DK175964B1 - Rekombinant metalloproteinaseinhibitorsekvensvektorsystem, anvendelse af denne samt rekombinant DNA-fremgangsmåde til fremstilling af denne - Google Patents

Description

4 » 5 Opfindelsens baggrund %

Endogene proteolytiske enzymer tjener til at nedl vaderende organismer, antigen-antistof-kompleksej se vævsproteiner, som ikke længere er nødvendige 10 nyttige for organismen. I en normalt fungerende < produceres proteolytiske enzymer i begrænset mæn< reguleres delvis ved hjælp af specifikke inhibiti

Metalloproteinaser er enzymer, som er til stede : 15 pen, og som ofte er involveret i nedbrydningen aJ væv. Selv om nogen bindevævsnedbrydning er nødver normal funktion af en organisme, sker der for sts devævsnedbrydning ved flere sygdomstilstande, og skrives i det mindste delvis overskud af metalloi 20 se. Det antages, at metalloproteinaser er i det r impliceret i periodontal sygdom, hornhinde- og hi rheumatoid arthritis og spredningen af cancerøse tumorer.

25 Disse sygdomme forekommer almindeligvis i områdej kroppen, som indeholder en høj andel af collagen, li« ·Ρλ rm a f K i «i-iiaxraatF Γλ nnrlarcmnAl o o -¾ f nnl- ί H stemt metalloproteinase, f.eks. collagenase, p H nase, gelatinase og visse elastaser, kan forår forværre den bindevævsdestruktion, som er forb de førnævnte sygdomme.

I I den normale tilstand besidder kroppen metall I se-inhibitorer, som bindes til metalloproteina I fektivt forhindrer disse enzymer i at virke på H devævssubstrater. Specifikt er metalloproteina H 10 inhibitorer i en sund organisme tilstede i til B koncentrationer til at samvirke med metallopro en grad, som muliggør, at tilstrækkelige mængd B loproteinase forbliver aktivt, medens overskud talloproteinase bindes, således at den bindevæ B 15 gelse, som ses ved forskellige sygdomme, ikke B Det er påstuleret, at én umiddelbar årsag til vævsdestruktion, som forekommer ved de førnævn B tilstande, er en ubalance i de relative metall B 20 se/metalloproteinase-inhibitor-koncentrationer B situationer antages overskuddet af metalloprot B enten skyldes en overskydende mængde aktiv met I nase eller en mangel i mængden af aktiv metall I se-inhibitor, at frembringe den bindevævsnedbr B 25 er ansvarlig for opståelse eller forværringen ·, 3 det antages, at disse inhibitorer vil være farmac nyttige-til behandling eller forhindring af binde domme.

5 Eksistensen af metalloproteinase og metalloprotei hibitorer er blevet omtalt i den videnskabelige 3 tur. F. eks. omtaler Sellers et al., Biochemical Biophysical Research Communications 87:581-587 {3 isoleringen af kanin-knogle-collagenaseinhibitor. 10 genaseinhibitor isoleret fra humane hudfibroblast omtalt i Stricklin and Welgus, J.B.C. 258:12252-1 (1983) og Welgus and Stricklin, J.B.C. 258:12259-(1983). Tilstedeværelsen af collagenaseinhibitore turligt forekommende kropsvæsker er yderligere on 15 Murphy et al., Biochem. J. 195:167-170 (1981) og et al., Arthritis and Rheumatism, 27:285 (1984). omtales metalloproteinaseinhibitorer af Reynolds Cellular Interactions, Dingle and Gordon, eds., ( Selvom disse artikler karakteriserer bestemte ise 20 metalloproteinaseinhibitorer og i nogen udstrækni ler metalloproteinasers rolle eller potentielle r behandling af bindevævssygdom og spekulerer over loproteinaseinhibitorers evne til at modvirke den brydning, har ingen af disse forskere tidligere v 25 stand til at isolere en overførbar DNA-sekvens, s stand til at dirigere intracellulær produktion af 1 Λ-Λ λ +»/—»* A ^ o a i ak 4 K i f a **a τ' a 1 1 ftv* η k aks ka an ι-a kamk I binant-DNA-syntesen af metalloparoteinaseinhib; I Disse metalloproteinaseinhibitorer er biologis! I lente med dem, der isoleres fra humane hudfibri I turer. Metalloproteinaseinhibitorerne ifølge o] I 5 fremstillet ved de heri angivne rekombinant-DNi I fremgangsmåder, vil muliggøre forøget forsknim I dring og behandling af metalloproteinase-indoc< I devævssygdomme. Desuden er metalloproteinaseinl I ifølge opfindelsen nyttige til neutralisering < I 10 loproteinaser, herunder det overskud af metall< I se, som er forbundet med sygdomstilstande. Der: I det, at der vil blive udviklet en behandling f< I sygdomme, der som aktiv ingrediens gør brug af I loproteinaseinhibitorerne ifølge opfindelsen. ’ I . 15 er metalloproteinaseinhibitorerne ifølge opfin< I stand til at samvirke med deres metalloprotein; I en måde, som muliggør udviklingen af diagnostik I ninger for nedbrydende bindevævssygdomme under I af de nyopdagede inhibitorer.

I 20 I De her omhandlede rekombinante metalloproteinai I rer samvirker støkiometrisk (dvs. i et forhold I med deres metalloprotéinase-mål. Desuden er dii I loproteinaseinhibitorer varmeresistente, syresi I 25 glycosylerede og udviser et højt isoelektrisk { 5 stand til at dirigere intracellulær produktion ai ^ loproteinaseinhibitorerne. Især angår opfindelser lagenaseinhibitor, en rekombinant-DNA-fremgangsm« fremstilling af denne og overførbare DNA-sekvens« 5 anvendelse ved rekombinant fremgangsmåde. Den foj de opfindelse angår også en række vektorer indehc disse overførbare DNA-sekvenser.

Et formål for opfindelsen er at tilvejebringe en 10 loproteinaseinhibitor, som kan produceres i tiist ge mængder og renheder til at give økonomiske fai ske præparater, som har metalloproteinaseinhibitc aktivitet.

15 Et yderligere formål for opfindelsen er at angive kombinant-DNA-fremgangsmåde til fremstilling af c talloproteinaseinhibitorer. De rekombinante metaJ teinaseinhibitorer, som fremstilles ved denne fre måde, er biologisk ækvivalente med den metalloprc 20 seinhibitor, som kan isoleres fra humane hudfibre kulturer.

For at lette rekombinant-DNA-syntesen af disse me loproteinaseinhibitorer er det et yderligere forn 25 opfindelsen at tilvejebringe overførbare DNA-sek\ som er i stand til at dirigere intracellulær proc af mat-al 1 ΛΓι>*Λΐ·ήΐ naeai nhiKi Ι*Λ)»Λί· naf λf 6

Yderligere formål for og fordele ved opfindels fremgå af den følgende beskrivelse og vil delv nærliggende ud fra beskrivelsen eller kan lære 5 praktisering af opfindelsen. Formålene og ford realiseres og opnås ved hjælp ,af de midler og ner, som særlig er påpeget i de vedføjede krav

For at opnå opfindelsens formål og i overensst 10 opfindelsens hensigter angives metalloproteina rer, som er i stand til støkiometrisk reaktion loproteinaser. Disse metalloproteinaseinhibito mærkelsesværdigt varmeresistente, syrestabile, rede og udviser et højt isoelektrisk punkt. En 15 disse metalloproteinaseinhibitorer biologisk æ med de inhibitorer, som isoleres fra humane hu fibroblastkulturer.

Til yderligere opnåelse af opfindelsens formål 20 ensstemmelse med opfindelsens hensigter tilvej overførbare DNA-sekvenser, som koder for metal seinhibitorer. Disse sekvenser omfatter nucleo ser, som er i stand til at dirigere intracellu tion af metalloproteinaseinhibitorer. De overf 25 kvenser kan være enten syntetiske sekvenser el 7 kultur.

Kodestrengen af en første foretrukken DNA-sekven; blevet opdaget, har den følgende nucleotidsekveni 5 LO 20 30 40 50

GTTGTTGCTG TGGCTGATAG CCCCAGCAGG GCCTGCACCT GTGTCCCACC CCA

70 80 90 100 110

ACGGCCTTCT GCAATTCCGA CCTCGTCATC AGGGCCAAGT TCGTGGGGAC ACC

130 140 150 160 170

AACCAGACCA CCTTATACCA GCGTTATGAG ATCAAGATGA CCAAGATGTA TAA

190 200 210 220 230

CAAGCCTTAG GGGATGCCGC TGACATCCGG TTCGTCTACA CCCCCGCCAT CGA

250 260 270 280 290

TGCGGATACT TCCACAGGTC CCACAACCGC AGCGAGGAGT TTCTCATTGC TGG

310 320 330 340 350

CAGGATGGAC TCTTGCACAT CACTACCTGC AGTTTCGTGG CTCCCTGGAA CAG

370 380 390 400 410

TTAGCTCAGC GCCGGGGCTT CACCAAGACC TACACTGTTG GCTGTGAGGA ATG

430 440 450 460 470

TTTCCCTGTT TATCCATCCC CTGCAAACTG CAGAGTGGCA CTCATTGCTT GTG

490 500 510 520 530

CAGCTCCTCC AAGGCTCTGA AAAGGGCTTC CAGTCCCGTC ACCTTGCCTG CCT

550 560 570 580 590 B Nucleotiderne repræsenteret ved de foregående B ser er angivet i detailbeskrivelsen og de fore I førelsesformer.

I En anden foretrukken DNA-sekvens, som er bleve I har en yderligere nucleotidsekvens 5' for init I kvensen. Denne sekvens, der som de 88. til 432 I der indeholder nucleotiderne 1-351 i den ovenfi 10 første foretrukne sekvens, har den følgende nu< kvens: I 10 20 30 40 so

GGCCATCOCC GCAGATCCAG CGCCCAGAGA GACACCAGAG AACCCACCAT C

I 70 80 90 100 110

I GACCCCTGGC TTCTGCATCC TGTTGTTGCT GTGGCTGATA GCCCCAGCAG C

I 130 140 150 * 160 170

I TGTGTCCCAC CCCACCCACA GACGGCCTTC TGCAATTCCG ACCTCGTCAT C

I 190 200 210 ' . 220 .. . 230

B TTCGTGGGGA CACCAGAAGT CAACCAGACC ACCTTATACC AGCGTTATGA C

B 250 260 270 280 290

B ACCAAGATGT ATAAAGGGTT CCAAGCCTTA GGGGATGCCG CTGACATCCG C

B 310 320 330 340 350

B ACCCCCGCCA TGGAGAGTGT CTGCGGATAC TTCCACAGGT CCCACAACCG C

B 370. 380 390 400 410 9 den første foretrukne sekvens, har den følgende tidsekvens: 10 20 30 40 50

GGCCATCGCC GCAGATCCAG CGCCCAGAGA GACACCAGAG AACCCACCAT GG

70 80 90 100 110

GACCCCTGGC TTCTGCATCC TGTTGTTGCT GTGGCTGATA GCCCCAGCAG GG

130 140 150 160 170

TGTGTCCCAC CCCACCCACA GACGGCCTTC TGCAATTCCG ACCTCGTCAT CA

190 200 210 220 230

TTCGTGGGGA CACCAGAAGT CAACCAGACC ACCTTATACC AGCGTTATGA GA

250 260 270 280 290

ACCAAGATGT ATAAAGGGTT CCAAGCCTTA GGGGATGCCG CTGACATCCG GT

310 320 330 340 350

ACCCCCGCCA TGGAGAGTGT CTGCGGATAC TTCCACAGGT CCCACAACCG CA

370 380 390 400 410

TTTCTCATTG CTGGAAAACT GCAGGATGGA CTCTTGCACA TCACTACCTG CA

430 440 450 460 470

GCTCCCTGGA ACAGCCTGAG CTTAGCTCAG CGCCGGGGCT TCACCAAGAC CT

490 500 510 520 530

GGCTGTGAGG AATGCACAGT GTTTCCCTGT TTATCCATCC CCTGCAAACT GC

550 560 570 580 590

ACTCATTGCT TGTGGACGGA CCAGCTCCTC CAAGGCTCTG AAAAGGGCTT CC

610 620 630 640 650 CACCTTGCCT GCCTGCCTCG GGAGCCAGGG CTGTGCACCT GGCAGTCCCT GC< I 10 H For tiden foretrækker opfinderne til udtrykkel H omhandlede metalloproteinaseinhibitorer i dyre en fremgangsmåde, som udnytter en fjerde, foret I sekvens. Kodestrengen af denne sekvens.ser ud 11 10 20 30 40 50

GGCCATCGCC CCAGATCCAG CGCCCAGAGA GACACCAGAG AACCCACCAT GG

70 80 90 100 110

GAGCCCCTGG CTTCTGGCAT CCTGTTGTTG CTCTGGCTGA TAGCCCCCAG CA

130 140 150 160 170

ACCTGTGTCC CACCCCACCC ACAGACGGCC TTCTGCAATT CCGACCTCGT CA

190 200 210 220 230

AAGTTCGTGG GGACACCAGA AGTCAACCAG ACCACCTTAT ACCAGCGTTA TG

250 260 270 280 290

ATGACCAAGA TGTATAAAGG GTTCCAAGCC TTAGGGGATG CCGCTGACAT CC

310 320 330 340 350

TACACCCCCG CCATGGAGAG TGTCTGCGGA TACTTCCACA GGTCCCACAA CC

370 380 390 400 410

GAGTTTCTCA TTGCTGGAAA ACTGCAGGAT GGACTCTTGC ACATCACTAC CT

430 440 450 460 470

GTGGCTCCCT GGAACAGCCT GAGCTTAGCT CAGCGCCGGG GCTTCACCAA GA

490 500 510 520 530

GTTGGCTGTG AGGAATGCAC AGTGTTTCCC TGTTTATCCA TCCCCTGCAA AC

550 560 570 580 590

GGCACTCATT GCTTGTGGAC GGACCAGCTC CTCCAAGGCT CTGAAAAGGG CTI

610 620 630 640 650

CGTCACCTTG CCTGCCTGCC TCGGGAGCCA GGGCTGTGCA CCTGGCAGTC CCT

670 680 690 700 710

CAGATAGCCT GAATCCTGCC CGGAGTGGAA GCTGAAGCCT GCACAGTGTC CAC

I 12 I for at lette identificeringen og isoleringen a: I DNA-sekvenser til anvendelse i forbindelse med sen har opfinderne udviklet et human-hudfibrob^ I bibliotek. Dette bibliotek indeholder den genel I 5 formation, som er i stand til at dirigere en c< I syntetisere metalloproteinaseinhibitorerne iføi I ' delsen. Andre naturlige DNA-sekvenser, som‘ kan I ved de her omhandlede rekombinant-DNA-fremgang: I isoleres fra humane genomiske bibliotekter.

I 10 I Desuden kan overførbare DNA-sekvenser, som er i I fremgangsmåderne ifølge opfindelsen, skabes syi I Disse syntetiske DNA-sekvenser kan fremstilles I nucleotid-syntese- og -sekvensbestemmelses-teki I 15 kendt af fagfolk*

Til opnåelse af opfindelsens formål i overenssi I med dens hensigter angives endvidere en rekomb: I fremgangsmåde, som resulterer i mikrobiel frem: I 20 de omhandlede metalloparoteinaseinhibitorer unc I delse af de ovenfor angivne overførbare DNA-sel

Denne rekombinant-DNA-fremgangsmåde omfatter: I C a) fremstilling af en overførbar DNA-sekvens, 25 stand til at dirigere en værts mikroorganisme t 13 tionelle elementer for den overførbare DNA-sekvei (c) overførsel af vektoren indeholdende den overi DNA-sekvens og operationelle elementer til en væj 5 organisme, som er i stand til at udtrykke metall< naseinhibitor-proteinet: (d) dyrkning af værtsmikroorganismen under betin< som er passende for forstærkning af vektoren og i 10 kelse af inhibitoren: og (e) i valgfri rækkefølge: (i) indhøstning af inhibitoren; og 15 (ii) inhibitoren bringes til at antage en aktiv, struktur, hvorved den har metalloparoteinaseinhil aktivitet.

Til yderligere opnåelse af opfindelsens formål o< 20 ligere overensstemmelse med dens hensigter tilve; en række kloningsvektorer omfattende mindst én aJ ovenfor omtalte overførbare DNA-sekvenser. Især i plasmid pUC9-F5/237plO.

25 Den foregående generelle beskrivelse og den følg« taljerede beskrivelse er udelukkende illustrativ klarende oq ikke begrænsende for opfindelsen som I 14 I Der vil nu blive henvist i detaljer til de for . retrukne udførelsesformer af opfindelsen, som de følgende eksempler tjener til at forklare o H principper.

Som bemærket ovenfor angår den foreliggende op H for en dels vedkommende overførbare DNA-sekven i stand til at dirigere intracellular produkti' talloproteinaseinhibitorer i en række forskeli 10 mikroorganismer. "Overførbar DNA-sekvens" skal H sammenhæng henføre enten til en syntetisk frem nucleotidsekvens eller til et restriktionsfragi

I naturligt forekommende DNA-sekvens. Til denne I

I ses formål skal "metalloproteinaseinhibitor” b< I 15 primære struktur af proteinet som defineret ve< I ner, som er til stede i den deoxyribonucleinsy: som dirigerer intracellulær produktion af amin< I kvensen, og som eventuelt inkluderer efter-trai I . modifikationer. Det kommer i betragtning, at s< . 20 ter-translations-modifikationer inkluderer f. < I sylering. Det er yderligere.hensigten, at betet "metalloproteinaseinhibitor" henfører til entei I af proteinet, som måtte blive udskilt fra en m: I nisme, eller til methionyl-metalloproteinaseinl I 25 som den kan være til stede i mikroorganismer, Ϊ 15 at dirigere intracellulær produktion af en colla hibitor, som .er biologisk ækvivalent med den, de gere er isoleret fra humane hudfibroblastkulture "biologisk ækvivalent" menes i denne beskrivelse 5 at en inhibitor fremstillet under anvendelse af førbar DNA-sekvens ifølge opfindelsen er i stand forhindre collagenase-induceret vævsbeskadigelse samme type, men ikke nødvendigvis i den samme gr en nativ human collagenaseinhibitor, specifikt d 10 humane collagenaseinhibitor, som kan isoleres fr hudfibroblastcellekulturer.

En første foretrukken overførbar DNA-sekvens ifø findelsen har en nucleotidsekvens som følger: I 16 10 20 . 30 40 5

H GTTGTTGCTG TGGCTGATAG CCCCAGCAGG GCCTGCACCT GTGTCCCAC

70 80 90 100 11

I ACGGCCTTCT GCAATTCCGA CCTCGTCATC AGGGCCAAGT TCGTGGGGA

I 130 140 150 160 17

I AACCAGACCA CCTTATACCA GCGTTATGAG ATCAAGATGA CCAAGATGT

190 200 210 220 23

CAAGCCTTAG GGGATGCCGC TGACATCCGG TTCGTCTACA CCCCCGCCA

250 260 270 280 29

TGCGGATACT TCCACAGGTC CCACAACCGC AGCGAGGAGT TTCTCATTG

I 310 320 330 340 35

I CAGGATGGAC TCTTGCACAT CACTACCTGC AGTTTCGTGG CTCCCTGGA

I 370 380 390 400 41

I TTAGCTCAGC GCCGGGGCTT CACCAAGACC TACACTGTTG GCTGTGAGG

I 430 440 450 460 47

TTTCCCTGTT TATCCATCCC CTGCAAACTG CAGAGTGGCA CTCATTGCT

I 490 500 510 520 53 I CAGCTCCTCC AAGGCTCTGA AAAGGGCTTC CAGTCCCGTC ACCTTGCCT1 I 550 560 570 580 59 GAGCCAGGGC TGTGCACCTG GCAGTCCCTG CGGTCCCAGA TAGCCTGAA' I 610 620 630 640 65< I GTGGAAGCTG AAGCCTGCAC AGTGTCCACC CTGTTCCCAC TCCCATCTT' , 670 680 690 700 17

Deoxyguanylsyre G

Deoxycytidylsyre , C

Thymidylsyre T

5 En anden foretrukken overførbar DNA-sekvens iføli delsen har den følgende nucleotidsekvens: 10 20 30 40 so GGCCATCGCC GCAGATCCAG CGCCCAGAGA GaCACCAGAG AACCCACCAT GG< 70 80 90 100 110 GACCCCTGGC TTCTGCATCC TGTTGTTGCT GTGGCTGATA GCCCCAGCAG GG< 130 140 150 160 170 TGTGTCCCAC CCCACCCACA GACGGCCTTC TGCAATTCCG ACCTCGTCAT CAl 190 200 210 220 230 TTCGTGGGGA CACCAGAAGT CAACCAGACC ACCTTATACC AGCGTTATGA GA' 250 260 270 280 290

ACCAAGATGT ATAAAGGGTT CCAAGCCTTA GGGGATGCCG CTGACATCCG GT

310 320 330 340 350 ACCCCCGCCA TGGAGAGTGT CTGCGGATAC TTCCACAGGT CCCACAACCG CA( 370 380 390 400 410 TTTCTCATTG CTGGAAAACT GCAGGATGGA CTCTTGCACA TCACTACCTG CAl 430

GCTCCCTGGA AC

I denne anden foretrukne sekvens eksisterer en åt læsningsramme fra nucleotid 1 til nucleotid 432. 10 ste methioninrest i denne aflæsningsramme er indk I 18 I . En tredje foretrukken overførbar DNA-sekvens h< I tidsekvensen: I 10 20 30 40 50

I GGCCATCGCC GCAGATCCAG CGCCCAGAGA GACACCAGAG AACCCACCAT G

I 70 SO . 90 100 110

I GACCCCTGGC TTCTGCATCC TGTTGTTGCT GTGGCTGATA GCCCCAGCAG G

I 130 140 150 160. 170

TGTGTCCCAC CCCACCCACA GACGGCCTTC TGCAATTCCG ACCTCGTCAT C

I 190 200 210 220 230

TTCGTGGGGA CACCAGAAGT CAACCAGACC ACCTTATACC AGCGTTATGA G

I 250 260 270 280 290

H ACCAAGATGT.ATAAAGGGTT CCAAGCCTTA GGGGATGCCG CTGACATCCG G

I 310 320 330 340 350

I ACCCCCGCCA TGGAGAGTGT CTGCGGATAC TTCCACAGGT CCCACAACCG C

I 370 380 390 400 410

TTTCTCATTG CTGGAAAACT GCAGGATGGA CTCTTGCACA TCACTACCTG C

I 430 440 450 460 470

I GCTCCCTGGA ACAGCCTGAG CTTAGCTCAG CGCCGGGGCT TCACCAAGAC C

I 490 500 510 520 530

GGCTGTGAGG AATGCACAGT GTTTCCCTGT TTATCCATCC CCTGCAAACT G

I 550 560 570' 580 590

I ACTCATTGCT TGTGGACGGA CCAGCTCCTC CAAGGCTCTG AAAAGGGCTT C

I 610 620 630 640 . 650 19

Denne tredje sekvens indeholder det ikke-transla 5'-område af den anden foretrukne sekvens og 3'-af den første foretrukne sekvens. Det forudses, tredje foretrukne sekvens er i stand til at diri 5 tracellulær produktion af en metalloproteinase, analog med en moden human collagenaseinhibitor, krobielt eller pattedyr-udtrykkelsessystem.

For tiden foretrækker opfinderne mest til udtryk 10 de omhandlede metalloproteinaseinhibitorer i dyr mest en fremgangsmåde, som udnytter en fjerde fo DNA-sekvens. Kodestrengen af denne sekvens ser u følger: I 20 Η 10 20 30 40 50 H GGCCATCGCC GCAGATCCAG CGCCCAGAGA GACACCAGAG AACCCACCAT ( 70 80 90 - 100 110 GAGCCCCTGG CTTCTGGCAT CCTGTTGTTG CTGTGGCTGA TAGCCCCCAG ( 130 140 150 160 170 ACCTGTGTCC CACCCCACCC ACAGACGGCC TTCTGCAATT CCGACCTCGT ( 190 200 210 220 230 AAGTTCGTGG GGACACCAGA AGTCAACCAG ACCACCTTAT ACCAGCGTTA ' 1' 250 260 270 280 290 ATGACCAAGA TGTATAAAGG GTTCCAAGCC TTAGGGGATG CCGCTGACAT ) H 310 320 330 340 350

TACACCCCCG CCATGGAGAG TGTCTGCGGA TACTTCCACA GGTCCCACAA I

370 380 390 400 410

GAGTTTCTCA TTGCTGGAAA ACTGCAGGAT GGACTCTTGC ACATCACTAC I

430 440 450 460 470 GTGGCTCCCT GGAACAGCCT GAGCTTAGCT CAGCGCCGGG GCTTCACCAA ( I 490 500 510 520 530

GTTGGCTGTG AGGAATGCAC AGTGTTTCCC TGTTTATCCA TCCCCTGCAA

550 560 570 580 590

GGCACTCATT GCTTGfGGAC GGACCAGCTC CTCCAAGGCT CTGAAAAGGG

610 620 630 640 650

. CGTCACCTTG CCTGCCTGCC TCGGGAGCCA GGGCTGTGCA CCTGGCAGTC

H 670 680 690 700 710

I CAGATAGCCT GAATCCTGCC CGGAGTGGAA GCTGAAGCCT GCACAGTGTC

21 ber. Derfor forudses det også, at andre overførba sekvenser, både dem, der er i stand til at dirige tracellulær produktion af identiske aminosyresekv og dem, der er i stand til at dirigere intracellu 5 duktion af analoge aminosyre4sekvenser, som også talloproteinaseinhibitor-aktivitet, er omfattet a foreliggende opfindelse.

Det forudses, at nogle af disse analoge aminosyre 10 ser vil være i det væsentlige homologe med native metalloproteinaseinhibitorer, medens andre aminos kvenser, der er i stand til at fungere som metall naseinhibitorer, ikke vil udvise væsentlig homolo native inhibitorer. Ved "væsentlig homologi" mene 15 ne beskrivelse med krav en grad af homologi med e metalloproteinaseinhibitor på over 50 %, fortrins 60 % og mest foretrukket over 80 %. Den her omtal logiprocent beregnes som procenten af aminosyrere som findes i den mindste af de to sekvenser, der 20 overens med identiske aminosyrerester i sammenlig kvensen, når fire mellemrum med en længde på 100 rer kan indføres for at hjælpe med til at bringe ske rester på linie som angivet af Dayhoff, M.O. bf Protein Sequence and Structure Vol. 5, side 12 25 ¢1972), National Biochemical Research Foundation, ington, D.C., der specifikt betragtes som inkorpo denne beskrivelse ved henvisnina.

I 22 I ser er almindeligt kendte for en fagmand, især

I de heri indeholdte anvisninger. Som et eksempeJ

I nikkens stade med hensyn til polynucleotidsynte

ses til Mat.teucci, M.D. og Caruthers, Μ.H. ,· i C

I 5 Chem. Soc. 103: 3185 (1981) og Beaucage, S.L. c I ruthers, M.H. i Tetrahedron Lett. 22: 1859 (19£ I specifikt betragtes som inkorporeret i denne be I og krav ved henvisning.

10 Desuden kan den overførbare DNA-sekvens være et I af en naturlig sekvens, dvs. et fragment af et I nucleotid, som forekom i naturen og er blevet i renset for første gang af opfinderne i denne sa I udførelsesform er den overførbare DNA-sekvens e

15 tionsfragment isoleret fra et cDNA-bibliotek. I

I retrukne udførelsesform frembringes cDNA-biblic I fra humane hudfibroblaster.

I I en alternativ udførelsesform isoleres den ove

I 20 DNA-sekvens fra et humant genomisk bibliotek. E

I på et sådant bibliotek, som er nyttigt i denne I , sesform, er anført i Lawn et al. Céll 15: 1157- I (1978), der specifikt betragtes som inkorporere I beskrivelse med krav ved henvisning.

I 25 23 mikroorganismes evne til at producere store mæng< den ønskede metalloproteinaseinhibitor.

Desuden kan kloningsvektorerne, der omfattes af < 5 sen, indeholde supplerende nucleotidsekvenser foi eller efter den overførbare DNA-sekvens. Disse s\ de sekvenser er dem, der ikke vil indvirke skade! transskriptionen af den overførbare DNA-sekvens t le tilfælde, som anført mere fuldstændigt nedenfc 10 forhøje transskription, translation eller evnen 1 resulterende metalloproteinaseinhibitores primære syrestruktur til at antage en aktiv tertiær form,

En foretrukken vektor ifølge opfindelsen, pUC9-F! 15 indeholder den ovenfor angivne foretrukne nucleol kvens. Vektoren pUC9-F5/237plO er til stede i C6( F5/237pl0 cellerne, som er deponeret i the Ameri< Culture Collection i Rockville, Maryland, USA un< cessionsnummeret 53003.

20

En foretrukken nucleotidsekvens, der koder for mi loproteinaseinhibitor er identificeret som regior Plasmid pUC9-F5/237P10 indeholder også yderligere gående eller efterfølgende nucleotidsekvenser i j 25 Disse yderligere sekvenser identificeres som hen! region B og C.

I 24 H fjernelse af de supplerende sekvenser. Den sup| sekvens efter den overførbare .DNA-sekvens kan .

behandling af vektoren med en egnet restriktio] I · noclease, fortrinsvis HgiAI, efterfulgt af rek< I 5 af. den overførbare DNA-sekvens' 3'-ende under i af syntetiske oligonucleotider og ligering af 1 med T4-DNA-ligase. Deletion af den supplerende forud for den overførbare DNA-sekvens vil spec: gennemført ved den fremgangsmåde, som er angiv< I 10 pel 2.

I foretrukne udførelsesformer vil kloningsvekt< I indeholder og er i stand til at udtrykke den o^ DNA-sekvens ifølge opfindelsen, indeholde forsi I 15 operationelle elementer. Disse "operationelle ΐ I som omtalt i denne beskrivelse med krav, inklu< I mindst én promotor, mindst én Shine-Dalgarno-s« I mindst én terminatorcodon. Fortrinsvis inkluder "operationelle‘elementer" også mindst én operat 20 én ledersekvens og, for proteiner, som skal eki . fra det intracellulære rum,- mindst én regulatoj andre DNA-sekvenser, som er nødvendige,eller f< I tilpassende transskription og efterfølgende trs I af vektor-DNA'en.

I 25 25 ganismesekvenser; -(2) er stabile i en ønske vært; i stand til at forekomme i et højt kopiantal i de de vært; (4) indeholder en regulerbar promotor; ( mindst én DNA-sekvens, som koder for et selekterb 5 træk, der er til stede på en portion af plasmidet fra den, hvori den overførbare DNA-sekvens vil bl sat; og (6) er integreret i vektoren.

Den følgende, ikke-fuldstændige, liste over kloni 10 torer antages at angive vektorer, som let kan ænd at opfylde de ovennævnte kriterier og derfor fore til anvendelse i forbindelse med den foreliggende delse. Sådanne ændringer gennemføres let af fagfo set af den tilgængelige litteratur og anvisninger 15 denne beskrivelse.

TABEL I

Vært Vektorer Bemærkninger 20 E. coli pUC8 Mange selekterbare pUC9 coner er blevet kar pBR322 riseret; pGW7 Maniatis, T. et al placlq Molecular Cloning: 25 pDP8 Laboratory Manual,

Spring Harbor Labor I 26 Η B. stearother- pBD6 .

H mophilus pBD8 I pT127 I 5 PSEUDOMONAS RSF1010 Nogle vektorer s Η Ρ. aeruginosa Rmsl49 . vendelige i et i: P. putida pKT209 område af Gram-r RK2 bakterier, herur pSa727 thomonas og Agre I CLOSTRIDIUM pJU12 Skyttelpladmider C.perfringens pJU7 li og C. perfrin

H pJUlO struktionsref. S

I pJU16 et al. (1984) Jc I 15 pJUl3 teriol. 159:465- SACCHAROMYCES YEp24 Bostein og Davis S. cerevisiae YIp5 cular Biology of

YRpl7 Saccharomyces, S

I 20 Jones, og Broach H . 1982, Cold Sprin H Laboratory, I De bør forstås,, at der kan findes eller vil bl I 25 yderligere kloningsvektorer, som har de ovenfo 27 anvendes ved den rekombbinant-DNA-fremgangsmåde, gives nærmere nedenfor.

Foruden den ovenstående liste foretrækkes et E. c 5 torsystem, som angivet i eksempel 2, i en udføre] som kloningsvektor. Endvidere foretrækkes flere \ torplasmider, som repliceres autonomt i et bredt af Gram-negative bakterier, til anvendelse som kl medier i værter tilhørende slægten Pseudomonas. C 10 beskrevet af Tait, R.C., Close, T.J., Lundquist, Hagiya, M., Rodriquez, R.L. og Kado, C.I-, i Biot gy, Maj 1983, side 269-275; Panopoulos, N.J. i Ge Engineering in the Plant Sciences, Praeger Publis New York, New York, side 163-185, (1981); og Saks 15 K. i Current Topic in Microbiology and Immunology 45, (1982), der hver for sig betragtes som specif korporeret i denne beskrivelse ved henvisning.

En særlig foretrukken konstruktion anvender plasn 20 RSF1010 og derivater deraf som beskrevet af Bagda M., Bagdasarian, M.M., Coleman, S. og Timmis, K.N Plasmids of Medical Environmental and Commercial tance, Timmis, K.N. og Publer, A. eds., Elsevier/ Holland Biomedical Press, (1979), der betragtes s 25 cifikt inkorporeret i denne beskrivelse ved henvi Fordelene ved RSF1010 er, at det er et relativt 1 hrai-ΐ a Ja 1 nlaiffliH Ci'MTi 1 /=>f· t rSncfA ϊ i*\H i I 28

H nas-RNA-polymerase som angivet af Sakaguchi, Y

Topics in Microbiology and Immunology 96:31-45

Gray, G.L., McKeown, K.A., Jones, A.J.S., Seet og Heyneker, H.L. i Biotechnology Feb. 1984, s 5 165, der begge betragtes som specifikt inkorpc denne beskrivelse ved henvisning. Transskripti teten kan yderligere maksimeres ved udskiftnin H toren med f. eks. en E. coli eller P. aeruginc H promotor.

I 10 I en foretrukken udførelsesform transformeres nosa med vektorer, som dirigerer syntesen af ir . teinaseinhibitoren som enten et intracellulært eller som et produkt koblet til ledersekvenser H 15 bevirke dets forarbejdning og eksport fra cell udførelsesform vælges disse ledersekvenser for I blandt ^-lactamase, OmpA-protein, det naturlig mende humane signalpeptid og ledersekvensen fo I peptidase G2 fra Pseudomonas. Translationen ka I 20 til translationsstart for ethvert af E. coli p I som beskrevet i eksempel 2 såvel som til start I ethvert af værtens højt udtrykte proteiner til gelse af intracellulær udtrykkelse af metallop I seinhibitoren.

I 25 29

Bagdasarian, M., et al., Plasmids of Medical, Em tal and Commercial Importance, side 411-422, Timr Puhler eds., Elsevier/North Holland Biomedical Pi (1979), der specifikt betragtes som inkorporeret 5 beskrivelse ved henvisning.

Endvidere involverer et foretrukket udtrykkelsesi værter af slægten Bacillus anvendelsen af plasmic pUBHO som kloningsmedium. Som i andre vektorvært 10 mer er det muligt i Bacillus at udtrykke metallof seinhibitorerne ifølge opfindelsen som enten et i lulært eller et secerneret protein. De her angivr relsesformer inkluderer begge systemer. Skyttelv« som repliceres i både Bacillus og E. coli, er ti] 15 hed for konstruktion og afprøvning af forskellige som beskrevet af Dubnau, D., Gryczan, T., Content Shivakumar, A.G. i Genetic Engineering, Vol. 2, ί and Hollander eds., Plenum Press, New York, New Ί side 115-131, (1980), der specifikt betragtes son 20 poreret i denne beskrivelse ved henvisning. Til x. kelsen og sekretionen af metalloproteinaseinhibit B. subtilis kobles signalsekvensen for a-amylase trinsvis til kodeområdet for metalloproteinaseinh ren. Til syntese af intracellulær metalloproteiné 25 bitor vil den overførbare DNA-sekvens blive tranl koblet til ribosombindingscentret i a-amylase- I 30 I promotors RNA-polymerase-genkendelse$sekvens, i I porerer ligeledes lac-operatoren. Lignende hyb.

I torer konstrueret ud fra penicillinasegen-promi I lac-operatoren er blevet vist at fungere i Bac I 5 værter på regulerbar måde som angivet af Yansu: I Henner i Genetics and Biotechnology of Bacilli I A.T. og Hoch, J.A., eds. Academic Press, side : (1984), der specifikt betragtes som inkorporere beskrivelse ved henvisning. Lad-genet af lad' 10 -så inkluderes til frembringelse af regulering.

31 ser anticollagenase-genet på 2 pm plasmidet. For< ved 2 pm cirklen inkluderer relativt kopiantal ot litet, når den indføres i cir°-stammer. Disse vel inkorporerer fortrinsvis repliceringsoriginet og 5 én antibiotikumresistens-markør fra pBR322 for al gøre replicering og selektion i E. coli. Desuden plasmidet fortrinsvis indeholde 2 pm sekvenser o< LEU2-genet til at tjene de samme formål i LEU2-m\ af gær.

10

Den regulerbare promotor fra gær-GALl-genet vil : vis blive tilpasset til direkte transskription a: overførbare DNA-sekvens-gen. Translation af den < bare DNA-sekvens i gær vil blive koblet til den ; 15 sekvens, som dirigerer sekretionen af gær-a-fakt< vil forårsage dannelse af et fusionsprotein, som ve forarbejdet i gær og resultere i sekretion af talloproteinaseinhibitor. Alternativt vil en metl metalloproteinaseinhibitor blive translateret til 20 sion i cellen.

Det forventes, at translation af mRNA, som koder talloproteinaseinhibitoren i gær, vil være mere « med gærens foretrukne codonbrug end med den sekvi 25 er til stede i pUC8-Fic, som identificeret i eks( og som er blevet skræddersyet til den prokaryotii I 32

Η · HgiAI

I 5’ GAT CCG TGC ACT TGT GTT CCA CCA CAC

GC ACG TGA ACA CAA GGT GGT GTG

I CCA CAA ACT GCT TTC TGT AAC TCT GAC C

I GGT GTT TGA CGA AAG ACA TTG AGA CTG GA

Som det vil ses ud fra en undersøgelse af de i B kloningsvektorer og systemer indeholdt i den o B 5 liste og beskrivelse, kan forskellige operatio menter være til stede i hver af de foretrukne B ifølge opfindelsen. Det forudsættes, at eventu B ligere operationelle elementer, som matte kræv B tilføjes disse vektorer under anvendelse af me 10 er kendte af fagfolk, især i lyset af de heri B visninger.

I praksis er det muligt at konstruere hver af torer på en måde, som gør det muligt let at is B '15 le,og ombytte dem. Dette letter samlingen af t funktionelle gener ud fra kombinationer af dis B ter og kodeområdet for metalloproteinaseinhibi B videre vil mange af. disse elementer være anven B mere end én vært.

I 20

M -i ia /-i c +- A f- ran! i /Ori nneAri πΐ n e Am rr Vonrlnc a-F

33 sekvenser, der er i stand til at fungere som regi ("operatorer"), og andre DNA-sekvenser, som er i til at kode for regulatorproteiner. Foretrukne ve af denne række indeholder yderligere ribosombin-5 dingscentre, transskriptionsafsluttere og lederse

Disse regulatorer vil i en udførelsesform tjene t forhindre udtrykkelse af den overførbare DNA-sek\ nærvær af visse miljøbetingelser og vil i nærvær 10 miljøbetingelser tillade transskription og efteri udtrykkelse af det protein, som den overførbare C sekvens koder for. Især foretrækkes det, at regul segmenter indsættes i vektoren, således at udtryk den overførbare DNA-sekvens ikke vil ske i fravæi 15 eks. isopropylthio-|3-d-galactosid. I denne situat den transformerede mikroorganisme indeholdende de førbare DNA vokse til en ønsket tæthed før udtryk af metalloproteinaseinhibitoren startes. I denne sesform induceres udtrykkelse af den ønskede prot 20 hibitor ved tilsætning af et stof til det mikrobi miljø, som er i stand til at frembringe udtrykkel DNA-sekvensen, efter at den ønskede tæthed er ble nået.

25 Desuden foretrækkes det, at der er en passende se risk ledersekvens tilstede, enten i vektoren elle C I ___3_____ .C -1*.* _____.C__1_____ ΓΜΤ71__I _ _ _ _ i___» 1 t___ 34 ningssignaler. Tilstedeværelsen af ledersekven; delvis af en eller flere af de følgende grunde; stedevasrelsen af. ledersekvensen kan lette vært« bejdning af det oprindelige produkt til den mo< 5 binante metalloproteinaseinhibitor; 2) Tilsted« af ledersekvensen kan lette rensningen af de r« metalloproteinaseinhibitorer ved at dirigere ra« teinaseinhibitoren ud af cellecytoplasmaet; 3) værelsen af ledersekvensen kan påvirke den rek< 10 metalloproteinaseinhibitors evne til at foles t aktive struktur under dirigeringen af metallopj seinhibitoren ud af cellecytoplasmaet.

Især kan ledersekvensen dirigere spaltning af c 15 delige translationsprodukt ved hjælp af en led« se, som fjerner .ledersekvensen og efterlader et tid med den aminosyresekvens, som har den poter talloproteinaseinhibitor-aktivitet. I nogle art værtsmikroorganismer vil tilstedeværelsen af di 20 ledersekvens muliggøre transport af det fuldsta tein ind i det periplasmiske rum, som i tilfælc coli. I tilfælde af visse gærarter og stammer c og Pseudomonas vil den passende ledersekvens mi transport af proteinet igennem cellemembranen c 25 ekstra cellulære medium. I denne situation kan 35 foldes til antagelse af dets aktive struktur, sor passende metalloproteinaseaktivitet.

yderligere operationelle elementer inkluderer, mi 5 ke begrænset til, ribosombindingscentre og andre sekvenser, som er nødvendige for mikrobiel udtryi fremmede proteiner. De operationelle elementer s< i denne beskrivelse kan vælges rutinemæssigt af i lyset af litteraturen og de heri indeholdte vejle 10 Almene eksempler på disse operationelle elementej givet i B. Lewin, Genes, Wiley & Sons, New York i der specifikt betragtes som inkorporeret i denne velse ved"henvisning. Forskellige eksempler på ec operationelle elementer kan findes på de ovenfor 15 vektorer og kan belyses ved gennemsyn af de publj ner, som omtaler4 de grundliggende egenskaber af nævnte vektorer.

1 en foretrukken udførelsesform af opfindelsen ei 20 yderligere DNA-sekvens lokaliseret umiddelbart fc overførbare DNA-sekvens, som koder for metalloprc seinhibitoren. Denne yderligere DNA-sekvens er i til at fungere som translationskobler, dvs. den € DNA-sekvens, som koder for en RNA, der tjener til 25 bringe ribosomer umiddelbart op til ribosombindir centret i den metalloproteinaseinhibitor-RNA, hvc 36 . almindeligt kendte af fagfolk. Samling af sådai rer antages at være inden for de pligter og opt udføres af folk med almindelig fagkundskab og : ledes kunne udføres uden overdreven eksperimenl 5 eks. er lignende DNA-sekvenser blevet ligeret 1 de kloningsvektorer som angivet i Schoner et a! dings of the National Academy of Sciences U.S.i 81:5403-5407 (1984),- der specifikt betragtes s< reret i denne beskrivelse ved henvisning.

10

Ved konstruktionen af kloningsvektorerne ifølge sen bør det yderligere noteres, at flere kopie] overførbare DNA-sekvens og dens ledsagende opej elementer kan indsættes i hver vektor. I en så< 15 relsesform vil værtsorganismen producere størr< per vektor af den ønskede metalloproteinaseinh: tallet af kopier af DNA-sekvensen, som kan indi vektoren, begrænses kun af den resulterende vel til på grund af den størrelse at overføres til 20 . ceres og transskriberes i en passende værtsmik] me.

Desuden foretrækkes det, at kloningsvektoren ii en selekterbar markør, såsom en lægemiddelrest 25 markør eller en anden markør, som forårsager uc 37

En sådan lægemiddelresistens eller anden selektei kør er delvis beregnet til at lette selektionen ε formanter. Desuden kan tilstedeværelsen af en såc lekterbar markør på kloningsvektoren være til nyt 5 at holde forurenende mikroorganismer fra at forme dyrkningsmediet. I denne udførelsesform ville dei opnået en sådan ren kultur af den transformerede kroorganisme ved dyrkning af mikroorganismerne ur tingelser, som kræver den inducerede phenotype fc 10 levelse.

Det bemærkes, at det i en foretrukken udførelsesi er ønskeligt at rekonstruere 3'-enden af kodeområ at muliggøre samling med ikke-translaterede 3'-se 15 Inkluderet blandt disse ikke-tranlaterede sekvens dem, der stabiliserer mRNA'en eller forhøjer dens skription, og dem, der tilvejebringer stærke trar tionsafslutningssignaler, som kan stabilisere vek således som de er identificeret af Gentz, R., Lar 20 A., Chang. A.C.Y., Cohen, S.H., og Bujard, H. i E Natl. Acad. Sci. USA 7_8:4936-4940 (1981), der spe betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ve visning.

25 Opfindelsen angår også en rekombinant-DNA-fremgan til fremstilling af metalloproteinaseinhibitorer. i nlf 1 nr)p*rpr Hpnnp f ; I 38 I ducere et protein med metalloproteinaseinhibit B aktivitet; I ‘ (b) kloning af den overførbare DNA-sekvens i e B 5 som er i stand til at overføres til og replice B værtsmikroorganismé, idet vektoren indeholder B nelle elementer for den overførbare DNA-sekven B (c) overførsel af vektoren indeholdende den ov 10 DNA-sekvens og operationelle elementer til en B organisme, som er i stand til at udtrykke meta naseinhibitor-proteinet; (d) dyrkning af værtsmikroorganismen under bet B 15 som er passende for forstærkning af vektoren o kelse af inhibitoren; hvorpå B £e) i valgfri rækkefølge: B 20 (i) inhibitoren indhøstes; og B (ii) inhibitoren bringes til at antage en ak B tiær struktur, hvorved den har metallop B inhibitor-aktivitet.

B 25 Ved denne fremgangsmåde er de overførbare DNA- 39 10 20 30 40 50 CTTGTTGCTG TGGCTGATAG CCCCACCAGG GCCTGCACCT GTGTCCCACC CCA< 70 80 90 100 110 ACGGCCTTCT GCAATTCCGA CCTCGTCATC AGGGCCAAGT TCGTGGGGAC ACCi 130 140 150 160 170

AACCAGACCA CCTTATACCA GCGTTATGAG ATCAAGATGA CCAAGATGTA TAAJ

190 200 210 220 230 CAAGCCTTAG GGGATGCCGC TGACATCCGG ttcgtctaca cccccgccat gga< 250 260 270 280 290

TGCGGATACT TCCACAGGTC CCACAACCGC AGCGAGGAGT TTCTCATTGC TGGJ

310 320 330 340 350 CAGGATGGAC TCTTGCACAT CACTACCTGC AGTTTCGT.GG CTCCCTGGAA CAC< ♦ 370 380 390 400 410 TTAGCTCAGC GCCGGGGCTT CACCAAGACC TACACTGTTG GCTGTGAGGA ATG( 430 440 450 460 470 TTTCCCTGTT TATCCATCCC CTGC\AACTG CAGAGTGGCA CTCATTGCTT GTG( 490 500 510 520 530 CAGCTCCTCC AAGGCTCTGA AAAGGGCTTC CAGTCCCGTC ACCTTGCCTG CCT< 550 560 570 580 590 GAGCCAGGGC TGTGCACCTG GCAGTCCCTG CGGTCCCAGA TAGCCTGAAT CCT( 610 620 630 640 650 GTGGAAGCTG AAGCCTGCAC AGTGTCCACC CTGTTCCCAC TCCCATCTTT CTT( 670 680 690 700

ATGAAATAAA GAGTTACCAC CCAGCAAAAA AAAAAAGGAA TTC

De vektorer, som forudsættes at være anvendelige foreliggende fremgangsmåde, er dem, der er beskre I 40 I Den således opnåede vektor overføres derpå til I sende værtsmikroorganisme. Det antages, at enh I organisme med evne til at optage exogen DNA og I 'de gener og ledsagende operationelle elementer I 5 ges. Det foretrækkes, at værtsmikroorganismen I rob, fakultativt anaerob eller aerob mikroorga I lige værter, som kan være at foretrække til an H ved denne fremgangsmåde, inkluderer gærarter c I er. Specifikke gærarter inkluderer sådanne af H 10 Saccharomyces, og især Saccharomyces cerevisia

Specifikke bakterier inkluderer dem af slægter H ,,og Escherichia og Pseudomonas. Forskellige and

H trukne værter er angivet i tabel I ovenfor. I

.15 ternativt foretrukne udførelsesformer af opfin ges Bacillus subtilis, Escherichia coli eller aeruginosa som værtsmikroorganismerne.

Efter at en værtsorganisme er blevet valgt, ov 20 vektoren til værtsorganismen under anvendelse som er almindeligt kendte af fagfolk. Eksempie ne metoder kan findes i Advanced Bacterial Gen

R.W. Davis et al., Cold Spring Harbor Press, C

I Harbor, New York, (1980), der specifikt betrag 25; korporeret i denne beskrivelse ved henvisning.

41 saltkoncentrationerne under transformationen til passende styring af syntesegenerne.

Hvis det forudsættes, at de rekombinante metallop 5 seinhibitorer i sidste ende vil blive udtrykt i c retrækkes det, at kloningsvektoren først overføre Escherichia coli, hvor vektoren vil få lov til at ceres, og hvorfra vektoren vil blive opnået og re ter forstærkning. Vektoren vil derpå blive overfe 10 gæren til endelig udtrykkelse af metalloprotinase toren.

Værtsmikroorganismerne dyrkes under betingelser, passende for udtrykkeisen af metalloproteinaseinh 15 ren. Disse betingelser er almindeligvis specifikk værtsorganismen og bestemmes let af en fagmand i den publicerede litteratur med hensyn til vækstbe serne for sådanne organismer, f. eks. Bergey's Ma Determinative Bacteriology, 8th Ed., Williams & Vi 20 Company, Baltimore, Maryland, der specifikt betra inkorporeret i denne beskrivelse ved henvisning.

Alle betingelser, som er nødvendige for regulerin udtrykkeisen af DNA-sekvensen, afhængigt af event 25 operationelle elementer, der er indsat i eller ti vektoren, vil være i kraft i transformations- og

Mk «S Al »I. 4» A aJ · Jh Mk A T Al A 1 k #kl A A I Ak Ak Λ ΐ Ak vk*kl aJ w v w 1A Ak Ak Ak A I I Ak w· I 42 H førbare DNA-sekvens. Det forudsættes således, tionen· af metalloproteinaseinhibitoren vil ske I rum efter væksten af værtscellerne til nær ved H densitet, og at dem resulterende metalloprotei I 5 tor vil blive indhøstet nogen tid efter at de I betingelser, som er nødvendige for dens udtryk induceret.

I I en foretrukken udførelsesform af opfindelsen I 10 rekombinante metalloproteinaseinhibitor efter H gen og før antagelsen af dens aktive struktur.

H førelsesform foretrækkes, fordi opfinderne ant I udvindingen af et højt udbytte af genfoldet pr tes, hvis proteinet først renses. Imidlertid k 15 loproteinaseinhibitoren i en foretrukken alter relsesform blive tilladt at genfoldes til anta dens aktive struktur før rensningen. I endnu e ken alternativ udførelsesform bringes metallop H seinhibitoren til at antage dens genfoldede ak I 20 stand ;efter udvinding fra dyrkningsmediet.

Under visse omstændigheder vil raetalloproteina; ren antage dens' rette aktive struktur efter ud' H . værtsmikroorganismen og transport af proteinet H - 25 cellevæggen eller -membranen eller ind i det p< 43 rige signalpeptider er blevet publiceret, f. eks rion E.E. Watson i Nuc. Acid Res. 1^2:515-5164, 1! specifikt betragtes som inkorporeret i denne besl ved henvisning. Det er hensigten, at disse leder: 5 sammen med overførbar DNA vil dirigere intracelli duktion af et fusionsprotein, som vil blive tran: igennem cellemembranen og vil få ledersekvensporl fraspaltet efter frigivelse fra cellen.

10 I en foretrukken udførelsesform anvendes signalp< for E.coli OmpA-proteinet som ledersekvens og an] en position ud i ét med den overførbare DNA-sekv< koder for metalloproteinaseinhibitor-strukturen.

15 Yderligere foretrukne ledersekvenser inkluderer < lactamase og carboxypeptidase G2 og det humane s: tein. Disse og andre ledersekvenser er beskrevet

Hvis metalloproteinaseinhibitoren ikke antager d< 20 aktive struktur, skal eventuelt dannede disulfidl og/eller eventuelt skete ikke-kovalente samvirkn: først nedbrydes af denaturerende og reducerende i f. eks. quanidiniumchlorid og β-mercaptoethanol, talloproteinaseinhibitoren får lov til at antage 25 tive struktur efter fortynding og oxidation af d: ler under kontrollerede betingelser.

I 44 I reret i denne beskrivelse ved.henvisning, til < i forbindelse med opfindelsen.

Det skal forstås, at anvendelse af læren ifølge . 5 liggende på et specifikt problem eller miljø v: I den for en fagmands kunnen i lyset af de heri : H vejledninger. Eksempler på produkter fremstilli I opfindelsen og repræsentative fremgangsmåder t: I fremstilling og isolering fremgår af de følgenc 10 seseksempler.

I EKSEMPLER

I EKSEMPEL 1 .

I 15 I Præparation af poly(A*)-RNA ud fra HEF-SA-fibro HEF-SA celler blev dyrket til nær ved sammenfl}

I cm2 T-kolber. Cellerne blev vasket to gange i D

I 20 phosphat-pufrede saltopløsning og indhøstet' vec I - ning af 2 ml 10 mM "Tris", pH 7,5 indeholdende M vægtvol. % SDS (skaffet fra BDH chemicals, Ltd.

I England)., 5 mM EDTA og 20pg/ml protease K (skaf I Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, I . 25 Hver kolbe blev derefter vasket med yderligere 45 lageropløsning og derefter ekstraheret med et lig stort volumen af en blanding af phenol og chlorof volumenforholdet 1:1. Den vandige fase blev genek ret med et lige så stort volumenchloroform. Der s 5 volumener ethanol til den vandige fase, og blandi blev inkuberet natten over ved -20 °C. De udfælde nucleinsyrer blev udvundet ved centrifugering ved g i 10 minutter i en Beckman J2-21 centrifuge, Be Instruments, Palo Alto, California, U.S.A. og ble 10 løst i 25 ml 0,1 vægt/vol. % w/v SDS. Denne opløs: blev igen ekstraheret med et lige så stort volume roform. Den vandige fase sattes til 2 volumener k< ethanol, og blandingen blev holdt ved -20 eC i 2 Bundfaldet blev opsamlet ved centrifugering ved 1 15 i 15 minutter og genopløst i 10 ml 1 mM "Tris", 0 EDTA, 0,1 % SDS, pH 7,5. RNA blev udfældet fra de: løsning ved tilsætning af 10 ml 4 M LiCl, 20 mM N, acetat, pH 5,0 og inkuberet ved -20 °C i 18 timer faldet blev igen udvundet ved centrifugering og v< 20 gange med 2 M LiCl, før det blev genopløst i 1 mM 0,5 mM EDTA, 0,1 % SDS, pH 7,5. Denne opløsning b bevaret ved -70 °C.

Chromatografi på oligo-dT-cellulose.

Total cellulær RNA fremstillet som ovenfor blev e fal ri at- r\rt rrannnl /act· Ί fl ^ M Kbfl ^ ml PMH-nnl aen 25 I 46

I rilt vand. Den eluerede poly(A+)-fraktion af FW

I ethanolfældet og opløst til en koncentration pi I 1 mM "Tris”, 0,1 mM EDTA, pH 8,0. Denne opløsn: I opbevaret ved -70·°C.

I cDNA-syntese.

Poly(A+)-RNA blev sammensmeltet med en startkæc go-dT (skaffet fra PL Biochemicals, Milwaukee, H 10 USA) til at tjene som skabelon for cDNA-syntes< af AMV-revers-transskriptase (skaffet fra Life

Inc., St. Petersburg, Florida, USA). Efter syn1 onen blev RNA'en hydrolyseret ved tilsætning ai men 3 N NaOH-opløsning og inkuberet ved 67 °C : 15 ter. Opløsningen blev derpå neutraliseret, og < I blev renset ved gelfiltreringschromatografi på H 1.5" (skaffet fra BioRad Laboratories, Richmonc nia, USA) i en 0,7 x 25 cm kolonne i en 10 mM ' U 7,5), 5 mM EDTA og 1 % SDS opløsning; Fraktion« I 20 dende cDNA blev hældt sammen og koncentreret v« I fældning. cDNA’en blev forsynet med dG-hale og I gelfiltrering under anvendelse af den ovenfor c procedure. Anden-strengs-syntese blev startet r I dC, og polymerisationen foregik ved en indleder H 25 on med det store (Klenow) fragment, af DNA-polyr 47 methylase, skaffet fra New England Biolabs, Bever sachusetts, USA. cDNA'en blev igen renset og lige syntetiske EcoRI-lænkere. Endelig blev enderne tr med endonucleasen, og cDNA'en renset ved gelfiltr 5 Denne DNA blev ligeret ind i et unikt EcoRI-cente XgtlO-DNA pakket in vitro og anvendt til at infic E.coli stamme hflA ifølge den metode, som er angi Huynh, T.V., Young, R.A., og Davis, R.W., i DNA C Techniques, A Practical Approach (ed. Glover, D.M 10 Press Ocford), i trykken, der specifikt betragtes korporeret i denne beskrivelse ved henvisning. Om 25000 rekombinanter blev forstærket på denne måde

Sigtning.

15

Rekombinant-fag-holdige sekvenser af interesse bl lekteret ved deres fortrinsvise hybridisering til tiske oligonucleotider, som koder for portioner a ønskede metalloproteinaseinhibitors primære struk 20 det følgende betegnet som FIBAC. Disse portioner teinsekvensen svarer delvist til dem, der er angi den publicerede litteratur af Stricklin, G.P. og H.G., J. Biol. Chem. 258: 12252-12258 (1983), der fikt betragtes som inkorporeret i denne beskrivel 25 henvisning. Rekombinant fag blev anvendt til at i E.coli stamme hflA og udpladet i en densitet på o .. 1 λ3λγ„ /1 ΓΛ__--j -t.ii T-<_________ _ _____ 48

Science 196:180-182 (1979), der specifikt betr, inkorporeret i denne beskrivelse ved henvisnim

Under anvendelse af den procedure blev filtrem 5 sekventielt i 10-15 minutter hver i 0,5 M NaCl M "Tris”, 1,5 M NaCl pH 8,0 og endelig neddryp; SSPE (2x SSPE er 0,36 M NaCl, 20 mM NaH2P04, 2 7,4). Filtrene blev duppet tørre og bagt ved 7 3-4 timer. Der blev fremstillet duplikatfiltre 10 plade. Filtrene blev præhybridiseret i 1-3 tim< °C i 5 x SSPE indeholdende 0,lx SET, 0,15 % Na Denhardts opløsning. Filtrene blev derpå hybrid 72 timer ved 37 °C i denne samme opløsning ind' x 105 tællinger/min pr. ml 5'-endemærket 51-mei 15 nucleotid med en specifik aktivitet på omkring linger/min pr. pmol). Efter hybridiseringen bl· vasket 6 gange i 5 x SSPE indeholdende 0,lx SE1 natriumpyrophosphat ved 37 °C, og derpå 3 gang» ved 21 °C. Disse blev derpå duppet tørre og au 20 feret på "Kodak"® XAR-5" film ved -70 °C med er lightening-plus" intensiveringsskærm. Signaler klart synlige fra dupl’ikatfiltre, blev anvendt samle fager til plakrensning. Filterpræparerim bridiseringsprocedurer for plakrensningstrinnei 25 samme som ovenfor. Vaskningsproceduren blev sii 49

Præferentielt hybridisering af 17-meren til hvert laterne (i modsætning til kontrolplakkerne) blev get under en tilstand, som var identisk med den, anvendt til plakrensning. Sonde C blev anvendt ve 5 lignende prøvning, undtagen at SSPE-koncentratior hybridiseringen blev reduceret til 4x. Igen udvis af isolaterne stærkere hybridisering til sonden e trolplakkerne.

10 Faqrensning og cDNA-karakteriserinq Mængder af hver af 6 isolerede fager blev fremsti lagerpladeteknikken og renset ved seriel CsCl-blokgradient-centrifugering. DNA blev ekstraheret 15 disse ved dialyse overfor 50 % formamid som beski Davis, R.W., Botstein, D., Roth, J.R., i A Manual netic Engineering: Advanced Bacterial Genetics, 1 Cold Spring Barbor Laboratory, Der specifikt beti som inkorporeret i denne beskrivelse ved henvisni 20 fra hvert af isolaterne blev nedbrudt med EcoRI, dukterne blev analyseret ved agarosegel-elektroph Indsætningen fra en af de større kloner, λ-FIBAC-tes at mangle indre centre for Sall, Hindlll, Barr EcoRI. cDNA-indsætningen blev frigjort fra λ-ΠΒί 25 og λ-armene nedbrudt ved samtidig nedbrydning med enzymer. Fragmenterne blev derpå ethanolfældet og I 50 H RI-nedbrydningsprodukterne. Der blev valgt et, en indsætning, der vandrede sammen med indsætn I X-FIBAC-5 ved agarosegel-elektrophorese. Dette I blevet navngivet pUC9-F5/237P10.

I kortlægning og subkloning

Indsætningen i pUC9-F5/237P10 blev kortlagt me til indre Pstl-centre. Dobbelte nedbrydninger : 10 og Pst viste 3 indre Pstl-genkendelsescentre.

I sætningen og komponentstykkerne blev subklonet I teriofag henholdsvis mpl9 og mpl8. Sekvensbest I stykkerne blev gennemført ved dideoxynucleotid I skrevet af Sanger et al., i Sanger, F., Nickle I 15 Coulson, A.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5 I (1977), der specifikt betragtes som inkorporer' I beskrivelse ved henvisning.

I Sekvensen af DNA-indsætningen fra pUC9'F5/237P

I 20 åben af læsning s ramme, som koder for den primær« . af en moden fibroblastcollagenaseinhibitor, soi gisk ækvivalent med den, der kan isoleres fra 1 I fibroblastre. Hovedtrækkene i sekvensen er: I 25 (1) Indsætningen er flankeret af EcoRI- 51 (3) Hvis den første G i sekvensen GTTGTTG ui bart op til 3'-enden af poly-C-området betragtes nucleotid 1, så præsenteres en åben aflæsningsrai 5 koder for den primære struktur af den modne humaj fibroblast-collagenaseinhibitor begyndende ved ni 34 og fortsættende til nucleotid 585; (4) Afslutningcodonen TGA ved nucleotiderne 10 definerer carboxyterminus af translationsproduktt er den samme som i det modne protein; (5) Nucleotiderne 1-33 definerer en aminosy. kvens, som ikke findes i den primære struktur af 15 arbejdede protein, men som sandsynligvis er en p< et lederpeptid karakteristisk for secernerede pr< (6) De tre indre Pstl-centre har som deres : base nucleotiderne 298, 327 og 448; 20 (7) Der er en enkelt genkendelsessekvens fo: striktionsenzymet Tthllll begyndende ved nucleot: (8) Der er en enkelt genkendelsessekvens fo: 25 restriktionsendonucleasen Ncol begyndende ved nu( 227.

52

Nr. Centre Fragmenter Fragme ACC 1 (GTVWAC) 1 214 495 (69.8) 214 214 (30.2) 1 ALU 1,(AGCT) 4 358 358 (50.5) 1 363 124 (17.5) 482 482 119 (16.8) 363 606 103 (14.5) 606 5 ( 0.7) 358 AVA 1 (CQCGPG) 1 536 536 (75.6) 1 173 (24.4) 536 AVA 2 (GGRCC) 3 257 257 (36.2) 1 477 220 (31.0) 257 572 137 (19.3) 572 95 (13.4) 477 BBV 1 (GCTGC) I- 269 440 (62,1) 269 26-9 (37.9) 1 53

Nr. Centre Fragmenter Fragmen BST NI (CCRGG) 3 344 344 (48.5) 1 544 200 (28.2) 344 557 152 (21.4) 557 13 ( 1.8) 544 DDE 1 (CTNAG) 4 185 344 (48.5) 365 355 186 (26.2) 1 360 169 (23.8) 186 365 5 ( 0.7) 360 5 ( 0.7) 355 ECO RI (GAATTC) 1 698 698 (98.4) 1 11 ( 1.6) 698 FNU4H 1 (GCNGC) 2 196 440 (62.1) 269 269 196 (27.6) 1 73 (10.3) 196 FOK 1 (GGATG) 4 192 274 (38.6) 435 204 192 (27.1) 1 303 132 (18.6) 303 435 99 (14.0) 204 12 ( 1.7) 192 HAE 2 (PGCGCQ) 1 368 368 (51.9) 1 341 (48.1) 368 I 54

Nr. Centre Fragmenter Fragrc Η HAE 3 (GGCC) . 3 30 616 (86.9) 93 I 63 30 ( 4.7) 30 I 93 30 ( 4.2) S3 I 30 ( 4.2) 1 I HGI Al (GRGCRC) 1 I 552 552 (77.9) 1 I 157 (22.1) 552 I HHA 1 (GCGC) 1 I 369 369 (52.0) 1 I 340 ¢48.0) 369 I HINC 2 (GTQPAC) 1 118 591 (83.4) 118 I 118 (16.6) 1 HINF 1 (GANTC) 2 308 308 (43.4) 1 587 279 (39.4) 308 I 122 ¢17.2) 587 I HPA 2 (CCGG) 4 I 207 224 (31.6) 372 I 372 207 (29.2) 1 I 596 165 (23.3) . 207 I 654 58 ( 8.2) 596 I 55 ( 7.8) 654 I HPH 1 (GGTGA) 2 55

Nr. Centre Fragmenter Fragment mnl l (CCTC} 5 81 193 (27.2) 81 274 174 (24-5) 535 406 132 (18.6Ϊ 274 486 81 (11.4) 1 535 80 (11.3) 406 49 (6.9) 486 MST 2 (CCTNAGG) 1 185 524 (73.9) 185 185 (26.1) 1 NCI 1 (CCSGG1 2 372 372 (52.5) 1 595 223 (31.5) 372 114 (16.1) 595 NCO 1 (CCATGG) 1 227 482 (68.0) 227 227 (32.0) 1 MSP B2 (CVGCWG) 1 197 512 (72.2) 197 197 (27.8) 1 PST 1 (CTGCAG) 3 298 298 (42.0) 1 327 261 (36.8) 448 448 121 (17.1) 327 29 ( 4.1) 298 SAU 1 (CCTNAGG) 1 185 524 (73.9) 185 185 (26.1) 1 I 56

Nr, Centre Fragmenter Fragim Η 150 (21.2) 1 I SAU96 1 (GGNCC) 5 I 29 220 (31.0) 257 I 92 165 (23.3) 92 I 257 137 (19.3) 572 477 95 (13.4) 477 I 572 63 ( 8.9) 29 I 29 ( 4.1) 1 I SCR TI (CCNGG) 5 344 344 (48.5) 1 372 172 (24.3) 372 544 114 (16.1) 595 I 557 38 ( 5.4) 557 I 59S 28 ( 3.9) 344 I 13 ( 1.8) 544 SFA NI {GATGC] 1 I 193 516 (72.8) 193 I 193 (27.2) 1 I TTHlll 11, (GACNNNGTC) 79 630 (88.9) 79 I 79 (11.1) 1 I De følgende forekommer ikke: I AAT 2 AFL 2 AFL 3 AHA 3 I APA 1 ASU 2 AVA 3 ‘ AVR 2 I BAL 1 BAM Hl BCL 1 BGL .

I BGL 2 BIN 1 BSSH 1 BST El 57 SNA 1 SPH 1 STU X TAQ 1 XBA 1 XHO i XHO 2 JCMA 3 XMN 1

10 20 30 40 SO

GTTGTTGCTG TGGCTGATAG CCCCAGCAGG GCCTGCACCT GTGTCCCACC CCAC

SH

AA

UE

13 70 80 90 100 110

ACGCCCTTCT GCAATTCCGA CCTCGTCATC AGGGCCAAGT TCGTGGGGAC ACCA

Η T H SH

A T N AA

E H L UE

3 1 1 13 130 140 150 160 170

AACCAGACCA CCTTATACCA GCGTTATGAG ATCAACATGA CCAAGATGTA TAAA

S

A

U

A

190 200 210 220 230 CAAGCCTTAG GGGATGCCGC TGACATCCGG TTCGTCTACA CCCCCGCCAT GGAG.

SD FS FN F H A N

AD OF NS OP C C

UE KA UP K A C 0 11 11 12 12 1 1 250 260 270 280 290 TGCGGATACT TCCACAGGTC CCACAACCGC AGCGAGGAGT TTCTCATTCC TGCA,

A B M

V BN

A V L

I 58 310 320 330 340 350

H CAGGATGGAC TCTTGCACAT CACTACCTGC AGTTTCGTGG CTCCCTGGAA

Γ Η P B

0 1 S S

K N T T

370 380 390 400 410

TTAGCTCAGC GCCGGGGCTT CACCAAGACC TACACTGTTG GCTGTGAGGA

A D HH N Η M

LDAHCP M

UEEA I H L

1 1 21 1 1 1 H 430 440 450 460 470

TTTCCCTGTT TATCCATCCC CTGCAAACTG CAGAGTGGCA CTCATTGCTT

I o

I T

490 500 510 520 530

CAGCTCCTCC AAGGCTCTGA AAAGGGCTTC CAGTCCCGTC ACCTTGCCTG

H AM. H

I L N P

U L H

550 560 570 . 580 590

GAGCCAGGGC TGTGCACCTG GCAGTCCCTG CGGTCCCAGA TAGCCTGAAT

B Η B A H

I 5 G S V I

I T I T A M

I 11 1 2 1 59 610 620 630 640 650 GTGGAAGCTG AAGCCTGCAC AGTGTCCACC CTGTTCCCAC TCCCATCTTT CT*

A M

L B

U O

1 2 670 680 690 700

ATGAAATAAA GAGTTACCAC CCAGCAAAAA AAAAAAGGAA TTC

E

C

O

L

EKSEMPEL 2

Udtrykkelse af collaqanaseinhibitorer i E. coli 5 I dette eksempel angives en foretrukken fremgangs kobling af en foretrukken overførbar DNA-sekvens enden af den klonede cDNA. Dette involverer foret af en nucleolytisk spaltning ved et specificeret 10 kodesekvensen og rekonstruktion af den ønskede pc kodesekvensen ved hjælp af syntetiske oligonuclec en måde, som muliggør dens udskæring og rekombine (dvs. ved inkorporering af nyttige restriktionsc€ 15 Trimning af 5'-enden af kodeområdet vil blive ger ved syntetisering af begge strenge af DNA'en, son ker sig fra Tthllll-centret i S'-retningen og ene BamHI-overhaenq. Dette syntetiske oligonucleotid, I 60 (2) En metioninkodon, hvorfra translatione I er blevet tilvejebragt umiddelbart ovenfor den I rest, som begynder kodesekvensen af human forar I 5 BAC; I (3) Afstanden mellem BamHI-centret og meth I nen er sådan, at når det klones ind i pUC8, vil I det af FIBAC være i ramme med 5’-enden af β-gal I 10 dase-genet;

I (4) . Der præsenteres også en stopcodon og S

I Dalgarno-sekvens i ramme. Translation af denne I 15 den aminoterminale portion af β-galactosidasen I af TAA-codonen, og translation af FIBAC bør sta I den følgende ATG-codon; I (5) Codoner er blevet udvalgt til at skabe I 20 center begyndende med G i FIBAC-startcodonen;. o I (6) Der er et Pvul-center adskilt af en ba I BamHI-sekvensens 3'-ende.

I 25 .Strukturen af FIBAC A er 61

GA TCC GCG ATC GGA GTG TAA GAA ATG TGC ACT G CGC TAG CCT CAC ATT CTT TAC ACG TGA

TGC GTT CCG CCG CAT CCG CAG ACT GCT TTC

ACG CAA GGC GGC GTA GGC GTC TGA CGA AAG

TGC AAC TCT GAC C

ACG TTG AGA CTG GA

FIBAC A syntetiseres under anvendelse af "the ABI synthesizer" (Foster City, California, U.S.A) som ke på 4 oligonucleotidkomponenter.

5

Oligonucleotidkomponent FA1 er:

GACTCC GCGAT CGGAG TGTAA GAAAT GTGCA CTTGC

10 Oligonucleotidkomponent FA2 er:

GGAACG CAAGT GCACA TTTCT TACAC TCCGA TCGCG

Oligonucleotidkomponent FA3 er: 15 GTTC CGCCG CATCC GCAGA CTGCT TTCTG CAACT CTGAC C Oligonucleotidkomponent FA4 er:

20 AGGTC AGAGT TGCAG AAAGC AGTCT GCGGA TGCGG C

I 62 Η · Der fremstilles en syntetisk linker til at kob af Tthllll-til EcoRI-fragmentet med et Sall-cei oligonucleotider vil blive udformet til at gen: centret og ødelægge EcoRI-centret. Linkeren er 5 af oligonucleotiderne linker Al og linker'A2.

Linker Al er: AATTGGCAG

Linker A2 er: TCGACTGCC

I 10

Disse oligonucleotider og oligonucleotiderne F; I nasebehandles separat og sammensmeltes i lige s re forhold med TthlllI-til-EcoRI-3'-enden af c!

I , BamHI/Sall-skåret mpl9RF-DNA. Den ligerede DNA

I 15 til at transficere JM105,- Plakker opsamles efte farve i nærvær af IPTG og X-gal og efter hybrie til oligonucleotid FA2. Flere positive plakker I kvensbestemmes. De der indeholder den udformede subklones i BamHI/Sall-nedbrudt pUC8. Translat: I 20 BAC-genet i denne konstruktion kobles til trani som startes for β-galactosidase. Denne udtrykke betegnes som pUCB-Fic.· I Kobling af translation af FIBAC med translatior I 25 for andre højt udtrykte proteiner arrangeres pc 63

Sekvensen af meningstrengen er: 10 20 30 40 50

GAATTCGATA TCTCGTTGGA GATATTCATG ACGTATTTTG GATGATAACG AGG B T E F Μ H

C A C O N H

0 Q O K L A

115 111 70 80 90 100 110

AATGAAAAAG ACAGCTATCG CGATCGCAGT GGCACTGGCT GGTTTCGCTA A NF PS

L RN VA

u uu uu

1 12 1A

120 130

GCGCA GGCCTCTGGT AAAAGCTT H S Η M HA

Η T A N IL

A 0 E L NU

1131 31 5

Denne sekvens betegnes herefter som OmpA-leder. ] af translationen af FIBAC med OmpA gennemføres v< ring af pUC8-Fic med Pvul og Sall og isolering a: rådet. Dette vil sammen med EcoRI-til-Pvul-fragm< 10 isoleret fra OmpA-lederen blive klonet ind i Ecoi skåret pUC8. Som i det forudgående eksempel drivi skriptionen af lac-promotoren og reguleres af la< genproduktet ved lac-operatoren. Denne FIBAC-udtJ

I 64 H blive transporteret og forarbejdet til dannels modne form.

For. at frembringe en sådan transport skabes et 5 som koder for signalpeptidet af E.coli OmpA-p i et med FIBAC-strukturområdet. Dette bestemte gør det nødvendigt at have stopcodoner i ramme 5'enden af det.ændrede FIBAC-kodeororåde. For a H te isoleres den portion af 5'-kodeområdet fra ] I 10 der strækker sig fra HgiAI-centret til NcOI-cei

Ovenfor liggende sekvenser resyntetiseres som < der har kohæsive ender fra BamHI og HgiAI og ii et indre Stul-center. Denne syntetiseres som t< I nucleotider, linker Bl og linker B2.

I 15

Linker Bl er: GATCCCAGGCCTGCA

I Linker B2 er: GGCCTGG

20 Linkerne Bl og B2 kinasebehandles separat og s< I tes i lige store molære forhold.med det ovenfoj I HgiAI- til -Ncol-fragment og BamHI/NcoI-skåret I Den resulterende konstruktion har FIBAC's kodef I ramme med translationen af β-galactosidases am: 25 nus. Translation af denne sekvens danner et fu« , 65 flere kolonier blive karakteriseret ved hybridise der har inkorporeret OmpA-lederfragmentet, karakt yderligere for at bekræfte strukturen. Dette plas pUC8-F-0mpAl vil dirigere syntesen af et fusionsp 5 begyndende i signalpeptidet for E. coli OmpA-prot endende i human FIBAC. Signalerne, som er til ste proteinets OmpA-portion, frembringer proteinets e fra cytoplasmaet og passende spaltning fra den pr struktur af FIBAC.

10

Hvis udtrykkelseseffektiviteten skulle blive ødel sekvensen af lederpeptidet eller dets kombination BAC enten i protein- eller i nucleinsyreniveauet, genet ændres til at kode for enhver af flere kend 15 coli ledersekvenser.

Transskription af alle de omtalte gener frembring lac-promotoren. Som i tilfælde af startcentre for lation kan genets promotor- og operatorområde omb 20 FIBAC kan også udtrykkes fra vektorer, som har in ret X-PL-promotoren og -operatoren (0L) og den hyl promotor-operator, Tac, som beskrevet i Amann, E. sius, J., og Ptashne, M. Gene Z5:167-178 (1983), cifikt betragtes som inkorporeret i denne beskriv 25 henvisning. Udskæring af de portioner af genet, s kluderer ribosombindingscenter-strukturområdet og ^ ν-Λ/ia *3 * — ολ ear ηη Ί nrleaaf η ι λλ ί a 1 I '66 I 1 nedbrudt plasmid pDP8 frembringer transskripti I gener direkte ved hjælp af X-PL-promotoren. Tr; I onsreguleringen vil være temperaturfølsom på g I cI857-mutation, som indeholdes .på dette samme I 5 I Indførelse af lignende genfragmenter i transsk I heden af Tac-promotoren vil blive gennemført v I isolere EcoRV- til Sall-fragmentet. Dette vil I den syntetiske Tac-promotorsekvens, som flanke 10 HI- og PvuII-centre, og som indeholder lac-ope

I ville indsat i BamHI- til -Sall-centrene' i pBR

I fortrinsvis derivater deraf. Derivaterne henfø I tilfælde til konstruktioner indeholdende enten I eller Iq-genet.

I 15

Udtrykkelse af FIBAC i andre værtsmikroorganisi

Escherichia overvejes. Gær og bakterier af slæi cillus, Pseudomonas og Clostridium kan hver ti . stemte fordele. De ovenfor skitserede fremgang; 20 let kunne tilpasses til andre.

I almindelighed vil udtrykkelsesvektorer for ei kroorganisme indeholde træk, som er analoge me< I vi har inkorporeret i de ovennævnte vektorer f< 25 I nogle tilfælde vil det være muligt simpelt hf 67 EKSEMPEL 3

Den humane collagenaseinhibitor kan let renses e trykkelse i en række forskellige mikroorganismer 5 tilfælde vil spektret af forurenende proteiner v. skelligt. Således vil passende rensningstrin bli blandt en række forskellige trin, som allerede e for at give en god adskillelse af den humane col seinhibitor fra andre proteiner, og blandt andre 10 rer, som sandsynligvis vil fungere.

Hvis inhibitoren ikke secerneres fra mikroorgani kan den danne indeslutningslegemer inden i de re te mikroorganismer. Disse legemer adskilles fra 15 proteiner ved differentiel centrifugering efter af cellerne med en fransk presse. De uopløselige slutningslegemer solubiliseres i 6 M guanidinhyd eller 8 M urinstof, og inhibitorproteinet solubi mere fuldstændigt ved omsætning af dets cysteinr 20 natriumsulfit. Ved ethvert tidspunkt efter dette dannes cysteinresterne tilbage til deres reducer med dithiothreitol. Når først inhibitorproteinet biliseret fra indeslutningslegemerne, anvendes i; finitetskromatografi under anvendelse af antisto 25 net mod den ufoldede inhibitor til rensning før ning.

I 68 H række forskellige metoder. De indledende trin H ultrafiltrering igennem en 50 kgdalton afskær! H eller ammoniumsulfatfraktionering. Andre nytti I inkluderer, men er ikke begrænset til, ionbytt I 5 grafi, gelfiltrering, heparin-"Sepharose"®-kron I revers-fase-kromatografi eller zink-chelat-kroi I Alle disse trin har været anvendt med held i r< reskrifter. Yderligere højopløsningstrin inklu« I drofob-interaktions-chromatografi eller immuno.

I 10 tetschromatografi. Efter rensning er metallopr< hibitoren fortrinsvis mindst 90-95 % ren.

I EKSEMPEL 4 I 15 Rensning af human collaqenaseinhibitor fra humi I væske.

I Human amnionvæske opnået fra kasserede amniosei ver blev hældt sammen, og 6 1 blev underkastet I 20 filtrering igennem et 100 kD molekylvægtafskær: I skaffet fra Millipore Corporation, i et Millip< I con Cassette System. Eluatet blev koncentreret 10 kD afskæringsfilter, skaffet fra Millipore < I tion, og derpå igennem en "Amicon PM-10"-membr£ 25 ter {10 ml) af koncentreret amnionvæske blev e! 69 for pH 7,5, 0,025 M "Hepes"-puffer indeholdende calciumchlorid og 0,02 % natriumazid, og sat på 28 cm heparin-"Sepharose®CL-6B" (skaffet fra Pha Inc.) kolonne ækvilibreret med den samme puffer. 5 kolonne blev skyllet med 1 1 af den ovenstående ; elueret med en lineær gradient på0-0,3 M natrium Fraktionerne fra den største top af inhibitorakt som elueredes ved omkring 0,1-0,15 M natriumchlo hældt sammen, koncentreret til 1 ml og sat på en 10 ropak rp-8" reversfase-HPLC-kolonne ækvilibreret 0,5 % trifluoreddikesyre (Aldrich Chemical Compa: lonnen blev elueret med en lineær gradient på 0-tonitril (J.T. Baker Chemical Company) ved 1/2 % nut. Alle fraktioner blev øjeblikkeligt tørret i 15 vant speed-vac concentrator" for at fjerne aceto genopløst i pH 7,5, 0,1 M "Hepes" før prøvning, ren elueredes ved mellem 32 og 38 % acetonitril. ner indeholdende inhibitoren blev hældt sammen, aliquotor blev elueret over en "Bio-rad biosil-T, 20 HPLC-gelfiltreringskolonne. De sammenhældte topp< hibitoraktivitet indeholdt 0,1 mg inhibitor, som 95 % ren bedømt ved SDS-polyacrylamidgel-elektro EKSEMPEL 5 25

Rensning af human fibroblastcollaqenaseinhibitor I 70 H deholdende 0,02 % natriumazid og 0,01 M calcic H påsat en 2,8 x 48 cm kolonne.af heparin-MSepha (Pharmacia, Inc.) ækvilibreret med den samme p lonnen blev skyllet med 2 1 af denne puffer ος 5 elueret med en lineær gradient på 0-0,3 M natr indeholdt i.denne puffer. De opnåede fraktions vet for tilstedeværelsen af inhibitor ved ders at inhibere human-fibroblast-collagenase. Frak svarende til aktivitetstoppen var dem, der ble 10 nær ved 0,15 M natriumchlorid. Disse fraktions centreret til omkring 5 ml ved ultrafiltrering H "Amicon YM10M-filter, og koncentratet blev i f B te forløb påsat en 250 x 4,1 mm "Synchropak rp B fase-HPLC-kolonne, ækvilibreret med 1 % triflu B 15 re. Kolonnen blev elueret med en lineær gradie

60 % acetonitril i 0,1 % trifluoreddikesyre. G

B blev' kørt med en 1/2 % acetonitril per minut.

elueredes i to skarpe toppe mellem 26 og 29 % nitril..Alle fraktioner blev øjeblikkeligt tør 20 "Savant speed-vac concentrator",'genopløst i p M "Hepes" og prøvet. Der blev udvundet mindst.

lagenaseinhibitor, som var 90-95 % ren. Dette giver et enkelt band, når det køres på en 17,5 rende SDS-gel..Efter carboxymethylering af cys B 25 ne og eluering igennem den samme RPt8 kolonne 71

Det forudses, at den humane collagenaseinhibtor 1 genfoldes til dens native struktur fra dens denat tilstand efter udtrykkelse af dens gen i en mikrc me og adskillelse af collagenaseinhibitoren fra d 5 af e andre proteiner produceret af mikroorganisme analogi til de betingelser, som er nødvendige for foldning af andre disulfidholdige proteiner, som af Freedman, R.B. og Hillson, D.A., "Formation of fide Bonds," i The Enzymology of Post-Translation 10 fication of Proteins, Vol 1, R. B* Freedman and H. kins, eds., side 158-207 (1980), der specifikt be som inkorporeret i denne beskrivelse ved henvisni skulle genfoldning af den humane collagenaseinhib i opløsninger med en pH-værdi på 8,0 eller større 15 denne pH-værdi er cysteinresterne i proteinet del niserede, og denne betingelse er nødvendig for op af native disulfidbindingsparringer. Inhibitorkon tionen bør relativt lav, mindre end 0,1 mg/ml, fc nimere dannelsen af intermolekylære disulfidbundn 20 gater, som vil skade genfoldningsprocessen.

Eftersom stabiliteten af den genfoldede (native) fidbundne struktur i forhold til den ufoldede (re de) struktur afhænger af både opløsningens oxidat 25 reduktions-potentiale og koncentrationerne af and dox-aktive molekyler, forudses det, at redoxpoten hcir v»rp ruifrpt γπργ! ρπ rpdnxnnffer. ripr oivpr pt I . 72 H protein, hvilket reducerer udbyttet af den gen (native) struktur. De relative stabiliteter af dede protein og den native struktur, og sålede den og udbyttet af genfoldning, vil også afhæn 5 opløsningsvariable, såsom pH-værdien, temperat af hydrogenpuffer, ionstyrken og nærværet elle af bestemte anioner eller kationer som omtalt

P.L., "Stability of Proteins, Small Globular P

Advances in Protein Chemistry, Vol. 33, side 1 10 (1979), der specifikt betragtes'som inkorporer H beskrivelse ved henvisning. Disse betingelser for hvert protein og kan bestemmes eksperiment forudses, at tilsætning af ethvert molekyle,· s foretrækker at binde den native,(i modsætning 15 ufoldede) struktur, og som bagefter let kan ad det native (genfoldede) protein, vil forøge ik byttet, men hastigheden af genfoldning. Disse inkluderer monoklonale antistoffer dannet mod I struktur, og andre proteiner, som tæt binder d 20 collagenaseinhibitor, såsom, pattedyrenzymerne eller gelatinase.

73 EKSEMPEL Ί

Den anden foretrukne sekvens, angivet i denne be; se, dvs.: 10 20 30 40 50

GGCCATCGCC GCAGATCCAG CGCCCAGAGA GACACCAGAG AACCCACCAT CGC

H F XB HH N S

A N HI AH C A

E V OH EA O U

3 1 21 21 11 70 80 90 100 110

GACCCCTGGC TTCTGCATCC TGTTGTTGCT GTGGCTCATA GCCCCAGCAG GCC

B 5F S H

S FO A A

T AK 0 ε - 1 11 13 5 I : 74 Η 130 140 150 160 170

H TCTGTCCCAC CCCACCCACA GACGGCCTTC TGCAATTCCG ACCTCGTCAT CAG

Η T M S

A T N A

E H L U

190 200 210 220 230

TTCGTGGGGA CACCAGAAGT CAACCAGACC ACCTTATACC AGCGTTATGA GAT

250 260 270 280 290

ACCAAGATGT ATAAAGGGTT CCAAGCCTTA GGGGATGCCG CTGACATCCG GTT

H SD FS FN F H

I AD OF NS Ο P -

UE KA UP K A

I 11 11 12 12 I 310 320 330 340 350

I ACCCCCGCCA TGGAGAGTGT CTGCGGATAC TTCCACAGGT CCCACAACCG CAG

ti A h C V Θ

O A V

I 370 380 . 390 400 410 H TTTCTCATTG CTGGAAAACT GCAGGATGGA CTCTTGCACA TCACTACCTG CAG* P F H p

I SOI S

. T K N T

I 1.1 1 430 . .

M GCTCCCTGGA AC

75 har de følgende restriktionscentre:

Nr. Centre Fragmenter Fragments ACC 1 (gtvwac) 295 295 (68.3) 1 137 (31.7) 295 AVA 2 (GGRCC) 338 338 (78.2) 1 94 (21.8) 338 B8V 1 (GCTGC) 350 350 (81.0) 1 82 (19.0) 350 BIN 1 (GGATC) 14 418 (96.8) 14 14 ( 3.2) 1 BST NI (CCRGG) 2 65 360 (83.3) 65 425 65 (15.0) 1 7 ( 1.6) 425 DDE 1 (CTNAG) I 76 I Nr. Centre Fragmenter Fragmen I 267 267 (61.8) 1 I 165 (38.2) 267 I FNU4H 1 (GCNGC) I 8 269 (62.3) 8 I 277 82 (19.0) 350 I 350 73 (16.9) 277 I 8( 1.9) 1 POK 1 (GGATG) I 76 197 (45.6) 76 I 273 99 (22.9) 285 I 285 76 ¢17.6) 1 , I 384 48 (11.1) 384 I 12 ¢2.8) 273 HAE 2 (PGCGCQ) I 19 413 (95.6) 19 I 19 ( 4.4} 1 HAE' 3 (GGCC) I 1 258 (59.7) 174 I 51 60 (13.9) 51 1,. in 50 (11.6) 1 I 144 33 ( 7.6) 111 I 174 30 ( 6.9) 144 * I 1 ( 0.2) 1 77

Nr * Centre Fragmenter Fragmente HINC 2 (GTQPAC) 199 233 (53.9) 199 199 (46.1) 1 HINF 1 (GANTC) 3Θ9 389 (90.0) 1 43 (10.0) 389 HPA 2 (CCGG) 288 288 (66.7) 1 144 (33.3) 288 MNL 1 (CCTC) 2 162 193 (44.7) 162 355 162 (37.5) 1 77 (17.8) 355 MST 2 (CCTNAGG) 266 266 (61.6) 1 166 (38.4) 266 NCO 1 (CCATGG) 47 261 (60.4) 47 308 124 (28.7) 308 47 (10.9) 1 2 MSP R2 fCVGrWG) 78 H Nr. Centre Fragmenter Fragmei pst 1 i CTGCAG) H 379 379 (87.7) 1 I 408 29 ( 6.7) 379 I 24 ( 5.6) 408 I SAU 1 (CCTNAGG)

I 266 266 (61.6) X

166 (38.4) 266 SAU 3A (GATC) I 14 217 (50.2) 14 I 231 201 (46.5) 231 I ‘14 ( 3.2) 1 I SAU96 1 (GGNCC) I 51 165 (38.2) 173 ' ’ 110 94 (21.8) 338 I 173 63 (14.6) . 110 I 338 59 (13.7) 51 I 51 (11.8) 1 I SCR Fl (CCNGG) 65 360 (83.3) 65 425 65 (15.0) 1 I 7 ( 1.6) 425 79

Nr. Centre Fragmenter Fragmente sty i (CCRRCG) 2 47 26X (60.4) 47 308 30Θ 124 (28.7) 308 432 47 (10.9) 1 47 TTH111 1 (GACNNNGTC) 160 272 (63.0) 160 432 160 (37.0) 1 160 XHO 2 (PGATCQ) 13 419 (97.0) 13 432 13 { 3.0) 1 13

De følgende forekommer ikke: AAT 2 AFL 2 AFL 3 AHA 2 AHA 3 ALU 1 APA 1 ASU 2 AVA 1 AVA 3 AVR 2 BAL 1 BAM Hl BAH 1 BAH 2 BCL 1 BGL 1 BGL 2 BSM 1 BSP 1 nSSH 1 BST E2 CFR 1 CLA 1 ECO RI ECO R5 FHUD 2 GDI 2

HAE 1 HGA 1 HGI Al HG1 C

HGI Dl HGI J2 HIND 3 ΗΡΑ 1 HPH 1 KPN 1 MBO 2 MLU 1 MST 1 ΝΑΕ 1 HAR 1 NCI 1 NDE 1 KHE 1 NOT 1 NRU 1 NSP Cl PVU 1 PVU 2 RRU 1 RSA 1 SAC 1 SAC 2 SAL 1

SCA 1 SMA 1 SNA 1 SKA B

SPE 1 SPH 1 SSP 1 STU 1 TAQ 1 XBA 1 XHO 1 XHA 3 XMN 1 5 Hovedtrækkene ved denne cDNA er: I 80 H ningsramme fra nucleotid 1 til nucleotid 432, enden af denne delvise cDNA.

3. Den første methioninrest i denne aflæsnings 5 indkodet af nucleotiderne 49-51 og repræsenter delsesstedet for translation.

4. Aminosyresekvensen foreskrevet af nucleotid findes ikke i den primære struktur af det modn 10 men er sekvensen af lederpeptidet for humant p H 6. Sekvensen af nucleotiderne 82-432 er identi kvensen af nucleotiderne nummereret 1-351 i in fra den første foretrukne sekvens i eksempel 1 I 15 6. Aminosyresekvensen af. det modne protein udv I konsensus-sekvenser for sukkertilknytning.. Dis I ser -N-Q-T- foreskrevet af nucleotiderne 202-2 I S- foreskrevet af nucleotiderne 346-354, er am 1. 20 sterne henholdsvis 30-32 og 78-80 i det modne j I Begge steder er glycosyleret i det humane inhil I tein.

' EKSEMPEL 8 I 25 81

Den første af disse konstruktioner er et derivat plasmidet pUC8, som indeholder kodeområdet af det fibroblastcollagenaseinhibitor-("FIBAC")-gen arra på en sådan måde at den tillader dens transskript 5 blive dirigeret og reguleret af lac-promotoren ος operatoren. Denne konstruktion, pFibSl, blev fren med mindre betydende modifikation af den procedui er skitseret i eksempel 2 for samlingen af udtryk sesvektoren pUC8-Fic.

10

Trimning af kodeområdet 5’-ende blev frembragt ve ring af det stykke DNA, som strækker sig fra Hael centret ved nucleotid 93 til 3'-EcoRI-centret bec ved nucleotid 698. Rekonstruktion af 5'-enden ble 15 nemført som beskrevet, undtagen at oligonucleotic og FA4 hvert blev forlænget med 12 baser for at u rekonstruktionen til Haelll-genkendelsescentret. skabtes strukturen af FIBAC A';

GA TCC GCG AT C GGA GTG TAA G AA

G CGC TAG CCT CAC ATT CTT

ATG TGC ACT TGC GTT CCG CCG CAT

TAC ACG TGA ACG CAA GGC GGC GTA

CCG CAG ACT GCT TTC TGC AAC TCT

; GGC GTC TGA CGA AAG ACG TTG AGA

i

G AC CTG GT G ATC AGG G

CTG GAC CAC TAG TCC C

82

Disse oligonucleotider blev udformet til at gen li-centret og ødelægge deres EcoRI-center. Desu linkerne modificeret fra den oprindelige beskri at inkludere et indre KpnI-center. Den nye link 5 mensat af oligonucleotiderne "modificeret linke "modificeret linker A2".

Modificeret linker Al er: AATTGGTAC

Modificeret linker A2 er: TCGACTGGT

10

Ligering ind i M13 mpl9, kloning og selektion v væsentlige som beskrevet i de forudgående eksem deområdet af FIBAC blev fjernet fra en klon med formede sekvens ved nedbrydning med BamHI og Hi 15 subklonet ind i disse restriktionscentre i pUC8 sulterendé plasmid er pFibSl. I dette plasmid d transskriptionen af FIBAC-genet af lac-promotor lation af methionyl-FIBAC er koblet til 'transla tet for β-galacosidase.

20 B.‘ Udtrykkelsesvektor pFib55.

Skabelsen af HgiAi restriktionscentret ved 5’-e moden-FIBAC-kodesekvensen ville gøre hele FIBAC 25 kodesekvensen overførbar via en HgiAI/Sall-, Kp: 83 betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse v€ visning.

Enkeltstrenget DNA isoleret fra et derivat af bal· 5 mpl8 indeholdende met-FIBAC-genet translationelt til lacZ som beskrevet ovenfor blev sammensmeltet syntetiske oligonucleotid GGGCTTTGCACCTGGCAG. Det gonucleotid smelter sammen med FIBAC-kodeområdet HgiAI-centret med en enkelt fejlpasning* Den resi 10 DNA blev derpå inkuberet med Klenow-fragmentet ai DNA-polymerase, T4-DNA-ligase og en blanding af ε deoxynucleotidtriphosphater.

Den således opnåede kovalent-lukkede dobbeltstrer 15 fag-DNA blev anvendt til at transficere E.coli st JM107. Plakker blev prøvet for tilstedeværelsen ε tantsekvensen ved deres hybridisering til det ove viste mutagene oligonucleotid ved 58 °C i 6 x SSC

20 Den udvalgte klon havde leu-codonen CTT i stedet i aminosyreposition 173. Kodeområdet fra denne k3 udskåret som et BamHI-til-HindIII-fragment og lie i et tilsvarende nedbrudt pUC8. Det resulterende pFib55, har alle trækkene hos pFib51 såvel som et 25 let flyttet FIBAC-kodeområde.

I 84 H udformet en klon, som med hensyn til regulerin· I . trykkelse ligner plasmid.pFib51 (dvs. FIBAC tr, H nelt koblet til lacZ i pUC8), men som anvender I. nativ translationskobler. For at skabe pFib56 5 redes de følgende stykker DNA:

EcoRI end HgiAJ

I 5' A A T.T 0 C A A G G A G.A AATAAATGTG

I HgiAi end. EcoRI end Η 5' CATTTATTTCTCCTTGG 3' I Dette dobbeltstrengede EcoRI/HgiAI-fragment bl< I 10 kombineret med HgiAI/HindIII-FIBAC*kodesekvens< I plasmid pUC8, som var blevet nedbrudt med EcoR: I dill, og ligeret* Det resulterende plasmid er l I kaldt pFib56. Når dette plasmid transformeres : I E.coli stamme JM107, kan den opnåede stamme,.

I 15 JM107/pFib56, induceres til at udtrykke endog i I methionyl-FIBAC end JM107/pFib51 eller JM107/p] I ud fra kan det konkluderes, at translationskob: I pFib56 er mere effektiv end den i pFibSl.

I 20 D. Udtrykkelsesvektorer pFiblO og pFibll.

I Til at dirigere den udtrykte FIBAC til det per: 85

To signalsekvenser er blevet separat hægtet til F dette formål. De er lederpeptiderne for E.coli Om phoS-genprodukter. Både OmpAL-FIBAO og phoSt-FIB/ fusionsproteiner indeholder signaler, som diriger 5 til at lokaliseres i periplasmaet hos E.coli og m proteolytisk forarbejdning af fusionen mellem Omp phoS-lederfragmenter og nativ FIBAC.

Plasmidet pFiblO er et derivat af pUC8, hvori kod 10 sen for OmpA^-FIBAC-fusionsproteinet er blevet inc Desuden er der inkluderet nogle utranslaterede 5’ sekvenser fra OmpA-genet. Transskriptionen af det plasmid dirigeres af pUC8's lac-promotor/operator lationen startes ved methionincodonen, som begynd 15 ledersekvensen, og anvender den Shine-Dalgarno-se som findes i OmpA-genet.

Plasmidet blev konstrueret ved ligering af FIBAC-kodesekvensen indeholdt på et HgiAI/HindIII-fragm 20 pFib55 sammen med syntetiske oligonucleotider, so for OmpA-lederpeptidet, og med EcoRI/Hindlll-nedb pUC8. Kodestrengen af det syntetiserede oligonucl er:

OmpAL

EcoRI end

5* AATTCCATATCTCGTTGCAGATATTCA GTATTTTGGATGATAACGAGGCGCAAA

I 86 H. Syntesen blev gennemført som fire oligonucleot for hver af strengene. Til sammen udviser den strengede DNA trækkene:

5 . (a) En EcoRI-kohæsiv ende ved 5'-enden og en H

kohæsiv ende ved 3' enden af kodestrengene; (b) en åben aflæsningsramme, som koder for led

H af OmpA-genproduktet, som er i ramme med FIBAC

I 10 det ligeres ved HgiAI-centret; I (c) ikke-kodende sekvenser 5' for den translati I tion, som indeholder det ribosombindingscenter I malt findes i OmpA-genet; og I 15 I (d) et indre, unikt Pvul-center.

I Plasmidet pFibll er et derivat af plasmid pKK2; I identisk med pFiblO, undtagen at dets pUC8-pori I 20 blevet erstattet med 4550 bp EcoRI/Hindlll-frai plasmid pKK223-3. I denne konstruktion diriger« I leres transskriptionen af den hybride tac-prom< I tor. Desuden indeholder dette plasmid en trans; I tionsterminator, som kan stabilisere plasmidet I ’ 25 udtrykkelsessystem.

87 tion af lacZ-genet, som det forekommer i plasmid Dette er blevet gennemført ved ligering af 3200 t RI/PvuI-fragmentet af plasmid pFiblO til et synte oligonucleotid, som er vist her: 5

EcoRI end 5' AATTCCAAGGAGAAATAAATGAAAAAGA TATCGCGAT 3*

Pvul end

Pvul end 5* CGCGATAGCTGTCTTTTTCATTTATTTC T G G 3'

EcoRI end F. Udtrykkelsesvektor pFib31.

phoS-genet i E.coli koder for det phosphatbindend 10 in og er blevet beskrevet og sekvensbestemt af Su B.D. et al., J. Bacteriol. 157:772-778 (1984), de fikt betragtes som inkorporeret i denne beskrivel henvisning. Dette protein er periplasmisk, med en nosyrers ledersekvens, som dirigerer det til det 15 plasmiske rum. Ledersekvensen fjernes proteolytis translationsprocessen, således at der kun efterla dent phoS-protein i periplasmaet. Vi har syntetis phoS-ledersekvensen som to dobbeltstrengede DNA-f ter med EcoRI- og HgiAI-ender som vist: 20 I 88 I EcoRl/Clal I EcoRI end

5' AATTCATGAAAGTTATGC GTACCACC

I AACTGTTGTC G C CGCGACCTTAT 3' I Clal end I Clal end

I 5' CGATAAGGTCGCGGCGACAACAGTTG

GTGGTACGCATAACTTTCATG 3'

EcoRI end

I Clal/HqiAI

I Clal end Hq I 5' CGATGAGTGCTTTCTCTGTGTTTGCG1 I H£iAI end ClaAI end I 5' CGCAAACACAGAGAAAGCACTCAT 3'

Disse fragmenter blev ligeret sammen ved et Cl; I internt i phoS-lederen. Disse fragmenter blev i H 5 kombineret med det ovenfor beskrevne' HgiAI/Hinc I kodefragment og plasmid pKK223-3, som var bleve med EcoRI og Hindlll. Det resulterende plasmid I kaldt pFib31.

10 EKSEMPEL 9 89 (1) Specifik reaktion af FIBAC-antistof overfor I proteiner produceret efter induktion af FIBAC-ger skilt ved polyacrylamid-SDS-elektroforese og der« bundet til nitrocellulosepapir (Western-dupning); 5 (2) mærkning af E.coli proteiner med 35S-cystein, methionin eller 35SC>42' efter induktion af FIBAC~g<

(3) undersøgelse af polyacrylamid-SDS-geler indet 10 E.coli proteiner og FIBAC uden antistofkobling eJ

dioaktiv mærkning.

Disse metoder har muliggjort ikke blot sanunenligr de mængder af FIBAC, som produceres af hver stamn 15 også rensning af FIBAC'en efter udtrykkelse uden for funktionel metalloproteinase-inhibering. Alle eksempel 8 omtalte plasmider er blevet udtrykt pé grund af E.coli stamme JM107. Udtrykkeisen af FIE E.coli har indtil nu været større i de systemer, 20 udformet til transport af proteinet udenfor den i cellemembran. Dette skyldes muligvis nedbrydning udtrykte protein i cytoplasmaet.

Forarbejdning af OmpAL-FIBAC-fusionsprotein til d 25 af den modne form af FIBAC har vist sig at være c afhængig af cellernes vækstfase. Celler induceret I 90 H net, viser sig at forarbejde proteinet fuldsta hængigt af vækstfasen.

Alle de ovenfor i eksempel 8 beskrevne udtrykk 5 rer har ampicillinresistens som den selekterba

Til produktionsformål kan det være at foretræk en tetracyclinresistens-markør. Et plasmid, so ' ligvis er nyttigt som udtrykkelsesvektor, er b

H strueret med en tetracyclinresistens-markør. D

I 10 plasmid er et derivat .af pKK223-3, hvori det a tetracyclinresistens-gen er blevet erstattet m H funktionelt tetr-gen tilpasset fra pBR322.

I EKSEMPEL 10 I 15

Rensning af FIBAC udtrykt i E.coli.

Den rekombinante humane collagenaseinhibitor ( . blevet renset fra E.coli stamme JM107 transfor 20 plasmidet pFibll. I denne stamme, JMl07/pFibll fremstilles således, at den akkumuleres som et ligt aggregat. I dette eksempel beskrives beti for vækst af cellerne, induktion af FIBAC-genu ' kelse, celleindhøstning og rensning af FIBAC f I 25 løselige fraktion af et totalt cellelysat. Den 91

Luria-væske indeholdende ampicillin i en koncentr 100 pg/ml blev podet med en natten over dyrket ku JM107/pFibll til en begyndelses-OD6oo på 0,15-0,20 kolbe-cellekulturen fik lov at vokse ved 37 °C ti 5 OD6oo på 1,5, ved hvilket tidspunkt dyrkningsmedie suppleret med IPTG til en slutkoncentration på 0, Inkubation ved 37 °C fortsattes derpå i 2,5 - 3 t Cellekulturen blev hurtigt afkølet til 4 °C i et hvor cellerne indhøstet ved centrifugering. En 1-10 kultur dyrket som beskrevet ovenfor gav i gennems celler (våd vægt). Cellerne blev vasket én gang i lysepuffer (50 mM MES, pH 6,0, 4mM EDTA) og derpå suspenderet i lysepufferen til en slutkoncentrati 0,26 g celler (våd vægt)/ml. Cellesuspensionen bl 15 frosset ved -70 °C, indtil yderligere forarbejdni

Totalt cellelysat blev fremstillet ved at sende c spensionen to gange igennem en fransk trykcelle ( Aminco model nr. FA-079 forsynet med stempel nr. 20 og drevet ved 20000 psti, SLM Instruments, Inc., Illinois, USA). Det resulterende cellelysat blev ret med 10 pg DNAase I/g celler (våd vægt) i 2-3 is. Cellelysatet blev derpå delt i mindre aliquot opbevaret nedfrosset ved -70 °C indtil yderligere 25 bejdning.

Pn /-a 1 1 1 uca +- _ eiirw=»rn,»1· λγί1~ — γρ! 1 1 1 p-f r I 92 H natanterne fra disse vaskninger blev hældt sam til yderligere analyse. Den vaskede pille blev lubiliseret ved resuspension i 3 ml 50 mM MES/ mM EDTA, 50 mM DTT, 10 M aurinstof, og inkuber* 5 stuetemperatur i 15 minutter. Skulle der ske p bamylering på grund af urinstofsolubilisering, reaktionen udslukkes ved tilsætning af et 100 i overskud af en egnet nucleofil i forhold til b H teinaminogrupper. Den resulterende opløsning b 10 ved centrifugering i 15 minutter ved 4 °C i en H mikrocentrifuge. Supernatanten indeholdt i det I alt proteinet fra solubiliseringsproceduren og til yderligere analyse. Den resterende lille p: I mest af cellevægrester og nogle få proteiner {] I 15 gen var FIBAC). Denne blev smidt væk.

. . Identificeringen af FIBAC i de forskellige fra! fremstillet som beskrevet ovenfor blev gennemfi H SDS-PAGE og sondering af Western-dupninger med I 20 FIBAC-antistoffer. SDS-gel-analyse af totalt c< I protein opnået fra IPTG-induceret JM107/pFibll I stedeværelsen af et proteinbånd på omkring 2001 I . tilsyneladende molekylmasse/ som mangler i geli I fra et cellelysat af ikke-induceret JM107/pFib! I 25 Da proteinet og et' hurtigere vandrende bånd, ,ai 93 fraktionen opnået fra IPTG-induceret JM107/pFibll lelysatpille-vaskeopløsningen afslørede kun lidt Hovedmængden af FIBAC fandtes imidlertid i den ur DTT-solubiliserede cellelysatpillefraktion. Dette 5 fortolket således, at FIBAC efter IPTG-induktion leres som en uopløselig fraktion og kan isoleres vedsageligt ren form fra den vaskede cellelysatpi

Den urinstof-DTT-solubiliserede cellelysatpille b 10 vendt som udgangsmateriale for CM-chromatografien ml aliquot af solubiliseret cellelysatpille (16 m in) blev fortyndet til 25 ml med kold CM-puffer ( MES, pH 6,0, 6M urinstof, 14 mM 2-ME). Prøven ble sat på en carboxymethylcellulosekolonne {25 x 130 15 som i forvejen var ækvilibreret med CM-puffer ved Efter prøvepåsætningen blev kolonnen vasket med C puffer, indtil A2øo-værdien vendte tilbage til bas en. Adsorberet protein blev elueret med en lineær triumchloridgradient (0-200 mM) i CM-pufre. Det t 20 - gradientvolumen var 400 ml, strømningshastigheden ml/h, og der blev opsamlet 5 ml fraktioner. "Genn nings"-fraktionen (CM-FT) og topfraktionerne 58-6 hældt sammen og analyseret ved SDS-PAGE. Den elek tiske og immunologiske analyse af disse fraktione 25 at den rekombinante FIBAC, inklusive noget nedbru 3AC, blev elueret ved omkring 120 mM NaCl uden noaen andre detekterbare oroteiner. Und I 94 H Den ved denne procedure opnåede mængde CM-rensi blev bedømt til at repræsentere 1,3 % af det t< I leprotein. Bradford-proteinprøvninger anvendte: I tisering under hele isolerings- og rensningspr< I 2 ml (100 pg) renset FIBAC i 50 mM MES, 6M uri) H mM 2-mercaptoethanol blev koncentreret til 200

Centricon-centrifugering og indstillet til pH i tilsætning af 2 M "Tris"-HCl, pH 8,5 til en ene 10 MTris"-koncentration på 0,5 M. Cysteinresterne blev derpå carboxymethyleret under anvendelse ; H iodeddikesyre. Alkyleringsreaktionsblandingen 1 I tet ved revers-fase-HPLC; Den modificerede FIBi I des ved 30 % acetonitril og blev opsamlet,til i 15 analyse. En aliquot af den modificerede FIBAC : I fra HPLC'en blev underkastet DSD-PAGE-analyse.

ning af den CM-rensede FIBAC, som blev anvendt I xymethyleringen (udgangsmaterialet) og FIBAC*ei

I kylering og HPLC-afsaltning viste, at den modiJ

I 20 FIBAC vandrede lidt langsommere i SDS-gelen em H modificerede FIBAC. Dette er ikke en usædvanlit I tion, især i betragtning af det væsentlige ante I cerede cysteinrester, som er til stede i FIBAC.

H 25 Den carboxymethylerede FIBAC blev derpå påsat s 95 kvens af den rensede FIBAC (C-T-V-P-P...) er iden den, der tidligere er bestemt for nativ FIBAC. De kluderes derfor, at pFibll forarbejder den rekomb FIBAC rigtigt ved spaltning af OmpA-FIBAC-5 fusionsproteinet ved dets Ala-Cys-samling til dan den modne form af FIBAC-proteinet.

N-terminal aminosyresekvens-analyse af renset rek FIBAC.

10 (Cysteinrester blev mærket med 3H-iodeddikesyre fc kvensbestemmelsen af proteinet)

Cyclus 3H-CPM PTH-aminosyre identifika 15 1 11470 Cys 2 385 Thr 3 12690 Cys 4 339 Val 20 5 145 Pro 6 255 Pro B. Opløselig fraktion.

25 På grund af de yderligere forureninger i udgangsm, resulterer den heri omtalte procedure ikke fra st, I 96 Η I dette eksempel var cellevæksten, induktionen ningen og fremstillingen af et totalt cellelys; det forudgående eksempel. For at påvise den he: H 5 de procedures evne til at rense FIBAC fra enhv< af cellelysatet blev den oprindelige centrifug; nering af homogenatet udeladt. I stedet blev df cellelysat gjort 10 M urinstof mM EDTA, 50 mM 1 MES, pH 6,0 og inkuberet ved 22 °C i 15 minutt« I - 10 ningen blev derpå centrifugeret i,15 minutter : I dorf mikrocentrifuge ved 4 °C. Pillen1blev smic H supernatanten fortyndet med CM-puffer (50 mM Mi 6 M urinstof, 14 mM 2-mercaptoethanol) og frakl I chromatografisk på carboxymethylcellulose som : 15 udgående eksempel. FIBAC elueredes ved omkring salt sammen med noget nedbrudt FIBAC og flere : . gisk ubeslægtede forureninger. Bedømmelse af d( BAC ved SDS-PAGE-analyse viste, at den udgjord« 50 % af det totale protein i denne fraktion. V« I 20 renhedsniveau er det muligt at genfolde FIBAC« native konformation under anvendelse af den nec genfoldningsprocedure. Den genfoldede FIBAC er funktionsdygtig som metalloproteaseinhibtor og yderligere ved anionbytterchromatografi.

25 97 cellulosen. Analyse af gennemstrømningsfraktione; at FIBAC'en ikke blev tilbageholdt. De immunolog. slægtede forureninger blev bundet til matrixen o< derved fjernet fra opløsningen. Gennemstrømnings: 5 nerne kan koncentreres på en CM-cellulose-kolonm vist nedenfor.

Gennemstrømningsfraktionen fra anionbytterkolonm titreret til pH 7,5 ved tilsætning af 5 N HC1. Di 10 løsning blev påsat en CM-cellulose-kolonne (25 x som i forvejen var ækvilibreret med 600 mM urins' mM "Tris", pH 7,5. Kolonnen blev vasket med denni puffer, indtil der ikke spektralt kunne iagttage protein i eluatet. FIBAC'en blev derpå elueret mi 15 ovenstående puffer gjort 250 mM mht NaCl. Proteii blev hældt sammen og dialyseret til ligevægt ove: mM"Tris", pH 7,5.

Elektroforetiske, immunologiske og funktionelle 3 20 ger af den resulterende FIBAC viser en aktiv gen: collagenaseinhibitor med en renhed på over 90 %. ste detekterbare forurening er et FIBAC-nedbrydningsprodukt som ved rensningen fra celle, len. På grund af den identiske aminoterminale se: 25 denne forurening og dens tilsyneladende molekylim det blevet konkluderet, at der er sket en proteo I 98 I . EKSEMPEL 11 I Konstruktion af en gær-FIBAC-udtrykkelses-klon, I 5 En anden organisme, hvori der er blevet konstri nudtrykkelses- og proteineksport-vektorer, er c I charomyces cerevisiae. Gær-a-faktoren er et foi hormon, som produceres intracellulært og ekspoi ' vækstmediet. En enkelt peptidsekvens dirigerer 10 transport. FIBAC-kodesekvensen er blevet klonet H gærudtrykkelsesvektor til skabelse af en fusior faktor-ledersekvensen med FIBAC. En konstruktic først fremstillet som et derivat af pGS385. Plc I pGS385 har de følgende træk: I 15 (a) Det indeholder portioner af gær-a-faktor-ge I klusive promotoren, lederpeptidet, polyadenylei let og transskriptionsafslutningssignalerne; I 20 (b) portionen af a-faktor-genet mellem de to me

Hindlll-centre er blevet deleteret, således at skabt et unikt HindiIl-center; I (c) det indeholder et unikt Sall-center 3' for I 25 centret; og 99

Plasmidet pGS385 blev nedbrudt med Hindlll og Sal dlll-centret afgrænser carboxyterminus af a-faktc ledersekvensen. Det syntetiske octanucleotid 5'-? 3' blev dannet til at danne bro mellem C-terminus 5 faktoren og N-terminus af FIBAC. a-faktor-transsfc tions-translations-sekvenserne driver genudtrykke denne vektor. Hele cx-faktor-FIBAC-fusionen blev c fjernet ved nedbrydning med EcoRI og indsat i pie YiP5, et derivat af plasmid pBR322, som indeholde 10 ura3-genet. Dette plasmid er egnet til anvendelse trykkelsesvektor efter nedbrydning ved et unikt S center i ura3 og transformation in di S. cerevisi at dirigere integration af hele plasmidet i det c male ura3-locus. Sådanne integranter af et a-fakt 15 FIBAC-fusionsderivat af YiP5 er blevet opnået og rede og secernerede her immunoreaktivt materiale stemt ved kolonisigtningsteknik.

EKSEMEPL 12 20

Odtrykkelse af rekombinant FIBAC i dyreceller.

Der forslås to udtrykkelsessystemer til produktic BAC i dyreceller. Det første inkorporerer den ser 25 promotor til at dirigere transskription i COS-1 c Dette udtrykkelsessystem er først og fremmest nyt 100 konstruktion er beskrevet i detaljer af Spragu« Condra, J.H., Arnheiter, H., og Lazzarini, R.A, rol. 45:773-781 ¢1983), der specifikt betragtes korporeret i denne beskrivelse ved henvisning.

5 plette FIBAC-kodeområde, inklusive den naturli< mende signalsekvens, er blevet samlet fra de di cDNA-kloner. Ncol-centret, som falder sammen me methioninet for lederpeptidet, vil være forbunc kort syntetisk oligonucleotid med det unikke Xh 10 i pJC119. Hele FIBAC-kodeområdet og utranslatei sekvenser indsættes i dette center, hvor transs dirigeres af den sene SV4O-promotor, Plasmidet des indeholde SV40~repliceringsoriginet, pBR32z ringsoriginet og den selekterbare ampicillinres 15 markør.

Det andet system vil blive foretrukket til proc FIBAC i dyreceller, fordi det vil resultere i s kontinuert udtrykkelse af FIBAC fra en human ce 20 -Denne vektor vil være et derivat af pBPV52-l, t af Florkiewicz, R.Z., Smith, A., Bergmann, J.E.

J.K* i Cell Biol. 97:1381-1388 (1983), der spec tragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ve ning. Dette plasmid indeholder oksepapillomavii 25 repliceringsoriginet, pBR322-repliceringsorigin 101 indsat således at dens transskription dirigeres a tidlige SV40-promotor.

Det forventes, at rensning af FIBAC fra mediet ef 5 trykkelse og sekretion fra disse celler vil være det væsentlige som beskrevet tidligere i eksempel EKSEMPEL 13 10 Genfoldning af FIBAC.

To prøvninger er blevet anvendt til at kontroller foldningen af FIBAC. Begge prøvninger måler forek af den funktionelle kapacitet af FIBAC som dens n 15 struktur. Den første prøvning er en inhiberingspr som måler prøvens inhiberende virkning på evnen h man-fibroblast-collagenase til at nedbryde 14C-mæi collagen. Den anden prøvning er en modificeret EL måler bindingen af den genfoldede FIBAC til human 20 genase.

Den collagenasebindende ELISA er den primære prøv hvorved FIBAC-aktivitet blev detekteret. Her over collagenase natten over ved 4 °C i 96-hullers Imm 25 plader (1,0 pg/ml i 50 mM "Tris”, pH 8,2, 5mM CaC μΐ pr. hul). Efter at hullerne er blokeret i 45 m mpH Ί50 ul/hul af 3 % RRA i vaskpnnfrp t50 mM "Tr I 102 H hullerne tre gange med vaskepuffer. Affinitetsi I nin- og anti-FIBAC sættes til hullerne (fortync I 100 μΐ/hul) og inkuberes ved 37 °C i 45 minutti H ne vaskes igen, og derpå sættes alkalisk-phospl I 5 konjugeret gede-anti-kanin-IgG (Sigma, fortynd« vaskepuffer) til hullerne (100 μΐ/hul). Efter : H kubation ved 37 °C vaskes hullerne en sidste gi sættes alkalisk-phosphatase-substrat (Sigma nr,

I . 1 mg/ml i 10 % diethanolamin, 100 mM MgCl2, pH

I 10 hullerne. Farveudviklingen kontrolleres ved 49i I anvendelse af en Titertek Multiskan MC ELISA aj I (Flow Laboratories). Nativ FIBAC tjener som sti I ve, overfor hvilken ukendte prøver kan kvantisi I 15 Ved collagenaseinhiberingsprøvningen nedbrydes I marsvinehudcollagenpiller (25 μΐ/pille = 2100 1 H med 50 μΐ trypsinaktiveret collagenase (omkrinc I i 50 mM "Tris", pH 7,5, 10 mM CaCls) , som frigi I opløsningen. Efter inkubering af pillerne i 1-: 20 (afhængigt af nedbrydningshastigheden) stoppes ved tilsætning af.100 μΐ "Tris"-puffer og centi i 10 minutter ved 10000 omdr./min. Supernatants res derpå ind i scintillationsampuller indeholc I scintillationsvæske og tælles. Præinkubering al 25 nasen med 50 μΐ af varierende fortyndinger af s 103 af den ukendte prøve udregnes ved antagelse af et forhold på 1:1 mellem inhibitor og enzym.

Under anvendelse af disse prøvninger er effektiv! 5 genfoldningsprocessen med hensyn til proteinkonce on, koncentration af oxideret gluthation, pH-værc temperatur blevet undersøgt. Selvom alle kombinat disse parametre ikke er blevet udtømmende undersc der blevet udviklet en procedure, som muliggør ef 10 renaturering.

Genfoldningen af FIBAC afhænger i høj grad af der tration af FIBAC, hvorved genfoldningen gennemfør der oxiderende betingelser forhindrer fortyndede 15 ninger dannelsen af mellemkæde-disulfider, som i ende fører til udfældningen af aggregater.

Renset rekombinant FIBAC kan genfoldes og forbliv selig med 100 % genvinding af protein, når man fe 20 nedenfor beskrevne forskrift: (1) Fortyndet renset FIBAC (mindre end 300 pg/ml) urinstof, 50 MES, pH 6,0, 14 mM 2-mercaptoethanol beres i nærvær af 70 mM oxideret gluthation.

25 (2) Efter 10 minutters inkubation ved stuetempera

4- 1 Λ Λ C A mfcX _ IT Q

I 104 H SDS-PAGE-analyse af dette reaktiverede materia H tilstedeværelsen af både intakt og nedbrudt Fil nedbrudte FIBAC bæres igennem fra rensningspro< synes ikke at nedbrydes yderligere under reakt 5 proceduren.

H Denne solubiliserede FIBAC er blevet påvist at I collagenasebindende aktivitet (ELISA) og colla< I berende aktivitet. Mængden af aktivitet i forh< 10 mængden af protein synes at være større end 90 I ved collagenaseinhiberingsprøvningen. Dette ta^ H ledt af beregninger baseret på den antagende m lagenase ved prøvningen. Selvom dette er en am menes den ikke at være mere end 50 %-ved siden 15 dingsaktiviteten målt overfor FIBAC-standarden ’ det muligt at kontrollere den relative reaktiv« forskellige prøver.

I Genfoldningsprocessen er også blevet vist at v: I 20 50 I rene FIBAC-præparater. Arten og mængden ad I nende protein, som kan tolereres, er stadig uvj gen aktiv FIBAC er blevet detekteret i totale < ter uden rensning, hvilket viser, at i det mine udbytter kan opnås ved mindre end 5% renhed.

I -25

Claims (21)

1. Overførbar DNA-sekvens, kendetegnet den er i stand til at dirigere intracellulær prod 5 af metalloproteinaseinhibitorer og omfatter følge kvens: 10 30 30 40 SO CTTCTTGC7C TCCCTCATAO CCCCAGCA0G OCCTCCACCT CTGTCCCACC CCACCCA 70 «0 »0 100 110 ACCCCCTTCT ccaattccca cctcctcatc agggccaaot tcctocccac accacaa 130 140 ISO U0 170 AACCACACCA CCTTATACCA CCCTTATCAC ATCAAOATOA CCAACATCTA TAAAOCC ISO 200 210 220 230 CAACCCT7AG GCCATGCCOC TOACATCCOG TTCOTCTACA CCCCCGCCAT GGAGAG" 330 2*0 270 200 290 TOCSGATACT TCCACABSTC CCACAACCSC AOCCASSAOT TTCTCATTCC TGCAAAA 310 320 330 340 350 CACCATCCAC rCTTOCACAT CACTACCTOC AOTTTCCTCG CTCCCTCCAA CAGCZT: 370 380 390 400 410 TTAGCTCACC GCCCCOeCTT CACCAASACC TACACTCTTtJ CCTGTGAGGA ATOCAO 430 440 4$0 4*0 470 rrrcccTCTT tatccatccc crccAAACTe cacactggca ctcattcctt gtcca:: 490 300 SIO 320 330 CAOCTCCTCC AAGGCTCTGA AAAGGCCTTC CACTCCCffTC ACCTTGCCTO CCTGCC‘

3 SO 3*0 370 580 390 CACCCACCCC TCTOCACCTG OCACTCCCTO CCCTCCCACA TACCCTCAAT CCTOCC: 613 620 630 640 630 OTGCAAOCre AAGCCTGCAC AGTGTCCACC CTCTTCCCAC TCZiATCTTT CTTUTl:

2. Rekombinant DNA-kloningsvektor, k e n d e t H ved, at den er i stand til at dirigere ekspresi I bakterielt system, der omfatter en nucleotidsei H er i stand til at dirigere intracellulær produ! I 5 metalloproteinaseinhibitorer med en cysteinresi I terminalen, hvilken vektor omfatter en nucleot: der indeholder mindst en del af de følgende nu< der koder for en aktiv metalloproteinaseinhibil I 10 20 30 40 50 I GTTCTTCCTG TGGCTGATAG CCCCAGCAGG GCCTGCACCT GTGTCCCACC ( I 70 00 90 100 110 I AcocccrrcT ocaattccga cctcctcatc aggcccaact tcgtgcccac j I UO 140 ISO 160 170 I AACGAGACCA CCTIATACCA GCGTTATGAG ATCAACATGA CCAAGATOTA * I 190 200 210 220 230 I i CAACCCTPAO GCGATCCCGC TCACATCCCG TTCOTCTACA CCCCCGCCAT I I 250 260 270 280 290 I TGCGGATACT tccacaggtc ccacaacccc agcgaggagt ttctcattgc 1 I 310 320 330 340 350 I CAGGATGGAC TCTTSCACAT CACTACCTCC AGTTTCGTGG CTCCCTCGAA I 370 380 390 400 ' 410 TTAGCTCAOC GCCGOGGCTT CACCAAGACC TACACTOTTO OCTGTGAGGA 430 440 450 460 470 I , TTTCCCTOTT TATCCATCCC CTGCAAACTQ CACAGTOOCA CTCATTOCTT I 490 500 510 520 330 CAGCTCCTCC AAOGCTCTCA AAACCCCTTC CAGTCCCGTC ACCTTGCCTG (

3. Vektoren pUC9-F5/237P10 der er deponeret unde: 53003. i

4. Rekombinant DNA-fremgangsmåde til bakteriel p: 5 af en metalloproteinaseinhibitor med en cysteinr< terminalen kendetegnet ved, at den omf.< (a) Fremstilling af en overførbar DNA-sekvens, s< stand til at dirigere en værtsbakterie til at pr< 10 et protein med metalloproteinaseinhibitor-aktivil (b) kloning af den overførbare DNA-sekvens ind i tor, som er i stand til at kunne overføres til o< ceres i en værtsbakterie, hvilken vektor indehol< 15 rationelle elementer for den overførbare DNA-sefr (c) overførsel af vektoren indeholdende den over: DNA-sekvens og operationelle elementer til en væ: rie, som er i stand til at udtrykke metalloprote: 20 hibitor-proteinet; (d) dyrkning af værtbakterien under betingelser, passende for forstærkning af vektoren og udtrykki inhibitoren; hvorpå 25 (e) i valgfri rækkefølge: I 108

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4,kendete< I ved, at metalloproteinaseinhibitoren er collag< I bitor. I 5

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, k e n d e t e < ved, at den overførbare DNA-sekvens indeholder I den følgende sekvens: 10 20' . .30 - 40 SO I GTTG7TCCTG TGGCTCATAG CCCCAGCAGC GCCTCCACCT GTGTCCCACC C 70 Θ0 40 100 110 ACGCCCTTCT GCAATTCCCA CCTCGTCATC AGGGCCAAGT TCGTGGGCAC J I 130 140 130 140 170 I XXCCAGACCA CCT7ATACCA GCGTTATGAG ATCAAGATGA CCAAGATGTA I 190 200 210 220 230 I CAAGCCTTAG GCCA7GCCOC TCACATCCGG TTCCTCTACA CCCCCGCCAT < I 2 50 260 270 200 290 I TGCGGATACT TCCACAGGTC CCACAACCGC AGCGAGGACT TTCTCATTGC 1 I 310 320 330 340 330 . CAGCATCGAC TCTTGCACAT CACTACCTOC ACTTTCGTGG CTCCCTGCAA ( 3 70 380 , 390 400 410 I TTAGCTCAGC GCCGGGGCTT CACCAAGACC TACACTGTTG GCTGTGAGGA i I 430 440 450 460 470 I TTTCCCTCTT TATCCATCCC CTGCAAACTG CAGAGTGGCA CTCATTGCTT < I 490 S00 510 320 330 I CAGCTCCTCG AAGGCTCTGA AAACCCCT'TC CAGTCCCGTC ACCTTCCCTC <

7. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegn ved, at vektoren ifølge krav 4 anvendes.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegn 5 ved, at værtsbakterien tilhører af slægten Bacill

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegn ved, at bakterien er Bacillus subtilis.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendeteg ved, at bakterien er Escherichia coli.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendeteg ved, at bakterien tilhører slægten Pseudomonas. 15

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendeteg ved, at bakterien er Pseudomonas aeruginosa.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendeteg 20 ved, at inhibitoren indhøstes, inden den bringes antage den aktive tertiære struktur.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendeteg ved, at inhibitoren bringes til at antage den akt 25 tiære struktur, inden den indhøstes.

1. Maf ϋΐ 1 aarat· ai naeai nh ΐ hi f ar HV a r- W ϊ ^ 1 r\n i ao

16. Mikroorganismen C600/pUC9-F5/237P10 med AT( sionnummer 53003.

17. Overførbar DNA-sekvens som er i stand til < 5 intracellulær produktion af metalloproteinaseir kendetegnet ved, at den omfatter føle nucleotidsekvens: . ' 10 20 30 40 50 CCCCATCGCC GCAGATCCAG CGCCCAGAGA GACACGAGAC AACCCACCAT CC

70 SO SO 100 UO GACCCCTOGC TTCTGCATCC ΤσΤΤδΤΤΟΟΤ GTGGCTGATA GCCCCAGCAG GC 130 140 . 150 160 170 ' TGTCTCCCAC CCCACCCACA GACOGCCTTC TGCAATTCCG ACCTCC7CAT CJ 190 . 200 210 220 230 TTCGTGOGGA CACCAGAAC7 CAACCAGACC ACCTTATACC ΑβΟβΓΤΑΤΟΑ GJ 2SC 260 270 2S0 290 kZZkACATG7 ATAAAGwGTT CGAAGCCTTA GGGGATOCCG C73ACATCGG C 313 323 330 340 350 ACCCCCGCCA TGCAGAG7G? CTGCGGATAC TTCCACAGGT CCCACAACCG ( 370 380 390 400 410 TTTCfCATTG CTGGAAAAC? GCACCATGCA CTCTTGCACA TCACTACCTG ( 430 «40 450 460 473 GCTC3CTGGA ACACCCTCAG CTTAGCTCAG CGCCSGGGCT TCACCAAGAC ( 490 500 510 5 20 5 30 GGCTGTGAGG AATGCACAGT GTTTCCCTCT TTATCCATCC CCTGCAAACT ( 550 560 570 580 590 ACTCATTGCT TCTCGACGCA CCAGCTCCTC CAAGGCTCTG AAAAGGGCTT (

18. Rekombinant DNA-fremgangsmåde til fremstillir metalloproteinaseinhibitorer med en cysteinrest i terminalen ud fra dyreceller, kendetegne at den omfatter: 5 (a) Fremstilling af en overførbar DNA-sekvens, sc stand til at dirigere en værtsdyrecelle til at p] et protein med metalloproteinaseinhibitor-aktivil 10 (b) kloning af den overførbare DNA-sekvens ind i tor, som er i stand til at kunne overføres til oc ceres i en værtsdyrecelle, hvilken vektor indeho] rationelle elementer for den overførbare DNA-sek\ 15 (c) forstærkning af vektoren der indeholder den c bare DNA-sekvens og operationelle elementer i en el værtscelle; (d) overførsel af den forstærkede rekombinante vi 20 en værtsdyrecelle som er i stand til at udtrykke loproteinaseinhibitor-proteinet; (d) dyrkning af værtsdyrecellerne under betingeli er passende for udtrykkelse af inhibitoren; hvorj 25 (e) i valgfri rækkefølge: I 112

19. Fremgangsmåde ifølge krav 18, Jc e n d e t H ved, at vektoren indeholder en del af den følg sekvens, som koder for en aktiv metalloprotein I 5 tor: 10 20 30 40 30 H gcccatcccc gcacatccac cgcccagaoa GACACCACAC AACCCACCAT I 70 eo 90 100 110 I OAGCCCCtGO CTTCTCOCAT CCTCTTCTTO CTCTGCCTGA TAGCCCCCAC i 130 140 ISO 140 170 ACCTCTCTCC CACCCCACCC ACACACCOCC TTCTOCXATT CCGACCTCGT i 190 200 210 220 230 jmCTTCCTOO GGACACCAGA AGTCAACCAG ACCACCTTAT ACCAGCGTTA TG. 250 260 270 280 290 ATGACCAAGA TGTATAAAGG GTTCCAAGCC TTAGGGGATG CCGCTGACAT CC 310 320 330 340 350 TACACCCCCG CCATGCAGAG TGTCTGCGGA TACTTCCACA GCTCCCACAA CC 370 380 390 400 410 GACTTTCTCA TTGCTCGAAA ACTGCAGGAT GCACTCTTOC ACATCACTAC CT 430 440 450 460 470 GTCGCTCCCT GOAACAOCCT GAGCTTAGCT CAGCGCCCCG OCTTCACCAA CA 490 500 510 520 530 GTTGCCTCTC AGGAATGCAC AGTCTTTCCC TGTTIATCCA TCCCCTGCAA AC 350 560 570 580 590 GGCACTCATT GCTTCTGGAC GGACCAGCTC CTCCAAGOCt CTGAAAAGCG Cl 610 620 630 640 650 CGTCACCTTG CCTGCCTGCC TCGCOAGCCA GGGCTCTGCA CCTGCCAGTC CC 670 680 690 700 710 CAGATACCCT GAATCCTGCC CGGACTGGAA QCTGAAOCCT OCACAGTOTC O 730 740 750 760 770 ccactcccat cmcrtccg gacaatgaaa taaagaotta ccacccagca w GGAATTC