，但效果不如美沙拉嗪，与造模组相比没有显著性差异(P>0.05)。与造模组相比，正常饮食组IL-1β转录水平(0.94±0.09)显著下调，且与空白对照组没有显著性差异 (P>0.05)，但与植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳相比效果较弱，这可能是由于DSS 诱导的下属，在自行恢复过程中，可使某些促炎因子下调。MRS、植物乳杆菌 ZJ316发酵上清和牛乳组，与造模组相比IL-1β转录水平几乎没有下调，其转录水平分别为1.98±0.07、1.08±0.79和1.67±0.13，说明MRS、植物乳杆菌ZJ316 发酵上清和牛乳均不能使IL-1β转录水平降低。如图15B，在各处理组中，植物乳杆菌ZJ316和植物乳杆菌ZJ316发酵乳组均显著下调了IL-6的转录水平 (0.96±0.04和1.44±0.14)甚至低于空白对照组IL-6的转录水平(2.56±0.02， P<0.05，)。两阳性对照组中，美沙拉嗪显著下调了IL-6转录水平(8.21±0.06)，但其转录水平依然显著高于空白对照组(P<0.05)。而副干酪乳杆菌2535组IL-6 转录水平(9.37±0.14)与造模组相似，没有显著性差异(P>0.05)，说明副干酪乳杆菌2535没有下调IL-6转录水平。正常饮食、MRS、植物乳杆菌ZJ316发酵上清和牛乳组IL-1β转录水平几乎，与造模组相似，其转录水平分别为9.62±0.04、 7.44±0.19、10.43±0.03和9.46±0.12。在图15(C)中，各处理组均不同程度下调了促炎性细胞因子TNF-α的表达。其中植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳组均显著下调了TNF-α的转录水平(0.98±0.04和0.84±0.14)，与空白对照组(1.07±0.01) 相比小鼠结肠的TNF-α转录水平几乎回到正常水平(P>0.05)。两阳性对照药物均显著下调了TNF-α转录水平(0.97±0.04和1.36±0.06)，且转录水平几乎回到正常值。正常饮食、MRS、植物乳杆菌ZJ316发酵上清和牛乳组，TNF-α转录水平(1.72±0.10、2.02±0.03、2.32±0.11和1.56±0.01)，均低于造模组，与植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳还存在明显差异(P<0.05)。由图15(D)可知，植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳(0.09±0.04和0.05±0.02)，两阳性对照药物(0.09±0.07 和0.14±0.02)，使均能使IL-8的转录水平下调并回到正常值。正常饮食、MRS、植物乳杆菌ZJ316发酵上清液和牛乳组中，MRS和植物乳杆菌ZJ316发酵上清液均可使IL-8的转录水平(0.15±0.08和0.17±0.06)下调，但效果明显不及植物乳杆菌ZJ316(P<0.05)，而正常饮食组和牛乳组IL-8转录水平(1.05±0.06和 1.01±0.04)与造模组相似，没有显著性差异(P<0.05)。

Jun Hua X等人发现植物乳杆菌NCU116及其该菌株发酵的胡萝卜浆可通过调节小鼠肠粘膜免疫反应来改善小鼠肠道健康。由本实验的结果可知，DSS引起小鼠结肠促炎性细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8表达量显著上调，可能因此导致小鼠结肠免疫紊乱，加剧炎症和对结肠组织的破坏，而植物乳杆菌ZJ316 和植物乳杆菌ZJ316发酵乳能显著下调促炎性细胞因子的表达，由此说明植物乳杆菌ZJ316和植物乳杆菌ZJ316发酵乳对宿主免疫应答也具有调节作用。

注：图E-I分别为IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β的相对转录水平；

图中上标字母不同表示具有显著性差异，P<0.05

Note：Figure a-d shows the relative transcriptional levels of IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10and TGF-β,respectively Superscript with different letters onthe bars are significantly different by Duncan's mμLtiple range test(P<0.05).

如图16A-16E所示，与急性组相似，与空白对照组(IL-1β、IL-6和TNF-α转录水平分别为：0.77±0.10、0.39±0.02和0.63±0.10)相比，慢性造模组小鼠结肠中促炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α转录水平(1.77±0.04、1.60±0.11和 1.61±0.12)均显著升高。经过一段时间的干预药物灌胃后，各促炎性细胞因子在不同处理组中转录水平均有所不同。由图16A-16C可知，植物乳杆菌ZJ316 (0.54±0.07、0.09±0.10和0.69±0.01)和植物乳杆菌ZJ316发酵乳(0.65±0.02、 0.10±0.10和0.68±0.03)均可显著下调小鼠结肠中促炎性细胞因子IL-1β、IL-6 和TNF-α的转录水平，与空白对照组相比几乎回到正常水平(P>0.05)。两阳性对照药物美沙拉嗪和副干酪乳杆菌2535菌悬液均下调了IL-1β和IL-6(图16A和16B)的转录水平，且与空白对照组相比没有显著性差异(P>0.05)，IL-1β和 IL-6的转录水平分别为0.85±0.02和0.11±0.10和0.90±0.03和0.15±0.01，而两阳性对照组小鼠结肠中促炎细胞因子TNF-α转录水平均与造模组相似，没有下调 (图16C)，其转录水平分别为1.05±0.13和0.89±0.14。正常饮食组和MRS组小鼠结肠中IL-1β、IL-6和TNF-α的转录水平(图16A、16B和16C)几乎与造模组相同(P>0.05)，转录水平分别为1.14±0.04和1.89±0.09(IL-1β)，1.01±0.14 和1.08±0.15(IL-6)和1.49±0.08、1.06±0.07(TNF-α)。植物乳杆菌ZJ316发酵上清液和牛乳均未使小鼠结肠中促炎性细胞因子IL-1β(0.22±0.07)和TNF-α(1.18±0.10)的转录水平下调(P>0.05)，但此两种药物均抑制了IL-6的表达，其转录水平分别为0.22±0.03和0.16±0.02，但与植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳相比，下调作用较弱。本课题组还测定了慢性组各处理组小鼠结肠中抑炎性细胞因子(IL-10和TGF-β)的mRAN水平的变化结果如图16D和16E所示。与空白对照组(0.98±0.02和1.37±0.10)相比，造模组小鼠结肠中抑炎性细胞因子IL-10 和TGF-β转录水平(0.10±0.02和0.26±0.05)显著下降。经过五周干预药物灌胃后，植物乳杆菌ZJ316(0.39±0.12和0.58±0.07)及其发酵乳(0.56±0.09和0.51±0.03) 均显著上调了抑炎性细胞因子IL-10和TGF-β转录水平。两阳性对照组小鼠结肠中抑炎性细胞因子IL-10(0.29±0.01和0.29±0.04)和TGF-β(0.42±0.04和0.48±0.04) 转录水平也有所上调，但两阳性对照药物上调作用不及植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳。抑炎性细胞因子IL-10和TGF-β转录水平在正常饮食组(0.17±0.04和0.29±0.07)、MRS组(0.17±0.05和0.25±0.02)、植物乳杆菌ZJ316发酵上清液组 (0.19±0.03和0.25±0.05)和牛乳组(0.13±0.04和0.21±0.08)小鼠结肠中虽均有不同程度的上调，但与造模组相比均无统计学意义(P>0.05)。

总之，植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳均能显著下调由DSS诱导的小鼠慢性结肠中促炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRAN转录水平，并能显著促进抑炎性细胞因子IL-10和TGF-β的表达。这些结果证明了，一些报道提到的植物乳杆菌及其乳制品可通过促进小鼠结肠粘膜免疫反应平衡来调节宿主免疫应答的作用。

3.4.6植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳对DSS诱导的结肠炎小鼠结肠中短链脂肪酸含量的影响

肠道中短链脂肪酸(SFCAs)主要通过微生物降解未消化的碳水化合物和少量的蛋白质而产生，对肠道健康至关重要。本发明利用GC-MS法分别检测了急性和慢性组各处理组小鼠结肠组织中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸和戊酸的含量，来探究植物乳杆菌ZJ316和植物乳杆菌ZJ316发酵乳对各处理组小鼠结肠中短链脂肪酸含量的影响。结果如图17A-17E(急性组各处理组小鼠结肠中短链脂肪酸含量)和图18A-18E(慢性组各处理组小鼠结肠中短链脂肪酸含量)所示。

注：图17A-E分别为各处理组小鼠结肠组织中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸和戊酸的含量

图中上标字母不同表示具有显著性差异，P<0.05

如图17A-17E所示，与空白对照组(乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸和戊酸含量分别为：1.85±0.37mg/g、387.46±36.12μg/g、14.93±4.11μg/g、238.67μg/g±32.12 和6.38±2.73μg/g)相比，造模组小鼠结肠组织中乙酸(1.85±0.89mg/g)、丙酸 (387.46±11.72μg/g)、异丁酸(14.93±4.86μg/mg)、丁酸(238.67±22.54μg/g) 和戊酸(6.38±1.74μg/g)的含量均显著降低，说明经DSS诱导后，小鼠结肠中短链脂肪酸含量会显著降低。经各干预药物干预5周后发现，植物乳杆菌ZJ316 小鼠结肠中乙酸(3.14±0.97mg/g)、丙酸(336.95±17.23μg/g)、异丁酸(19.93±5.89 mg/g)、丁酸(374.24±16.72μg/g)、戊酸(21.62±7.86μg/mg)的含量均显著增加，且除丙酸略低于空白对照组外，其余四个短链脂肪酸含量均显著高于空白对照组 (p>0.05)。植物乳杆菌ZJ316发酵乳也能使乙酸(1.17±0.19mg/g)、丙酸(143.41±14.72μg/g)、异丁酸(8.26±2.86μg/mg)、丁酸(130.66±12.54μg/g)和戊酸(8.70±1.79μg/g)的含量增加，但效果不如植物乳杆菌ZJ316。两阳性对照组中，美沙拉嗪组小鼠结肠中乙酸(0.75±0.17mg/g)、丙酸(147.25±19.23μg/g)、异丁酸(7.01±2.89mg/g)、丁酸(50.60±16.72μg/g)、戊酸(1.96±0.86μg/mg) 含量与造模组相近，没有显著性差异(p>0.05)，即美沙拉嗪不会影响由DSS诱导的急性溃疡性结肠炎小鼠结肠中短链脂肪酸含量的变化。而副干酪乳杆菌2535 可使结肠炎小鼠结肠中乙酸(3.96±1.17mg/g)、丙酸(315.04±27.23μg/g)、异丁酸(10.64±2.85mg/g)、丁酸(482.61±55.72μg/g)、戊酸(15.87±2.86μg/mg)含量均有所增加，且除丙酸和异丁酸外，其余三个短链脂肪酸含量都显著高于空白对照组(p<0.05)。灌胃了植物乳杆菌ZJ316发酵上清液的小鼠结肠中，乙酸(1.22±0.17mg/g)、丙酸(135.71±37.23μg/g)、异丁酸(9.74±2.85mg/g)、丁酸 (284.18±35.72μg/g)和戊酸(12.81±2.46μg/mg)含量均增加，且除乙酸和丙酸外，其它三个短链脂肪酸含量均显著高于造模组(p<0.05)，这是由于植物乳杆菌ZJ316经发酵后能产生短链脂肪酸，且这些短链脂肪酸存在于发酵上清液中，但其对小鼠结肠中短链脂肪酸的影响不及植物乳杆菌ZJ316。正常饮食组和MRS 组小鼠结肠中丙酸(143.98±23.43μg/mg和164.72±25.17μg/mg)、异丁酸 (10.78±3.45和12.45±3.14μg/mg)、丁酸(74.18±19.27μg/mg和200.21±77.23 μg/mg)和戊酸(9.58±2.63μg/mg和12.22±4.23μg/mg)均有所增加，但乙酸 (0.77±0.12μg/mg和0.76±0.12μg/mg)含量与造模组相似，几乎没有增加。牛乳组小鼠结肠中，乙酸(0.62±0.17mg/g)、丙酸(117.32±21.23μg/g)、异丁酸 (5.63±0.85mg/g)、丁酸(40.59±1.72μg/g)、戊酸(1.09±0.46μg/mg)含量与造模组相似，无显著性差异(p>0.05)。

综上所述，植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳均能促进由DSS诱导的急性溃疡性结肠炎小鼠结肠中短链脂肪酸的产生。

如图18A-18E所示，图18A-18E分别为各处理组小鼠结肠组织中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸和戊酸的含量，整体来看，与空白对照组(乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸和戊酸含量分别为：3.32±0.97mg/g、530.35±56.12μg/g、17.40±4.11μg/g、 569.74±42.13μg/g和34.16±6.73μg/g)相比，慢性造模组小鼠结肠组织中乙酸 (0.88±0.19mg/g)、丙酸(128.79±44.72μg/g)、异丁酸(5.96±1.86μg/mg)、丁酸(79.37±12.54μg/g)和戊酸(4.06±1.34μg/g)的含量均显著降低(p<0.01)，说明DSS诱导可导致小鼠结肠中短链脂肪酸代谢受阻。经各干预药物干预5周后发现，植物乳杆菌ZJ316可使小鼠结肠中乙酸(1.77±0.87mg/g)、丙酸(292.65±37.23μg/g)、异丁酸(19.67±5.79mg/g)、丁酸(556.09±36.72μg/g)、戊酸(19.56±8.86μg/mg)的含量增加，其中，异丁酸、丁酸和戊酸含量显著增加(p<0.05)。两阳性对照干预药物中，美沙拉嗪能使组小鼠结肠中丙酸 (200.80±33.23μg/g)、异丁酸(22.03±4.89mg/g)、丁酸(147.77±16.92μg/g)、戊酸(17.57±3.86μg/mg)含量增加，但乙酸含量(0.63±0.13mg/g)没有增加。而副干酪乳杆菌2535均可使小鼠结肠中乙酸(1.26±0.17mg/g)、丙酸 (211.16±29.23μg/g)、异丁酸(13.86±3.87mg/g)、丁酸(314.48±35.72μg/g)、戊酸(14.91±2.56μg/mg)含量增加。与急性组相似，灌胃了植物乳杆菌ZJ316 发酵上清液后，小鼠结肠中乙酸(1.41±0.72mg/g)、丙酸(221.96±23.42μg/g) 异丁酸(15.20±3.85mg/g)、丁酸(378.01±34.12μg/g)和戊酸(20.08±5.46μg/mg) 含量均能增加(p<0.05)，其中异丁酸、丁酸和戊酸显著增加，但其对小鼠结肠中短链脂肪酸含量的影响不及植物乳杆菌ZJ316。与造模组相比，正常饮食组小鼠结肠中异丁酸(14.96±2.45μg/mg)、丁酸(364.94±29.27μg/mg)和戊酸 (15.18±3.63μg/mg)含量均显著上升(p<0.05)，乙酸(1.48±0.24)、丙酸 (227.45±23.50μg/mg)含量有一定的增加，但无显著性差异(p>0.05)。由此说明，DSS慢性结肠炎小鼠在自我恢复的过程中，短链脂肪酸代谢系统也可能有所恢复。牛乳也可促进小鼠结肠中，乙酸(1.33±0.07mg/g)、丙酸(217.64±21.23μg/g)、异丁酸(11.28±0.35mg/g)、丁酸(196.11±11.72μg/g)、戊酸(19.15±3.46μg/mg) 含量上升，但其效果远不如植物乳杆菌ZI316发酵乳(p<0.05)。MRS组小鼠结肠中乙酸(0.76±0.12mg/g)和丙酸(164.72±22.31μg/g)含量与造模组相似，几乎没有增加，异丁酸(12.45±4.73μg/g)、丁酸(200.21±23.15μg/g)和戊酸 (12.22±2.14μg/g)含量与造模组比虽显著增加(p<0.05)，但远低于与植物乳杆菌ZJ316组(p<0.01)。

Zhao L等人在研究溃疡性结肠炎发病机制时发现，当小鼠结肠粘膜脂肪酸代谢受阻时，则会引起相关肠道疾病的发生。也有研究报道，UC患者肠道中脂肪酸含量变低，尤其是起抗炎作用的乙酸含量更是微乎其微，这是由于UC在发病过程中，肠道通透性增加，致使病原菌入侵肠道，使益生菌失去优势，从而减少了产短链脂肪酸菌株的数目，进而导致了脂肪酸代谢受阻，最终引发结肠炎等肠道疾病。从实验结果可以看出，植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳均能有效促进由 DSS诱导的急性和慢性结肠炎小鼠结肠中短链脂肪酸的产生，说明植物乳杆菌 ZJ316可通过代谢作用产生短链脂肪酸，从而调节了小鼠肠道脂肪酸的代谢平衡，进而减缓了DSS结肠炎症状。

3.4.7植物植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳对DSS诱导的结肠炎小鼠肠道菌群的影响

3.4.7.1 16S rRNA基因高通量测序结果分析

采用Illumina测序平台对21组(空白对照组、急性组和慢性组)小鼠105 个结肠样品中微生物群落进行16S rDNA(V3-V4高变区)进行高通量测序，获得的数据经筛选，优化和拼接，对拼接后的序列进一步去除嵌合体等质控后获得高质量的序列，再对高质量的序列在0.97相似度下进行聚类，对聚类后的序列进行嵌合过滤后，得到用于物种分类的OTU(Optical Transform Unit)，最后统计各个样本OTU中的丰度信息，进行下一步分析。

测序深度是否达到要求，测序数据量是否合理是由测序稀释曲线决定的。稀释曲线主要用于反映测序数据量是否达到要求，并能间接反映样品中物种的丰富程度，当曲线趋向平坦时，说明测序深度达到要求，测序数据量合理；若与之相反，则说明样品中物种多样性较高，测序深度不够，还存在较多未被检测到的物种。如图19显示的是21个组别小鼠胃样品高通量测序的稀释曲线。由图可得，随着sequence取样的增加，OTUS曲线趋于平稳，表明测序深度已基本覆盖样品中所有物种，即测序深度达到实验要求。

3.4.7.2植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳对DSS诱导的结肠炎小鼠肠道菌群结构组成的影响。

(1)植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳在“门”水平上对小鼠结肠菌群结构组成的影响。

由OTU的物种注释的结果，通过不同组分的菌群构成比例，我们在细菌“门”水平对21个组别的小鼠结肠样品中相对丰度为top10的菌群绘制柱状图并进行了比较分析。如图20所示，各处理组小鼠结肠中的优势菌群为厚壁菌门 (Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、和变形菌门(Proteobacteria)，其中厚壁菌门和拟杆菌门是最主要菌群，平均占到了各个样品总OUT的50％左右。由图也可知，在急性组中，造模组(JZ)与空白对照组(Ctrl)相比，Firmicutes 比例减少，Bacteroidetes和Proteobacteria比例增多。植物乳杆菌ZJ316(JX)及其发酵乳组(JH)小鼠结肠中，Firmicutes所占比例较多，Bacteroidetes和 Proteobacteria比例较少；与造模组相比，两阳性对照组中，美沙拉嗪组(JG) 小鼠结肠中Firmicutes所占比例增多，Bacteroidetes和Proteobacteria比例减少，但其中Bacteroidetes比例高于植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳组，而副干酪乳杆菌 2535(JS)组中Firmicutes所占比例减少，Bacteroidetes和Proteobacteria比例增多。在慢性组中，三个主要菌群Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria分别在造模组(MZ)、空白对照组(Ctrl)、植物乳杆菌ZJ316(MQ)及其发酵乳组 (MM)、美沙拉嗪(MF)和副干酪乳杆菌2535组(MN)中的比例与急性组相似。综上所述，经DSS诱导后，小鼠结肠中厚壁菌门比例减少，拟杆菌门和变形菌门比例增多，而经植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳灌胃后，小鼠结肠中厚壁菌门比例增加，而拟杆菌门和变形菌门减少，说明植物乳杆菌ZJ316及其发酵可抑制致病菌的繁殖。

(2)植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳在“属”水平上对小鼠结肠菌群结构组成的影响。

我们在细菌“属”水平对21个组别的小鼠结肠样品中相对丰度top10的菌群绘制柱状图，结果如图21所示。21组样品在属群水平上的菌群组成方面，急性造模组(JZ)样品中的菌群主要包含Bacteroides、Helicobacter、 unidentified_lachnospiraceae和Alistipes等多个属，而Lactobacillus和 Faecalibacterium未检出。空白对照组(Ctrl)、植物乳杆菌ZJ316(JX)及其发酵乳组(JH)的样品中，菌群包含Bacteroides、Helicobacter、unidentified_lachnospiraceae、Alistipes、Faecalibacterium和Lactobacillus属，另外，Bacteroides、Helicobacter和Alistipes这三个属与造模组相比，比例均减小。两阳性对照组美沙拉嗪(JG)和副干酪乳杆菌2535组(JS)小鼠结肠中菌群主要包Bacteroides、Helicobacter、unidentified_lachnospiraceae、Alistipes和 Lactobacillus属，且与造模组比，Bacteroides、Helicobacter和Alistipes这三个属的比例也均减小。慢性组各处理组样品中，在属水平上小鼠肠道菌群结构组成与急性组相似。Bacteroides属是肠道中的主要病原菌，Alistipes属可能导致肠道炎症，Helicobacter属可引起创伤感染，甚至腹膜炎等。而Faecalibacterium属中有些菌株具有抗炎功能，Lactobacillus属可维持动物肠道的健康。综上所述，植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳有利于提高由DSS诱导的结肠炎小鼠结肠中有益菌群的数量；同时，对致病菌的生长亦具有一定的抑制作用，从而改善紊乱的肠道菌群。

肠道中的拟杆菌门主要为拟杆菌纲，是肠道中许多条件病原菌的来源。厚壁菌门在肠道中能够帮助多糖发酵，厚壁菌门包括芽孢杆菌纲(芽孢杆菌目和乳杆菌目)，其中芽孢杆菌属的主要作用是维持动物肠道的健康。变形菌门是细菌中最大的一门，包括大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、幽门螺旋杆菌等病原菌，这类细菌易引起动物腹泻。医学研究者发现，UC或其它类型炎症性肠病患者肠道中后壁菌门明显低于健康人群，而变形菌门与拟杆菌门相应的增多。给DSS结肠炎小鼠灌胃了植物乳杆菌后，小鼠结肠中后壁菌门数目增加，且小鼠结肠炎有所改善。

3.4.7.3各处理组小鼠结肠中菌群的α多样性分析

α多样性(αdiversity)主要用于评价单个样品中微生物菌群组成的多样性程度，是反映丰富度和均匀度的综合指标。α多样性主要与两个因素有关：一是种类数目，即丰富度；二是多样性，即群落中个体分配上的均匀性。群落丰富度指数主要包括Chao1指数、observed species指数和ACE指数，这三个指数越大，表明群落的丰富度越高。群落多样性(Community diversity)的指数，包括Shannon 指数和Simpson指数，其中Shannon指数值越高，表明群落的多样性越高，而 Simpson指数值越大，说明群落多样性越低。另外，PD-whole-tree指数反映了样品中物种对进化历史保存的差异，PD-whole-tree指数越大越说明物种对进化历史保存的差异越大。为了分析各处理组样品的物种α多样性，我们制作各个样品指数的箱型图，如图22所示。由α多样性各指数来看，对于急性组和慢性组来说，造模组样品中微生物菌群组成的多样性和丰富度最低，经过各干预药物干预后，各组样品中菌落丰富度和多样性均有所提高，但其中提高最多的是植物乳杆菌 ZJ316及其发酵乳组。即植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳能显著增加DSS结肠炎小鼠的肠道菌群的丰富度和多样性，这与Qiu L^]等人发现植物乳杆菌可通过增加小鼠肠道中菌群的丰富度及多样性来改善结肠炎的结果一致。

注：图22(A-F)分别为ACE指数、Chao1指数、observed species指数、 PD-whole-tree指数Shannon指数和Simpson指数。

3.4.7.4各处理组小鼠结肠中菌群的β多样性分析。

β多样性用于不同生态系统之间多样性的比较，也就是样品间整体的差异；β多样性利用各样本序列间的进化关系及丰度信息来计算样本间距离，反映不同样本(组)间是否具有微生物群落结构的差异。β多样性计算主要基于OTU的群落比较方法，其中最常用的一种算法是Unifrac距离法，它考虑了序列间的进化距离，Unifrac指数越大表示样品间的差异越大。其中，UniFrac结果分为加权 UniFrac(weighted UniFrac)与非加权UniFirac(unweighted UniFrac)两种， weighted UniFrac考虑了序列的丰度，而unweightedUniFrac只考虑了系列间的进化距离，没有考虑序列丰度。UniFrac结果分析有多种方法，其中主坐标分析 (Principal coordinates analysis PcoA)是常用的一种分析方法，是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法，没有改变样品点之间的项目位置关系，只改变了坐标系统。为了展示样品间物种多样性差异，我们使用unweighted UniFrac PCoA 的方法展示各处理组样品间的差异大小，结果如图23A所示，通过图中各样品点的远近观察个体或者群体间的差异，坐标图上距离越近的样品，相似性越大。总体来看，急性造模组小鼠结肠肠道菌群(JZ)主要分布在右上侧，离其他各干预组较远，即与各干预组菌群是有差异的，其中，空白对照组(Ctrl，主要分布在下侧)，植物乳杆菌ZJ316组(JX，主要分布在左下侧)，植物乳杆菌ZJ316 发酵乳组(JH，主要分布在右下侧)，与造模组距离最远，说明这三组小鼠结肠菌群与造模组差异最大。慢性组中，造模组小鼠结肠肠道菌群(MZ)主要分布在上侧，与其他各干预组距离也较远，即与各干预组菌群也是有差异的，其中空白对照组(Ctrl)，植物乳杆菌ZJ316(MQ)及其发酵乳组(MM)结肠菌群主要分布在左下侧，与造模组距离最远，说明这三组小鼠结肠菌群与造模组差异最大，且这三组小鼠结肠菌群差异较小。经益生菌干预结肠炎小鼠后，分析其其肠道中菌群多样性发现，模型组与干预组肠道菌群存在整体上的差异。本发明实验结果表明，植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳能够影响由DSS诱导的结肠炎小鼠结肠菌群的β多样性，即经灌胃植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳后，DSS结肠炎小鼠结肠中菌群发生了改变。

图23B为21个组别小鼠105个结肠样品在基于加权情况下的主坐标分析结果，由图可知，当考虑物种丰度时，同一组别小鼠结肠组织中菌群的个体差异较大，但能大体看出，不同组别的小鼠结肠微生物群落依然存在一定的差异。

注：图23A是基于非加权距离的PcoA分析，图23B是基于加权距离PcoA 分析；百分比表示该主成分对样品差异的贡献程度；图中的每个点表示一个样品，同一个组的样品使用同一种颜色表示。

3.4.7.5各处理组小鼠结肠中物种显著性差异分析。

为具体分析各处理组之间在丰度上有显著差异的物种(Biomarke)，我们选用了LEfSe分析法。LEfse分析即LDA Effect Size分析，是一种线性判别分析方法用来估算每个物种丰度对差异效果影响的大小，以找出对样本划分产生显著性差异影响的群落或物种。

(1)急性组各处理组小鼠结肠中物种显著性差异分析

如同24A-24B所示，经过LEfSe分析，急性组各处理组中，小鼠结肠菌群出现显著差异的组别有，造模组(JZ)、空白对照组(Ctrl)、植物乳杆菌ZJ316 组(JX)、植物乳杆菌ZJ316发酵乳组(JH)和副干酪乳杆菌2535组(JS)。其中造模组(JZ)小鼠结肠微生物菌群中出现显著性增加的菌群为“种”水平上的 Bacteroides-sartorii；空白对照组出现显著性差异的菌群为“种”水平上的 lachnospiraceae bacterium；植物乳杆菌ZJ316组在“属”水平上有odoribacter 和unidentified lachnospiraceae两个菌群显著增加。；在“科”水平显著增加的菌群为Marinilabiliale，在“种”水平显著增加的菌落有 clostridiale-bacterium-CIEAF-020和lachnospiraceae-bacterium-COE1；植物乳杆菌ZJ316发酵乳组显著增加的菌群为，“科”水平上的Prevotellaceae和“属”水平上的Alloprevotella；副干酪乳杆菌2535组小鼠结肠中出现显著性差异的菌群为“科”水平的tannerellaceae和“属”水平上的Parabacteroides。

Bacteroides-sartorii属于动物肠道中的主要条件致病菌；lachnospiraceaebacterium属于厚壁菌门，是肠道中的常驻菌群，可维持肠道健康；Odoribacter 为健康动物肠道中常见菌其属于厚壁菌门，是肠道中的常驻菌群，可维持肠道健； unidentified-lachnospiraceae属于益生菌，可维持肠道健康； clostridiale-bacterium-CIEAF-020其属于梭状芽胞杆菌属与肠炎的发生有关；Alloprevotella该菌是拟普雷沃菌属，可参与碳水化合物的终末代谢； Parabacteroides该菌为副杆状菌属，健康动物肠道中常见菌。

综上所述，植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳可促进DSS急性结肠炎小鼠结肠中，有益菌群显著增加。

注：图24A为聚类树图，不同颜色表示不同分组，不同颜色的节点表示在该颜色代表的分组中，起到重要作用的微生物群，黄色均代表无显著差异的微生物，由内到外的圆环分别表示门、纲、目、科、属、种的物种分类水平。图24B为统计不同分组中有显著作用的微生物类群通过LAD分析后得到的LAD分值，不同颜色代表不同分组。

图25A-25B表示慢性组各处理组小鼠结肠中菌群的LEfse分析，由图可知，小鼠结肠菌群出现显著差异的组别有，慢性造模组(MZ)、空白对照组(Ctrl)、植物乳杆菌ZJ316组(MQ)、植物乳杆菌ZJ316发酵乳组(MM)、副干酪乳杆菌2535组(MN)、正常饮食组(MH)、牛乳组(MG)和植物乳杆菌ZJ316发酵上清液组(MX)。其中，造模组小鼠结肠中有显著差异的菌群为“属”水平上的Alloprevotella，“种”水平上的Bacteroides-stercorirosoris和Bacteroides-acidifaciense；空白对照组中出现显著性差异的菌群为“属”水平上的lachnospiraceae-bacterium-DW17；植物乳杆菌ZJ316组在“科”水平上显著增加的菌群为muribacμLaceae，在“属”水平上具有显著性差异的菌群有 Feacalibacterium和agathobacte；植物乳杆菌ZJ316发酵乳组小鼠结肠中出现显著性差异的菌群为“属”水平上的lachnospiraceae-bacterium-A4；副干酪乳杆菌 2535组在“科”水平上显著性增加的菌群有Microbacteriaceae和 unidentified0-oceanospirillales，在“属”水平上显著增加的菌群有Microbacterium、 Marinilabiliale、pantoea和Thiopseudomonas，在“种”水平上具有显著性差异的菌群有laeveniformans和Acinetobacter；正常饮食组小鼠结肠中出现显著性增加的菌群，在“纲”水平上为Bacteroidia，在“目”水平上为Bacteroidales，在“门”水平上为Bacteroidetes；牛乳组具有显著性差异的菌群是“种”水平上的 Helicobacter-sp MIT-01-6451；植物乳杆菌ZJ316发酵上清液组小鼠结肠中显著性增加的菌群分别是“属”水平上的unidentified-lachnospiraceae和“种”水平上的helicobacte-rodentium。

Alloprevotella为拟普雷沃菌属，可参与肠道中碳水化合物的终末代谢，Bacteroides-acidifaciense属于拟杆菌门，肠道中的主要致病菌的来源；lachnospiraceae-bacterium-DW17是健康肠道中的常驻菌群，可维持肠道健康；Feacalibacterium在肠道中具有抗炎的特性，和Agathobacte是健康肠道中的常见菌；Microbacteriaceae为微桿菌科属于益生菌；Unidentified0-oceanospirillales属于肠杆菌，与肠道代谢有关；Microbacterium是牛乳中的常见菌，具有益生作用； Pantoea是动物肠道的条件致病菌；Thiopseudomonas属于硫代单胞菌属，是肠道致病菌；Laeveniformans属于拉文斯弧菌，是肠道致病菌；Acinetobacter属于肠道致病菌；Helicobacter-sp MIT-01-6451属于螺杆菌属，是肠道致病菌； Helicobacter-rodentium可导致小鼠肝炎和盲肠结肠炎等。

注:图25A为统计不同分组中有显著作用的微生物类群通过LAD分析后得到的LAD分值，不同颜色代表不同分组。图25B为聚类树图，不同颜色表示不同分组，不同颜色的节点表示在该颜色代表的分组中，起到重要作用的微生物群，黄色均代表无显著差异的微生物，由内到外的圆环分别表示门、纲、目、科、属、种的物种分类水平。

总之，DSS诱导急性或慢性结肠炎后，小鼠结肠中有害菌群显著性增加，经植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳干预后，小鼠结肠中有害菌群明显减少，而有益菌群显著增加，由此说明，植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳可调节小鼠结肠中菌群紊乱现象，进而改善结肠炎症状。这与已有研究——乳杆菌可通过调节小鼠肠道微生态来缓解溃疡性结肠炎(UC)的结果一致。

本发明主要围绕植物乳杆菌ZJ316及其发酵乳对BALB/c小鼠DSS急性和结肠炎的影响展开了研究，通过检测结肠炎炎症的各个指标来评价植物乳杆菌 ZJ316及其发酵乳对小鼠结肠炎症状的改善作用，得出主要结论如下：

(1)物乳杆菌ZJ316及其发酵乳能够有效的促进由DSS诱导的急性和慢性结肠炎小鼠的体重恢复，能显著阻止结肠变短变轻，并能减轻组织损伤，从而显著改善结肠炎症状。

(2)物乳杆菌ZJ316及其发酵乳显著下调DSS结肠炎小鼠结肠中促炎性细胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8)表达量，并上调抑炎性细胞因子(IL-10 和TGF-β)表达量。

(3)物乳杆菌ZJ316及其发酵乳能促进DSS结肠炎小鼠结肠中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸和戊酸的含量增加。

(4)物乳杆菌ZJ316及其发酵乳能使DSS结肠炎小鼠结肠中有益菌群的多样性和丰度增加，并能抑制一些致病菌菌群的发展，进而调节DSS引起的肠道菌群紊乱现象，使小鼠的结肠微生态处于一个更健康稳定的状态。

本领域的技术人员应理解，上述描述及附图中所示的本发明的实施例只作为举例而并不限制本发明。本发明的目的已经完整并有效地实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中展示和说明，在没有背离所述原理下，本发明的实施方式可以有任何变形或修改。

Claims

1.一种用于治疗结肠炎的乳酸菌，其特征在于，包括：植物乳杆菌ZJ316。

2.根据权利要求1所述的用于治疗结肠炎的乳酸菌，其中所述植物乳杆菌ZJ316由婴儿粪便中筛选。

3.根据权利要求1所述的用于治疗结肠炎的乳酸菌，其中所述植物乳杆菌用于治疗由DSS诱导的急性和慢性结肠炎小鼠的结肠炎。

4.根据权利要求1所述的用于治疗结肠炎的乳酸菌，其中所述植物乳杆菌ZJ316能够耐受胃酸，能够通过胃进入肠道。

5.根据权利要求1所述的用于治疗结肠炎的乳酸菌，其中在培养植物乳杆菌ZJ316时，将-80℃甘油管冻存的植物乳杆菌ZJ316于MRS固体平板划线接种，37℃厌氧培养24h复苏，经两次传代活化后转接于MRS液体，过夜培养菌液16-18h，6000r/min离心10分钟，收集发酵上清液，菌泥用浓度为0.85％的灭菌生理盐水洗涤两次后，再用生理盐水重悬，使菌悬液活菌数达约2.5×10⁹CFU/mL。

6.根据权利要求1所述的用于治疗结肠炎的乳酸菌，其中所述植物乳杆菌ZJ316用于下调DSS结肠炎小鼠结肠中促炎性细胞因子表达量，并上调抑炎性细胞因子表达量。

7.植物乳杆菌ZJ316或者含有其发酵乳的一种药物组合物的制造药物中的用途，所述药物用于治疗或预防结肠炎。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述植物乳杆菌ZJ316用于下调DSS结肠炎小鼠结肠中促炎性细胞因子表达量，并上调抑炎性细胞因子表达量。

9.根据权利要求7所述的用途，其中在制备发酵乳时，量取一定量的新鲜牛乳，加入提前制备好的6％的植物乳杆菌ZJ316菌悬液，再加入7％的白砂糖，搅拌均匀后，置于酸奶机发酵8-12小时。

10.根据权利要求7所述的用途，其中在培养植物乳杆菌ZJ316时，将-80℃甘油管冻存的植物乳杆菌ZJ316于MRS固体平板划线接种，37℃厌氧培养24h复苏，经两次传代活化后转接于MRS液体，过夜培养菌液16-18h，6000r/min离心10分钟，收集发酵上清液，菌泥用浓度为0.85％的灭菌生理盐水洗涤两次后，再用生理盐水重悬，使菌悬液活菌数达约2.5×10⁹CFU/mL。

11.根据权利要求10所述的用途，其中MRS液体培养基的配制：准确称取10g蛋白胨，5g酵母提取物，20g无水葡萄糖，10g牛肉膏，2g磷酸氢二钾，2g柠檬酸氢二铵，5g乙酸钠，0.2g七水硫酸镁，0.05g硫酸锰，1mL吐温-80，用超纯水溶解并定容至1L，121℃灭菌15min。

12.根据权利要求10所述的用途，其中MRS固体培养基的配制：在MRS液体培养基配方的基础上加入1％-1.5％的琼脂，用超纯水溶解并定容至1L，121℃灭菌15min。

13.根据权利要求7所述的用途，其中所述植物乳杆菌ZJ316由婴儿粪便中筛选。

14.一种用于治疗结肠炎的乳酸菌发酵乳，其特征在于，包括：由植物乳杆菌ZJ316发酵得到植物乳杆菌ZJ316发酵乳。

15.根据权利要求14所述的用于治疗结肠炎的乳酸菌发酵乳，其中所述植物乳杆菌ZJ316发酵乳用于促进DSS结肠炎小鼠结肠中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸和戊酸的含量增加。

16.根据权利要求14所述的用于治疗结肠炎的乳酸菌发酵乳，其中在制备时，量取一定量的新鲜牛乳，加入提前制备好的6％的植物乳杆菌ZJ316菌悬液，再加入7％的白砂糖，搅拌均匀后，置于酸奶机发酵8-12小时。

17.根据权利要求14所述的用于治疗结肠炎的乳酸菌发酵乳，其中所述植物乳杆菌发酵乳用于治疗由DSS诱导的急性和慢性结肠炎小鼠的结肠炎。

18.根据权利要求14所述的用于治疗结肠炎的乳酸菌发酵乳，其中所述植物乳杆菌ZJ316用于下调DSS结肠炎小鼠结肠中促炎性细胞因子表达量，并上调抑炎性细胞因子表达量。

19.根据权利要求14所述的用于治疗结肠炎的乳酸菌发酵乳，其中在培养植物乳杆菌ZJ316时，将-80℃甘油管冻存的植物乳杆菌ZJ316于MRS固体平板划线接种，37℃厌氧培养24h复苏，经两次传代活化后转接于MRS液体，过夜培养菌液16-18h，6000r/min离心10分钟，收集发酵上清液，菌泥用浓度为0.85％的灭菌生理盐水洗涤两次后，再用生理盐水重悬，使菌悬液活菌数达约2.5×10⁹CFU/mL。

20.根据权利要求19所述的用于治疗结肠炎的乳酸菌发酵乳，其中MRS液体培养基的配制：准确称取10g蛋白胨，5g酵母提取物，20g无水葡萄糖，10g牛肉膏，2g磷酸氢二钾，2g柠檬酸氢二铵，5g乙酸钠，0.2g七水硫酸镁，0.05g硫酸锰，1mL吐温-80，用超纯水溶解并定容至1L，121℃灭菌15min。

21.根据权利要求19所述的用于治疗结肠炎的乳酸菌发酵乳，其中MRS固体培养基的配制：在MRS液体培养基配方的基础上加入1％-1.5％的琼脂，用超纯水溶解并定容至1L，121℃灭菌15min。