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CN101605906A - 结合cd70的人类抗体及其用途 - Google Patents

结合cd70的人类抗体及其用途 Download PDF

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CN101605906A
CN101605906A CNA2007800512313A CN200780051231A CN101605906A CN 101605906 A CN101605906 A CN 101605906A CN A2007800512313 A CNA2007800512313 A CN A2007800512313A CN 200780051231 A CN200780051231 A CN 200780051231A CN 101605906 A CN101605906 A CN 101605906A
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CN
China
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variable region
antibody
seq
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light chain
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Pending
Application number
CNA2007800512313A
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English (en)
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M·A·科恰
J·A·科雷特
D·J·金
C·帕恩
J·卡尔达雷利
M·亚马纳卡
K·A·亨宁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ER Squibb and Sons LLC
Original Assignee
Medarex LLC
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Abstract

本发明提供了以高亲和力特异性地结合CD70的分离的单克隆抗体，特别是人类单克隆抗体。优选地，这些抗体结合人类CD70。在某些实施方案中，这些抗体能被内化至表达CD70的细胞之中或能介导抗原依赖性细胞毒性。还提供了对本发明的抗体进行编码的核酸分子、表达载体、宿主细胞以及用于表达本发明抗体的方法。还提供了抗体－配偶体分子偶联物、双特异性分子以及包括本发明抗体的药物组合物。本发明还提供了使用本发明抗－CD70抗体来检测CD70的方法、以及治疗癌症(如肾癌以及淋巴瘤)的方法。

Description

结合CD70的人类抗体及其用途
相关申请
本专利申请主张于2006年12月14日提交的美国临时申请系列号60/870,091、于2007年5月1日提交的美国临时申请系列号60/915,314以及于2007年11月30日提交的美国临时申请系列号60/991,702的优先权，其内容在此合并作为参考。
发明背景
细胞因子受体CD27是肿瘤坏死因子受体(TFNR)超家族的成员，它在细胞生长和分化中，以及在细胞凋亡或程序性死亡中起一定作用。CD27的配体是CD70，它属于配体的肿瘤坏死因子家族。CD70是一个193个氨基酸的多肽，具有20个氨基酸亲水的N末端结构域以及包含2个潜在的N-连接糖基化位点的C末端结构域(Goodwin，R.G.等人(1993)Cell73：447-56；Bowman等人(1994)Immunol 152：1756-61)。基于这些特征，CD70被确定为具有细胞外C末端部分的II型跨膜蛋白。
已发现CD70瞬时出现于已激活的而非静止态的T和B淋巴细胞以及树突细胞(Hintzen等人(1994)J.Immunol.152：1762-1773；Oshima等人(1998)Int.Immunol.10：517-26；Tesselaar等人(2003)J.Immunol.170：33-40)。除在正常细胞上表达外，已报道CD70在不同类型的癌细胞中表达，包括肾细胞癌、转移型乳癌、脑肿瘤、白血病、淋巴瘤以及鼻咽癌(Junker等人(2005)J Urol.173：2150-3；Sloan等人(2004)Am J Pathol.164：315-23；Held-Feindt and Mentlein(2002)Int J Cancer 98：352-6；Hishima等人(2000)Am J Surg Pathol.24：742-6；Lens等人(1999)Br JHaematol.106：491-503)。另外，发现CD70在用DNA甲基转移酶抑制剂或ERK途径抑制剂处理的T细胞上过量表达，可能导致药物引起的或原发性狼疮(Oelke等人(2004)Arthritis Rheum.50：1850-60)。已提出，CD70与CD27的相互作用在细胞介导的自身免疫疾病以及抑制TNF-α的产生中起作用(Nakajima等人(2000)J.Neuroimmunol.109：188-96)。
因此，CD70代表了用于治疗以CD70表达为特征的癌症、自身免疫紊乱以及许多其他疾病的有价值的靶标。
概述
本发明提供了分离的单克隆抗体，特别是人类单克隆抗体，这些抗体特异性结合CD70并且具有多种所希望的特性。这些特性包括结合人类CD70的高亲和力、由表达CD70的细胞内化、介导抗体依赖性细胞毒性的能力、结合肾细胞癌肿瘤细胞系的能力、和/或结合淋巴瘤细胞系(例如B细胞肿瘤细胞系)的能力。本发明的抗体可以用于例如检测CD70蛋白或用于抑制表达CD70的细胞(如表达CD70的肿瘤细胞)的生长。
还提供了使用本发明分离的单克隆抗体及其组合物治疗多种CD70介导的疾病的方法。
一方面，本发明涉及分离的单克隆抗体或该抗体的抗原结合部分，其中该抗体结合CD70，并且表现出以下特性中的至少一种：
(a)以1×10-7M或更小的KD与人类CD70相结合；
(b)结合肾细胞癌肿瘤细胞系；
(c)结合淋巴瘤细胞系，例如B细胞肿瘤细胞系；
(d)被表达CD70的细胞内化；
(e)表现出针对表达CD70的细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)；并且
(f)当与细胞毒素相偶联时在体内抑制表达CD70的细胞的生长。
优选地，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的至少两种。更优选地，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的至少三种。更优选地，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的四种。甚至更优选地，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的五种。甚至更优选地，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的全部六种。在另一个优选的实施方案中，当该抗体与细胞毒素相偶联时该抗体在体内抑制表达CD70的肿瘤细胞的生长。
优选地，该抗体结合肾细胞癌肿瘤细胞系，该细胞系选自：786-O(ATCC登录号CRL-1932)、A-498(ATCC登录号HTB-44)、ACHN(ATCC登录号CRL-1611)、Caki-1(ATCC登录号HTB-46)以及Caki-2(ATCC登录号HTB-47)。
优选地，该抗体结合B细胞癌肿瘤细胞系，该细胞系选自Daudi(ATCC登录号CCL-213)、HuT 78(ATCC登录号TIB-161)、Raji(ATCC登录号CCL-86)或Granta-519(DSMZ登录号342)细胞。
优选地，该抗体是人类抗体，虽然在可替代地实施方案中，该抗体可以是鼠类抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
在更优选的实施方案中，该抗体以5.5×10-9M或更小的KD与人类CD70相结合，或以3×10-9M或更小的KD与人类CD70相结合，或以2×10-9M或更小的KD与人类CD70相结合，或以1.5×10-9M或更小的KD与人类CD70相结合。
在另一个实施方案中，该抗体与786-O肾细胞癌肿瘤细胞上表达的CD70结合后被那些细胞内化。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或该抗体的抗原结合部分，其中该抗体交叉竞争结合CD70上由参考抗体所识别的表位，其中该参考抗体：(a)以1×10-7M或更小的KD结合人类CD70；并且(b)结合肾细胞癌肿瘤细胞系。
在不同的实施方案中，该参照抗体包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：1；以及(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：7；
或该参照抗体包括(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：2；以及(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：8；
或该参照抗体包括(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：3；以及(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：9；
或该参照抗体包括(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：4；以及(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：10；
或该参照抗体包括(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：5或73；以及(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：11；
或该参照抗体包括(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：6；以及(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：12。
在另一个实施方案中，本发明的参考抗体为抗体69A7Y。69A7Y与抗体69A7相同，但在氨基酸序列SEQ ID NO：5的VH中含保守修饰，导致在氨基酸位置100处C(半胱氨酸)突变为Y(酪氨酸)。69A7Y的VH氨基酸序列由SEQ ID NO：73给出。从C到Y的突变是由在69A7的VH核苷酸序列(SEQ ID NO：53)的核苷酸位置323处发生从G到A的单一碱基对取代所形成的。69A7Y的VH核苷酸序列由SEQ ID NO：74给出。69A7Y具有重链可变区CDR3，包括如SEQ ID NO：75所给出的氨基酸序列。
另一方面，本发明涉及与治疗剂相连接的分离的单克隆抗体或它的抗原结合部分，该单克隆抗体或其抗原结合部分包括作为人类VH 3-30.3基因的产物或衍生自该基因的重链可变区，其中该抗体特异性结合CD70。本发明还提供分离的单克隆抗体，包括连接到治疗剂上的单克隆抗体或它的抗原结合部分，其中该抗体包括作为人类VH 3-33基因的产物或衍生自该基因的重链可变区，其中该抗体与CD70特异性结合。本发明还提供了分离的单克隆抗体，包括连接到治疗剂上的单克隆抗体或它的抗原结合部分，其中该抗体包括作为人类VH 4-61基因的产物或衍生自该基因的重链可变区，其中该抗体与CD70特异地结合。本发明还提供了分离的单克隆抗体，包括连接到治疗剂上的单克隆抗体或它的抗原结合部分，其中该抗体包括作为人类VH 3-23基因的产物或衍生自该基因的重链可变区，其中该抗体特异性地结合CD70。
本发明还进一步提供了分离的单克隆抗体，包括连接到治疗剂上的单克隆抗体或它的抗原结合部分，其中该抗体包括作为人类VK L6基因的产物或衍生自该基因的轻链可变区，其中该抗体特异地结合CD70。本发明还进一步提供了分离的单克隆抗体，包括连接到治疗剂上的单克隆抗体或它的抗原结合部分，其中该抗体包括作为人类VKL18基因的产物或衍生自该基因的轻链可变区，其中该抗体特异地结合CD70。本发明进一步提供了分离的单克隆抗体，包括连接到治疗剂上的单克隆抗体或它的抗原结合部分，其中该抗体包括作为人类VKL15基因的产物或衍生自该基因的轻链可变区，其中该抗体特异地结合CD70。本发明进一步提供了分离的单克隆抗体，包括连接到治疗剂上的单克隆抗体或它的抗原结合部分，其中该抗体包括作为人类VKA27基因的产物或衍生自该基因的轻链可变区，其中该抗体特异地结合CD70。
特别优选的抗体或其抗原结合部分包括：
(a)包括SEQ ID NO：13的重链可变区CDR1；
(b)包括SEQ ID NO：19的重链可变区CDR2；
(c)包括SEQ ID NO：25的重链可变区CDR3；
(d)包括SEQ ID NO：31的轻链可变区CDR1；
(e)包括SEQ ID NO：37的轻链可变区CDR2；以及
(f)包括SEQ ID NO：43的轻链可变区CDR3。
另一种优选的组合包括：
(a)包括SEQ ID NO：14的重链可变区CDR1；
(b)包括SEQ ID NO：20的重链可变区CDR2；
(c)包括SEQ ID NO：26的重链可变区CDR3；
(d)包括SEQ ID NO：32的轻链可变区CDR1；
(e)包括SEQ ID NO：38的轻链可变区CDR2；以及
(f)包括SEQ ID NO：44的轻链可变区CDR3。
另一种优选的组合包括：
(a)包括SEQ ID NO：15的重链可变区CDR1；
(b)包括SEQ ID NO：21的重链可变区CDR2；
(c)包括SEQ ID NO：27的重链可变区CDR3；
(d)包括SEQ ID NO：33的轻链可变区CDR1；
(e)包括SEQ ID NO：39的轻链可变区CDR2；以及
(f)包括SEQ ID NO：45的轻链可变区CDR3。
另一种优选的组合包括：
(a)包括SEQ ID NO：16的重链可变区CDR1；
(b)包括SEQ ID NO：22的重链可变区CDR2；
(c)包括SEQ ID NO：28的重链可变区CDR3；
(d)包括SEQ ID NO：34的轻链可变区CDR1；
(e)包括SEQ ID NO：40的轻链可变区CDR2；以及
(f)包括SEQ ID NO：46的轻链可变区CDR3。
另一种优选的组合包括：
(a)包括SEQ ID NO：17的重链可变区CDR1；
(b)包括SEQ ID NO：23的重链可变区CDR2；
(c)包括SEQ ID NO：29或75的重链可变区CDR3；
(d)包括SEQ ID NO：35的轻链可变区CDR1；
(e)包括SEQ ID NO：41的轻链可变区CDR2；以及
(f)包括SEQ ID NO：47的轻链可变区CDR3。
另一种优选的组合包括：
(a)包括SEQ ID NO：18的重链可变区CDR1；
(b)包括SEQ ID NO：24的重链可变区CDR2；
(c)包括SEQ ID NO：30的重链可变区CDR3；
(d)包括SEQ ID NO：36的轻链可变区CDR1；
(e)包括SEQ ID NO：42的轻链可变区CDR2；以及
(f)包括SEQ ID NO：48的轻链可变区CDR3。
本发明其他优选的抗体具有抗体或其抗原结合部分，其包括：(a)包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的重链可变区；以及(b)包括氨基酸序列SEQID NO：7的轻链可变区。
另一种优选的组合包括(a)包括氨基酸序列SEQ ID NO：2的重链可变区；以及(b)包括氨基酸序列SEQ ID NO：8的轻链可变区。
另一种优选的组合包括(a)包括氨基酸序列SEQ ID NO：3的重链可变区；以及(b)包括氨基酸序列SEQ ID NO：9的轻链可变区。
另一种优选的组合包括(a)包括氨基酸序列SEQ ID NO：4的重链可变区；以及(b)包括氨基酸序列SEQ ID NO：10的轻链可变区。
另一种优选的组合包括(a)包括氨基酸序列SEQ ID NO：5或73的重链可变区；以及(b)包括氨基酸序列SEQ ID NO：11的轻链可变区。
另一种优选的组合包括(a)包括氨基酸序列SEQ ID NO：6的重链可变区；以及(b)包括氨基酸序列SEQ ID NO：12的轻链可变区。
在另一个实施方案中，本发明的一种抗体是抗体69A7Y。69A7Y与抗体69A7相同，但在SEQ ID NO：5的VH氨基酸序列中包含保守修饰，导致在氨基酸位置100处C(半胱氨酸)突变为Y(酪氨酸)。69A7Y的VH氨基酸序列由SEQ ID NO：73给出。从C到Y的突变是在69A7的VH核苷酸序列(SEQ ID NO：53)的核苷酸位置323处发生从G到A的单一碱基对取代形成的。69A7Y的VH核苷酸序列由SEQ ID NO：74给出。69A7Y具有重链可变区CDR3，包含如SEQ ID NO：75所给出的氨基酸序列。
例如，本发明的抗体可以是全长抗体，例如IgG1或IgG4同种型。可替代地，该抗体可以是诸如Fab或Fab’2片段或单链抗体的抗体片段。
本发明还提供了免疫偶联物，包括连接到治疗剂(例如细胞毒素或放射性同位素)的本发明的抗体或它的抗原结合部分。在一个特别优选的实施方案中，本发明提供了免疫偶联物，该偶联物包含连接到细胞毒素(例如，此处说明的细胞毒素或参见于2006年12月28日申请的美国专利申请60/882,461或2007年11月30日申请的美国专利申请号60/991,300中，其全文在此合并作为参考)(例如通过硫羟醇基连接)的本发明抗体或其抗原结合部分。在某些实施方案中，该免疫偶联物的细胞毒素以及连接物具有N1或N2结构。
例如，在不同的实施方案中，本发明提供了以下优选的免疫偶联物：
(i)免疫偶联物，包括抗体或其抗原结合部分，包括：
(a)包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的重链可变区和包括氨基酸序列SEQ ID NO：7的轻链可变区；
(b)包括氨基酸序列SEQ ID NO：2的重链可变区和包括氨基酸序列SEQ ID NO：8的轻链可变区；
(c)包括氨基酸序列SEQ ID NO：3的重链可变区和包括氨基酸序列SEQ ID NO：9的轻链可变区；
(d)包括氨基酸序列SEQ ID NO：4的重链可变区和包括氨基酸序列SEQ ID NO：10的轻链可变区；
(e)包括氨基酸序列SEQ ID NO：5或73的重链可变区和包括氨基酸序列SEQ ID NO：11的轻链可变区，以及
(f)包括氨基酸序列SEQ ID NO：6的重链可变区和包括氨基酸序列SEQ ID NO：12的轻链可变区，其中该抗体或其抗原结合部分连接到细胞毒素上；
(ii)一种免疫偶联物，包括抗体或其抗原结合部分，包括：
(a)包括SEQ ID NO：13的重链可变区CDR1；
(b)包括SEQ ID NO：19的重链可变区CDR2；
(c)包括SEQ ID NO：25的重链可变区CDR3；
(d)包括SEQ ID NO：31的轻链可变区CDR1；
(e)包括SEQ ID NO：37的轻链可变区CDR2；以及
(f)包括SEQ ID NO：43的轻链可变区CDR3；
或者抗体或其抗原结合部分，包括：
(a)包括SEQ ID NO：14的重链可变区CDR1；
(b)包括SEQ ID NO：20的重链可变区CDR2；
(c)包括SEQ ID NO：26的重链可变区CDR3；
(d)包括SEQ ID NO：32的轻链可变区CDR1；
(e)包括SEQ ID NO：38的轻链可变区CDR2；以及
(f)包括SEQ ID NO：44的轻链可变区CDR3；
或者抗体或其抗原结合部分，包括：
(a)包括SEQ ID NO：15的重链可变区CDR1；
(b)包括SEQ ID NO：21的重链可变区CDR2；
(c)包括SEQ ID NO：27的重链可变区CDR3；
(d)包括SEQ ID NO：33的轻链可变区CDR1；
(e)包括SEQ ID NO：39的轻链可变区CDR2；以及
(f)包括SEQ ID NO：45的轻链可变区CDR3；
或者抗体或其抗原结合部分，包括：
(a)包括SEQ ID NO：16的重链可变区CDR1；
(b)包括SEQ ID NO：22的重链可变区CDR2；
(c)包括SEQ ID NO：28的重链可变区CDR3；
(d)包括SEQ ID NO：34的轻链可变区CDR1；
(e)包括SEQ ID NO：40的轻链可变区CDR2；以及
(f)包括SEQ ID NO：46的轻链可变区CDR3；
或者种抗体或其抗原结合部分，包括：
(a)包括SEQ ID NO：17的重链可变区CDR1，；
(b)包括SEQ ID NO：23的重链可变区CDR2，；
(c)包括SEQ ID NO：29或75的重链可变区CDR3，；
(d)包括SEQ ID NO：35的轻链可变区CDR1；
(e)包括SEQ ID NO：41的轻链可变区CDR2；以及
(f)包括SEQ ID NO：47的轻链可变区CDR3；
或者抗体或其抗原结合部分，包括：
(a)包括SEQ ID NO：18的重链可变区CDR1；
(b)包括SEQ ID NO：24的重链可变区CDR2；
(c)包括SEQ ID NO：30的重链可变区CDR3；
(d)包括SEQ ID NO：36的轻链可变区CDR1；
(e)包括SEQ ID NO：42的轻链可变区CDR2；以及
(f)包括SEQ ID NO：48的轻链可变区CDR3，
其中该抗体或其抗原结合部分连接到细胞毒素上；以及
(iii)一种免疫偶联物，包括连接到细胞毒素上的抗体或其抗原结合部分，它结合由下述抗体所识别的相同表位(如与该抗体交叉竞争结合人类CD70)，该抗体包括：
(a)包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的重链可变区和包括氨基酸序列SEQ ID NO：7的轻链可变区；
(b)包括氨基酸序列SEQ ID NO：2的重链可变区和包括氨基酸序列SEQ ID NO：8的轻链可变区；
(c)包括氨基酸序列SEQ ID NO：3的重链可变区和包括氨基酸序列SEQ ID NO：9的轻链可变区；
(d)包括氨基酸序列SEQ ID NO：4的重链可变区和包括氨基酸序列SEQ ID NO：10的轻链可变区；
(e)包括氨基酸序列SEQ ID NO：5或73的重链可变区和包括氨基酸序列SEQ ID NO：11的轻链可变区；以及
(f)包括氨基酸序列SEQ ID NO：6的重链可变区和包括氨基酸序列SEQ ID NO：12的轻链可变区。
本发明还提供了双特异性分子，该双特异性分子包括本发明的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部位与第二个功能部分相连接，该第二功能部分具有与所述抗体或其抗原结合部分相比不同的结合特异性。
还提供了组合物，包括本发明的抗体或其抗原结合部分或免疫偶联物或双特异性分子，以及药学上可接受的载体。
本发明还包括编码本发明抗体或它们的抗原结合部分的核酸分子以及包括此类核酸的表达载体以及包括此类表达载体的宿主细胞。还提供了使用包括此类表达载体的宿主细胞制备抗CD70抗体的方法，并且这些方法可包括的步骤有：(i)在宿主细胞中表达该抗体以及(ii)从宿主细胞中分离该抗体。
在又另一方面中，本发明涉及制备抗CD70抗体的方法。该方法包括：
(a)提供：(i)重链可变区抗体序列，包括选自SEQ ID NO：13至18的CDR1序列；选自SEQ ID NO：19至24的CDR2序列；和/或选自SEQID NO：25至30及75的CDR3序列；和/或(ii)轻链可变区抗体序列，包括选自SEQ ID NO：31至36的CDR1序列；选自SEQ ID NO：37至42的CDR2序列，和/或选自SEQ ID NO：43至48的CDR3序列；
(b)在重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列中改变至少一个氨基酸残基，以产生至少一种被改变的抗体序列；并且
(c)将被改变的抗体序列表达成蛋白质。
本发明还提供了以高亲和力与CD70特异性结合的分离的抗CD70抗体-配偶体分子偶联物，特别是那些包含人类单克隆抗体的抗CD70抗体-配偶体分子偶联物。此类抗体-配偶体分子偶联物中有某些能被内化至表达CD70的细胞中，并且能介导抗体依赖性细胞毒性作用。本发明还提供了使用在此披露的抗CD70抗体-配偶体分子偶联物治疗癌症的方法，这些癌症例如肾细胞癌或者淋巴瘤。
还提供了包括与本发明的配偶体分子相偶联的抗体或其抗原结合部分的组合物。可以有利地与在此披露的抗体配偶体分子偶联物中的抗体相偶联的配偶体分子包括但不限于：作为药物的分子、细胞毒素、标记分子(如放射性同位素)、蛋白质以及治疗剂。还在此披露了包括抗体-配偶体分子偶联物以及药学上可接受的载体的组合物。
一方面，此类抗体-配偶体分子偶联物通过化学连接物相偶联。在一些实施方案中，该连接物是肽基连接物，并在此被表示为(L4)p-F-(L1)m。其他连接物包括肼以及二硫化物连接物，并在此被分别表示为(L4)p-H-(L1)m或(L4)p-J-(L1)m。除了与配偶体相结合的连接物之外，本发明还提供了适用于结合至基本上任何分子种类的可切割的连接臂。
另一方面，本发明涉及抑制表达CD70的肿瘤细胞生长的方法。该方法包括将表达CD70的肿瘤细胞与本发明的抗体-配偶体分子偶联物相接触，使得表达CD70的肿瘤细胞的生长受到抑制。在一个优选的实施方案中，该配偶体分子是治疗剂，如细胞毒素。特别优选的表达CD70的肿瘤细胞是肾癌细胞和淋巴瘤细胞。
另一方面，本发明涉及治疗受试者的癌症的方法。该方法包括给予该受试者本发明的抗体-配偶体分子偶联物，使得该受试者的癌症得到治疗。在一个优选的实施方案中，该配偶体分子是治疗剂，如细胞毒素。特别优选的能治疗的癌症是肾癌以及淋巴瘤。
另一方面，本发明涉及治疗受试者的自身免疫病、炎症或者病毒感染的方法。该方法包括给予该受试者本发明的抗体-配偶体分子偶联物，使得该受试者的自身免疫紊乱得到治疗。
以下详细的说明书以及实施例将清楚地说明本发明的其他特征及优点，这些说明书与实施例不得被解释为是对本发明的限制。本申请全文引用的所有参考文献、Genbank登录号、专利以及已公开的专利申请都明确地合并入本文作为参考。
附图简要说明
图1A示出了2H5人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：49)以及氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。描述了CDR1(SEQ ID NO：13)、CDR2(SEQ ID NO：19)以及CDR3(SEQ ID NO：25)区，并指明了V与J的种系来源(germline derivations)。
图1B示出了2H5人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：55)以及氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。描述了CDR1(SEQ ID NO：31)、CDR2(SEQ ID NO：37)以及CDR3(SEQ ID NO：43)区，并指明了V与J的种系来源。
图2A示出了10B4人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：50)以及氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。描述出了CDR1(SEQ IDNO：14)、CDR2(SEQ ID NO：20)以及CDR3(SEQ ID NO：26)区，并指明了V、D以及J的种系来源。
图2B示出了10B4人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：56)以及氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。描述了CDR1(SEQ ID NO：32)、CDR2(SEQ ID NO：38)以及CDR3(SEQ ID NO：44)区，并指明了V与J的种系来源。
图3A示出了8B5人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：51)以及氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。描述了CDR1(SEQ ID NO：15)、CDR2(SEQ ID NO：21)以及CDR3(SEQ ID NO：27)区，并指明了V、D以及J的种系来源。
图3B示出了8B5人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：57)以及氨基酸序列(SEQ ID NO：9)。描述了CDR1(SEQ ID NO：33)、CDR2(SEQ ID NO：39)以及CDR3(SEQ ID NO：45)区，并指明了V与J的种系来源。
图4A示出了18E7人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：52)以及氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。描述了CDR1(SEQ ID NO：16)、CDR2(SEQ ID NO：22)以及CDR3(SEQ ID NO：28)区，并指明了V、D以及J的种系来源。
图4B示出了18E7人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：58)以及氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。描述了CDR1(SEQ ID NO：34)、CDR2(SEQ ID NO：40)以及CDR3(SEQ ID NO：46)区，并指明了V与J的种系来源。
图5A示出了69A7人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：53)以及氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。描述了CDR1(SEQ ID NO：17)、CDR2(SEQ ID NO：23)以及CDR3(SEQ ID NO：29)区，并指明了V、D及J的种系来源。
图5B示出了69A7人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：59)以及氨基酸序列(SEQ ID NO：11)。描述了CDR1(SEQ IDNO：35)、CDR2(SEQ ID NO：41)以及CDR3(SEQ ID NO：47)区，并指明了V与J的种系来源。
图6A示出了1F4人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：54)以及氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。描述了CDR1(SEQ ID NO：18)、CDR2(SEQ ID NO：24)以及CDR3(SEQ ID NO：30)区，并指明了V、D以及J的种系来源。
图6B示出了1F4人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：60)以及氨基酸序列(SEQ ID NO：12)。描述了CDR1(SEQ ID NO：36)、CDR2(SEQ ID NO：42)以及CDR3(SEQ ID NO：48)区，并指明了V与J的种系来源。
图7示出了2H5和10B4的重链可变区的氨基酸序列与人类种系VH3-30.3氨基酸序列(SEQ ID NO：61)的比对。
图8示出了8B5和18E7的重链可变区的氨基酸序列与人类种系VH3-33氨基酸序列(SEQ ID NO：62)的比对。
图9示出了69A7的重链可变区的氨基酸序列与人类种系VH 4-61氨基酸序列(SEQ ID NO：63)的比对。
图10示出了1F4的重链可变区的氨基酸序列与人类种系VH 3-23氨基酸序列(SEQ ID NO：64)的比对。
图11示出了2H5的轻链可变区的氨基酸序列与人类种系VK L6氨基酸序列(SEQ ID NO：65)的比对。
图12示出了10B4的轻链可变区的氨基酸序列与人类种系VK L18氨基酸序列(SEQ ID NO：66)的比对。
图13示出了8B5和18E7的轻链可变区的氨基酸序列与人类种系VKL15氨基酸序列(SEQ ID NO：67)的比对。
图14示出了69A7的轻链可变区的氨基酸序列与人类种系VK L6氨基酸序列(SEQ ID NO：65)的比对。
图15示出了1F4的轻链可变区的氨基酸序列与人类种系VK A27氨基酸序列(SEQ ID NO：68)的比对。
图16示出了ELSIA实验的结果，证明针对人类CD70的人类单克隆抗体特异性结合CD70。
图17示出了流式细胞术实验的结果，证明抗-CD70人类单克隆抗体2H5与肾癌细胞系结合。
图18A与B示出了流式细胞术实验结果，证明针对人类CD70的人类单克隆抗体以浓度依赖性的方式与肾细胞癌(RCC)细胞系结合。(A)786-ORCC细胞系(B)A498RCC细胞系。
图18C示出了流式细胞术实验的结果，证明针对人类CD70的人类单克隆抗体与786-O肾癌细胞系结合。
图18D示出了流式细胞术实验的结果，证明针对人类CD70的HuMAb69A7抗体以浓度依赖性的方式与肾细胞癌(RCC)细胞系786-O结合。
图19示出了流式细胞术实验的结果，证明抗CD70人类单克隆抗体2H5与人类淋巴瘤细胞系结合。
图20A与B示出了流式细胞术实验的结果，证明抗-CD70人类单克隆抗体2H5以浓度依赖性的方式与人类淋巴瘤细胞系结合。(A)Raji淋巴瘤细胞系(B)Granta-519淋巴瘤细胞系。
图20C示出了流式细胞术实验的结果，证明针对人类CD70的人类单克隆抗体结合Raji淋巴瘤细胞系。
图20D示出了竞争性流式细胞术测定的结果，证明HuMAb 2H5与69A7共用类似的结合表位。
图20E示出了流式细胞术实验的结果，证明针对人类CD70的人类单克隆抗体与Daudi淋巴瘤细胞系以及786-O肾癌细胞系结合。
图21示出了Hum-Zap内化实验的结果，证明针对人类CD70的人类单克隆抗体可以内化进入CD70阳性细胞中。
图22A至C示出了细胞增殖测定的结果，证明偶联细胞毒素的人类单克隆抗-CD70抗体杀死肾细胞癌细胞(RCC)系。(A)Caki-2RCC(B)786-ORCC(C)ACHN RCC。
图23A至D示出了ADCC测定的结果，证明人类单克隆抗-CD70抗体以ADCC依赖的方式杀死人类白血病以及淋巴瘤细胞系。(A)ARH-77白血病细胞系(B)HuT 78淋巴瘤细胞系(C)Raji淋巴瘤细胞系以及(D)L-540细胞系，它不表达CD70。
图24示出了细胞增殖测定的结果，证明偶联细胞毒素的人类单克隆抗-CD70抗体杀死人类淋巴瘤细胞系。
图25A至B示出了细胞增殖测定的结果，证明偶联细胞毒素的人类单克隆抗-CD70抗体显示出在(A)洗涤三小时以及(B)持续洗涤时对Raji细胞的细胞毒性。
图26A至B示出了在体内小鼠肿瘤模型研究的结果，证明用偶联细胞毒素的抗-CD70抗体2H5治疗对肾细胞癌(RCC)肿瘤具有直接的体内抑制作用。(A)A-498RCC肿瘤(B)ACHN RCC肿瘤。
图27A至F示出了ADCC测定的结果，证明非岩藻糖化的人类单克隆抗-CD70抗体对人类白血病细胞具有以ADCC依赖方式的增加的细胞毒性。(A)ARH-77细胞；(B)MEC-1细胞；(C)用抗-CD16抗体处理的MEC-1细胞；(D)SU-DHL-6细胞；(E)IM-9细胞；(F)HuT 78细胞。
图28示出了ADCC测定的结果，证明人类单克隆抗-CD70抗体以ADCC浓度依赖性方式杀死人类白血病细胞。
图29示出了抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定的结果，证明人类单克隆抗-CD70抗体以ADCC依赖性方式杀死人类白血病细胞，但是细胞毒性依赖于CD16。
图30示出了ADCC测定的结果，证明人类单克隆抗-CD70抗体杀死人类已激活的T细胞，并且该作用可随抗-CD16抗体的加入得到逆转。
图31示出了阻断测定的结果，证明一些人类单克隆抗-CD70抗体阻断CD70与CD27的结合，而其他人类单克隆抗-CD70抗体不阻断CD70与CD27的结合。
图32A至B示出了在体内小鼠肿瘤模型研究的结果，证明裸露的抗-CD70抗体2H5的治疗对淋巴瘤具有直接的体内抑制作用。(A)Raji肿瘤(B)ARH-77肿瘤。
图33A至C示出了在体内小鼠肿瘤模型研究的结果，证明用偶联细胞毒素的抗-CD70抗体2H5的治疗对淋巴瘤具有直接的体内抑制作用。(A)ARH-77肿瘤；(B)Granta 519肿瘤；(C)Raji肿瘤。
图34示出了一项研究结果，表明抗-CD70抗体69A7与在恒河猴CD70阳性B淋巴瘤细胞系上表达的CD70进行交叉反应。
图35示出了阻断测定的结果，证明人类抗-CD70抗体阻断已知小鼠抗-人类CD70抗体的结合。
图36A与B示出了用抗-CD70抗体或该抗体的非岩藻糖化形式处理的结果。(A)抗-CD70抗体以剂量依赖的方式抑制CD70共刺激的细胞的增殖。(B)抗-CD70抗体以剂量依赖的方式抑制CD70共刺激的IFN-γ分泌。
图37A至C示出了用抗-CD70抗体或该抗体的非岩藻糖化形式在肽刺激的细胞上处理的结果。(A)抗-CD70抗体抑制肽特异性的CD8阳性T细胞的增殖(expansion)。(B)没有观察到总细胞生存力的明显下降。(C)没有观察到总CD8阳性细胞数的明显下降。
图38示出了抗-CD70抗体对肽特异性的CD8阳性T细胞增殖的作用被外加的抗-CD16抗体阻断。
图39A至B示出了在体内小鼠肿瘤模型研究的结果，证明用细胞毒素偶联的抗-CD70抗体2H5的治疗对肾癌肿瘤具有直接的体内抑制作用。(A)786-O肿瘤(B)Caki-1肿瘤。
图40示出了免疫偶联物抗-CD70-N1与抗-CD70-N2在786-O肾细胞癌异种移植NOD-SCID小鼠模型中体内抵抗肿瘤形成的功效。
图41示出了单一剂量的免疫偶联物抗-CD70-N2在786-O肾细胞癌异种移植SCID小鼠模型中体内抵抗肿瘤形成的功效。
图42示出了不同剂量的免疫偶联物抗-CD70-N2在786-O肾细胞癌异种移植SCID小鼠模型中体内抵抗肿瘤形成的功效。
图43示出了不同剂量的免疫偶联物抗-CD70-N2在Caki-1肾细胞癌异种移植SCID小鼠模型中体内抵抗肿瘤形成的功效。
图44示出了免疫偶联物抗-CD70-N2在Raji细胞淋巴瘤SCID小鼠模型中体内抵抗肿瘤形成的功效。
图45示出了在BALB/c小鼠中免疫偶联物抗-CD70-N2在体内的安全性。
图46A至D示出与在犬中游离的药相比，免疫偶联物抗-CD70-N2在体内的安全性。
图47示出了ADCC测定的结果。hIgG1nf Neg Ctrl＝人类IgG1NF阴性对照抗体。hIgG1Neg Ctrl＝人类IgG1阴性对照抗体。mIgG1NegCtrl＝小鼠IgG1阴性对照抗体。(A)2H5结合至已激活的B细胞上的FACS分析。(B)在已激活的人类B细胞上的2H5NF和2H5的ADCC测定。(C)加入抗CD16抗体的ADCC测定。
图48描述了抗-CD70抗体通过ADCC利用在受刺激的人类PBMC培养物中天然存在的效应细胞介导经Ag激活、CD70阳性人类T细胞裂解的能力。
图49描述了抗-CD70抗体对天然表达CD70阳性的人类癌细胞系786-0细胞的结合特性。
图50描述了岩藻糖化的以及非岩藻糖化的抗-CD70抗体在CD70阳性淋巴瘤细胞系ARH77上介导ADCC的能力。
图51显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素E在786-O肾细胞癌异种移植SCID小鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图52显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素E在A498肾细胞癌异种移植SCID小鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图53显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素E在Caki-1肾细胞癌异种移植SCID小鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图54显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素E在Raji细胞淋巴瘤SCID小鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图55显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素E在Dauli细胞淋巴瘤SCID小鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图56显示抗CD70-细胞毒素E在Caki-1肾细胞癌异种移植大鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图57显示抗CD70-细胞毒素E在BALB/c小鼠中的体内安全性。
图58显示抗CD70-细胞毒素E在犬中的体内安全性。
图59显示抗CD70-细胞毒素E在猴子中的体内安全性。
图60显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素F在786-O肾细胞癌异种移植SCID小鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图61显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素F在Caki-1肾细胞癌异种移植SCID小鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图62显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素F在Raji细胞淋巴瘤SCID小鼠模型中的抗肿瘤形成的体内功效。
图63显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素G在786-O肾细胞癌异种移植SCID小鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图64显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素G在Caki-1肾细胞癌异种移植SCID小鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图65显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素H在A498肾细胞癌异种移植SCID小鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图66显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素H在Caki-1肾细胞癌异种移植SCID小鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图67显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素I在786-O肾细胞癌异种移植SCID小鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图68显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素I在Caki-1肾细胞癌异种移植大鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图69显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素J在786-O肾细胞癌异种移植SCID小鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图70显示抗-CD70抗体2H5功能性地阻断CD70刺激的人类T细胞增殖。
图71是细胞毒素B的结构。
图72是细胞毒素C的结构。
图73是细胞毒素D的结构。
图74是细胞毒素E的结构。
图75是细胞毒素F的结构。
图76是细胞毒素G的结构。
图77是细胞毒素H的结构。
图78是细胞毒素I的结构。
图79是细胞毒素J的结构。
详细说明
本发明涉及分离的单克隆抗体，特别是人类单克隆抗体，这些抗体结合人类CD70并且具有所希望的功能特性。在某些实施方案中，本发明的抗体衍生自特定的重链及轻链种系序列和/或包含特定的结构特征，例如包括特定氨基酸序列的CDR区。本发明提供了分离的抗体，制备此类抗体、抗体-配偶体分子偶联物以及包括此类抗体的双特异性分子的方法，以及包含本发明的抗体、抗体-配偶体分子偶联物或双特异性分子的药物组合物。本发明还涉及使用该抗体来例如检测CD70蛋白质的方法，以及使用本发明的抗CD70抗体来抑制表达CD70的细胞(例如肿瘤细胞)的生长的方法。因此，本发明还提供使用本发明的抗CD70抗体以及抗体-配偶体分子偶联物治疗多种类型的癌症的方法，例如，治疗肾细胞癌或者淋巴瘤。
为了更容易地理解本发明，首先定义了某些术语。其他定义在整个详细说明中给出。
如此处使用的术语“CD70”包括变异体、同种型、同系物、直向同源物以及种内同源物。例如对人类CD70蛋白具有特异性的抗体在某些情况下可以与来自除人类之外的物种的CD70蛋白进行交叉反应。在另一个实施方案中，对人类CD70蛋白具有特异性的抗体对于人类CD70蛋白可能是完全特异的，并且可能不表现出物种或其他类型的交叉反应性，或者可能与来自某些其他物种但不是所有其他物种的CD70进行交叉反应(如与灵长类CD70进行交叉反应但不与小鼠CD70进行交叉反应)。术语“人类CD70”指人类序列CD70，如具有Genbank登录号P32970的人类CD70的完整氨基酸序列(SEQ ID NO：76)。术语“小鼠CD70”指小鼠序列CD70，如具有Genbank登录号NP_035747的小鼠CD70的完整氨基酸序列。通过具有例如保守突变或在非保守区的突变，人类CD70序列可能不同于Genbank登录号P32970的人类CD70，而该CD70具有基本上与Genbank登录号P32970的人类CD70相同的生物功能。例如，人CD70的一个生物功能是结合细胞因子受体CD27。
特定的人类CD70序列与Genbank登录号P32970的人类CD70在氨基酸序列上通常会有至少90％的同一性，并且含有这样的氨基酸残基，当与其他物种(如鼠类)的CD70氨基酸序列相比时，这些氨基酸残基将该氨基酸序列鉴定为是人源的。在某些情况下，人类CD70与Genbank登录号为P32970的CD70在氨基酸序列上可具有至少95％，或者甚至至少96％、97％、98％或99％的同一性。在某些实施方案中，与Genbank登录号P32970的CD70序列相比，人类CD70序列可展示出不超过10个氨基酸的差异。在某些实施方案中，与Genbank登录号P32970的CD70序列相比，该人类CD70可展示出不超过5个，或者甚至不超过4、3、2或1个氨基酸的差异。百分比同一性可以如此处所说明进行确定。
术语“免疫应答”指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞以及由以上细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子以及补体)的作用，该作用导致对侵入性病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞或者在自身免疫炎症或病理炎症情况下的正常人类细胞或组织的选择性损害、破坏或将它们从人体中清除。
“信号转导途径”指在多种信号转导分子之间的生物化学关系，这些信号转导分子在信号从细胞的一部分传递至细胞的另一部分的转递中发挥作用。此处使用的短语“细胞表面受体”包括，例如，能够接受信号并将这种信号传递穿过细胞的细胞膜的分子及分子的复合物。本发明的“细胞表面受体”的一个实例是CD70受体。
此处提及的术语“抗体”包括完整抗体以及它们的任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或它们的单链。“抗体”指包括至少两条重(H)链及两条轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分，其中两条重链以及两条轻链之间通过二硫键相互连接。每一条重链均包括重链可变区(在此缩写为VH)以及重链恒定区。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2以及CH3构成。每一条轻链均包括轻链可变区(在此缩写为VL或Vk)以及轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域，CL。VH以及VL区可以进一步被分为高变区(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为框架区(FR)的区。每个VH以及VL均由三个CDR及四个FR构成，按照以下顺序从氨基端至羧基端排布：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链及轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，这些宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)以及经典补体系统的第一成分(Clq)。
在此所使用的术语“抗体的片段”以及抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)指一个或多个保留了特异性结合抗原的能力的抗体的片段(如CD70)。已经发现抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来实现。术语抗体的“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL及CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包括通过在铰链区的二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fab’片段，它实质上是带有铰链区部分的Fab(参见，FUNDAMENTALIMMUNOLOGY(Paul编著，第三版，1993)；(iv)由VH及CH1结构域组成的Fd片段；(v)由抗体单臂的VL及VH结构域组成的Fv片段；(vi)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，它由VH结构域组成；(vii)分离的互补决定区(CDR)；以及(viii)纳米抗体(nanobody)，含有单一可变结构域及两个恒定结构域的重链可变区。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL与VH是由单独的基因编码的，但是可以使用重组方法通过合成接头将它们连接起来，使它们形成单一蛋白链，其中VL与VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见，如Bird等人(1988)Science242：423-426；以及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883)。术语抗体的“抗原结合部分”也旨在涵盖此类单链抗体。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规方法获得，并且对这些片段采用与完整抗体相同的方式进行有用性筛选。
此处所使用的“分离的抗体”旨在指基本上没有具备不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合CD70的分离的抗体是基本上没有特异性结合除CD70以外的抗原的抗体)。然而，特异地结合CD70的分离的抗体对其他抗原(例如来自其他物种的CD70分子)可能具有交叉反应性。在某些实施方案中，分离的抗体特异性结合人类CD70而不与其它非人类CD70抗原交叉反应。此外，分离的抗体可能基本上不含其他细胞材料和/或化学品。
此处使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指具有单一分子组成的抗体分子的制品。单克隆抗体组合物展示了针对特定表位的单一结合特异性及亲和力。
此处使用的术语“人类抗体”旨在包括具有这样可变区的抗体，在这些可变区中，框架区及CDR区均衍生自人类种系免疫蛋白序列。此外，如果该抗体包括恒定区，则该恒定区也衍生自人类种系免疫球蛋白序列。人类抗体可以包括随后的修饰，包括天然或者合成的修饰。本发明的人类抗体可以包括不通过人类种系免疫球蛋白序列进行编码的氨基酸残基(例如，在体外由随机或定点特异性诱变或在体内由体细胞突变引入的突变)。然而，在此所使用的术语“人类抗体”并非旨在包括这样的抗体，其中来自另外的哺乳动物物种(如小鼠)种系的CDR序列已经被移植到人类框架序列上。
术语“人类单克隆抗体”指展示出单一结合特异性的抗体，这些抗体具有其中框架区以及CDR区均衍生自人类种系免疫球蛋白序列的可变区。在一个实施方案中，人类单克隆抗体是由杂交瘤细胞产生的，该杂交瘤细胞包括融合至无限增殖化细胞的从转基因非人类动物(例如转基因小鼠)处获得的B细胞，其具有包括人类重链转基因及轻链转基因的基因组。
此处使用的术语“重组人类抗体”包括由重组手段制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，例如(a)从动物(例如小鼠)或是由其制备出的杂交瘤(以下将进一步说明)中分离的抗体，该动物对于人类免疫球蛋白基因是转基因性的或转染色体性的；(b)从经转化以表达人类抗体的宿主细胞(例如，从转染瘤)中分离的抗体，(c)从重组的、组合的人类抗体文库中分离的抗体，以及(d)由其他方法制备、表达、产生或分离的抗体，这些方法涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列。此类重组人类抗体具有其中框架区及CDR区均衍生自人类种系免疫球蛋白序列的可变区。然而，在某些实施方案中，此类重组的人类抗体可进行体外诱变(或者，当使用针对人类Ig序列的转基因动物时，进行体内体诱变)，并且因此重组抗体VH和VL区的氨基酸序列是也许并不天然存在于体内人类抗体种系表达谱中的序列，尽管它们衍生自人类种系的VH和VL序列并与其相关。
此处使用的“同种型”指由重链恒定区基因编码的抗体种类(例如IgM或IgG1)。
短语“识别抗原的抗体”以及“对抗原特异的抗体”此处可以与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。
术语“人类抗体衍生物”指人类抗体的任何经修饰的形式，例如，该抗体与另一种试剂或抗体的偶联物。
术语“人源化抗体”旨在表示其中衍生自另一个哺乳动物物种(如小鼠)种系的CDR序列已被移植到人类框架序列上的抗体。可在人类框架序列中进行额外的框架区修饰。
术语“嵌合抗体”旨在表示其中可变区序列衍生于一个物种而恒定区序列衍生于另一个物种的抗体，如其中可变区序列衍生于小鼠抗体而恒定区序列衍生于人类抗体的抗体。
术语“抗体模拟物”旨在表示能够模拟抗体的结合抗原能力的分子，但是它们不局限于天然抗体结构。此类抗体模拟物的实例包括但不限于亲和体(Affibody)、经设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、抗运载蛋白(Anticalin)、高亲和性多聚体(Avimer)以及反向抗体(Versabody)，在模拟传统抗体结合时，所有这些抗体模拟物采用从不同机理产生并通过不同机理发挥作用的结合结构。
此处使用的术语“配偶体分子”指在抗体-配偶体分子偶联物中偶联至抗体的实体。配偶体分子的实例包括药物、毒素、标记分子(包括但不限于肽以及小分子标记物，如荧光染料标记物，以及单原子标记物，如放射性同位素)、蛋白质以及治疗剂。
此处使用的“特异性结合人类CD70”的抗体旨在指以5×10-8M或更小的KD结合人类CD70，更优选以1×10-8M或更小，更优选6×10-9M或更小，更优选3×10-9M或更小，甚至更优选2×10-9M或更小的KD结合人类CD70的抗体。
此处使用的术语“Kassoc”或“Ka”旨在指特定的抗体-抗原相互作用的结合速率，而此处使用的术语“Kdis”或“Kd，”旨在指特定的抗体-抗原相互作用的解离速率。此处使用的术语“KD”旨在指解离常数，它是由Kd与Ka之比(即Kd/Ka)得到，并表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可以使用本领域已经充分确定的方法进行确定。确定抗体的KD的优选方法是通过使用表面等离子共振，优选使用诸如
Figure A20078005123100381
系统的生物传感器系统。
此处使用的术语IgG抗体的“高亲和力”是指对于靶抗原抗体具有的KD为1×10-7M或更小，更优选为1×10-8M或更小，更优选为1×10-9M或更小，并且甚至更优选为1×10-10M或更小。然而，对于其他抗体同种型而言，“高亲和力”结合可以发生变化。例如，对于IgM同种型而言，“高亲和力”结合是指抗体具有的KD值为1×10-7M或更小，更优选为1×10-8M或更小，甚至更优选为1×10-9M或更小。
此处使用的术语“基本上不结合”蛋白质或细胞是指不结合或不以高亲和力结合蛋白质或细胞，即，以1×10-6M或更大，更优选为1×10-5M或更大，更优选为1×10-4M或更大，更优选为1×10-3M或更大，甚至更优选为1×10-2M或更大的KD结合蛋白质或细胞。
此处使用的术语“受试者”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物及非哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、犬、猫、马、牛、鸡、两栖动物、鱼、爬行动物等等。
符号“-”，不论是用作键或显示为垂直于键时均表示这样的点，在该点处所展示的部分连接到分子、固相支撑部分等的其余部分上。
除非另作说明，术语“烷基”就其本身或作为另一个取代基的部分而言指直链或支链或环烃基或它们的组合，它可能是完全饱和的、单不饱和的或多不饱和的，并且能包括二价以及多价基，具有所指定的碳原子数目(即C1-C10是指1至10个碳原子)。饱和烃基的实例包括但不限于以下基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基以及例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物或异构体，等等。不饱和烷基是具有一个或多个双键或三键的基团。不饱和烷基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基以及3-丙炔基、3-丁炔基，以及更高级同系物以及异构体。除非另有说明，术语“烷基”还意在包括那些以下详细说明的烷基衍生物，如“杂烷基”。限于烃基的烷基基团被称为“同型烷基”。
术语“亚烷基”就其本身或作为另一个取代基的部分而言是指衍生自烷烃的二价基团，例如但不局限于-CH2CH2CH2CH2-，并且进一步包括那些如下说明为“杂亚烷基”的基团。一般，烷基(或亚烷基)应具有1到24个碳原子，其中具有10个或更少的碳原子的那些基团在本发明中是优选的。“低级烷基”或“低级亚烷基”是较短的链烷基或亚烷基，一般具有八个或更少的碳原子。
除非另作说明，术语“杂烷基”就其本身或与另一个术语组合，是指稳定的直链或支链或环烃基或它们的组合，由所提及数目的碳原子以及至少一个杂原子组成，该杂原子选自：O、N、Si以及S，并且其中氮、碳以及硫原子可任选地受到氧化，并且氮杂原子可任选地受到季铵化。一个或多个杂原子O、N、S及Si可位于杂烷基的任何内部位置，或可位于烷基连接于该分子其余部分的位置上。实例包括但不限于：-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2，-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3以及-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多两个杂原子可以是连续的，例如-CH2-NH-OCH3以及-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，术语“杂亚烷基”就其本身或作为另一个取代基的部分而言是指衍生自杂烷基的二价基，例如但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-以及-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂亚烷基，杂原子也可占据链末端的任一端或两端(例如，亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基以及类似物)。术语“杂烷基”与“杂亚烷基”包括聚(乙二醇)及其衍生物(参见例如，Shearwater PolymersCatalog，2001)。此外，对于亚烷基以及杂亚烷基连接基团，书写连接基团的式的方向并不表示连接基团的方向。例如，式-C(O)2R’-代表-C(O)2R’-以及-R’C(O)2-。
与术语“烷基”或“杂烷基”组合使用的术语“低级”是指具有1到6个碳原子的部分。
术语“烷氧基”、“烷氨基”、“烷基磺酰基”以及“烷硫基”(或硫代烷氧基)都是以它们的常规意义使用，并分别指通过氧原子、氨基基团、SO2基团或硫原子连接于该分子其余部分的那些烷基基团。术语“芳基磺酰基”是指通过SO2基团连接于分子其余部分的芳基，且术语“巯基”是指SH基团。
一般而言，“酰基取代基”也选自以上所给出的组。在此使用的术语“酰基取代基”指连接于羰基碳并满足其化合价的基团，该羰基碳直接或间接地连接于本发明化合物的多环核上。
除非另作说明，术语“环烷基”与“杂环烷基”，就它们本身或与其他术语组合而言，分别表示环型的取代或未取代的“烷基”以及取代或未取代的“杂烷基”。另外，对于杂环烷基，杂原子可占据杂环连接于分子的其余部分的位置。环烷基的实例包括但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基以及类似物。杂环烷基的实例包括但不限于1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基以及类似物。环结构的杂原子以及碳原子可任选地受到氧化。
除非另作说明，术语“卤”或“卤素”，就它们自身或作为另一个取代基的部分而言是指氟、氯、溴或碘原子。此外，术语如“卤烷基”是指包括单卤烷基以及聚卤烷基。例如，术语“卤(C1-C4)烷基”旨在包括但不限于三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯代丁基、3-溴丙基以及类似物。
除非另作说明，术语“芳基”是指取代或未取代的多不饱和的芳香烃取代基，它可以是单环或多环(优选地从1至3个环)的，这些环稠合在一起或以共价键相连接。术语“杂芳基”指含有从一至四个选自N、O以及S杂原子的芳基基团(或环)，其中氮、碳以及硫原子可任选地被氧化，并且氮原子可任选地被季铵化。杂芳基可以通过杂原子连接于分子的其余部分。芳基以及杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基以及6-喹啉基。以上提到的每一个芳基以及杂芳基环体系的取代基选自以下说明的可接受的取代基。“芳基”以及“杂芳基”也包括环体系，其中一个或多个非芳香族环体系被稠合或者以其他方式结合至芳基或杂芳基体系上。
简言之，术语“芳基”当与其他术语组合使用时(如芳氧基、芳基硫氧基(arylthioxy)、芳烷基)包括以上定义的芳基环以及杂芳基环。因此，术语“芳基烷基”意在包括那些基团，其中芳基连接于烷基(例如苯甲基、苯乙基、吡啶甲基以及类似物)；该烷基包括其中碳原子(例如，亚甲基基团)已被例如氧原子替换的那些烷基基团(如苯氧甲基、2-吡啶氧甲基、3-(1-萘氧基)丙基以及类似物)。
以上术语(如“烷基”、“杂烷基”、“芳基”以及“杂芳基”)各自均包括指定基团的取代以及未取代这两种形式。以下提供每个类型基团的优选取代基。
烷基以及杂烷基(包括那些经常提到的如亚烷基、链烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基以及杂环烯基)的取代基一般分别称为“烷基取代基”以及“杂烷基取代基”，并且它们可以是下述多种基团的一个或多个，这些基团选自但不限于：-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R’”、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R’”、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R’”)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR’”、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN以及-NO2，数量在从0到(2m’+1)的范围内，其中m’是这种基团的碳原子的总数。R’、R”、R’”以及R””各自均优选独立地指氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基，例如1至3个卤素取代的芳基、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如，当这些基团中多于一个基团存在时，每个R基团独立地选择，如对每个R’、R”、R’”以及R””基团选择一样。当R’和R”连接于相同的氮原子时，它们可与氮原子组合成5、6或7元环。例如，-NR’R”旨在包括但不局限于，1-吡咯烷基以及4-吗啉基。从以上取代基的讨论中，本领域中的技术人员会明白术语“烷基”旨在包括结合到不是氢基的基团上的碳原子的基团，例如卤烷基(如-CF3以及-CH2CF3)以及酰基(如-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3以及类似物)。
类似于对烷基所说明的取代基，芳基取代基以及杂芳基取代基通常分别称为“芳基取代基”以及“杂芳基取代基”，并且是可改变的和选自，例如：卤素、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R’”、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R’”、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”)＝NR’”、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN以及-NO2、-R’、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基以及氟(C1-C4)烷基，并且其数目从0到芳香环体系上开放(open)化合价的总数的范围内；以及其中R’、R”、R’”以及R””优选独立地选自氢、(C1-C8)烷基以及杂烷基、未取代的芳基以及杂芳基、(未取代的芳基)-(C1-C4)烷基以及(未取代的芳基)氧-(C1-C4)烷基。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如，当这些基团中多于一个基团存在时，每个R基团独立地选择，如对每个R’、R”、R’”以及R””基团选择一样。
可任选地，在芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个芳基取代基可由具有式为-T-C(O)-(CRR’)q-U-的取代基替换，其中，T和U独立为-NR-、-O-、-CRR’-或单键；且q是从0到3的整数。可替代地，在芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可任选由具有式为-A-(CH2)r-B-的取代基代替，其中，A和B独立地为-CRR’-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR’-或单键；且r是从1到4的整数。如此形成的新环的单键之一可任选由双键代替。可替代地，在芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可任选地由具有式为-(CRR’)s-X-(CR”R’”)d-的取代基代替，其中s和d独立地是从0至3的整数，并且X是-O-、-NR’-、-S-、-S(O)、-S(O)2-或-S(O)2NR’-。优选地，取代基R、R’、R”以及R’”独立地选自氢或取代或未取代的(C1-C6)烷基。
此处使用的术语“二磷酸酯”包括但不局限于包含两个磷酸酯基团的磷酸的酯。术语“三磷酸酯”包括但不局限于包含三个磷酸酯基团的磷酸的酯。例如，具有二磷酸酯或三磷酸酯的特定的药物包括：
此处使用的术语“杂原子”包括氧(O)、氮(N)、硫(S)以及硅(Si)。
符号“R”是一个通用缩写，它代表取代基，该取代基选自：取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基以及取代或未取代的杂环基基团。
在以下各分部中进一步详细地说明了本发明的不同方面。
具有特定功能特性的抗-CD70抗体
本发明抗体的特征为抗体的特定功能特征或特性。例如，该抗体特异地结合人类CD70，例如表达在细胞表面的人类CD70。优选地，本发明的抗体以高亲和力结合CD70，例如以1×10-7M或更小的KD，更优选以5×10-8M或更小的KD，甚至更优选以1×10-8M或更小的KD结合CD70。评估抗体对CD70的结合亲和力的标准测定是本领域中已知的，包括例如ELISA、蛋白印迹法以及RIA。在实施例中详细地说明了适宜的测定。也可以用本领域中已知的标准测定评估抗体的结合动力学(如结合亲和力)，例如通过ELISA、Scatchard以及Biacore分析。作为另一个实例，本发明的抗体可以结合肾癌肿瘤细胞系，例如786-O、A-498、ACHN、Caki-1或Caki-2细胞系。作为又另一个实例，本发明的抗体可以结合B细胞肿瘤细胞系，例如Daudi、HuT 78、Raji或Granta-519细胞系。
本发明的抗-CD70抗体结合人类CD70，并且优选地表现以下特性中的一种或多种：
(a)以1×10-7M或更小的KD结合人类CD70；并且
(b)结合肾细胞癌肿瘤细胞系；
(c)结合淋巴瘤细胞系，如B细胞肿瘤细胞系；
(d)被表达CD70的细胞内化；
__(e)对表达CD70的细胞显示出抗体依赖性细胞毒性(ADCC)；以及
(f)当与细胞毒素相偶联时在体内抑制表达CD70的细胞的生长。
优选地，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的至少两种。更优选地，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的至少三种。更优选地，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的四种。甚至更优选地，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的五种。甚至更优选地，该抗体表现出全部六种特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)。
在另一个优选的实施方案中，该抗体与CD70结合的亲和力为5×10-9M或更小。在又另一个优选实施方案中，当该抗体与细胞毒素相偶联时在体内抗体抑制表达CD70的肿瘤细胞的生长。
本发明的抗体与CD70的结合可用一种或多种本领域已建立的技术进行评估。例如，在优选的实施方案中，抗体可用流式细胞术进行测试，其中该抗体与表达人类CD70的细胞系进行反应，例如已经得到转染而能在其表面表达CD70的CHO细胞，或表达CD70的细胞系，如786-O、A498、ACHN、Caki-1、和/或Caki-2(参见如实施例4和5中的适宜测定，以及对细胞系的进一步说明)。另外地或可选择地，抗体的结合，包括结合动力学(如KD值)可用BIAcore结合测定进行测试。其他适宜的结合测定包括ELISA测定，例如利用重组的CD70蛋白(参见如实施例1中的适宜测定)。
优选地，本发明的抗体与CD70蛋白结合的KD为5×10-8M或更小、与CD70蛋白结合的KD为3×10-8M或更小、与CD70蛋白结合的KD为1×10-8M或更小、与CD70蛋白结合的KD为7×10-9M或更小、与CD70蛋白结合的KD为6×10-9M或更小或者与CD70蛋白结合的KD为5×10-9M或更小。该抗体对CD70的结合亲和力可以通过例如标准BIACORE分析来评估。
在本领域已知通过表达CD70的细胞用于评估抗-CD70抗体的内化作用的标准测定(参见如在实施例7与21中说明的Hum-ZAP以及免疫荧光测定)。在本领域中也已知用于评估CD70与CD27的结合以及通过抗-CD70抗体对其抑制的标准测定(参见如在实施例17中说明的测定)。用于评估针对表达CD70的细胞的ADCC的标准测定在本领域中也是已知的(参见如在实施例9中说明的ADCC测定)。通过抗-CD70抗体以及其细胞毒素偶联物用于评估在体内抑制肿瘤细胞生长的标准测定在本领域中也是已知的(参见如在实施例18、19、24至31以及36至41中说明的肿瘤异种移植小鼠模型)。
本发明优选的抗体是人类单克隆抗体。另外地或可替代地，该抗体可以是，例如嵌合的或人源化的单克隆抗体。
单克隆抗体2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4
本发明的示例性抗体包括人类单克隆抗体2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4，它们如在实施例1与2所说明的那样进行分离并且进行结构性表征。2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的VH氨基酸序列分别在SEQ ID NO：1、2、3、4、5、73以及6中显示。2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的VL氨基酸序列分别在SEQID NO：7、8、9、10、11、11以及12中显示(69A7与69A7Y均具有氨基酸序列SEQ ID NO：11的VL)。考虑到这些抗体中每一种均能结合CD70，可将VH和VL序列进行“混合并匹配”，以产生本发明的其他抗-CD70结合分子。可以使用以上以及在实施例中说明的结合测定(如FACS或ELISA)来测试此类“混合并匹配”的抗体与CD70的结合。优选地，当VH和VL链得到混合并匹配时，来自特定VH/VL对的VH序列由结构相似的VH序列代替。同样地，优选来自特定VH/VL对的VL序列由结构相似的VL序列代替。
因此，一方面，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包括：
(a)重链可变区，包括选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6以及73的氨基酸序列；以及
(b)轻链可变区，包括选自：SEQ ID NO：7、8、9、10、11以及12的氨基酸序列；
其中该抗体特异性地结合CD70。
优选的重链及轻链组合包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：1；以及(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：7；或
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：2；以及(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：8；或
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：3；以及(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：9；或
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：4；以及(b)轻链可变区，包括SEQ ID NO：10的氨基酸序列；或
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：5或73；以及(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：11；或
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：6；以及(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：12。
另一方面，本发明提供了包括2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的重链和轻链CDR1、CDR2以及CDR3或它们的组合的抗体。2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的VH CDR1氨基酸序列分别在SEQ ID NO：13、14、15、16、17、17以及18中显示(69A7与69A7Y均具有SEQ ID NO：17的VH CDR1序列)。2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的VH CDR2的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：19、20、21、22、23、23以及24中显示(69A7与69A7Y均具有在SEQ ID NO：23中显示的VH CDR2序列)。2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的VH CDR3的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：25、26、27、28、29、75以及30中显示。
2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的VK CDR1的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：31、32、33、34、35、35以及36中显示(69A7与69A7Y均具有在SEQ ID NO：35中显示的VK CDR1序列)。2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的VK CDR2的氨基酸序列分别在SEQID NO：37、38、39、40、41、41以及42中显示(69A7与69A7Y均具有在SEQ ID NO：41中显示的VK CDR2序列)。2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的VKCDR3的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：43、44、45、46、47、47以及48中显示(69A7与69A7Y均有在SEQ ID NO：47中显示的VK CDR3序列)。这些CDR区是用Kabat系统绘出的(Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)。
鉴于这些抗体中每一种均能够结合CD70，并且主要由CDR1、CDR2及CDR3区提供抗原结合特异性，VH CDR1、CDR2、及CDR3序列以及Vk CDR1、CDR2、及CDR3序列可以得到“混合并匹配”(即，来自不同抗体的CDR可以得到混合并匹配，但是每种抗体均必须包含VH CDR1、CDR2、及CDR3，以及Vk CDR1、CDR2，及CDR3)，以产生本发明的其他抗-CD70结合分子。使用以上及在实施例中说明的结合测定(如FACS、ELISA、Biacore分析)可以测试此类“混和并匹配”的抗体的CD70结合。优选地，当VH CDR序列得到混合并匹配时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2、和/或CDR3序列由结构相似的CDR序列代替。同样地，当VkCDR得到混合并且匹配时，来自特定Vk序列的CDR1、CDR2、和/或CDR3序列由结构相似的CDR序列代替。对于本领域普通技术人员非常清楚的是，通过将来自在此披露的单克隆抗体2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的CDR序列的结构类似序列代替一个或多个VH和/或VL CDR区序列，可以产生新的VH和VL序列。
因此，另一方面，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包括：
(a)重链可变区CDR1，包括选自：SEQ ID NO：13、14、15、16、17以及18的氨基酸序列；
(b)重链可变区CDR2，包括选自：SEQ ID NO：19、20、21、22、23以及24的氨基酸序列；
(c)重链可变区CDR3，包括选自：SEQ ID NO：25、26、27、28、29、30以及75的氨基酸序列；
(d)轻链可变区CDR1，包括选自：SEQ ID NO：31、32、33、34、35以及36的氨基酸序列；
(e)轻链可变区CDR2，包括选自：SEQ ID NO：37、38、39、40、41以及42的氨基酸序列；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括选自：SEQ ID NO：43、44、45、46、47以及48的氨基酸序列，
其中该抗体特异地结合CD70，优选结合人类CD70。
在优选的实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：13；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：19；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：25；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：31；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：37；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：43。
在另一个优选的实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：14；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：20；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：26；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：32；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：38；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：44。
在另一个优选的实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：15；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：21；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：27；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：33；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：39；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：45。
在另一个优选的实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：16；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：22；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：28；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：34；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：40；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：46。
在另一个优选的实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：17；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：23；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：29或75；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：35；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：41；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：47。
在另一个优选的实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：18；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：24；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：30；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：36；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：42；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：48。
本领域熟知CDR3结构域不依赖于CDR1和/或CDR2结构域，可以独自确定抗体对同族抗原的结合特异性，并且可预测地产生多种抗体，这些抗体具有基于共同的CDR3序列的相同结合特异性。参见例如，Klimka等人，British J.of Cancer 83(2)：252-260(2000)(说明了仅使用鼠类抗CD30抗体Ki-4的重链可变结构域CDR3来产生人源化抗CD30抗体)；Beiboer等人，J.Mol.Biol.296：833-849(2000)(说明了仅使用亲代鼠类MOC-31抗EGP-2抗体的重链CDR3序列的重组上皮糖蛋白-2(EGP-2)抗体)；Rader等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：8910-8915(1998)(说明了使用鼠类抗整联蛋白αvβ3抗体LM609的重链和轻链可变CDR3结构域的一系列人源化抗整联蛋白αvβ3抗体，其中每个成员抗体在CDR3结构域之外均包含不同的序列，并均能与亲代鼠类抗体一样结合相同的表位，并且其结合亲和力与亲代鼠类抗体一样高或比亲代鼠类抗体更高)；Barbas等人，J.Am.Chem.Soc.116：2161-2162(1994)(披露CDR3结构域对抗原结合的作用最大)；Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：2529-2533(1995)(说明了将三个针对人类胎盘DNA的Fab(SI-1、SI-40以及SI-32)的重链CDR3序列移植到抗破伤风类毒素Fab的重链上，藉此替换存在的重链CDR3，并表明CDR3结构域独自赋予了结合特异性)；以及Ditzel等人，J.Immunol.157：739-749(1996)(说明了移植研究，其中仅将亲代多特异性Fab LNA3的重链CDR3移植到结合破伤风类毒素Fab p313抗体的单特异性IgG重链上，就足以保留亲代Fab的结合特异性)；Berezov等人，BIAjournal 8：Scientific Review 8(2001)(说明了基于抗HER2单克隆抗体的CDR3的肽模拟物)；Igarashi等人，J.Biochem(Tokyo)117：452-7(1995)(说明了对应于抗磷脂酰丝氨酸抗体的CDR3结构域的12个氨基酸的合成多肽)；Bourgeois等人，J.Virol 72：807-10(1998)(显示了衍生自抗呼吸道合胞病毒(RSV)抗体的重链CDR3结构域的单肽能够在体外中和该病毒)；Levi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：4374-8(1993)(说明了基于鼠类抗HIV抗体的重链CDR3结构域的肽)；Polymenis和Stoller，J.Immunol.152：5218-5329(1994)(说明了通过移植Z-DNA结合抗体的重链CDR3区使得scFv能够结合)；以及Xu和Davis，Immunity 13：37-45(2000)(说明了重链CDR3的多样性足以使得其他部分相同的IgM分子区分多种半抗原以及蛋白质抗原)。还参见于美国专利号6,951,646；6,914,128；6,090,382；6,818,216；6,156,313；6,827,925；5,833,943；5,762,905；以及5,760,185，说明了由单一CDR结构域定义的已获得专利的抗体。这些参考文献中每一篇的全文均由此合并作为参考。
因此，本发明提供包括来自衍生自人类或非人类动物抗体的一个或多个重和/或轻链CDR3结构域的单克隆抗体，其中该单克隆抗体能够特异性结合CD70。在某些方面，本发明提供包括来自非人类抗体(例如小鼠或大鼠抗体)的一个或多个重和/或轻链CDR3结构域的单克隆抗体，其中该单克隆抗体能够特异性结合CD70。在一些实施方案中，此类创造性的抗体包括来自非人类抗体的一个或多个重和/或轻链CDR3结构域，与相应的亲代的非人类抗体比较，(a)能与其竞争而进行结合；(b)保留功能特性；(c)结合到相同的表位；和/或(d)具有相似的结合亲和力。
在其他方面，本发明提供的单克隆抗体包括来自人类抗体(例如，获自非人类动物的人类抗体)的一个或多个重和/或轻链CDR3结构域，其中该人类抗体能够特异性结合CD70。在其他方面，本发明提供的单克隆抗体包括来自第一人类抗体(例如获自非人类动物的人类抗体)的一个或多个重和/或轻链CDR3结构域，其中该第一人类抗体能够特异性结合CD70，并且其中来自该第一人类抗体的CDR3结构域替换缺乏CD70结合特异性的人类抗体的CDR3结构域，以产生能特异地结合CD70的第二人类抗体。在一些实施方案中，此类本发明的抗体包括来自第一人类抗体的一个或多个重和/或轻链CDR3结构域，与相应的亲代第一人类抗体相比较，(a)能与其竞争而进行结合；(b)保留功能特性；(c)结合到相同的表位；和/或(d)具有相似的结合亲和力。
具有特定种系序列的抗体
在某些实施方案中，本发明的抗体包括来自特定的种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定的种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。
例如，在优选的实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或它的抗原结合部分，包括作为人类VH 3-30.3基因的产物或衍生自该基因的重链可变区，其中该抗体特异地结合CD70。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或它的抗原结合部分，包括作为人类VH 3-33基因的产物或衍生自该基因的重链可变区，其中该抗体特异地结合CD70。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或它的抗原结合部分，包括作为人类VH 4-61基因的产物或衍生自该基因的重链可变区，其中该抗体特异地结合CD70。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或它的抗原结合部分，包括作为人类VH 3-23基因的产物或衍生自该基因的重链可变区，其中该抗体特异地结合CD70。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或它的抗原结合部分，包括作为人类VK L6基因的产物或衍生自该基因的轻链可变区，其中该抗体特异性结合CD70。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或它的抗原结合部分，包括作为人类VK L18基因的产物或衍生自该基因的轻链可变区，其中该抗体特异性结合CD70。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或它的抗原结合部分，包括作为人类VK L15基因的产物或衍生自该基因的轻链可变区，其中该抗体特异性结合CD70。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或它的抗原结合部分，包括作为人类VK A27基因的产物或衍生自该基因的轻链可变区，其中该抗体特异性结合CD70。
在其它另一个优选的实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或它的抗原结合部分，其中该抗体：
(a)包括重链可变区，该重链可变区是人类VH 3-30.3、3-33、4-61或3-23基因的产物或衍生自该基因(这些基因所编码的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：61、62、63以及64中给出)；
(b)包括轻链可变区，该轻链可变区是人类基因VK L6、L18、L15或A27基因的产物或衍生自该基因(这些基因所编码的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：65、66、67以及68中给出)；并且
(c)特异地结合CD70。
此类抗体也可能拥有以上详细说明的一个或多个功能特性，例如结合人类CD70的高亲和力、由表达CD70的细胞内化、介导针对表达CD70的细胞的ADCC的能力、和/或当与细胞毒素相偶联时在体内抑制表达CD70的肿瘤细胞的肿瘤生长的能力。
分别具有VH 3-30.3以及Vk L6的VH以及Vk的抗体的实例是2H5。分别具有VH3-30.3以及VK L18的VH以及VK的抗体的实例是10B4。分别具有VH 3-33以及VK L15的VH以及VK的抗体的实例是8B5和18E7。分别具有VH 4-61以及VK L6的VH以及VK的抗体的实例是69A7和69A7Y。分别具有VH 3-23以及VKA27的VH以及VK的抗体的实例是1F4。
此类抗体也可能拥有以上详细说明的一个或多个功能特性，例如结合人类CD70的高亲和力、由表达CD70的细胞内化、结合肾细胞癌肿瘤细胞系、结合淋巴瘤细胞系、介导针对表达CD70的细胞的ADCC的能力、和/或当与细胞毒素相偶联时在体内抑制表达CD70的肿瘤细胞的肿瘤生长的能力。
如在此所用，如果人类抗体的可变区从使用人类种系免疫球蛋白基因的系统中获得，则该人类抗体包含重链或轻链可变区，它是特定种系序列的“产物”或者“衍生于”该特定种系序列。此类系统包括用目的抗原对携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠进行免疫，或者用目的抗原对展示在噬菌体上的人类免疫球蛋白基因文库进行筛选。是人类种系免疫球蛋白序列的“产物”或“衍生于”该序列的人类抗体可以通过对该人类抗体的氨基酸序列与人类种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较，并选择在序列上最接近(即最大％同一性)人类抗体的序列的人类种系免疫球蛋白序列这样进行鉴定。是特定人类种系免疫球蛋白序列的“产物”或“衍生于”该序列的人类抗体，与该种系序列相比可含有不同的氨基酸，这是由于例如天然发生的体细胞突变或故意引入的定点突变。然而，经选择的人类抗体一般与由人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上具有至少90％的同一性，并且当与其他物种(例如，鼠类种系序列)的种系免疫球蛋白氨基酸序列进行比较时，包含将该人类抗体鉴定为人类抗体的氨基酸残基。在某些情况中，人类抗体与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上可具有至少95％或甚至至少96％、97％、98％，或99％的同一性。一般，与由人类种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列相比，衍生于该特定人类种系序列的人类抗体将展示不超过10个的氨基酸差异。在某些情况中，与由种系免疫球蛋白基因进行编码的氨基酸序列相比，该人类抗体可以展示出不超过5个，或甚至不超过4个、3个、2个或1个的氨基酸差异。
同源抗体
在另一个实施方案中，本发明的抗体包括重链及轻链可变区，这些可变区包含与在此说明的优选抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中该抗体保留了本发明抗CD70抗体的所希望的功能特性。
例如，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包括重链可变区及轻链可变区，其中：
(a)该重链可变区包括与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6以及73的氨基酸序列具有至少80％的同源性的氨基酸序列；
(b)该轻链可变区包括与选自SEQ ID NO：7、8、9、10、11、及12的氨基酸序列具有至少80％的同源性的氨基酸序列；
(c)该抗体特异性与CD70相结合。
另外地或者可替代地，该抗体可具有以上讨论的以下功能特性中的一个或多个，例如结合人类CD70的高亲和力、由表达CD70的细胞内化、结合肾细胞癌肿瘤细胞系、结合淋巴瘤细胞系、介导针对表达CD70的细胞的ADCC的能力、和/或当与细胞毒素相偶联时在体内抑制表达CD70的肿瘤细胞的肿瘤生长的能力。
在不同的实施方案中，该抗体可以是例如人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在其他实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以与以上给出的序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。具有与以上给出的序列的VH以及VK区有高度同源性(即，80％或更高)的VH与VL区的抗体可以通过以下方式来获得：对编码SEQ ID NO：1-12和73的核酸分子进行诱变(例如，定点诱变或PCR介导的诱变)，然后用此处说明的功能测定法检测所编码、被改变的抗体的保留的功能(即以上所给出的功能)。
如在此所使用，两个氨基酸序列之间的百分比同源性等同于两个序列之间的百分比同一性。在这两个序列之间的百分比同一性是在考虑空位数目、以及每个空位长度的情况下，这些序列共有的相同位置的数目的函数(即，％同源性＝相同位置的数目/位置的总数目×100)，需要引入这些空位以用于两条序列的最佳比对。正如在以下的非限制性实施例中说明的，使用数学算法可以完成两条序列之间的序列比较以及百分比同一性的确定。
可以使用已经整合在ALIGN程序中(2.0版本)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12以及空位罚分为4，确定两个氨基酸序列的百分比同一性。此外，两个氨基酸序列的百分比同一性可以使用已经整合到GCG软件包中的GAP程序(可在www.gcg.com上获得)里的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))的算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及空位权重16、14、12、10、8、6或4以及长度权重1、2、3、4、5或6来确定。
另外地或者可替代地，本发明的蛋白质序列可以进一步作为“查询序列”而使用，对公共数据库进行检索，例如鉴定相关序列。使用Altschul，等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的XBLAST程序(版本2.0)可以进行此类检索。用XBLAST程序，记分＝50，字长＝3进行BLAST蛋白质检索，以获得与本发明抗体分子同源的氨基酸序列。为获得用于比较目的的空位比对，如在Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中说明的可使用Gapped BLAST。当使用BLAST及Gapped BLAST程序时，对应的程序(如XBLAST及NBLAST)的默认参数是有用的。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。
具有保守性修饰的抗体
在某些实施方案中，本发明的抗体包括含有CDR1、CDR2以及CDR3序列的重链可变区以及含有CDR1、CDR2以及CDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中的一个或多个序列包括基于已知抗CD70抗体或它们保守性修饰的特定氨基酸序列，并且其中这些抗体保留了本发明抗CD70抗体的所希望的功能特性。本领域所理解的是可以进行某些保守性序列修饰，这些保守性序列修饰并不去除抗原结合。参见，例如，Brummell等人(1993)Biochem 32：1180-8(说明了在对沙门氏菌特异的抗体CDR3重链结构域的突变分析)；de Wildt等人(1997)Prot.Eng.10：835-41(说明了抗UA1抗体的突变研究)；Komissarov等人(1997)J.Biol.Chem.272：26864-26870(显示了在HCDR3中间的突变导致亲和力的消除或减低)；Hall等人(1992)J.Immunol.149：1605-12(说明在CDR3区中的单一氨基酸改变消除了结合活性)；Kelley和O’Connell(1993)Biochem.32：6862-35(说明了酪氨酸残基在抗原结合中的作用)；Adib-Conquy等人(1998)Int.Immunol.10：341-6(说明了疏水性在结合中的作用)以及Beers等人(2000)Clin.Can.Res.6：2835-43(说明了HCDR3氨基酸突变体)。因此，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包括含有CDR1、CDR2以及CDR3序列的重链可变区以及含有CDR1、CDR2以及CDR3序列的轻链可变区，其中：
(a)重链可变区CDR3序列包括选自氨基酸序列SEQ ID NO：25、26、27、28、29、30以及75，以及它们的保守性修饰的氨基酸序列；
(b)轻链可变区CDR3序列包括选自氨基酸序列SEQ ID NO：43、44、45、46、47以及48，以及它们的保守性修饰的氨基酸序列；
(c)抗体与CD70特异性结合。
另外地或者可替代地，该抗体可拥有以上说明的以下功能特性中的一个或多个，例如结合人类CD70的高亲和力、被表达CD70的细胞内化、结合肾细胞癌肿瘤细胞系、结合淋巴瘤细胞系、介导针对表达CD70的细胞的ADCC的能力、和/或当与细胞毒素相偶联时在体内抑制表达CD70的肿瘤细胞的肿瘤生长的能力。
在优选的实施方案中，重链可变区CDR2序列包括选自氨基酸序列SEQ ID NO：19、20、21、22、23以及24，以及它们的保守性修饰的氨基酸序列；并且轻链可变区CDR2序列包括选自氨基酸序列SEQ ID NO：37、38、39、40、41、以及42，以及它们的保守性修饰的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，重链可变区CDR1序列包括选自氨基酸序列SEQ ID NO：13、14、15、16、17以及18，以及它们的保守性修饰的氨基酸序列；并且轻链可变区CDR1序列包括选自氨基酸序列SEQ ID NO：31、32、33、34、35以及36，以及它们的保守性修饰的氨基酸序列。
在不同的实施方案中，该抗体可以是例如人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
如在此所使用，术语“保守性序列修饰”旨在表示不显著影响或改变包含该氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。此类保守性修饰包括氨基酸的置换、插入以及缺失。通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变以及PCR介导的诱变，可将这些修饰引入本发明的抗体中。保守性氨基酸置换是以下这些置换，其中氨基酸残基由具有相似侧链的氨基酸残基替换。本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，以及具有芳香侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明抗体的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以由来自相同侧链家族的其他氨基酸残基所替换，并且使用在此说明的功能测定可以针对保留的功能(即，在以上给出的功能)测试被改变的抗体。
与本发明的抗-CD70抗体结合相同表位的抗体
在另一个实施方案中，本发明提供了抗体，其结合本发明任何CD70单克隆抗体所识别的人类CD70上的表位(即，有能力与本发明单克隆抗体中的任何抗体进行交叉竞争而结合CD70的抗体)。在优选的实施方案中，用于交叉竞争研究的参照抗体可以是单克隆抗体2H5(具有分别示于SEQ ID NO：1和7的VH和VL序列)或单克隆抗体10B4(具有分别示于SEQ ID NO：2和8的VH和VL序列)或单克隆抗体8B5(具有分别示于SEQ ID NO：3和9的VH和VL序列)或单克隆抗体18E7(具有分别示于SEQ ID NO：4和10的VH和VL序列)或单克隆抗体69A7(具有分别示于SEQ ID NO：5和11的VH和VL序列)或单克隆抗体69A7Y(具有分别示于SEQ ID NO：73和11的VH和VL序列)或单克隆抗体1F4(具有分别示于SEQ ID NO：6和12的VH和VL序列)。
此类交叉竞争抗体可以在标准的CD70结合测定中基于它们与2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y或1F4进行交叉竞争的能力而被鉴别。可使用标准ELISA测定，其中将重组的人类CD70蛋白固定在板上，这些抗体中的一种用荧光进行标记，并且评价了未标记抗体进行竞争脱去标记的抗体的结合的能力。另外地或可替代地，BIAcore分析也可以用于评价抗体的交叉竞争的能力。例如，使用BIAcore的表位结合实验证明了2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y或1F4抗体结合CD70上不同的表位。测试抗体抑制例如2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y或1F4结合人类CD70的能力证明该测试抗体能与2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y或1F4竞争与人类CD70的结合，并且因此结合至由2H5(具有分别示于SEQ ID NO：1和7的VH和VL序列)或10B4(具有分别示于SEQ ID NO：2和8的VH和VL序列)或8B5(具有分别示于SEQ ID NO：3和9的VH和VL序列)或18E7(具有分别示于SEQ ID NO：4和10的VH和VL序列)或69A7(具有分别示于SEQ ID NO：5和11的VH和VL序列)或69A7Y(具有分别示于SEQ ID NO：73和11的VH和VL序列)或1F4(具有分别示于SEQ ID NO：6和12的VH和VL序列)所识别的人类CD70的相同表位上。
在一个优选的实施方案中，结合至由2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y或1F4所识别的人类CD70上的相同表位的抗体是人类单克隆抗体。正如在实施例中所说明的，可以对此类人类单克隆抗体进行制备并分离。
经改造的并且经修饰的抗体
通过以下方式可以进一步制备本发明的抗体：可以使用具有一个或多个本文公开的VH和/或VL序列的抗体作为起始材料，以改造为经修饰的抗体，这种经修饰的抗体与起始抗体相比可能具有经改变的特性。通过在一个或两个可变区(即VH和/或VL)中，例如在一个或多个CDR区内和/或在一个或多个框架区内中修饰一个或多个残基，可以对抗体进行改造。另外地或可替代地，通过修饰恒定区中的残基，例如改变该抗体的效应物功能，能够对抗体进行改造。
在某些实施方案中，可以使用CDR移植以对抗体的可变区进行改造。抗体和靶抗原主要通过位于六个重链及轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基进行相互作用。由于这一原因，在各个抗体之间的CDR的氨基酸序列比在CDR之外的序列更具有多样性。因为CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，所以通过构建包括来自被移植至框架序列(来自具有不同特性的不同抗体)上的特异天然发生抗体的CDR序列的表达载体，表达模拟特异天然发生抗体的特性的重组抗体是可能的(参见，例如Riechmann，L.等人(1998)Nature 332：323-327；Jones，P.等人(1986)Nature321：522-525；Queen，C.等人(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86：10029-10033；Winter的美国专利号5,225,539，以及Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762及6,180,370)。
因此，本发明的另一个实施方案涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，该单克隆抗体或其抗原结合部分包括含有CDR1、CDR2以及CDR3序列的重链可变区，该CDR1、CDR2以及CDR3序列包括分别选自：SEQID NO：13、14、15、16、17和18，SEQ ID NO：19、20、21、22、23和24，以及SEQ ID NO：25、26、27、28、29、75和30的氨基酸序列；以及含有CDR1、CDR2以及CDR3序列的轻链可变区，该CDR1、CDR2以及CDR3序列包括分别选自：SEQ ID NO：31、32、33、34、35和36，SEQ ID NO：37、38、39、40、41和42，以及SEQ ID NO：43、44、45、46、47和48的氨基酸序列。因此，此类抗体含有单克隆抗体2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y或1F4的VH和VLCDR序列，但是可包含与这些抗体不同的框架序列。
此类框架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或已公开的文献获得。例如，针对人类重链及轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“Vbase”人类种系序列数据库中找到(在互联网在http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase上获得)，连同在以下献中找到：Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美国卫生和人类服务部，NIH Publication No.91-3242；Tomlinson，I.M.，等人(1992)“The Repertoire of Human Germline VH SequencesReveals about Fifty Groups of VH Segments with Different HypervariableLoops”J.Mol.Biol.227：776-798；以及Cox，J.P.L.等人(1994)“ADirectory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in theirUsage”Eur.J.Immunol.24：827-836；这些文献中每一篇的内容均明确地通过引用结合于此作为参考。作为另一个实例，针对人类重链及轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中找到。例如，在HCo7HuMAb小鼠中发现的以下重链种系序列在所附的Genbank登录号中可获得：1-69(NG_0010109、NT_024637、以及BC070333)、3-33(NG_0010109以及NT_024637)、以及3-7(NG_0010109以及NT_024637)。作为另一个实例，在HCo12HuMAb小鼠中发现的以下重链种系序列在所附的Genbank登录号中可获得：1-69(NG_0010109、NT_024637、以及BC070333)、5-51(NG_0010109以及NT_024637)、4-34(NG_0010109以及NT_024637)、3-30.3(CAJ556644)、以及3-23(AJ406678)。然而人类重链和轻链种系序列的另一个来源为人类免疫球蛋白基因数据库，该数据库可获自IMGT(http://imgt.cines.fr)。
使用序列相似性检索方法之一的称为Gapped BLAST方法(Altschul等人(1997)Nucleic Acids Research 25：3389-3402)将抗体蛋白质序列和已编制的蛋白质序列数据库进行比较，这对本领域的技术人员而言是熟知的。BLAST是一种启发式算法，因为抗体序列与数据库序列之间统计学上的显著性比对可能包含比对字符的高得分片段对(HSP)。通过扩展或修正不能改善片段对分数的片段对被称为命中项(hit)。简言之，翻译VBASE来源的核苷酸序列(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php)，并且保留在FR1至FR3框架区之间的区(包括FR1至FR3框架区)。这些数据库序列具有的平均长度为98个残基。去除重复序列(它们是蛋白质全长上的精确匹配)。用于蛋白质的BLAST检索使用程序blastp，其使用默认的、除了低复杂性过滤(它已被关闭)以外的标准参数，以及置换矩阵BLOSUM62，针对实现序列相配的前5个命中项的过滤。按全部六个读码框翻译核苷酸序列，并且认为在数据库序列的匹配片段中不具有终止密码子的读码框是潜在的命中项。进而使用BLAST程序tblastx对此结论进行确认，该程序以全部六个读码框翻译抗体序列，并且将这些翻译与以全部六个读码框动态翻译的VBASE核苷序列进行比较。可以如以上说明使用类似于VBASE的方法对其他人类种系序列数据库(例如可从IMGT(http://imgt.cines.fr)获得的数据库)进行检索。
同一性是抗体序列与蛋白质数据库之间在序列的全长上的精确的氨基酸匹配。这些阳性项(同一性+取代匹配)不是完全相同的，而是由BLOSUM62取代矩阵所引导的氨基酸取代。如果抗体序列以相同的同一性匹配数据库序列中的两条序列，则具有最大阳性的命中项将被判定为匹配的序列命中项。
可用于本发明抗体的优选框架序列是与所选择的本发明抗体所用框架序列在结构上类似的那些框架序列，例如类似于本发明优选的单克隆抗体所使用的以下框架序列：VH 3-30.3框架序列(SEQ ID NO：61)和/或VH 3-33框架序列(SEQ ID NO：62)和/或VH 4-61框架序列(SEQ ID NO：63)和/或VH 3-23框架序列(SEQ ID NO：64)和/或VKL6框架序列(SEQ IDNO：65)和/或VK L18框架序列(SEQ ID NO：66)和/或VK L15框架序列(SEQ ID NO：67)和/或VK A27框架序列(SEQ ID NO：68)。
VH CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及VK CDR1、CDR2以及CDR3序列可以被移植至这样的框架结构区上，其具有与从中衍生出该框架序列的种系免疫球蛋白基因中所发现的序列相同的序列，或者这些CDR序列可以被移植至与种系序列相比含有一个或多个突变的框架结构区上。例如，已发现在某些情况下在框架区内对残基进行突变可能是有益的，以保持或增强该抗体的抗原结合能力(参见，例如Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762以及6,180,370)。
另一种类型的可变区修饰是在VH和/或VK CDR1、CDR2和/或CDR3区中对氨基酸残基进行突变，由此改善目的抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变来引入一种或多种突变，并且对抗体的结合或其他目的功能特性的影响可以通过在此说明的以及在实施例中提供的体内或体外测定进行评估。优选引入保守性修饰(如以上所讨论)。这些突变可以是氨基酸置换、插入或缺失，但优选是置换。此外，一般在CDR区中改变不超过一个、两个、三个、四个或五个残基。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了分离的抗CD70单克隆抗体或其抗原结合部分，包括重链可变区，该重链可变区包括：(a)VH CDR1区，包括选自SEQ ID NO：13、14、15、16、17和18的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：13、14、15、16、17和18相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列。(b)VH CDR2区，包括选自SEQ ID NO：19、20、21、22、23和24的氨基酸序列，或者与SEQ IDNO：19、20、21、22、23和24相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VH CDR3区，包括选自SEQ IDNO：25、26、27、28、29、75和30的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：25、26、27、28、29、75和30相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(d)VK CDR1区，包括选自SEQ IDNO：31、32、33、34、35和36的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：31、32、33、34、35和36相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VK CDR2区，包括选自SEQ ID NO：37、38、39、40、41和42的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：37、38、39、40、41和42相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；以及(f)VK CDR3区，包括选自SEQ ID NO：43、44、45、46、47和48的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：43、44、45、46、47和48相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列。
本发明改造的抗体包括其中在VH和/或VK内已经对框架残基进行了修饰的抗体，如改善了抗体的特性。一般对此类框架进行修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一个方法是将一个或多个框架残基“回复突变”成为相应的种系序列的残基。更确切地说，已经经历了体细胞突变的抗体可能包含与从中衍生出该抗体的种系序列不同的框架残基。此类残基可以通过将该抗体框架序列与从中衍生出该抗体的种系序列进行比较而被鉴定。本发明也旨在涵盖此类“回复突变”的抗体。例如，对于10B4，VH(位于FR1)的#2氨基酸是异亮氨酸而该在相应的VH 3-30.3种系序列中此残基是缬氨酸。为了将框架区序列返回至它们的种系序列，通过例如定点诱变或PCR介导的诱变，可以将体细胞突变“回复突变”为种系序列(例如，可以将10B4的VH中FR1的2号残基从异亮氨酸回复突变为缬氨酸)。
作为另一个实例，对于10B4而言，VH的氨基酸残基#30(在FR1内)为甘氨酸，而在VH 3-30.3种系序列中相应的这一残基为丝氨酸。为了使该框架区序列返回到它们的种系构型，例如，10B4的VH的FR1的残基30可从甘氨酸“回复突变”到丝氨酸。
作为另一个实例，对于8B5而言，VH的氨基酸残基#24(在FR1内)为苏氨酸，而在VH 3-33种系序列中相应的这一残基为丙氨酸。为了使该框架区序列返回到它们的种系构型，例如，8B5的VH的FR1的残基24可从苏氨酸“回复突变”到丙氨酸。
作为另一个实例，对于8B5而言，VH的氨基酸残基#77(在FR3内)为赖氨酸，而在VH 3-33种系序列中相应的这一残基为天冬酰胺。为了使该框架区序列返回到它们的种系构型，例如，8B5的VH的FR3的残基11可从赖氨酸“回复突变”到天冬酰胺。
作为另一个实例，对于8B5而言，VH的氨基酸残基#80(在FR3内)是丝氨酸，而在相应的VH 3-33种系序列中这一残基是酪氨酸。为了使该框架区序列返回到它们的种系构型，例如，8B5的VH的FR3的残基14可从丝氨酸“回复突变”到酪氨酸。
作为另一个例子，对于69A7而言，VH的氨基酸残基#50(FR2内)是亮氨酸，而在VH 4-61种系序列中相应的这一残基是异亮氨酸。为了使该框架区序列返回到它们的种系构型，例如，69A7的VH的FR2的残基13可从亮氨酸“回复突变”到异亮氨酸。
作为另一个实例，对于69A7而言，VH的氨基酸残基#85(在FR3内)为精氨酸，而在VH 4-61种系序列中相应的这一残基为丝氨酸。为了使该框架结构区序列返回到它们的种系构型，例如，69A7的VH的FR3的残基18可从精氨酸“回复突变”到丝氨酸。
作为另一个实例，对于69A7而言，VH的氨基酸残基#89(在FR3内)为苏氨酸，而在VH 4-61种系序列中相应的这一残基为丙氨酸。为了使该框架区序列返回到它们的种系构型，例如，69A7的VH的FR3的残基22可从苏氨酸“回复突变”到丙氨酸。
作为另一个实例，对于10B4而言，VL的氨基酸残基#46(在FR2内)为苯丙氨酸，而在VLL18种系序列中相应的这一残基为亮氨酸。为了使该框架区序列返回到它们的种系构型，例如，10B4的VL的FR2的残基12可从苯丙氨酸“回复突变”到亮氨酸。
作为另一个实例，对于69A7而言，VL的氨基酸残基#49(在FR2内)为苯丙氨酸，而在VLL6种系序列中相应的这一残基为酪氨酸。为了使该框架区序列返回到它们的种系构型，例如，69A7的VL的FR2的残基15可从苯丙氨酸“回复突变”到酪氨酸。
另一种类型的框架修饰涉及在框架区内或甚至在一个或多个CDR区内的对一个或多个残基进行突变，以除去T细胞表位，由此降低抗体的潜在的免疫原性。这一方法也称为“去免疫化”，并且在Carr等人的美国专利公开号20030153043中进一步详细地说明了该方法。
本发明的经改造的抗体还包括那些抗体：其中对氨基酸残基进行修饰，以通过改变在抗体上与T细胞表位相互作用的氨基酸修饰来增加或降低免疫原性反应(参见，如美国专利号6,835,550；6,897,049以及6,936249)。
除了在框架区或CDR区内进行的修饰之外，或可替代地，还可以对本发明抗体进行改造，以在Fc区内包含一些修饰，一般改变该抗体的一种或多种功能特性，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖的细胞的细胞毒性作用。此外，本发明的抗体可以被化学修饰(例如，可以将一个或多个化学品部分连接于该抗体)或被修饰以改变其糖基化作用，以便再次改变该抗体的一个或多个功能特性。以下对这些实施方案中的每一个均进行更详细的说明。Fc区中残基的编号是Kabat的EU索引号的那些编号。
在一个实施方案中，对CH1的铰链区进行修饰，使得铰链区中的半胱氨酸残基的个数发生变化，如，增加或减少。在Bodmer等人的US专利号5,677,425中进一步说明了此方法。CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数目发生变化，例如便于组装轻链以及重链或者增大或者减小该抗体的稳定性。
在另一个实施方案中，对抗体的Fc铰链区进行突变以减小该抗体的生物半衰期。更确切地说，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2-CH3结构域的界面区，使得相对于天然Fc铰链结构域的葡萄球菌蛋白A(SpA)的结合而言，该抗体削弱了SpA的结合。Ward等人的US专利号6,165,745更详细地说明了这一方法。
在另一个实施方案中，对该抗体进行修饰以增大其生物半衰期。多种不同的方法是可能的。例如，如在Ward的美国专利号6,277,375中说明，可引入一个或多个以下突变：T252L、T254S以及T256F。可替代地，为增大生物半衰期，该抗体可以在CH1或CL区内进行改变以包含从IgG的Fc区的CH2结构域的两个环获得的补救抗体(salvage receptor)结合表位，如Presta等人的美国专利号5,869,046以及6,121,022所说明。
在另外其他的实施方案中，通过用不同的氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变Fc区，而改变该抗体的一种或多种效应物功能。例如，选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320及322的一个或多个氨基酸可以由不同的氨基酸残基所替换，使得该抗体对于效应物配体而言具有已改变的亲和力，但仍保留该亲代抗体的抗原结合能力。例如，亲和力被改变的效应物配体可以是Fc受体或补体的C1成分。这种方法在Winter等人的美国专利号5,624,821号以及5,648,260中有更详细的说明。
在另一个实例中，选自氨基酸残基329、331及322的一个或多个氨基酸残基可以被不同的氨基酸残基所替换，使得该抗体具有已改变的C1q结合和/或降低或已消除的补体依赖的细胞毒性作用(CDC)。这种方法在Idusogie等人的美国专利号6,194,551中有更详细的说明。
在另一个实例中，改变氨基酸位置231以及239中的一个或多个氨基酸，由此改变抗体的固定补体的能力。这一方法在Bodmer等人的PCT公开WO 94/29351中有更详细的说明。
在又另一个实例中，对Fc区进行修饰以提高抗体介导ADCC的能力，和/或增加抗体针对Fcγ受体的亲和力，通过在以下位置中修饰一个或多个氨基酸而实现：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。这个方法在Presta的PCT公开文件WO 00/42072中有进一步的说明。已经绘制出针对FcγR1、FcγRII、FcγRIII以及FcRn在人类IgG1上的结合位点，并且已经说明了具有已改善的结合的变体(参见Shields，R.L.等人(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604)。已表明在位置256、290、298、333、334及339上特异的突变改善对FcγRIII的结合。此外，已表明以下组合突变体改善FcγRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A、以及S298A/E333A/K334A。
在又另一个实施方案中，如美国临时申请号系列号60/957,271(其全文在此合并作为参考)所说明，通过引入半胱氨酸残基来修饰本发明抗体的C末端。此类修饰包括但不限于在全长重链序列的C端处或在其附近替换现有的氨基酸残基，以及将包含半胱氨酸的延长序列(extension)引入至全长重链序列的C端。在优选的实施方案中，包含半胱氨酸的延长序列包括序列丙氨酸-丙氨酸-半胱氨酸(从N端至C端)。
在优选的实施方案中，此类C末端半胱氨酸修饰的存在为配偶体分子的偶联提供了位点，该配偶体分子例如是治疗剂或标记物分子。特别是，由于C末端半胱氨酸修饰而出现的反应活性巯基可采用以下详细说明的二硫化物连接物与配偶体分子相偶联。抗体与配偶体分子以这一方式的偶联使得可以增强对所连接的特异位点的控制。此外，通过在C末端或在其附近引入连接位点，更优化了偶联物，使得它减少或者消除对该抗体功能特性的干扰，并且允许偶联制备物的简化分析以及质量控制。
在再另一个实施方案中，对抗体的糖基化进行了修饰。例如，可以制做去糖基化(aglycoslated)的抗体(即，该抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。例如，通过在抗体序列中改变一个或多个糖基化的位点可以实现此类碳水化合物修饰。例如，可以进行一个或多个氨基酸的置换，这导致去除一个或多个可变区框架的糖基化位点，由此消除在该位点处的糖基化作用。这种去糖基化作用可提高抗体对抗原的亲和力。这种方法在Co等人的美国专利号5,714,350以及6,350,861中有更详细的说明。以下文献还更详细地说明了另外一些改变糖基化作用的方法：Hanai等人的美国专利7,214,775、Presta的美国专利号6,737,056、Presta的美国专利公开号20070020260、Dickey等人的PCT公开WO/2007/084926、Zh u等人的PCT公开WO/2006/089294，以及Ravetch等人的PCT公开WO/2007/055916，以上文献的每一篇其全文在此均通过引用作为参考。
另外地或可替代地，可以制备具有被改变类型的糖基化作用的抗体，例如具有减少量的岩藻糖残基的低岩藻糖化(hypofucosylated)的抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已经证实此类已改变的糖基化类型可以提高抗体的ADCC能力。例如，通过在糖基化机制得到改变的宿主细胞中表达抗体可以实现此类碳水化合物修饰。具有已改变的糖基化作用机制的细胞在本领域中已被说明，并可以用作表达本发明重组抗体的宿主细胞，由此产生具有已改变的糖基化作用的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705以及Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因，FUT8(α(1，6)岩藻糖转移酶)，使得在Ms704、Ms705以及Ms709细胞系中表达的抗体缺乏在它们的碳水化合物上的岩藻糖。Ms704、Ms705以及Ms709FUT8-/-细胞系是通过使用两种替换载体对CHO/DG44细胞中的FUT8基因的靶向破坏而产生(参见Yamane等人的美国专利公开20040110704以及Yamane-Ohnuki等人(2004)Biotechnol Bioeng 87：614-22)。作为另一个实例，Hanai等人的EP 1,176,195说明了带有在功能上被破坏的FUT8基因(该基因编码岩藻糖基转移酶)的细胞系，使得通过减少或消除α1，6键相关的酶，在这种细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖化作用。Hanai等人也说明了一些细胞系，它们具有用于将岩藻糖添加至N-乙酰葡糖胺的低酶活性(N-乙酰葡糖胺结合至抗体的Fc区)，或者不具有该酶活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。Presta的PCT公开文件WO 03/035835说明了一种CHO细胞系变种，Lec13细胞，具有降低的将岩藻糖连接于与Asn(297)相连的碳水化合物的能力，这也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖化作用(还可参见Shields，R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人的PCT公开文件WO 99/54342中说明了经改造的而表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如，β(1，4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnT III))的细胞系，使得经改造的细胞系中表达的抗体具有增多的二等分GlcNac结构，这导致抗体的ADCC活性提高(还可参见Umana等人(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。可替代地，可以使用岩藻糖苷酶切去该抗体的岩藻糖残基。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体中去除岩藻糖残基(Tarentino，A.L.等人(1975)Biochem.14：5516-23)。
另外地或可替代地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，其中该改变涉及抗体的唾液酸(sialyation)化水平。此类改变在Dickey等人的PCT公开号WO/2007/084926以及Ravetch等人的PCT公开号WO/2007/055916中有说明，这两篇文献其原本均通过引用作为参考。例如，可以采用唾液酸酶的酶反应，例如产脲节杆菌唾液酸酶(Arthrobacterureafacens sialidase)。这一反应的条件主要说明于美国专利5,831,077中，其全部内容在此合并作为参考。适宜的酶的其他非限制性实例是神经氨酸酶以及N-糖苷酶F，分别如在Schloemer等人J.Virology，15(4)，882-893(1975)以及Leibiger等人Biochem J.，338，529-538(1999)中说明。去唾液酸化的抗体可以通过使用亲和色谱得到进一步纯化。可替代地，可以采用多种方法提高唾液酸化的水平，例如采用唾液酸转移酶。这种反应的条件只要说明于Basset等人，Scandinavian Journal of Immunology，51(3)，307-311(2000)中。
由本发明在此所考虑的抗体的另一种修饰是聚乙二醇化作用(pegylation)。可对抗体进行聚乙二醇化以例如增加该抗体的生物半衰期(例如血清半衰期)。为了对抗体进行聚乙二醇化，一般在一个或多个聚乙二醇(PEG)基团连接于抗体或其片段的条件下，将抗体或其抗体片段与PEG(例如PEG的反应性酯或醛类衍生物)进行反应。优选地，使用反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)，通过酰基化反应或烷基化反应进行聚乙二醇化。在此使用的术语“聚乙二醇”旨在涵盖已用于衍生其他蛋白质(例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺)的PEG的任何形式。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是去糖基化的抗体。对蛋白质进行聚乙二醇化的方法在本领域中是已知的，并可以应用于本发明的抗体。参见，例如Nishimura等人的EP 0154 316以及Ishikawa等人的EP 0 401 384。
抗体片段和抗体模拟物
本发明不限于传统的抗体，并可能通过抗体片段以及抗体模拟物的使用得以实施。如下面的详细说明，多种抗体片段以及抗体模拟物技术现在已经被开发出来并且已在本领域广为人知。虽然这些技术中有许多技术(如结构域抗体、纳米抗体以及UniBody)使用了传统抗体结构的片段或这些传统抗体结构的其他修饰，但是还存在着多种可替代的技术，如亲和体、经设计的锚蛋白重复蛋白、抗运载蛋白、高亲和性多聚体以及反向抗体，它们采用了结合的结构，这些结构(尽管它们模拟传统的抗体结合)产生于不同的机制并通过不同的机制发挥功能。
结构域抗体(dAb)是抗体的最小功能结合单位，对应于人类抗体的重链(VH)或轻链(VL)的可变区。结构域抗体的分子量大约为13kDa。Domantis已经开发了全部人类VH与VL dAb的一系列大而高功能性文库(每一文库中有超过一百亿个不同的序列)，并使用这些文库来选择对治疗靶标特异的dAb。与许多传统的抗体不同，结构域抗体在细菌、酵母以及哺乳动物的细胞体系中表达良好。结构域抗体及其生产方法的进一步细节可能通过参见以下文献而获得，这些文献是：美国专利6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197；6,696,245；美国系列号2004/0110941；欧洲专利申请号1433846、以及欧洲专利0368684和0616640；WO05/035572、WO04/101790、WO04/081026、WO04/058821、WO04/003019、以及WO03/002609，其中每一项的全文均在此合并作为参考。
纳米抗体(Nanobody)是源自抗体的治疗性蛋白质，它包含天然发生的重链抗体的独特结构及功能特性。这些重链抗体包含单一可变区(VHH)和两个恒定区(CH2与CH3)。重要的是，经克隆并分离的VHH结构域是携带原始重链抗体的全部抗原结合能力的完全稳定的多肽。纳米抗体与人类抗体的VH结构域具有高同源性，并且可以进一步被人源化而不会损失任何活性。重要的是，纳米抗体具有低免疫原性的潜力，这在使用纳米抗体所致的化合物的灵长类动物研究中已得到证实。
纳米抗体结合了常规抗体的优点以及小分子药物的重要特征。与常规抗体一样，纳米抗体显示出高靶向特异性，对它们的靶点的高亲和力以及低固有毒性。然而，像小分子药物一样，它们能够抑制酶类并且容易到达受体裂缝(receptor cleft)。此外，纳米抗体非常稳定，可以通过注射之外的方法进行给药(例如，参见WO 04/041867，其全文在此合并作为参考)，并且易于制造。纳米抗体的其他优点包括：由于其尺寸小而识别出不常见的或隐藏的表位；由于其独特的三维的、药物形式的灵活性，以高亲和力及选择性结合进入蛋白靶的空腔或活性位点；对半衰期进行修制，以及容易并且快速的发现药物。
纳米抗体由单一基因编码，并在几乎全部的原核宿主和真核宿主中有效生产，这些宿主例如大肠杆菌(E.coli)(参见，如，US 6,765,087，其全文在此合并作为参考)、霉菌(例如曲霉属或木霉属)、以及酵母(例如酵母菌属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属或毕赤酵母属)(参见，如，US6,838,254，其全文在此合并作为参考)。该生产方法是可比例放大的，并且已经生产了几千克量的纳米抗体。因为与常规抗体相比纳米抗体显示出优越的稳定性，所以可以将它们配制成保质期长，立即可用的溶液。
纳米克隆方法(参见，例如WO 06/079372，其全文在此合并作为参考)是用于产生对抗所希望靶标的纳米抗体的专利方法，它基于B细胞的自动高通量选择，并且能够在本发明的情况中使用。
UniBody是另一种抗体片段技术，然而这一技术是基于去除IgG4抗体的铰链区。删除铰链区得到基本上是传统IgG4抗体一半尺寸的分子，并且该分子具有单价结合区而不是IgG4抗体的二价结合区。众所周知，IgG4抗体为惰性的，并且因此不与免疫系统进行反应，这可能对治疗不期望产生免疫应答的疾病有利，并且这一优势传到了Unibody。例如，Unibody可发挥抑制或沉默它们所结合细胞的作用，但不杀死这些细胞。此外，结合至癌症细胞的UniBody并不刺激它们的增殖。此外，因为Unibody为传统IgG4抗体的大小的一半，它们在更大的实体瘤上可显示出更好的分布，具有潜在的有利功效。Unibody以与完整IgG4抗体相似的速度从人体中被清除并且能以与完整抗体相似的亲和力结合它们的抗原。Unibody的进一步的细节可从专利申请WO2007/059782获得，其全文在此合并作为参考。
亲和体分子代表新类型的亲和蛋白质，它基于58个氨基酸残基的蛋白结构域，衍生自葡萄球菌蛋白A的IgG结合结构域之一。这个三螺旋束结构域已作为支架用于构建组合的噬菌粒文库(combinatorial phagemidlibrary)，使用噬菌体展示技术可从该文库中选择靶向所希望分子的亲和体变异体(Nord K，Gunneriusson E，Ringdahl J，Stahl S，Uhlen M，NygrenPA，Binding proteins selected from combinatorial libraries of an α-helicalbacterial receptor domain，Nat Biotechnol 1997；15：772-7.Ronmark J，Gronlund H，Uhlen M，Nygren PA，Human immunoglobulin A(IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A，Eur JBiochem 2002；269：2647-55)。亲和体分子的结构简单坚固，并且它们的分子量低(6kDa)，这使它们适宜于各种广泛的应用，例如，作为检测试剂(Ronmark J，Hansson M，Nguyen T等人，Construction andcharacterization of affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli，JImmunol Methods 2002；261：199-211)，以及抑制受体的相互作用(Sandstorm K，Xu Z，Forsberg G，Nygren PA，In hibition of theCD28-CD80co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody liganddeveloped by combinatorial protein engineering，Protein Eng2003；16：691-7)。亲和体以及它们的生产方法的进一步细节可通过参见美国专利5,831,012而获得，其全文在此合并作为参考。
标记的亲和体也可用于确定同种型丰度的成像应用中。
DARPin(经设计的锚蛋白重复蛋白)是抗体模拟DRP(经设计的重复蛋白)技术的一个实例，已对该技术进行开发以利用非抗体多肽的结合能力。重复蛋白，例如锚蛋白或富含亮氨酸的重复蛋白是普遍存在的结合分子，与抗体不同，它们出现在细胞内及细胞外。它们独特的模块结构以重复结构单元(重复子)为特征，这些重复子堆叠在一起以形成展示可变的以及模块的靶结合表面的延长重复结构域。基于这一模块性，可以生成具有高度多样性的结合特异性的多肽组合文库。这一策略包括自我相容的重复体(self-compatible repeat)(展示可变的表面残基)的一致性设计，并将它们随机组装进入重复结构域中。
经设计的锚蛋白重复蛋白可以在细菌表达系统中以相当高的产率进行生产，并且它们属于已知的最稳定的蛋白质。已经选择出了针对大量靶蛋白的高特异、高亲和力的经设计的锚蛋白重复蛋白，这些靶蛋白包括人类受体、细胞因子、激酶、人类蛋白酶、病毒及膜蛋白。可以获得亲和力在单位数纳摩尔至单位数皮摩尔范围内的经设计的锚蛋白重复蛋白。
经设计的锚蛋白重复蛋白已经用于广泛的应用中，包括ELISA、夹心ELISA、流式细胞术分析(FACS)、免疫组织化学分析(IHC)、芯片应用、亲和纯化或蛋白质印迹法。还证明了经设计的锚蛋白重复蛋白在胞内区室中具有高活性，例如作为胞内标记物蛋白与绿色荧光蛋白(GFP)融合。经设计的锚蛋白重复蛋白进一步被用于抑制病毒进入，其IC50在pM范围内。经设计的锚蛋白重复蛋白不仅在阻断蛋白-蛋白相互作用方面是理想的，还抑制酶类。已经成功地抑制了蛋白酶、激酶、以及转运蛋白，通常是别构抑制模式。非常快速并且在肿瘤上特异地富集、以及以非常有利的肿瘤与血液的比例，使得经设计的锚蛋白重复蛋白非常适宜体内诊断或治疗方法。
有关经设计的锚蛋白重复蛋白及其他DRP技术的另外信息可以在美国专利申请公开2004/0132028及国际专利申请公开WO 02/20565中找到，它们的全文均在此合并作为参考。
抗运载蛋白是另一种抗体模拟技术，然而在这种情况下，结合的特异性源自脂质运载蛋白，脂质运载蛋白是一个低分子量蛋白家族，在人体组织及体液中天然地大量表达。脂质运载蛋白已经得到进化，在体内进行与生理运输及化学敏感的或不溶性化合物的存储有关的多种功能。脂质运载蛋白具有坚固的内部结构，包括在该蛋白的一端支持四个环(loop)的高度保守的β-桶。这些环形成了结合口袋的入口，并且在分子这一部分的构象差异解释了在各个脂质运载蛋白之间的结合特异性的变化。
尽管由保守的β-片层框架支持的超可变环的整体结构让人联想起免疫球蛋白，但脂质运载蛋白与抗体在大小上差异显著，它由160至180个氨基酸的单一多肽链构成，该单一多肽链少量地大于单一免疫球蛋白结构域。
对脂质运载蛋白进行克隆，并使它们的环经受改造以便产生抗运载蛋白。已经生成了在结构上多样的抗运载蛋白的文库，并且抗运载蛋白的展示允许对结合功能进行选择和筛选，随后在原核或真核体系中通过表达并生成可溶性蛋白用于进一步分析。多项研究已经成功地证明了可以开发出对几乎任何人类靶蛋白都特异性的抗运载蛋白，可以将它们分离出来，并且可以获得在纳摩尔或更高范围内的结合亲和力。
抗运载蛋白还可以形成双靶向性蛋白的形式，称为Duocalin。使用标准的生产方法，Duocalin以一个易于生产的单体蛋白质形式结合两种不同的治疗性靶标，同时保持靶向特异性和亲和力，无论它的两个结合结构域的结构取向如何。
通过单个分子对多个靶标进行调节在已知涉及不止一种致病因子的疾病中特别有优势。此外，例如Duocalin等二价或多价结合形式在靶向疾病的细胞表面分子、通过细胞表面受体的结合和集簇来介导对信号转导途径的激动剂效应或诱导增强的内化效应方面具有显著的潜力。此外，Duocalin的高固有稳定性与单体抗运载蛋白相似，这使得Duocalin具有灵活的配制和送递潜力。
有关抗运载蛋白的其他信息可以在美国专利7,250,297及国际专利申请公开号WO 99/16873中找到，它们的全文均在此合并作为参考。
在本发明的内容中有用的另一种抗体模拟技术是高亲和性多聚体(Avimer)。高亲和性多聚体是通过体外外显子重排及噬菌体展示从人类细胞外受体结构域的大家族中演化而来，产生具有结合及抑制特性的多结构域蛋白。已显示连接多种独立的结合结构域产生亲和力，并且与传统的单一表位结合蛋白相比，该结合结构域产生了改善的亲和力及特异性。其他潜在的优点包括在大肠杆菌中简单并有效地产生多靶特异性的分子，改善的热稳定性以及对蛋白酶的抵抗力。已经得到了针对多种靶的具有亚纳摩尔亲和力的高亲和性多聚体。
关于高亲和性多聚体的其他信息可在美国专利申请公开号2006/0286603、2006/0234299、2006/0223114、2006/0177831、2006/0008844、2005/0221384、2005/0164301、2005/0089932、2005/0053973、2005/0048512、2004/0175756中找到，其全部内容均在此合并作为参考。
反向抗体是另一种可用于本发明内容的抗体模拟技术。反向抗体是3至5kDa的小蛋白质，具有大于15％的半胱氨酸，其形成高二硫化物密度支架，替换一般蛋白具有的疏水核。这种用少量的二硫化物替换大量疏水性氨基酸(包括疏水核)使得蛋白质更小，更亲水(聚集及非特异性结合更小)，对于蛋白酶及热具有更大的抵抗力，并且具有较低密度的T细胞表位，因为对MHC呈递贡献最多的残基是疏水性的。这些特性中的全部四种都是熟知的会影响免疫原性，并且预期它们在一起会大幅度降低免疫原性。
反向抗体的启示来自于由水蛭、蛇、蜘蛛、蝎子、蜗牛，以及海葵(anemone)产生的天然可注射生物药剂，已知这些生物药剂表现出预料不到的低免疫原性。从经选择的天然蛋白质家族开始，通过设计和筛选，可以将尺寸、疏水性、蛋白水解性抗原加工、和表位密度都最小化至远远低于天然可注射蛋白质的平均值的水平。
鉴于反向抗体的结构，这些抗体模拟物提供了多样的形式，包括多价、多特异性、多样化的半衰期机制、组织靶模块及抗体Fc区的空缺。此外，可以在大肠杆菌中以高产率生产反向抗体，并且由于它们的亲水性和尺寸小，反向抗体高度可溶，而且能够被配制成高浓度。反向抗体具有特别的热稳定性(它们可被煮沸)，并且具有长的保质期。
关于反向抗体的其他信息可在美国专利申请公开号2007/0191272中找到，其全文在此合并作为参考。
以上提供的抗体片段及抗体模拟技术的详细说明并非旨在成为可以在本说明书的上下文中使用的所有技术的综合清单。例如，但并非作为限制，多种另外的技术，包括可替代的基于多肽的技术，如在Qui等人，NatureBiotechnology，25(8)921-929(2007)中概述的互补决定区的融合(其全文在此合并作为参考)，以及基于核酸的技术，如在美国专利5,789,157、5,864,026、5,712,375、5,763,566、6,013,443、6,376,474、6,613,526、6,114,120、6,261,774以及6,387,620中说明的RNA适体技术都可用于本发明的内容中，这些文献全部均在此合并作为参考。
抗体的物理特性
本发明抗体的进一步特征为抗-CD70抗体的不同物理特性。基于这些物理特性，可以使用不同测定来检测和/或区分不同类型的抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体可能在轻链或重链可变区含有一个或多个糖基化位点。在可变区中存在一个或多个糖基化位点，可导致抗体的免疫原性提高或抗体的pK值发生变化，这是因为抗原结合发生改变(Marshall等人(1972)Annu Rev Biochem41：673-702；Gala FA和Morrison SL(2004)J Immunol 172：5489-94；Wallick等人(1988)J Exp Med168：1099-109；Spiro RG(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh等人(1985)Nature316：452-7；Mimura等人(2000)Mol Immunol 37：697-706)。已知糖基化作用发生在包含N-X-S/T序列的基序中。使用Glycoblot测定可以检测可变区的糖基化作用，该测定对该抗体进行剪切产生Fab，并接着使用测量高碘酸盐氧化作用及席夫碱形成的测定来检测糖基化作用。可替代地，使用Dionex光色谱法(Dionex-LC)可以测试可变区的糖基化，该测定中将Fab上的糖类剪切成单糖，并分析每种糖的含量。在某些情况下，优选使用不包含可变区糖基化的抗体。这可以通过无论选择在可变区中不含有糖基化基序的抗体或者通过使用本领域熟知的标准技术对糖基化基序中的残基进行突变来实现。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体不含有天冬酰胺同分异构位点。在N-G序列或D-G序列上可能分别发生脱酰胺作用或异天冬氨酸作用。脱酰胺作用或异天冬氨酸作用导致异天冬氨酸残基的生成，其在侧链羧基端而不是在主链上，通过生成缠绕结构，降低抗体的稳定性。使用等产量测定(iso-quant assay)可以测试异天冬氨酸的产生，该测定使用反相HPLC来检测异天冬氨酸。
每种抗体都具有独特的等电点(pI)，但是抗体的等电点通常都落在pH6至9.5之间的范围内。IgG1抗体的pI一般落在pH7至9.5的范围内，并且IgG4抗体的pI一般落在pH6至8的范围内。抗体可能具有在这一范围之外的pI。虽然这些效果并不完全清楚，但是推测pI在正常范围之外的抗体在体内条件下可能会有一些解折叠(unfolding)及不稳定性。使用毛细管等电聚焦测定可以测试等电点，该测定产生pH梯度，并可以使用激光聚焦来提高准确性(Janini等人(2002)Electrophoresis 23：1605-11；Ma等人(2001)Chromatographia 53：S75-89；Hunt等人(1998)JChromatogr A800：355-67)。在某些情况下，优选具有包含pI值落在正常范围内的抗-CD70抗体。这可以通过选择pI值在正常范围内的抗体或者通过使用本领域熟知的标准技术对带电荷的表面残基进行突变来实现。
每种抗体都有熔解温度，其是热稳定性的指标(Krishnamurthy R和Manning MC(2002)Curr Pharm Biotechnol 3：361-71)。越高的热稳定性表明抗体在体内的总体稳定性越好。可以使用诸如差示扫描热量测定法的技术来测量抗体的熔解温度(Chen等人(2003)Pharm Res 20：1952-60；Ghirlando等人(1999)Immunol Lett 68：47-52)。TM1表示抗体起始解折叠的温度。TM2表示抗体完全解折叠的温度。通常地，优选本发明抗体的TM1高于60℃，优选高于65℃，甚至更优选高于70℃。可替代地，使用圆二色谱法可以测量抗体的热稳定性(Murray等人(2002)J.Chromatogr Sci40：343-9)。
在优选的实施方案中，选择不会快速降解的抗体。使用本领域所熟知的毛细管电泳(CE)及MALDI-MS可以测量抗-CD70抗体的片段化(Alexander AJ和Hughes DE(1995)Anal Chem 67：3626-32)。
在另一个优选的实施方案中，选择具有最小化聚集作用的抗体。聚集作用可能导致引发不需要的免疫反应和/或改变的或不良的药物动力学特性。总体上，可接受的抗体的聚集是25％或更低，优选20％或更低，甚至更优选是15％或更低，甚至更优选是10％或更低，并甚至更优选地是5％或更低。通过本领域熟知的几种技术可以对聚集进行测量以鉴别单体、二聚体、三聚体或多聚体，这些技术包括尺寸排阻柱(SEC)、高效液相色谱法(HPLC)以及光散射法。
改造抗体的方法
如以上所讨论，通过修饰VH和/或Vk序列，或其连接的一个或多个恒定区，可以使用具有在此披露的VH和Vk序列的抗-CD70抗体以产生新的抗-CD70抗体。因此，在本发明的另一方面，使用本发明的抗-CD70抗体，如2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y或1F4的结构特征，用于产生在结构上相关的抗-CD70抗体，该抗体保留了本发明抗体的至少一种功能特性，例如结合人类CD70。例如，如以上所讨论，可以将2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y或1F4的一个或多个CDR区或它们的突变与已知的框架区和/或其他CDR重组地组合，以产生另外的重组改造的本发明的抗-CD70抗体。其他类型的修饰包括上节中说明的那些修饰。用于改造方法的起始材料是在此提供的一个或多个VH和/或VK序列或它们的一个或多个CDR区。为产生改造的抗体，不必实际地制出抗体(即，表达成蛋白质)，该抗体具有在此提供的VH和/或Vk序列或它们的一个或多个CDR区中的一个或多个序列。相反，使用该序列中含有的信息作为起始材料，生成衍生自此原始序列的“第二代”序列，并接着制备此“第二代”序列，并将其表达成蛋白质。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了制备抗-CD70抗体的一种方法，包括：
(a)提供：(i)重链可变区抗体序列，包括选自SEQ ID NO：13、14、15、16、17以及18的CDR1序列，选自SEQ ID NO：19、20、21、22、23以及24的CDR2序列，和/或选自SEQ ID NO：25、26、27、28、29、75以及30的CDR3序列；和/或(ii)轻链可变区抗体序列，包括选自SEQID NO：31、32、33、34、35以及36的CDR1序列，选自SEQ ID NO：37、38、39、40、41以及42的CDR2序列，和/或选自SEQ ID NO：43、44、45、46、47以及48的CDR3序列；
(b)改变在重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列中的至少一个氨基酸残基，以产生至少一种经改变的抗体序列；并且
(c)将经改变的抗体序列表达成一种蛋白质。
可以使用标准的分子生物学技术来制备并表达经改变的抗体序列。
优选地，由经改变的抗体序列编码的抗体是保留了在此说明的抗-CD70抗体中一种、几种或全部功能特性的抗体，这些功能特性包括但不限于：
(a)以1x10-7M或更小的KD结合人类CD70；并且
(b)结合肾细胞癌肿瘤细胞系；
(c)结合淋巴瘤细胞系，如B细胞肿瘤细胞系；
(d)由表达CD70的细胞内化；
(e)对表达CD70的细胞表现出抗体依赖的细胞毒性(ADCC)；以及
(f)当与细胞毒素相偶联时在体内抑制表达CD70的细胞的生长。
使用本领域现有的和/或在此说明的标准测定例如实施例中给出的那些测定，(例如流式细胞术，结合测定)可以对经改变的抗体的功能特性进行评估。
在本发明的经改造抗体的方法的某些实施方案中，可以沿抗-CD70抗体编码序列的全长或一部分随机地或选择性地引入突变，并针对结合活性和/或在此说明的其他功能特性对得到的经修饰的抗-CD70抗体进行筛选。在本领域中已经说明了突变的方法。例如，Short的PCT公开文件WO02/092780说明了使用饱和诱变、合成连接装配，或它们的组合来生成并筛选抗体突变的方法。可替代地，Lazar等人的PCT公开文件WO 03/074679说明了使用计算机筛选方法以优化抗体的物理化学特性。
编码本发明抗体的核酸分子
本发明的另一个方面涉及对本发明的抗体进行编码的核酸分子。核酸可以存在于完整细胞中、细胞裂解液中或者以部分纯化的形式或基本上纯的形式存在。用标准的方法，包括用碱性/SDS处理、CsCl成带(CsClbanding)、柱层析、琼脂糖凝胶电泳以及其他本领域熟知的方法，当将核酸从其他的细胞成分或其他污染物(如其他细胞核酸或蛋白质)中纯化出来时，该核酸得到“分离”或“充分纯净化”。见F.Ausubel，等人编著(1987)Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and WileyInterscience，New York。本发明的核酸可以是，例如DNA或RNA，并且可以包含或不包含内含子序列。在优选的实施方案中，核酸为cDNA分子。
使用标准的分子生物学技术可以获得本发明的核酸。对于通过杂交瘤(例如，从以下进一步说明的携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体而言，通过标准的PCR扩增或cDNA克隆技术可以获得由杂交瘤制成的对抗体的轻链和重链进行编码的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库中(例如，使用噬菌体展示技术)获得的抗体而言，从该基因文库中可以回收编码此类抗体的核酸。
本发明优选的核酸分子是那些编码2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y或1F4单克隆抗体的VH和VL序列的核酸分子。对2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y，以及1F4的VH序列进行编码的DNA序列分别如SEQ ID NO：49、50、51、52、53、74以及54所示。对2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的VL序列进行编码的DNA序列分别如SEQ ID NO：55、56、57、58、59、59以及60所示(69A7和69A7Y具有如SEQ ID NO：59所示的编码VL序列的相同DNA序列)。
一旦获得了编码VH和VL区段的DNA片段，则通过标准的重组DNA技术可以进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转变成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段被有效地连接至编码另一种蛋白质(例如抗体恒定区或柔性连接物)的另一条DNA片段。在本文中使用的术语“有效地连接”旨在说明以使得由两条DNA片段编码的氨基酸序列以符合阅读框形式保留的方式连接这两个DNA片段。
通过将编码VH的DNA有效地连接至另一个编码重链恒定区(CH1、CH2及CH3)的DNA分子上，可以将编码VH区的分离的DNA转化成全长重链基因。人类重链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见，如Kabat E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH PublicationNo.91-3242)，并且含这些区域的DNA片段可通过标准的PCR扩增获得。该重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因而言，可以将编码VH的DNA有效地连接至另一个仅对重链CH1恒定区进行编码的DNA分子上。
通过将编码VL的DNA有效地连接至另一个编码轻链恒定区CL的DNA分子上，可以将编码VL区的分离的DNA转化成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。在本领域已知人类轻链恒定区基因的序列(参见，如Kabat E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.，Department of Health and Human Services，NIH PublicationNo.91-3242)，并且含这些区域的DNA片段可通过标准的PCR扩增获得。在优选的实施方案中，轻链恒定区可以为κ或λ恒定区。
为产生scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段有效地连接至另一条编码柔性连接物的片段，如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的片段，使得VH和VL序列可被表达为相邻的单链蛋白质，其中VH和VL区通过柔性连接物进行连接(例如，参见Bird等人(1988)Science 242：423-426；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；以及McCafferty等人.(1990)Nature 348：552-554)。
本发明的单克隆抗体的生产
可以通过多种技术产生本发明的单克隆抗体(mAb)，这些技术包括常规的单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495的标准体细胞杂交技术。虽然优选体细胞杂交方法，但是原则上可以采用其他用于生产单克隆抗体的技术，例如B淋巴细胞的病毒性转化或致癌性转化。
用于制备杂交瘤的优选的动物系统是鼠类系统。在小鼠中产生杂交瘤是充分确立的方法。用于分离经免疫的脾细胞以进行融合的免疫方案和技术在本领域中是已知的。融合配偶体(如小鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。
基于如以上说明制备的非人类单克隆抗体的序列，可以制备本发明的嵌合抗体或人源化抗体。使用标准的分子生物学技术从目的非人类杂交瘤中可以获得对重链及轻链免疫球蛋白进行编码的DNA，并且进行改造，以包含非鼠(例如人类)免疫球蛋白序列。例如，为生成嵌合抗体，使用本领域中已知的方法可将鼠类可变区与人类恒定区相连接(参见，如Cabilly等人的美国专利4,816,567)。为了生成人源化抗体，使用本领域已知的方法可以将鼠类CDR区插入人类框架中(参见，如Winter的美国专利5,225,539，以及Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762以及6,180,370)。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体是人类单克隆抗体。使用携带部分人类免疫系统而不是小鼠系统的转基因或转染色体小鼠，可以产生直接针对CD70的此类人类单克隆抗体。这些转基因小鼠或转染色体小鼠包括在此分别称为HuMAb
Figure A20078005123100831
和KM
Figure A20078005123100832
的小鼠，且它们在此都统称为“人类Ig小鼠”。
HuMAb(Medarex公司)含有对非重排的人类重链(μ和γ)以及κ轻链免疫球蛋白序列进行编码的人类免疫球蛋白基因小基因座，并含有使内源性μ和κ链基因座失活的靶向突变(参见，如Lonberg，等人(1994)Nature 368(6474)：856-859)。因此，这些小鼠表现出小鼠IgM或κ表达减少；并且响应于免疫，所诱导的人类重以及轻链转基因经历了类别转换以及体细胞突变以产生高亲和力的人类IgGκ单克隆(Lonberg，N.等人(1994)，supra；在Lonberg，N.(1994)Handbook of ExperimentalPharmacology 113：49-101中综述；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13：65-93和Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546)。HuMAb
Figure A20078005123100842
的制备和使用，以及由此类小鼠携带的基因组的修饰，进一步说明于Taylor，L.等人(1992)NucleicAcids Research20：6287-6295；Chen，J.等人(1993)InternationalImmunology 5：647-656；Tuaillon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：3720-3724；Choi等人(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen，J.等人(1993)EMBO J.12：821-830；Tuaillon等人(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Taylor，L.等人(1994)International Immunology6：579-591；以及Fishwild，D.等人(1996)Nature Biotechnology14：845-851，在此特别地将它们的全文通过引用作为参考。进一步见Lonberg与Kay的美国专利5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；以及5,770,429；Surani等人的美国专利5,545,807；Lonberg与Kay的PCT公开WO 92/03918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97/13852、WO 98/24884以及WO 99/45962；以及Korman等人的PCT公开WO 01/14424。还可以使用携带人类λ轻链基因的转基因小鼠，如Bruggemann的PCT公开号WO 00/26373中说明的那些转基因小鼠。例如，携带人类λ轻链的转基因小鼠可与携带人类重链转基因(如HCo7)并任选还携带人类κ轻链转基因(如KCo5)的小鼠进行杂交以产生同时携带人类重链转基因和轻链转基因的小鼠(参见，如实施例1)。
在另一个实施方案中，使用携带转基因及转染色体的人类免疫球蛋白序列的小鼠(例如，携带人类重链转基因及人类轻链转染色体的小鼠)可以生产本发明的人类抗体。这一小鼠在此称为“KM
Figure A20078005123100851
并且在Ishida等人的PCT公开WO 02/43478中有详细的说明。
再者，表达人类免疫球蛋白基因的可替代的转基因动物系统在本领域内是可以获得的，并且可以被用于生产本发明的抗-CD70抗体。例如，可以使用可替代的被称为Xenomouse(Abgenix公司)的转基因系统；此类小鼠说明于，例如Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584及6,162,963中。
此外，表达人类免疫球蛋白基因的可替代的转染色体动物系统在本领域内是可以获得的，并且可以用于生产本发明的抗-CD70抗体。例如，可以使用称作“TC小鼠”的同时携带人类重链转染色体和人类轻链转染色体的小鼠；这种小鼠说明于Tomizuka等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：722-727，(2000)中。此外，本领域中已经说明了携带人类重以及轻链转染色体的牛(Kuroiwa等人Nature Biotechnology 20：889-894(2002)和PCT申请WO 2002/092812)，并且可以用于生产本发明的抗-CD70抗体。
使用用于筛选人类免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法也可以制备本发明的人类单克隆抗体。此类用于分离人类抗体的噬菌体展示技术在本领域内是已经确定的。参见，例如Ladner等人的美国专利5,223,409；5,403,484；以及5,571,698；Dower等人的美国专利5,427,908以及5,580,717；McCafferty等人的美国专利5,969,108以及6,172,197；Griffiths等人的美国专利5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915以及6,593,081。
使用SCID小鼠也可以制备本发明的人类单克隆抗体，人类免疫细胞已被重构入SCID小鼠，使得免疫时可以产生人类抗体反应。此类小鼠例如在Wilson等人的美国专利5,476,996和5,698,767中有说明。
在另一个实施方案中，使用如Buechler等人的美国专利6,794,132中说明的人类Ig小鼠以及噬菌体展示技术的组合制备人类抗-CD70抗体。更确切地说，该方法首先包括通过用一种或多种CD70抗原对人类Ig小鼠(例如以上说明的HuMab小鼠或KM小鼠)进行免疫，在这些小鼠中产生抗-CD70抗体反应，随后从这些小鼠的淋巴细胞中分离编码人类抗体链的核酸，并将这些核酸导入展示载体(例如噬菌体)中以提供展示包装体(displaypackage)文库。由此，每个文库成员包含编码人类抗体链的核酸，并且每种抗体链通过展示包装体得到展示出来。然后用CD70蛋白筛选该文库以分离出与CD70特异性结合的文库成员。然后对所选的文库成员的核酸插入片段通过标准的方法进行分离并进行测序，以确定所选的CD70结合子的轻链和重链可变序列。通过标准的重组DNA技术可以将可变区转化成全长抗体链，这些技术例如，将可变区克隆进入携带人类重链及轻链恒定区的表达载体，使得VH区有效地连接至CH区，并且VL区有效地连接至CL区。
人类Ig小鼠的免疫接种
当人类Ig小鼠用于生产本发明的人类抗体时，用表达CD70的细胞系、CD70抗原和/或重组CD70的经纯化或者富集的制品或CD70融合蛋白可以对此类小鼠进行免疫，如Lonberg，N.等人(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.等人(1996)Nature Biotechnology 14：845-851；以及PCT公开号WO 98/24884以及WO 01/14424所说明。优选地，这些小鼠在初次输注时是6至16周龄。例如，可用CD70抗原的经纯化或重组的制备物(5至50μg)经腹膜内和/或皮下免疫人类Ig小鼠。
在以下实施例1中说明了用于产生结合CD70的全长人类单克隆抗体的详细方法。对多种抗原积累的经验显示在以下条件下转基因小鼠会应答：用在完全弗氏佐剂中的抗原进行腹腔内(IP)初始免疫，之后每隔一周在用不完全弗氏佐剂中的抗原进行IP免疫(至多共6次)。然而，除弗氏佐剂之外的其他佐剂也发现是有效的(例如RIBI佐剂)。另外，发现在不存在佐剂的情况下全细胞具有高度的免疫原性。在整个免疫过程中可以用眶后取血得到的血浆样品监测免疫应答。通过ELISA(如以下说明)可以筛选血浆，并且具有足够滴度的抗-CD70人类免疫球蛋白的小鼠可用于融合。例如，可以在处死并去除脾脏之前的3天，通过静脉内注射抗原对小鼠加强免疫。预期对每个免疫接种可能需要进行2至3次融合。每种抗原一般对6至24只小鼠进行免疫。经常使用HCo7与HCo12两个品系。HCo7和HCo12小鼠品系的产生分别说明于美国专利5,770,429和PCT公开WO01/09187的实施例2。另外，HCo7与HCo12两个转基因可以共同培育成单一的具有两种不同人类重链转基因的小鼠(HCo7/HCo12)。可替代的或另外的，如在PCT公开文件WO 02/43478中说明，可以使用KM
Figure A20078005123100871
品系。
产生本发明的人类单克隆抗体的杂交瘤的生成
为了生成产生本发明的人类单克隆抗体的杂交瘤，可以分离来自经免疫的小鼠的脾细胞和/或淋巴结细胞，并且将其融合至适合的永生化细胞系，例如小鼠骨髓瘤细胞系。针对抗原特异性抗体的产生可以对得到的杂交瘤进行筛选。例如，用50％PEG可以将来自经免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液与六分之一数量的P3X63-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)相融合。可替代地，使用基于电场的电融合方法，使用CytoPulse大腔细胞融合电穿孔仪(large chamber cell fusionelectroporator)(CytoPulse Sciences公司，Glen Burnie Maryland)，可以融合来自经免疫的小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液。将大约2×105的细胞培养于平底微量滴定板上，之后在选择性培养基中孵育一周：该培养基含有20％胚胎克隆血清(Clone Serum)、18％“653”条件培养液、5％origen(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0.055mM的2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素以及1×次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)培养基(Sigma；融合24小时后加入HAT)。大约2周后，可以将细胞培养于以HT替代HAT的培养基中。然后用ELISA针对人类单克隆IgM与IgG抗体对这些单个孔进行筛选。一旦出现杂交瘤的扩大生长，通常可以在10至14天后观察培养基。可以对分泌抗体的杂交瘤进行再接种，再筛选，并且如果它对人类IgG仍是阳性，则可以通过有限稀释将该单克隆抗体亚克隆至少2次。然后可以在体外培养稳定的亚克隆以便在组织培养基中产生少量抗体用于表征。
为了纯化人类单克隆抗体，可以让已选择的杂交瘤生长于两升的旋瓶中用于单克隆抗体纯化。可以对上清液进行过滤并浓缩，之后用蛋白A-琼脂糖(Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和层析。通过凝胶电泳及高效液相色谱可以检查被洗脱的IgG以确保纯度。可以将缓冲液换为PBS，且通过OD280使用1.43的消光系数确定其浓度。可以将单克隆抗体分成等份，并保存于-80℃下。
产生本发明的单克隆抗体的转染瘤的生成
使用例如本领域中熟知的重组的DNA技术及基因转染方法的结合，在宿主细胞转染瘤中也可以产生本发明的抗体(例如，Morrison，S.(1985)Science229：1202)。
例如，为了表达抗体或它们的抗体片段，通过标准的分子生物学技术(例如，使用对目的抗体进行表达的杂交瘤的PCR扩增或cDNA克隆)可以获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并且可将DNA插入至表达载体中，使得基因有效地连接至转录以及翻译的控制序列上。在此处，术语“有效地连接”旨在说明将抗体基因连接进入载体，以使载体中转录和翻译的控制序列起到其调节抗体基因的转录和翻译的预期功能。对表达载体及表达控制序列进行选择以便使其与所使用的表达宿主细胞相容。可以将抗体轻链基因与抗体重链基因插入至单独的载体中，或者更典型地，将两个基因均插入至相同的表达载体中。通过标准的方法将抗体基因插入至表达载体中(例如，连接抗体基因片段以及载体上的互补限制位点，或者如果不存在限制位点时进行平端连接)。可以通过以下方法将在此说明的抗体的轻链和重链可变区用于产生任何抗体同种型的全长抗体基因：将轻链和重链可变区插入至已经对希望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区进行编码的表达载体中，使得VH片段有效地连接至载体内的CH片段，并且将VK片段有效地连接至载体内的CL片段。另外地或可替代地，重组的表达载体可以编码信号肽，该信号肽有助于从宿主细胞中分泌抗体链。可以将抗体链基因克隆进入载体，使得信号肽以符合阅读框的方式连接至抗体链基因的氨基末端。该信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或者是异源的信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
本发明的重组表达载体除了携带抗体链基因之外，还携带在宿主细胞中控制这些抗体链基因表达的调节序列。术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子以及控制抗体链基因转录或翻译的其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。已经说明了此类调控序列，例如，在Goeddel(GeneExpression Technology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA(1990))中说明。本领域中的技术人员将会理解：表达载体的设计，包括调控序列的选择，可能依赖于此类因素，例如有待用于转化的宿主细胞的选择、所希望的蛋白质的表达水平等等。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平的蛋白质表达的病毒元件，例如衍生自巨细胞病毒(CMV)、猿病毒40(SV40)、腺病毒(如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))以及多瘤病毒的启动子和/或增强子。可替代地，可以使用非病毒调节序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。再者，调节元件由来自不同来源的序列组成，例如包含来自SV40早期启动子和I型人类T细胞白血病病毒的长末端重复的序列的SRα启动子系统(Takebe，Y.等人(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。
本发明的重组表达载体除了携带这些抗体链基因以及调节序列之外，还可能携带额外的序列，例如在宿主细胞中调节载体复制的序列(例如，复制原点)及可选择的标记物基因。可选的标记物基因促进其中已经导入载体的宿主细胞的选择(例如，参见均属于Axel等人的美国专利4,399,216、4,634,665以及5,179,017，)。例如，一般可选择的标记物基因赋予已导入载体的宿主细胞，对诸如G418、潮霉素或氨甲喋呤的药物的抗性。优选的可选择的标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主细胞中用于氨甲喋呤选择/扩增)以及neo基因(用于G418选择)。
为了轻链及重链的表达，通过标准技术将编码这些重链与轻链的表达载体转染进入宿主细胞中。术语“转染”的不同形式旨在涵盖范围宽广的多种技术，这些技术一般用于将外源DNA导入原核的或真核的宿主细胞，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染以及类似技术。虽然在理论上可以在原核宿主细胞或在真核宿主细胞中都表达本发明的抗体，但是在真核细胞中表达抗体，并且最优选在哺乳动物宿主细胞中表达是最优选的，因为该真核细胞，并且特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更有可能组装并分泌适当折叠且具有免疫活性的抗体。据报道，抗体基因的原核表达对于活性抗体的高产量的产生是无效的(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)Immunology Today 6：12-13)。
优选的用于表达本发明的重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，说明于Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220，使用DHFR可选择的标记物，例如在R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159：601-621中所说明)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞以及SP2细胞。特别地，对于使用NSO骨髓瘤细胞而言，另一个优选的表达体系是GS基因表达体系，该GS基因表达体系披露在WO 87/04462、WO 89/01036以及EP 338,841中。当编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过对宿主细胞培养一段时间可以产生抗体，该时间足以使抗体在该宿主细胞中得到表达，或者更优选地，使该抗体分泌进入宿主细胞生长的培养基中。使用标准的蛋白质纯化方法可以从培养基中回收抗体。
抗体结合抗原的表征
通过例如流式细胞术可以测试本发明抗体与CD70的结合。简言之，从组织培养瓶中新鲜收集表达CD70的细胞，并制备单细胞悬液。用第一抗体对表达CD70的细胞悬液进行直接染色，或者用含1％低聚甲醛的PBS液固定后再进行染色。将大约一百万个细胞重悬于含有0.5％BSA以及50至200μg/ml的第一抗体的PBS中，并在冰上孵育30分钟。将细胞用含有0.1％BSA、0.01％NaN3的PBS洗涤两次，重悬于100μl的以1∶100稀释的FITC偶联的山羊-抗-人类IgG抗体(Jackson ImmunoResearch，WestGrove，PA)中，并在冰上再孵育30分钟。再将细胞洗涤两次，重悬于0.5ml的洗涤缓冲液中，并在FACSCalibur细胞计数器(Becton-Dickinson，SanJose，CA)上分析荧光染色。
可替代地，通过标准ELISA可以测试本发明的抗体与CD70的结合。简言之，将微量滴定板用PBS中0.25μg/ml的经纯化的CD70蛋白进行包被，然后用PBS中5％的牛血清白蛋白进行封闭。在每个孔中加入稀释的抗体(例如来自CD70免疫小鼠的稀释的血浆)，并在37℃下孵育1至2小时。用PBS/吐温冲洗该板，并接着与偶联至碱性磷酸酶的第二试剂(例如，对于人类抗体而言，山羊-抗人类IgG Fc特异性多克隆试剂)在37℃孵育1小时。洗涤后，用pNPP底物(1mg/ml)对培养板进行显影，并在OD 405至650下进行分析。优选地，将形成最高滴度的小鼠用于融合。
如以上说明的ELISA测定也可用于筛选对CD70免疫原显示阳性反应的杂交瘤。对以高亲合力结合CD70的杂交瘤进行亚克隆并且进一步表征。可以选择一个来自每个杂交瘤的克隆(它保留亲本细胞的反应性(通过ELISA))用于制成5至10小瓶的细胞库，将其保存于-140℃下并用于抗体纯化。
为了纯化CD70抗体，可以让已选择的杂交瘤生长于两升的旋瓶中用于单克隆抗体纯化。可以将上清液进行过滤并浓缩，之后用蛋白A-琼脂糖(Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和层析。通过凝胶电泳及高效液相色谱可以检查经洗脱的IgG以确保纯度。可以将缓冲液换为PBS，且通过OD280使用1.43的消光系数确定其浓度。可以将单克隆抗体分成等份，并保存于-80℃下。
为了确定已选择的抗-CD70单克隆抗体是否结合至独特的表位，使用可商购的试剂(Pierce，Rockford，IL)可以对每种抗体进行生物素化。使用未标记的单克隆抗体以及生物素化的单克隆抗体的竞争性研究，可以使用以上说明的经CD70包被的ELISA板而进行。使用链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶探针可以检测生物素化的mAb的结合。可替代地，如以下实施例中进一步说明，可以使用经放射性标记的抗体进行竞争性研究，并用Scatchard分析来检测未标记的竞争性抗体。
为了确定经纯化的抗体的同种型，可以使用对特定同种型的抗体特异的试剂进行同种型ELISA。例如，为了测定人类单克隆抗体的同种型，可在4℃下用1μg/ml的抗人类免疫球蛋白包被微量滴定板的孔过夜。在用1％的BSA封闭后，这些培养板可与1μg/ml或更少的受试单克隆抗体或经纯化的同种型对照物在环境温度下反应一至两小时。随后将这些孔与人类IgG1或人类IgM-特异性的碱性磷酸酶偶联的探针进行反应。如以上说明对板进行显影并分析。
通过蛋白质印迹法可以进一步测试抗-CD70人类IgG与CD70抗原的反应性。简言之，可制备CD70并对其进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后将分开的抗原转移至硝酸纤维素膜上，用10％的胎牛血清进行封闭，并用待测试的单克隆抗体进行探测。人类IgG的结合可以用抗-人类IgG碱性磷酸酶进行检测并用BCIP/NBT底物片(Sigma Chem.公司，St.Louis，Mo.)进行显影。
也可以通过监测抗体与表达CD70蛋白的细胞的结合(例如通过流式细胞仪)，来确定本发明抗体的结合特异性。可使用天然表达CD70蛋白的细胞或细胞系，例如786-O、A498、ACHN、Caki-1、和/或Caki-2细胞(在实施例4与5中进一步说明)，或者可以用细胞系(例如CHO细胞系)可使用编码CD70的表达载体转染，使得CD70在该细胞的表面上表达。经转染的蛋白质可包含标签，例如myc-标签或his-标签，优选位于N-末端，其使用针对标签的抗体可得到检测。本发明的抗体与CD70蛋白的结合可以通过将经转染的细胞与抗体进行孵育，检测所结合的抗体而进行确定。可将抗体与经转染蛋白上的标签的结合用作阳性对照。
双特异性分子
在另一方面，本发明的特征在于包括本发明的抗-CD70抗体或其片段的双特异性分子。本发明的抗体或其抗原结合部分可被衍生化或与另一个功能分子相连接，例如与另一个肽或蛋白质(例如，另一种抗体或受体的配体)相连接，以生成结合至少两种不同结合位点或靶分子的双特异性分子。事实上，本发明的抗体可被衍生化或连接至其他多于一个的功能分子，以生成结合到多于两种的不同结合位点和/或靶分子的多特异性分子；在此所用的术语“双特异性分子”也旨在涵盖此类多特异性分子。为了产生本发明的双特异性分子，可将本发明的抗体与一个或多个其他的结合分子(例如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物)功能性地连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价连接或其他方式)，由此得到双特异性分子。
因此，本发明还包括双特异性分子，该双特异性分子包含针对CD70的至少一种第一结合特异性以及针对第二靶标表位的第二结合特异性。在本发明的一个具体的实施方案中，第二靶标表位是Fc受体，例如人类FcγRI(CD64)或人类Fcα受体(CD89)。因此，本发明包括的双特异性分子既能够结合至表达FcγR或FcαR的效应细胞(例如单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))，又能够结合表达CD70的靶细胞。这些双特异性分子将表达CD70的细胞靶向至效应细胞，并触发Fc受体介导的效应细胞的活性，例如，表达CD70的细胞的吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子的释放或超氧化物负离子的生成。
在本发明的一个实施方案(其中该双特异性分子是多特异性的)中，该分子除了包括抗-Fc结合特异性及抗-CD70结合特异性外，能进一步包括第三结合特异性。在一个实施方案中，第三结合特异性是抗增强因子(EF)部分，例如，结合至涉及细胞毒素活性的表面蛋白质上的分子并，由此增强针对靶细胞的免疫应答。“抗增强因子部分”可以是抗体、功能抗体片段或结合至给定分子(如抗原或受体)上的配体，并由此导致对于Fc受体或靶细胞抗原的结合决定簇的增强的作用。“抗增强因子部分”可以结合Fc受体或靶细胞抗原。可替代地，抗增强因子部分可以结合实体，该实体不同于第一及第二结合特异性结合的实体。例如，抗增强因子部分可结合细胞毒性T细胞(如，经CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或其他免疫细胞，导致针对靶细胞的免疫应答的增强)。
在一个实施方案中，由于其结合特异性，本发明的双特异性分子包括至少一种抗体或它的抗体片段，包括，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fd、dAb或单链Fv。抗体还可以是轻链或重链二聚物，或是其任何最小片段，如Fv或单链构建物，如在Ladner等人的美国专利4,946,778中所说明，其内容通过明确引用而作为参考。
在一个实施方案中，针对Fcγ受体的结合特异性由单克隆抗体提供，其结合并未被人类免疫球蛋白G(IgG)所阻断。在此使用的术语“IgG受体”是指在染色体1上的八个γ-链基因中的任何。这些基因编码总共十二个跨膜或可溶的受体同种型，这些同种型分成三种Fcγ受体类型：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)以及FcγRIII(CD16)。在一个优选的实施方案中，Fcγ受体是人类高亲合性FcγRI。该人类FcγRI是72kDa的分子，它对单体IgG具有高亲合性(108至109M-1)。
在Fanger等人的PCT公开文件WO 88/00052及美国专利4,954,617中说明了某些优选抗-Fcγ单克隆抗体的制备及表征，其中传授的内容都通过引用全部结合在此。这些抗体结合FcγI、FcγII或FcγIII的表位的位点区别于受体的Fcγ结合位点，并因此它们的结合基本上不会被生理水平的IgG所阻断。在本发明中有用的特异性抗-FcγRI抗体是mAb 22、mAb32、mAb44、mAb62以及mAb197。产生mAb32的杂交瘤可以获自美国典型培养物保存中心，ATCC登录号为HB9469。在其他实施方案中，抗Fcγ受体抗体是单克隆抗体22的人源化形式(H22)。在Graziano R.F.等人(1995)J.Immunol 155(10)：4996-5002以及PCT公开文件WO 94/10332中说明了H22抗体的生产以及表征。产生H22抗体的细胞系被命名为HA022CL1，保藏于美国典型培养物保藏中心，且登录号为CRL 11177。
在另外的其他优选实施方案中，对Fc受体的结合特异性是由结合至人类IgA受体的抗体提供，该人类IgA受体例如是Fc-α受体(FcαRI(CD89))，这种结合优选不会被人类免疫球蛋白A(IgA)所阻断。术语“IgA受体”旨在包括位于染色体19上的一个α基因的基因产物(FcαRI)。已知这一基因编码几个55到110kDa的可变剪切跨膜同种型。FcαRI(CD89)在单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性粒细胞以及嗜中性粒细胞中组成型表达，但在非效应细胞群中不表达。FcαRI对于IgA1和IgA2均具有中等亲合力(≈5×107M-1)，在暴露至细胞因子例如G-CSF或GM-CSF时该亲合力会增加(Morton，H.C.等人(1996)Critical Reviews inImmunology 16：423-440)。已经公开了鉴定为A3、A59、A62以及A77的四种FcαRI特异性的单克隆抗体，它们在IgA配体结合结构域外结合FcαRI(Monteiro，R.C.等人(1992)J.Immunol.148：1764)。
FcαRI及FcγRI是优选的用于本发明双特异性分子中的触发受体，因为它们：(1)主要表达在免疫效应细胞(例如单核细胞、PMN、巨噬细胞以及树突细胞)上；(2)高水平表达(例如5,000至100,000/细胞)；(3)细胞毒性活性的介导物(例如ADCC、吞噬作用)；以及(4)介导靶向它们的抗原(包括自体抗原)的增强的抗原呈递。
虽然人类单克隆抗体是优选的，但是在本发明的双特异性分子中所能采用的其他抗体是鼠类、嵌合以及人源化单克隆抗体。
使用本领域中已知的方法通过偶联组成性结合特异性(例如，抗-FcR及抗-CD70的结合特异性)可以制备本发明的双特异性分子。例如，双特异性分子的每种结合特异性可以单独生成，然后将彼此偶联。当结合特异性是蛋白质或肽时，可以使用多种偶联试剂或交联试剂来进行共价偶联。交联试剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5，5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻-亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)及4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)(参见，例如，Karpovsky等人(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他的方法包括那些说明于Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78，118-132；Brennan等人(1985)Science 229：81-83)；以及Glennie等人(1987)J.Immunol.139：2367-2375的方法。优选的偶联试剂是SATA及磺基-SMCC，二者都可从Pierce Chemical公司(Rockford，IL)购得。
当这些结合特异性是抗体时，它们可以通过两个重链的C末端铰链区的巯基键相偶联。在特别优选的实施方案中，在偶联之前对铰链区进行修饰，使其含有奇数个巯基残基，优选含有一个巯基残基。
可替代地，两种结合特异性均可以在相同载体中得到编码并在同一宿主细胞中得到表达和组装。当双特异性分子是mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab’)2或配体×Fab融合蛋白时，这一方法特别有用。本发明的双特异性分子可以是包括一种单链抗体及结合决定簇的单链分子，或包括两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可含有至少两种单链分子。制备双特异性分子的方法公开在例如美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；以及美国专利号5,482,858，所有这些内容通过引用明确地结合在此。
双特异性分子结合至它们的特异性靶可以通过下列方法来确认，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)或蛋白质印迹分析。这些测定中的每一种通常都是通过采用对目的复合物特异的经标记试剂(例如，抗体)，检测特定目的蛋白质-抗体复合物的存在。例如，可以使用例如识别并且特异性结合至抗体-FcR复合物的酶联抗体或抗体片段来检测FcR-抗体复合物。可替代地，使用多种其他免疫测定中的任何一种可以检测这些复合物。例如，抗体可被放射性标记，并用于放射免疫测定(RIA)中(参见例如，Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course onRadioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，March，1986，它通过引用结合在此)。通过诸如γ计数器或闪烁计数器或通过放射自显影的手段可检测放射性同位素。
连接物
本发明提供了抗体-配偶体偶联物，其中抗体通过化学连接物连接到配偶体上。在某些实施方案中，连接物为肽基连接物，并且在此描述为(L4)p-F-(L1)m。其他的连接物包括肼连接物和二硫化物连接物，并在此被分别描述为(L4)p-H-(L1)m或(L4)p-J-(L1)m。除了连接于配偶体的连接物之外，本发明也提供了适用于连接于基本上任何分子种类的可剪切的连接臂。本发明的连接臂方面在此通过参照它们所连接的治疗部分进行举例说明。然而，对本领域中技术人员来说很明显，这些连接物可以连接于多个种类，包括但不局限于，诊断试剂、分析试剂、生物分子、靶向试剂、可检测的标记以及类似物。
在抗体-配偶体偶联物中肽基以及其他连接物的使用说明于美国临时专利申请系列号60/295,196；60/295,259；60/295342；60/304,908；60/572,667；60/661,174；60/669,871；60/720,499；60/730,804；以及60/735,657，以及美国专利申请系列号10/160,972；10/161,234；11/134,685；11/134,826；以及11/398,854；以及美国专利号6,989,452以及PCT专利申请号PCT/US2006/37793，其所有内容均通过引用结合在此。
其他的连接物说明于美国专利号6,214,345(Bristol-Myers Squibb)、美国专利申请2003/0096743以及美国专利申请2003/0130189(这二者均属于Seattle Genetics)，de Groot等人，J.Med.Chem.42，5277(1999)；deGroot等人J.Org.Chem.43，3093(2000)；de Groot等人，J.Med.Chem.66，8815，(2001)；WO 02/083180(Syntarga)；Carl等人，J.Med.Chem.Lett.24，479，(1981)；Dubowchik等人，Bioorg & Med.Chem.Lett.8，3347(1998)；以及60/891,028(于2007年2月21日提交)。
一方面，本发明涉及用于将靶向基团连接于治疗剂以及标记物的连接物。另一方面，本发明提供了连接物，这些连接物赋予化合物稳定性、减小它们的体内毒性或者另外有利地影响它们的药物代谢动力学、生物利用度和/或药效学。通常以下情况是优选的：在此类实施方案中，一旦将药物输送至它的作用部位，连接物即受到剪切，释放该活性药物。因此，在本发明的一个实施方案中，本发明的连接物是无痕迹的，使得一旦连接物从治疗剂或标记物中去除时(例如在活化期间)，不留下连接物存在的痕迹。
在本发明的另一个实施方案中，连接物的特征在于它们在靶细胞位点或临近靶细胞处(例如在治疗作用位点或标记物活性位点)得到剪切的能力。这种剪切本质上可以是酶促性的。这一特性有助于降低治疗剂或标记物的系统激活作用、降低毒性以及系统副作用。用于酶促剪切的优选可剪切基团包括肽键、酯连接物以及二硫化物连接物。在其他的实施方案中，这些连接物对pH敏感，并通过改变pH而得到剪切。
本发明一个重要方面是控制连接物剪切速度的能力。快速剪切的连接物经常是所希望的。然而，在一些实施方案中，可能优选剪切较慢的连接物。例如，在缓释制剂或同时具有快速释放成分以及慢速释放成分的制剂中，提供较慢剪切的连接物可能是有用的。WO 02/096910提供了几种具有肼连接物的特异的配体-药物复合物。然而，没有办法根据所需要的环化速度来“调节”连接物组成，并且所说明的特定化合物以慢于许多药物-连接物偶联物所优选的速度从该药物上剪切该配体。相比之下，本发明的肼连接物提供了从很快到很慢的环化速度范围，从而允许基于所希望的环化速度挑选特定的肼连接物。
例如，使用在剪切时产生单一5元环的肼连接物可以实现非常快的环化作用。用于将细胞毒素试剂靶向传递到细胞的优选环化速度，可使用在剪切时产生来自在偕位置具有两个甲基的连接物的两个5元环或一个6元环的肼连接物而实现。已显示，与在偕位置没有这两个甲基的单一6元环相比，该偕-二甲基(gem-dimetyl)效应加快了环化反应的速度。这是因为应力在环中得以释放。然而有时，取代基可能减慢反应速度而不是使它变快。通常延迟发生的原因可追溯至位阻。例如，与偕碳为CH2时相比，偕-二甲基取代使环化反应发生得更快。
然而，重要的是应注意，在一些实施方案中，剪切较慢的连接物可以是优选的。例如，在缓释制剂或同时具有快速释放成分以及慢速释放成分的制剂中，提供剪切较慢的连接物是有用的。在某些实施方案中，使用肼 连接物实现慢速环化，一旦切割肼连接物，将产生没有该偕二甲基取代的 单个6元环或单个7元环。
这些连接物也用于在循环中稳定治疗剂或标记物，防止其降解。这一特性提供了重要的有利因素，因为这种稳定作用导致所连接的试剂或标记物的循环半衰期延长。连接物也可用于减弱所连接的试剂或标记物的活性，使得偶联物在循环时相对为良性，并且在所希望的作用位点激活后具有所需要的效应，例如具有细胞毒性。对于治疗剂偶联物而言，连接物这一特点用于改善试剂的治疗指数。
优选选择稳定化基团，以限制由可能存在于血液或者非标靶组织中的酶对治疗剂或标记物的清除及代谢；并且进一步选择该稳定化基团，以限制试剂或者标记物转运进入细胞中。这些稳定化基团用于阻止试剂或者标记物的降解，并且也可能在提供该试剂或标记物的其他物理特性中发挥作用。稳定化基团也可改善以经配置或未经配置形式贮藏的试剂或标记物的稳定性。
理想情况下，稳定化基团对于稳定治疗剂或标记物是有用的，条件是该稳定化基团所起的作用是在通过将治疗剂或标记物在人类血液中于37℃贮藏2小时而进行测试时保护了该治疗剂或标记物免于降解、并且导致了在给定的测定条件下由存在于人类血液中的酶对该治疗剂或标记物的少于20％，优选少于10％，更优选少于5％以及甚至更优选少于2％的剪切。
本发明还涉及含有这些连接物的偶联物。更具体而言，本发明涉及前体药物的使用，它可用于疾病的治疗，特别是用于癌症的化学治疗。确切地说，使用在此说明的连接物提供了多种前体药物，相对于具有相似结构的前体药物而言，其展示出高的作用特异性、降低的毒性以及在血液里改进的稳定性。
在此说明的本发明连接物可位于配偶体分子的不同位置。
因此，提供连接物，它可包含作为其链一部分的多种基团的任何，相对于缺乏此类基团的构建体来说，这些基团在体内(例如，在血流中)剪切的速率会增强。也提供了连接臂与治疗剂以及诊断试剂的的偶联物。这些连接物对于形成治疗剂的前体药物类似物是有用的，并且对可逆地将治疗剂或诊断试剂连接到靶向药剂、可检测的标记或固相载体是有用的。连接物可整合进入包括细胞毒素的复合体中。
前体药物与抗体的连接可能带来另外的超过常规细胞毒素药物的抗体偶联物的安全优势。在肿瘤细胞以及在几种正常的组织(包括血浆)内，均可用酯酶完成前体药物的激活。已经表明人类中相应酯酶的活性水平虽然比在小鼠中观察到的小，但与在大鼠和非人类的灵长类动物中观察到的很相似。前体药物的激活也可通过葡糖醛酸糖苷酶剪切而完成。
除了可剪切的肽、肼或二硫化物基团之外，一个或多个自消(self-immolative)连接物基团L1可任选地引入到细胞毒素和靶向试剂之间。这些连接物基团也可被说明为间隔基团，并且包含至少两个反应性官能团。一般，间隔基团的一个化学官能团键合治疗剂(例如细胞毒素)的化学官能团上，而该间隔基团的其他化学官能团用于键合靶向试剂或者可剪切的连接物的化学官能团。间隔基团的化学官能团的实例包括羟基、巯基、羰基、羧基、氨基、酮基以及巯基基团。
自消连接物，由L1代表，一般是取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基或取代或未取代的杂烷基。在一个实施方案中，该烷基或芳基基团可包含1至20个碳原子。它们也可能包含聚乙二醇部分。
示例性的间隔基团包括，例如6-氨基己醇、6-巯基己醇、10-羟基癸酸、甘氨酸以及其他氨基酸、1，6-己二醇、β-丙氨酸、2-氨基乙醇、半胱胺(2-氨基乙硫醇)、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、3-马来酰亚胺基苯甲酸、2-苯并呋喃酮、α-取代的2-苯并呋喃酮、羰基基团、动物酯、核酸、肽以及类似物。
间隔物可以用于引导另外的分子质量以及化学官能团进入该细胞毒素-靶向试剂复合物。通常，另外的质量和官能团将影响该复合物的血清半衰期和其他特性。因此，通过仔细选择间隔基团，可以产生血清半衰期在一定范围内的细胞毒素复合物。
位于与药物部分直接相邻的位置的间隔物也表示为(L1)m，其中m是选自0、1、2、3、4、5以及6的整数。当多个L1间隔物存在时，可使用相同的或者不同的间隔物。L1可能是任何自消基团。
L4是连接物部分，利用包含该部分或改变偶联物的水解速率的连接物，它优选地赋予偶联物增大的溶解性或减小的聚集特性。L4连接物并非必须是自消的。在一个实施方案中，L4部分是取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂烷基或未取代的杂烷基，这些基团的任一个可能是直链、支链或环状的。取代基可能是例如低级(C1-C6)烷基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基或者二烷基氨基。在某些实施方案中，L4包括非环状部分。在另一个实施方案中，L4包括任何带正电或负电的氨基酸聚合物，例如聚赖氨酸或聚精氨酸。L4可包括诸如聚乙二醇部分的聚合物。另外，L4连接物可以包括例如多聚体成分以及小分子化学部分两者。
在一个优选的实施方案中，L4包括聚乙二醇(PEG)部分。L4的PEG部分长度可以是1到50个单元。优选地，PEG具有1到12个重复单元，更优选3到12个重复单元，更优选2到6个重复单元，或甚至更优选3到5个重复单元，并最优选4个重复单元。L4可仅仅由PEG部分组成，或者它也可包括其他取代或未取代的烷基或杂烷基。将PEG作为L4部分的一部分进行组合可以用于提高复合物的溶解度。另外，PEG部分在药物与抗体偶联时降低了可能发生的聚集。
在一些实施方案中，L4包括直接连接于(AA1)c的N末端的
Figure A20078005123101011
R20是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基以及酰基的成员。R25、R25’、R26以及R26’各自均独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基以及取代或未取代的杂环烷基；并且s和t独立地是从1至6的整数。优选地，R20、R25、R25’、R26以及R26’是疏水性的。在一些实施方案中，R20是H或烷基(优选未取代的低级烷基)。在一些实施方案中，R25、R25’、R26以及R26’独立地是H或烷基(优选未取代的C1-C4烷基)。在一些实施方案中，R25、R25’、R26以及R26’均为H。在一些实施方案中，t是1并且s是1或2。
肽连接物(F)
如以上讨论，本发明的肽基连接物可用通式(L4)p-F-(L1)m表示，其中F表示包含肽基部分的连接物部分。在一个实施方案中，F部分包括任选的另外的自消连接物，L2以及羰基基团。在另一个实施方案中，F部分包括氨基以及任选的间隔基团L3。
因此，在一个实施方案中，包含肽基连接物的偶联物含有下式(a)的结构：
Figure A20078005123101021
在这一实施方案中，L1是如以上说明的自消连接物，并且L4是如以上说明的优选赋予增强的溶解度或减少的聚集特性或改变水解速率的部分。L2表示自消连接物。此外，m是0、1、2、3、4、5或6；并且o和p独立地是0或1。AA1表示一个或多个天然氨基酸、和/或非天然α-氨基酸；c是从1到20的整数。在一些实施方案中，c在2到5的范围内或c是2或3。
在本发明的具有上式(a)的肽连接物中，AA1在它的氨基末端直接与L4连接或，当L4不存在时直接与X4基团(即靶向试剂、可探测的标记、受保护的反应官能团或未受保护的反应官能团)连接。在一些实施方案中，当L4存在时，L4不含直接连接于(AA1)c的N末端的羧基酰基基团。因此，在这些实施方案中，不必存在直接在L4或X4与AA1之间的羧基酰基单位，而在美国专利号6,214,345的肽连接物中则是必需的。
在另一个实施方案中，含肽基连接物的偶联物包括下式(b)的结构：
Figure A20078005123101031
在这一实施方案中，L4是如以上说明的优选地赋予增加的溶解度或减少的聚集特性或改变水解速率的部分；L3是间隔基团，包含伯胺、仲胺或羧基官能团，并且L3的胺与D的侧羧基官能团形成酰胺键或者L3的羧基与D的侧胺基官能团形成酰胺键；并且o和p独立地为0或1。AA1表示一或多个天然氨基酸，和/或非天然α-氨基酸；c是从1到20的整数。在这个实施方案中，不存在L1(即m在该通式中为0)。
在本发明的具有上式(b)的肽连接物中，AA1在它的氨基末端直接与L4连接或，当L4不存在时，直接与X4基团(即靶向试剂、可检测的标记、受保护的反应官能团或未受保护的反应官能团)连接。在一些实施方案中，当L4存在时，L4不含直接连接于至(AA1)c的N末端的羧基酰基基团。因此，在这些实施方案中，不必存在直接在L4或X4与AA1之间的羧基酰基单位，而它在美国专利6,214,345的肽连接物中是必需的。
自消连接物L2
自消连接物L2是双官能化学部分，它能将两个间隔的化学部分共价连接成通常稳定的三节分子(tripartate molecule)，通过酶剪切从该三节分子释放所述间隔的化学部分中的一个；并在所述酶剪切之后，从该分子的其余部分中自发剪切而释放所述间隔的化学部分中的另一个。根据本发明，自消间隔物在其一端与肽部分共价连接，并在其另一端与药物部分的化学反应位点共价连接，该药物部分的衍生化抑制了药理学活性，以便间隔将肽部分以及药物部分共价连接成三节分子，该分子在靶酶不存在的情况下是稳定的并且无药理活性，但该分子可在共价连接间隔物部分与肽部分的键上通过此类靶酶而得到酶促剪切，由此使肽部分从该三节分子中释放。反过来，这种酶促剪切将激活间隔物部分的自消性质，并引发共价连接间隔物部分与药物部分的键的自发断裂，由此影响药理学上为活性形式的药物的释放。
自消连接物L2可是任何自消基团。优选L2是取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、未取代的杂环烷基、取代的杂环烷基、取代的以及未取代的芳基、及取代的和未取代的杂芳基。
一个特别优选的自消间隔物L2可由化学式(c)表示：
Figure A20078005123101041
氨基苄基基团的芳环可由一个或多个“K”基团取代。“K”基团是该芳环上的取代基，它替换了原本连接在为环结构一部分的四个未取代碳原子之一上的氢。“K”基团可是单一原子，例如卤原子，或可是多原子基团，例如烷基、杂烷基、氨基、硝基、羟基、烷氧基、卤烷基以及氰基。每个K均独立地选自：取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR21R22、NR21COR22、OCONR21R22、OCOR21以及OR21，其中R21和R22独立地选自：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基以及未取代的杂环烷基。示例性K取代基包括但不限于F、Cl、Br、I、NO2、OH、OCH3、NHCOCH3、N(CH3)2、NHCOCF3以及甲基。对于“Ki”，i是0、1、2、3或4中的一个整数。在一个优选的实施方案中，i是0。
以上显示结构的醚氧原子与羰基相连。从NR24官能团进入芳环的线表示胺功能团可键合至5个碳的任何一个，这5个碳都形成环、并且未被-CH2-O-基团取代。优选地，X的NR24官能团在相对于-CH2-O-基团的对位与芳环共价结合。R24选自：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基以及未取代的杂烷基。在一个具体的实施方案中，R24是H。
在一个实施方案中，本发明提供上式(a)的肽连接物，其中F包含以下结构：
Figure A20078005123101051
其中，R24选自：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基以及未取代的杂烷基。每个K均是独立地选自下组的成员：取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR21R22、NR21COR22、OCONR21R22、OCOR21以及OR21，其中R 21 和R 22 独立地选自：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂 烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未 取代的杂芳基、取代的杂环烷基、以及未取代的杂环烷基，并且i是整数 0、1、2、3或4。
在另一个实施方案中，具有上式(a)的肽连接物包含-F-(L1)m-，它含有以下结构：
Figure A20078005123101052
其中，每一个R24均是选自下组的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、以及未取代的杂烷基。
在一些实施方案中，自消间隔L1或L2包括：
Figure A20078005123101061
其中R17、R18、以及R19各自均独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及取代或未取代的芳基，并且w是从0到4的整数。在一些实施方案中，R17和R18独立地是H或烷基(优选未取代的C1-4烷基)。优选地，R17和R18是C1-C4烷基，如甲基或乙基。一些实施方案中，w是0。尽管不希望被任何特定的理论束缚，已经有实验发现，这个特定的自消间隔成环速度相对较快。
在一些实施方案中，L1或L2包括：
Figure A20078005123101062
间隔基团L3
间隔基团L3的特征在于它包括伯胺或仲胺或羧基官能团，并且L3基团的胺与D的侧羧基官能团形成酰胺键，或者L3的羧基与D的侧胺官能团形成酰胺键。L3可选自：取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基或取代或未取代的杂环烷基。在一个优选的实施方案中，L3包含芳香族基团。更优选地，L3包括苯甲酸基团、苯胺基团或吲哚基团。用作-L3-NH-间隔的结构的非限制性实例包括以下结构：
其中Z是选自O、S和NR23的成员，并且其中R23是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员。
切割本发明包含L3的连接物时，L3部分仍然连接在药物D上。因此，选择L3部分，使得它连接到D的存在不会显著地影响D的活性。在另一个实施方案中，药物D的一部分本身起L3间隔的功能。例如，在一个实施方案中，药物D是多卡米星(duocarmycin)的衍生物，其中药物的一部分起L3间隔的作用。此类实施方案的非限制性实例包括那些实例，其中NH2-(L3)-D具有选自如下的结构：
Figure A20078005123101081
以及
Figure A20078005123101082
其中，Z是选自O、S、以及NR23的成员，其中R23是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员；并且其中各个结构上的NH2基团与(AA1)c进行反应形成-(AA1)c-NH-。
肽序列AA1
基团AA1表示单个氨基酸或由酰胺键连接到一起的多个氨基酸。这些氨基酸可能是天然氨基酸和/或非天然α-氨基酸。
肽序列(AA1)c在功能上是单个氨基酸(c＝1时)或通过酰胺键连接在一起的多个氨基酸的酰胺化残基。选择本发明的肽用于在生物系统中在目的位置指导酶进行的肽的酶催化切割。例如，对于使用靶向试剂被靶向至细胞但是并未被该细胞内化的偶联物，选择肽，通过可以存在于细胞外基质中的一种或多种蛋白酶(例如由于附近濒于死亡的细胞释放的细胞内物质)对该肽进行剪切，使得该肽在细胞外得到剪切。在肽中氨基酸的数目可在从1到20的范围内变化；但是更优选(AA1)c包含1至8个氨基酸、1至6个氨基酸或1、2、3或4个氨基酸。容易被特定的酶或酶类切割的肽序列在本领域是已经熟知的。
许多被血清、肝、肠等中的酶切割的肽的序列在本领域是已知的。本发明的示例性肽序列包括被蛋白酶切割的肽序列。以下关于蛋白酶敏感序列的用途的讨论的中心是为了阐述的清晰性，并不用于限制本发明的范围。
当切割肽的酶是蛋白酶时，连接物一般包括包含蛋白酶切割识别序列的肽。蛋白酶的切割识别序列是在蛋白水解切割过程中被蛋白酶所识别的特定的氨基酸序列。许多蛋白酶切割位点在本领域中是已知的，并且这些以及其他切割位点可以包括在连接物部分中。见，例如Matayoshi等人Science 247：954(1990)；Dunn等人Meth.Enzymol.241：254(1994)；Seidah等人Meth.Enzymol.244：175(1994)；Thornberry，Meth.Enzymol.244：615(1994)；Weber等人Meth.Enzymol.244：595(1994)；Smith等人Meth.Enzymol.244：412(1994)；Bouvier等人Meth.Enzymol.248：614(1995)，Hardy等人，in Amyloid Protein Precursor in Development，Aging，and Alzheimer′s Disease，ed.Masters等人pp.190-198(1994)。
基于肽序列(AA1)c的氨基酸对于由特定分子(例如肿瘤相关蛋白酶)进行选择性酶切的适宜性，对肽序列(AA1)c的氨基酸进行选择。所用的氨基酸可以是天然或非天然氨基酸。它们可能是L或D构型。在一个实施方案中，使用了至少三种不同的氨基酸。在另一个实施方案中，仅仅使用了两种氨基酸。
在一个优选的实施方案中，选择肽序列(AA1)c是基于它被溶酶体蛋白酶剪切的能力，这些蛋白酶的非限制性实例包括组织蛋白酶B、C、D、H、L、以及S。优选地，该肽序列(AA1)c在体外能被组织蛋白酶B切割，这可以使用本领域已知的体外蛋白酶切割测定法进行测试。
在另一个实施方案中，选择肽序列(AA1)c是基于它被肿瘤相关蛋白酶剪切的能力，该蛋白酶例如在肿瘤细胞附近细胞外发现的蛋白酶，其非限制性实例包括甲拌磷寡肽酶(TOP)和CD10。肽能被TOP或CD10切割的能力可用本领域已知的体外蛋白酶切割测定法进行测试。
适宜在本发明的偶联物中使用的适宜的但非限制性的肽序列实例包括Val-Cit、Cit-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：77)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：78)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ.ID NO：79)、Val-Ala，Leu-Leu-Gly-Leu(SEQ ID NO：91)、Leu-Asn-Ala、以及Lys-Leu-Val。优选的肽序列是Val-Cit和Val-Lys。
在另一个实施方案中，位于与药物部分最近位置的氨基酸选自：Ala、Asn、Asp、Cit、Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、以及Val。在又一个实施方案中，位于与药物部分最近位置的氨基酸选自：Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、以及Val。
蛋白酶与癌症转移有关。蛋白酶尿激酶合成的增加在许多癌症中与转移能力的增加相关。尿激酶将纤溶酶原激活为纤溶酶，纤溶酶原在细胞外间隙中广泛存在，并且其激活作用导致细胞外基质中的蛋白降解，由此转移性肿瘤细胞侵入。纤溶酶也可以激活胶原酶，因此促进在围绕毛细管以及淋巴系统的基底膜中胶原的降解，由此允许肿瘤细胞侵入到靶组织中(Dano，等人Adv.Cancer.Res.，44：139(1985))。因此，使用通过尿激酶剪切的肽序列作为连接物也在本发明的范围内。
本发明也提供对类胰蛋白酶切割敏感的肽序列的用途。人类的肥大细胞表达至少四种不同的类胰蛋白酶，被称作α、βI、βII、以及βIII。这些酶不受血浆蛋白酶抑制剂控制，并且仅在体外切割一些生理学底物。丝氨酸蛋白酶的类胰蛋白酶家族与涉及肥大细胞的多种过敏性疾病以及炎性疾病有关，因为在患有这些病症的患者的生物液体里发现了类胰蛋白酶水平升高。然而，仍需要对类胰蛋白酶在疾病的病理生理学中的确切作用进行描绘。类胰蛋白酶的生物学功能的范围以及相应的生理学结果基本上由它们的底物特异性限定。
类胰蛋白酶是前-尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)的有效激活剂，uPA是与肿瘤转移以及侵入有关的蛋白酶的酶原形式。纤溶酶原级联反应的激活(导致细胞外基质的破坏而产生细胞外渗以及迁移)可以是在Pro-Arg-Phe-Lys的P4-P1序列(SEQ ID NO：80)上类胰蛋白酶激活前-尿激酶纤溶酶原激活物的函数(Stack等人Journal of BiologicalChemistry 269(13)：9416-9419(1994))。血管活性肠肽(一种神经肽，与血管透性的调控有关)也被类胰蛋白酶切割，主要在Thr-Arg-Leu-Arg(SEQ.ID NO：81)序列处切割(Tam，等人，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.3：27-32(1990))。G-蛋白偶联受体PAR-2可在Ser-Lys-Gly-Arg(SEQ.IDNO：82)序列上被类胰蛋白酶剪切并被激活，以促进成纤维细胞的增殖，而凝血酶激活受体PRA-1在Pro-Asn-Asp-Lys(SEQ.ID NO：83)序列上被类胰蛋白酶失活(Molino等人，Journal of Biological Chemistry 272(7)：4043-4049(1997))。综合在一起，这一证据提示类蛋白激酶在疾病导致的组织重塑中起核心作用。这与在几个肥大细胞介导的病症中观察到的深刻变化一致。慢性哮喘以及其他长期呼吸道疾病的特点是下面组织(underlying tissue)的纤维化以及增厚，这可能是类胰蛋白酶激活其生理学靶标的结果。类似地，一系列报道已经表明血管生成与多种癌症中的肥大细胞密度、类胰蛋白酶活性、以及不良的预后有关(Coussens等人，Genesand Development 13(11)：1382-97(1999))；Takanami等人，Cancer 88(12)：2686-92(2000)；Toth-Jakatics等人，Human Pathology 31(8)：955-960(2000)；Ribatti等人，International Journal of Cancer 85(2)：171-5(2000))。
本领域已知评价特定的蛋白酶是否切割已选择的肽序列的方法。例如，使用7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)荧光肽底物是确定蛋白酶特异性的已很好确立的方法(Zimmerman，M.等人，(1977)Analytical Biochemistry78：47-51)。N-酰苯胺键(anilide bond)的特异性切割释放荧光AMC离去基团，允许对各个底物的切割速率进行简单测定。近来，通过在单个实验中对宽范围的底物进行取样，可采用AMC肽底物文库的阵列(Lee D.等人(1999)Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9：1667-72)和位置扫描(positional-scanning)文库(Rano T.A.等人(1997)Chemistryand Biology 4：149-55)快速描绘蛋白酶的N末端的特异性。因此，本领域中的技术人员可容易地评定肽序列的阵列，以确定它们在本发明中的效用，而不用采取过度的实验。
本发明的抗体-配偶体偶联物可任选地包含两个或两个以上连接物。这些连接物可以相同或不同。例如，肽基连接物可用于将药物连接到配体上，并且第二肽基连接物可将诊断试剂连接到复合体上。另外的连接物的其他用途包括将分析试剂、生物分子、靶向试剂、以及可检测标记连接到抗体-配偶体复合体。
同样在本发明范围之内的是本发明的化合物，它们是多价的种类，包括，例如，诸如本发明化合物或其反应性类似物的二聚体、三聚体、四聚体或更高的同系物。多价的种类可由本发明的单一种类或多于一个种类装配而成。例如，二聚体构建体可为“均二聚体”或者“异二聚体”。此外，多价的构建体，其中本发明的化合物或者其反应类似物连接到寡聚或者多聚构架上(例如聚赖氨酸、葡聚糖、羟乙基淀粉、以及类似物)也是在本发明的范围内，该构架优选是多官能的(即，具有一批用于连接本发明化合物的反应性位点)。此外，该构架可用本发明的单一种类或本发明的多于一个的种类进行衍生。
此外，本发明包括多种化合物，这些化合物相对于没有类似地被官能化的类似化合物而言，被官能化以产生具有增强了的水溶解度的化合物。因此，在此给出的取代基中的任何取代基可被类似的具有增强了的水溶性的基团替换。例如，用二醇或具有季铵、羟基胺或类似的更具有水溶性部分的胺替换羟基基团，这也在本发明的范围内。在一个优选的实施方案中，通过用增强亲本化合物水溶解度的部分对在此给出的化合物的离子通道的活性不是必需的位点进行取代，赋予了附加的水溶解度。增强有机化合物水溶解度的方法在本领域中是已知的。此类方法包括，但不局限于，用永久带电的部分，例如季铵或在生理学上相关pH条件下带电的基团(例如羧酸、胺)使有机核官能化。其他方法包括向有机核添加包含羟基或胺的基团，例如醇、多元醇、聚醚、等等。代表性的例子包括但不局限于，聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚(乙二醇)以及聚(丙二醇)。这些化合物的适宜的官能化化学以及方案在本领域中是已知的。见，例如，Dunn，R.L.等人编著Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems，ACS Symposium Series Vol.469，American Chemical Society，Washington，D.C.1991。
肼连接物(H)
在第二实施方案中，本发明的偶联物包含肼自消连接物，其中该偶联物具有以下结构：
X4——(L4)p-H-(L1)m-D
其中，D、L1、L4、以及X4如上所限定，并且在此处进一步说明，并且H是包含以下结构的连接物：
Figure A20078005123101131
其中n1是从1至10的整数；n2是0、1或2；每个R24均是独立地选自下组的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、以及未取代的杂烷基；并且I或是一个键(即，主链上的碳原子与临近氮原子之间的键)或是以下结构：
Figure A20078005123101141
其中，n3是0或1，条件是当n3是0时，n2不是0；并且n4是1、2或3，其中当I是一个键，n1是3，并且n2是1时，D不能是：
Figure A20078005123101142
其中R是Me或CH2-CH2-NMe2。
在一个实施方案中，苯环上的取代是对位取代。在优选的实施方案中，n1是2、3或4或n1是3。在优选的实施方案中，n2是1。在优选的实施方案中，I是一个键(即，主链上的碳原子与临近氮原子之间的键)。一方面，肼连接物H可在剪切时形成6元的自消连接物，例如当n3是0并且n4是2时。另一方面，肼连接物H可在剪切时形成两个5元的自消连接物。在其他方面，剪切时，H形成5元的自消连接物、H形成7元的自消连接物或H形成5元的自消连接物以及6元的自消连接物。剪切速率受剪切时形成的环大小的影响。因此，依据所希望的剪切速率，可选择剪切时形成的适宜大小的环。
五元的肼连接物
在一个实施方案中，该肼连接物包括5元的肼连接物，其中H包括以下结构：
Figure A20078005123101151
在一个优选的实施方案中，n1是2、3或4。在另一个优选的实施方案中，n1是3。
在以上结构中，每个R24是独立选自：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、以及未取代的杂烷基的成员。在一个实施方案中，每个R24均独立地为H或C1-C6烷基。在另一个实施方案中，每个R24均独立地为H或C1-C3烷基，更优选H或CH3。在另一个实施方案中，至少一个R24为甲基基团。在另一个实施方案中，每个R24均是H。对每个R24进行选择以调整化合物的空间效应并且用于改变溶解度。
5元的肼连接物可经历一次或更多环化反应，将药物与连接物分开，并且可以通过例如下式进行说明：
Figure A20078005123101152
制备本发明5元连接物的示例性合成路线为：
Figure A20078005123101161
在亚硫酰氯溶液中，受Cbz保护的DMDA b与2，2-二甲基丙二酸a反应，形成Cbz-DMDA-2，2-二甲基丙二酸c。在EDC存在下，化合物c与Boc-N-甲基肼d反应，形成DMDA-2，2-二甲基丙二酸-Boc-N-甲基肼e。
六元的肼连接物
在另一个实施方案中，该肼连接物包括一个6元的肼连接物，其中H包括以下结构：
Figure A20078005123101162
在一个优选的实施方案中，n1是3。在以上结构中，每个R24是独立地选自如下的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、以及未取代的杂烷基。在一个实施方案中，每个R24独立地为H或C1-C6烷基。在另一个实施方案中，每个R24均独立地为H或C1-C3烷基，更优选H或CH3。在另一个实施方案中，至少一个R24为甲基基团。在另一个实施方案中，每个R24均是H。每个R24被选择为对该化合物的位阻效应进行调整并且用于改变溶解度。在一个优选的实施方案中，H包括以下结构：
Figure A20078005123101171
在一个实施方案中，H包括偕二甲基取代。在以上结构的一个实施方案中，每个R24均独立地为H或取代或未取代的烷基。
6元肼连接物会经历环化反应，该反应将该药物与该连接物分开，并可被描述为：
Figure A20078005123101172
制备本发明的6元连接物的示例性合成路线为：
Figure A20078005123101173
在含二氯甲烷的溶液中，受Cbz保护的二甲基丙氨酸a与HOAt、以及CPI反应，形成受Cbz保护的二甲基丙氨酸肼b。该肼b通过甲醇作用而被脱保护，形成化合物c。
其他肼连接物
预期本发明包括七元的连接物。这一连接物不可能像五元或六元连接物那样快的进行环化，但对一些抗体-配偶体偶联物而言这可能是优选的。类似地，该肼连接物可包括两个六元环或具有一个六元及一个五元环化产物的肼连接物。还考虑了五元以及七元连接物以及六元以及七元的连接物。
另一种肼结构H具有下式：
Figure A20078005123101181
其中q是0、1、2、3、4、5或6；并且
每个R24均是独立地选自下组的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、以及未取代的杂烷基。该肼结构也可形成五、六或七元环，并且可以加入附加成分以形成多个环。
二硫化物连接物(J)
在又一个实施方案中，该连接物包括可进行酶促剪切的二硫化物基团。在一个实施方案中，本发明提供一种具有式(d)结构的细胞毒性抗体-配偶体化合物：
其中，D、L1、L4、以及X4如以上所定义，并且在此进一步说明，并且J是包括具有以下结构的基团的二硫化物连接物：
Figure A20078005123101183
其中，每个R24均是独立地选自下组的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、以及未取代的杂烷基；每个K均是独立地选自下组的成员：取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR21R22、NR21COR22、OCONR21R22、OCOR21、以及OR21，其中，R21和R22是独立地选自下组的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、以及未取代的杂环烷基；i是0、1、2、3或4的整数；并且d是0、1、2、3、4、5或6的整数。
该二硫化物连接物的芳香环可用一个或多个“K”基团取代。“K”基团是芳香环上的取代基，它替换原本连接于为部分环结构的四个未取代的碳之一的氢。“K”基团可以是单个原子，如卤素，或可以是多原子的基团，如烷基、杂烷基、氨基、硝基、羟基、烷氧基、卤烷基、以及氰基。示例性的K取代基独立地包括但不限于F、Cl、Br、I、NO2、OH、OCH3、NHCOCH3、N(CH3)2、NHCOCF3、以及甲基。对于“Ki”，i是0、1、2、3或4的整数。在一个特定实施方案中，i是0。
在一个优选的实施方案中，该连接物包含具有下式的可酶促剪切的二硫化物基团：
Figure A20078005123101191
在这一实施方案中，L4、X4、p、以及R24的身份已如以上说明，并且d是0、1、2、3、4、5或6。在一个特定实施方案中，d是1或2。
更具体的二硫化物连接物如下式所示
Figure A20078005123101192
这一实施方案的一个特定实例如下：
Figure A20078005123101193
优选地，d是1或2。
另一种二硫化物连接物如下式所示：
Figure A20078005123101201
这一实施方案的一个特定实例如下：
Figure A20078005123101202
优选地，d是1或2。
在不同的实施方案中，二硫化物在胺的邻位。在另一个特定的实施方案中，a是0。在一个优选的实施方案中，R24独立地选自H和CH3。
制备本发明的二硫化物连接物的示例性合成路线如下：
Figure A20078005123101203
3-巯基丙酸a的溶液与二吡啶基二硫(aldrithiol-2)进行反应，形成碘化3-甲基苯并噻唑鎓(3-methyl benzothiazolium iodide)b。碘化3-甲基苯并噻唑鎓c与氢氧化钠进行反应，形成化合物d。化合物d的甲醇溶液与化合物b进一步反应，形成化合物e。通过乙酰氯与甲醇的作用，化合物e被脱保护，形成化合物f。
对于细胞毒素、连接物的类型、以及将治疗剂偶联至抗体的方法的进一步讨论，还参见Gangwar等人的PCT公开文件WO 2007/05940，且标题为“Cytotoxic Compounds And Conjugates，”Saito，G.等人(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail，P.A.等人(2003)Cancer Immunol.Immunother.52：328-337；Payne，G.(2003)Cancer Cell 3：207-212；Allen，T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan，I.and Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3：1089-1091；Senter，P.D.和Springer，C.J.(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53：247-264，它们中的每一个的全文均并入本文作为参考。
配偶体分子
本发明的特征是偶联配偶体分子(例如细胞毒素、药物(如免疫抑制剂)或放射性毒素)的抗体。此类偶联物在此也称为“免疫偶联物”。包括一种或多种细胞毒素的免疫偶联物称为“免疫毒素”。细胞毒素或者细胞毒性剂包括任何对细胞有害(例如杀死细胞)的试剂。
本发明的配偶体分子的实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracin dione)、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、以及嘌呤霉素、以及其类似物或同系物。配偶体分子的实例还包括，例如抗代谢物(如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氮烯咪胺)、烷基化试剂(如氮芥、噻替哌、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)及洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C，及顺铂(II)(DDP顺铂)、蒽环类抗生素(如柔红比星(以前称柔红霉素)以及阿霉素)，抗生素(如更生霉素(以前称放线菌素)、博来霉素、光辉霉素，及安曲霉素(AMC))，以及抗有丝分裂剂(如长春新碱以及长春碱)。
其他可与本发明抗体偶联的配偶体分子优选实例包括都卡霉素、加利车霉素、美登素、以及阿里斯达汀(auristatin)、以及其衍生物。加利车霉素抗体偶联物的一种实例是可商购的(
Figure A20078005123101221
American HomeProducts)。
配偶体分子的优选例子是CC-1065以及都卡霉素。CC-1065首次由Upjohn公司从泽尔链霉菌(streptomyces zelensis)分离出来(Hanka等人，J.Antibiot.31：1211(1978)；Martin等人，J.Antibiot.33：902(1980)；Martin等人，J.Antibiot.34：1119(1981))，并且被发现在体外以及在实验动物中都具有有效的抗肿瘤以及抗微生物活性(Li等人，Cancer Res.42：999(1982))。CC-1065结合到双链B-DNA的具有优先序列为5′-d(A/GNTTA)-3′以及5′-d(AAAAA)-3′的小沟内(Swenson等人，CancerRes.42：2821(1982))，并且通过它在分子中存在的CPI左手单元使3′-腺嘌呤的N3位置烷基化(Hurley等人，Science 226：843(1984))。尽管CC-1065具有有效且广泛的抗肿瘤活性，但因为CC-1065引起了实验动物的迟缓死亡，所以它不能被用于人类。
CC-1065以及都卡霉素的许多类似物以及衍生物在本领域是已知的。已对许多化合物的结构、合成以及特性的研究进行综述。参见，例如，Boger等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35：1438(1996)；以及Boger等人，Chem.Rev.97：787(1997)。
Kyowa Hakko Kogya Co.，Ltd.的一个团队已经制备了许多CC-1065衍生物。参见，例如，美国专利号5,101,038；5,641,780；5,187,186；5,070,092；5,703,080；5,070,092；5,641,780；5,101,038；以及5,084,468；以及已公开的PCT申请WO 96/10405以及已公开的欧洲申请0537 575A1。
Upjohn Company(Pharmacia Upjohn)已经在积极制备CC-1065的衍生物。参见，例如，美国专利号5,739,350、4,978,757、5,332,837、以及4,912,227。
本发明的一个特别优选的方面提供了细胞毒素化合物，该化合物具有根据下式(e)的结构：
Figure A20078005123101231
其中，环体系A是选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基中的成员。示例性的环体系包括苯基以及吡咯。
符号E和G独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、杂原子、单键，或者E和G可任选地进行结合形成一个环状体系，该体系选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基。
符号X表示选自O、S以及NR23中的成员。R23是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员。
符号R3表示选自(＝O)、SR11、NHR11以及OR11中的成员，其中R11是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磺酸酯、酰基、C(O)R12R13、C(O)OR12、C(O)NR12R13、P(O)(OR12)2、C(O)CHR12R13、SR12或SiR12R13R14。符号R12、R13、以及R14独立地表示H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及取代或未取代的芳基，其中R12和R13与它们所连接的氮原子或碳原子一起可任选地相连接以形成取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，可任选地包含2个或多个杂原子。R12、R13或R14中的一个或多个在其结构内可包括可剪切的基团。
R4、R4’、R5以及R5’是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR15R16、NC(O)R15、OC(O)NR15R16、OC(O)OR15、C(O)R15、SR15、OR15、CR15＝NR16、以及O(CH2)nN(CH3)2的成员，其中，n是从1到20的整数，或者R4、R4’、R5及R5’的任何相邻的一对与它们所连接的碳原子连接在一起以形成一个有4到6元的取代或未取代的环烷基或杂环烷基环状体系。R15和R16独立地表示H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、以及取代或未取代的肽基，其中R15和R16与它们所连接的氮原子一起可任选地相连接以形成取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，可任选地包含两个或更多个杂原子。一个示例性的结构是苯胺。
R4、R4’、R5、R5’、R11、R12、R13、R15以及R16在它们的结构内可任选地包括一个或多个可剪切的基团，例如可剪切的连接物或可剪切的底物。示例性的可剪切的基团包括，但不限于肽、氨基酸、肼、二硫化物、以及头孢菌素衍生物。
在一些实施方案中，R4、R4’、R5、R5’、R11、R12、R13、R15以及R16中的至少一个用于将药物与本发明的连接物或酶可剪切的底物相结合，如此处所说明的，例如连接至L1上(如果存在)，或连接至F、H、J或X2或J上。
在又一个示例性实施方案中，R4、R4’、R5、R5’、R11、R12、R13、R15以及R16中的至少一个带有适合用于偶联该化合物的反应基。在另一个示例性实施方案中，R4、R4’、R5、R5’、R11、R12、R13、R15以及R16独立地选自H、取代的烷基以及取代的杂烷基，并且在烷基或杂烷基部分的游离末端具有反应官能团。R4、R4’、R5、R5’、R11、R12、R13、R15以及R16中的一个或多个可以偶联到另一种类上，例如，靶向试剂、可检测的标记、固相支持体等。
R6是单键，它存在或不存在。当R6存在时，R6和R7结合形成环丙基环。R7是CH2-X1或-CH2-。当R7是-CH2-时，它是环丙烷环的组成部分。符号X1表示离去基团如卤素，例如Cl、Br或F。以不会违反化学价原则的方式解释R6和R7的组合。
X1可以是任何离去基团。有用的离去基团包括但不限于卤素、叠氮化物、磺基酯(如烷基磺酰基、芳基磺酰基)、氧鎓离子、高氯酸烷基酯、氨基烷烃磺酸酯、烷基氟代磺酸酯以及氟化化合物(如三氟甲磺酸盐、全氟丁基甲磺酸盐(nonaflates)、三氟乙磺酸盐(tresylates))等等。用作离去基团的具体卤素是F、Cl以及Br。对于特定反应条件的设置来说这些以及其他离去基团适当的选择在本领域的普通技术人员的能力之内(参见，例如，March J，Advanced Organic Chemistry，第二版，John Wiley和Sons，1992；Sandler SR，Karo W，Organic Functional Group Preparations，第二版，Academic Press，Inc.，1983；以及Wade LG，Compendium of OrganicSynthetic Methods，John Wiley和Sons，1980)。
六元环中的曲线表明该环可具有一个或多个不饱和度，并且它可以是芳族的。因此，环结构(如以下所给出)、以及相关结构在式(f)的范围内：
Figure A20078005123101251
在一些实施方案中，R4、R4’、R5、以及R5’中的至少一个将所述药物连接至L1(如果存在)上，或连接至F、H、J或X2上，并且包括
Figure A20078005123101261
其中v是从1到6的整数；并且R27、R27’、R28以及R28′各自均独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基。在一些实施方案中，R27、R27’、R28以及R28’都是H。在一些实施方案中，v是从1到3的整数(优选是1)。这一单位可用于将芳基取代基与药物分开，并因此阻碍或避免产生多抗药性的底物的化合物。
在一个实施方案中，R11包括一个部分X5，它不会自我环化，并将药物连接至L1(如果存在)上，或连接至F、H、J或X2上。部分X5优选使用酶可剪切，并且被剪切时提供活性药物。作为一个实例，R11可具有以下结构(其右侧与药物的其余部分相偶联)：
在一个示例性实施方案中，式(e)的环状体系A是取代或未取代的苯环。环状体系A可被在本文定义部分中给出的一个或多个芳基取代基所取代。在一些实施方案中，该苯环被CN或甲氧基部分所取代。
在一些实施方案中，R4、R4’、R5、以及R5’中的至少一个将所述药物与L1(如果存在)相连接，或与F、H、J或X2相连接，并且R3选自SR11、NHR11以及OR11。R11选自-SO(OH)2、-PO(OH)2、-AAn、-Si(CH3)2C(CH3)3、-C(O)OPhNH(AA)m、
或任何其他糖或糖的组合、
Figure A20078005123101272
及其药学上可接受的盐，其中n是1到10范围内的任意整数，m是1到4范围内的任意整数，p是1到6范围内的任意整数，并且AA是任何天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中，AAn或AAm选自以上说明的肽连接物(F)的相同氨基酸序列并且任选地与在R4、R4’、R5或R5’的连接物部分所用的氨基酸序列相同。在至少一些实施方案中，R3在体内是可剪切的以提供活性药物化合物。在至少一些实施方案中，R3提高化合物在体内的溶解度。在一些实施方案中，血液中活性药物浓度降低的速率实质上快于提供活性药物的R3的剪切速率。当活性药物的毒性实质上高于前体药物形式的毒性时，这可能是特别有用的。在其他的实施方案中，为提供活性药物而剪切R3的速率快于血液中活性药物的浓度降低速率。
在另一个示例性实施方案中，本发明提供了具有根据式(g)的结构的化合物：
Figure A20078005123101281
在这个实施方案中，取代基R3、R4、R4’、R5、R5’、R6、R7以及X的身份，以及对于特定的实施方案的优选项，基本上如同以上对于式(a)所做的说明所述。符号Z是独立选自O、S和NR23的成员。符号R23表示选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员。对每个R23进行独立地选择。符号R1代表H、取代或未取代的低级烷基，或C(O)R8或CO2R8。R8是选自取代的烷基、未取代的烷基、NR9R10、NR9NHR10以及OR9的成员。R9和R10独立地选自H、取代或未取代的烷基、以及取代或未取代的杂烷基。R2是H或取代或未取代的低级烷基。通常优选的是当R2是取代的烷基时，它不同于全氟烷基，例如CF3。在一个实施方案中，R2是取代的烷基，其中取代基不是卤素。在另一个实施方案中，R2是未取代的烷基。
在一些实施方案中，R1是酯部分，例如CO2CH3。在一些实施方案中，R2是低级烷基，它可以是取代或未取代的。目前优选的低级烷基是CH3。在一些优选的实施方案中，R1是CO2CH3且R2是CH3。
在一些实施方案中，R4、R4’、R5、以及R5’是独立地选自H、卤素、NH2、OMe、O(CH2)2N(R29)2、以及NO2的成员。每个R29均独立地是H或低级烷基(例如甲基)。
在一些实施方案中，对药物进行选择，使离去基团X1是选自下组的成员：卤素、烷基磺酰基、芳基磺酰基、以及叠氮化物。在一些实施方案中，X1是F、Cl或Br。
在一些实施方案中，Z是O或NH。在一些实施方案中，X是O。
在又一个示例性实施方案中，本发明提供了具有根据式(h)或(i)的结构的化合物：
Figure A20078005123101291
式(e)的都卡霉素类似物的另一个优选的结构是其中环状体系A是未取代的或取代的苯环的结构。当环状体系A是吡咯时，在以上说明的具有式7的结构的药物分子上优选的取代基也是当环状体系A是未取代的或取代的苯环时优选的取代基。
例如，在一个优选的实施方案中，药物(D)包含结构(j)：
Figure A20078005123101301
在这个结构中，R3、R6、R7、X如以上式(e)中说明。此外，Z是选自O、S以及NR23的成员，其中R23是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员；
R1是H、取代或未取代的低级烷基、C(O)R8或CO2R8，其中R8是选自NR9R10和OR9的成员，其中R9和R10是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基的成员；
R1’是H、取代或未取代的低级烷基或C(O)R8，其中R8是选自NR9R10和OR9的成员，其中R9和R10是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基的成员；
R2是H或取代或未取代的低级烷基或未取代的杂烷基或氰基或烷氧基；R2’是H或取代或未取代的低级烷基或未取代的杂烷基。
R4、R4’、R5、R5’、R11、R12、R13、R15或R16中的至少一个将药物连接至L1(如果存在)上，或连接至F、H、J或X2上。
药物(D)的另一个实施方案包括结构(k)，其中R4和R4’已相结合形成杂环烷基：
Figure A20078005123101302
在这个结构中，R3、R5、R5’、R6、R7、X如以上式(e)所说明。此外，Z是选自O、S以及NR23的成员，其中R23是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、和酰基的成员；
R32选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR15R16、NC(O)R15、OC(O)NR15R16、OC(O)OR15、C(O)R15、SR15、OR15、CR15＝NR16、以及O(CH2)nN(CH3)2，其中，n是从1到20的整数。R15和R16独自地表示H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基以及取代或未取代的肽基，其中R15和R16与它们所连接的氮原子一起可任选地相连接以形成取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，任选地包含两个或更多个杂原子。R32在其结构内任选地包含一个或多个可剪切的基团，例如可剪切的连接物或可剪切的底物。示例性的可剪切的基团包括，但不限于肽、氨基酸、肼、二硫化物、以及头孢菌素衍生物。而且，此处说明的R4、R4’、R5、R5’、R15、以及R16的取代基的任何选择也可应用于R32。
R5、R5’、R11、R12、R13、R15、R16或R32中的至少一个将该药物连接至L1(如果存在)上，或连接至F、H、J或X2上。在至少一些实施方案中，R32将药物连接至L1(如果存在)上，或连接至F、H、J或X2上。
这个化合物的一个优选的实施方案是：
Figure A20078005123101311
R1是H、取代或未取代的低级烷基、C(O)R8或CO2R8，其中R8是选自NR9R10和OR9的成员，其中R9和R10是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基的成员；
R1’是H、取代或未取代的低级烷基或C(O)R8，其中R8是选自NR9R10和OR9的成员，其中R9和R10是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基的成员；
R2是H或取代或未取代的低级烷基或未取代的杂烷基或氰基或烷氧基；R2’是H或取代或未取代的低级烷基或未取代的杂烷基。
另一个实施方案具有下式：
Figure A20078005123101321
在这个结构中，A、R6、R7、X、R4、R4’、R5以及R5’如以上式(e)所说明。此外，Z是选自O、S以及NR23的成员，其中R23是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员；
R33选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR15R16、NC(O)R15、OC(O)NR15R16、OC(O)OR15、C(O)R15、SR15、OR15、CR15＝NR16、以及O(CH2)nN(CH3)2，其中，n是从1到20的整数。R15和R16独自地表示H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基以及取代或未取代的肽基，其中R15和R16与它们所连接的氮原子一起可任选地相连接以形成取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，任选地包含两个或更多个杂原子。R33将药物连接至L1(如果存在)上，或连接至F、H、J或X2上。
优选地，A是取代或未取代的苯基或取代或未取代的吡咯。另外，此处说明的用于R11的取代基的任何选择也可应用于R33。
配体
X4表示选自：受保护的反应官能团、未受保护的反应官能团、可检测的标记、以及靶向试剂的配体。优选的配体是靶向试剂，如抗体及其片段。
在一些实施方案中，基团X4可以被说明为选自R29、COOR29、C(O)NR29、以及C(O)NNR29的成员，其中R29是选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及取代或未取代的杂芳基的成员。在又一个示例性的实施方案中，R29是硫醇反应成员。在另一个示例性实施方案中，R29是硫醇反应成员，选自卤代乙酰基以及烷基卤衍生物、马来酰亚胺、氮丙啶、以及丙烯酰衍生物。以上的硫醇反应成员可以充当反应保护基团，这些反应保护基团可以与例如靶向试剂(如抗体)的氨基酸侧链反应，由此使该靶向试剂连接至该连接物-药物部分上。
可检测的标记
与本发明化合物结合使用的特定标记或可检测基团以及本发明方法通常不是本发明的关键方面，只要它不显著干扰本发明化合物的活性或效用。可检测的基团可以是任何具有可检测的物理或化学特性的物质。此类可检测的标记在免疫测定的领域中已得到很好的发展，并且通常，在此类方法中有用的任何标记都能被应用至本发明中。因此，标记是通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段可检测的任何组分。本发明中有用的标记包括磁珠(例如DYNABEADSTM)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明等)、放射性标记(例如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶以及其他在ELISA中常用的酶)、以及比色标记，如胶体金或有色玻璃或塑料珠(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)。
根据本领域熟知的方法，标记可直接或间接偶联到本发明的化合物上。如以上所指，可使用多种标记，标记的选择取决于所需的灵敏度、与化合物偶联的容易程度、稳定性需求、可用的仪器、以及可支配的供应物。
当本发明的化合物与可检测的标记相偶联时，该标记优选是选自下组的成员：放射性同位素、荧光试剂、荧光试剂前体、生色团、酶类及它们的组合。将各种基团偶联到抗体的方法在本领域是熟知的。例如，经常被偶联到抗体的可检测的标记是酶，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、以及葡萄糖氧化酶。
非放射性标记常常是通过间接手段连接的。通常，配体分子(例如生物素)被共价地结合到该偶联物的成分上。然后该配体与另一个分子(如链霉抗生物素)结合，该分子是固有地可检测的或者与信号系统(如可检测的酶、荧光化合物或化学发光化合物)共价结合。
本发明偶联物的成分还可以直接偶联到产生信号的化合物上，例如通过与酶或荧光团相偶联。作为标记的目的酶主要是水解酶，特别是磷酸酶、酯酶以及糖苷酶或氧化酶(oxidotase)，特别是过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮等。化学发光化合物包括萤光素、以及2，3-二氢酞嗪二酮，例如鲁米诺。对于可以使用的各种标记或信号产生体系的评述，参见美国专利号4,391,904。
检测标记的手段是本领域普通技术人员熟知的。因此，例如，当标记是放射性标记时，检测手段包括闪烁计数器或如在放射自显影法中的照相胶片。当标记是荧光标记时，可通过用适当光波长激发荧光染料并检测产生的荧光对其进行检测。可通过照相胶片、通过使用电子探测器(例如电荷耦合器件(CCD)或光电倍增管等等)对荧光进行可视检测。类似地，可通过提供酶的适当底物并检测产生的反应产物来对酶标记进行检测。最后，可通过观察与标记相关的颜色对简单比色标记简单地进行检测。因此，在各种试纸条测定(dipstick assay)中，所偶联的金经常显示成粉红色，而各种偶联的珠子显示出珠子的颜色。
荧光标记是目前优选的，因为它们具有操作上需要的预防措施少、并适合高通量显像技术(光学分析包括在包含计算机的集成系统中用于分析的图像的数字化)的优点。优选的标记典型地具有以下的一项或多项特征：高灵敏度、高稳定性、低背景、低环境敏感性、以及标记的高特异性。许多荧光标记可从以下公司商购获得：SIGMA化学公司(Saint Louis，MO)、Molecular Probes(Eugene，OR)、R&D systems(Minneapolis，MN)、Pharmacia LKB Biotechnology(Piscataway，NJ)、CLONTECHLaboratories，Inc.(Palo Alto，CA)、Chem Genes Corp.、Aldrich ChemicalCompany(Milwaukee，WI)、Glen Research，Inc.、GIBCO BRL LifeTechnologies，Inc.(Gaithersburg，MD)、Fluka Chemica-BiochemikaAnalytika(Fluka Chemie AG，Buchs，Switzerland)、以及AppliedBiosystems(Foster City，CA)，以及许多技术人员已知的其他的商业来源。此外，本领域的普通技术人员将认识到如何选择合适的荧光团用于特定的应用中，并且如果它不容易商购获得，则能够从头合成必需的荧光团或对可商购的荧光化合物进行合成修饰以获得所希望的荧光标记。
除了小分子荧光团外，天然发生的荧光蛋白以及对此类蛋白质的改造的类似物在本发明中也有用。此类蛋白质包括(例如)刺胞动物的绿色荧光蛋白(Ward等人，Photochem.Photobiol.35：803-808(1982)；Levine等人，Comp.Biochem.Physiol.，72B：77-85(1982))、来自费氏弧菌菌株的黄色荧光蛋白(Baldwin等人，Biochemistry 29：5509-15(1990))、来自共生甲藻属甲藻(dinoflagellate Symbiodinium sp.)的多甲藻黄素-叶绿素(Morris等人，Plant Molecular Biology 24：673：77(1994))、来自海洋蓝细菌(如聚球藻属(Synechococcus))的藻胆蛋白，例如藻红蛋白和藻蓝蛋白(Wilbanks等人，J.Biol.Chem.268：1226-35(1993))，及类似物。
通常，在细胞毒素与靶向(或其他)试剂之间形成连接(并且任选是间隔基团)之前，这些化学官能团中的至少一个会被激活。本领域的普通技术人员将理解，可以使用许多种标准方法和条件来激活化学官能团，包括羟基、氨基以及羧基基团。例如，可以通过用光气处理形成相应的氯甲酸盐或用对硝基苯基氯甲酸盐处理形成相应的碳酸盐来激活细胞毒素或靶向试剂的羟基。
在一个示例性实施方案中，本发明利用包括羧基官能度的靶向试剂。羧基可通过，例如，转变为相应的酰卤或活性酯而被激活。这一反应可在March(同上)第388-89页中阐述的多种条件下进行。在一个示例性实施方案中，通过含羧基的基团与草酰氯进行反应来制备酰卤。被激活的试剂与细胞毒素或细胞毒素-连接物臂组合进行反应，以形成本发明的偶联物。本领域的普通技术人员将理解使用含羧基的靶向试剂仅仅是说明性的，并且具有许多其他官能团的试剂可偶联到本发明的连接物上。
反应官能团
为了阐述的清晰性，后面的讨论集中于细胞毒素与靶向试剂的偶联。焦点例证了本发明的一个实施方案，从这个实施方案，本领域的技术人员很容易推断出其他的实施方案。集中讨论单个实施方案并不意味着对本发明的限制。
本发明的示例性化合物带有反应官能团，该官能团通常位于取代或未取代的烷基或杂烷基链上，使它们易连接于另一种类上。该反应基的有利位置是该链的末端位置。
在实施本发明时有用的反应基和反应种类通常是那些在生物偶联化学领域所熟知的反应基和反应种类。反应官能团可以是受保护的或未受保护的，并且该官能团的受保护的本性可以通过有机合成领域已知的方法进行改变。用反应性细胞毒素类似物可获得的优选的反应种类是那些在相对温和的条件下进行的反应种类。这些反应种类包括但不限于亲核取代(例如，胺和醇与酰卤、活性酯的反应)、亲电取代(例如，烯胺反应)以及碳-碳以及碳-杂原子多个键的加成(例如，迈克尔反应、第尔斯-阿尔德反应)。这些以及其他有用的反应讨论于例如March，Advanced OrganicChemistry，第三版，John Wiley & Sons，New York，1985；Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego，1996；以及Feeney等人，Modification of Proteins；Advances in Chemistry Series，Vol.198，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982。
示例性反应类型包括羧基及其不同的衍生物的反应，羧基衍生物包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑酯、酰卤、酰基咪唑、硫酯、对硝基苯基酯、烷基、烯基、炔基以及芳族酯。羟基基团可被转变为酯、醚、醛等。通过与例如胺、羧酸阴离子、硫醇阴离子、碳负离子或醇盐离子进行反应，卤烷基基团可被转变为新的种类。亲双烯体(例如马来酰亚胺)基团参与第尔斯-阿尔德反应。醛基或酮基基团可被转变为亚胺、腙、缩氨基脲或肟，或通过例如Grignard加成反应或烷基锂加成反应这样的机制完成这些转变。磺酰卤容易与胺进行反应，例如形成磺酰胺。胺或巯基基团被例如酰化、烷基化或氧化。使用环加成作用、酰化作用、迈克尔加成等，可将烯烃转变为一系列新的种类。环氧化物容易与胺以及羟基化合物反应。
本领域的普通技术人员将容易理解，这些连接中有许多可通过多种方法并使用多种条件产生。对于酯的制备，见例如，March supra 1157页；对于硫酯，见March，(同上)第362-363页，491页，720-722页，829页，941页，和1172页；对于碳酸酯，见March，(同上)第346-347页；对于氨基甲酸酯，见March，(同上)第1156-57页；对于酰胺，见March，(同上)第1152页；对于脲及硫脲，见March，(同上)第1174页；对于缩醛以及缩酮，见Greene等人，(同上)第178-210和March，(同上)第1146页；对于酰氧基烷基衍生物，见Prodrugs：Topical and Ocular DrugDelivery，K.B.Sloan编著，Marcel Dekker，Inc.，New York，1992；对于烯醇酯，见March，(同上)第1160页；对于N-磺基亚磺亚酰胺(N-sulfonylimidates)，见例如Bundgaard等人，J.Med.Chem.，31：2066(1988)；对于酸酐，见March，(同上)第355-56页，636-37页，990-91页，和1154页；对于N-酰胺，见March，(同上)第379页；对于N-曼尼希碱，见March，(同上)第800-02页和828页；对于羟甲基酮酯，见Petracek等人Annals NY Acad.Sci.，507：353-54(1987)；对于二硫化物，见March(同上)第1160页；以及对于磷酸酯及膦酰胺酯的制备。
反应官能团可以是未被保护的并被选择，使得它们不参与或不干涉反应。备选地，反应官能基团可通过保护基团的存在受到保护而不参与反应。本领域的普通技术人员将理解怎样保护特定官能团不干扰已选择的反应条件设置。对于有用的保护基的例子，参见Greene等人，Protective Groups inOrganic Synthesis，John Wiley & Sons，New York，1991。
典型地，使用标准的化学技术通过其各自的化学官能团将靶试剂共价连接至细胞毒素上。任选地，连接物或试剂通过一个或多个间隔基团与该试剂偶联。当组合使用时，间隔基团可以是等效的或不同的。
通常，在细胞毒素与反应性官能团(并且任选地是间隔基团)之间形成连接之前，化学官能团中的至少一个将得到激活。本领域的普通技术人员将理解，使用许多种标准方法和条件可以激活多种化学官能团，包括羟基、氨基以及羧基基团。在一个示例性实施方案中，本发明包含作为反应官能团的羧基官能团。羧基可以如以上说明得到激活。
可剪切的底物
将本发明可剪切的底物说明为：“X2”。优选地，可剪切的底物是可被酶剪切的可剪切的酶底物。优选地，这种酶优选直接或间接与待处理的肿瘤或其他靶细胞相关联。该酶可以由待处理的肿瘤或其他靶细胞产生。例如，该可剪切的底物可以是肽，该肽优选可被肿瘤或其他靶细胞周围或在其中发现的酶剪切。另外地或备选地，该酶可连接于与肿瘤细胞进行特异结合的靶向试剂，例如对肿瘤抗原特异的抗体。
作为适宜于偶联到以上说明的药物的酶可剪切的底物例子，PCT专利申请公开文件WO 00/33888、WO 01/95943、WO 01/95945、WO 02/00263以及WO 02/100353(它们均并入本文作为参考)公开了可剪切的肽与药物的连接。这种肽可被与肿瘤相关的酶剪切，例如trouase(如甲拌磷寡肽酶)、CD10(中性溶酶)、基质金属蛋白酶(如MMP2或MMP9)、II型跨膜丝氨酸蛋白酶(如Hepsin、睾蛋白、TMPRSS4或matriptase/MT-SP1)或组织蛋白酶。在这个实施方案中，前体药物包括以上说明的药物、肽、稳定化基团、以及任选地在药物与肽之间的连接基团。稳定化基团连接于肽末端，以保护前体药物在到达肿瘤或其他靶细胞前不被降解。适宜的稳定化基团的例子包括非氨基酸，例如琥珀酸、二甘醇酸、马来酸、聚乙二醇、焦谷氨酸、醋酸、萘羧酸、对苯二酸、以及戊二酸衍生物；以及非遗传编码的氨基酸或天冬氨酸或谷氨酸，其在天冬氨酸的β-羧基或谷氨酸的γ-羧基处连接于肽的N末端。
肽一般包括3至12(或更多)个氨基酸。特定氨基酸的选择将至少部分取决于将用于剪切该肽的酶，以及这种肽在体内的稳定性。适宜的可剪切肽的一个例子是β-AlaLeuAlaLeu(SEQ ID NO：92)。这可与稳定化基团组合，形成琥珀酰基-β-AlaLeuAlaLeu(SEQ ID NO：92)。其他适宜的可剪切肽的例子提供于以上引用的文献中。
作为一个说明性实例，CD10，也被称为中性溶酶、中性内肽酶(NEP)、以及常见急性成淋巴细胞白血病抗原(CALLA)，是一种II型细胞-表面锌依赖型金属蛋白酶。适宜用于CD10的可剪切的底物包括LeuAlaLeu以及IleAlaLeu。其他已知的用于CD10的底物包括长度至多50个氨基酸的肽，尽管催化效率常随底物变大而降低。
另一个说明性实例基于基质金属蛋白酶(MMP)。作为也许是与肿瘤有关的最佳表征的蛋白水解酶，在肿瘤微环境中MMP的激活存在明显的相关性。特别是，已经对可溶性基质酶MMP2(明胶酶A)以及MMP9(明胶酶B)进行了深入研究，并且它们在包括肿瘤生长在内的组织重塑中显示出被选择性地激活。已设计出可被MMP2以及MMP9剪切的肽序列并测试了以下物质的偶联物：葡聚糖和甲氨喋呤(Chau等人，Bioconjugate Chem.15：931-941(2004))；PEG(聚乙二醇)和阿霉素(Bae等人，Drugs Exp.Clin.Res.29：15-23(2004))；以及白蛋白和阿霉素(Kratz等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.11：2001-2006(2001))。适宜与MMP一起使用的序列的实例包括但不限于：ProValGlyLeuIleGly(SEQ IDNO：84)、GlyProLeuGlyVal(SEQ ID NO：85)、GlyProLeuGlyIleAlaGlyGln(SEQ ID NO：86)、ProLeuGlyLeu(SEQ ID NO：87)、GlyProLeuGlyMetLeuSerGln(SEQ ID NO：88)、以及GlyProLeuGlyLeuTrpAlaGln(SEQ ID NO：89)。(参见例如，前文引用的参考文献连同Kline等人，Mol.Pharmaceut.1：9-22(2004)以及Liu等人，Cancer Res.60：6061-6067(2000))。也可使用其他可剪切的底物。
又一个实例是II型跨膜丝氨酸蛋白酶。这一组酶包括例如hepsin、睾蛋白、以及TMPRSS4。GlnAlaArg是一种底物序列，该序列与蛋白裂解酶(matriptase)/MT-SP1(在乳腺癌和卵巢癌中被过表达)一起使用，并且LeuSerArg与hepsin(在前列腺和其他一些肿瘤类型中被过表达)一起使用。(参见例如，Lee et.al.，J.Biol.Chem.275：36720-36725以及Kurachi和Yamamoto，Handbook of Proeolytic Enzymes第二卷，第二版(BarrettAJ，Rawlings ND & Woessner JF，eds)第1699-1702页(2004))。也可使用其他可剪切的底物。
另一类型可剪切的底物的安排包括制备能够剪切该可剪切底物的单独的酶，其变得与肿瘤或细胞相关联。例如，酶能够偶联到肿瘤特异的抗体(或其他实体，该实体优选地被吸引至肿瘤上或其他靶细胞上，例如受体配体)上，并接着酶-抗体偶联物可提供给病人。酶-抗体偶联物可定向到肿瘤相关的抗原并与之结合。随后，将该药物-可剪切的底物偶联物作为前体药物提供给病人。当药物-可剪切的底物偶联物与已变得与肿瘤相结合的酶相互作用时，药物只在肿瘤附近释放，这样可剪切的底物得到剪切并且药物得到释放。例如，美国专利号4,975,278；5,587,161；5,660,829；5,773,435；以及6,132,722公开了这种安排，所有文献都并入本文作为参考。适宜的酶以及底物的例子包括但不限于，β-内酰胺酶以及头孢菌素衍生物、羧肽酶G2及谷氨酸及天冬氨酸的叶酸酯衍生物。
在一个实施方案中，酶-抗体偶联物包括抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段是基于它对于目的靶细胞或靶位点上表达的相关抗原的特异性来进行选择。在上文提供了抗体的讨论。适宜的头孢菌素-可剪切的底物的一个例子是
Figure A20078005123101411
偶联物的实例
本发明的连接物和可剪切的底物可被用在含有多种配偶体分子的偶联物中。本发明偶联物的例子在以下作进一步详尽的说明。除非另外指明，如以上在有关细胞毒素、连接物、以及可剪切的底物的部分中所给出的，对取代基进行限定。
A.连接物偶联物
适宜的偶联物的一个例子是具有下式的化合物：
Figure A20078005123101412
其中L1是自消连接物；m是整数0、1、2、3、4、5或6；F是包括以下结构的连接物：
Figure A20078005123101413
其中AA1是独立地选自下组的一个或多个成员：天然氨基酸和非天然α-氨基酸；c是从1到20的整数；L2是自消连接物并且包含
Figure A20078005123101414
其中R17、R18以及R19各自独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及取代或未取代的芳基，并且w是从0到4的整数；o是1；L4是连接物成员；p是0或1；X4是选自下组的成员：受保护的反应官能团、未受保护的反应官能团、可检测的标记、以及靶向试剂；并且D包含以下结构：
Figure A20078005123101421
其中环状体系A是选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基的成员；E和G是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、杂原子、单键的成员，或者E和G相结合，形成一个环状体系，该环状体系选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基；X是选自O、S以及NR23的成员；R23是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员；R3是OR11，其中R11是选自下组的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磺酸酯、酰基、C(O)R12R13、C(O)OR12、C(O)NR12R13、P(O)(OR12)2、C(O)CHR12R13、SR12、以及SiR12R13R14，R4、R4’、R5及R5’是独立选自下组的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR15R16、NC(O)R15、OC(O)NR15R16、OC(O)OR15、C(O)R15、SR15、OR15、CR15＝NR16、以及O(CH2)nN(CH3)2，或R4、R4’、R5和R5’的任何相邻对与它们所连接的碳原子连接在一起以形成具有4到6元的、取代或未取代的环烷基或杂环烷基环状体系；其中n是从1到20的整数；R15和R16是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、以及取代或未取代的肽基，其中R15和R16与它们所连接的氮原子一起可任选地相连接以形成具有4到6元的、任选地包含两个或更多个杂原子的取代或未取代的杂环烷基环状体系；R6是单键，它存在或者不存在，并且当R6存在时，R6和R7相结合，形成环丙基环；并且R7是在所述环丙基环中与R6结合的CH2-X1或-CH2-，其中X1是离去基团，其中R11将所述药物连接至L1(如果存在)上，或连接至F上。
在一些实施方案中，药物具有以上的结构(c)或(f)。适宜作为偶联物使用的化合物的一个具体的例子是
Figure A20078005123101431
一类偶联物的另一个例子是具有下式的化合物
Figure A20078005123101432
其中L1是自消连接物；m是整数0、1、2、3、4、5或6；F是包括以下结构的连接物：
其中AA1是独立地选自下组的一个或多个成员：天然氨基酸和非天然α-氨基酸；c是从1到20的整数；L2是自消连接物；o是0或1；L4是连接物成员；p是0或1；X4是选自受保护的反应官能团、未受保护的反应官能团、可检测的标记、以及靶向试剂的成员；并且D包含以下结构：
Figure A20078005123101434
其中环状体系A是选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基基团的成员；E和G是独立选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、杂原子、单键的成员，或者E和G相结合形成环状体系，该环状体系选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基；X是选自O、S以及NR23的成员；R23是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员；R3是选自下组的成员：(＝O)、SR11、NHR11以及OR11，其中R11选自下组的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磺酸酯、酰基、C(O)R12R13、C(O)OR12、C(O)NR12R13、P(O)(OR12)2、C(O)CHR12R13、SR12以及SiR12R13R14，其中R12、R13、及R14是独立选自下组的成员：H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及取代或未取代的芳基，其中R12和R13与它们所连接的氮原子或碳原子一起可任选地连接以形成取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，任选地包含两个或更多个杂原子；R4、R4’、R5及R5’是独立选自下组的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR15R16、NC(O)R15、OC(O)NR15R16、OC(O)OR15、C(O)R15、SR15、OR15、CR15＝NR16、以及O(CH2)nN(CH3)2，或者R4、R4’、R5及R5’的任何相邻对与它们所连接的碳原子连接在一起以形成具有4到6元的、取代或未取代的环烷基或杂环烷基环状体系，其中n是从1到20的整数；R15和R16独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、以及取代或未取代的肽基，其中R15和R16与它们所连接的氮原子一起可任选地相连接以形成取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，任选地包含两个或更多杂原子；其中R4、R4’、R5及R5’中的至少一个连接所述药物到L1(如果存在)上，或连接至F上，并且包括
Figure A20078005123101451
其中v是从1到6的整数；并且R27、R27、R28及R28’各自独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基；R6是单键，它存在或者不存在，并且当R6存在时，R6和R7相结合，形成环丙基环；并且R7是在所述环丙基环中与R6结合的CH2-X1或-CH2-，其中X1是离去基团。
在一些实施方案中，药物具有以上的结构(c)或(f)。适宜作为偶联物使用的化合物的一个具体的例子是
Figure A20078005123101452
其中r是从0到24范围内的整数。
适宜的偶联物的另一个例子是具有下式的化合物：
Figure A20078005123101453
其中L1是自消连接物；m是整数0、1、2、3、4、5或6；F是包括以下结构的连接物：
Figure A20078005123101454
其中AA1是独立地选自下组的一个或多个成员：天然氨基酸和非天然α-氨基酸；c是从1到20的整数；L3是含有伯胺或仲胺或羧基官能团的间隔基团；其中如果L3存在，则m是0，并且L3的胺与D的侧羧基官能团形成酰胺键或者L3的羧基与D的侧胺官能团形成酰胺键；o是0或1；L4是连接物成员，其中L4包括
Figure A20078005123101461
其直接连接到(AA1)c的N端上，其中R20是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员，R25、R25’、R26、以及R26’各自独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基；并且s和t独立地是从1到6的整数；p是1；X4是选自下组的成员：受保护的反应官能团、未受保护的反应官能团、可检测的标记、以及靶向试剂；并且D含有以下结构：
Figure A20078005123101462
其中环状体系A是选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基基团的成员；E和G是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、杂原子、单键的成员，或者E和G相结合形成环状体系，该环状体系选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基；X是选自O、S以及NR23的成员；R23是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员；R3是选自下组的成员：(＝O)、SR11、NHR11以及OR11，其中R11是选自下组的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磺酸酯、酰基、C(O)R12R13、C(O)OR12、C(O)NR12R13、P(O)(OR12)2、C(O)CHR12R13、SR12以及SiR12R13R14，其中R12、R13和R14是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及取代或未取代的芳基的成员，其中R12和R13与它们所连接的氮原子或碳原子一起可任选地相连接以形成取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，任选地包含两个或更多个杂原子；R4、R4’、R5以及R5’是独立选自下组的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR15R16、NC(O)R15、OC(O)NR15R16、OC(O)OR15、C(O)R15、SR15、OR15、CR15＝NR16、以及O(CH2)nN(CH3)2，或R4、R4’、R5以及R5’的任何相邻对与它们所连接的碳原子连接在一起以形成具有4到6元的、取代或未取代的环烷基或杂环烷基环状体系，其中n是从1到20的整数；R15和R16是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、以及取代或未取代的肽基，其中R15和R16与它们所连接的氮原子一起可任选地相连接以形成一个取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，任选地包含两个或更多杂原子；R6是单键，存在或者不存在，并且当R6存在时，R6和R7相结合，形成环丙基环；并且R7是在所述环丙基环中与R6结合的CH2-X1或-CH2-，其中X1是离去基团，其中R4、R4’、R5、R5’、R15或R16中的至少一个将所述药物连接至L1(如果存在)上，或连接至F上。
在一些实施方案中，该药物具有以上的结构(c)或(f)。适宜作为偶联物使用的化合物的一个具体的例子是
Figure A20078005123101471
其中r是范围从0到24的整数。
作为偶联物使用的适宜的化合物的其他例子包括：
Figure A20078005123101481
以及
Figure A20078005123101491
Figure A20078005123101501
其中r是
Figure A20078005123101511
并且r是在从0到24范围内的整数。
还可以用具有结构(g)的药物形成偶联物，例如以下化合物：
Figure A20078005123101512
Figure A20078005123101521
(其中r是从0至24范围中的整数)。
还可以使用具有以下结构的药物形成偶联物：
Figure A20078005123101522
Figure A20078005123101531
Figure A20078005123101541
以及
Figure A20078005123101542
此类细胞毒素的合成，以及关于它们连接至抗体的细节公开于2007年11月30号提交的美国专利申请系列号60/991,300中。
在某些实施方案中，抗CD70偶联到连接物以及具有结构N1的治疗剂：
在某些实施方案中，抗CD70偶联到连接物以及具有结构N2的治疗剂：
B.可剪切的连接物偶联物
适宜的偶联物的一个例子是具有以下结构的化合物：
Figure A20078005123101553
其中L1是自消间隔；m是0、1、2、3、4、5或6的整数；X2是可剪切的底物；并且D含有以下结构：
Figure A20078005123101554
其中环状体系A是选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基基团的成员；E和G是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、杂原子、单键的成员，或者E和G结合形成一个环状体系，该环状体系选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基；X是选自O、S以及NR23的成员；R23是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员；R3是选自下组的成员：(＝O)、SR11、NHR11以及OR11，其中R11是选自下组的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磺酸酯、酰基、C(O)R12R13、C(O)OR12、C(O)NR12R13、P(O)(OR12)2、C(O)CHR12R13、SR12以及SiR12R13R14，其中R12、R13以及R14是独立选自下组的成员：H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及取代或未取代的芳基，其中R12和R13与它们所连接的氮原子或碳原子一起可任选地相连接以形成取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，任选地包含两个或更多个杂原子；R6是单键，它存在或者不存在，并且当R6存在时，R6和R7结合形成环丙基环；并且R7是在所述环丙基环中与R6结合的CH2-X1或-CH2-，其中X1是离去基团，R4、R4’、R5以及R5’是独立选自下组的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR15R16、NC(O)R15、OC(O)NR15R16、OC(O)OR15、C(O)R15、SR15、OR15、CR15＝NR16、以及O(CH2)nN(CH3)2，或R4、R4’、R5以及R5’的任何相邻的对与它们所连接的碳原子连接在一起以形成具有4到6元的、取代或未取代的环烷基或杂环烷基环状体系，其中n是从1到20的整数；R15和R16独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、以及取代或未取代的肽基，其中R15和R16与它们所连接的氮原子一起可任选地相连接以形成取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，可任选地包含两个或更多个杂原子；其中R4、R4’、R5以及R5’中的至少一个将所述药物连接至L1(如果存在)上，或连接至X2上，并且选自：
Figure A20078005123101571
其中R30、R30’、R31以及R31’各自独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基；并且v是从1到6的整数。
适宜的可剪切连接物的例子包括β-AlaLeuAlaLeu(SEQ ID NO：92)以及
Figure A20078005123101572
药物组合物
在另一方面，本公开提供了组合物，例如药物组合物，该组合物包含本发明的一种单克隆抗体或其抗原结合部分，或多种单克隆抗体或它们的抗原结合部分的组合，并与药学上可接受的载体共同配制而成。这种组合物可包含本发明的抗体或免疫缀合物或双特异性分子的一个或其组合(例如，两种或多种不同的)。例如，本发明的药物组合物可以包含抗体(或免疫缀合物、或双特异性分子)的组合，这些抗体(或免疫缀合物、或双特异性分子)与靶抗原上的不同表位结合、或具有互补的活性。
还可以在联合治疗中施用本发明的药物组合物(即，与其他试剂组合)。例如，该联合疗法可以包括本发明的抗-CD70抗体，该抗-CD70抗体与至少一种其他抗癌剂、消炎剂或者免疫抑制剂组合。以下在本发明的关于抗体用途的章节中对可用于联合治疗的治疗剂的实例进行了更加详尽的说明。
如此处使用的“药学上可接受的载体”包括任何及全部的生理学上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂及吸收延缓剂等。优选地，该载体适宜于静脉内、肌内、皮下、胃肠外、脊髓或表皮给药(例如通过注射或输注)。依据给药途径，活性化合物(即抗体、免疫缀合物或双特异性分子)可用材料包被以保护该化合物免受可能导致该化合物失活的酸以及其他自然条件的作用。
本发明的药物化合物可包含一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保持了母体化合物的所希望的生物活性并不会引起任何不希望的毒理学效应的盐(参见例如Berge，S.M.，等人(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。这种盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括源自无毒无机酸(例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸等)的盐，以及源自无毒有机酸(例如脂肪族单羧酸及二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂肪族及芳香族磺酸等)的盐。碱性加成盐包括源自碱土金属的盐，例如钠、钾、镁及钙等的盐，以及源自无毒有机胺的盐，例如N，N′-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺及普鲁卡因等。
本发明的药物组合物还可包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)，丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯及α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸及磷酸等。
在本公开的药物组合物中可以采用的适宜水性及非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇及聚乙二醇等)，以及它们的适宜的混合物、植物油，如橄榄油，以及可注射的有机酯，例如油酸乙酯。例如通过使用包衣材料(如卵磷脂)、通过维持分散系中所需颗粒的大小、以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。
这些组合物还可包含佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂及分散剂。可通过灭菌程序，以及通过加入不同的抗细菌剂及抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)均可确保防止微生物的存在。将等渗剂(如糖及氯化钠等)包含进入这些组合物中也可能是令人希望的。另外，通过包含延迟吸收的物质(如单硬脂酸铝及明胶)可以实现可注射药物形式的延长吸收。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液、以及用于无菌注射溶液或分散液的即时配制的无菌粉末。用于药学活性物质的这类介质及试剂的使用在本领域中是已知的。除了与活性化合物不相容的任何常规介质或试剂之外，可考虑它在本公开的多种药学组合物中使用。还可以在这些组合物中掺入辅助性活性化合物。
治疗组合物一般必须是无菌的并且在制造及存储条件下是稳定的。该组合物可以被配制成溶液、微乳剂、脂质体、或者其他适于高药物浓度的有序结构。该载体可以是溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇，以及液体聚乙二醇等)，以及它们的适宜的混合物。例如，通过使用包衣(如卵磷脂)、通过维持分散系中所需颗粒的大小、以及通过使用表面活性剂可维持适合的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗试剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)，或氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸盐及明胶)可以实现可注射组合物的延长吸收。通过在适当的溶剂中将所需量的活性化合物与以上列举的多种组分中的一种或组合(按照需要)相掺和、然后进行无菌微过滤即可制备出无菌注射液。总体上，通过将活性化合物掺入至无菌载体(它包含基本分散介质及上述列举的所需的其他组分)来制备分散体。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况，优选的制备方法是真空干燥及冷冻干燥(冻干)，制得该活性组分以及任何来自其预先无菌过滤的溶液的其他希望的组分的粉末。
与载体物质组合以产生单一剂型的活性组分的量值将随着正在接受治疗的受试者及具体给药方式而变化。与载体物质组合以产生单一剂型的活性组分的量一般是产生治疗效果的组合物的量。总体上讲，在100％的数量内，与药学上可接受的载体组合的活性组分的量大约是从0.01％至约99％的范围内，优选从约0.1％至约70％，最优选从约1％至约30％。
对剂量方案进行调节以提供最佳的理想的反应(如治疗反应)。例如，可给予单次大丸剂，可以在一定时间内施用几次分份剂量，或者根据治疗情况的紧急程度所示按比例减少或增加剂量。为给药方便以及剂量统一而按剂量单位形式配制成肠胃外组合物尤为有利。此处使用的剂量单位形式指用于待治疗的受试者单一剂量的物理上分散的单位；每个单位包含经计算能与所需的药学载体相结合产生理想的疗效的预定量的活性化合物。本公开的剂量单位形式的说明由以下因素决定并直接取决于以下因素：(a)活性化合物的独特特性及待实现的特定疗效，以及(b)配制这种用于治疗个体敏感性的活性化合物的领域中固有的局限性。
对于该抗体的给药，剂量为约0.0001至100mg/kg，并且更经常是0.01至25mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或者在1至10mg/kg的范围内。更高的剂量，例如15mg/kg体重，20mg/kg体重或25mg/kg体重可以按需要使用。一种示例性治疗方案限定为每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每三个月一次或每3至6个月一次。本发明抗-CD70抗体的优选剂量方案包括通过静脉内给药1mg/kg体重或3mg/kg体重，使用以下剂量方案之一给予抗体：(i)每4周给予6个剂量，之后每3个月给药；(ii)每三周给药；(iii)3mg/kg体重一次给药，接着每三周按1mg/kg体重给药。
在一些方法中，两种或多种具有不同结合特异性的本发明抗-CD70单克隆抗体被同时给药，这种情况下，所给予的每种抗体的剂量都在所指示的范围之内。通常在多个时间点给予抗体。单个剂量之间的间隔可以是，例如一周、一个月、每三个月或一年。间隔也可以是不规则的，如通过测量患者的针对靶抗原的抗体的血液水平所指示。在一些方法中，调整剂量使血浆抗体浓度大约是1至1000μg/ml，并且在一些方法中大约是25至300μg/ml。
备选地，抗体可以作为缓释制剂给药，在这种情况中需要以较低频率给药。剂量及频率随抗体在患者体内的半衰期而变。一般而言，人类抗体的半衰期最长，其次是人源化抗体、嵌合抗体、以及非人类抗体。给药的剂量及频率可根据治疗是预防性的或是治疗性的而变化。在预防性应用时，在很长的一段时间内以相对较不频繁的间隔给予相对少的剂量。一些患者在其余生中继续接受治疗。在治疗性的应用时，有时需要在相对较短的间隔内给予相对较高的剂量直至疾病进展缓减或终止，并且优选地直至患者显示疾病症状的部分或完全改善。之后，该患者可以接受预防性的给药方案。
为用于与细胞增殖异常有关的疾病预防和/或治疗，所施用化合物的循环浓度优选为大约0.001μM到20μM，优选大约0.01μM到5μM。
此处说明的化合物的患者口服剂量一般是从大约1mg/天到大约10,000mg/天的范围内，更典型地从大约10mg/天到大约1,000mg/天，并且最典型地从大约50mg/天到大约500mg/天。按照患者体重所述，典型的剂量是从大约0.01到大约150mg/kg/天的范围内，更典型地从大约0.1到大约15mg/kg/天，并且最典型地从大约1到大约10mg/kg/天，例如5mg/kg/天或3mg/kg/天。
在至少一些实施方案中，患者的阻滞或抑制肿瘤生长的剂量可以是1μmol/kg/天或者更少。例如，患者的剂量可以是0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.45、0.3、0.2、0.15、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01或0.005μmol/kg或更小(指药物的摩尔)。优选地，抗体-药物偶联物当在至少5天时间内以日剂量给药时，阻止肿瘤细胞的生长。在至少一些实施方案中，该肿瘤为SCID小鼠体内的人类型的肿瘤。作为一个例子，SICD小鼠可以是CB17.SCID小鼠(可从Taconic，Germantown，NY获得)。
可以改变本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平，以获得针对特定患者、组合物及给药方式而言有效实现所希望的治疗反应而对患者无毒的活性成分的量。所选的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素，包括采用的本发明的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，给药途径，给药时间，所用的特定化合物的排泄速率，疗程，在与所采用的特定组合物组合中使用的其他药物、化合物和/或材料，正在接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状态、总体健康状态和病史，以及在医学领域众所周知的类似因素。
本发明的抗CD70抗体的“治疗有效剂量”优选地导致减轻疾病症状的严重程度、延长无疾病症状时间的频率及持续时间或防止由于该病痛产生的损害或残疾。例如，对于CD70阳性肿瘤的治疗而言，相对于未治疗的受试者，“治疗有效剂量”优选抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20％，更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％，并仍更优选至少约80％。化合物抑制肿瘤生长的能力可以在预测人类肿瘤功效的动物模型系统中进行评价。备选地，组合物的这一特性可通过检验该化合物抑制细胞生长的能力来评价，这种抑制作用可通过有经验的从业者已知的测定方法在体外测定。治疗性化合物的治疗有效量可减小肿瘤的大小，或者缓解受试者的症状。本领域的技术人员应能根据受试者的大小、受试者症状的严重程度、以及所选具体组合物或所选择的给药途径等因素而确定这种量值。
使用本领域已知的一种或多种方法通过一种或多种给药途径可以对本发明的组合物进行给药。如技术人员应当理解的，给药途径和/或方式将随所希望的结果而变化。本发明的抗体的优选给药途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其他胃肠外给药途径，例如通过注射或输注。此处使用的短语“胃肠外给药”是指除了肠内及局部给药外的通常通过注射的其他给药方式，并包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、脊柱内、硬膜外及胸骨内注射及输注。
备选地，本发明的抗体可经非胃肠外途径进行给药，非胃肠外途径例如局部、表皮或粘膜途径给药，例如经鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部途径给药。
活性化合物可用载体制备，该载体将保护化合物免于快速释放，例如控释制剂，包括植入剂、经皮贴剂、以及微囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容性的聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、以及聚乳酸。用于制备这种制剂的许多方法已获得专利，或者是本领域技术人员所熟知的。参见，例如Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems，J.R.Robinson编著，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
治疗组合物可利用本领域中已知的医用装置进行给药。例如，在优选的实施方案中，本发明的治疗组合物可利用无针皮下注射装置进行给药，例如在美国专利号5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中所披露的装置。在本发明中有用的熟知的植入剂与模型的实例包括：美国专利号4,487,603，它披露了用于以受控速度释放药物的可植入式微量输注泵；美国专利号4,486,194，它披露了用于通过皮肤给药的治疗装置；美国专利号4,447,233，它披露了用于以精确的输注速度递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，它披露了用于持续药物递送的可变流速的可植入输注装置；美国专利号4,439,196，它披露了具有多腔区室的渗透药物送递系统；以及美国专利号4,475,196，它披露了渗透药物送递系统。这些专利通过引用并入本文。许多其他这种植入剂、递送系统、以及模型是本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，对本发明的人类单克隆抗体进行配制以确保其在体内分布适宜。例如，血脑屏障(BBB)阻止了许多高亲水性化合物。为确保本发明的治疗性化合物穿过BBB(如果需要时)，例如可以将它们配制在脂质体中。用于制造脂质体的方法，参见，例如，美国专利号4,522,811；5,374,548；以及5,399,331。这些脂质体可能包含一个或多个部分，这些部分被选择性地输送到特定的细胞或器官中，由此增强靶标药物的递送(参见，例如V.V.Ranade J.Clin.Pharmacol.29：685，(1989))。示例性靶向部分包括叶酸盐或生物素(参见，例如Low等人的美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等人(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等人(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等人(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods4：273。
本发明的用途和方法
本发明的抗体，特别是人类抗体、抗体组合物、抗体-配偶体分子偶联物组合物以及方法具有涉及诊断和治疗CD70介导的病症的多种体外和体内诊断及治疗用途。例如，可在体外或离体将这些分子给予至培养物中的细胞，或者给予人类受试者(例如体内)，以便治疗、预防并诊断多种病症。如在此所使用的术语“受试者”旨在包括人类及非人类动物。“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如，非人类灵长类动物、羊、犬、猫、牛、马、鸡、两栖动物以及爬行动物。优选的受试者包括患有由CD70活性介导的病症的人类患者。这些方法特别适宜于治疗患有与CD70异常表达相关的病症的人类患者。当与CD70偶联的抗体-配偶体分子偶联物与另一种试剂一起给药时，这两种物质可以依次或者同时给药。
在本发明的抗体特异结合CD70的情况下，本发明的抗体可用于在细胞表面特异地检测CD70的表达，而且，可用于通过免疫亲和纯化来纯化CD70。
CD70表达于各种人类癌症中，包括肾细胞癌、转移性乳癌、脑肿瘤、白血病、淋巴瘤以及鼻咽癌(Junker等人(2005)J Urol.173：2150-3；Sloan等人(2004)Am J Pathol.164：315-23；Held-Feindt和Mentlein(2002)Int JCancer 98：352-6；Hishima等人(2000)Am J Surg Pathol.24：742-6；Lens等人(1999)Br J Haematol.106：491-503)。抗-CD70抗体可单独使用以抑制癌性肿瘤的生长。可替代地，如下说明，抗-CD70抗体可与其他免疫原性试剂、标准癌症治疗或其他抗体结合使用。
优选的癌症(其生长可使用本发明的抗体来抑制)包括一般对免疫治疗作出响应的癌症。用于治疗的优选的癌症的非限制性实例包括肾癌(例如肾细胞癌)、乳癌、脑肿瘤、慢性或急性白血病(包括急性髓样白血病、慢性髓样白血病、急性成淋巴细胞白血病、慢性成淋巴细胞白血病)、淋巴瘤(例如，霍奇金氏及非霍奇金氏淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、T细胞淋巴瘤)以及鼻咽癌。使用本发明的方法可治疗的其他癌症的实例包括：黑色素瘤(例如，转移性恶性黑色素瘤)、前列腺癌、结肠癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌症、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴门癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌(carcinoma of the renalpelvis)、中枢神经系统(CNS)瘤、肿瘤血管发生、脊柱肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波济氏肉瘤、表皮样癌症、鳞状细胞癌、环境诱导性癌症(包括那些由石棉诱导的癌症，例如间皮瘤)以及所述癌症的组合。
此外，在不同肿瘤细胞上表达CD70的情况下，本发明的人类抗体、抗体组合物和方法可用于治疗患有致瘤性病症的受试者，该致瘤性病症例如是以存在表达CD70的肿瘤细胞为特征的病症，包括例如，肾细胞癌(RCC)，如透明细胞RCC、成胶质细胞瘤、乳癌、脑肿瘤、鼻咽癌、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(anaplastic large-celllymphomas)(ALCL)、多发性骨髓瘤、皮肤T淋巴细胞瘤、结节状小裂细胞淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、伦纳特淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴瘤、T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T细胞白血病(T-ALL)、中心母细胞性/中心细胞性(entroblastic/centrocytic)(cb/cc))滤泡淋巴瘤癌、B细胞谱系的弥漫型大细胞性淋巴瘤、血管免疫母细胞性淋巴结病(AILD)样T细胞淋巴瘤、HIV相关的基于体腔的淋巴瘤、胚胎性癌、未分化的鼻咽癌(例如施明克氏瘤)、卡斯尔曼氏病、卡波济氏肉瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症及其他B细胞淋巴瘤。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种在受试者体内抑制肿瘤细胞生长的方法，包括对该受试者给予治疗有效量的抗-CD70抗体或其抗原结合部分。优选地，该抗体为人类抗-CD70抗体(例如在此说明的人类抗-人类CD70抗体中任何抗体)。另外地或者可替代地，该抗体可能是嵌合的或人源化的抗-CD70抗体。
此外，也已提出CD70与CD27的相互作用在细胞介导的自身免疫疾病中发挥作用，如实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)(Nakajima等人(2000)J.Neuroimmunol.109：188-96)。这一效应被认为部分是由TNF-α生成的抑制介导的。此外，CD70信号传导的阻断抑制了CD40介导的CD8阳性T细胞的克隆性增殖并减少CD8阳性记忆T细胞的产生(Taraban等人(2004)J.Immunol.173：6542-6)。如此，本发明的人类抗体、抗体组合物及方法可用于治疗具有自身免疫障碍的受试者，例如以存在表达CD70的B细胞为特征的病症，包括例如，实验性自身免疫脑脊髓炎。可使用本发明抗体的其他的自身免疫障碍包括，但不局限于，系统性红斑狼疮(SLE)、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、炎症性肠病(IBD)(包括克罗恩病、溃疡性结肠炎以及乳糜泻)、多发性硬化症(MS)、牛皮癣、自身免疫性甲状腺炎、类风湿性关节炎(RA)以及肾小球肾炎。此外，本发明的抗体可用于抑制或阻止移植排异反应或治疗移植物抗宿主病(GVHD)。
此外，也已提出CD70与CD27的相互作用在CD4阳性细胞上的信号传导中发挥作用。已表明一些病毒为CD27途径发送信号，导致中和抗体反应的破坏(Matter等人(2006)J Exp Med 203：2145-55)。如此，本发明的人类抗体、抗体组合物及方法可用于治疗病毒感染的受试者，包括，例如，感染人类免疫缺陷病毒(HIV)、肝炎(甲型、乙型及丙型)、疱疹病毒(如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II及CMV、EB病毒)、腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒(cornovirus)、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒及虫媒性脑炎病毒和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)，或用于HIV感染/AIDS的治疗。此外，本发明的人类抗体、抗体组合物及方法可用于抑制TNF-α的生成。
在一个实施方案中，本发明的抗体(例如，人类单克隆抗体、多特异性及双特异性分子及组合物)可用于检测CD70的水平或在细胞膜表面含有CD70的细胞的水平，之后可将这些水平与某些疾病症状相关联。可替代地，抗体可用于抑制或阻断CD70的功能，这转而又可与防止或缓解某些疾病症状相关联，由此暗示了CD70为该疾病的介导物。在允许抗体与CD70之间形成复合物的条件下，这可通过使实验样本和对照样本与抗-CD70抗体相接触来实现。在实验样本和对照样本中检测抗体与CD70之间所形成的任何复合物并进行比较。
在另一个实施方案中，可首先测试本发明的抗体(例如，人类抗体、多特异性和双特异性分子及组合物)与体外治疗或诊断用途相关的结合活性。例如，使用以下实施例中说明的流式细胞测定可测试本发明的组合物。
本发明的抗体(例如，人类抗体、多特异性和双特异性分子、免疫偶联物及组合物)具有在CD70相关疾病的治疗和诊断方面的其他用途。例如，人类单克隆抗体、多特异性分子或双特异性分子、及免疫偶联物可用于在体内或体外激发一个或多个以下的生物学活性：抑制表达CD70的细胞的生长和/或杀死表达CD70的细胞；在人类效应细胞存在时介导表达CD70的细胞的吞噬作用或ADCC；或阻断CD70配体与CD70的结合。
在一个具体的实施方案中，该抗体(例如，人类抗体、多特异性和双特异性分子及组合物)用于体内治疗、预防或诊断多种CD70相关的疾病。CD70相关的疾病的例子除了其他之外还包括，自身免疫障碍、实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)、癌症、肾细胞癌(RCC)，如透明细胞RCC、胶质母细胞瘤、乳癌、脑肿瘤、鼻咽癌、非霍奇金氏淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、多发性骨髓瘤、皮肤T淋巴细胞瘤、结节状小裂细胞淋巴瘤、淋巴细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、伦纳特淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴瘤、T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T细胞白血病(T-ALL)、中心母细胞性/中心细胞性(cb/cc)滤泡淋巴瘤癌、B细胞谱系的弥漫型大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞淋巴结病(AILD)样T细胞淋巴瘤、HIV相关的基于体腔的淋巴瘤、胚胎性癌、未分化型鼻咽癌(例如，施明克氏瘤)、卡斯尔曼氏病、卡波济氏肉瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症及其他B细胞淋巴瘤。
在体内或体外给予本发明的抗体组合物(例如人类单克隆抗体、多特异性及双特异性分子以及免疫偶联物)的适宜途径是在本领域中所熟知的，并且可由那些普通技术人员进行选择。例如，抗体组合物可通过注射(如静脉内或皮下)进行给药。所用的分子的适宜剂量将取决于受试者的年龄与体重以及抗体组合物的浓度和/或配方。
如以上说明，本发明的人类抗-CD70抗体可与一种或多种治疗剂(例如细胞毒剂、放射性毒剂或免疫抑制剂)共同给药。抗体可以与试剂相连接(作为免疫复合物)而给药，或者可以与该试剂分开给药。在后一种(分开给药)情况下，抗体可以在该试剂之前、之后给予或与该试剂同时给予或者可以与其他已知治疗(例如抗癌治疗，如放射)进行共同给药。除其他外，此类治疗剂还包括抗肿瘤剂如多柔比星(阿霉素)、顺铂硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥以及环磷酰胺羟基脲，它们自身只在对患者有毒性或亚毒性的水平时有效。顺铂以100mg/剂静脉内给药，每四周一次，而阿霉素以60至75mg/ml的剂量静脉内给药，每21天一次。本发明的人类抗-CD70抗体或它们的抗原结合片段与化学治疗剂的共同给药提供了两种抗癌剂，这两种抗癌剂通过不同的机制起作用，产生针对人类肿瘤细胞的细胞毒效应。这种共同给药可以解决由于肿瘤细胞产生药物抗性或者抗原性改变方面的问题，产生抗药性或抗原性改变会导致肿瘤细胞与抗体不反应。
本发明的靶标特异性效应细胞，例如，与组合物(例如，人类抗体、多特异性分子以及双特异性分子)相连的效应细胞，也可用作治疗剂。用于靶向的效应细胞可以是人类白细胞，例如，巨噬细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞。其他细胞包括嗜酸性粒细胞、天然杀伤细胞以及其他带有IgG-或IgA-受体的细胞。如果希望的话，效应细胞可从待治疗的受试者体内获得。靶特异性效应细胞可作为在生理学上可接受的溶液中的细胞悬液来进行给药。给予的细胞数可以是108至109数量级，但会根据治疗目的有所变化。通常，该量值足以获得在靶细胞(例如，表达CD70的肿瘤细胞)的定位，并通过(例如吞噬作用)实现细胞杀伤。给药途径也可以改变。
靶特异性效应细胞的疗法可与其他去除靶细胞的技术联合进行。例如，使用本发明的组合物(例如，人类抗体、多特异性分子以及双特异性分子)和/或带有这些组合物的效应细胞的抗肿瘤疗法可以与化学疗法联合使用。此外，组合免疫疗法可用于指导两种不同的细胞毒性效应群对肿瘤细胞的排斥作用。例如，与抗FcγRI或抗-CD3相连的抗-CD70抗体可与IgG-或IgA-受体特异性结合剂联合使用。
本发明的双特异性分子及多特异性分子也可用于调节效应细胞上的FcγR或FcγR水平，例如通过对细胞表面上的受体进行帽化及清除。抗-Fc受体的混合物也可用于这一目的。
本发明的组合物(例如人类抗体、多特异性分子和双特异性分子及免疫偶联物)也可在存在补体的情况下使用，该组合物具有补体结合位点，例如来自结合补体的IgG1、IgG2或IgG3或IgM的部分。在一个实施方案中，细胞群(包括具有本发明的结合试剂的靶细胞及合适的效应细胞)的离体治疗可通过添加补体或含有补体的血清来补充。包被有本发明的结合试剂的靶细胞的吞噬作用可通过补体蛋白质的结合得以改善。在另一个实施方案中，包被有本发明的组合物(例如人类抗体、多特异性及双特异性分子)的靶细胞也可被补体裂解。在又一个实施方案中，本发明的组合物不激活补体。
本发明的组合物(例如人类抗体、多特异性分子和双特异性分子及免疫偶联物)也可与补体一起给予。因此，包含人类抗体、多特异性或双特异性分子及血清或补体的组合物在本发明的范围内。这些组合物是有利的，因为补体定位在非常接近人类抗体、多特异性或双特异性分子的位置。可替代地，本发明的人类抗体、多特异性或双特异性分子可与补体或血清分开给药。
同样在本发明范围内的是包括本发明的抗体组合物(例如人类抗体、双特异性或多特异性分子或免疫偶联物)和使用说明书的试剂盒。该试剂盒可以进一步包括一种或多种其他的药剂，例如免疫抑制试剂、细胞毒素试剂或放射性毒素试剂或一种或多种本发明的其他的人类抗体(例如，具有互补活性的人类抗体，该抗体与不同于第一人类抗体的CD70抗原中的表位相结合)。
因此，用本发明的抗体组合物治疗的患者可被(在给予本发明的人类抗体之前、同时或之后)额外给予另一种治疗剂，例如细胞毒性剂或放射性毒剂，这会增强或增大该人类抗体的治疗效果。
在其他实施方案中，可额外地用试剂来治疗受试者，该试剂通过(例如)用细胞因子治疗受试者，调节(例如，增强或抑制)Fcγ或Fcγ受体的表达或活性。在用多特异性分子治疗过程中给予的优选的细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、γ干扰素(IFN-γ)及肿瘤坏死因子(TNF)。
本发明的组合物(例如人类抗体、多特异性及双特异性分子)也可用于靶向表达FcγR或CD70的细胞，例如为了标记此类细胞。对于这种用途，可将该结合剂与可被检测的分子相连接。因此，本发明提供了离体或体外定位表达Fc受体(如FcγR或CD70)的细胞的方法。该可检测的标记可以是，例如，放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。
在一个具体的实施方案中，本发明提供了用于检测存在于样本中的CD70抗原或者测量CD70抗原的量的方法，这些方法包括：将样本以及对照样本与人类单克隆抗体或其抗原结合部分相接触，该抗体或其抗原结合部分在它们与CD70之间可形成复合物的条件下特异性地结合到CD70上。然后检测复合物的形成，其中与对照样本相比，在该样本中形成的差异复合物指示了在该样本中存在CD70抗原。
在又另一个实施方案中，本发明的免疫偶联物可用于将化合物(例如，治疗剂、标记物、细胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剂等)靶向到具有CD70细胞表面受体的细胞上，这种应用是通过将此类化合物连接至该抗体进行的。例如，抗-CD70抗体可被偶联到任何细胞毒素化合物上，这些细胞毒素化合物说明于美国专利号6,281,354和6,548,530、美国系列号60/991,300、美国专利申请公开号20030050331、20030064984、20030073852及20040087497中或者公开于WO 03/022806中，这些文献均结合在此作为参考。因此，本发明还提供了离体或体内对表达CD70的细胞进行定位的方法(例如，使用可检测的标记，如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。可替代地，免疫偶联物可用于通过将细胞毒素或放射性毒素靶向到CD70来杀死具有CD70细胞表面受体的细胞。
通过下列实例对本发明进行进一步阐述，这些实例不应被解释为进一步的限制。本申请通篇引用的所有附图及所有参考文献、Genbank序列、专利及已公开的专利申请的内容均结合在此作为参考。
实施例
实施例1：针对CD70的人类单克隆抗体的产生
抗原
免疫方案利用融合了双重myc-His标签的重组人类CD70作为抗原。可替代地，在一些免疫中使用了全细胞免疫，该全细胞免疫使用肾癌细胞系786-O(ATCC登录号CRL-1932)并用肾癌细胞系A-498(ATCC登录号HTB-44)加强免疫。
转基因的HuMAb
Figure A20078005123101711
和KM
使用HuMab转基因小鼠的HCo7、HCo12和HCo17品系以及转基因转染色体小鼠的KM品系制备针对CD70的完全人类单克隆抗体，每种小鼠均表达人类抗体基因。在这些小鼠品系中，内源性小鼠κ轻链基因已经如在Chen等人(1993)EMBO J.12：811-820说明被同型结合地破坏，并且该内源性小鼠重链基因已经如PCT公开文件WO 01/09187的实施例1说明的被同型结合地破坏。此外，这个小鼠品系携带人类κ轻链转基因KCo5(如在Fishwild等人(1996)Nature Biotechnology 14：845-851说明)以及人类重链转基因HCo7、HCo12或HCo17(如PCT公开文件WO 01/09187的实施例2说明)。如PCT公开文本WO 02/43478中说明，KM
Figure A20078005123101721
品系含有SC20转染色体。
HuMab和KM免疫：
为产生针对CD70的完全人类单克隆抗体，用作为抗原的重组人类CD70或在细胞表面上表达CD70的全细胞对HuMab
Figure A20078005123101722
和KM
Figure A20078005123101723
进行免疫。对HuMAb小鼠通常的免疫方案说明于Lonberg，N.等人(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.等人(1996)NatureBiotechnology 14：845-851及PCT公开文件WO 98/24884中。第一次输注抗原时小鼠是6至16周龄。用5×106至10×106个细胞对HuMab小鼠经过腹膜内(IP)、皮下(Sc)或通过足垫注射进行免疫。
转基因小鼠用完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原经IP免疫两次，然后3至21天内用不完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原经IP免疫(至多总计11次免疫)。通过眶后取血监测免疫应答。通过ELISA和FACS(如下说明)筛选血浆，并将具有足够滴度的抗-CD70人类免疫球蛋白小鼠用于融合。用抗原经静脉内对小鼠加强免疫3天后处死小鼠并去除脾脏。典型地，对每种抗原进行10至35次融合。每种抗原均免疫几十只小鼠。
产生抗-CD70抗体的HuMab
Figure A20078005123101724
或KM
Figure A20078005123101725
的选择：
为了选出能产生结合CD70的抗体的HuMab
Figure A20078005123101726
或KM
Figure A20078005123101727
通过流式细胞术对来自经免疫的小鼠的血清进行了筛选，选出与表达重组人类CD70的细胞系结合，而不与不表达CD70的对照细胞系结合的血清。此外，通过流式细胞术筛选出与786-O或A-498细胞结合的血清。简言之，通过将表达CD70的CHO细胞、786-O细胞或A498细胞与以1∶20比例稀释的抗-CD70抗体相孵育评估了抗-CD70抗体的结合。洗涤细胞，并用FITC标记的抗-人类IgG Ab检测了结合。使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行了流式细胞分析。如Fishwild，D.等人(1996)说明，与表达CD70的CHO细胞结合而不与表达非CD70的亲代CHO细胞结合的抗体与CD70的结合通过ELISA被进一步测试。简言之，用PBS溶液中的、1-2μg/ml的、来自经转染的CHO细胞的经纯化的重组CD70融合蛋白包被微量滴定板，100μl/孔，在4℃孵育过夜，然后用200μl/孔的、PBS/吐温(0.05％)中的5％鸡血清封闭。将来自经CD70免疫的小鼠的血清的稀释液加至每孔，并在环境物温度下孵育1至2小时。用PBS/吐温清洗板，并接着用偶联辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗人类IgG多克隆抗体在室温下孵育1小时。洗涤后，用ABTS底物(Sigma，A-1888，0.22mg/ml)对板进行显色，并用分光光度计在OD 415-495处进行分析。将显现最高滴度的抗-CD70抗体的小鼠用于融合。如以下说明进行融合，并通过ELISA测试杂交瘤上清液的抗-CD70活性。
生产抗CD70的人类单克隆抗体的杂交瘤的产生：
用基于PEG的标准方案或使用Cyto Pulse大腔细胞融合电穿孔仪(Cyto Pulse Sciences，Inc.，Glen Burnie，MD)的基于电场的电融合，将从HuMab
Figure A20078005123101731
和/或KM
Figure A20078005123101732
分离出的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系进行了融合。然后为了抗原特异性抗体的产生对产生的杂交瘤进行筛选。用50％的PEG(Sigma)使来自经免疫小鼠的脾细胞的单细胞悬液与四分之一数目的SP2/0非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1581)融合。将细胞以大约1×105/孔接种于平底微量滴定板上，之后在DMEM高糖培养基中孵育一周，该培养基含有L-谷氨酰胺和丙酮酸钠(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)，并且进一步含有10％的胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)、18％的P388DI条件培养基、5％的Origen Hybridoma克隆因子(BioVeris，Gaithersburg，VA)、4mM的L-谷氨酰胺、5mM的HEPES、0.055mM的β-巯基乙醇、50单位/ml的青霉素、50mg/ml链霉素及1×次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)培养基(Sigma；在融合后24小时加入HAT)。一周后，用HT替换了HAT的培养基培养细胞。然后通过FACS或ELISA(以上说明)针对人类抗-CD70单克隆IgG抗体筛选各孔。当杂交瘤广泛生长后，通常在10至14天后监测培养基。对分泌抗体的杂交瘤进行再次接种、再次筛选，并且，如果仍对人类IgG呈阳性，则通过有限稀释对抗-CD70单克隆抗体进行至少两次亚克隆。然后将稳定的亚克隆在体外进行培养以便在组织培养基中产生少量抗体用于进一步表征。
选择杂交瘤克隆2H5、10B4、8B5、18E7及69A7用于进一步分析。
实施例2：人类单克隆抗体2H5、10B4、8B5、18E7、69A7及1F4的结构表征
使用标准PCR技术分别从2H5、10B4、8B5、18E7、69A7和1F4杂交瘤中获得了对2H5、10B4、8B5、18E7、69A7和1F4单克隆抗体的重链和轻链可变区进行编码的cDNA序列，并使用标准的DNA测序技术进行了测序。
2H5的重链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图1A以及SEQ IDNO：49和SEQ ID NO：1中所示。
2H5的轻链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别如图1B以及SEQ IDNO：55和SEQ ID NO：7所示。
2H5重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列的比较证明了2H5重链利用了来自人类种系VH 3-30.3的VH区段、未确定的D区段及来自人类种系JH4b的JH区段。2H5VH序列与种系VH 3-30.3序列的比对示于图7。使用CDR区确定的Kabat系统对2H5VH序列进一步分析，得到分别如图1A和7以及SEQ ID NO：13、19和25所示的重链CDR1、CDR2和CDR3区的示意图。
2H5轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明了2H5轻链利用来自人类种系VK L6的VL区段以及来自人类种系JK 4的JK区段。2H5VL序列与种系VK L6序列的比对示于图11。使用CDR区确定的Kabat系统对2H5VL序列进一步分析，得到分别如图1B和11以及SEQ ID NO：31、37和43所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3区的示意图。
10B4的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别示于图2A以及SEQID NO：50和2中。
10B4的轻链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别示于图2B以及SEQ IDNO：56和8中。
10B4的重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列的比较证明了10B4重链利用来自人类种系VH 3-30.3的VH区段、来自人类种系4-11的D区段以及来自人类种系JH 4b的JH区段。10B4 VH序列与种系VH 3-30.3序列的比对示于图7。使用CDR区确定的Kabat系统对10B4VH序列进一步分析，得到分别如图2A和7，以及SEQ ID NO：14、20和26所示的重链CDR1、CDR2以及CDR3区的示意图。
10B4轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明了10B4轻链利用来自人类种系VK L18的VL区段以及来自人类种系JK 3的JK区段。10B4VL序列与种系VK L18序列的比对示于图12。使用CDR区确定的Kabat系统对10B4VL序列进一步分析，得到分别如图2B和12，以及SEQ ID NO：32、38和44所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3区的示意图。
8B5的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别示于图3A及SEQ IDNO：51和3中。
8B5的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别示于图3B以及SEQ IDNO：57及9中。
8B5的重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列的比较证明了8B5重链利用来自人类种系VH 3-33的VH区段、来自人类种系3-10的D区段以及来自人类种系JH 4b的JH区段。8B5 VH序列与种系VH 3-33序列的比对示于图8。使用CDR区确定的Kabat系统对8B5VH序列进一步分析，得到分别如图3A和8，以及SEQ ID NO：15、21和27所示的重链CDR1、CDR2以及CDR3区的示意图。
8B5轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明了8B5轻链利用来自人类种系VK L15的VL区段以及来自人类种系JK 4的JK区段。8B5VL序列与种系VK L15序列的比对示于图13。使用CDR区确定的Kabat系统对8B5VL序列进一步分析，得到分别如图3B和13，以及SEQ ID NO：33、39和45所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3区的示意图。
18E7的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别示于图4A及SEQ IDNO：52和4。
18E7的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别示于图4B及SEQ IDNO：58和10。
18E7的重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列的比较证明了18E7重链利用来自人类种系VH 3-33的VH区段、来自人类种系3-10的D区段以及来自人类种系JH 4b的JH区段。18E7VH序列与种系VH 3-33序列的比对示于图8。使用CDR区确定的Kabat系统对18E7VH序列进一步分析，得到分别如图4A和8，以及SEQ ID NO：16、22和28所示的重链CDR1、CDR2以及CDR3区的示意图。
18E7轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明了18E7轻链利用来自人类种系VK L15的VL区段以及来自人类种系JK 4的JK区段。18E7VL序列与种系VK L15序列的比对示于图13。使用CDR区确定的Kabat系统对18E7VL序列进一步分析，得到分别如图4B和13，以及SEQ ID NO：34、40和46所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3区的示意图。
69A7的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别如图5A以及SEQ IDNO：53和5所示。
69A7的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别如图5B以及SEQ IDNO：59和11所示。
69A7的重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列的比较证明了69A7重链利用来自人类种系VH 4-61的VH区段、来自人类种系4-23的D区段以及来自人类种系JH 4b的JH区段。69A7VH序列与种系VH 4-61序列的比对示于图9。使用CDR区确定的Kabat系统对69A7VH序列进一步分析，得到分别如图5A和9，以及SEQ ID NO：17、23和29所示的重链CDR1、CDR2以及CDR3区的示意图。
69A7轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明了69A7轻链利用来自人类种系VK L6的VL区段以及来自人类种系JK 4的JK区段。69A7VL序列与种系VK L6序列的比对示于图14。使用CDR区确定的Kabat系统对69A7VL序列进一步分析，得到分别如图5B和14，以及SEQ ID NO：35、41和47所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3区的示意图。
1F4的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别如图5A以及SEQ IDNO：54和6所示。
1F4的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别如图5B以及SEQ IDNO：60和12所示。
1F4的重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列的比较证明了1F4重链利用来自人类种系VH 3-23的VH区段、来自人类种系4-4的D区段以及来自人类种系JH 4b的JH区段。1F4VH序列与种系VH 3-23序列的比对示于图10。使用CDR区确定的Kabat系统对1F4VH序列进一步分析，得到分别如图5A和10，以及SEQ ID NO：18、24和30所示的重链CDR1、CDR2以及CDR3区的示意图。
1F4轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明了1F4轻链利用来自人类种系VK A27的VL区段以及来自人类种系JK 2的JK区段。1F4VL序列与种系VK A27序列的比对示于图15。使用CDR区确定的Kabat系统对1F4VL序列进一步分析，得到分别如图5B和15，以及SEQ ID NO：36、42和48所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3区的示意图。
实施例3：抗-CD70人类单克隆抗体的结合特异性的表征
通过标准的ELISA对抗-CD70抗体与经免疫纯化的CD70的结合进行比较，来检查对CD70的结合特异性。
将重组的带myc标签的CD70包被于板上过夜，然后测试其对抗-CD70人类单克隆抗体2H5、10B4、8B5和18E7的结合。进行标准的ELISA步骤。以1μg/ml的浓度加入抗-CD70人类单克隆抗体，并以1∶2的系列稀释比进行滴定。使用偶联辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗人类IgG(Fc或κ链特异的)多克隆抗体作为第二抗体。结果示于图16。抗-CD70人类单克隆抗体2H5、10B4、8B5及18E7以高特异性与CD70结合。
实施例4：与表达于肾癌的癌细胞系表面的CD70结合的抗-CD70抗体的表征
通过流式细胞术测试抗-CD70抗体与在细胞表面表达CD70的肾细胞癌细胞的结合。
各自测试了肾细胞癌细胞系A-498(ATCC登录号HTB-44)、786-O(ATCC登录号CRL-1932)、ACHN(ATCC登录号CRL-1611)、Caki-1(ATCC登录号HTB-46)以及Caki-2(ATCC登录号HTB-47)的抗体结合。通过将1×105个细胞与浓度为1μg/ml的2H5一起孵育来评估HuMAb2H5抗-CD70人类单克隆抗体的结合。洗涤细胞，并用FITC标记的抗人类IgG Ab检测结合。使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。结果示于图17。抗-CD70单克隆抗体2H5与肾癌细胞系A-498、786-O、ACHN、Caki-1以及Caki-2结合。
测试肾细胞癌细胞系786-O和A-498对于不同浓度的HuMAb抗-CD70人类单克隆抗体2H5、8B5、10B4以及18E7的结合。通过将5×105个细胞与抗体一起孵育来评估抗-CD70人类单克隆抗体的结合，该抗体起始浓度为50μg/ml，并以1∶3的稀释比对抗体进行系列稀释。洗涤细胞，并用PE标记的抗人IgG Ab检测结合。使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。结果示于图18A(786-O)和图18B(A-498)中。如通过染色的平均荧光强度(MFI)所测得的，抗CD7单克隆抗体2H5、8B5、10B4以及18E7以浓度依赖性的方式与肾癌细胞系786-O和A-498结合。抗-CD70单克隆抗体的EC50值的范围对于786-O细胞系是从1.844nM到6.669nM且对于A-498细胞系是从3.984nM到11.84nM。
通过将2×105个细胞与浓度为10μg/ml的2H5或69A7孵育，对HuMAb2H5和69A7抗-CD70人类单克隆抗体与肾细胞癌细胞系786-O的结合进行评估。使用同种型对照抗体作为阴性对照物。洗涤细胞，并用FITC标记的抗人类IgG Ab检测结合。使用FACSCalibur流式细胞仪(BectonDickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。结果示于图18C。两种抗-CD70单克隆抗体都能与肾癌细胞系786-O结合。
测试了肾细胞癌细胞系786-O对不同浓度的HuMAb抗-CD70人类单克隆抗体69A7的结合。通过将5×105个细胞与抗体一起孵育评估了抗-CD70人类单克隆抗体的结合，该抗体起始浓度为10μg/ml，并以1∶3的稀释比对抗体进行系列稀释。洗涤细胞，并用PE标记的抗人类IgG Ab检测结合。使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。结果示于图18D。如通过染色的平均荧光强度(MFI)所测得的，抗-CD70单克隆抗体69A7以浓度依赖性方式与肾癌细胞系786-O结合。抗-CD70单克隆抗体69A7与786-O结合的EC50值是6.927nM。
这些数据证明抗-CD70HuMAb与肾细胞癌的细胞系结合。
实施例5：与表达于淋巴瘤细胞系表面的CD70结合的抗-CD70抗体的表征
通过流式细胞术测试了抗-CD70抗体与在细胞表面表达CD70的淋巴瘤细胞的结合。
分别测试了淋巴瘤细胞系Daudi(ATCC登录号CCL-213)、HuT 78(ATCC登录号TIB-161)以及Raji(ATCC登录号CCL-86)对抗体的结合。通过将1×105细胞与浓度为1μg/ml的2H5一起孵育来评估HuMAb2H5抗-CD70人类单克隆抗体的结合。洗涤细胞，并用FITC标记的抗人类IgG Ab检测结合。使用在细胞表面不表达CD70的Jurkat细胞系作为阴性对照物。使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。结果示于图19。如通过染色的平均荧光强度(MFI)所测得的，抗-CD70单克隆抗体2H5与淋巴瘤细胞系Daudi、HuT 78以及Raji结合。
测试淋巴瘤细胞系Raji和Granta 519(DSMZ登录号342)对不同浓度的HuMAb抗-CD70人类单克隆抗体2H5的结合。通过将5×105个细胞与抗体一起孵育来评估抗-CD70人类单克隆抗体的结合，该抗体起始浓度为50μg/ml，并以1∶3的稀释比对抗体进行系列稀释。使用同种型对照抗体作为阴性对照物。洗涤细胞，并用PE标记的抗人IgG Ab检测结合。使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。结果示于图20A(Raji)和20B(Granta 519)中。如通过染色的平均荧光强度(MFI)所测得的，抗-CD70单克隆抗体2H5以浓度依赖性方式与淋巴瘤细胞系Raji和Granta 519结合。抗-CD70抗体的EC50值对于Raji细胞是1.332nM，而对于Granta 519细胞是1.330nM。
通过将2×105个细胞与浓度为10μg/ml的HuMAb一起孵育评估了HuMAb 2H5和69A7抗-CD70人类单克隆抗体与Raji淋巴瘤细胞系的结合。洗涤细胞，并用FITC标记的抗人类IgG Ab检测结合。使用同种型对照抗体并仅用第二抗体作为阴性对照物。使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。结果示于图20C中。如通过染色的平均荧光强度(MFI)所测得的，两种抗-CD70单克隆抗体都与Raji淋巴瘤细胞系结合。
进行竞争FACS测定以阐明69A7和2H5相比的结合特异性。Raji细胞与10μg/ml浓度的裸露的69A7、2H5、同种型对照抗体或无抗体一起孵育。洗涤后，将细胞与浓度为10μg/ml的偶联FITC的69A7一起孵育。洗涤细胞，并用FITC标记的抗人类IgG Ab检测结合。使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。结果示于图20D。抗-CD70抗体69A7和2H5均阻碍了FITC标记的69A7的结合，表明2H5和69A7二者共用相似的结合表位。
进一步测试了Daudi淋巴瘤细胞系和786-O肾癌细胞对抗体的结合。通过将2×105个细胞与浓度为1μg/ml的69A7一起孵育评估了HuMAb69A7抗-CD70人类单克隆抗体的结合。洗涤细胞，并用FITC标记的抗人类IgG Ab检测结合。使用在细胞表面不表达CD70的Jurkat细胞系作为阴性对照物。使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。结果示于图20E。如通过染色的平均荧光强度(MFI)所测得的，抗-CD70单克隆抗体69A7与Daudi淋巴瘤细胞系和786-O肾癌细胞系结合。
这些数据证明抗-CD70HuMAb与淋巴瘤细胞系结合。
实施例6：抗-CD70单克隆抗体的结合亲和力的Scatchard分析
使用Scatchard分析测试了2H5、8B5、10B4及18E7单克隆抗体对经CD70转染的CHO细胞系的结合亲和力。
使用标准技术用全长的CD70转染CHO细胞，并使其在含10％胎牛血清(FBS)的RPMI培养基中生长。细胞被胰蛋白酶消化，并在基于Tris的结合缓冲液(24mM Tris pH 7.2，137mM NaCl，2.7mM KCl，2mM葡萄糖，1mM CaCl2，1mM MgCl2，0.1％BSA)中洗涤一次，并且在结合缓冲液中将细胞调至2×106个细胞/ml。用水中的1％脱脂奶粉包被Millipore板(MAFB NOB)，并在4℃下贮存过夜。用0.2ml结合缓冲液将板洗涤三次。将50微升缓冲液单独加至最大结合孔(总结合)中。将25微升缓冲液单独加至对照孔(非特异性结合)中。将不同浓度的125I-抗-CD70抗体以25μl的体积加至所有孔中。以100倍过量的量向对照孔中加入体积为25μl不同浓度的未标记的抗体，并将结合缓冲液中的25μl经CD70转染的CHO细胞(2×106个细胞/ml)加至所有孔。将板置于摇床上以200RPM在4℃孵育2小时。孵育完成后，用0.2ml冷的洗涤缓冲液(24mM Tris pH 7.2，500mM NaCl，2.7mM KCl，2mM葡萄糖，1mMCaCl2，1mM MgCl2，0.1％BSA)将Millipore板洗涤3次。除去过滤物并用γ计数器计数。利用Prism软件(San Diego，CA)，用单一位点结合参数进行平衡结合评估。
使用以上的scatchard结合测定，抗体对转染CD70的CHO细胞的KD对于2H5是2.1nM，对于8B5是5.1nM，对于10B4是1.6nM，对于18E7是1.5nM。
实施例7：抗-CD70单克隆抗体的内化
使用Hum-Zap内化测定法测试抗-CD70HuMAb内化至表达CD70的肾癌细胞中的能力。Hum-Zap测定法对人类第一抗体的内化进行了测试，这是通过对与细胞毒素皂草毒蛋白相偶联的人类IgG具有亲和力的第二抗体的结合来进行的。
将表达CD70的肾癌癌细胞系786-O以1.25×104个细胞/孔(100μl/孔)接种于孔中过夜。向孔中加入抗-CD70HuMAb抗体2H5、8B5、10B4或18E7，起始浓度为30nM，并以1∶3的系列稀释比进行滴定。将对CD70非特异性的同种型对照抗体用作阴性对照物。以11nM的浓度加入Hum-Zap(Advanced Targeting Systems，San Diego，CA，IT-22-25)，并将板孵育72小时。然后用1.0μCi的3H-胸腺嘧啶核苷对板脉冲24小时，收集并用Top Count Scintillation Counter(Packard Instruments，Meriden，CT)进行读数。结果示于图21中。抗-CD70抗体2H5、8B5、10B4和18E7显示，在表达CD70的786-O肾癌癌细胞中3H-胸腺嘧啶核苷掺入的抗体浓度依赖性降低。抗-CD70抗体2H5的EC50值是0.9nM。此数据证明了抗-CD70抗体2H5、8B5、10B4和18E7内化至肾癌癌细胞系中。
实施例8：在肾细胞癌细胞系中偶联细胞毒素的抗-CD70抗体的细胞杀伤作用的评估
在这个实施例中，在细胞增殖测定中，测试偶联到细胞毒素D(图73)的抗-CD70单克隆抗体杀伤CD70阳性肾细胞癌细胞系的能力。细胞毒素D是一种需要酯酶激活的前体药物。
将抗-CD70HuMAb抗体2H5、8B5、10B4或18E7通过连接物与细胞毒素D相结合，该连接物例如肽基、腙或二硫化物连接物。在孔中以2.5×104个细胞/孔(100μl/孔)接种表达CD70的肾癌癌细胞系ACHN和Caki-2，并且以1.25×104个细胞/孔(100μl/孔)接种表达CD70的肾癌癌细胞系786-O 3小时。向孔中加入抗-CD70抗体-细胞毒素偶联物，起始浓度为30nM，并以1∶3的系列稀释比进行滴定。将对CD70非特异性的同种型对照抗体用作阴性对照物。将板孵育69小时。然后用1.0μCi的3H-胸腺嘧啶核苷对板脉冲24小时，收集并用Top Count Scintillation Counter(PackardInstruments，Meriden，CT)进行读数。结果示于图22A(Caki-2)、22B(786-O)和22C(ACHN)中。抗-CD70抗体2H5、8B5、10B4和18E7显示，在表达CD70的Caki-2、786-O和ACHN肾癌癌细胞中3H-胸腺嘧啶核苷掺入的抗体-细胞毒素浓度依赖性降低。抗-CD70抗体的EC50值在CAKI-2细胞中范围是从6nM到76nM，在786-O细胞中范围是从1.6nM到3.9nM，并且在ACHN细胞中范围是从9nM到108nM。此数据证明了抗-CD70抗体2H5、8B5、10B4和18E7当偶联到细胞毒素时对肾癌癌细胞是有细胞毒性的。
实施例9：抗-CD70抗体的ADCC活性的评估
在这个实施例中，在荧光细胞毒性测定中测试了抗-CD70单克隆抗体在效应细胞存在下通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)杀伤CD70阳性细胞系的能力。
如以下说明从全血中制备人类效应细胞。通过标准菲科帕克分离，从肝素化的全血中纯化了人类外周血单核细胞。将细胞重悬于含10％FBS和200U/ml人类IL-2的RPMI1640培养基中，并于37℃孵育过夜。次日收集细胞，并在培养基洗涤4次，并以2×107个细胞/ml重悬细胞。用BATDA试剂(Perkin Elmer，Wellesley，MA)在每1×106靶细胞2.5μl BATDA/mL情况下将CD70阳性的靶细胞于37℃孵育20分钟。将靶细胞洗涤4次，离心并达到1×105个细胞/ml的终体积。
使用以下的Delfia荧光发射分析测试下列CD70阳性细胞系对人类抗-CD70单克隆抗体的抗体特异性ADCC：ARH-77(人类B淋巴母细胞白血病；ATCC登录号CRL-1621)、HuT78(人类皮肤淋巴细胞淋巴瘤；ATCC登录号TIB-161)、Raji(人类B淋巴细胞伯基特淋巴瘤；ATCC登录号CCL-86)以及阴性对照细胞系(L540人类霍奇金氏淋巴瘤；DSMZ储存号.ACC 72)。使每个靶细胞系(100μl经标记的靶细胞)与50μl效应细胞和50μl抗体一起孵育。整个实验中使用的靶细胞与效应细胞比率为1∶50。在所有研究中，使用人类IgG1同种型对照物作为阴性对照物。在2000rpm脉冲离心以及37℃孵育一小时后，收集上清液，再次快速离心，并将20μl上清液转移至平底板中，向板中加入180μl Eu溶液(Perkin Elmer，Wellesley，MA)，并在RubyStar读数仪(BMG Labtech)中进行读数。裂解％计算如下：(样本释放量-自发释放量＊100)/(最大释放量-自发释放量)，其中自发释放量是来自仅含有靶细胞的那些孔的荧光，而最大释放量是来自含有靶细胞并已经用2％Triton-×处理的那些孔的荧光。ARH-77、HuT78、Raji和L-540细胞系的细胞的细胞毒性裂解％分别示于图23A至D中。使用HuMAb抗-CD70抗体2H5和18E7的每一种表达了CD70阳性的细胞系ARH-77、HuT78以及Raji均表现出抗体介导的细胞毒性，而阴性对照细胞系L-540在抗-CD70抗体的存在下没有表现出可评估的细胞毒性。此数据证明，HuMAb抗-CD70抗体显示出了对表达CD70阳性的细胞的特异性细胞毒性。
实施例10：评估偶联有细胞毒素的抗-CD70抗体对人类淋巴瘤细胞系的细胞杀伤作用
在这个实施例中，在细胞增殖测定中，测试偶联到细胞毒素C(图72)的抗-CD70单克隆抗体2H5杀伤CD70阳性人类淋巴瘤细胞系的能力。细胞毒素C是一种需要酯酶激活的前体药物。
将抗-CD70HuMAb抗体2H5通过连接物与细胞毒素C相偶联，该连接物例如肽基、腙或二硫化物连接物。可以偶联到本发明的抗体上的细胞毒素化合物的实施例说明于同时提交的申请：在2005年9月26日提交的美国系列号60/720,499以及2006年9月26日提交的PCT公开号WO07/038658，它们的内容在此合并作为参考。将表达CD70的人类淋巴瘤癌细胞系Daudi、HuT 78、Granta 519和Raji以105个细胞/孔(100μl/孔)接种于孔中3小时。向孔中加入抗-CD70抗体-细胞毒素偶联物，起始浓度为30nM，并以1∶2的系列稀释比进行滴定。也将HuMAb抗体2H5-细胞毒素偶联物在Jurkat细胞(在细胞表面不表达CD70的一种阴性对照细胞系)上进行测试。将板孵育72小时。然后用0.5μCi的3H-胸腺嘧啶核苷对板脉冲8小时，之后终止培养，收集并用Top Count Scintillation Counter(Packard Instruments)进行读数。图24表明了2H5-偶联物对Daudi、HuT 78、Granta 519和Jurkat细胞的效应。抗-CD70抗体2H5表现了在表达CD70的Daudi、HuT 78以及Granta 519B细胞淋巴瘤癌细胞中3H胸腺嘧啶核苷掺入的抗体-细胞毒素浓度依赖性降低，而在Jurkat细胞中没有相应表现。
在一个单独的测定中，将表达CD70的人类淋巴瘤癌细胞系Raji以104细胞/孔(100μl/孔)接种于孔中3小时。向孔中加入抗-CD70抗体-细胞毒素偶联物，起始浓度为30nM，并以1∶3的系列稀释比进行滴定。使用细胞毒素-偶联物同种型对照抗体作为对照物。将板孵育72小时，在3小时洗涤一次，或者连续洗涤。然后用0.5μCi的3H-胸腺嘧啶核苷对板脉冲8小时，之后终止培养，收集并在Top Count Scintillation Counter(PackardInstruments)中进行读数。图25A和25B分别示出采用3小时洗涤或连续洗涤在Raji细胞中3H胸腺嘧啶核苷掺入的抗体-细胞毒素浓度依赖性降低。
此数据证明了与细胞毒素偶联的抗-CD70抗体显示出对于人类淋巴瘤癌细胞的特异性细胞毒性。
实施例11：使用裸露的以及偶联细胞毒素的抗-CD70抗体对体内肿瘤异种移植模型的治疗
用偶联细胞毒素的抗-CD70抗体对植入了肾细胞癌肿瘤的小鼠进行体内治疗，以检验抗体在体内对肿瘤生长的影响。
使用标准的实验室操作在体外对A-498(ATCC登录号HTB-44)和ACHN(ATCC登录号CRL-1611)进行扩增。在6至8周龄之间的雄性Ncr无胸腺裸鼠(Taconic，Hudson，NY)每只小鼠在右侧腹经皮下植入了在0.2ml的PBS/基质胶(Matrigel)(1∶1)中的7.5×106ACHN或A-498细胞。对小鼠称重，并在植入后，用电子测径器每周两次对肿瘤进行三维测量。按照长×宽×高计算肿瘤体积。将带有平均270mm3的ACHN肿瘤或平均110mm3的A498肿瘤的小鼠随机分至治疗组。在0天向小鼠腹膜内注入PBS运载体、偶联细胞毒素的同种型对照抗体或偶联细胞毒素的抗-CD70HuMAb 2H5。可偶联到本发明抗体的细胞毒素化合物的实例说明于2006年9月26日提交的美国临时申请系列号60/720,499和PCT公开号WO 07/038658中，其内容在此合并作为参考。用三种不同的细胞毒素化合物(细胞毒素A(N1)、细胞毒素B(图71)和细胞毒素C(图72))对A-498样品组中的小鼠进行测试。给药后监测小鼠的肿瘤生长60天。当肿瘤达到肿瘤终点(2000mm3)时，使小鼠安乐死。
结果示于图26A(A-498肿瘤)和图26B(ACHN肿瘤)。偶联到细胞毒素上的抗-CD70抗体2H5延长了达到肿瘤终点体积(2000mm3)的平均时间，并减缓了肿瘤生长进程。因此，用抗-CD70抗体-细胞毒素偶联物体内治疗对肿瘤生长具有直接的抑制作用。
实施例12：2H5的免疫组织化学
使用来自透明细胞肾细胞癌(ccRCC)、淋巴瘤以及成胶质细胞瘤病人的临床活检组织，通过免疫组织化学检查了抗-CD70HuMAb 2H5识别CD70的能力。
使用了5μm的冰冻切片进行免疫组织化学测定(Ardais Inc，USA)。干燥30分钟后，用丙酮固定切片(室温下10分钟)，并风干5分钟。将载玻片在PBS中漂洗，并接着用含10％的正常山羊血清的PBS预孵育20分钟，并接着用在PBS中含10％正常山羊血清的10μg/ml的FITC化的2H5于室温孵育30分钟。然后，用PBS洗涤玻片3次，并在室温下用小鼠抗FITC(10μg/ml DAKO)孵育30分钟。再次用PBS洗涤玻片，并在室温下用山羊抗小鼠HRP偶联物(DAKO)孵育30分钟。再用PBS洗涤玻片3次。使用二氨基联苯胺(Sigma)作为底物，得到棕色染色。在用蒸馏水洗涤后，载玻片用苏木精(hematoxyllin)复染色1分钟。随后，将载玻片在流动的蒸馏水中洗涤10秒钟，并用glycergel(DAKO)封固。临床活组织检查免疫组织化学染色显示了在非霍奇金氏淋巴瘤、浆细胞瘤、ccRcc以及成胶质细胞瘤切片中的阳性染色。在每种情况中只有恶性细胞呈阳性，相邻的正常组织没有被染色。
实施例13：去岩藻糖化的HuMAb的产生
已经证实具有减少量的岩藻糖残基的抗体提高了抗体的ADCC能力。在这个实施例中，已经产生缺少岩藻糖残基的2H5HuMAb。
用表达抗体2H5的重链和轻链的载体对缺乏岩藻糖转移酶基因FUT 8的CHO细胞系Ms704-PF(Biowa，Inc.，Princeton，NJ)进行电穿孔。通过在含有6mM L-谷氨酰胺和500μg/ml G418(Invitrogen，Carlsbad，CA)的Ex-Cell 325-PF CHO培养基(JRH Biosciences，Lenexa，KS)中生长来选择药物抗性克隆。通过标准ELISA测定筛选表达IgG的克隆。产生了两个单独的克隆B8A6和B8C11，其产率在每天每个细胞1.0至3.8皮克的范围内。
实施例14：去岩藻糖化的抗-CD70抗体的ADCC活性的评估
在这个实施例中，在荧光细胞毒性测定中测试了去岩藻糖化和非去岩藻糖化的抗-CD70单克隆抗体在效应细胞存在下经抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)杀伤CD70阳性细胞的能力。
如以上方法对人类抗-CD70单克隆抗体2H5进行去岩藻糖化。如下从全血中制备人类效应细胞。通过标准菲科帕克分离，从肝素化的全血中纯化了人类外周血单核细胞。将细胞重悬于含有10％FBS(培养基)和200U/ml人类IL-2的RPMI1640培养基中，并在37℃孵育过夜。第二天，收集细胞并用培养基洗涤一次，并以2×107个细胞/ml的密度重悬。以每1×106靶细胞/mL用2.5μl BATDA的浓度，在补充有2.5mM丙磺舒(测定介质)的培养基中将CD70阳性靶细胞与BATDA试剂(Perkin Elmer，Wellesley，MA)在37℃孵育20分钟。将靶细胞用含有20mM HEPES和2.5mM丙磺舒的PBS洗涤四次，离心并使在测定介质中终体积为1×105个细胞/ml。
使用如下的Delfia荧光发射分析测试去岩藻糖化和非去岩藻糖化的人类抗-CD70单克隆抗体2H5对以下CD70阳性细胞系的抗体特异性ADCC：ARH-77(人类B淋巴母细胞白血病；ATCC登录号CRL-1621)、MEC-1(人类慢性B细胞白血病；DSMZ登录号ACC 497)、SU-DHL-6(人类B细胞淋巴瘤，DSMZ登录号Acc572)、IM-9(人类B淋巴母细胞；ATCC登录号CCL-159)以及HuT 78(人类皮肤淋巴细胞淋巴瘤；ATCC登录号TIB-161)。将靶细胞系ARH77(100μl经标记的靶细胞)与50μl效应细胞及50μl 2H5或去岩藻糖化的2H5抗体一起孵育。整个实验中使用靶细胞与效应细胞的比率为1∶50。使用人类IgG1同种型对照物作为阴性对照物。在2100rpm脉冲离心以及37℃孵育一小时后收集上清液，再次快速离心，并将20μl上清液转移至平底板中，向板中加入180μl的Eu溶液(Perkin Elmer，Wellesley，MA)，并用Fusion Alpha TRF平板读数仪(Perkin Elmer)读数。裂解％计算如下：(样本释放量-自发释放量×100)/(最大释放量-自发释放量)，其中自发释放量是来自仅含有靶细胞的孔的荧光，而最大释放量是来自含有靶细胞并经3％来苏尔处理的孔的荧光。ARH-77细胞系的细胞的细胞毒性特异性裂解％示于图27A至F。表达CD70阳性的细胞系ARH-77、MEC-1、SU-DHL-6、IM-9和HuT 78表现出了HuMAb抗-CD70抗体2H5的抗体介导的细胞毒性以及与抗-CD70抗体2H5的去岩藻糖化形式相关的特异性裂解的百分比的提高。此外，已显示抗CD16抗体在MEC-1细胞系中阻断ADCC效应。此数据证明，去岩藻糖化的HuMAb抗-CD70抗体显示出了对表达CD70阳性的细胞的提高的特异性细胞毒性。
实施例15：利用51Cr释放测定评估抗-CD70抗体的ADCC活性
在这个实施例中，在51Cr释放测定中测试了抗-CD70单克隆抗体在效应细胞存在下经抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)杀伤CD70阳性Raji B淋巴细胞的能力。
通过标准菲科帕克分离，从肝素化的全血中纯化了人类外周血单核细胞(效应细胞)。将细胞以2×106个/mL的密度重悬于含10％FBS和200U/ml人类IL-2的RPMI1640培养基中，并于37℃孵育过夜。第二天，收集细胞并用培养基洗涤一次，并以2×107个细胞/ml的密度重悬。在1ml总体积中将两百万个靶Raji细胞(人类B淋巴细胞伯基特淋巴瘤；ATCC登录号CCL-86)同200μCi 51Cr在37℃下孵育1小时。将靶细胞洗涤一次，重悬于1ml培养基中，并在37℃下另外孵育30分钟。在最后的孵育后，将靶细胞洗涤一次，并使终体积为1×105细胞/ml。为了最后的ADCC测定，将100μl被标记的Raji细胞与50μl效应细胞和50μl抗体进行孵育。整个实验中使用靶细胞与效应细胞的比例为1∶100。在所有研究中，使用人类IgG1同种型对照物作为阴性对照物。在一些研究中，在向测定板加入PBMC之前，将PBMC培养物等分到含有20μg/mL的抗人类CD16抗体、无关的小鼠IgG1抗体或没有抗体的试管中。随后在27℃孵育15分钟，如以上说明使用血细胞但不洗涤细胞。在37℃孵育4小时后，收集上清液并在具有240-400keV读数窗口的Cobra II auto-γCounter(Packard Instruments)上计数。每分钟计数被标绘为抗体浓度的函数，并使用Prism软件(San Diego，CA)，通过非线性回归、S形剂量反应(可变斜率)对数据进行分析。通过下列等式确定裂解百分比：裂解％＝(样本CPM-无抗体CPM)/TritonX CPM-无抗体CPM)×100。Raji细胞系的细胞毒性特异性裂解％的抗体滴定曲线示于图28中。此数据证明抗-CD70抗体对Raji细胞系具有ADCC作用。抗-CD70抗体针对Raji细胞的EC50值是36nM。在抗CD16抗体存在下在Raji细胞上的细胞毒性的条形图示于图29中。此数据证明抗-CD70抗体在Raji细胞上的ADCC作用取决于CD16。
实施例16：评估抗-CD70抗体在已激活的T细胞上的ADCC活性
在这个实施例中，在荧光细胞毒性测定中测试了去岩藻糖化的以及非去岩藻糖化的抗-CD70单克隆抗体在效应细胞存在下经抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)杀伤已激活的T细胞的能力。
如以上说明对人类抗-CD70单克隆抗体2H5进行去岩藻糖化。如以上说明制备人类效应细胞。用抗CD3包被的磁珠(纯度＞90％)对人类脾T细胞进行阳性选择。用抗CD3和CD28包被的珠以及在Iscove培养基中的25ng/ml的IL-2+10％热灭活的FCS刺激细胞6天。收集细胞并通过碘化丙锭的掺入(60％可参见的)测定生存力，在进行ADCC测定之前对活细胞进行筛选(gate)并针对CD70的表达(在活细胞上大约65％CD70阳性)进行分析。
如下使用Delfia荧光发射分析测试了去岩藻糖化以及非去岩藻糖化的人类抗-CD70单克隆抗体2H5针对已激活的T细胞的抗体特异的ADCC。将已激活的靶T细胞(100μl经标记的靶细胞)与50μl效应细胞和50μl的2H5或去岩藻糖化的2H5抗体一起孵育。整个实验中使用靶细胞与效应细胞的比率为1∶50。使用人类IgG1同种型对照物作为阴性对照物。在2100rpm脉冲离心以及37℃孵育一小时后收集上清液，再次快速离心，并将20μl上清液转移至平底板中，向板中加入180μl的Eu溶液(Perkin Elmer，Wellesley，MA)，并用Fusion Alpha TRF平板读数仪(Perkin Elmer)读数。裂解％计算如下：(样本释放量-自发释放量＊100)/(最大释放量-自发释放量)，其中自发释放量是来自仅含有靶细胞的孔的荧光，而最大释放量是来自含有靶细胞并已用3％来苏尔处理的孔的荧光。针对已激活的T细胞而言，细胞的细胞毒性特异性裂解％示于图30。已激活的T细胞显示出HuMAb抗-CD70抗体2H5的抗体介导的细胞毒性以及与抗-CD70抗体2H5的去岩藻糖化形式相关的增加的特异性裂解百分比。通过在抗-CD70抗体的去岩藻糖化和非去岩藻糖化的两种形式中加入抗CD16抗体，阻断了抗体介导的细胞毒性。对照IgG对细胞毒性没有作用。此数据证明，去岩藻糖化的HuMAb抗-CD70抗体显示出对已激活的T细胞的提高的特异性细胞毒性。
实施例17：受体-配体CD70-CD27结合的阻断测定
在这个实施例中，使用阻断测定法测试了抗-CD70单克隆抗体对CD70与配体CD27的相互作用进行阻断的能力。
用2μg/ml的抗IgG抗体(Fc-sp.)在4℃以100μl/孔对孔进行包被过夜。在室温用1％的BSA/PBS以200μl/孔对孔封闭1小时。边振荡动边向每个孔中加入100μl/孔的0.16μg/ml的CD27-Fc-his，在37℃持续1小时。每个孔以200μl/孔PBS/吐温20(0.05％(v∶v))洗涤5次。抗-CD70抗体在10％NHS+1％BSA/PBS中进行稀释，并与0.05μg/ml的CD70-myc-his混合，在室温下孵育1小时，并用200μl/孔的PBS/吐温20(0.05％(v∶v))洗涤5次。使用已知阻断CD70/CD27相互作用的抗体作为阳性对照物，并使用同种型对照抗体作为阴性对照物。CD70和抗-CD70抗体的混合物用抗Fc抗体进行阻断，并且向含有CD27-Fc-his的孔中加入100μl/孔CD70-myc-his+抗体。在37℃振荡下孵育混合物1小时。向混合物中加入100μl/孔的抗-myc-HRP(在10％NHS+1％BSA/PBS中以1∶1000进行稀释)并在37℃振荡时孵育1小时。通过加入100μlTMB底物，在室温下孵育5至10分钟检测信号，然后加入75μl 0.25M的H2SO4，并在A450nm读出结果。结果示于图31中。此数据证明包括2H5、8B5以及18E7的一些抗-CD70抗体阻断CD70与CD27的结合，而其他抗体并未影响CD70与CD27之间的相互作用。
实施例18：使用裸露的抗-CD70抗体对体内肿瘤异种移植模型的治疗
用裸露的抗-CD70抗体对植入了淋巴瘤肿瘤的小鼠进行体内治疗，以检查抗体在体内对肿瘤生长的影响。
使用标准的实验室操作在体外扩增ARH-77(人类B淋巴母细胞白血病；ATCC登录号CRL-1621)和Raji(人类B淋巴细胞伯基特淋巴瘤；ATCC登录号CCL-86)细胞。在6至8周龄之间的雄性Ncr无胸腺裸鼠(Taconic，Hudson，NY)每只小鼠在右侧腹植入了0.2ml的PBS/基质胶(1∶1)中的5×106ARH-77细胞或者Raji细胞。对小鼠进行称重，并在植入后，使用电子测径器每周两次对肿瘤进行三维测量。肿瘤体积计算为高×宽×长/2。将具有平均80mm3的ARH-77肿瘤或平均170mm3的Raji肿瘤的小鼠随机分到治疗组。用PBS运载体、同种型对照抗体或裸露的抗-CD70HuMAb 2H5在0天经腹膜对小鼠给药。当肿瘤达到肿瘤终点(2000mm3)时，使小鼠安乐死。结果示于图32A(Raji肿瘤)和32B(ARH-77肿瘤)中。裸露的抗-CD70抗体2H5延长了达到肿瘤终点体积(2000mm3)的平均时间，并减缓了肿瘤生长进程。因此，单独使用抗-CD70抗体进行治疗对于肿瘤生长具有直接的体内抑制效果。
实施例19：使用细胞毒素偶联的抗-CD70抗体对体内淋巴瘤肿瘤异种移植模型的治疗
用细胞毒素偶联的抗-CD70抗体对植入了淋巴瘤肿瘤的小鼠进行体内治疗，以检验抗体在体内对肿瘤生长的影响。
使用标准的实验室操作体外扩增ARH-77(人类B淋巴母细胞白血病；ATCC登录号CRL-1621)、Granta 519(DSMZ登录号.342)以及Raji(人类B淋巴细胞伯基特淋巴瘤；ATCC登录号CCL-86)细胞。在6至8周龄之间的雄性Ncr无胸腺裸鼠(Taconic，Hudson，NY)每只小鼠在右侧腹经皮下植入了在0.2ml PBS/基质胶(1∶1)中5×106个ARH-77、10×106个Granta 519或5×106个Raji细胞。对小鼠进行称重，并在植入后，使用电子测径器每周两次对肿瘤进行三维测量。肿瘤体积计算为高×宽×长/2。将具有平均80mm3(ARH-770)、220mm3(Granta 519)或170mm3(Raji)的肿瘤的小鼠随机分到治疗组。用PBS运载体、细胞毒素偶联的同种型对照抗体或细胞毒素偶联的抗-CD70HuMAb 2H5在0天经腹膜对小鼠进行给药。在这个实验中所使用的偶联物是通过剪切N1中连接物所释放的游离的毒素。可以偶联到本发明的抗体的细胞毒素化合物的实例说明于在2005年9月26日提交的美国临时申请系列号60/720,499以及2006年9月26日提交的PCT公开号WO 07/038658，它们的内容在此合并作为参考。当肿瘤达到肿瘤终点(2000mm3)时，使小鼠安乐死。结果示于图33A(ARH-77)、33B(Granta 519)以及33C(Raji肿瘤)中。偶联到细胞毒素上的抗-CD70抗体2H5延长了达到肿瘤终点体积(2000mm3)的平均时间，并减缓了肿瘤生长进程。因此，抗-CD70抗体-细胞毒素偶联物的治疗对淋巴瘤肿瘤生长有直接的体内抑制效果。
实施例20：抗-CD70抗体与恒河猴B淋巴瘤细胞的交叉反应性
还采用FACS分析评估了抗-CD70抗体69A7与恒河猴CD70阳性B淋巴瘤细胞系LCL8664(ATCC#：CRL-1805)进行交叉反应的能力。通过将1×105个细胞与浓度为1μg/ml的69A7一起孵育来评估HuMAb 69A7抗-CD70人类单克隆抗体的结合。洗涤细胞，并用FITC标记的抗人类IgGAb检测结合。使用同种型对照抗体作为阴性对照物。使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。结果示于图34中。该结果证明了抗-CD70抗体69A7与猴子CD70阳性B淋巴瘤细胞进行交叉反应。
实施例21：抗-CD70抗体结合到786-O肾癌细胞时的内化
使用免疫荧光染色用786-O人类肾癌细胞系测试了HuMab抗-CD70抗体69A7和2H5在结合到这些细胞上时的内化。通过用0.25％胰蛋白酶/EDTA处理从组织培养瓶中收集786-O细胞(96孔板中每孔每100μl 1×104个细胞)，然后与FACS缓冲液(PBS+5％FBS，培养基)中5μg/ml的每种HuMab抗-CD70抗体一起在冰上孵育30分钟。使用人类IgG1同种型对照作为阴性对照物。用培养基洗涤2次后，将细胞重悬于该培养基(每孔100μl)中，并接着与以1∶100稀释的偶联有PE的山羊抗人第二抗体(Jackson ImmunoResearch Lab)在冰上孵育30分钟。为了形态学和免疫荧光强度，在荧光显微镜(Nikon)下在0分钟使细胞立即成像，或者在37℃下孵育不同的时间。在用HuMab抗-CD70抗体染色的细胞中观察到了荧光，但在对照抗体中没有见到荧光。在这些测定中，用FITC直接偶联的HuMab抗-CD70抗体也获得了类似的结果。这些结果显示了在0分钟具有两种抗-CD70HuMab的细胞表面膜上出现荧光。在30分钟孵育后，膜荧光密度显著减少而内部荧光增加。在120分钟的时间点，膜荧光不明显，取而代之的是细胞内区室中存在明显的荧光。该数据证明HuMab抗-CD70抗体在与内源性表达CD70的肿瘤细胞结合时可被特异性内化。
实施例22：HuMAb抗-CD70阻断已知的小鼠抗-CD70抗体的结合
在这个实验中，测试了HuMAb抗-CD70抗体69A7对已知小鼠抗-CD70抗体与CD70阳性肾癌786-O细胞的结合进行阻断的能力。将786-O细胞与1μg/ml的小鼠抗-CD70抗体BU-69(Ancell，Bayport，MN)与1、5或10μg/ml的HuMAb 69A7在冰上孵育20分钟。使用IgG1和IgG2同种型对照抗体作为阴性对照物。洗涤细胞两次，并用FITC标记的抗人类IgG Ab检测结合。使用FACSCalibur流式细胞仪(BectonDickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。结果示于图35中。抗-CD70HuMAb 69A7以浓度依赖性方式阻断小鼠抗-CD70抗体的结合。
实施例23：HuMAb抗-CD70抑制炎症应答
在这个实验中，测试了HuMAb抗-CD70抗体2H5对炎症应答的抑制。用全长人类CD70构建体(CHO-S/mCD32/CD70细胞)对已稳定转染了小鼠CD32(CHO-S/mCD32细胞)的CHO-S细胞进行瞬时转染。通过使用2A5和PE偶联的抗人IgG第二抗体的流式细胞术证实了表面表达(数据未示出)。在96孔板的一式三个的孔中，用1×105个CHO-S/mCD32或CHO-S/mCD32/CD70细胞/孔、1μg/ml抗hCD3(克隆OKT3；BD Bioscience)以及HuMAb 2H5或非岩藻糖化的2H5(2H5NF)的系列稀释对经
Figure A20078005123101951
Human T Cell Enrichment Kit(Cat#15061；StemCell Technologies Inc)纯化的1×106个/孔的人类外周血CD3阳性T细胞进行体外刺激。在收集了3天上清液等分部分后，通过定量的ELISA试剂盒(BD Biosciences)测量了γ干扰素(INF-γ)的分泌。用1μCi/ml的3H-胸腺嘧啶核苷对板脉冲，孵育8小时，收集细胞并在
Figure A20078005123101952
1450Microbeta Counter(Wallac，Inc.)上对3H-胸腺嘧啶核苷的掺入进行读数。使用IgG1同种型对照抗体作为阴性对照物。结果示于图36A至B。2H5和2H5NF都以剂量依赖性方式完全抑制了CD70共刺激的增殖(图36A)。数据还显示2H5的抑制对CD70共刺激是特异性的，因为2H5对抗CD3阳性CHO-S/mCD3介导的增殖没有影响。2H5和2H5NF也都以剂量依赖性方式完全抑制了CD70共刺激的INF-γ的分泌(图36B)。数据还显示2H5的抑制对CD70共刺激是特异性的，因为2H5对抗CD3阳性CHO-S/mCD3介导的INF-γ分泌没有影响。合起来看，数据显示2H5和2H5NF功能性阻断CD70人类T细胞的共刺激。
在结合CMV肽IPSINVHHY(SEQ ID NO：90)(ProImmune，Oxford，UK)的25ng/ml的B＊3501以及HuMAb 2H5的系列稀释存在下培养人类MHC I类单元型B＊3501阳性外周血单核细胞(PBMC)11天，该细胞针对巨细胞病毒(CMV)特异性T细胞反应进行了预筛选(Astarte，Inc)。通过流式细胞术对培养物进行了分析，对于CD8阳性T细胞是通过PE偶联的抗CD8染色(克隆RPA-T8，BD Biosciences)、对于肽特异的CD8阳性T细胞是通过APC标记的肽-MHC I类五聚体的低聚物染色(F114-4B；ProImmune)、并且对于生存力是通过缺乏碘化丙锭染色。使用同种型对照抗体作为阴性对照物。结果示于图37A-C。2H5部分地抑制了肽特异性CD8阳性T细胞增殖，并且2H5NF和阳性对照抗MHC I类Ab(克隆W6/32；BD Bioscience)完全抑制了肽特异性CD8阳性T细胞增殖(图37A)。没有观察到总细胞生存力的显著减小(图37B)。没有观察到总CD8阳性细胞数目的显著减小(图37C)。合起来看，数据表明2H5和2H5NF效应对肽刺激的CD8阳性T细胞是特异的。数据代表了用同样的供体进行的一个另外的实验。
将针对巨细胞病毒(CMV)特异的T细胞反应进行了预筛选的人类MHC I类单元型B＊3501阳性PBMC(Astarte，Inc)进行11天的培养，这是在结合CMV肽IPSINVHHY(ProImmune)(SEQ ID NO：90)的25ng/ml B＊3501以及20μg/ml的HuMAb 2H5的存在下、存在或不存在功能性阻断抗体(克隆3G8；BD Biosciences)的抗人类CD16(FcRγIII)的系列稀释的情况下进行的，并且然后按以上的说明通过流式细胞术对肽特异性CD8阳性细胞的数目进行了分析。结果示于图38中。2H5和2H5NF介导的对肽特异性CD8阳性T细胞增殖的抑制通过抗CD16剂量依赖性的逆转表明2H5和2H5NF抑制是通过2H5和2H5NF与CD16阳性效应细胞的相互作用而介导的。与2H5相比，需要大约多出1000倍的3G8来逆转2H5NF介导的抑制。无论3G8的浓度如何均不存在由阴性同种型对照物对肽特异的CD8阳性T细胞增殖的抑制，并且对通过功能性阻断的阳性对照物W6/32对于肽特异的CD8阳性T细胞增殖的抑制，3G8存在很小至完全没有的作用。
实施例24：使用细胞毒素偶联的抗-CD70抗体对体内肾癌肿瘤异种移植模型的治疗
用细胞毒素偶联的抗-CD70抗体对植入了肾癌肿瘤的小鼠进行体内治疗，以检查抗体在体内对肿瘤生长的影响。在这个实施例中，抗-CD70抗体2H5偶联于N2。N2是一种需要酯酶激活的前体药物。
使用标准的实验室操作在体外扩增786-O(ATCC登录号CRL-1932)和Caki-1(ATCC登录号HTB-46)。在6至8周龄之间的雄性CB17.SCID小鼠(Taconic，Hudson，NY)每只小鼠在右侧腹经皮下植入了在0.2ml的PBS/基质胶(1∶1)中的250万个786-O或Caki-1细胞。对小鼠进行称重，并在植入后，使用电子测径器每周两次对肿瘤进行三维测量。肿瘤体积计算为长×宽×高。将具有平均200mm3的肿瘤的小鼠随机分至治疗组。在0天用PBS运载体、细胞毒素偶联的同种型对照抗体或细胞毒素偶联的抗-CD70Hu MAb 2H5经腹膜对小鼠进行给药。可以偶联到本发明的抗体的细胞毒素化合物的实例说明于在2005年9月26日提交的美国临时申请系列号60/720,499以及在2006年9月26日提交的PCT公开号WO 07/038658中，其内容在此合并作为参考。当肿瘤达到肿瘤体积终点(2000mm3)时，使小鼠安乐死。结果示于图39A(786-O)和图39B(Caki-1)中。偶联到N2上的抗-CD70抗体2H5延长了达到肿瘤终点体积(2000mm3)的平均时间，并减缓了肿瘤生长进程。经治疗的动物的体重变化小于10％。
因此，用抗-CD70抗体-细胞毒素偶联物治疗对淋巴瘤肿瘤生长有直接的体内抑制效果。
实施例25：使用抗-CD70免疫偶联物对肾细胞癌异种移植模型的体内治疗
用细胞毒素偶联的抗-CD70抗体对植入了肾癌肿瘤的小鼠进行体内治疗，以检查抗体在体内对肿瘤生长的影响。
如以上说明，制备连接至硫醇化的抗-CD70 2H5抗体的络合物N1和N2的免疫偶联物(参见例如，美国专利申请公开号2006/0024317；以及PCT申请号PCT/US2006/37793)。NOD-SCID小鼠经皮下植入2.5×106个786-O细胞。监测肿瘤的形成直到经测量平均肿瘤体积(使用精密测径器)达到大约80mm3。八只荷瘤小鼠的组用单一剂量的以下物质之一进行治疗：(a)运载体对照物，(b)免疫偶联物抗-CD70-N1，或(c)免疫偶联物抗-CD70-N2。经腹膜内(i.p.)对小鼠给予免疫偶联物抗-CD70-N1和抗-CD70-N2，剂量分别为0.3μmol/kg的N1等效物和0.1μmol/kg的N2等效物。抗-CD70-N1组在第一次给药21天后获得相同剂量的第二次治疗。在62天的实验过程中用精密测径器通过测量来监测肿瘤生长。
如在图40中明显可见的，与当只用运载体对照治疗时具有实质的肿瘤生长的小鼠相比，用免疫偶联物抗-CD70-N1或抗-CD70-N2的单一剂量治疗导致小鼠在15天内无肿瘤(并且直到62天仍然无肿瘤)。
实施例26：使用免疫偶联物抗-CD70-N2对肾细胞癌异种移植模型的体内治疗
用细胞毒素偶联的抗-CD70抗体对植入了肾癌肿瘤的小鼠进行体内治疗，以检查抗体在体内对肿瘤生长的效果。
如在实施例25说明，制备了连接至硫醇化的抗-CD702H5抗体的络合物N2的免疫偶联物。SCID小鼠每只小鼠经皮下植入了在0.1ml PBS和0.1ml基质胶中的2.5×106个786-O细胞。监测肿瘤的形成直到经测量平均肿瘤体积(用精密测径器)达到大约105mm3。八只荷瘤小鼠的组用单次剂量的以下物质之一进行治疗：(a)运载体对照物，(b)同种型对照物，(c)仅有抗-CD70抗体2H5，或(d)免疫偶联物抗-CD70-N2。腹膜内对小鼠给予免疫偶联物抗-CD70-N2和同种型对照物N2(IgG-N2)，剂量为0.1μmol/kg的N2等效物。给予10mg/kg的抗-CD70抗体(即，与免疫偶联物CD70-N2所用的N2等效物等效的蛋白质剂量)。在62天的实验过程中用精密测径器通过测量来监测肿瘤生长。
如在图41中明显可见的，与当只用对照物或用只用抗-CD70抗体治疗时具有实质的肿瘤生长的小鼠相比，用免疫偶联物抗-CD70-N2的单一低剂量的治疗导致小鼠在10天内具有最低限度可检测的肿瘤(并且保持这种情况一直到62天)。
实施例27：体内肾细胞癌异种移植对免疫偶联物抗-CD70-N2的剂量反应
用细胞毒素偶联的抗-CD70抗体对植入了肾癌肿瘤的小鼠进行体内治疗，以检查抗体在体内对肿瘤生长的影响。
如在实施例25中说明，制备连接至硫醇化的抗-CD70 2H5抗体的络合物N2的免疫偶联物。SCID小鼠每只小鼠经皮下植入了在0.1ml PBS和0.1ml基质胶中的2.5×106个786-O细胞。监测肿瘤的形成直到经测量平均肿瘤体积(使用精密测径器)达到大约280mm3。用(a)运载体对照物或(b)免疫偶联物抗-CD70-N2治疗八只荷瘤小鼠的组。经腹膜内给予每组小鼠以下剂量之一的免疫偶联物抗-CD70-N2：0.03μmol/kg、0.01μmol/kg或0.005μmol/kg的N2等效物。在实验过程中用精密测径器通过测量来监测肿瘤生长。
如在图42中明显可见的，出人意料的低剂量的免疫偶联物抗-CD70-N2导致肿瘤体积减小，并且肿瘤体积减小以剂量依赖性的方式发生。
实施例28：免疫偶联物抗-CD70-N2在体内对另一种肾细胞癌异种移植模型的效力
用细胞毒素偶联的抗-CD70抗体对植入了肾癌肿瘤的小鼠进行体内治疗，以检查抗体在体内对肿瘤生长的影响。
如在实施例25中说明，制备了连接至硫醇化的抗-CD702H5抗体的络合物N2的免疫偶联物。SCID小鼠每只小鼠经皮下植入了在0.1ml PBS和0.1ml基质胶中的2.5×106个Caki-1细胞。监测肿瘤的形成直到经测量平均肿瘤体积(使用精密测径器)达到大约105mm3。用单一剂量的以下物质之一治疗八只荷瘤小鼠的组：(a)运载体对照物，(b)同种型对照物，(c)仅有抗-CD70抗体2H5，或(d)免疫偶联物抗-CD70-N2。经腹膜内对小鼠给予免疫偶联物抗-CD70-N2和同种型对照物N2，剂量为0.3μmol/kg的N2等效物。给予11.5mg/kg的抗-CD70抗体(即，对免疫偶联物CD70-N2所用的N2等效物等效的蛋白质剂量)。在62天的实验过程中用精密测径器通过测量来监测肿瘤生长。
如在图43中明显可见的，与当只用对照物或只用抗-CD70抗体治疗时具有实质的肿瘤生长的小鼠相比，用免疫偶联物抗-CD70-N2的单一剂量治疗导致小鼠具有最低限度可检测的肿瘤，持续至多大约40天。因此，抗-CD70免疫偶联物有效抵抗多种肾癌模型。
实施例29：免疫偶联物抗-CD70-N2在体内淋巴瘤模型中的效力
用细胞毒素偶联的抗-CD70抗体对植入了淋巴瘤肿瘤的小鼠进行体内治疗，以检查抗体在体内对肿瘤生长的影响。
如在实施例25中说明，制备了连接至硫醇化的抗-CD702H5抗体的络合物N2的免疫偶联物。SCID小鼠每只小鼠经皮下植入了在0.1ml PBS和0.1ml基质胶中的1.0×107个Raji细胞。监测肿瘤的形成直到经测量平均肿瘤体积(使用精密测径器)达到大约50mm3。用单一剂量的以下物质之一治疗八只荷瘤小鼠的组：(a)运载体对照物，(b)同种型对照物，或(c)免疫偶联物抗-CD70-N2。腹膜内对小鼠给予免疫偶联物抗-CD70-N2，剂量为0.3μmol/kg的N2等效物。在60天的实验过程中用精密测径器通过测量来监测肿瘤生长。
如在图44中明显可见的，与当只用对照物或只用抗-CD70抗体治疗时具有实质的肿瘤生长的小鼠相比，用免疫偶联物抗-CD70-N2的单一剂量治疗导致小鼠具有最低限度可检测的肿瘤，持续至多大约40天。因此，抗-CD70免疫偶联物还有效抵抗淋巴瘤。
实施例30：免疫偶联物抗-CD70-N2的安全性研究
用以下剂量之一的免疫偶联物抗-CD70-N2经腹膜内治疗BALB/c小鼠：0.1μmol/kg、0.3μmol/kg、0.6μmol/kg或0.9μmol/kg的N2等效物。在最初12天每天测量小鼠的重量，并且此后定期地测量直到给药后60天。当小鼠体重减轻超过起始体重的20％时，使小鼠安乐死。在图45中标绘的数据是每组的平均体重。
如在图45中明显可见的，当以剂量低于0.9μmol/kg的N2等效物进行给药时，抗-CD70-N2免疫偶联物很好地被耐受并且是安全的。因此，免疫偶联物抗-CD70-N2已经表现出功效的剂量(在大约0.005至0.3μmol/kg的N2等效物的范围内)将具有良好的安全特性。
实施例31：免疫偶联物抗-CD70-N2的进一步安全性研究
免疫偶联物抗-CD70-N2的另一个安全性研究在雄性比格尔犬中进行。比较了免疫偶联物与仅有药物的情况。在两只比格尔犬中经静脉内给予0.18μmol/kg的N2等效物的免疫偶联物抗-CD70-N2以及0.15μmol/kg的仅有N2的药物(在N2结构中没有连接物)。在给药后4小时中每小时监测犬，并且每天做两次临床观察，持续28天。每天测量体重直至给药后8天，并此后每周测量。在给药前阶段进行两次以及给药后3、7、14和28天进行标准的血液学、凝固以及临床化学检测。结果示于图46A至D。由于毒性的临床迹象，在给药后8天使无药物组中的一只犬安乐死。如在图46A至D所示，经治疗的犬很好地耐受了抗-CD70-N2免疫偶联物。
实施例32：抗-CD70抗体介导已激活的人B细胞的ADCC
在这项研究中，测试了HuMAb抗-CD70抗体以及非岩藻糖化形式介导对人类B细胞的ADCC效应的能力。将冰冻的人类脾细胞解冻并通过磁珠对B细胞进行阴性纯化。将经纯化的B细胞以2×106/ml培养在补充有NEAA、丙酮酸钠、β-ME以及青霉素/链霉素的RPMI+10％FBS中。B细胞被10μg/ml的LPS和5μg/ml的抗CD40激活3天。收集细胞、洗涤并且一个等分部分用生物素偶联的非岩藻糖化的2H5(2H5NF-bio)+链霉抗生物素-APC进行染色。通过标准的菲可帕克分离，从肝素化的全血中纯化出人类外周血单核效应细胞，并在50U/ml的IL-2的存在下培养过夜。已激活的B细胞用每1×106个细胞100μCi的Na2 51CrO4(Perkin Elmer，Wellesley，MA)进行标记，持续1小时。在2H5和2H5NF(非岩藻糖化的)的系列稀释存在下以1∶100的比例将效应细胞加到被标记的靶细胞中。此外，在20μg/ml的鼠类抗CD16抗体3G8或小鼠同种型对照抗体的存在下在10μg/ml测定测试物。在37℃进行4次孵育持续4小时后，将细胞离心并且在具有240至400KeV的读数窗口的Cobra II自动-γ读数仪(PerkinElmer)上对上清液进行读数。特异性裂解百分比计算为：(实验释放量-自发释放量)/(最大释放量-自发释放量)×100，其中：(i)无效应细胞及无抗体对照物的靶细胞作为自发释放量且(ii)在3％来苏尔去污剂对照物的存在下的靶细胞和效应细胞作为最大释放量。针对抗体浓度标绘特异裂解百分比，并使用GraphPad PrismTM 3.0软件(San Diego，CA)，通过非线性回归，S形剂量反应(可变斜率)对数据进行分析。
数据示于图47中。2H5NF与大约60％的已激活的B细胞结合。2H5NF和2H5均诱导了已激活的人B细胞的裂解，但2H5NF比2H5更有力(大约10倍)及更有效。抗CD16对抗体诱导的裂解的逆转证实抗体介导的裂解的作用机制是NK细胞介导的ADCC。因此，2H5和2H5NF均介导人类已激活的B细胞的ADCC。
实施例33：抗-CD70抗体对CMV抗原刺激的人类CD4阳性T细胞增殖的体外抑制
这项研究证明抗-CD70抗体经ADCC通过天然存在于经刺激的人类PBMC培养物中的效应细胞介导被抗原激活的CD70阳性人类T细胞(这些细胞是在自身免疫和炎性疾病中炎症过程的关键因素)的裂解能力。
将CMV阳性的经预筛选的供体以1×106个细胞/ml培养于24孔培养板上补充有10％热灭活的FCS的AIM-V培养基中，并用5.0μg/ml的CMV溶解产物在2μg/ml的生物素酰化的2H5、2H5NF或hIgG1nf对照物抗体的存在下进行刺激。在第9天收集细胞并且使用血细胞计数器和台盼蓝排除法通过对等分部分计数确定了在每种培养物中每毫升有生存力的细胞的数目。将细胞在染色缓冲液中洗涤并用5％人类血清封闭。将生物素酰化的2H5、2H5NF或hIgG1nf加入到等体积的细胞中，终浓度为20μg/ml。将细胞孵育30分钟，洗涤并用抗CD4-FITC和PE偶联的链霉抗生物素染色。再将细胞孵育30分钟，洗涤两次并接着进行固定并用BDCytofix/Cytoperm试剂盒进行透化。将细胞在perm/wash缓冲液中洗涤两次并用抗INFγ-APC(BD Clone B27)进行细胞内染色。将细胞孵育30分钟，洗涤并重悬于染色缓冲液中。通过流式细胞术经过筛选针对在活的CD4阳性细胞上CD70表面表达以及INF-γ胞内表达对细胞进行了分析。在每种条件下CD4阳性/CD70阳性和CD4阳性/INFγ阳性的数目(细胞/ml)通过在CD4筛选中的CD70阳性或INFγ阳性细胞的百分比乘以总的CD4阳性细胞的百分比再乘以每毫升有生存力的细胞的总数目((％CD70阳性或INFγ阳性)×(％CD4阳性)×(总的有生存力的细胞/ml))。
此数据示于图48中。在第9天2μg/ml的2H5和2H5NF分别减少了67％和97％的CMV激活的CD70阳性/CD4阳性细胞。两种抗体均是有效的，但2H5NF比2H5更有效地通过存在于正常人血液中的CD16阳性效应细胞介导Ag激活的CD4阳性/CD70阳性T细胞的ADCC。
实施例34：与CD70阳性肾癌细胞系786-0结合的人类CD70抗体1F4、1F4NF和2H5NF的相对结合特征
这项研究调查了抗-CD70抗体与天然表达CD70阳性的人类癌细胞系786-0细胞的结合特征。使人类肾细胞腺癌细胞系786-0生长到汇合，用胰蛋白酶收集，在染色缓冲液中洗涤，并与终浓度为30、10、3、1、0.4、0.1、0.04及0.01ug/ml的1F4、1F4NF、2H5NF、hIgG1-NF或hIgG4孵育。将细胞在冰上孵育30分钟，在染色缓冲液中洗涤两次，并用山羊F(ab)’2-抗-人类-IgG(Fc)-PE偶联物染色30分钟。洗涤细胞并重悬于染色缓冲液中用于流式细胞术分析。
数据示于图49。2H5NF以比1F4和1F4NF低的浓度进行结合。对于天然细胞表面表达的CD70，2H5NF具有优于1F4和1F4NF的结合亲和力。1F4和1F4NF同样很好地与786-0细胞系结合，没有因NF同种型表现出对特异性结合特征的影响。
实施例35：1F4和1F4NF在CD70阳性淋巴瘤细胞系ARH77上介导ADCC的相对能力
在这项研究中，测试了岩藻糖化和非岩藻糖化(nf)的抗-CD70抗体在CD70阳性淋巴瘤细胞系ARH77上介导ADCC的相对的能力。通过标准的菲可帕克分离从肝素化的全血中纯化出人类外周血单核效应细胞，并在50U/ml IL-2的存在下培养过夜。用每1×106个细胞100μCi的Na2 51CrO4(Perkin Elmer，Wellesley，MA)对ARH77细胞进行标记，持续1小时。在2H5和2H5nf的系列稀释物存在下以1∶100的比例将效应细胞加到经标记的靶细胞中。此外，对5μg/ml测试物进行测定。在37℃下孵育4小时后，将细胞离心并且通过带有240-400KeV的读数窗口的Cobra II自动γ读数仪(Perkin Elmer)对上清液进行读数。特异性裂解百分比计算为：(实验释放量-自发释放量)/(最大释放量-自发释放量)×100其中：(i)无效应细胞和无抗体对照物的靶细胞作为自发释放量且(ii)在3％来苏尔去污剂对照物的存在下的靶细胞和效应细胞作为最大释放量。
数据示于图50中。1F4和1F4NF都在CD70阳性ARH77细胞上介导ADCC，并且1F4NF是比1F4更有力的ADCC介导者。
实施例36：抗-CD70细胞毒素E对肿瘤生长的体内抑制
为了证明抗-CD70-细胞毒素E偶联物作为抵抗不同肿瘤细胞的靶向治疗剂的广泛用途，将SCID小鼠的三种肾细胞癌异种移植模型和两种淋巴瘤模型用于测试抗-CD70-细胞毒素E偶联物的体内功效。CD70抗体2H5的细胞毒素偶联物此处指抗-CD70-细胞毒素E，它包含连接至细胞毒素E(图74)的重组2H5抗-CD70抗体，细胞毒素E进一步说明于在2006年12月28日提交的美国申请系列号60/882,461中，其全部内容专门合并在此作为参考。细胞毒素E是前体药物形式，并且为激活不仅需要从抗体释放，还需要4’氨基甲酸酯基团的剪切来释放活性部分。
为了证明抗-CD70-细胞毒素E在786-O细胞异种移植模型上的活性，将在0.1ml PBS和0.1ml MatrigelTM中的250万786-O细胞皮下植入每只SCID小鼠中，并且当肿瘤达到110mm3的平均大小时，通过经腹膜内注射单一剂量的抗-CD70-细胞毒素E(以0.005、0.03或0.1μmol/kg体重的剂量)对8只小鼠的组进行治疗。此外，仅用运载体或仅用抗-CD70抗体(以等效于以0.03和0.1μmol/kg的抗-CD70-细胞毒素E所使用的那些剂量的剂量)或用连接至细胞毒素E的同种型对照抗体(以0.03和0.1μmol/kg的剂量)对对照组进行注射。整个实验过程中记录了肿瘤体积(LWH/2)和小鼠的重量，使实验过程持续给药后61天。结果示于图51。在这个具体的小鼠异种移植模型中(它是免疫妥协的(immunocompomised))并且在说明的剂量下，用裸露的CD70抗体治疗没有显示出对肿瘤体积的影响(即，没有抑制肿瘤生长)。同种型对照物对肿瘤的生长也几乎没有影响。相反，抗-CD70-细胞毒素E偶联物清晰地显示了剂量依赖性抗肿瘤疗效。甚至在0.03μmol/kg，该特异性偶联物的疗效表现得最大。
抗-CD70-细胞毒素E的活性接下来在荷有A498肿瘤异种移植的SCID小鼠中得到证明。将A498细胞(在0.1ml PBS和0.1ml MatrigelTM中500万个细胞/小鼠)经皮下植入到SCID小鼠中，并且当肿瘤达到110mm3的平均大小时，通过经腹膜内注射单一剂量的抗-CD70细胞毒素E(以0.03、0.1或0.3μmol/kg体重的剂量)对八只小鼠的组进行治疗。此外，仅用运载体对对照组进行注射。在这项研究的整个实验过程中记录了肿瘤体积(LWH/2)和小鼠的重量，使实验过程持续进行到给药后大约60天。结果示于图52。这些结果证明抗-CD70-细胞毒素E偶联物在这个模型中治疗肾癌是有功效的，并且该治疗是剂量依赖性的。
抗-CD70-细胞毒素E的活性接下来在荷有Caki-1肿瘤异种移植的SCID小鼠中得到证明。将Caki-1细胞(0.1ml PBS和0.1ml MatrigelTM中250万个细胞/小鼠)经皮下植入到SCID小鼠中，并且当肿瘤达到150mm3的平均大小时，通过经腹膜内注射单一剂量的抗-CD70细胞毒素E(以0.03、0.1或0.3μmol/kg体重)对8只小鼠的组进行治疗。还使用额外的组，通过用两个剂量的0.1μmol/kg的抗-CD70-细胞毒素-E偶联物间隔14天进行给药，研究重复剂量治疗的效果。此外，仅用运载体对对照组进行注射。在该研究的整个实验过程中记录肿瘤体积(LWH/2)和小鼠的重量，使实验过程在给药后进行62天。结果示于图53。这些结果证明抗-CD70-细胞毒素E偶联物对治疗荷有caki-1肿瘤的小鼠的肾癌是有效的，并且该治疗是剂量依赖性的。
为了证明抗-CD70-细胞毒素E在淋巴瘤模型中的活性，在荷有皮下Raji异种移植的SCID小鼠中进行了治疗研究。将Raji细胞(在0.1ml PBS和0.1ml MatrigelTM中1000万个细胞/小鼠)经皮下植入到SCID小鼠中，并且当肿瘤达到250mm3的平均大小时，经腹膜内注射单一剂量的抗-CD70细胞毒素E(以0.03、0.1或0.3μmol/kg体重)对8只小鼠组成的组进行治疗。此外，仅用运载体，或用连接至细胞毒素E的同种型对照抗体(以0.1或0.3μmol/kg体重)对对照组进行注射。在该研究的整个实验过程中记录肿瘤体积(LWH/2)和小鼠的重量，该实验过程给药后持续进行大约60天。结果示于图54。这些结果证明抗-CD70-细胞毒素E偶联物在这个模型中治疗淋巴瘤也是有效的，并且该治疗是剂量依赖性的。
使用Daudi异种移植进行第二个淋巴瘤模型的研究。将Daudi细胞(在0.1ml PBS和0.1ml MatrigelTM中1000万个细胞/小鼠)经皮下植入到SCID小鼠中，并且当肿瘤达到70mm3的平均大小时，通过经腹膜内注射单一剂量的抗-CD70细胞毒素E(以0.1或0.3μmol/kg体重)对8只小鼠的组进行治疗。此外，仅用运载体、仅用抗-CD70抗体或者用同种型对照抗体细胞毒素E偶联物(以0.1或0.3μmol/kg体重)对对照组进行注射。在该研究的整个实验过程中记录肿瘤体积(LWH/2)和小鼠的重量，该实验过程给药后持续进行大约60天。结果示于图55。在这个具体的小鼠异种移植模型中(它是免疫妥协的)并且在所说明的剂量下，用裸露的CD70抗体治疗没有显示出对肿瘤体积的影响(即，没有抑制肿瘤生长)。相比之下，抗-CD70-细胞毒素E偶联物在这个模型中对淋巴瘤是有效的，并且该治疗是剂量依赖性的。
为了证明可在多个物种中观察到功效，对裸大鼠的异种移植模型进行了测试。在这个模型中，全身被γ照射的裸大鼠经皮下植入了Caki-1细胞(在0.2ml RPMI-1640中1000万个细胞/小鼠)，并且当肿瘤平均大小达到100mm3时，通过经腹膜内注射单一剂量的抗-CD70-细胞毒素E(以0.1或0.3μmol/kg体重)对大鼠的组进行治疗。可替代地进行多剂量治疗，其中在第8、15和22天大鼠接受0.3μmol/kg体重的剂量，共3个剂量。此外，仅用运载体、仅用抗-CD70抗体或者同种型对照抗体细胞毒素E偶联物(以0.3μmol/kg体重的剂量)以单一剂量或以相同的多剂量方案对对照组进行注射。在该研究的整个过程中记录肿瘤体积(LW2/2)和大鼠的重量。结果示于图56。在这个具体的大鼠异种移植模型中(它是免疫妥协的)并且在所说明的剂量下，用裸露的CD70抗体治疗没有显示出对肿瘤体积的影响(即，没有抑制肿瘤生长)。相比之下，抗-CD70-细胞毒素E偶联物显示了显著的抗肿瘤效果。用多剂量治疗提高了功效，而对动物的体重没有显著影响。即使使用重复剂量方案，该同种型对照偶联物显示出对肿瘤生长极小的影响。
在三个不同的动物物种中测试了抗-CD70偶联物的安全性。对5只正常balb/c小鼠的组用抗-CD70-细胞毒素E进行给药(腹膜内)，剂量为0.1、0.3、0.6和0.9μmol/kg体重，并与仅注射运载体的动物相比在60天内监测动物体重。在该研究的过程中，对照动物体重增加了10至20％。用抗-CD70细胞毒素E进行给药的小鼠显示在较低的剂量下该偶联物通常被很好地耐受并且对体重的影响很小。存在明显的剂量依赖性的毒性增加，高剂量引起动物在恢复前体重的暂时降低。然而，在剂量超过异种移植模型的疗效所需剂量时，该偶联物仍得到很好地耐受。结果示于图57。
还在犬和猴子中测试了毒性。三只犬的组以0.1、0.2、0.3、0.4和0.6μmol/kg体重的剂量进行给药，并且两只猴子的组以0.2、0.4、0.6和0.8μmol/kg体重的剂量进行给药。在每项研究中特别注意总的白细胞计数和血小板计数，因为据信这些是抗-CD70抗体-细胞毒素E偶联物的毒性的特别灵敏的指示器。在犬中没有观察到细胞计数的显著变化，直到剂量达到0.6μmol/kg体重。在这个剂量出现了血小板计数的暂时下降，并且白细胞计数也减少了。在任何剂量下，在猴子中观察到的这些参数的变化很小。两项研究均支持抗-CD70偶联物在动物中的中毒剂量显著高于在异种移植物模型中的功效剂量。结果示于图58(犬的结果)和59(猴子的结果)中。
实施例37：通过抗-CD70-细胞毒素F在体内抑制肿瘤生长
在这个实施例中，在两种肾癌和一种淋巴瘤异种移植模型中证明了抗-CD70-细胞毒素F的功效。CD70抗体2H5的细胞毒素偶联物在此称为CD70-细胞毒素F，它包含连接至细胞毒素F(图75)上的重组2H5抗-CD70抗体。细胞毒素F是一种需要酯酶激活的前体药物。
为了证明抗-CD70-细胞毒素F在786-O细胞异种移植上的活性，SCID小鼠每只小鼠经皮下植入了在0.1ml PBS和0.1ml MatrigelTM中的250万个786-O细胞，并且当肿瘤达到110mm3的平均大小时，通过经腹膜内注射单一剂量的抗-CD70-细胞毒素F(以0.005、0.03或0.1μmol/kg体重的剂量)对8只小鼠的组进行治疗。此外，仅用运载体或用连接至细胞毒素F的同种型对照抗体(以0.03μmol/kg以及0.1μmol/kg的剂量)对对照组进行注射。在该研究的整个过程中记录肿瘤体积(LWH/2)和小鼠的重量，使该研究进行到给药后62天。结果示于图60。在这个具体的小鼠异种移植模型中(它是免疫妥协的)并且在所说明的剂量下，用裸露的CD70抗体的治疗没有显示出对肿瘤体积的影响(即，没有抑制肿瘤生长)。在这项实验中，同种型对照偶联物也几乎对肿瘤的生长没有影响，而抗-CD70-细胞毒素F治疗的小鼠清楚地表现出剂量依赖性的抗肿瘤功效。甚至在0.03μmol/kg，该特异性偶联物的疗效表现最大。
在荷有Caki-1肿瘤异种移植的SCID小鼠中接下来证明了抗-CD70-细胞毒素F的活性。将Caki-1细胞(在0.1ml PBS和0.1ml MatrigelTM中250万个细胞/小鼠)经皮下植入到SCID小鼠中，并且当肿瘤达到120mm3的平均大小时，通过经腹膜内注射单一剂量的抗-CD70细胞毒素F(以0.03、0.1或0.3μmol/kg体重的剂量)对8只小鼠的组进行治疗。此外，仅用运载体对对照组进行注射。在该研究的整个实验过程中记录肿瘤体积和小鼠的重量，持续进行到给药后62天。结果示于图61。这些结果证明抗-CD70-细胞毒素F偶联物在荷有caki-1肿瘤的小鼠中是有功效的，并且该治疗是剂量依赖性的。
为了证明抗-CD70-细胞毒素F在淋巴瘤模型中的活性，在皮下荷有Raji异种移植物的SCID小鼠中进行了治疗研究。将Raji细胞(在0.1mlPBS和0.1ml MatrigelTM中1000万个细胞/小鼠)经皮下植入到SCID小鼠中，并且当肿瘤达到250mm3的平均大小时，通过经腹膜内注射单一剂量的抗-CD70细胞毒素F(以0.03、0.1或0.3μmol/kg体重的剂量)对8只小鼠的组进行治疗。此外，仅用运载体或用连接至细胞毒素F的同种型对照抗体(以0.1或0.3μmol/kg体重的剂量)对对照组进行注射。在该研究的整个实验过程中记录肿瘤体积(LWH/2)和小鼠的重量，持续进行到给药后大约60天。结果示于图62。这些结果证明抗-CD70-细胞毒素F偶联物抵抗淋巴瘤也是有功效的，并且该治疗是剂量依赖性的。
实施例38：通过抗-CD70-毒素G在体内抑制肿瘤生长
在这个实施例中，在两个肾癌的异种移植模型中证明了抗-CD70-细胞毒素G的功效。CD70抗体2H5的细胞毒素偶联物在此称为CD70-细胞毒素G，它包含连接至细胞毒素G(图76)的重组2H5抗-CD70抗体。细胞毒素G是一种需要酯酶激活的前体药物。
为了证明抗-CD70-细胞毒素G在786-O细胞异种移植上的活性，SCID小鼠每只小鼠经皮下植入了在0.1ml PBS和0.1ml MatrigelTM中的250万个786-O细胞，并且当肿瘤达到110mm3的平均大小时，通过经腹膜内注射单一剂量的抗-CD70-细胞毒素G(以0.005、0.03或0.1μmol/kg体重的剂量)对8只小鼠的组进行治疗。此外，仅用运载体或用连接至细胞毒素G的同种型对照抗体(以0.03μmol/kg以及0.1μmol/kg的剂量)对对照组进行注射。在该研究的整个过程中记录肿瘤体积(LWH/2)和小鼠的重量，持续进行到给药后61天。结果示于图63中。这些结果证明在本试验中抗-CD70抗体本身或同种型对照偶联物对肿瘤的生长几乎没有影响，而用抗-CD70-细胞毒素G治疗的小鼠清楚地表现出剂量依赖性的抗肿瘤功效。
在荷有Caki-1肿瘤异种移植的SCID小鼠中接下来证明了抗-CD70-细胞毒素G的活性。将Caki-1细胞(在0.1ml PBS和0.1ml MatrigelTM中250万个细胞/小鼠)经皮下植入到SCID小鼠中，并且当肿瘤达到120mm3的平均大小时，通过经腹膜内注射单一剂量的抗-CD70细胞毒素G(以0.03、0.1或0.3μmol/kg体重的剂量)对8只小鼠的组进行治疗。此外，仅用运载体对对照组进行注射。在该研究的整个实验过程中记录肿瘤体积(LWH/2)和小鼠的重量，持续进行到给药后61天。结果示于图64。这些结果证明抗-CD70-细胞毒素G偶联物在荷有caki-1肿瘤的小鼠中抵抗肾癌是有功效的，并且该治疗是剂量依赖性的。
实施例39：通过抗-CD70-毒素H在体内抑制肿瘤生长
在这个实施例中，在两个肾癌的异种移植模型中证明了抗-CD70-细胞毒素H的功效。CD70抗体2H5的细胞毒素偶联物在此称为CD70-细胞毒素H，它包含连接至细胞毒素H(图77)上的重组2H5抗-CD70抗体。
在荷有A498肿瘤异种移植的SCID小鼠中证明了抗-CD70-细胞毒素H的活性。将A498细胞(在0.1ml PBS和0.1ml MatrigelTM中500万个细胞/小鼠)经皮下植入到SCID小鼠中，并且当肿瘤达到110mm3的平均大小时，通过经腹膜内注射单一剂量的抗-CD70细胞毒素H(以0.1μmol/kg体重)对8只小鼠的组进行治疗。此外，仅用运载体对对照组进行注射。在该研究的整个实验过程中记录肿瘤体积(LWH/2)和小鼠的重量，持续进行到给药后大约60天。结果示于图65中。这些结果证明抗-CD70-细胞毒素H偶联物抵抗肾癌是有功效的。
为了证明抗-CD70-细胞毒素H在Caki-1细胞异种移植上的活性，将SCID小鼠每只小鼠皮下植入在0.1ml PBS和0.1ml MatrigelTM中的250万个Caki-1细胞，并且当肿瘤达到130mm3的平均大小时，通过经腹膜内注射单一剂量的抗-CD70-细胞毒素H(以0.03、0.1或0.3μmol/kg体重的剂量)对8只小鼠的组进行治疗。此外，仅用运载体或用连接至细胞毒素H的同种型对照抗体(以0.1μmol/kg以及0.3μmol/kg的剂量)对对照组进行注射。在该研究的整个过程中记录肿瘤体积(LWH/2)和小鼠的重量，持续进行到给药后61天。结果示于图66。在这个具体的小鼠异种移植模型中(它是免疫妥协的)并且在所说明的剂量下，用裸露的CD70抗体治疗没有显示出对肿瘤体积的影响(即，没有抑制肿瘤生长)。在这个实验中同种型对照偶联物对肿瘤的生长也几乎没有影响。相反，抗-CD70-细胞毒素H偶联物清楚地显示剂量依赖性的抗肿瘤功效。
实施例40：通过抗-CD70-毒素I在体内抑制肿瘤生长
在这个实施例中，在两个肾癌的异种移植模型(SCID小鼠中的786-O细胞和裸大鼠中的Caki-1细胞)中证明了抗-CD70-细胞毒素I的功效。CD70抗体2H5的细胞毒素偶联物在此称为CD70-细胞毒素I，它包含连接至细胞毒素I(图78)上的重组2H5抗-CD70抗体。
在荷有786-O肿瘤异种移植的SCID小鼠中证明了抗-CD70-细胞毒素I的活性。将786-O细胞(在0.1ml PBS和0.1ml MatrigelTM中250万个细胞/小鼠)经皮下植入到SCID小鼠中，并且当肿瘤达到170mm3的平均大小时，通过经腹膜内注射单一剂量的抗-CD70细胞毒素I(以0.005μmol/kg体重的剂量)对6只小鼠的组进行治疗。此外，仅用运载体对对照组进行注射。在该研究的整个过程中记录肿瘤体积(LWH/2)和小鼠的重量。结果示于图67中。这些结果证明即使在低剂量下抗-CD70-细胞毒素I偶联物抵抗肾癌也是有功效的。
为了证明在多个物种中能够观察到此功效，测试了裸大鼠中的异种移植模型。在这个模型中，将Caki-1细胞(在0.2ml RPMI-1640中1000万个细胞/大鼠)经皮下植入到裸大鼠中，并且当肿瘤达到100mm3的平均大小时，通过经腹膜内注射单一剂量的抗-CD70-细胞毒素I(以0.3μmol/kg体重的剂量)对大鼠的组进行治疗。此外，仅用运载体、仅用抗-CD70抗体或者用作为单一剂量(以0.3μmol/kg体重的剂量)的同种型对照抗体细胞毒素I偶联物对对照组进行注射。在该研究的整个过程中记录肿瘤体积(LW2/2)和大鼠的重量。结果示于图68中。这些结果证明仅有CD70抗体对肿瘤生长几乎没有影响，并且同种型对照偶联物未表现出对肿瘤生长的影响。然而，抗-CD70-细胞毒素I偶联物显示了显著的抗肿瘤作用。肿瘤消退得以实现。因此，抗-CD70-细胞毒素I偶联物在多个物种中显示了抗肿瘤作用。
实施例41：通过抗-CD70-毒素J在体内抑制肿瘤生长
在这个实施例中，已经在肾癌的异种移植模型(SCID小鼠中的786-O细胞)中证明了抗-CD70-细胞毒素J的功效。CD70抗体2H5的细胞毒素偶联物在此称为CD70-细胞毒素J，它包含连接至细胞毒素J(图79)上的重组2H5抗-CD70抗体。细胞毒素J是需要通过葡糖醛酸糖苷酶剪切来激活的一种前体药物。
在荷有786-O肿瘤异种移植的SCID小鼠中证明了抗-CD70-细胞毒素J的活性。将786-O细胞(在0.1ml PBS和0.1ml MatrigelTM中250万个细胞/小鼠)经皮下植入到SCID小鼠中，并且当肿瘤达到170mm3的平均大小时，通过经腹膜内注射单一剂量的抗-CD70细胞毒素J(以0.03μmol/kg体重的剂量)对6只小鼠的组进行治疗。此外，仅用运载体对对照组进行注射。在该研究的整个过程中记录肿瘤体积(LWH/2)和小鼠的重量。结果示于图69中。这些结果证明在这个模型中抗-CD70-细胞毒素J偶联物抵抗肾癌是有功效的。
实施例42：通过抗-CD70抗体功能性阻断CD70共刺激的T细胞增殖
这个实施例说明了对通过抗-CD70抗体1F4IgG1、1F4IgG4、2H5、2H5F(ab’)2和2H5Fab功能性阻断CD70共刺激的T细胞增殖的分析和表征。
使用MACS CD3微珠从冷藏保存的PBMC中分离出人类CD3阳性的T细胞，并接着在小鼠CD32和人类CD70两者稳定转染的经丝裂霉素C处理的CHO细胞的存在下，将细胞以2×106个细胞/ml培养在RPMI-1640完全培养基+10％热灭活的FCS中。细胞用1μg/ml的抗CD3(克隆OKT3)刺激3天，加入1μCi/孔的3H-胸腺嘧啶核苷持续6小时，并且收集细胞。将增殖测量为通过闪烁计数法测定的CPM掺入。
该数据显示，1F4和2H5抗体能够以剂量依赖性方式阻断CD70介导的CD27信号传导所引起的由人类抗CD3刺激的T细胞进行的增殖。该数据还显示通过2H5进行的功能性阻断非典型地需要IgG1Fc区介导的细胞表面CD70的多聚化来影响阻断活性，而1F4典型地不需要。参见图70。相对于2H5IgG1而言，通过2H5F(ab’)2的功能性阻断功效减小以及2H5Fab功能性阻断活性的完全缺乏，证明了2H5结合的表位的不寻常的特征。相比之下，1F4IgG4相对于1F4IgG1而言等效的功能性阻断活性证明了1F4结合的表位典型地不需要IgG1 Fc区介导的CD70多聚化来影响阻断活性，正如具有功能性阻断活性的抗体通常观察到的。
因此，这些数据显示，相对于功能性阻断CD70介导的人类T细胞激活而言，2H5结合具有不寻常以及可能独特的特性的表位。此外，通过2H5结合的表位还可以有利于2H5IgG1或2H5NF介导的ADCC、内化、亲和力等的质量和效力。
抗体1F4和2H5阻断CD70介导的CD27信号传导引起的由人类抗CD3刺激的T细胞增殖的能力与任何炎症迹象的治疗有关，其中CD70的功能在疾病进程中发挥作用。
序列标识符列表
  SEQID NO：   序列   SEQID NO：   序列
  1   VH氨基酸2H5   31   VK CDR1氨基酸2H5
  2   VH氨基酸10B4   32   VK CDR1氨基酸10B4
  3   VH氨基酸8B5   33   VK CDR1氨基酸8B5
  4   VH氨基酸18E7   34   VK CDR1氨基酸18E7
  5   VH氨基酸69A7   35   VK CDR1氨基酸69A7和69A7Y
  6   VH氨基酸1F4   36   VK CDR1氨基酸1F4
  7   VK氨基酸2H5   37   VK CDR2氨基酸2H5
  8   VK氨基酸10B4   38   VK CDR2氨基酸10B4
  9   VK氨基酸8B5   39   VK CDR2氨基酸8B5
  10   VK氨基酸18E7   40   VK CDR2氨基酸18E7
  11   VK氨基酸69A7和69A7Y   41   VK CDR2氨基酸69A7和69A7Y
  12   VK氨基酸1F4   42   VK CDR2氨基酸1F4
  13   VH CDR1氨基酸2H5   43   VK CDR3氨基酸2H5
  14   VH CDR1氨基酸10B4   44   VK CDR3氨基酸10B4
  15   VH CDR1氨基酸8B5   45   VK CDR3氨基酸8B5
  16   VH CDR1氨基酸18E7   46   VK CDR3氨基酸18E7
  17   VH CDR1氨基酸69A7和69A7Y   47   VK CDR3氨基酸69A7和69A7Y
  18   VH CDR1氨基酸1F4   48   VK CDR3氨基酸1F4
  19   VH CDR2氨基酸2H5   49   VH核苷酸2H5
  20   VH CDR2氨基酸10B4   50   VH核苷酸10B4
  21   VH CDR2氨基酸8B5   51   VH核苷酸8B5
  22   VH CDR2氨基酸18E7   52   VH核苷酸18E7
  23   VH CDR2氨基酸69A7和69A7Y   53   VH核苷酸69A7
  24   VH CDR2氨基酸1F4   54   VH核苷酸1F4
  25   VH CDR3氨基酸2H5   55   VK核苷酸2H5
  26   VH CDR3氨基酸10B4   56   VK核苷酸10B4
  27   VH CDR3氨基酸8B5   57   VK核苷酸8B5
  28   VH CDR3氨基酸18E7   58   VK核苷酸18E7
  29   VH CDR3氨基酸69A7   59   VK核苷酸69A7和69A7Y
  30   VH CDR3氨基酸1F4   60   VK核苷酸1F4
  61   VH 3-30.3种系氨基酸   69   JH 4b种系氨基酸
  62   VH 3-33种系氨基酸   70   JK 4种系氨基酸
  63   VH 4-61种系氨基酸   71   JK 3种系氨基酸
  64   VH 3-23种系氨基酸   72   JK 2种系氨基酸
  65   VK L6种系氨基酸   73   VH氨基酸69A7Y
  66   VK L18种系氨基酸   74   VH核苷酸69A7Y
  67   VK L15种系氨基酸   75   VH CDR3氨基酸69A7Y
  68   VK A27种系氨基酸   76   人类CD70(P32970)
  77   肽连接物
  78   肽连接物
  79   肽连接物
  80   肽连接物
  81   肽连接物
  82   肽连接物
  83   肽连接物
  84   肽连接物
  85   肽连接物
  86   肽连接物
  87   肽连接物
  88   肽连接物
  89   肽连接物
  90   巨细胞病毒肽
  91   肽连接物
  92   肽连接物
序列表
<110>梅达雷克斯公司
M·A·科恰
J·A·特雷特
D·J·金
C·帕恩
J·卡尔达雷利
M·亚马纳卡
K·A·亨宁
<120>结合CD70的人类抗体及其用途
<130>077375.0533
<150>US 60/870,091
<151>2006-12-14
<150>US 60/915,314
<151>2007-05-01
<150>US 60/991,702
<151>2007-11-30
<160>92
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>118
<212>PRT
<213>人类
<400>1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Thr Asp Gly Tyr Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>2
<211>119
<212>PRT
<213>人类
<400>2
Gln Ile Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Tyr Tyr
            20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Pro Tyr Ser Asn Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>3
<211>118
<212>PRT
<213>人类
<400>3
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe  Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Ser
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Ser Ile Met Val Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>4
<211>118
<212>PRT
<213>人类
<400>4
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Ser Ile Met Val Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>5
<211>122
<212>PRT
<213>人类
<400>5
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Asp
            20                  25                  30
Tyr Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Thr Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Gly Asp Gly Asp Tyr Gly Gly Asn Cys Phe Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>6
<211>120
<212>PRT
<213>人类
<400>6
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Ser
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Val Asp Tyr Ser Asn Tyr Leu Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>7
<211>107
<212>PRT
<213>人类
<400>7
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Thr Asn Trp Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>8
<211>107
<212>PRT
<213>人类
<400>8
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
            100                 105
<210>9
<211>107
<212>PRT
<213>人类
<400>9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>10
<211>107
<212>PRT
<213>人类
<400>10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>11
<211>107
<212>PRT
<213>人类
<400>11
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Phe Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>12
<211>108
<212>PRT
<213>人类
<400>12
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
                85                  90                  95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>13
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>13
Ser Tyr Ile Met His
1               5
<210>14
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>14
Tyr Tyr Ala Met His
1               5
<210>15
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>15
Asp Tyr Gly Met His
1               5
<210>16
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>16
Asp His Gly Met His
1               5
<210>17
<211>7
<212>PRT
<213>人类
<400>17
Ser Asp Tyr Tyr Tyr Trp Ser
1               5
<210>18
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>18
Ile Tyr Ala Met Ser
1               5
<210>19
<211>17
<212>PRT
<213>人类
<400>19
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>20
<211>17
<212>PRT
<213>人类
<400>20
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>21
<211>17
<212>PRT
<213>人类
<400>21
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>22
<211>17
<212>PRT
<213>人类
<400>22
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>23
<211>16
<212>PRT
<213>人类
<400>23
Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210>24
<211>17
<212>PRT
<213>人类
<400>24
Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val Arg
1               5                   10                  15
Gly
<210>25
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>25
Asp Thr Asp Gly Tyr Asp Phe Asp Tyr
1               5
<210>26
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>26
Glu Gly Pro Tyr Ser Asn Tyr Leu Asp Tyr
1               5                   10
<210>27
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>27
Asp Ser Ile Met Val Arg Gly Asp Tyr
1               5
<210>28
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>28
Asp Ser Ile Met Val Arg Gly Asp Tyr
1               5
<210>29
<211>12
<212>PRT
<213>人类
<400>29
Gly Asp Gly Asp Tyr Gly Gly Asn Cys Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>30
<211>11
<212>PRT
<213>人类
<400>30
Val Asp Tyr Ser Asn Tyr Leu Phe Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>31
<211>11
<212>PRT
<213>人类
<400>31
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>32
<211>11
<212>PRT
<213>人类
<400>32
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala
1               5                   10
<210>33
<211>11
<212>PRT
<213>人类
<400>33
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1               5                   10
<210>34
<211>11
<212>PRT
<213>人类
<400>34
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1               5                   10
<210>35
<211>11
<212>PRT
<213>人类
<400>35
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>36
<211>12
<212>PRT
<213>人类
<400>36
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>37
<211>7
<212>PRT
<213>人类
<400>37
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1               5
<210>38
<211>7
<212>PRT
<213>人类
<400>38
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1               5
<210>39
<211>7
<212>PRT
<213>人类
<400>39
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1               5
<210>40
<211>7
<212>PRT
<213>人类
<400>40
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1               5
<210>41
<211>7
<212>PRT
<213>人类
<400>41
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1               5
<210>42
<211>7
<212>PRT
<213>人类
<400>42
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
<210>43
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>43
Gln Gln Arg Thr Asn Trp Pro Leu Thr
1               5
<210>44
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>44
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Phe Thr
1               5
<210>45
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>45
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1               5
<210>46
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>46
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1               5
<210>47
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>47
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr
1               5
<210>48
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>48
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Thr
1               5
<210>49
<211>354
<212>DNA
<213>人类
<400>49
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc     60
tcctgtgcag cctctggatt taccttcagt agctatatta tgcactgggt ccgccaggct    120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagaaa caaatactac    180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat    240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatacg    300
gatggctacg attttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca          354
<210>50
<211>357
<212>DNA
<213>人类
<400>50
caaatacaac tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc    60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcggt tactatgcta tgcactgggt ccgccaggct    120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagcat taaatactac    180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat    240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagagggc    300
ccttacagta actaccttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca       357
<210>51
<211>354
<212>DNA
<213>人类
<400>51
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc     60
tcctgtgcga cgtctggatt caccttcagt gactatggca tgcactgggt ccgccaggct    120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat    180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa aacgctgtct    240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagattct    300
attatggttc ggggggacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca          354
<210>52
<211>354
<212>DNA
<213>人类
<400>52
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc     60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagc gaccatggca tgcactgggt ccgccaggct    120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat    180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat    240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagattct    300
attatggttc ggggggacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca          354
<210>53
<211>366
<212>DNA
<213>人类
<400>53
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc     60
acctgcactg tctctggtgg ctccgtcagc agtgattatt actactggag ctggatccgg    120
cagcccccag ggaagggact ggagtggctt gggtatatct attacagtgg gagcaccaac    180
tacaacccct ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc    240
tccctgaagc tgaggtctgt gaccactgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagaggg    300
gatggggact acggtggtaa ctgttttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc    360
tcctca                                                               366
<210>54
<211>360
<212>DNA
<213>人类
<400>54
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc     60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc atctatgcca tgagctgggt ccgccaggct    120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtgata gtggtggtcg cacatacttc    180
gcagactccg tgaggggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtct    240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaggtcgac    300
tacagtaact acctattctt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca    360
<210>55
<211>321
<212>DNA
<213>人类
<400>55
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc     60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct    120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc    180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct    240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtaccaact ggccgctcac tttcggcgga    300
gggaccaagg tggagatcaa a                                              321
<210>56
<211>321
<212>DNA
<213>人类
<400>56
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc     60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca    120
gggaaagctc ctaagttctt gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca    180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct    240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt acccattcac tttcggccct    300
gggaccaaag tggatatcaa a                                              321
<210>57
<211>321
<212>DNA
<213>人类
<400>57
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc     60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca    120
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca    180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct    240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccgctcac tttcggcgga    300
gggaccaagg tggagatcaa a                                              321
<210>58
<211>321
<212>DNA
<213>人类
<400>58
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc     60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca    120
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca    180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct    240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccgctcac tttcggcgga    300
gggaccaagg tggagatcaa a                                              321
<210>59
<211>321
<212>DNA
<213>人类
<400>59
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc     60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct    120
ggccaggctc ccaggctcct catctttgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc    180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct    240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcaa cgtagcaact ggccgctcac tttcggcgga    300
gggaccaagg tggagatcaa a                                              321
<210>60
<211>324
<212>DNA
<213>人类
<400>60
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc     60
ctctcctgca gggccagtca gagtattagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa    120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca    180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag    240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgta cacttttggc    300
caggggacca agctggagat  caaa                                          324
<210>61
<211>98
<212>PRT
<213>人类
<400>61
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala  Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>62
<211>98
<212>PRT
<213>人类
<400>62
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
     50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>63
<211>99
<212>PRT
<213>人类
<400>63
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
            20                  25                  30
Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg
<210>64
<211>98
<212>PRT
<213>人类
<400>64
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys
<210>65
<211>94
<212>PRT
<213>人类
<400>65
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp
                85                  90
<210>66
<211>95
<212>PRT
<213>人类
<400>66
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro
                 85                  90                  95
<210>67
<211>95
<212>PRT
<213>人类
<400>67
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro
                85                  90                  95
<210>68
<211>96
<212>PRT
<213>人类
<400>68
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
                85                  90                  95
<210>69
<211>15
<212>PRT
<213>人类
<400>69
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10                  15
<210>70
<211>12
<212>PRT
<213>人类
<400>70
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1              5                   10
<210>71
<211>12
<212>PRT
<213>人类
<400>71
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
1               5                   10
<210>72
<211>12
<212>PRT
<213>人类
<400>72
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>73
<211>122
<212>PRT
<213>人类
<400>73
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Asp
            20                  25                  30
Tyr Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Thr Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Gly Asp Gly Asp Tyr Gly Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>74
<211>366
<212>DNA
<213>人类
<400>74
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc      60
acctgcactg tctctggtgg ctccgtcagc agtgattatt actactggag ctggatccgg     120
cagcccccag ggaagggact ggagtggctt gggtatatct attacagtgg gagcaccaac     180
tacaacccct ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc     240
tccctgaagc tgaggtctgt gaccactgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagaggg     300
gatggggact acggtggtaa ctattttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc     360
tcctca                                                                366
<210>75
<211>12
<212>PRT
<213>人类
<400>75
Gly Asp Gly Asp Tyr Gly Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>76
<211>193
<212>PRT
<213>人类
<400>76
Met Pro Glu Glu Gly Ser Gly Cys Ser Val Arg Arg Arg Pro Tyr Gly
1               5                   10                  15
Cys Val Leu Arg Ala Ala Leu Val Pro Leu Val Ala Gly Leu Val Ile
            20                  25                  30
Cys Leu Val Val Cys Ile Gln Arg Phe Ala Gln Ala Gln Gln Gln Leu
        35                  40                  45
Pro Leu Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His
    50                  55                  60
Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala
65                  70                  75                  80
Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu
                85                  90                  95
Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu
            100                 105                 110
Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu
        115                 120                 125
Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg
    130                 135                 140
Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro
145                 150                 155                 160
Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu
                165                 170                 175
Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg
            180                 185                 190
Pro
<210>77
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>77
Ala Leu Ala Leu
1
<210>78
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>78
Ala Leu Ala Leu
1
<210>79
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>79
Gly Phe Leu Gly
1
<210>80
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>80
Pro Arg Phe Lys
1
<210>81
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>81
Thr Arg Leu Arg
1
<210>82
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>82
Ser Lys Gly Arg
1
<210>83
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>83
Pro Asn Asp Lys
1
<210>84
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>84
Pro Val Gly Leu Ile Gly
1               5
<210>85
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>85
Gly Pro Leu Gly Val
1               5
<210>86
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>86
Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Gln
1               5
<210>87
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>87
Pro Leu Gly Leu
1
<210>88
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>88
Gly Pro Leu Gly Met Leu Ser Gln
1               5
<210>89
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>89
Gly Pro Leu Gly Leu Trp Ala Gln
1               5
<210>90
<211>9
<212>PRT
<213>巨细胞病毒
<400>90
Ile Pro Ser Ile Asn Val His His Tyr
1               5
<210>91
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>91
Leu Leu Gly Leu
1
<210>92
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>92
Ala Leu Ala Leu
1

Claims (63)

1.一种抗体-配偶体分子偶联物，包括分离的人类单克隆抗体或该抗体的抗原结合部分，以及配偶体分子，其中该抗体结合人类CD70并表现出以下特性中的至少一种：
(a)以1×10-7M或更小的KD结合人类CD70；并且
(b)结合肾细胞癌肿瘤细胞系；
(c)结合淋巴瘤细胞系；
(d)被表达CD70的细胞内化；
(e)表现出针对表达CD70的细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)；并且
(f)当与细胞毒素相偶联时在体内抑制表达CD70的细胞的生长，其中该配偶体分子是治疗剂。
2.如权利要求1所述的抗体-配偶体分子偶联物，其中该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的至少两种。
3.如权利要求1所述的抗体-配偶体分子偶联物，其中该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的至少三种。
4.如权利要求1所述的抗体-配偶体分子偶联物，其中该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的至少四种。
5.如权利要求1所述的抗体-配偶体分子偶联物，其中该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的至少五种。
6.如权利要求1所述的抗体-配偶体分子偶联物，其中该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的所有六种。
7.如权利要求1所述的抗体-配偶体分子偶联物，该偶联物以5.5×10-9M或更小的亲和力与人类CD70结合。
8.如权利要求1所述的抗体-配偶体分子偶联物，该偶联物以3×10-9M或更小的亲和力与人类CD70结合。
9.如权利要求1所述的抗体-配偶体分子偶联物，该偶联物以2×10-9M或更小的亲和力与人类CD70结合。
10.一种抗体-配偶体分子偶联物，包括分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，以及配偶体分子，该单克隆抗体或其抗原结合部分结合由参考抗体识别的人类CD70上的表位，其中该参考抗体包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：1；以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：7；
(b)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：2；以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：8；
(c)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：3；以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：9；
(d)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：4；以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：10；
(e)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：5；以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：11；
(f)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：73；以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：11；或者
(g)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：6；以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：12；
其中该配偶体分子是治疗剂。
11.如权利要求10所述的抗体-配偶体分子偶联物，其中该参考抗体包括：
重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：1；以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：7。
12.如权利要求10所述的抗体-配偶体分子偶联物，其中该参考抗体包括：
重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：2；以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：8。
13.如权利要求10所述的抗体-配偶体分子偶联物，其中该参考抗体包括：
重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：3；以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：9。
14.如权利要求10所述的抗体-配偶体分子偶联物，其中该参考抗体包括：
重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：4；以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：10。
15.如权利要求10所述的抗体-配偶体分子偶联物，其中该参考抗体包括：
重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：5；以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：11。
16.如权利要求10所述的抗体-配偶体分子偶联物，其中该参考抗体包括：
重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：73；以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：11。
17.如权利要求10所述的抗体-配偶体分子偶联物，其中该参考抗体包括：
重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：6；以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：12。
18.一种抗体-配偶体分子偶联物，包括分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，以及配偶体分子，该单克隆抗体或其抗原结合部分包括重链可变区，该重链可变区是人类VH 3-30.3基因、人类VH 3-33基因、人类VH 4-61基因或人类VH 3-23基因的产物或衍生自该基因，其中该抗体特异性地结合CD70，其中该配偶体分子是治疗剂。
19.一种抗体-配偶体分子偶联物，包括分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，以及配偶体分子，该单克隆抗体或其抗原结合部分包括轻链可变区，该轻链可变区是人类VK L6基因、人类VK L18基因、人类VK L15基因、人类VK L6基因或人类VK 27基因的产物或衍生自该基因，其中该抗体特异性地结合CD70，其中该配偶体分子是治疗剂。
20.一种抗体-配偶体分子偶联物，包括分离的抗体或其抗原结合部分，以及配偶体分子，该抗体或其抗原结合部分包括：
(a)重链可变区，该重链可变区是人类VH 3-33基因的产物或衍生自该基因；以及轻链可变区，该轻链可变区是人类VK L15基因的产物或衍生自该基因；
(b)重链可变区，该重链可变区是人类VH 3-30.3基因的产物或衍生自该基因；以及轻链可变区，该轻链可变区是人类VK L6基因的产物或衍生自该基因；其中该抗体特异性地结合人类CD70；
(c)重链可变区，该重链可变区是人类VH 3-30.3基因的产物或衍生自该基因；以及轻链可变区，该轻链可变区是人类VK L-18基因的产物或衍生自该基因；其中该抗体特异性地结合人类CD70；
(d)重链可变区，该重链可变区是人类VH 4-61基因的产物或衍生自该基因；以及轻链可变区，该轻链可变区是人类VK L6基因的产物或衍生自该基因；其中该抗体特异性地结合人类CD70；或者
(e)重链可变区，该重链可变区是人类VH 3-23基因的产物或衍生自该基因；以及轻链可变区，该轻链可变区是人类VK A27基因的产物或衍生自该基因；其中该抗体特异性地结合人类CD70，
其中该配偶体分子是治疗剂。
21.如权利要求1所述的抗体-配偶体分子偶联物，包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：13；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：19；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：25；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：31；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：37；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：43。
22.如权利要求1所述的抗体-配偶体分子偶联物，包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：14；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：20；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：26；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：32；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：38；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：44。
23.如权利要求1所述的抗体-配偶体分子偶联物，包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：15；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：21；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：27；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：33；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：39；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：45。
24.如权利要求1所述的抗体-配偶体分子偶联物，包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：16；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：22；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：28；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：34；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：40；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：46。
25.如权利要求1所述的抗体-配偶体分子偶联物，包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：17；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：23；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：29；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：35；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：41；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：47。
26.如权利要求1所述的抗体-配偶体分子偶联物，包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：17；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：23；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：75；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：35；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：41；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：47。
27.如权利要求1所述的抗体-配偶体分子偶联物，包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：18；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：24；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：30；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：36；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：42；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：48。
28.一种抗体-配偶体分子偶联物，包括分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，以及配偶体分子，该分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包括：
(a)重链可变区，包括选自SEQ ID NO：1至6以及73的氨基酸序列；以及
(b)轻链可变区，包括选自SEQ ID NO：7至12的氨基酸序列；
其中该抗体特异性地结合人类CD70蛋白，其中该配偶体分子是治疗剂。
29.如权利要求28所述的抗体-配偶体分子偶联物，包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：1；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：7。
30.如权利要求28所述的抗体-配偶体分子偶联物，包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：2；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：8。
31.如权利要求28所述的抗体-配偶体分子偶联物，包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：3；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：9。
32.如权利要求28所述的抗体-配偶体分子偶联物，包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：4；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：10。
33.如权利要求28所述的抗体-配偶体分子偶联物，包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：5；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：11。
34.如权利要求28所述的抗体-配偶体分子偶联物，包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：73；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：11。
35.如权利要求28所述的抗体-配偶体分子偶联物，包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：6；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：12。
36.一种抗体-配偶体分子偶联物，包括分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，以及配偶体分子，该单克隆抗体或其抗原结合部分结合由下述抗体识别的人类CD70蛋白上的表位，所述抗体包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：1；以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：7；
(b)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：2；以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：8；
(c)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：3；以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：9；
(d)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：4；以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：10；
(e)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：5；以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：11；
(f)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：73；以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：11；或者
(g)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：6；以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：12，
其中该配偶体分子是治疗剂。
37.一种组合物，包括如权利要求1所述的抗体-配偶体分子偶联物以及药学上可接受的载体。
38.如权利要求1所述的抗体-配偶体分子偶联物，其中该治疗剂是细胞毒素。
39.一种组合物，包括如权利要求38所述的抗体-配偶体分子偶联物以及药学上可接受的载体。
40.如权利要求1所述的抗体-配偶体分子偶联物，其中该治疗剂是放射性同位素。
41.一种组合物，包括如权利要求40所述的抗体-配偶体分子偶联物以及药学上可接受的载体。
42.抑制表达CD70的肿瘤细胞生长的方法，包括将该表达CD70的肿瘤细胞与如权利要求1所述的抗体-配偶体分子偶联物相接触，这样使得该表达CD70的肿瘤细胞的生长受到抑制。
43.如权利要求42所述的方法，其中该表达CD70的肿瘤细胞是肾肿瘤细胞或淋巴瘤细胞。
44.如权利要求42所述的方法，其中该表达CD70的肿瘤细胞是来自选自肾细胞癌或淋巴瘤的癌症。
45.一种治疗受试者癌症的方法，包括给予该受试者如权利要求1所述的抗体-配偶体分子偶联物，这样使该受试者的癌症得到治疗。
46.如权利要求45所述的方法，其中该癌症是肾细胞癌或淋巴瘤。
47.如权利要求45所述的方法，其中该癌症是选自：肾细胞癌(RCC)、透明细胞RCC、成胶质细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、多发性骨髓瘤、皮肤T淋巴细胞瘤、结节状小裂细胞淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、伦纳特淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴瘤、T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T细胞白血病(T-ALL)、中心母细胞性/中心细胞性(cb/cc))滤泡淋巴瘤癌、B细胞谱系的弥漫型大细胞性淋巴瘤、血管免疫母细胞淋巴结病(AILD)样T细胞淋巴瘤、HIV相关的基于体腔的淋巴瘤、胚胎性癌、未分化的鼻咽癌、施明克氏瘤、卡斯尔曼氏病、卡波西氏肉瘤、多发性骨髓瘤、沃尔丹斯特伦氏巨球蛋白血症以及B细胞淋巴瘤。
48.治疗或预防受试者的自身免疫疾病的方法，包括给予该受试者如权利要求1所述的抗体-配偶体分子偶联物，由此使该受试者的自身免疫疾病得到治疗或预防。
49.治疗或预防受试者的炎症的方法，包括给予该受试者如权利要求1所述的抗体-配偶体分子偶联物，这样使该受试者的炎症得到治疗或预防。
50.治疗受试者的病毒感染的方法，包括给予该受试者如权利要求1所述的抗体-配偶体分子偶联物，这样使该受试者的病毒感染得到治疗。
51.如权利要求1所述的抗体-配偶体分子偶联物，其中该配偶体分子通过化学连接物被偶联到该抗体上。
52.如权利要求51所述的抗体-配偶体分子偶联物，其中该化学连接物选自肽基连接物、肼连接物以及二硫化物连接物。
53.如权利要求1所述的抗体-配偶体分子偶联物，其中该肾细胞癌肿瘤细胞系选自786-O、A-498、ACHN、Caki-1以及Caki-2细胞系。
54.如权利要求1所述的抗体-配偶体分子偶联物，其中该淋巴瘤细胞系是B细胞肿瘤细胞系。
55.如权利要求54所述的抗体-配偶体分子偶联物，其中该B细胞肿瘤细胞系选自Daudi、HuT 78、Raji以及Granta 519细胞系。
56.如权利要求1所述的抗体-配偶体分子偶联物，其中该抗体或其抗原结合部分是非岩藻糖化的。
57.分离的单克隆抗体或该抗体的抗原结合部分，包括：重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：6；以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ IDNO：12。
58.分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，该单克隆抗体或其抗原结合部分结合由下述抗体识别的人类CD70蛋白上的表位，所述抗体包括：重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：6；以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO：12。
59.一种分离的单克隆抗体或该抗体的抗原结合部分，包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：18；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：24；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：30；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO：36；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO：42；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO：48。
60.如权利要求57所述的抗体，其中该抗体或其抗原结合部分是非岩藻糖化的。
61.一种分离的核酸分子，该核酸分子对如权利要求57所述的抗体或其抗原结合部分进行编码。
62.一种表达载体，包括如权利要求61所述的核酸分子。
63.一种宿主细胞，包括如权利要求62所述的表达载体。
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