DK166681B1 - Dna-sekvenser, dna-sekvenser og dna-oligonucleotider til brug ved fremstilling af de foerstnaevnte dna-sekvenser, hybridplasmider indeholdende dna-sekvens, vaertsceller indeholdende hybridplasmiderne samt genteknologisk fremgangsmaade til fremstilling af il-2 - Google Patents
Dna-sekvenser, dna-sekvenser og dna-oligonucleotider til brug ved fremstilling af de foerstnaevnte dna-sekvenser, hybridplasmider indeholdende dna-sekvens, vaertsceller indeholdende hybridplasmiderne samt genteknologisk fremgangsmaade til fremstilling af il-2 Download PDFInfo
- Publication number
- DK166681B1 DK166681B1 DK237985A DK237985A DK166681B1 DK 166681 B1 DK166681 B1 DK 166681B1 DK 237985 A DK237985 A DK 237985A DK 237985 A DK237985 A DK 237985A DK 166681 B1 DK166681 B1 DK 166681B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- dna
- dna sequence
- sequences
- ctg
- sequence
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 54
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims abstract description 51
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims description 16
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims abstract description 6
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 25
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 24
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 21
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 20
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 10
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 8
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 claims description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 19
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 12
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 9
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethylpyridine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=N1 OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- LYGJENNIWJXYER-UHFFFAOYSA-N nitromethane Chemical compound C[N+]([O-])=O LYGJENNIWJXYER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 2
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical compound OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- -1 succinoyl group Chemical group 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BWZVCCNYKMEVEX-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-Trimethylpyridine Chemical compound CC1=CC(C)=NC(C)=C1 BWZVCCNYKMEVEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 2-methylphenol;3-methylphenol;4-methylphenol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1.CC1=CC=CC(O)=C1.CC1=CC=CC=C1O QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940082584 3-(triethoxysilyl)propylamine Drugs 0.000 description 1
- WLHCBQAPPJAULW-UHFFFAOYSA-N 4-methylbenzenethiol Chemical compound CC1=CC=C(S)C=C1 WLHCBQAPPJAULW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- LSMDIAAALJJLRO-XQXXSGGOSA-N Ala-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O LSMDIAAALJJLRO-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 1
- OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N Arg-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N Arg-Pro Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- CQMQJWRCRQSBAF-BPUTZDHNSA-N Asn-Arg-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N CQMQJWRCRQSBAF-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- GADKFYNESXNRLC-WDSKDSINSA-N Asn-Pro Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O GADKFYNESXNRLC-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- XDGBFDYXZCMYEX-NUMRIWBASA-N Asp-Glu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O XDGBFDYXZCMYEX-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLLSMEFANRROJE-GUBZILKMSA-N Cys-Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N XLLSMEFANRROJE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QNJNPKSWAHPYGI-JYJNAYRXSA-N Glu-Phe-Leu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QNJNPKSWAHPYGI-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- HVKAAUOFFTUSAA-XDTLVQLUSA-N Glu-Tyr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HVKAAUOFFTUSAA-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 1
- VIPDPMHGICREIS-GVXVVHGQSA-N Glu-Val-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O VIPDPMHGICREIS-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- DGKBSGNCMCLDSL-BYULHYEWSA-N Gly-Ile-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)CN DGKBSGNCMCLDSL-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIHJTGSVGIPHIW-QSFUFRPTSA-N Ile-Asn-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N QIHJTGSVGIPHIW-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 1
- TWYOYAKMLHWMOJ-ZPFDUUQYSA-N Ile-Leu-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O TWYOYAKMLHWMOJ-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- JODPUDMBQBIWCK-GHCJXIJMSA-N Ile-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JODPUDMBQBIWCK-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- LVTJJOJKDCVZGP-QWRGUYRKSA-N Leu-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O LVTJJOJKDCVZGP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- REPBGZHJKYWFMJ-KKUMJFAQSA-N Leu-Lys-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N REPBGZHJKYWFMJ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- ZDJQVSIPFLMNOX-RHYQMDGZSA-N Leu-Thr-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N ZDJQVSIPFLMNOX-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- ODRREERHVHMIPT-OEAJRASXSA-N Leu-Thr-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ODRREERHVHMIPT-OEAJRASXSA-N 0.000 description 1
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Chemical group C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091081548 Palindromic sequence Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- VADLTGVIOIOKGM-BZSNNMDCSA-N Phe-His-Leu Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CN=CN1 VADLTGVIOIOKGM-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- VHDNDCPMHQMXIR-IHRRRGAJSA-N Phe-Met-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 VHDNDCPMHQMXIR-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- FSXRLASFHBWESK-HOTGVXAUSA-N Phe-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- HFNPOYOKIPGAEI-SRVKXCTJSA-N Pro-Leu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 HFNPOYOKIPGAEI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- GZBKRJVCRMZAST-XKBZYTNZSA-N Ser-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GZBKRJVCRMZAST-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 1
- HBTCFCHYALPXME-HTFCKZLJSA-N Ser-Ile-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O HBTCFCHYALPXME-HTFCKZLJSA-N 0.000 description 1
- HDBOEVPDIDDEPC-CIUDSAMLSA-N Ser-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HDBOEVPDIDDEPC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- NADLKBTYNKUJEP-KATARQTJSA-N Ser-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NADLKBTYNKUJEP-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- PCJLFYBAQZQOFE-KATARQTJSA-N Ser-Thr-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O PCJLFYBAQZQOFE-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- 229910002808 Si–O–Si Inorganic materials 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- XYFISNXATOERFZ-OSUNSFLBSA-N Thr-Ile-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N XYFISNXATOERFZ-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 1
- UGFSAPWZBROURT-IXOXFDKPSA-N Thr-Phe-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O UGFSAPWZBROURT-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 1
- WPSKTVVMQCXPRO-BWBBJGPYSA-N Thr-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WPSKTVVMQCXPRO-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LYERIXUFCYVFFX-GVXVVHGQSA-N Val-Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N LYERIXUFCYVFFX-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 1
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229930003836 cresol Natural products 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000006642 detritylation reaction Methods 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N dimethylpyridine Natural products CC1=CC=CN=C1C HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 125000001041 indolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000002073 methionyl group Chemical group 0.000 description 1
- CAAULPUQFIIOTL-UHFFFAOYSA-N methyl dihydrogen phosphate Chemical group COP(O)(O)=O CAAULPUQFIIOTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZHCAAFJSYLFLPX-UHFFFAOYSA-N nitrocyclohexatriene Chemical group [O-][N+](=O)C1=CC=C=C[CH]1 ZHCAAFJSYLFLPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 125000006308 propyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012958 reprocessing Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001302 tertiary amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000002268 wool Anatomy 0.000 description 1
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 1
- VNDYJBBGRKZCSX-UHFFFAOYSA-L zinc bromide Chemical class Br[Zn]Br VNDYJBBGRKZCSX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
DK 166681 B1
Den foreliggende opfindelse angår en DNA-sekvens I med nucleotiderne 9-407 (aminosyrerne 1-133) som vist i tabel I, der koder for et protein med den biologiske aktivitet af humant interleukin-2 (IL-2), en DNA-sekvens I 5 med nucleotiderne 6-407 (aminosyrerne 0-133) som vist i tabel I, efterfulgt af ét eller to stopcodon(er) og kodende for et protein med den biologiske aktivitet af humant interleukin-2 (IL-2), DNA-sekvenser Ila (IL-2-1), lib (IL-2-2-II), Ile (IL-2-III) og Ild (IL-2-IV) som vist i tabel II til 10 brug ved fremstilling af de to førstnævnte DNA-sekvenser I, DNA-oligonucleotider Ia-IVj som vist i tabel II til brug ved fremstilling af de to førstnævnte DNA-sekvenser I, hy-bridplasmider, der mellem et EcoRl- og et SalI-overskæringssted indeholder DNA-sekvensen I som vist i tabel I, hybrid-15 plasmider, der indeholder DNA-sekvensen I (nucleotiderne 6-407) som vist i tabel I, værtsceller, især E.coli, der indeholder hybridplasmiderne, samt en genteknologisk fremgangsmåde til fremstilling af interleukin-2, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at den omfatter anvendelse 20 af et syntetisk gen, der indeholder DNA-sekvensen I (nucleotiderne 9-407 svarende til aminosyrerne 1-133) som vist i tabel I.
Humant interleukin-2, i det følgende kaldet IL-2, er et polypeptid bestående af 133 aminosyrer. Humant IL-2*s 25 DNA-sekvens samt den genteknologiske syntese deraf findes beskrevet i EP offentliggørelsesskrift nr. 0.091.539 (amino-syresekvensen II i fig. 2b). Til grund for denne syntese ligger et fra pattedyreceller isoleret mRNA, som overføres til cDNA, indbygges i vektorer og bringes til ekspression i 30 værtsceller, bl.a. også E.coli.
Bakterier, især E.coli, er af en lang række grunde foretrukne værtsceller til genteknologisk produktion af polypeptider. Gener af eukaryotiske celler, som - således som det er beskrevet i ovennævnte offentliggørelsesskrift -35 fås ved omvendt transcriptase ud fra mRNA, udtrykkes ofte efter indbygning i plasmider og transformation i bakterier 2 DK 166681 B1
Jam utilfredsstillende. Opfindelsen angår derfor en syntetisk DNA-sekvens, som koder for IL-2, og som særligt gunstigt i E.coli fører til ekspression af et polypeptid med IL-2-ak-tivitet. Endvidere angår opfindelsen sådanne"'DNA-sekvenser, 5 som hybridiserer mod den syntetiske DNA-sekvens, og som afledes ud fra denne ved enkelte eller flere substitutioner, udeladelser eller indsætninger af baser. Ombytningen, indsætningen eller udeladelsen af codoner eller en kombination deraf fører til peptider med en eller flere udskiftede ami-10 nosyre(r) eller til længere eller kortere IL-2-derivater.
Disse polypeptider med IL-2's biologiske eller immunologiske aktivitet kan med hensyn til egenskaber være således forandret, at peptidets stabilitet forøges, polypeptidets lipofili er ændret til fordel for en bedre opløselighed, anvendelsen 15 som lægemiddel lettes, eller den biologiske aktivitet er forøget.
Den genetiske kode er som bekendt specialiseret, dvs. at kun en eneste nucleotid-sekvens koder for to aminosyrer, medens de øvrige 18 genetisk indkodelige aminosyrer 20 skal grupperes med 2-6 tripletter. Værtscellerne af de forskellige arter gør clog ikke altid samme brug af de herved givne variationsmuligheder. Til syntense af generne findes der derfor en uoverskuelig mangfoldighed af codon- muligheder.
25
Det har nu vist sig, at DNA-sekvensen I nedenfor DK 166681 B1 3
DNA- Sekvens I
Tabel I
Triplet'nr. O 12
Aminosyre Met Ala Pro
Nucleotid Nr. 1 10
Kodende streng 5’ AA TTC ATG GCG CCG
Ikke-kodende streng_V_G TAC CGC GGC
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu 20 30 40
ACC TCT TCT TCT ACC AAA AAG ACT CAA CTG
TG G AGA AGA AGA TG G TTT TTC TG A GTT GAC
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Gin Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gin 50 60 70
CAA CTG GAA CAC CTG CTG CTG GAC CTG CAG
GTT GAC CTT GTG GAC GAC GAC CTG GAC GTC
23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 80 90 100
ATG ATC CTG AAC GGT ATC AAC AAC TAC AAA
TAC TAG GAC TTG CCA TAG TTG TTG ATG TTT
33 34 35 36 37 38 39 40 41 42
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe 110 120 130
AAC CCG AAA CTG ACG CGT ATG CTG ACC TTC
TTG GGC TTT GAC TG C GCA TAC GAC TGG AAG
4 DK 166681 B1 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52
Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu 140 150 160
AAA TT C TAC ATG CCG AAA AAA GCT ACC GAA
TTT AA G ATG TAC GGC TTT TTT CGA TG G CTT
53 54 55 56 57 58 59 60 61 62
Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu Glu Glu 170 l80 190
CTG AAA CAC CTC CAG TGT CTA GAA GAA GAG
GAC TTT GTG GAG GTC ACA GAT CTT CTT CTC
63 64 65 66 67 68 69 70 71 72
Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu 200 210 220
CTG AAA CCG CTG GAG GAA G TT CTG AAC CTG
GAC TTT GGC GAC CTC CTT C AA GAC TTG GAC
73 74 75 76 77 78 79 80 81 82
Ala Gin Ser Lys Asn Phe His Leu ' Arg Pro 230 240 250
GCT CAG TCT AAA AAT TTC CAC CTG CGT CCG
CGA GTC AGA TTT TTA AAG GTG GAC GCA GGC
83 84 85 86 ' 87 88 89 90 91 92
Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 260 270 280
CGT GAC CTG ATC TCT AAC ATC AAC GTT ATC
GCA CTG GAC TAG AGA TTG TAG TTG CAA TAG
93 94 95 96 97 98 99 100 101 102
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr 290 300 310
GTT CTG GAG CTC AAA GGT TCT GAA ACC ACG
CAA GAC CTC GAG TTT CCA AGA CTT TGG TG C
DK 166681 B1 5 103 104 105 106 107 108 109 HO 111 112
Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 320 330 340
TTC ATG TGC GAA TAC GCG GAC GAA ACT GCG
AAG TAC ACG CTT ATG CGC CTG CTT TGA CGC
113 114 115 116 117 118 119 120 121 122
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp lie 350 360 370
ACG ATC GTT GAA TTT CTG AAC CGT TGG ATC
TGC TAG CAA CTT AAA GAC TTG GCA ACC TAG
123 124 125 126 127 128 129 130 131 132
Thr Phe Cys Gin Ser Ile Ile Ser Thr Leu 380 390 400
ACC TTC TGC CAG TCG ATC ATC TCT ACC CTG
TGG AAG ACG GTC AGC TAG TAG AGA TGG GAC
133 134 135
Thr 410 ACC TGA TAG 3’ TGG ACT ATC AGC T 51 o 6 DK 166681 B1 som koder for hele aminosyresekvensen 1-133 i IL-2, samt de til syntese af sekvens I anvendte DNA-delsekvenser Ila (IL 2-1) til Ild (IL-2-IV)
Tabel II
5 DNA-Sekvens II
Sekvens Ha (IL 2-1) *-la-.-
Nucleotid Nr. 1 10
Kodende streng 51 AA TTC ATG GCG CCG
10 Ikke kodende strena 3’ G TAC CGC GGC
_Eco RI «-Ib — .....................
--Ic-► 20 30 40 ACC TCT TCT TCT ACC AAA AAG ACT C AA C13_
15 TGG AG A AG A AGA TG G TTT TTC TG A GTT GAC
- --* + Id- ~ -Ie-
50 60 70 CAA CTG GAA CAC CTG CTG CTG GAC CTG CA
20 GTT GAC CTT GTG GAC GAC GAC CTG G PstI
1 » « ...........— If ' '"**_ DNA-Sekvens Ilb (IL 2-II) *-Ha---- -
80 90 100 25 PstI G ATG ATC CTG AAC GGT ATC AAC AAC TAC AAA
A C GTC TAC TAG GAC TTG CCA TAG TTG TTG ATG TTT
-Ilb — ' - ♦ « - Ild- —-Ile--♦-Ile-— 110 120 130
30 AAC CCG AAA CTG ACG CGT ATG CTG ACC TTC
TTG GGC TTT GAC TGC GCA TAC GAC TGG AAG
- I-Id ♦ 1 Ilf 35 DK 166681 B1 7
Ile'-* *-Hg-- 140 150 160
AAA TTC TAC ATG CCG AAA AAA ...GCT ACC GAA
TTT AAG ATG TAC GGC TTT TTT CG A TG G CTT I
........» -----------------------------Ilh· " I
........ > -*—III 1 - -> 170 180 CTG AA A CAC CTC CAG TGT Xbal
IgAC TTT GTG GAG GTC ACA GAT C
+---------- , II.1 — ------------------------------o_ DNA-Sekvens Ile (IL 2-III) — Illa- 190
CTA GAA GAA GAG
TT CTT CTC
_Xba I _Hib — -- IIIc--!► **- Ille 200 210 220
CTG AAA CCG CTG GAG GAA GTT CTG AAC CTG
GAC TTT GGC GAG CTC CTT CAA GAC TTGGAc]
- Hib ---* ^ Uld ~ ^ I
--^ -Illg--- *- 230 ’ 240 250
GCT CAG TCT AAA AAT TTC CAC CTG CGT CCG
CGA GTC AGA TTT TTA AAG GTG GAC GCA GGC
........— — Ulf................. .....— Illh- .- Illi-► *-Ulk— 260 270 280
CGT GAC CTG ATC TCT AAC A TC AAC GTT ATC
GCA CTG GAC TAG AGA TTG TAG TTG CAA TAG
--------- —^111,1. .....-......—» * 8 DK 166681 B1
Illk.....- r 290
GTT CTG GAG CT
CAA GAC C Sac I
mi _ ._ DNA-Sekvens II d (IL 2-IV) -IVa--- 300 310
Sac I C AAA GGT TCT GAA ACC ACG L
TC GAG TTT CCA AGA CTT TGG TGC
<o - ,. — .....- IV b - - ------- **-IVc'-* 4- 320 330 3^0
TTC ATG TGC GAA TAC GCG GAC GAA ACT GCG
AAG TAC ACG CTT ATG CGC CTG CTT TG A CGC
- .IVd- - — - ......." -IVe-—* -IVg 350 360 370
ACG ATC GTT G AA TTT CTG AAC CGT TGG ATC
3 C TAG C AA CTT AAA GAC TTG GCA ACC TAG
* ---ivr r -IVg-► *a- IVi- 380 390 400
ACC TTC TG C CAG TCG ATC ATC TCT ACC CTG
TGG AAG ACG GTC AGC TAG TAG AGA TGG GAC
- IVh - »» *- IV ,1 — IVi-^ 410 ACC TGA TAG Sal I 3’ TGG ACT ATC AGC T 5’ iv j »_
O
9 DK 166681 B1 er særlig fordelagtige til genteknologisk syntese af IL-2.
På 5'-endén på DNA-sekvens I's indkodende streng findes en udragende DNA-sekvens, f.eks. svarende til restrik-tionsendonuclease Eco RI, på 3'-enden på den indkodende 5 streng derimod en anden enkeltstrenget udragende sekvens, f.eks. svarende til restriktionsenzymet Sal I. Disse to forskellige genkendelsessekvenser sørger for indsætning af DNA'et i plasmider i den ønskede orientering. Naturligvis kan der også vælges andre udragende sekvenser, som 10 svarer til snitstederne i den planlagte vektor.
Disse genkendelsessekvenser tillader ikke blot reisolering af DNA'et ud fra en vektor ved snit med de tilsvarende enzymer, f.eks. Eco RI og Sall, men også talrige modifikationer af DNA'et såsom fjernelse af enkeltstren-15 gede områder, f.eks, med Mung-Bean-nuclease, fuldstændig eller delvis påfyldning på de kortere ender, f.eks. med Kleenow-polymerase, eller tilføjelse af egnede adaptere eller forbindelsesstykker. Der overlappende ender er derfor overordentlig fordelagtige for indbygning af 20 DNA'et ifølge opfindelsen i ekspressionsvektorer.
Mellem disse genkendelsessekvenser og codonerne for aminosyrerækkefølgen findes på 5'-enden af den indkodende streng codonet for aminosyren methionin (som i DNA-sekvens I er betegnet med 0). Alternativt hertil kan 25 der være en præsekvens (også kaldet signal- eller ledersekvens) i et bakterielt eller på anden måde som vært egnet protein [oversigtsartikel: Perlman og Halvorson, J. Mol. Biol. 167. 391 (1983)], som forårsager udskillelsen af det ønskede polypeptid ud fra cytoplasmaet og 30 ved denne udskillelsesproces fraspaltes fra eh i værtscellen naturligt forekommende signal-peptidase. På enden af den indkodende streng følger så på den for threo-nin indkodende triplet 133 en eller fortrinsvis to stop--triplet(ter). Ovenfor er DNA-sekvensen I, som om-35 fatter nucleotiderne 9-407 (aminosyrer 1-133) , vist i sammenhæng med nucleotidsekvensen 1-8 (udragende sekvens ifølge
O
10 DK 166681 B1
Eco RI og Mst-codon) og to stopcodoner (nucleotiderne 408 til 413) samt den udragende sekvens ifølge Sall. De to stopcodoner indgår i en foretrukken udførelsesfonn for opfindelsen. De sørger for, at selv ved høj proteinsynte-5 serate afskæres molekylerne ved den ønskede ende^ og at der ikke dannes "fusionsproteiner".
Tre interne specifikke snitsteder for restriktionsenzymerne Pst I, Xba I og Sac I (nucleotider 60-74, 182-187 og 291-296 på den indkodende streng i DNA-sekvens 10 i) tillader subkloningen af fire genfragmenter IL 2-1 til IL 2-IV, som kan indbygges i vel undersøgte kloningsvek-torer, såsom f.eks. pUC 12. Desuden indbygges inden for strukturgenet en række yderligere specifikke genkendelsesekvenser for restriktionsenzymer, som på den ene side 15 giver adgang for delsekvenser af IL-2 og på den anden side tillader, at der foretages variationer: 1. nucleotids stilling
Restriktions- Genkendelses- i genkendelsessekvens enzym_sekvens_(indkodende streng) 20 5« 3»
Aha II GGCGCC 8
Ava II GGACC 65
Ban I GGCGCC 8
Ban II GAGCTC 291 25 Bbv I GCTGC 59
Bst NI CCTGG 221
Dde I CTCAG 226
Pnu 4HI GCTGC 59
Hae II GGCGCC 8 30 Hha I GCGC 9
Hinf I GACTC 35
Hph I TCACC 373
Mlu I ACGCGT 117
Nar I GGCGCC 8 35 Pvu I CGATCG 346
Sau 96 I GGACC 65
Ser PI CCTGG 221 o 11 DK 166681 B1 DNA-Sekvensen I kan opbygges af 38 oligonucleo-tider med forskellig længde (jfr. DNA-sekvens II), idet disse først syntetiseres kemisk og derpå via klæbrige ender på 4-9 nucleotider sammenknyttes enzymatisk.
5 For DNA-sekvensen I's vedkommende tages der end videre hensyn til, at hos de aminosyrer, der kan tilord-nes flere codoner, er disse ikke ligeværdige, men vil tværtimod i i den pågældende værtscelle, såsom E.coli,udvise forskellige præferencer. Desuden reduce-10 res palindromiske sekvenser til det mindst mulige.
Genstrukturen i DNA-sekvensen I er derfor let tilgængelig ud fra relativt små byggesten, tillader sub-kloning af fire genfragmenter i velkendte vektorer og tillader disses kombination til et samlet gen. De spe-15 cifikke genkendelsessekvenser for restriktionsenzymer letter overordenligt dannelsen af forlængelser, ændringer og forkortelser af proteinmolekylet.
Forlængelser fås efter omsætning med det pågældende restriktionsenzym ved tilføjelse af egnede, kemisk 20 syntetiserede DNA-molekyler. Ændringer fås ved udskæring af enkelte afsnit af DNA'et med egnede restriktionsenzymer og erstatning med andre kemisk udvundne DNA-sekven-ser. Forkortelser kan fås efter spaltning med det pågældende restriktionsenzym ved omsætning med nucleaser.
25 Den biologiske aktivitet af de forlængede, æn drede eller forkortede molekyler kan afprøves i et biologisk testsystem, f.eks. ved induktion af cellevækst i en T-celle-population, som til formering er stærkt afhængig af tilstedeværelsen i mediet af IL-2.
30 Indbygningen af de syntetiske gener eller gen fragmenter i kloningsvektorer, f.eks. de på markedet værende plasmider, såsom pUC 12 eller andre alment tilgængelige plasmider, såsom ptac 11, ptrp Hl og pKK 177.3 sker på i og for sig kendt måde. De kemisk syntetiserede gener 35 kan i forvejen være forsynet med egnede kemisk syntetiserede kontrolregioner, som tillader proteinernes ekspres- DK 166681 B1 12 sion. I denne forbindelse henvises til Maniatis' lærebog, Molecular Cloning, Maniatis m.fl., Cold Spring Harbor, 1982. Transformationen af de således opnåede hy-5 bridplasmider i egnede værtsorganismer, fortrinsvis E. coli, er ligeledes i og for sig kendt og er nøje beskrevet i ovennævnte lærebog.
De opnåede genfragmenter IL 2-1 til IL 2-IV, de dermed opnåede hybridpiasmider og de transformerede værtsorganismer 10 er ligeledes nye og genstand for opfindelsen. Det samme gælder nye ud fra DNA-sekvens I varierede DNA-sekvenser.
I de følgende eksempler forklares i detaljer yderligere nogle udføreIsesformer for opfindelsen, og herud fra vil fagmanden kunne udlede flertallet af de 15 mulige variationer og kombinationer. Procentangivelserne er efter vægt, når andet ikke er anført.
Eksempel 1
Kemisk syntese af et enkeltstrenget oligonucleotid 20 Som eksempel på genbyggestene la, som omfatter nucleotider 1-17 i den indkodende streng, forklares syntesen af genbyggestenene. Ved hjælp af kendte metoder [M.J. Gait m.fl., Nucleic Acids Res. 8, 1081-1096 (1980)] bindes det ved 3'-enden værende nucleosid, i det forelig-25 gende tilfælde altså cytidin (nucleotid nr. 17) til kie-selgel ("Fractosil1^, firma Merck) covalent via 3'-hydroxy funktionen. Hertil omsættes først kieselgelen under fraspaltning af ethanol med 3-(triethoxysilyl)-pro-pylamin, hvorved der opstår en Si-O-Si-binding. Cyti-30 dinet omsættes som N4-benzoyl-3,-0-succinoyl-5'-dimethoxy-tritylether i nærvær af paranitrophenyl og Ν,Ν'-dicyclo-hexylcarbodiimid med den modificerede bærer, hvorved den frie carboxygruppe i succinoylgruppen acylerer aminore-§ten i propylaminogruppen.
35 o 13 DK 166681 B1 I de følgende syntesetrin anvendes basekomponen-terne som 5'-O-dimethoxytrityl-nucleosid-3'-phosphorsyre-monomethylester-dialkylamid eller -chlorid, hvorved ade-
C
ninet foreligger som N -benzoy Ι-forbindelse--, cytosinet 4 2 5 som N -benzoyl-forbindelse, guaninet som N -isobutyryl- -forbindelse og thyminet, der ingen aminogruppe indeholder, uden beskyttelsesgruppe.
50 mg af den polymere bærer, som bundet indeholder 2^umol cytosin, behandles derefter i rækkefølge med 10 følgende midler: (a) nitromethan, (b) mættet zinkbromidopløsning i nitromethan med 1% vand, (c) methanol 15 (d) tetrahydrofuran, (e) acetonitril, (f) 40yUmol af det tilsvarende nucleosidphosphit og 200^umol tetrazol i 0,5 ml vandfrit acetonitril (5 minutter), 20 (g) 201 acetanhydrid i tetrahydrofuran med 40% lu- tidin og 10% dimethylaminopyridin (2 minutter), (h) tetrahydrofuran, (i) tetrahydrofuran med 20% vand og 40% lutidin, (j) 3% iod i kollidin/vand/tetrahydrofuran i volu- 25 menforholdet 5:4:1, (k) tetrahydrofuran og (l) methanol.
Ved "phosphit" forstås her desoxyribose-3'-mono-phosphorsyrling-monomethylesteren, hvor den tredje valens 30 er mættet med chlor eller en tertiær aminogruppe f.eks. en morpholinorest. Udbytterne af de enkelte syntesetrin kan efter detrityleringsreaktionen (b) bestemmes spektrofoto-metrisk ved måling af dimethoxytritylkationens absorption ved en bølgelængde på 496 nm.
35 Efter afsluttet syntese af oligonucleotidet fra spaltes methylphosphatbeskyttelsegrupperne for oligome-
O
14 DK 166681 B1 ren ved hjælp af p-thiocresol og triethylamin.
Derpå fraskilles ved hjælp af en 3 timer lang behandling med ammoniak oligonucleotidet fra den' faste bærer. En behandling i 2-3 dage af oligomererne med kon-5 centreret ammoniak fraspaltes basernes aminobeskyttelses-grupper kvantitativt.. Det således opnåede råprodukt renses ved højtryksvæskechromatografi (HPLC) eller ved po-lyacrylamid-gelelektrophorese.
Helt tilsvarende syntetiseres også de øvrige 10 genbyggesten i Ib-IVj, hvis nucleotidrækkefølge fremgår af DNA-sekvens II.
Eksempel 2
Enzymatisk tilknytning af de enkeltstrengede oligonucleo-15 tider til qenfraqmenterne IL-2-1 til IL-2-IV_
Til phosphorylering af olignucleotiderne ved 5'-endestillingen behandles hvert i nmol af oligonucleo-tiderne la og Ib med 5 nmol adenosintriphosphat med 4 enheder T4-polynucleotid-kinase i 20^ul 50 mmolær Tris-HCl-20 puffer (pH 7,6), 10 mmolær magnesiumchlorid og 10 mmolær dithiothreitol (DTT) i 30 minutter ved 37°C [C.C. Richardson, Progress in Nucl. Acids Res. 2, 825 (1972)]. Enzymet inaktiveres ved 5 minutters opvarmning til 95°C.
Derpå hybridiseres oligonucleotiderne la og Ib mod hin-25 anden, idet de opvarmes i vandig opløsning i 2 minutter til 95°C og derpå langsomt afkøles til 5°C.
Analogt phosphoryleres oligonucleotiderne Ic og Id samt le og If og hybridiseres parvis, Til subfragmen-tet IL 2-II phosphoryleres oligonucleotiderne Ila med Ilb 30 osv. indtil Ili med IIj, til subfragmentet IL-2-III oli-gomerene Illa med Hib osv. indtil Ulk med III1 og til subfragmentet IL-2-IV oligomerene IVa med IVb osv. til IVi med IVj og hybridiseres parvis.
De således opnåede tre oligonucleotidpar til 35 genfragmentet IL 2-1, de fem olignucleotidpar til genfragmenterne IL 2-II og lL-2-IV samt de seks oligonucleotid- o 15 DK 166681 B1 par til genfragmentet IL 2-III ligateres på følgende måde:
De dobbeltstrengede nucleotider forenes og ligateres hver i 40^uliter 50 mmolær Tris-HCl-puffer, 20 mmo-lær magnesiumchlorid og 10 mmolær DTT ved hjælp af 100 5 enheder T4-DNA-ligase ved 15°C i løbet af 16 timer.
Rensningen af genfragmenterne IL 2-1 til IL 2-IV sker ved hjælp af gelelektrophorese på en 20%'s polya-crylamidgel (uden urinstoftilsætning, 20 x 40 cm, lmm tyk), hvorved der som markørstof anvendes "ØX 174 DNA" (Fa. BRL), 10 snittet med Hinf I, eller pBR 322, snittet med Hae III.
Eksempel 3
Fremstilling af hybridplasmider, som indeholder genfrag- menterne IL 2-1 til IL 2-IV._ 15 (a) Indbygning af genfragmentet IL 2-1 i pUC 12.
Plasmidet pUC 12 svarer til plasmidet pUC 8 [Vieira m.fl., Gene 19, 259-268 (1982), Messing m.fl., ibid. 269-276 (1982)3, men indeholder et noget forstørret poly-forbindelsesstykke med ekstra restriktionssteder for en-20 zymerne Xbal og SacI [Norrander m.fl., Gene 26, 101-106, (1983)]. Plasmidet inkuberes med enzymerne EcoRI og Pstl. Herved udskæres et ca. 40 basepar stort polynucleotid fra plasmidet. Fraskillelsen af dette fragment fra det åbnede plasmid lykkes enten ved chromatografi på "Sephadex'^'’ 25 G50 eller ved elektrophorese på 1,5%’s agarose på kendt måde (Maniatis). En fraskillelse af fragmentet kan også undlades, da plasmider med indsat IL 2-1 let kan konstateres ved udstrygning (således som det sker i det følgende) på plade: 30 I det åbnede plasmid indsættes fragmentet IL 2-1 enzymatisk, som følger, hvorved plasmidet p 145/3 (fig.
1) dannes: DNA'et ligateres i en blanding af 50 mmolær Tris (pH 7,6), 5 mmolær ATP, 5 mmolær dithiothreitol (DTT), 35 5 mmolær MgCl2 og ca. 100 enheder T4-DNA-ligase i 16 ti mer ved 12°C. Derpå transformeres plasmidet i E.coli DK 166681 Bl o 16 K12 (JM 103), der er gjort kompentent med 70 mmolær CaCl2· Bakterier, der indeholder plasmidet p 145/3, kan opdages på agarplader med 50^,ug/ml ampicillin, 1 mmolær isopropyl-thiogalactosid (IPTG) og 2% 5-brom-4-chlor-3-5 -indoly1-3-D-galactosid (X-Gal) som "hvide" kolonier.
Eventuelt endnu uforandret eller ikke fuldstændig snittet plasmid pUC 12 giver "blå" bakteriekolonier. Ca. 5 af de hvide bakterierkloner dyrkes, og de opnåede plasmi-der isoleres på kendt måde (Maniatis).
10 Det indsattes størrelse kontrolleres ved hjælp af inkubation med restriktionsenzymerne Pst I og EcoRI og efterfølgende elektrophorese på 10%?s polyacrylamid-geler. Herpå sker en sekvensering af det indsatte efter Maxam og Gilbert [Methods Enzymol. 65, 499 (1980) eller 15 Sanger og Coulson, J. Mol. Biol. 94, 441 (1975)3.
(b) Indbygning af genfragmentet IL 2-II i pUC 12.
Analogt med (a) omsættes plasmidet pUC 12 med restriktionsenzymerne Pst I og Xba I ogj eventuelt efter fraskillelse af det opståede oligonucleotide indbygges 20 fragmentet IL—2-II enzymatisk. Der opstår plasmidet p 147/1 (fig. 2).
(c) Indbygning af genfragmentet IL-2-III i pUC 12. Analogt med (a) omsættes plasmidet pUC 12 med restriktionsenzymerne Xba I og Sac I og fragmentet IL-25 2-III indbygges enzymatisk. Herved opstår plasmidet p 138/25 (fig. 3) .
(d) Analogt med (a) snittes plasmidet pUC 12 med restriktionsenzymerne Sac I og Sal I, og fragmentet IL- 2-IV indbygges enzymatisk. Herved opstår plasmidet 30 p 143/1 (fig. 4) .
Eksempel 4
Sammenknytning af genfragmenterne
Efter formering af plasmiderne p 145/3, p 147/1, 35 p 138/25 og p 143/1 og bekræftelse af sekvensen udskæres subfragmenterne IL-2-I til IL—2-IV igen med de tilsvaren-
O
17 DK 166681 B1 de restriktionsenzymer og fraskilles ved hjælp af elek-trophorese på polycarylamid. Efter neddypning af gelerne i en vandig ethidiumbromidopløsning identificeres båndene under UV-lys, udskæres og DNA'et élueres på 5 kendt måde (Maniatis).
Subfragmenterne IL-2-I til IL-2-IV sanmenknyttes som beskrevet i eksempel 3(a) enzymatisk og indbygges i det ved omsætning med restriktionsenzymerne Eco RI og Sal I åbnede plasmid pUC 12. Der fås hybridplasmidet 10 p 159/6 (fig. 5), hvis sekvens endnu engang bekræftes ved analyse.
Eksempel 5
Konstruktion af hybridplasmidet til ekspression af DNA-15 sekvensen I._ (a) Indbygning i pKK 177.3.
Ekspressionsplasmidet pKK 177.3 [plasmid ptac 11, Amman m.fl., Gene 25, 167 (1983), hvor der i Eco RI-genkendelsesstedet syntetisk indbygges en sekvens, 20 der indeholder et Sal I-snitsted] åbnes med restriktionsenzymerne Eco RI og Sal I. Fra plasmidet p 159/6 (fig.
• 5) udskæres DNA-sekvensen I med restriktionsenzymerne Eco RI og Sal I og anbringes på polyacrylamid eller 2%'s lavtsmeltende agarose, adskilles fra Plasmid-DNA'et og 25 det indsatte udvindes igen (Maniatis). Ved ligatering af det opsnittede plasmid pKK 177.3 med DNA-sekvensen I fremskaffes et hybridplasmid, hvor der forud for det indsatte er indskudt en ekspressions- eller regulations-region. Efter tilsætningen af en egnet induktor såsom 30 IPTG dannes et mRNA, som fører til ekspression af poly-peptidet svarende til DNA-sekvensen I.
(b) Indbygning i p trp Hl.
Ekspressionsplasmidet p trp Hl [Amann m.fl.,
Gene 25, 167-168 (1983)] indeholder Trp-operonets (pro-35 motor, operator) kontrolelementer, efterfulgt af et Hind III-restriktionssted (fig. 6).
O
18 DK 166681 B1
Efter isolering af DNA-sekvensen I fra p 159/6 nedbrydes de udragende ender med Mung-Bean-nuclease efter fabrikantens anvisninger (PL Biochemicals). p trp Hl åbnes med Hind III, og de udragende ender fjernes li-5 geledes med Mung Bean Nuclease. DNA-sekvensen 1 indbygges så med stumpe ender med T 4 DNA-ligase i det åbnede plasmid (fig. 6).
Ved hjælp af tripletten ATG for methionin i stilling 0 bestemmes begyndelsen for proteinsyntesen. Eks-10 pressionen induceres ved manglen på tryptophan og/eller tilstedeværelse af indolylacryleddikesyre.
Eksempel 6
Fremstilling af modifikationer 15 (a) Forkortelser ved proteinets C-endestilling
Til fremstilling af forkortede proteinmolekyler med IL-2's biologiske aktivitet omsættes plasmidet p 159/6 med restriktionsenzymet Sal I, og derpå inkuberes på i og for sig kendt måde med eksonuclease III og S 1-nuclea-20 se. Efter omsætning med Eco RI fås nu IL 2-'s delsekvenser, som på den ene ende bærer de overlappende sekvenser for Eco RI og i den anden ende er stumpe. Efter tilføjelse af et kemisk syntetiseret DNA, som i den ene ende er stumpt og her som første codon har et stop-codon, men 25 i den anden ende derimod bærer en udragende Sal I-sekvens, kan denne forkortede DNA-sekvens indbygges i de samme ekspressionsvektorer.
(b) Forkortelser ved proteinets N-endestilling
Til konstruktion af et hybridplasmid, som inde-30 holder DNA-sekvensen til ekspression af Des-[Ala'*']-IL-2, udsnittes fra plasmidet p 159/6 ifølge i og for sig kendte metoder med restriktionsenzymerne Eco RI og Hind III DNA-sekvensen I inkl. polyforbindelsesstykdelen i plasmidet, fraskilles elektrophoretisk fra resten af plasmi-35 det og eftersnittes med restriktionsenzymet Aha II. Det isolerede Aha Il-Hind Ill-fragment gøres stumpendet som
O
19 DK 166681 B1 beskrevet i eksempel 5 (b) og eftersnittes derefter med Sal I. Ved hjælp af følgende adaptorer 5' AA TTC ATG 3' 3’ G TAC 5' 5 fås efter ligatering med det med Eco RI og Sal I åbnede plasmid pK.K 177.3 et nyt hybridplasmid, som indeholder genet til fremstilling af Des-[Ala^J-IL-2.
Eksempel 7 10 Transformation af hybridplasmiderne
Kompetente E.coli-celler transformeres med 0,1-1 yUg af hybridplasmiderne, som indeholder sekvensen I eller derivater deraf, og udstryges på ampicillin-holdi-ge agarplader. Derpå kan kloner, som indeholder de kor-15 rekt integrerede IL-2-gensekvenser eller derivater deraf i de tilsvarende plasmider, identificeres ved DNA-hurtig-oparbejdning (Maniatis ovenfor).
Eksempel 8 20 Ekspression af de polypeptider, der har IL-2-aktivitet Efter transformation af hybridplasmiderne med DNA-sekvens I eller derivater deraf i E.coli eksprimeres et polypeptid, som foruden IL-2-aminosyresekvensen eller varierede sekvenser i aminoendestillingen desuden har en 25 ekstra methiony1gruppe.
Eksempel 9
Oparbejdning og rensning
De til den ønskede optiske tæthed dyrkede bak-30 teriestammer inkuberes med en egnet induktor, f.eks.
IPTG, i tilstrækkelig lang tid, f.eks. 2-4 timer. Derpå dræbes cellerne med 0,1% cresol og 0,1 mmolær benzyl-sulfnoylfluorid. På en SDS-PAA-gel konstateres efter induktionen et proteinbånd med en molvægt på ca. 15.000 35 Dalton. Efter centrifugering eller filtrering optages cellemassen i en pufferopløsning (50 mmolær Tris, 50 mmo- o 20 DK 166681 B1 lær EDTA, pH 7,5) og opforydes mekanisk, f.éks. med en trench- ' presse eller "Dyno-mølle’® (firma Willy Bachofer, Basel), hvorpå de uopløselige bestanddele centrifugeres fra.
En del af IL-2-proteinet forbliver efter celle-5 oplukningen i remanensen og kan opløseliggøres med 8 molær urinstof, 6 molær guanidiniuift-hydrochlorid, pufferopløsninger med detergenter af ionisk eller ikke-ionisk art og lignende opløsningsmidler. Ud fra disse opløsninger renses proteinet, der indeholder IL-2-aktivitet?ifølge 10 gængse metoder. Egnede er ionbytter-, adsorptions-, gelfiltreringskolonner eller affinitetschromatografi på antistofkolonner. Ved hjælp af natriumdodecylsulfat/acryl-amidgel- eller HPLC-analyseteknik kontrolleres produktets berigelse og renhed.
15 Til biologisk karakterisering af IL-2-proteinet anvendes T-celler, som er stærkt afhængige af tilstedeværelse af IL-2 i mediet. Sådanne celle-liniers celle- l delingsrate er inden for visse grænser proportional med IL-2-koncentrationen i mediet, som derfor kan konstate-20 res via optagelsen af H-thymidin fra mediet.
25 30 35
Claims (8)
1. DNA-Sekvens I med nucleotiderne 9-407 (aminosyrerne 1-133) som vist i tabel I, der koder for et protein med den biologiske aktivitet af humant interleukin-2 (IL-2).
2. DNA-Sekvens I med nucleotiderne 6-407 (aminosyrerne 0-133) som vist i tabel I, efterfulgt af ét eller to stop-codon(er) og kodende for et protein med den biologiske aktivitet af humant interleukin-2 (IL-2).
3. DNA-Sekvenser Ila (IL-2-1), lib (IL-2-2-II), Ile 10 (IL-2-III) og Ild (IL-2-IV) som vist i tabel II til brug ved fremstilling af DNA-sekvensen ifølge krav 1 eller 2.
4. DNA-Oligonucleotider Ia-IVj som vist i tabel II til brug ved fremstilling af DNA-sekvensen ifølge krav 1 eller 2.
5. Hybridplasmider, der mellem et EcoRI- og et Sall- -overskæringssted indeholder DNA-sekvensen I som vist i tabel I.
6. Hybridplasmider, der indeholder DNA-sekvensen I (nucleotiderne 6-407) som vist i tabel I. 20
7. Værtsceller, især E.coli, der indeholder hybrid plasmider ifølge krav 5-6.
8. Genteknologisk fremgangsmåde til fremstilling af IL-2, kendetegnet ved, at den omfatter anvendelse af et syntetisk gen, der indeholder DNA-sekvensen I (nucleo-25 tiderne 9-407 svarende til aminosyrerne 1-133) som vist i tabel I.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3419995 | 1984-05-29 | ||
| DE19843419995 DE3419995A1 (de) | 1984-05-29 | 1984-05-29 | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von human-interleukin-2 und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK237985D0 DK237985D0 (da) | 1985-05-28 |
| DK237985A DK237985A (da) | 1985-11-30 |
| DK166681B1 true DK166681B1 (da) | 1993-06-28 |
Family
ID=6237111
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK237985A DK166681B1 (da) | 1984-05-29 | 1985-05-28 | Dna-sekvenser, dna-sekvenser og dna-oligonucleotider til brug ved fremstilling af de foerstnaevnte dna-sekvenser, hybridplasmider indeholdende dna-sekvens, vaertsceller indeholdende hybridplasmiderne samt genteknologisk fremgangsmaade til fremstilling af il-2 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0163249B1 (da) |
| JP (1) | JPS6199A (da) |
| AT (1) | ATE65797T1 (da) |
| AU (1) | AU589896B2 (da) |
| DE (2) | DE3419995A1 (da) |
| DK (1) | DK166681B1 (da) |
| ES (1) | ES8605813A1 (da) |
| GR (1) | GR851291B (da) |
| IE (1) | IE57996B1 (da) |
| PT (1) | PT80542B (da) |
| ZA (1) | ZA854031B (da) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK174501B1 (da) * | 1983-12-23 | 2003-04-28 | Hoffmann La Roche | Fremgangsmåde til fremstilling af interleukin-2 |
| CA1340265C (en) * | 1985-01-18 | 1998-12-15 | Kirston E. Koths | Oxidation resistant muteins |
| DE3537461A1 (de) * | 1985-10-22 | 1987-04-23 | Hoechst Ag | Derivat des interleukin-2, seine herstellung und verwendung |
| US5496924A (en) * | 1985-11-27 | 1996-03-05 | Hoechst Aktiengesellschaft | Fusion protein comprising an interleukin-2 fragment ballast portion |
| DE3712985A1 (de) * | 1987-04-16 | 1988-11-03 | Hoechst Ag | Bifunktionelle proteine |
| JPS62185098A (ja) * | 1986-02-10 | 1987-08-13 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | インタ−ロイキン−２活性を有するポリペプチド |
| US5831022A (en) * | 1986-02-18 | 1998-11-03 | Hoffmann-La Roche Inc. | Purification of recombinant human IL-1α |
| US4992367A (en) * | 1986-05-12 | 1991-02-12 | Hoffmann-La Roche Inc. | Enhanced expression of human interleukin-2 in mammalian cells |
| US5017692A (en) * | 1986-09-04 | 1991-05-21 | Schering Corporation | Truncated human interleukin-a alpha |
| CA1339757C (en) * | 1987-04-16 | 1998-03-17 | Robert F. Halenbeck | Production of purified biologically active, bacterially produced recombinant human csf-1 |
| US4929700A (en) * | 1987-04-16 | 1990-05-29 | Cetus Corporation | Production of purified, biologically active, bacterially produced recombinant human CSF-1 |
| US5162507A (en) * | 1987-05-11 | 1992-11-10 | Cetus Corporation | Process for recovering purified, oxidized, renatured recombinant interleukin-2 from microorganisms |
| FR2643646B1 (fr) * | 1989-02-27 | 1993-09-17 | Pasteur Institut | Expression de sequences de nucleotides codant pour des vesicules a gaz |
| US6008319A (en) * | 1996-12-23 | 1999-12-28 | University Of Southern California | Vasopermeability enhancing peptide of human interleukin-2 and immunoconjugates thereof |
| US6955807B1 (en) | 1998-05-15 | 2005-10-18 | Bayer Pharmaceuticals Corporation | IL-2 selective agonists and antagonists |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2483592A1 (fr) * | 1980-06-02 | 1981-12-04 | Stein Industrie | Dispositif de reduction des contraintes thermiques sur un echangeur de chaleur |
| CA1341562C (en) * | 1982-03-31 | 2007-11-27 | Tadatsugu Taniguchi | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant dna, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
| US4738927A (en) * | 1982-03-31 | 1988-04-19 | Ajinomoto Co. Inc. | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant DNA, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
| AU579089B2 (en) * | 1983-02-08 | 1988-11-17 | Biogen, Inc. | Human interleukin-2-like polypeptides |
| IL71275A0 (en) * | 1983-03-21 | 1984-06-29 | Sparamedica Ag | Human interleukin-2-and its preparation |
| WO1985000817A1 (en) * | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Amgen | Microbial expression of interleukin ii |
| FR2559782B1 (fr) * | 1984-02-16 | 1986-07-18 | Transgene Sa | Vecteur d'expression dans les levures de l'interleukine-2, levures transformees et procede de preparation de l'interleukine-2 |
| EP0163603B1 (en) * | 1984-05-08 | 1989-12-13 | Genetics Institute, Inc. | A human t-cell growth factor |
-
1984
- 1984-05-29 DE DE19843419995 patent/DE3419995A1/de not_active Withdrawn
-
1985
- 1985-05-22 DE DE8585106279T patent/DE3583634D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-05-22 EP EP85106279A patent/EP0163249B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-22 AT AT85106279T patent/ATE65797T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-05-27 GR GR851291A patent/GR851291B/el unknown
- 1985-05-27 ES ES543508A patent/ES8605813A1/es not_active Expired
- 1985-05-28 ZA ZA854031A patent/ZA854031B/xx unknown
- 1985-05-28 AU AU43070/85A patent/AU589896B2/en not_active Ceased
- 1985-05-28 JP JP60113324A patent/JPS6199A/ja active Pending
- 1985-05-28 DK DK237985A patent/DK166681B1/da not_active IP Right Cessation
- 1985-05-28 IE IE1319/85A patent/IE57996B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-05-29 PT PT80542A patent/PT80542B/pt not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6199A (ja) | 1986-01-06 |
| DE3419995A1 (de) | 1985-12-05 |
| ZA854031B (en) | 1986-01-29 |
| EP0163249B1 (de) | 1991-07-31 |
| PT80542B (pt) | 1987-09-30 |
| EP0163249A3 (en) | 1988-05-11 |
| AU589896B2 (en) | 1989-10-26 |
| ES8605813A1 (es) | 1986-01-16 |
| ATE65797T1 (de) | 1991-08-15 |
| EP0163249A2 (de) | 1985-12-04 |
| AU4307085A (en) | 1985-12-05 |
| IE57996B1 (en) | 1993-06-02 |
| DK237985A (da) | 1985-11-30 |
| ES543508A0 (es) | 1986-01-16 |
| GR851291B (da) | 1985-11-25 |
| DK237985D0 (da) | 1985-05-28 |
| DE3583634D1 (de) | 1991-09-05 |
| PT80542A (de) | 1985-06-01 |
| IE851319L (en) | 1985-11-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI91883B (fi) | Menetelmä hirudiinin vaikutusta omaavan polypeptidin valmistamiseksi | |
| DK166681B1 (da) | Dna-sekvenser, dna-sekvenser og dna-oligonucleotider til brug ved fremstilling af de foerstnaevnte dna-sekvenser, hybridplasmider indeholdende dna-sekvens, vaertsceller indeholdende hybridplasmiderne samt genteknologisk fremgangsmaade til fremstilling af il-2 | |
| EP0046039B1 (en) | Synthetic urogastrone gene, corresponding plasmid recombinants, transformed cells, production thereof and urogastrone expression | |
| KR920009505B1 (ko) | 인체 γ－인터페론 활성을 갖는 폴리펩타이드의 제조방법 | |
| KR950000299B1 (ko) | 융합 단백질의 제조방법 | |
| Lupski et al. | Regulation of the rpsU-dnaG-rpoD macromolecular synthesis operon and the initiation of DNA replication in Escherichia coli K-12 | |
| IE62511B1 (en) | Mini-proinsulin, its preparation and use | |
| DK171940B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af polypeptider meden C-terminal carboxamidgruppe, polypeptider til anvendelse ved fremgangsmåden, fusionsproteiner deraf og dertil egnede DNA-sekvenser, plasmider og værtsorganismer | |
| JPS63304987A (ja) | アンギオゲニン類の遺伝子工学産生方法 | |
| AU634926B2 (en) | Gene synthesis | |
| US4711847A (en) | Preparation of secretin | |
| AU592062B2 (en) | Synthetic regulation region | |
| DK175511B1 (da) | DNA-sekvens, fremgangsmåde til transportekspression af proteiner ved anvendelse af DNA-sekvensen, hybridvektor og hybridplasmid indeholdende DNA-sekvensen samt værtsorganisme indeholdende hybridvektoren eller hybridplasmidet | |
| EP0121569B1 (en) | Novel vector | |
| NO851065L (no) | Genteknologisk fremgangsmaate til fremstilling av human-gammainterferon og middel til gjennomfoering av denne fremgangsmaaten | |
| GB2223496A (en) | Gene encoding human acidic fibroblast growth factor | |
| EP0295286A1 (en) | METHOD FOR PRODUCING A SALMON GROWTH HORMONE BY MEANS OF AN ARTIFICIAL GENE. | |
| GB2210618A (en) | Synthetic gene | |
| JPH0642833B2 (ja) | ヒト表皮細胞増殖因子の遺伝子 | |
| JPS63226288A (ja) | 新規遺伝子、その発現プラスミドｄｎａ、及び形質転換微生物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PBP | Patent lapsed |