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KR102007055B1 - Cd27l 항원 결합 단백질 - Google Patents

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KR102007055B1
KR102007055B1 KR1020147010524A KR20147010524A KR102007055B1 KR 102007055 B1 KR102007055 B1 KR 102007055B1 KR 1020147010524 A KR1020147010524 A KR 1020147010524A KR 20147010524 A KR20147010524 A KR 20147010524A KR 102007055 B1 KR102007055 B1 KR 102007055B1
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KR
South Korea
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seq
set forth
antigen binding
sequence set
Prior art date
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Inventor
존 엠. 델라니
윌리엄 크리스챤 3세 팬슬로우
채드위크 테렌스 킹
Original Assignee
암젠 인크
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Publication date
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Abstract

본 발명은 CD27L 항원 결합 단백질, 예를 들면, 항체, 상기 CD27l 항원 결합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 항체 약물 접합체 조성물, 및 CD27L 발현과 연관된 질환을 진단하고 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

CD27L 항원 결합 단백질{CD27L Antigen Binding Proteins}
관련된 출원
본 출원은 2011년 9월 22일자 제출된 U.S. 특허가출원 61/538,024에 우선권을 주장하고, 이의 내용은 본원에 전체로서 참조로서 편입된다.
본 출원은 전자 형태의 서열 목록과 함께 제출된다. 서열 목록은 2012년 9월 17일자 작성된, 94.3 KB 크기의 A-1437-US-NP(US Non-Prov)_ST25.txt로 명명된 파일로서 제공된다. 서열 목록의 전자 형태에 담긴 정보는 본원에 전체로서 참조로서 편입된다.
발명의 분야
본 발명의 분야는 CD27L에 결합할 수 있는 항체를 비롯한 항원 결합 단백질의 조성물뿐만 아니라 관련된 방법에 관한 것이다.
배경
CD27L (CD70, TNFSF7)은 정상 조직에서 발현이 활성화된 T와 B 세포의 부분집합, 수상돌기 세포 및 흉선 상피 내에 세포의 작은 부분집합으로 고도로 제한되는 타입 II 내재 막 단백질이다. 면역 반응의 증대 또는 조절을 포함하는 CD27L의 생물학적 기능은 림프구양 세포 상에서 우세하게 발현되는 수용체, CD27에 결합을 통해 매개된다. CD27L/CD27 상호작용은 B-세포 증식과 분화 및 T-세포 공동자극/활성화를 조절한다. CD27 결함성 생쥐에서 CD27L/CD27 상호작용의 파괴는 면역 공격의 부재에서 어떤 표현형도 유발하지 못한다. (Grewal, Expert Opin. Ther. Targets. 12, 341-351 (2008)).
정상 조직에서 매우 제한된 발현에 더하여, CD27L은 일부 B 세포 비-호지킨 림프종 (B-NHL) 종양 아류형, 전-B 세포 급성 림프성 백혈병 (ALL) 및 B 세포 유형-만성 림프성 백혈병 (B-CLL)에서 상대적으로 높은 수준으로 발현된다. CD27L의 비정상적인 발현은 신장 세포 암종 (RCC)에서도 관찰되지만, 정상 신장 또는 기타 정상 조직에서는 관찰되지 않는다. 따라서 CD27L은 "종양 특이적 항원"의 것들과 거의 일치하는 성질을 나타낸다 (Grewal, Expert Opin. Ther. Targets. 12, 341-351 (2008)).
매년, 미국에서 RCC가 발병하는 대략 49,000명 환자 중에서, 40,000여명은 ccRCC로 진단될 것이다 (American Cancer Society: Cancer Facts and Figures final (2008). 지난 4년 동안 RCC를 위한 몇몇 새로운 치료제가 승인되긴 했지만, 전이성 RCC를 앓는 환자에 대한 5년 생존율은 10-20%의 실망스러운 수준에 머물러 있고 (National Cancer Institute. SEER cancer statistics fact sheet: cancer of the kidney and renal pelvis -- accessed 2008), 그리고 충족되지 못한 유의미한 의료 요구가 여전하다. CD27L을 발현하는 것으로 예상되는 새로 진단된 ccRCC 환자의 예측된 연인원수 (U.S.)는 대략 36,000명이다. 현재, 활동성 질환을 앓는 64,000명의 ccRCC 환자가 있는 것으로 추정된다.
CD27L을 비정상적으로 발현하는 것으로 보고된 B-세포 악성 중에서, 미만성 거대 세포 B-세포 림프종 (DLBCL)과 여포성 림프종 (FL)의 B-NHL 부분집합은 검증된 항체를 이용하여 동결된 절편에서 IHC에 의해 산정될 때, FL의 경우에 33% 내지 DLBCL의 경우에 71%의 범위에서 발현의 최대 발생 빈도를 보인다 (Lens et al., Brit. J. Hematol. 106, 491-503 (1999). 또한, B-CLL 종양 중에서 50-89%가 동결된 종양 절편에서 IHC에 의해 또는 순환 종양 세포에서 유세포분석법에 의해 산정될 때, CD27L을 발현한다 (Ranheim et al., Blood 85, 3556-3565 (1965); Trentin et al., Cancer Res. 57, 4940-4947 (1997)).
현재 미국에서 활동성 B-NHL을 앓는 127,000명 환자 중에서, 대략 50%가 DLBCL (중간 등급) 아류형을 나타낸다 (Morton et al., Blood 107, 265-276 (2002)). DLBCL 환자에 대한 리툭산 + 시클로포스파미드, 아드리아마이신, 빈크리스틴, 프레드니손 (CHOP) 치료 기준 요법에도 불구하고, 거의 50%가 재발한다. 이런 이유로, 상기 질환 역시 충족되지 못한 의료 요구가 여전하다.
요약
본 발명은 항-CD27L 항원 결합 단백질, 예를 들면, 항체 및 이들의 기능적 단편을 제시한다. 이들 항-CD27L 항원 결합 단백질은 비정상적인 세포 증식과 연관된 질환과 장애, 예를 들면, 암, 및/또는 염증과 연관된 질환과 장애를 치료하는 방법에서 특히 유용한다.
첫번째 양상에서, CD27L 항원 결합 단백질은 a) 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 또는 서열번호 70에 기재된 아미노산 서열에 적어도 90% 동일성을 갖거나, 적어도 95% 동일성을 갖거나, 또는 동일한 경쇄 가변 도메인; b) 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 또는 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열에 적어도 90% 동일성을 갖거나, 적어도 95% 동일성을 갖거나, 또는 동일한 중쇄 가변 도메인; 또는 c) a)의 경쇄 가변 도메인 및 b)의 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
첫번째 양상의 바람직한 항원 결합 단백질에는 서열번호 63에 기재된 아미노산 서열에 적어도 90% 동일성을 갖거나, 적어도 95% 동일성을 갖거나, 또는 동일한 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열에 적어도 90% 동일성을 갖거나, 적어도 95% 동일성을 갖거나, 또는 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; 서열번호 64에 기재된 아미노산 서열에 적어도 90% 동일성을 갖거나, 적어도 95% 동일성을 갖거나, 또는 동일한 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열에 적어도 90% 동일성을 갖거나, 적어도 95% 동일성을 갖거나, 또는 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; 서열번호 65에 기재된 아미노산 서열에 적어도 90% 동일성을 갖거나, 적어도 95% 동일성을 갖거나, 또는 동일한 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 19에 기재된 아미노산 서열에 적어도 90% 동일성을 갖거나, 적어도 95% 동일성을 갖거나, 또는 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; 서열번호 66에 기재된 아미노산 서열에 적어도 90% 동일성을 갖거나, 적어도 95% 동일성을 갖거나, 또는 동일한 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 20에 기재된 아미노산 서열에 적어도 90% 동일성을 갖거나, 적어도 95% 동일성을 갖거나, 또는 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; 서열번호 67에 기재된 아미노산 서열에 적어도 90% 동일성을 갖거나, 적어도 95% 동일성을 갖거나, 또는 동일한 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 21에 기재된 아미노산 서열에 적어도 90% 동일성을 갖거나, 적어도 95% 동일성을 갖거나, 또는 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; 서열번호 68에 기재된 아미노산 서열에 적어도 90% 동일성을 갖거나, 적어도 95% 동일성을 갖거나, 또는 동일한 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열에 적어도 90% 동일성을 갖거나, 적어도 95% 동일성을 갖거나, 또는 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; 서열번호 69에 기재된 아미노산 서열에 적어도 90% 동일성을 갖거나, 적어도 95% 동일성을 갖거나, 또는 동일한 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열에 적어도 90% 동일성을 갖거나, 적어도 95% 동일성을 갖거나, 또는 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; 그리고 서열번호 70에 기재된 아미노산 서열에 적어도 90% 동일성을 갖거나, 적어도 95% 동일성을 갖거나, 또는 동일한 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열에 적어도 90% 동일성을 갖거나, 적어도 95% 동일성을 갖거나, 또는 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들이 포함된다.
두번째 양상에서, CD27L 항원 결합 단백질은 a) 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 또는 서열번호 70에 기재된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 경쇄 가변 도메인; b) 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 또는 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 중쇄 가변 도메인; 또는 c) a)의 경쇄 가변 도메인 및 b)의 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
두번째 양상의 바람직한 항원 결합 단백질에는 서열번호 63에 기재된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; 서열번호 64에 기재된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; 서열번호 65에 기재된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 19에 기재된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; 서열번호 66에 기재된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 20에 기재된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; 서열번호 67에 기재된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 21에 기재된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; 서열번호 68에 기재된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; 서열번호 69에 기재된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; 그리고 서열번호 70에 기재된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들이 포함된다.
세번째 양상에서, CD27L 항원 결합 단백질은 a) 서열번호 71에 기재된 LCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR1; 서열번호 79에 기재된 LCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR2; 그리고 서열번호 87에 기재된 LCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR3; b) 서열번호 72에 기재된 LCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR1; 서열번호 80에 기재된 LCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR2; 그리고 서열번호 88에 기재된 LCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR3; c) 서열번호 73에 기재된 LCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR1; 서열번호 81에 기재된 LCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR2; 그리고 서열번호 89에 기재된 LCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR3; d) 서열번호 74에 기재된 LCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR1; 서열번호 82에 기재된 LCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR2; 그리고 서열번호 90에 기재된 LCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR3; e) 서열번호 75에 기재된 LCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR1; 서열번호 83에 기재된 LCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR2; 그리고 서열번호 91에 기재된 LCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR3; f) 서열번호 76에 기재된 LCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR1; 서열번호 84에 기재된 LCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR2; 그리고 서열번호 92에 기재된 LCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR3; g) 서열번호 77에 기재된 LCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR1; 서열번호 85에 기재된 LCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR2; 그리고 서열번호 93에 기재된 LCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR3; 또는 h) 서열번호 78에 기재된 LCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR1; 서열번호 86에 기재된 LCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR2; 그리고 서열번호 94에 기재된 LCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인; 그리고 i) 서열번호 25에 기재된 HCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR1; 서열번호 33에 기재된 HCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR2; 그리고 서열번호 41에 기재된 HCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR3; j) 서열번호 26에 기재된 HCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR1; 서열번호 34에 기재된 HCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR2; 그리고 서열번호 42에 기재된 HCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR3; k) 서열번호 27에 기재된 HCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR1; 서열번호 35에 기재된 HCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR2; 그리고 서열번호 43에 기재된 HCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR3; l) 서열번호 28에 기재된 HCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR1; 서열번호 36에 기재된 HCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR2; 그리고 서열번호 44에 기재된 HCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR3; m) 서열번호 29에 기재된 HCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR1; 서열번호 37에 기재된 HCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR2; 그리고 서열번호 45에 기재된 HCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR3; n) 서열번호 30에 기재된 HCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR1; 서열번호 38에 기재된 HCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR2; 그리고 서열번호 46에 기재된 HCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR3; o) 서열번호 31에 기재된 HCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR1; 서열번호 39에 기재된 HCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR2; 그리고 서열번호 47에 기재된 HCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR3; 또는 p) 서열번호 32에 기재된 HCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR1; 서열번호 40에 기재된 HCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR2; 그리고 서열번호 48에 기재된 HCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 내포한다.
세번째 양상의 바람직한 CD27L 항원 결합 단백질에는 a)의 경쇄 가변 도메인 및 i)의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; b)의 경쇄 가변 도메인 및 j)의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; c)의 경쇄 가변 도메인 및 k)의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; d)의 경쇄 가변 도메인 및 l)의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; e)의 경쇄 가변 도메인 및 m)의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; f)의 경쇄 가변 도메인 및 n)의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; g)의 경쇄 가변 도메인 및 o)의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; 그리고 h)의 경쇄 가변 도메인 및 p)의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들이 포함된다.
본 발명의 네번째 양상에서, 첫번째, 두번째, 또는 세번째 양상의 CD27L 항원 결합 단백질은 2 x 10-11 M 이하의 친화성으로 인간 CD27L에 결합한다.
본 발명의 다섯번째 양상에서, 첫번째, 두번째, 세번째, 또는 네번째 양상의 CD27L 항원 결합 단백질은 CD27에 대한 CD27L의 결합을 저해한다.
본 발명의 여섯번째 양상에서, 첫번째, 두번째, 세번째, 네번째, 또는 다섯번째 양상의 CD27L 항원 결합 단백질은 항체, 예를 들면, 인간 항체이다. 바람직한 항체에는 서열번호 56에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체; 서열번호 57에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체; 서열번호 58에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체; 서열번호 59에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체; 서열번호 60에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체; 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 중쇄 번호:15에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체; 그리고 서열번호 62에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 16에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체가 포함된다.
일곱번째 양상에서, 첫번째, 두번째, 세번째, 네번째, 다섯번째, 또는 여섯번째 양상의 CD27L 항원 결합 단백질은 약물 또는 화학치료제에 접합된다. 바람직한 구체예에서, 약물 또는 화학치료제는 링커를 이용하여 항원 결합 단백질, 예를 들면, 항체에 접합된다. 바람직한 링커에는 비-절단가능 링커, 예를 들면, MCC가 포함된다. 바람직한 화학치료제는 DM1이다. 따라서 특히 바람직한 구체예에서, 일곱번째 양상은 하나 이상의 리신 잔기에 부착된 MCC 링커에 의해 DM1에 접합된 첫번째, 두번째, 세번째, 네번째, 다섯번째, 또는 여섯번째 양상의 CD27L 항원 결합 단백질을 제시한다.
DM1을 CD27L 항원 결합 단백질, 예를 들면, 항체에 접합하는 과정은 항체마다 일정한 범위의 DM1 분자를 갖는 DM1-접합된 항체의 집단을 포함하는 조성물을 생산할 것이다. 조성물에 대한 평균 수를 측정하는 것이 가능하다. 바람직한 구체예에서, CD27L 항원 결합 단백질, 예를 들면, 항체마다 DM1 분자의 평균 수는 1 내지 10, 3 내지 7, 또는 4 내지 6이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 첫번째, 두번째, 세번째, 네번째, 다섯번째, 여섯번째, 또는 일곱번째 양상의 CD27L 항원 결합 단백질의 조성물은 CD27L 항원 결합 단백질마다 약 4.0, 약 4.1, 약 4.2, 약 4.3, 약 4.4, 약 4.5, 약 4.6, 약 4.7, 약 4.8, 약 4.9, 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 또는 약 6.0의 DM1 분자의 평균 수를 갖는다. 이런 조성물은 치료 유효량의 CD27L 항원 결합 단백질을 내포할 수 있고, 그리고 동결건조될 수 있다.
여덟번째 양상에서, 본 발명은 CD27L 항원 결합 단백질의 하나 이상의 폴리펩티드 요소, 예를 들면, 항체 경쇄 또는 항체 중쇄를 인코딩하는 단리된 핵산을 제시한다. 바람직한 구체예에서, 핵산은 하기를 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다:
a) 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 또는 서열번호 70에 기재된 아미노산 서열에 적어도 95% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인;
b) 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 또는 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열에 적어도 95% 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 ;
c) 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 또는 서열번호 70에 기재된 아미노산 서열로부터 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 경쇄 가변 도메인;
d) 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 또는 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열로부터 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 중쇄 가변 도메인;
e) 하기를 포함하는 경쇄 가변 도메인:
i) 서열번호 71에 기재된 LCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR1; 서열번호 79에 기재된 LCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR2; 그리고 서열번호 87에 기재된 LCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR3;
ii) 서열번호 72에 기재된 LCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR1; 서열번호 80에 기재된 LCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR2; 그리고 서열번호 88에 기재된 LCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR3;
iii) 서열번호 73에 기재된 LCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR1; 서열번호 81에 기재된 LCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR2; 그리고 서열번호 89에 기재된 LCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR3;
iv) 서열번호 74에 기재된 LCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR1; 서열번호 82에 기재된 LCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR2; 그리고 서열번호 90에 기재된 LCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR3;
v) 서열번호 75에 기재된 LCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR1; 서열번호 83에 기재된 LCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR2; 그리고 서열번호 91에 기재된 LCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR3;
vi) 서열번호 76에 기재된 LCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR1; 서열번호 84에 기재된 LCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR2; 그리고 서열번호 92에 기재된 LCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR3;
vii) 서열번호 77에 기재된 LCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR1; 서열번호 85에 기재된 LCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR2; 그리고 서열번호 93에 기재된 LCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR3; 또는
viii) 서열번호 78에 기재된 LCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR1; 서열번호 86에 기재된 LCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR2; 그리고 서열번호 94에 기재된 LCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR3; 또는
f) 하기를 포함하는 중쇄 가변 도메인:
i) 서열번호 25에 기재된 HCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR1; 서열번호 33에 기재된 HCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR2; 그리고 서열번호 41에 기재된 HCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR3;
ii) 서열번호 26에 기재된 HCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR1; 서열번호 34에 기재된 HCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR2; 그리고 서열번호 42에 기재된 HCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR3;
iii) 서열번호 27에 기재된 HCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR1; 서열번호 35에 기재된 HCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR2; 그리고 서열번호 43에 기재된 HCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR3;
iv) 서열번호 28에 기재된 HCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR1; 서열번호 36에 기재된 HCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR2; 그리고 서열번호 44에 기재된 HCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR3;
v) 서열번호 29에 기재된 HCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR1; 서열번호 37에 기재된 HCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR2; 그리고 서열번호 45에 기재된 HCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR3;
vi) 서열번호 30에 기재된 HCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR1; 서열번호 38에 기재된 HCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR2; 그리고 서열번호 46에 기재된 HCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR3;
vii) 서열번호 31에 기재된 HCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR1; 서열번호 39에 기재된 HCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR2; 그리고 서열번호 47에 기재된 HCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR3; 또는
viii) 서열번호 32에 기재된 HCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR1; 서열번호 40에 기재된 HCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR2; 그리고 서열번호 48에 기재된 HCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR3.
여덟번째 양상의 일정한 구체예에서, 폴리펩티드는 항체 경쇄를 인코딩하고, 그리고 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 또는 서열번호 55에 기재된 뉴클레오티드 서열에 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일하다. 여덟번째 양상의 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 항체 중쇄를 인코딩하고, 그리고 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 또는 서열번호 9에 기재된 뉴클레오티드 서열에 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일하다.
아홉번째 양상에서, 본 발명은 여덟번째 양상의 하나 이상의 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제시한다. 일정한 구체예에서, 발현 벡터는 항체 경쇄, 항체 중쇄, 또는 항체 경쇄와 중쇄 둘 모두를 인코딩한다.
열번째 양상에서, 본 발명은 본 발명의 아홉번째 양상의 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 비롯하여, 프로모터에 작동가능하게 연결된 여덟번째 양상의 하나 이상의 단리된 핵산을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제시한다. 바람직한 구체예에서, 재조합 숙주 세포는 CD27L에 결합하는 항체를 분비한다. 바람직한 숙주 세포는 CHO 세포주를 비롯한 포유류 숙주 세포이다.
열한번째 양상에서, 본 발명은 링커와 약물, 예를 들면, 화학치료제를 첫번째, 두번째, 세번째, 네번째, 다섯번째, 또는 여섯번째 양상의 임의의 CD27L 항원 결합 단백질에 접합함으로써 일곱번째 양상의 CD27L 항체 약물 접합체를 제조하는 방법을 제시한다. 링커와 약물이 먼저 연결되고, 이후 CD27L 항원 결합 단백질에 접합되거나, 또는 링커가 CD27L 항원 결합 단백질에 먼저 접합되고, 이후 약물에 연결될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 링커는 MCC이고, 그리고 약물은 DM1이다. 특히 바람직한 구체예에서, CD27L 항원 결합 단백질은 항체 내에 하나 이상의 리신 잔기를 MCC 또는 MCC-DM1과 화학적으로 반응시킴으로써 MCC에 의해 DM1에 접합된, 서열번호 63에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열번호 17에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 (가령, Ab1), 서열번호 64에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열번호 18에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 (가령, Ab2), 서열번호 65에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열번호 19에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 (가령, Ab3), 서열번호 66에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열번호 20에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 (가령, Ab4), 서열번호 67에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열번호 21에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 (가령, Ab5), 서열번호 68에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열번호 22에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 (가령, Ab6), 서열번호 69에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열번호 23에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 (가령, Ab7), 또는 서열번호 70에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열번호 24에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 (가령, Ab8)이다.
열두번째 양상에서, 본 발명은 첫번째, 두번째, 세번째, 네번째, 다섯번째, 또는 여섯번째 양상의 CD27L 항원 결합 단백질의 치료 유효량을 포함하는 조성물의 치료 유효량을 환자에 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제시한다. 바람직한 구체예에서, CD27L 항원 결합 단백질은 서열번호 63에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열번호 17에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 (가령, Ab1), 서열번호 64에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열번호 18에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 (가령, Ab2), 서열번호 65에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열번호 19에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 (가령, Ab3), 서열번호 66에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열번호 20에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 (가령, Ab4), 서열번호 67에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열번호 21에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 (가령, Ab5), 서열번호 68에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열번호 22에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 (가령, Ab6), 서열번호 69에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열번호 23에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 (가령, Ab7), 또는 서열번호 70에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열번호 24에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 (가령, Ab8)이다. 특히 바람직한 구체예에서, CD27L 항원 결합 단백질은 링커 (MCC)에 의해 화학치료제 (가령, DM1)에 접합된다. 열두번째 양상의 다른 바람직한 구체예에서, 항체는 증강된 작동체(effector) 기능을 포함한다.
일부 구체예에서, CD27L 항원 결합 단백질은 신장 세포 암종 (RCC), 투명 세포 RCC, 두경부 암, 교아종, 유방 암, 뇌종양, 상인두 암종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 급성 림프성 백혈병 (ALL), 만성 림프성 백혈병 (CLL), 버킷 림프종, 미분화성 대세포 림프종 (ALCL), 다발성 골수종, 피부 T-세포 림프종, 결절성 소형 분획 세포(nodular small cleaved-cell) 림프종, 림프구 림프종, 말초 T-세포 림프종, 레너트 림프종, 면역아세포 림프종, T-세포 백혈병/림프종 (ATLL), 성인 T-세포 백혈병 (T-ALL), 중심아세포성/중심세포성 (cb/cc) 여포성 림프종 암, B 계통의 미만성 거대 세포 림프종, 혈관면역아세포성 림프절증 (AILD)-유사 T 세포 림프종, HIV 연관된 체강 기초된 림프종, 태생성 암종, 상인두의 미분화 암종, 캐슬만병, 카포시 육종, 다발성 골수종, 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증 또는 기타 B-세포 림프종을 앓는 환자에 투여된다.
일정한 구체예에서, 환자로부터의 샘플은 CD27L 항원 결합 단백질을 투여하기에 앞서, CD27L 발현에 대해 조사된다. CD27L 발현은 샘플 내에서 CD27L-인코딩 RNA의 존재 또는 CD27L 단백질의 존재에 대해 조사함으로써 결정될 수 있다. 샘플은 혈액 샘플 또는 생검일 수 있다.
열세번째 양상에서, 본 발명은 자가면역 또는 염증 질환을 치료하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 치료가 필요한 환자에 첫번째, 두번째, 세번째, 네번째, 다섯번째, 또는 여섯번째 양상 중에서 임의의 한 가지의 CD27L 항원 결합 단백질의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서, CD27L 항원 결합 단백질은 서열번호 63에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열번호 17에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 (가령, Ab1), 서열번호 64에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열번호 18에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 (가령, Ab2), 서열번호 65에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열번호 19에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 (가령, Ab3), 서열번호 66에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열번호 20에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 (가령, Ab4), 서열번호 67에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열번호 21에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 (가령, Ab5), 서열번호 68에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열번호 22에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 (가령, Ab6), 서열번호 69에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열번호 23에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 (가령, Ab7), 또는 서열번호 70에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열번호 24에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 (가령, Ab8)이다. 바람직한 구체예에서, CD27L 항원 결합 단백질은 CD27L에 대한 CD27의 결합을 저해한다. 특히 바람직한 구체예에서, 자가면역 또는 염증 질환은 전신성 홍반성 낭창 (SLE), 인슐린 의존성 당뇨병 (IDDM), 염증성 장 질환 (IBD), 다발성 경화증 (MS), 건선, 자가면역성 갑상선염, 류머티스성 관절염 (RA), 또는 사구체신염이다. 다른 구체예에서, 치료는 환자에서 이식 거부반응 또는 이식편 대 숙주 질환을 저해하거나 예방한다.
도면의 간단한 설명
도 1. CD27L 항원 결합 단백질의 예시적인 구체예의 기능적 및 물리적 특징의 요약.
도 2. 시간의 흐름에서 786-0 세포 내로 Ab4 (A4)와 Ab8 (A8) 및 이들의 접합된 대응물의 내재화의 수준과 속도의 측정 (A).
도 3. 786-0 세포는 증가하는 농도의 항-스트렙타비딘-MCC-DM1, Ab4-MCC-DM1과 Ab8-MCC-DM1의 존재에서 4일 동안 배양되었다. 세포 성장에 대한 효과는 발광성 판독을 이용하여 세포 수를 측정하는 세포-TITER-GLO 시약을 이용하여 측정되었다.
도 4. 786-0 이종이식편 모델에서 Ab4-MCC-DM1과 Ab8-MCC-DM1의 용량 반응. 24일자에 정맥내 분량은 지시된 분량에서 화살표에 의해 표시된다.
도 5. Caki-1 이종이식편 모델에서 Ab4-MCC-DM1과 Ab8-MCC-DM1의 용량 반응. 정맥내 투약 일정은 화살표에 의해 표시된다.
도 6. Raji 이종이식편 모델에서 Ab4-MCC-DM1의 용량 반응. 정맥내 투약 일정은 화살표에 의해 표시된다.
도 7. 786-0 이종이식편 모델에서 Ab4-MCC-DM1의 가변 용량 반응.
도 8. Raji 종양 세포에 대한 Ab4-MCC-DM1 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC) 검정.
도 9. Raji와 786-0 종양 세포 둘 모두에 대한 Ab4-MCC-DM1 항체 의존성 세포 식작용 (ADCP) 검정.
도 10. 차폐된 IHC에 의해 "양"으로 채점되는 일차 동결된 종양 샘플에 대한 CD27L 발현의 비교. 이들 결과는 전체 CD27L 단백질 발현이 ccRCC 환자 샘플에서 가장 높고, DLBCL (미만성 거대 B-세포 림프종); B-CLL와 FL 샘플이 그 뒤를 잇는다는 것을 지시한다.
도 11. CD27L mRNA와 단백질 발현 분석의 결과. 이들 결과는 RCC, B-NHL과 CLL 세포에서 CD27L 발현의 우세가 나타난다는 것을 지시한다.
도 12. 본원의 실시예 2에서 설명된 Ab-MCC-DM1 ADC의 구조 제시.
바람직한 구체예의 상세한 설명
본원에서 이용된 섹션 제목은 단지 편제를 목적으로 하고 설명된 요부를 한정하는 것으로 해석되지 않는다. 본 명세서 내에서 언급된 모든 참고문헌은 전체로서 참조로서 명시적으로 편입된다.
표준 기술이 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 조직 배양과 형질전환, 단백질 정제 등에 이용될 수 있다. 효소적 반응 및 정제 기술은 제조업체의 명세에 따라 또는 당분야에서 통상적으로 달성되는 바와 같이 또는 본원에서 설명된 바와 같이 수행될 수 있다. 하기 절차와 기술은 일반적으로, 당분야에 널리 공지된 전통적인 방법에 따라, 그리고 명세서 전반에서 언급되고 논의되는 다양한 일반적인 참고문헌과 더욱 특정한 참고문헌에서 설명된 바와 같이 수행될 수 있다. 예로서, Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manuel, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, cold Spring Harbor, N.Y.을 참조하고, 이것은 본원에 순전히 참조로서 편입된다. 특정한 정의가 제공되지 않으면, 본원에서 설명된 분석 화학, 유기 화학, 그리고 의료 화학과 제약 화학과 관련하여 이용된 명명법, 그리고 이들의 실험실 절차와 기술은 당분야에 널리 공지되고 통상적으로 이용되는 것들이다. 표준 기술이 화학적 합성, 화학적 분석, 제약학적 제조, 조제, 그리고 환자의 전달과 치료에 이용될 수 있다.
CD27L
항원 결합 단백질은 CD27L에 결합하는데, 이것은 또한, CD70 및 TNFSF7로서 알려져 있다. CD27L은 US 특허 번호 5,573,924에서 최초 설명되었다. 예시적인 인간 CD27L 아미노산 서열은 본원에서 서열번호 1로서 제공되는데, 이것은 NCBI 참고 서열 NP_001423.1 (GI:4507605)에 상응한다. 일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 CD27L과 이의 수용체 CD27의 상호작용을 차단한다. 예시적인 CD27 아미노산 서열은 서열번호 2로서 제공되는데, 이것은 Swiss-Prot: P26842.2 (GI:269849546)에 상응한다. 성숙 CD27 아미노산 서열은 서열번호 2의 아미노산 20-260에 상응한다.
CD27L 항원 결합 단백질
본 발명은 CD27L에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 제시한다. 항원 결합 단백질의 구체예는 CD27L에 특이적으로 결합하는 펩티드 및/또는 폴리펩티드를 포함한다. 이런 펩티드 또는 폴리펩티드는 하나 이상의 번역후 변형을 선택적으로 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질의 구체예는 CD27L에 특이적으로 결합하는, 본원에서 다양하게 정의된 바와 같은 항체 및 이들의 단편을 포함한다. 이들에는 CD27L이 CD27에 결합하고 및/또는 CD27을 활성화시키는 것을 저해하는 항체를 비롯하여, 인간 CD27L에 특이적으로 결합하는 항체가 포함된다.
본 발명의 항원 결합 단백질은 CD27L에 특이적으로 결합한다. 본원에서 이용된 바와 같이, "특이적으로 결합하는"은 항원 결합 단백질이 다른 단백질에 비하여 CD27L에 우선적으로 결합한다는 것을 의미한다. 일부 구체예에서, "특이적으로 결합하는"은 CD27L 항원 결합 단백질이 다른 단백질보다 CD27L에 대해 더욱 높은 친화성을 갖는다는 것을 의미한다. CD27L에 특이적으로 결합하는 CD27L 항원 결합 단백질은 인간 CD27L에 대해 1 x 10-7 M 이하, 2 x 10-7 M 이하, 3 x 10-7 M 이하, 4 x 10-7 M 이하, 5 x 10-7 M 이하, 6 x 10-7 M 이하, 7 x 10-7 M 이하, 8 x 10-7 M 이하, 9 x 10-7 M 이하, 1 x 10-8 M 이하, 2 x 10-8 M 이하, 3 x 10-8 M 이하, 4 x 10-8 M 이하, 5 x 10-8 M 이하, 6 x 10-8 M 이하, 7 x 10-8 M 이하, 8 x 10-8 M 이하, 9 x 10-8 M 이하, 1 x 10-9 M 이하, 2 x 10-9 M 이하, 3 x 10-9 M 이하, 4 x 10-9 M 이하, 5 x 10-9 M 이하, 6 x 10-9 M 이하, 7 x 10-9 M 이하, 8 x 10-9 M 이하, 9 x 10-9 M 이하, 1 x 10-10 M 이하, 2 x 10-10 M 이하, 3 x 10-10 M 이하, 4 x 10-10 M 이하, 5 x 10-10 M 이하, 6 x 10-10 M 이하, 7 x 10-10 M 이하, 8 x 10-10 M 이하, 9 x 10-10 M 이하, 1 x 10-11 M 이하, 2 x 10-11 M 이하, 3 x 10-11 M 이하, 4 x 10-11 M 이하, 5 x 10-11 M 이하, 6 x 10-11 M 이하, 7 x 10-11 M 이하, 8 x 10-11 M 이하, 9 x 10-11 M 이하, 1 x 10-12 M 이하, 2 x 10-12 M 이하, 3 x 10-12 M 이하, 4 x 10-12 M 이하, 5 x 10-12 M 이하, 6 x 10-12 M 이하, 7 x 10-12 M 이하, 8 x 10-12 M 이하, 또는 9 x 10-12 M 이하의 결합 친화성을 가질 수 있다. 항원 결합 단백질의 결합 친화성을 측정하는 방법은 당분야에 널리 알려져 있다. 실시예 1은 예시적인 방법을 제공한다.
본원에서 CD27L-결합 항체의 다양한 구체예가 언급될 때, 이것은 이들의 CD27L-결합 단편을 포괄하는 것으로 이해된다. CD27L-결합 단편은 CD27L에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 본원에서 설명된 임의의 항체 단편 또는 도메인을 포함한다. CD27L-결합 단편은 본원에서 설명된 임의의 골격 내에 있을 수 있다.
일정한 치료적 구체예에서, CD27L 항원 결합 단백질은 CD27에 대한 CD27L의 결합을 저해하고 및/또는 CD27에 대한 CD27L의 결합과 연관된 하나 이상의 생물학적 활성, 예를 들면, CD27-매개된 신호전달을 저해한다. 이런 항원 결합 단백질은 "중화"인 것으로 일컬어진다. 일정한 구체예에서, 중화 CD27L 항원 결합 단백질은 CD27L에 특이적으로 결합하고, 그리고 CD27에 대한 CD27L의 결합을 대략 10% 내지 100%, 예를 들면, 적어도 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 또는 그 이상 저해한다. 가령, CD27L 항원 결합 단백질은 MP-1 세포에 CD27-Fc의 결합을 차단하는 항원 결합 단백질의 능력을 결정함으로써 중화 능력에 대해 조사될 수 있다 (Slack et al, Int. Immunol. (1995) 7(7): 1087-1092)).
항원 결합 단백질의 구체예는 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDRs)을 갖는, 본원에서 다양하게 정의된 바와 같은 골격 구조를 포함한다. 구체예는 무거운 또는 가벼운 하나 이상의 항체 가변 도메인을 갖는 골격 구조를 포함하는 항원 결합 단백질을 더 포함한다. 구체예에는 Ab1 경쇄 가변 도메인 (LCv), Ab2 LCv, Ab3 LCv, Ab4 LCv, Ab5 LCv, Ab6 LCv, Ab7 LCv, 그리고 Ab8 LCv (각각 서열번호 63-70)로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 가변 도메인 및/또는 Ab1 중쇄 가변 도메인 (HCv), Ab2 HCv, Ab3 HCv, Ab4 HCv, Ab5 HCv, Ab6 HCv, Ab7 HCv, 그리고 Ab8 HCv (각각 서열번호 17-24)로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 그리고 이들의 단편, 유도체, 뮤테인, 그리고 변이체가 포함된다.
Ab1 LCv를 포함하는 예시적인 경쇄는 서열번호 56에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄이다.
Ab2 LCv를 포함하는 예시적인 경쇄는 서열번호 57에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄이다.
Ab4 LCv를 포함하는 예시적인 경쇄는 서열번호 58에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄이다.
Ab5 LCv를 포함하는 예시적인 경쇄는 서열번호 59에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄이다.
Ab6 LCv를 포함하는 예시적인 경쇄는 서열번호 60에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄이다.
Ab7 LCv를 포함하는 예시적인 경쇄는 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄이다.
Ab8 LCv를 포함하는 예시적인 경쇄는 서열번호 62에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄이다.
Ab1 HCv를 포함하는 예시적인 중쇄는 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄이다.
Ab2 HCv를 포함하는 예시적인 중쇄는 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄이다.
Ab4 HCv를 포함하는 예시적인 중쇄는 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄이다.
Ab5 HCv를 포함하는 예시적인 중쇄는 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄이다.
Ab6 HCv를 포함하는 예시적인 중쇄는 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄이다.
Ab7 HCv를 포함하는 예시적인 중쇄는 서열번호 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄이다.
Ab8 HCv를 포함하는 예시적인 중쇄는 서열번호 16에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄이다.
구상되는 골격의 추가적인 실례에는 피브로넥틴, 네오카르지노스타틴 CBM4-2, 리포칼린, T-세포 수용체, 단백질-A 도메인 (단백질 Z), Im9, TPR 단백질, 아연 핑거 도메인, pVIII, 조류 췌장 폴리펩티드, GCN4, WW 도메인 Src 상동성 도메인 3, PDZ 도메인, TEM-1 베타-락타마아제, 티오레독신, 스타필로코커스 뉴클레아제, PHD-핑거 도메인, CL-2, BPTI, APPI, HPSTI, 에코틴, LACI-D1, LDTI, MTI-II, 전갈 독소, 곤충 디펜신-A 펩티드, EETI-II, Min-23, CBD, PBP, 시토크롬 b-562, Ldl 수용체 도메인, 감마-크리스탈린, 유비퀴틴, 트랜스페린, 그리고 또는 C-타입 렉틴-유사 도메인이 포함된다. 비-항체 골격 및 치료제로서 이들의 용도는 Gebauer and Skerra, Curr. Opin. Chem. Biol., 13:245-255 (2009) 및 Binz et al., Nat. Biotech., 23(10):1257-1268 (2005)에서 검토되고, 이들은 본원에 전체로서 참조로서 편입된다.
본 발명의 양상에는 하기 가변 도메인을 포함하는 항체가 포함된다: Ab1 LCv/Ab1 HCv (서열번호 63/서열번호 17), Ab2 LCv/Ab2 HCv (서열번호 64/서열번호 18), Ab3 LCv/Ab3 HCv (서열번호 65/서열번호 19), Ab4 LCv/Ab4 HCv (서열번호 66/서열번호 20), Ab5 LCv/Ab5 HCv (서열번호 67/서열번호 21), Ab6 LCv/Ab6 HCv (서열번호 68/서열번호 22), Ab7 LCv/Ab7 HCv (서열번호 69/서열번호 23), Ab8 LCv/Ab8 HCv (서열번호 70/서열번호 24), 그리고 이들의 조합뿐만 아니라 이들의 단편, 유도체, 뮤테인과 변이체.
본 발명의 예시적인 항체에는 Ab1 (서열번호 56/서열번호 10), Ab2 (서열번호 57/서열번호 11), Ab4 (서열번호 58/서열번호 12), Ab5 (서열번호 59/서열번호 13), Ab6 (서열번호 60/서열번호 14), Ab7 (서열번호 61/서열번호 15), Ab8 (서열번호 62/서열번호 16)이 포함된다.
전형적으로, 항체 경쇄 또는 중쇄의 각 가변 도메인은 3개의 CDR을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은 중쇄 CDR1 (HCDR1), 중쇄 CDR2 (HCDR2), 그리고 중쇄 CDR3 (HCDR3)을 포함한다. 경쇄 가변 도메인은 경쇄 CDR1 (LCDR1), 경쇄 CDR2 (LCDR2), 그리고 경쇄 CDR3 (LCDR3)을 포함한다. 일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 본원에서 설명된 바람직한 가변 도메인에 내포된 하나 이상의 CDR을 포함한다.
이런 CDR의 실례에는 하기가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다:
Ab1 LCv의 CDR: LCDR1 (서열번호 71), LCDR2 (서열번호 79), 그리고 LCDR3 (서열번호 87);
Ab2 LCv의 CDR: LCDR1 (서열번호 72), LCDR2 (서열번호 80), 그리고 LCDR3 (서열번호 88);
Ab3 LCv의 CDR: LCDR1 (서열번호 73), LCDR2 (서열번호 81), 그리고 LCDR3 (서열번호 89);
Ab4 LCv의 CDR: LCDR1 (서열번호 74), LCDR2 (서열번호 82), 그리고 LCDR3 (서열번호 90);
Ab5 LCv의 CDR: LCDR1 (서열번호 75), LCDR2 (서열번호 83), 그리고 LCDR3 (서열번호 91);
Ab6 LCv의 CDR: LCDR1 (서열번호 76), LCDR2 (서열번호 84), 그리고 LCDR3 (서열번호 92);
Ab7 LCv의 CDR: LCDR1 (서열번호 77), LCDR2 (서열번호 85), 그리고 LCDR3 (서열번호 93);
Ab8 LCv의 CDR: LCDR1 (서열번호 78), LCDR2 (서열번호 86), 그리고 LCDR3 (서열번호 94);
Ab1 HCv의 CDR: HCDR1 (서열번호 25), HCDR2 (서열번호 33), 그리고 HCDR3 (서열번호 41);
Ab2 HCv의 CDR: HCDR1 (서열번호 26), HCDR2 (서열번호 34), 그리고 HCDR3 (서열번호 42);
Ab3 HCv의 CDR: HCDR1 (서열번호 27), HCDR2 (서열번호 35), 그리고 HCDR3 (서열번호 43);
Ab4 HCv의 CDR: HCDR1 (서열번호 28), HCDR2 (서열번호 36), 그리고 HCDR3 (서열번호 44);
Ab5 HCv의 CDR: HCDR1 (서열번호 29), HCDR2 (서열번호 37), 그리고 HCDR3 (서열번호 45);
Ab6 HCv의 CDR: HCDR1 (서열번호 30), HCDR2 (서열번호 38), 그리고 HCDR3 (서열번호 46);
Ab7 HCv의 CDR: HCDR1 (서열번호 31), HCDR2 (서열번호 39), 그리고 HCDR3 (서열번호 47); 그리고
Ab8 HCv의 CDR: HCDR1 (서열번호 32), HCDR2 (서열번호 40), 그리고 HCDR3 (서열번호 48).
일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 A) 서열번호 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 그리고 78로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR1; 서열번호 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 그리고 86로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR2; 및/또는 서열번호 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 그리고 94로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함하는 폴리펩티드, 예를 들면, 경쇄; 및/또는 B) 서열번호 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 그리고 32로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR1; 서열번호 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 그리고 40으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR2; 및/또는 서열번호 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 그리고 48로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR3을 포함하는 폴리펩티드, 예를 들면, 중쇄를 포함한다.
추가의 구체예에서, 항원 결합 단백질은 A) Ab1 LCv, Ab2 LCv, Ab3 LCv, Ab4 LCv, Ab5 LCv, Ab6 LCv, Ab7 LCv, 그리고 Ab8 LCv 중에서 한 가지의 LCDR1, LCDR2, 그리고 LCDR3을 포함하는 경쇄 아미노산 서열, 그리고 B) Ab1 HCv, Ab2 HCv, Ab3 HCv, Ab4 HCv, Ab5 HCv, Ab6 HCv, Ab7 HCv, 그리고 Ab8 HCv 중에서 한 가지의 HCDR1, HCDR2, 그리고 HCDR3을 포함하는 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.
일정한 구체예에서, 이들 CDR은 본원에 기재된 예시적인 CDR로부터 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 또는 6개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 포함한다.
본 발명의 양상에는 서열번호 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 그리고 70으로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체가 포함된다. 본 발명의 양상에는 서열번호 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 그리고 24로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체가 포함된다. 본 발명의 추가의 양상에는 A) 서열번호 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 그리고 70으로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 가변 도메인, 그리고 B) 서열번호 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 그리고 24로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체가 포함된다.
본 발명의 항체는 당분야에 공지된 임의의 불변 영역을 포함할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 예로서, 카파- 또는 람다-유형 경쇄 불변 영역, 예를 들면, 인간 카파- 또는 람다-유형 경쇄 불변 영역일 수 있다. 중쇄 불변 영역은 예로서, 알파-, 델타-, 엡실론-, 감마-, 또는 뮤-유형 중쇄 불변 영역, 예를 들면, 인간 알파-, 델타-, 엡실론-, 감마-, 또는 뮤-유형 중쇄 불변 영역일 수 있다. 한 구체예에서, 경쇄 또는 중쇄 불변 영역은 자연 발생 불변 영역의 단편, 유도체, 변이체, 또는 뮤테인이다.
본 발명의 양상에는 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하, 또는 10개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는, 서열번호 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 그리고 70로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체가 포함된다. 본 발명의 양상에는 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하, 또는 10개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는, 서열번호 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 그리고 24로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체가 포함된다. 본 발명의 추가의 양상에는 A) 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하, 또는 10개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는, 서열번호 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 그리고 70으로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 가변 영역, 그리고 B) 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하, 또는 10개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는, 서열번호 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 그리고 24로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체가 포함된다. 가령, 일정한 예시적인 구체예에서, 항체는 하기를 포함한다: 1) 서열번호 66에 기재된 경쇄 가변 도메인의 변이체, 여기서 위치 51에서 페닐알라닌은 류신으로 돌연변이되고 및/또는 위치 105에서 프롤린은 글리신 또는 글루타민으로 돌연변이되고; 2) 서열번호 20에 기재된 중쇄 가변 도메인의 변이체, 여기서 위치 1에서 글루타민은 글루타민산으로 돌연변이되고 및/또는 위치 16에서 아르기닌은 글리신으로 돌연변이되고; 또는 서열번호 66에 기재된 경쇄 가변 도메인의 변이체, 여기서 위치 51에서 페닐알라닌은 류신으로 돌연변이되고 및/또는 위치 105에서 프롤린은 글리신 또는 글루타민으로 돌연변이되고, 그리고 서열번호 20에 기재된 중쇄 가변 도메인의 변이체, 여기서 위치 1에서 글루타민은 글루타민산으로 돌연변이되고 및/또는 위치 16에서 아르기닌은 글리신으로 돌연변이된다.
한 변형에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 그리고 70으로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 변형에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 그리고 24로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 추가의 구체예에서, 항원 결합 단백질은 A) 서열번호 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 그리고 70으로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열, 그리고 B) 서열번호 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 그리고 24로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 경쇄 및/또는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 그리고 48에 기재된 서열의 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, 아미노산 서열은 서열번호 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 그리고 48에 기재된 예시적인 서열로부터 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 또는 6개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 포함한다. 따라서 본 발명의 구체예에는 서열번호 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 그리고 48에 기재된 서열의 군에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단백질이 포함된다.
일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 경쇄 및/또는 중쇄 CDR2를 포함한다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 그리고 40에 기재된 서열의 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, 아미노산 서열은 서열번호 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 그리고 40에 기재된 예시적인 서열로부터 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 또는 6개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 내포한다. 따라서 본 발명의 구체예에는 서열번호 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 그리고 40에 기재된 서열의 군에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단백질이 포함된다.
일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 경쇄 및/또는 중쇄 CDR1을 포함한다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 그리고 32에 기재된 서열의 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, 아미노산 서열은 서열번호 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 그리고 32에 기재된 예시적인 서열로부터 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 또는 6개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 포함한다. 따라서 본 발명의 구체예에는 서열번호 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 그리고 32에 기재된 서열의 군에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단백질이 포함된다.
본 발명의 항원 결합 단백질은 인간과 단일클론 항체, 이중특이적 항체, 디아바디, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체 (때때로, 본원에서 "항체 모방체"로 지칭됨), 키메라 항체, 항체 융합체 (때때로, "항체 접합체"), 그리고 각각의 단편을 비롯한 전통적인 항체의 골격을 포함한다. CDR의 다양한 조합을 비롯한 전술한 CDR은 하기 골격 중에서 한 가지 내로 접합될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "항체"는 본원에서 다양하게 설명된 바와 같이, 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 다양한 형태의 단위체 또는 다합체 단백질을 지칭한다. 일정한 구체예에서, 항체는 재조합 DNA 기술에 의해 생산된다. 추가의 구체예에서, 항체는 자연 발생 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산된다. 다른 양상에서, 항체는 a) 인간 항체; b) 인간화 항체; c) 키메라 항체; d) 단일클론 항체; e) 다중클론 항체; f) 재조합 항체; g) 항원-결합 단편; h) 단일 사슬 항체; i) 디아바디; j) 트리아바디, k) 테트라바디, l) Fab 단편; m) F(ab')2 단편, n) IgA 항체, o) IgD 항체, p) IgE 항체, q) IgG1 항체, r) IgG2 항체, s) IgG3 항체, t) IgG4 항체, 그리고 u) IgM 항체로 구성된 군에서 선택된다.
가변 영역은 뼈대 영역 (뼈대 영역 FR1, FR2, FR3, 그리고 FR4로 명명됨) 내에 박힌 적어도 3개의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함한다. Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD. 전통적인 항체 구조 단위는 전형적으로, 사합체를 포함한다. 각 사합체는 전형적으로, 폴리펩티드 사슬의 2개의 동일한 쌍으로 구성되고, 각 쌍은 1개의 "경쇄" 및 1개의 "중쇄"를 갖는다. 각 사슬의 아미노-말단 부분은 항원 인식을 일차적으로 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각 사슬의 카르복시-말단 부분은 작동체 기능을 일차적으로 담당하는 불변 영역을 정의한다. 인간 경쇄는 카파 또는 람다 경쇄로 분류된다. 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로 분류되고, 그리고 항체의 아이소타입을 각각, IgM, IgD, IgG, IgA, 그리고 IgE로서 정의한다. IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, 그리고 IgG4가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 몇몇 하위부류를 갖는다. IgM은 IgM1과 IgM2가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 하위부류를 갖는다. 본 발명의 구체예에는 본원에서 설명된 바와 같이, 항원 결합 단백질의 가변 도메인 또는 CDR을 통합하는 이와 같은 모든 부류와 하위부류의 항체를 포함한다.
일부 자연 발생 항체, 예를 들면, 낙타와 야마에서 발견되는 것들은 2개의 중쇄로 구성되는 이합체이고 경쇄를 포함하지 않는다. 본 발명은 CD27L에 결합할 수 있는, 2개의 중쇄 또는 이들의 단편의 이합체성 항체를 포괄한다.
중쇄와 경쇄의 가변 영역은 전형적으로, 3개의 초가변 영역, 다시 말하면, 상보성 결정 영역 또는 CDR에 의해 연결된 상대적으로 보존된 뼈대 영역 (FR)의 동일한 일반 구조를 보인다. 이들 CDR은 항원 인식과 결합을 일차적으로 담당한다. 각 쌍의 두 사슬로부터 CDR은 뼈대 영역에 의해 정렬되고, 특정 에피토프에 결합을 가능하게 한다. N-말단에서부터 C-말단까지, 경쇄와 중쇄 둘 모두 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 그리고 FR4을 포함한다. 각 도메인에 아미노산의 배정은 Kabat 정의에 따른다.
CDR은 항원 결합을 위한 주요 표면 접점(surface contact point)을 구성한다. 경쇄의 CDR3 및, 특히 중쇄의 CDR3은 경쇄와 중쇄 가변 영역 내에 항원 결합에서 가장 중요한 결정기를 구성할 수 있다. 일부 항체에서, 중쇄 CDR3은 항원과 항체 사이에 주요 접촉 구역을 구성하는 것으로 보인다. CDR3만 변경되는 시험관내 선별 계획이 항체의 결합 성질을 변화시키거나 또는 어떤 잔기가 항원의 결합에 기여하는 지를 결정하는데 이용될 수 있다.
자연 발생 항체는 전형적으로, 신호 서열을 포함하는데, 이것은 항체를 단백질 분비를 위한 세포 경로로 지향시키고 전형적으로, 성숙 항체 내에 존재하지 않는다. 본 발명의 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하기에 설명된 바와 같이, 자연 발생 신호 서열 또는 이종기원성 신호 서열을 인코딩할 수 있다.
한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 본원에서 설명된 예시적인 CDR 중에서 1개 내지 6개를 포함하는 항체이다. 본 발명의 항체는 IgM, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 포함), IgD, IgA, 또는 IgE 항체를 비롯한 임의의 유형일 수 있다. 특정한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 IgG 타입 항체, 예를 들면, IgG1 항체이다.
일부 구체예에서, 예로서 항원 결합 단백질이 완전한 중쇄와 경쇄를 갖는 항체일 때, CDR 모두 동일한 종, 예를 들면, 인간으로부터 유래된다. 대안으로, 예로서 항원 결합 단백질이 앞서 개설된 서열로부터 6개 이하의 CDR을 내포하는 구체예에서, 추가의 CDR은 다른 종으로부터 유래되거나 또는 예시적인 서열에서 묘사된 것들과 상이한 인간 CDR일 수 있다. 가령, 본원에서 확인된 적절한 서열로부터 HCDR3과 LCDR3 영역이 이용될 수 있고, HCDR1, HCDR2, LCDR1, 그리고 LCDR2는 대안적 종 또는 상이한 인간 항체 서열, 또는 이들의 조합으로부터 선택적으로 선별될 수 있다. 가령, 본 발명의 CDR은 상업적으로 적절한 키메라 또는 인간화 항체의 CDR 영역을 대체할 수 있다.
특정한 구체예는 인간 요소인 항원 결합 단백질의 골격 요소를 이용한다. 일부 구체예에서, 하지만, 골격 요소는 상이한 종으로부터 혼합물일 수 있다. 따라서 항원 결합 단백질이 항체이면, 이런 항체는 키메라 항체 및/또는 인간화 항체일 수 있다. 일반적으로, "키메라 항체"와 "인간화 항체" 둘 모두 하나 이상의 종으로부터 영역을 합동하는 항체를 지칭한다. 가령, "키메라 항체"는 전통적으로, 생쥐 (또는 일부 경우에 쥐)로부터 가변 영역(들) 및 인간으로부터 불변 영역(들)을 포함한다.
"인간화 항체"는 일반적으로, 인간 항체에서 발견되는 항체에 대해 교체된 가변 도메인 뼈대 영역을 갖는 비-인간 항체를 지칭한다. 일반적으로, 인간화 항체에서, 하나 이상의 CDR을 제외하고 전체 항체는 인간 기원의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되고 또는 하나 이상의 CDR을 제외하고, 이런 항체와 동일하다. 일부 또는 전부가 비-인간 생물체에서 기원하는 핵산에 의해 인코딩되는 이들 CDR은 항체를 산출하기 위해 인간 항체 가변 영역의 베타-시트 뼈대 내로 이식되고, 이의 특이성은 이식된 CDR에 의해 결정된다. 이런 항체의 산출은 예로서, WO 92/11018, Jones 1986, Nature 321:522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536에서 설명된다. 인간화 항체는 또한, 유전자 조작된 면역계를 갖는 생쥐를 이용하여 산출될 수 있다. Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654. 본원에서 설명된 예시적인 구체예에서, 확인된 CDR은 인간적이고, 그리고 따라서 이러한 맥락에서 인간화 항체와 키메라 항체 둘 모두 일부 비-인간 CDR을 포함한다; 가령, HCDR3과 LCDR3 영역을 포함하고, 다른 CDR 영역 중에서 하나 이상이 상이한 종으로부터 기원하는 인간화 항체가 산출될 수 있다.
한 구체예에서, CD27L 항원 결합 단백질은 다중특이적 항체, 그리고 그 중에서도 특히, "디아바디"로 때때로 지칭되는 이중특이적 항체이다. 이들은 2개 또는 그 이상의 상이한 항원 또는 단일 항원 상에서 상이한 에피토프에 결합하는 항체이다. 일정한 구체예에서, 이중특이적 항체는 CD27L 및 인간 작동체 세포 (가령, T 세포) 상에서 항원에 결합한다. 이런 항체는 작동체 세포 반응을 CD27L 발현 세포, 예를 들면, 종양 세포로 표적화하는데 유용하다. 바람직한 구체예에서, 인간 작동체 세포 항원은 CD3이다. U.S. 특허 번호 7,235,641. 이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당분야에 알려져 있다. 이와 같은 한 가지 방법은 세포에서 공동-발현될 때 중쇄의 이형이합체 형성을 조장하는 "손잡이"와 "구멍"을 산출하기 위해 중쇄의 Fc 부분을 가공하는 것을 수반한다. U.S. 7,695,963. 다른 방법은 또한, 중쇄의 Fc 부분을 가공하는 것을 수반하지만, 세포에서 공동-발현될 때 중쇄의 동종이합체 형성을 방해하면서 이형이합체 형성을 장려하기 위해 정전기 스티어링 (electrostatic steering)을 이용한다. WO 09/089,004, 이것은 본원에 전체로서 참조로서 편입된다.
한 구체예에서, CD27L 항원 결합 단백질은 미니바디이다. 미니바디는 CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 최소화된 항체-유사 단백질이다. Hu et al., 1996, Cancer Res. 56:3055-3061.
한 구체예에서, CD27L 항원 결합 단백질은 도메인 항체이다; 예로서, U.S. 특허 번호 6,248,516을 참조한다. 도메인 항체 (dAbs)는 인간 항체의 중쇄 (VH) 또는 경쇄 (VL)의 가변 영역에 상응하는, 항체의 기능적 결합 도메인이다. dAB는 대략 13 kDa의 분자량을 갖거나, 또는 완전 항체의 크기의 1/10 이하이다. dAB는 세균, 효모, 그리고 포유류 세포 시스템을 비롯한 다양한 숙주에서 잘 발현된다. 이에 더하여, dAb는 가혹한 조건, 예를 들면, 냉동-건조 또는 열 변성에 종속된 이후에도 매우 안정되고 활성을 유지한다. 예로서, US 특허 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; US 일련 번호 2004/0110941; 유럽 특허 0368684; US 특허 6,696,245, WO04/058821, WO04/003019 및 WO03/002609를 참조한다.
한 구체예에서, CD27L 항원 결합 단백질은 항체 단편, 다시 말하면, CD27L에 결합 특이성을 유지하는 본원에서 개설된 임의의 항체의 단편이다. 다양한 구체예에서, 항체 결합 단백질은 F(ab), F(ab'), F(ab')2, Fv, 또는 단일 사슬 Fv 단편을 포함하지만 이들에 국한되지 않는다. 최소한, 본원에서 의도되는 항체는 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 전부 또는 일부, 예를 들면, 하나 이상의 CDR을 포함하는, CD27L에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드를 포함한다.
CD27L-결합 항체 단편의 추가의 실례에는 (i) VL, VH, CL과 CH1 도메인으로 구성되는 Fab 단편, (ii) VH와 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 단편, (iii) 단일 항체의 VL과 VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편; (iv) 단일 가변으로 구성되는 dAb 단편 (Ward et al., 1989, Nature 341:544-546), (v) 단리된 CDR 영역, (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 이가 단편인 F(ab')2 단편, (vii) 단일 사슬 Fv 분자 (scFv), 여기서 VH 도메인과 VL 도메인은 이들 두 도메인이 연합하여 항원 결합 부위를 형성할 수 있도록 하는 펩티드 링커에 의해 연결된다 (Bird et al., 1988, Science 242:423-426, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883), (viii) 이중특이적 단일 사슬 Fv 이합체 (PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 작제된 다가 또는 다중특이적 단편인 "디아바디" 또는 "트리아바디" (Tomlinson et. al., 2000, Methods Enzymol. 326:461-479; WO94/13804; Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 항체 단편은 변형될 수 있다. 가령, 이들 분자는 VH와 VL 도메인을 연결하는 이황화 가교 (disulphide bridge)의 통합에 의해 안정될 수 있다 (Reiter et al., 1996, Nature Biotech. 14:1239-1245). 본 발명의 양상은 이들 단편의 비-CDR 요소가 인간 서열인 구체예를 포함한다.
한 구체예에서, CD27L 항원 결합 단백질은 완전 인간 항체이다. 이러한 구체예에서, 전술한 바와 같이, 특정 구조는 CDR 영역을 포함하는 묘사된 완전한 중쇄와 경쇄를 포함한다. 추가의 구체예는 본 발명의 하나 이상의 CDR을 이용하고, 다른 CDR, 뼈대 영역, J와 D 영역, 불변 영역 등은 다른 인간 항체로부터 유래된다. 가령, 본 발명의 CDR은 다수의 인간 항체, 특히 상업적으로 적절한 항체의 CDR을 대체할 수 있다.
단일 사슬 항체는 아미노산 가교 (짧은 펩티드 링커)를 거쳐 중쇄와 경쇄 가변 도메인 (Fv 영역) 단편을 연결하여 단일 폴리펩티드 사슬을 산출함으로써 형성될 수 있다. 이런 단일 사슬 Fv (scFvs)는 2개의 가변 도메인 폴리펩티드 (VL과 VH)를 인코딩하는 DNA 사이에, 펩티드 링커를 인코딩하는 DNA를 융합함으로써 제조되었다. 결과의 폴리펩티드는 둘로 되접힘되어 항원-결합 단위체를 형성할 수 있고, 또는 이들은 두 가변 도메인 사이에 유연성 링커의 길이에 따라, 다합체 (가령, 이합체, 삼합체, 또는 사합체)를 형성할 수 있다 (Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10:423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18:95-108). 상이한 VL과 VH-포함 폴리펩티드를 합동함으로써, 상이한 에피토프에 결합하는 다합체 scFv를 형성할 수 있다 (Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18:31-40). 단일 사슬 항체의 생산을 위해 개발된 기술에는 U.S. 특허 번호 4,946,778; Bird, 1988, Science 242:423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879; Ward et al., 1989, Nature 334:544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol. 178:379-87에서 설명된 것들이 포함된다. 본원에서 제시된 항체로부터 유래된 단일 사슬 항체 (Ab1 LCv/Ab1 HCv (서열번호 63/서열번호 17), Ab2 LCv/Ab2 HCv (서열번호 64/서열번호 18), Ab3 LCv/Ab3 HCv (서열번호 65/서열번호 19), Ab4 LCv/Ab4 HCv (서열번호 66/서열번호 20), Ab5 LCv/Ab5 HCv (서열번호 67/서열번호 21), Ab6 LCv/Ab6 HCv (서열번호 68/서열번호 22), Ab7 LCv/Ab7 HCv (서열번호 69/서열번호 23), Ab8 LCv/Ab8 HCv (서열번호 70/서열번호 24)의 가변 도메인 조합을 포함하는 scFv이 포함되지만 이들에 국한되지 않음), 그리고 이들의 조합은 본 발명에 포함된다.
한 구체예에서, CD27L 항원 결합 단백질은 항체 융합 단백질 (본원에서 때때로 "항체 접합체"로 지칭됨)이다. 접합체 상대는 단백질성 또는 비-단백질성일 수 있다; 후자는 일반적으로, 항원 결합 단백질 및 접합체 상대 상에서 기능기를 이용하여 산출된다. 일정한 구체예에서, 항체는 비-단백질성 화학물질 (약물)에 접합되어 항체 약물 접합체를 형성한다. 이런 접합체를 만드는 예시적인 항체 약물 접합체와 방법은 하기에 논의된다.
한 구체예에서, CD27L 항원 결합 단백질은 때때로 "합성 항체"로 지칭되는 항체 유사체이다. 가령, 다양한 창작물은 이식된 CDR을 갖는 대안적 단백질 골격 또는 인공 골격을 이용한다. 이런 골격에는 결합 단백질의 3-차원 구조를 안정시키기 위해 도입된 돌연변이뿐만 아니라 예로서 생물적합성 중합체로 구성되는 완전 합성 골격이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 예로서 Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, Volume 53, Issue 1:121-129. Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654를 참조한다. 이에 더하여, 펩티드 항체 모방체 ("PAMs")뿐만 아니라 피브로넥션 (fibronection) 요소를 골격으로서 이용한 항체 모방체에 기초된 창작물이 이용될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "단백질"은 적어도 2개의 공유 부착된 아미노산을 의미하고, 이것은 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드와 펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 이들 2개 또는 그 이상의 공유 부착된 아미노산은 펩티드 결합에 의해 부착된다. 단백질은 이러한 단백질이 예로서, 하기에 개설된 바와 같이, 발현 시스템 및 숙주 세포를 이용하여 재조합 방식으로 만들어질 때 자연 발생 아미노산 및 펩티드 결합으로 구성될 수 있다. 대안으로, 단백질은 합성 아미노산 (가령, 동종페닐알라닌, 시트룰린, 오르니틴, 그리고 노르류신), 또는 펩티드모방체 구조, 다시 말하면, "펩티드 또는 단백질 유사체", 예를 들면, 펩토이드 (예로서, 본원에 참조로서 편입되는 Simon et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:9367)을 포함할 수 있는데, 이들은 프로테아제 또는 기타 생리학적 및/또는 보관 조건에 저항할 수 있다. 이런 합성 아미노산은 특히, 항원 결합 단백질이 당분야에 널리 공지된 전통적인 방법에 의해 시험관내에서 합성될 때, 통합될 수 있다. 이에 더하여, 펩티드모방체, 합성과 자연 발생 잔기/구조의 임의의 조합이 이용될 수 있다. "아미노산"은 또한, 이미노 산성 잔기, 예를 들면, 프롤린과 히드록시프롤린을 포함한다. 아미노산 "R 기" 또는 "측쇄"는 (L)- 또는 (S)-형태일 수 있다. 특정한 구체예에서, 아미노산은 (L)- 또는 (S)-형태이다.
일정한 양상에서, 본 발명은 CD27L 및 일부 구체예에서, 재조합 인간 CD27L 또는 이의 일부분에 결합하는 재조합 항원 결합 단백질을 제시한다. 이러한 문맥에서, "재조합 단백질"은 당분야에 공지된 임의의 기술과 방법에 의해, 다시 말하면, 본원에서 설명된 바와 같은 재조합 핵산의 발현을 통해 재조합 기술을 이용하여 만들어진 단백질이다. 재조합 단백질의 생산을 위한 방법과 기술은 당분야에 널리 알려져 있다. 본 발명의 구체예는 야생형 CD27L 및 이의 변이체에 결합하는 재조합 항원 결합 단백질을 포함한다.
"본질적으로 구성되는"은 아미노산 서열이 기재된 서열번호 서열에 비하여 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15% 변할 수 있고, 그리고 본원에서 설명된 바와 같이, 생물학적 활성을 여전히 유지한다는 것을 의미한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 단리된 단백질 또는 실질적으로 순수한 단백질이다. "단리된" 단백질은 이것이 자연 상태에서 정상적으로 연관되는, 예를 들면, 소정의 샘플에서 전체 단백질의 중량으로 적어도 약 5%, 또는 적어도 약 50%를 구성하는 물질의 적어도 일부를 동반하지 않는다. 단리된 단백질은 상황에 따라, 총 단백질 함량의 중량으로 5 내지 99.9%를 구성할 수 있는 것으로 이해된다. 가령, 단백질은 이러한 단백질이 증가된 농도 수준에서 만들어지도록, 유도성 프로모터 또는 높은 발현 프로모터의 이용을 통해 훨씬 높은 농도에서 만들어질 수 있다. 상기 정의는 당분야에 공지된 매우 다양한 생물체 및/또는 숙주 세포에서 항원 결합 단백질의 생산을 포함한다.
아미노산 서열의 경우에, 서열 동일성 및/또는 유사성은 가급적 디폴트 설정을 이용한 Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482의 국부 서열 동일성 알고리즘, Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443의 서열 동일성 정렬 알고리즘, Pearson and Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444의 유사성 방법에 대한 검색, 이들 알고리즘의 전산화된 실행 (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.에서 GAP, BESTFIT, FASTA, 그리고 TFASTA), Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387-395에 의해 설명된 Best Fit 서열 프로그램이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 당분야에 공지된 표준 기술을 이용함으로써, 또는 조사에 의해 결정된다. 바람직하게는, 퍼센트 동일성은 하기 파라미터에 기초된 FastDB에 의해 계산된다: 1의 미스매치 페널티 (mismatch penalty); 1의 갭 페널티 (gap penalty); 0.33의 갭 크기 페널티 (gap size penalty); 그리고 30의 결합 페널티 (joining penalty), "Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.
유용한 알고리즘의 실례는 PILEUP이다. PILEUP는 진행성, 쌍별 정렬을 이용하여 일군의 관련된 서열로부터 복수의 서열 정렬을 산출한다. 이것은 또한, 정렬을 산출하는데 이용되는 클러스터링 관계 (clustering relationship)를 보여주는 트리를 플롯팅한다. PILEUP는 Feng & Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 35:351-360의 진행성 정렬 방법의 단순화를 이용한다; 상기 방법은 Higgins and Sharp, 1989, CABIOS 5:151-153에 의해 설명된 방법과 유사하다. 3.00의 디폴트 갭 가중치 (default gap weight), 0.10의 디폴트 갭 길이 가중치 (default gap length weight), 그리고 가중된 엔드 갭 (weighted end gap)을 비롯한 유용한 PILEUP 파라미터.
유용한 알고리즘의 다른 실례는 Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; 그리고 Karin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787에서 설명된 BLAST 알고리즘이다. 특히 유용한 BLAST 프로그램은 Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266:460-480으로부터 획득된 WU-BLAST-2 프로그램이다. WU-BLAST-2는 몇몇 검색 파라미터를 이용하는데, 이들 대부분은 디폴트 값으로 설정된다. 조정가능 파라미터는 하기 값으로 설정된다: 오버랩 스팬 (overlap span)=1, 오버랩 프랙션 (overlap fraction)=0.125, 단어 역치 (word threshold) (T)=II. HSP S와 HSP S2 파라미터는 동적 값 (dynamic value)이고, 그리고 특정 서열의 구성 및 관심 서열이 검색되는 특정 데이터베이스의 구성에 따라, 프로그램 자체에 의해 확립된다; 하지만, 이들 값은 민감도를 증가시키기 위해 조정될 수 있다.
추가의 유용한 알고리즘은 Altschul et al., 1993, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402에 의해 보고된 갭트 BLAST이다. 갭트 BLAST는 BLOSUM-62 치환 스코어를 이용한다; 9로 설정된 역치 T 파라미터; 갭이 없는 신장을 유발하는 2-히트 방법은 k의 갭 길이 (gap length)에 10+k의 비용을 부가한다; 16으로 설정된 Xu, 그리고 데이터베이스 검색 단계의 경우에 40 및 알고리즘의 출력 단계의 경우에 67로 설정된 Xg. 갭트 정렬은 약 22 비트에 상응하는 스코어에 의해 유발된다.
일반적으로, 개별 변이체 CDR 사이에 아미노산 상동성, 유사성, 또는 동일성은 본원에서 묘사된 서열에 적어도 80%이고, 그리고 더욱 전형적으로, 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 그리고 거의 100%의 가급적 증가하는 동종성 또는 동일성을 갖는다. 유사한 방식으로, 본원에서 확인된 결합 단백질의 핵산 서열에 대하여 "퍼센트 (%) 핵산 서열 동일성"은 항원 결합 단백질의 코딩 서열에서 뉴클레오티드 잔기와 동일한, 후보 서열에서 뉴클레오티드 잔기의 백분율로서 정의된다. 특정한 방법은 디폴트 파라미터로 설정된 WU-BLAST-2의 BLASTN 모듈을 이용하는데, 오버랩 스팬과 오버랩 프랙션이 각각, 1과 0.125로 설정된다.
일반적으로, 개별 변이체 CDR을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 본원에서 묘사된 뉴클레오티드 서열 사이에 핵산 서열 상동성, 유사성, 또는 동일성은 적어도 80%, 그리고 더욱 전형적으로, 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 그리고 거의 100%의 가급적 증가하는 동종성 또는 동일성을 갖는다.
따라서 "변이체 CDR"은 본 발명의 부모 CDR에 특정된 상동성, 유사성, 또는 동일성을 갖는 것이고, 그리고 부모 CDR의 특이성 및/또는 활성의 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 포함되지만 이에 국한되지 않는 생물학적 기능을 공유한다.
아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위 또는 영역은 미리 결정되는 반면, 돌연변이 그 자체는 미리 결정될 필요는 없다. 가령, 소정의 부위에서 돌연변이의 성과를 최적화하기 위해, 표적 코돈 또는 영역에서 무작위 돌연변이유발이 수행될 수 있고, 그리고 발현된 항원 결합 단백질 CDR 변이체는 원하는 활성의 최적 조합을 위해 스크리닝될 수 있다. 공지된 서열을 갖는 DNA 내에 미리 결정된 부위에서 치환 돌연변이를 만들기 위한 기술, 예를 들면, M13 프라이머 돌연변이유발 및 PCR 돌연변이유발은 널리 알려져 있다. 돌연변이체의 스크리닝은 항원 결합 단백질 활성, 예를 들면, CD27L 결합의 검정을 이용하여 수행된다.
아미노산 치환은 전형적으로, 단일 잔기의 치환이다; 삽입은 비록 훨씬 큰 삽입이 관용될 수도 있지만, 통상적으로 대략 약 1개 내지 약 20개 아미노산 잔기일 것이다. 결실은 비록 일부 경우에 결실이 훨씬 클 수도 있지만, 약 1개 내지 약 20개 아미노산 잔기의 범위에서 변한다.
치환, 결실, 삽입 또는 이들의 임의의 조합은 최종 유도체 또는 변이체에 도달하는데 이용될 수 있다. 일반적으로, 이들 변화는 분자의 변경, 특히 항원 결합 단백질의 면역원성과 특이성을 최소화하기 위해 소수의 아미노산 상에서 수행된다. 하지만, 더욱 큰 변화가 일정한 상황에서 관용될 수도 있다. 보존성 치환은 일반적으로, 표 1에서 묘사된 하기 차트에 따라 만들어진다.
본래 잔기 예시적인 치환
Ala
Arg
Asn
Asp
Cys
Gln
Glu
Gly
His
Ile
Leu
Lys
Met
Phe
Ser
Thr
Trp
Tyr
Val		 Ser
Lys
Gln, His
Glu
Ser
Asn
Asp
Pro
Asn, Gln
Leu, Val
Ile, Val
Arg, Gln, Glu
Leu, Ile
Met, Leu, Tyr
Thr
Ser
Tyr
Trp, Phe
Ile, Leu
기능 또는 면역학적 동일성에서 실질적인 변화는 표 1에서 도시된 것들보다 보존성이 덜한 치환을 선별함으로써 만들어진다. 가령, 변경의 구역 내에 폴리펩티드 중추의 구조, 예를 들면, 알파-나선 또는 베타-시트 구조; 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성; 또는 측쇄의 크기에 훨씬 유의미한 영향을 주는 치환이 만들어질 수 있다. 일반적으로, 폴리펩티드의 성질에서 가장 큰 변화를 발생시킬 것으로 예상되는 치환은 (a) 친수성 잔기, 예를 들면, 세릴 또는 트레오닐이 소수성 잔기, 예를 들면, 류실, 이소류실, 페닐알라닐, 발릴 또는 알라닐에 대해 (또는 의해) 치환되는 것들; (b) 시스테인 또는 프롤린이 임의의 다른 잔기에 대해 (또는 의해) 치환되는 것들; (c) 양성 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들면, 리실, 아르기닐, 또는 히스티딜이 음성 잔기, 예를 들면, 글루타밀 또는 아스파르틸에 대해 (또는 의해) 치환되는 것들; 또는 (d) 부피가 큰 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들면, 페닐알라닌이 측쇄를 갖지 않는 잔기, 예를 들면, 글리신에 대해 (또는 의해) 치환되는 것들이다.
변이체는 비록 변이체가 필요에 따라 항원 결합 단백질 또는 단백질들의 특징을 변화시키기 위해 선별되기도 하지만, 전형적으로, 자연 발생 유사체와 동일한 정량적 생물학적 활성을 나타내고 동일한 면역 반응을 유도할 것이다. 대안으로, 변이체는 항원 결합 단백질의 생물학적 활성이 변하도록 설계될 수 있다. 가령, 당화 부위가 본원에서 논의된 바와 같이 변경되거나 또는 제거될 수 있다.
본 발명의 범위 내에 CD27L 항체의 다른 유도체에는 예로서, CD27L 항체 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 이종기원성 폴리펩티드를 포함하는 재조합 융합 단백질의 발현에 의한, CD27L 항체 또는 이들의 단편과 다른 단백질 또는 폴리펩티드의 공유 또는 응집성 접합체가 포함된다. 가령, 접합된 펩티드는 이종기원성 신호 (또는 리더) 폴리펩티드, 예를 들면, 효모 알파-인자 리더, 또는 에피토프 태그와 같은 펩티드일 수 있다. CD27L 항체-내포 융합 단백질은 CD27L 항체의 정제 또는 확인을 조장하기 위해 부가된 펩티드 (가령, 폴리-His)를 포함할 수 있다. CD27L 항체 폴리펩티드는 또한, Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988, 그리고 U.S. 특허 5,011,912에서 설명된 바와 같이, FLAG 펩티드에 연결될 수 있다. FLAG 펩티드는 고도로 항원성이고, 그리고 특정 단일클론 항체 (mAb)에 의해 가역적으로 결합된 에피토프를 제공하고, 발현된 재조합 단백질의 신속한 검정과 용이한 정제를 가능하게 한다. FLAG 펩티드가 소정의 폴리펩티드에 융합된 융합 단백질을 제조하는데 유용한 시약은 상업적으로 구입가능하다 (Sigma, St. Louis, MO).
하나 이상의 CD27L 항체 폴리펩티드를 내포하는 올리고머는 CD27L 길항제로서 이용될 수 있다. 올리고머는 공유-연결된 또는 비-공유-연결된 이합체, 삼합체, 또는 고등 올리고머의 형태일 수 있다. 2개 또는 그 이상의 CD27L 항체 폴리펩티드를 포함하는 올리고머가 이용에 예기되는데, 한 가지 실례는 동종이합체이다. 다른 올리고머에는 이형이합체, 동종삼합체, 이형삼합체, 동종사합체, 이형사합체 등이 포함된다.
한 구체예는 CD27L 항체 폴리펩티드에 융합된 펩티드 모이어티 사이에 공유 또는 비-공유 상호작용을 거쳐 연결된 복수의 CD27L 항체 폴리펩티드를 포함하는 올리고머에 관한 것이다. 이런 펩티드는 펩티드 링커 (스페이서), 또는 올리고머화를 증진하는 성질을 갖는 펩티드일 수 있다. 류신 지퍼 및 항체로부터 유래된 일정한 폴리펩티드는 하기에 더욱 상세하게 설명된 바와 같이, 자기에게 부착된 CD27L 항체 폴리펩티드의 올리고머화를 증진할 수 있는 펩티드에 속한다.
특정 구체예에서, 올리고머는 2개 내지 4개 CD27L 항체 폴리펩티드를 포함한다. 올리고머의 CD27L 항체 모이어티는 전술한 임의의 형태, 예를 들면, 변이체 또는 단편일 수 있다. 바람직하게는, 올리고머는 CD27L 결합 활성을 갖는 CD27L 항체 폴리펩티드를 포함한다.
한 구체예에서, 올리고머는 면역글로불린으로부터 유래된 폴리펩티드를 이용하여 제조된다. 항체-유래된 폴리펩티드의 다양한 부분 (Fc 도메인 포함)에 융합된 일정한 종기원성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질의 제조는 예로서, Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88:10535; Byrn et al., 1990, Nature 344:677; 그리고 Hollenbaugh et al., 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, 10.19.1 - 10.19.11페이지에 의해 설명되었다.
본 발명의 한 구체예는 CD27L 항체의 CD27L 결합 단편을 항체의 Fc 영역에 융합함으로써 산출된 2개의 융합 단백질을 포함하는 이합체에 관한 것이다. 이합체는 예로서, 융합 단백질을 인코딩하는 유전자 융합체를 적절한 발현 벡터 내로 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포에서 유전자 융합체를 발현하고, 그리고 발현된 융합 단백질이 항체 분자와 유사하게 조립할 수 있도록 함으로써 만들어질 수 있는데, 여기서 사슬간 이황화 결합이 Fc 모이어티 사이에 형성되어 이합체가 산출된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "Fc 폴리펩티드"는 항체의 Fc 영역으로부터 유래된 고유와 뮤테인 형태의 폴리펩티드를 포함한다. 이합체화를 증진하는 힌지 영역을 내포하는 이런 폴리펩티드의 절두된 형태 역시 포함된다. Fc 모이어티 (및 이들로부터 형성된 올리고머)를 포함하는 융합 단백질은 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼 위에서 친화성 크로마토그래피에 의한 용이한 정제의 이점을 제공한다.
PCT 출원 WO 93/10151 (본원에 참조로서 편입됨)에서 설명된 한 가지 적절한 Fc 폴리펩티드는 인간 IgG 항체의 N-말단 힌지 영역에서부터 Fc 영역의 고유 C-말단까지 뻗어있는 단일 사슬 폴리펩티드이다. 다른 유용한 Fc 폴리펩티드는 U.S. 특허 5,457,035 및 Baum et al., 1994, EMBO J. 13:3992-4001에서 설명된 Fc 뮤테인이다. 이러한 뮤테인의 아미노산 서열은 아미노산 19가 Leu에서 Ala로 변경되고, 아미노산 20이 Leu에서 Glu로 변경되고, 그리고 아미노산 22가 Gly에서 Ala로 변경된 점을 제외하고, WO 93/10151에서 제공된 고유 Fc 서열의 아미노산 서열과 일치한다. 상기 뮤테인은 Fc 수용체에 대한 감소된 친화성을 나타낸다.
다른 구체예에서, CD27L 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 부분은 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 부분에 대해 대체될 수 있다.
대안으로, 올리고머는 펩티드 링커 (스페이서 펩티드)와 함께 또는 이들 없이, 복수의 CD27L 항체 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이다. 적절한 펩티드 링커에는 U.S. 특허 4,751,180과 4,935,233에서 설명된 것들이 포함된다.
올리고머성 CD27L 항체 유도체를 제조하기 위한 다른 방법은 류신 지퍼의 이용을 수반한다. 류신 지퍼 도메인은 그들이 발견되는 단백질의 올리고머화를 증진하는 펩티드이다. 류신 지퍼는 몇몇 DNA-결합 단백질에서 최초 확인되었고 (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759), 그리고 그 이후로, 다양한 상이한 단백질에서 발견되었다. 공지된 류신 지퍼에는 이합하거나 또는 삼합하는 자연 발생 펩티드 및 이들의 유도체가 포함된다. 가용성 올리고머성 단백질을 생산하는데 적합한 류신 지퍼 도메인의 실례는 PCT 출원 WO 94/10308에서 설명되고, 그리고 폐 계면활성제 단백질 D (SPD)로부터 유래된 류신 지퍼는 본원에 참조로서 편입되는 Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191에서 설명된다. 자기에게 융합된 이종기원성 단백질의 안정된 삼합체화를 가능하게 하는 변형된 류신 지퍼의 이용은 Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78에서 설명된다. 한 가지 접근법에서, 류신 지퍼 펩티드에 융합된 CD27L 항체 단편 또는 유도체를 포함하는 재조합 융합 단백질은 적절한 숙주 세포에서 발현되고, 그리고 형성되는 가용성 올리고머성 CD27L 항체 단편 또는 유도체는 배양 상층액으로부터 회수된다.
항원 결합 단백질의 공유 변형은 본 발명의 범위 내에 포함되고, 그리고 일반적으로 번역후 수행되지만, 항상 그러한 것은 아니다. 가령, 항원 결합 단백질의 공유 변형의 몇몇 유형은 항원 결합 단백질의 특정한 아미노산 잔기를 선별된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화 작용제 (organic derivatizing agent)와 반응시킴으로써 분자내로 도입된다.
시스테이닐 잔기는 가장 일반적으로, α-할로아세테이트 (및 상응하는 아민), 예를 들면, 클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드와 반응되어, 카르복시메틸 또는 카르복시아미도메틸 유도체를 제공한다. 시스테이닐 잔기는 또한, 브로모트리플루오르아세톤, α-브로모-β-(5-이미도조일)프로피온산, 클로로아세틸 인산염, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 이황화물, 메틸 2-피리딜 이황화물, p-클로로머큐리벤조산염, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀, 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸과의 반응에 의해 유도체화된다.
히스티딜 잔기는 pH 5.5-7.0에서 디에틸파이로탄산염과의 반응에 의해 유도체화되는데, 그 이유는 상기 작용제가 히스티딜 측쇄에 상대적으로 특이적이기 때문이다. 파라-브로모펜아실 브롬화물 역시 유용하다; 반응은 바람직하게는, pH 6.0에서 0.1M 나트륨 카코딜염산에서 수행된다.
리시닐과 아미노 말단 잔기는 숙신산 또는 다른 카르복실산 무수물과 반응된다. 이들 작용제로 유도체화는 리시닐 잔기의 전하를 반전시키는 효과를 갖는다. 알파-아미노-내포 잔기를 유도체화하기 위한 다른 적절한 시약에는 이미도에스테르, 예를 들면, 메틸 피콜린이미데이트; 피리독살 인산염; 피리독살; 클로로수소화붕소; 트리니트로벤젠술폰산; O-메틸이소우레아; 2,4-펜탄디온; 그리고 글리옥실레이트와의 트랜스아미나아제-촉매된 반응이 포함된다.
아르기닐 잔기는 하나 또는 여러 개의 전통적인 시약, 그 중에서 특히 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-시클로헥산디온, 그리고 닌히드린과의 반응에 의해 변형된다. 아르기닌 잔기의 유도체화는 반응이 구아니딘 기능기의 높은 pKa로 인하여 알칼리성 조건에서 수행될 것을 요구한다. 게다가, 이들 시약은 리신의 기뿐만 아니라 아르기닌 엡실론-아미노 기와 반응할 수 있다.
티로실 잔기의 특정한 변형은 특히, 티로실 잔기 내로 스펙트럼 표지를 도입하는데 관심을 두고, 방향족 디아조늄 화합물 또는 테트라니트로메탄과의 반응에 의해 만들어질 수 있다. 가장 흔히, N-아세틸이미디졸과 테트라니트로메탄이 각각, O-아세틸 티로실 종류와 3-니트로 유도체를 형성하는데 이용된다. 티로실 잔기는 방사성면역검정에서 이용을 위한 표지된 단백질을 제조하기 위해 125I 또는 131I을 이용하여 요오드화되고, 전술한 클로라민 T 방법이 적합하다.
카르복실 측기 (아스파르틸 또는 글루타밀)는 카르보디이미드 (R'-N=C=N--R')와의 반응에 의해 선별적으로 변형되는데, 여기서 R과 R'는 선택적으로 상이한 알킬 기, 예를 들면, 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리닐-4-에틸) 카르보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸) 카르보디이미드이다. 게다가, 아스파르틸과 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과의 반응에 의해 아스파라기닐과 글루타미닐 잔기로 전환된다.
이중기능성 작용제로 유도체화는 다양한 방법에서 이용을 위해, 항원 결합 단백질을 물-불용성 서포트 기반 또는 표면에 교차결합하는데 유용하다. 통상적으로 이용되는 교차결합 작용제에는 예로서, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들면, 4-아지도살리실산과의 에스테르, 디숙신이미딜 에스테르, 예를 들면, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피온산염)을 비롯한 동종이중기능성 이미도에스테르, 그리고 이중기능성 말레이미드, 예를 들면, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄이 포함된다. 유도체화 작용제, 예를 들면, 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트는 광활성가능 중간물질을 산출하고, 이들은 빛의 존재에서 교차결합을 형성할 수 있다. 대안으로, 반응성 물-불용성 기반, 예를 들면, 시아노겐 브롬화물-활성화된 탄수화물 및 U.S. 특허 번호 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; 그리고 4,330,440에서 설명된 반응성 기질이 단백질 고정화에 이용된다.
글루타미닐과 아스파라기닐 잔기는 각각, 상응하는 글루타밀과 아스파르틸 잔기로 빈번하게 탈아미드화된다. 대안으로, 이들 잔기는 약산성 조건 하에 탈아미드화된다. 이들 잔기의 어느 쪽 형태든 본 발명의 범위 내에 있다.
다른 변형에는 프롤린과 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실 기의 인산화, 리신, 아르기닌과 히스티딘 측쇄의 α-아미노 기의 메틸화 (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp. 79-86), N-말단 아민의 아세틸화, 그리고 임의의 C-말단 카르복실 기의 아미드화가 포함된다.
본 발명의 범위 내에 포함되는 항원 결합 단백질의 공유 변형의 다른 유형은 단백질의 당화 패턴의 변경을 포함한다. 당분야에 공지된 바와 같이, 당화 패턴은 단백질의 서열 (가령, 하기에 논의된, 특정 당화 아미노산 잔기의 존재 또는 부재), 또는 단백질이 생산되는 숙주 세포 또는 생물체 둘 모두에 좌우될 수 있다. 특정 발현 시스템은 하기에 논의된다.
폴리펩티드의 당화는 전형적으로, N-연결되거나 또는 O-연결된다. "N-연결된"은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. 트리-펩티드 서열 아스파라긴-X-세린과 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 아스파라긴 측쇄에 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서 폴리펩티드 내에 이들 트리-펩티드 서열 중에서 어느　하나의 존재는 잠재적인 당화 부위를 발생시킨다. O-연결된 당화는 비록 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신 역시 이용될 수 있긴 하지만, 히드록시아미노산, 가장 흔히 세린 또는 트레오닌에 당류 N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스, 또는 자일로스 중에서 하나의 부착을 지칭한다.
항원 결합 단백질에 당화 부위의 부가는 전술한 트리-펩티드 서열 중에서 하나 이상을 내포하도록, 아미노산 서열을 변경함으로써 편의하게 달성된다 (N-연결된 당화 부위의 경우). 변경은 또한, 출발 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 이들에 의한 치환에 의해 만들어질 수 있다 (O-연결된 당화 부위의 경우). 용이함을 위하여, 항원 결합 단백질 아미노산 서열은 바람직하게는, 특히 원하는 아미노산으로 번역되는 코돈이 산출되도록 미리 선별된 염기에서 표적 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 돌연변이시킴으로써 DNA 수준에서 변화를 통해 변경된다.
항원 결합 단백질 상에서 탄수화물 모이어티의 숫자를 증가시키는 다른 수단은 단백질에 글리코시드의 화학적 또는 효소적 커플링이다. 이들 절차는 그들이 N-과 O-연결된 당화를 위한 당화 능력을 갖는 숙주 세포에서 단백질의 생산을 요구하지 않는다는 점에서 유리하다. 이용된 커플링 양식에 따라, 당(들)은 (a) 아르기닌과 히스티딘, (b) 유리 카르복실 기, (c) 유리 설피드릴 기, 예를 들면, 시스테인의 것들, (d) 유리 히드록실 기, 예를 들면, 세린, 트레오닌, 또는 히드록시프롤린의 것들, (e) 방향족 잔기, 예를 들면, 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판의 것들, 또는 (f) 글루타민의 아미드 기에 부착될 수 있다. 이들 방법은 1987년 9월 11일자 공개된 WO 87/05330, 그리고 Aplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306에서 설명된다.
출발 항원 결합 단백질 상에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈당화는 화합물 트리플루오르메탄술폰산, 또는 동등한 화합물에 상기 단백질의 노출을 필요로 한다. 이러한 처리는 폴리펩티드를 본래 대로 두면서, 연결 당 (N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분 또는 모든 당의 절단을 유발한다. 화학적 탈당화는 Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 및 Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131에 의해 설명된다. 폴리펩티드 상에서 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350에 의해 설명된 바와 같이, 다양한 엔도-와 엑소-글리코시다아제의 이용에 의해 달성될 수 있다. 잠재적 당화 부위에서 당화는 Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105에 의해 설명된 바와 같이, 화합물 튜니카마이신의 이용에 의해 예방될 수 있다. 튜니카마이신은 단백질-N-글리코시드 연쇄의 형성을 차단한다.
항원 결합 단백질의 공유 변형의 다른 유형은 U.S. 특허 번호 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 또는 4,179,337에 기재된 방식에서, 다양한 폴리올, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 비단백질성 중합체에 항원 결합 단백질을 연결하는 것을 포함한다. 이에 더하여, 당분야에 공지된 바와 같이, 아미노산 치환은 중합체, 예를 들면, PEG의 부가를 조장하기 위해 항원 결합 단백질 내에 다양한 위치에서 만들어질 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질의 공유 변형은 하나 이상의 표지의 부가를 포함한다.
용어 "표지화 기"는 임의의 검출가능 표지를 의미한다. 적절한 표지화 기의 실례에는 하기가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: 방사선동위원소 또는 방사성핵종 (가령, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광 기 (가령, FITC, 로다민, 란탄족 인광체), 효소 기 (가령, 양고추냉이 과산화효소, β-갈락토시다아제, 루시페라아제, 알칼리성 포스파타아제), 화학발광 기, 비오티닐 기, 또는 이차 리포터에 의해 인식되는 미리 결정된 폴리펩티드 에피토프 (가령, 류신 지퍼 쌍 서열, 이차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그). 일부 구체예에서, 표지화 기는 잠재적인 입체 장해 (steric hindrance)를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 팔을 거쳐 항원 결합 단백질에 커플링된다. 단백질을 표지화하기 위한 다양한 방법이 당분야에 알려져 있고 본 발명을 수행하는데 이용될 수 있다.
일반적으로, 표지는 그들이 검출되는 검정에 따라, 다양한 부류로 분류된다: a) 방사성 동위원소 또는 중 동위원소일 수 있는 동위원소 표지; b) 자성 표지 (가령, 자성 입자); c) 산화 환원 반응 활성 모이어티; d) 광학 염료; 효소 기 (가령, 양고추냉이 과산화효소, β-갈락토시다아제, 루시페라아제, 알칼리성 포스파타아제); e) 비오티닐화 기; 그리고 f) 이차 리포터에 의해 인식되는 미리 결정된 폴리펩티드 에피토프 (가령, 류신 지퍼 쌍 서열, 이차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그 등). 일부 구체예에서, 표지화 기는 잠재적인 입체 장해 (steric hindrance)를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 팔을 거쳐 항원 결합 단백질에 커플링된다. 단백질을 표지화하기 위한 다양한 방법이 당분야에 알려져 있고 본 발명을 수행하는데 이용될 수 있다.
특정한 표지에는 발색단, 인광체와 형광단이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 광학 염료가 포함되고, 후자가 많은 경우에 특이적이다. 형광단은 "소형 분자" 플루오레, 또는 단백질성 플루오레일 수 있다.
"형광 표지"는 본래의 형광 성질을 통해 검출될 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 적절한 형광 표지에는 플루오레세인, 로다민, 테트라메틸로다민, 에오신, 에리트로신, 쿠마린, 메틸-쿠마린, 피렌, 말라카이트 그린, 스틸벤, Lucifer Yellow, Cascade BlueJ, Texas Red, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705, Oregon green, Alexa-Fluor 염료 (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Cascade Blue, Cascade Yellow와 R-피코에리트린 (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, 로다민, 그리고 Texas Red (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 형광단을 비롯한 적절한 광학 염료는 본원에 참조로서 명백히 편입되는 Richard P. Haugland에 의한 Molecular Probes Handbook에서 설명된다.
적절한 단백질성 형광 표지에는 또한, GFP의 레닐라 (Renilla), 프틸로사르쿠스 (Ptilosarcus), 또는 에쿼리아 (Aequorea) 종류 (Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805)를 비롯한 녹색 형광 단백질, EGFP (Clontech Laboratories, Inc., Genbank Accession Number U55762), 청색 형광 단백질 (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178-182), 증강된 황색 형광 단백질 (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), 루시페라아제 (Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408-5417), β 갈락토시다아제 (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607) 및 레닐라 (WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, U.S. 특허 번호 5292658, 5418155, 5683888, 5741668, 5777079, 5804387, 5874304, 5876995, 5925558)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 앞서 언급된 모든 참고문헌은 본원에 참조로서 명백히 편입된다.
CD27L 항원 결합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 발명에는 본원에서 정의된 바와 같은 항체를 비롯한 CD27L 항원 결합 단백질을 인코딩하는 핵산이 포함된다. 바람직한 핵산에는 본원에서 설명된 예시적인 경쇄와 중쇄를 인코딩하는 것들이 포함된다.
Ab1 LC를 인코딩하는 예시적인 핵산은 서열번호 49에 기재된 서열을 포함하는 핵산이다.
Ab2 LC를 인코딩하는 예시적인 핵산은 서열번호 50에 기재된 서열을 포함하는 핵산이다.
Ab4 LC를 인코딩하는 예시적인 핵산은 서열번호 51에 기재된 서열을 포함하는 핵산이다.
Ab5 LC를 인코딩하는 예시적인 핵산은 서열번호 52에 기재된 서열을 포함하는 핵산이다.
Ab6 LC를 인코딩하는 예시적인 핵산은 서열번호 53에 기재된 서열을 포함하는 핵산이다.
Ab7 LC를 인코딩하는 예시적인 핵산은 서열번호 54에 기재된 서열을 포함하는 핵산이다.
Ab8 LC를 인코딩하는 예시적인 핵산은 서열번호 55에 기재된 서열을 포함하는 핵산이다.
Ab1 HC를 인코딩하는 예시적인 핵산은 서열번호 3에 기재된 서열을 포함하는 핵산이다.
Ab2 HC를 인코딩하는 예시적인 핵산은 서열번호 4에 기재된 서열을 포함하는 핵산이다.
Ab4 HC를 인코딩하는 예시적인 핵산은 서열번호 5에 기재된 서열을 포함하는 핵산이다.
Ab5 HC를 인코딩하는 예시적인 핵산은 서열번호 6에 기재된 서열을 포함하는 핵산이다.
Ab6 HC를 인코딩하는 예시적인 핵산은 서열번호 7에 기재된 서열을 포함하는 핵산이다.
Ab7 HC를 인코딩하는 예시적인 핵산은 서열번호 8에 기재된 서열을 포함하는 핵산이다.
Ab8 HC를 인코딩하는 예시적인 핵산은 서열번호 9에 기재된 서열을 포함하는 핵산이다.
본 발명의 양상은 본원에서 설명된 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 변이체 (가령, 축중성에 기인)를 포함한다.
본 발명의 양상은 하기의 예시적인 구체예가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 구체예를 포함한다.
단리된 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩한다:
A.1. 서열번호 63-70에 기재된 경쇄 가변 도메인 서열에 적어도 90% 동일한 경쇄 가변 도메인 서열;
2. 서열번호 17-24에 기재된 중쇄 가변 도메인 서열에 적어도 90% 동일한 중쇄 가변 도메인 서열;
3. (1)의 경쇄 가변 도메인 및 (2)의 중쇄 가변 도메인; 그리고
B. 각 CDR에서 총 3개 이하의 아미노산 부가, 치환, 및/또는 결실에 의해 하기 서열과 상이한 CDR1, CDR2, CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및/또는 CDR1, CDR2, CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인:
1. Ab1의 경쇄 CDR1 (서열번호 71), CDR2 (서열번호 79), CDR3 (서열번호 87) 또는 중쇄 CDR1 (서열번호 25), CDR2 (서열번호 33), CDR3 (서열번호 41);
2. Ab2의 경쇄 CDR1 (서열번호 72), CDR2 (서열번호 80), CDR3 (서열번호 88) 또는 중쇄 CDR1 (서열번호 26), CDR2 (서열번호 34), CDR3 (서열번호 42);
3. Ab3의 경쇄 CDR1 (서열번호 73), CDR2 (서열번호 81), CDR3 (서열번호 89) 또는 중쇄 CDR1 (서열번호 27), CDR2 (서열번호 35), CDR3 (서열번호 43);
4. Ab4의 경쇄 CDR1 (서열번호 74), CDR2 (서열번호 82), CDR3 (서열번호 90) 또는 중쇄 CDR1 (서열번호 28), CDR2 (서열번호 36), CDR3 (서열번호 44);
5. Ab5의 경쇄 CDR1 (서열번호 75), CDR2 (서열번호 83), CDR3 (서열번호 91) 또는 중쇄 CDR1 (서열번호 29), CDR2 (서열번호 37), CDR3 (서열번호 45);
6. Ab6의 경쇄 CDR1 (서열번호 76), CDR2 (서열번호 84), CDR3 (서열번호 92) 또는 중쇄 CDR1 (서열번호 30), CDR2 (서열번호 38), CDR3 (서열번호 46);
7. Ab7의 경쇄 CDR1 (서열번호 77), CDR2 (서열번호 85), CDR3 (서열번호 93) 또는 중쇄 CDR1 (서열번호 31), CDR2 (서열번호 39), CDR3 (서열번호 47); 그리고
8. Ab8의 경쇄 CDR1 (서열번호 78), CDR2 (서열번호 86), CDR3 (서열번호 94) 또는 중쇄 CDR1 (서열번호 32), CDR2 (서열번호 40), CDR3 (서열번호 48).
바람직한 구체예에서, 단리된 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드는 CD27L에 결합하는 항원 결합 단백질의 요소이다.
핵산의 단리를 위한 프로브 또는 프라이머로서 또는 데이터베이스 검색을 위한 조회 서열로서 이용되는, 본원에서 설명된 아미노산 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 아미노산 서열로부터 "역 번역 (back-translation)"에 의해, 또는 코딩 DNA 서열이 확인된 폴리펩티드와의 아미노산 동일성의 영역의 확인에 의해 획득될 수 있다. 널리 공지된 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 절차는 CD27L 항원 결합 단백질 또는 CD27L 항원 결합 단백질 폴리펩티드 단편의 원하는 조합을 인코딩하는 DNA 서열을 단리하고 증폭하는데 이용될 수 있다. DNA 단편의 조합의 원하는 말단을 정의하는 올리고뉴클레오티드는 5'와 3' 프라이머로서 이용된다. 이들 올리고뉴클레오티드는 발현 벡터 내로 DNA 단편의 증폭된 조합의 삽입을 용이하게 하기 위한 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위를 추가적으로 내포할 수 있다. PCR 기술은 Saiki et al., Science 239:487 (1988); Recombinant DNA Methodology, Wu et al., eds., Academic Press, Inc., San Diego (1989), pp. 189-196; 그리고 PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et. al., eds., Academic Press, Inc. (1990)에서 설명된다.
본 발명의 핵산 분자에는 단일-가닥과 이중-가닥 형태 둘 모두에서 DNA와 RNA 뿐만 아니라 상응하는 상보성 서열이 포함된다. DNA에는 예로서, cDNA, 게놈 DNA, 화학적으로 합성된 DNA, PCR에 의해 증폭된 DNA, 그리고 이들의 조합이 포함된다. 본 발명의 핵산 분자에는 전장 유전자 또는 cDNA 분자뿐만 아니라 이들의 단편의 조합이 포함된다. 본 발명의 핵산은 인간 공급원으로부터 우선적으로 유래되지만, 본 발명은 비-인간 종으로부터 유래된 핵산 역시 포함한다.
"단리된 핵산"은 자연 발생 공급원으로부터 단리된 핵산의 경우에, 핵산이 단리된 생물체의 게놈 내에 존재하는 인접 유전자 서열로부터 분리된 핵산이다. 예로서, 주형으로부터 효소적으로 또는 화학적으로 합성된 핵산, 예를 들면, PCR 산물, cDNA 분자, 또는 올리고뉴클레오티드의 경우에, 이런 과정으로부터 발생하는 핵산은 단리된 핵산인 것으로 이해된다. 단리된 핵산 분자는 별개의 단편의 형태에서 또는 더욱 큰 핵산 구조체의 요소로서 핵산 분자를 지칭한다. 한 가지 바람직한 구체예에서, 이들 핵산은 내인성 오염 물질이 실질적으로 없다. 핵산 분자는 바람직하게는, 실질적으로 순수한 형태에서, 그리고 표준 생화학적 방법 (가령, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)에서 개설된 것들)에 의해 요소 뉴클레오티드 서열의 확인, 조작과 회수를 가능하게 하는 양 또는 농도에서 적어도 1회 단리된 DNA 또는 RNA로부터 유래된다. 이런 서열은 바람직하게는, 진핵 유전자 내에 전형적으로 존재하는 내부 비-번역 서열, 또는 인트론에 의해 중단되지 않는 개방 해독 틀 (open reading frame)의 형태로 제공되고 및/또는 작제된다. 비-번역 DNA의 서열은 개방 해독 틀로부터 5' 또는 3'에 존재할 수 있는데, 여기서 이들은 코딩 영역의 조작 또는 발현을 간섭하지 않는다.
본 발명은 또한, 본원에서 설명된 바와 같은 CD27L 항원 결합 단백질을 인코딩하는 핵산에 중간 정도로 엄밀한 조건 하에, 그리고 더욱 바람직하게는, 고도로 엄밀한 조건 하에 혼성화되는 핵산을 포함한다. 혼성화 조건의 선택에 영향을 주는 기본 파라미터 및 적절한 조건을 고안하기 위한 보도는 Sambrook,, Fritsch, and Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 9 장및 11 장; 그리고 Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., 섹션 2.10 및 6.3-6.4)에 의해 기재되고, 그리고 예로서, DNA의 길이 및/또는 염기 조성에 기초하여 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 중간 정도로 엄밀한 조건을 달성하는 한 가지 방침은 5 x SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0), 약 50% 포름아미드, 6 x SSC의 혼성화 완충액, 그리고 약 55 섭씨온도의 혼성화 온도를 내포하는 전세척 용액 (또는 다른 유사한 혼성화 용액, 예를 들면, 약 42 섭씨온도의 혼성화 온도에서 약 50% 포름아미드를 내포하는 용액)의 이용, 그리고 0.5 x SSC, 0.1% SDS에서 약 60 섭씨온도의 세척 조건을 수반한다. 일반적으로, 고도로 엄밀한 조건은 대략 68 섭씨온도, 0.2 x SSC, 0.1% SDS에서 세척을 제외하고, 전술한 바와 동일한 혼성화 조건으로 정의된다. SSPE (1xSSPE는 0.15M NaCl, 10 mM NaH.sub.2 PO.sub.4, 그리고 1.25 mM EDTA, pH 7.4이다)는 혼성화와 세척 완충액에서 SSC (1xSSC는 0.15M NaCl과 15 mM 구연산나트륨이다)에 대해 대체될 수 있다; 세척은 혼성화가 완결된 후, 15분 동안 수행된다. 세척 온도 및 세척 염 농도는 당업자에게 공지되고 하기에 더욱 설명된 바와 같이, 혼성화 반응과 이중나선안정성을 지배하는 기본 원리를 적용함으로써, 원하는 정도의 엄밀도를 달성하기 위해 필요에 따라 조정될 수 있는 것으로 이해되어야 (예로서, Sambrook et al., 1989 참조). 핵산을 미지의 서열의 표적 핵산에 혼성화시킬 때, 하이브리드 길이는 혼성화 핵산의 길이인 것으로 가정된다. 공지된 서열의 핵산이 혼성화될 때, 하이브리드 길이는 이들 핵산의 서열을 정렬하고, 그리고 최적 서열 상보성의 영역 또는 영역들을 확인함으로써 결정될 수 있다. 50개 이하의 염기쌍 길이를 갖는 것으로 예상되는 하이브리드에 대한 혼성화 온도는 하이브리드의 용융 온도 (Tm)보다 5 내지 10.섭씨온도 낮은데, 여기서 Tm은 하기 방정식에 따라 결정된다. 18개 이하의 염기쌍 길이를 갖는 하이브리드의 경우에, Tm (섭씨온도) = 2(A + T 염기의 #) + 4(#G + C 염기의 #). 18개 초과의 염기쌍 길이를 갖는 하이브리드의 경우에, Tm (섭씨온도) = 81.5 + 16.6(log10 [Na+]) + 0.41(% G + C) - (600/N), 여기서 N은 하이브리드 내에 염기의 총수이고, 그리고 [Na+]는 혼성화 완충액 내에서 나트륨 이온의 농도이다 (1xSSC에 대한 [Na+] = 0.165M). 바람직하게는, 각각의 이런 혼성화 핵산은 혼성화되는 본 발명의 핵산의 길이의 적어도 15개 뉴클레오티드 (또는 더욱 바람직하게는, 적어도 18개 뉴클레오티드, 또는 적어도 20개 뉴클레오티드, 또는 적어도 25개 뉴클레오티드, 또는 적어도 30개 뉴클레오티드, 또는 적어도 40개 뉴클레오티드, 또는 가장 바람직하게는, 적어도 50개 뉴클레오티드), 또는 적어도 25% (더욱 바람직하게는, 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 그리고 가장 바람직하게는, 적어도 80%)인 길이를 갖고, 그리고 혼성화되는 본 발명의 핵산과 적어도 60% 서열 동일성 (더욱 바람직하게는, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 그리고 가장 바람직하게는, 적어도 99.5%)을 갖고, 여기서 서열 동일성은 상기에 더욱 상세하게 설명된 바와 같이, 서열 갭이 최소화되면서 오버랩과 동일성이 최대화되도록 정렬될 때, 혼성화 핵산의 서열을 비교함으로써 결정된다.
본 발명에 따른 변이체는 통상적으로, 카세트 또는 PCR 돌연변이유발 또는 당분야에 널리 공지된 기타 기술을 이용한, 항원 결합 단백질을 인코딩하는 DNA에서 뉴클레오티드의 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 상기 변이체를 인코딩하는 DNA를 생산하고, 그리고 그 이후, 본원에서 개설된 바와 같이, 재조합 DNA를 세포 배양 동안 발현함으로써 제조된다. 하지만, 약 100-150개까지의 잔기를 갖는 변이체 CDR을 포함하는 항원 결합 단백질 단편은 확립된 기술을 이용한 시험관내 합성에 의해 제조될 수 있다. 변이체는 비록 하기에 더욱 상세하게 개설된 바와 같은 변형된 특징을 갖는 변이체가 선별될 수도 있지만, 전형적으로, 자연 발생 유사체와 동일한 정성적 생물학적 활성, 예를 들면, CD27L에 결합을 나타낸다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 유전자 코드의 축중성으로 인하여, 극히 많은 수의 핵산이 만들어질 수 있는데, 이들 모두 본 발명의 CDR (및 항원 결합 단백질의 중쇄와 경쇄 또는 기타 요소)을 인코딩한다. 따라서 특정 아미노산 서열이 확인되면, 당업자는 인코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 방식으로, 하나 이상의 코돈의 서열을 단순히 변경함으로써 다수의 상이한 핵산을 만들 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 바와 같은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 발현 벡터, 전사 또는 발현 카세트의 형태에서 발현 시스템과 구조체를 제시한다. 이에 더하여, 본 발명은 이런 발현 시스템 또는 구조체를 포함하는 숙주 세포를 제시한다.
전형적으로, 임의의 숙주 세포에서 이용되는 발현 벡터는 플라스미드 유지 및 외인성 뉴클레오티드 서열의 클로닝과 발현을 위한 서열을 내포할 것이다. 일정한 구체예에서, "측면 서열"로서 총칭되는 이런 서열은 하기 뉴클레오티드 서열 중에서 하나 이상을 전형적으로 포함할 것이다: 프로모터, 하나 이상의 인핸서 서열, 복제 기점, 전사 종결 서열, 공여자와 수용자 스플라이스 부위를 내포하는 완전한 인트론 서열, 폴리펩티드 분비를 위한 리더 서열을 인코딩하는 서열, 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 서열, 발현되는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 삽입하기 위한 폴리링커 영역, 그리고 선별가능 마커 원소. 이들 서열 각각은 하기에 논의된다.
선택적으로, 벡터는 "태그"-인코딩 서열, 다시 말하면, CD27L 항원 결합 단백질 코딩 서열의 5' 또는 3' 단부에 위치하는 올리고뉴클레오티드 분자를 내포할 수 있다; 상기 올리고뉴클레오티드 서열은 폴리His (가령, 헥사His), 또는 다른 "태그", 예를 들면, FLAG, HA (헤마글루티닌 인플루엔자 바이러스), 또는 myc를 인코딩하고, 이에 대한 상업적으로 가용한 항체가 존재한다. 이러한 태그는 전형적으로, 폴리펩티드의 발현 시에 폴리펩티드에 융합되고, 그리고 숙주 세포로부터 CD27L 항원 결합 단백질의 친화성 정제 또는 검출을 위한 수단으로서 역할할 수 있다. 친화성 정제는 예로서, 태그에 대한 항체를 친화성 기질로서 이용한 칼럼 크로마토그래피에 의해 달성될 수 있다. 선택적으로, 태그는 다양한 수단에 의해, 예를 들면, 절단을 위한 일정한 펩티다아제를 이용함으로써, 정제된 CD27L 항원 결합 단백질로부터 차후에 제거될 수 있다.
측면 서열은 동종성 (즉, 숙주 세포와 동일한 종 및/또는 균주로부터), 이종기원성 (즉, 숙주 세포 종 또는 균주 이외의 종으로부터), 하이브리드 (즉, 하나 이상의 공급원으로부터 측면 서열의 조합), 합성 또는 고유일 수 있다. 따라서 측면 서열의 공급원은 측면 서열이 숙주 세포 기구 내에서 기능적이고, 그리고 숙주 세포 기구에 의해 활성화될 수 있기만 하면, 임의의 원핵 또는 진핵 생물체, 임의의 척추 또는 무척추 생물체, 또는 임의의 식물일 수 있다.
본 발명의 벡터에서 유용한 측면 서열은 당분야에 널리 공지된 여러 방법 중에서 한 가지에 의해 획득될 수 있다. 전형적으로, 본원에서 유용한 측면 서열은 맵핑에 의해 및/또는 제한 엔도뉴클레아제 소화에 의해 이미 확인되었을 것이고, 따라서 적절한 제한 엔도뉴클레아제를 이용하여 적절한 조직 공급원으로부터 단리될 수 있다. 일부 경우에, 측면 서열의 완전 뉴클레오티드 서열이 알려져 있다. 여기서, 측면 서열은 핵산 합성 또는 클로닝에 대해 본원에서 설명된 방법을 이용하여 합성될 수 있다.
측면 서열의 전부 또는 단지 일부만 알려져 있는 지에 상관없이, 이것은 중합효소 사슬 반응 (PCR)을 이용하고 및/또는 적절한 프로브, 예를 들면, 동일한 또는 다른 종으로부터 올리고뉴클레오티드 및/또는 측면 서열 단편으로 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 획득될 수 있다. 측면 서열이 알려져 있지 않는 경우에, 측면 서열을 내포하는 DNA의 단편이 예로서, 코딩 서열 또는 심지어 다른 유전자 또는 유전자들을 내포할지도 모르는 DNA의 더욱 큰 조각으로부터 단리될 수 있다. 단리는 적절한 DNA 단편을 생산하기 위한 제한 엔도뉴클레아제 소화, 그 이후에 아가로즈 겔 정제, Qiagen® 칼럼 크로마토그래피 (Chatsworth, CA), 또는 당업자에게 공지된 기타 방법을 이용한 단리에 의해 달성될 수 있다. 이러한 목적을 달성하기 위한 적절한 효소의 선별은 당업자에게 명백할 것이다.
복제 기점은 전형적으로, 상업적으로 구입된 원핵 발현 벡터의 일부이고, 그리고 이러한 복제 기점은 숙주 세포에서 벡터의 증폭을 조력한다. 선택된 벡터가 복제 기점 부위를 내포하지 않으면, 이것은 공지된 서열에 기초하여 화학적으로 합성되고, 그리고 벡터 내로 결찰될 수 있다. 가령, 플라스미드 pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA)로부터 복제 기점은 대부분의 그람-음성 세균에 적합하고, 그리고 다양한 바이러스 기점 (가령, SV40, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 또는 유두종 바이러스, 예를 들면, HPV 또는 BPV)은 포유류 세포에서 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 요소는 포유류 발현 벡터에 필요하지 않다 (가령, SV40 기점은 종종, 단지 이것이 바이러스 초기 프로모터를 또한 내포하기 때문에 이용된다).
전사 종결 서열은 전형적으로, 폴리펩티드 코딩 영역의 단부의 3'에 위치하고 전사를 종결시키는 역할을 한다. 통상적으로, 원핵 세포에서 전사 종결 서열은 G-C 풍부한 단편이고, 폴리-T 서열이 그 뒤를 잇는다. 상기 서열은 라이브러리부터 쉽게 클로닝되거나 또는 심지어, 벡터의 일부로서 상업적으로 구입되긴 하지만, 핵산 합성을 위한 방법, 예를 들면, 본원에서 설명된 방법을 이용하여 쉽게 합성될 수도 있다.
선별가능 마커 유전자는 선별 배양 배지에서 성장된 숙주 세포의 생존과 성장에 필수적인 단백질을 인코딩한다. 전형적인 선별 마커 유전자는 (a) 원핵 숙주 세포의 경우에 항생제 또는 다른 독소, 예를 들면, 암피실린, 테트라사이클린, 또는 카나마이신에 대한 내성을 공여하고; (b) 세포의 영양요구성 결핍을 보충하고; 또는 (c) 복합 배지 또는 정의된 배지로부터 가용하지 않은 중요 영양소를 공급하는 단백질을 인코딩한다. 특정한 선별가능 마커는 카나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 그리고 테트라사이클린 내성 유전자이다. 유리하게는, 네오마이신 내성 유전자 역시 원핵과 진핵 숙주 세포 둘 모두에서 선별에 이용될 수 있다.
다른 선별가능 유전자는 발현되는 유전자를 증폭하는데 이용될 수 있다. 증폭은 성장 또는 세포 생존에 결정적인 단백질의 생산에 필요한 유전자가 재조합 세포의 연속 세대의 염색체 내에서 나란히 반복되는 과정이다. 포유류 세포에 대한 적절한 선별가능 마커의 실례에는 디히드로엽산 환원효소 (DHFR) 및 프로모터없는 티미딘 키나아제 유전자가 포함된다. 포유류 세포 형질전환체는 단지 형질전환체만 벡터 내에 존재하는 선별가능 유전자에 힘입어 생존에 유일하게 적응되는 선택 압력 하에 놓인다. 선택 압력은 배지 내에 선별 작용제의 농도가 연속적으로 증가되는 조건 하에 형질전환된 세포를 배양하고, 따라서 선별가능 유전자 및 다른 유전자, 예를 들면, CD27L 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 단백질 항체를 인코딩하는 DNA 둘 모두의 증폭을 유발함으로써 가해진다. 결과로서, 증가된 양의 폴리펩티드, 예를 들면, CD27L 항원 결합 단백질이 증폭된 DNA로부터 합성된다.
리보솜-결합 부위는 통상적으로, mRNA의 번역 개시에 필요하고 Shine-Dalgarno 서열 (원핵생물) 또는 Kozak 서열 (진핵생물)에 의해 특징된다. 상기 원소는 전형적으로, 프로모터의 3' 및 발현되는 폴리펩티드의 코딩 서열의 5'에 위치한다. 일정한 구체예에서, 하나 이상의 코딩 영역은 내부 리보솜 결합 부위 (IRES)에 작동가능하게 연결되고, 단일 RNA 전사체로부터 2개 개방 해독 틀의 번역을 가능하게 한다.
일부 경우에, 예를 들면, 당화가 진핵 숙주 세포 발현 시스템에서 요망되는 경우에, 당화 또는 수율을 향상시키기 위해 다양한 프리- 또는 프로서열을 조작할 수 있다. 가령, 특정 신호 펩티드의 펩티다아제 절단 부위를 변경하거나, 또는 프로서열을 부가할 수 있는데, 이것 역시 당화에 영향을 줄 수 있다. 최종 단백질 산물은 -1 위치 (성숙 단백질의 첫번째 아미노산에 비하여)에서 발현에 부수하는 하나 이상의 추가 아미노산을 가질 수 있는데, 이들은 완전히 제거되지 않을 수도 있다. 가령, 최종 단백질 산물은 아미노-말단에 부착된, 펩티다아제 절단 부위 내에서 발견되는 1개 또는 2개의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 대안으로, 일부 효소 절단 부위의 이용은 상기 효소가 성숙 폴리펩티드 내에서 이런 구역을 절단하면, 원하는 폴리펩티드의 약간 절두된 형태를 발생시킬 수 있다.
본 발명의 발현과 클로닝 벡터는 전형적으로, 숙주 생물체에 의해 인식되고 CD27L 항원 결합 단백질을 인코딩하는 분자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 내포한다. 프로모터는 구조 유전자의 전사를 제어하는, 구조 유전자의 출발 코돈 (일반적으로, 약 100 내지 1000 bp 이내)의 상류 (즉, 5')에 위치하는 비전사 서열이다. 프로모터는 2가지 부류 중에서 한 가지로 전통적으로 분류된다: 유도성 프로모터와 구조성 프로모터. 유도성 프로모터는 배양 조건에서 일부 변화, 예를 들면, 영양소의 존재 또는 부재 또는 온도에서 변화에 응하여 그들의 제어 하에 DNA로부터 증가된 수준의 전사를 개시한다. 다른 한편, 구조성 프로모터는 그들이 작동가능하게 연결된 유전자를 균등하게, 다시 말하면, 유전자 발현에서 제어가 거의 또는 전혀 없이 전사한다. 다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 널리 알려져 있다. 적절한 프로모터는 공급원 DNA로부터 프로모터를 제한 효소 소화에 의해 제거하고 원하는 프로모터 서열을 벡터 내로 삽입함으로써, 본 발명의 CD27L 항원 결합 단백질을 포함하는 중쇄 또는 경쇄를 인코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된다.
효모 숙주에 이용하기 적합한 프로모터 역시 당분야에 널리 알려져 있다. 효모 인핸서는 유리하게는, 효모 프로모터와 함께 이용된다. 포유류 숙주 세포에 이용하기 적합한 프로모터는 널리 알려져 있고, 여기에는 바이러스, 예를 들면, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (가령, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 가장 바람직하게는, 유인원 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터 획득된 것들이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 다른 적절한 포유류 프로모터에는 이종기원성 포유류 프로모터, 예를 들면, 열-쇼크 프로모터 및 액틴 프로모터가 포함된다.
관심되는 추가의 프로모터에는 SV40 초기 프로모터 (Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310); CMV 프로모터 (Thornsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. U.S.A. 81:659-663); 라우스 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복에 내포된 프로모터 (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797); 헤르페스 티미딘 키나아제 프로모터 (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-1445); 금속 티오닌 유전자로부터 프로모터와 조절 서열 (Prinster et al., 1982, Nature 296:39-42); 그리고 원핵 프로모터, 예를 들면, 베타-락타마아제 프로모터 (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731); 또는 tac 프로모터 (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 또한, 조직 특이성을 나타내고 유전자도입 동물에서 이용되는 하기 동물 전사 제어 영역이 관심된다: 췌장 소엽 세포에서 활동성인 엘라스타아제 I 유전자 제어 영역 (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); 췌장 베타 세포에서 활동성인 인슐린 유전자 제어 영역 (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); 림프구양 세포에서 활동성인 면역글로불린 유전자 제어 영역 (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444); 고환, 유방, 림프구양 세포와 비만 세포에서 활동성인 생쥐 유방 종양 바이러스 제어 영역 (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495); 간에서 활동성인 알부민 유전자 제어 영역 (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1 :268-276); 간에서 활동성인 알파-태아-단백질 유전자 제어 영역 (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 253:53-58); 간에서 활동성인 알파 1-안티트립신 유전자 제어 영역 (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171); 골수성 세포에서 활동성인 베타-글로빈 유전자 제어 영역 (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); 뇌에서 희돌기교세포에서 활동성인 수초 염기성 단백질 유전자 제어 영역 (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); 골격근에서 활동성인 미오신 경쇄-2 유전자 제어 영역 (Sani, 1985, Nature 314:283-286); 그리고 시상하부에서 활동성인 생식선자극-방출 호르몬 유전자 제어 영역 (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).
고등 진핵생물에 의한, 본 발명의 CD27L 항원 결합 단백질을 포함하는 경쇄 또는 중쇄를 인코딩하는 DNA의 전사를 증가시키기 위해 인핸서 서열이 벡터 내로 삽입될 수 있다. 인핸서는 프로모터 상에 작용하여 전사를 증가시키는, 통상적으로 약 10-300 bp 길이의 DNA의 시스-작용 원소이다. 인핸서는 상대적으로 방향과 위치 독립적이고, 전사 단위의 5'와 3' 둘 모두의 위치에서 발견된다. 포유류 유전자로부터 가용한 몇몇 인핸서 서열이 알려져 있다 (가령, 글로빈, 엘라스타아제, 알부민, 알파-태아-단백질 및 인슐린). 전형적으로, 하지만, 바이러스로부터 인핸서가 이용된다. 당분야에 알려진 SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 폴리오마 바이러스 인핸서, 그리고 아데노바이러스 인핸서는 진핵 프로모터의 활성화를 위한 예시적인 증강 원소이다. 인핸서는 벡터 내에서 코딩 서열의 5' 또는 3' 어느 한쪽에 위치할 수 있지만, 전형적으로 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다. 적절한 고유 또는 이종기원성 신호 서열 (리더 서열 또는 신호 펩티드)을 인코딩하는 서열은 항체의 세포외 분비를 증진하기 위해, 발현 벡터 내로 함입될 수 있다. 신호 펩티드 또는 리더의 선택은 항체가 생산되는 숙주 세포의 유형에 의존하고, 그리고 이종기원성 신호 서열이 고유 신호 서열을 대체할 수 있다. 포유류 숙주 세포에서 기능적인 신호 펩티드의 실례에는 하기가 포함된다: US 특허 번호 4,965,195에서 설명된 인터류킨-7 (IL-7)에 대한 신호 서열; Cosman et al.,1984, Nature 312:768에서 설명된 인터류킨-2 수용체에 대한 신호 서열; EP 특허 번호 0367 566에서 설명된 인터류킨-4 수용체 신호 펩티드; U.S. 특허 번호 4,968,607에서 설명된 타입 I 인터류킨-1 수용체 신호 펩티드; EP 특허 번호 0 460 846에서 설명된 타입 II 인터류킨-1 수용체 신호 펩티드.
벡터는 이러한 벡터가 숙주 세포 게놈 내로 함입될 때, 발현을 조장하는 하나 이상의 원소를 내포할 수 있다. 실례에는 EASE 원소 (Aldrich et al. 2003 Biotechnol Prog. 19:1433-38) 및 기반 부착 영역 (MAR)이 포함된다. MAR은 염색질의 구조 조직화를 매개하고 함입된 벡터를 "위치" 효과로부터 차단할 수 있다. 따라서 MAR은 벡터가 안정된 형질감염체를 산출하는데 이용될 때, 특히 유용하다. 다수의 자연과 합성 MAR-내포 핵산이 당분야에서, 예를 들면, U.S. 특허 번호 6,239,328; 7,326,567; 6,177,612; 6,388,066; 6,245,974; 7,259,010; 6,037,525; 7,422,874; 7,129,062에서 알려져 있다.
본 발명의 발현 벡터는 출발 벡터, 예를 들면, 상업적으로 구입가능한 벡터로부터 작제될 수 있다. 이런 벡터는 원하는 측면 서열 전부를 내포하거나 내포하지 않을 수 있다. 본원에서 설명된 하나 이상의 측면 서열이 벡터 내에 존재하지 않는 경우에, 이들은 개별적으로 획득되고 벡터 내로 결찰될 수 있다. 각각의 측면 서열을 획득하는데 이용되는 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다.
벡터가 작제되고, 그리고 CD27L 항원 결합 서열을 포함하는 경쇄, 중쇄, 또는 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 핵산 분자가 벡터의 적절한 부위 내로 삽입된 후, 완결된 벡터는 증폭 및/또는 폴리펩티드 발현을 위해 적절한 숙주 세포 내로 삽입될 수 있다. CD27L 항원 결합 단백질에 대한 발현 벡터의 선별된 숙주 세포 내로의 형질전환은 형질감염, 감염, 인산칼슘 공동-침전, 전기천공, 현미주입, 리포펙션, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 또는 기타 공지된 기술을 비롯한 널리 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다. 선별된 방법은 부분적으로, 이용되는 숙주 세포의 유형의 함수이다. 이들 방법 및 다른 적절한 방법은 당업자에게 널리 알려져 있고, 그리고 예로서, Sambrook et al., 2001, supra에 기재된다.
숙주 세포는 적절한 조건 하에 배양될 때, 배양 배지로부터 (숙주 세포가 CD27L 항원 결합 단백질을 배지 내로 분비하면) 또는 CD27L 항원 결합 단백질을 생산하는 숙주 세포로부터 직접적으로 (CD27L 항원 결합 단백질이 분비되지 않으면) 차후 수집될 수 있는 CD27L 항원 결합 단백질을 합성한다. 적절한 숙주 세포의 선별은 다양한 인자, 예를 들면, 원하는 발현 수준, 활성을 위해 바람직하거나 필요한 폴리펩티드 변형 (가령, 당화 또는 인산화) 및 생물학적으로 활성 분자로의 접힘의 용이성에 좌우될 것이다. 숙주 세포는 진핵 또는 원핵일 수 있다.
발현을 위한 숙주로서 이용가능한 포유류 세포주는 당분야에 널리 알려져 있고, 여기에는 American Type Culture Collection (ATCC)로부터 입수가능한 영속화 세포주가 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 그리고 당분야에 공지된 발현 시스템에 이용되는 임의의 세포주가 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 만드는데 이용될 수 있다. 일반적으로, 숙주 세포는 원하는 항-CD27L 항체 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된다. 이용될 수 있는 숙주 세포에는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵 세포가 포함된다. 원핵생물에는 그람 음성 또는 그람 양성 생물체, 예를 들면, 대장균 (E. coli) 또는 간균이 포함된다. 고등 진핵 세포에는 곤충 세포 및 포유류 기원의 확립된 세포주가 포함된다. 적절한 포유류 숙주 세포주의 실례에는 COS-7 원숭이 신장 세포주 (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., 1981, Cell 23:175), L 세포, 293 세포, C127 세포, 3T3 세포 (ATCC CCL 163), 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 혈청-없는 배지에서 이들의 유도체, 예를 들면, Veggie CHO 및 관련된 세포주 (Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28: 31), HeLa 세포, BHK (ATCC CRL 10) 세포주, 그리고 McMahan et al., 1991, EMBO J. 10: 2821에서 설명된 바와 같은 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주로부터 유래된 CVI/EBNA 세포주 CVI (ATCC CCL 70), 인간 태아 신장 세포, 예를 들면, 293, 293 EBNA 또는 MSR 293, 인간 상피 A431 세포, 인간 Colo205 세포, 기타 형질전환된 영장류 세포주, 정상 이배체 세포, 일차 조직의 시험관내 배양액으로부터 유래된 세포 계통, 일차 외식편, HL-60, U937, HaK 또는 Jurkat 세포가 포함된다. 선택적으로, 포유류 세포주, 예를 들면, HepG2/3B, KB, NIH 3T3 또는 S49는 예로서, 다양한 신호 전달 또는 리포터 검정에서 폴리펩티드를 이용하는 것이 바람직할 때, 폴리펩티드의 발현에 이용될 수 있다. 대안으로, 하등 진핵생물, 예를 들면, 효모에서 또는 원핵생물, 예를 들면, 세균에서 폴리펩티드를 생산하는 것이 가능하다. 적절한 효모에는 사카로미세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로미세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로미세스 (Kluyveromyces) 균주, 칸디다 (Candida), 또는 이종기원성 폴리펩티드를 발현할 수 있는 임의의 효모 균주가 포함된다. 적절한 세균 균주에는 대장균 (Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 또는 이종기원성 폴리펩티드를 발현할 수 있는 임의의 세균 균주가 포함된다. 폴리펩티드가 효모 또는 세균에서 만들어지면, 기능적 폴리펩티드를 획득하기 위해, 예로서 적절한 부위의 인산화 또는 당화에 의해, 그 내에 생산된 폴리펩티드를 변형하는 것이 바람직할 수 있다. 이런 공유 부착은 공지된 화학적 또는 효소적 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 폴리펩티드는 또한, 본 발명의 단리된 핵산을 하나 이상의 곤충 발현 벡터 내에 적절한 제어 서열에 작동가능하게 연결하고, 그리고 곤충 발현 시스템을 이용함으로써 생산될 수 있다. 배큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템을 위한 재료와 방법은 예로서, Invitrogen, San Diego, Calif., U.S.A. (the MaxBac® kit)로부터 키트 형태로 상업적으로 구입가능하고, 그리고 이런 방법은 Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987), 그리고 Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988)에서 설명된 바와 같이, 당분야에 널리 알려져 있다. 세포-없는 번역 시스템 역시 본원에서 개시된 핵산 구조체로부터 유래된 RNA를 이용하여 폴리펩티드를 생산하는데 활용될 수 있다. 세균, 진균, 효모, 그리고 포유류 세포 숙주에서 이용을 위한 적절한 클로닝과 발현 벡터는 Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985)에 의해 설명된다. 적어도 하나의 발현 제어 서열에 가급적 작동가능하게 연결된 본 발명의 단리된 핵산을 포함하는 숙주 세포는 "재조합 숙주 세포"이다.
일정한 구체예에서, 세포주는 어떤 세포주가 높은 발현 수준을 갖고, 그리고 CD27L 결합 성질을 갖는 항원 결합 단백질을 구조성으로 생산하는 지를 결정함으로써 선별될 수 있다. 다른 구체예에서, 자체 항체를 만들지 않지만 이종기원성 항체를 만들고 분비하는 능력을 갖는 B 혈통으로부터 세포주가 선별될 수 있다.
항체 약물 접합체
본 발명의 구체예는 항체 약물 접합체 (ADCs)를 포함한다. 일반적으로, ADC는 화학치료제, 예를 들면, 세포독성 작용제, 세포정지 작용제, 독소, 또는 방사성 작용제에 접합된 항체를 포함한다. 링커 분자는 약물을 항체에 접합하는데 이용될 수 있다. ADC 기술에 유용한 광범위한 링커와 약물은 당분야에 알려져 있고 본 발명의 구체예에서 이용될 수 있다. (US20090028856; US2009/0274713; US2007/0031402; WO2005/084390; WO2009/099728; US5208020; US5416064; US5475092; 5585499; 6436931; 6372738; 그리고 6340701 참조, 이들 모두 본원에서 참조로서 편입됨).
항체 약물 접합체는 시험관내 방법에 의해 제조될 수 있다. 약물 또는 프로드러그를 항체에 연결하기 위해, 연결 기가 이용된다. 적절한 연결 기는 당분야에 널리 알려져 있고, 여기에는 이황화 기, 산 불안정 기, 광불안정 기, 펩티다아제 불안정 기, 그리고 에스테라아제 불안정 기가 포함된다. 바람직한 연결 기는 이황화 기이다. 가령, 접합체는 항체와 약물 또는 프로드러그 사이에 이황화물 교환 반응을 이용하여 작제될 수 있다. 약물 분자는 또한, 중간 담체 분자, 예를 들면, 혈청 알부민을 통해 세포 결합 작용제에 연결될 수 있다.
일정한 구체예에서, 세포 결합 작용제는 이중기능성 교차결합 시약을 세포 결합 작용제와 반응시켜, 세포 결합 작용제에 링커 분자의 공유 부착을 유발함으로써 변형된다. 본원에서 이용된 바와 같이, "이중기능성 교차결합 시약" 또는 "링커"는 세포 결합 작용제를 약물, 예를 들면, 본원에서 설명된 약물에 공유 연결하는 임의의 화학적 모이어티이다. 본 발명의 특정 구체예에서, 연결 모이어티의 부분은 약물에 의해 제공된다. 이와 관련하여, 약물은 세포 결합 작용제를 약물에 연결하는데 이용되는 더욱 큰 링커 분자의 일부인 연결 모이어티를 포함한다. 가령, 메이탄시노이드 DM1을 형성하기 위해, 메이탄신의 C-3 히드록실 기에서 측쇄가 유리 설피드릴 기 (SH)를 갖도록 변형된다. 메이탄신의 이러한 티올화된 형태는 변형된 세포-결합 작용제와 반응하여 접합체를 형성할 수 있다. 이런 이유로, 최종 링커는 2가지 요소로부터 조립되는데, 이들 중에서 하나는 교차결합 시약에 의해 제공되고, 나머지 하나는 DM1로부터 측쇄에 의해 제공된다. 링커 시약이 각각, 약물과 세포 결합 작용제의 치료, 예를 들면, 세포독성, 그리고 표적화 특징의 유지를 제공하기만 하면, 임의의 적절한 이중기능성 교차결합 시약이 본 발명과 관련하여 이용될 수 있다. 바람직하게는, 링커 분자는 약물과 세포 결합 작용제가 서로에 화학적으로 결합 (가령, 공유 결합)되도록, 화학적 결합 (전술한 바와 같음)을 통해, 약물을 세포 결합 작용제에 연결한다. 링커
일정한 구체예에서, ADC는 하나 이상의 링커 요소로 구성된 링커를 포함한다. 바람직하게는, 약물은 이황화 결합을 통해 세포 결합 작용제에 연결된다. 링커 분자는 세포 결합 작용제와 반응할 수 있는 반응성 화학기를 포함한다. 세포 결합 작용제와의 반응을 위한 바람직한 반응성 화학기는 N-숙신이미딜 에스테르 및 N-술포숙신이미딜 에스테르이다. 부가적으로, 링커 분자는 약물과 반응하여 이황화 결합을 형성할 수 있는 반응성 화학기, 바람직하게는 디티오피리딜 기를 포함한다. 예시적인 링커 분자에는 예로서, N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피온산염 (SPDP) (예로서, Carlsson et al., Biochem. J., 173, 723-737 (1978) 참조), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오)부타노에이트 (SPDB) (예로서, U.S. 특허 번호 4,563,304 참조) 및 N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오)펜타노에이트 (SPP) (예로서, CAS 등록 번호 341498-08-6 참조)가 포함된다. 추가의 예시적인 링커 요소에는 6-말레이미도카프로일, 말레이미도프로파노일, 발린-시트룰린, 알라닌-페닐알라닌, p-아미노벤질옥시카르보닐, 그리고 N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트 ("SPP"), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1 카르복실레이트 ("SMCC", 본원에서 "MCC"로 지칭됨), 그리고 N-숙신이미딜 (4-요오드-아세틸) 아미노벤조산염 ("SIAB")이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 링커 시약과의 접합으로부터 발생하는 것들이 포함된다.
링커는 "절단가능" 링커 또는 "비-절단가능" 링커일 수 있다 (Ducry and Stump, Biocongugates Chem. 2010, 21, 5-13; 본원에서 전체로서 참조로서 편입된다). 절단가능 링커는 일정한 환경 인자에 종속될 때, 예를 들면, 표적 세포 내로 내재화될 때, 약물을 방출하도록 설계된다. 절단가능 링커에는 산 불안정 링커, 프로테아제 민감성 링커, 광 불안정 링커, 디메틸 링커 또는 이황화물-내포 링커가 포함된다. 비-절단가능 링커는 표적 세포에 의한 내재화 및 표적 세포 내에서 분해 시에, 항체의 적어도 하나의 아미노산 및 약물과 공유 연관된 상태로 존속하는 경향이 있다. 비-절단가능 링커는 약물, 예를 들면, 메이탄시노이드 (가령, DM1 등), 탁산, 또는 CC-1065 유사체를 세포 결합 작용제에 안정된 공유 방식으로 연결할 수 있는 임의의 화학적 모이어티이다. 따라서 비-절단가능 링커는 약물 또는 세포 결합 작용제가 활성 상태로 존속하는 조건에서, 산-유도된 절단, 광-유도된 절단, 펩티다아제-유도된 절단, 에스테라아제-유도된 절단, 그리고 이황화 결합 절단에 실질적으로 저항한다.
약물과 세포-결합 작용제 사이에 비-절단가능 링커를 형성하는 적절한 교차결합 시약은 당분야에 널리 알려져 있다. 비-절단가능 링커의 실례에는 세포 결합 작용제와 반응을 위한 N-숙신이미딜 에스테르 또는 N-술포숙신이미딜 에스테르 모이어티뿐만 아니라 약물과의 반응을 위한 말레이미도- 또는 할로아세틸-기초된 모이어티를 갖는 링커가 포함된다. 말레이미도-기초된 모이어티를 포함하는 교차결합 링커 시약에는 N-숙신이미딜 4-(말레이미도메틸)시클로헥산카르복실레이트 (SMCC), N-숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복시-(6-아미도카프로에이트), 이것은 SMCC의 "긴 사슬" 유사체 (LC-SMCC)이다, x-말레이미도운데칸산 N-숙신이미딜 에스테르 (KMUA), .감마.-말레이미도부티르산 N-숙신이미딜 에스테르 (GMBS), .엡실론.-말레이미도카프로산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (EMCS), m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (MBS), N-(.알파.-말레이미도아세톡시)-숙신이미드 에스테르 (AMAS), 숙신이미딜-6-(.베타.-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트 (SMPH), N-숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)-부티레이트 (SMPB), 그리고 N-(p-말레이미도페닐)이소시아네이트 (PMPI)가 포함된다. 할로아세틸-기초된 모이어티를 포함하는 교차결합 시약에는 N-숙신이미딜-4-(요오드아세틸)-아미노벤조산염 (SIAB), N-숙신이미딜 요오드아세테이트 (SIA), N-숙신이미딜 브로모아세테이트 (SBA), 그리고 N-숙신이미딜 3-(브로모아세트아미도)프로피온산염 (SBAP)이 포함된다. 예시적인 바람직한 비-절단가능 링커는 MCC이다.
비-절단가능 링커를 형성하는, 황 원자를 결여하는 다른 교차결합 시약 링커 역시 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. 이런 링커는 디카르복실산 기초된 모이어티로부터 유래될 수 있다. 적절한 디카르복실산 기초된 모이어티에는 일반식 (IX)의 알파,오메가-디카르복실산이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다:
HOOC-X1--Yn--Zm--COOH (IX),
여기서 X는 2 내지 20개 탄소 원자를 갖는 선형 또는 가지형 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 기이고, Y는 3 내지 10개 탄소 원자를 보유하는 시클로알킬 또는 시클로알케닐 기이고, Z는 6 내지 10개 탄소 원자를 보유하는 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 기, 또는 이형 원자가 N, O 또는 S에서 선택되고, 그리고 l, m, 그리고 n이 각각 0 또는 1이고, 단서로서 l, m, 그리고 n이 모두 동시에 0이 아닌 치환된 또는 치환되지 않은 이형환상 기이다.
본원에서 개시된 많은 비-절단가능 링커는 U.S. 특허 출원 공개 2005/0169933 A1에서 상세하게 설명된다. 적절한 절단가능 링커의 실례에는 이황화물 링커, 산 불안정 링커, 광 불안정 링커, 펩티다아제 불안정 링커, 그리고 에스테라아제 불안정 링커가 포함된다. 이황화물 내포 링커는 생리학적 조건 하에 발생할 수 있는 이황화물 교환을 통해 절단가능한 링커이다. 산 불안정 링커는 산성 pH에서 절단가능한 링커이다. 가령, 일정한 세포내 구획, 예를 들면, 엔도솜과 리소좀은 산성 pH (pH 4-5)를 갖고, 그리고 산 불안정 링커를 절단하는데 적합한 조건을 제공한다. 광 불안정 링커는 광이 접근가능한 신체 표면에서 및 많은 체강 내에서 유용하다. 게다가, 적외선은 조직을 투과할 수 있다. 펩티다아제 불안정 링커는 세포 내외에서 일정한 펩티드를 절단하는데 이용될 수 있다 (예로서, Trouet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 626-629 (1982), 그리고 Umemoto et al., Int. J. Cancer, 43, 677-684 (1989) 참조). 약물
일정한 구체예에서, 항체는 화학치료제에 접합된다. 화학치료제의 실례에는 알킬화제, 예를 들면, 티오테파 및 시클로포스파미드 (CYTOXAN.TM.); 알킬 술포네이트, 예를 들면, 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들면, 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸로멜라민을 비롯한 에틸렌이민과 메틸아멜라민; 아세토게닌 (특히, 불라탁신 및 불락타시논); 캄토테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴 칼리스타틴; CC-1065 (아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신 (특히, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CBI-TMI 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 겨자, 예를 들면, 클로람부실, 클로마파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 산화물 염산염, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 겨자; 니트로소우레아, 예를 들면, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예를 들면, 에네디인 항생제 (가령, 칼리키아마이신, 특히 칼리키아마이신 .감마1 및 칼리키아마이신 세타 I, 예로서, Angew Chem. Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994) 참조; 디네마이신 A를 비롯한 디네마이신; 에스페라마이신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 색소단백질 에네디인 항생성 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 안트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린; 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 니토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 퀘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질, 예를 들면, 메토트렉사트 및 5-플루오르우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들면, 데노프테린, 메토트렉사트, 프테로프테린, 트리메트렉사트; 퓨린 유사체, 예를 들면, 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들면, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐, 예를 들면, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피온산염, 에피티오스탄올, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신, 예를 들면, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물, 예를 들면, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉사트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 질산염; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 메이탄시노이드, 예를 들면, 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK.RTM.; 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테뉴아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들면, 파클리탁셀 (TAXOL.TM., Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 도세탁셀 (TAXOTERE.RTM., Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉사트; 백금 유사체, 예를 들면, 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 국소이성화효소 저해제 RFS 2000; 디플루오르메틸로미틴 (DMFO); 레티노산; 카페시타빈; 그리고 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다. 또한, 이러한 정의에는 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 저해하는 역할을 하는 항-호르몬제, 예를 들면, 항-에스트로겐, 예를 들면, 타목시펜, 랄록시펜, 방향화효소 저해 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 그리고 토레미펜 (Fareston); 그리고 항-안드로겐, 예를 들면, 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 그리고 고세렐린; siRNA 및 이의 제약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다. 본 발명에 이용될 수 있는 다른 화학치료제는 본원에서 참조로서 편입되는 US 공개 번호 20080171040 또는 US 공개 번호 20080305044에서 개시된다.
항체는 2개 또는 그 이상의 상이한 화학치료제에 접합되거나, 또는 제약학적 조성물은 항체의 혼합물을 포함하는 것으로 예기되고, 여기서 항체 요소는 상이한 화학치료제에 접합되는 점을 제외하고 동일하다. 이런 구체예는 표적 세포로 복수의 생물학적 경로를 표적화하는데 유용할 수 있다.
바람직한 구체예에서, ADC는 튜불린 중합화를 저해함으로써 작용하는 유사분열 저해제인 하나 이상의 메이탄시노이드 분자에 접합된 항체를 포함한다. 다양한 변형을 비롯한 메이탄시노이드는 US 특허 번호 3896111; 4151042; 4137230; 4248870; 4256746; 4260608; 4265814; 4294757; 4307016; 4308268; 4309428; 4313946; 4315929; 4317821; 4322348; 4331598; 4361650; 4364866; 4424219; 4450254; 4362663; 4371533; 그리고 WO 2009/099728에서 설명된다. 메이탄시노이드 약물 모이어티는 자연 공급원으로부터 단리되거나, 재조합 기술을 이용하여 생산되거나, 또는 합성적으로 제조될 수 있다. 예시적인 메이탄시노이드에는 C-19-데클로로 (US 특허 번호 4256746), C-20-히드록시 (또는 C-20-데메틸) +/- C-19-데클로로 (US 특허 번호 4307016과 4361650), C-20-데메톡시 (또는 C-20-아실옥시 (-OCOR), +/- 데클로로 (US 특허 번호 4294757), C-9-SH (US 특허 번호 4,424,219), C-14-알콕시메틸 (데메톡시/CH2OR) (U.S. 특허 번호 4,331,598), C-14-히드록시메틸 또는 아실옥시메틸 (CH2OH 또는 CH2OAc) (U.S. 특허 번호 4,450,254), C-15-히드록시/아실옥시 (U.S. 특허 번호 4,364,866), C-15-메톡시 (U.S. 특허 번호 4,313,946과 4,315,929), C-18-N-데메틸 (U.S. 특허 번호 4,362,663과 4,322,348), 그리고 4,5-데옥시 (U.S. 특허 번호 4,371,533)가 포함된다.
메이탄시노이드 화합물 상에서 다양한 위치가 원하는 연결의 유형에 따라, 연쇄 위치로서 이용될 수 있다. 가령, 에스테르 연쇄를 형성하기 위해, 히드록실 기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록실 기로 변형된 C-15 위치, 그리고 히드록실 기를 갖는 C-20 위치 모두 적합하다 (US 특허 번호 5208020, RE39151과 6913748; US 특허 출원 공개 번호 20060167245와 20070037972, 그리고 WO 2009099728).
바람직한 메이탄시노이드에는 당분야에서 DM1, DM3, 그리고 DM4로서 알려져 있는 것들이 포함된다 (US 특허 출원 공개 번호 2009030924와 20050276812, 본원에서 참조로서 편입됨).
메이탄시노이드를 내포하는 ADC, 이런 ADC를 제조하는 방법, 그리고 이들의 치료적 용도는 US 특허 번호 5208020과 5416064, US 특허 출원 공개 번호 20050276812, 그리고 WO 2009099728 (이들 모두 본원에 참조로서 편입된다)에서 개시된다. 메이탄시노이드 ADC를 만드는데 유용한 링커는 당분야에 알려져 있다 (US 특허 번호 5208020 및 US 특허 출원 공개 번호 2005016993과 20090274713; 이들 모두 본원에서 참조로서 편입된다). SMCC 링커를 포함하는 메이탄시노이드 ADC는 US 특허 공개 번호 2005/0276812에서 개시된 바와 같이 제조될 수 있다.
일정한 구체예에서, ADC는 SMCC 링커로 DM1에 접합된 항체를 포함한다. 바람직한 구체예에는 Ab1-SMCC-DM1, Ab2-SMCC-DM1, Ab3-SMCC-DM1, Ab4-SMCC-DM1, Ab5-SMCC-DM1, Ab6-SMCC-DM1, Ab7-SMCC-DM1, 그리고 Ab8-SMCC-DM1이 포함된다.
약물 부하
ADC는 항체마다 1 내지 20개의 화학치료제를 가질 수 있다. ADC의 조성물은 조성물 내에서 항체 분자마다 약물 모이어티의 평균 수에 의해 특징될 수 있다. 약물 모이어티의 평균 수는 전통적인 수단, 예를 들면, 질량 분광법, 면역검정, 그리고 HPLC에 의해 결정될 수 있다. 일부 경우에, 동종성 ADC 집단은 역상 HPLC 또는 전기영동에 의해 분리되고 정제될 수 있다. 따라서 제약학적 ADC 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 이상의 약물 모이어티에 연결된 항체의 이종성 또는 동종성 집단을 내포할 수 있다.
바람직한 구체예에서, ADC는 하나 이상의 DM1 분자에 접합된 항체를 포함한다. 본 발명의 구체예는 항체마다 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 또는 약 20개 DM1 분자의 평균을 갖는 조성물을 포함한다. 바람직한 ADC 조성물은 항체마다 평균적으로 1 내지 10개의 DM1 분자를 갖는 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, 또는 Ab8을 포함하는 것들, 항체마다 평균적으로 3 내지 7개의 DM1 분자를 갖는 항체를 포함하는 것들, 그리고 항체마다 약 4.0, 약 4.1, 약 4.2, 약 4.3, 약 4.4, 약 4.5, 약 4.6, 약 4.7, 약 4.8, 약 4.9, 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9 및 약 6.0 DM1 분자의 평균을 비롯하여, 평균적으로 4 내지 6개의 DM1 분자를 갖는 항체를 포함하는 것들이다.
작동체 기능-증강된 항체
항체의 Fc 부분의 기능 중의 한 가지는 항체가 표적에 결합할 때, 면역계와 소통하는 것이다. 이것은 "작동체 기능"으로 간주된다. 소통은 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC), 항체-의존성 세포 식작용 (ADCP), 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)으로 이어진다. ADCC와 ADCP는 면역계의 세포의 표면 상에서 Fc 수용체에 Fc의 결합을 통해 매개된다. CDC는 보체계의 단백질, 예를 들면, C1q와 Fc의 결합을 통해 매개된다.
IgG 하위부류는 작동체 기능을 매개하는 그들의 능력이 상이하다. 가령, IgG1은 ADCC와 CDC를 매개함에 있어서 IgG2와 IgG4보다 훨씬 우월하다. 따라서 CD27L을 발현하는 세포가 파괴를 위해 표적화되는 구체예에서, 항-CD27L IgG1 항체가 선호될 것이다.
항체의 작동체 기능은 하나 이상의 돌연변이를 Fc 내로 도입함으로써, 증가되거나 또는 감소될 수 있다. 본 발명의 구체예는 작동체 기능을 증가시키기 위해 조작된 Fc를 갖는 항원 결합 단백질, 예를 들면, 항체를 포함한다 (U.S. 7,317,091 및 Strohl, Curr. Opin. Biotech., 20:685-691, 2009; 이들 둘 모두 본원에서 전체로서 참조로서 편입된다). 증가된 작동체 기능을 갖는 예시적인 IgG1 Fc 분자에는 하기 치환을 갖는 것들이 포함된다 (Kabat 넘버링 계획에 기초됨):
S239D/I332E
S239D/A330S/I332E
S239D/A330L/I332E
S298A/D333A/K334A
P247I/A339D
P247I/A339Q
D280H/K290S
D280H/K290S/S298D
D280H/K290S/S298V
F243L/R292P/Y300L
F243L/R292P/Y300L/P396L
F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L
G236A/S239D/I332E
K326A/E333A
K326W/E333S
K290E/S298G/T299A
K290N/S298G/T299A
K290E/S298G/T299A/K326E
K290N/S298G/T299A/K326E
본 발명의 추가의 구체예는 작동체 기능을 감소시키기 위해 조작된 Fc를 갖는 항원 결합 단백질, 예를 들면, 항체를 포함한다. 감소된 작동체 기능을 갖는 예시적인 Fc 분자에는 하기 치환을 갖는 것들이 포함된다 (Kabat 넘버링 계획에 기초됨):
N297A (IgG1)
L234A/L235A (IgG1)
V234A/G237A (IgG2)
L235A/G237A/E318A (IgG4)
H268Q/V309L/A330S/A331S (IgG2)
C220S/C226S/C229S/P238S (IgG1)
C226S/C229S/E233P/L234V/L235A (IgG1)
L234F/L235E/P331S (IgG1)
S267E/L328F (IgG1)
IgG Fc-내포 단백질의 작동체 기능을 증가시키는 다른 방법은 Fc의 푸코실화를 감소시키는 것이다. Fc에 부착된 비안테나리 (biantennary) 복합체-유형 저당류로부터 코어 푸코오스의 제거는 항원 결합 또는 CDC 작동체 기능을 변화시키지 않으면서, ADCC 작동체 기능을 상당히 증가시켰다. Fc-내포 분자, 예를 들면, 항체의 푸코실화를 감소시키거나 소멸시키기 위한 몇 가지 방법이 알려져 있다. 이들에는 FUT8 적중 세포주, 변이체 CHO 세포주 Lec13, 쥐 하이브리도마 세포주 YB2/0, FUT8 유전자에 대해 특이적으로 소형 간섭 RNA를 포함하는 세포주, 그리고 B-1,4-N-아세틸글루코사미닐전이효소 III 및 골지 α-만노시다아제 II를 동시 발현하는 세포주를 비롯한 일정한 포유류 세포주에서 재조합 발현을 포함한다. 대안으로, Fc-내포 분자는 비-포유류 세포, 예를 들면, 식물 세포, 효모, 또는 원핵 세포, 예를 들면, 대장균 (E. coli)에서 발현될 수 있다. 따라서 본 발명의 일정한 구체예에서, 조성물은 감소된 푸코실화를 갖거나 또는 푸코실화를 완전히 결여하는 항체, 예를 들면, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, 또는 Ab8을 포함한다.
제약학적 조성물
일부 구체예에서, 본 발명은 제약학적으로 효과적인 희석제, 담체, 용해제, 유화제, 보존제, 및/또는 어쥬번트와 함께, 하나 또는 복수의 본 발명의 항원 결합 단백질의 치료 유효량을 포함하는 제약학적 조성물을 제시한다. 일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 약물-접합된 항체 또는 이중특이적 항체를 비롯한 항체이다. 본 발명의 제약학적 조성물에는 액체, 냉동, 그리고 동결건조된 조성물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
바람직하게는, 조제 물질은 이용된 용량과 농도에서 수용자에게 비독성이다. 특정 구체예에서, CD27L 항원 결합 단백질, 예를 들면, CD27L-결합 ADC의 치료 유효량을 포함하는 제약학적 조성물이 제시된다.
일정한 구체예에서, 제약학적 조성물은 예로서, 조성물의 pH, 삼투성, 점성, 투명도, 색, 등장성, 냄새, 멸균, 안정성, 용해 또는 방출의 속도, 흡착 또는 침투를 변경하거나, 유지하거나 또는 보존하기 위한 조제 물질을 내포할 수 있다. 이런 구체예에서, 적절한 조제 물질에는 아미노산 (가령, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 프롤린, 또는 리신); 항균제; 항산화제 (가령, 아스코르브산, 아황산나트륨 또는 아황산수소나트륨); 완충액 (가령, 붕산염, 중탄산염, Tris-HCl, 구연산염, 인산염 또는 기타 유기산); 증량제 (가령, 만니톨 또는 글리신); 킬레이트화제 (가령, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA)); 착화제 (가령, 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린 또는 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린); 충전제; 단당류; 이당류; 그리고 기타 탄수화물 (가령, 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린); 단백질 (가령, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린); 착색제, 방향제와 희석제; 유화제; 친수성 중합체 (가령, 폴리비닐피롤리돈); 낮은 분자량 폴리펩티드; 염-형성 반대이온 (가령, 나트륨); 보존제 (가령, 벤잘코늄 염화물, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 펜에틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소); 용매 (가령, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜); 당 알코올 (가령, 만니톨 또는 소르비톨); 현탁제; 계면활성제 또는 전착제 (가령, pluronics, PEG, 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트, 예를 들면, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트, 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 틸록사팔); 안정성 증진제 (가령, 수크로오스 또는 소르비톨); 토니시티 증진제 (가령, 알칼리성 금속 할로겐 화합물, 바람직하게는 나트륨 또는 칼륨 염화물, 만니톨 소르비톨); 전달 운반체; 희석제; 부형제 및/또는 제약학적 어쥬번트가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18" Edition, (A. R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company을 참조한다.
일정한 구체예에서, 최적 제약학적 조성물은 예로서, 의도된 투여 루트, 전달 형식 및 원하는 용량에 따라 당업자에 의해 결정될 것이다. 예로서, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra를 참조한다. 일정한 구체예에서, 이런 조성물은 본 발명의 항원 결합 단백질의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출의 속도 및 생체내 제거의 속도에 영향을 줄 수 있다. 일정한 구체예에서, 제약학적 조성물 내에서 일차적인 운반체 또는 담체는 성격에서 수성 또는 비-수성일 수 있다. 가령, 적절한 운반체 또는 담체는 아마도 비경구 투여를 위한 조성물에서 통상적인 다른 물질로 보충된 주사용수, 생리학적 식염수 용액 또는 인공 수액일 수 있다. 혈청 알부민과 혼합된 중성 완충된 식염수 또는 식염수는 추가의 예시적인 운반체이다. 특정 구체예에서, 제약학적 조성물은 약 pH 7.0-8.5의 Tris 완충액, 또는 약 pH 4.0-5.5의 아세테이트 완충액을 포함하고, 그리고 소르비톨 또는 이의 적절한 대체제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 일정한 구체예에서, CD27L 항원 결합 단백질 조성물은 원하는 정도의 순도를 갖는 선별된 조성물을 선택적 조제 작용제 (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra)와 동결건조된 덩어리 또는 수성 용액의 형태에서 혼합함으로써 보관용으로 제조될 수 있다. 게다가, 일정한 구체예에서, CD27L 항원 결합 단백질 산물은 적절한 부형제, 예를 들면, 수크로오스를 이용하여 리오필리제이트 (lyophilizate)로서 조제될 수 있다.
본 발명의 제약학적 조성물은 비경구 전달을 위해 선별될 수 있다. 대안으로, 조성물은 흡입을 위해 또는 소화관을 통한, 예를 들면, 경구 전달을 위해 선별될 수 있다. 이런 제약학적으로 허용되는 조성물의 제조는 당업자의 능력 범위 내에 있다. 제제 요소는 가급적, 투여 부위에 허용되는 농도로 존재한다. 일정한 구체예에서, 완충액은 생리학적 pH 또는 약간 더 낮은 pH에서, 전형적으로 약 5 내지 약 8의 pH 범위 내에 조성물을 유지하는데 이용된다.
비경구 투여가 예기될 때, 본 발명에서 이용을 위한 치료 조성물은 제약학적으로 허용되는 운반체 내에 원하는 CD27L 항원 결합 단백질을 포함하는, 발열원-없는, 비경구 허용되는 수성 용액의 형태로 제공될 수 있다. 비경구 주사를 위한 특히 적합한 운반체는 CD27L 항원 결합 단백질이 무균 등장성 용액으로서 조제되고, 적절하게 보존되는 무균 증류수이다. 일정한 구체예에서, 제조는 데포 주사 (depot injection)를 통해 전달될 수 있는 산물의 제어된 또는 지속된 방출을 제공하는 작용제, 예를 들면, 주사가능 미소구체, 생물-침식성 입자, 중합성 화합물 (가령, 폴리젖산 또는 폴리글리콜산), 구슬 또는 리포좀으로 원하는 분자의 조제를 수반할 수 있다. 일정한 구체예에서, 순환에서 지속된 존속을 증진하는 효과를 갖는 히알루론산 역시 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 이식가능 약물 전달 장치가 원하는 항원 결합 단백질을 도입하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 제약학적 조성물은 흡입용으로 조제될 수 있다. 이들 구체예에서, CD27L 항원 결합 단백질은 유리하게는, 건성, 흡입가능 분말로서 조제된다. 특정 구체예에서, CD27L 항원 결합 단백질 흡입 용액은 또한, 에어로졸 전달을 위한 추진제를 이용하여 조제될 수도 있다. 일정한 구체예에서, 용액은 분무될 수 있다. 폐 투여 및 이를 위한 조제 방법은 국제 특허 출원 번호 PCT/US94/001875에서 더욱 설명되는데, 이것은 참조로서 편입되고 화학적으로 변형된 단백질의 폐 전달을 설명한다.
또한, 제제는 경구 투여될 수 있는 것으로 예기된다. 이러한 방식으로 투여되는 CD27L 항원 결합 단백질은 고형 제형, 예를 들면, 정제와 캡슐의 배합에 통상적으로 이용되는 담체를 이용하여 또는 담체 없이 조제될 수 있다. 일정한 구체예에서, 캡슐은 생물학적이용효율이 극대화되고 전신 순환 전 분해 (pre-systemic degradation)가 최소화되는 위장관내 지점에서 제제의 활성 부분을 방출하도록 설계될 수 있다. CD27L 항원 결합 단백질의 흡수를 조장하는 추가의 작용제가 포함될 수 있다. 희석제, 풍미제, 낮은 융점 왁스, 식물성 오일, 윤활제, 현탁제, 정제 붕해제, 그리고 접합제 역시 이용될 수 있다.
지속된- 또는 제어된-전달 제제에서 CD27L 항원 결합 단백질을 포함하는 제제를 비롯한 추가의 제약학적 조성물은 당업자에게 명백할 것이다. 다양한 다른 지속된- 또는 제어된-전달 수단, 예를 들면, 리포좀 담체, 생물-침식성 미세입자 또는 다공성 구슬 및 데포 주사를 조제하기 위한 기술 역시 당업자에게 알려져 있다. 예로서, 국제 특허 출원 번호 PCT/US93/00829를 참조하는데, 이것은 참조로서 편입되고 제약학적 조성물의 전달을 위한 다공성 중합성 미세입자의 제어된 방출을 설명한다. 지속된-방출 제조물은 정형된 물품, 예를 들면, 필름, 또는 미세캡슐의 형태에서 반투과성 중합체 기반을 포함할 수 있다. 지속된 방출 기반은 폴리에스테르, 히드로겔, 폴리락티드 (U.S. 특허 번호 3,773,919 및 유럽 특허 출원 공개 번호 EP 058481에서 개시된 바와 같고, 이들 각각은 참조로서 편입된다), L-글루타민산과 감마 에틸-L-글루타민산염의 공중합체 (Sidman et al., 1983, Biopolymers 2:547-556), 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 및 Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), 에틸렌 비닐 아세테이트 (Langer et al., 1981, supra) 또는 폴리-D(-)-3-히드록시부티르산 (유럽 특허 출원 공개 번호 EP 133,988)을 포함할 수 있다. 지속된 방출 조성물은 또한, 당분야에 공지된 여러 방법 중에서 한 가지에 의해 제조될 수 있는 리포좀을 포함할 수 있다. 예로서, 참조로서 편입되는 Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3688-3692; 유럽 특허 출원 공개 번호 EP 036,676; EP 088,046과 EP 143,949를 참조한다.
생체내 투여에 이용되는 제약학적 조성물은 전형적으로, 무균 제조물로서 제공된다. 멸균은 무균 여과 막을 통한 여과에 의해 달성될 수 있다. 조성물이 동결건조될 때, 이러한 방법을 이용한 멸균은 동결건조와 재구성 이전에 또는 이후에 수행될 수 있다. 비경구 투여를 위한 조성물은 동결건조된 형태로 또는 용액으로 보관될 수 있다. 비경구 조성물은 일반적으로, 무균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들면, 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개가 달린 정맥내 용액 가방 또는 바이알 내로 배치된다.
본 발명의 양상은 자기-완충 CD27L 항원 결합 단백질 제제를 포함하는데, 이것은 본원에 전체로서 참조로서 편입되는 국제 특허 출원 WO 06138181A2 (PCT/US2006/022599)에서 설명된 바와 같이, 제약학적 조성물로서 이용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 일정한 구체예는 CD27L 항원 결합 단백질 이외에, 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 본 단락 및 본원의 다른 곳에서 예시적으로 설명된 것들을 포함하는 CD27L 항원 결합 단백질 조성물, 특히 제약학적 CD27L 항원 결합 단백질 조성물을 제시한다. 본 발명에서 부형제는 이와 관련하여, 다양한 목적, 예를 들면, 제제의 물리적, 화학적, 또는 생물학적 성질의 조정, 예를 들면, 점성의 조정, 및/또는 효능을 향상시키고 및/또는 이런 제제를 안정화시키기 위한 본 발명의 공정 및/또는 예로서, 제조, 선적, 보관, 사용전 준비, 투여, 그리고 그 이후에 발생하는 스트레스에 기인한 분해와 손상에 대항하기 위한 공정에 이용될 수 있다.
다양한 공개, 예를 들면, Arakawa et al., "Solvent interactions in pharmaceutical formulations," Pharm Res. 8(3): 285-91 (1991); Kendrick et al., "Physical stabilization of proteins in aqueous solution," in: RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE, Carpenter and Manning, eds. Pharmaceutical Biotechnology. 13: 61-84 (2002), 그리고 Randolph et al., "Surfactant-protein interactions," Pharm Biotechnol. 13: 159-75 (2002)가 이와 관련하여 유용한 단백질 안정화 및 조제 물질과 방법에 가용한데, 이들 각각은 특히, 부분적으로 부형제 및 본 발명에 따른 자기-완충 단백질 제제를 위한 이들의 공정에 관해, 특히 수의 및/또는 인간 의학 용도를 위한 단백질 제약학적 산물과 공정에 관해 본원에서 전체로서 참조로서 편입된다.
예로서, 제제의 이온 강도 및/또는 등장성을 조정하고 및/또는 본 발명에 따른 조성물의 단백질 또는 다른 성분의 용해성 및/또는 물리적 안정성을 향상시키기 위해, 본 발명의 일정한 구체예에 따라서 염이 이용될 수도 있다.
널리 알려진 바와 같이, 이온은 단백질의 표면 상에서 하전된 잔기에 결합에 의해, 그리고 단백질 내에서 하전된 기와 극성 기를 보호하고 이들의 정전 상호작용, 인력 상호작용, 그리고 반발 상호작용의 강도를 감소시킴으로써, 단백질의 고유 상태를 안정화시킬 수 있다. 이온은 또한, 특히 단백질의 변성된 펩티드 연쇄 (--CONH)에 결합에 의해 단백질의 변성된 상태를 안정화시킬 수 있다. 게다가, 단백질 내에서 하전된 기와 극성 기와의 이온 상호작용은 또한, 분자간 정전 상호작용을 감소시키고, 따라서 단백질 응집과 불안정성을 예방하거나 감소시킬 수 있다.
이온 종류는 단백질에 대한 그들의 효과에서 유의미하게 상이하다. 본 발명에 따른 제약학적 조성물을 조제하는데 이용될 수 있는 다수의 단정적 등급의 이온 및 단백질에 대한 이들의 효과가 개발되었다. 한 가지 실례는 호프마이스터 계열인데, 이것은 용해 상태에서 단백질의 입체 형태적 안정성에 대한 그들의 효과에 의해 이온과 극성 비-이온 용질을 등급 매긴다. 안정화 용질은 "코스모트로픽 (kosmotropic)"으로 지칭된다. 불안정화 용질은 "카오트로픽 (chaotropic)"으로 지칭된다. 코스모트로프 (kosmotrope)는 통상적으로, 용액으로부터 단백질을 침전시키기 위해 높은 농도 (가령, >1 몰 황산암모늄)에서 이용된다 ("염석 (salting-out)"). 카오트로프 (chaotrope)는 통상적으로, 단백질을 변성하고 및/또는 용해시키는데 이용된다 ("염용 (salting-in)"). "염용" 및 "염석"하는 이온의 상대적 효능은 호프마이스터 계열에서 그들의 위치를 정의한다.
유리 아미노산은 본 발명의 다양한 구체예에 따른 CD27L 항원 결합 단백질 제제에서 증량제, 안정제, 그리고 항산화제뿐만 아니라 다른 표준 용도로서 이용될 수 있다. 리신, 프롤린, 세린, 그리고 알라닌은 제제에서 단백질을 안정시키는데 이용될 수 있다. 글리신은 동결건조 동안 정확한 덩어리 구조와 성질을 담보하는데 유용하다. 아르기닌은 액체와 동결건조된 제제 둘 모두에서 단백질 응집을 저해하는데 유용할 수 있다. 메티오닌은 항산화제로서 유용하다.
폴리올에는 당류, 예를 들면, 만니톨, 수크로오스와 소르비톨 및 다가 알코올, 예를 들면, 글리세롤과 프로필렌 글리콜, 그리고 본원에서 논의의 목적으로, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 관련된 물질이 포함된다. 폴리올은 코스모트로픽이다. 이들은 단백질을 물리적 및 화학적 분해 과정으로부터 보호하기 위해, 액체와 동결건조된 제제 둘 모두에서 유용한 안정화 작용제이다. 폴리올은 또한, 제제의 토니시티를 조정하는데 유용하다.
본 발명의 선별 구체예에서 유용한 폴리올에는 동결건조된 제제에서 덩어리의 구조적 안정성을 담보하는데 통상적으로 이용되는 만니톨이 포함된다. 이것은 덩어리에 구조적 안정성을 담보한다. 이것은 일반적으로, 냉동건조보호제, 예를 들면, 수크로오스와 함께 이용된다. 소르비톨과 수크로오스는 토니시티를 조정하기 위한 작용제 및 제조 공정 동안 벌크의 수송 또는 제조 동안 냉동-해동 스트레스로부터 보호하는 안정제로서 바람직하다. 환원 당 (이들은 유리 알데히드 또는 케톤 기를 내포한다), 예를 들면, 글루코오스와 락토오스는 표면 리신과 아르기닌 잔기를 당화시킬 수 있다. 이런 이유로, 이들은 일반적으로, 본 발명에 따라서 이용하기 바람직한 폴리올에 포함되지 않는다. 이에 더하여, 산성 조건 하에 프럭토오스와 글루코오스로 가수분해되고, 그리고 결과적으로, 당화 (glycation)를 일으키는 이런 반응성 화학종을 형성하는 당류, 예를 들면, 수크로오스 역시 이와 관련하여, 본 발명의 바람직한 폴리올에 포함되지 않는다. PEG는 단백질을 안정화시키는데 유용하고, 그리고 이와 관련하여 본 발명에서 동결방지제로서 이용될 수 있다.
CD27L 항원 결합 단백질 제제의 구체예는 계면활성제를 더 포함한다. 단백질 분자는 표면 상에 흡착, 그리고 공기-액체, 고체-액체와 액체-액체 계면에서 변성 및 결과적으로 발생하는 응집에 취약할 수 있다. 이들 효과는 일반적으로, 단백질 농도와 반비례한다. 이들 유해한 상호작용은 일반적으로, 단백질 농도와 반비례하고, 그리고 전형적으로, 예로서 산물의 선적과 취급 동안 발생된 물리적 동요에 의해 악화된다.
계면활성제는 표면 흡착을 예방하거나, 최소화시키거나, 또는 감소시키는데 일과적으로 이용된다. 본 발명에서 이와 관련하여 유용한 계면활성제에는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 소르비탄 폴리에톡실레이트의 다른 지방산 에스테르, 그리고 폴록사머 188이 포함된다.
계면활성제는 또한, 단백질의 입체 형태적 안정성을 제어하는데 통상적으로 이용된다. 이와 관련하여 계면활성제의 이용은 단백질-특이적인데, 그 이유는 임의의 소정의 계면활성제가 전형적으로, 일부 단백질을 안정화시키고 다른 단백질을 불안정시킬 것이기 때문이다.
폴리소르베이트는 산화성 분해에 취약하고, 그리고 종종, 공급될 때 단백질 잔기 측쇄, 특히 메티오닌의 산화를 유발할 만큼 충분한 양의 과산화물을 내포한다. 결과적으로, 폴리소르베이트는 조심스럽게 이용되어야 하고, 그리고 이용될 때, 가장 낮은 효과 농도에서 이용되어야 한다. 이와 관련하여, 폴리소르베이트는 부형제가 가장 낮은 효과 농도에서 이용되어야 한다는 일반 규정의 모범이 된다.
CD27L 항원 결합 단백질 제제의 구체예는 하나 이상의 항산화제를 더 포함한다. 단백질의 유해한 산화는 적절한 수준의 주변 산소와 온도를 유지하고 빛에 대한 노출을 피함으로써, 제약학적 제제에서 어느 정도 예방될 수 있다. 단백질의 산화성 분해를 예방하기 위해 항산화성 부형제 역시 이용될 수 있다. 이와 관련하여 유용한 항산화제에는 환원제, 산소/유리-라디칼 소거제, 그리고 킬레이트화제가 포함된다. 본 발명에 따른 치료 단백질 제제에서 이용을 위한 항산화제는 바람직하게는, 물-가용성이고 산물의 유통 기간 내내 그들의 활성을 유지한다. EDTA는 이와 관련하여 본 발명에 따른 바람직한 항산화제이다.
항산화제는 단백질을 손상시킬 수 있다. 가령, 환원제, 예를 들면, 특히 글루타티온은 분자내 이황화 연쇄를 파괴할 수 있다. 따라서 본 발명에서 이용을 위한 항산화제는 그 중에서도 특히, 그들 자체가 제제 내에서 단백질을 손상시키는 가능성이 배제되거나 또는 충분히 감소하도록 선별된다.
본 발명에 따른 제제는 단백질 보조-인자이고 단백질 배위 복합체 (coordination complex)를 형성하는데 필요한 금속 이온, 예를 들면, 일정한 인슐린 현탁액을 형성하는데 필요한 아연을 포함할 수 있다. 금속 이온은 또한, 단백질을 분해하는 일부 과정을 저해할 수 있다. 하지만, 금속 이온은 또한, 단백질을 분해하는 물리적 및 화학적 과정을 촉진한다.
마그네슘 이온 (10-120 mM)은 아스파르트산의 이소아스파르트산으로의 이성화 (isomerization)를 저해하는데 이용될 수 있다. Ca+2 이온 (100 mM까지)은 인간 데옥시리보뉴클레아제의 안정성을 증가시킬 수 있다. Mg+2, Mn+2와 Zn+2는 하지만, rhDNase를 불안정시킬 수 있다. 유사하게, Ca+2와 Sr+2는 인자 VIII를 안정화시키고, 이것은 Mg+2, Mn+2와 Zn+2, Cu+2와 Fe+2에 의해 불안정될 수 있고, 그리고 이의 응집은 Al+3 이온에 의해 증가될 수 있다.
CD27L 항원 결합 단백질 제제의 구체예는 하나 이상의 보존제를 더 포함한다. 보존제는 동일한 용기로부터 1회 이상의 추출을 수반하는 복수-분량 비경구 제제를 개발할 때 필요하다. 이들의 일차적인 기능은 미생물 성장을 저해하고 약물 산물의 유통 기한 또는 이용 연한 내내 산물 무균을 담보하는 것이다. 통상적으로 이용되는 보존제에는 벤질 알코올, 페놀 및 m-크레졸이 포함된다. 비록 보존제가 소형-분자 비경구 제제에 오랫동안 이용되고 있긴 하지만, 보존제를 포함하는 단백질 제제의 개발은 도전적일 수 있다. 보존제는 거의 항상, 단백질에 대한 불안정화 효과 (응집)를 갖고, 그리고 이것은 복수-분량 단백질 제제에서 이들의 이용을 제한하는 주요 인자가 된다. 현재까지, 대부분의 단백질 약물은 단지 1회용으로 조제되고 있다. 하지만, 복수-분량 제제가 가능할 때, 이들은 환자 편의, 그리고 증가된 시장성을 가능하게 하는 추가된 이점을 갖는다. 우수한 실례는 보존된 제제의 개발이 더욱 편의한 다용도 주사 펜 프레젠테이션의 상업화로 이어진 인간 성장 호르몬 (hGH)이다. hGH의 보존된 제제를 내포하는 적어도 4가지 이와 같은 펜 장치가 현재 시판되고 있다. Norditropin (액체, Novo Nordisk), Nutropin AQ (액체, Genentech) & Genotropin (동결건조된-이중 챔머 카트리지, Pharmacia & Upjohn)는 페놀을 내포하는 반면, Somatrope (Eli Lilly)는 m-크레졸로 조제된다.
보존된 제형의 조제와 개발 동안 몇몇 양상이 고려되어야 한다. 약물 산물에서 효과적인 보존제 농도가 최적화되어야 한다. 이것은 단백질 안정성을 약화시키지 않으면서, 항-미생물 효능을 공여하는 농도 범위를 갖는 제형에서 소정의 보존제를 조사하는 것을 필요로 한다.
예상된 바와 같이, 보존제를 내포하는 액체 제제의 개발은 동결건조된 제제보다 더욱 도전적이다. 냉동-건조된 산물은 보존제 없이 동결건조되고 이용 시점에서 희석제를 내포하는 보존제로 재구성될 수 있다. 이것은 보존제가 단백질과 접촉하는 시간을 단축시키고, 연관된 안정성 위험을 유의미하게 최소화시킨다. 액체 제제에서, 보존제 유효성과 안정성은 전체 산물 유통 기한 (.약.18 내지 24개월) 내내 유지되어야 한다. 주목해야 하는 중요한 점은 보존제 유효성이 활성 약물 및 모든 부형제 요소를 내포하는 최종 제제에서 증명되어야 한다는 것이다.
CD27L 항원 결합 단백질 제제는 일반적으로, 특히 생물학적이용효율과 지속성의 범위에서, 특정한 투여 루트와 방법, 특정한 투여량과 투여 빈도, 특정한 질환의 특정한 치료에 맞게 설계될 것이다. 따라서 제제는 입, 귀, 눈, 직장, 그리고 질이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 적절한 루트, 그리고 정맥내와 동맥내 주사, 근육내 주사, 그리고 피하 주사를 비롯한 비경구 루트에 의한 전달을 위해 본 발명에 따라서 설계될 수 있다.
일단 제약학적 조성물이 조제되면, 이것은 무균 바이알에서 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고체, 결정, 또는 탈수된 또는 동결건조된 분말로서 보관될 수 있다. 이런 제제는 즉시 사용 형태 또는 투여에 앞서 재구성되는 형태 (가령, 동결건조된)로 보관될 수 있다. 본 발명은 또한, 1회용 투여 단위를 생산하기 위한 키트를 제시한다. 본 발명의 키트는 건조된 단백질을 갖는 첫번째 용기 및 수성 제제를 갖는 두번째 용기 둘 모두를 각각 내포할 수 있다. 본 발명의 일정한 구체예에서, 미리 충전된 단일과 다중-챔버 주사기 (가령, 액체 주사기 및 리오시린지)를 내포하는 키트가 제시된다.
이용되는 CD27L 항원 결합 단백질-내포 제약학적 조성물의 치료 유효량은 예로서, 치료 배경과 목적에 좌우될 것이다. 당업자는 치료를 위한 적절한 용량 수준이 부분적으로, 전달되는 분자, CD27L 항원 결합 단백질이 이용되는 징후, 투여 루트, 그리고 환자의 크기 (체중, 체표면 또는 장기 크기) 및/또는 상태 (연령과 건강)에 따라 변한다는 것을 인지할 것이다. 일정한 구체예에서, 임상의는 최적 치료 효과를 달성하기 위해 용량을 적정하고 투여 루트를 변경할 수 있다. 전형적인 용량은 전술한 인자에 따라, 약 0.1 μg/kg 내지 최대 약 30 mg/kg 또는 그 이상의 범위에서 변할 수 있다. 특정 구체예에서, 용량은 1.0 μg/kg 내지 약 20 mg/kg, 선택적으로 10 μg/kg 내지 약 10 mg/kg 또는 100 μg/kg 내지 약 5 mg/kg의 범위에서 변할 수 있다.
CD27L 항원 결합 단백질의 치료 유효량은 바람직하게는, 질환 증상의 심각도에서 감소, 질환 증상-없는 기간의 빈도 또는 지속 기간에서 증가, 또는 질환 고통에 기인한 장애 또는 무능력의 예방을 유발한다. CD27L-발현 종양을 치료하기 위해, 치료 유효량의 CD27L 항원 결합 단백질, 예를 들면, 항-CD27L ADC는 바람직하게는, 세포 성장 또는 종양 성장을 치료되지 않은 환자에 비하여 적어도 약 20%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 저해한다. 종양 성장을 저해하는 화합물의 능력은 인간 종양에서 효능을 전조하는 동물 모델에서 평가될 수 있다.
제약학적 조성물은 의료 장치를 이용하여 투여될 수 있다. 제약학적 조성물을 투여하기 위한 의료 장치의 실례는 U.S. 특허 번호 4,475,196; 4,439,196; 4,447,224; 4,447, 233; 4,486,194; 4,487,603; 4,596,556; 4,790,824; 4,941,880; 5,064,413; 5,312,335; 5,312,335; 5,383,851; 그리고 5,399,163에서 설명되고, 이들 모두 본원에서 참조로서 편입된다.
CD27L-연관된 질환 또는 장애를 진단하거나 치료하는 방법
본 발명의 CD27L 항원 결합 단백질은 생물학적 샘플에서 CD27L을 검출하는데 특히 유용하다. 일정한 구체예에서, 환자로부터 획득된 생물학적 샘플은 CD27L 항원 결합 단백질과 접촉된다. CD27L에 CD27L 항원 결합 단백질의 결합은 이후, 샘플 내에서 CD27L의 존재 또는 상대적인 양을 결정하기 위해 검출된다. 이런 방법은 CD27L 항원 결합 단백질, 예를 들면, 항-CD27L ADC로 치료에 순종하는 환자를 진단하거나 또는 결정하는데 유용할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 CD27L 항원 결합 단백질은 자가면역 또는 염증 질환을 진단하거나, 검출하거나, 또는 치료하는데 이용된다. 자가면역 또는 염증 질환을 치료하는데 있어서, CD27L 항원 결합 단백질은 파괴를 위해 면역계의 표적 CD27L-발현 세포를 표적으로 하고 및/또는 CD27L과 수용체 CD27의 상호작용을 차단할 수 있다.
CD27L과 CD27의 상호작용은 세포-매개된 자가면역 질환, 예를 들면, 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)에서 일정한 역할을 하는 것으로 생각된다 (Nakajima et al. (2000) J. Neuroimmunol. 109:188-96). 이러한 효과는 부분적으로, TNF-a 생산의 저해에 의해 매개되는 것으로 생각된다. 게다가, CD27L 신호전달의 차단은 CD8+ T-세포의 CD40-매개된 클론 확장을 저해하고 CD8+ 기억 T-세포의 발생을 감소시킨다 (Taraban et al. (2004) J. Immunol. 173:6542-6). 따라서 CD27L 항원 결합 단백질은 자가면역 장애, 예를 들면, CD27L을 발현하는 B-세포의 존재에 의해 특징되는 장애, 예를 들면, 실험적 자가면역 뇌척수염을 앓는 개체를 치료하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 항체가 이용될 수 있는 추가의 자가면역 장애에는 전신성 홍반성 낭창 (SLE), 인슐린 의존성 당뇨병 (IDDM), 염증성 장 질환 (IBD) (크론병, 궤양성 대장염 및 소아 지방변증 포함), 다발성 경화증 (MS), 건선, 자가면역성 갑상선염, 류머티스성 관절염 (RA) 및 사구체신염이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 게다가, 본 발명의 cd27L 항원 결합 단백질 조성물은 이식 거부반응의 저해 또는 예방, 또는 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)의 치료에 이용될 수 있다.
부가적으로, CD27L과 CD27의 상호작용은 또한, CD4+ T 세포 상에서 신호전달에서 일정한 역할을 하는 것으로 제안되었다. 일부 바이러스는 CD27 경로를 신호하고, 중화 항체 반응의 파괴를 유발하는 것으로 밝혀졌다 (Matter et al. (2006) J Exp Med 203:2145-55). 따라서 본 발명의 CD27L 항원 결합 단백질 조성물과 방법은 예로서, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 간염 (A, B, & C), 헤르페스 바이러스 (가령, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II와 CMV, 엡스타인 바 바이러스), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스, 코르노바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 이하선염 바이러스, 로터바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파르보바이러스, 우두 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기열 바이러스, 유두종 바이러스, 연속종 바이러스, 소아마비 바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스와 아르보바이러스성 뇌염 바이러스, 그리고 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV)로부터 감염을 비롯한 바이러스 감염을 앓는 개체를 치료하거나, 또는 HIV 감염/AIDS를 치료하는데 이용될 수 있다. 부가적으로, 본 발명의 인간 항체, 항체 조성물과 방법은 TNF-a 생산을 저해하는데 이용될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 CD27L 항원 결합 단백질은 암 또는 종양원성 장애를 진단하거나, 검출하거나, 또는 치료하는데 이용된다. 본원에서 치료에 순종하는 종양과 암 (여기서 종양 또는 암의 세포는 CD27L을 발현한다)에는 신장 세포 암종 (RCC), 예를 들면, 투명 세포 RCC, 유두상 RCC, 혐색소성 RCC 등, 교아종, 두경부 암 (가령, 편평 세포 암종 (HNSCC) 등), 유방 암, 뇌종양, 상인두 암종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 예를 들면, 낮은 등급 NHL, 미만성 거대 세포 NHL 등, 급성 림프성 백혈병 (ALL), 예를 들면, 전-B-ALL 등, 만성 림프성 백혈병 (CLL 또는 B-CLL), 버킷 림프종, 미분화성 대세포 림프종 (ALCL), 다발성 골수종, 피부 T-세포 림프종, 결절성 소형 분획 세포 림프종, 림프구 림프종, 말초 T-세포 림프종, 레너트 림프종, 면역아세포 림프종, T-세포 백혈병/림프종 (ATLL), 성인 T-세포 백혈병 (T-ALL), 중심아세포성/중심세포성 (cb/cc) 여포성 림프종 암, B 계통의 미만성 거대 세포 림프종, 혈관면역아세포성 림프절증 (AILD)-유사 T 세포 림프종, HIV 연관된 체강 기초된 림프종, 태생성 암종, 상인두의 미분화 암종 (가령, Schmincke 종양), 캐슬만병, 카포시 육종, 다발성 골수종, 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증 및 기타 B-세포 림프종이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본원에서 치료에 순종하는 추가의 종양 유형에는 신장, 췌장, 후두 또는 인두, 흑색종, 난소, 폐 선암종, 대장, 유방, 뇌 등의 종양이 포함된다.
실시예
실제적이고 예언적인 하기 실시예는 본 발명의 특정 구체예 또는 특질을 예시하는 목적으로 제공되고 이의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1 -- CD27L에 대한 완전 인간 단일클론 항체
인간 CD27L에 대한 완전 인간 항체의 산출은 XENOMOUSE® 기술 (United States 특허 번호 6,114,598; 6,162,963; 6,833,268; 7,049,426; 7,064,244, 이들은 본원에 전체로서 참조로서 편입됨; Green et al., 1994, Nature Genetics 7:13-21; Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156; Green and Jakobovitis, 1998, J. Ex. Med. 188:483-495)을 이용하여 수행되었다.
IgG1, IgG2, 그리고 IgG4 XENOMOUSE® 생쥐는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포의 표면 상에서 재조합 방식으로 발현된 가용성 인간 CD27L 또는 인간 CD27L로 면역되고/부스트되었다. 하이브리도마는 면역된 생쥐로부터 생산되었다. 하이브리도마 상층액은 재조합 인간 CD27L-발현 293 세포에 결합에 대해 스크리닝되었다. 260개 이상의 상층액이 결합에 양성이었다.
양성 상층액은 이후, Raji 및/또는 786-0 세포의 표면 상에서 고유 CD27L에 결합에 대해 스크리닝되었다. 고유 CD27L 결합 검정은 161개의 양성 상층액을 드러냈다.
이들 상층액은 게먹이원숭이 CD27L과의 교차-반응성에 대해 조사되었다. 25개 상층액은 게먹이원숭이 CD27L과의 교차-반응성에 대해 양성이었다. 이들 25개 상층액은 이후, CDC 활성 및 인간 CD27L에 인간 CD27 결합을 차단하는 능력에 대해 조사되었다. 19개 상층액은 CDC 활성 및 CD27L에 CD27 결합의 저해에 대해 양성이었다. 13 IgG1과 6 IgG4 라인의 하위클로닝과 서열화는 7개의 독특한 IgG1 항체 (Ab1-Ab7) 및 1개의 독특한 IgG4 항체 (Ab8)를 드러냈다.
상업적으로 구입가능한 생쥐 항-인간 CD27L 항체의 키메라 이형의 요약과 함께, 8개 항체의 특징의 요약이 도 1에 제공된다.
친화성
재조합 가용성 인간 CD27L에 대한 친화성은 BIACORE 3000 상에서 CM5 칩을 이용하여 결정되었다. 염소 항-인간 IgG 항체가 검사 항체를 포획하는데 이용되었다. Ka, Kd, 그리고 KD를 결정하기 위해 히스티딘-표식된 인간 가용성 CD27L의 결합과 해리가 측정되었다. 조건은 하기와 같았다:
온도 = 25℃
유속 = 50 ul/분
흐름 완충액 = HBS-EP
10mM 글리신 pH 1.5로 재생
Hu CD27L-his의 농도 범위는 200 nM → 0.217 nM이었다
모델 적합 (Scrubber2): 1:1 결합 + 국부 Rmax
5분 결합 및 25분 해리
ADCC 활성
ADCC 검정은 무균 96 웰 둥근 바닥 조직 배양 평판 (Corning)에서 수행되었다. 항체는 10% FCS (1:10 희석액)을 내포하는 100μL의 완전 RPMI에서 10 μL를 옮김으로써 20 μg/mL에서부터 0.0002 μg/mL까지 적정되었다. 10,000개 세포를 내포하기 위해 칼세인-표지된 표적 50 μL가 첨가되었다. 표적 세포 및 다양한 농도의 항체는 4℃에서 40분 동안 배양되고, 이후 200,000개 세포를 내포하기 위해 NK 세포 작동체 50 μL가 첨가되었다. 배양액은 37℃에서 4시간 동안 배양되고, 이후 상층액이 채취되고, 그리고 Wallac Victor II 1420 Multilable HTS 계수기에서 485-535 nm에서 형광을 측정함으로써 칼세인 방출에 대해 검정되었다. 100% 용해 값은 칼세인 표지된 Raji 표적의 6개 웰을 Igepal 630 세정제 (3 μL/웰)로 용해시킴으로써 결정되고, 그리고 자발적 용해 값은 표적 단독으로부터 상층액에서 형광을 측정함으로써 결정되었다.
퍼센트 (%) 특이적 용해는 (샘플 형광) - (자발적 용해 형광)/(100% 용해 - 자발적 용해 형광)으로서 정의되었다. 미가공 데이터는 % 특이적 용해를 계산하기 위해 임베디드 방식의 Excel 스프레드시트에 입력되고, 그리고 결과의 값은 그래픽 프로그램 (GraphPad Prism)으로 이전되었는데, 여기서 데이터는 S자형 곡선 적합 그래프에서 변환되었다. 차후 분석 (선형 회귀 계산)이 GraphPad에서 수행되어 EC50 값이 산출되었다.
ADCP 활성
단핵구는 인간 말초 혈액으로부터 선택된 음성이고, 그리고 10% FBS를 내포하는 배지 RPMI 1640에서 하룻밤 동안 4℃ 차가운 공간에서 보관되었다. 이후, 단핵구는 200 μL의 성장 배지 (10% FBS 및 40 ng/ml Hu M-CSF를 내포하는 RPMI 1640)에서 웰당 200,000개 세포에서 48-웰 조직 배양 평판에 파종되고, 그리고 단핵구가 대식세포로 분화하도록 37℃, 5% CO2에서 6일 동안 배양되었다.
6일자에, ADCP 검정은 하기와 같이 수행되었다:
1. 2x10 -6 M PKH67 염료의 최종 농도에서 PKH67 그린 염료로 표적 세포의 표지화
ㆍ 종양 세포는 수집되고, 그리고 세포를 5분 동안 원심분리 (400 ′g)함으로써 PBS로 1회 세척되었다.
ㆍ 세포를 원심분리한 후, 상층액은 조심스럽게 흡출되지만 25 mL 정도의 상층액이 남겨졌다.
ㆍ 4x10-6 M의 스톡 농도에서 4 μL의 PKH67 에탄올성 염료 용액이 폴리프로필렌 튜브 내에 키트로부터 1 ml의 희석제 C에 첨가되고 충분히 혼합되었다.
ㆍ 세포 펠릿은 폴리프로필렌 튜브 내에 20 x 106의 밀도에서 1 mL의 희석제 C 내로 재현탁되었다.
ㆍ 세포는 완전한 분산을 담보하기 위해, 부드러운 피펫팅으로 염료 작업 용액에 빠르게 이전되었다.
ㆍ 혼합물은 주기적으로 혼합하면서 실온에서 4분 동안 배양되었다.
ㆍ 2 mL의 완전 활성화된 FBS가 염색을 중단하기 위해 세포 내로 첨가되고, 그리고 과잉 염료의 결합을 허용하기 위해 실온에서 1분 동안 배양되었다.
ㆍ 10% FBS를 내포하는 40 mL의 RPMI가 세포 내로 첨가되고, 그리고 세포를 10분 동안 원심분리 (400 ′g)함으로써 1회 세척되었다.
ㆍ 세포 펠릿은 40 mL의 배지로 다시 현탁되고 새로운 튜브로 이전되었다.
ㆍ 세포는 배지 RPMI +10% FBS로 3회, 그리고 완전 성장 배지 (10% FBS 및 40 ng/ml Hu M-CSF를 내포하는 RPMI 1640)로 1x 다시 세척되었다.
ㆍ 세포는 계수되고, 그리고 1:2 비율에서 T:E에 대한 mL당 1x106 세포에서 성장 배지로 현탁되었다.
2. 항체 의존성 세포 식작용 ( ADCP )을 위한 항체로 종양 세포의 처리
ㆍ 항체 희석액은 대식세포 성장 배지에서 제조되었다. 이들 희석액은 최종 농도보다 4배 높게 농축되었다.
ㆍ PKH67 그린 표지된 표적 세포를 항체와 함께 전배양하기 위해, 280 ul의 4x 농축된 항체가 280 ul의 그린 표지된 종양 세포와 혼합되고 4℃에서 30분 동안 배양되었다.
ㆍ 그린 표지된 종양 세포와 항-종양 항체의 혼합물은 하기 실험 설계 표에서 지시된 바와 같이, 각 웰에 대해 200 μl에서 48-웰 평판 내에 대식세포 세포에 첨가되었다. 최종 부피는 웰당 0.4 ml이었다. 표적 세포 대 효과 세포 (대식세포)의 비율은 1:2이다.
ㆍ 세포는 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 배양되었다.
3. 대식세포 마커로 대식세포의 대비염색
ㆍ 48-웰 평판에서 표적 세포와 대식세포는 트립신-베르센 혼합물로 분리되었다.
ㆍ 세포는 웰당 2.2-ml 부피를 갖는 96-웰 블록 내로 이전되고, 그리고 이들 블록을 400 ′g에서 5분 동안 회전시키고, 이후 상층액을 버림으로써, 미리 가온된 FASC 세척 용액으로 1회 세척되었다.
ㆍ 대식세포는 웰당 100 μl로 블록 용액에서 1:200 희석도에서 그들의 마커, CD11b-비오틴으로 얼음 위에서 10분 동안 염색되었다.
ㆍ 세포를 1회 세척한 후, 대식세포는 1:1000 희석액에서 스트렙타비딘 Alexa 568로 얼음 위에서 10분 동안 검출되었다.
ㆍ 세포를 PBS로 1x 세척한 후, 세포는 4% 포름알데히드-PBS로 실온에서 20분 동안 고정되었다. 이후, 세포는 dH2O로 1x 세척되었다.
ㆍ 세포 펠릿은 웰당 200 μl에서 물로 재현탁되고 웰당 100 μl에서 96-웰 평판에 이전되었다.
4. 20x 대물렌즈를 이용한 Target Activation BioApplication으로 ArrayScan VTI HCS 판독기 (버전 6, Cellomics Inc. Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)에서 식작용 활성의 정량적 측정. 필터 세팅은 표 2에서 지시되었다. 적어도 200개 세포가 각 웰에서 계수되었다.
채널 표적 표지 형광
1 대식세포 Ms-항-Hu CD11b 비오틴→스트렙타비딘 Alexa 568 적색
2 종양 세포 PHK67 녹색
통계학적 분석은 Prism 4.01 (GraphPad, San Diego, CA)을 이용하여 수행되었다. 플롯은 % 종양 세포 식작용 대 항체 농도의 로그 (log) (ng/ml)를 도시한다. 종양 세포 식작용의 백분율은 대식세포와 겹쳐진 종양 세포 대 선별된 필드에서 총 대식세포의 백분율로 표시되고, 그리고 ArrayScan 판독기 "%ObjectCounts"의 출력 특질 (output feature)로부터 획득되었다. % 값은 이중 측정 (n = 2)에 대한 평균 +/- 평균의 표준 오차 (SEM)로서 표시되었다. EC50은 비선형 회귀 (곡선 적합), 그 이후에 S자형 용량-반응 방정식을 이용하여 결정되었다. 데이터는 최대와 최소 신호에 정규화되고 S자형 용량-반응 곡선에 적합되었다.
CDC 활성
종양 세포의 준비: Raji 세포는 검정 배지로 1회 세척되고 검정 배지 (RPMI 1640 + 1% FBS)에서 재현탁되었다. 세포는 토끼와 인간 보체 둘 모두에 대한 2가지 세포 밀도에서 웰당 50 μL에서 96-웰 조직 배양 평판에 파종되었다. 토끼 보체의 경우에, 세포 밀도는 웰당 5x104 세포이었다. 인간 보체의 경우에, 세포 밀도는 웰당 2x105 세포이었다.
보체와 검사 항체로 세포의 처리: 3회 농축된 보체는 표 3에서 개설된 바와 같이, 검정 배지에서 제조되었다. 이후, 이들은 웰당 50 μL에서 평판 내에 세포에 첨가되었다. 토끼 보체로 처리된 세포의 경우에, 토끼 보체의 최종 농도는 10%이었다; 인간 보체로 처리된 세포의 경우에, 인간 보체의 최종 농도는 20%이었다.
검정 배지 (RPMI 1640+1%FBS)에서 3x 농축된 보체의 제조
3x 보체 보체 (ml) 검정 배지 (ml) 총 부피 (ml)
30% HI 토끼 C' (비활성) 0.5 1.16 1.66
30% HI 없음 토끼 C' (활성) 2.5 5.83 8.33
60% HI Hu C' (비활성) 0.5 0.33 0.83
60% HI 없음 Hu C' (활성) 3 2.0 5.0
10 μg/mL에서 검사 항체가 웰당 50 μL에서 세포에 첨가되었다. 배양의 시작 시점에서 각 웰에서 총 부피는 150 μL이었다. 세포는 37℃, 5% CO2에서, 토끼 보체로 처리된 세포의 경우에 1시간 동안, 그리고 인간 보체로 처리된 세포의 경우에 6시간 동안 연속적으로 배양되었다.
ArrayScan 평판 판독기로 세포독성의 측정: 배양 후, 각 웰로부터 50 μl 배지가 제거되었다. 2% FBS를 내포하는 PBS 용액에서 1:1000 희석도에서 제조된 Hoechst 33342와 프로피디움 요오드화물 (PI)의 칵테일이 웰당 100 μL에서 세포 내로 첨가되었다. 인간 보체로 처리된 세포는 부드럽게 교반한 후, 웰당 40 μL에서 새로운 96-웰 평판 내로 이전되었다. 샘플은 20x 대물렌즈를 이용한 BioApplication "Target Activation"으로 ArrayScan VTI HCS 판독기 (버전 6, Cellomics. Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)에서 분석되었다. 필터 세팅은 표 4에서 지시되었다. 적어도 200개 세포가 각 웰에서 계수되었다.
채널 표적 표지 형광 필터
1 모든 세포에 대한 핵산 Hoechst 33342 UV/460 nm DAPI
2 죽은 세포에 대한 핵산 프로피디움 요오드화물 488/>575 nm TRITC
통계학적 분석: 통계학적 분석은 Prism 4.01 (GraphPad, San Diego, CA)을 이용하여 수행되었다.
내재화 시간
세포 파종: 786-0 세포는 100 μL의 성장 배지 (10% FBS를 내포하는 RPMI)에서 웰당 10,000개 세포에서 96-웰 평판에 파종되고, 그리고 검정 일자에 100% 세포 합류에 도달하기 위해 37℃, 5% CO2에서 2일 동안 배양되었다. 도말된 세포는 1) 내재화 및 2) 엔도솜 공동-국지화 (endosomal co-localization)에 대해 평가되었다.
내재화 시간-경과를 위한 세포 염색: 평판은 검정 배지 (2% FBS를 내포하는 PBS)로 1x 세척되었다. 항체가 검정 배지에서 웰당 2 μg/mL (웰당 100 μL)에서 웰에 첨가되었다. 인간 항체는 4℃에서 30분 동안 세포에 결합하도록 허용되고, 이후 검정 배지로 1x 세척되었다. 항-인간 IgG Fab' Alexa 488 (1:100)과 Hoechst 33342 (1:2000)가 4℃에서 20분 동안 검정 배지 내에 세포에 첨가되었다. 그 다음, 세포는 검정 배지로 1x 세척되었다. 세포는 고정되고, 그리고 0시에 시작하여 침투되거나 또는 37℃, 5% CO2에서 1, 3, 또는 5시간 동안 배양되었다. 배양 후, 세포는 고정되고 하기 절차로 침투되었다. 세포는 BD 세척 완충액으로 1x 세척되고, 그 이후에 고정/침투 용액이 웰당 100 μL에서 웰에 추가되었다. 샘플은 40x 대물렌즈를 이용한 BioApplication "Spot Detector"로 ArrayScan VTI HCS 판독기 (버전 6, Cellomics. Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)에서 분석되었다. 내재화를 위한 필터 세팅은 표 5에서 지시되었다. 적어도 400개 세포가 각 웰에서 계수되었다.
채널 표적 표지 필터
1 모든 세포에 대한 핵산 Hoechst 33342 DAPI (청색)
2 내재화된 스팟 Alexa 488 FITC (녹색)
내재된 스팟을 초기 엔도솜 구획에 공동-국지화하기 위한 세포의 대비염색:내재화 분석 후, 786-0 세포는 BD 완충액으로 1x 세척되었다. 세포는 RT에서 20분 동안 고정/침투 용액에 탐구되었다. 2x 세척 단계 이후에, 세포는 RT에서 20분 동안, 0.5 μg/mL (100 μl/웰)에서 BD 완충액에서 EEA-1과 함께 배양되었다. 세포는 BD 완충액으로 1x 세척되고 1:1000 희석도에서 항-생쥐 Alexa 568이 첨가되었다. 세포는 RT에서 20분 동안 배양되고, 그 이후에 BD 완충액 용액의 2회 세척 단계가 수행되었다.
이미지 사진촬영: 내재화와 공동-국지화에 대한 세포 이미지는 Openlab 이미지 분석 소프트웨어 (Improvision Inc, Lexington, MA)가 설치된 Hamamutsu 디지털 카메라에 연결된 Leica 형광 현미경 또는 ArrayScan VTI HCS 판독기로 촬영되었다.
통계학적 분석: 통계학적 분석은 Prism 4.01 (GraphPad, San Diego, CA)을 이용하여 수행되었다. 스팟 집계는 이중 측정 (n = 2)에 대한 평균 ± 평균의 표준 편차 (SEM)로서 표시되었다. 분석 툴을 이용하여, 단위 시간당 스팟 집계 (내재화 속도)는 1상 기하급수적 결합 방정식에 적합되었다.
실시예 2 - MCC-DM1-접합된 항체의 산정
Ab1, Ab2, Ab4, Ab7, 그리고 Ab8은 MCC-DM1에 접합되었다(도 12 참조). 표적된 부하 수준은 항체마다 4.5-5 약물이었다. 간단히 말하면, 항체의 리신이 NHS-에스테르 및 말레이미드를 내포하는 이형-이중기능성 교차-링커 숙신이미딜 4-[N-말레이미도메틸] 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC)의 NHS-에스테르에 접합되었다. 그 다음, 링커-변형된 항체가 과잉의 링커로부터 정제되고, 이후 DM1 상에 존재하는 설피드릴을 거쳐 탄두 DM1에 접합되었다. 과잉의 DM1은 이후, 두번째 정제 단계에 의해 제거되어 최종 접합체 Ab-MCC-DM1이 산출되었다.
더욱 구체적으로, 포유류 세포 배양 2936-E 세포에서 일시적으로 발현된 CD27L 항체는 25mM Tris, 150mM 염화나트륨, pH 7.4에서 평형화된 MabSelect SuRe 칼럼 (GE Healthcare) 위에 부하되었다. 결합된 CD27L 항체를 갖는 칼럼은 이후, 3회 세척 단계로 세척되었다: 먼저 평형화 완충액 세척, 그 이후에 25mM Tris, 500mM L-아르기닌, pH 7.5 세척, 그리고 평형화 완충액으로 최종 세척. CD27L 항체는 100mM 나트륨 아세테이트, pH 3.5로 용리되었다. 항체를 내포하는 분획물은 모아지고 1M Tris, pH 8.0로 5.0의 최종 pH까지 조정되었다. 항체는 차후에, 30mM 나트륨 아세테이트, pH 5.0에서 평형화된 Fractogel® EMD SO3-(M) 칼럼 (EMD Chemicals Inc)에서 정제되었다. 결합된 항체는 30mM 나트륨 아세테이트, pH 5.0에서 0 내지 0.8M 염화나트륨의 8CV 구배로 용리되었다. 항체 내포 분획물은 모아지고 접합 완충액 (2mM EDTA, 50mM 염화나트륨, 50mM 인산칼륨, pH 6.5) 내로 투석되었다.
정제된 CD27L 항체는 티올 반응성 말레이미드 기를 도입하기 위해, 아민 반응성 링커 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC) (Thermo Scientific)로 변형되었다. 55μM의 농도에서 항체는 최종 반응 혼합물에서 10% 디메틸아세트아미드 (v/v)에 대해 조정된 접합 완충액에서 20 몰 당량의 SMCC로 처리되었다. 실온에서 90분 동안 배양 후, 반응 혼합물은 2mM EDTA, 150mM 염화나트륨, 35mM 구연산나트륨, pH 5.0에서 평형화된 Sephadex G-25 미세 수지 (GE Healthcare)를 내포하는 HiPrep 26/10 탈염 칼럼으로 탈염되었다. 항체 내포 분획물은 모아지고 하기에 설명된 바와 같이, Ellman 시약 (5,5'-디티오-비스-[2-니트로벤조산])을 이용하여, 링커로 변형의 정도에 대해 검정되었다. 상기 항체는 항체마다 평균적으로 7.5 말레이미드 기로 변형되는 것으로 밝혀졌다.
Ellman 시약은 티올에 의해 절단되어, 412nm에서 흡광도를 갖는 황색 산물을 산출한다. SMCC와의 반응 후 CD27L 항체 상에서 말레이미드 기의 총수를 결정하기 위해 감법 Ellman 검정이 이용되었다. SMCC로 변형된 CD27L 항체 또는 항체가 없는 완충액의 대조 샘플은 동등한 농도의 티올, 0.4mM DTT (디티오트레이톨)와 함께 배양되었다. 항체 샘플 내에 존재하는 임의의 말레이미드는 DTT 내에 티올과 반응하여, 이것을 Ellman 시약과의 추가 반응에 이용될 수 없도록 만들 것이다. 이후, Ellman 시약이 양쪽 샘플에 첨가되고, 그리고 반응된 Ellman 시약의 농도를 결정하기 위해 412nm에서 비색 정량 (colorimetric quantitation)이 수행되었다. 대조 샘플과 비교하여 항체 샘플에서 티올의 감소된 농도는 항체 샘플 내에 존재하는 말레이미드의 총수와 비례한다. 이러한 값은 변형된 CD27L 항체마다 연결된 말레이미드 기의 총수를 결정하는데 이용되었다.
17 μM 내지 27 μM의 농도에서 SMCC 변형된 CD27L 항체 (항체마다 7.5 말레이미드 기)는 최종 반응 혼합물에서 3% DMA (v/v)에 대해 조정된 2mM EDTA, 150mM NaCl, 35mM 구연산나트륨, pH 5.0로 완충된 말레이미드 기마다 1.7 몰 당량의 DM1 (Immunogen)로 처리되었다. 반응 혼합물은 실온에서 최대 20시간 동안 하룻밤 배양되었다. 반응 혼합물은 20mM 나트륨 인산염, 150 mM 염화나트륨, pH 6.5로 평형화된 Superdex 200 겔 여과 칼럼 (GE Healthcare) 상에 부하되었다. 분획물은 수집되고, 그리고 단위체성 항체 내포 분획물은 모아지고 검정되었다. 항체마다 연결된 DM1 분자의 몰 비율은 252 nm와 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정되고, 그리고 항체마다 4.5 - 5.0 DM1 분자인 것으로 밝혀졌다.
시험관내 약리학
항체 약물 접합체 (ADC) Ab4-와 Ab8-MCC-DM1은 유세포분석법에 의해 산정될 때, 그들의 접합되지 않은 대응물에 필적하는 고유 CD27L 결합을 보였다. Ab4와 Ab4-MCC-DM1에 대해 관찰된 결합 EC50은 동일한 반면, Ab8-MCC-DM1의 경우에 Ab8과 비교하여 4-배 낮았다 (표 6). 결합 친화성의 더욱 정확한 적도는 Gyros 기술을 이용하여 Raji 세포 상에서 발현된 고유 인간 CD27L에 결합하는 능력을 측정함으로써 Ab4, Ab8 및 이들의 접합체 대응물에 대해 결정되었다. 획득된 결과는 양쪽 접합체가 접합되지 않은 Ab4와 Ab8에 대해 관찰된 것들의 2배 이내에서, CD27L에 대한 nM 이하 친화성을 보인다는 것을 증명하였다 (표 6). 또한, 접합되지 않은 Ab4와 Ab8 및 접합된 Ab4와 Ab8 둘 모두 BIACORE에 의해 측정될 때, 서로의 2배 이내에서 가용성 인간 CD27L-his에 대한 결합 친화성을 보였다.
MCC-DM1 접합체 대응물에 대한 Ab4와 Ab8의 결합 비교
측정 Ab4 Ab4-MCC-DM1 Ab8 Ab8-MCC-DM1
Gyros KD -고유 CD27L-Raji 0.014 nM 0.023 nM 0.078 nM 0.077 nM
FACS (EC50)-786-0 세포 0.1 nM 0.1 nM 0.02 nM 0.08 nM
Ab4-MCC-DM1, Ab8-MCC-DM1, Ab4, 그리고 Ab8의 내재화는 CD27L-발현 인간 ccRCC 세포주 786-0에서 평가되었다. CD27L 발현 786-0 세포는 접합되지 않은 Ab4와 Ab8 인간 항-CD27L 항체, Ab4-MCC-DM1, Ab8-MCC-DM1, 대조 HuIgG1, 또는 대조 αSA-MCC-DM1에 노출되고 4℃에서 결합하도록 허용되었다. 검사 물품의 내재화는 FluoroNanogold 염소 항-hu IgG Fab' Alexa 488을 이용하여 평가되었다. 세포는 고정되고 검사 물품과 함께 배양 후 특정한 시점 (시점 = 0, 1, 3, 그리고 5시)에 침투되고 ArrayScan VTI HCS 판독기를 이용하여 이미지화되었다. 내재화된 검사 물품의 엔도솜으로의 공동-국지화는 엔도솜 마커인 항-EEA-1 항체를 이용하여 결정되었다. Ab4-MCC-DM1을 비롯한 항체의 시간-의존성 내재화는 4℃에서 0시에 세포 막 국지화와 비교하여 37℃에서 세포 세포질 내에 반점 스팟의 형성에 의한 형광 검경 이미지 분석을 거쳐 관찰되었다. Ab4-MCC-DM1은 37℃에서 5-시간 배양 후, 엔도솜 마커 EEA-1와 공동-국지화되는데, 이것은 Ab4-MCC-DM1이 786-0 세포의 엔도솜 준세포 구획 내로 내재화된다는 것을 증명하였다. 내재화의 수준과 속도는 Ab4, Ab8 및 그들의 접합된 대응물에 대해 유사한 범위 내에 있었다 (도 2).
Ab4-MCC-DM1과 Ab8-MCC-DM1 둘 모두 CD27L-발현 종양 세포의 강력하고 특이적인 시험관내 성장 저해를 보였다. 항-증식 (종양 성장 저해) 검정에서, Ab4-MCC-DM1, Ab8-MCC-DM1 또는 접합되지 않은 항-CD27L Ab4 또는 Ab8은 각각 나신 Ab4 또는 Ab8, 또는 대조 HuIgG1의 존재/부재에서, CD27L 발현 786-0 루시페라아제 또는 CD27L 음성 H1650 표적세포와 함께 4일 동안 배양되었다. 양쪽 세포주, 786-0 루시페라아제와 H1650은 100 μL의 성장 배지에서 786-0 루시페라아제의 경우에 웰당 500개 세포, 그리고 H1650의 경우에 웰당 1000개 세포에서 96-웰 조직 배양 평판에 파종되었다. 모든 평판은 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 배양되었다. 4시간 배양 후, 나신 Ab 및 접합체가 다양한 용량 적정에서 웰당 100 μL에서 세포에 첨가되었다. 배양의 시작 시점에서 각 웰에서 총 부피는 200 μL이었다. 세포는 세포 ATP 수준의 측정에 앞서 4일 동안 37℃, 5% CO2에서 연속적으로 배양되었다. 세포 성장 저해를 산정하기 위해, ATP 수준 (세포 수의 적도로서)은 CellTiter-Glo 검정 키트를 이용한 발광에 의해 측정되었다.
Ab4-MCC-DM1과 Ab8-MCC-DM1 둘 모두 표 7에 기재된 바와 같은 50% 저해의 농도 (IC50)에서, CD27L-발현 786-0 세포의 세포 성장을 저해하였다. Ab4-MCC-DM1과 Ab8-MCC-DM1에 노출 시에 CD27L-음성 H1650 세포에서 세포 성장 저해가 관찰되지 않았다. 과잉의 접합되지 않은 부모 항-CD27L 항체의 첨가는 Ab4-MCC-DM1 매개된 성장 저해를 차단할 수 있었는데, 이것은 Ab4-MCC-DM1에 의한 CD27L 결합이 활성에 요구된다는 것을 확증하였다. 접합되지 않은 부모 항-CD27L 항체는 CD27L-발현 786-0 세포의 성장을 저해하지 않았다. 대조 접합체, 항-스트렙타비딘-MCC-DM1 (αSA-MCC-DM1)은 CD27L-양성 또는 CD27L-음성 세포주 중에서 어느 것에서도 세포 성장의 저해를 보이지 않았다. 이들 결과는 Ab4-MCC-DM1과 Ab8-MCC-DM1 둘 모두 대조 접합체와 비교하여 786-0 세포 성장의 강력한 저해제라는 것을 지시한다 (도 3). Ab4-MCC-DM1은 Ab8-MCC-DM1보다 약간 증가된 효능을 보이는 경향이 있었다 (표 7).
항 CD27L-MCC-DM1 접합체의 세포 효능
786-0-IC50 Ab4-MCC-DM1 Ab8-MCC-DM1
약물 농도 (nM) 0.34 0.54
항체 농도 (nM) 0.07 0.11
Ab4-MCC-DM1은 접합되지 않은 부모 Ab4 항-CD27L 항체에 대해 관찰된 것 (EC50 = 0.01 μg/mL)과 유사한 효능 (EC50 = 0.006 μg/mL)과 크기에서, Raji 세포에 대한 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)을 매개하였다. 간단히 말하면, 정상 인간 혈액 공여자로부터 획득된 PBMC로부터 단리된 자연 킬러 (NK) 세포는 전술한 바와 같이 Ab4-MCC-DM1 또는 대조 항체의 존재에서 칼세인 표지된 Raji 인간 B 세포 림프종 표적 세포 (CD27L 발현)와 함께 배양되었다. 퍼센트 (%) 특이적 세포독성은 대조 웰과 비교하여 Ab4-MCC-DM1의 존재에서 용해된 CD27L 발현 표적 세포로부터 칼세인 방출을 측정함으로써 결정되었다. 획득된 결과는 도 8에 도시되는데, 이것은 Ab4-MCC-DM1이 Ab4 항체의 것과 유사한 수준의 ADCC를 매개한다는 것을 지시한다 (각각, 0.006과 0.01 μg/mL의 EC50 값). huIgG1 대조는 CD27L 발현 표적의 임의의 측정가능한 용해를 매개하지 않았다. Ab4-MCC-DM1과 접합되지 않은 Ab4 항체 둘 모두 CD27L 특이적 표적의 NK 세포 매개된 ADCC를 유사한 수준에서 유도할 수 있다. 유사한 결과가 Ab8-MCC-DM1과 접합되지 않은 Ab8 항체에 대해 관찰되었다.
Ab4-MCC-DM1 또는 접합되지 않은 부모 항체 Ab4의 시험관내 항체 의존성 세포 식작용 (ADCP) 활성은 Raji와 786-0 종양 세포 둘 모두에 대해 측정되었다. Ab4-MCC-DM1은 접합되지 않은 부모 항체 Ab4에 대해 관찰된 것과 유사한 수준의 보체-매개된 용해를 매개하였다. 간단히 말하면, 대식세포는 정상 인간 혈액 공여자로부터 획득된 인간 말초 혈액으로부터 단리된 단핵구로부터 분화되었다. 대식세포는 전술한 바와 같이, 접합되지 않은 항 CD27L 항체 Ab4, HuIgG1, Ab4-MCC-DM1, 또는 대조 항체 (αSA-MCC-DM1)의 존재에서, 표적 세포로서 PHK67 그린 표지된 CD27L 발현 세포주, 786-0와 Raji와 함께 배양되었다. 퍼센트 (%) 종양 세포 식작용은 대식세포에 의해 삼켜진 종양 세포 대 선별된 필드에서 총 대식세포의 백분율로부터 결정되었다. 획득된 결과는 도 9에 도시되는데, 이것은 Ab4-MCC-DM1이 CD27L 발현 세포주, 786-0와 Raji에서 유사한 ADCP 효능을 매개한다는 것을 지시한다. 접합되지 않은 Ab4의 EC50 값은 Ab4-MCC-DM1에 대해 관찰된 것들의 10배 이내에 있었다 (표 8 참조).
786-0 Raji
Abs EC50 (pM) EC50 (pM)
Ab4 0.008 0.008
Ab4-MCC-DM1 0.087 1.421
희석 곡선이 1:40 희석 간격에서 작성된 점을 고려하면, Ab4-MCC-DM1과 접합되지 않은 Ab4 둘 모두에 대한 관찰된 EC50은 효능이 유사하였다 (희석 인자의 범위 이내). 따라서 접합된 Ab4-MCC-DM1과 접합되지 않은 WT Ab4 항체 둘 모두 CD27L 발현 세포의 ADCP를 매개하는 인간 대식세포를 유사한 수준에서 유도할 수 있다. 유사한 결과가 Ab8-MCC-DM1과 접합되지 않은 Ab8 항체에 대해 관찰되었다.
Ab4-MCC-DM1의 시험관내 보체 의존성 세포독성 (CDC) 활성은 인간과 토끼 보체 둘 모두 및 CD27L-발현 Raji 종양 세포를 이용하여 산정되었다. 10 μg/mL에서, Ab4-MCC-DM1은 접합되지 않은 부모 항체 Ab4에 대해 관찰된 것과 유사한 수준의 보체-매개된 용해를 매개하였다 (토끼 보체 72% 용해 및 인간 17% 용해). 간단히 말하면, 활성화된 토끼 또는 인간 보체는 전술한 바와 같이, 항 CD27L 항체 또는 대조 항체의 존재에서 CD27L 발현 Raji 표적 세포와 함께 배양되었다. CDC 매개된 사멸은 "% 세포독성"에 대한 PI 양성 대 Hoechst의 %를 검출하기 위한 ArrayScan 판독기 "% 선별된 물체"의 외부 특질로부터 측정되었다. 획득된 결과는 종양 Raji 세포를 10% 아기 토끼 보체 또는 20% 인간 보체와 함께 배양할 때, Ab4-MCC-DM1이 WT Ab4 항체의 것과 유사한 수준의 CDC를 매개한다는 것을 지시한다. 열 비활성화된 토끼 또는 인간 보체는 Raji에 대한 CDC 매개된 사멸을 전혀 보이지 않았다. 따라서 Ab4-MCC-DM1과 접합되지 않은 Ab4 둘 모두 CD27L 발현 종양 표적 세포에 대한 유사한 수준의 CDC 활성을 유도한다. 유사한 결과가 Ab8-MCC-DM1과 접합되지 않은 Ab8 항체에 대해 관찰되었다.
생체내 약리학
생체내 계대된 786-0 ccRCC 세포 (786-0 S4)는 효능 연구를 위한 종양 이종이식편을 산출하기 위해 성장-인자 감소된 MATRIGEL을 이용하여 암컷 CB-17/ SCID 생쥐 내로 이식되었다. 786-0 S4 세포는 평균적으로, 대략 180,000 CD27L 부위/세포를 발현한다. Ab4-MCC-DM1 또는 Ab8-MCC-DM1로 치료는 종양 크기가 대략 250 mm3의 평균에 도달할 때 시작되었다. 종양-보유 동물은 종양 크기에 의해 각각 10마리 동물의 군으로 무작위화되고 1회 정맥내 투약되었다. 7-64 ug DM1/kg (0.3-2.5 mg Ab/kg) 범위에서 변하는 분량을 이용한 Ab4-MCC-DM1과 Ab8-MCC-DM1의 맹검 용량 반응 연구가 이러한 확립된 종양 모델에서 수행되었다. 강건한 종양 퇴행은 낮은 7 ug DM1/kg, 중간 25 ug DM1/kg 및 높은 64 ug DM1/kg 분량에서 관찰되었다. 중간과 높은 분량에서, 완전한 퇴행은 단일 투약 이후에 적어도 28일간 유지되었다 (도 4). 연구의 경과 동안 어떤 투약 군에서도 체중 감소가 관찰되지 않았다.
생체내 효능의 다른 증거에서, 평균적으로 59,000 CD27L 부위/세포 (786-0 세포보다 3-배 적음)를 발현하는 Caki-1 ccRCC 세포는 전술한 바와 같이 CB-17/SCID 생쥐 내로 이식되었다. Caki-1 이종이식편이 250 mm3의 평균 크기에 도달할 때, 종양-보유 동물은 종양 크기에 의해 각각 10마리 동물의 군으로 무작위화되고 3주 동안 주1회 정맥내 투약되었다 (주1회 임상적 투약 섭생을 더욱 가깝게 모방하기 위해). 60-270 ug DM1/kg (2.4-11 mg Ab/kg) 범위에서 변하는 분량을 이용한 Ab4-MCC-DM1과 Ab8-MCC-DM1의 맹검 용량 반응 연구가 이러한 확립된 종양 모델에서 수행되었다. 대조 접합체 또는 운반체와 비교하여, 종양 퇴행은 중간 120 ug DM1/kg 및 높은 270 ug DM1/kg 분량에서 최초 관찰되는 반면, 종양 성장 저해는 낮은 60ug DM1/kg 분량에서 관찰되었다. 시간이 진행됨에 따라서, 이들 2가지 높은 분량 군에서 종양 퇴행은 최종 분량을 제공받고 7일 이내에 감소하기 시작하였다 (도 5).
ccRCC 세포와 유사하게, Raji B-림프종 세포는 CD27L (약 200,000 부위 / 세포)을 발현하고 항-CD27L 약물 접합체를 내재화하는데, 이것은 시험관내에서 유사분열 정지 (mitotic arrest)와 세포 사멸을 유발한다. Ab4-MCC-DM1은 피하 Raji 이종이식편 모델에서 효능에 대해 평가되었다. Raji 이종이식편이 250 mm3의 평균 크기에 도달할 때, 종양-보유 동물은 종양 크기에 의해 각각 10마리 동물의 군으로 무작위화되고 총 3회 투약을 위해 q4일 x 2, 이후 추가의 1주 동안 주1회 정맥내 투약되었다 (주1회 임상적 투약 섭생을 더욱 가깝게 모방하기 위해). 60-270 ug DM1/kg (2.4-11 mg Ab/kg) 범위에서 변하는 분량을 이용한 Ab4-MCC-DM1의 맹검 용량 반응 연구가 이러한 확립된 종양 모델에서 수행되었다. 종양 성장 저해가 모든 분량 수준에서 관찰되었는데, 대조 접합체와 비교하여 >90% 종양 성장 저해가 활발한 투약 기간 동안 중간 120 ug DM1/kg 및 높은 270 ug DM1/Kg 분량에서 관찰되고 중간 항종양 반응이 낮은 60ug DM1/kg 분량에서 관찰되었다 (도 6). 종양 측정 기간의 종결 시점에서, 중간과 높은 분량 군에서 거의 대부분의 동물은 종양 퇴행을 보였는데, 이것은 추가의 분량과 일정 최적화가 반응을 향상시킬 수 있다는 것을 암시하였다.
대조 접합체 αSA-MCC-DM1, 또는 Ab4-MCC-DM1의 상이한 투약 간격의 효능이 786-0 이종이식편 모델에서 평가되었다. CB-17/SCID 생쥐는 786-0 종양 세포가 이식되었다. 13일자에, 50마리 동물은 200 mm3의 평균 종양 체적을 갖는 각각 10마리 동물의 코호트로 무작위화되었다. 각 코호트는 대조 접합체 αSA-MCC-DM1 또는 Ab4-MCC-DM1의 복강내 분량이 투여되었다. 종양 체적은 군 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM)로 표시된다. 성장 곡선 간에 관찰된 차이의 통계학적 유의성은 13일자에서부터 59일자까지, Dunnett 조정된 다중 비교로 로그 변환된 종양 체적 데이터의 반복 측정 공분산 분석 (repeated measures analysis of covariance, RMANOVA)에 의해 평가되었다. 유의성은 p < 0.05이면 달성된다. 3가지 분량 수준의 Ab4-MCC-DM1 (각각, 1.0, 2.0, 또는 2.9 mg/kg의 Ab4-MCC-DM1 기초된 항체 또는 25, 50, 또는 75 μg/kg DM1 기초된 등가물)이 투여되었다. 1.0 mg/kg 분량은 6주 동안 주1회 또는 2주마다 1회 투여되고, 2.0 mg/kg 분량은 6주 동안 2주마다 1회 투여되고, 그리고 2.9 mg/kg 분량은 6주 동안 3주 마다 1회 투여되었다. 동물은 종양 접종 후 13일자부터 복강내 투약되었다. 59일자까지, αSA-MCC-DM1 치료된 군은 큰 종양 체적으로 인하여 안락사되었다. 59일자에, Ab4-MCC-DM1이 투여되는 각 투약 섭생으로 치료된 생쥐의 평균 종양 체적은 αSA-MCC-DM1 대조 접합체 군보다 훨씬 낮았다 (p < 0.0001) (도 7). Ab4-MCC-DM1은 각 투약 섭생에서 영속적인 종양 퇴행을 매개하였다. 어떤 Ab4-MCC-DM1 치료 군에서도 체중 감소가 관찰되지 않았다.
약물통태학
Ab4와 Ab8 항체 약물 접합체는 효능 연구 및 추적 말단 PK 연구의 배경에서, CD27L-발현 786-0 이종이식편을 내포하는 암컷 CB-17/SCID 생쥐에 정맥내 투여 후 산정되었다. 누적 노출 및 제거 값은 Ab4-MCC-DM1과 Ab8-MCC-DM1 분자 사이에 1.33과 1.4-배 이내에 있었고, 그리고 양쪽 ADC의 반감기는 생쥐에서 대략 12일이었다.
Ab4-MCC-DM1과 Ab8-MCC-DM1 항체 약물 접합체의 안정성과 PK 파라미터는 786-0 이종이식편을 보유하는 CB-17/SCID 생쥐 내로 단일 정맥내 (IV) 투약 이후에 생체내에서 특징화되었다. 이들 두 항체 약물 접합체의 노출은 매우 동등하지만, Ab4-MCC-DM1은 친화성-MS에 의해 결정될 때 연구의 96시간 시간-경과에 걸쳐, Ab8-MCC-DM1 분자보다 더욱 안정된 약물-대-항체 접합 비율을 보였다. Ab4-MCC-DM1은 주사 후 30분 또는 24시간 시점에서 접합체 완전성의 검출가능한 상실을 보이지 않는 반면, Ab8-MCC-DM1은 주사 후 30분 시점에서 변화, 그리고 주사 후 24시간까지 모든 접합체 종류에서 유의미한 감소를 보였다.
실시예 3 -- 파라토프 맵핑
Ab4에 대한 변형은 ELISA에 의해 CD27L에 결합에 대해 조사되었다. CD27L은 100 uL에서 1ug/mL로 교반하면서, 실온에서 > 2시간 동안 Maxisorp 평판에 결합되었다. 이들 평판은 이후, PBS + 0.05% Tween 20에서 250 uL 10% 무지분유로 2시간 동안 차단되었다. 4 x 300 uL PBS + 0.05% Tween20 (PBST) 세척 후, 0.045 내지 100 ng/mL 범위에서 변하는 변형된 Ab와 정제된 부모 대조 적정이 평판에 적용되고 1시간 동안 배양되었다. 1:7000 희석된 αhuFc 검출 항체 (Jackson)에 접합된 양고추냉이 과산화효소가 추가 PBST 세척 후 평판에 적용되고, 그리고 1시간 동안 배양되었다. 최종 세척이 수행되고, 그리고 TMB 기질이 10분 동안 배양되고 인산으로 중단되었다. 450nm에서 OD 시도가 획득되고 농도에 대비하여 플롯팅되었다. 이들 곡선은 이후, 3 파라미터 비선형 곡선 적합으로 분석되고, 그리고 EC50 및 최대 계산된 신호가 정제된 대조와 비교되었다. 결합은 EC50이 2배 이내에 있고 최대 신호가 50% 이상이면 부모와 유사한 것으로 결정되었다. 결합은 EC50이 2배 이상 증가하고 및/또는 최대 신호가 50% 이하이면 감소되었다. 결합은 곡선이 산출되지 않거나 또는 최대 신호가 5% 이하이면 소멸되었다.
경쇄와 중쇄 변형 조합이 그들의 발현 수준 (ug/mL) (ForteBio 단백질 A 정량에 의해 결정됨) 및 결합에 대한 그들의 효과와 함께 열거된다.
조합 발현 결합
N31H-Y58N + N31S-I34M 30.3 감소
N31H-Y58N + G33S-I34L 46.7 소멸
N31H-Y58N + D54E-G55S 9.91 소멸
N31H-Y58N + S103G-G104S 14.6 소멸
N31H-Y58N + 부모 HC 10.4 감소
R24K-S26G + N31S-I34M 13.8 유사
R24K-S26G + G33S-I34L 16.9 소멸
R24K-S26G + D54E-G55S 1.87 감소
R24K-S26G + S103G-G104S 3.76 감소
R24K-S26G + 부모 HC 3.43 유사
L55I-Y58F + N31S-I34M 9.53 감소
L55I-Y58F + G33S-I34L 11.6 소멸
L55I-Y58F + D54E-G55S 1.26 감소
L55I-Y58F + S103G-G104S 2.61 감소
L55I-Y58F + 부모 HC 2.72 유사
Q95N-T96S + N31S-I34M 24.6 유사
Q95N-T96S + G33S-I34L 32.7 소멸
Q95N-T96S + D54E-G55S 1.89 감소
Q95N-T96S + S103G-G104S 4.99 소멸
Q95N-T96S + 부모 HC 5.85 유사
부모 LC + N31S-I34M 31.6 감소
부모 LC + G33S-I34L 51.2 소멸
부모 LC + D54E-G55S 7.03 감소
부모 LC + S103G-G104S 10.7 소멸
부모 LC + 부모 HC 9.25 유사
Ab4에 만들어진 24개 변형 조합 중에서 13개가 CD27L에 결합의 상당한 수준을 유지하였다. CD27L에 결합하지 않은 9개는 다음 중에서 적어도 한 가지를 가졌다: "G33S-I34L"과 "S103G-G104S" 중쇄 변형 또는 "N31H-Y58N" 경쇄 변형. 97% 유사 항체 (2개 아미노산 변형) 중에서, 75% (8개중 6개)가 상당한 수준의 결합을 유지하는 반면, 94% 유사 항체 (4개 아미노산 변형) 중에서 56% (16개중 7개)가 상당한 수준의 결합을 유지하는데, 이들 중에서 2개는 정제된 부모 대조와 유사한 결합을 갖는다. 이것은 Ab4에 낮게는 94% 유사한 항체가 CD27L에 여전히 결합할 수 있다는 것을 증명한다.
서열 목록
서열번호 1
인간 CD27L 아미노산 서열
MPEEGSGCSVRRRPYGCVLRAALVPLVAGLVICLVVCIQRFAQAQQQLPLESLGWDVAELQLNHTGPQQDPRLYWQGGPALGRSFLHGPELDKGQLRIHRDGIYMVHIQVTLAICSSTTASRHHPTTLAVGICSPASRSISLLRLSFHQGCTIASQRLTPLARGDTLCTNLTGTLLPSRNTDETFFGVQWVRP
서열번호 2
인간 CD27 전구체 아미노산 서열
MARPHPWWLCVLGTLVGLSATPAPKSCPERHYWAQGKLCCQMCEPGTFLVKDCDQHRKAAQCDPCIPGVSFSPDHHTRPHCESCRHCNSGLLVRNCTITANAECACRNGWQCRDKECTECDPLPNPSLTARSSQALSPHPQPTHLPYVSEMLEARTAGHMQTLADFRQLPARTLSTHWPPQRSLCSSDFIRILVIFSGMFLVFTLAGALFLHQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP
서열번호 3
Ab1 중쇄-인코딩 뉴클레오티드 서열
CAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
서열번호 4
Ab2 중쇄-인코딩 뉴클레오티드 서열
CAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
서열번호 5
Ab4 중쇄-인코딩 뉴클레오티드 서열
CAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
서열번호 6
Ab5 중쇄-인코딩 뉴클레오티드 서열
GAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
서열번호 7
Ab6 중쇄-인코딩 뉴클레오티드 서열
AGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
서열번호 8
Ab7 중쇄-인코딩 뉴클레오티드 서열
CAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
서열번호 9
Ab8 중쇄-인코딩 뉴클레오티드 서열
CAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
서열번호 10
Ab1 중쇄 아미노산 서열
QMQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSDGSIISGVYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTSYNPSLKSRLTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGYSYALFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 11
Ab2 중쇄 아미노산 서열
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSIISGGYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIFYSGSTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGYSYALFDHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 12
Ab4 중쇄 아미노산 서열
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGIHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGYSGYDSGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 13
Ab5 중쇄 아미노산 서열
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQATGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFWSGYYYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 14
Ab6 중쇄 아미노산 서열
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGYTHYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYGGNDYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 15
Ab7 중쇄 아미노산 서열
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDNSHYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 16
Ab8 중쇄 아미노산 서열
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSDKYFADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGIAGARYVYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 17
Ab1 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열
QMQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSDGSIISGVYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTSYNPSLKSRLTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGYSYALFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 18
Ab2 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSIISGGYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIFYSGSTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGYSYALFDHWGQGTLVTVSS
서열번호 19
Ab3 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVISDSGGTTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHDYSNRYYFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 20
Ab4 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGIHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGYSGYDSGFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 21
Ab5 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQATGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFWSGYYYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
서열번호 22
Ab6 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGYTHYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYGGNDYYGMDVWGQGTTVTVSS
서열번호 23
Ab7 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDNSHYYYGMDVWGQGTTVTVSS
서열번호 24
Ab8 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSDKYFADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGIAGARYVYFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 25
Ab1 중쇄 CDR1 아미노산 서열
SGVYYWS
서열번호 26
Ab2 중쇄 CDR1 아미노산 서열
SGGYYWS
서열번호 27
Ab3 중쇄 CDR1 아미노산 서열
SYAMS
서열번호 28
Ab4 중쇄 CDR1 아미노산 서열
NYGIH
서열번호 29
Ab5 중쇄 CDR1 아미노산 서열
SYDIN
서열번호 30
Ab6 중쇄 CDR1 아미노산 서열
SYGIS
서열번호 31
Ab7 중쇄 CDR1 아미노산 서열
TYGMH
서열번호 32
Ab8 중쇄 CDR1 아미노산 서열
SYGMH
서열번호 33
Ab1 중쇄 CDR2 아미노산 서열
YIYYSGSTSYNPSLKS
서열번호 34
Ab2 중쇄 CDR2 아미노산 서열
YIFYSGSTDYNPSLKS
서열번호 35
Ab3 중쇄 CDR2 아미노산 서열
VISDSGGTTDYADSVKG
서열번호 36
Ab4 중쇄 CDR2 아미노산 서열
VIWYDGSNKYYADSVKG
서열번호 37
Ab5 중쇄 CDR2 아미노산 서열
WMNPNSGNTGYAQKFQG
서열번호 38
Ab6 중쇄 CDR2 아미노산 서열
WISAYNGYTHYAQKLQG
서열번호 39
Ab7 중쇄 CDR2 아미노산 서열
VIWYDGSNKYYGDSVKG
서열번호 40
Ab8 중쇄 CDR2 아미노산 서열
VIWYDGSDKYFADSVKG
서열번호 41
Ab1 중쇄 CDR3 아미노산 서열
SGYSYALFDY
서열번호 42
Ab2 중쇄 CDR3 아미노산 서열
SGYSYALFDH
서열번호 43
Ab3 중쇄 CDR3 아미노산 서열
HDYSNRYYFDY
서열번호 44
Ab4 중쇄 CDR3 아미노산 서열
DGGYSGYDSGFDY
서열번호 45
Ab5 중쇄 CDR3 아미노산 서열
GYDFWSGYYYYYYGMDV
서열번호 46
Ab6 중쇄 CDR3 아미노산 서열
DYGGNDYYGMDV
서열번호 47
Ab7 중쇄 CDR3 아미노산 서열
DNSHYYYGMDV
서열번호 48
Ab8 중쇄 CDR3 아미노산 서열
DGIAGARYVYFDY
서열번호 49
Ab1 경쇄-인코딩 뉴클레오티드 서열
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTTTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCGTTGACAGATATTTCAATTGGTATCAGCAGAAACCTGGGAAAGCCCCTAAGGTCCTGATCTTTGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCGGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGCTACAGTACCCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAGTCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
서열번호 50
Ab2 경쇄-인코딩 뉴클레오티드 서열
GACATCCAGATGACCCAGTCCCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCCGGGCAAGTCAGTTCATTGGCAGATATTTCAATTGGTATCAGCAGCAACCAGGGAAAGCCCCTAAGGTCCTGATCTATGCTGAATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAAGATACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
서열번호 51
Ab4 경쇄-인코딩 뉴클레오티드 서열
GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGAATAGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGTTCCTGATCTATTTGGGTTCTTATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGTATACAAACTCTACAAACTCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
서열번호 52
Ab5 경쇄-인코딩 뉴클레오티드 서열
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCTGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAGACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCTGCAGTCTGGTAGCTCTGTCCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
서열번호 53
Ab6 경쇄-인코딩 뉴클레오티드 서열
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTTCTGGAAGCAGCTCCAACATCGGAATTAATTATGTATACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATAGGAGTGATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCCTCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGGTGTGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGCCAACCGAAAGCGGCGCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATAG
서열번호 54
Ab7 경쇄-인코딩 뉴클레오티드 서열
CAGTCTGTGCTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTAAATTGGTATCAGCAGTTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGTTAACAACAATCGGCCCTCAGGAGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCACGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGACTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACACCAGCCTGAGTGCTTCGGTATTCGGCGGAGGGACCAGACTGACCGTCCTAGGCCAACCGAAAGCGGCGCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA
서열번호 55
Ab8 경쇄-인코딩 뉴클레오티드 서열
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGCATTAGCAATTATTTAGCCTGGTTTCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGTCCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAGGTGGGGTCCCATCAAAGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAATATTATAATTACCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCACAGTGGATATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
서열번호 56
Ab1 경쇄 아미노산 서열
DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCRASQSVDRYFNWYQQKPGKAPKVLIFAASSLQSGVPSRFGGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPWTFGQGTKVEVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
서열번호 57
Ab2 경쇄 아미노산 서열
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQFIGRYFNWYQQQPGKAPKVLIYAESSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFARYYCQQSYSTPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
서열번호 58
Ab4 경쇄 아미노산 서열
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLNSNGYNYLDWYLQKPGQSPQFLIYLGSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCIQTLQTPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
서열번호 59
Ab5 경쇄 아미노산 서열
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQRPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCLQSGSSVPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
서열번호 60
Ab6 경쇄 아미노산 서열
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGINYVYWYQQLPGTAPKLLIYRSDQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLALSGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
서열번호 61
Ab7 경쇄 아미노산 서열
QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVNWYQQFPGTAPKLLIYVNNNRPSGVPDRFSGSTSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDTSLSASVFGGGTRLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
서열번호 62
Ab8 경쇄 아미노산 서열
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Variable Domain amino acid sequence <400> 22 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Tyr Thr His Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Tyr Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 23 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab7 Heavy Chain Variable Domain amino acid sequence <400> 23 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Asn Ser His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 24 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab8 Heavy Chain Variable Domain amino acid sequence <400> 24 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Phe Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Ile Ala Gly Ala Arg Tyr Val Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab1 Heavy Chain CDR1 amino acid sequence <400> 25 Ser Gly Val Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab2 Heavy Chain CDR1 amino acid sequence <400> 26 Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab3 Heavy Chain CDR1 amino acid sequence <400> 27 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 28 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab4 Heavy Chain CDR1 amino acid sequence <400> 28 Asn Tyr Gly Ile His 1 5 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> SYDIN <400> 29 Ser Tyr Asp Ile Asn 1 5 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab6 Heavy Chain CDR1 amino acid sequence <400> 30 Ser Tyr Gly Ile Ser 1 5 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab7 Heavy Chain CDR1 amino acid sequence <400> 31 Thr Tyr Gly Met His 1 5 <210> 32 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab8 Heavy Chain CDR1 amino acid sequence <400> 32 Ser Tyr Gly Met His 1 5 <210> 33 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab1 Heavy Chain CDR2 amino acid sequence <400> 33 Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 34 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab2 Heavy Chain CDR2 amino acid sequence <400> 34 Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 35 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab3 Heavy Chain CDR2 amino acid sequence <400> 35 Val Ile Ser Asp Ser Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 36 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab4 Heavy Chain CDR2 amino acid sequence <400> 36 Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab5 Heavy Chain CDR2 amino acid sequence <400> 37 Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 38 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab6 Heavy Chain CDR2 amino acid sequence <400> 38 Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Tyr Thr His Tyr Ala Gln Lys Leu Gln 1 5 10 15 Gly <210> 39 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab7 Heavy Chain CDR2 amino acid sequence <400> 39 Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 40 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab8 Heavy Chain CDR2 amino acid sequence <400> 40 Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Phe Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab1 Heavy Chain CDR3 amino acid sequence <400> 41 Ser Gly Tyr Ser Tyr Ala 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MISC_FEATURE <223> Ab7 Heavy Chain CDR3 amino acid sequence <400> 47 Asp Asn Ser His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 48 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab8 Heavy Chain CDR3 amino acid sequence <400> 48 Asp Gly Ile Ala Gly Ala Arg Tyr Val Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 49 <211> 642 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Ab1 Light Chain-encoding nucleotide sequence <400> 49 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctttaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcgttgac agatatttca attggtatca gcagaaacct 120 gggaaagccc ctaaggtcct gatctttgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcggtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agctacagta ccccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaagtcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 50 <211> 642 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Ab2 Light Chain-encoding nucleotide sequence <400> 50 gacatccaga tgacccagtc cccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcagttgcc gggcaagtca gttcattggc agatatttca attggtatca gcagcaacca 120 gggaaagccc ctaaggtcct gatctatgct gaatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 agattcagtg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caagatacta ctgtcaacag agttacagta ccccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 51 <211> 660 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Ab4 Light Chain-encoding nucleotide sequence <400> 51 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg aatagtaatg gatacaacta tttggattgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccacag ttcctgatct atttgggttc ttatcgggcc 180 tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgagaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgta tacaaactct acaaactcca 300 ttcactttcg gccctgggac caaagtggat atcaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660 <210> 52 <211> 651 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Ab5 Light Chain-encoding nucleotide sequence <400> 52 gaaattgtgt tgacgcagtc tcctggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaga 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagtctggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtctg cagtctggta gctctgtccc gctcactttc 300 ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgt acggtggctg caccatctgt cttcatcttc 360 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 420 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 480 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 540 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 600 cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta a 651 <210> 53 <211> 651 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Ab6 Light Chain-encoding nucleotide sequence <400> 53 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga attaattatg tatactggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat aggagtgatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccctcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgag tggtgtggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggccaaccga aagcggcgcc ctcggtcact 360 ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata 420 agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag 480 gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc 540 tatctgagcc tgacgcctga gcagtggaag tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg 600 catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg gcccctacag aatgttcata g 651 <210> 54 <211> 651 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Ab7 Light Chain-encoding nucleotide sequence <400> 54 cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtaaattg gtatcagcag 120 ttcccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatgttaaca acaatcggcc ctcaggagtc 180 cctgaccgat tctctggctc cacgtctggc acctcagcct ccctggccat cactggactc 240 caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acaccagcct gagtgcttcg 300 gtattcggcg gagggaccag actgaccgtc ctaggccaac cgaaagcggc gccctcggtc 360 actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 420 ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 480 aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 540 agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 600 acgcatgaag ggagcaccgt ggagaagaca gtggccccta cagaatgttc a 651 <210> 55 <211> 645 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Ab8 Light Chain-encoding nucleotide sequence <400> 55 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca gggcattagc aattatttag cctggtttca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaggtgg ggtcccatca 180 aagttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgccaacaa tattataatt acccattcac tttcggccct 300 gggaccacag tggatatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645 <210> 56 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab1 Light Chain amino acid sequence <400> 56 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Arg Tyr 20 25 30 Phe Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Phe Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Gly Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 57 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab2 Light Chain amino acid sequence <400> 57 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Phe Ile Gly Arg Tyr 20 25 30 Phe Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Lys 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Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Phe Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ile Gln Thr 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 59 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab5 Light Chain amino acid sequence <400> 59 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Gly Ser Ser Val 85 90 95 Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 115 120 125 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 130 135 140 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 145 150 155 160 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 180 185 190 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 195 200 205 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 60 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab6 Light Chain amino acid sequence <400> 60 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ile Asn 20 25 30 Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Ser Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Leu Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 61 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab7 Light Chain amino acid sequence <400> 61 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val Asn Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Val Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Thr Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr Ser 85 90 95 Leu Ser Ala Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 130 135 140 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 145 150 155 160 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 165 170 175 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 180 185 190 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 195 200 205 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 62 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab8 Light Chain amino acid sequence <400> 62 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Gly Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Thr Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 63 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab1 Light Chain Variable Domain amino acid sequence <400> 63 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Arg Tyr 20 25 30 Phe Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Phe Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Gly Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys 100 105 <210> 64 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab2 Light Chain Variable Domain amino acid sequence <400> 64 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Phe Ile Gly Arg Tyr 20 25 30 Phe Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Glu Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Arg Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 65 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab3 Light Chain Variable Domain amino acid sequence <400> 65 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Phe 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Gly Ile Ser Pro 85 90 95 Cys Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 66 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab4 Light Chain Variable Domain amino acid sequence <400> 66 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Phe Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ile Gln Thr 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 110 <210> 67 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab5 Light Chain Variable Domain amino acid sequence <400> 67 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Gly Ser Ser Val 85 90 95 Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 68 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab6 Light Chain Variable Domain amino acid sequence <400> 68 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ile Asn 20 25 30 Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Ser Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Leu Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 69 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab7 Light Chain Variable Domain amino acid sequence <400> 69 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val Asn Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Val Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Thr Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr Ser 85 90 95 Leu Ser Ala Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 70 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab8 Light Chain Variable Domain amino acid sequence <400> 70 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Gly Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Thr Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 71 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab1 Light Chain CDR1 amino acid sequence <400> 71 Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Arg Tyr Phe Asn 1 5 10 <210> 72 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab2 Light Chain CDR1 amino acid sequence <400> 72 Arg Ala Ser Gln Phe Ile Gly Arg Tyr Phe Asn 1 5 10 <210> 73 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab3 Light Chain CDR1 amino acid sequence <400> 73 Arg Ala Ser Gln Ser Phe Ser Ser Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 74 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab4 Light Chain CDR1 amino acid sequence <400> 74 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp 1 5 10 15 <210> 75 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab5 Light Chain CDR1 amino acid sequence <400> 75 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 76 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab6 Light Chain CDR1 amino acid sequence <400> 76 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ile Asn Tyr Val Tyr 1 5 10 <210> 77 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab7 Light Chain CDR1 amino acid sequence <400> 77 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val Asn 1 5 10 <210> 78 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab8 Light Chain CDR1 amino acid sequence <400> 78 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 79 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab1 Light Chain CDR2 amino acid sequence <400> 79 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 80 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab2 Light Chain CDR2 amino acid sequence <400> 80 Ala Glu Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 81 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab2 Light Chain CDR2 amino acid sequence <400> 81 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 82 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab4 Light Chain CDR2 amino acid sequence <400> 82 Leu Gly Ser Tyr Arg Ala Ser 1 5 <210> 83 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab5 Light Chain CDR2 amino acid sequence <400> 83 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 84 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab6 Light Chain CDR2 amino acid sequence <400> 84 Arg Ser Asp Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 85 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab7 Light Chain CDR2 amino acid sequence <400> 85 Val Asn Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 86 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab8 Light Chain CDR2 amino acid sequence <400> 86 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Gly 1 5 <210> 87 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab1 Light Chain CDR3 amino acid sequence <400> 87 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab2 Light Chain CDR3 amino acid sequence <400> 88 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 89 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab3 Light Chain CDR3 amino acid sequence <400> 89 Gln Gln Tyr Gly Ile Ser Pro Cys Ser 1 5 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab4 Light Chain CDR3 amino acid sequence <400> 90 Ile Gln Thr Leu Gln Thr Pro Phe Thr 1 5 <210> 91 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab5 Light Chain CDR3 amino acid sequence <400> 91 Leu Gln Ser Gly Ser Ser Val Pro Leu Thr 1 5 10 <210> 92 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab6 Light Chain CDR3 amino acid sequence <400> 92 Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Val Val 1 5 10 <210> 93 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab7 Light Chain CDR3 amino acid sequence <400> 93 Gln Ser Tyr Asp Thr Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab8 Light Chain CDR3 amino acid sequence <400> 94 Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Phe Thr 1 5

Claims (148)

  1. 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 포함하는 CD27L 항원 결합 단백질이며, 여기서
    a) 경쇄 가변 도메인은
    서열번호 74에 기재된 LCDR1 서열,
    서열번호 82에 기재된 LCDR2 서열, 및
    서열번호 90에 기재된 LCDR3 서열
    을 포함하고,
    중쇄 가변 도메인은
    서열번호 28에 기재된 HCDR1 서열,
    서열번호 36에 기재된 HCDR2 서열, 및
    서열번호 44에 기재된 HCDR3 서열
    을 포함하거나,
    b) 경쇄 가변 도메인은 a)에 정의된 바와 같으나, 서열번호 74에 기재된 LCDR1 서열의 위치 1 및 위치 3에서 Arg 및 Ser이 각각 Lys 및 Gly으로 돌연변이되고,
    중쇄 가변 도메인은 a)에 정의된 바와 같으나, 서열번호 28에 기재된 HCDR1 서열의 위치 1 및 위치 4에서 Asn 및 Ile이 각각 Ser 및 Met으로 돌연변이되거나,
    c) 경쇄 가변 도메인은 a)에 정의된 바와 같으나, 서열번호 74에 기재된 LCDR1 서열의 위치 1 및 위치 3에서 Arg 및 Ser이 각각 Lys 및 Gly으로 돌연변이되고,
    중쇄 가변 도메인은 a)에 정의된 바와 같거나,
    d) 경쇄 가변 도메인은 a)에 정의된 바와 같으나, 서열번호 82에 기재된 LCDR2 서열의 위치 1 및 위치 4에서 Leu 및 Tyr이 각각 Ile 및 Phe으로 돌연변이되고,
    중쇄 가변 도메인은 a)에 정의된 바와 같거나,
    e) 경쇄 가변 도메인은 a)에 정의된 바와 같으나, 서열번호 90에 기재된 LCDR3 서열의 위치 2 및 위치 3에서 Gln 및 Thr이 각각 Asn 및 Ser으로 돌연변이되고,
    중쇄 가변 도메인은 a)에 정의된 바와 같으나, 서열번호 28에 기재된 HCDR1 서열의 위치 1 및 위치 4에서 Asn 및 Ile이 각각 Ser 및 Met으로 돌연변이되거나,
    f) 경쇄 가변 도메인은 a)에 정의된 바와 같으나, 서열번호 90에 기재된 LCDR3 서열의 위치 2 및 위치 3에서 Gln 및 Thr이 각각 Asn 및 Ser으로 돌연변이되고,
    중쇄 가변 도메인은 a)에 정의된 바와 같은 것인
    CD27L 항원 결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    a) 서열번호 66에 기재된 아미노산 서열에 적어도 90% 동일성, 또는 적어도 95% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인,
    b) 서열번호 20에 기재된 아미노산 서열에 적어도 90% 동일성, 또는 적어도 95% 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인, 또는
    c) 상기 a)의 경쇄 가변 도메인 및 상기 b)의 중쇄 가변 도메인
    을 포함하는 CD27L 항원 결합 단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    a) 서열번호 66에 기재된 아미노산 서열로부터 10개 이하, 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 경쇄 가변 도메인,
    b) 서열번호 20에 기재된 아미노산 서열로부터 10개 이하, 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 중쇄 가변 도메인, 또는
    c) 상기 a)의 경쇄 가변 도메인 및 상기 b)의 중쇄 가변 도메인
    을 포함하는 CD27L 항원 결합 단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    a) 서열번호 66에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인,
    b) 서열번호 20에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 또는
    c) 상기 a)의 경쇄 가변 도메인 및 상기 b)의 중쇄 가변 도메인
    을 포함하는 CD27L 항원 결합 단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    경쇄 가변 도메인이 서열번호 66에 기재된 아미노산 서열을 갖고,
    중쇄 가변 도메인이 서열번호 20에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것인
    CD27L 항원 결합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 2 x 10-11 M 이하의 친화성으로 인간 CD27L에 특이적으로 결합하는 CD27L 항원 결합 단백질.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, CD27에 대한 CD27L의 결합을 저해하는 CD27L 항원 결합 단백질.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체인 CD27L 항원 결합 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 항체가 인간 항체인 CD27L 항원 결합 단백질.
  10. 제9항에 있어서,
    서열번호 58에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및
    서열번호 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄
    를 포함하는 CD27L 항원 결합 단백질.
  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 CD27L 항원 결합 단백질.
  12. 제11항에 있어서, 이중특이적 항체가 CD3인 인간 작동체(effector) 세포 항원 및 CD27L에 결합하는 것을 특징으로 하는 CD27L 항원 결합 단백질.
  13. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는 CD27L 항원 결합 단백질.
  14. 제13항에 있어서, 항원-결합 단편이
    (a) F(ab),
    (b) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편,
    (c) F(ab'),
    (d) F(ab')2,
    (e) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편,
    (f) Fv,
    (g) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편,
    (h) dAb 단편,
    (i) 단일 사슬 Fv 분자 (scFv),
    (j) 이중특이적 단일 사슬 Fv 이합체,
    (k) 디아바디, 및
    (l) 트리아바디
    로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 CD27L 항원 결합 단백질.
  15. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 화학치료제에 접합된 CD27L 항원 결합 단백질.
  16. 제15항에 있어서, 링커가 화학치료제를 CD27L 항원 결합 단백질에 접합시키는 것인 CD27L 항원 결합 단백질.
  17. 제16항에 있어서, 링커가 비-절단가능 링커인 CD27L 항원 결합 단백질.
  18. 제17항에 있어서, 링커가 N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1 카르복실레이트(MCC)를 포함하는 것인 CD27L 항원 결합 단백질.
  19. 제15항에 있어서, 화학치료제가 CD27L 항원 결합 단백질의 폴리펩티드에 내포된 하나 이상의 리신에 접합된 것인 CD27L 항원 결합 단백질.
  20. 제15항에 있어서, 화학치료제가 메이탄시노이드(DM1)인 CD27L 항원 결합 단백질.
  21. 제20항의 CD27L 항원 결합 단백질을 포함하는 암 치료용 조성물이며, CD27L 항원 결합 단백질마다 DM1 분자의 평균 수가 1 내지 10인 조성물.
  22. 제21항에 있어서, CD27L 항원 결합 단백질마다 DM1 분자의 평균 수가 3 내지 7인 조성물.
  23. 제22항에 있어서, CD27L 항원 결합 단백질마다 DM1 분자의 평균 수가 4 내지 6인 조성물.
  24. 제22항에 있어서, CD27L 항원 결합 단백질마다 DM1 분자의 평균 수가 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 또는 6.0인 조성물.
  25. 제21항에 있어서, 치료 유효량의 CD27L 항원 결합 단백질을 포함하는 제약학적 조성물인 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 제약학적 조성물이 동결건조된 조성물.
  27. 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 핵산이며, 여기서 폴리펩티드는
    i) 서열번호 74에 기재된 서열을 갖는 LCDR1,
    서열번호 82에 기재된 서열을 갖는 LCDR2, 및
    서열번호 90에 기재된 서열을 갖는 LCDR3
    을 포함하는 경쇄 가변 도메인; 및
    서열번호 28에 기재된 서열을 갖는 HCDR1,
    서열번호 36에 기재된 서열을 갖는 HCDR2, 및
    서열번호 44에 기재된 서열을 갖는 HCDR3
    을 포함하는 중쇄 가변 도메인,
    ii) 상기 i)에 정의된 바와 같으나, 서열번호 74에 기재된 LCDR1 서열의 위치 1 및 위치 3에서 Arg 및 Ser이 각각 Lys 및 Gly으로 돌연변이되거나 또는 서열번호 90에 기재된 LCDR3 서열의 위치 2 및 위치 3에서 Gln 및 Thr이 각각 Asn 및 Ser으로 돌연변이된 경쇄 가변 도메인; 및
    상기 i)에 정의된 바와 같으나, 서열번호 28에 기재된 HCDR1 서열의 위치 1 및 위치 4에서 Asn 및 Ile이 각각 Ser 및 Met으로 돌연변이된 중쇄 가변 도메인, 또는
    iii) 상기 i)에 정의된 바와 같으나, 서열번호 82에 기재된 LCDR2 서열의 위치 1 및 위치 4에서 Leu 및 Tyr이 각각 Ile 및 Phe으로 돌연변이된 경쇄 가변 도메인; 및
    상기 i)에 정의된 바와 같은 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것인,
    단리된 핵산.
  28. 제27항에 있어서, 폴리펩티드가
    a) 서열번호 66에 기재된 아미노산 서열에 적어도 95% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인,
    b) 서열번호 20에 기재된 아미노산 서열에 적어도 95% 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인,
    c) 서열번호 66에 기재된 아미노산 서열로부터 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 경쇄 가변 도메인,
    d) 서열번호 20에 기재된 아미노산 서열로부터 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 중쇄 가변 도메인,
    e) 서열번호 51에 기재된 뉴클레오티드 서열에 적어도 80% 동일한, 또는 적어도 90% 동일한, 또는 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩되거나, 또는
    서열번호 51에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩되는
    항체 경쇄, 또는
    f) 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열에 적어도 80% 동일한, 또는 적어도 90% 동일한, 또는 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩되거나, 또는
    서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩되는
    항체 중쇄
    를 포함하는 것인 단리된 핵산.
  29. 제27항 또는 제28항의 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  30. 제29항에 있어서, 단리된 핵산이 항체 경쇄, 항체 중쇄, 또는 둘다를 인코딩하는 것인 발현 벡터.
  31. 프로모터에 작동가능하게 연결된 제27항 또는 제28항의 단리된 핵산, 또는
    상기 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터이며 여기서 단리된 핵산이 항체 경쇄, 항체 중쇄, 또는 둘다를 인코딩하는 것인 발현 벡터
    를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  32. 제31항에 있어서, 포유류 기원인 재조합 숙주 세포.
  33. 제32항에 있어서, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주인 재조합 숙주 세포.
  34. i) a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 CD27L 항원 결합 단백질을 제공하는 단계,
    b) CD27L 항원 결합 단백질을 링커에 접합시키는 단계, 및
    c) 상기 링커에 약물을 접합시키는 단계
    를 포함하거나, 또는
    ii) a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 CD27L 항원 결합 단백질을 제공하는 단계, 및
    b) 약물에 공유 결합된 링커를 상기 CD27L 항원 결합 단백질에 접합시키는 단계
    를 포함하는, CD27L 항원 결합 단백질-약물 접합체를 제조하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 링커가 MCC를 포함하는 것인 방법.
  36. 제34항에 있어서, 약물이 DM1을 포함하는 것인 방법.
  37. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 CD27L 항원 결합 단백질을 포함하는, 암 치료용 제약학적 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 암이 신장 세포 암종 (RCC), 투명 세포 RCC, 두경부 암, 교아종, 유방 암, 뇌종양, 상인두 암종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 급성 림프성 백혈병 (ALL), 만성 림프성 백혈병 (CLL), 버킷 림프종, 미분화성 대세포 림프종 (ALCL), 다발성 골수종, 피부 T-세포 림프종, 결절성 소형 분획 세포(nodular small cleaved-cell) 림프종, 림프구 림프종, 말초 T-세포 림프종, 레너트 림프종, 면역아세포 림프종, T-세포 백혈병/림프종 (ATLL), 성인 T-세포 백혈병 (T-ALL), 중심아세포성/중심세포성 (cb/cc) 여포성 림프종 암, B 계통의 미만성 거대 세포 림프종, 혈관면역아세포성 림프절증 (AILD)-유사 T 세포 림프종, HIV 연관된 체강 기초된 림프종, 태생성 암종, 상인두의 미분화 암종, 캐슬만병, 카포시 육종, 다발성 골수종, 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증 또는 기타 B-세포 림프종인 제약학적 조성물.
  39. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 CD27L 항원 결합 단백질을 포함하는, 자가면역 또는 염증 질환의 치료용 제약학적 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 자가면역 또는 염증 질환이 전신성 홍반성 낭창 (SLE), 인슐린 의존성 당뇨병 (IDDM), 염증성 장 질환 (IBD), 다발성 경화증 (MS), 건선, 자가면역성 갑상선염, 류머티스성 관절염 (RA), 또는 사구체신염인 제약학적 조성물.
  41. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 CD27L 항원 결합 단백질을 포함하는, 환자에서 이식 거부반응 또는 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)을 저해 또는 예방하기 위한 제약학적 조성물.
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