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KR102703974B1 - 이중특이적 t 세포 활성화 항원 결합 분자 - Google Patents

이중특이적 t 세포 활성화 항원 결합 분자 Download PDF

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KR102703974B1
KR102703974B1 KR1020227020721A KR20227020721A KR102703974B1 KR 102703974 B1 KR102703974 B1 KR 102703974B1 KR 1020227020721 A KR1020227020721 A KR 1020227020721A KR 20227020721 A KR20227020721 A KR 20227020721A KR 102703974 B1 KR102703974 B1 KR 102703974B1
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Abstract

본 발명은 일반적으로 T 세포 활성화 및 특이적 표적 세포로의 방향 전환을 위한 신규한 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 제조하는 방법, 및 질병의 치료에 이들 이중특이적 항원 결합 분자를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

이중특이적 T 세포 활성화 항원 결합 분자{BISPECIFIC T CELL ACTIVATING ANTIGEN BINDING MOLECULES}
본 발명은 일반적으로 T 세포를 활성화시키는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 제조하는 방법, 및 질병의 치료에서 이들 이중특이적 항원 결합 분자를 사용하는 방법에 관한 것이다.
개별 세포 또는 특이적 세포 유형의 선택적 파괴는 종종 다양한 임상적 환경에서 바람직하다. 예를 들면, 건강한 세포 및 조직을 온전하고 손상되지 않은 상태로 남기면서 종양 세포를 특이적으로 파괴하는 것이 암 치료의 일차 목적이다.
이것을 달성하는 흥미로운 방법은 종양에 대한 면역 반응을 유도함으로써 면역 효과기 세포, 예컨대, 자연 살해(NK) 세포 또는 세포독성 T 림프구(CTL) 공격을 유발하고 종양 세포를 파괴하는 것이다. CTL은 면역계의 가장 강력한 효과기 세포를 구성하지만, 이들은 통상적인 치료 항체의 Fc 도메인에 의해 매개되는 효과기 기작에 의해 활성화될 수 없다.
이와 관련하여, 하나의 "아암(arm)"으로 표적 세포 상의 표면 항원에 결합하고 제 2 "아암"으로 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 활성화 불변 성분에 결합하도록 설계된 이중특이적 항체가 최근에 관심을 끌고 있다. 이러한 항체와 이의 표적 둘다의 동시적인 결합은 표적 세포와 T 세포 사이의 일시적인 상호작용을 발생시켜, 임의의 세포독성 T 세포의 활성화 및 표적 세포의 후속 용해를 야기한다. 따라서, 면역 반응은 표적 세포로 방향 전환되고, CTL의 일반적인 MHC-제한된 활성화와 관련될 수 있는 표적 세포에 의한 펩티드 항원 제시 또는 T 세포의 특이성과 무관하다. 이와 관련하여, 표적 세포가 이중특이적 항체를 CTL에 제시할 때, 즉 면역학적 시냅시스가 모방될 때에만 CTL이 활성화된다는 것은 매우 중요하다. 표적 세포의 효율적인 용해를 이끌어내기 위해 림프구 예비컨디셔닝(preconditioning) 또는 보조자극을 요구하지 않는 이중특이적 항체가 특히 바람직하다.
여러 이중특이적 항체 포맷이 개발되었고, T 세포-매개된 면역치료에 대한 이들의 적합성이 연구되었다. 이들 중에서 소위 BiTE(이중특이적 T 세포 개입유발자(engager)) 분자는 매우 잘 특징규명되어 있고 이미 임상에서 일부 가능성을 보여주었다(문헌[Nagorsen and Bauerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260(2011)]에서 검토됨). BiTE는 2개의 scFv 분자가 유연한 연결기에 의해 융합되어 있는 탠덤(tandem) scFv 분자이다. T 세포 개입에 대해 평가되는 추가의 이중특이적 포맷은 다이아바디(문헌[Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305(1996)]) 및 이의 유도체, 예컨대, 탠덤 다이아바디(문헌[Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-66(1999)])를 포함한다. 보다 최근의 개발은 다이아바디 포맷에 근거하지만 추가의 안정화를 위한 C-말단 다이설파이드 가교를 특징으로 하는 소위 DART(이중 친화성 재표적화) 분자이다(문헌[Moore et al., Blood 117, 4542-51(2011)]). 전체 하이브리드 마우스/래트 IgG 분자이고 또한 현재 임상 시험에서 평가되고 있는 소위 트라이오맙(triomab)은 보다 큰 크기의 포맷을 대표한다(문헌[Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467(2010)]에서 검토됨).
개발되고 있는 다양한 포맷은 면역치료에서 T 세포 방향 전환 및 활성화에 기인하는 큰 잠재력을 보여준다. 그러나, 그에 적합한 이중특이적 항체를 발생시키는 작업은 결코 쉽지 않고 항체의 효능, 독성, 적용가능성 및 제조가능성과 관련되어 충족되어야 하는 다수의 과제를 수반한다.
작은 구축물, 예컨대, BiTE 분자는 효과기와 표적 세포를 효율적으로 교차결합시킬 수 있지만 매우 짧은 혈청 반감기를 가지므로, 연속 주입에 의해 환자에게 투여될 필요가 있다. 다른 한편으로, IgG-유사 포맷은 긴 반감기라는 큰 이점을 갖지만 IgG 분자에 내재하는 천연 효과기 기능과 관련된 독성을 갖는다. 이들의 면역원성 잠재력은 성공적인 치료제 개발에 있어서 IgG-유사 이중특이적 항체, 특히 비인간 포맷의 또 다른 불리한 특징을 구성한다. 마지막으로, 이중특이적 항체의 일반적인 개발에 있어서 주요 과제는 이중특이적 항체 구축물을 임상적으로 충분한 양 및 순도로 제조하는 것인데, 공동-발현시 상이한 특이성의 항체 중쇄와 경쇄의 짝풀림으로 인해, 이는 정확히 조립된 구축물의 수율을 감소시키고 원하는 이중특이적 항체를 분리하는 것이 어려울 수 있는 다수의 비기능적 부산물을 초래한다.
이중특이적 항체에서 쇄 회합 문제를 극복하기 위해 다른 접근법을 실행하였다(예를 들면, 문헌[Klein et al., mAbs 6, 653-663 (2012)] 참조). 예를 들면, "놉-인투-홀"(knob-into-hole)" 전략은 돌연변이를 CH3 도메인에 도입하여 접촉 계면을 변형시켜 2개의 상이한 항체 중쇄의 쌍을 가용하는 것이 목표이다. 하나의 쇄에서 벌키 아미노산은 짧은 측쇄를 갖는 아미노산으로 대체되어 "홀"을 생성한다. 반대로, 긴 측쇄를 갖는 아미노산은 다른 CH3 도메인에 도입되어 "놉"을 생성한다. 이러한 2개 중쇄(및 2개의 동일한 경쇄, 이는 중쇄 모두에 접합하여야 한다)를 공동-발현시킴으로써, 고수율의 이종다이머(놉-홀) 대 동종다이머(홀-홀 또는 놉-놉)가 관찰된다(문헌[Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9(1996) 617-621]; 및 WO 96/027011). 이종다이머의 퍼센트는, 파지 디스플레이 접근법 및 이종다이머를 안정화시키기 위한 다이설파이드 가교의 도입을 사용하여 2개의 CH3 도메인의 상호작용 표면을 개조하여 추가로 증가될 수 있다(문헌[Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16(1998) 677-681]; [Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270(1997) 26-35]). 놉-인투-홀 기법에 대한 신규한 접근법은 예를 들면 EP 1870459 A1에 기재되어 있다.
그러나, 놉-인투-홀 전략은 상이한 표적 항원에 결합하는 상이한 경쇄를 포함하는 이중특이적 항체에서 발생하는 중쇄-경쇄 짝풀림 문제를 해결하지 못한다.
중쇄-경쇄 짝풀림을 방지하기 위한 전략은 이중특이적 항체의 결합 아암 중 하나의 중쇄와 경쇄 사이에 도메인을 교환하는 것이다(WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254 및 문헌[Schaefer, W. et al, PNAS, 108(2011) 11187-11191](이는 도메인 교차형을 갖는 이중특이적 IgG 항체에 관함) 참조).
이중특이적 항체의 결합 아암 중 하나에서 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 VH 및 VL의 교환(WO 2009/080252, 또한 문헌[Schaefer, W. et al, PNAS, 108(2011) 11187-11191] 참조)은 (상기 도메인을 교환하지 않는 접근법에 비해) 제 1 항원에 대한 경쇄와 제 2 항원에 대한 잘못된 중쇄의 짝풀림에 의해 야기된 부산물을 분명히 감소시킨다. 그럼에도 불구하고, 이러한 항체 제조가 완전히 부산물을 함유하지 않는 것은 아니다. 주요 부산물은 벤스 존스 유형(Bence Jones-type) 상호작용에 기초한다(문헌[Schaefer, W. et al, PNAS, 108(2011) 11187-11191]; 보충자료의 도면 S1I). 따라서, 상기 부산물의 추가 감소는 예를 들면 상기 이중특이적 항체의 수율을 개선시키는데 바람직하다.
T 세포-매개된 면역치료를 위해 현재 사용가능한 이중특이적 항체와 관련한된 어려움 및 단점이 존재하는 한, 이러한 분자의 신규 개선된 포맷에 대한 필요성이 남아있다. 본 발명은 낮은 독성 및 유리한 약동학적 성질과 함께 우수한 효능 및 제조가능성을 겸비하는, T 세포 활성화 및 방향 전환을 위해 설계된 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
본 발명에 따라, 목적하지 않은 부산물, 특히 이중특이적 항체의 결합 아암 중 하나에서 VH/VL 도메인 교환을 갖는 이중특이적 항체에서 발생하는 벤스 존스 유형 부산물에 비해 목적한 이중특이적 항체의 비는, 하전된 아미노산을 CH1 및 CL 도메인에서 특정한 아미노산 위치에 반대 전하로 도입하여 향상시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 제 1 양상에서
(a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 1 Fab 분자;
(b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하되 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되는 제 2 Fab 분자
를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고,
상기 제 1 항원은 활성화 T 세포 항원이고, 제 2 항원은 표적 세포 항원이거나, 상기 제 1 항원은 표적 세포 항원이고, 제 2 항원은 활성화 T 세포 항원이고;
i) 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트(Kabat)에 따라 넘버링)으로 독립적으로 치환되고, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 독립적으로 치환되거나;
ii) 상기 (b)의 제 2 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따라 넘버링)으로 독립적으로 치환되고, 상기 (b)의 제 2 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 독립적으로 치환된다.
본 발명에 따라, 제 2 Fab 분자는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역이 교환되는 교차 Fab 분자이다. 특정 실시양태에서, 제 1 Fab 분자(및 임의의 경우 제 3 Fab 분자)는 통상적인 Fab 분자이다. 추가의 특정 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이하의 Fab 분자는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 존재한다(즉, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 활성화 T 세포 항원에 결합하는 1가를 제공한다).
특정 실시양태에서, 제 1 항원은 표적 세포 항원이고, 제 2 항원은 활성화 T 세포 항원이다. 추가의 특정 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원은 CD3, 특히 CD3 엡실론이다. 하나의 실시양태에서, 표적 세포 항원은 CD20이다.
본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 하나의 실시양태에서, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따라 넘버링)(바람직한 하나의 실시양태에서, 리신(K) 또는 아르기닌(R))으로 독립적으로 치환되고, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 독립적으로 치환된다.
또 하나의 실시양태에서, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따라 넘버링)으로 독립적으로 치환되고, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 독립적으로 치환된다.
추가의 또 하나의 실시양태에서, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따라 넘버링)(바람직한 하나의 실시양태에서, 리신(K) 또는 아르기닌(R))으로 독립적으로 치환되고 위치 123의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따라 넘버링)(바람직한 하나의 실시양태에서, 리신(K) 또는 아르기닌(R))으로 독립적으로 치환되고, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 독립적으로 치환되고 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 독립적으로 치환된다.
특정 실시양태에서, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K)(카바트에 따라 넘버링)으로 치환되고 위치 123의 아미노산은 리신(K)(카바트에 따라 넘버링)으로 치환되고, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 치환되고 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 치환된다.
또 다른 특정 실시양태에서, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K)(카바트에 따라 넘버링)으로 치환되고 위치 123의 아미노산은 아르기닌(R)(카바트에 따라 넘버링)으로 치환되고, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 치환되고 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 치환된다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는
(a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 1 Fab 분자;
(b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하되 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되는 제 2 Fab 분자
를 포함하고, 상기 제 1 항원은 표적 세포 항원이고, 제 2 항원은 활성화 T 세포 항원이고; 이때
상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따라 넘버링)(바람직한 하나의 실시양태에서, 리신(K) 또는 아르기닌(R))으로 독립적으로 치환되고 위치 123의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따라 넘버링)(바람직한 하나의 실시양태에서, 리신(K) 또는 아르기닌(R))으로 독립적으로 치환되고, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 독립적으로 치환되고 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 독립적으로 치환된다. 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 또 하나의 실시양태에서, 상기 (b)의 제 2 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따라 넘버링)(바람직한 하나의 실시양태에서, 리신(K) 또는 아르기닌(R))으로 독립적으로 치환되고, 상기 (b)의 제 2 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 독립적으로 치환된다.
또 하나의 실시양태에서, 상기 (b)의 제 2 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따라 넘버링)으로 독립적으로 치환되고, 상기 (b)의 제 2 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 독립적으로 치환된다.
또 하나의 실시양태에서, 상기 (b)의 제 2 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따라 넘버링)(바람직한 하나의 실시양태에서, 리신(K) 또는 아르기닌(R))으로 독립적으로 치환되고 위치 123의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따라 넘버링)(바람직한 하나의 실시양태에서, 리신(K) 또는 아르기닌(R))으로 독립적으로 치환되고, 상기 (b)의 제 2 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 독립적으로 치환되고 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 독립적으로 치환된다.
하나의 실시양태에서, 상기 (b)의 제 2 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K)(카바트에 따라 넘버링)으로 치환되고 위치 123의 아미노산은 리신(K)(카바트에 따라 넘버링)으로 치환되고, 상기 (b)의 제 2 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 치환되고 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 치환된다.
또 하나의 실시양태에서, 상기 (b)의 제 2 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K)(카바트에 따라 넘버링)으로 치환되고 위치 123의 아미노산은 아르기닌(R)(카바트에 따라 넘버링)으로 치환되고, 상기 (b)의 제 2 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 치환되고 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 치환된다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 3 Fab 분자를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 제 3 Fab 분자는 제 1 Fab 분자와 동일하다. 따라서, 이러한 실시양태에서, 제 3 Fab 분자는 제 1 Fab 분자와 같은 동일한 아미노산 치환을 포함한다. 제 1 Fab 분자와 유사하게, 제 3 Fab 분자는 특히 통상적인 Fab 분자이다.
제 3 Fab 분자가 존재하는 경우, 특정 실시양태에서, 제 1 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하고, 제 2 Fab 분자는 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 더욱 특히 CD3 엡실론에 특이적으로 결합한다.
본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 일부 실시양태에서, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자 및 상기 (b)의 제 2 Fab 분자는, 임의적으로 펩티드 연결기를 통해, 서로 융합된다. 특정 실시양태에서, 제 2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 또 하나의 실시양태에서, 제 1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. (i) 제 2 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되거나, (ii) 제 1 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되는 실시양태에서, 추가적으로 제 1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄는, 임의적으로 펩티드 연결기를 통해, 서로 융합될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 추가적으로 안정하게 회합할 수 있는 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 포함한다.
본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 상이한 배열을 가질 수 있고, 즉, 제 1 Fab 분자, 제 2 Fab 분자(및 임의적으로 제 3 Fab 분자)는 서로에 융합될 수 있고 상이한 방식으로 Fc 도메인에 융합될 수 있다. 상기 성분은 서로 직접적으로 또는 바람직하게는 하나 이상의 적합한 펩티드 연결기를 통해 융합될 수 있다. Fc 도메인의 서브유닛의 N-말단에 융합되는 경우, 전형적으로 면역글로불린 힌지 영역을 통한다.
하나의 실시양태에서, 제 2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 서브유닛 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 이러한 실시양태에서, 제 1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 또는 Fc 도메인의 서브유닛 중 다른 하나의 N-말단에 융합될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 제 1 Fab 분자 및 제 2 Fab 분자는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다. 이러한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 본질적으로 면역글로불린 분자를 포함하고, 이때 Fab 아암 중 하나에서 중쇄 및 경쇄 가변 영역 VH 및 VL은 서로에 의해 교환된다/대체된다(도 1A 및 1D 참조).
또 하나의 실시양태에서, 제 3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 서브유닛 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 이러한 특정 실시양태에서, 제 2 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되고, 제 1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 이러한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 본질적으로 면역글로불린 분자를 포함하고, 이때 Fab 아암 중 하나에서 중쇄 및 경쇄 가변 영역 VH 및 VL은 서로 교환되고/대체되고, 추가의 (통상적인) Fab 분자는 상기 Fab 아암에서 N-말단에 융합된다(도 1B 및 1E 참조). 이러한 또 하나의 실시양태에서, 제 1 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되고, 제 2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 이러한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 본질적으로 면역글로불린 Fab 아암 중 하나에 N-말단에 융합된 추가 Fab 분자를 갖는 면역글로불린 분자를 포함하고, 상기 추가 Fab 분자에서 중쇄 및 경쇄 가변 영역 VH 및 VL은 서로 교환된다/대체된다(도 1C 및 1F 참조).
본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 상이한 배열 모두에서, 본원에 기재된 아미노산 치환은 제 1 Fab 분자 및 (존재하는 경우) 제 3 Fab 분자의 CH1 및 CL 도메인에 또는 제 2 Fab 분자의 CH1 및 CL 도메인에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 상기 아미노산 치환은 제 1 Fab 분자 및 (존재하는 경우) 제 3 Fab 분자의 CH1 및 CL 도메인에 존재한다. 본 발명의 개념에 따라, 본원에 기재된 아미노산 치환이 제 1 Fab 분자(및 존재하는 경우 제 3 Fab 분자)에서 발생하는 경우, 상기 아미노산 치환은 제 2 Fab 분자에서 발생하지 않는다. 반대로, 본원에 기재된 아미노산 치환이 제 2 Fab 분자에서 발생하는 경우, 상기 아미노산 치환은 제 1 Fab 분자(및 존재하는 경우 제 3 Fab 분자)에서 발생하지 않는다.
본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 특정 실시양태에서, 특히 본원에 기재된 아미노산 치환이 제 1 Fab 분자(및 존재하는 경우 제 3 Fab 분자)에서 발생하는 경우, 제 1 Fab 분자(및 존재하는 경우 제 3 Fab 분자)의 불변 도메인은 카파 동종형(isotype)이다. 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 또 하나의 실시양태에서, 특히 본원에 기재된 아미노산 치환이 제 2 Fab 분자에서 발생하는 경우, 제 2 Fab 분자의 불변 도메인 CL은 카파 동종형의 불변 도메인 CL이다. 일부 실시양태에서, 제 1 Fab 분자(및 존재하는 경우 제 3 Fab 분자)의 불변 도메인 CL 및 제 2 Fab 분자의 불변 도메인 CL은 카파 동종형의 불변 도메인 CL이다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 포함된 면역글로불린 분자는 IgG 부류 면역글로불린이다. 추가의 특정 실시양태에서, 면역글로불린은 IgG1 하위부류 면역글로불린이다. 또 하나의 실시양태에서, 면역글로불린은 IgG4 하위부류 면역글로불린이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은
a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 1 Fab 분자;
b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하되 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되는 제 2 Fab 분자;
c) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 3 Fab 분자; 및
d) 안정하게 회합할 수 있는 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고,
상기 제 1 항원은 표적 세포 항원이고, 제 2 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 더욱 특히 CD3 엡실론이고,
상기 (c)의 제 3 Fab 분자는 상기 (a)의 제 1 Fab 분자와 동일하고;
상기 (a)의 제 1 Fab 분자 및 상기 (c)의 제 3 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K)(카바트에 따라 넘버링)으로 치환되고 위치 123의 아미노산은 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따라 넘버링)으로 치환되고, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자 및 상기 (c)의 제 3 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 치환되고 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 치환되고;
(i) 상기 (a)의 제 1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 (b)의 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 상기 (b)의 제 2 Fab 분자 및 상기 (c)의 제 3 Fab 분자는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 (d)의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되거나,
(ii) 상기 (b)의 제 2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자 및 상기 (c)의 제 3 Fab 분자는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 (d)의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다.
추가의 특정 실시양태에서, 본 발명은
a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 1 Fab 분자;
b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하되 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되는 제 2 Fab 분자;
c) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 3 Fab 분자; 및
d) 안정하게 회합할 수 있는 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고,
상기 제 1 항원은 표적 세포 항원이고, 제 2 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 더욱 특히 CD3 엡실론이고,
상기 (c)의 제 3 Fab 분자는 상기 (a)의 제 1 Fab 분자와 동일하고;
상기 (a)의 제 1 Fab 분자 및 상기 (c)의 제 3 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K)(카바트에 따라 넘버링)으로 치환되고 위치 123의 아미노산은 아르기닌(R)(카바트에 따라 넘버링)으로 치환되고, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자 및 상기 (c)의 제 3 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 치환되고 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 치환되고;
상기 (a)의 제 1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 (b)의 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 상기 (b)의 제 2 Fab 분자 및 상기 (c)의 제 3 Fab 분자는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 (d)의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다.
또 하나의 실시양태에서, 본 발명은
a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 1 Fab 분자;
b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하되 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되는 제 2 Fab 분자; 및
c) 안정하게 회합할 수 있는 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고, 이때
(i) 상기 제 1 항원은 표적 세포 항원이고, 제 2 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 더욱 특히 CD3 엡실론이거나;
(ii) 상기 제 2 항원은 표적 세포 항원이고, 제 1 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 더욱 특히 CD3 엡실론이고,
상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K)(카바트에 따라 넘버링)으로 치환되고 위치 123의 아미노산은 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따라 넘버링)으로 치환되고, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 치환되고 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 치환되고;
상기 (a)의 제 1 Fab 분자 및 상기 (b)의 제 2 Fab 분자는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 (c)의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 특정 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 특정 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 또 다른 특정 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. 추가의 특정 실시양태에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 S228P(카바트 넘버링)를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 특정 실시양태에서, Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다.
특정 실시양태에서, Fc 도메인은 제 1 Fc 도메인 서브유닛 및 제 2 Fc 도메인 서브유닛의 결합을 촉진시키는 변형을 포함한다. 구체적인 이러한 실시양태에서, Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기는 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환됨으로써, 돌출부(protuberance)를, 제 2 서브유닛의 CH3 도메인 내의 캐비티(cavity)에 위치할 수 있는 제 1 서브유닛의 CH3 도메인 내에서 발생시키고, Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기는 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환됨으로써, 캐비티를, 제 1 서브유닛의 CH3 도메인 내의 돌출부가 위치할 수 있는 제 2 서브유닛의 CH3 도메인 내에서 발생시킨다.
특정 실시양태에서, Fc 도메인은 천연 IgG1 Fc 도메인에 비해 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 조작되지 않은 Fc 도메인과 비교하여 Fc 도메인은 조작되어 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 갖는다. 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 하나의 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 도메인 내의 하나 이상의 아미노산 치환은 L234, L235 및 P329(카바트 EU 지수 넘버링)의 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 존재한다. 특정 실시양태에서, Fc 도메인의 각각의 서브유닛은 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3개의 아미노산 치환, 즉, L234A, L235A 및 P329G(카바트 EU 지수 넘버링)를 포함한다. 이러한 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 또 하나의 실시양태에서, 도메인의 각각의 서브유닛은 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 2개의 아미노산 치환, 즉, L235E 및 P329G(카바트 EU 지수 넘버링)를 포함한다. 이러한 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인, 특히 인간 IgG4 Fc 도메인이다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이고 아미노산 치환 L235E 및 S228P(SPLE)(카바트 EU 지수 넘버링)를 포함한다.
하나의 실시양태에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 하나의 실시양태에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 하나의 실시양태에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정 실시양태에서, Fc 수용체는 인간 FcγRIIa, FcγRI 및/또는 FcγRIIIa이다. 하나의 실시양태에서, 효과기 기능은 항체 의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC)이다.
본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 특정 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 더욱 특히 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 서열번호 4의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)1, 서열번호 5의 중쇄 CDR2, 서열번호 6의 중쇄 CDR3, 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2 및 서열번호 10의 경쇄 CDR3을 포함한다. 추가의 특정 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 더욱 특히 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 서열번호 3의 아미노산 서열과 약 95% 이상, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열과 약 95% 이상, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 포함된 제 2 Fab 분자는 CD3, 더욱 특히 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고 서열번호 4의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)1, 서열번호 5의 중쇄 CDR2, 서열번호 6의 중쇄 CDR3, 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2 및 서열번호 10의 경쇄 CDR3을 포함한다. 추가의 특정 실시양태에서, 상기 제 2 Fab 분자는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 추가의 특정 실시양태에서, 표적 세포 항원, 특히 CD20에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 서열번호 46의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)1, 서열번호 47의 중쇄 CDR2, 서열번호 48의 중쇄 CDR3, 서열번호 49의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2 및 서열번호 51의 경쇄 CDR3을 포함한다. 추가의 특정 실시양태에서, 표적 세포 항원, 특히 CD20에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 서열번호 30의 아미노산 서열과 약 95% 이상, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 31의 아미노산 서열과 약 95% 이상, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 포함된 제 1 Fab 분자(및 존재하는 경우 제 3 Fab 분자)는 CD20에 특이적으로 결합하고, 서열번호 46의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)1, 서열번호 47의 중쇄 CDR2, 서열번호 48의 중쇄 CDR3, 서열번호 49의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2 및 서열번호 51의 경쇄 CDR3을 포함한다. 추가의 특정 실시양태에서, 상기 제 1 Fab 분자(및 존재하는 경우 상기 제 3 Fab 분자)는 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 양상에서, 본 발명은
a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 1 Fab 분자;
b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하되 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되는 제 2 Fab 분자;
c) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 3 Fab 분자; 및
d) 안정하게 회합할 수 있는 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고, 이때
(i) 상기 제 1 항원은 CD20이고, 제 2 항원은 CD3, 특히 CD3 엡실론이고;
(ii) 상기 (a)의 제 1 Fab 분자 및 상기 (c)의 제 3 Fab 분자는 각각 서열번호 46의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)1, 서열번호 47의 중쇄 CDR2, 서열번호 48의 중쇄 CDR3, 서열번호 49의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2 및 서열번호 51의 경쇄 CDR3을 포함하고, 상기 (b)의 제 2 Fab 분자는 서열번호 4의 중쇄 CDR1, 서열번호 5의 중쇄 CDR2, 서열번호 6의 중쇄 CDR3, 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2 및 서열번호 10의 경쇄 CDR3을 포함하고;
(iii) 상기 (a)의 제 1 Fab 분자 및 상기 (c)의 제 3 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K)(카바트에 따라 넘버링)으로 치환되고 위치 123의 아미노산은 리신(K) 또는 아르기닌(R), 특히 아르기닌(R)(카바트에 따라 넘버링)으로 치환되고, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자 및 상기 (c)의 제 3 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 치환되고 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 치환되고;
(iv) 상기 (a)의 제 1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 (b)의 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 상기 (b)의 제 2 Fab 분자 및 상기 (c)의 제 3 Fab 분자는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 (d)의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다.
추가 양상에서, 본 발명은
a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 1 Fab 분자;
b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하되 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되는 제 2 Fab 분자;
c) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 3 Fab 분자; 및
d) 안정하게 회합할 수 있는 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고, 이때
(i) 상기 제 1 항원은 CD20이고, 제 2 항원은 CD3, 특히 CD3 엡실론이고;
(ii) 상기 (a)의 제 1 Fab 분자 및 상기 (c)의 제 3 Fab 분자는 각각 서열번호 46의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)1, 서열번호 47의 중쇄 CDR2, 서열번호 48의 중쇄 CDR3, 서열번호 49의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2 및 서열번호 51의 경쇄 CDR3을 포함하고, 상기 (b)의 제 2 Fab 분자는 서열번호 4의 중쇄 CDR1, 서열번호 67의 중쇄 CDR2, 서열번호 6의 중쇄 CDR3, 서열번호 68의 경쇄 CDR1 , 서열번호 9의 경쇄 CDR2 및 서열번호 10의 경쇄 CDR3을 포함하고;
(iii) 상기 (a)의 제 1 Fab 분자 및 상기 (c)의 제 3 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K)(카바트에 따라 넘버링)으로 치환되고 위치 123의 아미노산은 리신(K) 또는 아르기닌(R), 특히 아르기닌(R)(카바트에 따라 넘버링)으로 치환되고, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자 및 상기 (c)의 제 3 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 치환되고 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 치환되고;
(iv) 상기 (a)의 제 1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 (b)의 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 상기 (b)의 제 2 Fab 분자 및 상기 (c)의 제 3 Fab 분자는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 (d)의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 본 발명은 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 발현 벡터, 및 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 특히 포유동물 세포이다.
또 다른 양태에서, (a) T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건하에 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 (b) T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제조 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 추가로 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 약학 조성물의 사용 방법을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학 조성물을 제공한다. 한 양태에서, 질환의 치료가 필요한 개체를 치료하기 위한 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학 조성물이 제공된다. 특정 실시양태에서, 질환은 암이다.
또한, 질환의 치료가 필요한 개체의 질환의 치료를 위한 약제를 제조하기 위한 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 용도; 뿐만 아니라 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 약학적으로 허용되는 형태로 포함하는 조성물의 치료 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서. 질환은 암이다. 임의의 상기 실시양태에서, 개체는 바람직하게 포유동물, 특히 인간이다.
또한, 본 발명은 T 세포, 특히 세포독성 T 세포의 존재하에 표적 세포를 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 접촉시키는 단계를 포함하는, 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법을 제공한다.
도 1은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(TCB)의 예시적인 배열을 도시한다. (A 및 D) "1+1 교차Mab" 분자의 예시. (B 및 E) 교차Fab 및 Fab 성분(도립된)의 대체 순서를 갖는 "2+1 IgG 교차Fab" 분자의 예시. (C 및 F) "2+1 IgG 교차Fab" 분자의 예시. (G, K) 교차Fab 및 Fab 성분(도립된)의 대체 순서를 갖는 "1+1 IgG 교차Fab" 분자의 예시. (H 및 L) "1+1 IgG 교차Fab" 분자의 예시. (I 및 M) 2개의 교차Fab를 갖는 "2+1 IgG 교차Fab" 분자의 예시. (J 및 N) 2개의 교차Fab 및 교차Fab 및 Fab 성분(도립된)의 대체 순서를 갖는 "2+1 IgG 교차Fab" 분자의 예시. (O 및 S) "Fab-교차Fab" 분자의 예시. (P 및 T) "교차Fab-Fab" 분자의 예시. (Q 및 U) "(Fab)2-교차Fab" 분자의 예시. (R 및 V) "교차Fab-(Fab)2" 분자의 예시. (W 및 Y) "Fab-(교차Fab)2" 분자의 예시. (X 및 Z) "(교차Fab)2-Fab" 분자의 예시. 흑색점: 이종이량체화를 촉진하는 Fc 도메인의 임의적인 변형. ++, --: CH 및 CL 도메인에 도입된 반대 전하의 아미노산.
도 2는 실시예 1에서 제조된 TCB를 도시한다. (A) 전하 변형(CD3 결합제에서 CH1/CL 교환)이 없는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab", (B) 전하 변형(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, CD20 결합제에서 전하 변형, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K)이 있는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab", (C) 전하 변형(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, CD20 결합제에서 전하 변형, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K)이 있는 "2+1 IgG 교차Fab", (D) 전하 변형(CD3 결합제에서 VH/VL 교환)이 없는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab", (E) 전하 변형(CD3 결합제에서 VH-CH1/VL-CL 교환)이 없는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab", (F) 전하 변형(CD20 결합제에서 VH/VL 교환, CD3 결합제에서 전하 변형, EE = 147E, 213E; KK = 123K, 124K)이 있는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab", (G) Fc 영역에서 전하 변형 및 DDKK 돌연변이(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, CD20 결합제에서 전하 변형, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K)이 있는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab", (H) 전하 변형(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, CD20 결합제에서 전하 변형, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K)이 있는 "1+1 교차Mab", (I) 전하 변형(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, CD20 결합제에서 전하 변형, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K, 상이한 CD20 결합제)이 있는 "1+1 교차Mab", (J) 전하 변형 213E, 123R(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, CD20 결합제에서 전하 변형, E = 213E; R = 123R)이 있는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab", (K) 전하 변형(CD3 결합제에서 VH/VL 교환 및 전하 변형)이 있는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab".
도 3은 (A 내지 I, N 및 O) 실시예 1에서 제조(최종 정제 준비)된 TCB의 CE-SES 분석을 도시한다. (A) 도 2에 나타낸 분자 "A"의 전기영동도, (B) 도 2에 나타낸 분자 "B"의 전기영동도, (C) 도 2에 나타낸 분자 "C"의 전기영동도, (D) 도 2에 나타낸 분자 "D"의 전기영동도, (E) 도 2에 나타낸 분자 "E"의 전기영동도, (F) 도 2에 나타낸 분자 "F"의 전기영동도, (G) 도 2에 나타낸 분자 "G"의 전기영동도, (H) 도 2에 나타낸 분자 "H"의 전기영동도, (I) 도 2에 나타낸 분자 "I"의 전기영동도, (N) 도 2에 나타낸 분자 "J"의 전기영동도, (O) 도 2에 나타낸 분자 "K"의 전기영동도. 레인 A = 비환원됨, 레인 B = 환원됨. (J 내지 L, P 및 Q) 제 1 정제 단계(단백질 A 친화성 크로마토그래피) 후 실시예 1에서 제조된 TCB의 SDS-PAGE 분석. (J) 4 내지 12% 비스-트리스 SDS-PAGE, 비환원됨; 레인 1 = 마커(마크(Mark) 12, 비염색된 표준물, 인비트로겐(Invitrogen)); 레인 2 내지 11 = 분자 B의 단백질 A 친화성 크로마토그래피로부터의 분획, (K) 3 내지 8% 트리스-아세테이트 SDS-PAGE, 비환원됨; 레인 1 = 마커(하이마크(HiMark), 인비트로겐); 레인 2 내지 12 = 분자 C의 단백질 A 친화성 크로마토그래피로부터의 분획, (L) 4 내지 12% 비스-트리스 SDS-PAGE, 비환원됨; 레인 1 = 마커(마크 12, 비염색된 표준물, 인비트로겐); 레인 2 내지 14 = 분자 D의 단백질 A 친화성 크로마토그래피로부터의 분획, (P) 4 내지 12% 비스-트리스 SDS-PAGE, 비환원됨; 레인 1 = 마커(마크 12, 인비트로겐); 레인 2 내지 10 = 분자 J의 단백질 A 친화성 크로마토그래피로부터의 분획, (Q) 4 내지 12% 비스-트리스 SDS-PAGE, 비환원됨; 레인 1 = 마커(마크 12, 인비트로겐); 레인 2 내지 12 = 분자 K의 단백질 A 친화성 크로마토그래피로부터의 분획. (M) 실시예 1(분자 A(제 1 SEC 단계), B 및 D, 나타낸 바와 같음)에서 제조된 TCB의 제조용 크기 배제 크로마토그래피(SEC; 제 1 정제 단계).
도 4는 전하 변형(전하 잔기)이 있거나 없는(실시예 1 참조) 항-CD3/항-CD20 T 세포 이중특이적(TCB) 항체(CD20 TCB)의 CD3 및 CD20 결합을 도시한다.
도 5는 인간 PBMC로 22 시간 항온처리시 전하 변형(전하 잔기)이 있거나 없는(실시예 1 참조) 항-CD3/항-CD20 T 세포 이중특이적(TCB) 항체(CD20 TCB)에 의해 유도된 종양 세포 용해를 도시한다.
도 6은 전하 변형(전하 잔기)이 있거나 없는(실시예 1 참조) 항-CD3/항-CD20 T 세포 이중특이적(TCB) 항체(CD20 TCB)에 의해 유도된 CD20-발현 종양 표적 세포(Nalm-6)의 T 세포-매개된 사멸시 CD8+ T 세포(A) 또는 CD4+ T 세포(B)의 활성화를 도시한다.
도 7은 전하 변형(전하 잔기)이 있거나 없는(실시예 1 참조) 항-CD3/항-CD20 T 세포 이중특이적(TCB) 항체(CD20 TCB)에 의해 유도된 CD20-발현 종양 표적 세포(Z-138)의 T 세포-매개된 사멸시 CD8+ T 세포(A) 또는 CD4+ T 세포(B)의 활성화를 도시한다.
도 8은 전하 변형(전하 잔기)이 있거나 없는(22 시간 분석; 실시예 1 참조) 항-CD3/항-CD20 T 세포 이중특이적(TCB) 항체(CD20 TCB)로 항온처리시 건강한 인간 전혈에서 세포 감소를 도시한다.
도 9는 전하 변형(전하 잔기)이 있거나 없는(실시예 1 참조) 항-CD3/항-CD20 T 세포 이중특이적(TCB) 항체(CD20 TCB)에 의해 유도된 건강한 인간 전혈에서 CD20-발현 B 세포의 T 세포-매개된 사멸시 CD8+ T 세포(A) 또는 CD4+ T 세포(B)의 활성화를 도시한다.
도 10은 인간 CD20-(A) 및 CD3-발현(B) 표적 세포에 대한 항-CD20/항-CD3 TCB(도 2에서 나타낸 분자 "B")의 결합을 도시한다.
도 11은 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD20- 및 CD3-발현 표적 세포에 대한 항-CD20/항-CD3 TCB(도 2에서 나타낸 분자 "B")의 결합을 도시한다. (A) B 세포, (B) CD4 T 세포, (C) CD8 T 세포.
도 12는 상이한 항-CD20/항-CD3 TCB 항체 포맷에 의해 매개된 종양 세포 용해를 도시한다.
도 13은 상이한 항-CD20/항-CD3 TCB 항체 포맷에 의해 매개된 종양 세포 용해 및 이후 T 세포 활성화를 도시한다. (A 내지 C) 3개의 상이한 인간 공여자로부터 PBMC 효과기 세포에 의한 Z138 종양 표적 세포의 용해. (D) 나타낸 바와 같은 DLBCL 종양 세포주의 패널의 용해.
도 14는 인간 전혈에서 상이한 항-CD20/항-CD3 TCB 항체 포맷에 의해 매개된 B 세포 고갈을 도시한다.
도 15는 주르카트(Jurkat)-NFAT 리포터 분석을 사용하여 CD3 다운스트림 신호전달의 강도의 정량화에 의해 추정된, 상이한 항-CD20/항-CD3 TCB 항체 포맷에 의한 T 세포의 활성화를 도시한다.
도 16은 NOG 마우스의 희소 샘플링 데이타로부터 항-CD20/항-CD3 TCB 항체(도 2에 나타낸 분자 "B")의 0.5 mg/kg i.v.(정맥내) 볼루스 투여의 약동학적 매개변수를 도시한다.
도 17은 완전 인간화된 NOG 마우스에서 항-CD20/항-CD3 TCB 항체(도 2에 나타낸 분자 "B")의 B 세포 고갈 활성을 추정하기 위한 연구의 도시적 표시를 도시한다
도 18은 (B) 항-CD20/항-CD3 TCB 항체(도 2에 나타낸 분자 "B") 또는 (A) 비히클 대조군으로 처리된 완전 인간화된 NOG 마우스의 혈액 중에 B 세포 및 T 세포 빈도의 동역학을 도시한다. D0, D7: 치료 주사 일수.
도 19는 완전 인간화된 마우스에서 비히클(흑색 막대) 또는 항-CD20/항-CD3 TCB 항체(도 2에 나타낸 분자 "B")(백색 막대) 주사 후 3일(D3) 및 10일(D10)에 말초 T 세포에서 상이한 표면 마커 발현의 분석을 도시한다.
도 20은 연구 종결시(제 1 치료제 주사 수 D10) 비히클(흑색 막대) 또는 항-CD20/항-CD3 TCB 항체(도 2에 나타낸 분자 "B")(백색 막대)-처리된 완전 인간화된 마우스의 비장에서 B 세포 빈도(A), T 세포 빈도(B) 및 T 세포에서 표면 마커 발현(C)의 분석을 도시한다.
도 21은 huPBMC 트랜스퍼를 갖는 NOG 마우스의 WSU-DLCL2 모델에서 항-CD20/항-CD3 TCB 항체(도 2에 나타낸 분자 "B")(0.5 mg/kg, 주 1회)의 항-종양 활성을 도시한다.
도 22는 실시예 2에서 제조된 "도립된 2+1 IgG 교차Fab" 분자를 도시한다. (1) 전하 변형이 없는 분자, (2) BCMA에 특이적으로 결합하는 Fab 분자의 CH1 및 CL 도메인에 전하 변형이 있는 분자(EE = 147E, 213E; KK = 123K, 124K).
도 23은 실시예 2에서 사용된 "도립된 2+1 IgG 교차Fab" 분자(레인 A = 비환원됨, 레인 B = 환원됨, 레인 A에 대한 피크 표)의 CE-SDS 분석을 도시한다. 상이한 정제 방법[단백질 A 친화성 크로마토그래피(PA), 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 양이온 교환 크로마토그래피(cIEX), 및 최종 크기 배제 크로마토그래피 단계(re-SEC)]은 전하 변형이 없는 분자(83A10-TCB) 및 전하 변형이 있는 분자(83A10-TCBcv)에 적용된다.
도 24는 단백질 A 친화성 크로마토그래피(PA) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 정제 단계 후 헤드-투-헤드(head-to-head: H2H) 비교에서, 실시예 2에 사용된 "도립된 2+1 IgG 교차Fab" 분자의 CE-SDS 분석(레인 A = 비환원됨, 레인 B = 환원됨, 레인 A에 대한 피크 표)을 도시한다.
도 25는 항-BCMA/항-CD3 T 세포 이중특이적 항체와 BCMA-양성 다발성 골수종 세포주 결합의 유동 세포계측법 분석을 도시한다. (A) H929 세포 및 MKN45 세포에서 83A10-TCB, (B) H929 세포 및 MKN45 세포에서 83A10-TCBcv, (C) H929 세포에서 83A10-TCB 및 83A10-TCBcv의 비교.
도 26은 LDH 방출에 의해 측정된 항-BCMA/항-CD3 TCB 항체((A) 83A10-TCB, (B) 83A10-TCBcv)에 의한 BCMA-양성 H929 골수 세포의 사멸을 도시한다.
도 27은 실시예 3에서 제조된 TCB를 도시한다. (A) 전하 변형(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, Her2 결합제에서 전하 변형, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K)이 있는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab", (B) 전하 변형이 있는 "2+1 IgG 교차Fab"(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, Her3 결합제에서 전하 변형, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K).
도 28은 실시예 3에서 제조된(최종 정제 준비) TCB의 CE-SDS 분석을 도시한다. (A) 도 27에 나타낸 Her2 TCB의 전기영동도, (B) 도 27에 나타낸 Her3 TCB의 전기영동도. 레인 A = 비환원됨, 레인 B = 환원됨.
도 29는 FACS에 의해 측정된, Her2 TCB(A) 및 Her3 TCB(B)와 세포의 결합을 도시한다. 유동 세포계측법으로 측정된, Her2 TCB 분자와 주르카트 세포(좌측)에서 인간 CD3 또는 KPL-4 세포(우측)에서 인간 Her2(A) 또는 Her3(B)과 결합하기 위한 중간 형광 강도. SD를 포함하여 3회 반복 검정에 기초하여 중간 형광 값이 도시된다.
도 30은 Her3 TCB에 의한 T 세포 활성화를 도시한다. 인간 PBMC 효과기 세포, KPL-4 표적 세포의 공동 항온처리 및 Her3 TCB의 농도 증가시, CD69 양성 CD8 T 세포의 퍼센트를 48시간 후 FACS로 측정하였다. SD를 포함하여 3회 반복 검정으로 나타내었다.
도 31은 발광에 의해 측정된, 5시간 후 CD3을 통한 주르카트 세포의 활성화를 도시한다. KPL4 종양 세포와 함께 주르카트-NFAT 리포터 세포(E:T 5:1(A) 또는 2.5:1(B))의 항온처리 및 Her2 TCB(A) 또는 Her3 TCB(B)의 농도 증가시, 주르카트의 활성화를 5시간 후 상대적인 발광 신호(RLU)에 의해 측정하였다. EC50 값을 그래프 패드 프리즘(Graph Pad Prism)으로 계산하였다(34.4 pM(A) 및 22 pM(B)). 3회 반복 검정으로 평균 값을 도시하고, 오차 막대는 SD를 나타낸다.
도 32는 (A 및 B) 25시간(A) 또는 46 시간(B) 동안 Her2-양성 KPL4, N87, T47D 또는 MDA-MB-231 표적 세포를 인간 PBMC 효과기 세포(E:T 10:1)와 함께 항온처리 및 Her2 TCB 분자의 농도 증가시, LDH 방출에 의해 측정된, 종양 세포 용해율을 도시한다. 3회 반복 검정으로 평균 값을 도시하고, 오차 막대는 SD를 나타낸다. EC50 값을 그래프 패드 프리즘으로 계산하였다: 7.5 pM(KPL4 세포), 25.6 pM(N87 세포), 30.6 pM(T47D 세포), 및 59.9 pM(MDA-MB-231 세포). (C) 나타낸 바와 같이, 24시간 또는 48시간 동안 Her3-양성 KPL4 표적 세포를 인간 PBMC 효과기 세포(E:T 10:1)와 함께 항온처리 및 Her3 TCB 분자의 농도 증가시, LD 방출에 의해 측정된 종양 세포 용해. 3회 반복 검정으로 평균 값을 도시하고, 오차 막대는 SD를 나타낸다. EC50 값을 그래프 패드 프리즘으로 계산하였다: 2.54 pM(24시간) 및 0.53 pM(48시간).
도 33은 카스파제 3/7 활성(발광)에 의해 측정된, Her3 TCB에 의해 유도된 종양 세포 용해율을 도시한다. PBMC(E:T = 10:1) 및 나타낸 바와 같은 상이한 농도의 Her3 TCB와 6.5시간 공동 항온처리 후 KPL-4-카스파제-3/7 글로센서(GloSensor) 표적 세포에서 카스파제 3/7 활성의 결과로서 측정된, 상대 발광 신호를 나타낸다. SD를 포함하여 3회 반복 검정하였다. EC50 값을 그래프 패드 프리즘으로 계산하였다: 0.7 pM.
도 34는 실시예 4에서 제조된 TCB를 도시한다. (A) 전하 변형(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, MCSP 결합제에서 전하 변형, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K)이 있는 "(Fab)2-교차Fab", (B) 전하 변형(CD3 결합제에서 VH/VL 교환)이 없는 "(Fab)2-교차Fab".
도 35는 실시예 4에서 제조(최종 정제 준비)된 전하 변형이 있는 TCB의 CE-SDS 분석을 도시한다: 도 34에 나타낸 (Fab)2-XFab-LC007cv의 전기영동도. 레인 A = 비환원됨, 레인 B = 환원됨.
도 36은 유동 세포계측법에 의해 측정된, TCB 분자와 MV-3 세포(좌측)에서 인간 MCSP 또는 주르카트 세포(우측)에서 인간 CD3의 결합에 대한 중간 형광 강도를 도시한다. SD를 포함하여 3회 반복 검정으로 측정된 중간 형광 값이 도시된다.
도 37은 인간 MCSP-양성 MV-3 세포와 인간 PBMC 효과기 세포(E:T = 10:1)의 항온처리 및 24시간(좌측) 또는 48시간(우측) 동안 TCB 분자의 농도 증가시, LDH 방출에 의해 측정된, 종양 세포 용해를 도시한다. 3회 반복 검정으로 평균 값을 도시하고, 오차 막대는 SD를 나타낸다.
정의
하기에서 달리 정의되어 있지 않은 한, 용어는 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 바와 같이 본원에서 사용된다.
본원에서 사용된 용어 "항원 결합 분자"는 그의 가장 넓은 의미에서 항원성 결정인자에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 항원 결합 분자의 예는 면역글로불린 및 이의 유도체, 예를 들면, 단편이다.
용어 "이중특이적"은 항원 결합 분자가 2개 이상의 상이한 항원성 결정인자에 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 의미한다. 전형적으로, 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항원 결합 부위를 포함하고, 상기 부위 각각은 상이한 항원성 결정인자에 대해 특이적이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항원성 결정인자, 특히 2개의 상이한 세포 상에서 발현된 2개의 항원성 결정인자에 동시적으로 결합할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "원자가(valent)"는 항원 결합 분자에 특정된 수의 항원 결합 부위가 존재한다는 것을 표시한다. 따라서, 용어 "항원에 대한 1가 결합"은 항원에 대해 특이적인 하나의(및 하나 이하의) 항원 결합 부위가 항원 결합 분자에 존재한다는 것을 표시한다.
"항원 결합 부위"는 항원과의 상호작용을 제공하는 항원 결합 분자의 부위, 즉 하나 이상의 아미노산 잔기를 지칭한다. 예를 들면, 항체의 항원 결합 부위는 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 잔기를 포함한다. 천연 면역글로불린 분자는 전형적으로 2개의 항원 결합 부위를 갖고, Fab 분자는 전형적으로 단일 항원 결합 부위를 갖는다.
본원에서 사용된 용어 "항원 결합 모이어티"는 항원성 결정인자에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 분자를 지칭한다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 모이어티는 그 자신에 부착된 물질(예를 들면, 제 2 항원 결합 모이어티)이 표적 부위, 예를 들면, 항원성 결정인자를 보유하는 특정 유형의 종양 세포 또는 종양 간질(stroma)로 향하게 할 수 있다. 또 하나의 실시양태에서, 항원 결합 모이어티는 그의 표적 항원, 예를 들면, T 세포 수용체 복합체 항원을 통해 신호전달을 활성화시킬 수 있다. 항원 결합 모이어티는 본원에 추가로 정의된 바와 같은 항체 및 이의 단편을 포함한다. 특정 항원 결합 모이어티는 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 모이어티는 본원에 더 정의되어 있고 당해 분야에서 공지되어 있는 바와 같은 항체 불변 영역을 포함할 수 있다. 유용한 중쇄 불변 영역은 하기 5종의 동종형 중 임의의 동종형을 포함한다: α, δ, ε, γ 및 μ. 유용한 경쇄 불변 영역은 하기 2종의 동종형 중 임의의 동종형을 포함한다: κ 및 λ.
본원에서 사용된 용어 "항원성 결정인자"는 "항원" 및 "에피토프"와 동의어이고, 항원 결합 모이어티가 결합하여 항원 결합 모이어티-항원 복합체를 형성하는 폴리펩티드 거대분자 상의 부위(예를 들면, 아미노산의 연속 스트레치 또는 비연속 아미노산의 상이한 영역으로 구성된 입체구조적 배열)를 지칭한다. 유용한 항원성 결정인자는 예를 들면, 종양 세포의 표면 상에, 바이러스-감염된 세포의 표면 상에, 다른 병든 세포의 표면 상에, 면역 세포의 표면 상에, 혈액 혈청 내에 자유롭게 및/또는 세포외 매트릭스(ECM) 내에서 발견될 수 있다. 달리 표시되어 있지 않는 한, 본원에서 항원으로서 지칭된 단백질(예를 들면, CD3)은 포유동물, 예컨대, 영장류(예를 들면, 인간) 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 척추동물 공급원으로부터 유래된 임의의 천연 형태 단백질일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항원은 인간 단백질이다. 본원에서 특정 단백질이 언급되는 경우, 상기 용어는 "전장" 비프로세싱된 단백질뿐만 아니라 세포에서의 프로세싱으로부터 발생되는 임의의 형태의 단백질도 포괄한다. 상기 용어는 단백질의 천연 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체도 포괄한다. 항원으로서 유용한 예시적 인간 단백질은 CD3, 특히 CD3의 엡실론 서브유닛(유니프롯 번호 P07766(버전 130) 참조, NCBI RefSeq 번호 NP_000724.1, 인간 서열의 경우 서열번호 1; 또는 유니프롯 번호 Q95LI5(버전 49), NCBI 유전자은행 번호 BAB71849.1, 사이노몰구스[필리핀 원숭이(Macaca fascicularis) 서열]의 경우 서열번호 2)이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 상이한 종의 CD3 또는 표적 세포 항원 사이에 보존되어 있는 CD3 또는 표적 세포 항원의 에피토프에 결합한다.
"특이적 결합"은 결합이 항원에 대해 선택적이고 원치 않거나 비특이적인 상호작용으로부터 구별될 수 있다는 것을 의미한다. 특이적 항원성 결정인자에 결합하는 항원 결합 모이어티의 능력은 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA) 또는 당업자에게 알려진 다른 기법, 예를 들면, (비아코어 기기 상에서 분석되는) 표면 플라스몬 공명(SPR) 기법(문헌[Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329(2000)]) 및 전통적인 결합 분석(문헌[Heeley, Endocr Res 28, 217-229(2002)])을 통해 측정될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 모이어티와 관련없는 단백질의 결합 정도는 예를 들면, SPR에 의해 측정되었을 때 항원 결합 모이어티와 항원의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티, 또는 상기 항원 결합 모이어티를 포함하는 항원 결합 분자는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM(예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(KD)를 갖는다.
"친화성"은 분자의 단일 결합 부위(예를 들면, 수용체)와 그의 결합 파트너(예를 들면, 리간드) 사이의 비공유 상호작용의 총 합계의 강도를 지칭한다. 달리 표시되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원(예를 들면, 항원 결합 모이어티와 항원, 또는 수용체와 그의 리간드) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화성을 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로 해리 속도 상수 및 결합 속도 상수(각각 koff 및 kon)의 비인 해리 상수(KD)로 표시될 수 있다. 따라서, 상기 속도 상수의 비가 동일하게 유지되는 한, 동등한 친화성은 상이한 속도 상수를 포함할 수 있다. 친화성은 본원에 기재된 방법을 포함하는, 당해 분야에서 공지된 잘 확립된 방법에 의해 측정될 수 있다. 친화성을 측정하는 특정 방법은 표면 플라스몬 공명(SPR)이다.
"감소된 결합", 예를 들면, Fc 수용체에 대한 감소된 결합은 예를 들면, SPR에 의해 측정시 각각의 상호작용에 대한 친화성의 감소를 지칭한다. 명료함을 위해, 상기 용어는 0(또는 분석 방법의 검출 한계 미만), 즉 상호작용의 완전한 제거까지의 친화성의 감소도 포함한다. 대조적으로, "증가된 결합"은 각각의 상호작용에 대한 결합 친화성의 증가를 지칭한다.
본원에서 사용된 "활성화 T 세포 항원"은 항원 결합 분자와의 상호작용시 T 세포 활성화를 유도할 수 있는, T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 표면 상에서 발현된 항원성 결정인자를 지칭한다. 구체적으로, 항원 결합 분자와 활성화 T 세포 항원의 상호작용은 T 세포 수용체 복합체의 신호전달 캐스케이드를 유발함으로써 T 세포 활성화를 유도할 수 있다. 특정 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원은 CD3, 특히 CD3의 엡실론 하위단위이다(유니프롯(UniProt) 번호 P07766(버전 130), NCBI 참조 번호 NP_000724.1, 인간 서열에 대하여 서열번호 1; 또는 유니프롯 번호 Q95LI5(버전 49), NCBI 젠뱅크(GenBank) 번호 BAB71849.1, 시노몰구스[마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)] 서열에 대하여 서열번호 2 참조).
본원에서 사용된 "T 세포 활성화"는 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성, 및 활성화 마커의 발현으로부터 선택된, T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 하나 이상의 세포 반응을 지칭한다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 T 세포 활성화를 유도할 수 있다. T 세포 활성화를 측정하기에 적합한 분석은 본원에 기재된 바와 같이 당해 분야에서 공지되어 있다.
본원에서 사용된 "표적 세포 항원"은 표적 세포, 예를 들면, 종양 내의 세포, 예컨대, 암세포 또는 종양 간질의 세포의 표면 상에서 제시된 항원성 결정인자를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 표적 세포 항원은 CD20, 특히 인간 CD20이다(유니프롯 번호 P11836 참조).
본원에서 Fab 분자 등과 관련하여 사용된 용어 "제 1", "제 2" 또는 "제 3"은 하나 초과의 각각의 유형의 모이어티가 존재할 때 구별의 편리함을 위해 사용된다. 달리 명시되어 있지 않은 한, 이들 용어의 사용은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 특정 순서 또는 배향을 부여하기 위한 것이 아니다.
"Fab 분자"는 면역글로불린의 중쇄의 VH 및 CH1 도메인("Fab 중쇄") 및 경쇄의 VL 및 CL 도메인("Fab 경쇄")으로 구성된 단백질을 지칭한다.
"융합된"은 구성성분(예를 들면, Fab 분자 및 Fc 도메인 서브유닛)이 직접 또는 하나 이상의 펩티드 연결기를 통해 펩티드 결합에 의해 연결되어 있다는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "단일 쇄"는 펩티드 결합에 의해 선형으로 연결된 아미노산 단량체를 포함하는 분자를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 모이어티 중 하나는 단일 쇄 Fab 분자, 즉 Fab 경쇄와 Fab 중쇄가 펩티드 연결기에 의해 연결되어 단일 펩티드 쇄를 형성하는 Fab 분자이다. 이러한 특정 실시양태에서, Fab 경쇄의 C-말단은 단일 쇄 Fab 분자에서 Fab 중쇄의 N-말단에 연결되어 있다.
"교차" Fab 분자("교차Fab"로도 지칭됨)는 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인이 교환되어 있는(즉, 서로 대체된) Fab 분자를 의미한다(즉, 교차 Fab 분자는 경쇄 가변 도메인 VL 및 중쇄 불변 도메인 1 CH1(VL-CH1, N- 내지 C-말단 방향에서)로 구성된 펩티드 쇄, 및 중쇄 가변 도메인 VH 및 경쇄 불변 도메인 CL(VH-CL, N- 내지 C-말단 방향에서)로 구성된 펩티드 쇄를 포함한다). 명료함을 위해, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인이 교환되어 있는 교차 Fab 분자에서, 중쇄 불변 도메인 1 CH1을 포함하는 펩티드 쇄는 본원에서 교차 Fab 분자의 "중쇄"로서 지칭된다.
용어 "면역글로불린 분자"는 천연 항체의 구조를 갖는 단백질을 지칭한다. 예를 들면, IgG 부류의 면역글로불린은 다이설파이드 결합된 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 또는 중쇄 가변 도메인으로도 지칭되는 가변 도메인(VH)에 이어서 중쇄 불변 영역으로도 지칭되는 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 지칭되는 가변 도메인(VL)에 이어서 경쇄 불변 영역으로도 지칭되는 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 면역글로불린의 중쇄는 α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG) 또는 μ(IgM)로 지칭되는 5종의 유형 중 하나로 배정될 수 있고, 이들 유형 중 일부는 하위유형, 예를 들면, γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) 및 α2(IgA2)로 세분될 수 있다. 면역글로불린의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여 카파(κ) 및 람다(λ)로 지칭되는 2종의 유형 중 하나로 배정될 수 있다. 면역글로불린은 본질적으로 면역글로불린 힌지(hinge) 영역을 통해 연결된 2개의 Fab 분자 및 1개의 Fc 도메인으로 구성된다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 한, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 항체 구조물을 포괄한다.
"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는, 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예에는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 다이아바디, 선형 항체, 단일 쇄 항체 분자(예를 들면, scFv), 및 단일 도메인 항체가 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 일부 항체 단편의 검토를 위해서는 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해서는 예를 들면, 문헌[Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibody, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조하고, WO 93/16185 및 US 5,571,894 및 US 5,587,458도 참조한다. 살비지(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의를 위해서는 US 5,869,046을 참조한다. 다이아바디는 2가일 수 있거나 이중특이적일 수 있는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들면, EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]; 및 문헌[Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)]을 참조한다. 또한, 트라이아바디 및 테트라바디가 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]에 기재되어 있다. 단일 도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부, 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체(도맨티스 인코포페이티드(Domantis, Inc.), 미국 매사추세츠주 왈탐 소재); 예를 들면, US 6,248,516 B1 참조)이다. 항체 단편은 본원에 기재된 바와 같이 온전한 항체의 단백질용해성 분해 및 재조합 숙주 세포(예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 파지)에 의한 제조를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 기법에 의해 제조될 수 있다.
용어 "항원 결합 도메인"은 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 항원의 일부 또는 전부에 상보적인 영역을 포함하는 항체의 일부를 지칭한다. 항원 결합 도메인은 예를 들면, 하나 이상의 항체 가변 도메인(항체 가변 도메인으로도 지칭됨)에 의해 제공될 수 있다. 특히, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체와 항원의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 이때 각각의 도메인은 4개의 보존된 골격 영역(FR) 및 3개의 초가변 도메인(HVR)을 포함한다. 예를 들면, 문헌[Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)]을 참조한다. 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열 면에서 초가변성을 갖고/갖거나 구조적으로 정의된 루프("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역 각각을 지칭한다. 일반적으로, 천연 4쇄 항체는 6개의 HVR(VH 내의 3개 HVR(H1, H2 및 H3) 및 VL 내의 3개 HVR(L1, L2 및 L3))을 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프 및/또는 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 잔기를 포함하고, 이때 후자는 가장 높은 서열 가변성을 갖고/갖거나 항원 인식에 관여한다. VH 내의 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. 초가변 도메인(HVR)은 "상보성 결정 영역"(CDR)으로도 지칭되고, 이들 용어는 항원 결합 영역을 형성하는 가변 도메인의 일부를 언급하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이러한 특정 영역은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 및 [Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987)]에 기재되어 있고, 이때 정의는 서로에 대해 비교되었을 때 아미노산 잔기의 중첩 또는 서브세트를 포함한다. 그럼에도, 항체 또는 이의 변이체의 CDR을 지칭하기 위한 어느 한 정의의 적용은 본원에서 정의되고 사용된 용어의 범위 내에 있기 위한 것이다. 상기 인용된 참조문헌 각각에 의해 정의된 CDR을 구성하는 적절한 아미노산 잔기는 비교로서 하기 표 1에 기재되어 있다. 특정 CDR을 구성하는 정확한 잔기 수는 상기 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 당업자는 항체의 가변 도메인 아미노산 서열이 주어졌을 때 어떤 잔기가 특정 CDR을 구성하는 지를 상용적으로 결정할 수 있다. 본원에 주어진 CDR 서열은 일반적으로 카바트 정의에 따른다.
[표 1]
또한, 카바트 등의 문헌은 임의의 항체에 적용될 수 있는 가변 도메인 서열에 대한 넘버링 시스템을 정의하였다. 당업자는 서열 자체 이외의 임의의 실험 데이터에 의존하지 않으면서 이 "카바트 넘버링" 시스템을 임의의 가변 도메인 서열에 명확히 배정할 수 있다. 가변 영역 서열과 관련하여 본원에서 사용된 "카바트 넘버링"은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 기재된 넘버링 시스템을 지칭한다. 달리 특정되어 있지 않은 한, 항체 가변 도메인 내의 특정 아미노산 잔기 위치의 넘버링에 대한 언급은 카바트 넘버링 시스템에 따른다.
본원에 사용된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 보든 불변 영역 및 도메인의 아미노산 위치는 문헌[Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 기재된 카바트 넘버링 시스템에 따라 넘버링되고, 본원에서 "카바트에 따라 넘버링" 또는 "카바트 넘버링"으로 지칭된다. 구체적으로, 카바트 넘버링 시스템(문헌[Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]의 647 내지 660쪽 참조)은 카파 및 람다 동종형의 경쇄 불변 도메인 CL에 대하여 사용되고, 카바트 EU 지수 넘버링 시스템(661 내지 723쪽 참조)은 중쇄 불변 도메인(CH1, 힌지, CH2 및 CH3)에 대하여 사용되고, 이러한 경우 본원에서 "카바트 EU 지수에 따라 넘버링"을 언급함으로써 본원에서 또한 명백해진다.
서열목록의 폴리펩티드 서열은 카바트 넘버링 시스템에 따라 넘버링되어 있지 않다. 그러나, 서열목록의 서열의 넘버링을 카바트 넘버링으로 전환시키는 것은 당해 분야에서 통상의 기술 범위 내에 있다.
"골격" 또는 "FR"은 초가변 도메인(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 하기 4개의 FR 도메인으로 구성된다: FR1, FR2, FR3 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
항체 또는 면역글로불린의 "부류"는 그의 중쇄에 의해 보유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 하기 5종의 주요 부류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 일부는 하위부류(동종형), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 나누어질 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다.
본원에서 용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계가 약간 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 Cys226 또는 Pro230부터 중쇄의 카복시-말단까지 걸쳐 있는 것으로 정의된다. 그러나, 숙주 세포에 의해 생성된 항체는 중쇄의 C-말단으로부터 하나 이상, 특히 1 또는 2개의 아미노산의 전사 후 절단을 겪을 수 있다. 따라서, 전장 중쇄를 암호화하는 특이적 핵산 분자의 발현에 의한 숙주 세포에 의해 생성된 항체는 전장 중쇄를 포함할 수 있고, 상기 항체는 전장 중쇄의 절두된 가변(본원에서 "절두된 가변 중쇄"로도 지칭됨)을 포함할 수 있다. 중쇄의 최종 2개의 C-말단 아미노산이 글리신(G446) 및 리신(K447, 카바트 EU 지수에 따라 넘버링)인 경우 사실일 수 있다. 따라서, Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447), 또는 C-말단 글리신(Gly446) 및 리신(K447)은 존재할 수 있거나 존재할 수 없다. Fc 도메인(또는 본원에 정의된 바와 같은 Fc 도메인의 서브유닛)을 비롯한 중쇄의 아미노산 서열은 달리 나타내지 않는 경우 C-말단 글리신-리신 다이펩티드를 포함하지 않고 본원에 나타낸다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 포함된, 본원에 명시된 Fc 도메인의 서브유닛을 비롯한 중쇄는 추가의 C-말단 글리신-리신 다이펩티드(G446 및 K447, 카바트의 EU 지수에 따라 넘버링)를 포함한다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 포함된, 본원에 명시된 Fc 도메인의 서브유닛을 비롯한 중쇄는 추가의 C-말단 글리신 잔기(G446, 카바트의 EU 지수에 따라 넘버링)를 포함한다. 본 발명의 조성물, 예컨대 본원에 기재된 약학 조성물은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 개체군(population)을 포함한다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 개체군은 전장 중쇄를 갖는 분자 및 절두된 가변 중쇄를 갖는 분자를 포함할 수 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 개체군은 전장 중쇄를 갖는 분자 및 절두된 가변 중쇄를 갖는 분자의 혼합물로 이루어질 수 있고, 이때 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상은 절두된 가변 중쇄를 갖는다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 개체군을 포함하는 조성물은 추가의 C-말단 글리신-리신 다이펩티드(G446 및 K447, 카바트의 EU 지수에 따라 넘버링)를 갖는 본원에 명시된 Fc 도메인의 서브유닛을 비롯한 중쇄를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 개체군을 포함하는 조성물은 추가의 C-말단 글리신 잔기(G446, 카바트의 EU 지수에 따라 넘버링)를 갖는 본원에 명시된 Fc 도메인의 서브유닛을 비롯한 중쇄를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, 상기 조성물은 본원에 명시된 Fc 도메인의 서브유닛을 비롯한 중쇄를 포함하는 분자; 추가의 C-말단 글리신 잔기(G446, 카바트의 EU 지수에 따라 넘버링)를 갖는 본원에 명시된 Fc 도메인의 서브유닛을 비롯한 중쇄를 포함하는 분자; 및 추가의 C-말단 글리신-리신 다이펩티드(G446 및 K447, 카바트의 EU 지수에 따라 넘버링)를 갖는 본원에 명시된 Fc 도메인의 서브유닛을 비롯한 중쇄를 포함하는 분자로 구성된다. 본원에서 달리 특정되어 있지 않은 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)](또한 상기 참조)에 기재된 바와 같이 EU 지수로도 지칭되는 EU 넘버링 시스템에 따른다. 본원에서 사용된 Fc 도메인의 "서브유닛"은 안정한 자가 결합을 형성할 수 있는, 이량체 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드 중 하나, 즉 면역글로불린 중쇄의 C-말단 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들면, IgG Fc 도메인의 서브유닛은 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인을 포함한다.
"Fc 도메인의 제 1 서브유닛과 제 2 서브유닛의 결합을 촉진하는 변형"은 Fc 도메인 서브유닛을 포함하는 폴리펩티드와 동일한 폴리펩티드가 결합하여 동종이량체를 형성하는 것을 감소시키거나 방해하는, Fc 도메인 서브유닛의 펩티드 골격 조작 또는 번역 후 변형이다. 본원에서 사용된 결합을 촉진하는 변형은 특히 원하는 2개의 Fc 도메인 서브유닛(즉, Fc 도메인의 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛) 각각이 결합하도록 만들어진 별도의 변형을 포함하고, 이때 상기 변형은 상기 2개의 Fc 도메인 서브유닛의 결합을 촉진하도록 서로 상보적이다. 예를 들면, 결합을 촉진하는 변형은 Fc 도메인 서브유닛의 결합을 각각 입체적으로 또는 정전기적으로 유리하게 만들도록 상기 Fc 도메인 서브유닛 중 하나 또는 둘다의 구조 또는 전하를 변형시킬 수 있다. 따라서, (이종)이량체화는 서브유닛(예를 들면, 항원 결합 모이어티) 각각에 융합된 추가의 구성성분이 동일하지 않다는 의미에서 동일하지 않을, 제 1 Fc 도메인 서브유닛을 포함하는 폴리펩티드와 제 2 Fc 도메인 서브유닛을 포함하는 폴리펩티드 사이에 일어난다. 일부 실시양태에서, 결합을 촉진하는 변형은 Fc 도메인에서 아미노산 돌연변이, 특히 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 결합을 촉진하는 변형은 Fc 도메인의 2개 서브유닛 각각에서 별도의 아미노산 돌연변이, 특히 아미노산 치환을 포함한다.
용어 "효과기 기능"은 항체 동종형에 따라 달라지는, 항체의 Fc 영역에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 효과기 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체 의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC), 항체 의존적 세포 식균작용(ADCP), 사이토카인 분비, 항원 제시 세포에 의한 면역 복합체-매개된 항원 섭취, 세포 표면 수용체(예를 들면, B 세포 수용체)의 하향조절 및 B 세포 활성화를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "조작하다", "조작된" 및 "조작하는"은 천연 또는 재조합 폴리펩티드 또는 이의 단편의 임의의 펩티드 골격 조작 또는 번역 후 변형을 포함하는 것으로 간주된다. 조작은 아미노산 서열, 글리코실화 패턴 또는 개별 아미노산의 측쇄 기의 변형뿐만 아니라 이들 방법의 조합도 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "아미노산 돌연변이"는 아미노산 치환, 결실, 삽입 및 변형을 포괄하기 위한 것이다. 최종 구축물이 원하는 특성, 예를 들면, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 또는 또 다른 펩티드에 대한 증가된 결합을 보유하는 한, 최종 구축물에 도달하기 위해 치환, 결실, 삽입 및 변형의 임의의 조합을 만들 수 있다. 아미노산 서열의 결실 및 삽입은 아미노산의 아미노-말단 및/또는 카복시-말단 결실 및 삽입을 포함한다. 특정 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 예를 들면, Fc 영역의 결합 특성을 변형시키기 위한 목적으로, 비보존적 아미노산 치환, 즉 한 아미노산을 상이한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것이 특히 바람직하다. 아미노산 치환은 비천연 아미노산에 의한 치환 또는 20종의 표준 아미노산의 천연 아미노산 유도체(예를 들면, 4-하이드록시프롤린, 3-메틸히스티딘, 오르니틴, 동종세린, 5-하이드록시라이신)에 의한 치환을 포함한다. 당해 분야에서 주지된 유전적 또는 화학적 방법을 사용하여 아미노산 돌연변이를 발생시킬 수 있다. 유전적 방법은 부위-지정된 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 아미노산의 측쇄 기를 유전적 조작 이외의 방법, 예컨대, 화학적 변형으로 변형시키는 방법도 유용할 수 있다고 생각된다. 동일한 아미노산 돌연변이를 표시하기 위해 다양한 표기가 본원에서 사용될 수 있다. 예를 들면, Fc 도메인의 위치 329에서 프롤린을 글리신으로 치환시키는 것은 329G, G329, G329, P329G 또는 Pro329Gly로서 표시될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드"는 아미드 결합(펩티드 결합으로도 공지됨)에 의해 선형으로 연결된 단량체(아미노산)로 구성된 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드"는 2개 이상의 아미노산으로 구성된 임의의 쇄를 지칭하고, 구체적 길이의 생성물을 지칭하지 않는다. 따라서, 2개 이상의 아미노산으로 구성된 쇄를 지칭하기 위해 사용되는 펩티드, 다이펩티드, 트라이펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 쇄" 또는 임의의 다른 용어가 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩티드"는 이들 용어 중 임의의 용어 대신에 또는 이러한 용어와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 또한, 용어 "폴리펩티드"는 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질용해성 절단, 또는 비천연 아미노산에 의한 변형을 포함하나 이들로 한정되지 않는 폴리펩티드의 발현 후 변형의 생성물을 지칭하기 위한 것이다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유래될 수 있거나 재조합 기술에 의해 제조될 수 있지만, 반드시 표기된 핵산 서열로부터 번역되지는 않는다. 폴리펩티드는 화학적 합성을 포함하는 임의의 방식으로 발생할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 크기는 약 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 500개 이상, 1,000개 이상 또는 2,000개 이상의 아미노산일 수 있다. 폴리펩티드는 정의된 3차원적 구조를 가질 수 있지만 반드시 이러한 구조를 갖지는 않는다. 정의된 3차원적 구조를 갖는 폴리펩티드는 접혀진(folded) 폴리펩티드로서 지칭되고, 정의된 3차원적 구조를 보유하지 않는 폴리펩티드는 오히려 다수의 상이한 입체구조를 채택할 수 있고 접혀지지 않은(unfolded) 폴리펩티드로서 지칭된다.
"단리된" 폴리펩티드 또는 변이체, 또는 이의 유도체는 그의 천연 환경에서 존재하지 않는 폴리펩티드를 의미하기 위한 것이다. 특정한 수준의 정제가 요구되지는 않는다. 예를 들면, 단리된 폴리펩티드는 그의 천연 상태 또는 천연 환경으로부터 분리될 수 있다. 재조합적으로 제조된 폴리펩티드 및 숙주 세포에서 발현된 단백질은 임의의 적합한 기법에 의해 분리되거나, 분획되거나, 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩티드처럼 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다.
기준 폴리펩티드 서열에 대하여 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은 서열을 정렬하고 필요하다면 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입하고 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 후 기준 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 퍼센트로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당해 분야의 기술 내에 있는 다양한 방식, 예를 들면, 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈라인(Megalign)(디엔에이스타(DNASTAR)) 소프트웨어를 사용함으로써 결정될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 결정하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 서열 정렬을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상% 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2의 사용을 통해 발생한다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 만들어졌고, 소스 코드는 미국 저작권 협회(U.S. Copyright Office, 미국 워싱톤 디씨 20559 소재)에 사용자 문서로 출원되었고, 상기 미국 저작권 협회에서 상기 코드는 미국 저작권 등록 번호 TXU510087하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재)로부터 공개적으로 입수될 수 있거나 상기 소스 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하는 UNIX 작동 시스템 상에서 사용을 위해 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 변형되지 않는다. ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의% 아미노산 서열 동일성(또는, 주어진 아미노산 서열 B에 대한 특정% 아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:
100 x 분율(X/Y)
여기서, X는 A 및 B의 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2 정렬에서 상기 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 일치(match)로서 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에 존재하는 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동등하지 않은 경우, B에 대한 A의% 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의% 아미노산 서열 동일성과 동등하지 않을 것임이 인식될 것이다. 달리 구체적으로 명시되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든% 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램의 사용을 통해 바로 이전 단락에 기재된 바와 같이 수득된다.
용어 "폴리펩티드"는 단리된 핵산 분자 또는 구축물, 예를 들면, 메신저 RNA(mRNA), 바이러스로부터 유래된 RNA 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포다이에스터 결합 또는 비통상적인 결합(예를 들면, 아미드 결합, 예컨대, 펩티드 핵산(PNA)에서 발견되는 결합)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오티드에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 분절, 예를 들면, DNA 또는 RNA 단편을 지칭한다.
"단리된" 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 그의 천연 환경으로부터 분리되어 있는 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의미하기 위한 것이다. 예를 들면, 벡터에 함유된 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가의 예에는 이종 숙주 세포 내에서 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액 중의(부분적으로 또는 실질적으로) 정제된 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 분자를 통상적으로 함유하지 않는 세포 내에 함유된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하지만, 폴리뉴클레오티드 분자는 염색체 외부에 존재하거나 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체뿐만 아니라, 양성 및 음성 가닥 형태 및 이중 가닥 형태도 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성 제조된 이러한 분자를 추가로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 조절 요소, 예컨대, 프로모터, 리보좀 결합 부위 또는 전사 종결요소일 수 있거나 이러한 조절 요소를 포함할 수 있다.
본 발명의 기준 뉴클레오티드 서열과 예를 들면 95% 이상 "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기준 뉴클레오티드 서열의 각각 100개 뉴클레오티드당 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 점을 제외하고 상기 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 기준 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 다시 말해, 기준 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해, 기준 서열에서 5% 이하의 뉴클레오티드가 결실될 수 있거나 또 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 기준 서열 내의 총 뉴클레오티드의 5% 이하를 차지하는 다수의 뉴클레오티드가 기준 서열 내로 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이들 변형은 기준 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 일어날 수 있거나, 이들 말단 위치 사이의 임의의 위치에서 일어날 수 있거나, 기준 서열 내의 잔기 사이에 개별적으로 산재되어 있을 수 있거나, 기준 서열 내에서 하나 이상의 인접한 군으로 산재되어 있을 수 있다. 실질적인 문제로서, 임의의 특정 폴리뉴클레오티드 서열이 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한지를, 공지된 컴퓨터 프로그램, 예컨대, 폴리펩티드에 대해 상기 논의된 프로그램(예를 들면, ALIGN-2)을 사용하여 통상적으로 결정할 수 있다.
용어 "발현 카세트"는 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 특정된 핵산 요소와 함께 재조합적으로 또는 합성적으로 발생된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 플라스티드 DNA, 바이러스 또는 핵산 단편 내로 삽입될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은 다른 서열 중에서 전사될 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 발현 카세트는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 "발현 구축물"과 동의어이고, 표적 세포 내로 도입되어 표적 세포에서 그 자신과 작동가능하게 연결된 특정 유전자의 발현을 지시하는 데에 사용되는 DNA 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자가 복제 핵산 구조물로서의 벡터뿐만 아니라 그 자신이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 삽입된 벡터도 포함한다. 본 발명의 발현 벡터는 발현 카세트를 포함한다. 발현 벡터는 다량의 안정한 mRNA의 전사를 가능하게 한다. 발현 벡터가 표적 세포 내부에 존재하면, 유전자에 의해 암호화된 리보핵산 분자 또는 단백질이 세포 전사 및/또는 번역 기구에 의해 제조된다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고, 외래 핵산이 도입되어 있는 세포(이러한 세포의 자손을 포함함)를 지칭한다. 숙주 세포는 일차 형질전환된 세포 및 계대배양의 수와 관계없이 이로부터 유래된 자손을 포함하는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함한다. 자손은 핵산 함량 면에서 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으나 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선별된 기능 또는 생물학적 활성과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 여기에 포함된다. 숙주 세포는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 발생시키는 데에 사용될 수 있는 임의의 유형의 세포 시스템이다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들면, 배양된 포유동물 세포, 예컨대, CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포 및 식물 세포를 포함할 뿐만 아니라, 형질전환 동물, 형질전환 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포도 포함한다.
"활성화 Fc 수용체"는 항체의 Fc 도메인의 개입 후 효과기 기능을 수행하도록 수용체 보유 세포를 자극하는 신호전달 사건을 이끌어내는 Fc 수용체이다. 인간 활성화 Fc 수용체는 FcγRIIIa(CD16a), FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32) 및 FcαRI(CD89)를 포함한다.
항체 의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC)은 면역 효과기 세포에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용해를 유발하는 면역 기작이다. 표적 세포는 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 이의 유도체가 일반적으로 Fc 영역의 N-말단에 위치하는 단백질 부분을 통해 특이적으로 결합하는 세포이다. 본원에서 사용된 용어 "감소된 ADCC"는 상기 정의된 ADCC의 기작에 의해 표적 세포를 둘러싸는 매질 중의 항체의 주어진 농도에서 주어진 시간 이내에 용해되는 표적 세포 수의 감소, 및/또는 ADCC의 기작에 의해 주어진 시간 이내에 주어진 수의 표적 세포의 용해를 달성하는 데에 요구되는, 표적 세포를 둘러싸는 매질 중의 항체의 농도의 증가로서 정의된다. ADCC의 감소는 동일한 표준 제조, 정제, 제형화 및 저장 방법(당업자에게 공지되어 있음)을 사용하였을 때 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 제조되되, 조작되지 않은 동일한 항체에 의해 매개된 ADCC에 비해 상대적인 감소이다. 예를 들면, ADCC를 감소시키는 아미노산 치환을 그의 Fc 도메인 내에 포함하는 항체에 의해 매개된 ADCC의 감소는 Fc 도메인 내에 이 아미노산 치환을 갖지 않는 동일한 항체에 의해 매개된 ADCC에 비해 상대적인 감소이다. ADCC를 측정하기에 적합한 분석은 당해 분야에서 공지되어 있다(예를 들면, WO 2006/082515 또는 WO 2012/130831 참조).
제제의 "효과량"은 이 제제가 투여되는 세포 또는 조직에서 생리학적 변화를 발생시키기 위해 필요한 양을 지칭한다.
제제, 예를 들면, 약학 조성물의 "치료 효과량"은 필요한 시간 동안 필요한 용량에서 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기에 효과적인 양을 지칭한다. 치료 효과량의 제제는 예를 들면, 질환의 불리한 효과를 제거하거나, 감소시키거나, 지연시키거나, 최소화하거나 방지한다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축(예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들면, 인간 및 비인간 영장류, 예컨대, 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 구체적으로, 개체 또는 대상체는 인간이다.
용어 "약학 조성물"은 내부에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이게 하는 형태로 존재하고 제제가 투여될 대상체에게 허용되지 않는 독성을 나타내는 추가의 구성성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분 이외에 대상체에게 독성을 나타내지 않는 약학 조성물 중의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 방부제를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 "치료"(및 이의 문법적 어미변화, 예컨대, "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체에서의 질환의 자연 경과를 변형시키기 위한 시도에서의 임상 시술을 지칭하고, 예방을 위해 또는 임상 병리의 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이의 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 경감, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 질환의 발달을 지연시키거나 질환의 진행을 늦추기 위해 사용된다.
실시양태의 상세한 설명
본 발명은 치료 적용을 위한 양호한 특성, 특히 개선된 생산력(예를 들면, 순도, 수율에 관함)을 갖는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 포함된 Fab 분자의 아미노산 치환은 특히 경쇄와 비일치하는 중쇄의 짝풀림(벤스-존즈-유형 부산물)을 감소시키는데 효율적이고, 이의 결합 아암 중 하나(또는 이상, 2개 이상의 항원 결합 Fab 분자를 포함하는 분자의 경우)에서 VH/VL 교환으로 Fab-기초된 이중특이적/다중특이적 항원 결합 분자의 제조시 발생할 수 있다(또한 전체가 본원에 참조로서 혼입된, PCT/EP2015/057165, 특히 실시예 부분 참조).
본 발명의 제 1 양상에서
(a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 1 Fab 분자
(b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하되 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되는 제 2 Fab 분자
를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고, 이때
상기 제 1 항원은 활성화 T 세포 항원이고, 제 2 항원은 표적 세포 항원이거나, 제 1 항원은 표적 세포 항원이고, 제 2 항원은 활성화 T 세포 항원이고;
i) 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산(카바트에 따라 넘버링)으로 치환되고, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 음으로 하전된 아미노산(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 치환되거나;
ii) 상기 (b)의 제 2 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산(카바트에 따라 넘버링)으로 치환되고, 상기 (b)의 제 2 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 음으로 하전된 아미노산(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 치환된다.
본 발명에 따라, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 상기 i) 및 ii)에 언급된 변형을 둘 다 포함하지 않는다. 제 2 Fab 분자의 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 대체되지 않는다(즉, 교화되지 않고 유지된다).
본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 하나의 실시양태에서, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따라 넘버링)(바람직한 하나의 실시양태에서, 리신(K) 또는 아르기닌(R))으로 독립적으로 치환되고, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 독립적으로 치환된다.
또 하나의 실시양태에서, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따라 넘버링)으로 독립적으로 치환되고, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 독립적으로 치환된다.
특정 실시양태에서, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따라 넘버링)(바람직한 하나의 실시양태에서, 리신(K) 또는 아르기닌(R))으로 독립적으로 치환되고 위치 123의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따라 넘버링)(바람직한 하나의 실시양태에서, 리신(K) 또는 아르기닌(R))으로 독립적으로 치환되고, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 독립적으로 치환되고 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 독립적으로 치환된다.
추가의 특정 실시양태에서, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K)(카바트에 따라 넘버링)으로 치환되고 위치 123의 아미노산은 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따라 넘버링)으로 치환되고, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 치환되고 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 치환된다.
추가의 특정 실시양태에서, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K)(카바트에 따라 넘버링)으로 치환되고 위치 123의 아미노산은 아르기닌(R)(카바트에 따라 넘버링)으로 치환되고, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 치환되고 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링)으로 치환된다.
특정 실시양태에서, 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CL은 카파 동종형의 불변 도메인 CL이다.
다르게는, 상기 실시양태에 따른 아미노산 치환은 상기 (a)의 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1 대신에 상기 (b)의 제 2 Fab 분자의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서 발생할 수 있다. 이러한 특정 실시양태에서, 상기 (b)의 제 2 Fab 분자의 불변 도메인 CL은 카파 동종형의 불변 도메인 CL이다.
본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 3 Fab 분자를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 제 3 Fab 분자는 상기 (a)의 제 1 Fab 분자와 동일하다. 이러한 실시양태에서, 상기 실시양태에 따른 아미노산 치환은 제 1 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자 각각의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서 발생한다. 다르게는, 상기 실시양태에 따른 아미노산 치환은 상기 (b)의 제 2 Fab 분자의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서 발생할 수 있지만, 제 1 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서 발생할 수 없다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 안정하게 회합할 수 있는 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 추가로 포함한다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 포맷
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 성분은 다양한 배열로 서로 융합될 수 있다. 예시적 배열은 도 1에 도시되어 있다.
특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 안정하게 회합할 수 있는 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제 2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 서브유닛 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다.
이러한 실시양태에서, 제 1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다. 구체적인 이러한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 본질적으로 제 1 Fab 분자, 제 2 Fab 분자, 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 구성되되, 제 1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있고, 제 2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 서브유닛 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다. 이러한 배열은 도 1G 및 1K에 구조적으로 도시된다. 임의적으로, 제 1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 추가로 서로 융합될 수 있다.
또 이러한 추가의 실시양태에서, 제 1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 서브유닛 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다. 구체적인 이러한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 본질적으로 제 1 Fab 분자, 제 2 Fab 분자, 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 구성되되, 제 1 Fab 분자 및 제 2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 각각 융합되어 있다. 상기 배열은 도 1A 및 1D에 구조적으로 도시된다. 제 1 Fab 분자 및 제 2 Fab 분자는 펩티드 연결기를 통해 Fc 도메인에 직접 융합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제 1 Fab 분자 및 제 2 Fab 분자는 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인에 각각 융합된다. 구체적인 실시양태에서, 면역글로불린 힌지 영역은 인간 IgG1 힌지 영역이고, 특히 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다.
또 하나의 실시양태에서, 제 1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛에 융합된다.
이러한 실시양태에서, 제 2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다. 구체적인 이러한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 본질적으로 제 1 Fab 분자, 제 2 Fab 분자, 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 구성되고, 이때 제 2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 Fc 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있고, 제 1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 서브유닛 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다. 상기 배열은 도 1H 및 1L에 구조적으로 도시된다. 임의적으로, 제 1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 추가로 서로 융합될 수 있다.
Fab 분자는 Fc 도메인에 융합될 수 있거나, 직접 또는 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2 내지 20개의 아미노산을 포함하는 펩티드 연결기를 통해 서로 융합될 수 있다. 펩티드 연결기는 당해 분야에서 공지되어 있고 본원에 기재된 바와 같다. 적합한 비면역원성 펩티드 연결기는 예를 들면, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 연결기를 포함한다. "n"은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4의 정수이다. 하나의 실시양태에서, 상기 펩티드 연결기의 길이는 5개 이상의 아미노산, 하나의 실시양태에서, 5 내지 100개, 또 하나의 실시양태에서, 10 내지 50개의 아미노산을 갖는다. 하나의 실시양태에서, 상기 펩티드 연결기는 (GxS)n 또는 (GxS)nGm 이고, 이때 G는 글리신, S는 세린이고, x는 3이고, n은 3, 4, 5 또는 6이고, m은 0, 1, 2 또는 3이거나, x는 4이고, n은 2, 3, 4 또는 5이고, m은 0, 1, 2 또는 3이고, 하나의 실시양태에서, x는 4이고, n은 2 또는 3이고, 또 하나의 실시양태에서, x는 4이고, n은 2이다. 하나의 실시양태에서, 상기 펩티드 연결기는 (G4S)2이다. 제 1 Fab 분자 및 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄를 서로 융합하는데 특히 적합한 펩티드 연결기는 (G4S)2이다. 제 1 Fab 분자 및 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄를 연결하는데 적합한 예시적 펩티드 연결기는 서열(D)-(G4S)2(서열번호 11 및 12)를 포함한다. 추가로, 연결기는 면역글로불린 힌지 영역(의 일부)을 포함할 수 있다. 특히, Fab 분자가 Fc 도메인 서브유닛의 N-말단에 융합되는 경우, 추가의 펩티드 연결기를 사용하거나 사용하지 않고 면역글로불린 힌지 영역 또는 이의 일부를 통해 상기 Fab 분자를 융합시킬 수 있다.
특히, 고친화성 Fab 분자의 결합 후 표적 세포 항원의 내재화가 예상되는 경우, (예를 들면, 도 1A, 1D, 1G, 1H, 1K, 1L에 나타낸 바와 같이) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단일 항원 결합 모이어티(예컨대, Fab 분자)를 갖는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 유용하다. 이러한 경우, 표적 세포 항원에 대해 특이적인 하나 초과의 Fab 분자의 존재는 표적 세포 항원의 내재화를 향상시킴으로써 그의 사용가능성을 감소시킬 수 있다.
그러나, 많은 또 다른 경우에서, 예를 들면, 표적 부위로의 표적화를 최적화하거나 표적 세포 항원의 가교결합을 가능하게 하기 위해 표적 세포 항원에 대해 특이적인 2개 이상의 항원 결합 모이어티(예컨대, Fab 분자)를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 갖는 것이 유리할 것이다(도 1B, 1C, 1E, 1F, 1I, 1J, 1M 또는 1N에 나타낸 예 참조).
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 3 Fab 분자를 추가로 포함한다. 제 1 항원은 바람직하게는 표적 세포 항원이다. 하나의 실시양태에서, 제 3 Fab 분자는 통상적인 Fab 분자이다. 하나의 실시양태에서, 제 3 Fab 분자는 제 1 Fab 분자와 동일하다(즉, 제 1 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자는 동일한 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 포함하고 동일한 도메인 배열(즉, 통상적 또는 교차)을 갖는다). 특정 실시양태에서, 제 2 Fab 분자는 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3에 특이적으로 결합하고, 제 1 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합한다.
또 하나의 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 제 3 Fab 분자를 추가로 포함한다. 이러한 실시양태에서, 제 2 항원은 바람직하게는 표적 세포 항원이다. 이러한 하나의 실시양태에서, 제 3 Fab 분자는 교차 Fab 분자(Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL이 서로 교환된/대체된 Fab 분자)이다. 이러한 하나의 실시양태에서, 제 3 Fab 분자는 제 2 Fab 분자와 동일하다(즉, 제 2 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자는 동일한 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 포함하고, 도메인의 동일한 정렬(즉, 통상의 또는 교차)을 갖는다). 이러한 하나의 실시양태에서, 제 1 Fab 분자는 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3에 특이적으로 결합하고, 제 2 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합한다.
하나의 실시양태에서, 제 3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 도메인의 제 1 서브유닛 또는 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합된다.
특정 실시양태에서, 제 2 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되고, 제 1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 이러한 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 본질적으로 제 1 Fab 분자, 제 2 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자, 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 구성되고, 이때 제 1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 제 2 Fab 분자는 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 N-말단에 융합되고, 제 3 Fab 분자는 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 상기 배열은 도 1B 및 1E(제 3 Fab 분자는 통상적인 Fab 분자이고 바람직하게는 제 1 Fab 분자와 동일한 특정 실시양태), 및 도 1I 및 1M(제 3 Fab 분자는 교차 Fab 분자이고 바람직하게는 제 2 Fab 분자와 동일한 또 하나의 실시양태)에 개략적으로 도시된다. 제 2 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자는 직접적으로 또는 펩티드 연결기를 통해 Fc 도메인에 융합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제 2 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자는 각각 면역글로불린 힌지 영역를 통해 Fc 도메인에 융합된다. 특정 실시양태에서, 면역글로불린 힌지 영역은 인간 IgG1 힌지 영역이고, 특히 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 임의적으로, 제 1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 추가로 서로 융합될 수 있다.
또 하나의 실시양태에서, 제 1 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되고, 제 2 Fab 분자는 중쇄의 C-말단에서 제 1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 이러한 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 본질적으로 제 1 Fab 분자, 제 2 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자, 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 이루어지고, 이때 제 2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 제 1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 N-말단에 융합되고, 제 3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 상기 배열은 도 1C 및 1F(제 3 Fab 분자는 통상적인 Fab 분자이고 바람직하게는 제 1 Fab 분자와 동일한 특정 실시양태) 및 도 1J 및 1N(제 3 Fab 분자는 교차 Fab 분자이고 바람직하게는 제 2 Fab 분자와 동일한 또 하나의 실시양태)에 개략적으로 도시된다. 제 1 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자는 직접적으로 또는 펩티드 연결기를 통해 Fc 도메인에 융합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제 1 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자는 각각 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인에 융합된다. 특정 실시양태에서, 면역글로불린 힌지 영역은 인간 IgG1 힌지 영역이고, 특히 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 임의적으로, 제 1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 추가로 서로 융합될 수 있다.
Fab 분자가 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 각각의 서브유닛의 N-말단으로 면역글로불린 힌지 영역을 통해 융합되는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 배열에서, 2개의 Fab 분자, 힌지 영역 및 Fc 도메인은 본질적으로 면역글로불린 분자를 형성한다. 특정 실시양태에서, 면역글로불린 분자는 IgG 부류 면역글로불린이다. 추가의 특정 실시양태에서, 면역글로불린은 IgG1 하위부류 면역글로불린이다. 또 하나의 실시양태에서, 면역글로불린은 IgG4 하위부류 면역글로불린이다. 추가의 특정 실시양태에서, 면역글로불린은 인간 면역글로불린이다. 또 하나의 실시양태에서, 면역글로불린은 키메릭 면역글로불린 또는 인간화된 면역글로불린이다.
본 발명의 일부 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에서, 제 1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄는, 임의적으로 펩티드 연결기를 통해, 서로 융합된다. 제 1 Fab 분자 및 제 2 Fab 분자의 배열에 따라, 제 1 Fab 분자의 Fab 경쇄는 이의 C-말단에서 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄의 N-말단에 융합될 수 있거나, 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 이의 C-말단에서 제 1 Fab 분자의 Fab 경쇄의 N-말단에 융합될 수 있다. 제 1 Fab 분자 및 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄의 융합은 불일치된 Fab 중쇄 및 경쇄의 짝풀림을 추가로 감소시키고, 또한 본 발명의 일부 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 발혈에 필요한 플라스미드의 수를 감소시킨다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제 2 Fab 분자는 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다), Fc 도메인 서브유닛(VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드, 및 제 1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛(VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2))과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드, 및 제 1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 예를 들면, 이황화 결합에 의해 공유 결합된다.
일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는, 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제 2 Fab 분자는 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다), 제 1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, Fc 도메인 서브유닛(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 포함한다. 또 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는, 제 1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제 2 Fab 분자는 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다), Fc 도메인 서브유닛(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 포함한다.
이러한 실시양태의 일부에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 2 Fab 분자의 교차 Fab 경쇄 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 이때 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역은 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제 1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유한다. 이러한 추가의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는, 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 제 1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(2)-CH1(2)-VL(1)-CL(1))와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드, 또는 적절한 경우 제 1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드가 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2))과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
이러한 실시양태에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 (i) Fc 도메인 서브유닛 폴리펩티드(CH2-CH3(-CH4)), 또는 (ii) 제 3 Fab 분자의 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4))과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드 및 제 3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(3)-CL(3))를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 예를 들면, 이황화 결합에 의해 공유 결합된다.
일부 실시양태에서, 제 1 Fab 분자는 중쇄의 C-말단에서 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fc 도메인을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 본질적으로 제 1 Fab 분자 및 제 2 Fab 분자, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 이루어지고, 제 1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 상기 배열은 도 10 및 15에 개략적으로 도시된다.
또 하나의 실시양태에서, 제 2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fc 도메인을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 본질적으로 제 1 Fab 분자 및 제 2 Fab 분자, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 이루어지고, 이때 제 2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 상기 배열은 도 1P 및 1T에 개략적으로 도시된다.
일부 실시양태에서, 제 1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된 제 3 Fab 분자를 추가로 포함한다. 이러한 특정 실시양태에서, 상기 제 3 Fab 분자는 통상적인 Fab 분자이다. 이러한 또 하나의 실시양태에서, 상기 제 3 Fab 분자는 본원에 기재된 교차 Fab 분자, 즉, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL이 서로 교환된/대채된 Fab 분자이다. 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 본질적으로 제 1 Fab 분자, 제 2 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 이루어지고, 이때 제 1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 제 3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 상기 배열은 도 1Q 및 1U(제 3 Fab 분자가 통상적인 Fab 분자이고 바람직하게는 제 1 Fab 분자와 동일한 특정 실시양태)에 개략적으로 도시된다.
일부 실시양태에서, 제 1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fab 중쇄의 N-말단에서 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 C-말단에 융합된 제 3 Fab 분자를 추가로 포함한다. 이러한 특정 실시양태에서, 상기 제 3 Fab 분자는 본원에 기재된 교차 Fab 분자, 즉, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL이 서로 교환된/대체된 Fab 분자이다. 이러한 또 하나의 실시양태에서, 상기 제 3 Fab 분자는 통상적인 Fab 분자이다. 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 본질적으로 제 1 Fab 분자, 제 2 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 이루어지고, 이때 제 1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 제 3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 N-말단에서 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 C-말단에 융합된다. 상기 배열은 도 1W 및 1Y(제 3 Fab 분자가 교차 Fab 분자이고 바라직하게는 제 2 Fab 분자와 동일한 특정 실시양태)에 개략적으로 도시된다.
일부 실시양태에서, 제 2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 중쇄의 N-말단에서 제 1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 C-말단에 융합된 제 3 Fab 분자를 추가로 포함한다. 이러한 특정 실시양태에서, 제 3 Fab 분자는 통상적인 Fab 분자이다. 이러한 또 하나의 실시양태에서, 상기 제 3 Fab 분자는 본원에 기재된 교차 Fab 분자, 즉, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL이 서로 교환된/대체된 Fab 분자이다. 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 본질적으로 제 1 Fab 분자, 제 2 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 이루어지고, 이때 제 2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 제 3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 N-말단에서 제 1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 C-말단에 융합된다. 상기 배열은 도 1R 및 1V(제 3 Fab 분자가 통상적인 Fab 분자이고 바람직하게는 제 1 Fab 분자와 동일한 특정 실시양태)에 개략적으로 도시된다.
일부 실시양태에서, 제 2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된 제 3 Fab 분자를 추가로 포함한다. 이러한 특정 실시양태에서, 상기 제 3 Fab 분자는 본원에 기재된 교차 Fab 분자이고, 즉, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL이 서로 교환된/대체된 Fab 분자이다. 이러한 또 하나의 실시양태에서, 상기 제 3 Fab 분자는 통상적인 Fab 분자이다. 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 본질적으로 제 1 Fab 분자, 제 2 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 이루어지고, 이때 제 2 Fab 분자 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 제 3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 상기 배열은 도 1X 및 1Z(제 3 Fab 분자가 교차 Fab 분자이고 바람직하게는 제 1 Fab 분자와 동일한 특정 실시양태)에 개략적으로 도시된다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는, 제 1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역(즉, 제 2 Fab 분자는 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다)(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는, 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제 1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는, 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역(즉, 제 2 Fab 분자는 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다)과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 제 1 Fab 분자의 Fab 중쇄(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는, 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제 1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는, 제 3 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제 1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역(즉, 제 2 Fab 분자는 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다)(VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는, 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제 1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(3)-CL(3))를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는, 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역(즉, 제 2 Fab 분자는 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다)과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 제 1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 제 3 Fab 분자의 Fab 중쇄(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3))와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는, 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제 1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(3)-CL(3))를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는, 제 1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역(즉, 제 2 Fab 분자는 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다)과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 제 3 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 제 3 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역(즉, 제 3 Fab 분자는 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다)(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-VL(3)-CH1(3))과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는, 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제 1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는, 제 3 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제 3 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(3)-CL(3))과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는, 제 3 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제 3 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역(즉, 제 3 Fab 분자는 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다)과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역(즉, 제 2 Fab 분자는 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다)(VL(3)-CH1(3)-VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 제 1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는, 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제 2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제 1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는, 제 3 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제 3 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(3)-CL(3))과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
상기 실시양태 중 임의의 실시양태에 따라, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 구성성분(예를 들면, Fab 분자, Fc 도메인)은 직접적으로 융합될 수 있거나, 본원에 기재되어 있거나 당해 분야에서 공지되어 있는 다양한 연결기, 특히 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2개 내지 20개의 아미노산을 포함하는 펩티드 연결기를 통해 융합될 수 있다. 적합한 비면역원성 펩티드 연결기는 예를 들면, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 연결기를 포함하고, 이때 n은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4의 정수이다.
Fc 도메인
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 중쇄 도메인을 포함하는 한 쌍의 폴리펩티드 쇄로 구성된다. 예를 들면, 면역글로불린 G(IgG) 분자의 Fc 도메인은 이량체이고, 이들의 각각의 서브유닛은 CH2 IgG 중쇄 불변 도메인 및 CH3 IgG 중쇄 불변 도메인을 포함한다. Fc 도메인의 2개 서브유닛은 서로 안정한 결합을 형성할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 하나 이하의 Fc 도메인을 포함한다.
본 발명에 따른 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 특정 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다.
또 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 S228(카바트 넘버링)에서 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 S228P를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 이 아미노산 치환은 IgG4 항체의 생체내 Fab 아암 교환을 감소시킨다(문헌[Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)] 참조). 추가의 특정 실시양태에서, Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다. 인간 IgG1 Fc 영역의 예시적인 서열은 서열번호 13으로 주어진다.
이종이량체화를 촉진하는 Fc 도메인 변형
본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fc 도메인의 2개 서브유닛 중 하나 또는 다른 하나에 융합된 상이한 Fab 분자를 포함하므로, 상기 Fc 도메인의 2개 서브유닛은 전형적으로 2개의 동일하지 않은 폴리펩티드 쇄에 포함되어 있다. 이들 폴리펩티드의 재조합 공동-발현 및 후속 이량체화는 상기 2개의 폴리펩티드의 여러 가능한 조합을 유발한다. 따라서, 재조합 제조에 있어서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 수율 및 순도를 개선하기 위해, 원하는 폴리펩티드의 결합을 촉진하는 변형을 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인 내에 도입하는 것이 유리할 것이다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 Fc 도메인의 제 1 서브유닛과 제 2 서브유닛의 결합을 촉진하는 변형을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개 서브유닛 사이의 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용의 부위는 Fc 도메인의 CH3 도메인에 존재한다. 따라서, 하나의 실시양태에서, 상기 변형은 Fc 도메인의 CH3 도메인에 존재한다.
이종이량체화를 시행하기 위해 Fc 도메인의 CH3 도메인에서 변형시키기 위한 여러 접근법이 존재하고, 예를 들면 WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291에 잘 기재되어 있다. 전형적으로, 모든 상기 접근법에서, Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 CH3 도메인 및 Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 CH3 도메인 둘 다는, 각각의 CH3 도메인(또는 이를 포함하는 중쇄)이 더 이상 스스로 동종이량체화 될 수 없지만 (제 1 CH3 도메인 및 제 2 CH3 도메인이 이종이량체화되고 2개의 제 1 CH3 도메인 또는 2개의 제 2 CH3 도메인 사이에 동종이량체가 형성되지 않도록) 상보적으로 조작된 다른 CH3 도메인과 이종이량체화 하도록 상보적인 방식으로 조작된다. 향상된 중쇄 이종이량체화를 위한 이러한 상이한 접근법은 경쇄 짝풀림 및 벤스 존스 유형 부산물을 감소시키는 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에서 중쇄-경쇄 변형(하나의 결합 아암에서 VH 및 VL 교환/대체 및 CH1/CL 계면에서 반대 전하로 하전된 아미노산 치환의 도입)과 함께 상이한 대안으로서 고려된다.
특정 실시양태에서, Fc 도메인의 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛의 회합을 촉진하는 상기 변형은 Fc 도메인의 2개 서브유닛 중 하나에서 "놉" 변형을 포함하고 Fc 도메인의 2개 서브유닛 중 나머지 하나에서 "홀" 변형을 포함하는 소위 "놉-인투-홀(knob-into-hole)" 변형이다.
놉-인투-홀 기술은 예를 들면, US 5,731,168, US 7,695,936, 문헌[Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)] 및 [Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)]에 기재되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 돌출부를 캐비티에 위치시켜 이종이량체 형성을 촉진하고 동종이량체 형성을 방해할 수 있도록 돌출부("놉")를 제 1 폴리펩티드의 계면에서 도입하고 상응하는 캐비티("홀")를 제 2 폴리펩티드의 계면에서 도입하는 단계를 포함한다. 돌출부는 제 1 폴리펩티드의 계면의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄(예를 들면, 티로신 또는 트립토판)로 치환됨으로써 구축된다. 상기 돌출부와 동일하거나 유사한 크기의 상쇄 캐비티는 큰 아미노산 측쇄가 보다 작은 아미노산 측쇄(예를 들면, 알라닌 또는 쓰레오닌)로 치환됨으로써 제 2 폴리펩티드의 계면에서 생성된다.
따라서, 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환됨으로써, 돌출부가 제 2 서브유닛의 CH3 도메인 내의 캐비티에 위치할 수 있는 제 1 서브유닛의 CH3 도메인 내에서 발생되고, Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환됨으로써, 캐비티가 제 1 서브유닛의 CH3 도메인 내의 돌출부가 위치할 수 있는 제 2 서브유닛의 CH3 도메인 내에서 발생한다.
바람직하게는 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기는 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기는 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T) 및 발린(V)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
돌출부 및 캐비티는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 변형시킴으로써, 예를 들면, 부위 특이적 돌연변이유발 또는 펩티드 합성에 의해 만들어질 수 있다.
특정 실시양태에서, Fc 도메인의 제 1 서브유닛("놉" 서브유닛)의 CH3 도메인에서 위치 366의 쓰레오닌 잔기는 트립토판 잔기로 치환되고(T366W), Fc 도메인의 제 2 서브유닛("홀" 서브유닛)의 CH3 도메인에서 위치 407의 티로신 잔기는 발린 잔기로 치환된다(Y407V). 하나의 실시양태에서, Fc 도메인의 제 2 서브유닛에서 추가로 위치 366의 쓰레오닌 잔기는 세린 잔기로 치환되고(T366S) 위치 368의 류신 잔기는 알라닌 잔기로 치환된다(L368A)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
추가의 실시양태에서, Fc 도메인의 제 1 서브유닛에서 추가로 위치 354의 세린 잔기는 시스테인 잔기로 치환되거나(S354C) 위치 356의 글루탐산 잔기는 시스테인 잔기로 치환되고(E356C), Fc 도메인의 제 2 서브유닛에서 추가로 위치 349의 티로신 잔기는 시스테인 잔기로 치환된다(Y349C)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링). 이들 2개의 시스테인 잔기의 도입은 Fc 도메인의 2개 서브유닛 사이에서 이량체를 더 안정화시키는 다이설파이드 가교의 형성을 야기한다(문헌[Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)] 참조).
특정 실시양태에서, Fc 도메인의 제 1 서브유닛은 아미노산 치환 S354C 및 T366W를 포함하고, Fc 도메인의 제 2 서브유닛은 아미노산 치환 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
특정 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 Fc 도메인의 제 1 서브유닛("놉" 변형을 포함함)에 융합된다(임의적으로 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자를 통해). 이론에 구애됨이 없이, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자와 Fc 도메인의 놉-함유 서브유닛의 융합은 활성화 T 세포 항원에 결합하는 2개의 Fab 분자를 포함하는 분자에 결합하는 항원의 생성(2개의 놉-함유 폴리펩티드의 입체 충돌)을 (추가로) 최소화한다.
이종이량체화를 실시하기 위한 CH3-변형의 다른 기술은 본 발명에 따른 대안으로 고려되고 예를 들면, WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291에 기재되어 있다.
하나의 실시양태에서, 다르게는 EP 1870459 A1에 기재된 이종이량체화 접근법이 사용된다. 이러한 접근법은 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 사이의 CH3/CH3 도메인 계면 중에 특정한 아미노산 위치에서 전하된 아미노산을 반대 전하로 도입하는 것에 기초한다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 대한 바람직한 하나의 실시양태는 (Fc 도메인의) 2개의 CH3 도메인 중 하나에서 아미노산 돌연변이 R409D; K370E 및 Fc 도메인의 CH3 도메인의 다른 하나에서 아미노산 돌연변이 D399K; E357K이다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
또 하나의 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 도메인의 제 1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 T366W 및 제 2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 T366S, L368A, Y407V, 및 추가적으로 Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 R409D; K370E 및 Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 D399K; E357K를 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
또 하나의 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 S354C, T366W, 및 Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 Y349C, T366S, L368A, Y407V를 포함하거나, 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 Y349C, T366W, 및 Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 S354C, T366S, L368A, Y407V, 및 추가로 Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 R409D; K370E 및 Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 D399K; E357를 포함한다(모두 카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
하나의 실시양태에서, 다르게는 WO 2013/157953에 기재된 이종이량체화 접근법이 사용된다. 하나의 실시양태에서, 제 1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366K를 포함하고, 제 2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351D를 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링). 또 하나의 실시양태에서, 제 1 CH3 도메인은 추가 아미노산 돌연변이 L351K를 포함한다. 또 하나의 실시양태에서, 제 2 CH3 도메인은 Y349E, Y349D 및 L368E(바람직하게는 L368E)로부터 선택된 추가 아미노산 돌연변이를 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
하나의 실시양태에서, 다르게는 WO 2012/058768에 기재된 이종이량체화 접근법이 사용된다. 하나의 실시양태에서, 제 1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351Y, Y407A를 포함하고, 제 2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366A, K409F를 포함한다. 또 하나의 실시양태에서, 제 2 CH3 도메인은 위치 T411, D399, S400, F405, N390 또는 K392에서, 예를 들면, (a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E 및 T411W, (b) D399R, D399W, D399Y 및 D399K, (c) S400E, S400D, S400R 및 S400K, (d) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V 및 F405W, (e) N390R, N390K 및 N390D, (f) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F 및 K392E로부터 선택된 추가 아미노산 돌연변이를 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링). 또 하나의 실시양태에서, 제 1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351Y, Y407A를 포함하고, 제 2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366V, K409F를 포함한다. 또 하나의 실시양태에서, 제 1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407A를 포함하고, 제 2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366A, K409F를 포함한다. 또 하나의 실시양태에서, 제 2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 K392E, T411E, D399R 및 S400R을 추가로 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
하나의 실시양태에서, 다르게는 WO 2011/143545에 기재된 이종이량체화 접근법, 예를 들면, 368 및 409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 변형이 사용된다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
하나의 실시양태에서, 다르게는 상기 기재된 놉-인투-홀 기법을 또한 사용하는 WO 2011/090762에 기재된 이종이량체화 접근법이 사용된다. 하나의 실시양태에서, 제 1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366W를 포함하고, 제 2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407A를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 제 1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366Y를 포함하고, 제 2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407T를 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 Fc 도메인은 IgG2 서브클래스의 분자 또는 도메인이고, 다르게는 WO 2010/129304에 기재된 이종이량체화 접근법이 사용된다.
대안적인 실시양태에서, Fc 도메인의 제 1 서브유닛과 제 2 서브유닛의 결합을 촉진하는 변형은 예를 들면, WO 2009/089004에 기재된 바와 같이 정전기 조종(steering) 효과를 매개하는 변형을 포함한다. 일반적으로, 이 방법은 동종이량체 형성이 정전기적으로 불리하게 되지만 이종이량체화가 정전기적으로 유리하게 되도록 2개의 Fc 도메인 서브유닛의 계면에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 하전된 아미노산 잔기로 치환시키는 단계를 포함한다. 이러한 하나의 실시양태에서, 제 1 CH3 도메인은 음으로 하전된 아미노산으로 K392 또는 N392의 아미노산 치환(예를 들면, 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D), 바람직하게는 K392D 또는 N392D)을 포함하고 제 2 CH3 도메인은 양으로 하전된 아미노산으로 D399, E356, D356 또는 E357의 아미노산 치환(예를 들면, 리신(K) 또는 아르기닌(R), 바람직하게는 D399K, E356K, D356K 또는 E357K, 더욱 바람직하게는 D399K 또는 E356K)을 포함한다. 또 하나의 실시양태에서, 제 1 CH3 도메인은 음으로 하전된 아미노산으로 K409 또는 R409의 아미노산 치환(예를 들면, 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D), 바람직하게는 K409D 또는 R409D)을 추가로 포함한다. 또 하나의 실시양태에서, 제 1 CH3 도메인은 추가로 또는 다르게는 음으로 하전된 아미노산으로 K439 및/또는 K370의 아미노산 치환(예를 들면, 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D))을 포함한다(모두 카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
또 하나의 실시양태에서, 다르게는 WO 2007/147901에 기재된 이종이량체화 접근법이 사용된다. 하나의 실시양태에서, 제 1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 K253E, D282K 및 K322D를 포함하고, 제 2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 D239K, E240K 및 K292D를 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
또 하나의 실시양태에서, 다르게는 WO 2007/110205에 기재된 이종이량체화 접근법이 사용될 수 있다.
하나의 실시양태에서, Fc 도메인의 제 1 서브유닛은 아미노산 치환 K392D 및 K409D를 포함하고, Fc 도메인의 제 2 서브유닛은 아미노산 치환 D356K 및 D399K를 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 도메인 변형
Fc 도메인은 표적 조직에서의 우수한 축적 및 유리한 조직-혈액 분포 비에 기여하는 긴 혈청 반감기를 포함하는 유리한 약동학적 성질을 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 부여한다. 그러나, 동시에 상기 Fc 도메인은 바람직한 항원 보유 세포로의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 표적화보다는 오히려 Fc 수용체를 발현하는 세포로의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 원치 않는 표적화를 유발할 수 있다. 더욱이, Fc 수용체 신호전달 경로의 공활성화(co-활성화)는 항원 결합 분자의 T 세포 활성화 성질 및 긴 반감기와 함께 사이토카인 수용체의 과도한 활성화 및 전신 투여 시 심각한 부작용을 초래하는 사이토카인 방출을 유발할 수 있다. T 세포 이외의(Fc 수용체 보유) 면역 세포의 활성화는 예를 들면, NK 세포에 의한 T 세포의 잠재적 파괴로 인해 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 효능조차도 더 감소시킬 수 있다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 천연 IgG1 Fc 도메인에 비해 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 이러한 하나의 실시양태에서, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)은 천연 IgG1 Fc 도메인(또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)에 비해 Fc 수용체에 대한 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만의 결합 친화성, 및/또는 천연 IgG1 Fc 도메인(또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)에 비해 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만의 효과기 기능을 나타낸다. 하나의 실시양태에서, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)은 실질적으로 Fc 수용체에 결합하지 않고/않거나 효과기 기능을 유도하지 않는다. 특정 실시양태에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 하나의 실시양태에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 하나의 실시양태에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 구체적인 실시양태에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 보다 구체적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로 인간 FcγRIIIa이다. 하나의 실시양태에서, 효과기 기능은 CDC, ADCC, ADCP 및 사이토카인 분비로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효과기 기능이다. 특정 실시양태에서, 효과기 기능은 ADCC이다. 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 천연 IgG1 Fc 도메인에 비해 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 실질적으로 유사한 결합 친화성을 나타낸다. Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)이 FcRn에 대한 천연 IgG1 Fc 도메인(또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)의 결합 친화성의 약 70% 초과, 구체적으로 약 80% 초과, 보다 구체적으로 약 90% 초과의 결합 친화성을 나타내는 경우 FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합이 달성된다.
특정 실시양태에서, Fc 도메인은 조작되지 않은 Fc 도메인에 비해 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 구체적인 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 전형적으로, 동일한 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc 도메인의 2개 서브유닛 각각에 존재한다. 하나의 실시양태에서, 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 감소시킨다. 하나의 실시양태에서, 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 2배 이상, 5배 이상 또는 10배 이상만큼 감소시킨다. Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 감소시키는 하나 초과의 아미노산 돌연변이가 존재하는 실시양태에서, 이들 아미노산 돌연변이의 조합은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 10배 이상, 20배 이상 또는 심지어 50배 이상만큼 감소시킬 수 있다. 하나의 실시양태에서, 조작된 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 조작되지 않은 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 비해 Fc 수용체에 대한 20% 미만, 특히 10% 미만, 보다 특히 5% 미만의 결합 친화성을 나타낸다. 특정 실시양태에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 구체적인 실시양태에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 보다 구체적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로 인간 FcγRIIIa이다. 바람직하게는, 이들 수용체 각각에 대한 결합이 감소된다. 일부 실시양태에서, 보체 구성성분에 대한 결합 친화성, 구체적으로 C1q에 대한 결합 친화성도 감소된다. 하나의 실시양태에서, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합 친화성은 감소되지 않는다. Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)이 FcRn에 대한 조작되지 않은 형태의 Fc 도메인(또는 상기 조작되지 않은 형태의 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)의 결합 친화성의 약 70% 초과의 결합 친화성을 나타내는 경우 FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합, 즉 상기 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성의 보존이 달성된다. Fc 도메인, 또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 이러한 친화성의 약 80% 초과, 심지어 약 90% 초과의 결합 친화성을 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 조작되지 않은 Fc 도메인에 비해 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 감소된 효과기 기능은 하기 효과기 기능 중 하나 이상의 효과기 기능을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다: 감소된 보체 의존적 세포독성(CDC), 감소된 항체 의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC), 감소된 항체 의존적 세포 식균작용(ADCP), 감소된 사이토카인 분비, 항원 제시 세포에 의한 감소된 면역 복합체-매개된 항원 흡수, NK 세포에 대한 감소된 결합, 대식세포에 대한 감소된 결합, 단핵세포에 대한 감소된 결합, 다형핵세포에 대한 감소된 결합, 세포자멸을 유도하는 감소된 직접적인 신호전달, 표적-결합된 항체의 감소된 가교결합, 감소된 수지상 세포 성숙, 및 감소된 T 세포 프라이밍(priming). 하나의 실시양태에서, 감소된 효과기 기능은 감소된 CDC, 감소된 ADCC, 감소된 ADCP 및 감소된 사이토카인 분비로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효과기 기능이다. 특정 실시양태에서, 감소된 효과기 기능은 감소된 ADCC이다. 하나의 실시양태에서, 감소된 ADCC는 조작되지 않은 Fc 도메인(또는 조작되지 않은 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)에 의해 유도된 ADCC의 20% 미만이다.
하나의 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 E233, L234, L235, N297, P331 및 P329로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링). 보다 구체적인 실시양태에서, Fc 도메인은 L234, L235 및 P329로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링). 일부 실시양태에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A 및 L235A를 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링). 이러한 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환을 포함한다. 보다 구체적인 실시양태에서, 아미노산 치환은 P329A 또는 P329G, 특히 P329G이다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링). 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환을 포함하고 E233, L234, L235, N297 및 P331로부터 선택된 위치에서 추가의 아미노산 치환을 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링). 보다 구체적인 실시양태에서, 추가의 아미노산 치환은 E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D 또는 P331S이다. 특정 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 P329, L234 및 L235에서 아미노산 치환을 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링). 보다 특정 실시양태에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G("P329G LALA")를 포함한다. 이러한 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 아미노산 치환의 "P329G LALA" 조합은 전체적으로 본원에 참조로 도입되는 WO 2012/13083에 기재된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 도메인의 Fcγ 수용체(및 상보적) 결합을 거의 완전히 제거한다. 또한, WO 2012/130831은 이러한 돌연변이체 Fc 도메인을 제조하는 방법 및 그의 성질, 예컨대, Fc 수용체 결합 또는 효과기 기능을 결정하는 방법을 기재한다.
IgG4 항체는 IgG1 항체에 비해 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인, 특히 인간 IgG4 Fc 도메인이다. 하나의 실시양태에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 S228에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 S228P를 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링). Fc 수용체에 대한 그의 결합 친화성 및/또는 그의 효과기 기능을 더 감소시키기 위해, 하나의 실시양태에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 L235에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 L235E를 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링). 또 하나의 실시양태에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 P329G를 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링). 특정 실시양태에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 S228, L235 및 P329에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 S228P, L235E 및 P329G를 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링). 이러한 IgG4 Fc 도메인 돌연변이체 및 이들의 Fcγ 수용체 결합 성질은 전체적으로 본원에 참조로 도입되는 WO 2012/130831에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 천연 IgG1 Fc 도메인에 비해 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타내는 Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A, L235A 및 임의적으로 P329G를 포함하는 인간 IgG1 Fc 도메인, 또는 아미노산 치환 S228P, L235E 및 임의적으로 P329G를 포함하는 인간 IgG4 Fc 도메인이다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
특정 실시양태에서, Fc 도메인의 N-글리코실화는 제거되어 있다. 하나의 이러한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 N297에서 아미노산 돌연변이, 특히 아스파라긴을 알라닌(N297A) 또는 아스파르트산(N297D)으로 치환시키는 아미노산 치환을 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
전술되어 있고 WO 2012/130831에도 기재된 Fc 도메인 이외에, 감소된 Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 갖는 Fc 도메인은 Fc 도메인 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 도메인도 포함한다(US 6,737,056)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링). 이러한 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297이 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하는, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상의 아미노산 위치에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다(US 7,332,581).
돌연변이체 Fc 도메인은 당해 분야에서 주지되어 있는 유전적 또는 화학적 방법을 사용한 아미노산 결실, 치환, 삽입 또는 변형에 의해 제조될 수 있다. 유전적 방법은 암호화 DNA 서열의 부위 특이적 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 정확한 뉴클레오티드 변화는 예를 들면, 서열분석에 의해 검증될 수 있다.
Fc 수용체에 대한 결합은 예를 들면, ELISA에 의해, 또는 표준 기기, 예컨대, 비아코어 기기(지이 헬쓰케어)를 사용한 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 용이하게 결정될 수 있고, Fc 수용체는 예컨대, 재조합 발현에 의해 수득될 수 있다. 적합한 이러한 결합 분석은 본원에 기재되어 있다. 대안적으로, 특정 Fc 수용체를 발현하는 것으로 공지된 세포주, 예컨대, FcγIIIa 수용체를 발현하는 인간 NK 세포를 사용하여 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인, 또는 Fc 도메인을 포함하는 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 결합 친화성을 평가할 수 있다.
Fc 도메인, 또는 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 효과기 기능은 당해 분야에서 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. ADCC를 측정하기에 적합한 분석은 본원에 기재되어 있다. 관심 있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 다른 예는 US 5,500,362, 문헌[Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)], [Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985), US 5,821,337 및 문헌[Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)]에 기재되어 있다. 대안적으로, 비방사성 분석 방법이 사용될 수 있다(예를 들면, 유세포계수를 위한 ACTI(상표) 비방사성 세포독성 분석(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재), 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비방사성 세포독성 분석(프로메가(프로메가), 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 참조). 이러한 분석을 위한 유용한 효과기 세포는 말초혈 단핵세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 있는 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들면, 동물 모델, 예컨대, 문헌[Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)]에 개시된 동물 모델에서 평가될 수 있다.
일부 실시양태에서, Fc 도메인과 보체 구성성분, 특히 C1q의 결합이 감소된다. 따라서, Fc 도메인이 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작되어 있는 일부 실시양태에서, 상기 감소된 효과기 기능은 감소된 CDC를 포함한다. C1q 결합 분석은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 C1q에 결합할 수 있음으로써 CDC 활성을 갖는 지를 결정하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들면, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에 기재된 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 분석을 수행할 수 있다(예를 들면, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996)], [Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003)] 및 [Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)] 참조).
항원 결합 모이어티
본 발명의 항원 결합 분자는 이중특이적이다(즉, 상기 분자는 2개의 상이한 항원성 결정인자에 특이적으로 결합할 수 있는 2개 이상의 Fab 분자를 포함한다). 본 발명에 따라, Fab 분자는 Fab 분자(즉, 가변 도메인 및 불변 도메인을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄로 구성된 항원 결합 도메인)이다. 하나의 실시양태에서, 상기 Fab 분자는 인간 Fab 분자이다. 또 하나의 실시양태에서, 상기 Fab 분자는 인간화된 Fab 분자이다. 또 하나의 실시양태에서, 상기 Fab 분자는 인간 중쇄 불변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
Fab 분자 중 하나 이상은 교차 Fab 분자이다. 이러한 변형은 상이한 Fab 분자의 중쇄와 경쇄의 짝풀림을 감소시킴으로써 재조합 제조에 있어서 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 수율 및 순도를 개선한다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 유용한 특정 교차 Fab 분자에서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인(각각 VL 및 VH)은 교환된다. 그러나, 이러한 도메인 교환에도 불구하고, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제조는 짝풀림된 중쇄 및 경쇄 사이의 소위 벤스 존스 유형 상호작용으로 인해 특정한 부산물을 포함할 수 있다(문헌[Schaefer et al, PNAS, 108 11187-11191 (2011)] 참조). 상이한 Fab 분자로부터 중쇄 및 경쇄의 짝풀림을 추가로 감소시키고 따라서 목적한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 순도 및 수율을 증가시키기 위해, 본 발명에 따라 하전된 반대 전하를 갖는 아미노산은 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자, 또는 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자의 CH1 및 CL 도메인에서 특정한 아미노산 위치에 도입된다. 전하 변형은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 포함된 통상적인 Fab 분자(예컨대, 도 1A 내지 C, G 내지 J에 나타냄), 또는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 포함된 교차 Fab 분자(예컨대, 도 1D 내지 F, K 내지 N에 나타냄)에서 수행된다(그러나 둘 다에서는 아님). 특정 실시양태에서, 전하 변형은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 포함된 통상적인 Fab 분자에서 수행된다(특정 실시양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합한다).
본 발명에 따른 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원, 특히 종양 세포 항원, 및 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3에 동시적으로 결합할 수 있다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원 및 활성화 T 세포 항원에 동시적으로 결합함으로써 T 세포와 표적 세포를 가교결합시킬 수 있다. 보다 구체적인 실시양태에서, 이러한 동시적인 결합은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 야기한다. 하나의 실시양태에서, 이러한 동시적인 결합은 T 세포의 활성화를 야기한다. 또 하나의 실시양태에서, 이러한 동시적인 결합은 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성 및 활성화 마커의 발현으로 이루어진 군으로부터 선택된, T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 세포 반응을 야기한다. 하나의 실시양태에서, 표적 세포 항원에 대한 동시적인 결합의 부재하에 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자와 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3의 결합은 T 세포 활성화를 야기하지 않는다.
하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 T 세포의 세포독성 활성을 표적 세포로 방향 전환시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 방향 전환은 표적 세포에 의한 MHC-매개된 펩티드 항원 제시 및/또는 T 세포의 특이성과 무관하다.
특히, 본 발명의 실시양태 중 임의의 실시양태에 따른 T 세포는 세포독성 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포, 특히 CD8+ T 세포이다.
T 세포 활성화 항원 결합 Fab 분자
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 Fab 분자를 포함한다(본원에서 "활성화 T 세포 항원 결합 Fab 분자"로도 지칭됨). 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이하의 Fab 분자(또는 다른 Fab 분자)를 포함한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 활성화 T 세포 항원과 결합하는 1가를 제공한다.
특정 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 본원에 기재된 교차 Fab 분자, 즉, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL이 서로 교환된/대체된 Fab 분자이다. 이러한 실시양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 통상적인 Fab 분자이다. 하나 이상의 Fab 분자가 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 포함된 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 바람직하게는 교차 Fab 분자이고, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 통상적인 Fab 분자이다.
또 하나의 실시양태에서, 활성화 T 세포에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 통상적인 Fab 분자이다. 이러한 실시양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 본원에 기재된 교차 Fab 분자, 즉, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL이 서로 교환된/대체된 Fab 분자이다.
특정 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원은 CD3, 특히 인간 CD3(서열번호 1) 또는 시노몰구스 CD3(서열번호 2), 가장 특히 인간 CD3이다. 특정 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원 결합 Fab 분자는 인간 및 시노몰구스 CD3에 대하여 교차-반응성이다(즉, 인간 및 시노몰구스 CD3에 특이적으로 결합한다). 일부 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원은 CD3의 엡실론 서브유닛(CD3 엡실론)이다.
일부 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원 결합 Fab 분자는 CD3, 특히 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
하나의 실시양태에서, CD3 결합 Fab 분자는 서열번호 4의 중쇄 CDR1, 서열번호 5의 중쇄 CDR2 및 서열번호 6의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2 및 서열번호 10의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 하나의 실시양태에서, CD3 결합 Fab 분자는 서열번호 4의 중쇄 CDR1, 서열번호 67의 중쇄 CDR2 및 서열번호 6의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 68의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2 및 서열번호 10의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 실시양태에서, CD3 결합 Fab 분자는 서열번호 3과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 7과 적어도 약 5%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
하나의 실시양태에서, CD3 결합 Fab 분자는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 실시양태에서, CD3 결합 Fab 분자는 서열번호 3의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 7의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
표적 세포 항원 결합 Fab 분자
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 Fab 분자(본원에서 "표적 세포 항원 결합 Fab 분자"로도 지칭됨)를 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 2개의 Fab 분자를 포함한다. 이러한 특정 실시양태에서, 이러한 Fab 분자는 각각 동일한 항원 결정기에 특이적으로 결합한다. 추가의 특정 실시양태에서, 이러한 Fab 분자는 모두 동일한바, 상기 분자는 (임의의 경우) 본원에 기재된 CH1 및 CL 도메인에서 동일한 아미노산 치환을 포함하는 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 포함한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 2개 이하의 Fab 분자를 포함한다.
특정 실시양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 통상적인 Fab 분자이다. 이러한 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 본원에 기재된 교차 Fab 분자, 즉, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL이 서로 교환된/대체된 Fab 분자이다.
또 하나의 실시양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 본원에 기재된 교차 Fab 분자, 즉, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL이 서로 교환된/대체된 Fab 분자이다. 이러한 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 통상적인 Fab 분자이다.
표적 세포 항원 결합 Fab 분자는 특이적 항원 결정기에 결합하고, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 표적 부위로, 예를 들면 항원 결정기를 갖는 종양 세포의 특이적 유형으로 유도할 수 있다.
특정 실시양태에서, 표적 세포 항원 결합 Fab 분자는 세포 표면 항원에 특이적으로 결합한다.
특정 실시양태에서, 표적 세포 항원 결합 Fab 분자는 병리 조건과 관련된 항원, 예컨대 종양 세포에 또는 바이러스-감염된 세포에 존재하는 항원에 관한 것이다. 적합한 표적 세포 항원은 세포 표면 항원, 예를 들면 비제한적으로, 세포 표면 수용체이다. 특정 실시양태에서, 표적 세포 항원은 인간 항원이다. 예시적인 표적 세포 항원은 CD20, Her2, Her3, MCSP(흑색종 관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸, 또한 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4로 공지됨), 또는 BCMA(인간 B 세포 성숙 표적, 또한 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 멤버 17(유니프롯 Q02223)로 공지됨)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 표적 세포 항원은 CD20, 특히 인간 CD20이다. 하나의 실시양태에서, 표적 세포 항원은 CD20이고, 상기 표적 세포 상원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 서열번호 46의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)1, 서열번호 47의 중쇄 CDR2 및 서열번호 48의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 49의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2 및 서열번호 51의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 하나의 실시양태에서, 표적 세포 항원은 CD20이고, 상기 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 서열번호 30의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 31의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 경쇄 가변 영역을 포함한다. 더욱 또 하나의 실시양태에서, 표적 세포 항원은 CD20이고, 상기 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 서열번호 30의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 31의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 18의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 서열번호 19의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 서열번호 20의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 및 서열번호 21의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드를 포함한다. 추가의 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 18의 폴리펩티드 서열, 서열번호 19의 폴리펩티드 서열, 서열번호 20의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 21의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 32의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 서열번호 19의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 서열번호 20의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 및 서열번호 21의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드를 포함한다. 또 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 32의 폴리펩티드 서열, 서열번호 19의 폴리펩티드 서열, 서열번호 20의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 21의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 36의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 서열번호 37의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 서열번호 38의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 및 서열번호 39의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드를 포함한다. 또 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 36의 폴리펩티드 서열, 서열번호 37의 폴리펩티드 서열, 서열번호 38의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 39의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 40의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 서열번호 41의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 서열번호 20의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 및 서열번호 21의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드를 포함한다. 또 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 40의 폴리펩티드 서열, 서열번호 41의 폴리펩티드 서열, 서열번호 20의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 21의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
또 하나의 실시양태에서, 표적 항원은 Her2, 특히 인간 Her2이다. 하나의 실시양태에서, 표적 세포 항원은 Her2이고, 상기 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 서열번호 61의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 62의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 하나의 실시양태에서, 표적 세포 항원은 Her2이고, 상기 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 서열번호 61의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 62의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 21의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 서열번호 52의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 서열번호 53의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 및 서열번호 54의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드를 포함한다. 또 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 21의 폴리펩티드 서열, 서열번호 52의 폴리펩티드 서열, 서열번호 53의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 54의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
또 하나의 실시양태에서, 표적 항원은 Her3, 특히 인간 Her3이다. 하나의 실시양태에서, 표적 세포 항원은 Her3이고, 상기 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 서열번호 63의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 64의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 하나의 실시양태에서, 표적 세포 항원은 Her3이고, 상기 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 서열번호 63의 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 64의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 21의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 서열번호 55의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 서열번호 56의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 및 서열번호 57의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드를 포함한다. 또 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 21의 폴리펩티드 서열, 서열번호 55의 폴리펩티드 서열, 서열번호 56의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 57의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
또 하나의 실시양태에서, 표적 항원은 흑색종 관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 특히 인간 MCSP이다. 하나의 실시양태에서, 표적 세포 항원은 MCSP이고, 상기 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 서열번호 65의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 66의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 하나의 실시양태에서, 표적 세포 항원은 Her2이고, 상기 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 서열번호 65의 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 66의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적 항원은 BCMA이다. 또 하나의 실시양태에서, 표적 세포 항원은 BCMA가 아니다.
폴리뉴클레오티드
본 발명은 본원에 기재된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 단편은 항원 결합 단편이다.
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 전체 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 단일 폴리뉴클레오티드로서 발현될 수 있거나 공동-발현되는 다수(예를 들면, 2개 이상)의 폴리뉴클레오티드로서 발현될 수 있다. 공동-발현되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드는 예를 들면, 다이설파이드 결합 또는 다른 수단을 통해 결합하여 기능성 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 형성할 수 있다. 예를 들면, Fab 분자의 경쇄 부분은 Fab 분자의 중쇄 부분, Fc 도메인 서브유닛 및 임의적으로 또 다른 Fab 분자(의 일부)를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 일부로부터 분리된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 공동-발현되는 경우, 중쇄 폴리펩티드는 경쇄 폴리펩티드와 결합하여 Fab 분자를 형성할 것이다. 또 다른 예에서, 2개의 Fc 도메인 서브유닛 중 하나 및 임의적으로 하나 이상의 Fab 분자(의 일부)를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 일부는 상기 2개의 Fc 도메인 서브유닛 중 나머지 하나 및 임의적으로 Fab 분자(의 일부)를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 일부로부터 분리된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 공동-발현되는 경우, Fc 도메인 서브유닛은 결합하여 Fc 도메인을 형성할 것이다.
일부 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같이 본 발명에 따른 전체 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화한다. 또 하나의 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같이 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 포함된 폴리펩티드를 암호화한다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. 또 하나의 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 메신저 RNA(mRNA) 형태의 RNA이다. 본 발명의 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
재조합 방법
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 예를 들면, 고체 상태 펩티드 합성(예를 들면, 메리필드(Merrifield) 고체상 합성) 또는 재조합 제조에 의해 수득될 수 있다. 재조합 제조를 위해, 예를 들면, 전술된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(단편)를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 단리하고 숙주 세포에서의 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입한다. 통상적인 절차를 사용하여 이러한 폴리뉴클레오티드를 용이하게 단리하고 서열분석할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상을 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터가 제공된다. 당업자에게 주지된 방법을 사용하여 적절한 전사/번역 조절 신호와 함께 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(단편)의 암호화 서열을 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 재조합/유전적 재조합을 포함한다. 예를 들면, 문헌[Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)] 및 [Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)]에 기재된 기법을 참조한다. 발현 벡터는 플라스미드 또는 바이러스의 일부일 수 있거나 핵산 단편일 수 있다. 발현 벡터는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(단편)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(즉, 암호화 영역)가 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 조절 요소와 작동가능하게 연결된 상태로 클로닝되어 있는 발현 카세트를 포함한다. 본원에서 사용된 "암호화 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈들로 구성된 핵산의 일부이다. "정지 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지 않지만, 암호화 영역의 일부인 것으로 간주될 수 있지만, 존재하는 경우 임의의 플랭킹 서열, 예를 들면, 프로모터, 리보좀 결합 부위, 전사 종결요소, 인트론, 5' 및 3' 비번역 영역 등은 암호화 영역의 일부가 아니다. 2개 이상의 암호화 영역은 단일 폴리뉴클레오티드 구축물 내에, 예를 들면, 단일 벡터 상에 존재할 수 있거나 별도의 폴리뉴클레오티드 구축물 내에, 예를 들면, 별도의 (상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 더욱이, 임의의 벡터는 단일 암호화 영역을 함유할 수 있거나 2개 이상의 암호화 영역을 포함할 수 있다(예를 들면, 본 발명의 벡터는 단백질용해성 절단을 통해 번역 후에 또는 번역과 동시에 최종 단백질로 분리되는 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화할 수 있다). 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(단편), 또는 이의 변이체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 융합되거나 융합되지 않은 이종 암호화 영역을 암호화할 수 있다. 이종 암호화 영역은 전문화된 요소 또는 모티프, 예컨대, 분비 신호 펩티드 또는 이종 기능성 도메인을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 작동가능한 연결은 유전자 생성물, 예를 들면, 폴리펩티드에 대한 암호화 영역이 조절 서열의 영향 또는 조절하에 유전자 생성물이 발현되게 하는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 연결되어 있는 경우이다. 2개의 DNA 단편(예컨대, 폴리펩티드 암호화 영역 및 이와 연결된 프로모터)은 프로모터 기능의 유도가 원하는 유전자 생성물을 암호화하는 mRNA의 전사를 야기하는 경우 및 상기 2개의 DNA 단편 사이의 연결의 성질이 유전자 생성물의 발현을 지시하는 발현 조절 서열의 능력을 방해하지 않거나 전사되는 DNA 주형의 능력을 방해하지 않는 경우 "작동가능하게 연결"되어 있다. 따라서, 프로모터 영역은 이 프로모터가 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 전사에 영향을 미칠 수 있는 경우 상기 핵산과 작동가능하게 연결되어 있을 것이다. 프로모터는 예정된 세포에서만 DNA의 실질적인 전사를 지시하는 세포 특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외의 다른 전사 조절 요소, 예를 들면, 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서 및 전사 종결 신호는 세포 특이적 전사를 지시하도록 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결될 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 조절 영역은 본원에 개시되어 있다. 다양한 전사 조절 영역이 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 척추동물 세포에서 기능하는 전사 조절 영역, 예컨대, 사이토메갈로바이러스(예를 들면, 인트론-A와 함께 즉시 초기 프로모터), 원숭이 바이러스 40(예를 들면, 초기 프로모터) 및 레트로바이러스(예를 들면, 라우스 육종 바이러스)의 프로모터 및 인핸서 분절(그러나, 이들로 한정되지 않음)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 다른 전사 조절 영역은 척추동물 유전자, 예컨대, 액틴, 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 α-글로빈으로부터 유래된 전사 조절 영역뿐만 아니라, 진핵 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열도 포함한다. 추가의 적합한 전사 조절 영역은 조직 특이적 프로모터 및 인핸서뿐만 아니라 유도성 프로모터(예를 들면, 테트라사이클린 유도성 프로모터)도 포함한다. 유사하게, 다양한 번역 조절 요소들이 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 리보좀 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 및 바이러스 시스템으로부터 유래된 요소(특히, CITE 서열로도 지칭되는 내부 리보좀 도입 부위 또는 IRES)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 발현 카세트는 다른 특징, 예컨대, 복제기점 및/또는 염색체 삽입 요소, 예컨대, 레트로바이러스 긴 말단 반복부(LTR), 또는 아데노 관련 바이러스(AAV) 도립 말단 반복부(ITR)도 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 암호화 영역은 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 분비를 지시하는 분비 또는 신호 펩티드를 암호화하는 추가의 암호화 서열과 연결될 수 있다. 예를 들면, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 분비를 원하는 경우, 신호 서열을 암호화하는 DNA를 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산의 상류에 배치할 수 있다. 신호 가설에 따르면, 포유동물 세포에 의해 분비된 단백질은 일단 성장하는 단백질 쇄가 조면 소포체(rough endoplasmic reticulum)를 횡단하여 이출되기 시작하면 성숙 단백질로부터 절단되는 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당업자는 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩티드가 일반적으로 이 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 신호 펩티드를 갖고, 상기 신호 펩티드는 상기 폴리펩티드의 분비된 또는 "성숙" 형태를 생성하기 위해 번역된 폴리펩티드로부터 절단된다는 것을 인식하고 있다. 일부 실시양태에서, 천연 신호 펩티드, 예를 들면, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드, 또는 그 자신과 작동가능하게 연결된 폴리펩티드의 분비를 지시하는 능력을 보유하는 상기 서열의 기능성 유도체가 사용된다. 대안적으로, 이종 포유동물 신호 펩티드 또는 이의 기능성 유도체가 사용될 수 있다. 예를 들면, 야생형 리더 서열은 인간 조직 플라스미노겐 활성화제(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제의 리더 서열로 치환될 수 있다.
추가의 정제를 용이하게 하기 위해 또는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 표지하는 것을 보조하기 위해 사용될 수 있는 짧은 단백질 서열(예를 들면, 히스티딘 태그)을 암호화하는 DNA가 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(단편) 암호화 폴리뉴클레오티드의 내부 또는 말단에 포함될 수 있다.
추가의 실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 상기 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 폴리뉴클레오티드 및 벡터 각각과 관련하여 본원에 기재된 특징 중 임의의 특징을 단독으로 또는 조합으로 포함할 수 있다. 이러한 하나의 실시양태에서, 숙주 세포는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(의 일부)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다(예를 들면, 이러한 벡터로 형질전환되어 있거나 형질감염되어 있다). 본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 발생시키기 위해 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 지칭한다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 발현을 복제하고 뒷받침하기에 적합한 숙주 세포는 당해 분야에서 공지되어 있다. 이러한 세포를 적절한 경우 특정 발현 벡터로 형질감염시킬 수 있거나 형질도입할 수 있고, 임상 적용에 충분한 양의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 수득하기 위해 다량의 벡터 함유 세포를 대규모 발효기 시딩용으로 성장시킬 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵 미생물, 예컨대, 에스케리키아 콜라이 또는 다양한 진핵 세포, 예컨대, 중국 햄스터 난소 세포(CHO), 곤충 세포 등을 포함한다. 예를 들면, 특히 글리코실화가 필요하지 않은 경우 폴리펩티드를 세균에서 제조할 수 있다. 발현 후, 상기 폴리펩티드를 가용성 분획으로 세균 세포 페이스트로부터 단리할 수 있고 더 정제할 수 있다. 원핵생물 이외에, 진핵 미생물, 예컨대, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 있어 부분적으로 또는 전체적으로 인간 글리코실화 패턴을 갖는 폴리펩티드의 생성을 야기하는 진균 및 효모 균주를 포함하는 사상 진균 또는 효모가 폴리펩티드 암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌[Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)] 및 [Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)]을 참조한다. (글리코실화된) 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터도 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 식물 세포 및 곤충 세포가 포함된다. 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주가 동정되어 있다. 식물 세포 배양물도 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, (형질전환 식물에서 항체를 제조하기 위한 플랜티바디스(PL항체: 상표) 기술을 기술하는) US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978 및 US 6,417,429를 참조한다. 척추동물 세포도 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액 중에서 성장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7), 인간 배아 신장 세포주(예를 들면, 문헌[Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)]에 기재된 293 또는 293T 세포), 새끼 햄스터 신장 세포(BHK), 마우스 세르톨리 세포(예를 들면, 문헌[Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)]에 기재된 TM4 세포), 원숭이 신장 세포(CV1), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76), 인간 자궁경부암종 세포(HELA), 개 신장 세포(MDCK), 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A), 인간 폐 세포(W138), 인간 간 세포(Hep G2), 마우스 유선 종양 세포(MMT 060562), TRI 세포(예를 들면, 문헌[Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)]에 기재됨), MRC 5 세포 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 dhfr- CHO 세포(문헌[Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)])를 포함하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 골수종 세포주, 예컨대, YO, NS0, P3X63 및 Sp2/0를 포함한다. 단백질 제조에 적합한 일부 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는 예를 들면, 문헌[Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들면, 포유동물 배양된 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 세균 세포 및 식물 세포뿐만 아니라, 형질전환 동물, 형질전환 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포도 포함한다. 하나의 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 예컨대, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포 또는 림프계 세포(예를 들면, Y0, NS0, Sp20 세포)이다.
이들 시스템에서 외래 유전자를 발현하기 위한 표준 기술은 당해 분야에서 공지되어 있다. 항원 결합 도메인, 예컨대, 항체의 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포는 나머지 항체 쇄도 발현하여 발현된 생성물이 중쇄 및 경쇄 둘다를 갖는 항체이도록 조작될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본원에서 제공된 바와 같은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계, 및 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 회수하는 단계를 포함하는 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제조하는 방법이 제공된다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 구성성분은 서로 유전적으로 융합되어 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 그의 구성성분이 직접적으로 또는 연결기 서열을 통해 간접적으로 서로 융합되도록 설계될 수 있다. 상기 연결기의 조성 및 길이는 당해 분야에서 주지된 방법에 따라 결정될 수 있고 효능에 대해 시험될 수 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 상이한 성분 사이의 연결기 서열의 예는 본원에 제공된 서열에서 발견된다. 필요에 따라, 융합체의 개별 구성성분을 분리하기 위한 절단 부위, 예를 들면, 엔도펩티다제 인식 서열을 도입하도록 추가의 서열도 포함될 수 있다.
특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 하나 이상의 Fab 분자는 항원성 결정인자에 결합할 수 있는 하나 이상의 항체 가변 도메인을 포함한다. 가변 도메인은 천연 또는 비천연 항체 또는 이의 단편의 일부를 형성할 수 있고 이러한 천연 또는 비천연 항체 또는 이의 단편으로부터 유래될 수 있다. 다중클론 항체 및 단일클론 항체를 제조하는 방법은 당해 분야에서 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Harlow and Lane, "Antibody, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] 참조). 비천연 항체는 고체상 펩티드 합성의 사용을 통해 구축될 수 있거나, (예를 들면, US 4,186,567에 기재된 바와 같이) 재조합적으로 제조될 수 있거나, 예를 들면, 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는 조합 라이브러리의 스크리닝에 의해 수득될 수 있다(예를 들면, US 5,969,108 (McCafferty) 참조).
임의의 동물 종의 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 도메인이 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 사용될 수 있다. 본 발명에서 유용한 비한정적 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 도메인은 뮤린, 영장류 또는 인간으로부터 유래될 수 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 인간에 사용되기 위한 것인 경우, 키메라 형태의 항체가 사용될 수 있고, 이때 항체의 불변 도메인은 인간으로부터 유래된다. 인간화된 또는 전체 인간 형태의 항체도 당해 분야에서 주지된 방법에 따라 제조될 수 있다(예를 들면, US 5,565,332 (Winter) 참조). 인간화는 (a) 중요한 골격 잔기(예를 들면, 우수한 항원 결합 친화성 또는 항체 기능을 보유하는 데에 있어서 중요한 골격 잔기)를 보유하거나 보유하지 않으면서 비인간(예를 들면, 공여자 항체) CDR을 인간(예를 들면, 수용자 항체) 골격 및 불변 도메인에 그래프팅하는 방법, (b) 비인간 특이적 결정 영역(SDR 또는 a-CDR: 항체-항원 상호작용에 중요한 잔기)을 인간 골격 및 불변 도메인에 그래프팅하는 방법, 또는 (c) 전체 비인간 가변 도메인을 이식하되, 표면 잔기의 치환을 통해 이들을 인간 유사 구획으로 "은폐"시키는 방법을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 인간화된 항체 및 이를 제조하는 방법은 예를 들면, 문헌[Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)]에서 검토되어 있고, 예를 들면, 하기 문헌에 더 기재되어 있다: 문헌[Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988)]; [Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)]; US 5,821,337, US 7,527,791, US 6,982,321 및 US 7,087,409; 문헌[Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986)]; 문헌[Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984)]; [Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988)]; [Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994)]; [Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005)](SDR(a-CDR) 그래프팅이 기재됨); [Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991)]("재표면화"가 기재됨); [Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005)]("FR 셔플링"이 기재됨); 및 [Osbourn et al., Methods 36, 61-68(2005) and Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000)](FR 셔플링에 대한 "유도 선택" 방법이 기재됨). 당해 분야에서 공지된 다양한 기법을 사용하여 인간 항체 및 인간 가변 도메인을 제조할 수 있다. 인간 항체는 문헌[van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001)] 및 [Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)]에 일반적으로 기재되어 있다. 인간 가변 도메인은 하이브리도마 방법에 의해 제조된 인간 단일클론 항체의 일부를 형성할 수 있고 이러한 인간 단일클론 항체로부터 유래될 수 있다(예를 들면, 문헌[Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)] 참조). 또한, 인간 항체 및 인간 가변 도메인은 항원 챌린지에 반응하여 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 도메인을 갖는 온전한 항체를 생성하도록 변형된 형질전환 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다(예를 들면, 문헌[Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)] 참조). 또한, 인간 항체 및 인간 가변 도메인은 인간으로부터 유래된 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 발생할 수 있다(예를 들면, 문헌[Hoogenboom et al., in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)], [McCafferty et al., Nature 348, 552-554] 및 [Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)] 참조). 파지는 전형적으로 단일 쇄 Fv(scFv) 단편 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 디스플레이한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에서 유용한 Fab 분자는 예를 들면, 전체 내용이 본원에 참조로 도입되는 US 2004/0132066에 개시된 방법에 따라 향상된 결합 친화성을 갖도록 조작된다. 특정 항원성 결정인자에 결합하는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 능력은 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA) 또는 당업자에게 공지된 다른 기법, 예를 들면, (비아코어 T100 시스템 상에서 분석되는) 표면 플라스몬 공명 기법(문헌[Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)]) 및 전통적인 결합 분석(문헌[Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)])를 통해 측정될 수 있다. 경쟁 분석을 사용하여 특정 항원에 대한 결합에 대해 기준 항체와 경쟁하는 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 도메인, 예를 들면, CD3에 대한 결합에 대해 V9 항체와 경쟁하는 항체를 확인할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 경쟁 항체는 기준 항체에 의해 결합되는 에피토프와 동일한 에피토프(예를 들면, 선형 또는 입체구조형 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하는 상세한 예시적 방법은 문헌[Morris., "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (1996) (Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공되어 있다. 예시적 경쟁 분석에서, 고정된 항원(예를 들면, CD3)은 이 항원에 결합하는 표지된 제 1 항체(예를 들면, US 6,054,297에 기재된 V9 항체) 및 상기 항원에 대한 결합에 대해 제 1 항체와 경쟁하는 그의 능력을 시험받는 비표지된 제 2 항체를 포함하는 용액에서 항온처리된다. 제 2 항체는 하이브리도마 상청액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정된 항원은 표지된 제 1 항체를 포함하되 비표지된 제 2 항체를 포함하지 않는 용액에서 항온처리된다. 제 1 항체와 항원의 결합을 허용하는 조건하에 항온처리된 후, 과량의 비결합된 항체가 제거되고, 고정된 항원과 연결된 표지의 양이 측정된다. 고정된 항원과 연결된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 상대적으로 시험 샘플에서 실질적으로 감소되는 경우, 이것은 제 2 항체가 상기 항원에 대한 결합에 대해 제 1 항체와 경쟁한다는 것을 표시한다. 문헌[Harlow and Lane (1988) Antibody: A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]을 참조한다.
본원에 기재된 바와 같이 제조된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 당해 분야에서 공지된 기법, 예컨대, 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등에 의해 정제될 수 있다. 특정 단백질의 정제에 사용되는 실제 조건은 부분적으로 순 전하, 소수성, 친수성 등과 같은 인자에 의해 좌우될 것이고 당업자에게 자명할 것이다. 친화성 크로마토그래피 정제의 경우, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 결합하는 항체, 리간드, 수용체 또는 항원이 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 친화성 크로마토그래피 정제를 위해, 단백질 A 또는 단백질 G를 갖는 매트릭스가 사용될 수 있다. 실시예에 기재된 바와 같이 근본적으로 순차적 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 단리할 수 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 순도는 겔 전기영동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 포함하는 주지된 다양한 분석 방법 중 임의의 분석 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 실시예에 기재된 바와 같이 발현된 중쇄 융합 단백질은 환원 SDS-PAGE에 의해 입증된 바와 같이 온전하고 적절하게 조립되어 있는 것으로 밝혀졌다(예를 들면, 도 3 참조). 3개의 밴드가 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 경쇄, 중쇄 및 중쇄/경쇄 융합 단백질의 예측된 분자량에 상응하는 약 Mr 25,000, Mr 50,000 및 Mr 75,000에서 분석되었다.
분석
본원에 제공된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 당해 분야에서 공지된 다양한 분석에 의해 그들의 물리적/화학적 성질 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인될 수 있거나, 스크리닝될 수 있거나 특징규명될 수 있다.
친화성 분석
Fc 수용체 또는 표적 항원에 대한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 친화성은 표준 기기, 예컨대, 비아코어 기기(지이 헬쓰케어)를 사용한 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 실시예에 기재된 방법에 따라 결정될 수 있고, 수용체 또는 표적 단백질은 예컨대, 재조합 발현에 의해 수득될 수 있다. 대안적으로, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자와 상이한 수용체 또는 표적 항원의 결합은 특정 수용체 또는 표적 항원을 발현하는 세포주를 사용함으로써 예를 들면, 유세포계수(FACS)에 의해 평가될 수 있다. 결합 친화성을 측정하는 구체적인 예증적 및 예시적 실시양태는 하기 설명 및 하기 실시예에 기재되어 있다.
하나의 실시양태에 따라, 25℃에서 비아코어(등록상표) T100 기기(지이 헬쓰케어)를 사용하여 표면 플라스몬 공명으로 KD를 측정한다.
Fc 부분과 Fc 수용체 사이의 상호작용을 분석하기 위해, His 태그가 부착된 재조합 Fc 수용체를 CM5 칩 상에 고정된 항-펜타 His 항체(퀴아젠(Qiagen))로 포획하고, 이중특이적 구축물을 분석물로서 사용한다. 요약하건대, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 지이 헬쓰케어)을 공급자의 설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 약 6,500 반응 유닛(RU)의 커플링된 단백질을 달성하기 위해 5 ㎕/분의 유속으로 주입하기 전에 항-펜타 His 항체를 10 mM 나트륨 아세테이트(pH 5.0)로 40 ㎍/㎖까지 희석한다. 리간드의 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응된 기를 차단한다. 그 후, Fc 수용체를 4 또는 10 nM에서 60초 동안 포획한다. 동역학적 측정을 위해, HBS-EP(지이 헬쓰케어, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20, pH 7.4) 중의 이중특이적 구축물의 4배 연속 희석물(500 내지 4000 nM의 범위)을 25℃에서 30 ㎕/분의 유속으로 120초 동안 주입한다.
표적 항원에 대한 친화성을 결정하기 위해, 이중특이적 구축물을 항-펜타 His 항체에 대해 기재된 바와 같이 활성화된 CM5-센서 칩 표면 상에 고정된 항-인간 Fab 특이적 항체(지이 헬쓰케어)로 포획한다. 커플링된 단백질의 최종 양은 약 12000 RU이다. 이중특이적 구축물을 300 nM에서 90초 동안 포획한다. 표적 항원을 250 내지 1000 nM의 농도 범위에서 30 ㎕/의 유속으로 180초 동안 유동 셀에 통과시킨다. 해리를 180초 동안 모니터링한다.
기준 유동 셀에 대해 수득된 반응을 차감함으로써 벌크 굴절률 차이를 보정한다. 정상 상태 반응을 사용하여 랭뮤어(Langmuir) 결합 등온선의 비선형 곡선 피팅으로 해리 상수 KD를 유도하였다. 결합 센서그램 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 단순 1-대-1 랭뮤어 결합 모델(비아코어(등록상표) T100 평가 소프트웨어 버전 1.1.1)을 사용하여 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)를 계산한다. 평형 해리 상수(KD)를 비 koff/kon로서 계산한다. 예를 들면, 문헌[Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881(1999)]을 참조한다.
활성 분석
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 생물학적 활성은 실시예에 기재된 바와 같이 다양한 분석에 의해 측정될 수 있다. 생물학적 활성은 예를 들면, T 세포의 증식의 유도, T 세포에서의 신호전달의 유도, T 세포에서의 활성화 마커 발현의 유도, T 세포에 의한 사이토카인 분비의 유도, 표적 세포, 예컨대, 종양 세포의 용해의 유도, 및 종양 퇴행의 유도 및/또는 생존의 개선을 포함할 수 있다.
조성물, 제형 및 투여 경로
추가의 양상에서, 본 발명은 예를 들면, 하기 치료 방법 중 임의의 치료 방법에서 사용되는, 본원에 제공된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 중 임의의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 중 임의의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 또 하나의 실시양태에서, 약학 조성물은 예를 들면, 후술된 바와 같이 본원에 제공된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 중 임의의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 하나 이상의 추가의 치료제를 포함한다.
또한, 생체내 투여에 적합한 형태로 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제조하는 방법으로서, (a) 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 수득하는 단계, 및 (b) 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체로 제형화함으로써 생체내 투여를 위한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제제를 제형화하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체에 용해되거나 분산된 치료 효과량의 하나 이상의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다. 어구 "약학적 또는 약학적으로 허용되는"은 사용된 용량 및 농도에서 수용체에게 일반적으로 독성을 나타내지 않는, 즉 적절한 경우 동물, 예컨대, 인간에게 투여되었을 때 불리한, 알레르기 또는 다른 원치 않는 반응을 발생시키지 않는 분자 물질 및 조성물을 지칭한다. 하나 이상의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 임의적으로 추가의 활성 성분을 함유하는 약학 조성물의 제조는 본원에 참조로 도입되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990]에 의해 예시된 바와 같이 본 개시내용에 비추어 볼 때 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 더욱이, 동물(예를 들면, 인간) 투여의 경우, 제제는 FDA 생물학적 표준 관청 또는 다른 국가의 상응하는 정부기관에 의해 요구되는 멸균성, 발열원성, 일반적인 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 한다는 것을 이해할 것이다. 바람직한 조성물은 동결건조된 제형 또는 수용액이다. 본원에서 사용된 "약학적으로 허용되는 담체"는 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이(예를 들면, 본원에 참조로 도입되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329] 참조) 임의의 모든 용매, 완충제, 분산 매질, 코팅제, 계면활성제, 항산화제, 방부제(예를 들면, 항균제, 항진균제), 등장제, 흡수 지연제, 염, 단백질, 약물, 약물 안정화제, 중합체, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 풍미제, 안료, 이와 유사한 물질 및 이들의 조합물을 포함한다. 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 상용불가능한 경우를 제외하고, 치료 또는 약학 조성물에서의 상기 담체의 사용이 고려된다.
조성물은 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여될지, 및 주사로서 이러한 투여 경로를 위해 멸균될 필요가 있는 지에 따라 상이한 유형의 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(및 임의의 추가의 치료제)는 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이(예를 들면, 본원에 참조로 도입되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990] 참조) 흡입(예를 들면, 에어로졸 흡입), 주사, 주입, 연속 주입, 직접적으로, 카테터를 통해 또는 세척을 통해 표적 세포를 세척하는 국소화된 관류, 크림, 지질 조성물(예를 들면, 리포좀) 또는 다른 방법, 또는 상기 방법의 임의의 조합에 의해 정맥내, 피내, 동맥내, 복강내, 병변내, 두개내, 관절내, 전립선내, 비장내, 신장내, 흉막내, 경막내, 비내, 유리체내, 질내, 직장내, 종양내, 근육내, 피하, 결막하, 소포내, 점막, 심장주위내, 배꼽내, 안구내, 경구, 국부 또는 국소 투여될 수 있다. 비경구 투여, 특히 정맥내 주사가 폴리펩티드 분자, 예컨대, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 투여하기 위해 가장 통상적으로 사용된다.
비경구 조성물은 주사, 예를 들면, 피하, 피내, 병변내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 경막내 또는 복강내 주사에 의한 투여용으로 설계된 비경구 조성물을 포함한다. 주사의 경우, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 수용액, 바람직하게는 생리학적으로 상용가능한 완충제, 예컨대, 행크(Hank) 용액, 링거(Ringer) 용액 또는 생리학적 식염수 완충제에서 제형화될 수 있다. 용액은 제형화제, 예컨대, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들면, 발열원 무함유 멸균수로 재구성될 분말 형태로 존재할 수 있다. 멸균 주사 용액은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 요구된 양으로 필요에 따라 하기 나열된 다양한 다른 성분들과 함께 적절한 용매 내로 도입함으로써 제조된다. 멸균성은 예를 들면, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분들을 염기성 분산 매질 및/또는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 도입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액, 현탁액 또는 유화액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 및 임의의 추가의 원하는 성분으로 구성된 분말을 이의 미리 멸균-여과된 액체 매질로부터 생성하는 진공 건조 또는 동결 건조 기법이다. 상기 액체 매질은 필요한 경우 적절하게 완충되어야 하고, 액체 희석제는 먼저 주사 전에 충분한 식염수 또는 당에 의해 등장성을 갖게 되어야 한다. 조성물은 제조 및 저장 조건하에 안정해야 하고 미생물, 예컨대, 세균 및 진균의 오염 작용으로부터 보존되어야 한다. 내독소 오염은 안전한 수준, 예를 들면, 단백질 1 mg 당 0.5 ng 미만에서 최소한으로 유지되어야 한다는 것을 인식할 것이다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체는 하기 담체를 포함하나 이들로 한정되지 않는다: 완충제, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제(예컨대, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 모노사카라이드, 다이사카라이드 및 다른 탄수화물; 킬레이팅제, 예컨대, EDTA; 당, 예컨대, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대, 나트륨; 금속 착물(예를 들면, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 수성 주사 현탁액은 이 현탁액의 점도를 증가시키는 화합물, 예컨대, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 덱스트란 등을 함유할 수 있다. 임의적으로, 상기 현탁액은 적합한 안정화제, 또는 화합물의 가용성을 증가시켜 고도로 농축된 용액의 제조를 가능하게 하는 물질도 함유할 수 있다. 추가로, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 지방유, 예컨대, 참깨유, 또는 합성 지방산 에스터, 예컨대, 에틸 클레에이트 또는 트라이글리세라이드, 또는 리포좀을 포함한다.
활성 성분은 예를 들면, 코아세르베이션 기법 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중의 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 기법은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Ed. Mack Printing Company, 1990)]에 개시되어 있다. 지속 방출 제제가 제조될 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예에는 폴리펩티드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 상기 매트릭스는 성형된 제품, 예를 들면, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태로 존재한다. 특정 실시양태에서, 흡수를 지연하는 물질, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 이들의 조합물을 조성물에서 사용함으로써 주사가능한 조성물의 연장된 흡수를 달성할 수 있다.
전술된 조성물 이외에, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 데포 제제로서 제형화될 수도 있다. 이러한 장기 작용 제형은(예를 들면, 피하 또는 근육내) 이식 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 적합한 중합체성 또는 소수성 물질(예를 들면, 허용되는 오일 중의 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지로 제형화될 수 있거나, 약한 가용성을 나타내는 유도체, 예를 들면, 약한 가용성을 나타내는 염으로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 약학 조성물을 통상적인 혼합, 용해, 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조 과정으로 제조할 수 있다. 단백질을 약학적으로 사용될 수 있는 제제로 프로세싱하는 것을 용이하게 하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 통상적인 방식으로 약학 조성물을 제형화할 수 있다. 적절한 제형화는 선택된 투여 경로에 의해 좌우된다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 자유 산 또는 염기, 중성 또는 염 형태로 조성물로 제형화할 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 자유 산 또는 염기의 생물학적 활성을 실질적으로 보유하는 염이다. 이들은 산 부가 염, 예를 들면, 단백질성 조성물의 자유 아미노 기에 의해 형성된 염, 또는 무기 산, 예컨대, 염산 또는 인산, 또는 유기산, 예컨대, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델산에 의해 형성된 염을 포함한다. 자유 카복시 기에 의해 형성된 염도 무기 염기, 예컨대, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화철; 또는 유기 염기, 예컨대, 이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인으로부터 유도될 수 있다. 약학적 염은 수성 및 다른 양성자성 용매에서 상응하는 자유 염기 형태보다 더 높은 가용성을 나타내는 경향을 갖는다.
치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 중 임의의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 치료 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 예를 들면, 암의 치료에서 면역치료제로서 사용될 수 있다.
치료 방법에서 사용하기 위해, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 우수한 의학적 관행과 일치하는 방식으로 제형화되고 복용되고 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 인자는 치료될 구체적인 장애, 치료될 구체적인 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 상기 장애의 원인, 약제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의사에게 공지된 다른 인자를 포함한다.
하나의 양상에서, 약제로서 사용되는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 추가의 양상에서, 질환의 치료에 사용되는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 특정 실시양태에서, 치료 방법에서 사용되는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 질환의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료에 사용되는 본원에 기재된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 치료 효과량의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 질환을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법에서 사용되는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, 치료되는 질환은 증식 장애이다. 특정 실시양태에서, 상기 질환은 암이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 치료되는 질환이 암인 경우 치료 효과량의 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들면, 항암제를 상기 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 데에 사용되는, 본원에 기재된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 효과량의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 개체에게 투여하여 표적 세포의 용해를 유도하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법에서 사용되는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 상기 실시양태 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.
추가의 양상에서, 본 발명은 약제의 제작 또는 제조에 있어서 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 용도를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 약제는 질환의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료를 위한 약제이다. 추가의 실시양태에서, 약제는 치료 효과량의 약제를 질환을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 질환의 치료 방법에서 사용되는 약제이다. 특정 실시양태에서, 치료되는 질환은 증식 장애이다. 특정 실시양태에서, 상기 질환은 암이다. 하나의 실시양태에서, 상기 방법은 치료되는 질환이 암인 경우 치료 효과량의 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들면, 항암제를 상기 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 약제는 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하기 위한 약제이다. 추가의 실시양태에서, 약제는 효과량의 약제를 개체에게 투여하여 표적 세포의 용해를 유도하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법에서 사용되는 약제이다. 상기 실시양태 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명은 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 상기 방법은 치료 효과량의 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 이러한 질환을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 약학적으로 허용되는 형태로 포함하는 조성물을 상기 개체에게 투여한다. 특정 실시양태에서, 치료되는 질환은 증식 장애이다. 특정 실시양태에서, 상기 질환은 암이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 치료되는 질환이 암인 경우 치료 효과량의 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들면, 항암제를 상기 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 실시양태 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 상기 방법은 T 세포, 특히 세포독성 T 세포의 존재하에 표적 세포를 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자와 접촉시키는 단계를 포함한다. 추가의 양상에서, 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법이 제공된다. 이러한 하나의 실시양태에서, 상기 방법은 효과량의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 개체에게 투여하여 표적 세포의 용해를 유도하는 단계를 포함한다. 하나의 실시양태에서, "개체"는 인간이다.
특정 실시양태에서, 치료되는 질환은 증식 장애, 특히 암이다. 암의 비한정적 예에는 방광암, 뇌암, 두경부암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 결장암, 결장직장암, 직장암, 위암, 전립선암, 혈액암, 피부암, 편평세포암종, 골암 및 신장암이 포함된다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 사용하여 치료할 수 있는 다른 세포 증식 장애는 복부, 골, 유방, 소화 시스템, 간, 췌장, 복막, 내분비선(부신, 부갑상선, 뇌하수체, 정소, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 두경부, 신경계(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 흉부 영역 및 비뇨생식계에 위치하는 신생물을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 전구암성 병태 또는 병변, 및 암 전이도 포함된다. 특정 실시양태에서, 암은 신장세포암, 피부암, 폐암, 결장직장암, 유방암, 뇌암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 당업자는 많은 경우에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 치유를 제공할 수 없지만 부분적인 이익만을 제공할 수 있다는 것을 용이하게 인식한다. 일부 실시양태에서, 일부 이익을 갖는 생리학적 변화도 치료적으로 유리한 것으로 간주된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 생리학적 변화를 제공하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 양은 "효과량" 또는 "치료 효과량"으로서 간주된다. 치료를 필요로 하는 대상체, 환자 또는 개체는 전형적으로 포유동물, 보다 구체적으로 인간이다.
일부 실시양태에서, 효과량의 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 세포에게 투여된다. 또 하나의 실시양태에서, 치료 효과량의 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 질환의 치료를 위해 개체에게 투여된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, (단독으로 사용되거나 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 함께 사용될 때) 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 적절한 용량은 치료되는 질환의 유형, 투여 경로, 환자의 체중, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 유형, 질환의 중증도 및 경과, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 예방 목적으로 투여되는 지 아니면 치료 목적으로 투여되는 지, 선행 또는 병행 치료 시술, 환자의 임상 병력 및 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 의해 좌우될 것이다. 투여를 담당하는 의사는 어떠한 경우에서든 개별 대상체를 위한 조성물 중의 활성 성분의 농도 및 적절한 용량을 결정할 것이다. 단회 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다회 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 투약 일정이 본원에서 고려된다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg(예를 들면, 0.1 내지 10 mg/kg)의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 예를 들면, 1회 이상의 분리 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여될 초기 후보 용량일 수 있다. 한 전형적인 1일 용량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상일 것이다. 수일 또는 이보다 오랜 시간에 걸친 반복된 투여의 경우, 병태에 따라 치료는 일반적으로 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 지속될 것이다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 한 예시적 용량은 약 0.005 내지 약 10 mg/kg의 범위 내에 있을 것이다. 다른 비한정적 예에서, 용량은 투여 당 약 1 ㎍/kg 체중, 약 5 ㎍/kg 체중, 약 10 ㎍/kg 체중, 약 50 ㎍/kg 체중, 약 100 ㎍/kg 체중, 약 200 ㎍/kg 체중, 약 350 ㎍/kg 체중, 약 500 ㎍/kg 체중, 약 1 mg/kg 체중, 약 5 mg/kg 체중, 약 10 mg/kg 체중, 약 50 mg/kg 체중, 약 100 mg/kg 체중, 약 200 mg/kg 체중, 약 350 mg/kg 체중 또는 약 500 내지 약 1000 mg/kg 체중 또는 그 이상, 및 상기 범위 내에서 유도될 수 있는 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에서 나열된 수치로부터 유도될 수 있는 범위의 비한정적 예에서, 상기 기재된 수치에 근거하여 약 5 내지 약 100 mg/kg 체중, 약 5 ㎍/kg 체중 내지 약 500 mg/kg 체중의 범위 등이 투여될 수 있다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 5.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 이들의 임의의 조합)의 1회 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은(예를 들면, 환자가 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들면, 약 6회 용량의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공받도록) 간헐적으로, 예를 들면, 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다. 초기 보다 높은 적재 용량에 이어서 1회 이상의 보다 낮은 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투약 요법이 유용할 수 있다. 이 치료의 진행은 통상적인 기법 및 분석에 의해 용이하게 모니터링된다.
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 일반적으로 의도된 목적을 달성하기에 효과적인 양으로 사용될 것이다. 질환 상태를 치료하거나 예방하기 위해 사용되는 경우, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 약학 조성물은 치료 효과량으로 투여되거나 적용된다. 치료 효과량의 결정은 특히 본원에 제공된 상세한 개시내용에 비추어 볼 때 당업자의 능력 내에 있다.
전신 투여의 경우, 치료 효과 용량을 먼저 시험관내 분석, 예컨대, 세포 배양 분석로부터 추정할 수 있다. 그 다음, 용량을 동물 모델에서 공식화하여 세포 배양에서 결정된 IC50을 포함하는 순환 농도 범위를 달성할 수 있다. 이러한 정보를 사용하여 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다.
당해 분야에서 주지된 기법을 사용하여 생체내 데이터, 예를 들면, 동물 모델로부터 초기 용량을 추정할 수도 있다. 당업자는 동물 데이터에 근거하여 인간에게의 투여를 용이하게 최적화할 수 있다.
치료 효과를 유지하기에 충분한 혈장 수준의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하기 위해 투약 용량 및 간격을 개별적으로 조절할 수 있다. 주사에 의한 투여를 위한 일반적인 환자 용량은 약 0.1 내지 50 mg/kg/일, 전형적으로 약 0.5 내지 1 mg/kg/일이다. 매일 다회 용량을 투여함으로써 치료 유효 혈장 수준을 달성할 수 있다. 혈장 중의 수준은 예를 들면, HPLC에 의해 측정될 수 있다.
국소 투여 또는 선택 흡수의 경우, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 유효 국소 농도는 혈장 농도와 관련되지 않을 수 있다. 당업자는 과도한 실험없이 치료 유효 국소 용량을 최적화할 수 있을 것이다.
본원에 기재된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 치료 효과 용량은 일반적으로 실질적인 독성을 야기하지 않으면서 치료 이익을 제공할 것이다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 독성 및 치료 효과는 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차에 의해 결정될 수 있다. 세포 배양 분석 및 동물 연구를 사용하여 LD50(집단의 50%에게 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정할 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 용량 비는 비 LD50/ED50로서 표현될 수 있는 치료 지수이다. 큰 치료 지수를 나타내는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 바람직하다. 하나의 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 높은 치료 지수를 나타낸다. 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에서 사용되기에 적합한 용량 범위를 공식화하는 데에 사용될 수 있다. 상기 용량은 바람직하게는 거의 또는 전혀 독성을 나타내지 않으면서 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 상기 용량은 다양한 인자, 예를 들면, 사용되는 투약 제형, 사용되는 투여 경로, 대상체의 상태 등에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 용량은 환자의 상태를 고려하여 개별 의사에 의해 선택될 수 있다(예를 들면, 전체적으로 본원에 참조로 도입되는 문헌[Fingl et al., 1975, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1] 참조).
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자로 치료된 환자의 주치의는 독성, 장기 기능장애 등으로 인해 투여를 종결하거나, 중단하거나 조절하는 방법 및 시기를 알 것이다. 대조적으로, 주치의는 임상 반응이 적절하지 않은 경우(방해 독성) 치료를 보다 높은 수준까지 조절하는 것도 알 것이다. 관심 있는 장애의 관리에 있어서 투여되는 용량의 크기는 치료되는 병태의 중증도, 투여 경로 등에 따라 달라질 것이다. 상기 병태의 중증도는 예를 들면, 부분적으로 표준 예후 평가 방법에 의해 평가될 수 있다. 추가로, 용량 및 아마도 용량 빈도도 개별 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 달라질 것이다.
다른 제제 및 처리
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 치료에서 하나 이상의 다른 제제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 하나 이상의 추가의 치료제와 공투여될 수 있다. 용어 "치료제"는 이러한 치료를 필요로 하는 개체에서 증상 또는 질환을 치료하기 위해 투여되는 임의의 제제를 포괄한다. 이러한 추가의 치료제는 치료되는 구체적인 증상에 적합한 임의의 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상보적인 활성을 갖는 임의의 활성 성분을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 면역조절제, 세포증식정지제, 세포 부착의 억제제, 세포독성제, 세포 세포자멸의 활성화제, 또는 세포자멸 유도제에 대한 세포의 민감성을 증가시키는 제제이다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 항암제, 예를 들면, 마이크로튜불 파괴제, 항대사물질, 토포이소머라제(topoisomerase) 억제제, DNA 인터칼레이터, 알킬화제, 호르몬 치료, 키나제(kinase) 억제제, 수용체 길항제, 종양 세포 세포자멸의 활성화제 또는 항혈관신생제이다.
이러한 다른 제제는 적절하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 함께 존재한다. 이러한 다른 약제의 효과량은 사용되는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 의해 좌우된다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 일반적으로 본원에 기재된 용량 및 투여 경로와 동일한 용량 및 투여 경로로 사용되거나, 본원에 기재된 용량의 1 내지 99%의 용량으로 사용되거나, 적절한 용량 및 경로로서 실험적으로/임상적으로 결정된 임의의 용량 및 임의의 경로로 사용된다.
상기 언급된 이러한 병용 치료는 병용 투여(2종 이상의 치료제가 동일한 또는 분리된 조성물에 포함되는 경우), 및 분리 투여를 포괄하고, 어느 경우에서든 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 투여는 추가의 치료제 및/또는 보조제의 투여 전에, 동시에 및/또는 후에 일어날 수 있다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 방사선치료와 함께 사용될 수도 있다.
제품의 제조
본 발명의 또 다른 양태에서, 전술된 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기; 및 용기 상에 존재하거나 용기와 연결되어 있는 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등을 포함한다. 상기 용기는 다양한 물질, 예컨대, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 그 자체로 존재하거나 병태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 조합되어 있는 조성물을 보유하고, 멸균 출입구를 가질 수 있다(예를 들면, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 천공될 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 하나 이상의 활성 물질은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자이다. 상기 표지 또는 포장 삽입물은 상기 조성물이 선택된 병태의 치료에 사용된다는 것을 표시한다. 나아가, 제품은 (a) 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 조성물을 그 내부에 함유하는 제 1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물을 그 내부에 함유하는 제 2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이 실시양태에서, 제품은 상기 조성물이 특정 병태의 치료에 사용될 수 있다는 것을 표시하는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제품은 약학적으로 허용되는 완충제, 예컨대, 정균성 주사용수(BWFI), 포스페이트 완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제 2(또는 제 3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제품은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하는, 상업적 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제공된 일반적인 설명을 고려할 때, 다양한 또 하나의 실시양태가 실시될 수 있음이 이해된다.
일반적인 방법
재조합 DNA 기법
문헌[Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 기재된 바와 같이 표준 방법을 사용하여 DNA를 조작하였다. 분자 생물학적 시약을 제조자의 설명서에 따라 사용하였다. 인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 대한 일반적인 정보는 문헌[Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., NIH Publication No. 91-3242]에 제공되어 있다.
DNA 서열분석
DNA 서열을 이중 가닥 서열분석으로 측정하였다.
유전자 합성
필요에 따라, 원하는 유전자 절편을 적절한 주형을 사용하여 PCR로 생성하거나 진아트 아게(Geneart AG, 독일 레겐스부르그 소재)에 의해 합성 올리고뉴클레오티드로부터 및 자동화된 유전자 합성에 의해 PCR 생성물로부터 합성하였다. 정확한 유전자 서열을 이용할 수 없는 경우, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 가장 유사한 상동체의 서열에 기초하여 설계하고, 유전자를 적절한 조직으로부터 유래된 RNA로부터 RT-PCR로 단리하였다. 단일 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease) 절단 부위에 의해 플랭킹된 유전자 절편을 표준 클로닝/서열분석 벡터 내로 클로닝하였다. 플라스미드 DNA를 형질전환된 박테리아로부터 정제하고, UV 분광법으로 농도를 측정하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열분석으로 확인하였다. 각각의 발현 벡터 내로 서브클로닝을 허용하기 위해 적합한 제한 부위를 갖는 유전자 절편을 설계하였다. 모든 구축물이 진핵 세포에서 분비하는 단백질을 표적하는 리더 펩티드를 암호화하는 5'-말단 DNA 서열을 갖도록 설계하였다.
실시예 1
전하 변형(항-CD20/항-CD3)이 있거나 없는 T 세포 이중특이적(TCB) 항체의 제조
하기 분자를 이 실시예에서 제조하고, 이의 개략도를 도 2에 나타내었다.
A. 전하 변형이 없는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab"(CD3 결합제에서 CH1/CL 교환)(서열번호 14 내지 17)
B. 전하 변형이 있는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab"(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, CD20 결합제에서 전하 변형)(서열번호 18 내지 21)
C. 전하 변형이 있는 "2+1 IgG 교차Fab"(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, CD20 결합제에서 전하 변형)(서열번호 32, 19 내지 21)
D. 전하 변형이 없는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab"(CD3 결합제에서 VH/VL 교환)(서열번호 33, 15, 17, 21)
E. 전하 변형이 없는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab"(CD3 결합제에서 VH-CH1/VL-CL 교환)(서열번호 34, 15, 17, 35)
F. 전하 변형이 있는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab"(CD20 결합제에서 VH/VL 교환, CD3 결합제에서 전하 변형)(서열번호 36 내지 39)
G. 전하 변형 및 Fc 영역에서 DDKK 돌연변이가 있는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab"(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, CD20 결합제에서 전하 변형)(서열번호 40, 41, 20, 21)
H. 전하 변형이 있는 "1+1 교차Mab"(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, CD20 결합제에서 전하 변형)(서열번호 42, 43, 20, 21)
I. 전하 변형이 있는 "1+1 교차Mab"(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, CD20 결합제에서 전하 변형, 상이한 CD20 결합제)(서열번호 43 내지 45, 21)
J. 전하 변형 213E, 123R이 있는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab"(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, CD20 결합제에서 전하 변형)(서열번호 69 내지 71, 21)
K. 전하 변형이 있는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab"(VH/VL 교환 및 CD3 결합제에서 전하 변형)(서열번호 15, 17, 72, 73).
중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 각각의 수용체 포유 동물 발현 벡터에 예비-삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄를 갖는 프레임에 서브클로닝하였다. 단백질 발현은 MPSV 프로모터에 의해 구동되고 합성 폴리A 신호 서열은 CDS의 3' 말단에 존재한다. 또한, 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 함유한다.
현탁액 중에서 자라고 있는 HEK293-EBNA 세포를 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 포유 동물 발현 벡터와 공형질감염시켜 분자를 제조하였다. 상기 세포를 1:2:1:1 비율[A: "벡터 중쇄(VH-CH1-VH-CL-CH2-CH3)":"벡터 경쇄(VL-CL)":"벡터 중쇄(VH-CH1-CH2-CH3)":"벡터 경쇄(VL-CH1)"; B, D, G, J, K: "벡터 중쇄(VH-CH1-VL-CH1-CH2-CH3)":"벡터 경쇄(VL-CL)":"벡터 중쇄(VH-CH1-CH2-CH3)":"벡터 경쇄(VH-CL)"; C: "벡터 중쇄(VL-CH1-VH-CH1-CH2-CH3)":"벡터 경쇄(VL-CL)":"벡터 중쇄(VH-CH1-CH2-CH3)":"벡터 경쇄(VH-CL)"; E: "벡터 중쇄(VH-CH1-VL-CL-CH2-CH3)":"벡터 경쇄(VL-CL)":"벡터 중쇄(VH-CH1-CH2-CH3)":"벡터 경쇄(VH-CH1)"; F: "벡터 중쇄(VL-CH1-VH-CH1-CH2-CH3)":"벡터 경쇄(VH-CL)":"벡터 중쇄(VL-CH1-CH2-CH3)":"벡터 경쇄(VH-CH1)"] 또는 1:1:1:1 비율[H, I: "벡터 중쇄(VL-CH1-CH2-CH3)":"벡터 경쇄(VL-CL)":"벡터 중쇄(VH-CH1-CH2-CH3)":"벡터 경쇄(VH-CL)"]로 상응하는 발현 벡터와 형질감염시켰다.
형질감염을 위해, HEK293 EBNA 세포를 6 mM L-글루타민 및 250 mg/ℓ G418을 함유하는 엑셀(Excell) 배양 배지의 무혈청 현탁액 중에 배양하였다. 600 ml 튜브스핀 플라스크(최대 작동 용량 400 ml) 중에서 제조하기 위해, 형질감염 24시간 전에 6억 개의 HEK293 EBNA 세포를 시딩하였다. 형질감염을 위해, 세포를 210 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 미리 가온된 CD CHO 배지(20 ml)로 대체하였다. 발현 벡터를 CD CHO 배지(20 ml) 중에서 혼합하여 최종 DNA(400 ㎍)를 수득하였다. PEI 용액(2.7 ㎍/㎖; 1080 ㎕)을 첨가한 후, 혼합물을 15초 동안 볼텍싱한 후 10분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 600 ml 튜브스핀 플라스크로 옮기고 5% CO2 대기로 37℃에서 항온처리기에서 3시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 엑셀 + 6 mM L-글루타민 + 5 g/ℓ 펩소이(Pepsoy) + 1.0 mM VPA 배지(360 ml)를 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 형질감염 1일 후 7% 피드(Feed) 1(론자(Lonza))을 첨가하였다. 7일 후, 정제를 위해 3600 x g에서 20 내지 30분 동안 원심분리(시그마 8케이(시그마 8K) 원심분리기)하여 배양 상청액을 수집하고, 용액을 멸균 여과하고(0.22 mm 필터), 0.01% w/v의 최종 농도의 나트륨 아지드를 첨가하였다. 용액을 4℃에서 유지하였다.
배양 배지 중에 구성물의 농도는 단백질 A-HPLC로 측정하였다. 기본 분리는 pH 8.0에서 단백질 A에서 Fc-함유 분자의 결합 및 pH 2.5로부터 용리 단계였다. 2개의 이동 상이 있었다. 이들이 상이한 pH(8 및 2.5)로 조정됨을 제외하고 동일한 트리스(10 mM)-글리신(50 mM)-NaCl(100 mM) 완충액이었다. 컬럼 몸체는 포로스(POROS) 20A로 포장된 약 63 ㎕의 내부 용량을 갖는 업처치(Upchurch) 2 x 20 mm 예비-컬럼이었다. 각각의 샘플(100 ㎕)을 0.5 ml/분의 유속으로 평형 물질에 주입하였다. 0.67분 후, 상기 샘플을 pH 2.5까지 pH 단계로 용리하였다. 280 nm 흡광도를 측정하여 정량을 수행하고 표준 곡선을 사용하여 16 내지 166 mg/ℓ 농도 범위의 인간 IgG1로 계산하였다.
분비된 단백질을 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 친화성 크로마토그래피 후, 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다.
친화성 크로마토그래피를 위해, 상청액을 20 mM 나트륨 포스페이트(25 ml), 20 mM 나트륨 시트레이트(pH 7.5)로 평형시킨 하이트랩(HiTrap) 단백질 A HP 컬럼(CV = 5 mL, 지이 헬쓰케어(GE Healthcare))에 로딩하였다. 미결합 단백질을 10 컬럼 부피 이상의 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 7.5)로 세척한 후, 6 컬럼 부피의 10 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 5.45)로 추가 세척하여 제거하였다. 이후 컬럼을 10 mM MES(20 ml), 100 mM 나트륨 클로라이드(pH 5.0)로 세척하고, 표적 단백질을 6 컬럼 부피의 20 mM 나트륨 시트레이트, 100 mM 나트륨 클로라이드, 100 mM 글리신(pH 3.0)으로 용리하였다. 0.5 M 나트륨 포스페이트(pH 8.0; 1/10)를 첨가하여 단백질 용액을 중화하였다. 표적 단백질을 농축하고 여과한 후 20 mM 히스티딘, 140 mM 나트륨 클로라이드, 0.01% 트윈(Tween)-20(pH 6.0)으로 평형시킨 하이로드 수퍼덱스(HiLoad Superdex) 200 컬럼(지이 헬쓰케어)에 로딩하였다. 분자 A를 추가의 제조용 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 단계에 의해 정제하여 100%의 최종 단량체 함량을 달성하여야 한다. 따라서, 제 1 크기 배제 단계로부터의 고함량 단량체를 갖는 분획을 모으고, 농축하고, 다시 하이로드 수퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어)에 로딩하였다. 이 추가 정제 단계는 다른 분자의 경우 필요하지 않았다(그러나, 부산물 프로필에 따라, 분획 모으기 및 제 1 크기 배제 크로마토그래피 후 이에 따른 회수는 이러한 분자의 경우 상이하다).
분자의 순도 및 분자량을, 환원제의 부재 하에 SDS-PAGE에 의한 제 1 정제 단계(단백질 A 친화성 크로마토그래피) 및 쿠마시(Coomassie)[심플블루(상표) 세이프스테인(SimpleBlue™ SafeStain), 인비트로겐]로 염색 후 분석하였다. 누페이지(NuPAGE: 등록상표) 프리-캐스트(Pre-Cast) 겔 시스템(인비트로겐, 미국 소재)을 제조자의 설명(4 내지 12% 트리스-아세테이트 겔 또는 4 내지 12% 비스-트리스)에 따라 사용하였다.
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정하여 결정하였다.
최종 정제 단계 후 분자의 순도 및 분자량은 환원제의 존재 및 부재 하에 CE-SDS 분석으로 분석하였다. 칼리퍼 랩칩(Caliper LabChip) GXII 시스템(칼리퍼 라이프사이언스(Caliper lifescience))을 제조자의 설명서에 따라 사용하였다. 분석을 위해 샘플(2 μg)을 사용하였다.
항체 샘플의 응집물 함량을 25℃에서 TSK겔 G3000 SW XL 분석용 크기-배제 컬럼(토소(Tosoh))을 사용하여 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3(pH 6.7) 실행 완충액 중에서 분석하였다.
모든 분자를 제조하고 동일한 방법에 따라 정제하였다(상기한 바와 같이 추가 SEC 단계에 사용되는 분자 A를 제외함).
분자 A는 제 1 제조용 크기 배제 크로마토그래피 후 고함량 응집물을 나타낸다. 이 정제 단계 후 응집물의 함량은 고분자량 불순물 및 단량체 분획의 기준선 분리가 아니므로 측정될 수 없다. 100% 단량체 물질을 수득하기 위해, 추가 제조용 크기 배제 크로마토그래피 단계가 필요하다. 분자 B는 하나의 제조용 크기 배제 크로마토그래피 후 100% 단량체였다.
상청액의 농도는 분자 A보다 높지만, 최종 수율은 (고함량 응집물로 인해) 분자 B보다 2.3배 낮다(표 2).
CE-SDS 분석에 의해 나타낸 최종 순도는 분자 A보다 분자 B가 더 높다(표 3, 도 3A 및 B). 도 3M 및 3N은, 분자 A가 분자 B와 비교하여 광범위한 피크를 갖는 SEC 정제 단계(제조용 SEC)의 크로마토그램을 나타내고, SEC에 로딩된 분자 A의 제제는 균일하지 않지만, 분자 B의 제제는 대체로 단량체임을 나타낸다.
분자 C는 높은 역가로 생성될 수 있지만 분자 B와 비교하여 최종 회수율은 적용된 크로마토그래피 방법에 의해 완전히 제거될 수 없는 고함량의 부산물로 인해 적다(표 2, 표 3, 도 3B 및 J, 도 3C 및 K). 도 3B 및 3K에 나타낸 바와 같이, 단백질 A 정제 단계 후 SDS-PAGE 분석은 분자 B의 부산물이 없음을 나타내는 반면, 분자 C의 제제는 100 kDa의 분명한 분자량을 보이는 일부 부산물을 함유한다.
분자 D는 항-CD20 Fab 중에 하전된 잔기의 부재 하에서만 분자 B와 상이하다. 이러한 분자는 또한 높은 역가로 일시적으로 생성될 수 있지만 분자 C에 대하여 이미 기재된 바와 같이, 최종 품질은 분석용 SEC에서 나타내고(분자 D의 98% 단량체 대 분자 B의 100% 단량체), 회수율은 고함량의 부산물로 인해 분자 B보다 낮다(표 2; 표 3; 도 3B 및 J, 도 3D 및 L). 도 3J 및 3L에 나타낸 바와 같이, 단백질 A 정제 단계 후 SDS-PAGE 분석은 분자 B의 부산물이 없음을 나타내지만, 분자 D의 제제는 66 kDa 및 40 kDa의 분명한 분자량을 보이는 일부 부산물을 함유한다. 도 3N 및 3O는, 분자 D가 분자 B에 비해 광범위한 피크를 갖는 SEC 정제 단계(제조용 SEC)의 크로마토그램을 나타내고, SEC에 로딩된 분자 D의 제제는 균일하지 않지만, 분자 B의 제제는 주로 단량체임을 나타낸다.
또한, 분자 E의 생성 역가는 높지만 최종 생성물은 분석용 SEC 및 모세관 전기영동에 의해 나타낸 바와 같이 여전히 저분자량 불순물을 함유하였다(표 2; 표 3; 도 3E).
분자 B와 대조적으로, 분자 F는 종양 표적 결합 잔기의 Fab에서 VH-VL 교환을 갖지만, 전하 변형은 항-CD3 Fab에 도입되었다. 이러한 분자는 너무 높은 역가로 생성될 수 있지만, 최종 회수율은 부산물로 인해 낮다. 항-CD20/항-CD3 TCB의 경우, 항-CD20 Fab 중에 전하 변형이 있는 포맷이 제조 및 정제에 대하여 바람직할 수 있다.
분자 G는 "놉-인투-홀" 돌연변이를 대신하여 Fc 영역에서 전하 변형이 있는 분자이다("DD" = Fc 도메인의 서브유닛 중 하나에서 K392D; K409, "KK" = Fc 도메인의 서브유닛 중 다른 하나에서 D356K; D399K)(EU 넘버링). 이중특이적 분자의 생성은 1개의 중쇄에 2개의 아스파르트산 잔기 및 제 2 중쇄 중에 2개의 리신 잔기의 도입에 의해 조성된다(도 2G). 이러한 분자는 높은 역가로 생성될 수 있지만 최종 생성물은 여전히 분석용 SEC 및 모세관 전기영동에 의해 나타낸 일부 고분자량 및 저분자량 불순물을 갖지만(표 2; 표 3), 부산물은 "놉-인투-홀" 돌연변이를 전달하는 동일한 분자(분자 B)를 완전히 제거할 수 있다.
분자 I의 CD20 결합제 중에 분자 H와 상이한 분자 I는, 분자 H와 비교하여 최종 제조용 크기 배제 크로마토그래피 후 고함량 응집물을 나타낸다. CE-SES 분석에 의해 나타낸 최종 순도는 분자 I보다 분자 H에 대하여 더 높다(표 3; 도 3H 및 I). 또한, 분자 H에 대한 회수율은 분자 I보다 40% 더 높았다(표 2). 이 결과는 분자의 품질이 또한 T 세포 이중특이적 포맷에 사용된 항체에 따름을 보여준다.
분자 J 및 분자 K의 생성은 우수한 수율로 이어지는 우수한 출발 역가를 갖는다. 그러나, 두 분자에 대하여 약 20%의 최종 회수율은 분자 B로 달성된 48% 훨씬 미만이었다(표 2). 두 분자는 99% 초과의 단량체 함량을 갖는 최종 품질에서 유사하였다(표 2). 비환원된 CE-SDS에서 순도는 90%를 갖는 분자 K(전하 변형 및 CD3 결합제에서 VL-VH 교환을 가짐)와 비교하여 거의 99%를 갖는 분자 J(이는 CL 도메인의 위치 124 및 CH1 도메인의 위치 147에서 전하 변형이 부족함)가 우수하다(표 3, 도 3N 및 3O). 분자 J는 친화성 크로마토그래피 후 농축 단계 동안 일부 침전을 나타낸다. 분자 K는 CD20 결합 Fab보다는 CD3 결합 교차Fab에서 전하 변형을 갖는다. 이는 CE-SDS에 의해 나타낸 바와 같이 최종 품질에 영향을 미친다(표 3, 도 3O). 품질에서의 차이는 SDS-PAGE에서 제 1 정제 단계 후 흔히 볼 수 있다(도 3P, 3Q). 분자 K는 분자 J보다 150 kDa 및 70 kDa에서 더 많은 부산물을 함유한다(절반의 분자 및 아마도 경쇄가 손실된 구축물). 두 분자는 분자 B와 유사한 동일한 열 안정성을 갖는다(표 4).
항-CD20/항-CD3 TCB에 대하여, 항-CD20 Fab(분자 B)에서 전하 변형이 있는 "도립된" 버전은 가장 높은 회수율 및 최종 품질로 생성될 수 있는 포맷이다.
[표 2]
전하 변형이 있거나 없는 항-CD20/항-CD3 TCB 분자의 제조 및 정제의 요약
Figure 112022063433243-pat00002
[표 3]
전하 변형이 있거나 없는 항-CD20/항-CD3 TCB 분자의 CE-SDS 분석(비환원됨)
Figure 112022063433243-pat00003
LC-MS 분석에 의한 분자량 확인
탈당화
분자의 균일한 제제를 확인하기 위해, 최종 단백질 용액을 LC-MS 분석으로 분석하였다. 탄수화물에 의해 도입된 이질성을 제거하기 위해, 구축물을 PNGaseF로 처리하였다. 이를 위해, 단백질 용액의 pH는 2 M 트리스(2 ㎕)를 0.5 mg/㎖의 농도의 단백질(20 ㎍)에 첨가하여 pH 7.0으로 조정하였다. PNGaseF(0.8 ㎍)를 첨가하고 12시간 동안 37℃에서 항온처리하였다.
LC-MS 분석 - 온 라인 검출
LC-MS 방법은 TOF 6441 질량 분석계(아질런트(Agilent))에 결합된 아질런트 HPLC 1200에서 수행하였다. 크로마토그래피 분리는 매커레이 나겔 폴리스테렌(Macherey Nagel Polysterene) 컬럼, RP1000-8(8 ㎛ 입자 크기, 4.6 x 250 mm, 카탈로그 번호 719510)에서 수행하였다. 용리액 A는 5% 아세토니트릴 및 물 중 0.05%(v/v) 포름산이고, 용리액 B는 95% 아세토니트릴, 5% 물 및 0.05% 포름산이었다. 유속은 1 ml/분이고, 분리는 40℃에서 이전에 기재된 처리로 수득된 단백질 샘플(6 ㎍, 15 ㎕)로 수행하였다
Figure 112022063433243-pat00004
처음 4분 동안, 용리액을 물로 유도하여 질량 분석계의 염 오염을 방지하였다. ESI-공급원을 12 ℓ/분의 무수 가스 흐름, 350℃의 온도 및 60 psi의 분무기 압력으로 실행하였다. 양이온 방식으로 380 V의 단편화 전압 및 700 내지 3200 m/z의 질량 범위를 사용하여 MS 스펙트럼을 수득하였다. 4 내지 17분 동안 장치 소프트웨어를 사용하여 MS 데이타를 수득하였다.
분자 A의 제제는 잘못 짝지어진 경쇄, 및 자유 또는 연결된 경쇄의 트레이스(trace)를 갖는 분자를 약 10 내지 15% 갖는다. 분자 B의 제제는 2개의 CD3 경쇄를 포함하는 분자의 트레이스를 갖는다. 자유 경쇄 또는 연결된 경쇄와 같은 불순물은 검출될 수 없다(표 2).
정적 광 산란에 의한 열 안정성
열 안정성을 정적 광 산란(SLS) 및 적용된 온도 스트레스에 대한 고유 단백질 형광을 측정하여 모니터링하였다.
1 mg/㎖의 단백질 농도의 여과된 단백질 샘플(30 ㎍)을 옵팀(Optim) 2(아박타 애날리티칼 리미티드(Avacta Analytical Ltd), 영국 소재)에 이중으로 적용하였다. 온도를 0.1℃/분으로 25℃에서 85℃로 증가시키면서 반경 및 총 산란 강도를 수집하였다. 고유 단백질 형광의 측정을 위해, 샘플을 295 nm에서 여기하고, 방출을 266 내지 473 nm에서 수집하였다.
모든 분자에 대하여 열 안정성을 측정하고, 상기 결과를 표 4에 나타내었다. 동적 광 산란에 의해 측정된 응집 온도(TAgg)(54 내지 58℃의 범위) 및 온도 구배 적용 후 단백질 형광에 의해 측정된 용융 온도(TM)(56 내지 60℃의 범위)는 모든 분자에 대하여 비교할 수 있다(표 4).
[표 4]
전하 변형이 있거나 없는 항-CD20/항-CD3 TCB 분자의 열 안정성
Figure 112022063433243-pat00005
항-CD3/항-CD20 TCB 항체의 CD3 및 CD20에 대한 결합
전하 변형이 있거나 없는 항-CD3/항-CD20 T 세포 이중특이적(TCB) 항체(상기에서 분자 "A" 및 "B")의 CD3에 대한 결합은 인간 CD3-발현 주르카트 세포를 사용하여 측정하였다. CD20에 대한 결합은 인간 CD20-발현 Z-138 세포를 사용하여 측정하였다. 현탁 세포를 수확하고, PBS로 1회 세척하고, 바이셀(Vicell)을 사용하여 생존력 및 세포 밀도를 측정하였다. 현탁 세포를 FACS 완충액 중에 2 x 106 세포/㎖로 재현탁하였다. 세포 현탁액(100 ㎕)을 96-웰 환저 플레이트에 시딩하였다. 각각의 단계를 4℃에서 수행하였다. 상기 플레이트를 360 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 항체 희석액을 PBS/0.1% BSA 중에 준비하였다. 희석된 항-CD3/항-CD20 TCB 항체(30 ㎕) 또는 FACS 완충액을 웰에 첨가하고, 세포를 30분 동안 4℃에서 항온처리하였다. 항온처리 후, FACS 완충액(120 ㎕)을 웰당 첨가하고, 플레이트를 350 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 세척 단계를 1회 반복하였다. 예비-희석된 2차 항체(30 ㎕)를 플레이트 배치에 나타낸 바와 같이 웰당 첨가하였다. 플레이트를 추가 30분 동안 4℃에서 항온처리하였다. 항온처리 후, FACS 완충액(120 ㎕)을 웰당 첨가하고, 플레이트를 350 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 세척 단계를 모든 플레이트에 대하여 1회 반복하지만 주르카트 세포를 함유하는 플레이트는 이러한 1회 세척 단계 후 직접 고정시켰다. 세포를 웰당 BD 고정 완충액(비디 바이오사이언시스(BD Biosciences), #554655)(100 ㎕)을 사용하여 4℃에서 20 내지 30분 동안 고정시켰다. 세포를 BD FACS 칸토(Canto)II를 사용하여 FACS 측정을 위해 80 ㎕/웰 FACS 완충액에 재현탁하였다.
이 실험의 결과를 도 4에 나타내었다.
항-CD3/항-CD20 TCB 항체에 의해 유도된 CD20-발현 종양 표적 세포의 T 세포-매개된 사멸시 종양 세포 용해, 및 CD4 + 및 CD8+ T 세포 활성화
전하 변형이 있거나 없는 항-CD3/항-CD20 TCB 항체(상기 분자 "A" 및 "B")에 의해 유도된 T 세포의 활성화 및 표적 세포의 T 세포-매개된 사멸은 Z-138 및 Nalm-6 종양 세포에서 추정하였다. 인간 PBMC는 효과기로서 사용되고, 사멸 및 세포 활성화는 이중특이적 항체로 항온처리 후 22시간째에 검출되었다. 간단히, 표적 세포를 수확하고, 세척하고, 96-웰 환저 플레이트를 사용하여 3만개 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 건강한 인간 공여자로부터 선혈을 히스토파크(히스토파크) 밀도 원심분리하여 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 준비하였다. 선혈을 멸균 PBS로 희석하고, 히스토파크 구배(시그마(Sigma), #H8889)에 걸쳐 적층하였다. 원심분리(450 x g, 30분, 실온) 후, PBMC-함유 인터페이스 위의 혈장을 버리고, PBMC를 새로운 팔콘 튜브로 옮긴 후 PBS(50 ml)로 채웠다. 혼합물을 원심분리하고(400 x g, 10분, 실온), 상청액을 버리고, PBMC 펠렛을 멸균 PBS로 2회 세척하였다(원심분리 단계 350 x g, 10분). 생성된 PBMC 개체군을 자동으로(바이셀) 카운팅하고 추가 사용까지(24시간 미만) 세포 항온처리기(37℃, 5% CO2)에서 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민(바이오크롬(Biochrom), K0302)을 함유하는 RPMI1640 배지에서 유지하였다. 사멸 분석을 위해, 항체를 지시된 농도(1000 pM 내지 0.1 pM의 범위, 3회)로 첨가하였다. PBMC를 6:1의 최종 E:T 비율로 표적 세포에 첨가하였다. 항온처리 후, 플레이트를 420 x g에서 4분 동안 원심분리하고, LDH 검출을 위해 웰당 50 ㎕씩 새로운 96-웰 평편 바닥 플레이트로 옮겼다. LDH 검출은 세포독성 검출 키트(로슈(Roche) #11644793001)를 사용하여 제조자의 설명서에 따라 수행하였다. 잔여 세포를 0.1% BSA를 함유하는 PBS로 세척하였다. CD8(APCCy7 항-인간 CD8, 바이오레전드(Biolegend) #301016), CD4(FITC 항-인간 CD4, 바이오레전드 #300506), CD69(BV421 항-인간 CD69 바이오레전드 #310930) 및 CD25(PECy7 항-인간 CD25 바이오레전드 #302612)에 대한 표면 염색을 공급처의 지시에 따라 수행하였다. 4℃에서 30분 후, 세포를 0.1% BSA를 함유하는 PBS로 웰당 150 ㎕씩 2회 세척하고, 2% PFA를 웰당 100 ㎕씩 사용하여 고정시켰다. BD FACS 칸토II를 사용하여 측정하였다.
이 실험의 결과를 도 5, 6 및 7에 나타내었다. 두 분자는 종양 세포 용해 및 T 세포 활성화에 관하여 필적할만한 활성을 나타낸다.
인간 전혈에서 항-CD3/항-CD20 TCB 항체에 의해 유도된 건강한 인간 B 세포의 T 세포-매개된 사멸시 B 세포 고갈, 및 CD4 + 및 CD8 + T 세포 활성화
건강한 공여자로부터의 인간 전혈을 전하 변형이 있거나 없는 항-CD3/항-CD20 TCB 항체(상기 분자 "A" 및 "B")로 지시된 농도(50,000 pM 내지 1 pM의 범위, 3회)로 항온처리하였다. 22 시간 후, 혈액을 혼합하고, CD8(APCCy7 항-인간 CD8, 바이오레전드 #301016), CD4(FITC 항-인간 CD4, 바이오레전드 #300506), CD69(BV421 항-인간 CD69 바이오레전드 #310930), CD25(PECy7 항-인간 CD25, 바이오레전드 #302612), CD22(APC 항-인간 CD22, 바이오레전드 #302510) 및 CD45(PerCPCy5.5 항-인간 CD45, 바이오레전드 #304028)를 함유하는 FACS 항체 믹스(20 ㎕)로 염색하기 위해 항체(35 ㎕)를 수집하였다. 실온에서 15분 항온처리 후, 혈액을 FACS 용해 용액(비디(BD), #349202)으로 고정시키고, 유동 세포계측법으로 분석하였다. B 세포 고갈은 미처리된 샘플을 0% 세포 감소까지 설정하는 B 세포 수 및 CD4+ T 세포 수의 비율에 기초하여 계산하였다.
이 실험의 결과는 도 8 및 9에 나타내었다. 두 분자는 전혈에서 B 세포 고갈 및 T 세포 활성화에 관하여 필적할만한 활성을 나타낸다.
인간 CD20- 및 CD3-발현 표적 세포에 항-CD3/항-CD20 TCB 항체의 결합
상기 분자 "B"로서 나타낸 항-CD3/항-CD20 TCB 항체의 결합을 인간 CD20-발현 미만성 거대 세포 B 세포 림프종(DLBCL) 세포주(WSU DLCL2, 0.5 내지 1 x 106 CD20 결합 부위) 및 CD3-발현 불멸성 T 림프구 세포주(주르카트)에서 시험하였다. 간단히, 세포를 수확하고, 카운팅하고, 생존력에 대하여 확인하고, FACS 완충액(PBS 0.1% BSA) 중에 1.5 x 106 세포/㎖로 재현탁하였다. 세포 현탁액(0.15 x 106 세포 함유)(100 ㎕)을 CD20 TCB의 농도를 증가시키면서(50 pM 내지 200 nM) 96-웰 환저 플레이트에서 30분 동안 4℃로 항온처리하고, 저온 PBS 0.1% BSA로 2회 세척하고, 희석된 PE-공액결합된 아피니퓨어(AffiniPure) F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG Fcg 단편 특이적 2차 항체(잭슨 이뮤노 리서치 랩 피이(잭슨 이뮤노 리서치 랩 PE) #109-116-170)로 4℃에서 추가 30분 동안 재항온처리하고, 저온 PBS 0.1% BSA로 2회 세척하고, 2% PFA를 첨가하여 고정시키고, FSC/SSC 게이팅(gating)에 의한 분석으로부터 죽은 세포를 제외하고 FACS 칸토II(소프트웨어 FACS 디바)를 사용하여 FACS에 의해 분석하였다.
결과를 도 10A(WSU DLCL2 세포에 결합) 및 도 10B(주르카트 세포에 결합)에 나타내었다. 결합 곡선 및 결합에 대한 EC50 값을 그래프패드프리즘(GraphPadPrism)5를 사용하여 계산하였다. EC50 값은 0.98 nM(CD20-발현 WSU DLCL2 세포에 2가 결합) 및 약 12.5 nM(CD3-발현 주르카트 세포에 1가 결합)이었다.
인간 및 시노몰구스 원숭이 CD20- 및 CD3-발현 표적 세포에 항-CD3/항-CD20 TCB 항체의 결합
상기 분자 "B"로서 나타낸 항-CD3/항-CD20 TCB 항체의 교차반응성을 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD20-발현 B 세포 및 CD3-발현 CD4 및 CD8 T 세포에 대한 결합을 추정하여 평가하였다. 간단히, 건강한 공여자로부터의 헤파린처리된 인간 및 시노몰구스 원숭이 혈액을 사용하여 밀도 원심분리에 의해 PBMC를 단리하였다. 단리된 PBMC를 카운팅하고, 생존력에 대하여 확인하고, FACS 완충액(100 ㎕ PBS 0.1% BSA) 중에 4 x 106 세포/㎖로 재현탁하였다. 세포 현탁액(0.4 x 106 세포 함유)(100 ㎕)을 96-웰 U-바닥 플레이트에 플레이팅하고, 원심분리하였다(420 x g, 4분). 상청액을 제거한 후, PBMC를 CD20 TCB-알렉사플루오르(AlexaFluor)488의 농도를 증가시키면서(200 pM 내지 200 nM) 4℃에서 30분 동안 항온처리하고, 저온 PBS 0.1% BSA로 2회 세척하고, 인간/시노몰구스 교차반응성 항체[항-CD19(자체 제조, 클론 8B8)-알렉사플루오르647, 항-CD4(비디, #552838, 클론 L200)-PerCPCy5.5 및 항-CD8(비디, #555367, 클론 RPA-T8)-PE]로 4℃에서 추가 30분 동안 재항온처리하였다. 30분 후, PBMC를 저온 PBS 0.1% BSA로 2회 세척하고, FACS 용해 용액(비디, #349202)으로 처리한 후 FACS 칸토II(Software FACS Diva)를 사용하여 FACS 분석하였다. 그래프패드프리즘5를 사용하여 결합 곡선을 수득하였다.
결과를 도 11A(인간 및 시노몰구스 원숭이 B 세포에 결합), 도 11B(인간 및 시노몰구스 원숭이 CD4 T 세포에 결합) 및 도 11C(인간 및 시노몰구스 원숭이 CD8 T 세포에 결합)에 나타내었다. 그래프패드프리즘5를 사용하여 계산된, CD20-발현 B 세포에 결합하는 것과 관련된 EC50 값은 4.8 nM(인간 B 세포) 및 3.3 nM(시노몰구스 B 세포)이었다.
상이한 항-CD20/항-CD3 TCB 항체 포맷에 의해 매개된 종양 세포 용해
상이한 항-CD20/항-CD3 TCB 항체 포맷(상기 나타낸 분자 "B", "A", "C" 및 "H")에 의해 매개된 종양 세포 용해를 Z138 세포(외투 세포 림프종, 0.06 내지 0.23 x 106 CD20 결합 부위)에서 추정하였다. 인간 PBMC를 효과기로서 사용하고, 종양 용해를 상이한 이중특이적 항체 포맷으로 21 내지 24시간 항온처리 후 검출하였다. 간단히, 표적 세포를 수확하고, 세척하고, 96-웰 U-바닥 플레이트를 사용하여 50,000 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 건강한 인간 혈액의 히스토파크 밀도 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 준비하였다. 선혈을 멸균 PBS로 희석하고, 히스토파크 구배(시그마, #H8889)에 걸쳐 적재하였다. 원심분리(450 x g, 30분, 실온, 제동 없음) 후, PBMC-함유 인터페이스 위의 혈장을 버리고, PBMC를 새로운 팔콘 튜브로 옮긴 후 PBC(50 ml)로 채웠다. 혼합물을 원심분리하고(350 x g, 10분, 실온), 상청액을 버리고, PBMC 펠렛을 멸균 PBS로 세척하였다(300 x g, 10분). 생성된 PBMC 개체군을 자동으로(바이셀) 카운팅하고, 추가 사용까지(24시간 미만) 세포 항온처리기에서 37℃에서 5% CO2로 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민(바이오크롬, K0302)을 함유하는 RPMI1640 배지에서 저장하였다. 종양 용해 분석을 위해, 항체를 지시된 농도(0.1 pM 내지 1 nM의 범위, 3회)로 첨가하였다. PBMC를 6:1의 최종 E:T의 비율로 표적 세포에 첨가하였다. 종양 세포 용해를 세포자멸성/괴사성 세포(LDH 검출 키트, 로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science), #11 644 793 001)에 의해 세포 상청액으로 방출된 LDH의 정량화에 의해 37℃에서 5% CO2로 21 내지 24시간 항온처리 후 추정하였다. 표적 세포의 최대 용해율(= 100%)은 표적 세포를 1% 트리톤 X-100으로 항온처리하여 달성하였다. 최저 용해(= 0%)는 표적 세포를 이중특이적 구축물이 없는 효과기 세포와 공동 항온처리함을 지칭한다.
도 12는, 상이한 CD20 TCB 항체 포맷이 CD20+ 표적 세포의 강력한 표적-특이적 용해를 유도함을 나타낸다. 패널 A는, "도립된, 전하가 있는 CD20 TCB_2+1"(상기 나타낸 분자 "B")이 "도립된, 전하가 없는 CD20 TCB_2+1"(상기 나타낸 분자 "A")에 필적할만한 활성을 나타내고, 둘 다 "전하가 있는 CD20 TCB_1+1" 포맷(상기 나타낸 분자 "H")보다 더욱 강력함을 나타낸다. 패널 B는, "도립된, 전하가 있는 CD20 TCB_2+1"(상기 나타낸 분자 "B")이 "통상의, 전하가 있는 CD20 TCB_2+1" 포맷(상기 나타낸 분자 "C")보다 더욱 강력함을 나타낸다. 그래프패드프리즘5를 사용하여 계산된, 사멸 분석에 관한 EC50 값을 표 5에 나타내었다.
[표 5]
CD20-발현 Z138 종양 표적 세포를 사용하여 평가된 상이한 항-CD20/항-CD3 TCB 항체 포맷에 의해 매개된 종양 세포 용해의 EC50 값(pM)
Figure 112022063433243-pat00006
상이한 항-CD20/항-CD3 TCB 항체 포맷에 의해 매개된 종양 세포 용해 및 후속 T 세포 활성화
상이한 항-CD20/항-CD3 TCB 항체 포맷(상기 나타낸 분자 "B" 및 "H")에 의해 매개된 종양 세포 용해를 3개의 상이한 건강한 공여자로부터 유도된 인간 PBMC를 사용하여 Z138 세포(외투 세포 림프종) 및 OCI Ly-18(0.06 내지 0.2 x 106 CD20 결합 부위), 공여자)(0.1 내지 0.4 x 106 CD20 결합 부위), SU-DHL-5(0.13 내지 21 x 106 CD20 결합 부위), SU-DHL-8(분석 검출치 미만의 CD20 결합 부위), 톨레도(Toledo)(0.02 x 106 CD20 결합 부위) 및 U2932(0.09 내지 0.4 x 106 CD20 결합 부위) 세포주를 비롯한 DLBCL 세포주의 광범위한 패널에서 추가로 추정하였다. 종양 세포 수확, PBMC 단리, 및 분석 조건은 이전 실시예에 기재된 것과 동일하였다. 도 13A 내지 C에 나타낸 분석에 대한 E:T 비는 6:1이고, 도 13D에 나타낸 분석에 대한 E:T 비는 3:1이었다. 종양 세포 용해를, 세포자멸성/괴사성 세포(LDH 검출 키트, 로슈 어플라이드 사이언스, #11 644 793 001)에 의해 세포 상청액으로 방출된 LDH의 정량화에 의해 37℃에서 5% CO2로 21 시간 항온처리 후 추정하였다. 종양 세포 용해시 발생하는 T 세포 활성화의 추정을 위해, PBMC를 96-웰 환저 플레이트로 옮기고, 400 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 0.1% BSA를 함유하는 PBS로 2회 세척하였다. CD8(APCCy7 항-인간 CD8 바이오레전드, #301016), CD4(FITC 항-인간 CD4, 바이오레전드 #300506) 및 CD25(PECy7 항-인간 CD25 바이오레전드 #302612)에 대한 표면 염색은 공급처의 지시에 따라 수행하였다. 세포를 0.1% BSA를 함유하는 PBS로 웰당 150 ㎕씩 2회 세척하고, 2% PFA 또는 FACS 용해 용액(비디, #349202)을 사용하여 고정시켰다. 샘플을 BD FACS 칸토II에서 분석하였다.
도 13은, "도립된, 전하가 있는 CD20 TCB_2+1" 항체 포맷(상기 나타낸 분자 "B")이 상이한 공여자로부터 PBMC를 사용하여 종양 세포 용해(패널 A, D) 및 T 세포 활성화(패널 B, C) 둘 다의 검출에 의해 추정되는 바와 같이 "CD20 TCB_1+1" 항체 포맷(상기 나타낸 분자 "H")보다 더욱 강력함을 나타낸다. 종양 용해 및 Z138 세포의 T 세포 활성화에 관한 EC50 값은 표 6a에 나타내었다. DLBCL 세포주의 패널의 종양 용해 분석에 관한 EC50 값은 표 6b에 나타내었다. EC50 값은 그래프패드프리즘5를 사용하여 계산하였다.
[표 6a]
CD20-발현 Z138 종양 세포를 사용하여 항-CD20/항-CD3 TCB 항체에 의해 매개된 종양 세포 용해 및 T 세포 활성화의 EC50 값(pM)
Figure 112022063433243-pat00007
[표 6b]
항-CD20/항-CD3 TCB 항체에 의해 매개된 DLBCL 종양 세포주의 패널의 종양 분해의 EC50 값(pM)
Figure 112022063433243-pat00008
상이한 항-CD20/항-CD3 TCB 항체 포맷에 의해 매개된 인간 전혈에서 B 세포 고갈
상이한 항-CD20/항-CD3 TCB 항체 포맷(상기 나타낸 분자 "B" 및 "H") 및 오비누투주맙에 의해 매개된 정상 B 세포 고갈을 건강한 지원자로부터의 인간 선혈을 사용하여 추가로 추정하였다. 간단히, 선혈을 헤파린-함유 주사기에 수집하였다. 혈액 분취액(180 ㎕/웰)을 96-웰 깊은 플레이트에 놓고, TCB 또는 항체 희석액(10 ㎕/웰 + 10 ㎕/웰 PBS)을 보충하고, 습식 세포 항온처리기에서 37℃에서 5% CO2로 24시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 혈액을 위 아래로 피펫팅하여 혼합한 후 혈액 분취액(35 ㎕)을 96-웰 U-바닥 플레이트로 옮기고, 유동 세포계측을 위해 총 55 ㎕ 용량으로 형광성 항-CD45(APC, 바이오레전드, #304037), 항-CD4(PerCPCy5.5, 비디, #552838), 항-CD8(APCCy7, 바이오레전드, #301016), 항-CD19(PE, 바이오레전드, #302208), 항-CD25(PECy7, 바이오레전드, #302612) 및 항-CD69(BV421, 바이오레전드, #310930)로 항온처리하였다. 실온(암실)에서 15분 항온처리 후, FACS 용해 용액(비디 바이오사이언시스)을 웰당 180 ㎕씩 첨가하여 적혈구를 감소시키고 유동 세포계측 전에 세포를 고정시켰다.
도 14는, "도립된, 전하가 있는 CD20 TCB_2+1"(상기 분자 "B")이 오비누투주맙(Gazyva) 및 전하가 있는 "CD20 TCB_1+1"(상기 분자 "H") 둘 다 보다 정상 B 세포를 감소시키는데 더욱 강력함을 나타낸다.
[표 7]
상이한 CD20-표적화 항체에 의해 매개된 정상 인간 전혈에서 B 세포 고갈의 EC50 값(pM)
Figure 112022063433243-pat00009
주르카트-NFAT 리포터 분석을 사용하여 CD3 다운스트림 신호의 강도를 정량화하여 추정된 T 세포의 활성화
T 세포 교차 결합 및 이후 T 세포 활성화를 유도하기 위한 상이한 항-CD20/항-CD3 TCB 항체 포맷의 수용력을 CD20-발현 종양 표적 세포 및 주르카트-NFAT 리포터 세포(NFAT 프로모터를 함유하는 CD3-발현 인간 급성 림프성 백혈병 리포터 세포주, 글로리스폰스(GloResponse) 주르카트 NFAT-RE-luc2P, 프로메가(Promega) #CS176501)의 공배양을 사용하여 추정하였다. CD20 항원(종양 세포에서 발현됨) 및 CD3 항원(주르카트-NFAT 리포터 세포에서 발현됨)에 대한 항-CD20/항-CD3 TCB의 동시 결합시, NFAT 프로모터는 활성화되고 활성 파이어플라이 루시퍼라제(firefly luciferase)의 발현을 야기한다. 발광 신호(루시퍼라제 기질의 첨가시 수득됨)의 강도는 CD3 활성화 및 신호화의 강도에 비례한다. 주르카트-NFAT 리포터 세포는 현탁액 중에서 성장하고, 2 g/ℓ 글루코스, 2 g/ℓ NaHCO3, 10% FCS, 25 mM HEPES, 2 mM L-글루타민, 1x NEAA, 0.1 내지 0.5 미오(mio) 세포/㎖에서 1x 나트륨-피루베이트, 200 ㎍/㎖ 하이그로마이신을 함유하는 RPMI1640 중에서 배양하였다. 분석을 위해, 종양 표적 세포(Z138)를 수확하고, 바이셀을 사용하여 생존력을 측정하였다. 50 ㎕/웰의 희석된 항체 또는 배지(대조용)를 표적 세포에 첨가하였다. 웰당 20,000개 세포를 96-웰 평편 바닥 백색 벽 플레이트(#655098, 그라이너 바이오-온(Greiner bio-one))에 플레이팅하였다. 이후, 주르카트-NFAT 리포터 세포를 수확하고, 바이셀을 사용하여 생존력을 추정하였다. 세포를 하이그로마이신 B가 없는 세포 배양 배지 중에 2 미오 셀/㎖로 재현탁하고 0.1 x 106 세포/웰(웰당 50 ㎕씩)로 종양 세포에 첨가하여 5:1의 최종 E:T 및 100 ㎕/웰의 최종 용량을 수득하였다. 세포를 습식 항온처리기에서 37℃에서 6 시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 끝에, 100 ㎕/웰의 온-글로(ONE-Glo) 용액(웰당 1:1 온-글로 및 분석 배지 용량)을 웰에 첨가하고 실온(암실)에서 10분 동안 항온처리하였다. 왈락 빅터(WALLAC Victor)3 ELISA 판독기(퍼킨엘머(PerkinElmer)2030)를 사용하여 발광을 검출하고, 검출 시간은 5초/웰이었다.
도 15는, "도립된, 전하가 있는 CD20 TCB_2+1"(상기 분자 "B")이 "CD20 TCB_1+1"(상기 분자 "H")보다 더욱 강한 T 세포 활성화 및 CD3의 신호화 다운스트림을 야기함을 나타낸다.
[표 8]
주르카트-NFAT 리포터 세포를 사용하여 검출된 CD3 활성화의 EC50 값(pM)
Figure 112022063433243-pat00010
건강한 NOG 마우스에서 항-CD20/항-CD3 TCB에서 단일 용량 PK
단일 용량 약동학 연구(SDPK)는 효능 연구 동안 항-CD20/항-CD3 TCB 분자 "B"(이하에서 CD20 TCB로 지칭됨)의 노출을 평가하기 위해 수행하였다(도 16). 0.5 mg/kg의 i.v.(정맥내) 볼루스 투여를 NOG 마우스에 투여하고, 약동학 평가를 위해 혈액 샘플을 선택된 시점에 취하였다. 일반적인 면역 분석은 CD20 TCB의 총 농도를 측정하기 위해 사용된다. CD20 TCB에 대한 표준 곡선의 교정 범위는 0.78 내지 50 ng/㎖이고, 여기서 15 ng/㎖는 정량 하한치(LLOQ)이다.
10일의 베타 반감기(비구획적 분석) 및 8 mL/d/kg의 클리어런스(clearance)(2-구획적 모델)를 갖는 이상성 감소(biphasic decline)를 관찰하였다. 반감기 및 클리어런스는 정상 비표적된 IgG과 비교하여 예상하였다(표 9).
파르사이트 리미티드(Pharsight Ltd)로부터의 포이닉스(Phoenix) v6.2는 PK 분석, 모델링 및 모의실험을 위해 사용하였다.
[표 9]
NOG 마우스에서 CD20 TCB의 0.5 mg/kg i.v.(정맥내) 볼루스 투여의 약동학적 매개변수
Figure 112022063433243-pat00011
항-CD20/항-CD3 TCB의 생체내 B 세포 고갈 활성
CD20 TCB의 말초 B 세포 고갈 활성을 완전 인간화된 NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull(NOG) 마우스에서 시험하였다.
인간 B 및 T 세포를 순환하는 생리학적 수준을 갖는(문헌[Hayakawa J. et al., Stem Cell 27(1), 175-182, 2009), 14 주령의 완전 인간화된 NOG 마우스를 1주에 1회 0.5 mg/kg의 투여량으로 정맥내(i.v.) 투여된 비히클(n = 7) 또는 CD20 TCB(n = 6)로 처리하였다. 도 17에 도시된 연구 설계에 나타낸 바와 같이, 연구가 종결된 시점에서 첫 번째 치료적 주입 후 1 및 3일(D1, D3), 및 두 번째 치료적 주입 후 10일(D10) B 세포 및 T 세포 분석을 위해 마우스를 채혈하였다. 후자의 시점에서, B 및 T 세포 카운트를 순회하기 위한 기준 참조로서 치료적 주입 4일 전(D-4)에 또한 스크리닝하기 위해 비장을 수확하였다. 도 18은, 상이한 시점에서 비히클(좌측 패널)- 및 CD20 TCB(우측 패널)-처리된 마우스의 혈액에서 체외 유동 세포계측에 의해 분석된 B 및 T 세포 카운트를 나타낸다. 결과는, 순환 B 세포가 CD20 TCB 주입 후 1 일째 이미 매우 효율적으로 감소되고, 전체 연구 기간 동안 이들의 수는 검출불가하게 남아 있음을 입증한다. 이에 반해, 순환 T 세포 카운트는 치료적 주입 후 D1에서 오직 일시적으로 떨어지고, D3에서 기준 수준으로 돌아오고, 전체 연구 기간 동안 안정하게 남아있는다. 또한, T 세포 활성화 상태는 상이한 T 세포 표면 마커 및 증식 마커 Ki67을 사용하여 체외 유동 세포계측으로 첫 번째 치료적 주입 후 D3 및 D10에서 처리된 마우스의 혈액 중에서 분석하였다(도 19). CD20 TCB-처리된 마우스로부터의 T 세포는 치료적 주입(상부 패널) 후 D3에서 활성화된 표현형을 나타내고, 비히클 대조군으로부터의 T 세포와 비교하여, CD4 및 CD8 T 세포 둘 다의 구획에서 활성화 마커 CD25, 4-1BB, PD-1 및 그랜-B(GZB)의 상향 조절을 갖는다. 처리된 마우스로부터의 T 세포는 또한 증식 마커 Ki67을 더 높은 수준으로 발현시킨다. 첫 번째 치료적 주입 후 D10에, 대부분의 T 세포 활성화 마커는 비히클 대조군와 비교하여 여전히 높은 수준으로 발현되는 GZB 및 PD-1을 제외하고 기준 수준으로 돌아갔다.
도 20은, 연구 종결시(D10) 비히클 및 CD20 TCB-처리된 마우스의 비장에서 수행된 B 세포 및 T 세포의 분석 결과를 나타낸다. CD20 TCB 처리는 또한 이러한 2차 림프 기관에서 매우 효율적인 B 세포 고갈을 매개하는 반면(도 20A), T 세포 카운트는 비히클 대조군과 필적할만한 수준을 나타낸다(도 20B). T 세포 활성화 상태(도 20C)는 혈액에서 관찰된 결과와 유사하고, 비히클 대조군과 비교하여 처리된 마우스의 비장 T 세포에서 GZB 및 PD-1의 많은 발현을 갖는다.
이러한 모든 결과는, CD20 TCB 처리가 연구 종결(두 번째 치료적 주입 후 3 일)까지 검출불가하게 남아있는 B 세포와 함께, 치료적 주입 후 1 일째 이미 말초 B 세포의 매우 효율적인 감소를 매개할 수 있음을 입증한다. 또한, B 세포는 처리된 마우스의 비장에서 효율적으로 감소된다. B 세포 고갈 활성은 처리된 마우스의 혈액에서 일시적인 T 세포 활성화에 의해 병행되고, GZB 및 PD-1 활성화 마커는 제외하고, 치료적 주입 후 3 일째 기준 수준으로 회복되고, 미처리된 대조군과 비교하여 높은 수준으로 발현된 채로 남아있다.
WSU-DLCL2 모델에서 항-CD20/항-CD3 TCB의 항-종양 활성
CD20 TCB의 항-종양 활성은 인간 미만성 거대 B 세포 림프종 세포주 WSU-DLCL2를 갖고 인간 말초 단핵 세포(PBMC)로 형질감염된 NOG 마우스에서 시험되었다. 간단히, 암컷 NOG 마우스에 1.5 x 106 WSU-DLCL2 세포(원래 유럽 세포 배양 센터(European Collection of Cell Culture)로부터 수득됨)를 피하로(s.c.) 주입하였다. 평균 종양 부피가 200 ㎣에 도달할 때, 인간 T 세포 공급원으로서 인간 PBMC(마우스당 10 x 106 세포)를 마우스에 복강내 주입하였다. 2일 후, 마우스는 0.5 mg/kg의 용량으로 i.v.(정맥내)로 주 1회 투여하는 CD20 TCB 요법을 받았다. 도 21에 도시된 바와 같이, CD20 TCB는 연구 종결시(34일) 관찰된 거의 완전한 종양 회귀와 함께 강력한 항-종양 활성을 나타낸다.
실시예 2
전하 변형이 있거나 없는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab" T 세포 이중특이적 항체의 제조(항-BCMA/항-CD3)
이 실시예에서 제조된 분자의 개략도를 도 22에 나타내었다. 전하 변형이 없는 항-BCMA/항-CD3 "도립된 2+1 IgG 교차Fab" 분자(이 실시예에서 "83A10-TCB"로서 지칭됨)는 서열번호 22 내지 25의 아미노산 서열을 포함하고, 전하 변형이 있는 항-BCMA/항-CD3 "도립된 2+1 IgG 교차Fab" 분자(이 실시예에서 "83A10-TCBcv"로서 지칭됨)는 서열번호 26 내지 29의 아미노산 서열을 포함한다.
BCMAxCD3 이중특이적 항체 벡터의 생성을 위해, IgG1 유도된 이중특이적 분자는 2개의 별개의 항원 결정기인 CD3 및 BCMA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 2개의 항원 결합 모이어티(moiety)로 이루어진다. 항원 결합 모이어티는 중쇄 및 경쇄(각각은 가변 영역 및 불변 영역을 포함함)로 이루어진 Fab 단편이다. 적어도 1개의 Fab 단편은 VH 및 VL이 교환되어 있는 "교차Fab" 단편이다. Fab 단편 내에서 VH 및 VL의 교환은, 상이한 특이성의 Fab 단편이 동일한 도메인 정렬을 갖지 않음을 보장한다. 이중특이적 분자 설계는 CD3의 경우 1가이고, BCMA의 경우 1개의 Fab 단편이 내부 교차Fab(2+1)의 N-말단에 융합된 2가이다. 이중특이적 분자는 분자가 더 긴 반감기를 갖기 위해 Fc 부분을 함유한다. 분자는 현탁액 중에서 자라는 HEK293 EBNA 세포를 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 포유 동물 발현 벡터와 함께 공형질감염시켜 생성된다. 2+1 교차Fab-IgG 구축물의 제조를 위해, 세포를 1:2:1:1 비로 상응하는 발현 벡터("벡터 Fc(놉)":"벡터 경쇄":"벡터 경쇄 교차Fab":"벡터 중쇄-교차Fab")와 형질감염시켰다.
이중특이적 항체를 위해, 1개의 결합 아암(arm) "교차Fab"에서 대체/교환의 도입은 분명히 부산물을 감소시키지만 상기 제제는 부산물이 완전히 없지 않다(WO 2009/080252 및 문헌[Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191]에 상세히 기재됨). 따라서, 제 1 항원에 대한 경쇄와 제 2 항원에 대하여 잘못된 중쇄의 미스매치에 의해 야기된 부산물을 추가로 감소시키고 이중특이적 항체의 수율을 개선시키기 위해, 하전된 아미노산을 CH1 및 CL 도메인 중에 특정한 아미노산 위치에서 반대 전하로 치환을 도입하는 추가 접근법이 분자에 적용되고, 이때 i) 제 1 경쇄의 불변 도메인 CL 중에서 상기 (a)의 위치 124의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(바람직한 하나의 실시양태에서, 리신(K), 아르기닌(R))으로 독립적으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), 제 1 중쇄의 불변 도메인 CH1 중에서 상기 (a)의 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 독립적으로 치환되거나(카바트에 따라 넘버링); ii) 제 2 경쇄의 불변 도메인 중에서 상기 (b)의 위치 124의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(바람직한 하나의 실시양태에서, 리신(K), 아르기닌(R))으로 독립적으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), 제 2 중쇄의 불변 도메인 중에서 상기 (b)의 위치 147 또는 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 독립적으로 치환된다(카바트에 따라 넘버링).
이중특이적 항체의 생성을 위해, 이중특이적 항체는, 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 현탁액 중에 배양된 HEK293-EBNA 세포 중에 각각의 포유 동물 발현 벡터의 일시적인 공형질감염에 의해 발현된다. 형질감염 1일 전에, HEK293-EBNA 세포를 6 mM L-글루타민이 보충된 체외 배지 중에 1.5 미오 생존가능한 세포/㎖로 시딩하였다. 최종 생산량의 모든 mL를 위해, 2.0 미오 생존가능한 세포를 원심분리하였다(210 x g에서 5분). 상청액을 흡입하고 세포를 CD CHO 배지(100 ㎕) 중에 재현탁하였다. 최종 생산량의 모든 mL를 위한 DNA는 CD CHO 배지(100 ㎕) 중에 DNA(중쇄:변형된 중쇄:경쇄:변형된 경쇄의 비 = 1:1:2:1)(1 ㎍)를 혼합하여 제조하였다. PEI 용액(1 mg/㎖; 0.27 ㎕)을 첨가한 후, 혼합물을 15초 동안 볼텍싱하고, 10분 동안 실온에서 방치하였다. 10분 후, 재현탁된 세포 및 DNA/PEI 혼합물을 함께 넣은 후 적절한 용기로 옮기고 이를 쉐이킹 장치(37℃, 5% CO2)에 넣었다. 3시간의 항온처리 시간 후, 6 mM L-글루타민, 1.25 mM 발프로산 및 12.5% 펩소이(50 g/ℓ)가 보충된 체외 배지(800 ㎕)를 최종 생산량의 모든 mL를 위해 첨가하였다. 24시간 후, 공급물(SF40, 론자)(70 ㎕)을 최종 생산량의 모든 mL를 위해 첨가하였다. 7일 후 또는 세포 생존력이 70% 이하일 때, 세포를 원심분리 및 멸균 여과에 의해 상청액으로부터 분리하였다. 항체를 친화성 단계 및 1 또는 2개의 연마 단계인 양이온 교환 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다. 필요한 경우 추가 연마 단계를 사용하였다.
친화성 단계를 위해, 상청액을 6 CV 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트(pH 7.5)로 평형시킨 단백질 A 컬럼(하이트랩 단백질 A FF , 5 mL, 지이 헬쓰케어)에 로딩하였다. 동일한 완충액으로 세척 단계 후, 항체를 20 mM 나트륨 포스페이트, 100 mM 나트륨 클로라이드, 100 mM 글리신(pH 3.0)을 사용하는 용리 단계에 의해 컬럼으로부터 용리하였다. 목적한 항체를 함유하는 분획을 0.5 M 나트륨 포스페이트(pH 8.0)으로 즉시 중화하고(1:10), 모으고, 원심분리에 의해 농축하였다. 농축물을 멸균 여과하고, 양이온 교환 크로마토그래피 및/또는 크기 배제 크로마토그래피로 추가 처리하였다.
양이온 교환 크로마토그래피 단계를 위해, 농축된 단백질을 친화성 단계를 위해 사용된 용리 완충액으로 1:10 희석하고 양이온 교환 컬럼(포로스 50 HS, 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)) 위에 로딩하였다. 평형 완충액 및 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 20 mM 트리스(pH 5.0) 및 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 20 mM 트리스, 100 mM 나트륨 클로라이드(pH 5.0)의 각각의 세척 완충액을 사용하는 2개의 세척 단계 후, 단백질을 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 20 mM 트리스, 100 mM 나트륨 클로라이드(pH 8.5)를 사용하는 구배로 용리하였다. 목적 항체를 함유하는 분획을 모으고, 원심분리로 농축하고, 멸균 여과하고, 크기 배제 단계로 추가 가공하였다.
크기 배제 단계를 위해, XK16/60 하이로드 수퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어)에 농축된 단백질, 및 제형 완충액으로서 트윈20을 함유하거나 함유하지 않는 20 mM 히스티딘, 140 mM 나트륨 클로라이드(pH 6.0)를 주입하였다. 단량체를 함유하는 분획을 모으고, 원심분리로 농축하고, 멸균 바이알에 멸균 여과하였다.
항체 농도의 측정은 0.1% 용액의 항체의 흡광도의 이론값을 사용하여, 280 nm에서 흡광도를 측정하여 수행하였다. 이 값은 아미노산 서열에 기초하고 GPMAW 소프트웨어(라이트하우스 데이타(Lighthouse data))에 의해 계산된다.
최종 단백질 제제의 순도 및 단량체 함량은 25 mM 칼륨 포스페이트, 125 mM 나트륨 클로라이드, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) 나트륨 아지드, pH 6.7 완충액 중에 각각의 HPLC[TSK겔 G3000 SW XL 분석용 크기 배제 컬럼(토소(Tosoh))]를 사용하여 CE-SDS[칼리퍼 랩칩 GXII 시스템(칼리퍼 라이프 사이언시스(Caliper Life Sciences))]로 측정하였다.
최종 단백질 제제의 분자량을 확인하고 분자의 최종 단백질 용액의 균일한 제제를 확인하기 위해, 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC-ME)을 사용하였다. 탈당하 단계를 먼저 수행하였다. 탄수화물에 의해 도입된 이질성을 제거하기 위해, 구축물을 PNGaseF(프로자임(ProZyme))로 처리하였다. 따라서, 단백질 용액의 pH는, 2 M 트리스(2 ㎕)를 0.5 mg/㎖의 농도로 단백질(20 ㎍)에 첨가하여 pH 7.0으로 조정하였다. PNGaseF(0.8 ㎍)를 첨가하고, 12 시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 이어서, LC-MS 온라인 검출을 수행하였다. LC-MS 방법은 TOF 6441 질량 분석계(아질런트)과 결합된 아질런트 HPLC 1200에서 수행하였다. 크로마토그래피 분리는 매커레이 나겔 폴리스테렌 컬럼 RP1000-8(8 ㎛ 입자 크기, 4.6 x 250 mm; 카탈로그 번호 719510)에서 수행하였다. 용리액 A는 5% 아세토니트릴 및 물 중 0.05%(v/v) 포름산이고, 용리액 B는 95% 아세토니트릴, 5% 물 및 0.05% 포름산이었다. 유속은 1 ml/분이고, 상기 분리는 40℃에서 수행되고, 상기 기재된 처리로 단백질 샘플(6 ㎍; 15 ㎕)로 수득하였다.
Figure 112022063433243-pat00012
처음 4분 동안, 용출액은 폐수로 유도되어 염 오염으로부터 질량 분석계를 보호하였다. ESI-공급원을 12 l/분의 무수 기체 유속, 350℃의 온도 및 60 psi의 분무기 압력으로 실행하였다. 양이온 모드로 380 V의 단편화 전압 및 700 내지 3200 m/z의 질량 범위를 사용하여 MS 스펙트럼을 수득하였다. 4 내지 17 분 동안 기계 소프트웨어에 의해 MS 데이타를 수득하였다.
도 23은 83A10-TCB 및 83A10-TCBcv 항체에 대하여 상이한 방법으로 정제한 후 최종 단백질 제제의 CE-SDS(비환원됨) 그래프를 도시한다. 83A10-TCB 항체에 적용된 단백질 A(PA) 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 정제 단계는 30% 미만의 순도 및 82.8%의 단량체 함량(A)을 야기한다. 양이온 교환 크로마토그래피(cIEX) 및 최종 크기 배제 크로마토그래피(re-SEC) 단계를 비롯한 추가 정제 단계가 (A)에서 최종 단백질 제제에 적용될 때, 순도는 93.4%로 증가하지만, 단량체 함량은 여전히 동일하게 남아있고, 수율은 0.42 mg/ℓ로 유의미하게 감소된다. 그러나, 특이적 전하 변형이 83A10 항-BCMA Fab CL-CH1, 즉, 83A10-TCBcv 항체에 적용될 때, 95.3%의 순도, 100%의 단량체 함량 및 3.3 mg/ℓ 이하의 수율로 입증되는 TCB 분자의 뛰어난 생성/정제 프로필은, 심지어 PA + cIEX + SEC 정제 단계가 추가 재-SEC 정제 단계를 포함함에도 불구하고 7.9-배 낮은 수율 및 17.2% 낮은 단량체 함량을 보이는 생성/정제 프로필을 갖는 (B)에 비해 적용될 때(C) 아마 관찰될 수 있다.
이어서, 83A10-TCB 대 83A10-TCBcv 항체의 생성/정제 프로필을 비교하기 위한 헤드-투-헤드 생성 실행을 수행하여 항체에 적용된 CL-CH1 전하 변형의 장점을 추가로 평가하였다. 도 24에 도시된 바와 같이, 83A10-TCB 및 83A10-TCBcv 항체의 특성을 나란히 측정하고 하기 각각의 정제 단계 후 비교하였다: (1) PA 친화성 크로마토그래피 단독(A, B), (2) PA 친화성 크로마토그래피, 이어서 SEC(C, D), 및 (3) PA 친화성 크로마토그래피, 이어서 SEC, 이어서 cIEX 및 재-SEC(E, F). 83A10-TCB 및 83A10-TCBcv 항체에 대하여 각각의 방법으로 정제한 후 최종 단백질 용액의 CE-SDS(비환원됨) 그래프는 도 24에서 입증되었다. 도 24A 및 24B에 나타낸 바와 같이, TCB 항체에 전하 변형을 적용하는 개선은 이미 PA 친화성 크로마토그래피 단독으로 정제 후 관찰되었다. 이 헤드-투-헤드 연구에서, 83A10-TCB 항체에 적용된 PA 친화성 크로마토그래피 정제 단계는 61.3%의 순도, 26.2 mg/ℓ의 수율 및 63.7%의 단량체 함량(24A)을 야기하였다. 83A10-TCBcv 항체가 PA 친화성 크로마토그래피로 정제될 때와 비교하여, 모든 특성은 81.0%의 더 나은 순도, 51.5 mg/ℓ의 더 나은 수율 및 68.2%의 단량체 함량(24B)으로 개선되었다. 추가 SEC 정제 단계가 도 24A 및 24B에 나타낸 바와 같이 최종 단백질 제제에 적용될 때, 83A10-TCB는 각각 91.0% 및 83.9%까지의 개선된 순도 및 단량체 함량, 및 10.3 mg/ℓ의 수율을 갖는 83A10-TCBcv와 비교하여 69.5% 순도, 14.1 mg/ℓ의 수율 및 74.7%의 단량체 함량을 수득하였다. 비록 수율이 특정한 실험에서 83A10-TCB보다 83A10-TCBcv에 대하여 약간 적을지라도(즉, 27% 이하), 정확한 분자의 퍼센트는 LC-MS로 측정된 바에 따라 각각 90% 대 40 내지 60%로 83A10-TCB보다 83A10-TCBcv에서 훨씬 낫다. 제 3 헤드-투-헤드 비교에서, 도 24C 및 24D로부터의 83A10-TCB 및 83A10-TCBcv 최종 단백질 제제를 PA 친화성 크로마토그래피 정제 단계 단독 후 또 다른 정제 배치(동일한 제품)로부터의 대략 1 L(동일용량)의 각각의 최종 단백질 제제와 함께 모았다. 이어서, 모은 단백질 제제를 cIEX 및 SEC 정제 방법으로 추가 정제하였다. 도 24E 및 24F에 도시된 바와 같이, 전하 변형이 있는 TCB 항체의 생성/정제 프로필의 개선은 전하 변형이 없는 TCB 항체와 비교될 때 지속적으로 관찰된다. 정제 방법의 여러 단계(즉, PA +/- SEC + cIEX + SEC)를 사용하여 83A10-TCB 항체를 정제한 후, 오직 43.1%의 순도에 달하고 98.3%의 단량체 함량을 달성할 수 있지만 0.43 mg/ℓ로 감소된 수율의 손실을 달성하였다. LC-MS로 측정된 정확한 분자의 퍼센트는 여전히 60 내지 70%로 불량하였다. 결국에는, 최종 단백질 제제의 품질은 시험관내 용도에 적합하지 않았다. 아주 대조적으로, 동일한 연대순 배열을 갖는 동일한 다중 정제 단계가 83A10-TCBcv 항체에 적용될 때, 96.2%의 순도 및 98.9%의 단량체 함량에 달하고 LC-MS로 측정된 95%의 정확한 분자에 달한다. 그러나, 수율은 또한 cIEX 정제 단계 후 0.64 mg/ℓ로 크게 감소된다. 상기 결과는 더 나은 순도, 높은 단량체 함량, 높은 퍼센트의 정확한 분자 및 더 나은 수율이 2가지 표준 정제 단계 후, 즉, PA 친화성 크로마토그래피 및 SEC 정제 후 83A10-TCBcv 항체 단독으로 달성될 수 있지만(도 2D), 상기 특성은 추가 정제 단계가 적용될 때조차도 83A10-TCB로 달성될 수 없음(도 24E)을 나타낸다.
표 10은 PA 정제 단계 후 83A10-TCVcv와 비교하여 83A10-TCB의 특성을 요약한다. 표 11은 PA 및 SEC 정제 단계 후 83A10-TCVcv와 비교하여 83A10-TCB의 특성을 요약한다. 표 12는 PA 및 SEC + PA 단독, 이어서 cIEX 및 재-SEC 정제 단계 후 83A10-TCVcv와 비교하여 83A10-TCB의 특성을 요약한다. 표 10 내지 12에 대하여, 볼드체로 표시된 값은 83A10-TCB와 83A10-TCVcv 사이를 비교하여 뛰어난 특성을 강조한다. 대표적일 수 없는 한가지 예외를 제외하고는, 3가지 헤드-투-헤드 비교 실험으로부터 생성되는 모든 생성/정제 파라미터 및 값은 83A10-TCB와 비교하여 83A10-TCBcv에 대하여 뛰어나다. 전체 결과는, 생성/정제 특징에서 장점이 TCB 항체에 CL-CH1 전하 변형을 적용하여 달성될 수 있고, 오직 2가지 정제 단계(즉, PA 친화성 크로마토그래피 및 SEC)가 매우 우수한 발달력 특성을 갖는 이미 고품질 단백질 제제를 달성하는데 요구됨이 분명하게 입증된다.
[표 10]
단백질 A 친화성 크로마토그래피 정제 단계 후 항-BCMA/항-CD3 T 세포 이중특이적 항체의 생성/정제 프로필
Figure 112022063433243-pat00013
[표 11]
단백질 A 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피 정제 단계 후 항-BCMA/항-CD3 T 세포 이중특이적 항체의 생성/정제 프로필
Figure 112022063433243-pat00014
[표 12]
1.a) 단백질 A 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피, 및 1.b) 함께 모은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단독, 이어서 2) 양이온 교환 크로마토그래피 및 3) 최종 크기 배제 크로마토그래피 정제 단계 후 항-BCMA/항-CD3 T 세포 이중특이적 항체의 생성/정제 프로필
Figure 112022063433243-pat00015
BCMA-양성 다발성 골수종 세포주에 항-BCMA/항-CD3 T 세포 이중특이적 항체의 결합(유동 세포계측법)
유동 세포계측법에 의해 BCMA-발현 NCI-H929 세포(ATCC(등록상표) CRL-9068(상표))에서 인간 BCMA에 결합하는 항-BCMA/항-CD3 TCB 항체(83A10-TCB, 13A4-TCBcv)를 분석하였다. MKN45(BCMA를 발현하지 않는 인간 위 선암 세포주)를 음성 대조군으로 사용하였다. 간단히, 배양된 세포를 수확하고, 카운팅하고, 바이셀을 사용하여 세포 생존력을 평가하였다. 이어서, 생존 가능한 세포를 BSA-함유 FACS 스테인 완충액(비디 바이오사이언시스) 중에 2 x 106 세포/ml로 조정하였다. 이 세포 현탁액(100 ㎕)을 96-웰 환저 플레이트에서 웰당 추가로 분취하고 항-BCMA 항체(30 ㎕) 또는 상응하는 IgG 대조군과 함께 30분 동안 4℃에서 항온처리하였다. 모든 항-BCMA/항-CD3 TCB 항체(및 TCB 대조군)를 적정하고 1 내지 300 nM의 최종 농도 범위에서 분석하였다. 이어서, 세포를 원심분리하고(5분, 350 x g), 120 ㎕/웰 FACS 스테인 완충액(비디 바이오사이언시스)으로 세척하고, 재현탁하고 형광색소-접합된 PE-접합된 아피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG Fc 단편 스페시픽(잭슨 이뮤노 리서치 랩; 109-116-170)과 함께 추가 30분 동안 4℃에서 항온처리하였다. 이어서, 세포를 스테인 완충액(비디 바이오사이언시스)으로 2회 세척하고, 100 ㎕/웰 BD 고정 완충액(비디 바이오사이언시스, #554655)을 사용하여 4℃에서 20분 동안 고정시키고, FACS 완충액(120 ㎕) 중에 재현탁하고 BD FACS 칸토II를 사용하여 분석하였다. 도 25에 도시된 바와 같이, 항-BCMA/항-CD3 TCB 항체의 평균 형광 강도는 H929 세포 및 MKN45 세포에서 83A10-TCB(A), H929 세포 및 MKN45 세포에서 83A10-TCBcv(B)의 항체 농도의 함수로 플롯팅하였다. 적용가능한 경우, 프리즘 그래프패드(미국 캘리포니아주 라 호이아 소재)를 사용하여 EC50 값을 계산하고, H929 세포에서 83A10-TCB 및 83A10-TCBcv의 결합을 위해 최대 결합의 50%에 도달하기 위해 필요한 항체 농도를 나타내는 EC50 값을 표 13에 요약하였다. 도 25C는, 83A10-TCB 및 83A10-TCBcv가 농도 의존 방식으로 H929 세포에 결합하고 유사한 효능을 가짐을 나타낸다. 상기 결과는 83A10-TCB 및 83A10-TCBcv 분자가 각각의 VL 및 VH 가변 도메인에서 동일한 CDR 서열을 공유하므로 예상된다. DP47-TCB 대조군 항체는 중간 형광 강도에서 증가하지 않는 것으로 측정된 BCMA-양성 H929 골수 세포에 결합하지 않았다. 제 2 헤드-투-헤드 비교 실험에서, BCMA-양성 H929 세포에 대한 결합 및 BCMA/CD3-음성 MKN45 세포에 대한 비결합을 위해 83A10-TCB 및 83A10-TCBcv를 평가하였다. 도 25d에 도시된 바와 같이, 83A10-TCB 및 83A10-TCBcv는 농도 의존 방식으로 BCMA-양성 H929 세포에 결합하고 유사한 효능을 갖는다. 상기 제 2 실험에서 H929 세포에 83A10-TCB 및 83A10-TCBcv가 결합하기 위한 EC50 값을 표 14에 요약하였다.
[표 13]
H929 세포에 항-BCMA/항-CD3 TCB 항체가 결합하기 위한 EC50 값(실험 1)
Figure 112022063433243-pat00016
[표 14]
H929 세포에 항-BCMA/항-CD3 TCB 항체가 결합하기 위한 EC50 값(실험 2)
Figure 112022063433243-pat00017
항-BCMA/항-CD3 T 세포 이중특이적 항체에 의해 유도된 BCMA-고 발현 H929 골수 세포의 재유도된 T 세포 세포독성(LDH 방출 분석)
또한, 세포에서 BCMA에 항원 결합 모이어티의 결합을 통해 구축물의 교차결합시 BCMA-고 발현 골수 세포에서 T 세포-매개된 세포자멸을 유도하기 위한 가능성을 위해 항-BCMA/항-CD3 TCB 항체를 분석하였다. 간단히, 인간 BCMA-발현 H929 다발성 골수종 표적 세포를 세포 해리 완충액으로 수확하고, 세척하고 10% 소 태아 혈청(인비트로겐)이 보충된 RPMI 중에 재현탁하였다. 웰당 대략 30,000개 세포를 96-웰 환저 플레이트에 플레이팅하고, 항체 구축물의 각각의 희석물을 0.1 pM 내지 10 nM 범위의 목적한 최종 농도를 위해 첨가하였다(3회 반복). 적합한 비교를 위해, 모든 TCB 구축물 및 대조군을 동일한 몰 농도로 조정하였다. 총 인간 T 세포(효과기)를 상기 웰에 첨가하여 5:1의 최종 효과기:표적(E:T) 비를 수득하였다. 인간 PBMC를 효과기 세포로서 사용하는 경우, 10:1의 최종 E:T 비를 사용하였다. 음성 대조군은 효과기 또는 표적 세포 단독으로 나타낸다. 인간 pan T 세포의 활성화를 위한 양성 대조군으로서, 1 μg/㎖ PHA-M(시그마 #L8902)을 사용하였다. 표준화를 위해, H929 MM 표적 세포의 최대 용해율(= 100%)은 세포 사멸을 유도하는 1% 트리톤 X-100의 최종 농도로 표적 세포를 항온처리하여 측정하였다. 최소 용해율(= 0%)은 효과기 세포 단독으로, 즉, 임의의 T 세포 이중특이적 항체 없이 공동-항온처리된 표적 세포로 나타내었다. 이어서, 37℃, 5% CO2에서 20 내지 24시간 항온처리 후, 세포자멸성/괴사성 골수종 표적 세포로부터 상청액으로 LDH 방출을 제조사의 설명서에 따라 LDH 검출 키트(로슈 어플라이드 사이언스)로 측정하였다. %LDH 방출을 농도 반응 곡선으로 항-BCMA/항-CD3 T 세포 이중특이적 항체의 농도에 대하여 플롯팅하였다. 적용가능한 경우, 프리즘 소프트웨어(그래프패드)를 사용하여 EC50 값을 측정하고 최대 LDH 방출의 50%를 야기하는 TCB 항체 농도로서 측정하였다. 도 26에 도시된 바와 같이, 항-BCMA/항-CD3 TCB 항체[(A,B) 83A10-TCB, (C,D) 83A10-TCBcv]는 LDH 방출로 측정된 바와 같이 BCMA-양성 H929 골수 세포의 농도-의존적 사멸을 유도하였다. H929 세포의 사멸은, BCMA-양성 표적 세포에 결합하지 않는 DP47-TCB 대조군 항체가 1 nM의 가장 농도에서조차도 LDH 방출을 유도하지 않으므로 특이적이다(A). 비록 EC50 값은 83A10-TCB(A, B) 및 83A10-TCBcv(C, 실험 1)에 대한 프리즘(그래프패드) 통계 소프트웨어로 측정할 수 없을지라도, EC50 값의 크기는 비하전된 및 하전된 TCB 분자 둘 다에 대한 낮은 피코몰 범위 효능으로 대략 추정될 수 있다. 제 2 실험에서, 83A10-TCBcv의 효과는 재유도된 T 세포 사멸 분석에서 평가되고 EC50 값은 1.5 pM으로 측정될 수 있다. 본 발명자들은 혈액 기능자의 다양성으로 인해 약간 낮은 EC50 값(약간 나은 효능)이 있을 수 있음을 배제할 수 없었다. 그러나, H929 세포를 사멸하기 위한 효능의 크기는 낮은 피코몰 범위에서 분명하다. 전체 결과는 83A10-TCB(전하 변형이 없음) 대 83A10-TCBcv(전하 변형이 있음)가 세포계 분석에서 유사한 생물학적 특성을 나타냄을 시사한다.
[표 15]
항-BCMA/항-CD3 TCB 항체에 의해 유도된 H929 세포의 재유도된 T 세포 사멸을 위한 EC50 값 및 추정치
Figure 112022063433243-pat00018
실시예 3
전하 변형이 있는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab" T 세포 이중특이적 항체(항-Her2/항-CD3) 및 전하 변형이 있는 "2+1 IgG 교차Fab" T 세포 이중특이적 항체(항-Her3/항-CD3)의 제조
이 실시예에서 제조된 분자의 개략도를 도 27에 나타내었다. 전하 변형이 있는 항-Her2/항-CD3 "도립된 2+1 IgG 교차Fab" 분자(이 실시예에서 "Her2 TCB"로 지칭됨)는 서열번호 21, 52, 53 및 54의 아미노산 서열을 포함한다. 전하 변형이 있는 항-Her3/항-CD3 "2+1 IgG 교차Fab" 분자(이 실시예에서 "Her3 TCB"로 지칭됨)는 서열번호 21, 55, 56 및 57의 아미노산 서열을 포함한다.
상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 (단일 제조용 SEC 단계를 사용하여) 분자를 제조하고, 정제하고 분석하였다.
두 분자는 분석용 크기 배제 크로마토그래피 및 CE-SDS로 나타낸 높은 최종 품질로 정제될 수 있다(표 16, 17). 이러한 제제에서 Her2 TCB의 회수가 Her3 TCB와 비교하여 적을지라도, 단백질은 2가지 정제 단계(단백질 A 및 SEC) 후 거의 순수하다. CE-SDS 분석은 대략 164 kDa에서 단지 1.18%의 저분자량 불순물을 나타낸다(표 17). 187.28 kDa에서 검출된 종은 Fc 도메인에서 N-연결된 당화 없이 표적 분자에 상응한다(이 종은 보통 진행 세포에서 생성된 후 인간 IgG1에 대한 CE-SDS에 의해 검출된다).
Her3 TCB는 우수한 회수율로 정제될 수 있다. 최종 품질은 최종 단량체 함량과 비교하여 Her2 TCB에 대하여 뛰어나다. 또한, CE-SDS는 100% 표적 단백질을나타내고, 192.05 kDa에서 검출된 피크는 비-당화된 Fc-종에 상응함이 추정된다.
자유 경쇄(25 kDa에서 예상된 분자량)와 같이 생성물-관련 저분자량 불순물이 아닌 2개 제제의 경우, 이와 같이 이량체화된 경쇄는 하나의 경쇄(50 kDa에서 예상된 분자량)에서 오직 하나의 CH1-CL 교환을 도입하여 발생할 수 있거나, 손실되거나 비공유결합된 경쇄(125 kDa, 150 kDa 또는 175 kDa에서 예상된 분자량)를 갖는 분자는 CE-SDS 또는 분석용 크기 배제 크로마토그래피에 의해 검출되었다.
[표 16]
전하 변형이 있는 항-Her2/항-CD3 및 항-Her3/항-CD3 TCB 분자의 제조 및 정제 요약
Figure 112022063433243-pat00019
[표 17]
전하 변형이 있는 항-Her2/항-CD3 및 항-Her3/항-CD3 TCB 분자의 CE-SDS 분석(비환원됨)
Figure 112022063433243-pat00020
세포에 Her2 TCB 및 Her3 TCB의 결합
주르카트 현탁 세포를 수확하고 FACS 완충액(PBS + 0.1% BSA)으로 1회 세척하고, 바이셀에 의해 생존력을 측정하였다.
부착성 KPL-4 종양 세포(일본 소재의 가와사키 메디칼 스쿨(Kawasaki Medical School)의 구레바야시(J. Kurebayashi)에 의해 친절하게 제공됨)를 세포 해리 완충액(깁코 인비트로겐)으로 수확하고 FACS 완충액으로 1회 세척한 후, 바이셀에 의해 생존력을 측정하였다.
20만개 세포/웰을 96-웰 환저 플레이트에 플레이팅하고, 상기 플레이트를 4분 동안 400 x g에서 원심분리하였다. 이어서, FACS 완충액 중에 25 ㎕/웰 TCB 희석액을 세포에 첨가하였다. 상기 세포를 30분 동안 냉장고에서 항온처리하였다. 이후 상기 세포를 150 ㎕/웰 FACS 완충액으로 2회 세척하였다.
적당하게 희석된 2차 항체[FITC 접합된 아피니퓨어 F(ab')₂ 단편, 염소 항-인간 IgG, F(ab')₂ 단편 특이적, 잭슨 이뮤노리서치](25 ㎕)를 웰당 첨가하고, 상기 플레이트를 추가 30분 동안 4℃의 암실에서 착색하였다.
상기 플레이트를 150 ㎕/웰 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 150 ㎕ FACS 완충액(150 ㎕) 중에 재현탁하였다. FACS 디바 소프트웨어가 장착된 BD FACS 칸토II를 사용하여 분석을 수행하였다. 중간 형광 값(MFI)을 TCB 분자의 농도에 대하여 플롯팅하였다.
도 29에 도시된 바와 같이, 2개의 TCB는 세포에서 그들의 각각의 표적 항원에 대한 농도-의존적 우수한 결합을 나타낸다.
인간 종양 세포의 T 세포-매개된 용리 후, Her3 TCB에 의해 유도된 인간 CD8 + T 효과기 세포의 활성화
10:1의 효과기 대 표적의 비(E:T) 및 48시간의 항온처리 시간을 사용하여 Her3 TCB로 CD8+ T 효과기 세포의 고전적인 종양 세포 용해 실험(하기 기재됨)을 CD69-양성 세포의 %에 대해 평가하였다.
간단히, 항온처리 후, PBMC를 96-웰 환저 플레이트로 옮기고, 350 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 0.1% BSA를 함유하는 PBS로 2회 세척하였다. CD8(바이오레전드 #300908) 및 CD69(바이오레전드 #310904)에 대한 표면 염색을 공급자의 설명서에 따라 수행하였다. 세포를 0.1% BSA를 함유하는 150 ㎕/웰 PBS로 2회 세척하고, 100 ㎕/웰 1% PFA를 사용하여 4℃에서 20분 동안 고정시켰다. 원심분리 후, 샘플을 0.1% BSA를 함유하는 200 ㎕/웰 PBS 중에 재현탁하고, FACS 칸토II(소프트웨어 FACS 디바)에서 분석하였다.
도 30에 도시된 바와 같이, Her3 TCB는 T 세포 및 종양 세포(KPL-4) 각각의 표적 잔기를 통해 T 세포 및 종양 세포(KPL-4)의 교차결합을 유도하고, 농도 의존 방식으로 T 세포의 활성화를 유도한다.
주르카트-NFAT 활성화 분석
T 세포 교차 결합 및 이후 T 세포 활성화를 유도하기 위한 Her2 TCB 및 Her3 TCB의 능력을, 종양 항원 양성 표적 세포(KPL-4) 및 주르카트-NFAT 리포터 세포(NFAT 프로모터가 있는 CD3-발현 인간 급성 림프성 백혈병 리포터 세포주, 글로리스폰스 주르카트 NFAT-RE-luc2P, 프로메가 #CS176501)의 공동-배양을 사용하여 추정하였다. 인간 Her2, 각각의 인간 Her3, 항원(종양 세포에서 발혐됨) 및 CD3 항원(주르카트-NFAT 리포터 세포에서 발혐됨)에 TCB 분자의 동시 결합시, NFAT 프로모터는 활성화되고 활성 파이어플라이 루시퍼라제의 발현을 초래한다. 발광 신호(루시퍼라제 기질의 첨가시 수득됨)의 강도는 CD3 활성화 및 신호화의 강도에 비례한다.
분석을 위해, KPL-4 인간 종양 세포를 세포 해리 완충액(깁코 인비트로겐)으로 수확하고, 바이셀을 사용하여 생존력을 측정하였다. 웰당 20,000개 세포를 평편 바닥 백색 벽 96-웰 플레이트(그라이너 바이오-온)에 플레이팅하고, 희석된 TCB 또는 배지(대조용)를 첨가하였다. 이후, 주르카트-NFAT 리포터 세포를 수확하고, 바이셀을 사용하여 생존력을 추정하였다. 세포를 세포 배양 배지에 재현탁하고 종양 세포에 첨가하여 나타낸 바와 같이 2.5:1(Her2 TCB의 경우) 또는 5:1(Her3 TCB의 경우)의 최종 E:T, 및 100 ㎕/웰의 최종 용량을 수득하였다. 세포를 5시간 동안 37℃로 습식 항온처리기에서 항온처리하였다. 항온처리가 끝난 후, 100 ㎕/웰의 온-글로(ONE-Glo) 용액(프로메가, #E6120)(1:1 온-글로 및 웰당 분석 배지 용량)을 웰에 첨가하고, 10분 동안 실온으로 암실에서 항온처리하였다. 왈락 빅터3 ELISA 판독기(퍼킨엘머2030)를 사용하여, 5초/웰의 검출 시간으로 발광을 검출하였다.
도 31에 도시된 바와 같이, 2개의 TCB 분자는 CD3을 통해 T 세포 교차 결합 후 T 세포 활성화를 유도한다. Her3 TCB는 KPL-4 세포에서 약간 더 강력하고, 이러한 표적 세포에서 Her2에 비해 Her3의 수준이 더 높음을 입증할 수 있다.
Her2 TCB 및 Her3 TCB에 의해 유도된 종양 세포 용해
각각의 TCB 분자에 의해 유도된 Her2- 또는 Her3-발현 종양 표적 세포의 종양 세포 용해를, 효과기로서 인간 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 사용하여 10:1의 E:T로 추정하였다. 나타낸 바와 같이, TCB로 항온처리시 24시간 및 48시간 후 상청액으로 방출된 LDH를 측정하여 종양 세포 용해를 측정하였다.
인간 PBMC를 선혈 또는 버피 코트로부터 단리하였다. 간단히, 혈액을 PBS와 2:1(선혈) 또는 3:1(버피 코트)로 희석하였다. 혈액/PBS 혼합물(약 30 ml)을 히스토파크(시그마)(15 ml)에 적층하고 30분 동안 450 x g에서 중단 없이 실온으로 원심분리하였다. 10 ml 피펫을 사용하여 PBS를 함유하는 50 mL 관에 림프구를 수집하였다. 상기 관을 PBS로 50 ml까지 채우고, 350 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 펠렛을 PBS(50 ml) 중에 재현탁하고, 300 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 세척 단계를 1회 반복하였다. 세포를 10% FCS 및 1% 글루타맥스[GlutaMax, 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)]를 함유하는 RPMI 중에 재현탁하고, 분석 시작시까지(24시간을 초과하지 않음) 37℃, 5% CO2로 항온처리기에서 저장하였다.
표적 세포를 트립신/EDTA로 수확하고, 세척하고, 96-웰 평편 바닥 플레이트를 사용하여 웰당 3만개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 밤새 습식 항온처리기에 부착시켰다. 분석 일에, 분석 플레이트를 350 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 배지를 흡입하였다. 100 ㎕/웰의 분석 배지를 첨가하였다.
TCB를 나타낸 농도(Her3 TCB의 경우 0.001 pM 내지 1 nM의 범위, 및 Her2 TCB의 경우 0.01 pM 내지 100 nM의 범위, 3회 반복 검정)로 첨가하였다. PBMC를 10:1의 최종 E:T 비로 표적 세포에 첨가하였다. 표적 세포 사멸은 24시간 및 48시간 항온처리 후 세포자멸성/괴사성 세포에 의해 세포 상청액으로 방출된 LDH(락테이트 탈수소효소)의 정량화(LDH 검출 키트, 로슈 어플라이드 사이언스, #11 644 793 001)에 의해 추정하였다. 표적 세포의 최대 용해율(= 100%)은 표적 세포를 1% 트리톤 X-100과 항온처리하여 달성되었다. 최소 용해율(= 0%)은 이중특이적 항체 없이 효과기 세포와 공동 항온처리된 표적 세포에 대하여 언급된다. 그래프패드프리즘5를 사용하여 EC50 값을 계산하였다.
다른 실험에서, 종양 세포 용해는 6.5시간 후 마이크로플레이트 판독기(웰당 5초의 판독 시간)에서 발광을 측정함으로써 카스파제 3/7 활성에 의해 측정되었다.
카스파제 3/7 활성의 측정을 위해, KPL-4-카스파제-3/7 글로센서 표적 세포(글로센서 플라스미드로 안정하게 형질감염된 KPL-4 세포)를 상기한 바와 같이 수확하였다. PBS로 1회 세척 후, 농도를 분석 매질(RPMI1640, 2% FCS, 1% 글루타맥스) 중에 0.3 x 106 세포/㎖로 조정하고, 2% v/v 글로센서 cAMP 시약(프로메가)과 혼합하였다. 이러한 표적 세포 현탁액(100 ㎕)(= 30,000개 세포)을 백색 벽 96-웰 바닥 플레이트의 각각의 웰로 형질감염시켰다.
상기한 바와 같이, 건강한 인간 공여자로부터 수득된 풍부한 림프구 제제(버피코트)를 히스토파크 밀도 원심분리하여 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 제조하였다. 종양 세포 용해 분석을 상기한 바와 같이 본질적으로 수행하였다.
도 32C 및 도 33에 도시된 결과는, Her3 TCB 분자가 KPL-4 종양 세포의 강력한 농도-의존적 세포자멸 및 용해를 유도함을 도시한다.
도 32A 및 32B에 도시된 Her2 TCB에서도 마찬가지이고, 시간에 따른 종양 세포의 유의미한 농도-의존적 용해를 나타낸다. 따라서, 사멸의 EC50은 각각의 표적 세포에서 Her2의 발현 수준에 따르는 것처럼 보인다. 발현 수준이 높을수록, Her2 TCB에 의한 종양 세포 사멸이 우수하다.
실시예 4
전하 변형이 있거나 없는 "(Fab) 2 -교차Fab" T 세포 이중특이적 항체의 제조(항-MCSP/항-CD3)
이 실시예에서 제조된 분자의 개략도를 도 34에 나타내었다. MCSP 결합제에서 전하 변형이 있는 항-MCSP/항-CD3 "(Fab)2-교차Fab" 분자(이 실시예에서 "(Fab)2-XFab-LC007cv"로 지칭됨)는 서열번호 58, 59 및 60의 아미노산 서열을 포함한다. 전하 변형이 없는 항-MCSP/항-CD3 "(Fab)2-교차Fab" 분자(이 실시예에서 "(Fab)2-XFab"로 지칭됨)는 전하 변형이 없는 상응하는 아미노산 서열을 포함한다.
상기 실시예 1에 기재된 바와 같이, 하기 적응을 갖는 분자를 제조하고, 정제하고 본질적으로 분석하였다.
이러한 분자의 제조를 위해, HEK293-EBNA 세포를 1:2:1 비("벡터 중쇄":"벡터 경쇄 항-MSCP Fab":"벡터 경쇄 항-CD3 Fab")로 상응하는 발현 벡터에 형질감염시켰다.
배양 배지 중에 구축물의 농도는 pH 8.0에서 단백질 A에 대한 CH1 도메인의 일부 결합 및 실시예 1에 기재된 바와 같이 pH 2.5에서의 용리 단계에 기초하여, 단백질 A-HPLC에 의해 측정되었다.
분비된 단백질을 CH1에 결합하는 친화성 크로마토그래피를 사용하는 친화성 크로마토그래피 후, 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다.
친화성 크로마토그래피를 위해, 상청액을 5 ml의 50 mM 트리스, 100 mM 글리신, 150 mM NaCl(pH 8.0)이 장착된 하이트랩 카파셀렉트(KappaSelect) 컬럼(CV = 5 mL, 지이 헬쓰케어) 위에 로딩하였다. 결합되지 않은 단백질을 10 컬럼 부피 이상의 50 mM 트리스, 100 mM 글리신, 150 mM NaCl(pH 8.0)로 세척하여 제거하였다. 표적 단백질을 10 컬럼 부피 구배로 50 mM 트리스, 100 mM 글리신, 150 mM NaCl(pH 2.0)에 용리하였다. 1/40의 2 M 트리스(pH 8.0)를 첨가하여 단백질 용액을 중화하였다. 표적 단백질을 농축하고 여과한 후 20 mM 히스티딘, 140 mM 나트륨 클로라이드, 0.01% 트윈-20(pH 6.0)이 장착된 하이로드 수퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어)에 로딩하였다.
전하 변형("(Fab)2-XFab")이 없는 분자와 비교하여 동일한 방법에 따라 2개 분자를 제조하고 정제하고, 전하가 있는 분자의 역가는 10배 낮았다. 그럼에도 불구하고, 최종 회수율을 2개의 항-MCSP Fab("(Fab)2-XFab-LC007cv")에서 전하 변형이 있는 분자에 경우 대략 2배 더 높았다(표 18). (Fab)2-XFab-LC007cv 분자는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제되어 최종 단량체 함량은 95.8%를 나타낼 수 있고, CE-SDS 분석에 의해 최종 순도는 94.33%로 입증될 수 있다.
[표 18]
전하 변형이 있거나 없는 항-MCSP/항-CD3 TCB 분자의 제조 및 정제 요약
Figure 112022063433243-pat00021
[표 19]
전하 변형이 있는 항-MCSP/항-CD3 TCB 분자의 CE-SDS 분석(비환원됨)
Figure 112022063433243-pat00022
전하 변형이 있거나 없는 "(Fab) 2 -교차Fab" T 세포 이중특이적 항체의 세포 결합(항-MCSP/항-CD3)
주르카트-NFAT 현탁 세포를 수확하고, FACS 완충액(PBS + 0.1% BSA)으로 1회 세척하고, 바이셀에 의해 생존력을 측정하였다.
부착성 MV-3 종양 세포를 세포 해리 완충액(깁코 인비트로겐)으로 수확하고 FACS 완충액으로 1회 세척한 후, 바이셀에 의해 생존력을 측정하였다.
20만개 세포를 96-웰 환저 플레이트의 웰당 플레이팅하고, 상기 플레이트를 400 x g에서 4분 동안 원심분리하였다. 이어서, FACS 완충액 중 1차 항체 희석액(25 ㎕/웰)을 세포에 첨가하였다. 세포를 냉장고에서 30분 동안 항온처리하였다. 이후, 세포를 FACS 완충액(150 ㎕/웰)으로 2회 세척하였다.
희석된 2차 항체[FITC 접합된 아피니퓨어 F(ab')₂ 단편, 염소 항-인간 IgG, F(ab')₂ 단편 특이적, 잭슨 이뮤노리서치](25 ㎕)를 웰당 첨가하고, 상기 플레이트를 추가 30분 동안 4℃로 암실에서 착색시켰다.
플레이트를 FACS 완충액(150 ㎕/웰)으로 2회 세척하고, FACS 완충액(150 ㎕) 중에 재현탁하였다. FACS 디바 소프트웨어가 장착된 BD FACS 칸토II를 사용하여 분석을 수행하였다. 중간 형광 값(MFI)을 MCSP TCB 분자의 농도에 대하여 플롯팅하였다.
도 36에 도시된 바와 같이, (Fab)2-XFAb-LC007cv 분자는 MV-3에서 인간 MCSP에 대하여 농도-의존적 결합을 나타내고, 주르카트 세포에서 인간 CD3에 대하여 농도-의존적 결합을 나타낸다. 전하 변형이 없는 (Fab)2-XFab 분자는 (Fab)2-XFAb-LC007cv와 같이 인간 MCSP에 대하여 필적할만한 결합을 나타낸다[(Fab)2-XFAb-LC007cv에 대하여 2.3 nM의 EC50 결합 대 (Fab)2-XFab에 대하여 1.5 nM의 EC50 결합].
전하 변형이 있거나 없는 "(Fab) 2 -교차Fab" T 세포 이중특이적 항체에 의해 매개딘 종양 세포 용해(항-MCSP/항-CD3)
효과기로서 인간 PBMC를 사용하여 10:1의 E:T에서 MCSP TCB 분자에 의해 유도된 MCSP-발현 MV-3 종양 표적 세포를 종양 세포 용해하였다. 종양 세포 용해는 TCB와 항온처리시 24시간 및 48시간 후 상청액으로 방출된 LDH를 측정하여 결정하였다.
간단히, 표적 세포를 트립신/EDTA로 수확하고, 세척하고, 96-웰 평편 바닥 플레이트를 사용하여 25,000개 세포/웰의 농도로 플레이팅하였다. 세포를 밤새 습식 항온처리기에서 부착시켰다. 분석 일에, 분석 플레이트를 350 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 배지를 흡입하였다. 웰당 분석 매질(100 ㎕)을 첨가하였다.
말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 선혈로부터 단리하였다. 간단히, 혈액을 PBS와 2:1로 희석하였다. 혈액/PBS 혼합물(약 30 ml)을 히스토파크(시그마)(15 ml) 위에 적층시키고, 30분 동안 450 x g에서 제동을 걸지 않고 원심분리하였다. 림프구를 10 ml 피펫을 사용하여 PBS를 함유하는 50 ml 관에 수집하였다. 상기 관을 50 ml까지 PBS로 채우고, 10분 동안 350 x g에서 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 펠렛을 PBS(50 ml) 중에 재현탁하고, 10분 동안 300 x g에서 원심분리하였다. 세척 단계를 1회 반복하였다. 세포를 10% FCS 및 1% 글루타맥스(라이프 테크놀로지즈)를 함유하는 RPMI 중에 재현탁하고, 분석이 시작할 때까지(24시간 미만) 항온처리기에서 37℃에서 5% CO2로 저장하였다.
사멸 분석을 위해, TCB 분자를 나타낸 농도(0.04 pM 내지 10 nM의 범위, 3회 반복 검정)로 첨가하였다. PBMC를 10:1의 최종 E:T 비로 표적 세포에 첨가하였다. 표적 세포 사멸을 세포자멸성/괴사성 세포에 의해 세포 상청액으로 방출된 LDH(락테이트 탈수소효소)의 정량화(LDH 검출 키트, 로슈 어플라이드 사이언스, #11 644 793 001)로 24시간 및 48시간 항온처리 후 추정하였다. 표적 세포의 최대 용해율(= 100%)은 1% 트리톤 X-100과 함께 표적 세포를 항온처리하여 달성하였다. 최소 용해율(= 0%)은 이중특이적 항체가 없는 효과기 세포와 공동-항온처리된 표적 세포를 나타낸다. 그래프패드프리즘5를 사용하여 EC50 값을 계산하였다.
도 37에 도시된 바와 같이, 2개의 분자는 hMCSP-발현 표적 세포의 농도-의존적 용해를 나타낸다. (Fab)2-XFAb-LC007cv 분자의 효능(EC50: 24시간 후 2.8 pM, 및 48시간 후 8.6 pM)은 전하 변형이 없는 (Fab)2-XFab 분자의 효능(EC50: 24시간 후 5.9 pM, 및 48시간 후 4.8 pM)과 필적할만하다.
상기 발명이 명확한 이해를 목적으로 설명 및 실시예에 의해 다소 상세히 기재되어 있지만, 상기 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것으로서 해석되어서는 안 된다. 본원에서 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 전체가 참조로서 분명히 도입된다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Bispecific T cell activating antigen binding molecules <130> P32209 <140> PCT/EP2015/067776 <141> 2015-08-03 <150> EP 14179764.7 <151> 2014-08-04 <150> EP 15170866.6 <151> 2015-06-05 <160> 73 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 207 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser 1 5 10 15 Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr 20 25 30 Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr 35 40 45 Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys 50 55 60 Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp 65 70 75 80 His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr 85 90 95 Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu 100 105 110 Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met 115 120 125 Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu 130 135 140 Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys 145 150 155 160 Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn 165 170 175 Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg 180 185 190 Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile 195 200 205 <210> 2 <211> 198 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 2 Met Gln Ser Gly Thr Arg Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser 1 5 10 15 Ile Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr 20 25 30 Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr 35 40 45 Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys 50 55 60 Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu 65 70 75 80 Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro 85 90 95 Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn 100 105 110 Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp 115 120 125 Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys 130 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Artificial Sequence <220> <223> CD20 VL-CL(R) <400> 71 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 72 <211> 672 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD20 VH-CH1-CD3 VL-CH1(EE)-Fc(knob, P329G LALA) <400> 72 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly 210 215 220 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu 225 230 235 240 Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly 245 250 255 Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln 260 265 270 Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys 275 280 285 Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly 290 295 300 Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu 305 310 315 320 Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly 325 330 335 Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 340 345 350 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 355 360 365 Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 370 375 380 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 385 390 395 400 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 405 410 415 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 420 425 430 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 435 440 445 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 450 455 460 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 465 470 475 480 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 485 490 495 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 500 505 510 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 515 520 525 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 530 535 540 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu 545 550 555 560 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 565 570 575 Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 580 585 590 Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 595 600 605 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 610 615 620 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 625 630 635 640 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 645 650 655 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 660 665 670 <210> 73 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 VH-CL(RK) <400> 73 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val 115 120 125 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys 130 135 140 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 145 150 155 160 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 165 170 175 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 180 185 190 Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 195 200 205 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 210 215 220 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230

Claims (65)

  1. 서열번호 18의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 제 1 폴리펩티드 서열, 서열번호 19의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 제 2 폴리펩티드 서열, 서열번호 20의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 제 3 폴리펩티드 서열 및 서열번호 21의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 제 4 폴리펩티드 서열을 포함하고,
    (a) CD20에 특이적으로 결합하고, 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 제 1 Fab 분자;
    (b) CD3에 특이적으로 결합하고, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하되, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 각각 서로 대체되는 제 2 Fab 분자; 및
    (c) CD20에 특이적으로 결합하고, 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 제 3 Fab 분자
    를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자로서,
    (i) 상기 제 1 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 카바트에 따른 위치 123 및 124의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환되고, 상기 제 1 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 카바트 EU 지수에 따른 위치 147 및 위치 213 중 어느 한 위치 또는 두 위치 모두의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환되거나;
    (ii) 상기 제 2 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 카바트에 따른 위치 124의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환되고, 상기 제 2 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 카바트 EU 지수에 따른 위치 147 및 위치 213 중 어느 한 위치 또는 두 위치 모두의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환되는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  2. 서열번호 18의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 제 1 폴리펩티드 서열, 서열번호 19의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 제 2 폴리펩티드 서열, 서열번호 20의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 제 3 폴리펩티드 서열 및 서열번호 21의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 제 4 폴리펩티드 서열을 포함하고,
    (a) CD20에 특이적으로 결합하고, 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 제 1 Fab 분자;
    (b) CD3에 특이적으로 결합하고, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하되, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 각각 서로 대체되는 제 2 Fab 분자; 및
    (c) CD20에 특이적으로 결합하고, 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 제 3 Fab 분자
    를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자로서,
    (i) 상기 제 1 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 카바트에 따른 위치 124의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환되고, 상기 제 1 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 카바트 EU 지수에 따른 위치 147 및 위치 213 중 어느 한 위치 또는 두 위치 모두의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환되거나;
    (ii) 상기 제 2 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 카바트에 따른 위치 124의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환되고, 상기 제 2 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 카바트 EU 지수에 따른 위치 147 및 위치 213 중 어느 한 위치 또는 두 위치 모두의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환되는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  3. 제 1 항에 있어서,
    제 1 폴리펩티드 서열이 서열번호 18의 아미노산 서열과 적어도 96% 동일하고/거나, 제 2 폴리펩티드 서열이 서열번호 19의 아미노산 서열과 적어도 96% 동일하고/거나, 제 3 폴리펩티드 서열이 서열번호 20의 아미노산 서열과 적어도 96% 동일하고/거나, 제 4 폴리펩티드 서열이 서열번호 21의 아미노산 서열과 적어도 96% 동일한, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  4. 제 1 항에 있어서,
    제 1 폴리펩티드 서열이 서열번호 18의 아미노산 서열과 적어도 97% 동일하고/거나, 제 2 폴리펩티드 서열이 서열번호 19의 아미노산 서열과 적어도 97% 동일하고/거나, 제 3 폴리펩티드 서열이 서열번호 20의 아미노산 서열과 적어도 97% 동일하고/거나, 제 4 폴리펩티드 서열이 서열번호 21의 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  5. 제 1 항에 있어서,
    제 1 폴리펩티드 서열이 서열번호 18의 아미노산 서열과 적어도 98% 동일하고/거나, 제 2 폴리펩티드 서열이 서열번호 19의 아미노산 서열과 적어도 98% 동일하고/거나, 제 3 폴리펩티드 서열이 서열번호 20의 아미노산 서열과 적어도 98% 동일하고/거나, 제 4 폴리펩티드 서열이 서열번호 21의 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  6. 제 1 항에 있어서,
    제 1 폴리펩티드 서열이 서열번호 18의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일하고/거나, 제 2 폴리펩티드 서열이 서열번호 19의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일하고/거나, 제 3 폴리펩티드 서열이 서열번호 20의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일하고/거나, 제 4 폴리펩티드 서열이 서열번호 21의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  7. 제 1 항에 있어서,
    제 1 폴리펩티드 서열이 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하거나, 제 2 폴리펩티드 서열이 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함거나, 제 3 폴리펩티드 서열이 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 제 4 폴리펩티드 서열이 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  8. 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드, 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 폴리펩티드 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 폴리펩티드를 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  9. 제 1 항에 있어서,
    제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 카바트에 따른 위치 124의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환되고, 제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 카바트 EU 지수에 따른 위치 147 및 위치 213 중 어느 한 위치 또는 두 위치 모두의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환되는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  10. 제 9 항에 있어서,
    제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 카바트 EU 지수에 따른 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환되는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  11. 제 10 항에 있어서,
    제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 카바트에 따른 위치 123의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환되고, 카바트 EU 지수에 따른 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환되는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  12. 제 11 항에 있어서,
    제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 카바트에 따른 위치 124의 아미노산은 리신(K)으로 치환되고, 카바트에 따른 위치 123의 아미노산은 아르기닌(R)으로 치환되며,
    제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 카바트 EU 지수에 따른 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)으로 치환되고, 카바트 EU 지수에 따른 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)으로 치환되는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  13. 제 11 항에 있어서,
    제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 카바트에 따른 위치 124의 아미노산은 리신(K)으로 치환되고, 카바트에 따른 위치 123의 아미노산은 리신(K)으로 치환되며,
    제 1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 카바트 EU 지수에 따른 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)으로 치환되고, 카바트 EU 지수에 따른 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)으로 치환되는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  14. 제 1 항에 있어서,
    제 2 Fab 분자가 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  15. 제 1 항에 있어서,
    제 1 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자가 각각 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  16. 제 1 항에 있어서,
    Fc 도메인의 제 1 서브유닛 및 Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 회합(association)을 촉진하는 변형을 포함한 Fc 도메인을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  17. 제 16 항에 있어서,
    Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어 제 2 서브유닛의 CH3 도메인 내의 캐비티에 위치할 수 있는 제 1 서브유닛의 CH3 도메인 내에 돌출부를 생성하고, Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어 제 1 서브유닛의 CH3 도메인 내의 돌출부가 위치할 수 있는 제 2 서브유닛의 CH3 도메인 내의 캐비티를 생성하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  18. 제 17 항에 있어서,
    큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기가 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기가 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T) 및 발린(V)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  19. 제 17 항에 있어서,
    Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 CH3 도메인에서 카바트 EU 지수에 따른 위치 366의 트레오닌 잔기가 트립토판 잔기로 대체되고(T366W), Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 CH3 도메인에서 카바트 EU 지수에 따른 위치 407의 티로신 잔기가 발린 잔기로 대체되는(Y407V), T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  20. 제 17 항에 있어서,
    Fc 도메인의 제 1 서브유닛에서 카바트 EU 지수에 따른 위치 354의 세린 잔기가 시스테인 잔기로 대체되거나(S354C), 카바트 EU 지수에 따른 위치 356의 글루탐산 잔기가 시스테인 잔기로 대체되고(E356C),
    Fc 도메인의 제 2 서브유닛에서 카바트 EU 지수에 따른 위치 349의 티로신 잔기가 시스테인 잔기로 대체되는(Y349C), T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  21. 제 17 항에 있어서,
    Fc 도메인의 제 1 서브유닛이 카바트 EU 지수에 따른 아미노산 치환 S354C 및 T366W를 포함하고, Fc 도메인의 제 2 서브유닛이 아미노산 치환 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  22. 제 16 항에 있어서,
    Fc 도메인이 천연 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기(effector) 기능을 나타내는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  23. 제 16 항에 있어서,
    Fc 도메인이 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  24. 제 23 항에 있어서,
    하나 이상의 아미노산 치환이 카바트 EU 지수에 따른 L234, L235 및 P329의 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 존재하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  25. 제 16 항에 있어서,
    Fc 도메인의 각각의 서브유닛이 활성화 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3개의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환이 카바트 EU 지수에 따른 L234A, L235A 및 P329G인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  26. 제 22 항에 있어서,
    Fc 수용체가 Fcγ수용체인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  27. 제 22 항에 있어서,
    효과기 기능이 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC)인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  28. 제 1 항에 있어서,
    CD3는 CD3엡실론인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  29. 제 16 항에 있어서,
    Fc 도메인이 IgG1 Fc 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  30. 제 19 항에 있어서,
    Fc 도메인의 제 2 서브유닛에서 카바트 EU 지수에 따른 위치 366의 트레오닌 잔기가 세린 잔기로 대체되고(T366S), 위치 368의 류신 잔기가 알라닌 잔기로 대체되는(L368A), T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  31. 제 1 항에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  32. (a) CD20에 특이적으로 결합하고, 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 제 1 Fab 분자;
    (b) CD3에 특이적으로 결합하고, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하되, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 각각 서로 대체되는 제 2 Fab 분자; 및
    (c) CD20에 특이적으로 결합하고, 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 제 3 Fab 분자
    를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 암 치료용 약학 조성물로서,
    (i) 상기 제 1 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 카바트에 따른 위치 124의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환되고, 상기 제 1 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 카바트 EU 지수에 따른 위치 147 및 위치 213 중 어느 한 위치 또는 두 위치 모두의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환되거나;
    (ii) 상기 제 2 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 카바트에 따른 위치 124의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환되고, 상기 제 2 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 카바트 EU 지수에 따른 위치 147 및 위치 213 중 어느 한 위치 또는 두 위치 모두의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환되는, 암 치료용 약학 조성물.
  33. 제 32 항에 있어서,
    T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가
    (d) 안정하게 회합할 수 있는 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛을 포함하는 Fc 도메인을 추가로 포함하고,
    (i) 상기 제 1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 상기 제 2 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 각각 상기 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되거나,
    (ii) 상기 제 2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제 1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 상기 제 1 Fab 분자 및 상기 제 3 Fab 분자는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되는, 암 치료용 약학 조성물.
  34. 제 33 항에 있어서,
    상기 제 1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제 2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 상기 제 2 Fab 분자 및 제 3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 각각 상기 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되는, 암 치료용 약학 조성물.
  35. 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드, 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 폴리펩티드 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 폴리펩티드를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는, 암 치료용 약학 조성물.
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