JPH1010128A

JPH1010128A - 排泄物検体中のｈ．ピロリ菌のイムノアッセイ

Info

Publication number: JPH1010128A
Application number: JP9062637A
Authority: JP
Inventors: Christopher Vance Larka; ヴァンスラーカクリストファー; Ching Sui Arthur Yi; スイアーサーイーチン; Kenneth James Kozak; ジェームズコザックケニス
Original assignee: Meridian Diagnostics Inc
Current assignee: Meridian Bioscience Inc
Priority date: 1996-05-09
Filing date: 1997-03-17
Publication date: 1998-01-16
Anticipated expiration: 2017-03-17
Also published as: US5871942A; AU698513B2; EP0806667B2; CN1165299A; CA2198336A1; CN1271408C; MX9701877A; DE69709434T2; AR006016A1; CA2198336C; AU1502997A; DE69709434D1; US5716791A; USRE38088E1; GR990300022T1; ES2132044T3; DE69709434T3; EP0806667B1; ES2132044T1; ES2132044T5

Abstract

(57)【要約】【課題】排泄物検体中のヘリコバクターピロリ（Heli
cobacter pylori)を検出する方法を提供する。【解決手段】下記(a) 〜(e) の工程を有する、排泄物
検体中のH.ピロリ菌の検出方法： (a) H.ピロリ菌を含むと考えられる排泄物検体を検体希
釈液に懸濁する工程； (b) 希釈液中の排泄物検体をH.ピロリ菌抗原に対する第
１ポリクローナル抗体に接触させて、該抗体と抗原の複
合体を形成する工程； (c) 前記排泄物検体と前記複合体を分離する工程； (d) 該複合体を、前記抗原に対する第２ポリクローナル
抗体、及び該複合体と反応する抗体の一部に曝す工程、
なお、第１及び第２ポリクローナル抗体の何れか一方が
固形担体と結合し、かつ他方が検出剤でラベルされてい
る；及び (e) ラベルされた抗体の量を測定し、かつ次いで、前記
排泄物検体におけるH.ピロリ菌抗原の存在を検出する工
程。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、排泄物検体中のヘリコ
バクターピロリ（Helicobacter pylori)を検出する方法
に関するものである。

【０００２】

【従来技術】H.ピロリ菌は、消化性潰瘍、胃炎及び他の
疾患のような胃十二指腸疾患に罹った人の上部胃腸系に
見出される細菌である。この細菌はもともとカンピロバ
クター (Campylobacter)に分類されていたが、その後、
微細構造及び脂肪酸組成に関するさらに詳細な情報に基
づき、ヘリオバクター(Heliobacter) に再分類された。
侵入型及び非侵入型双方の多くの異なる技術がH.ピロリ
菌を検出するために用いられてきた。この侵入型技術に
は胃部生検及び培養がある。該非侵入型技術には尿素呼
吸試験があり、この試験では、患者にＣ₁₃又はＣ₁₄でラ
ベルした尿素を飲物とともに与え、酵素結合抗体法(ELI
SA) において、抗原を用い、血清中のH.ピロリ菌抗体を
検出する。後の技術の例は、Aleonohammadに付与された
米国特許第5,262,156 号及びBlaserの欧州特許出願第0,
329,570 号に見られる。数種の主要抗原が特定され、か
つH.ピロリ菌抗体を検出するイムノアッセイに用いられ
てきた。しかし、これらのアッセイでは、血清学的診断
において望まれる特異性と感受性を示していなかった(N
ewell, D.G.,らの論文、Serodian. Immunother. Infec.
Dis.,,3:1-6頁 (1989年) ）。これらのイムノアッセイ
に関する問題の一つに交差反応がある。H.ピロリ菌にお
ける優性抗原の研究、特に、分子量60Daを有する推定鞭
毛タンパク質の研究により、これらの抗原の幾つかはH.
ピロリ菌に特異的なものではなく、C.ジェウニ(C.jeun
i) 及びC.コリ(C.coli)のような他の細菌にも見られる
ことが見出された。H.ピロリ菌に対するイムノアッセイ
を設計する際に直面している第二の問題は、菌株の変異
である。抗原における実質的な相違がH.ピロリ菌の異な
る菌株で観察されている。これらの問題が単一の抗原を
用いるアッセイの設計を阻んでいる。また、これらがモ
ノクローナル抗体の使用を阻んでいる。H.ピロリ菌に対
する抗体イムノアッセイの特異性及び感受性の改善を行
おうとする試みとして、ある種の抗原フラグメントに富
む、異なるH.ピロリ菌株のから得られた抗原の混合物を
使用することがある。血清中のH.ピロリ菌抗体を検出す
る、ＥＬＩＳＡがメリジアンジアグノスチクス (Meridi
an Diagnostics) から市販されている。このアッセイは
細菌全細胞溶解物を抗原として用いるものである。

【０００３】H.ピロリ菌の抗体を検出するために、複数
の抗原を使用するＥＬＩＳＡにはある種の不都合があ
る。特にヒト血清における抗体力価は、感染症を治療し
た後も長期間（若干の場合、６カ月に渡る。）高く維持
される。その結果、このＥＬＩＳＡを用いた陽性試験
は、患者が現在感染していること、及びH.ピロリ菌感染
の治療を必要としていることを必ずしも意味するもので
はない。陽性ＥＬＩＳＡになった場合、治療を行う医師
は、しばしば胃部生検を指示し、抗生物質治療を行う前
に細菌の存在を確認する。このため抗原に基づくＥＬＩ
ＳＡを行っても、侵入性処置の必要性はなくならない。
これに対し、イムノアッセイを抗体の代わりにH.ピロリ
菌抗原を検出するように設計することができれば、胃部
生検により感染を確認する必要をかなり減らすことがで
きる。その理由は、一般に該抗原が治療から数日以内に
患者から検出できなくなるからである。したがって、H.
ピロリ菌抗原を検出するＥＬＩＳＡが必要であり、さら
に、排泄物検体から直接H.ピロリ菌を検出できるＥＬＩ
ＳＡが必要である。

【０００４】排泄物検体からC.デフィシレ(C.difficil
e) 及びアデノイドウイルスのような微生物を検出する
ＥＬＩＳＡは公知であるが、H.ピロリ菌に陽性を示す胃
部生検を行った患者の研究においては、本来、該細菌を
培養したり、排泄物検体から分離することはできなかっ
た。この問題、並びに交差反応及び菌株変異の問題は、
排泄物検体から直接H.ピロリ菌抗原を信頼できるように
検出することができる程十分に、H.ピロリ菌に特異的で
あり、かつ感度があるＥＬＩＳＡを設計できるかという
重大な疑問を提起した。

【０００５】［発明の詳細な説明］

【発明が解決しようとする課題】本発明は、排泄物検体
中のH.ピロリ菌を検出する方法を提供することを目的に
する。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、下記工程を有
する、排泄物検体中のH.ピロリ菌の検出方法を提供す
る： (a) H.ピロリ菌を含むと考えられる排泄物検体を検体希
釈液に懸濁する工程； (b) 希釈液中の排泄物検体をH.ピロリ菌抗原に対する第
１ポリクローナル抗体に接触させて、該抗体と抗原の複
合体を形成する工程； (c) 前記排泄物検体と前記複合体を分離する工程； (d) 該複合体を、前記抗原に対する第２ポリクローナル
抗体、及び該複合体と反応する抗体の一部に曝す工程、
なお、第１及び第２ポリクローナル抗体の何れか一方が
固形担体と結合し、かつ他方が検出剤でラベルされてい
る； (e) ラベルされた抗体の量を測定し、かつ次いで、前記
排泄物検体におけるH.ピロリ菌抗原の存在を検出する工
程である。

【０００７】本発明の好ましい実施態様においては、第
１抗体が担体と結合し、第２抗体が酵素でラベルされて
いる。また、トリプルサンドイッチアッセイを提供す
る。本発明のイムノアッセイは、抗体で被覆されたウェ
ルを有するプレート、検体希釈液、例えば、酵素−抗体
結合体のような、ラベルされた抗体、洗浄緩衝液、及
び、ＥＬＩＳＡの場合は、基質溶液を有する、キットの
形態で提供される。本発明のイムノアッセイではH.ピロ
リ菌に対するポリクローナル抗体を用いる。これらの抗
体は感作された動物の血清から得ることができる。感作
は抗原を抗原産生種、通常、哺乳類動物、好ましくはウ
サギ、山羊及び牛に注射することにより行うことができ
る。通常、最初の注射に続き、追加抗原注射を行い、そ
の応答を最大にする。最適化するために、注射の態様
は、複数の投与量で、白ニュージーランドウサギに対し
て行う。注射する抗原の量は、検出できる十分な量の抗
体を誘導するのに適した量でなければならない。抗体産
生は、試験的な採血及び間接蛍光アッセイを用いて確か
めることができる。

【０００８】ATCC菌株43504 から得たH.ピロリ菌細胞は
ポリクローナル抗体の産生に特に有用であることが見出
された。先に記載したように、実質的な菌株変異がH.ピ
ロリ菌に見られた。微生物における相違が、異なる地理
的領域並びに食餌群で観察された。しかし、菌株43504
から得られた細胞を用いる感作から得られた抗体は、地
理的領域並びに食餌群に渡る微生物検出において有用で
あることが判った。もし必要ならば、例えば、該ＥＬＩ
ＳＡが特定の固体群における微生物の検出において効果
的でないことが見い出されれば、H.ピロリ菌の一種以上
の菌株から得られた細胞を使って抗体を産生することが
できる。公知のイムノアッセイで用いられているのと同
じラベルを本発明で用いるポリクローナル抗体をラベル
するのに使用することができる。これらのラベルについ
て次のものを挙げることができる：米国特許第3,940,47
5 号に記載されている蛍光計量法により検出する蛍光性
ラベル、米国特許第3,654,090 号に記載されている酵素
マーカー、ヨウ素125 のような放射性同位体である。最
も普通に用いられている酵素マーカーの一つにホースラ
ディッシュペルオキシダーゼ(HRP) 及びアルカリホスフ
ァターゼ酵素がある。後述する実施例３はHRP を用いて
ポリクローナル抗体をラベルすることについて説明して
いる。

【０００９】本発明の方法で用いられる非ラベルポリク
ローナル抗体はテストされる排泄物検体から抗原性物質
を引き出すものであって、イムノアッセイで普通に用い
られているいずれかの支持体に固定することができる。
使用することができるものを挙げると、濾紙、プラスチ
ックビーズ、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピ
レン、又は他の適当なテストチューブがある。このよう
な材料に抗体を結合させる技術は当業者にとり周知であ
る。該アッセイにおいて用いる排泄物検体を調製するた
めに、該検体をタンパク質ベース検体希釈液に懸濁す
る。該検体希釈液は交差反応を最小にするよう配合し、
かつ緩衝する。検体希釈液の例を挙げると、胎児牛血
清、標準山羊血清、モルモット血清、馬血清、カゼイ
ン、アルブミン、ゼラチン及び牛血清アルブミン(BSA)
などがある。排泄物検体１部と希釈液４部とを希釈する
ことが有用であることを見出した。タンパク質ベース添
加剤を用いることに加えて、洗剤の添加、及びpH又は希
釈緩衝液のイオン強度を上げ又は下げることにより、交
差反応を減らすことができる。例えば、多くの検体希釈
液は、Triton X-100及び／又はTween20を0.05〜２％の
濃度範囲で含んでいる。NaClを０〜2.9 ％の濃度で加
え、緩衝液系のイオン強度を変えることができる。これ
らの変更は、形成から弱い又は非特異的な相互作用の蓋
然性を低下させて、より高い特異性をもたらす。また、
抗体の溶液及びアッセイで用いる洗浄液の配合におい
て、交差反応性に対処することができる。該抗体を前記
タンパク質血清の一種とともに、緩衝液に加えることが
できる。該アッセイで用いる洗浄液は、塩及び界面活性
剤を加えて配合し、かつ緩衝することにより交差反応性
をコントロールすることができる。交差反応性を低下さ
せるのに好ましい洗浄液に、リン酸緩衝生理食塩水溶液
がある。

【００１０】

【実施例】

〔実施例１〕ヘリコバクターピロリ（H.ピロリ菌）抗原の調製分離を行うために、５％脱繊維素羊血を補ったトリプテ
ックソイ寒天(TrypticSoy Agar, TSA)上にピロリ菌（AT
CC菌株43504 ）を、すじ状に植えつけた。該プレートを
37℃の微好気性環境中に６〜７日間インキュベートし
た。得られた細菌生育部を、コロニー形態、ウレアー
ゼ、カタラーゼ及びオキシダーゼ反応、並びにグラム染
色を用いて評価した。許容できる生育部を羊血寒天プレ
ートを用いて４個のTSA に対し植継ぎ培養し、37℃の微
好気性環境中に３〜４日間生育させた。各プレートに0.
85％NaCl溶液５mlを注ぎ、細菌生育部をプレートスプレ
ッダーで集めた。該細菌を２〜８℃で15分間、10,000xg
で遠心分離した。各ペレットを0.85％NaCl溶液３mlに再
懸濁し、一つの遠心分離容器にまとめた。該細菌懸濁液
を２〜８℃で15分間、10,000xgで遠心分離した。このペ
レットを再懸濁し、先と同じように遠心分離した。最終
的なペレットを、20mMリン酸緩衝液にもとの総容量の３
％となるように再懸濁した。該細菌細胞を氷冷した容器
に移し、泡立たない範囲の最大価で３分間、５回音波処
理した。各処理サイクルの間に30秒ずつ休止させた。音
波処理した細菌細胞を２〜８℃で15分間、57,000xgで遠
心分離した。この細菌上清を集め、かつ該ペレットを捨
てた。

【００１１】〔実施例２〕ウサギポリクローナル抗体の調製実施例１で得た細菌上清を等量のフロイント完全アジュ
バンド（総免疫原1.0ml ）で希釈し、１×10⁸細胞／ml
とした。この溶液を完全に混合し、該溶液0.2〜0.5ml
を右後ろ足に筋肉注射し、かつ該溶液0.1 〜0.25mlを背
中の８〜10部位に皮下注射した。続く注射は、フロイン
ト不完全アジュバンドを用い、１月後に行い、注射する
部位は、背中の皮下に限定した。３月後に試験的な採血
を行った。この採血は、３回目の注射の１週間後に、中
耳静脈から行った。この採取した血液を２〜８℃で一晩
インキュベートした。次の日、該血液を室温で15分間、
5,000xg で遠心分離した。該上清を集め、ペレットを捨
てた。該上清を間接蛍光アッセイ(IFA) によりテストし
た。スライドグラス上にH.ピロリ菌懸濁液10μl を載
せ、加熱固定することにより、該IFA を行った。該スラ
イドを３％牛血清アルブミン(BSA) を用いて、５分間ブ
ロックし、次いで、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)とTwee
n20 0.5 ％の洗浄液(PBS/TWEEN 洗浄液）で洗浄した。
アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水(PBSA)で
１：10に希釈した試験血液及び通常ウサギ血清（コント
ロール）50μl を加え、湿気のある環境下で30分間イン
キュベートした。PBS/TWEEN 洗浄液で洗浄した後、FITC
（フルオロエスセインイソチオシアナート）と結合し
た山羊−抗ウサギをPBSAで１：10に希釈し、かつ50μl
を各ウェルに加えた。該スライドを暗く湿気のある環境
下で30分間インキュベートした。該スライドを再度洗浄
した。蛍光アッセイ積載媒体及びカバースリップを載
せ、蛍光顕微鏡を用いて調べた。次いで、その血清が蛍
光強度４＋の読みを示すウサギから多量に採血した。

【００１２】各ウサギから50ml採血したこと以外は、こ
の多量の血液を、試験的な採血と同様の方法で各ウサギ
から得た。この血液を、試験的な採血で行ったのと同様
に、インキュベートし、かつ遠心分離した。血清の総容
量を計り、かつ等量のリン酸緩衝生理食塩水(PBS) を加
えた。40％の硫酸アンモニウム沈殿を行って、不必要な
タンパク質を除去し、２〜８℃で24時間インキュベート
した。該混合物を遠心分離チューブに移し、室温で30分
間10,000xgで遠心分離した。得られたペレットをPBS に
再懸濁し、ほぼもとの容量の１／３とした。該懸濁液を
２〜８℃で、その総容量の200 倍の0.0175M リン酸カリ
ウム溶液（pH6.5 ）に対し透析した。透析後、該懸濁液
を室温で20分間10,000xgで遠心分離した。該上清を集
め、かつペレットを捨てた。DEAE（ジエチルアミノエチ
ルセルロース）カラムを室温で、0.0175M リン酸カリウ
ム溶液（pH6.5 ）を用いて平衡にした。該上清をカラム
の上に置き、流出画分を集めた。タンパク質濃度(O
D₂₈₀) を測定し、0.200 以上の全ての画分をプールし
た。このプールされた抗体をＥＬＩＳＡにおいて試験し
た。

【００１３】〔実施例３〕ホースラディシュペルオキシダーゼ結合該結合に、DEAE精製ウサギ抗−H.ピロリ菌抗体を用い
た。該抗体を濃縮、又は10mM重炭酸ナトリウム溶液（pH
9.6 ）を加えることにより、最終的な容量を2.5ml にし
た。PD-10 カラム（Pharmacia ）を10mM重炭酸ナトリウ
ム溶液（pH9.6 ）を用いて平衡にした。該抗体をカラム
に入れ、1.0ml の９画分を採取した。各画分のタンパク
質濃縮物(OD₂₈₀E.O.= 1.4)を採取し、0.200 よりも高い
ものをプールした。分離PD-10 カラムを１mM酢酸ナトリ
ウム・三水和物溶液（pH4.3 ）を用いて平衡にした。使
用するホースラディシュペルオキシダーゼ(HRP) の最
小量は、抗体１mg当たりHRP 1.172mg であった。計算最
小HRP の１〜1/2 倍を計り、脱イオン水1.0ml に加え
た。タンパク質濃度(OD₄₀₃E.O.= 2.275)とし、HRP を脱
イオン水で10mg/ml とした。0.1M m- 過ヨウ素酸ナトリ
ウム溶液を、HRP 4mg 当たり0.2 mlの濃度で加えた。こ
の反応を、穏やかに揺り動かしながら室温で、20分間進
めた。HRP(4mg)１ml当たり2Mエチレングリコール50μl
を加えることにより、該反応を止めた。該HRP を１mM酢
酸ナトリウム・三水和物溶液（pH4.3 ）を用い、PD-10
カラムを通して抽出した。

【００１４】結合率は、抗体１mg当たりHRP 1.172mg で
あった。該抗体を10mM重炭酸ナトリウム溶液（pH9.6 ）
を用いて調節し、かつHRP を１mM酢酸ナトリウム・三水
和物溶液（pH4.3 ）を用いて調節した。これら２成分を
専用フラスコで結合させ、0.2M重炭酸ナトリウム溶液を
用いてpHを調節した（pH9.6 〜9.6 ）。光から保護され
た状態で、該混合物を室温で、85〜95rpm で回転するロ
ーター上で２時間インキュベートした。２時間経過後、
ホウ化水素ナトリウム(4mg/ml)溶液0.1ml を抗体８mg毎
に加えた。この新しい混合物をローター上で４℃で２時
間インキュベートした。該結合体をPBS で平衡にしたPD
-10 カラムを通した。該画分をプールし、約1.0ml に濃
縮した。該濃縮物を、流速10ml/ 時間で、PBS で平衡に
したセフラクリル(Sephracryl)S-200 カラム上に置い
た。2.0ml の画分を集め、抗体とHRP 双方のタンパク質
濃縮を行った。OD₂₈₀とOD₄₀₃.同時にピークを有する画
分をプールし、約１mg/ml に濃縮した。

【００１５】下記実施例４は、いわゆる前進的なアッセ
イを説明したものであって、該アッセイでは支持体に結
合した抗体を、最初に試験される検体に接触させ、抗体
／抗原複合体の形成及び該複合体を既知量のラベルされ
た抗体と接触させることにより、検体から抗原を抽出す
る。しかしながら、当業者はイムノアッセイは、いわゆ
る "同時" 又は "逆" アッセイとしても実施し得ると評
価するであろう。同時アッセイは、固形支持体に結合し
た抗体とラベルされた抗体の双方を同時に試験される検
体に加えるという理由で、単一のインキュベート工程を
含む。インキュベートを完了した後、固形支持体を洗浄
して残留検体と未複合のラベルされた抗体を除去する。
次いで、固形支持体に結びついたラベルされた抗体の存
在を検出する。逆アッセイは、排泄物検体にラベルされ
た抗体の溶液を最初に加え、それに続き支持体と結合し
たラベルされていない抗体を加える工程を含む。第２イ
ンキュベートの後、該支持体を通常の様式で洗浄し、残
留検体と未反応のラベルされた抗体をなくす。

【００１６】〔実施例４〕ＥＬＩＳＡ試験抗原を20μg/mlと2.5 μg/mlの間で連続的にPBS で希釈
した。各希釈液から0.100ml ずつ分け取り、イミュンロ
ン(Immunlon)-II ストリップ(Dynatech)に載せ、カバー
をし、かつ室温で一晩インキュベートした。該プレート
をPBS/TWEEN 洗浄液で一回洗浄した。これを１％BSA/Tw
een を用い、室温で１時間ブロックした。再度、PBS/TW
EEN 洗浄液で一回洗浄した。幾つかの陽性及び陰性検体
を１％BSA/PBS で１：５で希釈した。各検体(0.100ml)
を前記プレートのウェルに入れ、カバーをし、室温で１
時間インキュベートした。次いで、該プレートをメリフ
ルオロ(Merifluor)C/G洗浄液で５回洗浄した。ホースラ
ディシュペルオキシダーゼと結合した、先に許容され
たウサギ抗H.ピロリ菌抗体を10μg/mlに希釈し、0.100m
l ずつ各ウェルに加えた。該プレートにカバーをし、室
温で１時間インキュベートした。再度、PBS/TWEEN 洗浄
液で５回洗浄し、トリメチルベンズイデン(TBS) 溶液0.
100ml を用い、室温で、10分間現像した。２Ｎ H₂SO₄0.
050ml を用いて停止し、その２分後に判読した。最大の
シグナル及び最も低いバックグラウンドが得られる希釈
を最適希釈として選択した。量的な測定を、ラベルされ
た抗体の測定価を、既知量の抗原を含む検体から計算し
て出した測定値と、比較することにより、行うことがで
きる。下記表１に、それぞれ既知数の微生物を含む４検
体をアッセイした場合に得られた光学密度を示す。

【００１７】

【表１】

【００１８】６臨床検体に該アッセイを行った結果を表
２に示す。

【表２】表２検体ＯＤ_450/630 結果１ 0.301 陽性２ 0.713 陽性３ 0.284 陽性４ 0.005 陰性５ 0.033 陰性６ 0.008 陰性

【００１９】また、本発明に従い、排泄物検体中のH.ピ
ロリ菌を検出するために、いわゆるトリプルサンドイッ
チアッセイを用いることができる。トリプルアッセイ
は、当該技術分野で公知であり、かつこの基本的な原理
体系を適用して排泄物検体中のH.ピロリ菌の検出を行う
ことができる。トリプルアッセイは、通常、交差反応を
最小にする検体希釈液中にH.ピロリ菌を含む疑いがある
排泄物検体を懸濁し、この懸濁した検体を、抗体産生動
物の第１種から得た、H.ピロリ菌に対する固定化抗体に
加えることにより実施する。該検体をインキュベート
し、抗体−抗原複合体を形成する。固定化支持体から過
剰な検体を洗い流した後、第一次抗原として知られ、か
つ抗体産生動物の第２種から得られたH.ピロリ菌抗体
を、前記抗体−抗原複合体に加え、インキュベートして
抗体−抗原−抗体複合体を形成する。この複合体を形成
し、未反応の抗体を除去した後、該複合体を抗−（ウサ
ギ、牛又は山羊）免疫グロブリンのような第２抗体産生
種に対する抗体であり、第二次抗体として知られている
抗体と、反応させる。第二次抗体を常法、通常は酵素で
ラベルし、前記抗体−抗原−抗体複合体と共にインキュ
ベートし、トリプル抗体複合体、すなわちサンドイッチ
を形成する。未反応の第二次抗体を除去した後、該抗原
を常法でアッセイする。酵素ラベルを用いた場合、抗原
と３種の抗体の複合体に基質を加え、結合している酵素
による基質の反応をモニターし、検体中の抗原の量を測
定する。トリプルサンドイッチアッセイにおいて、基本
的なサンドイッチアッセイとして、洗浄液及び抗体溶液
を配合し、又は緩衝し、必要とされる交差反応のコント
ロールを行う。詳細に発明が記載されていること、及び
好ましい実施態様に参照されていることにより、当業者
にとり、次の添付された請求項に規定されている発明の
範囲から離れることなく改良及び変形できることは明ら
かである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者チンスイアーサーイーアメリカ合衆国オハイオ州 45244 シンシナチウィリアムズクリークドライヴ 3078 (72)発明者ケニスジェームズコザックアメリカ合衆国オハイオ州 45244 シンシナチナイツブリッジドライヴ 2161

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記(a) 〜(e) の工程を有する、排泄物
検体中のH.ピロリ菌の検出方法： (a) H.ピロリ菌を含むと考えられる排泄物検体を検体希
釈液に懸濁する工程； (b) 希釈液中の排泄物検体をH.ピロリ菌抗原に対する第
１ポリクローナル抗体に接触させて、該抗体と抗原の複
合体を形成する工程； (c) 前記検体と前記複合体を分離する工程； (d) 該複合体を、前記抗原に対する第２ポリクローナル
抗体、及び該複合体と反応する抗体の一部に曝す工程、
なお、第１及び第２ポリクローナル抗体の何れか一方が
固形担体と結合し、かつ他方が検出剤でラベルされてい
る；及び (e) ラベルされた抗体の量を測定し、かつ次いで、前記
排泄物検体におけるH.ピロリ菌抗原の存在を検出する工
程。
【請求項２】第１抗体が固形担体と結合し、第２抗体
が検出剤でラベルされている、請求項１記載の方法。
【請求項３】第１抗体が検出剤でラベルされ、第２抗
体がて固形担体と結合しいる請求項１記載の方法。
【請求項４】検体希釈液がタンパク質ベース希釈液で
ある請求項１記載の方法。
【請求項５】前記ポリクローナル抗体が、H.ピロリ菌
細胞で抗体産生哺乳動物を感作することにより得られた
ものである請求項１記載の方法。
【請求項６】検体希釈液が、胎児牛血清、標準山羊血
清、モルモット血清、馬血清、カゼイン、アルブミン、
ゼラチン及び牛血清アルブミンからなる群から選ばれた
タンパク質を含む、請求項４記載の方法。
【請求項７】前記複合体を第２抗体に曝した後、該複
合体を交差反応を減らし、又はアッセイの特異性を改善
する緩衝液で洗浄する、請求項１記載の方法。
【請求項８】前記細胞が、多数のH.ピロリ菌株から選
ばれたものである請求項５記載の方法。
【請求項９】前記検出剤が、アルカリホスファター
ゼ、βガラクトシダーゼ及びホースラディシュペルオキ
シダーゼからなる群から選ばれたものである請求項３記
載の方法。
【請求項10】前記洗浄剤が、リン酸緩衝生理食塩水で
ある請求項７記載の方法。
【請求項11】前記細胞が、ATCC菌株43504 から得た細
胞である請求項５記載の方法。
【請求項12】下記(a) 〜(d) の工程を有する、排泄物
検体中のH.ピロリ菌の検出方法： (a) H.ピロリ菌を含むと考えられる排泄物検体を検体希
釈液に懸濁する工程； (b) 希釈液中の排泄物検体を、固形担体に結合した、H.
ピロリ菌抗原に対する第１ポリクローナル抗体、及びラ
ベルされた、H.ピロリ菌に対する第２ポリクローナル抗
体に接触させて、該抗体と該抗原の複合体を形成する工
程； (c) 前記検体と前記複合体を分離する工程；及び (d) ラベルされた抗体の量を測定し、かつ次いで前記排
泄物検体中のH.ピロリ菌抗原の存在を検出する工程。
【請求項13】下記(a) 〜(g) の工程を有する、排泄物
検体中のH.ピロリ菌の検出方法： (a) H.ピロリ菌を含むと考えられる排泄物検体を検体希
釈液に懸濁する工程； (b) 希釈液中の排泄物検体と、第１抗体産生種によって
産生され、固形担体と結合した、H.ピロリ菌抗原に対す
る第１ポリクローナル抗体とを接触させ、抗体と抗原と
の複合体を形成する工程； (c) 前記検体と前記複合体を分離する工程； (d) 工程(b) で形成された抗体−抗原複合体と、第２抗
体産生種から得たH.ピロリ菌抗原に対する第一次ポリク
ローナル抗体を接触させ、抗体−抗原−抗体複合体を形
成する工程； (e) 工程(d) で複合体に含まれていない第一次抗体を除
去する工程； (f) 工程(d) で得られた抗体−抗原−抗体複合体を、第
２抗体産生種に対する抗体である、第二次抗体と接触さ
せ、それにより、前記第二次抗体を、前記抗体−抗原−
抗体複合体との複合体に形成する工程；及び (g) 前記排泄物検体中のH.ピロリ菌抗原の存在を検出す
る工程。
【請求項14】 H.ピロリ菌抗原に対するポリクローナル
抗体を結合させたウェルを有するプレート、タンパク質
ベースの検体希釈液、酵素−H.ピロリ菌抗原に対するポ
リクローナル抗体結合体、洗浄緩衝液及び基質溶液を有
する、排泄物検体中のH.ピロリ菌の検出キット。