CN102565391A - 胃黏膜样品中幽门螺杆菌的免疫测定法 - Google Patents

Abstract

一种测定胃黏膜样品中幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)的免疫方法，它包括：(a)把怀疑含有幽门螺杆菌的胃黏膜样品悬浮于样品稀释液中；(b)把该稀释液中的胃黏膜样品与抗幽门螺杆菌抗原的第一种多克隆抗体接触以形成该抗体和抗原的复合体；(c)把该样品和该复合体进行分离；(d)把该复合体暴露于抗该抗原的第二种多克隆抗体并把该抗体的一部分与该复合体反应，把所述的第一种和第二种抗体之一结合在一种固体载体上，其它用检测剂进行标记；和(e)测定标记的抗体量并依次测定该胃黏膜样品中幽门螺杆菌抗原的存在。本发明具有成本低廉、检测结果直观、准确、反应速度快的优点。

Description

胃黏膜样品中幽门螺杆菌的免疫测定法

技术领域

本发明涉及一种胃黏膜样品中幽门螺杆菌的免疫测定法。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是一种在人的胃肠道上部发现的细菌，已经发现它与胃十二指肠疾病如消化性溃疡、胃炎和其它疾病有关。按来源把该细菌属弯曲杆菌属，然后根据有关它的超微结构和脂肪酸组分方面更详细的资料再分在螺杆菌属。

幽门螺杆菌的检测方法很多，常用方法有：(1)细菌培养法。该方法是诊断幽门螺杆菌的“黄金标准”。该方法能直接证明H.pylori的存在，无假阳性出现，同时还可作药敏试验。对不同菌株作遗传因子研究。但是，分离培养技术条件较高。且需一定的培养时间，可有假阴性出现，尚未能广泛开展。(2)尿素酶试验。幽门螺杆菌能够产生大量很高活性的尿素酶，而其他细菌罕有如此高的尿素酶活性。基于此原理，多采用pH＜6.0，一般情况下试剂颜色不变。如果胃内有H.pylori感染，当标本放人试剂中，H.pylori所产生的尿素酶则分解尿素产生氨，使pH升高，导致剂酚红变色-粉红色。尿素酶试验方法简便实用、快速灵敏。能在1分钟内判断结果，且镜检完后就可及时治疗。(3)组织病理学检查方法较多，有HE染色、Warthin-Starry染色、Giemsa染色、石炭酸复红染色、Gimenez染色、吖啶橙染色、间接免疫光法、相差显微镜观察、无标记抗体PAP染色法、双特异抗体酶免疫染色法、寡核苷酸探针检查等方法。以Warthin-Starry染色、Gimenez染色效果最佳而常用。但是该检测方法繁琐费时，需要一定的技术，有一定的假阳性。(4)呼气试验。感染H.pylori的患者口服同位素标记的尿素溶液。则尿素分解后产生的同位素CO₂从肺呼出。

对于已经做胃肠镜检查后的所获得的胃黏膜活检标本，主要采用快速尿素酶法和病理检测两种方法检查可能存在的幽门螺杆菌。一般而言，这两个检测方法具有较高的一致性，但是，并不是可以相互取代，仍然有不一致的地方。不一致的原因可有：(1)H.pylori胃内分布有差异，快速尿素酶法是检测一块组织。存在标本取样能否取到的问题，而病理只是一块组织几块切片，取样的问题更为突出。(2)尿素酶活性和H.pylori的不一致。虽然H.pylori能够产生大量很高活性的尿素酶，而其他细菌罕有如此高尿素酶活性。但是目前发现，抑酸药物、一些抗菌素等会影响尿素酶试验，而抑酸药物有可能为患者服用。(3)pH法，因为其他混杂的尿素酶，颜色判断的视觉误差等存在假阳性。(4)病理形态学上可有其他相似的螺杆菌、弧菌等干扰。正是因为这个原因，1999年4月中华医学会消化病学分会在《幽门螺杆菌若干问题共识意见》中提出，H.pylori培养阳性或下列4项中任2项阳性者，诊断为H.pylori阳性：(1)H.pylori形态学(涂片、组织学染色或免疫组法染色)；(2)尿素酶依赖试验(快速尿素酶试验)；(3)血清学试验(ELISA或免疫印迹试验等)；(4)特异的PCR检测。H.pylori感染的临床诊断标准，下列2项中任1项阳性者，诊断为H.pylori阳性：(1)H.pylori形态学(涂片或组织学染色)；(2)尿素酶依赖性试验(快速尿素酶试、13C-UBT)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种成本低廉，检测结果直观、准确的胃黏膜样品中幽门螺杆菌的免疫测定法。

本发明的目的是这样实现的：它包括以下步骤：

(a)制作带检测物质的样品稀释液；

(b)把该稀释液中的胃黏膜样品与抗幽门螺杆菌抗原的第一种多克隆抗体接触以形成抗体-抗原复合体；

(c)把步骤(b)的样品和步骤(b)所得到的抗体-抗原复合体进行分离；

(d)把步骤把步骤(c)得到的分离后的抗体-抗原复合体暴露于抗幽门螺杆菌抗原的第二种多克隆抗体并把抗幽门螺杆菌抗原的第二种多克隆抗体的一部分与复合体反应，其中所述的第一种多克隆抗体和第二种多克隆抗体中的其中一种多克隆抗体结合在一种固体载体上，而另一种多克隆抗体用一种检测剂进行标记；

(e)测定标记的抗体的量。

其特征在于：所示的样品稀释液制作方式为把怀疑含有幽门螺杆菌的一种胃黏膜样品悬浮于基于蛋白质的、含碱性物质的稀释液中。

本发明的优点在于：1成本低廉，相对现有的尿素酶试验、细菌培养法等方法，本发明制作样品稀释液的成本低廉，各个试剂属于容易获取的产品而且价格较为低廉。2检测结果直观、准确。如果标记的是辣根过氧化物酶等，可通过添加显色液，反应后的结果可以直接通过显色反应看出，含有幽门螺杆菌的反应后的样品稀释液呈现蓝色或浅蓝色，未含有幽门螺杆菌的反应后的样品稀释液呈现无色透明；如果标记的是胶体金，则可以直接观察结果。3反应速度快，一般5～30分钟可以显示结果，4、通过试验，特别是针对已服用制酸剂、铋剂或抗生素患者ELISA试验和幽门螺杆菌荧光定量PCR，二者具有同样地检测效能，而且前者具有后者所没有的价格低廉、方便快捷，检测速度快的优点。

具体实施方式

本发明的具体步骤如下：

(a)制作带检测物质的样品稀释液；制作方式为把怀疑含有幽门螺杆菌的一种胃黏膜样品悬浮于基于蛋白质的、含碱性物质的稀释液中。其中的蛋白质是指代选自胎牛血清、正常山羊血清、豚鼠血清、马血清、酪蛋白、白蛋白、明胶和牛血清白蛋白中的其中一种蛋白质，增加蛋白质为了提高非特异性。为对抗胃黏膜样品所含的酸性液体，样品缓冲液应含碱性物质，有助于降低胃黏膜物质的对反应液pH值的改变，有助于提高pH值，降低胃黏膜所含蛋白酶的活性，以及其他物质对反应的干扰。

其中样品稀释液为含有选自胎牛血清、正常山羊血清、豚鼠血清、马血清、酪蛋白、白蛋白、明胶和牛血清白蛋白中的一种蛋白的样品稀释液。

样品稀释液内含有的碱性物质包含但不限于三羟甲基甲胺基丙磺酸、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷、N-三-(羟甲基)甲基氨基乙酸、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸、3-(N-吗非啉)乙磺酸、四硼酸钠缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种组合，其中由碱性物质配制的缓冲液其pH大于8。配置碱性物质的方法是本技术领域技术人员所熟悉的。

在将含有幽门螺杆菌的一种胃黏膜样品悬浮于基于蛋白质的、含碱性物质的样品稀释液后，样品稀释液的pH在6～10为宜，其中pH＝8的时候，检测的效果最好。

(b)把样品稀释液中的胃黏膜样品与抗幽门螺杆菌抗原的第一种多克隆抗体接触以形成抗体-抗原复合体；一般来说本发明使用了抗幽门螺杆菌的抗体，可以为单克隆抗体和多克隆抗体两种，但是目前常用的为多克隆抗体。这些抗体能够从致敏的动物的血清中获得。目前国内外已有多家公司可提供商品化的抗幽门螺杆菌的抗体，可以较经济的价格获得。中国专利(申请号97103112.6)已详细描述幽门螺杆菌抗体的制备方法。在此仅简述如下：把幽门螺杆菌抗原注射到哺乳动物如兔、羊等体内，多次注射适当剂量的抗原，验证试验动物已产生抗幽门螺杆菌抗体，取试验动物血清，经纯化即可得到所需抗体。许多样品稀释液以0.05％到2％之间范围浓度含有Triton X-100和/或Tween 20，加0～2.9％NaCL可改变缓冲体系的离子强度。这些变化通过降低形成中的弱的或非特异性反应来导致较好的特异性。

(c)把步骤(b)的样品和步骤(b)所得到的抗体-抗原复合体进行分离；

(d)把步骤把步骤(c)得到的分离后的抗体-抗原复合体暴露于抗幽门螺杆菌抗原的第二种多克隆抗体并把抗幽门螺杆菌抗原的第二种多克隆抗体的一部分与复合体反应，其中所述的第一种多克隆抗体和第二种多克隆抗体中的其中一种多克隆抗体结合在一种固体载体上，而另一种多克隆抗体用一种检测剂进行标记；其中固体载体为酶标反应板或纤维素膜(如硝酸纤维素膜、混合纤维素膜)等，当然也可以是其他免疫学领域常见的固体载体。

上述的检测剂选自碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、放射性物质(如碘-125)、胶体金、胶体颗粒(金、硒等)、彩色乳胶微球、分散染料颗粒中的一种或多种组合。最常用的酶标记物之一是辣根过氧化酶(HRP)和碱性磷酸酶。把抗体结合在这类标记物质上的技术是本领域普通技术人员所熟知的。

在样品稀释液中还含有胃蛋白酶抑制剂，所述的胃蛋白酶抑制剂包含但不限于抑肽素、硫柳汞中的一种或几种的混合物。

其中抗体-抗原复合体暴露给第二种多克隆抗体的一部分反应后，用一种能够降低交叉反应度或以其它方式提高该测定法特异性的缓冲液洗涤该复合体。所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液。

(e)测定标记的抗体的量；其中步骤(e)中的还可能设有添加有显色液。是否添加显色液可以根据标记的检测剂决定，如果标记的抗体是辣根过氧化物酶，底物是四甲基联苯胺(TMB)，如果标记的抗体是碱性磷酸酶，底物是对硝基苯磷酸盐；如果标记的是胶体金或彩色染料颗粒，则不需要底物，通过颜色直接判定结果。

一种测定胃黏膜样品中幽门螺杆菌的方法，它包括：

其中用于从被试验的胃黏膜样品中提取抗原物质的方法所用的未标记的多克隆抗体能够固定在任何一种免疫测定法中常用的支持物上。在这些支持物中可使用的是滤纸、硝酸纤维素膜、塑料珠、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯或其它适当的试管、酶标反应板等。把抗体结合在这类物质上的技术是本领域普通技术人员所熟知的。

其中在步骤(d)中复合体暴露给第二种多克隆抗体的一部分反应后，用一种能够降低交叉反应度或以其它方式提高该测定法特异性的缓冲液洗涤该复合体。在用于测定法中的抗体溶液和洗涤液的配制中也能体现交叉反应度。该抗体能够在缓冲液中结合上述提到的一种蛋白脲而被提供。通过加入盐和表面活性剂来控制交叉反应度能够配制和缓冲该测定法中所用的洗涤液。

通过部分试剂、检测剂的配置以及和ELISA实验对本发明进行说明：

下列实施例二说明一种称作“向前”测定法，其中把结合在支持物上的抗体首先与被测试的样品接触通过形成一种抗体/抗原复合体并把该复合体与一种已知量的标记抗体接触的方法来从样品中提取抗原。但是，本领域普通技术人员也能想到用称作“同时”或“反向”测定法进行免疫测定。同时测定法包括同时把结合到固体支持物上的抗体和标记的抗体加到被测试的样品中的单一温育步骤。完成温育后，冲洗固体支持物除去残余样品和未复合标记的抗体。然后测定与固体支持物相连的标记抗体的存在。反向测定法包括先把标记的抗体溶液加到粪便样品中，接着加入结合在支持物上的未标记的抗体的步骤。温育一秒钟后，用常规的洗液冲洗该支持物使其不含残余的样品和未反应的标记抗体。

由于缓冲液，检测剂等溶剂中的每种溶剂都涉及到使用多种物质，在配置溶剂方面具体参数方面有较大的差异，下面结合具体实施例(实验室实验时，采用各种物质作为溶剂时的参数以及配置方法)，对本发明的步骤进行说明。

一、本试验涉及到的溶液配制：

(一)、常见碱性溶液配制

本发明涉及的采用碱性生物缓冲液的配制方法如下：

1、羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲液

HEPES  分子式：C₈H₁₈N₂O₄S    分子量：238.3

每1000ml去离子水中加入2～5克HEPES，待溶后用lN NaOH调pH至8.2～9.15范围之间，滤过除菌后使用。

2、硼砂-氯化钙缓冲液

取硼砂0.3～2g与氯化钙2～5g，加水约800ml溶解后，用1mol/L盐酸溶液约2.5ml调节pH值至8.0-9.5，加水稀释至1000ml，即得。

3、硼酸-氯化钾缓冲液(pH8.0～9.5)

取硼酸2.7～5.0g，加0.1mol/L氯化钾溶液500ml使溶解，再加0.1mol/L氢氧化钠溶液210ml，即得。

4、甘氨酸缓冲液配制

甘氨酸缓冲液：6～8克甘氨酸、9～12克氯化钠溶于蒸馏水，用1mol/L氢氧化钠调节pH至8.2～9.15范围之间，蒸馏水补足至1升。

(二)、样品稀释液的配制

样品稀释液的配制方法如下：在上述碱性液体100ml加上0.1～2.0g牛血清白蛋白(BSA)，加入适量(终浓度为0.01％～0.02％)硫柳汞，再加上0.05～2％的Triton X-100和/或Tween-20。

(三)、包被缓冲液用于ELISA试验中将抗幽门螺杆菌抗体包被到微孔板

0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)：0.75g碳酸钠，1.46g碳酸氢钠，加去离子水定容至500ml。

(四)、封闭缓冲液用于包被后减少非特异性反应

0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)(同上)+2.0％BSA：2g牛血清白蛋白(BSA)加入100ml上述配好的0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)

(五)、0.02mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.4)

0.2g磷酸二氢钾，2.90g磷酸氢二钠，8g氯化钠，加去离子水定容至1000ml。

(六)、抗体稀释液用于稀释各种抗体等

0.02mol/L PBS(pH7.4)+0.2％BSA：0.2g牛血清白蛋白(BSA)加入100ml上述配好的上述配好的0.02mol/L PBS(pH7.4)中。

(七)、洗涤缓冲液用于洗脱多余的未结合的抗原和抗体等。

0.02mol/L PBS(pH7.4)+0.05％吐温-20(Tween-20)：将50微升Tween-20加入上述配好的100ml 0.02mol/L PBS(pH7.4)中，震荡混匀。

(八)、显色液

TMB-过氧化尿素溶液

A液3′，3′，5′，5′，-四甲基联苯胺(TMB)20mg，无水乙醇(或DMSO)10ml，加双蒸水至100ml。

B液(0.1ml/L柠檬酸-0.2ml/L磷酸氢二纳，pH5.0-5.4)：Na₂HPO₄ 14.60g，柠檬酸9.33g，0.75％过氧化尿素6.4ml，加去离子水至1000ml，调至pH5.0-5.4。

将A液和B液按1∶1混合后即为TMB-过氧化尿素溶液

(九)、终止液：2mol/L H₂SO₄溶液

10ml 98％浓硫酸加入60ml去离子水中，定容至100ml，室温保存。

终止液一般在显色液加入后5～10分钟加入。

(十)酶标记抗幽门螺杆菌抗体的稀释

将(HRP)酶标记的抗幽门螺杆菌抗体用抗体稀释液按照适当比例稀释至工作浓度。本发明使用的是美国KPL公司的辣根过氧化物酶标记的抗人幽门螺杆菌抗体，按照说明书的方法稀释到0.1mg/ml。

实施例一：ELISA试验

(一)、ELISA试验碱性溶液配制

本发明涉及的采用碱性生物缓冲液的配制方法如下：

1、羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲液

HEPES  分子式：C₈H₁₈N₂O₄S  分子量：238.3

每1000ml去离子水中加入2.38克HEPES，待溶后用lN NaOH调pH至8.2，滤过除菌后使用。

2、样品稀释液的配制

样品稀释液的配制方法如下：在羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲液100ml加上1g牛血清白蛋白(BSA)，加入适量(终浓度为0.02％)硫柳汞，再加上0.1％的Tween-20。

3、包被缓冲液用于ELISA试验中将抗幽门螺杆菌抗体包被到微孔板

0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)：0.75g碳酸钠，1.46g碳酸氢钠，加去离子水定容至500ml。

4、封闭缓冲液用于包被后减少非特异性反应

0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)(同上)+2.0％BSA：2g牛血清白蛋白(BSA)加入100ml上述配好的0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)

5、洗涤缓冲液用于洗脱多余的未结合的抗原和抗体等。

0.02mol/L PBS(pH7.4)+0.05％吐温-20(Tween-20)：将50微升Tween-20加入上述配好的100ml 0.02mol/L PBS(pH7.4)中，震荡混匀。

6、显色液

TMB-过氧化尿素溶液

A液3′，3′，5′，5′，-四甲基联苯胺(TMB)20mg，无水乙醇(或DMSO)10ml，加双蒸水至100ml。

B液(0.1ml/L柠檬酸-0.2ml/L磷酸氢二纳，pH5.0-5.4)：Na₂HPO₄ 14.60g，柠檬酸9.33g，0.75％过氧化尿素6.4ml，加去离子水至1000ml，调至pH5.0-5.4。

将A液和B液按1∶1混合后即为TMB-过氧化尿素溶液

7、终止液：2mol/L H₂SO₄溶液

10ml 98％浓硫酸加入60ml去离子水中，定容至100ml，室温保存。

终止液一般在显色液加入后5～10分钟加入。

8、酶标记抗幽门螺杆菌抗体的稀释

将(HRP)酶标记的抗幽门螺杆菌抗体用抗体稀释液按照适当比例稀释至工作浓度。本发明使用的是美国KPL公司的辣根过氧化物酶标记的抗人幽门螺杆菌抗体，按照说明书的方法稀释到0.1mg/ml。

二、酶标反应板的包被和封闭(即检测步骤的b～d的过程)，本过程在直接将步骤b～d直接作为一个整体进行处理。

包被用上述的包被缓冲液将抗幽门螺杆菌抗原的第一种多克隆抗体稀释到适当浓度，抗幽门螺杆菌抗原的第一种多克隆抗体使用的是美国KPL公司的抗人幽门螺杆菌抗体，按照说明书的方法稀释到10μg/ml。每孔加入上述稀释好的抗体100μl，用薄膜包好放于4度保存过夜。

封闭次日，将上述酶标板甩干，每孔加100μl前述配好的封闭缓冲液，用薄膜包好放于4度保存过夜。次日，将酶标板甩干，晾干，密封，备用。

三、检测带检测物质的样品稀释液

1、待测胃黏膜标品及阳性对照和阴性对照用前述的样品稀释液作1∶4稀释后，于前述已包被好的酶标板中每孔加入100ul，置湿盒中37℃作用30分钟。

取出酶标板甩干，用前述配制好的洗涤缓冲液洗涤，洗涤3-5次，每次3-5分钟。

2、将上述已稀释好的辣根过氧化物酶标记的抗人幽门螺杆菌抗体酶标板中每孔加入100ul，置湿盒中37℃作用30分钟。

取出酶标板甩干，用前述配制好的洗涤缓冲液洗涤，洗涤3-5次，每次3-5分钟。扣干。

3、显色。于酶标板中每孔各加入50ul前述已配制的显色液A液和B液。

4、检测。置温盒中37℃作用5-15分钟，直接肉眼观察结果；或者每孔加前述终止液100ul，在酶标仪上读取波长为450纳米时的吸光度值。判定标准以待检胃黏膜(P)与已知阴性对照胃黏膜(N)的比值P/N≥2.1为阳性。

实施例二dot-ELISA试验

(一)、本试验所需溶液溶液配制

1、碱性缓冲液的配制同前，以硼砂-氯化钙缓冲液(pH8.0)作说明。

硼砂-氯化钙缓冲液(pH8.0)

取硼砂0.572与氯化钙2.94g，加水约800ml溶解后，用1mol/L盐酸溶液约2.5ml调节pH值至8.0，加水稀释至1000ml，即得。

2、样品稀释液的配制

样品稀释液的配制方法如下：在硼砂-氯化钙缓冲液(pH8.0)100ml加上1g牛血清白蛋白(BSA)，加入适量(终浓度为0.01％)硫柳汞，再加上0.1％的Tween-20。

3、包被缓冲液

0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)：0.75g碳酸钠，1.46g碳酸氢钠，加去离子水定容至500ml。

4、封闭缓冲液用于包被后减少非特异性反应

0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)(同上)+2.0％BSA：2g牛血清白蛋白(BSA)加入100ml上述配好的0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)

5、0.02mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.4)

0.2g磷酸二氢钾，2.90g磷酸氢二钠，8g氯化钠，加去离子水定容至1000ml。

6、抗体稀释液用于稀释各种抗体等

0.02mol/L PBS(pH7.4)+0.2％BSA：0.2g牛血清白蛋白(BSA)加入100ml上述配好的上述配好的0.02mol/L PBS(pH7.4)中。

7、洗涤缓冲液用于洗脱多余的未结合的抗原和抗体等。

0.02mol/L PBS(pH7.4)+0.05％吐温-20(Tween-20)：将50微升Tween-20加入上述配好的100ml 0.02mol/L PBS(pH7.4)中，震荡混匀。

8、底物溶液：

3，3二氨基联苯胺50mg，0.05mol/L、pH值7.6TrisHCl缓冲液100ml，溶解后过滤，4℃避光保存。临用前加入H₂O₂使终浓度为0.03％。

9酶标记抗幽门螺杆菌抗体的稀释

将(HRP)酶标记的抗幽门螺杆菌抗体用抗体稀释液按照适当比例稀释至工作浓度。本发明使用的是美国KPL公司的辣根过氧化物酶标记的抗人幽门螺杆菌抗体，按照说明书的方法稀释到0.1mg/ml。

10、载体：硝酸纤维素膜022～045μm。硝酸纤维素膜(NC膜，由浙江黄岩人民化工厂生产，规格：20cm×20cm)。

11、兔抗幽门螺杆菌抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗人幽门螺杆菌抗体由美国KPL公司提供。

二、前处理(即检测步骤的b～d的过程)，本过程在直接将步骤b～d直接作为一个整体进行处理。

1、硝酸维素膜的处理剪取适当大小的硝酸纤维素膜，置于蒸馏水中浸泡2～10分钟，取出放于洁净的滤纸上，自然干燥，用直径4～6mm打孔器于膜的光面间隔压印，备用。

2、包被。用上述包被缓冲液将抗幽门螺杆菌抗体稀释到适当浓度。本发明使用的是美国KPL公司的抗人幽门螺杆菌抗体，按照说明书的方法稀释到10μg/ml。每孔加入上述稀释好的抗体100μl，覆盖并在室温下温育过夜。用洗涤缓冲液冲洗一次。在室温下用封闭缓冲液将其封闭1小时。再用洗涤缓冲液冲洗一次。

3、酶标记抗幽门螺杆菌抗体的稀释

将(HRP)酶标记的抗幽门螺杆菌抗体用抗体稀释液按照适当比例稀释至工作浓度。本发明使用的是美国KPL公司的辣根过氧化物酶标记的抗人幽门螺杆菌抗体，按照说明书的方法稀释到0.01mg/ml。

(三)、dot-ELISA试验

1、用样品稀释液把待测胃黏膜样品、阳性和阴性对照按1∶4稀释。然后，各加100μl入试纸的孔中，覆盖并在室温下温育1小时。

2、用洗涤缓冲液把平皿冲洗5次。

3、将已稀释好的辣根过氧化酶标记的兔抗幽门螺杆菌向各孔加入100μl。遮盖平皿，并在室温下温育1小时。

4、用洗涤缓冲液把平皿冲洗5次。

5、然后在室温下加入实施例2配置溶液配置步骤中的底物溶液。

6、冲洗晾干，目测观察结果。

选择能够产生最大信号和最低背景的稀释液作理想的稀释液。

按照本发明称作三明治的测定法也能够用于测定胃黏膜样品中的幽门螺杆菌。现有技术中已知三步测定法并且该基本方法能够用于测定胃黏膜样品中的幽门螺杆菌。三步测定法一般是这样进行的：把怀疑含有幽门螺杆菌的胃黏膜样品分散到一种最小交叉反应度的样品稀释液中并把稀释的样品加入到一种已经从第一种产生抗体的动物中得到的幽门螺杆菌的固相抗体中。把该样品温育，形成抗体-抗原复合物。冲洗固相支持物上的过量样品后，把一种从第二种产生抗体动物中所得到的并作为初级抗体的已知幽门螺杆菌抗体加入该抗体-抗原复合物中并温育来形成一种抗体-抗原-抗体复合物。在形成该复合物并除去未反应的抗体后，把该复合物与一种作为二级抗体的已知抗体反应，其中的二级抗体是一种产生二级抗体种类如抗(兔、牛或山羊)的免疫球蛋白。用常规方法(一般用酶)标记二级抗体并与抗体-抗原-抗体复合物温育，来形成三抗体复合物或三明治。在除去未反应的二级抗体后，用常规方法测定抗原。在使用酶标记中，把一种底物加入该抗原和三种抗体的复合物中并控制底物与连接酶的反应来测定存在于样品中的抗原量。在这种作为基础测定法的三明治测定法中，如果必要的话，配制或缓冲洗液和抗体溶液来控制交叉反应度。经过详细描述本发明和通过参考优选实施方案，在不超出下列权利要求中所限定的范围内可能的改良和变化对本领域普通技术人员都将是显而易见的。

Claims (10)

1.一种胃黏膜样品中幽门螺杆菌的免疫测定法，它包括：

(a)制作带检测物质的样品稀释液；

(b)把样品稀释液中的胃黏膜样品与抗幽门螺杆菌抗原的第一种多克隆抗体接触以形成抗体-抗原复合体；

(c)把步骤(b)的样品和步骤(b)所得到的抗体-抗原复合体进行分离；

(d)把步骤(c)得到的分离后的抗体-抗原复合体暴露于抗幽门螺杆菌抗原的第二种多克隆抗体并把抗幽门螺杆菌抗原的第二种多克隆抗体的一部分与复合体反应，其中所述的第一种多克隆抗体和第二种多克隆抗体中的其中一种多克隆抗体结合在一种固体载体上，而另一种多克隆抗体用一种检测剂进行标记；

(e)测定标记的抗体的量；

其特征在于：所示的样品稀释液制作方式为把怀疑含有幽门螺杆菌的一种胃黏膜样品悬浮于基于蛋白质的、含碱性物质的稀释液中。

2.根据权利要求1的胃黏膜样品中幽门螺杆菌的免疫测定法，其特征在于：所述的样品稀释液是一种基于蛋白质的稀释液，样品稀释液为含有选自胎牛血清、正常山羊血清、豚鼠血清、马血清、酪蛋白、白蛋白、明胶和牛血清白蛋白中的一种蛋白的样品稀释液。

3.根据权利要求1的胃黏膜样品中幽门螺杆菌的免疫测定法，其特征在于：在样品稀释液内还含有为降低胃黏膜所含酸液对检测的影响而添加的含碱性物质。所述的碱性物质包含但不限于三羟甲基甲胺基丙磺酸、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷、N-三-(羟甲基)甲基氨基乙酸、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸、3-(N-吗非啉)乙磺酸、四硼酸钠缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种组合，其中由碱性物质配制而成的缓冲液其pH大于8。

4.根据权利要求1的胃黏膜样品中幽门螺杆菌的免疫测定法，其特征在于：步骤(d)中抗体-抗原复合体暴露给第二种多克隆抗体的一部分反应后，用一种能够降低交叉反应度或以其它方式提高该测定法特异性的缓冲液洗涤该复合体。

5.根据权利要求4的胃黏膜样品中幽门螺杆菌的免疫测定法，其特征在于：所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液。

6.根据权利要求1的胃黏膜样品中幽门螺杆菌的免疫测定法，其特征在于：步骤(d)中的检测剂选自碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、放射性物质(如碘-125)、胶体金、胶体颗粒(金、硒等)、彩色乳胶微球、分散染料颗粒中的一种或多种组合。

7.根据权利要求1的胃黏膜样品中幽门螺杆菌的免疫测定法，其特征在于：固体载体为酶标反应板或纤维素膜。

8.根据权利要求1的胃黏膜样品中幽门螺杆菌的免疫测定法，其特征在于：样品稀释液的PH为6～10，其中最优值为PH＝8。

9.根据权利要求1的胃黏膜样品中幽门螺杆菌的免疫测定法，其特征在于：在样品稀释液中还含有胃蛋白酶抑制剂，所述的胃蛋白酶抑制剂包含但不限于抑肽素、硫柳汞中的一种或几种的混合物。

10.根据权利要求1的胃黏膜样品中幽门螺杆菌的免疫测定法，其特征在于：步骤(e)中的还添加有显色液。