JPH11503906A - シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼの変異体に関する。更に詳しくは、本発明は、前駆体CGTase酵素の基質結合及び／又は生成物選択性を改良する方法、並びにその基質に近い位置を保持する１又は複数のアミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失により前駆体CGTase酵素から得られるCGTase変異体に関する。更に、本発明は、CGTase変異体をコードするDNA構造物、発現ベクター、宿主細胞及び本発明のCGTase変異体を生産する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ変異体 技術分野 本発明は、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼの変異体に 関する。更に詳しくは、本発明は、前駆体CGTase酵素の基質結合及び／又は生成 物選択性を改良する方法、並びにその基質に近い位置を保持する１又は複数のア ミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失により前駆体CGTase酵素から得られるCG Tase変異体に関する。更に、本発明は、CGTase変異体をコードするDNA構造物、 発現ベクター、宿主細胞及び本発明のCGTase変異体を生産する方法に関する。 背景技術 以下、CGTaseと呼ばれるシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ又は シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼとも呼ばれるシクロマルトデ キストリングルカノトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．４．１．19）は、分子ト ランスグリコシル化反応によりデンプン及び同様の基質のシクロマルトデキスト リンへの転化を触媒し、それにより、種々の大きさの以後シクロデキストリン（ 又はCD）と呼ばれるシクロマルトデキストリンを形成する。商業的に最も重要な のは、各々α−，β−，γ−シクロデキストリンと呼ばれる６，７及び８グルコ ース単位のシクロデキストリンである。商業的にあまり重要でないのは、各々δ −，ε−及びζ−シクロデキストリンと呼ばれる９，10、及び11グルコース単位 のシクロデキストリンである。 これによりシクロデキストリンは疎水性内部空洞を有する環式グルコースオリ ゴマーである。それらは水溶液中で多くの小さな疎水性分子と包接複合体を形成 し、それにより物理特徴の変化、例えば溶解度及び安定性の増加並びに化学反応 性及び揮発性の減少を生ずる。シクロデキストリンは、特に食物、化粧品、化学 及び医薬工業に適用される。 ほとんどのCGTaseはデンプン分解活性及びトランスグリコシル化活性の両方を 有する。特定のCGTaseは主にα−シクロデキストリンを作り出し、特定のCGTase は主にβ−シクロデキストリンを作り出すが、CGTaseは通常、α−，β−及びγ −シクロデキストリンの混合物を形成する。有機溶媒での選択的沈殿ステップは 、別個のα−，β−及びγ−シクロデキストリンの単離のために用いることがで きる。高価な及び環境に有害な手順を避けるために、増加された比の１つの特定 の型のシクロデキストリンを生産することができるCGTaseの利用性が要求される 。 バチルス（Bacillus）、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）、クロストリ ジウム(Clostridium)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、クレブシエラ（Klebsiella ）、ミクロコッカス(Micrococcus)、サーモアナエロバクター（Therm oanaerobacter ）及びサーモアナエロバクテリウム(Thermoanaerobacterium)から 得られたCGTaseを含む異なるバクテリアソースからのCGTaseが文献に記載されて いる。 これにより、Kimuraら[Kimura K，Kataoka S，Ishii，Y，Takano T and Yaman e K；J．Bacteriol. 1987 169 4399-4402]はバチルス種（Bacillus sp.）1011 C GTaseを記載し、Kanekoら[Kaneko T，Hamamoto T and Horikoshi K；J ．Gen．Mi crobiol. 1988 134 97-105]はバチルス種（Bacillus sp.）株38-2 CGTaseを記載 し、Ka nekoら[Kaneko T，Song KB，Hamamoto T，Kudo T and Horikoshi K；J ．Gem．Mi crobiol. 1989 135 3447-3457]はバチルス種（Bacillus sp.）株17-1 CGTaseを 記載し、Itkorら［Itkor P，Tsukagoshi N and Udaka S；Biochem ．Biophys．Re s．Commum. 1990 166 630-636]はバチルス種（Bacillus sp.）B1018 CGTaseを記 載し、Schmidら［Schmid G，Englbrecht A，Schmid D；Proceedings of the Fou rth International Symposium on Cyclodextrins(Huber O，Szejtli J．Eds.)， 1988 71-76］はバチルス種（Bacillus sp.）1-1 CGTaseを記載し、Kitamotoら［ Kitamoto N，Kimura T，Kito Y，Ohmiya K；J ．Ferment．Bioeng. 1992 74 345- 351］はバチルス種（Bacillus sp.）KC201 CGTaseを記載し、Sakaiら[Sakai S， Kubota M，Nakada T，Torigoe K，Ando O and Sugimoto T；J ．Jpn．Soc．Starc h．Sci. 1987 34 140-147]はバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus ste arothermophilus ）CGTase及びバチルス・マセランス（Bacillus macerans）CGTa seを記載し、Takanoら[Takano T，Fukuda M，Monma M，Kobayashi S，Kainuma K and Yamane K；J ．Bacteriol. 1986 166（3）1118-1122]はバチルス・マセラン ス（Bacillus macerans）CGTaseを記載し、Sinら［Sin K A，Nakamura A，Kobay ashi K，Masaki H and Uozumi T；Appl ．Microbiol．Biotechnol. 1991 35 600- 605］はバチルス・オーベンシス（Bacillus ohbensis）CGTaseを記載し、Nitsch keら[Nitschke L，Heeger K，Bender H and Schultz G；Appl ．Microbiol．Biot echnol. 1990 33 542-546]はバチルス・サーキュランス（Bacillus circulans） CGTaseを記載し、Hillら[Hill D E，Aldape R and Rozzell J D；Nucleic Acids Res. 1990 18 199]はバチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）CG Taseを記載し、Tomitaら[Tomita K，Kaneda M，Kawamura K and Nakanishi K；J ．Ferm．Bioe ng. 1993 75（2）89-92]はバチルス・アウトリチクス（Bacillus autolyticus） CGTaseを記載し、Jamunaら[Jamuna R，Saswathi N，Sheela R and Ramakrishna S V；Appl ．Biochem．Biotechnol. 1993 43 163-176]はバチルス・セレウス（Ba cillus cereus ）CGTaseを記載し、Akimaruら[Akimaru K，Yagi T and Yamamoto S；J ．ferm．Bioeng. 1991 71（5）322-328]はバチルス・コアギュランス（Baci llus coagulans ）CGTaseを記載し、Schmid G［Schmid G；New Trends in Cyclod extrins and Derivatives (Duchene D，Ed.)，Editions de Sante，Paris，1991 ，25-54］はバチルス・フィルムス（Bacillus firmus）CGTaseを記載し、Abelia nら[Abelian V A，Adamian M O，Abelian L A A，Balayan A M and Afrikian E K；Biochememistry （Moscow）1995 60（6）665-669]はバチルス・ハロフィルス （Bacillus halophilus）CGTaseを記載し、そしてKatoら[Kato T and Horikoshi K；J ．Jpn．Soc．Starch Sci. 1986 33（2）137-143]はバチルス・サブチリス （Bacillus subtilis）CGTaseを記載する。 EP 614971はブレビバクテリウム（Brevibacterium）CGTaseを記載し、Haeckel 及びBahl[Haeckel K，Bahl H；FEMS Microbiol ．Lett. 1989 60 333-338]はクロ ストリジウム・サーモスルフロゲネス（Clostridium thermosulfurogenes）CGTa seを記載し、Podkovyrov及びZeikus[Podkovyrov S M，Zeikus J G；J ．Bacterio l. 1992 174 5400-5405]はクロストリジウム・サーモヒドロスルフリクム（Clos tridium thermohydrosulfuricum ）CGTaseを記載し、JP 7000183はコリネバクテ リウム(Corynebacterium)CGTaseを記載し、Binderら［Binder F，Huber O and B ock A；Gene 1986 47 269-277］はクレブシエラ・ネウモニアエ（Klebsiella pn eumoniae ）CGTaseを記載し、US 4,317,881はマイクロコッカス（Micrococcus）C GTaseを記載し、そしてWindら［Wind R D，Liebl W，Buitelaar R M， Penninga D，Spreinat A，Dijkhuizen L，Bahl H；Appl ．Environ．Microbiol. 1995 61（4）1257-1265］はサーモアナエロバクテリウム・サーモスルフリゲネ ス（Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes）CGTaseを記載する。 サーモアナエロバクター種（Thermoanaerobacter sp.）により生産されたCATa seは、Norman及びJorgensen［Norman B E，Jorgensen S T；Denpun Kagaku 1992 ，39，99-106及びWO89/03421］により報告されるが、そのアミノ酸配列はまだ開 示されていない。本明細書において、我々はサーモアナエロバクター種CGTaseを コードするヌクレオチド（配列番号：１）及びそのアミノ酸配列（配列番号：２ ）を報告する。 また、好熱性放射菌類(Actinomycetes)からのCGTaseは［Abelian V A，Afyan K B，Avakian Z G，Melkumyan A G及びAfrikian E G；Biochemistry （Moscow）1 995，60（10）1223-1229］に報告されている。 現在、タンパク質工学は、幾分かの特定のシクロデキストリンを選択的に生産 するために特定のCGTaseを改良するために用いられている。 CGTaseの構造 CGTaseはα−アミラーゼに機能的に関連している。CGTase及びα−アミラーゼ は両方ともα−（１，４）−グリコシド結合の加水分解によりデンプンを分解す るのが、実質的に排他的に各々環式及び直鎖状生成物を生産する。 CGTaseファミリーのメンバーは高い全アミノ酸配列の同一性、60％超を有する 。CGTase及びα−アミラーゼは約30％のアミノ酸同一性を有する。しかしながら 、Ａ及びＢドメインの間に位置したCGTase及びα−アミラーゼの活性部位の裂け 目（Asp229，Glu257及びAs p328）はむしろ類似している。 現在、CGTaseの三次構造が決定されている。これにより、Hofmanら［Hofman B E，Bender H，Schultz G E；J ．Mol．Biol. 1989 209 793-800］並びにKlein及 びSchulz［Klein C，Schulz G E；J ．Mol．Biol. 1991 217 737-750］はバチル ス・サーキュランス(Bacillus circulans)Strain ８由来のCGTaseの三次構造を 報告し、Kubotaら[Kubota M，Matsuura Y，Sakai S and Katsube Y；Denpun Kag aku 1991 38 141-146]は、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stear othermophilus ）TC-91由来のCGTaseの三次構造を報告し、Lawsonら［Lawson C L ，van Montfort R，Strokopytov B，Rozeboom H J，Kalk K H，de Vries G E，P enninga D，Dijkhuizen L，and Dijkstra B W；J ．Mol．Biol. 1994 236 590-60 0］はバチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）Strain 251由来のCGTas eの三次構造を報告し、Strokopytovら［Strokopytov B，Penninga D，Rozeboom H J；Kalk K H，Dijkhuizen L and Dijkstra B W；Biochemistry 1995 34 2234- 2240］は有効なCGTaseインヒビターであるアカルボース（acarbose）と複合体を 形成しているバチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）Strain 251由来 のCGTaseの三次構造を報告し、そしてKnegtelら［Knegtel R M A，Wind R D，Ro zeboom H J，Kal k K H，Buite1aar R M，Dijkhuizen L and Dijkstra B W；J ． Mol．Biol. 1996 256 611-622］は、サーマス・サーモスルフリゲネス（Thermoa naerobacterium thermosulfurigenes ）由来のCGTaseの三次構造を報告する。 これら及び他の研究は、バチルス・サーキュランスCGTaseが５つのドメインか ら構造されることを示した。その三次元構造は、CGTaseのＮ末端ドメインがα− アミラーゼのそれに構造的な類似性を有し、他方Ｃ末端ドメインはCGTaseに特有 であることが見い出された 。 CGTaseの触媒部位はＡドメイン中に位置し、３つの触媒残基を有する（バチル ス・サーキュランス株25において、これらは各々Asp229，Glu257及びAsp328であ る。例えばStrokopytovら、1995、前掲）。中心のアミノ酸残基はＢドメイン中 に位置し、その残基周辺にシクロデキストリンが形成され、即ち環化の軸がある 。この中心残基の置換、例えばβ−シクロデキストリンに対するγ−シクロデキ ストリンの相対生産量を増加させるための（CGTase番号で位置195に相当する） バチルス・オーベンシス(Bacilles ohbensis)における残基188におけるチロシン の置換が、Sinら(Sink，Nakamura A，Masaki H，Matsuura Y及びUozumi T；Jour nal of Biotechnology 1994，32，283-288]及びJP−Ａ−5219948により記載され る研究の目的であった。 Nakamuraら[Nakamura A，Haga K及びYamane K；Biochemistry 1994，33，9929 -9936]は、バチルス種株1011 CGTaseの活性中心における４つの残基で行われた 置換による基質結合及び環化特性への効果を記載する。これらのCGTaseにおいて 、位置183におけるフェニルアラニンはロイシンにより置換され、位置195におけ るチロシンは、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、トレオニン、バリン、 及びトリプトファンに各々置換され、位置259におけるフェニルアラニンはロイ シンにより置換され、そして位置283におけるフェニルアラニンはロイシンによ り置換される。 Penningaら[Penninga D，Strokopytov B，Rozeboom H J，Lawson C L，Dijkst ra B W，Bergsma J及びDijkkuizen L；Biochemistry 1995，34，3368-3376]は、 バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）株251 CGTaseの位置195にお けるチロシンにおける部位特異的変異の活性及び生成物選択性への効果を記載す る。この出 版物において、位置195におけるチロシンが各々フェニルアラニン、トリプトフ ァン、ロイシン及びグリシンにより置換されているCGTase変異体が作られている 。 Fujiwaraら[Fujiwara S，Kakihara H，Sakaguchi K及びImanaka T；J ．Bacter iol 1992，174（22）7478-7481]は、（CGTase番号で位置195に相当する）位置18 1におけるチロシン残基がフェニルアラニンにより置換され、（CGT番号で位置25 8に相当する）位置254におけるトリプトファン残基がバリンにより置換され、（ CGTase番号で位置259に相当する）位置255におけるフェニルアラニンがフェニル アラニン及びイソロイシンに各々置換され、（CGTase番号で位置598に相当する ）位置591におけるトレオニン残基がフェニルアラニンにより置換され、そして （CGTase番号で位置636に相当する）位置629におけるトリプトファン残基がフェ ニルアラニンにより置換されているバチルス・ステアロサーモフィルス由来のCG Tase変異体を記載する。 JP−Ａ−7023781は、位置195におけるチロシン残基がロイシン、バリン、フェ ニルアラニン及びイソロイシンにより各々置換されているバチルス種1011由来の CGTase変異体を記載する。 JP−Ａ−5244945は、（CGTase番号で位置195及び259に相当する）位置222及び 286におけるチロシン残基が、β−シクロデキストリンに対するα−シクロデキ ストリンの相対生産量を増加させるために、フェニルアラニンにより置換されて いるバチルス・ステアロサーモフィルスTC−91由来のCGTase変異体を記載する。 JP−Ａ−5041985は、領域Ａにおける残基140のヒスチジン領域Ｂにおける残基 233のヒスチジン、領域Ｃにおける残基327のヒスチジン各々をアルギニン及びア スパラギン残基各々により置換されているバチルス種＃1011由来のCGTase変異体 を記載する。 EP 630,967は、（CGTase番号で位置195に相当する）バチルス種290−３ CGTas eの位置211におけるチロシン残基、（CGTase番号で位置195に相当する）バチル ス種１−１ CGTaseの位置217におけるチロシン残基、及び（CGTase番号で位置19 5に相当する）バチルス・サーキュランスCGTaseの位置229におけるチロシン残基 がトリプトファン及びセリンに置換されているCGTase変異体を記載する。 現在まで、CGTase変異体を作る全ての努力は、活性部位周辺の領域、特にCGTa se番号で位置195に相当する中心環化残基の置換を導いている。より遠位の領域 において置換を有するCGTaseで示されているものはほんの少ししかなく、これら の変異体の製造はいずれの特定の概念にも基づいていなかった。 発明の概要 本発明の目的は、新規のCGTaseの変異体であって、前駆体酵素と比較した時に 、生成物選択性の増加及び／又は生成物阻害の減少を示すことを特徴とする変異 体を提供することである。 従って、その第１の態様において、本発明は、前駆体CGTase酵素の基質結合及 び／又は生成物選択性を改良する方法であって、該方法が、前記基質に近い位置 を保持する前記前駆体酵素の１又は複数のアミノ酸残基の置換、挿入及び／又は 欠失を含むことを特徴とする方法を提供する。 他の態様において、本発明は、基質に近い位置を保持する１又は複数のアミノ 酸残基の置換、挿入及び／又は欠失により前駆体CGTase酵素から得られるCGTase 変異体を提供する。 第３の態様において、本発明は、本発明のCGTase変異体をコードするDNA構成 物を提供する。 第４の態様において、本発明は、本発明のDNA構成物を含む組換え発現ベクタ ーを提供する。 第５の態様において、本発明は、本発明のDNA構成物、又は本発明の組換え発 現ベクターを含む宿主細胞を提供する。 第６の態様において、本発明は、本発明のCGTase変異体を生産する方法であっ て、CGTase変異体の生産を許容する条件下で本発明の宿主細胞を培養し、そして その培養物から前記酵素を回収することを含むことを特徴とする方法を提供する 。 更なる態様において、本発明は、シクロデキストリンの製造のための過程、直 鎖オリゴヌクレオチドの製造のための過程、及びシクロデキストリンのin situ 形成のための過程に用いるためのCGTase変異体を提供する。 アミノ酸 本発明の文脈において、以下のアミノ酸及びアミノ酸残基についての記号及び 略語を用いる Ａ＝Ala＝アラニン Ｃ＝Cys＝システイン Ｄ＝Asp＝アスパラギン酸 Ｅ＝Glu＝グルタミン酸 Ｆ＝Phe＝フェニルアラニン Ｇ＝Gly＝グリシン Ｈ＝His＝ヒスチジン Ｉ＝Ile＝イソロイシン Ｋ＝Lys＝リシン Ｌ＝Leu＝ロイシン Ｍ＝Met＝メチオニン Ｎ＝Asn＝アスパラギン Ｐ＝Pro＝プロリン Ｑ＝Gln＝グルタミン Ｒ＝Arg＝アルギニン Ｓ＝Ser＝セリン Ｔ＝Thr＝トレオニン Ｖ＝Val＝バリン Ｗ＝Trp＝トリプトファン Ｙ＝Tyr＝チロシン Ｂ＝Asx＝Asp又はAsn Ｚ＝Glx＝Glu又はGln Ｘ＝Xaa＝いずれかのアミノ酸 ^* ＝欠失又は欠損アミノ酸 CGTase変異体 本発明のCGTase変異体は、天然には見い出されないアミノ酸配列を有するCGTa se変異体又は突然変異CGTaseである。 本発明のCGTase変異体又は突然変異CGTaseは、前駆体CGTase酵素（即ちネイテ ィブ、親、又は野生型酵素）の機能的誘導体であり、前駆体酵素をコードする前 駆体遺伝子又はその誘導体のDNAヌクレオチド配列の変換により得ることができ る。CGTase変異体をコードするDNAヌクレオチド配列が適切な宿主生物内の適切 なベクター内に挿入された場合にCGTase変異体又は変異CGTaseが発現され、そし て生産され得る。宿主生物は前駆体遺伝子の起源である生物と同一である必要は ない。 本明細書においては、酵素変異体は、突然変異体又はムテインとしても呼ばれ る。 CGTase番号 本発明の文脈において、CGTaseにおけるアミノ酸残基の位置の特 定の番号を用いる。種々の周知のCGTaseのアミノ酸配列のアラインメントにより 、アミノ酸配列が知られているいずれかのCGTase酵素におけるいずれかのアミノ 酸位置に、CGTaseアミノ酸位置番号を明白に割り当てることが可能である。 他の周知のCGTaseの番号とアラインした表１に示されるバチルス・サーキュラ ンス株251から得られたCGTaseのアミノ酸配列の由来の番号システムを用いて、C GTase酵素におけるアミノ酸残基の位置を明らかに示すことが可能である。 本発明に従って作られ又は考慮される種々のCGTase変異体を記載することにお いて、参照の容易さのために以下の命名法が適合される。 〔もとのアミノ酸；位置；置換したアミノ酸〕 従って、位置145におけるセリンのアラニンでの置換は、S145Aと示される。 バチルス・サーキュランス株251からのCGTaseのアミノ酸配列に関連した挿入 を示すアミノ酸残基は、先行するCGTase番号にアルファベット順で文字を加える ことにより番号をつける。例えば、サーモアナエロバクター種のATCC 53627から のCGTase（表１（ｉ））のアミノ酸の位置91のThrと位置92のGlyとの間の“挿入 ”Pheについて位置91aFである。 位置149におけるプロリンの欠失はP149^*として示され、アミノ酸残基が存在し ない位置147と148との間の挿入は、位置147aにおけるアスパラギン酸の挿入につ いて^*147aDとして示される。 多重の変異はスラッシュ記号（“／”）により分離され、例えばS145A／P147L はセリンをアラニンで、そしてアスパラギン酸をロイシンで各々置換した位置14 5及び147の変異を表す。 置換が、例えばバチルス・サーキュランスの株から得られたCGTa seにおける変異により行われるなら、その生成物は例えば“Ｂ．サーキュランス ／S145A”として表される。 CGTase番号による本願において言及される全ての位置は、上述のCGTase番号を いう。 図面の簡単な記載 本発明は、添付の図面を参照することにより更に詳説される。 図１は、直鎖デンプン分子と複合体化されているバチルス・サーキュランス株 251からのCGTaseの活性部位クレフト（ドメインＡ及びＢ）、及びその酵素−基 質相互作用に関連する残基の構造のモデルを示す。 図２は、（Ａ）野生型酵素（バチルス・サーキュランス株251 CGTase）、（Ｂ ）Y89D CGTase変異体、（Ｃ）S146P CGTase変異体、及び（Ｄ）Y89D／S146P CGT ase変異体により触媒された50℃における50時間のインキュベーションの間の10 ％ Paselli^TMWA4（プレゼラチン化ドラム−乾燥デンプン）からのα−（●）， β−（■）、及びγ−（▲）シクロデキストリンの形成（シクロデキストリン（ ％））を示す。 図３は、プラスミドpDP66Kの構造を示し、ここでサブクローニングステップは 矢印近くに示される。 図４は、β−シクロデキストリンなし（●）、及び0.1mM β−シクロデキスト リン（○）での０〜８％の生のデンプンのデンプン濃度におけるデンプン結合実 験（生のデンプンに結合したタンパク質の割合（％））の結果を示す；（ａ）野 生型（バチルス・サーキュランス株251 CGTase）、（ｂ）W616A/W662A変異体、 及び（ｃ）Y633A変異体。 図５は、β−シクロデキストリンなし（●）、0.1mM β−シクロデキストリン （○）、及び0.2mM β−シクロデキストリン（◆）での０〜５％のPaselli^TMの 濃度におけるPaselli^TMSA2（即ち部分的に加水分解されたポテトデンプン）での 反応速度実験（活性，Ｕ／mg）の結果を示す；（ａ）野生型酵素（バチルス・サ ーキュランス株251 CGTase）、（ｂ）W616A/W662A変異体、及び（ｃ）Y633A変異 体。 図６は、野生型酵素（バチルス・サーキュランス株251 CGTase）（●）、W616 A／W626A変異体（□）、及びY633A変異体（■）での０〜60％の生のデンプンの デンプン濃度における生のデンプンでの反応速度実験の結果（活性、Ｕ／mg）を 示す；点線は、Ｅドメイン上のMBS２とＣドメイン上のMBS３との間に支持された 相互作用からのモデルの曲線を示す。 図７は、０〜45時間のインキュベーションの間の野生型酵素（バチルス・サー キュランス株251、図７Ａ）と比較した本発明の２つのCGTase変異体(N193G、図 ７Ｂ、及びY89G、図７Ｃ）の生成物形成（○：α−シクロデキストリン形；□： β−シクロデキストリン形成、及び△：γ−シクロデキストリン形成）を示す。 図８は、０〜45時間のインキュベーションの間の野生型酵素（バチルス・サー キュランス株251、図８Ａ）と比較した本発明の２つのCGTase変異体（^*145aI、 図８Ｂ、及びD371G、図８Ｃ）の生成物形成（○：α−シクロデキストリン形成 ；□：β−シクロデキストリン形成；及び△：γ−シクロデキストリン形成）を 示す。 図９は、０〜10時間のインキュベーションの間の野生型酵素（バチルス・サー キュランス株251、図９Ａ）と比較した本発明の２つのCGTase変異体(N193G、図 ９Ｂ、及びY89G、図９Ｃ）の生成物形成（○：α−シクロデキストリン形成；□ ：β−シクロデキストリン 形成；及び△：γ−シクロデキストリン形成）を示す。 図10は、０〜10時間のインキュベーションの間の野生型酵素（バチルス・サー キュランス株251、図10Ａ）と比較した本発明の２つのCGTase変異体(145aI、図1 0Ｂ、及びD371G、図10Ｃ）の生成物形成（○：α−シクロデキストリン形成；□ ：β−シクロデキストリン形成；及び△：γ−シクロデキストリン形成）を示す 。 発明の詳細な記載 その第１の態様において、本発明は、基質結合を改良し及び／又はCGTase酵素 の生成物選択性を増加させることにより、前駆体酵素と比較して、改良された基 質結合能及び／又は増加された生成物選択性を有するCGTase変異体を得る方法を 提供する。 本発明の文脈において、改良された基質結合能力のCGTase変異体は、その基質 により有効に作用することができるCGTase変異体、及び／又は生成物阻害により より影響を受けないCGTase変異体を記述することを意味する。本発明の文脈にお いて、生成物阻害とは、生成物の増加量が減少し又は基質転化を阻害さえする現 象を記述することを意味する。生成物阻害によりより影響を受けないCGTase変異 体（即ち生成物阻害の減少した変異体）を得ることが要求される。 更に、本発明の文脈において、生成物選択性の増加したCGTase変異体とは、前 駆体酵素と比較して、種々のシクロデキストリンのいずれかをより選択的に生産 することができ、それにより要求される生成物の比率を増加させるCGTase変異体 を記述することを意味する。 本発明は活性部位クレフト、基質結合クレフト、又はそれらを導く溝のサブ部 位中に“障害物”を除去及び／又は導入し、それにより予め決められた大きさの 生成物を得るように、及び基質結合がそ の生成物によって阻害されないようにその基質の導入及びその配置を容易にする 概念に基づく。 CGTaseの基質結合を改良することにより、その生成物選択性は、CGTase変異体 が種々のシクロデキストリン、即ちα−，β−及びγ−シクロデキストリンのい ずれかをより選択的に生産することができるように改良され得る。９，10及び11 グルコース単位を各々有するδ，ε−、及びζ−シクロデキストリンを生産する ことができるCGTaseでさえ得ることができる。CGTaseの基質結合の改良は、生成 物阻害の傾向も減少させることができ、それによりCGTase変異体のシクロデキス トリン収率を増加させることができる。 本発明の概念は、酵素−基質側鎖分子内相互作用の改良として異なって表現さ れ得る。本発明に従って特定の変異を導入することにより、基質とCGTaseとの間 の分子内相互作用は、活性部位クレフト中の特定の位置に基質を方向づけるよう に変化させることができ、それにより予め決められた大きさの環式もしくは直鎖 生成物、好ましくはα−，β−もしくはγ−シクロデキストリン、もしくはδ， ε−、及びζ−シクロデキストリン、又は同様の大きさの直鎖オリゴサッカリド 、好ましくは２〜12グルコース単位のもの、より好ましくは２〜９グルコース単 位のものを得ることができる。 本発明の好ましい実施形態において、図１のグルコース単位Ｃ〜Ｉ、好ましく はＣ〜Ｈ周囲の領域におけるより多くの分子内相互作用（例えばより多くの水素 結合ポテンシャル）の導入は、（図１のグルコース単位ＢとＣとの間の）触媒部 位から６グルコース単位の位置で基質を閉じ込め、α−シクロデキストリン（６ −グルコース単位）についての生成物選択性を増加させるであろう。更に、より 大きいシクロデキストリン及び／又はより大きいオリゴサッカリドの形成は、図 １のグルコース単位Ｉ〜Ｊの潜在的分子内相互作用を 減少させることにより、同時に削減され得る。 本発明の他の好ましい実施形態において、図１のグルコース単位Ｆ〜Ｊ、好ま しくはＨ及びＩ周囲の領域におけるより多くの分子内相互作用（例えばより多く の水素結合ポテンシャル）の導入は、（図１のグルコース単位ＢとＣとの間の） 触媒部位から７グルコース単位の位置で基質を閉じ込め、β−シクロデキストリ ン（７−グルコース単位）についての生成物選択性を増加させるであろう。更に 、例えばα−シクロデキストリン及び／又は小さな直鎖オリゴサッカリドの形成 は、図１のグルコース単位Ｃ〜Ｇの潜在的分子内相互作用を減少させることによ り、同時に削減され得る。 本発明の第３の好ましい実施形態において、図１のグルコース単位Ｉ〜Ｋ、好 ましくはＩ及びＪ周囲の領域におけるより多くの分子内相互作用（例えばより多 くの水素結合ポテンシャル）の導入は、（図１のグルコース単位ＢとＣとの間の ）触媒部位から８グルコース単位の位置で基質を閉じ込め、γ−シクロデキスト リン（８−グルコース単位）についての生成物選択性を増加させるであろう。更 に、より小さいシクロデキストリン及び／又は直鎖オリゴサッカリドの形成は、 図１のグルコース単位Ｃ〜Ｈの潜在的分子内相互作用を減少させることにより、 同時に削減され得る。 本発明の第４の好ましい実施形態において、図１のグルコース単位Ｊ〜Ｍ、好 ましくはＫ及びＬ周囲の領域におけるより多くの分子内相互作用（例えばより多 くの水素結合ポテンシャル）の導入は、（図１のグルコース単位ＢとＣとの間の ）触媒部位から９グルコース単位の位置で基質を閉じ込め、δ−シクロデキスト リン（９−グルコース単位）についての生成物選択性を増加させるであろう。更 に、より小さなシクロデキストリン及び／又は直鎖オリゴサッカリドの形成は、 図１のグルコース単位Ｃ〜Ｈの潜在的分子内相互作用 を減少させることにより、同時に削減され得る。 本発明の第５の好ましい実施形態において、図１のグルコース単位Ｋ〜Ｎ、好 ましくはＬ及びＭ周囲の領域におけるより多くの分子内相互作用（例えばより多 くの水素結合ポテンシャル）の導入は、（図１のグルコース単位ＢとＣとの間の ）触媒部位から10グルコース単位の位置で基質を閉じ込め、ε−シクロデキスト リン（10−グルコース単位）についての生成物選択性を増加させるであろう。更 に、より小さなシクロデキストリン及び／又は直鎖オリゴサッカリドの形成は、 図１のグルコース単位Ｃ〜Ｈの潜在的分子内相互作用を減少させることにより、 同時に削減され得る。 本発明の第６の好ましい実施形態において、図１のグルコース単位Ｌ〜Ｏ、好 ましくはＭ及びＮ周囲の領域におけるより多くの分子内相互作用（例えばより多 くの水素結合ポテンシャル）の導入は、（図１のグルコース単位ＢとＣとの間の ）触媒部位から11グルコース単位の位置で基質を閉じ込め、ζ−シクロデキスト リン（11−グルコース単位）についての生成物選択性を増加させるであろう。更 に、より小さなシクロデキストリン及び／又は直鎖オリゴサッカリドの形成は、 図１のグルコース単位Ｃ〜Ｈの潜在的分子内相互作用を減少させることにより、 同時に削減され得る。 第７の本発明の好ましい実施形態において、要求される長さの直鎖オリゴサッ カリドの形成は、CGTase番号で位置195に相当する環化軸における置換と上述の 条件を組み合わせることにより、増加され得る。 本発明の方法に係るCGTaseは、天然に見い出されるいずれかのCGTaseであり得 る。しかしながら、CGTaseは好ましくは微生物の酵素、好ましくはバクテリアの 酵素であり、そして好ましくは、CGTaseはバチルスの株、ブレビバクテリウムの 株、クロストリジウムの株 、コリネバクテリウムの株、クレブシエラの株、マイクロコッカスの株、サーモ アナエロビウムの株、サーモアナエロバクターの株、サーモアナエロバクテリウ ムの株、又はサーモアクチノマイセスの株から得られる。 より好ましい実施形態において、CGTaseは、バチルス・アウトリチクス（Baci llus autolyticus ）の株、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)の株、バチル ス・サーキュランス（Bacillus circulans）の株、バチルス・サーキュランス変 種アルカロフィルス（Bacillus circulans var．alkalophilus）の株、バチルス ・コアギュランス（Bacillus coagulans）の株、バチルス・フィルムス(Bacillu s firmus )の株、バチルス・ハロフィルス(Bacillus halophilus)の株、バチルス ・マセランス(Bacillus macerans)の株、バチルス・メガテリウム(Bacillus meg aterium )、バチルス・オーベンシス(Bacillus ohbensis)の株、バチルス・ステ アロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)の株、バチルス・サブチル ス(Bacillus subtilis)の株、クレブシエラ・ネウモニア（Klebsiella pneumoni a ）の株、サーモアナエロバクター・エタノリクス（Thermoanaerobacter ethano licus ）の株、サーモアナエロバクター・フィンニ(Thermoanaerobacter finnii) の株、クロストリジウム・サーモアミロリチウム（Clostridium thermoamylolyt icum ）の株、クロストリジウム・サーモサッカロリチウム(Clostridium thermos accharolyticum )の株、又はサーモアナエロバクテリウム・サーモスルフリゲネ ス（Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes）の株から得られる。 最も好ましい実施形態において、CGTaseは、バチルス種株1011の株、バチルス 種株38−２の株、バチルス種株17−１の株、バチルス種１−１の株、バチルス種 株B1018の株、バチルス・サーキュラン ス株８の株、サーモアナエロバクター種ATCC 53627の株、又はバチルス・サーキ ュランス株251の株又はそれらの突然変異体もしくは変異体から得られる。 サーモアナエロバクター種ATCC 53627の株は、American Type Culture Collec tion（ATCC）(12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，USA)に1987 年６月３日に特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に 従って寄託されている。株バチルス・サーキュランス株251は、Rijksinstituut voor Volksg ezondheid(RIV)，Bilthoven，The Netherlandにオープンコレクシ ョンにおいて寄託されており、受託番号RIV 11115が割り当てられ、これにより 公共的に利用できる。 本発明の方法は、基質がその基質結合部位においてCGTase酵素に結合している 場合に基質に近い位置を保持する酵素の１又は複数のアミノ酸残基の置換、挿入 及び／又は欠失を含む。更に詳しい態様において、本発明の方法は、２以上のア ミノ酸残基、好ましくは３以上のアミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失を含 む。 本発明の文脈において、基質に近い位置を保持するCGTaseアミノ酸残基は、基 質のグルコース単位（即ちポリサッカリド）から潜在的に分子内（即ち酵素−基 質）相互作用する距離以内であるように酵素内に位置するアミノ酸残基を示す。 潜在的分子内相互作用の例は、これらに限定されないが、水素結合、塩橋形成、 極性相互作用、疎水性相互作用、及び芳香族相互作用を含む。 本発明の好ましい実施形態において、基質に近いアミノ酸位置は、基質から８ Å（オングストローム）未満、好ましくは５Å未満、更に好ましくは３Å未満の 距離を示す。 本発明のより好ましい実施形態において、これらの距離は、その配置がエント リーコード1DIJ下でProtein Data Bank(Biology Dep artment，Bldg．463，Brookhaven National Laboratory，P．O．Box 5000，Upto n，NY 11973-5000，USA)に寄託されているマルトナノースの誘導体と複合体化さ れたバチルス・サーキュランス株251からのCGTase[例えばLawson CL，van Montf ort R，Strokopytov B，Rozeboom H J，Kalk K H，de Vries G E，Penning a D ，Dijkhuizen L、及びDijkstra B W，J ．Mol．Biol 1994（236）590-600]を用 いて計算される。この構造の知見は、例えば表２、また表１にも言及される位置 に相当する周知の一次構造を有する他のCGTaseにおける同様の位置を同定するこ とを可能にする。 CGTaseはその酵素のＡドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン及びＥドメインに位 置する基質結合領域を有する。結果として、好ましい実施形態において、本発明 の方法は、その残基が表１の１又は複数のＡ，Ｂ，Ｃ及び／又はＥドメインに位 置するCGTase酵素の１又は複数のアミノ酸残基を置換することを含む。 天然に見い出されるCGTase酵素の配列アラインメント及び分子モデリングによ り、基質近くに位置したアミノ酸残基を同定することができる。配列アラインメ ントを用いることにより、いずれかの相同なCGTaseの三次構造を、周知の三次元 CGTase構造に基づいてモデル形成することができる。 次の表２は、基質から８Å以内に位置し、それゆえ本発明の文脈中のものであ ると考えられるCGTaseアミノ酸位置のリストを供する。アミノ酸残基は、いずれ かのCGTase酵素における対応するアミノ酸位置の同定を許容するCGTaseナンバリ ングにより同定される。 好ましくは、本発明の方法は、以下の表２に確認される１又は複数のアミノ酸 残基における置換、挿入及び／又は欠失を含む。 バチルス・サーキュランス株251から得られたCGTaseの分子モデリングにより 、以下の表３〜５に供されるアミノ酸位置を、基質に近い位置、即ち各々８Å、 ５Å及び３Åの位置として同定した。 より好ましい実施形態において、本発明の方法は、以下の表３〜５に同定され る１又は複数のアミノ酸残基において置換、挿入及び／又は欠失を含む。 同様に、サーモアナエロバクター種ATCC 53627の株から得られたCGTaseの分子 モデリングは、基質に近い位置、即ち各々８Å，５Å及び３Åの距離のものとし て以下の表６〜８に供されるアミノ酸位置を示した。 他の好ましい実施形態において、本発明の方法は、以下の表６〜８に同定され る１又は複数のアミノ酸残基における置換、挿入及び／又は欠失を含む。 上述のように、本発明のCGTase変異体の基質結合及び生成物選択性は、CGTase 変異体とその基質との間の潜在的分子内相互作用を除去し、存在させ及び／又は 導入することによりデザインすることができる。 分子内相互作用の例は、これに限定されないが、水素結合、塩橋形成、極性相 互作用、疎水性相互作用、及び芳香族相互作用を含む。 水素結合ポテンシャル（即ちＨ結合能力を有する）側鎖を有するアミノ酸残基 は一般に次のもの： Ser(S)，Thr(T)，Asn(N)，Gln(Q)，His(H)，Asp(D)，Tyr(Y)，Glu(E)，Lys(K) ，Arg(R)，Trp（W）及びCys(C)である。 対応して、次のアミノ酸は一般に側鎖水素結合を形成する潜在的能力を有さな い（即ちＨ結合能がない）。 Ala(A)，Val(V)，Leu(L)，Ile(I)，Phe(F)，Gly(G)，Met(M)及びPro(P)。 塩橋形成ポテンシャルを有する側鎖を有するアミノ酸残基は一般に次のもので ある： Asp(D)，Glu(E)，Lys(K)，Arg（R）及びHis（H）。 極性相互作用ポテンシャルを有する側鎖を有するアミノ酸残基は一般に次のも のである： Asp(D)，Asn(N)，Glu(E)，Gln(Q)，Lys(K)，Arg(R)，His(H)，Tyr(Y)，Trp（W ）及びCys(C)。 疎水性相互作用ポテンシャルを有する側鎖を有するアミノ酸残基は一般に次の ものである： Ala(A)，Val(V)，Leu(L)，Ile(I)，Phe(F)，Met(M)，Pro(P)並びにGlu（E）及 びGln(Q)側鎖の一部。 芳香族相互作用ポテンシャルを有する側鎖を有するアミノ酸残基 は一般に次のものである： His(H)，Phe(F)，Tyr（Y）及びTrp(W)。 CGTase変異体 その第２の態様において、本発明は、天然では見い出されないアミノ酸配列を 有する新規のCGTase変異体を提供する。機能的に、本発明のCGTase変異体は前駆 体CGTase酵素（即ちネイティブ、親、又は野生型酵素）の誘導体として考えられ る。 本発明のCGTase変異体において、基質結合及び／又は生成物選択性は、基質に 近い位置を保持する１又は複数のアミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失によ り前駆体CGTase酵素と比べて改良されている。 本発明のCGTase変異体は、天然に見い出されるいずれかのCGTase酵素から得る ことができる。しかしながら、本発明のCGTaseは、好ましくは、微生物の酵素、 好ましくはバクテリアの酵素から得られ、そして好ましくは、CGTase変異体は、 バチルスの株、ブレビバクテリウムの株、クロストリジウムの株、コリネバクテ リウムの株、クレブシエラの株、マイクロコッカスの株、サーモアナエロビウム の株、サーモアナエロバクターの株、サーモアナエロバクテリウムの株、又はサ ーモアクチノマイセスの株から得られる。 より好ましい実施形態において、本発明のCGTase変異体は、バチルスアウトリ チクスの株、バチルス・セレウスの株、バチルス・サーキュランスの株、バチル ス・サーキュランス変種アルカロフィルスの株、バチルス・コアギュランスの株 、バチルスフィルムスの株、バチルス・ハロフィルスの株、バチルス・マセラン スの株、バチルス・メガテリウムの株、バチルスオーベンシスの株、バチルス・ ステアロサーモフィルスの株、バチルス・サブチルスの株、クレブシエラ・ネウ モニアの株、サーモアナエロバクター・エタノリクス の株、サーモアナエロバクター・フィンニの株、クロストリジウム・サーモアミ ロリチクムの株、クロストリジウム・サーモサッカロリチクムの株、又はサーモ アナエロバクテリウム・サーモスルフリゲネスの株から得られる。 最も好ましい実施形態において、本発明のCGTase変異体は、バチルス種株1011 の株、バチルス種株38−２の株、バチルス種株17−１の株、バチルス種１−１の 株、バチルス種株B1018の株、バチルス・サーキュランス株８の株、バチルス・ サーキュランス株251の株、もしくはサーモアナニロバクター種ATCC 53627の株 、又はそれらの突然変異体もしくは変異体から得られる。 本発明の文脈において、基質に近い位置を保持するアミノ酸残基は、基質のグ ルコース単位（即ちポリサッカリド）から潜在的に分子内（即ち酵素−基質）相 互作用する距離内にあるように酵素内に位置したアミノ酸を示す。 潜在的な分子内相互作用の例は、これらに限定されないが、水素結合、塩橋形 成、極性相互作用、疎水性相互作用、及び芳香族相互作用を含む。 本発明の好ましい実施形態において、基質に近いアミノ酸位置は、基質から８ Å（オングストローム）未満、好ましくは５Å未満、更に好ましくは３Å未満の 距離を示す。 更に、CGTaseは、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン及びＥドメインに位置 した基質結合領域を有する。結果として、好ましい実施形態において、本発明は 、変異体内で置換、挿入及び／又は欠失が、１又は複数のＡ，Ｂ，Ｃ及びＥドメ イン内に位置した１又は複数のアミノ酸残基で導入されているCGTase変異体を提 供する。 他の好ましい実施形態において、本発明は、変異体内で、置換、挿入及び／又 は欠失が、表２に言及される位置に相当する１又は複 数のアミノ酸位置で導入されているCGTase変異体を提供する。 しかしながら、位置195及び198（CGTaseナンバリング）における置換が行われ ているなら、CGTaseは、１又は複数のアミノ酸残基における更なる置換、挿入及 び／又は欠失が導入されていないなら、本発明のCGTase変異体として考慮されな い。更に、次の特定の変異体：H140R，H140N，F183L，H233R，H233N，W258V，F2 59L，F259I，F259Y，F283L，H327R，H327N，T598F及び／又はW636Fのいずれかを 含むCGTaseは、本明細書で言及される一以上の位置においてアミノ酸残基の更な る置換、挿入及び／又は欠失が導入されていなければ、本発明のCGTase変異体と して考慮されない。最後に、次の特定の変異：F195Y／F259Y，W258V／F259I，T5 98F／W636F、及びF183L／F259Lのいずれかを含むCGTaseは、１以上の位置でアミ ノ酸残基の更なる置換、挿入及び／又は欠失が導入されていなければ本発明のCG Tase変異体として考慮されない。それゆえ、上述のようなCGTase変異体は本発明 によりクレームされない。 より好ましい実施形態において、本発明のCGTase変異体は、その酵素が表３〜 ５に言及される位置に相当する１又は複数のアミノ酸位置で置換、挿入及び／又 は欠失により改良されているバチルスの株から得られる酵素から得られるCGTase 変異体である。好ましくは、CGTase変異体は、バチルスアウトリチクスの株、バ チルス・セレウスの株、バチルス・サーキュランスの株、バチルス・サーキュラ ンス変種アルカロフィルスの株、バチルス・コアギュランスの株、バチルスフィ ルムスの株、バチルス・ハロフィルスの株、バチルス・マセランスの株、バチル ス・メガテリウムの株、バチルスオーベンシスの株、バチルス・ステアロサーモ フィルスの株、又はバチルス・サブチルスの株から得られる。 最も好ましくは、GTase変異体は、バチルス種株1011の株、バチ ルス種株38−２の株、バチルス種株17−１の株、バチルス種１−１の株、バチル ス種株B1018の株、バチルス・サーキュランス株８の株、もしくはバチルス・サ ーキュランス株251の株、又はそれらの突然変異体もしくは変異体から得られる 。 他の好ましい実施形態において、本発明のCGTaseは、酵素が表６〜８に言及さ れる位置に相当する１又は複数のアミノ酸位置において置換、挿入及び／又は欠 失により改良されているサーモアナエロバクターの株から得られうる酵素から得 られるCGTase変異体である。好ましくは、CGTase変異体は、サーモアナエロバク ター種ATCC 53627の株又はそれらの突然変異体もしくは変異体から得られる。 本発明のCGTase変異体において、前駆体酵素と比較して、細胞内酵素／基質相 互作用が改良されている。潜在的分子内相互作用の例は、これらに限定されない が、水素結合、塩橋形成、極性相互作用、疎水性相互作用、及び芳香族相互作用 を含む。このような改良は、以下の案内に従って、上述の１以上の位置における 置換、挿入及び／又は欠失により行うことができる。 水素結合ポテンシャル（即ちＨ結合能力を有する）側鎖を有するアミノ酸残基 は一般に次のもの： Ser(S)，Thr(T)，Asn(N)，Gln(Q)，His(H)，Asp(D)，Tyr(Y)，Glu(E)，Lys(K) ，Arg(R)，Trp（W）及びCys(C)である。 対応して、次のアミノ酸は一般に側鎖水素結合を形成する潜在的能力を有さな い（即ちＨ結合能がない）。 Ala(A)，Val(V)，Leu(L)，Ile(I)，Phe(F)，Gly(G)，Met(M)及びPro(P)。 塩橋形成ポテンシャルを有する側鎖を有するアミノ酸残基は一般に次のもので ある： Asp(D)，Glu(E)，Lys(K)，Arg（R）及びHis（H）。 極性相互作用ポテンシャルを有する側鎖を有するアミノ酸残基は一般に次のも のである： Asp(D)，Asn(N)，Glu(E)，Gln(Q)，Lys(K)，Arg(R)，His(H)，Tyr(Y)，Trp（W ）及びCys(C)。 疎水性相互作用ポテンシャルを有する側鎖を有するアミノ酸残基は一般に次の ものである： Ala(A)，Val(V)，Leu(L)，Ile(I)，Phe(F)，Met(M)，Pro(P)並びにGlu（E）及 びGln(Q)側鎖の一部。 芳香族相互作用ポテンシャルを有する側鎖を有するアミノ酸残基は一般に次の ものである： His(H)，Phe(F)，Tyr（Y）及びTrp(W)。 本発明の方法により、活性クレフトもしくはこのクレフトに導く溝のサブ部位 内又はマルトース結合部位上で変化した数の水素結合は他の相互作用を有する変 異体が得られる。結合クレフト中でサブ部位を変えることにより、結合できる糖 の数を操作し、これにより酵素によって作られるα−，β−，γ−シクロデキス トリン等の比を変えることが可能になる。 特に、α−シクロデキストリン形成性CGTase変異体の作製を行う場合、基質の サブ部位Ｃ−Ｉ上又はその前の相互作用（図１）は増加されるべきであり、そし てサブ部位Ｉ以上の相互作用は減少されるべきである。あるいは、サブ部位Ｉ以 上の結合を防ぐために立体障害が適用され得よう。例えば、バチルスCGTaseから 始めて、以下の変異体が別個に又は組み合わせて作られる。 酵素とドナー／アクセプターとの間、即ちCGTaseとサブ部位Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤ との間の相互作用を除去することにより、より少いカップリング及び不均化活性 が達成される。水素結合を除去する変異は、例えば：H233Q，D135L，R47L又はR4 7Qである。 基質に対する水素結合が増加された変異は、例えば次のものである： H233Q(基質のサブ部位Ｂに対するもの)、L197DもしくはL197E(サブ部位Ｄ)、N 94Q，N94K，N94R，N94WもしくはN94F（サブ部位Ｅ）、D371NもしくはD371G(サブ 部位Ｅ＋Ｆ)、Y89D（サブ部位Ｅ）、A144K，A144RもしくはA144D(サブ部位Ｈ)、 N193DもしくはN193E(サブ部位Ｈ)、Y167F(サブ部位Ｈへの水素結合のための位置 １９３の残基を放離するためのもの)、並びにT185R，T185E、もしくはT185D(以 下のようなマルトース結合部位２上)。 基質結合クレフトの構造を変えて、これにより新しい酵素−基質相互作用を作 る変異は、例えば次のものである： N88P及びP143G。 基質に対する水素結合を減少させる変異は例えば次のものである： S145E又はS145A、及びS146P，S146QもしくはS146G（基質のサブ部位Ｉに対す るもの）。 サブ部位Ｈに対する水素結合を増加させる変異は例えばA144Rである。 サブ部位に対する水素結合を増加させる変異は、例えばN88Kである。 立体障害を導く変異は例えば次のものである： S145W，S145Y又はS145F、及びS146W，S146I，S146RもしくはS146P(基質のサブ 部位Ｉ上の結合を防ぐもの) 静電相互作用（スタッキング）を増加させる変異は例えば次のものである： L600W，L600F又はL600Y(以下のマルトース結合部位のもの)。 好ましい実施形態において、本発明のα−シクロデキストリン形 成性CGTase変異体は、位置87〜94において部分的アミノ酸配列IKYSGVNNを含み、 及び／又は位置143〜151において部分的アミノ酸配列GRAGTNPGFを含み、又は位 置143〜145において部分的アミノ酸配列GRWを含む変異体であり得る。 β−シクロデキストリンに対して改良された生成物選択性を有する酵素を作る ために、より小さな及びより大きな環式生成物の生産を回避することが必要であ る。原理的には、基質が活性部位内により迅速に動くことを可能にする酵素と基 質との間の水素結合を除去することにより、α−シクロデキストリンの生産を防 ぐことができよう。逆に、関連位置における水素結合の導入は、基質の動きを遅 めて、より大きなシクロデキストリンの割合を導く。基質の動きをブロックする ようデザインされた位置におけるより小さなアミノ酸残基について立体障害を引 きおこすアミノ酸残基の置換と組み合わせたこの試みは、β−シクロデキストリ ンより大きいシクロデキストリンの形成を防ぐ。それゆえ、β−シクロデキスト リン形成性CGTase変異体の作製が考えられるなら、バチルスCGTaseから始めて別 個に又は組み合わせて以下の変異体が考えられる。 活性部位近くの基質結合クレフトの構造を変え、これによりより大きなシクロ デキストリン（β−及びγ−シクロデキストリン）のための空間を形成する変異 は、例えば次のものである： N88P，Ｙ89^*（欠失），91aY（挿入），Ｖ92^*又はＮ92^*、及びＮ94^* 基質に対する水素結合を増加させる変異は、例えばS146Eである。 基質に対する水素結合を減少させる変異は、例えばS145L及びQ148Nである。 基質のサブ部位Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，Ｉ及びＪから水素結合を除去す る変異は例えば次のものである： R375G，D371G，D317N，Y89G，N193G，S145A，Q148A、及び^*145aI。 基質のサブ部位ＩとＪとの間に立体障害を導入し、より小さなシクロデキスト リンの生産に対する生産比を変えるようデザインされた変異体は例えばD147Wで ある。 好ましい実施形態において、本発明のβ−シクロデキストリン形成性CGTase変 異体は、位置87〜94において部分的アミノ酸配列HP^* SGY^**を含み、及び／又は 位置143〜151において部分的アミノ酸配列PALETNPNFを含み、又は位置143〜151 において部分的アミノ酸配列PAAETWPAFを含む変異体であり得る。 好ましい実施形態において、本発明のβ−シクロデキストリン形成性CGTase変 異体は、位置87〜94において部分的アミノ酸配列HP^* SGY^**を含み、及び／又は 位置143〜151において部分的アミノ酸配列PALETNPNFを含み、又は位置143〜151 において部分的アミノ酸配列PAAETWPAFを含む変異体であって、位置195がロイシ ン残基を保持する(X195L)ものであり得る。 第３の好ましい実施形態において、直鎖オリゴサッカリドを形成することがで きる本発明のCGTase変異体は、位置87〜94において部分的アミノ酸配列HP^* SGY^{* *} を含み、及び／又は位置143〜151において部分的アミノ酸配列PALETNPNFを含み 、又は位置143〜151において部分的アミノ酸配列PAAETWPAFを含む変異体であっ て、位置195においてグリシン残基を保持する(X195G)を保持するものであり得る 。 同様に、γ−シクロデキストリン形成性CGTase変異体の作製が考えられるなら 、再びバチルスCGTaseから始めて、別個に又は組み合わせて以下の変異が考えら れる。 活性部位に近い基質結合クレフトの構造を変え、それによりより大きなシクロ デキストリン（β−及びγ−シクロデキストリン）のための空間を形成する変異 は例えば次のものである。 N88P，Ｙ89^*（欠失），91aY（挿入），Ｖ92^*又はＮ92^*、及びＮ94^* 基質に対する水素結合を増加させる変異は例えばS146Eである。 基質に対する水素結合を減少させる変異は例えばS145L及びQ148Nである。 基質のサブ部位Ｄ，Ｅ，Ｆ及びＨから水素結合を除去する変異は、例えば次の ものである： N193G，R375G，D371G、及びD371N。 基質のサブ部位Ｄ，Ｅ，Ｆ及びＨから水素結合及び疎水性スタッキングを除去 する変異は、例えばY89Gである。 基質のサブ部位Ｉ及びＪにおいて結合特性を変化させる変異は、例えば次のも のである： X145aI又は^*145aI(挿入)，S145A、及びQ148E、特にS145A／X145aI又はA145A／^* 145aI、並びにX145aI／Q148E又は^*145aI／Q148E。 サブ部位Ａ，Ｄ及びＥにおいてカップリング活性を減少させる変異は、例えば 次のものである。 R375G，D371G，K232Q、及びE264Q。 シクロデキストリンの特定の結合を変えることによりカップリング活性を減少 させる変異は例えばR47Qである。 特に、活性部位に近い水分子を除去することにより得られるより少い加水分解 を導くサーモアナエロバクターの株から得られるCGTase変異体を考慮する場合は 、例えばV21F又はV21Yである。 より少いカップリング及び不均化活性は、酵素とドナー／アクセ プターとの間、即ちCGTaseとサブ部位Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤの間の相互作用を除去す ることにより達成される。水素結合を除去する変異は、例えばY259F，H233Q及び D135Lである。 好ましい実施形態において、本発明のγ−シクロデキストリン形成性CGTase変 異体は、位置87〜94において部分的アミノ酸配列HP^* SGY^**を含み、及び／又は 位置143〜151において部分的アミノ酸配列PALETNPNFを含み、又は位置143〜151 において部分的アミノ酸配列PAAEADPNFを含む変異体であり得る。 他の好ましい実施形態において、本発明のγ−シクロデキストリン形成性CGTa se変異体は、位置87〜94において部分的アミノ酸配列HP^* SGY^**を含み、及び／ 又は位置143〜151において部分的アミノ酸配列PALETNPNFを含み、又は位置143〜 151において部分的アミノ酸配列PAAEADPNFを含む変異体であって、位置195がロ イシン残基を保持する(X195W)ものであり得る。 第３の好ましい実施形態において、要求される長さの直鎖オリゴヌクレオチド を得るために、本発明の変異体は、CGTaseナンバリングで位置195に相当する環 化軸を形成する中心アミノ酸残基の置換と組み合わせられ得る。この位置におい て、チロシン及びフェニルアラニンが野生型CGTaseにおいて支配的である（表１ ）。この残基を変えることにより、環化特性が影響を受け、そして環化が妨げら れる。好ましい実施形態において、グリシンはこの部分に導入される(X195G)。 更に他の好ましい実施形態において、本発明の変異体は以下の表９に示される 位置に相当する１以上のアミノ酸位置における置換、挿入及び／又は欠失により 改良されている酵素である。この表に示すように、これらの１以上の置換／挿入 ／欠失の導入は、α−，β−又はγ−シクロデキストリン各々に関する生成物選 択性の増加し たCGTase変異体を導く。 生成物結合及び生成物障害に関して、バチルス・サーキュランス株251 CGTase のＥドメインが生デンプン結合ドメインとして同定された。マルトース依存性結 晶構造において、これらの分子間の接触点上の各々の酵素分子(マルトース結合 部位、MBS)において３つのマルトース分子が見い出された。これらのマルトース の２つはＥドメイン上の特定の部位(MBS１及びMBS２、616及び662の近く)に結合 し、第３の部位はＣドメイン(MBS３，413の近く)に位置する 。これにより、Ｅドメイン上の結合部位は生デンプンをシクロデキストリンに転 化するのに必要とされる。以下に行われる実験は、酵素がMBS１により生デンプ ン粒子に結合し、他方MBS２は粒子活性部位に伸びるデンプン鎖を誘導する。 他の好ましい実施形態において、本発明のCGTase変異体は、以下の表10に示さ れる位置に相当する１以上のアミノ酸位置における置換、挿入及び／又は欠失に より改良されている酵素である。このような改良は生成物阻害の減少したCGTase 変異体を導く。 例えば、本発明の文脈において、生成物阻害を減少させるために、別個に又は 組み合わせて、バチルスCGTaseから始めて、以下の変異が考えられる。 非競合的生成物阻害を減少させる変異は次のものである： Y633A（MBS２上にある、この変異は非競合的生成物阻害を完全に除去する）、 599aP，559aR又は599aH、及びL600R。 残基595〜605はMBS２の次のループを形成する。挿入はループを大きくし、そ れにより立体障害によりMBS２へのシクロデキストリンの結合を防ぐ一方、基質 鎖の誘導におけるMBS２の役割が保存される。位置600及び隣接する残基での変異 は、環式生成物のMBS２への結合を減少させることができる一方、直鎖基質の結 合は影響を受けない。位置600でのロイシンのアスパラテート、アラニン又はグ リシンでの置換は生成物阻害に少しの効果かある。アルギニンでの置換は、その 大きなサイズ及び荷電した性質のため、シクロデキストリンの結合に影響を与え 、それにより生成物阻害を減少させる。 生成物のアフィニティーを減少させるMBS１周囲の静電相互作用を減少させる 変異は、例えばW616A及び／又はW662Aである。 生成物のアフィニティーを減少させるMBS２周囲の静電相互作用 を減少させる変異は、例えばL600A又はL600S、及び／又はY663Aである。 生成物アフィニティーを減少させるMBS３周囲の静電相互作用を減少させる変 異は、例えばW413Aである。 カップリング反応により引きおこされる競合的生成物阻害が考えられる。この カップリング反応の減少は、第１（シクロデキストリン）及び第２（マルトーオ リゴサッカリド）基質の結合を減少させることにより達成され得る。 シクロデキストリン結合を減少させることにより競合的生成物阻害を減少させ る変異は、例えば次のものである。 R47A，R47Q又はR47L，Y89G，D196A又はD196L，D371G，D371N，D371A又はD371L 及びR375G，R375Q，R375N，R375A又はR375L。 第２基質の結合を減少させることにより競合的生成物阻害を減少させる変異は 、例えば次のものである。 K232Q，K232N，K232A又はK232L，E264A，E264N又はE264L，T186A及びE268A。 好ましい実施形態において、本発明のCGTase変異体は、その酵素が以下の表11 に示される位置に相当する１以上のアミノ酸位置における置換、挿入及び／又は 欠失により改良されているバチルスの株から得られうる酵素から得られるCGTase 変異体である。このような改良は表に示されるように、生成物選択性の増加した CGTase変異体を導く。 より好ましくは、CGTase変異体は、バチルスアウトリチクスの株、バチルス・ セレウスの株、バチルス・サーキュランスの株、バチルス・サーキュランス変種 アルカロフィルスの株、バチルス・コアギュランスの株、バチルスフィルムスの 株、バチルス・ハロフィルスの株、バチルス・マセランスの株、バチルス・メガ テリウムの株、バチルスオーベンシスの株、バチルス・ステアロサーモフィルス の株、バチルス・サブチルスの株から得られる。 更に好ましくは、CGTase変異体は、バチルス種株1011の株、バチルス種株38− ２の株、バチルス種株17−１の株、バチルス種１−１の株、バチルス種株B1018 の株、バチルス・サーキュランス株８の株、もしくはバチルス・サーキュランス 株251の株、又はそれらの突然変異体もしくは変異体から得られる。 他の好ましい実施形態において、本発明のCGTase変異体は、酵素が以下の表12 に示される位置に相当する１以上のアミノ酸における置換、挿入及び／又は欠失 により改良されているバチルスの株から得られうる酵素から得られたCGTase変異 体である。このような改良は、生成物阻害の減少したCGTase変異体を導く。 その最も好ましい実施形態において、本発明は以下のCGTase変異体を提供する ： 位置21においてチロシン残基を保持するCGTase変異体（F21Y）。 位置47においてグルタミン残基（R47Q）、アラニン残基（R47A）、ロイシン残 基（R47L）、又はヒスチジン残基（R47H）を保持するCGTase変異体。 位置88においてプロリン残基（N88P）又はリシン残基（N88K）を保持するCGTa se変異体。 位置89においてアスパラギン酸残基（Y89D）、アラニン残基（Y89A）、又はグ リシン残基（Y89G）を保持するCGTase変異体。 位置91ａ（挿入）においてアラニン残基（^*91aA）又はチロシン残基（^*91aY） を保持するCGTase変異体。 変異体位置92ａが削除されている（Ｖ92^*）CGTase変異体。 位置94においてグルタミン残基（N94Q）、リシン残基（N94K）、アルギニン残 基（N94R）、トリプトファン残基（N94W）、もしくはフェニルアラニン残基（N9 4F）を保持するか、又は変異体位置94が削除されている(N94^*)CGTase変異体。 位置135においてロイシン残基を保持するCGTase変異体(D135L)。 位置143において野生型酵素のそれと異なる天然アミノ酸残基を保持するCGTas e変異体(P143X)。 位置143においてアラニン残基(P143A)又はグリシン残基(P143G)を保持するCGT ase変異体。 位置144において野生型酵素のそれと異なる天然のアミノ酸残基を保持するCGT ase変異体(A144X)。 位置144においてアルギニン残基(A144R)、リシン残基(A144K)、又はアスパラ ギン酸残基(A144D)を保持するCGTase変異体。 位置145において野生型酵素のそれと異なる天然のアミノ酸残基を保持するCGT ase変異体(S145X)。 位置145においてアラニン残基(S145A)、グルタミン酸(S145E)、又はトリプト ファン残基(S145W)、グリシン残基(S145G)、フェニルアラニン残基(S145F)、チ ロシン残基(S145Y)、又はロイシン残基(S145L)を保持するCGTase変異体。 位置145a（挿入）において天然のアミノ酸残基を保持するCGTase変異体(^*145a X)。 位置145a（挿入）においてイソロイシン残基を保持するCGTase変異体(^*145aI) 。 位置146において野生型のそれと異なる天然のアミノ酸残基を保持するCGTase 変異体(S146X)。 位置146においてプロリン残基(S146P)、イソロイシン残基(S146I)、グルタミ ン残基(S146Q)、トリプトファン残基(S146W)、アルギニン残基(SI46R)、又はグ ルタミン酸残基(S146E)を保持するCGTase変異体。 位置147において野生型酵素のそれと異なる天然のアミノ酸残基を保持するCGT ase変異体(D147X)。 位置147においてイソロイシン残基(D147I)、ロイシン残基(D147L)、アラニン 残基(D147A)、セリン残基(D147S)、又はトリプトファン残基(D147W)を保持するC GTase変異体。 位置147a（挿入）においてアラニン残基を保持するCGTase変異体(^*147aA)。 位置147a（挿入）において天然のアミノ酸残基を保持するCGTase変異体(^*147a X)。 位置148において野生型酵素のそれと異なる天然のアミノ酸残基を保持するCGT ase変異体(Q148X)。 位置148においてアラニン残基(Q148A)、グリシン残基(Q148G)、グルタミン酸 残基(Q148E)、又はアスパラギン酸残基(Q148N)を保持するCGTase変異体。 位置149において野生型酵素のそれと異なる天然のアミノ酸残基を保持するCGT ase変異体(P149X)。 位置149においてイソロイシン残基を保持するCGTase変異体(P149I)。 位置167においてフェニルアラニン残基を保持するCGTase変異体(Y167F)。 位置179においてセリン残基(G179S)、アスパラギン残基(G179N)、又はアスパ ラギン酸残基(G179D)を保持するCGTase変異体。 位置180においてセリン残基(G180S)、アスパラギン残基(G180N）、又はアスパ ラギン酸残基(G180D)を保持するCGTase変異体。 位置185においてアルギニン残基(T185R)、グルタミン酸残基(T185E)、又はア スパラギン酸残基(T180D)を保持するCGTase変異体。 位置186においてアラニン残基を保持するCGTase変異体(T186A)。 位置193において野生型酵素のそれと異なる天然のアミノ酸残基を保持するCGT ase変異体(N193X)。 位置193においてグリシン残基(N193G)、アラニン残基(N193A)、アスパラギン 酸残基(N193D)、又はグルタミン酸残基(N193E)を保持するCGTase変異体。 位置195において野生型酵素のそれと異なる天然のアミノ酸残基を保持するCGT ase変異体(Y195X)。 位置196において野生型酵素のそれと異なる天然のアミノ酸残基を保持するCGT ase変異体(D196X)。 位置196においてアラニン残基(D196A)、セリン残基(D196S)、又はロイシン残 基(D196L)を保持するCGTase変異体。 位置197においてアスパラギン残基(L197D)又はグルタミン酸残基(L197E)を保 持するCGTase変異体。 位置232においてグルタミン残基(K232Q)、アスパラギン残基(K232N)、アラニ ン残基(K232A)、又はロイシン残基(K232L)を保持するCGTase変異体。 位置233においてグルタミン残基を保持するCGTase変異体(H233Q)。 位置264においてグルタミン残基(E264Q)、アラニン残基(E264A)、アスパラギ ン残基(E264N)、又はロイシン残基(E264L)を保持するCGTase変異体。 位置268においてアラニン残基を保持するCGTase変異体(E268A)。 位置371において野生型酵素のそれと異なる天然のアミノ酸残基を保持するCGT ase変異体(D371X)。 位置371においてグリシン残基(D371G)、アスパラギン残基(D371N)、アラニン 残基(D371A)、又はロイシン残基(D371L)を保持するCGTase変異体。 位置375において野生型酵素のそれと異なる天然のアミノ酸残基を保持するCGT ase変異体(R375X)。 位置375においてプロリン残基(R375P)、グリシン残基(R375G)、グルタミン残 基(R375Q)、アスパラギン残基(R375N)、アラニン残基(R375A)、又はロイシン残 基(R375L)を保持するCGTase変異体。 位置599a（挿入）においてプロリン残基(^*599aP)、アルギニン残基(^*599aR)、 又はヒスチジン残基(^*599aH)を保持するCGTase 変異体。 位置600において、異なる天然のアミノ酸残基、特にトリプトファン残基(L600 W)、フェニルアラニン残基(L600F)、チロシン残基(L600Y)、アルギニン残基(L60 0R)、プロニン残基(L600P)、又はアスパラギン残基(L600N)に置換されたCGTase 変異体。 位置616においてアラニン残基を保持するCGTase変異体(W616A)。 位置633においてアラニン残基を保持するCGTase変異体(W633A)。 位置662においてアラニン残基を保持するCGTase変異体(W662A)。 位置47にヒスチジン残基を、位置135にロイシン残基を保持するCGTase変異体( R47H／D135L)。 位置88にプロリン残基を、位置143にグリシン残基を保持するCGTase変異体(N8 8P／P143G)。 位置89にアスパラギン酸残基を、位置146にプロリン残基を保持するCGTase変 異体(Y89D／S146P)。 位置89にグリシン残基を、位置193にグリシン残基を保持する(Y89G／N193G)。 位置92及び94が削除されているCGTase変異体（Ｖ92^*／Ｎ94^*）。 位置143にアラニン残基を、位置144にアルギニン残基を保持するCGTase変異体 (P143A／A144R)。 位置143にグリシン残基を、位置144にアルギニン残基を、位置145にトリプト ファン残基を保持するCGTase変異体(P143G／A144R／S145W)。 位置143にグリシン残基を、位置144にアルギニン残基を、位置 145にトリプトファン残基を保持し(P143G／A144R／S145W)、そして位置179にお いてセリン残基(G179S)、アスパラギン残基(G179N)、又はアスパラギン酸残基(G 179D)を保持するCGTase変異体。 位置143〜148において、部分アミノ酸配列GRA^**A、部分アミノ酸配列GRAAAA、 部分アミノ酸配列GRAPAA、又は部分アミノ酸配列GRGPAAを含むCGTase変異体。 位置144にアルギニン残基を、位置145にアラニン残基を、位置146にプロリン 残基を保持するCGTase変異体(A144R／S145A／S146P)。 位置145にアラニン残基を、位置145a（挿入）にイソロイシン残基を保持するC GTase変異体(S145A／^*145aI)。 位置145にアラニン残基を保持し、位置146にグリシン残基を保持するCGTase変 異体(S145A／S146G)。 位置145にロイシン残基を保持し、位置148にアスパラギン残基を保持するCGTa se変異体(S145L／Q148N)。 位置145にグルタミン酸残基を、位置146にプロリン残基又はグルタミン残基を 保持するCGTase変異体(S145E／S146P又はS145E／S146Q)。 位置145にトリプトファン残基を、位置146にトリプトファン残基、イソロイシ ン残基：又はアルギニン残基を保持するCGTase変異体(S145W／S146W，S145W／S1 46I又はS145W／S146R)。 位置145にアラニン残基を、位置145a（挿入）にイソロイシン残基を、位置148 にグルタミン酸残基を保持するCGTase変異体(S145A／^*145aI／Q148E)。 位置145a（挿入）にイソロイシン残基を、位置148にグルタミン酸残基を保持 するCGTase変異体(^*145aI／Q148E)。 位置148にグルタミン酸残基を、位置193にグルタミン残基を保 持するCGTase変異体。 位置616にアラニン残基を、位置662にアラニン残基を保持するCGTase変異体(W 616A／W662A)。 位置87〜94において、部分アミノ酸配列IKYSGVNNを含み、及び／又は位置143 〜151において部分アミノ酸配列GRAGTNPGFを含むか、又は位置143〜145において 部分アミノ酸配列GRWを含むCGATase変異体。 位置87〜94において部分アミノ酸配列HP^* SGY^**を含み、及び／又は位置143〜 151において部分アミノ酸配列PALETNPNFを含むか、又は位置143〜151において部 分アミノ酸配列PAAETWPAFを含むCGTase変異体。 位置87〜94において部分アミノ酸配列HP^* SGY^**を含み、及び／又は位置143〜 151において部分アミノ酸配列PALETNPNFを含むか、又は位置143〜151において部 分アミノ酸配列PAAETWPAFを含み、そして位置195においてロイシン残基を保持す る(Y195L)CGTase変異体。 位置87〜94において部分アミノ酸配列HP^* SGY^**を含み、及び／又は位置143〜 151において部分アミノ酸配列PALETPNFを含むか、又は位置143〜151において部 分アミノ酸配列PAAEADPNFを含むCGTase変異体。 位置87〜94において部分アミノ酸配列HP^* SGY^**を含み、及び／又は位置143〜 151において部分アミノ酸配列PALETNPNFを含むか、又は位置143〜151において部 分アミノ酸配列PAAEADPNFを含み、そして位置195においてロイシン残基を保持す る(Y195W)CGTase変異体。 好ましくは、上述のCGTase変異体は、バチルスアウトリチクスの株、バチルス ・セレウスの株、バチルスサーキュランスの株、バチ ルス・サーキュランス変種アルカロフィルスの株、バチルス・コアギュランスの 株、バチルスフィルムスの株、バチルス・ハロフィルスの株、バチルス・マセラ ンスの株、バチルス・メガテリウムの株、バチルスオーベンシスの株、バチルス ・ステアロサーモフィルスの株、又はバチルス・サブチルスの株から得られる。 最も好ましくは、上述のCGTase変異体は、バチルス種株1011の株、バチルス種 株38−２の株、バチルス種株17−１の株、バチルス種１−１の株、バチルス種株 B1018の株、バチルス・サーキュランス株８の株もしくはバチルス・サーキュラ ンス株251の株、又はそれらの突然変異体もしくは変異体から得られる。 更に他の好ましい実施形態において、本発明のCGTase変異体は、その酵素が以 下の表13に示される位置に相当する１以上のアミノ酸位置における置換、挿入及 び／又は欠失により改良されているサーモアナエロバクターの株から得られうる 酵素から得られるCGTase変異体である。このような改良は、表に示すように、選 択性の増加したCGTase変異体を導く。 好ましくは、CGTase変異体はサーモアナエロバクター種ATCC 53627の株又はそ れらの突然変異体もしくは変異体から得られる。 更に他の好ましい実施形態において、本発明のCGTase変異体は、その酵素が以 下の表14に示される位置に相当する１以上のアミノ酸残基における置換、挿入及 び／又は欠失により改良されているサーモアナエロバクターの株から得られうる 酵素から得られるCGTase変異体である。このような改良は、生成物阻害の減少し たCGTase変異体を導く。 好ましくは、CGTase変異体はサーモアナエロバクター種ATCC 53627の株又はそ れらの突然変異体もしくは変異体から得られる。 位置21においてフェニルアラニン残基（V21F）又はチロシン残基（V21Y）を保 持するCGTase変異体。 位置47においてグルタミン残基（K47Q）、アラニン残基（K47A）、ロイシン残 基（K47L）、ヒスチジン残基（K47H）、又はアルギニン残基（K47R）を保持する CGTase変異体。 位置88においてリシン残基（P88K）を保持するCGTase変異体。 位置89においてアラニン残基（D89A）又はグリシン残基（D89G）を保持するCG Tase変異体。 位置91においてアラニン残基(F91aA)又はチロシン残基(F91aY)を保持するか又 は位置91ａが削除された（F91a^*）CGTase変異体。 位置92が削除されたCGTase変異体(G92^*)。 位置94においてグルタミン残基（S94Q）、リシン残基（S94K）、アルギニン残 基（S94R）、トリプトファン残基（S94W）、もしくはフェニルアラニン残基（S9 4F）を保持するか又は位置94が削除された(S94^*)CGTase変異体。 位置135においてロイシン残基(D135L)を保持するCGTase変異体。 位置143において野生型酵素のそれと異なる天然のアミノ酸残基(P143X)を保持 するCGTase変異体。 位置143においてアラニン残基(P143A)を保持するかグリシン残基(P143G)を保 持するCGTase変異体。 位置144において野生型酵素のそれと異なる天然のアミノ酸残基(A145X)を保持 するCGTase変異体。 位置144においてアルギニン残基(A144R)、リシン残基(A144K)、又はアスパラ ギン酸残基(A144D)を保持するCGTase変異体。 位置145において野生型酵素と異なる天然のアミノ酸残基(S145X)を保持するCG Tase変異体。 位置145においてアラニン残基(S145A)、グルタミン酸残基(S145E)、トリプト ファン残基(S145W)、グリシン残基(S145G)、フェニルアラニン残基(S145Y)、チ ロシン残基(S145Y)、又はロイシン残基(S145L)を保持するCGTase変異体。 位置145a（挿入）において天然のアミノ酸残基(^*145aX)を保持するCGTase変異 体。 位置145a（挿入）においてイソロイシン残基(^*145aZ)を保持するCGTase変異体 。 位置146において野生型酵素のそれと異なる天然のアミノ酸残基(E146X)を保持 するCGTase変異体。 位置146においてプロリン残基(E146P)、セリン残基(E146S)、イソロイシン残 基(E146I)、グルタミン残基(E146Q)、トリプトファン残基(E146W)、又はアルギ ニン残基(E146R)を保持するCGTase変異体。 位置147において野生型酵素のそれと異なる天然のアミノ酸残基を保持するCGT ase変異体(T147X)。 位置147においてイソロイシン残基(T147I)、ロイシン残基(T147L)、アラニン 残基(T147A)、セリン残基(T147S)、又はトリプトファン残基(T147W)を保持するC GTase変異体。 位置147a（挿入）において天然のアミノ酸残基(^*147aX)を保持するCGTase変異 体。 位置I47a（挿入）においてアラニン残基(^*147aA)を保持するCGTase変異体。 位置148において野生型酵素のそれと異なる天然のアミノ酸残基(D148X)を保持 するCGTase変異体。 位置148においてアラニン残基(D148A)、グリシン残基(D148G)、グルタミン酸 残基(D148E)、又はアスパラギン酸残基(D148N)を 保持するCGTase変異体。 位置149において野生型酵素のそれと異なる天然のアミノ酸残基を保持するCGT ase変異体(P149X)。 位置149においてイソロイシン残基(P149I)を保持するCGTase変異体。 位置167においてフェニルアラニン残基(Y167F)を保持するCGTase変異体。 位置179においてセリン残基(G179S)、アスパラギン残基(G179N)、又はアスパ ラギン酸残基(G179D)を保持するCGTase変異体。 位置180においてセリン残基(G180S)、アスパラギン残基(G180N)、又はアスパ ラギン酸残基(G180D)を保持するCGTase変異体。 位置185においてアルギニン残基(S185R)、グルタミン酸残基(S185E)、アスパ ラギン酸残基(S185D)を保持するCGTase変異体。 位置186においてアラニン残基(Y186A)を保持するCGTase変異体。 位置193において野生型酵素のそれと異なる天然のアミノ酸残基(N193X)を保持 するCGTase変異体。 位置193においてグリシン残基(N193G)、アラニン残基(N193A)、アスパラギン 酸残基(N193D)、又はグルタミン酸残基(N193E)を保持するCGTase変異体。 位置195において野生型酵素のそれと異なる天然のアミノ酸(F195X)を保持する CGTase変異体。 位置196において野生型酵素のそれと異なる天然のアミノ酸残基(D196X)を保持 するCGTase変異体。 位置196においてアラニン残基(D196A)、セリン残基(D196S)、又はロイシン残 基(D196L)を保持するCGTase変異体。 位置197においてアスパラギン酸残基(L197D)又はグルタミン酸 残基(L197E)を保持するCGTase変異体。 位置232においてグルタミン酸残基(K232Q)、アスパラギン酸残基(K232N)、ア ラニン残基(K232A)、又はロイシン残基(K232L)を保持するCGTase変異体。 位置233においてグルタミン酸残基(H233Q)を保持するCGTase変異体。 位置259においてフェニルアラニン残基(Y259F)を保持するCGTase変異体。 位置264においてグルタミン残基(E264Q)、アラニン残基(E264A)、アスパラギ ン残基(E264N)、又はロイシン残基(E264L)を保持するCGTase変異体。 位置268においてアラニン残基(N268A)を保持するCGTase変異体。 位置371において野生型酵素のそれと異なる天然のアミノ酸(D371X)を保持する CGTase変異体。 位置371においてグリシン残基(D371G)、アスパラギン残基(D371N）、アラニン 残基(D371A)、ロイシン残基(D371L)、又はグルタミン酸残基(D371E)を保持するC GTase変異体。 位置375において野生型酵素のそれと異なる天然のアミノ酸残基(R375X)を保持 するCGTase変異体。 位置375においてプロリン残基(R375P)、グリシン残基(R375G)、グルタミン残 基(R375Q)、アスパラギン残基(R375N)、アラニン残基(R375A)、又はロイシン残 基(R375L)を保持するCGTase変異体。 位置599a（挿入）においてプロリン残基(^*599aP)アルギニン残基(^*599aR)、又 はヒスチジン残基(^*599aH)を保持するCGTase変異体。 変異体位置600が異なるアミノ酸残基、特にフェニルアラニン残基(W600F)、チ ロシン残基(W600Y)、アルギニン残基(W600R)、プロリン残基(W600P)、ロイシン 残基(W600L)、又はアスパラギン残基(W600N)で置換されたCGTase変異体。 位置616においてアラニン残基(W616A)を保持するCGTase変異体。 位置633においてアラニン残基(Y633A)を保持するCGTase変異体。 位置662においてアラニン残基(W662A)を保持するCGTase変異体。 位置47においてヒスチジン残基又はアルギニン残基を、及び／又は位置135に おいてロイシン残基（K47H／D135L又はK47R／D135L）を保持するCGTase変異体。 位置87〜94において部分アミノ酸配列IKYSGVNN又は部分アミノ酸配列INDSGVNN を、及び／又は位置143〜151において部分アミノ酸配列GRAGTNPGFを、又は位置1 43〜145において部分アミノ酸配列GRWを含み、又は位置195においてチロシン残 基(F195Y)を保持するCGTase変異体。 位置87〜94に部分アミノ酸配列INDSGVNNを、及び／又は位置146〜150において 部分アミノ酸配列SDQPSを含むCGTase変異体。 位置87〜94に部分アミノ酸配列HP^* SGY^**を、及び／又は位置143〜151に部分 アミノ酸配列PALETNPNFを、又は位置143〜151に部分アミノ酸配列PAAETWPAFを含 むCGTase変異体。 位置87〜94に部分アミノ酸配列HP^* SGY^**を、及び／又は位置143〜151に部分 アミノ酸配列PALETNPNFを、又は位置143〜151に部分アミノ酸配列PAAETWPAFを含 み、位置195にロイシン残基(F195L)を保持するCGTase変異体。 位置87〜94に部分アミノ酸配列HP^* SGY^**を、及び／又は位置143〜151に部分 アミノ酸配列PALETNPNFを、又は位置143〜151に部分アミノ酸配列PAAEADPNFを含 むCGTase変異体。 位置87〜94に部分アミノ酸配列HP^* SGY^**を、及び／又は位置143〜151に部分 アミノ酸配列PALETNPNFを、又は位置143〜151に部分アミノ酸配列PAAEADPNFを含 み、位置195にロイシン残基(F195W)を保持するCGTase変異体。 位置92及び94が削除されているCGTase変異体（Ｃ92^*／Ｓ94^*）。 位置143にアラニン残基を保持し、位置144にアルギニン残基を保持するCGTase 変異体(P143A／A144R)。 位置143にグリシン残基を、位置144にアルギニン残基を、位置145にトリプト ファン残基(P143G／A144R／S145W)を保持するCGTase変異体。 位置143にグリシン残基を、位置144にアルギニン残基を、位置145にトリプト ファン残基を保持し(P143G／A144R／S145W)、そして位置179にセリン残基(G179S )、アスパラギン残基(G179N)、又はアスパラギン酸残基(G179D)を、及び／又は 位置180にアスパラギン残基(G180N)又はアスパラギン酸残基(G180D)を保持するC GTase変異体。 位置143〜148において、部分アミノ酸配列GRA^**A、部分アミノ酸配列GRAAAA、 部分アミノ酸配列GRPAAA、部分アミノ酸配列GRAPAA、又は部分アミノ酸配列GRGP AAを含むCGTase変異体。 位置143〜151に部分アミノ酸配列GRAGTNPGを含むCGTase変異体。 位置143〜151に部分アミノ酸配列GRAGTNPGを含み、位置195にチロシン残基(F1 95Y)を保持するCGTase変異体。 位置144にアルギニン残基を、位置145にアラニン残基を、位置146にプロリン 残基(A144R／S145A／E146P)を保持するCGTase変異体。 位置145にアラニン残基を、位置145a（挿入）にイソロイシン残基(S145A／^*14 5aI)を保持するCGTase変異体。 位置145にアラニン残基を、位置146にグリシン残基(S145A／E146G)を保持する CGTase変異体。 位置145にロイシン残基を、位置148にアスパラギン残基(S145L／D148N)を保持 するCGTase変異体。 位置145にグルタミン酸残基を、位置146にプロリン残基又はグルタミン残基(S 145E／E146P又はS145E／E146Q)を保持するCGTase変異体。 位置145にトリプトファン残基を、位置146にトリプトファン残基、イソロイシ ン残基、又はアルギニン残基(S145W／E146W，S145W／E146I又はS145W／E146R)を 保持するCGTase変異体。 位置145にアラニン残基を、位置145a（挿入）にイソロイシン残基を、位置148 にグルタミン酸残基(S145A／^*145aI／D148E)を保持するCGTase変異体。 位置145a（挿入）にイソロイシン残基を、位置148にグルタミン酸残基(^*145aI ／D148E)を保持するCGTase変異体。 位置616にアラニン残基を、位置662にアラニン残基(W616A／W662A)を保持する CGTase変異体。 CGTase変異体を生産する方法 本発明のCGTase変異体の生産は、Sambrookら［Sambrook J，Fritsch E F，Man iatis T；Molecu1ar Cloning ；A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labo ratory Press，1989，New York］により記載され、当業者に周知であるような組 換えDNA技術の一般的な 原理に従う。 形式的には、生産は本発明のCGTase変異体をコードするDNA構成物を用意して 行われる。DNA 構成物 他の態様において、本発明は、本発明のCGTase変異体をコードするDNA構成物 を提供する。本明細書に定義する場合、“DNA構成物”は、cDNA、ゲノムDNA、合 成DNA又はRNA源のいずれをも含むことを意図する。“構成物”という用語は、一 本鎖又は二本鎖であり得、関心のCGTase変異体をコードする完全な又は部分的に 天然のヌクレオチド配列に基づき得る核酸セグメントを示すことを意図する。そ の構成物は必要に応じて他の核酸セグメントを含み得る。 本発明のDNA構成物は、前駆体CGTaseをコードするDNA配列を適切に改良するこ とにより調製することができる。その改良は、次のことをもたらし得る： （ｉ）アミノ酸配列中の１又は複数の異なる部位における１又は複数のアミノ 酸残基の導入；及び／又は （ii）アミノ酸配列中の１又は複数の異なる部位における１又は複数のアミノ 酸残基の置換；及び／又は （iii）アミノ酸配列中の１又は複数の部位における１又は複数のアミノ酸残 基の欠失。 DNA配列の改良は、例えばSambrookら（前掲）に記載されるような公知の手順 に従って、部位特異的変異誘発もしくはランダム変異誘発、又はこれらの技術の 組み合わせにより行うことができる。 より好ましい実施形態において、本発明のDNA構成物は、以下の実施例に記載 される１又は複数の部分的なオリゴヌクレオチド配列（プライマー）を含む、こ れらの部分的オリゴヌクレオチド配列は特に、 及び 並びに実施例５，６及び７のプライマーＡ１−Ａ24、プライマーＢ１−Ｂ15、 及びプライマーＣ１−Ｃ９に記載されるような部分的オリゴヌクレオチド配列（ プライマー） である。発現ベクター 改良の後、CGTase変異体は、本発明のCGTase変異体をコードするDNA構成物を 、適切なベクター内の適切な発現シグナルと組み合わせることにより、得ること ができる。 本発明の発現ベクターは、便利には組換えDNA手順が行われるいずれかの発現 ベクターであり得、ベクターの選択は、しばしばそれが導入される宿主細胞によ る。これにより、ベクターは、自己複製ベクター、即ちその複製が染色体の複製 と独立している染色体外存在物として存在するベクター、例えばプラスミドであ り得る。あるいは、ベクターに、宿主細胞に導入した時に宿主細胞ゲノム内に一 体化して、それが一体化されている染色体と共に複製され得るものであり得る。 本発明の発現ベクターにおいては、CGTase変異体をコードするDNA配列は、DNA の転写に必要とされる更なるセグメントに作用的に連結される。一般に、発現ベ クターは、プラスミドもしくはウイルスDNAから得られるが、又は両方の要素を 含み得る。“作用的に連結”とは、セグメントがそれらの意図される目的と合わ せて機能するように、例えば転写がプロモーターにおいて始まり、CGTase変異体 をコードするDNA配列を通して進むように配置されることを示す。 これにより、本発明の発現ベクターにおいて、CGTase変異体をコードするDNA 配列は、好ましくは適切なプロモーター及びターミネーター配列に作用的に連結 されるはずである。プロモーターは、選択された宿主細胞中で転写活性を示すい ずれかのDNA配列であり得、宿主細胞に対して同種又は異種のいずれかのタンパ ク質をコードする遺伝子から得ることができる。CGTase変異体、プロモーター及 びターミネーターをコードするDNA配列を各々連結し、そしてそれらを適切なベ クター内に挿入するのに用いられる手順は当業者に公知である（例えばSambrook ら、前掲）。 プロモーターは、選択された宿主細胞中で転写活性を示すいずれかのDNA配列 であり得、宿主細胞に対して同種又は異種のいずれかのタンパク質をコードする 遺伝子から得られうる。 バクテリア宿主細胞中で本発明のCGTase変異体をコードするDNAの転写を行う ための適切なプロモーターの例は、バチルスステアロサーモフィルス(Bacillus stereothermophilus )マルトジェニックアミラーゼ遺伝子、バチルス・リケニホ ルムス(Bacillus licheniforms）α−アミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリク エファシエン ス（Bacillus amyloliquefaciens）BANアミラーゼ遺伝子、バチルス・サブチル スアルカリプロテアーゼ遺伝子、又はバチルス・プミルス（Bacillus pumilus） キシラーゼもしくはキシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、又はλファージＰ_R もしくはＰ_Lプロモーターもしくは大腸菌lac，trpもしくはTacプロモーターを含 む。 イースト宿主細胞に用いるための適切なプロモーターの例は、イースト解糖遺 伝子［Hitzemanら、J ．Biol．Chem. 1980 255 12073-12080；Alber及びKawasaki ，J ．Mol．Appl．Gen. 1982 1419-434］アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子[You ngら、in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals(Hollaender et al，Eds.)，Plenum Press，New York，1982]、からのプロモーター又はthe T PI １ ［US 4,599,311］もしくはADH ２−４ｃ[Russellら、Nature 1983 304 652- 654]プロモーターを含む。 糸状菌宿主細胞に用いるための適切なプロモーターの例は、例えば、ADH ３プ ロモーター［McKnightら、EMBO ．J 1985（4）2093-2099］又はtpiＡプロモータ ーである。他の有用なプロモーターの例は、Ａ．オリザエ（A．oryzae）TAKAア ミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロテ イナーゼ、Ａ．ニゲル（A ．niger）中性のα−アミラーゼ、Ａ．ニゲル酸安定α −アミラーゼ、Ａ．ニゲルもしくはＡ．アワモリ（A ．awamori）グルコアミラー ゼ（gluA）、リゾムモール・ミエヘイリパーゼ、Ａ．オリザエアルカリプロテア ーゼ、Ａ．オリザエトリオースホスフェートイソメラーゼ又はＡ．ニジュランス (A ．nidulans)アセトアミダーゼから得られるものである。好ましいのはTAKAア ミラーゼ及びgluAプロモーターである。 本発明の発現ベクターは、ベクターが問題の宿主細胞中で複製するのを可能に するDNA配列を更に含み得る。発現ベクターは、選択 マーカー、例えばその産物が宿主中の欠損を補う遺伝子、例えばジヒドロホレー トレダクターゼ（DHFR）をコードする遺伝子もしくはスキゾサッカロマイセス・ ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)TPＩ遺伝子［Russell PR；Gene 1985（40） 125-130)又は薬剤、例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、ク ロラムフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシン又はメトトレキセートに対 する耐性を供するものも含み得る。糸状菌のために、選択マーカーは、amdS，py rG ，argB，niaD及びsCを含む。 CGTaseを宿主細胞の分泌経路に方向づけるために、（リーダー配列、プレプロ 配列又はプレ配列としても知られる）分泌シグナル配列が発現ベクター内に供さ れ得る。分泌シグナル配列は、正確な読み枠内でCGTaseをコードするDNA配列に 連結される。分泌シグナル配列は、一般にCGTase変異体をコードするDNA配列に 対して５’に位置する。分泌シグナル配列は、通常CGTaseに関連し、又は他の分 泌タンパク質をコードする遺伝子からのものであり得る。 好ましい実施形態において、本発明の発現ベクターは、例えばWO86/05812に記 載されるようなバチルス・リケニホルミスα−アミラーゼ遺伝子の分泌シグナル コード化配列と実質的に同一な分泌シグナル配列を含み得る。 また、例えばUS 4,959,316又はWO91/09129に記載されるように、例えば一本鎖 もしくは二本鎖クロスオーバーに関するタンデム増幅技術又はマルチコピー技術 により、発現の増幅についての測定を行うことができる。あるいは、発現ベクタ ーは、例えばEP 283,075に記載されるように複製の温度センシティブ源を含み得 る。 CGTase変異体をコードするDNA配列、プロモーター並びに必要に応じてターミ ネーター及び／又は分泌シグナル配列を連結し、それらを複製に必要な情報を含 む適切なベクター内に挿入する手順は当 業者に公知である（例えばSambrookら、前掲）。宿主細胞 更に他の態様において、本発明は、本発明のDNA構成物及び／又は本発明の組 換え発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。 本発明のDNA構成物又は組換え発現ベクターが導入されるべき本発明の宿主細 胞は、CGTase変異体を生産することができるいずれかの細胞、好ましくは非病原 性細胞であり得、バクテリア、イースト、真菌及び高等な真核細胞を含む。 培養に基づいて本発明のCGTase変異体を生産することができるバクテリア宿主 細胞の例は、グラム陽性バクテリア、例えばバチルスの株、特にＢ．サブチルス 、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．レントゥス(B ．lentus)、Ｂ．ブレビス(B ．brevis) 、Ｂ．ステアロサーモフィルス、Ｂ．アルカロフィルス(B ．alkalophilus)、Ｂ ．アミロリクエファシエンス、Ｂ．コアギュランス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ． ラウトゥス(B ．lautus)、Ｂ．メガテリウム（B ．megatherium）、Ｂ．プミルス （B ．pumilus）、Ｂ．トウリンギエンシス（B ．thuringiensis）もしくはＢ．ア ガラドヘレンス(B ．agaradherens)の株、又はストレプトマイセス（Streptomyce s ）の株、特にＳ．リビダンズ(S ．lividans)もしくはＳ．ムリヌス（S ．murinus ）の株、又はグラム陰性バクテリア、例えば大腸菌である。バクテリアの形質転 換体は、それ自体周知である方法で、プロトプラスト形質転換により又はコンピ テント細胞を用いることにより行うことができる。 大腸菌のようなバクテリア内でCGTase変異体を発現する場合、CGTaseは細胞質 内に、典型的には（封入体として知られる）不溶性粒子として保持され得、又は バクテリアの分泌配列により細胞周辺腔に向けられ得る。前者の場合、細胞が溶 解され、粒子が回収されて 変性された後、変性剤を希釈することにより再び折りたたまれる。後者の場合、 CGTaseは、細胞周辺腔の成分を放出するために、例えば音波処理又は浸透性ショ ックにより細胞を破壊し、CGTase変異体を回収することにより、細胞周辺腔から 回収することができる。 適切なイースト細胞の例は、サッカロマイセス種又はスキゾサッカロマイセス 種、特にサッカロマイセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）又はサ ッカロマイセス・クルイベリ（Saccharonyces kluyveri）の株の細胞を含む。異 種DNAでイースト細胞を形質転換し、それから異種ポリペプチドを産生する方法 は、例えば引用により本明細書に組み込まれるUS 4,599,311，US 4,931,373，US 4,870,008，US 5,037,743、及びUS 4,845,075に記載される。形質転換された細 胞は、選択マーカー、一般に薬剤耐性又は特定の栄養素、例えばロイシンの欠如 下で増殖する能力により決定された表現型により選択される。イーストに用いる ための好ましいベクターは、US 4,931,373に開示されるPOT１ベクターである。 本発明のCGTase変異体をコードするDNA配列は、例えば上述のように、その上流 にシグナル配列及び必要に応じてリーダー配列を有し得る。適切なイースト細胞 の更なる例は、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)、例えばＫ．ラクチス(Klac tis )、ハンセヌラ(Hansenula)、例えばＨ．ポリモルファ(H ．polymorpha)、又は ピキア（Pichia）、例えばＰ．ポストリス(P ．postoris)の株である［Gleesonら 、J ．Gen．Mscrobiol. 1986（132）3459-3465；US 4,882,279］。 他の真菌の例は、糸状菌の細胞、例えばアスペルギルス種（Aspergillus spp. ）、ニューロスポーラ種(Neurospora spp.)、フサリウム種(Fusarium spp.)、又 はトリコデルマ種（Thichoderma spp.）、特にＡ．オリザエ、Ａ．ニジュランス 又はＡ．ニゲルの株である。タンパク質の発現のためのアスペルギルス種の使用 は、例えば EP 272,277及びEP 230,023に記載されている。Ｆ．オキシスポルムの形質転換は 、例えばMalardierら（Gene 1989（78）147-156）に記載されるように行うこと ができる。 上述の形質転換又は移入された宿主細胞は、次にCGTaseの発現を許容し、その 後CGTase変異体がその培地から回収されるのを許容する条件下で適切な栄養培地 中で培養される。 細胞を培養するのに用いられる培地は、適切な補足物を含む最小又は複合培地 のような宿主細胞を増殖させるのに適したいずれかの慣用の培地であり得る。適 切な培地は商業的供給元から利用でも、又は出版されている処方（例えばAmeric an Type Culture Collectionのカタログ）に従って調製することができる。次に 、細胞により生産されるCGTase変異体は慣用的手順により培養培地から回収され 得る。その手順は、問題のCGTaseのタイプにより、遠心又はろ過により培地から 宿主細胞を分離し、塩、例えば硫酸アンモニウムにより上清又はろ液のタンパク 質構成物を沈殿させ、種々のクロマトグラフィー手順、例えばイオン交換クロマ トグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、又はアフィニティークロマトグラ フィー等により精製することを含む。CGTase 変異体の製法 更に他の態様において、本発明は、本発明のCGTase変異体を生産する方法であ って、CGTaseをコードするDNA配列で形質転換されている適切な宿主細胞を、酵 素の生産を許容する条件下で培養し、生じた酵素をその培地から回収することを 特徴とする方法を提供する。 形質転換された宿主細胞を培養するのに用いる培地は問題の宿主細胞を増殖さ せるのに適したいずれかの慣用的な培地であり得る。発現されたCGTaseは便利に は培養培地中に分泌され得、そして公知 の手順によりそれから回収され得る。その手順は、遠心又はろ過により培地から 細胞を分離し、硫酸アンモニウムのような塩により培地のタンパク質構成物を沈 殿させ、次にイオン交換クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフ ィー等のようなクロマトグラフィー手順を行うことを含む。 工業上の適用 本発明のCGTaseは、種々の工業的適用、特に食品、化粧品、化学、農薬及び医 薬工業において、シクロデキストリンを製造するための方法に適用することがで きる。 それゆえ、他の態様において、本発明は、シクロデキストリン、特にα−，β −，γ−，δ，ε−、及び／又はζ−シクロデキストリンを製造するための方法 に用いるためのCGTaseを提供する。より好ましい実施形態において、本発明は、 α−，β−及びγ−シクロデキストリン、又はそれらの混合物の製造のための方 法に用いるためのCGTase変異体を提供する。他の好ましい実施形態において、本 発明は、δ，ε−、及びζ−シクロデキストリン、又はそれらの混合物を製造す るために用いるためのCGTase変異体を提供する。 本発明のCGTase変異体は、直鎖オリゴサッカリド、特に２〜12グルコース単位 の直鎖オリゴサッカリド、好ましくは２〜９グルコース単位の直鎖オリゴサッカ リドの製造のための方法にも用いることができる。 更に他の好ましい実施形態において、本発明のCGTase変異体は、シクロデキス トリンのイン・シトゥ形成のために用いることができる。この方法において、本 発明のCGTase変異体はその酵素変異体が要求されるシクロデキストリンを形成す ることができる培地を含む基質に添加することができる。この適用は、焼いたも のを製造する 方法、化学製品を安定化するための方法においてそれらの製造の間、及び界面活 性組成物において行われるのに特によく適している。 特定のシクロデキストリンは、焼いたもの(baked product)の質を改良するこ とが知られている。それゆえ本発明のCGTase変異体はパン改質添加物、例えば生 地組成物、生地添加物、生地コンディショナー、プレミックス、並びにパンもし くは焼いたものを作るための過程の間に穀粉及び／又は生地に添加するのに便利 に用いられる同様の調製物への適用に用いることができる。 シクロデキストリンは、安定性、可溶性等に役立つ包接能力を有する。これに より、シクロデキストリンは、酸化性及び光分解性物質を安定に、揮発性物質を 非揮発性に、不十分にしか溶けない物質を可溶性に、そして芳香性物質を非芳香 性にするなどのことを行うことができ、これにより香料、ビタミン、染料、医薬 品、農薬及び殺真菌剤を被包するのに役立つ。シクロデキストリンは、コレステ ロールのような疎水性物質に結合して卵黄、バター等から、それらを除去するこ ともできる。 シクロデキストリンは、プラスチック積層体、フィルム、膜等において種々の 目的のために用いられているプラスチック及びゴムに関する製品及び過程に利用 することもできる。また、シクロデキストリンは、生分解性プラスチックの製造 のためにも用いられている。 実施例 本発明は、以下の実施例を参照して更に詳細に説明されるが、これらは請求さ れる本発明の範囲を限定するいずれの方法でもない。 実施例１ CGTase酵素の結晶構造及び分子モデル化 バチルス・サーキュランス株251［Lawson C L，van Montfort R，Strokopytov B，Rozeboom H J，Kalk K H，de Vries G E，Penninga D，Dijkhuizen L、及び Dijkstra B W，J ．Mol．Biol. 1994（236）590-600］を非加水分解性テトラサッ カリドアカルボースを含む緩衝液中に浸漬して、触媒部位に位置した擬−テトラ サッカリドを含むCGTaseのＸ線構造を得た(Strokopytovら［Strokopytov B，Pen ninga D，Rozeboom H J；Kalk K H，Dijkhuizen L及びDijkstra B W，Biochemis try 1995（34）2234-2240］。この構造の配置はエントリーコード1CXGでProtein Data Bank(Biology Department，Bldg．463，Brookhaven National Laboratory ，P．O．Box 5000，Upton，NY 11973-5000，USA)に寄託されている。 マルトヘプタオースを含む緩衝液中に更に浸漬することにより、酵素−基質複 合体構造中にノナサッカリド（Ａ−１）を形成した。この構造の配置は、エント リーコード1DIJでProtein Data Bank(Biology Department，Bldg．463，Brookha ven National Laboratory，P．O．Box 5000，Upton，NY 11973-5000，USA)に寄 託されている。コンピューターモデル化によりノナサッカリドの非還元端にトリ サッカリド（Ｊ−Ｌ）を更に加えることにより、Ａ及びＢドメインにおける基質 結合クレフト及びそれに関連する残基を位置決定した。 サブセット−ゾーン関数を用いるコンピュータープログラムInsight^TMソフト ウェアーパッケージ（Biosym）により、選択された距離内の位置を同定すること ができた。この方法で表１〜４を作った。 図１に列記される残基は、バチルス・サーキュランス株251 CGTaseを示し、基 質と酵素との間の最も近い接触のみを含む。酵素と基質との間の水素結合及び他 の相互作用の数を変えることにより、生 成物選択性を変えることができる。通常、デンプンの開裂は、モデルのグルコー ス単位ＢとＣとの間でおこる。 コンピューターモデル化により、アカルボース（Ａ）の還元端に、及びＥ−ド メインに位置したペンタサッカリドの非還元端によりサッカリドを加え、これに よりＡ−Ｂ及びＥ−ドメイン中の基質結合部位に一緒に結合させた。全体として 、20グルコース単位の基質が酵素内に位置した。 サーモアナエロバクターCGTaseの構造を、バチルス・サーキュランスCGTaseの 周知の構造に基づいてモデル化した。製造元の説明書に従ってホモロジーモジュ ールを用いて、再びコンピュータープログラムBiosymからのInsight^TMを用いた 。バチルス・サーキュランスに見い出された基質は、サーモアナエロバクターモ デルに合体され、表５〜７に示す位置が同定された。 実施例２ バチルスからのα−シクロデキストリン産生性CGTase変異体の作製 本実施例は、部位特異的変異誘発が活性部位クレフトのサブ部位中の水素結合 の数を変えるものである３つのα−シクロデキストリン産生性CGTase変異体を記 載する。その変異体は、Lawsonら［Lawson C L，van Montfort R，Strokopytov B，Rozeboom H J，Kalk K H，de Vries G E，Penninga D，Dijkhuizen L、及びD ijkstra B W，J ．Mol．Biol. 1994 236 590-600］により記載されるように得ら れたバチルス・サーキュランス株251 CGTase（即ち野生型酵素）から得られる。 変異体の作製のための方法は部位特異的変異誘発のためのPCRに基づく。変異 体を作るのに以下のオリゴヌクレオチド（プライマー）を用いた。 ；及び 成功した変異誘発は、下線の制限部位に表れ、潜在的な変異体の迅速なスクリ ーニングを許容した。 制限分析及び配列決定により変異体を確認した。変異体タンパク質をアミラー ゼ及びプロテアーゼ陰性バチルス・サブチルス株を用いることにより生産し、ア フィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。 CGTase活性を、50℃で５〜10分、10mMクエン酸ナトリウム、pH6.0中に基質と 共に適切に希釈された酵素溶液をインキュベートすることにより決定した。 シクロデキストリン形成活性（トランスグリコシル化活性）を、基質として５ ％ Paselli^TM SA2（即ちAVEBE，Foxhol，The Netherlandsから利用できる50の平 均重合度の部分的に加水分解されたポテト）を用いて測定した。形成されたβ− シクロデキストリンを、フェノールフタレインで測定した。活性の１単位を、分 当りに１μmolのβ−シクロデキストリンを生産することができる酵素の量とし て定義される。次にα−及びβ−シクロデキストリン形成を、HPLC（以下）を用 いることにより測定した。 シクロデキストリン形成を工業生産過程条件下でも測定した。この目的のため に、0.1Ｕ／mlのCGTaseを、45時間、50℃で10mMクエン酸緩衝液(pH6.0)中で10％ Paselli^TM WA4（即ちジェット−クック(jet−cooked)プレゼラチン化ドラム− 乾燥デンプン）とインキュベートした。サンプルを規則的な時間間隔で収集し、 ５分間、沸騰して、その生成物を分当り１mlの流速でアセトニトリル／水（60／ 40％ ｖ／ｖ）で溶出する25cm Econsosil−NH₂10ミクロンカラ ム（Alltech Associates Inc.，USA）を用いてHPLCにより分析した。 結 果 α−シクロデキストリン形成を増加させるために変異体をデザインした。第１ の実験において、位置89のチロシン残基を、基質のサブ部位Ｆとの更なる水素結 合を導く（図１）アスパラギン酸残基（Y89D）に変えた。これは、より小さいシ クロデキストリンの形成と共に活性部位クレフト中にアミラーゼ鎖のより強い結 合を生じさせる。結果として、α−シクロデキストリン形成活性の増加が、β− シクロデキストリン形成活性の減少と同時に検出され、それはPaselli^TMから生 産されたシクロデキストリンの比率（表16）及びシクロデキストリン形成プロフ ァイル（図２Ｂ）から見られる。 第２の実験において、位置146のセリンをプロリン残基に変えた(S146P)。これ は、基質のサブ部位Ｉ（図１）における水素ネットワークの劇的な変化を生じた 。以下の表15から見られるように、この変異は、シクロデキストリン形成活性に 実質的な影響力を有する。α−シクロデキストリン形成活性は、β−シクロデキ ストリン形成活性の損失において劇的に増加した。γ−シクロデキストリン形成 活性にはほとんど効果がなかった。これは、表16及び図２Ｃにおいて決定され、 それに供されたシクロデキストリンの比にも対応する。 第３の実験において、二重変異を行った。この実験において、位置89のチロシ ンをアスパラギン酸残基に変え、位置146のセリンをプロリン残基に変えた(Y89D ／S146P)。これらの変異は、上述のように行われた２つの単一変異から見られる 結果の組み合わせを生じた。この変異体は、最も大きなα−シクロデキストリン 形成活性（表15）、及び最も大きいα−シクロデキストリンの形成（表16及び 図２Ｄ）を有する。 実施例３ バチルスCGTaseのＥドメインにおける変異 本実施例は、Ｅドメインクレフトにおいて変異を保持する２つのCGTase変異体 の作製を記載する。その変異体は、Lawsonら［Lawson C L，van Montfort R，St rokopytov B，Rozeboom H J，Kalk K H， de Vries G E，Penninga D，Dijkhuizen L、及びDijkstra B W，J ．Mol．Biol. 1994 236 590-600］により記載されるように得られるバチルス・サーキュランス 株251 CGTase（即ち野生型酵素）から得られる。 Ｅドメイン中に２つのマルトース結合部位(MBS)を同定し、本実験においてこ れらの部位が酵素の生デンプン結合特性について特に重要であることが見い出さ れた。第１の部位（MBS1）は、基質のグルコース環とのそれらのインドール基の ファン・デル・ワールス接触を介してマルトースに結合する位置616及び662にお けるトリプトファンを含む。第２の部位（MBS2）、ほとんどの場合位置633にお ける保存性チロシンは基質のグルコース残基とのファン・デル・ワールス接触を 形成する。周囲の残基との水素結合は、これらの部位における結合を増強させる 。MBS2は、活性部位に導く溝近くに位置する。 VENT−DNAポリメラーゼを用いる２つのPCR反応に基づく方法により変異を導入 した。各々の変異のために、特定のオリゴヌクレオチドを開発した。制限分析及 び配列決定により変異を確認した。アミラーゼ及びプロテアーゼ陰性バチルス・ サブチルス株から変異体を得て、アフィニティークロマトグラフィーを用いて精 製した。 バクテリア株及びプラスミド：大腸菌MC1061[Meissner P S，Sisk W P，Berma n M L；Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 1987（84）4171-4175]を、組換えDNA操作 及び部位特異的変異誘発のために用いた。大腸菌DH５α[Hanahan D；J ．Mol．Bi ol 1983（166）557]を配列決定のためのモノマースーパーコイルプラスミドの生 産のために用いた。CGTase変異体をα−アミラーゼ及びプロテアーゼ陰性バチル ス・サブチルス株DB104A[Smith H，de Jong A，Bron S，Venema G；Gene 1988（ 70）351-361]で生産した。カナマイシン耐性マ ーカーを含むフラグメントを、HindIII及びXbaＩで消化されたバチルスサーキュ ランスCGTase（クレノウポリメラーゼで平滑化されたもの）を含むプラスミドpD P66S[Penninga D，Strokopytov．B，Rozeboom H J，Lawson C L，Dijkstra B W ，Bergsma J，Dijikhwizen L；Biochemistry 1995（34）3368-3376]からその最 も大きいフラグメントで消化した。結果として生ずるエリトロマイシン誘導性ｐ 32プロモーター［Van der Vossen J M B M，Kodde J，Haandrikman A J，Venema G，Kok J；Appl ．Environ．Microbiol 1992（58）3142-3149］の制御下のCGTas e遺伝子を有するCGTaseタンパク質発現シャトルベクターpDP66Kをエリトロマイ シン及びカナマイシン耐性についての選択下で大腸菌MC1061に形質転換した（図 ３）。 CGTase 変異体の作製：プラスミドpDP66S（8.5kb）[Saenger W，Angew ．Chem. 1980（19）344-362]での相対的に低い安定性のみが見られたので、pDP66K(7.7kb )を、強ｐ32プロモーター[van der Vossen J M B M，Kodde J，Haandrikman A J ，Venema G，Kok J；Appl ．Environ．Microbiol. 1992（58）3142-3149]の制御 下でCGTase遺伝子と共に作製した（図３）。カナマイシンについての更なる抗生 物質耐性マーカーを含むプラスミドpDP66Kは、ストレプトマイシン／スペクチノ マイシン耐性カセットを含むプラスミドpDP66Sより大腸菌及びＢ．サブチリスに おいてかなりより安定であるようであった。シャトルベクターを用いて、野生型 酵素及びCGTase変異体の高い細胞外生産を、α−アミラーゼ及びプロテアーゼ陰 性Ｂ．サブチリス株DB104Aとのバッチ発酵で再現可能に得られた。１ｌのＢ．サ ブチリス株DB104A培養物を含む１つの５ｌエーレンマイカーフラスコは、25mgま でのCGTase変異体の均一性までの精製を許容した。部位特異的(PCR)変異誘発に より変異体を作製した。特定のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、70％に 近い変異頻度が観察され た。全ての変異は制限分析及びDNA配列決定により確認した。 増殖条件：バクテリア株を有するプラスミドを、大腸菌及びバチルス・サブチ ルスについて各々100及び５μｇ／mlの濃度で抗生物質エリトロマイシン及びカ ナマイシンの存在下でLB培地上で増殖させた〔Sambrookら、前掲〕、適切な場合 、寒天プレートはハロ形成のためにスクリーニングするために１％のデンプンを 含んでいた。バチルス・サブチルス株DB104Aは、２％トリプトン、0.5％イース ト抽出液、１％塩化ナトリウム及び１％カザミノ酸(pH7.0)を含み、10μｇ／ml エリトロマイシン及び５μｇ／mlカナマイシンを含む１ｌ培地を含む５ｌフラス コ中で増殖させた。 DNA 操作：制限エンドヌクレアーゼ及びクレノウ酵素をPharmacia LKB Biotec hnology，Swedenから購入し、製造元の説明書に従って用いた。DNA操作及び大腸 菌株の塩化カルシウム形質転換を、記載される通りに行った〔Sambrookら、前掲 〕。バチルス・サブチルスの形質転換を、Bronにより記載されるように行った[H arwood C R及びCutting S M，Eds．；Modern Microbiological Methoeds for Ba cillus ，1990，Wiley & Sons，New York／Chichester；“Plasmids”，pp．146- 147]。 部位特異的変異誘発：変異を導入するために、我々は、第１のPCRをコード化 鎖上の変異誘発プライマー＋テンプレート鎖上の910〜1050bp下流のプライマー を用いて行うVENT−DNAポリメラーゼ(New−England Biolaks，Beverly，MA，USA )を用いる２つのPCR反応に基づく方法を用いた。この反応の生成物(910〜1050bp )を、次にコード化鎖上の760〜900bp上流のプライマーと共に第２のPCRにおける プライマーとして用いた。最終反応の生成物(1800bp)をBgII及びHindIIIで切断 し、ベクターpDP66Kからの対応するフラグメント(600bp)と交換した。生じた（ 変異）プラスミドを大腸菌MC1061 細胞に形質転換した。変異を作るために以下のオリゴヌクレオチド（プライマー ）を用いた。 成功した変異誘発は、潜在的な変異の迅速なスクリーニングを許容する下線の 制限部位を示した。Y633Aのために、この制限部位は、NarＩであり、W616Aにつ いてはSacＩであり、そしてW662AについてはSacIIであった。 DNA 配列決定：正しい制限部位を有するプラスミドpDP66Kを、大腸菌DH５α細 胞に形質転換した。ジデオキシ鎖ターミネーション法[Sanger F，Coulson A R；J ．Mol．Biol. 1975（94）441-448]及びPharmacia LKB Biotechnology（Sweden ）を用いて、スーパーコイルプラスミドDNAで配列決定を行った。 CGTase 変異体の生産及び精製：陽性とキャラクタライズされた変異CGTase遺伝 子を有するプラスミドpDP66Kをバチルス・サブチルス株DB104Aに形質転換した。 その生物を（約36時間）５ｌフラスコ内で600nmにおいて測定した4.5の光学座席 まで増殖させた。これらの条件下で、高い細胞外CGTaseレベルを作った。その培 養物を30分、４℃で遠心（×10,000ｇ）した。（変異）CGTaseを、ml当り3.5mg の最大容量の30ML α−シクロデキストリン−Sepharose−６FFカラム(Pharmaci a，Sweden)を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより均一になるまで更 に精製した。10mMの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)で洗った後、結合したCGTase を10mg／ml α−シクロデキストリンを含む同緩衝液で溶出した。 酵素アッセイ β−シクロデキストリン形成活性：基質として５％ Paselli^TM S A2（即ちAVEBE，Foxhol，The Netherlandから利用できる50の平均重合度の部分 的に加水分解されたポテトデンプン）を用いて、50℃で30分のインキュベーショ ンの後に、β−シクロデキストリン形成活性を測定した。活性の0.1−0.1単位を 用いた。形成されたβ−シクロデキストリンを、フェノールフタレインとの安定 な無色包接複合体を形成する能力に基づいて測定した。活性の１単位を分当りの β−シクロデキストリンの１μmolを形成することができる酵素の量として定義 した。 生デンプン結合特性：生デンプン結合特性を、４℃で１時間、0.1mMのβ−シ クロデキストリンあり及びなしで粒状ポテトデンプン(Paselli^TM SA2，AVEBE，F oxhol，The Netherlandからのもの)の増加量（０〜10％）と共に６μｇ／mlの酵 素をインキュベートすることにより研究した。（10分以内に平衡に達した）。イ ンキュベーションの後、デンプン粒子に結合したタンパク質を、４℃で１分間、 10,000×ｇで遠心して落とし、その残りの上清のβ−シクロデキストリン形成活 性を上述のように測定した。 速度研究：Paselli^TM SA2（AVEBE，Foxhol，The Netherlands）での速度研究 を、0.1又は0.2mMのβ−シクロデキストリンの添加あり又はなしで０〜５％の範 囲のPaselli^TM濃度での酵素のβ−シクロデキストリン形成活性の測定により行 った。これらの実験において、約0.6μｇ／ml（0.15〜0.18単位）の酵素を用い た。 速度研究：あるいは、生デンプンでの速度研究を、０〜50％の範囲の生デンプ ン濃度で10分間、６μｇ／mlの酵素をインキュベートすることにより行った。β −シクロデキストリン形成は上述の通り測定した。 これらの速度及び結合研究から収集されたデータを、ヒルの等式を用いて適合 させ、結合研究についてのＹ_max及びＫ₅₀値、並びに 速度研究についてのＶ_max及びＫ₅₀を算出した。Ｋ_i値は次の通り計算した。 結 果 マルトース結合部位１（MBS1）は、２つのトリプトファン残基を含むので、二 重変異体W616A／W662Aを行った。この方法において、我々は基質のグルコース単 位との芳香族残基の疎水性相互作用を完全に除去するようにデザインした２つの 結合部位においてかなりの変化を行った。２つの別個のCGTase変異体W616A及びW 662Aは、二重変異体W616A／W662Aと比較して中間の結果を供した。 その曲線がミカエリスメンテンの等式よりヒルの等式によりよく適合する図４ 〜６に供される結果から、反応及び結合速度に協同的に関連する形態が示される 。 生デンプン結合実験の結果を表17及び図４に示す。生デンブン結合の測定が、 W616A／W662Aについて鋭い減少を示したことは、MBS1が必要とされ、それが基質 結合について最も高いアフィニティーを有することを示す。Y633A変異体は、ア フィニティー及びＹ_maxの少しだけの減少を示し、それはMBS2が生デンプン結合 にほとんど寄与しないことを示す。 β−シクロデキストリンの生デンプンへの効果は、それが酵素の結合部位のた めのデンプン鎖との競合により結合を阻害することができることを示す。この効 果が野生型と比較して、生産された変異 体についてより促進されることは、１つのMBSが削除された場合に、残った部位 についての生デンプンとのβ−シクロデキストリンの競合がより強くなることを 示す。これは、MBS間の協同性の形態も示す。 生デンプン結合に関する協同性の程度を示すヒル因子“ｎ”が、W616A／W662A 変異体において大きく減少したことは、MBS1が協同的結合にかなり寄与すること を示す。Y633A変異体は、野生型酵素と同じ“ｎ”値を有する。これは、結合に おいてMBS2以外の部位がMBS1と協同することを示唆する。 加水分解されたポテトデンプン(Paselli^TM SA2)での反応速度の結果を表18及 び図５に示す。これらの結果は、野生型酵素におけるMBS2について他の役割を示 す。Y633A変異体のPaselli^TMについてのより低いアフィニティーは、基質がその 結合部位の欠如下で活性部位により効果的でなく導かれ得ることを示す。これは 、反応速度において観察された協同性がこの変異体において損失されていること を示す因子“ｎ”の約１への減少によっても支持される。β−シクロデキストリ ンによる非競合から競合阻害へのシフトは、MBS2が非競合的生成物阻害に応答す ることを意味する。W616A/W662A変異体での結果は、MBS1がPaselli^TMの分解に少 しだけ関連することを示す。 生デンプンでの反応速度実験の結果を表19及び図６に示す。これらの結果は、 MBSのいずれかが削除された場合のアフィニティーのかなりの減少を示し、これ は、生デンプンへの活性について、両方のMBSが等しく重要であることを示す。 しかしながら、高い生デンプン濃度においては、W616A／W662A変異体を示す曲線 が、野生型酵素のそれにアラインされることは、MBS1以外の結合部位がその機能 を引き継ぐことを示唆する。この部位はＣドメイン上のMBS3であ り得る。 これらの実験から、その結合部位を有するＥドメインは、生デンプンのシクロ デキストリンへの転化に必要とされることが結論づけられた。酵素はMBS1を介し て生デンプン粒子に結合し、他方MBS2は粒子から活性部位に伸びるデンプン鎖を 導く。 実施例４ バチルスからのβ−及びγ−シクロデキストリン生成性CGTaseの作製 本実施例は、部位特異的変異誘発が活性部位における水素結合の数を変えるい くつかのβ−及びγ−シクロデキストリン生成CGTase変異体の作製を記載する。 変異体は、Lawsonら［Lawson C L，van MOntfort R，Strokopytov B，Rozeboom H J，Kalk K H，de Vries G E，Penninga D，Dijkhuizen L及びDijkstra B W，J ．Mol．Biol. 1994（236）590-600］に記載されるように得られるバチルス・サ ーキュランス株251 CGTase（即ち野生型酵素）から得られる。 VENT−DNAポリメラーゼ(New−England Biolabs，Beverly，MA，USA)を用いるP CR法で変異を導入した。第１のPCR反応を、コード化鎖についての変異誘発プラ イマー＋テンプレート鎖上の下流のプ ライマーで行った。その反応生成物を、次に、コード化鎖上の上流のプライマー と一緒の第２のPCR反応におけるプライマーとして用いた。その最後の反応の生 成物をPvuII及びSalＩで切断し、ベクターpDP66Kからの対応するフラグメント（ 1200bp）と交換した。生じた（変異）プラスミドを大腸菌MC1061細胞[Meissner P S，Sisk W P，Berman M L；Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 1987（84）4171-417 5]に形質転換した。 変異体を作るために以下のオリゴヌクレオチド（プライマー）を用いた。 及び 成功した変異誘発は潜在的な変異体の迅速なスクリーニングを許容する下線の 制限部位に現れた。 正確な制限部位を有するプラスミドpDP66Kを大腸菌DH５α細胞［Hanahan D；J ．Mol．Biol. 1983（166）557］に形質転換した。ジデオキシ鎖ターミネーショ ン法[Sanger F，Cowlson A R；J ．Mol．Biol. 1975（94）441-448]及びPharmaci a-LKB Biotechnology，SwedenからのT7−配列決定キットを用いてスーパーコイ ルプラスミドDNA上でDNA配列決定を行った。 陽性とキャラクタライズされた変異cgt遺伝子を有するプラスミドpDP66KをＢ ．サブチリス株DB104A[Smith H，de Jong A，Bron S ，Venema G；Gene 1988（70）351-361]に形質転換した。その生物を（約36時間 ）５ｌフラスコ中で4.5の600nmでの光学密度になるまで増殖させた。これらの条 件下において、高い細胞外CGTaseレベルが作られた。 その培養物を10,000×ｇで30分間、40℃で遠心した。その培養物上清中のCGTa se変異体を、ml当り3.5mgのタンパク質の最大容量の30ml α−シクロデキスト リン−Sepharose−６FFカラム（Pharmacia，Sweden）[Sundburg L，Porath J；C ．Chromatogr. 1974（90）87-98]を用いるアフィニティークロマトグラフィーに より均一になるまで更に精製した。10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)で洗浄し た後、結合したCGTaseを10mg／mlのα−シクロデキストリンを含む同緩衝液で溶 出した。 β−シクロデキストリン形成活性を、50℃で３分間、適切に希釈された酵素サ ンプル(0.1〜0.2単位の活性）をインキュベートすることにより測定した。50の 平均重合度の部分的に加水分解されたポテトデンプンであるPaselli^TM SA2（５ ％溶液）を、基質として用いた。形成されたβ−シクロデキストリンを、フェノ ールフタレインとの安定な無色包接複合体を形成する能力に基づいて測定した。 活性の１単位を分当りのβ−シクロデキストリンの１μmolを生産することがで きる酵素の量として定義した。 シクロデキストリン形成活性を、生産工程条件下でも測定した。この目的のた めに、0.1Ｕ／mlのCGTaseを45時間、50℃において10mMクエン酸ナトリウム緩衝 液(pH6.0)中で10％ Paselli^TM WA4（即ちジェットクックプレゼラチン化ドラム 乾燥デンプン）と共にインキュベートした。一定の時間間隔でサンプルを収集し 、10倍希釈して、８分間沸騰して、形成された生成物を、分当り１mlで、アセト ニトリル／水（60／40 ｖ／ｖ）で溶出する25cm Econosphere−NH ₂ ５ミクロ７カラム［Alltech Associates Inc.，USA）を用いてHPLCにより分析 した。 結 果 本実施例の変異体を、β−及びγ−シクロデキストリン形成を増加させるため にデザインした。N193G，Y89G，D371G，D371N及びY89G／N193G CGTase変異体は 、全て、アミロース鎖と活性部位クレフトの第１の部分との間（サブ部位Ｃ−Ｇ ）の相互作用を減少させる意図でデザインした。結果として、アミロース鎖は、 活性部位クレフトへ更に動くことができ、これによりβ−及びγ−シクロデキス トリンに向かうシクロデキストリンの比率を変化させるであろう。 N193G CGTase変異体は、β−シクロデキストリンの迅速な増加を示した（図７ 及び９）。結果として、その比は、５時間のインキュベーション（表20）の後、 既に劇的にα−及びβ−シクロデキストリンに向かって変化する。しかしながら 、45時間後（表21）、その比はα−シクロデキストリン形成に向かってのみ変化 した。この変異は、他の変異、例えばD371G又はD371Nとの組み合わせに特によく 適するようである。 Y89G CGTase変異体は、α−シクロデキストリンの損失において、45時間のイ ンキュベーション後にβ−シクロデキストリンに向かって少し変化した（図７及 び表21）。 D371N及びD371G CGTase変異体は、両方とも、より大きなシクロデキストリン の形成に向かうシフトを示す（図８及び表21）。β−及びγ−シクロデキストリ ンがα−シクロデキストリンの代償で増加した。このシフトは早いインキュベー ション時間でより促進された（表20及び図10）。 Y89G／N193G 二重変異体は、β−シクロデキストリンからのα−及びγ−シク ロデキストリンの両方へのシフトを生じた（表21）。 他の変異、特にD371G又はD371Nとの組み合わせにおいて、この変異はβ−シクロ デキストリンへの単一シフトを生じ得た。 ^*145aI CGTase変異体を、アラインメント研究に基づいて作製した。この挿入 変異は、β−シクロデキストリン生成性CGTase変異体を得るために特に有利であ るようである。短いインキュベーション時間（図10及び表20）と長いインキュベ ーション時間（図８及び表21）の両方性、α−及びγ−シクロデキストリンの両 方へのβ−シクロデキストリンからのシフトを供した。また、β−シクロデキス トリンへの単一シフトを得るために、この変異は、他の変異、例えばD371G又はD 371Nとの組み合わせに特によく適しているようである。 N326Q CGTase変異体を作製し、これは、α−シクロデキストリンからβ−及び γ−シクロデキストリン形成へのシフトを生じることが示された（表21）。 最後に、上述の変異の組み合わせは、β−及び／又はγ−シクロデキストリン 形成の増加したCGTase変異体を得るために、直接的であるようである。 実施例５ サーモアナエロバクターからのα−シクロデキストリン生成物CGTase変異体の 作製 本実施例は、部位特異的変異誘発が活性クレフトのサブ部位における水素結合 の数を変化させ、又は基質結合クレフトの部分において立体障害を導く24のα− シクロデキストリン生成性CGTase変異体（Ａ１〜Ａ24）の作製を記載する。 その変異体は、WO89/03421に従って得られたサーモアナエロバクター種CGTase から得られ、配列番号：１〜２（即ち野生型酵素）として供されるヌクレオチド 及びアミノ酸配列を有する。 PWOポリメラーゼの使用によるPCRに基づく方法により、変異を導入した。各々 の変異のために、特定のオリゴヌクレオチド（プライマー）を開発した。その変 異体を、可能な限り制限分析により、及び配列決定により確認した。変異タンパ ク質を、大腸菌MC1061[Meissner P S，Sisk W P，Berman M L；Proc ．Natl．Aca d．Sci．USA 1987（84）4171-4175]又はα−アミラーゼ及びプロテアーゼ陰性バ チルス・サブチリス株DB104A[Smith H，de Jong A，Bron S，Venema G；Gene 19 88（70）351-361]において発現させた。タンパク質を、アフィニティークロマト グラフィー(AfC)及び／又は陰イオン交換クロマトグラフィー(AEC)を用いて培地 から精製した。 酵素アッセイ 酵素活性を、Phadebasアミラーゼテスト(Pharmacia)の少し改良し手順により 測定した。Phadebas錠剤(Padebas^TM Amylase Tese，Pharmacia)を基質として用 いる。この基質は、ウシ血清アルブミン 及び緩衝物質と混合した架橋された不溶性青色デンプンポリマーである。水に懸 濁した後、デンプンを酵素により加水分解して青色フラグメントを生成した。60 ℃，pH6.2での0.15mMカルシウム中での15分のインキュベーションの後に測定を 行う。620nmで測定した生じた青色溶液の吸光度は酵素活性に相当する。 その酵素活性を酵素標準のそれと比較し、その活性を酵素標準のそれと同じ単 位で表現する。酵素標準をTermamyl^TM(Novo Nordisk A/D，Denmark)とした。そ のデンプン分解活性は、基質としてポテトデンプンを用いて測定されている。こ の方法は、酵素により修飾されたポテトデンプンの分解に基づき、その反応の後 、デンプン／酵素溶液のサンプルをヨウ素溶液と混合する。有色ガラス標準と比 べて、最初は黒ずんだ青色が形成されたが、デンプンの分解の間、青色が弱くな り、次第に赤茶に変わった。 １キロNOVOαアミラーゼ単位(KNU)を、標準条件(即ち37℃＋／−0.05；0.0003 Ｍ Ca²⁺；及びpH5.6)下で5.26ｇのデンプン乾燥物質Merck Amylum溶解物をデキ ストリン化する（dextrinize）酵素の量として定義する。以下に、活性12ml当り のNOVO単位（NU）で表現する。 CGTase活性を、60℃で４〜10分、10mMクエン酸ナトリウム、pH6.0中で基質と 共に希釈した酵素をインキュベートすることにより、測定した。 シクロデキストリン形成活性を、基質として５％ Paselli^TM（即ちAVEBE，Fox hol，The Netherlandsから利用できる50の平均重合度の部分的に加水分解された ポテトデンプン）を用いて測定した。形成されたα−シクロデキストリンをメチ ルオレンジで測定し、形成されたβ−シクロデキストリンをフェノールフタレイ ンで測定し、そして形成されたγ−シクロデキストリンをブロモクレゾールグリ ーンで測定した。その活性をmg当りの単位で表す（Ｕ／mg）。酵素活性の１単位 を分当りに特定のシクロデキストリンの１μmolを生産することができる酵素の 量として定義する。 シクロデキストリン形成を、慣用的な工業生産工程条件下でも測定した。プレ クックした(precooked)pH5.5の0.5mM CaCl₂中のアミロペクチン溶液を、24時間 、60℃で基質のグラム当り50NUのCGTaseと共にインキュベートした。サンプルを HPLCにより分析する前に、規則的にとり、2.5〜３のpHで10分間、沸騰した。 これらの実験の結果を以下の表23〜25で議論し、そこに示す。表25において、 図は、シクロデキストリンの最大の全体のレベルにおける比率である。 オリゴヌクレオチドプライマー 部位特異的変異誘発を始めるために、以下のオリゴヌクレオチドを合成した（ 番号はCGTaseナンバリングに従う位置を示す）。 Ａ１：143−151（ＧＲＡＧＴＮＰＧ）； Ａ２：87−94（ＩＫＹＳＧ−ＶＮＮ）＋143−151（ＧＲＡＧＴＮＰＧ）； 開始点として以下の実施例６に記載されるＢ９変異体（87−94（ＩＫＹＳＧ− ＶＮＮ））を用いて、143−151(ＧＲＡＧＴＮＰＧ)変異体をＡ１プライマーを用 いて導入した。 Ａ３：F195Y＋143−151（ＧＲＡＧＴＮＰＧ）； 、開始点としてこの変異体を用いて、87−94（ＩＫＹＳＧ−ＶＮＮ）変異をＡ１ プライマーを用いて導入した。 Ａ４：F195Y＋87−94（ＩＫＹＳＧ−ＶＮＮ）＋143−151（ＧＲＡ ＧＴＮＰＧ）； Ａ２のSpeＩ−BstXＩフラグメントをF195Y変異を有するCGTase遺伝子に連結し た。F195YをＡ３プライマーを用いることにより導入した。 Ａ５：P143G−A144R−S145W； Ａ６：87−94（ＩＮＤＳＧ−ＶＮＮ）； Ａ７：87−94（ＩＮＤＳＧ−ＶＮＮ）＋146−150（ＳＤＱＰＳ）； 開始点としてＡ６変異体（87−94（ＩＮＤＳＧ−ＶＮＮ））を用 Ａ８：143−148（ＧＲＧＰＡＡ）； Ａ９：143−148（ＧＲＡＰＡＡ）； Ａ10：143−148（ＧＲＡ^**Ａ）； Ａ11：143−148（ＧＲＰＡＡＡ）； Ａ12：G180S； Ａ13：A144R； Ａ14：P143A−A144R； Ａ15：G180N； Ａ16：G180D； Ａ17：G180N＋P143G−A144R−S145W； 開始点としてＡ５変異体(P143G−A144R−S145W)を用いて、G180 いて導入した。 Ａ18：G180D＋P143G−A144R−S145W； 開始点としてＡ５変異体(P143G−A144R−S145W)を用いて、G180 いて導入した。 Ａ19：G179N； Ａ20：G179S； Ａ21：G179D； Ａ22：G179N＋P143G−A144R−S145W； 開始点としてＡ５変異体(P143G−A144R−S145W)を用いて、G180 いて導入した。 Ａ23：G179S＋P143G−A144R−S145W； 開始点としてＡ５変異体(P143G−A144R−S145W)を用いて、G180 いて導入した。 Ａ24：G179D＋P143G−A144R−S145W； 開始点としてＡ５変異体(P143G−A144R−S145W)を用いて、G180 いて導入した。 結 果 本実施例の変異体は、α−シクロデキストリン形成を増加させるためにデザイ ンした。 実験Ａ１において、酵素とグルコース単位Ｈとの間の相互作用を増加させ、並 びに酵素とグルコース単位Ｉ及びＪとの間の相互作用を減少させるために、位置 143〜151のループを（ＧＲＡＧＴＮＰＧ）により置換した（図１）。β−CD形成 及びγ−CD形成の両方の開始比率は減少した。CD生産アッセイにおいてα−CDの 比は増加したが、β−CD比は減少した。 実験Ａ２において、酵素とグルコース単位Ｅ，Ｆ及びＨとの間の相互作用を増 加させるため、並びに酵素とグルコース単位Ｉ及びＪとの間の相互作用を減少さ せるために、位置87〜94のループを（ＩＫＹＳＧ^* ＶＮＮ）により置換し、同時 に位置143〜151のループを（ＧＲＡＧＴＮＰＧ）により置換した（図１）。β− CD形成及びγ−CD形成の開始比率は減少した。 実験Ａ３において、酵素とグルコース単位１−１との間の相互作用を増加させ 、並びに酵素とグルコース単位Ｉ及びＪとの間の相互作用を減少させるために、 位置143〜151のループを（ＧＲＡＧＴＮＰＧ）により置換した（図１）。同時に 、酵素と基質との間の接触を減少させるために、F195を195Yにより置換した。β −CD形成及びγ−CD形成の両方の開始比率は減少した。CD生産アッセイにおいて α−CDの比は増加したが、β−CD比は減少した。 実験Ａ４において、酵素とグルコース単位Ｅ，Ｆ及びＨとの間の相互作用を増 加させるため、並びに酵素とグルコース単位Ｉ及びＪ との間の相互作用を減少させるために、位置87〜94のループを（ＩＫＹＳＧ^* Ｖ ＮＮ）により置換し、同時に位置143〜151のループを（ＧＲＡＧＴＮＰＧ）によ り置換した（図１）。同時に、酵素と基質との間の接触を減少させるために、F1 95を195Yにより置換した。β−CD形成の開始比率は減少した。CD生産アッセイに おいて、β−CD比は減少した。 実験Ａ５において、立体障害を作ることにより酵素とグルコース単位１−１と の間の相互作用を増加させ、並びに酵素とグルコース単位Ｉ及びＪとの間の相互 作用を減少させるために、位置143〜145のループを（ＧＲＷ）により置換した（ 図１）。α−CD形成の開始速度は増加したが、β−CD形成及びγ−CD形成の両方 の開始速度は減少した。CD生産アッセイにおいてα−CDの比は増加したが、β− CD比は減少した。 実験Ａ６において、酵素とグルコース単位Ｅ及びＦとの間の相互作用を増加さ せるために、位置87〜94のループを（ＩＫＤＳＧ^* ＶＮＮ）により置換した（図 １）。 実験Ａ７において、酵素とグルコース単位Ｅ及びＦとの間の相互作用を増加さ せるため、並びに酵素とグルコース単位Ｉ及びＪとの間の相互作用を減少させる ために、位置87〜94のループを（ＩＫＤＳＧ^* ＶＮＮ）により置換し、同時に位 置146〜150のループを（ＳＤＱＰＳ）により置換した（図１）。 実験Ａ８において、酵素とグルコース単位Ｈとの間の相互作用を増加させるた め、並びに酵素とグルコース単位Ｉ及びＪとの間の相互作用を減少させるために 、位置143〜148のループを（ＧＲＧＰＡＡ）により置換した（図１）。 実験Ａ９において、酵素とグルコース単位Ｈとの間の相互作用を増加させ、並 びに酵素とグルコース単位Ｉ及びＪとの間の相互作用 を減少させるために、位置143〜148のループを（ＧＲＡＰＡＡ）により置換した 。 実験Ａ10において、酵素とグルコース単位Ｈとの間の相互作用を増加させるた め、並びに酵素とグルコース単位Ｉ及びＪとの間の相互作用を減少させるために 、位置143〜148のループを（ＧＲＡ^**Ａ）により置換した（図１）。 実験Ａ11において、酵素とグルコース単位Ｈとの間の相互作用を増加させるた め、並びに酵素とグルコース単位Ｉ及びＪとの間の相互作用を減少させるために 、位置143〜148のループを（ＧＲＷ）により置換した（図１）。β−CD形成及び γ−CD形成の両方の開始比率はα−CD形成の開始比率より大きく減少し、結果と してα−CD形成とβ−CD形成との間の比が増加した。 実験Ａ12において、酵素とグルコース単位Ｈとの間の相互作用を増加させるた めに、G180を180Sにより置換した（図１）。 実験Ａ13において、酵素とグルコース単位Ｈとの間の相互作用を増加させるた めに、A144を144Rにより置換した（図１）。 実験Ａ14において、酵素とグルコース単位Ｈとの間の相互作用を増加させるた めに、P143−A144を143A−144Rにより置換した（図１）。 実験Ａ15において、酵素とグルコース単位Ｈとの間の相互作用を増加させるた めに、G180を180Nにより置換した（図１）。 実験Ａ16において、酵素とグルコース単位Ｈとの間の相互作用を増加させるた めに、G180を180Dにより置換した（図１）。 実験Ａ17において、酵素とグルコース単位Ｈとの間の相互作用を増加させるた めに、G180を180Nにより置換した（図１）。同時に、立体障害を作ることにより 、酵素とグルコース単位Ｈとの間の相互作用を増加させるため、並びに酵素とグ ルコース単位Ｉ及びＪとの 間の相互作用を減少させるために、位置143〜145の領域を（ＧＲＷ）により置換 した（図１）。 実験Ａ18において、酵素とグルコース単位Ｈとの間の相互作用を増加させるた めに、G180を180Dにより置換した（図１）。同時に、立体障害を作ることにより 、酵素とグルコース単位Ｈとの間の相互作用を増加させるため、並びに酵素とグ ルコース単位Ｉ及びＪとの間の相互作用を減少させるために、位置143〜145の領 域を（ＧＲＷ）により置換した（図１）。 実験Ａ19において、酵素とグルコース単位Ｈとの間の相互作用を増加させるた めに、G179を179Nにより置換した（図１）。 実験Ａ20において、酵素とグルコース単位Ｈとの間の相互作用を増加させるた めに、G179を179Sにより置換した（図１）。 実験Ａ21において、酵素とグルコース単位Ｈとの間の相互作用を増加させるた めに、G179を179Dにより置換した（図１）。 実験Ａ22において、酵素とグルコース単位Ｈとの間の相互作用を増加させるた めに、G179を179Nにより置換した（図１）。同時に、立体障害を作ることにより 、酵素とグルコース単位Ｈとの間の相互作用を増加させるため、並びに酵素とグ ルコース単位Ｉ及びＪとの間の相互作用を減少させるために、位置143〜145の領 域を（ＧＲＷ）により置換した（図１）。 実験ABBEにおいて、酵素とグルコース単位Ｈとの間の相互作用を増加させるた めに、G179を179Sにより置換した（図１）。同時に、立体障害を作ることにより 、酵素とグルコース単位Ｈとの間の相互作用を増加させるため、並びに酵素とグ ルコース単位Ｉ及びＪとの間の相互作用を減少させるために、位置143〜145の領 域を（ＧＲＷ）により置換した（図１）。 実験Ａ24において、酵素とグルコース単位Ｈとの間の相互作用を 増加させるために、G179を179Dにより置換した（図１）。同時に、立体障害を作 ることにより、酵素とグルコース単位Ｈとの間の相互作用を増加させるため、並 びに酵素とグルコース単位Ｉ及びＪとの間の相互作用を減少させるために、位置 143〜145の領域を（ＧＲＷ）により置換した（図１）。 実施例６ サーモアナエロバクターからのβ−シクロデキストリン生成性CGTase変異体の 作製 本実施例は、部位特異的変異誘発が活性クレフトのサブ部位における水素結合 の数を変化させ、又は基質結合クレフトの部分において立体障害を導く15のβ− シクロデキストリン生成性CGTase変異体（Ｂ１〜Ｂ９）の作製を記載する。 その変異体は、WO89/03421に従って得られたサーモアナエロバクター種CGTase から得られ、配列番号：１〜２（即ち野生型酵素）として供されるヌクレオチド 及びアミノ酸配列を有する。 PWOポリメラーゼの使用によるPCRに基づく方法により、変異を導入した。各々 の変異のために、特定のオリゴヌクレオチド（プライマー）を開発した。その変 異体を、可能な限り制限分析により、及び配列決定により確認した。変異タンパ ク質を、大腸菌MC1061[Meissner P S，Sisk W P，Berman M L；Proc ．Natl．Aca d．Sci．USA 1987（84）4171-4175]又はα−アミラーゼ及びプロテアーゼ陰性バ チルス・サブチリス株DB104A[Smith H，de Jong A，Bron S，Venema G；Gene 19 88（70）351-361]において発現させた。タンパク質を、アフィニティークロマト グラフィー(AfC)及び／又は陰イオン交換クロマトグラフィー(AEC)を用いて培地 から精製した。 酵素アッセイ 酵素活性を、Phadebasアミラーゼテスト(Pharmacia)の少し改良した手順によ り測定した。Phadebas錠剤（Phadebas^TM Amylase Tese，Pharmacia）を基質とし て用いる。この基質は、ウシ血清アルブミン及び緩衝物質と混合した架橋された 不溶性青色デンプンポリマーである。水に懸濁した後、デンプンを酵素により加 水分解して青色フラグメントを生成した。60℃，pH6.2での0.15nMカルシウム中 での15分のインキュベーションの後に測定を行う。620nmで測定した生じた青色 溶液の吸光度は酵素活性に相当する。 その酵素活性を酵素標準のそれと比較し、その活性を酵素標準のそれと同じ単 位で表現する。酵素標準をTermamyl^TM(Novo Nordisk A/D，Denmark)とした。そ のデンプン分解活性は、基質としてポテトデンプンを用いて測定されている。こ の方法は、酵素により修飾されたポテトデンプンの分解に基づき、その反応の後 、デンプン／酵素溶液のサンプルをヨウ素溶液と混合する。有色ガラス標準と比 べて、最初は黒ずんだ青色が形成されたが、デンプンの分解の間、青色が弱くな り、次第に赤茶に変わった。 １キロNOVOαアミラーゼ単位(KNU)を、標準条件(即ち37℃＋／−0.05；0.0003 Ｍ Ca²⁺；及びpH5.6)下で5.26ｇのデンプン乾燥物質Merck Amylum溶解物をデキ ストリン化する（dextrinize）酵素の量として定義する。以下に、活性12ml当り のNOVO単位（NU）で表現する。 CGTase活性を、85℃で４〜10分、10mMクエン酸ナトリウム、pH6.0中で基質と 共に希釈した酵素をインキュベートすることにより、測定した。 シクロデキストリン形成活性を、基質として５％ Paselli^TM（即ちAVEBE，Fox hol，The Netherlandsから利用できる50の平均重合度の部分的に加水分解された ポテトデンプン）を用いて測定した。形成されたα−シクロデキストリンをメチ ルオレンジで測定し、形成されたβ−シクロデキストリンをフェノールフタレイ ンで測定し、そして形成されたγ−シクロデキストリンをブロモクレゾールグリ ーンで測定した。その活性をmg当りの単位で表す（Ｕ／mg）。酵素活性の１単位 を分当りに特定のシクロデキストリンの１μmolを生産することができる酵素の 量として定義する。 シクロデキストリン形成を、慣用的な工業生産工程条件下でも測定した。プレ クックした(precooked)pH5.5の0.5mM CaCl₂中のアミロペクチン溶液を、24時間 、85℃で基質のグラム当り50NUのCGTaseと共にインキュベートした。サンプルを HPLCにより分析する前に、規則的にとり、2.5〜３のpHで10分間、沸騰した。 これらの実験の結果を以下の表26〜28で議論し、そこに示す。表28において、 図は、シクロデキストリンの最大の全体のレベルにおける比率である。 オリゴヌクレオチドプライマー 部位特異的変異誘発を始めるために、以下のオリゴヌクレオチド を合成した（番号はCGTaseナンバリングに従う位置を示す）。 Ｂ１：S145A； Ｂ２：E146S； Ｂ３：T147A； Ｂ４：T147L； Ｂ５：D148A； Ｂ６：D89A； Ｂ７：F91aA； Ｂ８：F91a^*； Ｂ９：87−94（ＩＫＹＳＧ−ＶＮＮ）； この変異体は上述の実施例５のＡ２の作製にも用いられる。 Ｂ10：F195Y＋87−94（ＩＫＹＳＧ−ＶＮＮ）； た。開始点としてこの変異体を用いて、87−94（ＩＫＹＳＧ−ＶＮＮ）変異体を プライマーＢ９を用いて導入した。同時に、酵素と基質との間の接触を減少させ るために、F195を195Yにより置換した。 Ｂ11：D196S； Ｂ12：D196A； Ｂ13：D371N； Ｂ14：D371G； Ｂ15：D371A； 結 果 本実施例の変異体は、β−シクロデキストリン形成を増加させるためにデザイ ンした。 実験Ｂ１において、酵素とグルコース単位Ｊとの間の相互作用を減少させるた めに、S145を145Aにより置換した（図１）。β−CD形成及びγ−CD形成の両方の 開始比率は増加した。CD生産アッセイにおいてα−CDの比は減少したが、β−CD 比は増加した。 実験Ｂ２において、酵素とグルコース単位Ｉとの間の相互作用を増加させるた めに、E146を146Sにより置換した（図１）。β−CD形成及びγ−CD形成の開始比 率は減少した。CD生成アッセイにおいて、α−CDの比率は減少した。 実験Ｂ３において、酵素とグルコース単位Ｊとの間の相互作用を減少させるた めに、T147を147Aにより置換した（図１）。CD生産アッセイにおいてα−CDの比 は減少したが、β−CD比は増加した。 実験Ｂ４において、酵素とグルコース単位Ｊとの間の相互作用を減少させるた めに、T147を147Lにより置換した（図１）。CD生産アッセイにおいて、α−CDの 比率は減少したが、β−CD比率は増加した。 実験Ｂ５において、酵素とグルコース単位Ｊとの間の相互作用を 減少させるために、D148を148Aにより置換した（図１）。CD生産アッセイにおい て、α−CDの比率は減少したが、β−CD比率は増加した。 実験Ｂ６において、酵素とグルコース単位Ｆとの間の相互作用を減少させるた めに、Ｄ89を89Ａにより置換した（図１）。β−CD形成及びγ−CD形成の開始比 率が減少した。 実験Ｂ７において、酵素とグルコース単位Ｆとの間の相互作用を減少させるた めに、Y91Aを91aAにより置換した（図１）。β−CD形成及びγ−CD形成の開始比 率が減少した。 実験Ｂ８において、酵素とグルコース単位Ｆとの間の相互作用を減少させるた めに、Y91aをY91a^*（欠失）により置換した（図１）。β−CD形成の開始比率が 減少した。 実験Ｂ９において、酵素とグルコース単位Ｅとの間の接触を増加させるために 、位置87〜94を（ＩＫＹＳＧ^* ＶＮＮ）により置換した（図１）。 F195Y変異を導入した。開始点としてこの変異体を用いて、87−94（ＩＫＹＳＧ −ＶＮＮ）変異をプライマーＢ９を用いて導入した。同時に、酵素と基質との間 の接触を減少させるために、F195をI95Yにより置換した。 実験Ｂ11において、酵素とグルコース単位Ｅとグルコース単位Ｆとの間の相互 作用を減少させるために、D196を196Sにより置換した。 実験Ｂ12において、酵素とグルコース単位Ｅとグルコース単位Ｆとの間の相互 作用を減少させるために、D196を196Aにより置換した。 実験Ｂ13において、酵素とグルコース単位Ｅとグルコース単位Ｆ との間の相互作用を増加させるために、D371を371Nにより置換した。 実験Ｂ14において、酵素とグルコース単位Ｅとグルコース単位Ｆとの間の相互 作用を減少させるために、D371を371Gにより置換した。 実験Ｂ15において、酵素とグルコース単位Ｅとグルコース単位Ｆとの間の相互 作用を減少させるために、D371を371Aにより置換した。 実施例７ サーモアナエロバクターからのβ−シクロデキストリン生成性CGTase変異体の 作製 本実施例は、部位特異的変異誘発が活性クレフトのサブ部位における水素結合 の数を変化させ、又は基質結合クレフトの部分において立体障害を導く９のβ− シクロデキストリン生成性CGTase変異体（Ｃ１〜Ｃ９）の作製を記載する。 その変異体は、WO89/03421に従って得られたサーモアナエロバクター種CGTase から得られ、配列番号：１〜２（即ち野生型酵素）として供されるヌクレオチド 及びアミノ酸配列を有する。 去（Unigue Site Elimination（USE））に基づく方法により変異体を導入した。 CGTase遺伝子と反対のプロスミドにおける特有の制限 ヌクレオチドを用いることにより除去した。このオリゴヌクレオチドにおいて“ Ｐ”は、その手順に必要な５’リン酸化を示す。各々の変異について、特定のオ リゴヌクレオチドを開発した。その変異体を、可能な限り制限分析により、及び 配列決定により確認した。変異タンパク質を、大腸菌MC1061[Meissner P S，Sis k W P，Berman M L；Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 1987（84）4171-4175]におい て発現させた。タンパク質を、アフィニティークロマトグラフィー(AfC)を用い て培地から精製した。 酵素アッセイ 酵素活性を、Phadebasアミラーゼテスト(Pharmacia)の少し改良した手順によ り測定した。Phadebas錠剤（Phadebas^TM Amylase Tes e，Pharmacia）を基質として用いる。この基質は、ウシ血清アルブミン及び緩衝 物質と混合した架橋された不溶性青色デンプンポリマーである。水に懸濁した後 、デンプンを酵素により加水分解して青色フラグメントを生成した。60℃，pH6. 2での0.15mMカルシウム中での15分のインキュベーションの後に測定を行う。620 nmで測定した生じた青色溶液の吸光度は酵素活性に相当する。 その酵素活性を酵素標準のそれと比較し、その活性を酵素標準のそれと同じ単 位で表現する。酵素標準をTermamyl^TM(Novo Nordisk A/D，Denmark)とした。そ のデンプン分解活性は、基質としてポテトデンプンを用いて測定されている。こ の方法は、酵素により修飾されたポテトデンプンの分解に基づき、その反応の後 、デンプン／酵素溶液のサンプルをヨウ素溶液と混合する。有色ガラス標準と比 べて、最初は黒ずんだ青色が形成されたが、デンプンの分解の間、青色が弱くな り、次第に赤茶に変わった。 １キロNOVOαアミラーゼ単位(KNU)を、標準条件(即ち37℃＋／−0.05；0.0003 Ｍ Ca²⁺；及びpH5.6)下で5.26ｇのデンプン乾燥物質Merck Amylum溶解物をデキ ストリン化する（dextrinize）酵素の量として定義する。以下に、活性12ml当り のNOVO単位（NU）で表現する。 CGTase活性を、85℃で４〜10分、10mMクエン酸ナトリウム、pH6.0中で基質と 共に希釈した酵素をインキュベートすることにより、測定した。 シクロデキストリン形成活性を、基質として５％ Paselli^TM（即ちAVEBE，Fox hol，The Netherlandsから利用できる50の平均重合度の部分的に加水分解された ポテトデンプン）を用いて測定した。形成されたα−シクロデキストリンをメチ ルオレンジで測定し、形成されたβ−シクロデキストリンをフェノールフタレイ ンで測定し、 そして形成されたγ−シクロデキストリンをブロモクレゾールグリーンで測定し た。その活性をmg当りの単位で表す（Ｕ／mg）。酵素活性の１単位を分当りに特 定のシクロデキストリンの１μmolを生産することができる酵素の量として定義 する。 シクロデキストリン形成を、慣用的な工業生産工程条件下でも測定した。プレ クックした(precooked)pH5.5の0.5mM CaCl₂中のアミロペクチン溶液を、24時間 、60℃で基質のグラム当り50NUのCGTaseと共にインキュベートした。サンプルを HPLCにより分析する前に、規則的にとり、2.5〜３のpHで10分間、沸騰した。 これらの実験の結果を以下の表29〜31で議論し、そこに示す。表31において、 図は、シクロデキストリンの最大の全体のレベルにおける比率である。 オリゴヌクレオチドプライマー 部位特異的変異誘発を始めるために、以下のオリゴヌクレオチドを合成した（ 番号はCGTaseナンバリングに従う位置を示す）。 Ｃ１：N193A； Ｃ２：146−150（ＳＤＱＰＳ）； Ｃ３：145−148（ＡＥＬＡ）； Ｃ４：145−148（ＡＥＷＡ）； Ｃ５：87−94（ＩＮＹＳＧ^*ＶＮＮ）； Ｃ６：87−94（ＨＰ^*ＳＧＹ^**）； Ｃ７：145−148（ＬＥＴＮ）； Ｃ８：87−94（ＨＰ^*ＳＧＹ^***）＋145−148（ＬＥＴＮ）； Ｃ６及びＣ７としてリストされる両方のプライマーを同時に用いた。 Ｃ９：87−94（ＩＮＹＳＧ^* ＶＮＮ）＋146−150（ＳＤＱＰＳ）； Ｃ２及びＣ５としてリストされた両方のプライマーを同時に用いた。 結 果 本実施例の変異体は、β−シクロデキストリン形成を増加させるためにデザイ ンした。 実験Ｃ１において、酵素とグルコース単位Ｈとの間の相互作用を減少させるた めに、N193を193Aにより置換した。CD生産アッセイにおいてα−CDの比は減少し たが、β−CD比は増加した。 実験Ｃ２において、酵素とグルコース単位Ｊとの間の相互作用を減少させるた め、並びに酵素とグルコース単位Ｉとの間の相互作用を増加させるために、位置 146〜150の領域を（ＳＤＱＰＳ）により置換した。 実験Ｃ３において、酵素とグルコース単位Ｊとの間の相互作用を減少させ、並 びに酵素とグルコース単位Ｉとの間の相互作用を減少させるために、位置145〜1 48の領域を（ＡＥＬＡ）により置換した。 実験Ｃ４において、酵素とグルコース単位Ｊとの間の相互作用を減少させるた め、並びに酵素とグルコース単位Ｉとの間の相互作用を増加させるために、位置 145〜148の領域を（ＡＥＷＡ）により置換した。 実験Ｃ５において、酵素とグルコース単位Ｅ及びグルコース単位Ｆとの間の相 互作用を減少させるために、位置87〜94のループを（ＩＮＹＳＧ^* ＶＮＮ）によ り置換した。 実験Ｃ６において、酵素とグルコース単位Ｅとグルコース単位Ｆとの間の相互 作用を減少させるために、位置87〜94のループを（ＨＰ^*ＳＧＹ^***）により置換 した。 実験Ｃ７において、酵素とグルコース単位Ｊとの間の相互作用を減少させるた め、並びに酵素とグルコース単位Ｉとの間の相互作用を増加させるために、位置 145〜148の領域を（ＬＥＴＮ）により置換した。 実験Ｃ８において、酵素とグルコース単位Ｅとグルコース単位Ｆとの間の相互 作用を減少させるために、位置87〜94のループを（ＨＰ^*ＳＧＹ^***）により置換 した。同時に、酵素とグルコース単位Ｊとの間の相互作用を減少させるため、並 びに酵素とグルコース単位Ｉとの間の相互作用を増加させるために、位置145〜1 48のループを（ＬＥＴＮ）により置換した。 実験Ｃ９において、酵素とグルコース単位Ｅとグルコース単位Ｆとの間の相互 作用を減少させるために位置87〜94のループを（ＩＮＹＳＧ^* ＶＮＮ）により置 換した。同時に、酵素とグルコース単位Ｊとの間の相互作用を減少させるため、 及び酵素とグルコース単位Ｉとの間の相互作用を増加させるために、位置145〜1 48の領域を（ＳＤＱＰＳ）により置換した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/26 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 １２８１／９５ (32)優先日 1995年11月16日 (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 アンデルセン，カールステン デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ (72)発明者 ヴォン デル オステン，クラウス デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．前駆体CGTase酵素の基質結合及び／又は生成物選択性を改良する方法であ って、前記基質に近い位置を保持する前記前駆体酵素の１又は複数のアミノ酸残 基の置換、挿入及び／又は欠失を含むことを特徴とする方法。 ２．前記アミノ酸残基が前記基質から８Å未満の位置を保持することを特徴と する請求項１に記載の方法。 ３．前記アミノ酸残基が前記酵素のドメインＡに位置することを特徴とする請 求項１〜２のいずれかに記載の方法。 ４．前記アミノ酸残基が前記酵素のドメインＢに位置することを特徴とする請 求項１〜２のいずれかに記載の方法。 ５．前記アミノ酸残基が前記酵素のドメインＣに位置することを特徴とする請 求項１〜２のいずれかに記載の方法。 ６．前記アミノ酸残基が前記酵素のドメインＥに位置することを特徴とする請 求項１〜２のいずれかに記載の方法。 ７．前記基質に近い位置を保持するアミノ酸残基が表２に列記される位置に相 当するアミノ酸残基であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方 法。 ８．前記アミノ酸残基がより多くの分子内相互作用と共に１又は複数のアミノ 酸残基を導入することにより置換されることを特徴とする請求項１〜７のいずれ かに記載の方法。 ９．前記アミノ酸残基がより少い分子内相互作用と共に１又は複数のアミノ酸 残基を導入することにより置換されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか に記載の方法。 10．前記CGTaseが、バチルス（Bacillus）の株、ブレビバクテリウム（Brevib acterium ）の株、クロストリジウム(Clostridium)の 株、コリネバクテリウム(Corynebacterium)の株、クレブシエラ（Klebsiella） の株、マイクロコッカス(Micrococcus)の株、サーモアナエロビウム（Thermoana erobium ）の株、サーモアナエロバクテリウム(Thermoanaerobacterium)の株、サ ーモアナエロバクター（Thermoanaerobacter）の株、又はサーモアクチノマイセ ス(Thermoactinomyces)の株から得られることを特徴とする請求項１〜９のいず れかに記載の方法。 11．前記CGTaseが、バチルス・アウトリチクス（Bacillus autolyticus）の株 、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)の株、バチルス・サーキュランス（Bac illus circulans ）の株、バチルス・サーキュランス変種アルカロフィルス（alk alophilus ）の株、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）の株、バ チルス・フィルムス(Bacillus firmus)の株、バチルス・ハロフィルス(Bacillus halophilus )の株、バチルス・マセランス（Bacillus macerans）の株、バチル ス・メガテリウム(Bacillus megaterium)の株、バチルス・オーベンシス(Bacill us ohbensis )の株、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermo philus )の株、又はバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)の株から得られる ことを特徴とする請求項10に記載の方法。 12．前記CGTaseがバチルス種株1011の株、バチルス種株38−２の株、バチルス 種株17−１の株、バチルス種１−１の株、バチルス種株Ｂ1018の株、バチルス・ サーキュランス株８の株もしくはバチルス・サーキュランス株251の株、又はそ れらの突然変異体もしくは変異体から得られることを特徴とする請求項10に記載 の方法。 13．前記CGTaseが、クレブシエラ・ネウモニア（Klebsiella pneumonia）の株 、サーモアナエロバクター・エタノリクス（Thermoanaerobacter ethanolicus） の株、サーモアナエロバクター・フィン ニ（Thermoanaerobacter finni）の株、クロストリジウム・サーモアミロリチク ム（Clostridium thermoamylolyticum）の株、クロストリジウム・サーモサッカ ロリチクム(Clostridium thermosaccharolyticum)の株、又はサーモアナエロバ クテリウム・サーモスルフリゲネス（Thermoanaerobacterium thermosulfurigen es ）の株から得られることを特徴とする請求項10に記載の方法。 14．前記CGTaseがバチルス・サーキュランス株251の株から得られることを特 徴とする請求項10に記載の方法。 15．前記CGTaseがサーモアナエロバクター種ATCC 53627の株から得られること を特徴とする請求項10に記載の方法。 16．基質に近い位置を保持する１又は複数のアミノ酸残基の置換、挿入及び／ 又は欠失により前駆体CGTase酵素から得られるCGTase変異体。 17．前記基質から８Å未満の位置を保持する１又は複数のアミノ酸残基が置換 、挿入及び／又は欠失されていることを特徴とする請求項16に記載のCGTase変異 体。 18．前記酵素のドメインＡに位置した１又は複数のアミノ酸残基が置換、挿入 及び／又は欠失されていることを特徴とする請求項16〜17のいずれかに記載のCG Tase変異体。 19．前記酵素のドメインＢに位置した１又は複数のアミノ酸残基が置換、挿入 及び／又は欠失されていることを特徴とする請求項16〜17のいずれかに記載のCG Tase変異体。 20．前記酵素のドメインＣに位置した１又は複数のアミノ酸残基が置換、挿入 及び／又は欠失されていることを特徴とする請求項16〜17のいずれかに記載のCG Tase変異体。 21．前記酵素のドメインＥに位置した１又は複数のアミノ酸残基が置換、挿入 及び／又は欠失されていることを特徴とする請求項16 〜17のいずれかに記載のCGTase変異体。 22．１又は複数のアミノ酸残基がより多くの水素結合ポテンシャルと共にアミ ノ酸により置換されていることを特徴とする請求項16〜21のいずれかに記載のCG Tase変異体。 23．１又は複数のアミノ酸残基がより少い水素結合ポテンシャルと共にアミノ 酸により置換されていることを特徴とする請求項16〜21のいずれかに記載のCGTa se変異体。 24．バチルス（Bacillus）の株、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）の株 、クロストリジウム(Clostridium)の株、コリネバクテリウム(Corynebacterium) の株、クレブシエラ（Klebsiella）の株、マイクロコッカス(Micrococcus)の株 、サーモアナエロビウム（Thermoanaerobium）の株、サーモアナエロバクテリウ ム(Thermoanaerobacterium)の株、サーモアナエロバクター（Thermoanaerobacte r ）の株、又はサーモアクチノマイセス(Thermoactinomyces)の株から得られるこ とを特徴とする請求項16〜23のいずれかに記載のCGTase変異体。 25．バチルス・アウトリチクス（Bacillus autolyticus）の株、バチルス・セ レウス(Bacillus cereus)の株、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulan s ）の株、バチルス・サーキュランス変種アルカロフィルス（alkalophilus）の 株、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）の株、バチルス・フィル ムス(Bacillus firmus)の株、バチルス・ハロフィルス（Bacillus halophilus） の株、バチルス・マセランス(Bacillus macerans)の株、バチルス・メガテリウ ム(Bacillus megaterium)の株、バチルス・オーベンシス(Bacillus ohbensis)の 株、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)の株、 又はバチルス・サブチリス(Bacil1us subtilis)の株から得られることを特徴と する請求項 24に記載のCGTase変異体。 26．バチルス種株1011の株、バチルス種株38−２の株、バチルス種株17−１の 株、バチルス種１−１の株、バチルス種株Ｂ1018の株、バチルス・サーキュラン ス株８の株もしくはバチルス・サーキュランス株251の株、又はそれらの突然変 異体もしくは変異体から得られることを特徴とする請求項24に記載のCGTase変異 体。 27．バチルス・サーキュランス株251の株から得られることを特徴とする請求 項24に記載のCGTase変異体。 28．クレブシエラ・ネウモニア（Klebsiella pneumonia）の株、サーモアナエ ロバクター・エタノリクス（Thermoanaerobacter ethanolicus）の株、サーモア ナエロバクター・フィンニ（Thermoanaerobacter finni）の株、クロストリジウ ム・サーモアミロリチクム（Clostridium thermoamylolyticum）の株、クロスト リジウム・サーモサッカロリチクム(Clostridium thermosaccharolyticum)の株 、又はサーモアナエロバクテリウム・サーモスルフリゲネス（Thermoanaerobact erium thermosulfurigenes ）の株から得られることを特徴とする請求項24に記載 のCGTase変異体。 29．サーモアナエロバクター種ATCC 53627の株から得られることを特徴とする 請求項24に記載のCGTase変異体。 30．表２に列記される位置に相当する１又は複数のアミノ酸残基が置換、挿入 及び／又は欠失されていることを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCG Tase変異体。 31．表９に列記される位置に相当する１又は複数のアミノ酸残基が該表に示す 通り置換、挿入及び／又は欠失されていることを特徴とする請求項16〜29のいず れかに記載のCGTase変異体。 32．表10に列記される位置に相当する１又は複数のアミノ酸残基が該表に示す 通り置換、挿入及び／又は欠失されていることを特徴 とする請求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 33．表３〜５に列記される位置に相当する１又は複数のアミノ酸残基が置換、 挿入及び／又は欠失されていることを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載 のCGTase変異体。 34．表11に列記される位置に相当する１又は複数のアミノ酸残基が該表に示す 通り置換、挿入及び／又は欠失されていることを特徴とする請求項16〜29のいず れかに記載のCGTase変異体。 35．表12に列記される位置に相当する１又は複数のアミノ酸残基が該表に示す 通り置換、挿入及び／又は欠失されていることを特徴とする請求項16〜29のいず れかに記載のCGTase変異体。 36．バチルスの株から得られることを特徴とする請求項33〜35のいずれかに記 載のCGTase変異体。 37．バチルス・アウトリチクス（Bacillus autolyticus）の株、バチルス・セ レウス(Bacillus cereus)の株、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulan s ）の株、バチルス・サーキュランス変種アルカロフィルス（alkalophilus）の 株、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）の株、バチルス・フィル ムス(Bacillus firmus)の株、バチルス・ハロフィルス（Bacillus halophilus） の株、バチルス・マセランス(Bacillus macerans)の株、バチルス・メガテリウ ム(Bacillus megaterium)の株、バチルス・オーベンシス(Bacillus ohbensis)の 株、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)の株、 バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)、バチルス種株1011の株、バチルス 種株38−２の株、バチルス種株17−１の株、バチルス種１−１の株、バチルス種 株Ｂ1018の株、バチルス・サーキュランス株８の株もしくはバチルス・サーキュ ランス株251の株、又はそれらの突然変異体もしくは変異体から得られることを 特徴とする請求項36に記載のCGTase変 異体。 38．バチルス・サーキュランス株251の株又はその突然変異体もしくは変異体 から得られることを特徴とする請求項36に記載のCGTase変異体。 39．表６〜８に列記される位置に相当する１又は複数のアミノ酸残基が置換、 挿入及び／又は欠失されていることを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載 のCGTase変異体。 40．表13に列記される位置に相当する１又は複数のアミノ酸残基が置換、挿入 及び／又は欠失されていることを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCG Tase変異体。 41．表14に列記される位置に相当する１又は複数のアミノ酸残基が置換、挿入 及び／又は欠失されていることを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCG Tase変異体。 42．サーモアナエロバクターの株から得られることを特徴とすることを特徴と する請求項39〜41のいずれかに記載のCGTase変異体。 43．サーモアナエロバクター種ATCC 53627の株又はその突然変異体もしくは変 異体から得られることを特徴とする請求項41に記載のCGTase変異体。 44．位置21においてフェニルアラニン残基（X21F）又はチロシン残基（X21Y） を保持することを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 45．位置47においてグルタミン残基（X47Q）、アラニン残基（X47A）、ロイシ ン残基（X47L）、ヒスチジン残基（X47H）、又はアルギニン残基（X47R）を保持 することを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 46．位置88においてプロリン残基（X88P）又はリシン残基（X88K）を保持する ことを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCG Tase変異体。 47．位置89においてアスパラギン酸残基（X89D）、アラニン残基（X89A）、又 はグリシン残基（X89G）を保持することを特徴とする請求項16〜29のいずれかに 記載のCGTase変異体。 48．位置91ａ（例えば挿入によるもの）においてアラニン残基(X91aA又は^*91a A)もしくはチロシン残基(X91aY又は^*91aY)を保持するか、又は位置91ａが削除（ X91a^*）されていることを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変 異体。 49．位置92が削除(X91^*)されていることを特徴とする請求項16〜29のいずれか に記載のCGTase変異体。 50．位置94においてグルタミン残基（X94Q）、リシン残基（X94K）、アルギニ ン残基（X94R）、トリプトファン残基（X94W）、もしくはフェニルアラニン残基 （X94F）を保持するか、又は位置94が削除(X94^*)されていることを特徴とする請 求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 51．位置135においてロイシン残基(X135L)を保持することを特徴とする請求項 16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 52．位置143においてアラニン残基(X143A)又はグリシン残基(X143G)を保持す ることを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 53．位置144においてアルギニン残基(X144R)、リシン残基(X144K）、又はアス パラギン酸残基(X144D)を保持することを特徴とする請求項16〜29のいずれかに 記載のCGTase変異体。 54．位置145においてアラニン残基(X145A)、グルタミン酸残基(X145E)、トリ プトファン残基(X145W)、グリシン残基(X145G)、フェニルアラニン残基(X145F) 、チロシン残基(X145Y)、ロイシン残基(X145L)、又はプロリン残基(X145P)を保 持することを特徴と する請求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 55．位置145a（例えば挿入によるもの）においてイソロイシン残基(X145aI又 は^*145aI)を保持することを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCGTase 変異体。 56．位置146においてプロリン残基(X146P)、セリン残基(X146S)、イソロイシ ン残基(X146I)、グルタミン残基(X146Q)、トリプトファン残基(X146W)、アルギ ニン残基(X146R)、又はグルタミン酸残基(X146E)を保持することを特徴とする請 求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 57．位置147においてイソロイシン残基(X147I)、ロイシン残基(X147L)、アラ ニン残基(X147A)、セリン残基(X147S)、又はトリプトファン残基(X147W)を保持 することを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 58．位置147a（例えば挿入によるもの）においてアラニン残基(X147aA又は^*14 7aA)を保持することを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体 。 59．位置148においてアラニン残基(X148A)、グリシン残基(X148G)、グルタミ ン酸残基(X148E)、又はアスパラギン残基(X148N)を保持することを特徴とする請 求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 60．位置149においてイソロイシン残基(X149I)を保持することを特徴とする請 求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 61．位置167においてフェニルアラニン残基(X167F)を保持することを特徴とす る請求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 62．位置185においてアルギニン残基(X185R)、グルタミン酸残基(X185E)、又 はアスパラギン酸残基(X185D)を保持することを特徴とする請求項16〜29のいず れかに記載のCGTase変異体。 63．位置186においてアラニン残基(X186A)を保持することを特徴とする請求項 16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 64．位置193においてグリシン残基(X193G)、アラニン残基(X193A）、アスパラ ギン酸残基(X193D)、又はグルタミン酸残基(X193E)を保持することを特徴とする 請求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 65．位置196においてアラニン残基(X196A)又はロイシン残基(X196L)を保持す ることを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 66．位置197においてアスパラギン酸残基(XI97D)又はグルタミン酸残基(X197E )を保持することを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 67．位置232においてグルタミン残基(X232Q)、アスパラギン残基(X232N)、ア ラニン残基(X232A)、又はロイシン残基(X232L)を保持することを特徴とする請求 項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 68．位置233においてグルタミン残基(X233Q)を保持することを特徴とする請求 項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 69．位置259においてフェニルアラニン残基(X259F)を保持することを特徴とす る請求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 70．位置264においてグルタミン残基(X264Q)、アラニン残基(X264A)、アスパ ラギン残基(X264N)、又はロイシン残基(X264L)を保持することを特徴とする請求 項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 71．位置268においてアラニン残基(X268A)を保持することを特徴とする請求項 16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 72．位置371においてグリシン残基(X371G)、アスパラギン残基 (X371N)、アラニン残基(X371A)、ロイシン残基(X371L)、又はグルタミン酸残基( X371E)を保持することを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異 体。 73．位置375においてプロリン残基(X375P)、グリシン残基(X375G)、グルタミ ン残基(X375Q)、アスパラギン残基(X375N)、アラニン残基(X375A)、又はロイシ ン残基(X375L)を保持することを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCGT ase変異体。 74．位置599a（例えば挿入になるもの）において、プロリン残基(X599aP又は^* 599aP)、アルギニン残基(X599aR又は^*599aR)、又はヒスチジン残基(X599aH又は^* 599aH)を保持することを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異 体。 75．位置600が異なるアミノ酸残基、特にトリプトファン残基(X600W)、フェニ ルアラニン残基(X600F)、チロシン残基(X600Y)、アルギニン残基(X600R)、プロ リン残基(X600P)、ロイシン残基(X600L)、又はアスパラギン残基(X600N)に置換 されていることを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 76．位置616においてアラニン残基(X616A)を保持することを特徴とする請求項 16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 77．位置633においてアラニン残基(X633A)を保持することを特徴とする請求項 16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 78．位置662においてアラニン残基(X662A)を保持することを特徴とする請求項 16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 79．位置47においてヒスチジン残基又はアルギニン残基を保持し、及び／又は 位置135においてロイシン残基を保持する(X47H／X135L又はX47R／X135L)ことを 特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 80．位置88においてプロリン残基を、位置143においてグリシン 残基を保持する(X88P／X143G)ことを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載 のCGTase変異体。 81．位置89においてアスパラギン酸残基を、位置146においてプロリン残基を 保持する(X84D／X146P)ことを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCGTas e変異体。 82．位置92及び94が削除されている(X92^*／X94^*)ことを特徴とする請求項16〜 29のいずれかに記載のCGTase変異体。 83．位置143においてアラニン残基を、位置144においてアルギニン残基を保持 する(X143A／X144R)ことを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変 異体。 84．位置143においてグリシン残基を、位置144においてアルギニン残基を、そ して位置145においてトリプトファン残基を保持する(X143G／X144R／X145W)こと を特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 85．位置143〜148において部分アミノ酸配列GRA^**A、部分アミノ酸配列GRAAAA 、部分アミノ酸配列GRAPAA、又は部分アミノ酸配列GRGPAAを含むことを特徴とす る請求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 86．位置144においてアルギニン残基を保持し、位置145においてアラニン残基 を、そして位置146においてプロリン残基を保持する(X144R／X145A／X146P)こと を特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 87．位置145においてアラニン残基を、位置145a（例えば挿入によるもの）に おいてイソロイシン残基を保持する(X145A／X145aI又はX145A／^*145aI)ことを特 徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 88．位置145においてアラニン残基を、位置146においてグリシ ン残基を保持する(X145A／X146G)ことを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記 載のCGTase変異体。 89．位置145においてロイシン残基を、位置148においてアスパラギン残基を保 持する(X145L／X148N)ことを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCGTase 変異体。 90．位置145においてグルタミン酸残基を、位置146においてプロリン残基又は グルタミン残基を保持する(X145E／146P又はX145E／X146Q)ことを特徴とする請 求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 91．位置145においてトリプトファン残基を、位置146においてトリプトファン 残基、イソロイシン残基、又はアルギニン残基を保持する(X145W／X146W，X145W /X146I又はX145W／X146R)ことを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCGT ase変異体。 92．位置145においてアラニン残基を、位置145a（例えば挿入によるもの）に おいてイソロイシン残基を、そして位置148においてグルタミン酸残基を保持す る(X145A／X145aI／X148E又はX145A／^*145aI／X148E)ことを特徴とする請求項16 〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 93．位置145a（例えば挿入によるもの）においてイソロイシン残基を、位置14 8においてグルタミン酸残基を保持する(X145aI／X148E又は^*145aI／X148E)こと を特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 94．位置616においてアラニン残基を、位置662においてアラニン残基を保持す る(X616A／X662A)ことを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異 体。 95．位置87〜94において部分アミノ酸配列IKYSGVNNを、及び／又は位置143〜1 51において部分アミノ酸配列GRAGTNPGFを、又は位 置143〜145おいて部分アミノ酸配列GRWを含むことを特徴とする請求項16〜29の いずれかに記載のCGTase変異体。 96．位置87〜94において部分アミノ酸配列HP^* SGY^**を、及び／又は位置143〜 151において部分アミノ酸配列PALETNPNFを、又は位置143〜151において部分アミ ノ酸配列PAAETWPAFを含むことを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCGT ase変異体。 97．位置87〜94において部分アミノ酸配列HP^* SGY^**を、及び／又は位置143〜 151において部分アミノ酸配列PALETNPNFを、又は位置143〜151において部分アミ ノ酸配列PAAETWPAFを含み、位置195においてロイシン残基(X195L)を保持するこ とを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 98．位置87〜94において部分アミノ酸配列HP^* SGY^**を、及び／又は位置143〜 151において部分アミノ酸配列PALETNPNFを、又は位置143〜151において部分アミ ノ酸配列PAAEADPNFを含むことを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCGT ase変異体。 99．位置87〜94において部分アミノ酸配列HP^* SGY^**を、及び／又は位置143〜 151において部分アミノ酸配列PALETNPNFを、又は位置143〜151において部分アミ ノ酸配列PAAEADPNFを含み、そして位置195がロイシン残基(X195W)を保持するこ とを特徴とする請求項16〜29のいずれかに記載のCGTase変異体。 100．バチルス・アウトリチクス（Bacillus autolyticus）の株、バチルス・ セレウス(Bacillus cereus)の株、バチルス・サーキュランス（Bacillus circul ans ）の株、バチルス・サーキュランス変種アルカロフィルス（alkalophilus） の株、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）の株、バチルス・フィ ルムス（Bacillus firmus)の株、バチルス・ハロフィルス(Bacillus halophilus )の株、バチルス・マセランス(Bacillus macerans)の株、バチルス ・メガテリウム(Bacillus megaterium)の株、バチルス・オーベンシス(Bacillus ohbensis )の株、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermoph ilus )の株、又はバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)の株から得られるこ とを特徴とする請求項44〜99のいずれかに記載のCGTase変異体。 101．バチルス種株1011の株、バチルス種株38−２の株、バチルス種株17−１ の株、バチルス種１−１の株、バチルス種株Ｂ1018の株、バチルス・サーキュラ ンス株８の株もしくはバチルス・サーキュランス株251の株、又はそれらの突然 変異体もしくは変異体から得られることを特徴とする請求項44〜99のいずれかに 記載のCGTase変異体。 102．サーモアナエロバクター種の株から得られることを特徴とする請求項44 〜99のいずれかに記載のCGTase変異体。 103．サーモアナエロバクター種ATCC53627又はその突然変異体もしくは変異体 から得られることを特徴とする請求項44〜99のいずれかに記載のCGTase変異体。 104．請求項16〜103のいずれかに記載のCGTase変異体をコードするDNA構成物 。 105．実施例３〜７においてプライマーとして記載される一又は複数の部分オ リゴヌクレオチド配列を含む請求項104に記載のDNA構成物。 106．請求項104〜105のいずれかに記載のDNA構成物を含む組換え発現ベクター 。 107．請求項104〜105のいずれかに記載のDNA構成物又は請求項106に記載の組 換え発現ベクターを含む宿主細胞。 108．請求項16〜103のいずれかに記載のCGTase変異体を生産する方法であって 、該CGTase変異体の生産を許容する条件下で請求項10 7に記載の細胞を培養し、そしてその培養物から酵素を回収することを含むこと を特徴とする方法。 109．シクロデキストリンの製造工程における請求項16〜103のいずれかに記載 のCGTase変異体の使用。 110．α−，β−及びγ−シクロデキストリン、又はそれらの混合物の製造工 程におけるCGTase変異体の請求項109に記載の使用。 111．δ，ε−、及びζ−シクロデキストリン、又はそれらの混合物の製造工 程におけるCGTase変異体の請求項109に記載の使用。 112．直鎖オリゴサッカリドの製造工程における請求項16〜98のいずれかに記 載のCGTase変異体の使用。 113．シクロデキストリンのイン・シトウ形成（in situ generation）のため の方法における請求項16〜98のいずれかに記載のCGTase変異体の使用。 114．焼かれるもの(baked product)の製造工程におけるCGTase変異体の請求項 113に記載の使用。 115．製造の間、化学製品を安定化するための方法におけるCGTase変異体の請 求項13に記載の使用。 116．直鎖オリゴサッカリドのイン・シトウ生成（in situ generation）のた めの方法における請求項16〜98のいずれかに記載のCGTase変異体の使用。