JPH088870B2 - メタロプロテイナ−ゼ阻害剤の配列をもつ組換ベクタ−系及びメタロプロテイナ−ゼ阻害剤製造のための組換ｄｎａ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 背景技術 この発明は、1985年２月５日登録の米国特許出願第69
9181号の部分継続出願である1985年10月４日登録の米国
特許出願第784319号の部分継続出願である。内在性蛋白
分解酵素は、侵入してきた生物体、抗原−抗体複合体、
及び、生物体にはもはや不要のあるいは役立たないある
種の組織蛋白を分解する役割をもつ。正常に機能する生
物では、蛋白分解酵素は、限定された量で生産され、特
異的な阻害剤により一部調節される。

メタロプロテイナーゼは、結合組織の分解にしばしば
関与する体内に存在する酵素である。いくらかの結合組
織の分解は生物の正常な機能には必要である一方、過剰
の結合組織分解がいくつかの疾病状態で起きており、少
なくとも一部分は、過剰のメタロプロテイナーゼのため
であると信じられている。メタロプロテイナーゼは少な
くとも歯根膜の疾病、角膜及び皮膚の潰瘍、リューマチ
様関節炎及び癌様の固形腫瘍の展開に関連すると信じら
れている。

これらの疾病は通常結合組織の特定の形態であるコラ
ーゲンを高い割合で含む体内の領域で起きる。結合組織
のこれらの疾病をもつ患者の試験から、コラーゲンプロ
テオグリカン及びエラスチンを含む結合組織の各種成分
の過剰な破壊が明らかとなった。それ故、例えば、コラ
ーゲナーゼ、プロテオグリコナーゼ、ゲラチナーゼ及び
ある種のエラスターゼのような特定のメタロプロテイナ
ーゼの過剰濃度が、前記の疾病を伴う結合組織破壊を引
き起こし、あるいは悪化させることが推測された。

正常状態で体は、結合組織基質にメタロプロテイナー
ゼが作用するのを効果的に妨げるようにこれらの酵素に
結合するメタロプロテイナーゼ阻害剤を有している。特
に、健康な生物では、メタロプロテイナーゼ阻害剤は、
過剰のメタロプロテイナーゼを結合しつつ充分量のメタ
ロプロテイナーゼを活性のあるままにさせる範囲までメ
タロプロテイナーゼと相互作用するのに充分な濃度で存
在し、その結果各種疾病で見られる結合組織の損傷は起
こらない。

前述の疾病状態に存在する結合組織破壊の１つの直接
の原因は、メタロプロテイナーゼ／メタロプロテイナー
ゼ阻害剤の相対的な濃度の不均衡であると仮定されてい
る。これらの場合において、過剰量の活性メタロプロテ
イナーゼ、あるいは活性メタロプロテイナーゼ阻害剤の
量の欠乏のために、過剰のメタロプロテイナーゼが、疾
病を引き起こしあるいは悪化させるような結合組織の分
解を起こすと信じられている。結合組織の疾病をもつ人
をメタロプロテイナーゼ阻害剤で処置することにより、
過剰のメタロプロテイナーゼの分解作用は縮小されある
いは停止されることが仮定される。それ故、本発明者に
とって特定の興味ある特定のメタロプロテイナーゼ阻害
剤は、これらの阻害剤が医薬的に結合組織の疾病の処置
あるいは妨害に役立つと信じられているので、コラゲナ
ーゼ阻害剤である。

メタロプロテイナーゼ及びメタロプロテイナーゼ阻害
剤の存在は、科学文献で議論されている。例えばセラー
ズ等、バイオケミカル・アンド・バイオフイジカル・リ
サーチ・コミユニケーシヨン、第87巻、581−587ページ
（1979年）は、ウサギの骨のコラゲナーゼ阻害剤の分離
を議論している。ヒト皮膚繊維芽細胞から分離されるコ
ラゲナーゼ阻害剤は、ストリツクリンとウエルガス、ジ
ヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第25
8巻、12252−12258ページ（1983年）及びウエルガスと
ストリツクリン、ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー、第258巻、12259−12264ページ（1983
年）に議論されている。自然に生ずる体液中のコラゲナ
ーゼ阻害剤の存在は、さらに、マーフイ等、バイオケミ
カル・ジヤーナル、第195巻、167−170ページ（1981
年）及びコーストン等、アースリデイス・アンド・リユ
ーマテイズム、第27巻、285ページ（1984年）に議論さ
れている。さらに、メタロプロテイナーゼ阻害剤は、セ
ルラー・インターラクシヨンズ（細胞相互作用）、デイ
ングルとゴードン編（1981年）の中でレイノルズ等によ
り論議されている。これらの論文は、特定の分離された
メタロプロテイナーゼ阻害剤を特徴づけし、ある程度ま
で結合組織の疾病の処置におけるメタロプロテイナーゼ
の役割あるいは潜在的な役割を議論し、この破壊を妨げ
るメタロプロテイナーゼ阻害剤の能力を推測しているの
だが、以前には、これらの研究者の誰も、メタロプロテ
イナーゼ阻害剤の細胞内生産を指揮することのできる簡
易DNA配列を分離し、あるいは、これらの阻害剤の生産
のための組換えDNA法を創造することはできなかつた。

驚くべきことに、本発明者は、メタロプロテイナーゼ
阻害剤の組換えDNA合成を指揮できる簡易DNA配列を発見
した。これらのメタロプロテイナーゼ阻害剤は、生物学
的にヒト皮膚繊維芽細胞の培養から分離されたものと等
価である。ここで述べられている組換えDNA法により調
製された本発明のメタロプロテイナーゼ阻害剤は、メタ
ロプロテイナーゼにより誘導される結合組織の疾病の予
防及び処置についての拡大研究を可能にする。さらに、
本発明のメタロプロテイナーゼ阻害剤は、疾病状態に伴
う過剰のメタロプロテイナーゼを含むメタロプロテイナ
ーゼを中和するのに役立つ。それ故、活性成分として本
発明のメタロプロテイナーゼ阻害剤を具象化するこれら
の疾病の治療法が開発されると信じられている。さら
に、この新しく発見された本発明のメタロプロテイナー
ゼ阻害剤は、その阻害剤を用いて、結合組織の分解疾病
に対する診断試験の開発方法で、メタロプロテイナーゼ
の標的と相互作用することができる。

ここで議論されている組換えメタロプロテイナーゼ阻
害剤は、そのメタロプロテイナーゼ標的と化学量論的に
（即ち、1:1の割合で）相互作用する。さらに、これら
のメタロプロテイナーゼ阻害剤は熱耐性、酸安定、グリ
コシレーシヨンされており、高等電点を示す。

発明の開示 本発明は、メタロプロテイナーゼ阻害剤及びそれを生
産する組換えDNA法及びメタロプロテイナーゼ阻害剤の
細胞内生産を指揮することができる簡易DNA配列に関す
る。特に、本発明は、コラゲナーゼ阻害剤、それを生産
するための組換えDNA法及び組換え法に利用するための
簡易DNA配列に関する。本発明は又、これらの簡易DNA配
列を含む一連のベクターに関する。

本発明の１つの目的は、メタロプロテイナーゼ阻害剤
活性をもつ経済的な医薬成分を供給するため、充分な量
と純度で生産されるメタロプロテイナーゼ阻害剤を供給
することである。

本発明の別の目的は、これらのメタロプロテイナーゼ
阻害剤の生産のための組換えDNA法を供給することであ
る。この方法により生産された組換えメタロプロテイナ
ーゼ阻害剤は、生物学的に、ヒト皮膚繊維芽細胞の培養
から分離されるメタロプロテイナーゼ阻害剤と等価であ
る。

これらのメタロプロテイナーゼ阻害剤の組換えDNA合
成を促進するために、本発明のもう一つ目的は、メタロ
プロテイナーゼ阻害剤の細胞内生産を指揮することがで
きる簡易DNA配列を供給することがある。又、本発明の
目的は、これらの簡易配列を含むクローニング・ベクタ
ーを供給することである。これらのベクターは、医薬的
に役立つ量のメタロプロテイナーゼ阻害剤を供給するた
めに組換え系に使用することができる。

発明の更に別の目的及び利点は以下記述の部に述べら
れ、一部は記述から自明となりこの発明の実践から習得
しうるものとなろう。これらの目的と利点は、特許請求
の範囲に特に指摘されている手段と組合わせにより実現
達成される。

これらの目的を達するため、本発明の目的に従い、メ
タロプロテイナーゼと化学量論的に反応することができ
るメタロプロテイナーゼ阻害剤が述べられている。これ
らのメタロプロテイナーゼ阻害剤は著しく熱耐性で酸に
安定、グリコシレーシヨンされており、高い等電点を示
した。さらに、これらのメタロプロテイナーゼ阻害剤は
ヒト皮膚繊維芽細胞の培養から分離される阻害剤と生物
学的に同等である。

さらにこれらの目的を達成するため、かつ本発明の目
的に従い、実象化され、この中で広く述べられているよ
うにメタロプロテイナーゼ阻害剤をコードする簡易DNA
配列が準備される。これらの配列は、メタロプロテイナ
ーゼ阻害剤の細胞内生産を指摘できるヌクレオチド配列
から成る。簡易配列は合成配列又は制限断片（“天然"D
NA配列）のいずれでも良い。最良の形態では、簡易DNA
配列は、ヒト繊維芽細胞cDNAライブラリーから分離さ
れ、ヒト皮膚繊維芽細胞培養から分離される阻害剤と生
物学的に等価であるコラゲナーゼ阻害剤の細胞内生産を
指摘できる。

発見された最初の好ましいDNA配列の解読鎖は次のヌ
クレオチド配列をもつ。

上記略記号によりあらわされたヌクレオチドは、発明
を実施するための最良の形態の項に述べられている。

開始配列の５′に付加的なヌクレオチド配列をもつ第
２の好ましいDNA配列が発見された。82番目から432番目
のヌクレオチドとして、上述の第１の配列の１番目から
351番目のヌクレオチドを含むこの配列は次のヌクレオ
チド配列をもつ。

第２の配列の５′領域と第１の配列の３′領域を合わ
せた第３の好ましい配列は次のヌクレオチド配列をも
つ。

現在のところ、動物細胞で迅速なメタロプロテイナー
ゼ阻害剤の発現のためには、本発明者らは第４の好まし
いDNA配列を利用する方法が最も好ましいと考えてい
る。この配列の解読鎖は以下のように読む。

本発明に使用するための天然のDNA配列の同定及び分
離を進めるために、ヒト皮膚繊維芽細胞cDNAライブラリ
ーを開発した。このライブラリーは、本発明のメタロプ
ロテイナーゼ阻害剤を合成するための細胞を指揮できる
遺伝情報を含む。ここに述べられている組換えDNA法に
用いられている他の天然のDNA配列はヒトのゲノムライ
ブラリーから分離される。

更に、本発明の方法に役立つ簡易DNA配列は、合成に
より作製される。これらの合成DNA配列は、この分野に
おける通常の知識を有する者により既知のポリヌクレオ
チド合成及びシーケンシング技術により調製される。

さらに、これらの目的を達するために、本発明の意図
するところに従い、上記簡易DNA配列を用いたメタロプ
ロテイナーゼ阻害剤の微生物による製造に帰着する組換
えDNA法が明らかにされる。この組換えDNA法は、 （ａ） メタロプロテイナーゼ阻害剤活性をもつ蛋白、
好ましくはコラゲナーゼ阻害剤活性をもつ蛋白を生産す
るために宿主微生物を指揮できる簡易DNA配列の調製 （ｂ） 簡易DNA配列に対して操作しうる成分を含み、
宿主微生物へ移行され、その中で複製されるベクターへ
の簡易DNA配列のクローニング （ｃ） 簡易DNA配列及び操作成分を含むベクターのメ
タロプロテイナーゼ阻害剤蛋白を発現できる宿主微生物
への移行 （ｄ） ベクターの増幅及び阻害剤の発現に適当な条件
下での宿主微生物の培養 （ｅ） （ｉ） 阻害剤の回収及び （ii） 阻害剤に活性のある３次構造をとらせ、それに
よりメタロプロテイナーゼ阻害剤活性をもたせることか
ら成る。尚、（ｅ）（ｉ）又は（ii）の順序はいずれが
先でも差支えない。

さらにこれらの目的を達成するために、さらに本発明
の目的に従い、上述の簡易DNA配列の少なくとも１個を
含む一連のクローニング・ベクターが準備される。特
に、プラスミドpUC9−F5/237P10が明らかにされる。前
述の一般的記述及び以下の詳細な記述は本発明を例示的
に説明するものであつて、これによつてこの発明が限定
されるものではない。

この明細書の一部として組込まれ、かつその一部を構
成している各種の図表は、発明の１つの実施態様を示
し、記述の部分と共に、本発明の原理を説明するもので
ある。

発明を実施するための最良の形態 図及び以下の実施例と共にこの発明の最良の形態につ
いてふれながら、本発明の原理を説明する。

上述の様に、本発明は一つには、各種の宿主微生物に
おいて、メタロプロテイナーゼ阻害剤の細胞内生産を指
揮できる簡易DNA配列に関するものである。これに関連
して本発明においては“簡易DNA配列”は、合成により
生産されたヌクレオチド配列あるいは天然に存在するDN
A配列の制限断片と意味するものである。また、この明
細書では、“メタロプロテイナーゼ阻害剤”は、アミノ
酸配列の細胞内生産を指揮し、翻訳後修飾を含むあるい
は含まないデオキシリボ核酸配列に存在するコドンによ
り定義されるような蛋白の１次構造を意味する。そのよ
うな翻訳後修飾に例えばグリコシレーシヨンを含むこと
が期待される。さらに、“メタロプロテイナーゼ阻害
剤”という語は、微生物から排泄されるような蛋白の形
態あるいは、微生物から排泄されずに存在しているよう
なメチオニル−メタロプロテイナーゼ阻害剤と解釈する
ように意図されている。

好ましい形態としては、簡易DNA配列は、コラゲナー
ゼ阻害剤の細胞内生産を指揮できるものである。特に好
ましい形態としては、簡易DNA配列は、ヒト皮膚繊維芽
細胞培養から以前に分離されたものと生物学的に等価の
コラゲナーゼ阻害剤の細胞内生産を指揮できるものであ
る。明細書及び特許請求の範囲の中で用いられているよ
うな“生物学的に同等”という用語は、本発明の簡易DN
A配列用いて生産される阻害剤は、同一型のコラゲナー
ゼにより誘導される組織損傷を妨げることはできるが、
必ずしも天然のヒトコラゲナーゼ阻害剤、特に、ヒト皮
膚繊維芽細胞培養から分離されたヒトコラゲナーゼ阻害
剤と同等でなければならないことを意味する。

本発明の第１の最良の簡易DNA配列は次の様なヌクレ
オチド配列をもつ。

この中で、次のヌクレオチドは、下に示すような省略
であらわされている。ヌクレオチド 省 略 デオキシアデニル酸 Ａ デオキシグアニル酸 Ｇ デオキシシチジル酸 Ｃ チミジル酸 Ｔ 本発明の第２の最良の簡易DNA配列は、次のヌクレオ
チド配列をもつ。

この第２の配列において、読み取り枠はヌクレオチド
の１番から432番目に存在している。この読み取り枠の
最初のメチオニンは、ヌクレオチド49番から51番により
暗号化され、翻訳開始部位である。ヌクレオチド49番目
から114番目により指令されるアミノ酸配列は、天然の
メタロプロテイナーゼには見い出されないことは注目さ
れるべきである。この配列は、ヒト蛋白のリーダーペプ
チドであると信じられる。

第３の最良の簡易DNA配列は、次のヌクレオチド配列
をもつ。

この第３の配列は、第２の配列の５′非翻訳領域及び
第１の配列の３′領域を含む。この第３の配列は微生物
又は哺乳類の発現系で成熟ヒトコラゲナーゼ阻害剤類似
のメタロプロテイナーゼの細胞内生産を指揮できること
が想像される。

現在、動物細胞でのメタロプロテイナーゼ阻害剤の発
現について、第４の最良のDNA配列を使用した方法が最
も好ましい。この配列の解読鎖は次の様に読まれる。

本発明の実施において、蛋白配列中のいくつかのアミ
ノ酸の変化は、蛋白の基本的な性質には影響しないこと
を記憶せねばならない。それ故、同一のアミノ酸配列及
びメタロプロテイナーゼ阻害剤活性をももつ類似のアミ
ノ酸配列の細胞内生産を指揮できる他の簡易DNA配列は
本発明の範囲に含まれるものである。

これらの類似のアミノ酸配列のいくつかは本質的には
天然のヒトメタロプロテイナーゼ阻害剤と相同である
が、一方、メタロプロテイナーゼ阻害剤として機能する
ことができる他のアミノ酸配列は、天然の阻害剤と本質
的な相同性は示さないことが予期される。ここで用いら
れているような“本質的な相同性”という用語は、天然
のメタロプロテイナーゼ阻害剤との相同性の程度が、50
％を越えること、望ましくは60％、80％を越えることを
意味する。ここで議論されているような相同性のパーセ
ントは、参考文献としてここに特に引用するアトラス・
オブ・プロテイン・シーケンス・アンド・ストラクチヤ
ー（蛋白の配列と構造の図解）第５巻124ページ（1972
年）国立生化学研究財団、ワシントンD.C.中でM.O.デイ
ホフにより述べられているように、整列を補助するため
に100個のアミノ酸に４個のギヤツプが導入されると
き、比較する配列中の同一のアミノ酸残基を並べた２つ
の配列の小さな部分に見い出されるアミノ酸残基のパー
セントとして計算される。

上で注意したように、本発明の簡易DNA配列は合成的
に作製される。これらのポリヌクレオチド配列の合成作
製方法は、一般的に、この技術、習熟している者には特
にこの明細書に記載された開示に徴せば明らかなことで
ある。ポリヌクレオチド合成に関した技術の現在の状態
の例として、参考文献でこの中で引用するジヤーナル・
オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエテイ第103巻、3
185ページ（1981年）のM.D.マテウシとM.H.カルザース
及びテトラヘドロン・レターズ第22巻、1859ページ（19
81年）のS.L.ビユーケージとM.H.カルガースが挙げられ
る。

加えて、簡易DNA配列は、天然の配列の断片、即ち、
天然に生じ、本発明者により初めて分離精製されたポリ
ヌクレオチドの断片でも良い。ある形態において、簡易
DNA配列は、cDNAライブラリーから分離された制限断片
である。この最良の形態では、cDNAライブラリーはヒト
皮膚繊維芽細胞から作製される。

より好ましい形態では、簡易DNA配列は、ヒトのゲノ
ム・ライブラリーから分離される。この形態に役に立つ
ようなライブラリーの例は、参考文献として特に引用さ
れたローン等、セル第15巻、1157−1174ページ（1978
年）に述べられている。

又上記のように、本発明は、ここに述べられている簡
易DNA配列の少なくとも１個を各々含む一連のベクター
に関する。望みのメタロプロテイナーゼ阻害剤を大量に
生産する宿主微生物の能力を増加させるために簡易DNA
配列の追加コピーが単一のベクターに含まれることが予
期される。

さらに、本発明のクローニング・ベクターは、簡易DN
A配列の前あるいは後に補足的なヌクレオチド配列を含
む。これらの補足的配列は、簡易DNA配列の転写を妨害
せず、これ以降に充分述べられているようにある実施例
では、活性３次構造をとらせるため、得られたメタロプ
ロテイナーゼ阻害剤のアミノ酸の１次構造の能力、又、
転写、翻訳を増強させるものである。

本発明の最良のベクターは、図１に記載されている。
このベクター、pUC9−F5/237P10は、上述の最良のヌク
レオチド配列を含む。ベクターpUC9−F5/237P10は、受
託番号第53003号のもとメリーランド州ロツクビルのア
メリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨンに寄託さ
れたC600/pUC9−F5/237P10細胞内に存在している。

メタロプロテイナーゼ阻害剤を暗号化するヌクレオチ
ド配列は図１で領域Ａとして示されている。プラスミド
pUC9−F5/237P10は又、領域Ａの簡易DNA配列の前後に補
足ヌクレオチド配列を含む。これらの補足配列はそれぞ
れ領域Ｂ及びＣと同定される。

より好ましい形態においては、前あるいは後の補足配
列の一方又は両方が、補足配列の除去に適当な制限エン
ドヌクレアーゼによるベクターの処理で図１のベクター
から除去される。図１で領域Ｃとして同定された簡易DN
A配列に続く補足配列は、適当な制限エンドヌクレアー
ゼ、望ましくはHgiAIでベクターを処理することにより
除去され、続いて、合成オリゴヌクレオチドを用いて領
域Ａの３端が再構築され、Ｔ−4DNAリガーゼでベクター
の連結がおこなわれる。図１で領域Ｂとされた簡易DNA
配列の前にある補足配列の欠失は、特に、実施例２で述
べられている方法により遂行される。

最良の形態では、本発明の簡易DNA配列を含み、発現
することができるクローニング・ベクターは、各種の操
作成分を含む。ここで述べられているこれらの“操作成
分”は、少なくとも１個のプロモーター、少なくとも１
個のシヤイン・ダルガノ配列、少なくとも１個の終止コ
ドンを含む。好ましくは、これらの“操作成分”は又、
少なくとも１個のオペレーター、少なくとも１個のリー
ダー配列、及び、細胞内空間から移送される蛋白に関し
て、少なくとも１個の調節因子及びベクターDNAの適正
な転写とそれに続く翻訳に必要なあるいは望ましい他の
DNA配列を含む。

ここで述べられている簡易DNA配列の１個又はそれ以
上を含む他の既知のあるいは目下発見されていないベク
ターを使用するときに、本発明がさらに具体化されるこ
とが想像される。特に、これらのベクターが次の性質の
うちのいくつか又は全てをもつことが好ましい： （１） 最小数の宿主生物の配列をもつ、（２） 望み
の宿主中で安定である、（３） 望みの宿主中で、高コ
ピー数で存在可能である、（４） 調節可能なプロモー
ターをもつ、（５） 簡易DNA配列が挿入されている場
所とは別のプラスミドの一部に存在する選択特性をコー
ドする少なくとも１個のDNA配列をもつ、及び（６）
ベクターに組込まれる。

次のクローニングベクターのリストは、上述の基準を
満たすために容易に変えることができるベクターを述べ
ており、それ故、本発明に使用しやすい。そのような変
化は容易に、入手可能な文献及びこの中の教訓による技
術に普通に精通する者により成就される。上に確認され
た性質をもち、それ故、本発明への使用に適する別のク
ローニング・ベクターが現在存在し、発見されるであろ
うことを理解すべきである。これらのベクターは又、必
要な操作成分と共に簡易DNA配列が導入された新しい一
連のクローニング・ベクターの範囲内にあると予想さ
れ、変化したベクターは本発明の範囲 内に含まれ、以下にさらに充分に述べられている組換え
DNA法を使用することが可能である。

上のリストに加えて、実施例２に述べられているよう
な大腸菌のベクター系が、クローニング・ベクターとし
て具体的に好ましい。さらに、グラム陰性菌の広い範囲
で独立的に複製するいくつかのベクタープラスミドが、
シユードモナス属の宿主でのクローニング媒体としては
使用しやすい。これらは、それぞれ参考文献として引用
されているが、バイオテクノロジー1983年５月、269−2
75ページに、R.C.テイト、T.J.クローズ、R.C.ルンドク
ウイスト、M.ハギヤ、R.L.ロドリグとC.I.カドにより、
ジエネテイツク・エンジニアリング・イン・ザ・プラン
ト・サイエンス（植物科学における遺伝子工学）、プレ
ーガー出版、ニューヨーク州ニューヨーク、163−185ペ
ージ（1981年）にN.J.パノポロスにより、カレント・ト
ピツク・イン・マイクロバイオロジー・アンド・イミユ
ノロジー第96巻31−45ページ（1982年）にK.サカグチに
より述べられている。

特に好ましい構築では、参考文献としてあげているよ
うに、プラスミズ・オブ・メデイカル・エンバイアメン
タル・アンド・コマーシヤル・インポータンス（医学環
境及び商業上重要なプラスミド）、K.N.テイミスとA.プ
ーラー編、エルゼビア／ノース・ホランド・バイオメデ
イカル・プレス（1979年）の中で、M.バグダサリアン、
M.M.バグダサリアン、S.コールマンとK.N.テイミスによ
り述べられている。プラスミドRSF1010及びその誘導体
が使用されている。RSF1010の利点は、簡単に大腸菌と
シユードモナス属の両者に形質転換され、安定に保持さ
れる比較的小さな、高コピー数のプラスミドであること
である。この系では、参考文献としてあげられている
が、カレント・トピツクス・イン・マイクロバイオロジ
ー・アンド・イミユノロジー第96巻、31−45ページ（19
82年）のK.サカグチと、バイオテクノロジー1984年２
月、161−165ページのG.L.グレイ、K.A.マツケオウン、
A.J.S.ジヨーンズ、P.H.ジーバーグとH.L.ハイネカーに
より述べられているように、大腸菌trpプロモーターは
シユードモナスのRNAポリメラーゼにより直ちに認識さ
れるので、大腸菌について述べられているようにTac発
現系を用いることが望ましい。転写活性は、プロモータ
ーを例えば、大腸菌又はP.アエルギノサのtrpプロモー
ターに交換することによりさらに最大化される。

最良の形態では、P.アエルギノサは、細胞内産物ある
いはプロセシングと細胞からの運搬に影響を及ぼすリー
ダー配列と共役した産物としてメタロプロテイナーゼ阻
害剤を合成するベクターで形質転換される。この形態で
は、これらのリーダー配列は、むしろβ−ラクタマー
ゼ、OmpA蛋白、天然に存在するヒトの信号ペプチド及び
シユードモナスのカルボキシペプチダーゼG2から成るグ
ループから選択される。翻訳は実施例２で述べられてい
るように、メタロプロテイナーゼ阻害剤を細胞内で発現
させる宿主に高度に発現する蛋白の開始部位同様、大腸
菌蛋白の翻訳開始と一緒になつている。

宿主のシユードモナス属で制限系のない菌株が得られ
ない場合、大腸菌から分離されたプラスミドでの形質転
換の効率は低い。それ故、参考文献としてあげられたM.
バグダサリアン等、プラスミズ・オブ・メデイカル・エ
ンバイアメンタル・アンド・コマーシヤル・インポータ
ンス、411−422ページ、テイミスとプーラー編、エルゼ
ビア／ノース・ホランド・バイオケミカル・プレス（19
79年）に述べられているように、望みの宿主での形質転
換の前に、シユードモナスのクローニング・ベクターを
別の種のr^-m⁺株に移すことが望まれる。

さらに、バチルス属の宿主での好ましい発現系は、ク
ローニング媒体としてプラスミドpUB110を用いることを
包含する。他の宿主ベクター系での場合同様、バチルス
の場合、細胞内あるいは分泌蛋白として本発明のメタロ
プロテイナーゼ阻害剤を発現することができる。本形態
は両方の系を含む。バチルス及び大腸菌の両者で複製す
るシヤトル・ベクターは、ジエネテイツク・エンジニア
リング（遺伝子工学）第２巻、セツトローとホランダー
編、プレナム、プレス、ニユーヨーク州ニユーヨーク、
115−131ページ、（1980年）にD.ダブナウ、T.グリクザ
ン、S.コンテントとA.G.シドクマーが述べているように
各種遺伝子を構築し試験することにより得られる。B.ズ
ブチリスからのメタロプロテイナーゼ阻害剤の発現と分
泌のために、α−アミラーゼの信号配列がメタロプロテ
イナーゼ阻害剤の暗号領域と一緒にされる。メタロプロ
テイナーゼ阻害剤の合成のため、簡易DNA配列は、α−
アミラーゼのリーダー配列のリボソーム結合部位に翻訳
的につながれる。

これらの構築物のいずれかの転写は、α−アミラーゼ
のプロモーター又はその誘導体により指揮される。この
誘導体は、天然のα−アミラーゼ・プロモーターのRNA
ポリメラーゼ認識配列を含むが、同様にlacオペレータ
ー領域を組込んでいる。ペニシリナーゼ遺伝子のプロモ
ーターとlacオペレーターから構築された類似の雑種プ
ロモーターは、ジエネテイクス・アンド・バイオテクノ
ロジー・オブ・バチリ（バチルスの遺伝学と生物工
学）、A.T.ガネサンとJ.A.ホツク編、アカデミツクプレ
ス、249−263ページ（1984年）でD.G.ヤンスラとヘナー
により述べられているように調節様式でバチルス宿主の
中で機能することが示されている。lacI9のlacI遺伝子
も又、調節を果たすために含まれる。

クロストリジウムでの発現のための好ましい構築は、
ジヤーナル・オブ・バクテリオロジー、第159巻、460−
464ページ（1984年）に述べられているD.L.ヘーフナー
等の方法でC.パーフリンゲンスに形質転換されたプラス
ミドpJU12（ジヤーナル・オブ・バクテリオロジー、第1
59巻、465−471ページ（1984年）にC.H.スクワイア等に
より述べられている）である。転写は、テトラサイクリ
ン耐性遺伝子のプロモーターにより指揮される。翻訳
は、他の宿主で用いるのに適しているベクターで上に概
略した方法に全く類似した様式で、この同じtet^r遺伝子
のシヤイン・ダルガリ配列に連結されている。

酵母に導入された外来DNAの保持は、数種の方法で果
たされる（モレキユラー・バイオロジー・オブ・ザ・イ
ースト・サツカロマイセス（酵母サツカロマイセスの分
子生物学）、コールド・スプリング・ハーバー研究所、
ストラサン、ジヨーンズとブローチ編、607−636ペー
ジ、（1982年）中の、D.ボツトスタインとR.W.デイビ
ス）。サツカロマイセス属の宿主生物を用いた１つの好
発現系は、２μｍプラスミド上に抗コラゲナーゼ遺伝子
をもつ。２μサークルの利点は、cir⁰株に導入される
と、比較的高コピー数で安定であることである。これら
のベクターは好ましくは、複製起源と、大腸菌で複製と
選択させるために少なくとも１つのpBR322からの抗生物
質耐性マーカーを組込んでいる。加えて、プラスミド
は、酵母のLEU2変異体で同一目的を果たすために２μの
配列と酵母のLEU2遺伝子をもつ。

酵母GAL1遺伝子の調節プロモーターは、簡易DNA配列
遺伝子の転写を指揮するのに適合している。酵母での簡
易DNA配列の翻訳は、酵母α−因子の分泌を指揮するリ
ーダー配列につなげられる。これは、酵母内で処理さ
れ、メタロプロテイナーゼ阻害剤を分泌させる融合蛋白
の形成を引き起こす。かわつて、メチオニル・メタロプ
ロテイナーゼ阻害剤が細胞内含有物として翻訳される。

酵母でのメタロプロテイナーゼ阻害剤をコードするmR
NAの翻訳は実施例２に明らかにされているように、原核
生物の偏りを調整されているpUC8−Ficに存在する配列
を用いるよりも、酵母のコドン使用を用いた方がより効
率的であることが予想される。このため、TthlllI部位
で始まる簡易DNA配列の５′端の部分は、再合成される
方が好ましい。新しい配列は、酵母で最も頻繁に使用さ
れるコドンを与える。この新しい配列は好んで次のヌク
レオチド配列をもつ。

上のリスト及び説明に含まれる個々のクローニング・
ベクターと系の試験からわかるように、各種の操作成分
が本発明のベクターのそれぞれに存在する。必要とされ
るかもしれない別の操作要素を当業者は特に本明細書記
載の教示に照らしてじようとう手段を用いてこれらのベ
クターに付加されることが予想される。

実際に、これらのベクターのそれぞれを簡単に分離、
集合、置換される方法で構築することができる。これ
は、これらの成分とメタロプロテイナーゼ阻害剤の暗号
領域の組合わせからなり多くの機能的な遺伝子の集合を
容易にする。さらに、これらの成分の多くは、１種以上
の宿主に応用することができる。

少なくとも１個の選択マーカー及び簡易DNA配列の転
写を開始できる少なくとも１個のプロモーター配列に加
えて、予想される宿主微生物に認識される少なくとも１
個の複数開始点がこれらのベクターに含まれることが予
想される。ある程度好ましい形態でのベクターは、調節
因子として機能することができるDNA配列（“オペレー
ター”）と、調節蛋白をコードすることができる他のDN
A配列を含むことがさらに予想される。この一連のベク
ターで、ベクターはさらに、リボソーム結合部位、転写
終了暗号及びリーダー配列を含む。

ある形態におけるこれらの調節因子は、ある環境条件
の存在で簡易DNA配列の発現を妨げ、他の環境条件下で
簡易DNA配列によりコードされる蛋白の転写とそれに続
く発現をさせる。特に、簡易DNA配列を発現させるよう
なベクターへ挿入される調節部分は、例えば、イソプロ
ピルチオ−β−ｄ−ガラクトシドなしでは生じないこと
がむしろ選ばれる。この場合、簡易DNA配列を含む形質
転換された微生物は、メタロプロテイナーゼ阻害剤の発
現の開始前に、望ましい密度まで生育される。この形態
において、望むプロテアーゼ阻害剤の発現は、望む密度
に達した後にDNA配列の発現をさせることのできる微生
物環境に基質を添加することにより誘導される。

加えて、ベクターの中あるいは簡易DNA配列の５′端
に存在する適正な分泌のリーダー配列、介在する転写又
は翻訳の終了信号なしに、プロテアーゼ阻害剤の発現を
指揮できるヌクレオチド配列の開始部分に直接隣接する
ような位置にあるリーダー配列がむしろ選ばれる。リー
ダー配列の存在は次の理由のうち１つ又はいくつかのた
めに望まれる。１） リーダー配列の存在は、最初の産
物の成熟組換えメタロプロテイナーゼ阻害剤への宿主の
処理を促進する。２） リーダー配列の存在は細胞質の
外のメタロプロテイナーゼ阻害剤を指揮することによ
り、組換えメタロプロテイナーゼ阻害剤の精製を促進す
る。３） リーダー配列の存在は、細胞質外のメタロプ
ロテイナーゼ阻害剤を指揮することにより、組換えメタ
ロプロテイナーゼ阻害剤の活性構造への折りたたみの能
力へ影響を及ぼす。

特に、リーダー配列は、リーダー配列を除去するため
に、リーダーペプチダーゼによる最初の翻訳産物の切断
を指揮し、潜在的なメタロプロテイナーゼ阻害剤活性を
もつアミノ酸配列をもポリペプチドを残す。ある種の宿
主微生物では、適当なリーダー配列の存在は、大腸菌の
場合のように完全な蛋白をペリプラズマへ移送させる。
ある酵母とバチルス及びシュードモナスの菌株の場合に
適当なリーダー配列は、細胞膜を通つて細胞外の培地へ
蛋白を移送させる。この場合、蛋白は細胞外蛋白から精
製される。

第３に、本発明により調製されるいくつかのメタロプ
ロテイナーゼ阻害剤の場合、リーダー配列の存在は完全
な蛋白が活性構造を呈するために折りたたまれる環境に
所在し、その構造が適当なメタロプロテイナーゼ活性を
もつのに必要である。

さらに、操作成分には限定はされないが、リボソーム
結合部位及び外来蛋白の微生物での発現に必要な他のDN
A配列を含んでいる。ここで議論されているような操作
要素は、以前の文献及びこの明細書による技術に習熟し
た者によりルーチンに選択される。これらの操作成分の
一般的な例は、B.レーウイン ジーン（遺伝子）、ウイ
リー＆サンズ、ニユーヨーク（1983年）に述べられてい
る。適当な操作成分の各種の例は、上で議論したベクタ
ーに認められ、前述のベクターの基本的な性質を議論し
た出版物の総説により明らかにされる。

本発明の１つの好ましい形態において、付加的なDNA
配列は、メタロプロテイナーゼ阻害剤をコードしている
簡易DNA配列のすぐ前に所在している。付加的DNA配列
は、翻訳の連結者として機能することができる、即ち、
DNA配列は、メタロプロテイナーゼ阻害剤のリボソーム
結合部位に隣接したリボソームを正しい位置におかせる
RNAを暗号化する。

上に議論したクローニング・ベクターの全ての必要な
そして望みの構成因子の合成及び／又は分離に関して、
ベクターは、一般的に知られている方法で集められる。
そのようなベクターの集合は、技術者によりおこなわれ
る義務と仕事の範囲内で、それ自体、過度の実験なしに
おこなわれると信じられている。例えば、類似のDNA配
列は、シヨーナー等、プロシーデイングス・オブ・ザ・
ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・US
A第81巻5403−5407ページ（1984年）に述べられている
ように、適当なクローニング・ベクターに連結される。

本発明のクローニング・ベクターの構築について、簡
易DNA配列とそれに付随する操作要素の多重コピーがそ
れぞれのベクターに挿入されていることをさらに注目す
べきである。そのような形態において、宿主生物は、望
むメタロプロテイナーゼ阻害剤をベクターあたり大量に
生産する。ベクターに挿入されたDNA配列の多重コピー
数は、大きさのため、得られたベクターの適当な宿主微
生物への移行とその中での複製及び転写の能力によつて
のみ限定される。

さらに、クローニング・ベクターは、薬剤耐性マーカ
ーあるいは、宿主微生物により選択的な特徴の発現を引
き起こさせる他のマーカーのような選択マーカーを含む
ことが好まれる。本発明の特に好ましい形態では、アン
ピシリン耐性遺伝子がベクターpUC9−F5/237P10に含ま
れている。

そのような薬剤耐性あるいは他の選択マーカーは、形
質転換体の選択を部分的に促進するようである。さら
に、クローニング・ベクター上のそのような選択マーカ
ーの存在は、培養培地中で雑菌が増殖するのを防ぐのに
役立つ。この形態において、そのような形質転換された
宿主微生物の純粋培養は、生存のために誘導された表現
型を必要とする条件下で微生物を培養することで得られ
る。

この形態において、３′非翻訳配列を集合させるため
に、暗号領域の３′端を再構築するのが望ましいという
ことは注目に値する。プロシーデイングス・オブ・ナシ
ヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・USA第7
8巻、4936−4940ページ（1981年）にR.ゲンツ、A.ラン
グナー、A.C.Y.チヤン、S.H.コーエンとH.ブヤードによ
り同定されているように、mRNAを安定化し、あるいはそ
の転写を強め、そして、ベクターを安定化する強力な転
写終了信号を準備する配列が、これらの非翻訳配列に含
まれる。

この発明は、又、メタロプロテイナーゼ阻害剤の生産
に関する組換えDNA法に関する。一般的に、その方法
は、以下を含む。

（ａ） メタロプロテイナーゼ阻害剤活性をもつ蛋白を
生産するために宿主微生物を指揮できる簡易DNA配列を
調製すること。

（ｂ） 宿主微生物へ移され、そこで複製できるベクタ
ーへの簡易DNA配列のクローニング。そのようなベクタ
ーは、簡易DNA配列に対しての操作成分を含む。

（ｃ） 簡易DNA配列及び操作成分を含むベクターのメ
タロプロテイナーゼ阻害剤蛋白を発現できる宿主微生物
への移行。

（ｄ） ベクターの増幅と阻害剤の発現に適当な条件下
での宿主微生物の培養。及び （ｅ） （ｉ） 阻害剤の回収、及び （ii） 阻害剤に活性３次構造をとらせること。それ
によりメタロプロテイナーゼ阻害剤活性をもつようにな
る。尚、（ｅ）（ｉ）又は（ii）のいずれを先きに行つ
て良い。

この方法において、簡易DNA配列は、上述の合成又
は、天然に存在するポリヌクレオチドである。本方法の
好ましい形態では、簡易DNA配列は次の様なヌクレオチ
ド配列をもつ。

本方法で役に立つと予想されるベクターは上述のベク
ターである。最良の形態では、クローニングベクターpU
C9−F5/237P10が、明らかにされた方法で用いられてい
る。

得られたベクターは、それから適当な宿主微生物に移
される。異種DNAを取り込み、それらの遺伝子及び付随
する操作成分を発現する能力をもつ微生物は選択され
る。宿主微生物には嫌気性菌、通性嫌気性菌あるいは好
気性菌が選択される。この方法に用いられる特定の宿主
は酵母と細菌を含む。特定の酵母にはサツカロミセス
属、特にサツカロミセス・セレビシエが含まれる。

特異的な細菌には、バチルス、エツシエリヒア、シユ
ードモナス属のものが含まれる。各種の他の好ましい宿
主は表Ｉに述べられている。本発明の他のかわりになる
好ましい形態において、バチルス・ズブチリス、エツシ
エリヒア・コリ又はシユードモナス・アエルギノサが宿
主微生物として選択されている。

宿主生物を選択した後、ベクターが一般的に既知の方
法で宿主生物に移される。そのような方法の例はアドバ
ンスト・バクテリアル・ジエネテイクス、R.W.デイビス
等、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、ニユー
ヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（1980年）に
見い出される。ある形態において、温度調節が上述の操
作要素の使用による遺伝子発現を調節する手段として予
想されるときには、形質転換は低温でおこなわれるのが
望ましい。別の形態で、浸透圧調節因子がベクターに挿
入されているならば、形質転換の間の塩濃度の調節は、
合成遺伝子の適当なコントロールを保証するのに必要で
ある。

組換えメタロプロテイナーゼ阻害剤が最終的に酵母で
発現されることが予想されるならば、まずクローニング
・ベクターは、大腸菌に移され、そこで複製され、増幅
の後に、そこから回収精製されるのが望ましい。ベクタ
ーはそれからメタロプロテイナーゼ阻害剤の最終的な発
現のために酵母に移される。

宿主微生物はメタロプロテイナーゼ阻害剤の発現に適
当な条件下で培養される。これらの条件は一般的には宿
主生物にに特異的で、そのような生物の生育条件に関し
て出版されている文献、例えばバージエイズ・マニユア
ル・オブ・デイターミネイテイブ・バクテリオロジー第
８版、ウイリアムズ＆ウイルキンス・カンパニー、メリ
ーランド州バルチモアに従い、技術者により確実に決定
される。

ベクターに挿入されたあるいは存在する操作要素に依
存するDNA配列の発現の調節に必要な条件は、結果とし
て、形質転換と培養段階である。ある形態において、DN
A配列の発現を阻害する適当な調節条件の存在下で高密
度まで細胞が生育される。最適細胞密度に達すると、環
境条件は、簡易DNA配列を発現するのに適した条件に変
化する。それ故、メタロプロテイナーゼ阻害剤の生産
は、最適密度近くまで宿主細胞を生育した次の時期に起
き、その結果得られたメタロプロテイナーゼ阻害剤は、
発現に必要な調節条件が誘導された後にある程度の時間
で回収されることが予期される。

本発明の好ましい形態において、組換えメタロプロテ
イナーゼ阻害剤は、回収に続いて、活性構造の仮定の前
に精製される。再び折りたたまれた蛋白の高収量の回収
が蛋白が最初に精製されると促進されると発明者は信じ
るのでこの形態が好ましい。しかし、別の形態では、メ
タロプロテイナーゼ阻害剤は、精製前にその活性構造を
仮定するために折りたたまれた状態に戻される。またさ
らに別の形態では、メタロプロテイナーゼ阻害剤は、培
養培地からの回収について、その再び折りたたまれた活
性のある状態を仮定することがおこなわれた。

ある周囲環境では、メタロプロテイナーゼ阻害剤は、
宿主微生物の中で発現し、細胞壁又は膜を通りあるいは
ペリプラズムへ蛋白を移送するために正しい活性構造を
呈する。これは一般的に、適当なリーダー配列をコード
するDNAが組換え蛋白をコードするDNAに接していると起
きる。本発明の好ましいメタロプロテイナーゼ阻害剤
は、内側の細胞膜の外へ移送するために、成熟活性型を
呈する。数多くの信号ペプチドの構造は例えばヌクレイ
ツク・アミド・リサーチ第12巻、515−5164・1984年に
E.E.マリオン、ワトソンにより公表されている。簡易DN
Aと共に、これらのリーダー配列は、細胞膜を通つて移
動し、細胞から放出されると切断されるリーダー配列部
分をもつ融合蛋白の細胞内生産を指揮する。

好ましい形態では、大腸菌OmpA蛋白の信号ペプチド
は、リーダー配列として使用され、メタロプロテイナー
ゼ阻害剤構造をコードする簡易DNA配列に続く位置に所
在する。

さらに好ましいリーダー配列としてβ−ラクタマー
ゼ、カルボキシペプチダーゼG2及びヒト信号蛋白のもの
が含まれる。これら及び他のリーダー配列が述べられて
いる。

メタロプロテイナーゼ阻害剤が正しい活性構造をとら
ないと、形成されているジスルフイド結合及び／あるい
は、生じた非共有的な相互作用が最初に例えば塩酸グア
ニジン及びβ−メルカプトエタノールのような変性剤及
び還元剤により、コントロールされた条件下でこれらの
試薬の希釈及び酸化に続いて活性構造を呈する前に破壊
される。

ここで予想される転写終了信号はベクターを安定化す
るのに役立つ。特に、プロシーデイングス・オブ・ナシ
ヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブUSA第78
巻、4936−4940ページ（1981年）にゲンツ等により述べ
られている配列は、本発明への利用が予想される。

本発明の明細書の科学的問題あるいは環境への応用
は、ここに含まれる明細書に従つた技術に習熟した者の
能力の範囲内であることは理解されるべきである。本発
明の生産の実施例及び分離と製造に関する代表的な過程
は次の例に表わされている。

実施例 実施例１ HEF−SA繊維芽細胞からのポリ（A⁺）RNAの調製 HEF−SA細胞が75cm²T−フラスコで、コンフルエント
近くまで生育された。細胞はダルベツコのリン酸緩衝化
塩溶液で２度洗浄され、2mlの１％（w/v）SDS（BDHケミ
カルスLtd.、プール、英国から入手）、5mM EDTA及び2
0μg/mlプロテアーゼＫ（ベーリンガーマンハイム・バ
イオケミカルス、インデイアナ州インデイアナポリスか
ら入手）を含む10mM Tris、pH7.5を添加することによ
り集められた。それぞれのフラスコを相続いてこの同じ
溶液でさらに1mlを用いて洗浄した。

細胞回収からプールした液体がプロテアーゼＫで70μ
g/mlにされ、40℃で45分間保温された。蛋白分解処理さ
れた溶液は、5Mの保存液を添加することにより、NaCl濃
度150mMにされ、続いて等量のフエノール：クロロホル
ム1:1で抽出された。水層が等量のクロロホルムで再抽
出された。２容のエタノールが水層に添加され、１晩−
20℃で保温された。沈澱した核酸は、ベツクマンJ2−21
遠心機（ベツクマン・インストルメンツ、カリフオルニ
ア州パロアルト）で17500xgで10分間遠心することによ
り回収された。そして25mlの0.1％（w/v）SDSに再溶解
された。この溶液は再び等量のクロロホルムで抽出され
た。水層に２容の冷却したエタノールが添加され、−20
℃に２時間保存された。沈澱が10000xgで15分間の遠心
により集められ、10mlの1mM Tris、0.5mM EDTA、0.1
％SDS、pH7.5に再溶解された。RNAは、この溶液から、1
0mlの4M LiCl、20mM酢酸ナトリウムpH5.0を添加するこ
とにより再沈澱され、−20℃で18時間保温された。沈澱
は再び遠心により回収され、1mM Tris、0.5mM EDTA
0.1％SDS pH7.5に再溶解する前に2M LiClで２度洗浄
された。この溶液は−70℃で保存された。

オリゴdTセルロースによるクロマトグラフイー 上で調製された全細胞RNAはエタノールで沈澱され、
0.5M NaClに再溶解された。0.45mg/mlのRNA5mlが洗浄
されたタイプVIIオリゴdTセルロース（PLバイオケミカ
ルズ、ウイスコンシン州ミルウオーキーから入手）の1m
lカラムに充填された。カラムはそれから10mlの0.5M N
aClで洗浄され、2.0mlの滅菌水で溶出された。RNAの溶
出されたポリ（A⁺）画分は、エタノールで沈澱され、1m
g/ml溶液になるように、1mM Tris、0.1mM EDTA、pH8.
0に溶解された。これは−70℃で保存された。

cDNA合成 ポリ（A⁺）RNAは、AMV逆転写酵素（ライフサイエンス
Inc.フロリダ州St.ピータースバーグから入手）によるc
DNA合成の鋳型として容いるためにオリゴdT（PLバイオ
ケミカルズ、ウイススコンシル州ミルウオーキから入
手）で準備された。合成反応に続いて、RNAは、0.1容の
3N NaOHの添加により加水分解され、67℃で10分間保温
された。溶液はそれから中和され、cDNAは、バイオゲル
A1.5（バイオラツド・ラボラトリー、カリフオルニア州
リツチモンドから入手）の0.7×25cmカラムで、10mM T
ris、5mM EDTA、１％SDS、pH7.5の溶液によるゲル濾過
クロマトにより精製された。cDNAを含む画分が集めら
れ、エタノール沈澱により濃縮された。cDNAにdGのテイ
ルがつけられ、上述の方法を用いたゲル濾過により精製
された。第２鎖の合成は、オリゴdCで準備され、DNAポ
リメラーゼの大（クレノウ）断片（ベーリンガー・マン
ハイムから入手）を用いた開始反応で重合された。第２
鎖の合成に続いて、大腸菌DNAポリメラーゼＩ（ベーリ
ンガー・マンハイムから入手）が添加され、平滑末端を
形成するために、保温が続けられた。２本鎖cDNAはクロ
マトグラフイーにより再精製された。cDNAの中にあるEc
oRI制御部位は、ニユーイングランド・バイオラボ、マ
サチユーセツツ州ベバリーから入手したEcoRIメチラー
ゼの作用により修飾された。cDNAは再び精製され、合成
EcoRIリンカーに連結された。最終的に、末端はエンド
ヌクレアーゼで削られてcDNAはゲル濾過で精製された。
このDNAは、試験管内でパツケージングされたλgt10DNA
の唯一のEcoRI部位に連結され、DNAクローニング・テク
ニクス・ア・プラクテイカル・アプローチ（DNAクロー
ニング技術、実際の研究方法）、D.M.グローバー編、IR
Lプレス、オツクスフオード（印刷中）でT.V.ヒユー
ン、R.A.ヤングとR.W.デイビズにより述べられている方
法に従い大腸菌hflA株の感染に使用された。およそ2500
0の組換え体がこの方法で増幅された。

スクリーニング 対象の配列を含む組換え体フアージは、これ以降FIBA
Cとして引用される望みのメタロプロテイナーゼ阻害剤
の１次構造部分を暗号化する合成オリゴヌクレオチドに
対する選択的なハイブリダイゼーシヨンにより選択され
た。蛋白配列のこれらの部分は、G.P.ストリツクリンと
H.G.ウエルガス、ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー第258巻、12252−12258（1983年）により
公表された文献に述べられているものと一部が相当す
る。組換え体フアージは、大腸菌hflA株感染に用いら
れ、約２×10³pfu/150mmペトリ皿の密度でプレートにま
かれた。フアージはニトロセルロース濾紙（BA85、シユ
ライヒヤー＆シユエルInc.ニユーハンプシヤー州キー
ン）上に移し取られ、DNAは、サイエンス第196巻、180
−182ページ（1979年）の中でベントンとデイビスによ
り述べられているように変性固定された。

この方法を用いて、濾紙は順にそれぞれ10から15分
間、0.5M NaCl、それから1.0M Tris 1.5M NaCl pH
8.0で処理され、そして最後に２×SSPEに浸された。
（２×SSPEは、0.36M NaCl、20mM NaH₂PO₄、2mMEDTA
pH7.4である）。濾紙は乾燥され、75゜から80゜で３
から４時間焼かれた。重複した濾紙はそれぞれのプレー
トから作られた。濾紙は、0.1×SFT、0.15％NaPPi及び
１×デンハルト溶液を含む５×SSPE中で37℃で１−３時
間予めハイブリダイズされた。濾紙はそれから、72時
間、37℃で、比活性約10⁶cpm/pmoleの５′末端標識した
51merオリゴヌクレオチドを５×10⁵cpm/ml含む同溶液中
でハイブリダイズされた。ハイブリダイゼーシヨンに続
いて、濾紙は６回0.1×SETと0.05％ピロリン酸ナトリウ
ムを含む５×SSPEで37℃で洗浄され、それから、３度２
×SSPEで21℃で洗浄された。これらはその後乾燥され、
−70゜でコダツクのライトニング・プラス・インテンシ
フアイングスクリーンを用いて、コダツクXAR−５フイ
ルム上でオートラジオグラフがおこなわれた。重複した
濾紙から明らかに見ることができる信号がプラーク精製
のためのフアージを釣るのに使用された。プラーク精製
段階の濾紙の調製とハイブリダイゼーシヨンの方法は上
と同じであつた。洗浄方法は、37℃で２×SSPEの６回交
換に簡略化された。繰り返しのプレーテイングにより精
製された６個の単離体がそれから次のプローブでの試験
のために大腸菌C600株の単相の上にまかれた。

（対照プラークに対するものとして）分離したものの
それぞれに対する17−merの選択的ハイブリダイゼーシ
ヨンは、プラーク精製に使用したのと同一条件下で観察
された。プローブＣは、ハイブリダイゼーシヨン中のSS
PE濃度が４×に減少したことを除いて類似の試験に用い
られた。さらに、それぞれの単離体は、対照プラークで
よりもより強いプローブとのハイブリダイゼーシヨンを
決定した。

フアージ精製とcDNAの特徴づけ ６個の単離されたフアージのそれぞれの量は、プレー
トストツク法により決定され、連続のCsCLブロツク勾配
遠心により精製された。DNAは、マニユアル・フオー・
ジエネテイツク・エンジニアリング：アドバンスト・バ
クテリアル・ジエネテイクス（遺伝子工学マニユアル：
先進的な細菌遺伝学）1980年、コールド・スプリング・
ハーバー研究所の中でR.W.デイビス、D.ボツトスタイ
ン、J.R.ロスにより述べられているように、50％ホルム
アミドに対して透析することによりこれらから抽出され
た。それぞれの単離体からのDNAは、EcoRIで消化され、
その産物はアガロース・ゲル電気泳動により解析され
た。大きなクローンの１つ、λFIBAC5の挿入は、SalI、
Hind III、BamHI及びEcoRIに対する内部部位を欠くこと
がわかつた。cDNA挿入は、これら４種の酵素で一緒にλ
FIBAC5DNAとλの腕を消化することにより明らかとなつ
た。断片がそこからエタノール沈澱され、さらに精製す
ることなしにプラスミドpUC9のEcoRI部位に連結され
た。これらのプラスミドは、その後、大腸菌JM83株を形
質転換するのに使用された。形質転換体は、アンピシリ
ンを含む平板で選択された。数個の形質転換体のプラス
ミドが精製され、EcoRI消化産物に基づいて特徴が調べ
られた。アガロースゲル電気泳動でλFIBAC5の挿入と共
に移動する挿入をもつ１個が選択された。このプラスミ
ドは、pUC9−F5/237P10と命名された。

マツピングとサブクローニング pUC9−F5/237P10の挿入が内部のPstI部位に関してマ
ツプされた。EcoRIとPstIの２重消化は、３ケ所内部にP
stI認識部位があることを示した。完全な挿入と成分断
片がM13バクテリオフアージmpl9とmpl8にそれぞれサブ
クローニングされた。断片のシーケンシングが、プロシ
ーデングス・オブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス・オブ・USA第74巻、5463−5467ページ（1977
年）の中で、サンガー等、F.サンガー、S.ニツクレンと
A.R.コールソンにより述べられたジデオキシヌクレオチ
ド法によりおこなわれた。

pUC9−F5/237P10のDNA挿入の配列は、ヒト皮膚繊維芽
細胞から分離されるものと生物学的に等しい成熟繊維芽
細胞コラゲナーゼ阻害剤の１次構造を暗号化する読み取
り枠を示した。配列の顕著な特徴は、 （１） 挿入はEcoRI制限部位及びクローニング法と一
致したG/CおよびA/Tのホモポリメリツク領域に隣接す
る。

（２） 暗号鎖は、又用いた技術で一致して、５′端に
ポリＣ、３′端にポリＡをもつ５′から３′に通常通し
存在する。

（３） ポリＣ領域の３′端にすぐに隣接する配列GTTG
TTGの最初のＧがヌクレオチドの第１番と考えられるな
らば、ヌクレオチド第34番から始まりヌクレオチド第58
5番まで続く、成熟ヒト繊維芽細胞コラゲナーゼ阻害剤
の１次構造を暗号化する読み取り枠が存在する。

（４） ヌクレオチド586番から588番の終止コドンTGA
は、成熟蛋白のものと同一の翻訳産物のカルボキシ末端
を決定する。

（５） ヌクレオチド１番から33番は、プロセシングさ
れた蛋白の１次構造には見られないが、おそらく、分泌
蛋白のリーダーペプチドの性質をもつ部分のアミノ酸配
列を定義する。

（６） ３ケ所のPstI部位は、最初の塩基ヌクレオチド
が298、327及び448番である。

（７） ヌクレオチド78番から始まる制限酵素TthlllI
の唯一の認識配列がある。及び （８） ヌクレオチド227番から始まる制限エンドヌク
レアーゼNcoIの唯一の認識配列がある。

ヌクレオチド１番から703番の配列及び制限部位の解
析が示されている。

以下は存在しない。

AAT 2 AFL 2 AFL 3 AHA 3 APA 1 ASU 2 AVA 3 AVR 2 BAL 1 BAM H1 BCL 1 BGL 1 BGL 2 BIN 1 BSSH 1 BST E2 CFR 1 CLA 1 ECO R5 FNUD 2 GDI 2 HAE 1 HGA 1 HGI C1 HGI D1 HGI J2 HIND 3 HPA 1 KPN 1 MUL 1 MST 1 NAE 1 NAR 1 NDE 1 NRU 1 NSP C1 PVU 1 PVU 2 PRU 1 RSA 1 SAC 1 SAC 2 SAL 1 SMA 1 SNA 1 SPH 1 STU 1 TAQ 1 BXA 1 XHO 1 XHO 2 XMA 3 XMN 1 実施例2.大腸菌におけるコラゲナーゼ阻害剤の発現 この実施例において、簡易DNA配列をクローン化したc
DNAの５′端に連結する最良の方法が述べられる。これ
には、暗号配列内の特定の点でヌクレオチドを切断し、
その切除及び組換えを許すような方式で合成オリゴヌク
レオチドによる（即ち、有効な制限部位を組み込むこと
により）暗号配列の望む部分を再構築することが含まれ
る。

暗号領域の５′端を削除することは、５′方向にTthl
llI部位からのびるDNAの両鎖を合成し、BamHIの付き出
しで終わることによりおわる。FIBAC Ａと引用される
この合成オリゴヌクレオチドは、次の性質をもつ。

（１） コドンの選択は、高度に発現される最近の蛋白
の遺伝子に最も頻繁に見い出されるものに偏つている。

（２） 翻訳が開始されるメチオニンのコドンは、ヒト
のプロセシングを受けたFIBACの暗号領域を始めるシス
テインのすぐ上流に準備される。

（３） BamHI部位とメチオニンコドンとの間隔は、pUC
8にクローニングされたとき、FIBACの暗号領域がβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子の５′端をもつた枠内にあること
を示す。

（４） 枠内の終止コドンとシヤイン・ダルガノ配列も
又存在する。β−ガラクトシダーゼのアミノ末端部分に
対するこの枠の翻訳は、TAAコドンで終了し、FIBACの翻
訳は次のATGで始められる。

（５） コドンは、FIBACの開始コドンがＧで始まるHgi
AI部位をつくるように選択された。

（６） BamHI配列の３′端から１塩基離れてPvuI部位
が存在する。

FIBAC Ａの構造は、 FIBAC Ａは、一連の４種の成分のオリゴヌクレオチド
として、ABI DNA合成機を用いて合成された。成分オリ
ゴヌクレオチドFA1は、 GATCC GCGAT CGGAG TGTAA GAAAT GTGCA CTTGCである。

成分オリゴヌクレオチドFA2は、 GGAACG CAAGT GCACA TTTCT TACAC TCCGA TCGCGである。

成分オリゴヌクレオチドFA3は、 GTTC CGCCG CATCC GCAGA CTGCT TTCTG CAACT CTGAC Cで
ある。

成分オリゴヌクレオチドFA4は、 AGGTC AGAGT TGCAG AAAGC AGTCT GCGGA TGCGG Cであ
る。

FIBAC遺伝子の暗号部分の残りは、pUC9−F5/237P10の
TthlllIとEcoRIによる２重消化により生じた３′Tthlll
IからEcoRIの断片として分離された。

合成リンカーがTthlllIからEcoRIの断片の３′端をSa
lI部位に連結するために作製された。これらのオリゴヌ
クレオチドは、SalI部位を再作製し、EcoRI部位をこわ
すように考えられている。リンカーはオリゴヌクレオチ
ドリンカーA1とリンカーA2から成る。

リンカーA1は、AATTGGCAGである。

リンカーA2は、TCGACTGCCである。

これらのオリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドFA
1−FA4は、別々にキナーゼで処理され、等モル比で、cD
NAのTthlllI−EcoRI3′端及びBamHI/SalI切断mpl9RFDNA
とアニールされた。連結されたDNAは、JM105にトランス
フエクトするのに使用される。プラークは、IPTGとＸ−
galの存在下での色とオリゴヌクレオチドFA2に対するハ
イブリダイゼーシヨンにより釣られる。数個の陽性プラ
ークがシーケンスされるべきである。計画された配列を
含むプラークは、BamHI/SalI消化のpUC8にサブクローニ
ングされる。この構築物におけるFIBAC遺伝子の翻訳
は、β−ガラクトシダーゼで始められる翻訳に続く。こ
の発現ベクターはpUC8−Ficとして引用される。

他の高度に発現される蛋白で開始される翻訳につなが
つたFIBACの翻訳は似たように整えられる。例えば、シ
ヤイン・ダルガノ配列と開始メチオニンを含むOmpA遺伝
子の一部が合成された。この配列は、OmpA蛋白の完全な
信号ペプチドを暗号化し、EcoRI、EcoRV、PvuI及びStuI
を含む使いやすい制限部位を有していた。意味をもつ鎖
の配列は この配列はこれ以降、OmpAリーダーとして記載され
る。OmpAとのFIBACの翻訳の組合せは、pUC8−FicをPvuI
及びSalIで切断し、暗号領域を分離することにより達せ
られる。OmpAリーダーから分離されたEcoRIからPvuI断
片と共にこれは、EcoRI/SalI切断のpUC8にクローニング
され。先の実施例でのように、転写は、lacプロモータ
ーにより動かされ、lacオペレーターでlacI遺伝子産物
により調節される。このFIBAC発現ベクターは、pUC8−F
/OmpAicと呼ばれる。

内側の細胞膜を通つてFIBACの移送をさせるために、
適当なリーダー配列がFIBACのアミノ末端に付加され
る。そこで産生される蛋白は、移送され、プロセシング
されて、成熟した形態となる。

そのような移送をおこなわせるために、FIBACの構造
領域に続いて大腸菌OmpA蛋白の信号ペプチドを暗号化す
るFIBAC遺伝子が作製される。この特殊なFIBAC遺伝子
は、変えられたFIBAC暗号領域の５′端に枠内の終止コ
ドンを有する必要がある。これを達成するため、HgiAI
部位からNcoI部位までひろがるpUC8−Ficの５′暗号領
域の部分が分離される。上流配列は、BamHI及びHgiAIの
付着末端をもち、内側にStuI部位を含むリンカーとして
再合成される。これは２種類のオリゴヌクレオチド、リ
ンカーB1とリンカーB2として合成される。

リンカーB1は、GATCCCAGGCCTGCAである。

リンカーB2は、GGCCNTGGである。

リンカーB1及びB2は別々にキナーゼで処理され、等モ
ル比で、上述のHgiAI−NcoI断片及びBamHI/NcoI切断pUC
8−Ficにアニールされる。得られた構築物は、β−ガラ
クトシダーゼのアミノ末端の翻訳に伴う枠内にFIBACの
暗号配列を有する。この配列の翻訳物は、FIBACとの融
合蛋白を生成する。このプラスミドはpUC8−Ffと呼ばれ
る。

OmpAリーダー配列のFIBACの暗号領域への接着は、Eco
RI/StuI切断pUC8−Ffを過剰の精製されたOmpAリーダー
のEcoRI−StuI断片に連結することにより完了される。
形質転換の後数個のコロニーからのプラスミドがハイブ
リダイゼーシヨンにより、特性が調べられた。OmpAリー
ダー断片を組み込んでいるプラスミドはさらに、構造を
確認するために特性が調べられた。このプラスミド、pU
C8−FOmpA1は、大腸菌OmpA蛋白の信号ペプチドから始ま
り、ヒトFIBACで終わる融合蛋白の合成を指揮する。蛋
白のOmpA部分に存在する信号は、蛋白の細胞質からの移
動及びFIBACの１次構造の適切な切断を起こさせる。蛋
白あるいは核酸レベルでのリーダーペプチド又はFIBAC
との組合わせの配列により発現の頻度が影響されるなら
ば、遺伝子は、いくつかの既知の大腸菌リーダー配列を
暗号化するように換えられなければならない。

議論されている全ての遺伝子の転写がlacプロモータ
ーによりおこなわれる。翻訳開始部位の場合でのよう
に、遺伝子のプロモーター及びオペレーター領域は、交
換される。FIBACは又、λP_Lプロモーターとオペレータ
ー（O_L）及びE.アマン、J.プロシウスとM.タシユネ ジ
ーン第25巻、167−178ページ（1983年）に述べられてい
るような雑種プロモーター・オペレーターTacを組み込
んだベクターから発現される。リボソーム結合部位構造
領域と３′非翻訳配列を含む遺伝子の部分の削除及びP_L
又はTacプロモーターを含む変えられたベクターへの挿
入には、pUC8−F/OmpAicとpUC8−F/OmpAlのこれらの構
造に隣接する独特の制限部位が利用される。EcoRIからS
alIへの断片の同様に消化されたプラスミドpDP8への挿
入は、λP_Lプロモーターに支配されるこれらの遺伝子の
転写をおこさせる。転写制御は、この同じプラスミド上
にあるcI857変異の長所により温度感受性である。

Tacプロモーターの転写単位への類似の遺伝子断片の
挿入は、最初に分離されたEcoRVからSalIの断片により
行なわれる。これは、BamHIとRvu Iの部位に隣接し、la
cオペレーターを含む合成のTacプロモーター配列と共
に、pBR322又はその誘導体のBamHI−SalI部位に挿入さ
れる。この場合の誘導体は、lacI遺伝子又はI⁹遺伝子の
いずれかを含むプラスミドをさす。

大腸菌とは別の宿主微生物でのFIBACの発現が考えら
れる。酵母及びバチルス、シユードモナスとクロストリ
ジウム属の細菌がそれぞれ著しい利点を示す。上に概略
した過程は容易に他に適合する。

一般的に、どの微生物の発現ベクターも上記の大腸菌
のベクターと類似の性質を具体化する。ある場合におい
て、上で議論された特異的な遺伝子構築物を直接的に新
しい宿主と両立できるベクターの中に簡単に移すことが
可能である。他の場合には、遺伝子の操作又は構造成分
を変えることが必要であるか又は望ましい。

実施例３ ヒトコラゲナーゼ阻害剤は、各種の微生物で発現され
た後に、簡単に精製される。それぞれの場合において、
混在する蛋白のスペクトラムは異なる。それ故、適当な
精製段階が、他の蛋白からのそして同様な仕事の他の方
法からのヒトコラゲナーゼ阻害剤の良好な分離を与える
ことが既に知られている各種の段階から選択される。

阻害剤が微生物から分泌されないとすると、組換え体
微生物の内部で含有体を形成する。これらの形態は、フ
レンチプレスで細胞を破砕した後に、分別遠心により他
の蛋白から分離される。不溶性の含有体は、6M塩酸グア
ニジンか8M尿素で可溶化され、そして阻害剤蛋白は、亜
硫酸ナトリウムとシステインの反応により、より完全に
可溶化される。この段階の次に、システインは、ジチオ
スレイトールでその還元型に戻される。阻害剤蛋白が含
有体から可溶化されると、折りたたまれていない阻害剤
に対する抗体を用いたイミユノアフイニテイクロマトグ
ラフイーが再び折りたたまれる前に精製に使用される。

阻害剤は、以下の実施例６に述べられている方法に従
つて再び折りたたまれる。阻害剤が再び折りたたまれた
後あるいは、阻害剤が微生物から分泌されないならば、
他の蛋白からの精製が各種の方法によりおこなわれる。
初期段階には、50Kダルトンで分離する膜を通す限外濾
過又は硫安分画が含まれる。他の有効な方法には、限定
はされないが、イオン交換クロマトグラフイー、ゲル濾
過、ヘパリン−セフアロースクロマトグラフイー、逆相
クロマトグラフイー、あるいは亜鉛キレートクロマトグ
ラフイーが含まれる。これら全てがうまく精製に用いら
れる。さらに高い分離能をもつ段階が、疎水的相互作用
によるクロマトグラフイー又はイミユノアフイニテイー
クロマトグラフイーである。精製後、メタプロテイナー
ゼ阻害剤は少なくとも90−95％の純度である。

実施例４ ヒト羊水からのコラゲナーゼ阻害剤の精製 廃棄された羊水診断試料から得られたヒト羊水が集め
られ、ミリポア社のミリポア・ペリコン・カセツト・シ
ステムで100kDの排除フイルターを通す限外濾過に６
がかけられた。溶出液はミリポア社の10kD排除フイルタ
ーに続いてアミコンPM−10膜を通すことにより濃縮され
た。濃縮羊水10mlが、pH7.6、0.05M Hepes、1M塩化ナ
トリウム、0.01M塩化カルシウム及び0.02％窒化ナトリ
ウム（全ての薬品はシグマ・ケミカル・カンパニーから
入手された）で平衡化されたLKB社のウルトロゲルACA54
の2.5×100cmカラムを通して溶出された。阻害剤を含む
画分が回収され0.01M塩化カルシウムと0.02％窒化ナト
リウムを含むpH7.5の0.025M Hepes緩衝液に透析され、
同緩衝液で平衡化された1.5×28cmのヘパリン−セフア
ロースCL−6B（フアルマシアInc.から入手）カラムにの
せられた。このカラムは、上記緩衝液１で洗浄され、
０から0.3Mの塩化ナトリウムの直線濃度勾配で溶出され
た。約0.1から0.15M塩化ナトリウムで溶出される阻害剤
活性の最大のピークの画分が集められ、1mlに濃縮され
て、0.05％トリフルオロ酢酸（アルドリツチ・ケミカル
・カンパニー）で平滑化されたシンクロパツクrp−８逆
相HPLCカラムにかけられた。カラムは０から40％のアセ
トニトリルの直線勾配で１分間あたり1/2％で溶出され
た。全ての画分が直ちに、アセトニトリルを除くため
に、サバント・スピード−バツク・コンセントレーター
で乾燥され、アツセイの前に、pH7.5の0.1M Hepesに再
溶解された。阻害剤は、32から38％のアセトニトリルで
溶出した。阻害剤を含む画分が集められ、100μがバイ
オラツドバイオミル−TSK250HPLCゲル濾過カラムで溶出
された。阻害剤活性の回収ピークは阻害剤を0.1mg含ん
でおり、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により判
定すると95％以上の純度であった。

実施例５ ヒト胎児皮膚繊維芽細胞無血清培地からの繊維芽細胞コ
ラゲナーゼ阻害剤の精製 ヒト胎児皮膚繊維芽細胞が、無血清組織培養培地で生
育された。この培地10が集められ、0.02％窒化ナトリ
ウムと0.01M塩化カルシウムを含むpH7.5の0.02M Hepes
緩衝液に対し、透析されて、同緩衝液で平衡化されたヘ
パリン・セファロースCL−6B（フアルマシアInc.）の2.
8×48cmカラムに充填された。カラムはこの緩衝液２
で洗浄され、０から0.3Mの塩化ナトリウムを含むこの緩
衝液の直線勾配で溶出された。得られた画分は、ヒト繊
維芽細胞コラゲナーゼを阻害する能力により阻害剤の存
在が試験された。活性のピークに相当する画分は、0.15
M塩化ナトリウム付近で得られたものである。これらの
画分は約5mlまでアミコンYM10フイルターを通す限外濾
過により濃縮され、濃縮液は、１％トリフルオロ酢酸で
平衡化された250×4.1mmのシンクロパツクrp−８逆相HP
LCカラムに４回に分けて充填された。カラムは、0.1％
トリフルオロ酢酸中の０から60％アセトニトリルの直線
勾配で溶出された。勾配は１分間あたり1/2％アセトニ
トリルで運転された。阻害剤は、26から29％のアセトニ
トリルの間で２個の鋭いピークで溶出した。全ての画分
が直ちにサバント・スピード・バツク・コンセントレー
ターで乾燥され、pH7.5の0.1M Hepesに再溶解され、検
定された。少なくとも1.2mgのコラゲナーゼ阻害剤が回
収され90−95％の純度であつた。この物質は、17.5％還
元SDSゲルで泳動すると単一のバンドを与える。システ
インのカルボキシメチレーシヨンと同一条件下での同一
RP−８カラムによる溶出の後、阻害剤は、蛋白のシーケ
ンシングに適した均一性をもつ。

実施例６ ヒトコラゲナーゼ阻害剤は、微生物でのその遺伝子の
発現と微生物により生産された他のほとんどの蛋白から
のコラゲナーゼ阻害剤の分離の後、その変性状態から元
の構造に容易に戻れると予想される。ザ・エンザイモロ
ジー・オブ・ポスト・トランスレーシヨナル・モデイフ
イケーシヨン・オブ・プロテインズ（蛋白の翻訳後修飾
の酵素学）第１巻、R.B.フリードマンとH.C.ホーキンス
編、158−207ページ（1980年）の中の“ジスルフイド結
合の精製”でR.B.フリードマンとD.A.ヒルソンにより述
べられているように他のジスルフイドを含む蛋白の再生
に必要な条件から類推することにより、ヒト・コラゲナ
ーゼ阻害剤の再生は、pH8.0かそれ以上の溶液中でおき
る。このpHで、蛋白のシステインは、部分的にイオン化
され、そしてこの条件は、元のジスルフイド結合の対合
の達成に必要である。阻害剤濃度は、比較的低く、再生
過程を妨害する分子間ジスルフイド結合をした集合体の
形成を最少化する0.1mg/ml以下であつた。

再生されていない（還元された）構造に比較して、再
生された（自然の）ジスルフイド結合をもつ構造の安定
性は、溶液の酸化・還元能及び他の酸化−還元活性分子
の濃度の両者に依存するので酸化還元能は、還元型：酸
化型グルタチオンの比10に等価の能力を与える酸化還元
緩衝液で緩衝化されることが予想される。還元グルタチ
オンの好ましい濃度範囲は0.1から1.0mMである。より高
濃度では、蛋白と混合ジスルフイドを形成し、再生され
た（自然の）構造の収量が減少する。非再生蛋白と天然
構造の相対的な安定性及び再生の速度と回収量は又、ア
ドバンス・イン・プロテイン・ケミストリー（蛋白科学
の進歩）第33巻、167−236ページ（1979年）のP.L.プリ
バロフ“蛋白、小球状蛋白の安定性”に議論されている
ように、pH、温度、水素イオン緩衝液の型、イオン強度
及び特別な陽イオン又は陰イオンの存在の有無のような
他の溶液の変数に依存している。これらの条件は、それ
ぞれの蛋白で変化し、実験的に決定される。（非再生に
対して）天然の構造に強く結合しやすく、天然の（再
生）蛋白からその後簡単に分離される分子の添加は、再
生の収量だけでなく速度も増加することが予想される。
これらの分子には、天然構造に対して生じた単クローン
抗体及び哺乳類の酵素コラゲナーゼあるいはゲラチナー
ゼのような強く天然のコラゲナーゼ阻害剤に結合する他
の蛋白が含まれる。

実施例７ ここに述べられている第２の最良配列、即ち、 は次の制限部位をもつ： 以下のものは出現しない： AAT 2 AFL 2 AFL 3 AHA 2 AHA 3 ALU 1 APA 1 ASU 2 AVA 1 AVA 3 AVR 2 BAL 1 BAM H1 BAN 1 BAN 2 BCL 1 BGL 1 BGL 2 BSM 1 BSP 1286 nSSH 1 BST E2 CFR 1 CLA 1 ECO R1 ECO R5 FNUD 2 GDI 2 HAE 1 HGA 1 HGI A1 HGI C1 HGI D1 HGI J2 HIND 3 HPA 1 HPH 1 KPN 1 MBO 2 MLU 1 MST 1 NAE 1 NAR 1 NCI 1 NDE 1 NHE 1 NOT 1 NRU 1 NSP C1 PVU 1 PVU 2 RRU 1 RSA 1 SAC 1 SAC 2 SAL 1 SCA 1 SMA 1 SNA 1 SNA B1 SPE 1 SPH 1 SSP 1 STU 1 TAQ 1 XBA 1 XHO 1 XMA 3 XMN 1 このcDNAの顕著な特徴は、 1.暗号鎖は、５′端にポリＣ領域をもつ５′から３′方
向へ存在する。

2.配列GGC CAT CGC CGCの最初のＧをヌクレオチドの第
１番と考えるならば、読み取り枠はヌクレオチド１か
ら、この部分的cDNAの３′端であるヌクロチド432に存
在する。

3.この読み取り枠の最初のメチオニンはヌクレオチド49
から51に暗号化され、翻訳の開始部位をあらわす。

4.ヌクレオチド49から114で示されるアミノ酸配列は、
成熟蛋白の１次構造には見られないが、ヒト蛋白のリー
ダーペプチドの配列である。

5.ヌクレオチド82から432の配列は、実施例１の第１の
配列の挿入のヌクレオチド１から351の配列と同一であ
る。

6.成熟蛋白のアミノ酸配列は、糖の付着の２個のコンセ
ンサス配列を示す。ヌクレオチド202から210の−Ｎ−Ｑ
−Ｔ及びヌクレオチド346から354の−Ｎ−Ｒ−Ｓ−、こ
れらの配列は、成熟蛋白のそれぞれ30から32及び78から
80のアミノ酸残基である。両方の部位はヒトの阻害剤蛋
白ではグリコシル化されている。

実施例８ 大腸菌で、FIBAC遺伝子の転写と翻訳を司どる一連の
発現ベクターが構築された。

A.発現ベクターpFib51 これらの構築ベクターの最初は、その転写がlacプロ
モーターとオペレーターにより司さどられ、調節される
ように編成されたヒト繊維芽細胞コラゲナーゼ阻害剤
（“FIBAC"）の暗号領域を含むプラスミドpUC8の誘導体
である。このベクターpFib51は、発現ベクターpUC8−Fi
cの集合のため実施例２に概略された方法を少し修正し
て作製された。

暗号領域の５′端の削除は、ヌクレオチド93のHae II
I部位からヌクレオチド698に始まる３′側EcoRI部位に
ひろがるDNA断片を単離することによりなされる。５′
端の再構築は、オリゴヌクレオチドFA3及びFA4がそれぞ
れ、再構築物をHae III認識部位へひろけるために12塩
基に長さをそろえられた以外は述べられたようにおこな
われた。その結果、FIBAC Ａ′の構造が創られた。

FIBAC Ａ′の顕著な特徴は、実施例２に述べられた
そのままである。

Hae III−EcoRI断片の３′端にSalI部位をつけるため
に、合成リンカーが作製された。これらのオリゴヌクレ
オチドは、SalI部位をつくり、そのEcoRI部位を破壊す
るために設計された。さらに、リンカーは、内部にKpnI
部位をもたせるためには、元の記載から修飾された。新
しいリンカーは、オリゴヌクレオチド“修飾リンカーA
1"及び”修飾リンカーA2"から成る。

修飾リンカーA1は、AATTGGTACCAG。

修飾リンカーA2は、TCGACTGGTACC。

M13mp19への連結、クローニング及び選択は、基本的
には前の実施例に述べられている通りであつた。FIBAC
の暗号領域は、BamHIとHind IIIの消化により、計画さ
れた配列をもつクローンから取り除かれ、pUC8のこれら
の制限部位にサブクローニングされた。得られたプラス
ミドがpFib51である。このプラスミドにおいて、FIBAC
遺伝子の転写は、lacプロモーターによりつかさどられ
る。メチオニルFIBACの翻訳は、β−ガラクトシダーゼ
で始まる翻訳に共役している。

B.発現ベクターpFib55 成熟FIBAC暗号配列の５′端にHgiAI制限部位を作製す
ることは、完全なFIBAC暗号配列を暗号配列内の552位置
のもう１つのHgiA1部位を除いて、HgiAI/SalI、KpnI又
はHind IIIによるプラスミドpFib51の２重消化により、
軽便なものとさせる。この制限部位は、メソツズ・イン
・エンザイモロジー第100巻468ページにゾラーとスミス
により述べられたように、試験管内でのオリゴヌクレオ
チドによる部位特異的突然変異誘発を用いて除去され
た。

上述のような翻訳的にlacZに共役するmet−FIBAC遺伝
子を含むバクテリオフアージmpl8の誘導体から分離され
た１本鎖DNAは、合成オリゴヌクレオチドGGGCTTTGCACCT
GGCAGにアニールされた。このオリゴヌクレオチドは、
１個の誤対合をもつHgiAI部位を介してFIBAC暗号領域に
アニールする。得られたDNAは、それから大腸菌DNAポリ
メラーゼのクレノウ断片、T4DNAリガーゼ及び４種のデ
オキシヌクレオチド・３・リン酸全ての混合物とインキ
ユベートされた。

得られた共有結合の閉環状２本鎖フアージDNAは、大
腸菌JM107株トランスフエクトするのに用いられた。プ
ラークは、６×SSC中58℃で、上に示された変異オリゴ
ヌクレオチドに対するハイブリダイゼーシヨンによる変
異配列の存在が試験された。

選択クローンは、アミノ酸第173番のロイシンのコド
ンがCTGのかわりにCTTであつた。このクローンの暗号領
域は、BamHI−Hind III断片として切り出され、同様に
消化されたpUC8に連結された。得られたプラスミドpFib
55は、より容易に動かせるFIBAC暗号領域同様、pFib51
の全ての性質を有している。

C.発現ベクターpFib56 β−ガラクトシダーゼ又は他の大腸菌の蛋白に翻訳上
つながつた交互の方法が同様に構築される。１つの具体
例として、プラスミドpFib51に対する発現という観点の
調節に類似した（即ちpUC8のlacZにつながつた翻訳をす
るFIBAC）、しかし、交互の翻訳のカツプラーを用いる
クローンが考えられた。pFib56を作製するために、次の
DNAの断片が合成された： この２本鎖のEcoRI/HgiAI断片は、それから、HgiAI/H
ind III FIBAC暗号配列と、EcoRIとHind IIIで消化さ
れたプラスミドpUC8に合わせられ連結された。得られた
プラスミドはpFib56と呼ばれた。このプラスミドが大腸
菌JM107株に形質転換されると、JM107/pFib56株はJM107
/pFib51あるいはJM107/pFib55よりもメチオニンFIBACで
さえ発現が誘導される。これから、pFib56の翻訳のカツ
プラー、pFib51のよりも効果的であると結論された。

D.発現ベクターpFib10及びpFib11 発現されたFIBACを大腸菌のペリプラズムへ向けるた
めに、リーダーペプチドがFIBACのアミノ末端に付加さ
れる。リーダーペプチドは、内側の細胞膜の外へ有効蛋
白を輸送させる。細胞のプロセシングは信号ペプチドを
除去し、FIBACの成熟型を回収する。

２個の信号配列が個別にこの目的のためにFIBACに融
合された。それらは、大腸菌OmpA及びphoS遺伝子産物の
リーダーペプチドである。ompA_L−FIBAC及びphoS_L−FIB
ACの両融合蛋白は、大腸菌のペリプラズムに局在させ、
ompA又はphoSのリーダー断片と天然のFIBACに対する融
合の蛋白分解プロセシングをさせる信号を含む。

プラスミドpFib10は、ompA_L−FIBAC融合蛋白の暗号配
列がその中に挿入されているようなpUC8の誘導体であ
る。さらに、ompA遺伝子の５′非翻訳配列が含まれてい
る。このプラスミドの転写は、pUC8のlacプロモーター
／オペレーターにより司どられる。翻訳は、ompAリーダ
ー配列が始まるメチオニン・コドンで開始され、ompA遺
伝子に見られるシヤイン・ダルガノ配列を用いる。

プラスミドは、pFib55のHgiAI/Hind III断片に含まれ
るFIBAC暗号配列をompAリーダーペプチドを暗号化する
合成オリゴヌクレオチド及びEcoRI/Hind III消化のpUC8
と共に連結することにより構築された。合成オリゴヌク
レオチドの暗号鎖は、 である。

４種のオリゴヌクレオチド、それぞれの鎖当り各２種
合成した。全体として、２本鎖DNAの性質は、 （ａ） 暗号鎖の５′端がEcoRIの付着末端で３′端がH
giAIの付着末端。

（ｂ） HgiAI部位で連結されると、FIBAC遺伝子を枠内
にもつompA遺伝子産物のリーダーペプチドを暗号化する
読み取り枠。

（ｃ） 通常ompA遺伝子に見られるリボソーム結合部位
を含む翻訳部分に対する５′非暗号配列。

（ｄ） 内部の独特のPvuI部位。

プラスミドpFib11は、プラスミドpKK223−３の誘導体
で、pUC8部分がプラスミドpKK223−３の4550bpのEcoRI/
Hind III断片に置換されていることを除いてpFib10と同
一である。このプラスミドにおいて、転写は雑種tacプ
ロモーター／オペレーターによりつかさどられ調節され
る。さらに、このプラスミドは、高度の発現系において
プラスミドを安定化させる転写ターミネーターを含む。

E.発現ベクターpFib13 プラスミドpFib13において、ompA_L配列の５′非暗号
領域は、除去され、ompA_L−FIBAC融合遺伝子は、プラス
ミドpUC8で発現するように直接的にlacZ遺伝子のＮ末端
部分に翻訳上つなげられている。これは、プラスミドpF
ib10のEcoRI/PvuI（3200bp）断片をここに示した合成オ
リゴヌクレオチドに連結することにより完成された。

F.発現ベクターpFib31 大腸菌phoS遺伝子はリン酸結合蛋白をコードし、ジヤ
ーナル・オブ・バクテリオロジー第157巻、772−778ペ
ージ（1984年）にB.D.スーリン等により述べられ、シー
ケンスされた。この蛋白は、蛋白をペリプラズマに向か
わせる25アミノ酸のリーダー配列をもつペリプラズマ蛋
白である。リーダー配列は、成熟phoS蛋白のみがペリプ
ラズムに残るように翻訳過程の間に蛋白分解により除去
される。我々は以下に示すようにEcoRI及びHgiAI末端を
もつた２本鎖DNA断片としてphoSリーダー配列を合成し
た。

これらの断片は、phoSリーダーの中にあるClaI部位で
連結された。これらの断片は、同時に上述のHgiAI/Hind
III FIBAC暗号断片とEcoRI及びHind IIIで消化された
プラスミドpKK223−３に合わせられた。得られたプラス
ミドがpFib31と呼ばれた。

実施例９ 大腸菌におけるFIBAC遺伝子の発現 上述のプラスミドをもつ大腸菌細胞により産生される
FIBACの量と形態を定性的に決定するのに３つの方法が
用いられた。それらは、 （１） SDS−ポリアクリルアミド電気泳動により解析
されて続いてニトロセルロースペーパーに結合された
（ウエスタン・ブロツテイング）FIBAC遺伝子の誘導後
産生された大腸菌蛋白に対するFIBAC抗体の特異的反
応。

（２） FIBAC遺伝子の誘導に続く³⁵S−システイン、³⁵
S−メチオニン又は³⁵SO₄ ^2-での大腸菌蛋白の標識。

（３） 抗体結合又は放射活性標識なしでの大腸菌蛋白
及びFIBACを含むSDSポリアクリルアミドゲルの検査。

これらの方法は、それぞれの菌株により産生されるFI
BACの量の比較だけでなく、機能的なメタロプロテイナ
ーゼ阻害の必要なしに発現されたFIBACの精製にも用い
られる。実施例８で議論された全てのプラスミドは、大
腸菌JM107株で発現された。大腸菌でのFIBACの発現は、
細胞内膜の外側への蛋白の輸送を計画されたこれらの系
の中ではかなり大きかつた。これは、あるいは、細胞質
における発現蛋白の分解のためである。

FIBACの成熟形態を得るためのompA_L−FIBACの融合蛋
白のプロセシングは、部分的に、細胞の生育相に依存し
ていることが発見されている。生育対数増殖期の初期に
IPTGで誘導された細胞は、プロセシングを受けたFIBAC
と受けていないFIBACの混合物を蓄積するが一方、対数
増殖期の後期で誘導された細胞培養は、プロセシングを
受けたFIBACのみを蓄積する。phoS_L−FIBAC融合蛋白を
発現する株は、全く生育相に依存しないで蛋白をプロセ
シングすると思われる。

実施例８に述べられた全ての発現ベクターが選択マー
カーとしてアンピシリン耐性をもつ。生産のためには、
テトラサイクリン耐性マーカーをもつことが好ましい。
一般に発現ベクターとして有効なプラスミドが、テトラ
サイクリン耐性マーカーを付けて構築された。このプラ
スミドは、切りつめられたテトラサイクリン耐性遺伝子
が、pBR322に適合された完全に機能するtet^r遺伝子と置
き換えられているpKK223−３の誘導体である。

実施例10 大腸菌で発現されたFIBACの精製 組換えヒトコラゲナーゼ阻害剤（FIBAC）は、プラス
ミドpFib11で形質転換された大腸菌JM107株から精製さ
れた。この株、JM107/pFib11では、FIBACは、不溶性の
凝集体として蓄積される。本実施例では、細胞の生育、
FIBAC遺伝子発現の誘導、細胞の回収及び全細胞抽出物
の不溶性画分からのFIBACの精製についての条件が述べ
られている。同一プロトコールは又、全細胞抽出物の可
溶性画分からのFIBACの濃縮にも用いられる。

A.不溶性画分 100μg/mlアンピシリンを含むルリアブロースに初期O
D₆₀₀＝0.15〜0.20で１晩培養のJM107/pFibllが接種され
た。振盪フラスコ細胞培養は37℃でOD₆₀₀＝1.5まで生育
され、その時点で、培地に終濃度0.5mMのIPTGで添加さ
れた。37℃でのインキユベーシヨンがさらに2.5から３
時間続けられた。細胞培養液はアイスバスの中で４℃ま
で急冷され、遠心により細胞が回収された。上述のよう
に生育された１培養液から、平均3g（湿重量）の細胞
が得られた。細胞は冷却した溶解用の緩衝液（50mM ME
S、pH6.0、4mM EDTA）で１度洗浄され、それから、終
濃度0.26g細胞/mlになるように同緩衝液に再懸濁され
た。細胞懸濁液は次の過程まで−70℃で凍結された。

全細胞抽出物はフレンチプレスセル（SLM−アミン
コ、モデル＃FA−079、ピストン＃FA−073、20000psti
で操作、SLMインストルメンツInc.イリノイ州ウルバ
ナ）に２度細胞懸濁液を通すことで調製された。得られ
た細胞抽出物は、氷上で２−３時間（湿重量）1gの細胞
あたり10μｇのDNaseIとインキユベートされた。その
後、少量ずつにわけられて次の操作まで−70℃で凍結保
存された。

細胞抽出物の上清と沈澱の画分は、エツペンドルフの
マイクロ遠心機で４℃、30分間細胞抽出物5mlを遠心す
ることにより得られた。得られた沈澱が50mMTris−HC
l、pH8.0、4mM EDTA、50mMDTT3mlで２度洗浄された。
これらの洗浄上清が集められ分析のために保存された。
洗浄された沈澱は50mM MES、pH6.0、4mM EDTA、50mM
DTT、10M尿素3mlに再懸濁することで可溶化され、15
分間室温で保温された。蛋白のカルバミル化が尿素可溶
化のために起きるので、全蛋白のアミノ基に対して100
倍過剰の適当な求核分子を添加することにより、副反応
は抑えられた。得られた溶液は、エツペンドルフのマイ
クロ遠心機で４℃、15分間遠心することにより不純物が
除去された。上清は基本的に、可溶化法からの全ての蛋
白を含み、解析のために保存された。残りの少量の沈澱
物はほとんどの細胞壁残渣と数種の蛋白（FIBACはな
い）から成る。この部分は捨てられた。

上述のように調製された各種画分中のFIBACの同定
は、SDS−PAGE及び抗FIBAC抗体を用いたウエスタン・ブ
ロツト試験によりおこなわれた。

IPTGで誘導されたJM107/pFibllから得られた全細胞抽
出蛋白のSDS−ゲルによる解析は、非誘導JM107−pFib11
の細胞抽出物のゲルパターンには存在しない約20000ダ
ルトンの分子量の蛋白バンドの存在を示す。20000ダル
トンの蛋白及びおそらくFIBACの分解産物の少し速く移
動するバンドがウエスタン・ブロツト分析で抗FIBAC抗
体と反応する。この蛋白がIPTG誘導に依存して存在する
こと、分子量及び抗FIBAC抗体との反応性は、蛋白が発
現された組換えFIBACであることを示唆する。

IPTG誘導JM107/pFib11から得られた細胞抽出上清及び
沈澱洗浄液の分析の結果にはほとんどFIBACは含まれて
いなかつた。しかし、尿素−DTT可溶化細胞抽出沈澱画
分に大部分のFIBACが見い出された。これは、IPTG誘導
によりFIBACが不溶性画分に蓄積し、洗浄された細胞抽
出物の沈澱から実質的に精製された形態で分離されたと
解釈された。

尿素−DTT可溶化細胞抽出物の沈澱画分は、CM−クロ
マトグラフイの開始物質として用いられた。可溶化細胞
抽出沈澱画分1.5ml（16mg蛋白）は、冷却されたCM−緩
衝液（50mM MES、ph6.0、6M尿素、14mM ２−ME）で25
mlまで希釈された。試料はそれから、４℃でCM緩衝液で
予め平衡化したカルボキシメチル・セルロース・カラム
（25×130mm）に充填された。試料充填後、カラムは、C
M緩衝液でA₂₈₀が基準線に戻るまで洗浄された。吸着さ
れた蛋白は、CM緩衝液中の塩化ナトリウムの直線濃度勾
配（０−200mM）で溶出された。全勾配量は400ml、流速
は26ml/br、5mlの分画量で集められた。“通り抜け”画
分（CM−FT）及びピーク画分58−61が集められて、SDS
−PAGEで分析された。これらの画分の電気泳動及び免疫
学的分析の結果、いくらか分解されたFIBACを含む組換
えFIBACは、他に検出される蛋白なしに約120mM NaClで
溶出されることがわかつた。用いたクロマトグラフイー
の条件下で、非FIBAC蛋白は、CMカラムには吸着せず
“通り抜け”画分に見い出された。

この方法で得られたCM精製にFIBACの量は、全細胞蛋
白の1.3％を示すと計算された。分離及び精製を通して
定量にはブラツドフオードの蛋白アツセイが使用され
た。

50mM MES 6M尿素、14mM ２−メルカプトエタノー
ル中の精製FIBAC2ml（100μｇ）がセントリコン遠心に
より200μｌまで濃縮され、Trisの終濃度が0.5Mまで2M
Tris HCl、pH8.5を添加することによりpH8.5に調製
された。FIBACのシステイン残基は、³H−酢酸ヨードを
用いてカルボキシメチル化された。アルキル化反応混合
液は逆相HPLCにより脱塩された。修飾FIBACは30％アセ
トニトリルで溶出し、分析のために回収された。HPLCか
ら分離された修飾FIBACの溶液はSDS−PAGE分析に用いら
れた。カルボキシメチル化に使用されたCM精製FIBAC
（開始物質）とアルキル化とHPLC脱塩後のFIBACの比較
は、SDSのゲルで、修飾されたFIBACは非修飾のFIBACよ
りもわずかに遅く移動することを示した。これは、特に
FIBACに存在する修飾されたシステインの実質的な数と
いう点から異常な観察ではない。

カルボキシメチル化されたFIBACは、それから、自動
エドマン分解のために、アプライド・バイオシステムズ
（モデル470A）の気相蛋白シーケンサー（フオスター・
シテイ、CA）に充填され、最初の24残基のアミノ酸が同
定された。エドマン分解の最初の６サイクルのシーケン
シングのデータが下の表に示されている。精製FIBACの
Ｎ末端アミノ酸配列（Ｃ−Ｔ−Ｖ−Ｐ−Ｐ…）は、天然
のFIBACで以前に決められていたものと同一であること
をデータは明らかに示した。それ故、成熟FIBAC蛋白を
産生するようにそのAla−Cys結合でompA−FIBAC融合蛋
白を切断することにより、pFib11は適正に組換えFIBAC
をプロセシングすると結論される。

精製された組換えFIBACのＮ末端アミノ酸配列の分析 （システイン残基は蛋白のシーケンシングの前に³H−酢
酸ヨードで標識された。）サイクル ³H−CPM PTH−AA同定 １ 11470 CYS ２ 385 THR ３ 12690 CYS ４ 339 VAL ５ 145 PRO ６ 255 PRO B.可溶画分 開始物質に付加的な混り物があるために、ここで議論
された方法は、最初には、FIBACの均一な標品を結果と
して得られない。しかしながら、方法は、 FIBACをその天然のコンフオメーシヨンへ再生されるの
に充分な精製を準備する。次の精製過程は、分離方法を
完全にするために使用される。

本実施例では、先の実施例の通り、細胞の生育、誘
導、回収及び全細胞抽出物の調整が述べられる。細胞抽
出物のどの画分からもFIBACを精製するために現在の方
法の能力を決定するため、ホモジネートの遠心分画が除
かれた。かわつて、全細胞抽出物は、10M尿素、4mM EDT
A、50mM DTT、50mM MES、pH6.0に調整され、22℃で15分
間保温された。その後、溶液は、エツペンドルフのマイ
クロ遠心機で４℃15分間遠心された。沈澱は除去され、
上清がCM緩衝液（50mM MES、pH6.0、6M尿素、14mM 2−
メリカプトエタノール）で希釈され、先の実施例でのよ
うにカルボキシメチルセルロースでクロマトグラフによ
り分画された。FIBACはいくらかの分解されたFIBAC及び
数種の免疫学的には無関係の混在物質と共に約120mMの
塩で溶出された。SDS−PAGEによるFIBACの純度の算出
は、この画分では全蛋白の50％以上であることを示し
た。この水準の純度で、以下の再生法を用いてFIBACを
天然のコンフオメーシヨンに再生することは可能であつ
た。再生されたFIBACは完全にメタロプロテイナーゼ阻
害剤として機能し、さらに陰イオン交換クロマドクラフ
イにより精製された。

陰イオン交換クロマトグラフイは、600mM尿素、50mM
Tris、pH9.6で平衡化されたワツトマン DE−52（ワツト
マン Inc.ニユージヤージー州クリフトン）の10×100m
カラムでおこなわれた。不純な再生されたFIBACを含む
溶液は、5N−NaOHの滴下によりpH9.6まで滴定され、DEA
Eセルロースに充填された。通り抜け画分の分析は、FIB
ACが保持されないことを示した。免疫学的に無関係な混
入物質はマトリツクスに結合し、それにより溶液から除
去された。通り抜け画分は以下に示すようにCMセルロー
スカラムで濃縮された。

陰イオン交換カラムの通り抜け画分は、5N−HCl添加
によりpH7.5まで滴定された。この溶液が、600mM尿素、
50mM Tris、pH7.5で予め平衡化したCM−セルロースカラ
ム（25×130mm）に充填された。カラムはこの同じ緩衝
液で、蛋白が全て溶出液に吸光的に観察されなくなるま
で洗浄された。FIBACは250mM NaClを含む上記の緩衝液
で溶出された。蛋白ピークが回収され、50mM Tris、pH
7.5に対して平衡となるまで透析された。

得られたFIBACに対する電気泳動、免疫学的、及び機
能試験により、90％以上の純度の活性のある再生された
コラゲナーゼ阻害剤であることが示された。わずかに検
出される混入物質は、細胞抽出物の沈澱からの精製にあ
るのでFIBACの分解産物である。この混入物室の同一の
アミノ末端配列とその明白な分子量のため、蛋白分解部
分はカルボキシ末端近くにあるものと結論された。この
物質は、さらに精製することで除去される（例えば、再
生FIBACの高分解能イオン交換クロマトグラフイあるい
アフアニテイクロマトグラフイ）。

実施例11 酵母FIBAC発現クローンの構築 遺伝子発現及び蛋白輸送のベクターが構築される別の
生物は酵母サツカロミセス・セレビシエである。酵母の
α因子は、細胞内で産生され生育培地に移送される接合
ホルモンである。単一のペプチド配列がその輸送をつか
さどる。FIBAC暗号配列は、酵母α−因子のリーダー配
列にFIBACを融合させるために酵母の発現ベクターにク
ローニングされた。プラスミドは、まずpGS385の誘導体
として作製された。プラスミドpGS385は次の特徴をも
つ。

（ａ） プロモーター、リーダーペプチド、ポリアデニ
レーシヨン信号及び転写終了信号を含む酵母α因子の部
分を含む。

（ｂ） ２個の最も離れたHind III部位の間にあるα因
子遺伝子の部分が欠失され、独特にHind III部位が作製
された。

（ｃ） Hind III部位の３′に独特のSalI部位を含む。

（ｄ） 大陽菌で複製と選択をさせるため、pBR322の複
製起源とアンピシリン耐生遺伝子をもつ。

プラスミドpGS385は、Hind IIIとSalIで消化された。
Hind III部位は、α因子のリーダー配列のカルボキシ末
端を決定する。合成オクタヌクレオチド５′−AGCTTGCA
−３′が、α因子のＣ末端とFIBACのＮ末端を橋渡しす
るのに使用された。α因子の転写−翻訳配列は、このベ
クターでの遺伝子発現を動かす。完全なα因子−FIBAC
融合遺伝子がEcoRI消化により切り出され、酵母ura3遺
伝子を含むプラスミドpBR322の誘導体であるプラスミド
Yip5に挿入された。このプラスミドは、ura3の中の独特
のStuI部位で消化し、染色体ura3座に完全なプラスミド
を組込ませるたむにS.セレビシエの形質転換する発現ベ
クターとして使用するのに適している。そのようなYip5
のα−FIBAC融合誘導体の組込み体が得られ、ここでコ
ロニー検索技術により決定されるように免疫反応性物質
を産生し分泌した。

実施例12 動物細胞における組換えFIBACの発現 FIBAC生産のための動物細胞における２つの発現系が
提出されている。第１のものには、COS−１細胞で転写
をさせるようにSV40後期プロモーターを組込んでいる。
この発現系は、元来、COS−１細胞における発現、蛋白
合成、翻訳後修飾、FIBACの輸送を研究するの役立つ。
この系は速くて簡便であるが、COS−１猿細胞系列に限
定される。SV40発現プラスミドは、ジヤーナル・オブ・
ビロロジー第45巻、773−781ページ（1983年）にJ.スプ
ラーギユ、J.H.コンドラ、H.アーンハイラーとR.A.ラザ
リーンにより詳細に述べれらている構築プラスミドpJC1
19の誘導体である。天然に生ずる信号配列を含む完全な
FIBAC暗号領域が部分的なcDNAクローンから集められ
た。リーダーペプチドの開始メチオニンと一致するNcoI
部位が短い合成オリゴヌクレオチドを介してpJC119の独
特のXhoI部位に連結された。完全なFIBAC暗号領域と
３′非翻訳配列がSV40後期プロモーターにより転写がつ
かさどられるこの部位に挿入される。プラスミドはそれ
故、SV40の複製起源、pBR322の複製起源及びアンピシリ
ン耐生選択マーカーを含む。

第２の系は、ヒトの細胞系列からの安全で連続的なFI
BACの発現をもたらすので、動物細胞におけるFIBACの産
生にむしろ用いられる。このベクターは、セル・バイオ
ロジー第97巻、1381−1388ページ（1983年）の中で、R.
Z.フローキウイツク、A.スミス、J.E.バーグマンとJ.K.
ローズにより述べられているpBPV52−１の誘導体であ
る。このプラスミドは、ウシパピローマウイルスの複製
起源、pBR322の複製起源、β−ラクタマーゼ遺伝子及び
BPVDNAの69％形質転換断片を特徴とする。SV40の複製起
源及び初期プロモーターがこのプラスミドにクローニン
グされる。ヒト細胞内でベクターの複製を妨けるpBR322
の配列は取り除かれる。前記のプラスミドでのように、
FIBAC cDNAの完全な暗号部分が、SV40初期プロモーター
による転写がおこなわれるように挿入される。

これらの細胞での発現及び分泌に続く培地からのFIBA
Cの精製は、基本的には前に実施例４及び同５で述べら
れたように可能である。

実施例13 FUBACの再生 ２種類の試験がFIBACの再生を追跡するのに使用され
た。両試験とも、天然構造としてのFIBACの機能的能力
の出現を測定する。第１の試験は、ヒト繊維芽細胞コラ
ゲナーゼの¹⁴C標識したコラーゲンの分解能に対する試
料の阻害効果を測定する阻害試験である。第２の試験
は、ヒト・コラゲナーゼへの再生FIBACの結合を測定す
る改良ELISAである。

コラゲナーゼ結合ELISAは、それによりFIBAC活性が検
出される基本的な試験である。ここでは、コラゲナーゼ
は、96穴のイムロンIIプレートに４℃で１晩コートされ
る（1.0μg/ml 50mM Tris pH8.2、5mM CaCl₂、100μ
／ウエル）。３％BSAを含む洗浄緩衝液（50mM Tris、pH
7.5、5mM CaCl₂、0.02％Tween−20）でウエルあたり150
μを用いて45分間ウエルをブロツクした後、FIBAC標
準試料の各種希釈又は、ブロツキング緩衝液で希釈した
未知試料をウエルへ入れる（100μ／ウエル）。45分
間の保温（37℃）の後、ウエルを３度洗浄緩衝液で洗浄
する。アフイニテイ精製したウサギ及び抗FIBAC抗体を
ウエルに添加し（1/100希釈、100μ／ウエル）、37℃
45分間インキユベートする。ウエルを再洗浄し、アルカ
リホスフアターゼ結合ヤギ抗ウサギIgG（シグマ、洗浄
緩衝液で1/1000希釈）をウエルに加える（100μ／ウ
エル）。37℃で１時間のインキユベーシヨンの後、最後
の洗浄をおこない、アルカリホスフアターゼ基質（シグ
マ、＃104−105、1mg/ml 10％ジエタノールアミン、100
mM MgCl₂、pH9.8）をウエルに添加する。発色は、タイ
ターテツク・マルチスキヤンMC ELTSAリーダー（フロウ
ラボラトリーズ）を用いて495nmで測定される。天然のF
IBACは、未知試料が定量される際の標準曲線を供する。

コラゲナーゼ阻害試験で、¹⁴C標識したモルモツトの
皮膚コラーゲのペレツト（25μ／ペレツト＝2100cp
m）が50μのトリプシン活性化コラゲナーゼ（約75μg
/ml 50mM Tris、pH7.5、10mM CaCl₂）で消化され、¹⁴C
が溶液中に出される。（消化速度に依存して）１から３
時間ペレツトをインキユベートした後、反応を100μ
のTris緩衝液を加え10分間10000rpmで遠心することによ
り停止する。上清が3mlのシンチレーターの入つている
シンチレーシヨン・バイアル瓶に入れられカウントされ
る。コラーゲンのペレツトに添加する前に標品又は精製
FIBACの各希釈液50μとコラゲナーゼを予めインキユ
ベートすると、コラーゲンの消化と¹⁴Cの溶液への放出
が阻害される。未知試料の阻害活性の定量は試験に用い
た活性コラゲナーゼの量に依存する。これから、未知試
料の活性は、阻害剤と酵素のモル比が1:1と仮定して計
算される。

これらの試験を用いて、蛋白濃度、酸化グルタチオン
濃度、pH及び温度に関する再生過程の効率が試された。
これらのパラメーターの全ての組合わせが徹底的に試さ
れたわけではないが、効率的な再生をさせる方法が開発
された。

FIBICの再生は再生がおこなわれる際のFIBAC濃度に大
きく依存する。酸化条件では希釈溶液はジスフイド結合
の形成を妨げ、結果として凝集体の沈澱を引きおこす。

精製された組換えFIBACは、以下に述べるプロトコー
ルに従うことにより、再生され、蛋白100％の回収で可
溶性のままである。

（１） 6M尿素50mM MES、pH6.0 14mM2−メルタプトエ
タノール中の希釈精製FIBAC（300μg/ml以下）が70mM酸
化クルタチオン存在下でインキユベートされる。

（２） 室温で10分間の保温の後、試料は50mM Tris、p
H9.0で10倍に希釈される。

（３） 試料はその後、４℃で１晩保温される。

この再活性物質のSDS−PAGE解析は、完全なFIBACと分
解されたFIBACの両者の存在を示す。分解さたFIBACは、
精製法からずつと存在し、再活性法の間にさらに分解す
るようには思われない。

この可溶化FIBACのコラゲナーゼ結合活性（ELISA）と
コラゲナーゼ阻害活性の両者をもつことが示された。蛋
白量に対する活性の量は、コラゲナーゼ阻害試験により
決定されたように90％以上であると思われる。この数字
は、試験の中の推測されたコラゲナーゼ量に基づく計算
に由来する。これは概算だか、50％を下回るとは信じら
れない。FIBAC標品に対し測定された結合活性は、異な
る試料の相対的に再活性化の追跡を可能にする。

再生過程は又、50％純度のFIBAC標品での研究でも示
された。許容される混入蛋白の性質と量はまだ不確かで
あるが、少なくとも回収は５％以下の純度で得られる活
性FIBACが精製なしに全細胞抽出物に検出される。

各種の改良変法が本発明の過程及び産物になされるこ
とは明らかである。それ故、本発明は請求の範囲と及び
それと実質に同一である本発明の改良及び変法をも包含
するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ストリツクリン，ジヨージ ピー. アメリカ合衆国 38119 テネシー州，ジ ヤーマンタウン，ジヤーミン コウブ 7259 (72)発明者 ウエルガス，ハワード ジー. アメリカ合衆国 63011 ミズリー州，セ ント ルイス，オールド オウクス ドラ イブ 109 (56)参考文献 特開 昭57−79897（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−282095（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−227786（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 258，Ｎｏ．20，Ｐ．12252−12258（1983)

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の配列よりなるメタロプロティナーゼ
   阻害剤の細胞内生産を指揮できるDNA配列。
2. 【請求項２】Ｎ−末端にシスティン残基を有するメタロ
   プロティナーゼ阻害剤の細胞内生産を指揮できるヌクレ
   オチド配列よるなる細菌系内で発現できる組換えDNAク
   ローニングベクターであって、活性メタプロティナーゼ
   をコードする下記のヌクレオチド又は該ヌクレオチドと
   同一の機能を示す該ヌクレオチドの一部よりなる上記ベ
   クター。
3. 【請求項３】前記ベクターがベクターpUC9−F5/237P10
   ATCC寄託番号53003である請求項第２項に記載のベク
   ター。
4. 【請求項４】下記のヌクレオチド又は該ヌクレオチドと
   同一の機能を示す該ヌクレオチドの一部よりなる組換え
   DNAクローニングベクターを含有する原核生物の宿主細
   胞。
5. 【請求項５】前記宿主細胞がバチルス ズブチリス、大
   腸菌、又はシュードモナス アエルギノサである請求項
   第４項に記載の宿主細胞。
6. 【請求項６】前記宿主細胞が微生物C600/pUC9−F5/237P
   10 ATCC寄託番号 53003である請求項第４項に記載の
   宿主細胞。
7. 【請求項７】下記のヌクレオチド配列よりなるメタロプ
   ロティナーゼ阻害剤の細胞内生産を指摘できるDNA配
   列。
8. 【請求項８】下記配列よりなるメタロプロティナーゼ阻
   害剤の細胞内生産を指揮することのできるDNA配列。
9. 【請求項９】下記の配列よりなるメタロプロティナーゼ
   阻害剤の細胞内生産を指揮できるDNA配列。