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JPH07121229B2 - 酸アミド―カルボキシ末端を有するポリペプチドの調製 - Google Patents

酸アミド―カルボキシ末端を有するポリペプチドの調製

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JPH07121229B2
JPH07121229B2 JP59154188A JP15418884A JPH07121229B2 JP H07121229 B2 JPH07121229 B2 JP H07121229B2 JP 59154188 A JP59154188 A JP 59154188A JP 15418884 A JP15418884 A JP 15418884A JP H07121229 B2 JPH07121229 B2 JP H07121229B2
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grf
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methionine
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JP59154188A
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ヨーアヒム・エンゲルス
ヴオルフガング・ケーニヒ
フーベルト・ミユルナー
オイゲーン・ウールマン
ヴアルデマル・ヴエテカム
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ヘキスト・アクチエンゲゼルシヤフト
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Publication date
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Publication of JPH07121229B2 publication Critical patent/JPH07121229B2/ja
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明はカルボン酸アミド−カルボキシ末端を有するポ
リペプチドの製法に関する。
カルボン酸アミド−カルボキシ末端を有するポリペプチ
ドの直接的な遺伝子工学的合成は可能でない。しかしな
がらカルボキサミド末端を有する多くの系列の天然のペ
プチドが単離された。例えばPHI、VIP、CRF、神経生長
因子、オキシトシン、コレシストキニン、ガストリン、
カルシトニン、バソプレツシン、メリチン、メラノトロ
ピンおよび特に以下「GRF」と呼ばれる成長ホルモン放
出因子である。本発明は特にGRFのアミノ酸配列を有す
るペプチドおよびGRF類似の修飾されたペプチドおよび
これらペプチドな部分配列の製法に関する。それゆえ以
下にGRFのアミノ酸配列および修飾されたGRF誘導体のア
ミノ酸配列を有するペプチドの調製についての本発明の
本質を最初に説明する。
GRFは視床下部で形成されそして下垂体における成長ホ
ルモンの分泌を刺激する。しかしながらこれまでGRFは
人間の視床下部抽出物からは単離および特性化できなか
つた。しかしヒトの膵臓腫瘍から生体外および生体内で
GRF活性を示す44個のアミノ酸からなるペプチドが単離
できた〔R.Guillemin氏他「Science」第218巻第585〜58
7頁（1982年）参照〕。このペプチドは下記のアミノ酸
配列を有する。
Ｈ−Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Asn−Ser− Tyr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser− Ala−Arg−Lyg−Leu−Leu−Gln−Asp−Ile−Met− Ser−Arg−Gln−Gln−Gly−Glu−Ser−Asn−Gln− Glu−Arg−Gly−Ala−Arg−Ala−Arg−Leu−NH2 既知のように遺伝コード「変質する」。すなわち２個の
アミノ酸についてのみ１個のヌクレオチド配列がコード
化され、一方残る18個の遺伝的にコード化されうるアミ
ノ酸は２〜６個のトリプレットに割当てられる。従つて
遺伝子の合成には莫大な種類のコドン可能性が存在す
る。今やDNA配列Ｉが特に好ましいことが見出された。
コード化される鎖（strand）の５′−末端には制限エン
ドヌクレアーゼEcoR Iに対応する「張り出している」DN
A配列が存在し、これに対しコード化される鎖の３′−
末端には制限酵素Sal Iに対応する一本鎖の張り出して
いる配列が存在する。この２つの相異なる認識配列がプ
ラスミド中への所望の方向におけるDNAの挿入を保証す
る。
この認識配列とアミノ酸順列のためのコドンとの間には
アミノ酸メチオニン（これはDNA配列Ｉにおいて番号０
とされる）のためのコドンがコード化される鎖の５′−
末端に存在する。この鎖の末端にはロイシンをコードす
るトリプレットにグリシンのためのコードン45および２
個の末端トリプレットが続く （コード化される鎖のコドン24またはコード化されない
鎖のコドン23における）制限酵素Pst Iにとつての内部
の１個の切断部位により、例えばrBR322またはpUC8のよ
うなよく研究されたクローニングベクター中に組み込ま
れうる２個の遺伝子断片のサブクローニングができる。
加えて、構造遺伝子の内部に一連の他の独特の制限エン
ドヌクレアーゼに対する認識配列が組み込まれた。これ
は一方ではGRFの部分配列への接近をもたらしそしても
う一方では変異をもたらしめうる。
DNA配合Ｉは18〜29個の長さのヌクレオチドであるオリ
ゴヌクレオチド13個から、これを初めに化合的に合成し
そして次に４〜６個にヌクレオチドの「粘性末端」を経
て酵素的に結合することにより構成されうる。
DNA配列Ｉにおいてはさらに、数種のコドンが割当てら
れるこれらアミノ酸においてこれらコドンは等価ではな
くむしろ大腸菌のようなそれぞれの宿主細胞において異
なる優生性を示すことが顧慮された。さらに反復配列は
最小限におさえられた。
従つてDNA配列Ｉの遺伝子構造は比較的小さな構成単位
から容易に得られ、周知のベクター中における２個の遺
伝子断片のサブクローニングを許容しそして高収量でそ
れを発現せしめる。クローニングベクター中への合成遺
伝子の組み込み後にGRFのアミノ酸配列を有する所望の
ペプチドが直接かまたはβ−ガラクトシダーゼのような
細菌蛋白質との融合蛋白の形態で発現される。次にかか
る融合蛋白質をそれ自体既知方法で化学的または酵素的
に分解させる。
末端カルボンアミド基を有する（そしてアミノ末端にメ
チオニン残基を有する）GRFの最初の16個のアミノ酸を
有するペプチドを生ずる部分配列の例として、トリプレ
ットNo.16にトリプレットNo.45〜47が直接続く変性され
たDNA配列Ｉがあげられる。相当する記述は前記した表
に示され且つNo.24、29、34、36および41までのアミノ
酸を有するペプチド断片にもあてはまる。同様にまた例
えば最初の26個のアミノ酸を有する部分配列も調製され
うる。
修飾されたGRFの例としては27位においてメチオニンが
ロイシンにより置換されたポリペプチドがあげられよ
う。これにはDNA配列ＩにおいてトリプレットNo.27が下
記のもの、すなわち 27 Leu CTG GAC により置換される。
DNA配列IIから生ずるその他の変異については簡略化の
ためにコード化される鎖のみが示される。
従つて本発明によれば、式Ｉ Ｙ−Ｒ−NH2 （Ｉ） （式中Ｙはメチオニン残基またはメチオニンを介して結
合した細胞蛋白質残基でありそしてＲは遺伝的にコード
化されうるアミノ酸のペプチド配列を意味する）を有す
るポリペプチドが、式II Ｙ−Ｒ−NH−CH2−COOH （II） を有するポリペプチドを遺伝子工学的に産生させそして
この生成物を酵素的に式Ｉのポリペプチドに変換するこ
とにより調製されうる。
ＲがGRFのアミノ酸配列（ここで27位にはLeuが存在す
る）を意味する場合、アミノ末端のメチオニンはブロム
シアン分解により除去されうる。遺伝子工学的合成にお
いて融合蛋白質が得られる場合は、細菌蛋白質の望まし
からぬ部分もブロムシアン分解に際して除去される。
カルボンアミド官能分のアミノ基へのグリシル残基の酵
素的変換はそれ自体知られている〔A.F.Bradbury氏他
「Nature」第298巻第686〜688頁（1982年）およびI.Hus
ajn氏他「FEBS Letters」第152巻第277〜281頁（1983
年）参照〕。
クローニングベクター例えばプラスミドpUC8、pBR322、
pKK177.3、ptac11および他の商業的または一般的に入手
しうるプラスミドへの合成遺伝子または遺伝子断片の組
込みはそれ自体既知の方法で遂行される。これにはMani
atis氏著「Molecular Cloning」（Cold Spring Harbor
社1982年版）が参照としてあげられる。
かくして得られた雑種（ハイブリツド）プラスミドの適
当な宿主細菌好ましくは大腸菌への形質転換は同様に知
られておりそして前記した刊行物に詳細に記載されてい
る。発現された蛋白質の取得、ブロムシアン分解および
後処理はGillemin氏他（前出）により記載されている。
アミノ末端にメチオニン残基を有してそして／またはカ
ルボキシ末端にグリシン残基を有する本発明により得ら
れるポリペプチドは新規である。DNA配列IIによる修飾
されたGRF誘導体、DNA配列ＩおよびII、前記遺伝子断
片、それを用いて得られる雑種プロスミド、形質転換さ
れた宿主細菌および発現された融合蛋白質も同じであ
る。
本明細書においてこれまで言及したDNA配列Ｉ、IIおよ
びIIIのそれぞれを次表に示す。
以下の例において本発明のいくつかの態様を詳細に説明
する。これらから多数のありうる変形および組み合せが
当業者には明白であろう。百分率は別に断わりなければ
重量によるものとする。
例１ 一本鎖オリゴヌクレオチドの化学的合成 コード化される鎖のヌクレオチド１〜27を包含する遺伝
子構成単位Iaを例として遺伝子構成単位の合成について
説明する。既知方法〔M.J.Gait氏他「Nucleic Acids Re
s.」第８巻 第1081〜1096頁（1980年）〕に従い、３′
−末端に存在するヌクレオシド〔この場合アデノシン
（ヌクレオチドNo.27）〕をシリカゲル（メルク社製
品、FRACTOSIL ）に３′−ヒドロキシ官能分を介して
共有結合させる。この目的には、はじめにシリカゲルを
３−（トリエトキシシリル）−プロピルアミンと反応さ
せてエタノールを除去してSi−Ｏ−Si結合を生成させ
る。アデノシンをN6−ベンゾイル−３′−Ｏ−スクシノ
イル−５′−ジメトキシトリチルエーテルとしてｐ−ニ
トロフエノールおよびN,N′−ジシクロヘキシルカルボ
ジイミドの存在下に修飾された担体と反応させると、ス
クシノイル基の遊離カルボキシ基かプピルアミン基のア
ミノ残基をアシル化する。
続く合成段階において塩基成分が５′−Ｏ−ジメトキシ
トリチル−ヌクレオシド−３′−亜燐酸モノメチルエス
テル−ジアルキルアミドまたは−クロライドとして使用
され、ここでアデニンはN6−ベイゾイル化合物として、
シトシンはN4−ベンゾイル化合物として、グアニンはN2
−イソブチリル化合物として、そして何らアミノ基を含
有しないチミンは保護基なしで存在する。
４μモルの結合アデニンを含有する重合体担体100mgを
下記の試薬で順に処理する。
ａ）ニトロメタン、 ｂ）水１％を含有するニトロメタン中の飽和臭化亜鉛溶
液、 ｃ）メタノール、 ｄ）テトラヒドロフラン、 ｅ）アセトニトリル、 ｆ）無水アセトニトリル1ml中の相当するヌクレオシド
ホスフアイト80μモルおよびテトラゾール400μモル
（５分間）、 ｇ）ルチジン40％およびジメチルアミノピリジン10％を
含有するテトラヒドロフラン中の20％無水酢酸（２分
間）、 ｈ）テトラヒドロフラン、 ｉ）水20％およびルチジン40％を含有するテトラヒドロ
フラン、 ｊ）コリジン／水／テトラヒドロフラン（容量比5:4:
1）中の３％ヨード、 ｋ）テトラヒドロフラン、および ｌ）メタノール。
「ホスフアイト」はここではデオキシリボース−３′−
モノ亜燐酸−モノメチルエステルであると理解されるべ
きで、ここで第３番目の結合手は塩素または第三アミノ
基例えばモルホリノ残基により飽和されている。個々の
合成段階の収量はそれぞれ脱トリチル化反応（ｂ）後に
波長496nmでのジメトキシトリチル陽イオンの吸収を測
定することにより分光測定されうる。
オリゴヌクレオチドの合成完了後、オリゴマーのメチル
ホスフエート保護基をｐ−チオクレゾールおよびトリエ
チルアミンを用いて除去する。次にアンモニアで３時間
処理することによりオリゴヌクレオチドを固体担体から
除く。オリゴマーを濃アンモニアで２〜３日間処理する
ことにより塩基のアミノ保護基が定量的に除去される。
かくして得られた粗生成物を高圧液体クロマトグラフイ
ー（HPLC）またはポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り精製する。
残りの遺伝子構成単位I b〜II gも全く相当する方法で
合成され、そのヌクレオチド順列はDNA配列IIIから明ら
かである。
例２ 一本鎖オリゴヌクレオチドの遺伝子断片Ｉおよび
IIへの酵素的結合 ５′−末端でオリゴヌクレオチドをホスホリル化するた
めにオリゴヌクレオチドI aおよびI bの各1nモルずつ
を、50mMトリス−HCl緩衝液（pH7.6）20μ中の４単位
のT4−ポリヌクレオチドキナーゼを有するアデノシン三
燐酸5nモル、塩化マグネシウム10mMおよびジチオトレイ
トール（DTT）10mMで37℃、30分間処理する〔C.C.Richa
rdson氏「Progress in Nucl.Acids Res.」第２巻第825
頁（1972年）参照〕。この酵素を95℃に５分間加熱する
ことにより不活性化させる。次に、オリグヌクレオチド
I aおよびI bを水溶液中95℃に２分間加熱しそして次に
５℃までゆつくり冷却することにより相互に交雑させ
る。
同様にしてオリゴヌクレオチドI cおよびI dならびにI
eおよびI fをホスホリル化しそして１対ずつ交雑させ
る。
遺伝子断片IIにはオリグヌクレオチドII aをII bと、な
らびにII fをII gと対をなして交雑させそして残るオリ
ゴヌクレオチドII c、II dおよびII eを一緒にして交雑
させる。
かくして得られた遺伝子断片Ｉのための３種のオリゴヌ
クレオチド対または断片IIのための２種のオリゴヌクレ
オチド対およびオリゴヌクレオチドトリプレットを以下
のようにして連結させる。
二本鎖ヌクレオチドを合してそして50mMトリス−HCl緩
衝液、20mMマグネシウムおよび10mM DTTそれぞれ40μ
ずつ中T4DNAリガーゼ100単位を用い15℃で16時間かかつ
て連結させる。
遺伝子断片ＩおよびIIの精製は15％ポリアクリルアミド
ゲル上のゲル電気泳動により遂行され（尿素添加せず、
20×40cm、厚さ1m）、その際Hinf Iで切断されたφX174
DNA（BRL社）が標識物質として用いられる。
例３ 遺伝子断片ＩおよびIIを含有する雑種プラスミド
の調製 ａ） pBR322への遺伝子断片Ｉの組込み 商業上のプラスミドpBR322を既知方法で制限エンドヌク
レアーゼEcoR IおよびPst Iを用いて製造者の指示に従
い開環させる。消化混合物を５％ポリアクリルアミドゲ
ル上の電気泳動により既知方法で分離しそして断片をエ
チジウムブロマイドで染色することによるかまたは放射
性標識（Maniatis氏「Nick−Translation」参照、前記
引用文献）により可視化する。次にプラスミドバンドを
アクリルアミドゲルから切断しそしてポリアクリルアミ
ドから電気泳動により分離する。
次にプロスミド１μｇを遺伝子断片I 10ngと16℃で一夜
連結させる。第１図に示される雑種プラスミドが得られ
る。
ｂ） pUC8への遺伝子断片IIの組込み 前記ａ）と同様にして商業上のプラスミドpUC8をPst I
およびSal Iで切断しそして遺伝子断片IIと連結させ
る。第２図に示される雑種プラスミドが得られる。
ｃ）修飾された遺伝子断片の組込み 塩基ｂ）に相当して修飾された遺伝子断片IIが組み込ま
れ、その場合ヌクレオチド三重項No.27中にDNA配列IIに
対応してロイシンのコドンが挿入される。この修飾され
た遺伝子断片IIは相当して変形された遺伝子構成単位II
aおよびII bの合成により得られ、その場合構成単位II
aにおいては配列ATGがCTGによりそして相当して遺伝子
構成単位II bにおいては配列TACがGACにより置換され
る。
例４ 完全な遺伝子の合成 ａ） 形質転換および増殖（Amplification） かくして得られた雑種プラスミドを大腸菌中に形質転換
させる。このためには大腸菌K12株を70mM塩化カルシウ
ム溶液で処理することによりコンピーテントとなしそし
て10mMトリス−HCl緩衝液（pH7.5）または70mM塩化カル
シウム溶液中の雑種プラスミドの懸濁液を加える。形質
転換された株は通常の方法と同じくプラスミドよりもた
らされた抗生物質抵抗性または感受性を用いて選択しそ
して雑種ベクターを増殖させる。細胞を殺菌後に雑種プ
ラスミドを単離し、最初に用いられた制限酵素を用いて
切断しそして遺伝子断片ＩおよびIIをゲル電気泳動によ
り単離する。
ｂ）遺伝子断片の連結 増殖により得られた遺伝子断片I aおよびI bを例２に記
載されるようにして酵素的に連結させそしてかくして得
られたDNA配列Ｉを有する合成遺伝子クローニングベク
ター中に導入する。
例５ 完全な遺伝子を含有する雑種プラスミドの合成 ａ） pKK177.3中への組込み 表現プラスミドpKK177.3〔プラスミドptac11、Amman氏
他「Gene」1983年第167〜178頁参照、そこではSal I切
断部位を含有する配列がEcoR I認識部位中に合成的に組
み込まれた〕を制限酵素EcoR IおよびSal Iを用いて開
環させそしてDNA配列Ｉに相当する合成遺伝子と連結さ
せる。その際導入された遺伝子がプラズミドpKK177.3の
調節領域（regulations region）のうしろに置かれる。
イソプロピル−β−チオガラクト−ピラノシド（IPTG）
のような適当なインダクター（Inducer）の添加後にmRN
Aが形成され、これがポリペプチドMet−GRF−Glyの発現
を生ずる。
ｂ） pWH1中への組込み 表現プラスミドpWH1はpBR322部分およびその調節領域を
有するβ−ガラクトシダーゼのための遺伝子からなる
（第３図）。その調製にはpBR322 10μｇを制限エンド
ヌクレアーゼEcoR IおよびPvu IIで切断してそして５％
ポリアクリルアミドゲル中電気泳動により分離する。エ
チジウムブロマイドを用い（または放射性標識化によ
り）DNAバンドを可視化した後大きい方のバンド（2292
塩基対）をゲルから切り取りそして電気的溶離によりポ
リアクリルアミドから取り出すλまたはφ80dlacのよう
なLac−形質導入性フアージからEcoR Iを用いる消化お
よびPvu IIを用いる部分消化によりβ−ガラクトシダー
ゼのための遺伝子を解裂させる。前記後処理と同様にし
て大約3185ヌクレオチド対の断片を単離する。この断片
はLac−オペロンの完全な調節領域およびアミノ酸１〜1
005を有するβ−ガラクトシダーゼの遺伝情報を担持す
る。このLac−DNA断片をプラスミドpBR322からのDNA断
片中に連結することによりLac−オペロンの調節領域、
β−ガラクトシダーゼのコード化配列（アミノ酸１〜10
05）、pBR322のアンピシリン抵抗性およびpBR322の複製
領域を有するプラスミドpWH1が得られる。その場合Lac
−オペロンの天然の調節領域は例えばtacのような任意
の合成調節領域により置換されうる。このプラスミドは
β−ガラクトシダーゼのアミノ酸1005において１個のEc
oR I切断部位を含有し、これは成熟核遺伝子のためのク
ローニング部位として利用されうる。
DNA配列Ｉには制限酵素Sal IおよびEcoR Iの認識配列を
含有する化学的に合成されたリンカーが連結される。
５′−TCGACGCCCG GCGGGCTTAA−５′ EcoR Iを用いる制限酵素の消化後にEcoR I認識配列で側
面を破られたDNA断片が得られる。次にかかる断片はEco
R Iで開裂されたプラスミドpWH1中にとり込まれうる。
このためにはpWH1をEcoR Iで開裂させそして細菌性アル
カリホスフアターゼを用いEcoR I切断部位の５′−末端
で脱ホスホリル化する。これによりプラスミドそれ自体
との連結が阻止されそして組換えてないプラスミドを有
する形質転換された細菌培養液の「背景」を大いに低下
させる。側面を破られたEcoR I認識配列を有する遺伝子
断片をとり込まれて有するプラスミドのみが環状に閉鎖
されうる。
例６ 雑種プラスミトの形質転換 コンピーテントな大腸菌細胞をGRF遺伝子10μｇと連結
されたプラスミドpWH10.1〜１μｇを用いて形質転換
し、そしてアンピシリン寒天プレート上に拡げる。次に
GRF遺伝子のとり込みおよびプラスミド中におけるその
とり込み方法がDNA迅速処理により測定されうる。
例７ 発現 この雑種プラスミドを大腸菌中に形質転換後Met−GRF配
列のアミノ末端にβ−ガラクトシダーゼの1005個のアミ
ノ酸を担持する融合蛋白質が発現される。ブロムシアン
分解後GRF−Gly誘導体が得られる。
これと同様にして修飾されたGRF蛋白質例えばアミノ酸N
o.27としてメチオニンの代りにロイシンが存在する生成
物が得られる。
例８ 後処理および精製 所望の光学濃度まで培養された細菌菌株に適当な誘導物
質（Inductor）例えばIPTGを用いて充分に長く例えば２
時間誘導する。続いて細胞を0.1％クレゾールおよび0.1
mMフエニルメチルスルホニルフルオライド（ベンジルス
ルホニルフルオライド）を用いて殺す。遠心分離または
過したのち細胞塊を適当な装置（French−Presseまた
はDnyo−Ｍhle ）中酸性水溶液中pH3.0で温浸し、次
に不要の成分を去する。上澄液からGillemin（前出）
氏の方法により蛋白質を単離する。HPLC分析により生成
物の富化および精製を検査する。
メチオニン（または融合蛋白質においてはβ−ガラクト
シダーゼのようなメチオニンに結合した細菌蛋白質部分
を含む）ブロムシアン分解により分離しそしてGRF誘導
体を酸性条件下抽出してそして精製する（Gillemin氏
他、前出）。
β−カラクトシダーゼ部分を有する融合蛋白質は溶解さ
れた細菌の粗抽出物中においてすでにゲル電気泳動にお
ける真正β−ガラクトシダーゼとは異なるその走行挙動
に基き検出されうる。プロムシアン分解後、前記したよ
うにGRF誘導体およびその変異体の純度等級および富化
はHPLCにより測定される。
生成物のGRF活性についての特性化は免疫学的および生
物学的に遂行される。
放射線免疫検定においては細菌学的に調製されたGRFお
よびその変異体をアミノ酸配列１〜44を有する合成GRF
に体する抗体と反応させる。放射線免疫検定は合目的的
には抗GRF−抗体および抗IgG−抗GRF−抗体を有する間
接的免疫沈殿検定として設定される。RIAの感度はGRF10
ngである。
生物学的試験においては細菌学的に調製された生成物お
よびその変異体をラツトにおける成長ホルモン放出につ
いて試験する。このためには麻酔されたラツトに生成物
またはその変異体を静脈投与してラツトの血液における
成長ホルモンの放出を放射線免疫学的に検出する。
【図面の簡単な説明】
第１図はpBR322中に遺伝子断片Ｉが組込まれた雑種プラ
スミドを示し、第２図はpUC8中に遺伝子断片IIが組込ま
れた雑種プラスミドを示し、そして第３図は発現プラス
ミドpWH1を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ヴオルフガング・ケーニヒ ドイツ連邦共和国デー―6238ホフハイム・ アム・タウヌス．エプシユタイナーシユト ラーセ25 (72)発明者 フーベルト・ミユルナー ドイツ連邦共和国デー―6233ケルクハイム ／タウヌス．ペスタロツイシユトラーセ４ (72)発明者 オイゲーン・ウールマン ドイツ連邦共和国デー―6240ケーニヒシユ タイン／タウヌス．フクスタンツシユトラ ーセ16 (72)発明者 ヴアルデマル・ヴエテカム ドイツ連邦共和国デー―6239エプシユタイ ン／タウヌス．ツアイルリング40／イー (56)参考文献 Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．218，Ｐ．585 〜587（1982) Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．298，Ｐ．686〜 688（1982) ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ，Ｖｏｌ. 152，Ｎｏ．２，Ｐ．277〜281（1983)

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式Ｉ Ｙ−Ｒ−NH2 （Ｉ） 〔式中Ｙはメチオニン残基またはメチオニンを介して結
    合した細菌蛋白質残基であり、そしてＲは成長ホルモン
    放出因子（GRF）のアミノ酸配列の第１番目から第ｎ番
    目（ｎは16〜44を表す）までのアミノ酸のアミノ酸配列
    またはその配列の修飾物を表す〕 を有するポリペプチドを調製するに当たり、式II Ｙ−Ｒ−NH−CH2−COOH （II） （式中ＹおよびＲは前述した意味を有する） を有するポリペプチドを遺伝子工学的に産生させ、そし
    てこの生成物（II）を酵素的に式Ｉのポリペプチドに変
    換することを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】ペプチド配列がメチオニンを含まない特許
    請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】成長ホルモン放出因子のアミノ酸配列の修
    飾物がGRFの27−位のMetがLeuで置換されたものである
    ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
  4. 【請求項４】式IIのポリペプチドの遺伝子工学的生産に
    おいて、グリシンをコードするトリプレットのうしろに
    ２個のストップ−コドンが備えられていることを特徴と
    する特許請求の範囲第１〜３項のいずれかの項に記載の
    方法。
  5. 【請求項５】式III Ｈ−Ｒ−NH2 （III） 〔式中Ｒは成長ホルモン放出因子（GRF）のアミノ酸配
    列の第１番目から第ｎ番目（ｎは16〜44を表す）までの
    アミノ酸のアミノ酸配列のメチオニンを含まない修飾物
    を表す〕 を有するポリペプチドを調製するに当たり、式II Ｙ−Ｒ−NH−CH2−COOH （II） （式中Ｙはメチオニン残基またはメチオニンを介して結
    合した細菌蛋白質残基であり、Ｒは前述した意味を有す
    る） を有するポリペプチドを遺伝子工学的に産生させ、そし
    てこの生成物（II）を酵素的に変換して式Ｉ Ｙ−Ｒ−NH2 （Ｉ） （式中ＹおよびＲは前述した意味を有する） を有するポリペプチドを調製し、次いでこの生成物
    （Ｉ）から残基Ｙをブロムシアン分解により除去するこ
    とを特徴とする方法。
  6. 【請求項６】成長ホルモン放出因子のアミノ酸配列の修
    飾物がGRFの27−位のMetがLeuで置換されたものである
    ことを特徴とする特許請求の範囲第５項記載の方法。
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