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JP7304375B2 - 血清アルブミンに結合するタンパク質 - Google Patents

血清アルブミンに結合するタンパク質 Download PDF

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Description

本発明は、血清アルブミンに結合することのできるアミノ酸配列；このようなアミノ酸配列を含むかまたは本質的にからなるタンパク質およびポリペプチド；このようなアミノ酸配列、タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸；このようなアミノ酸配列、タンパク質およびポリペプチドを含む組成物、特に薬学的組成物；並びに、このようなアミノ酸配列、タンパク質およびポリペプチドの使用に関する。
本発明の他の局面、態様、利点および適用は、本明細書のさらなる記載から明らかとなろう。
いずれの用語も本明細書において特に定義されていなければ、これらの用語は、国際公開公報第２００９／０６８６２７号または国際公開公報第０６／１２２７８７号においてそれらに与えられた意味を有する。本明細書において使用されるいずれの用語も、本明細書または国際公開公報第２００９／０６８６２７号／国際公開公報第０６／１２２７８７号において特に定義されていなければ、それらは当技術分野におけるその通常の意味を有し、例えばそれは標準的なハンドブックに言及されている。
ヒト血清アルブミンに結合することのできるアミノ酸配列、並びに治療関連タンパク質およびポリペプチドの半減期を増加させるためのポリペプチド構築物におけるその使用は、当技術分野において公知である。
例えば、出願人による国際公開公報第０４／０４１８６５号は、他のタンパク質（例えば所望のターゲットに対して指向される１つ以上の他のナノボディ）の半減期を増加させるために前記タンパク質に連結させることのできる、血清アルブミンに対して（特にヒト血清アルブミンに対して）指向されるナノボディを記載している。
国際出願の国際公開公報第０６／１２２７８７号は、（ヒト）血清アルブミンに対する多くのナノボディを記載している。これらのナノボディとしては、Ａｌｂ－１（国際公開公報第０６／１２２７８７号における配列番号５２）およびそのヒト化変異体、例えばＡｌｂ－８（国際公開公報第０６／１２２７８７号における配列番号６２）と呼ばれるナノボディが挙げられる。［Nanobody（登録商標）およびNanobodies（登録商標）はAblynx N.V.の商標である］。ここでも、これらを使用して、治療タンパク質およびポリペプチド並びに他の治療成分または部分の半減期を延長させることができる。
本出願の最初の出願日において、ナノボディなどの治療部分の半減期を延長させるための（ヒト）血清アルブミンに対するナノボディの使用は、臨床試験によって検証されてきた。例えば、ＲＡＮＫ－Ｌに対する２つのナノボディおよびヒト血清アルブミンに対する１つのナノボディを含むタンパク質構築物である、ＡＬＸ－０１４１の安全性、耐容性、免疫原性および薬物動態（ＰＫ）が第Ｉ相臨床試験において確認された（データはロンドンにおける欧州リウマチ学会（ＥＵＬＡＲ）で２０１１年５月２７日にAblynx N.V.によって提示された）。また、Ablynx N.V.の数多くの公開特許出願は、治療ターゲットに対する１つ以上のナノボディおよび血清アルブミンに対する１つ以上のナノボディ（例えばＡｌｂ－８）を含む半減期の増加した構築物の例を示す。例えば国際公開公報第０４／０４１８６２号、国際公開公報第２００６／１２２７８６号、国際公開公報第２００８／０２００７９号、国際公開公報第２００８／１４２１６４号、国際公開公報第２００９／０６８６２７号および国際公開公報第２００９／１４７２４８号に言及されている。
（ヒト）血清アルブミンに対するナノボディ（例えば国際公開公報第０４／０４１８６５号および国際公開公報第０６／１２２７８７号に記載のもの、特に国際公開公報第０６／１２２７８７号に記載のＡｌｂ－１のヒト化変異体）の使用が、ナノボディ並びに他の治療部分および成分の半減期の延長のための良好で広範囲に適用可能な方法を提供することが確立されているが、これは、当業者がこの目的のためにヒト血清アルブミンに対するさらに改良されたナノボディを自由に使えることから利益が得られないことを意味するものではない。
本発明は、ヒト血清アルブミンに対して指向されるこのような改良されたナノボディ（「Ａｌｂ－２３」と呼ばれる；配列番号１を参照されたい）、並びにこのナノボディの多くの変異体（本明細書においては「Ａｌｂ－２３様配列」または「Ａｌｂ－２３変異体」とも呼ばれる、いくつかの非限定的な例としては配列番号３～１１を参照されたい）、並びにそれを含む化合物、ポリペプチドおよび他の（タンパク質）構築物（本明細書においてさらに記載されているような）を提供する。
配列番号１の改良されたナノボディおよびその変異体が、国際公開公報第０４／０４１８６５号および国際公開公報第０６／１２２７８７号に記載のナノボディを上回って提供することのできる利点は、本明細書におけるさらなる記載から明らかとなろう。例えばであって限定するものではないが、これらの利点は、
－ 改良された安定性（例えばＴｍを測定することによって決定されるような改良された熱安定性）；および／または
－ および／または例えば実施例５に記載されたＳＥＣ実験で測定されるような、改良された保存安定性；および／または
－ 特定の製剤化条件下で（例えば、特定の水性の製剤化バッファー中で高濃度で、ここでも例えば実施例５を参照されたい）二量体を形成する傾向が低いこと
を含み得る。
さらに、配列番号１の改良されたナノボディおよびその変異体は、「ＶＨＨ－１クラス」に属するＶＨＨおよびナノボディなどの、１つを上回るジスルフィド橋を含む（本明細書においてさらに記載されているように、２つまたはさらには３つのジスルフィド橋を含み得る）免疫グロブリン単一可変ドメインの半減期を延長するのに特に適している。例えばであって限定するものではないが、ＶＨＨ－１クラスの１つ以上の治療用ＶＨＨ／ナノボディおよびナノボディＡｌｂ－２３（またはＡｌｂ－２３変異体）を含むポリペプチドは、特定の宿主または宿主細胞において、配列番号１のアミノ酸配列の代わりに「Ａｌｂ－８」（国際公開公報第０６／１２２７８７号における配列番号６２）などの国際公開公報第０６／１２２７８７号に記載の血清アルブミン結合ナノボディを含む対応するポリペプチドよりも、より良好な発現レベル（および／または一般的に、発現、精製および／または産生／製造の点において他の有利な特性）を有し得ることが判明した。ここでも、これは、本明細書におけるさらなる記載および実験部から明らかとなろう。
本発明のこれらおよび他の利点、並びに種々の局面、態様、使用および適用は、本明細書におけるさらなる記載から明らかとなろう。
ナノボディ、ＶＨＨ、（単一）ドメイン抗体、ｄＡｂ、ＩｇＮＡＲドメインおよびマイクロボディ（例えば国際公開公報第００／２９００４号に記載のような）などの免疫グロブリン単一可変ドメインは、多くの宿主細胞および宿主生物、例えば細菌細胞、例えばE.coli、酵母株、例えばPichiaおよびSaccharomyces、並びに種々の哺乳動物細胞または細胞株において発現させることができることが知られている。例えば、欧州特許第０ ６５６ ９４６号および欧州特許第０ ６９８ ０９７号、並びにAblynx N.V.からの種々の公開特許出願、例えば国際公開公報第０４／０４１８６２号、国際公開公報第２００６／１２２７８６号、国際公開公報第２００８／０２００７９号、国際公開公報第２００８／１４２１６４号、国際公開公報第２００９／０６８６２７号または国際公開公報第２００９／１４７２４８号に言及されている。
同様に、治療ターゲットに対して指向される１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを、（ヒト）血清アルブミンに対して指向されるナノボディ（国際公開公報第０４／０４１８６５号および国際公開公報第０６／１２２７８７号に記載のものなど）に連結させて、半減期の増加した（すなわち治療ドメイン単独と比較して）構築物を提供する場合、得られたポリペプチドおよび構築物も、多くの宿主細胞および宿主生物、例えば細菌細胞、例えばE.coli、酵母株、例えばPichiaおよびSaccharomyces、並びに種々の哺乳動物細胞または細胞株において発現させることができることが知られている。ここでも、国際公開公報第０４／０４１８６５号、国際公開公報第０６／１２２７８７号、国際公開公報第２０１０／０５６５５０号、および本明細書に記載されたAblynx N.V.の種々の公開特許出願に言及されている。
また、全てのＶＨＨおよびナノボディが２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間に少なくとも１つのジスルフィド橋を含むことが一般的に知られている（ナンバリングはKabatに従う、Ablynx N.V.の特許出願を参照されたい）。
大半のＶＨＨは、この単一のジスルフィド橋のみを含んでいるが、いくつかのＶＨＨは全部で２つ（または例外的な場合では３つ）のジスルフィド橋を含むことも知られている。例えば、「ＶＨＨ－１型」または「ＶＨＨ－１クラス」と称されるＶＨＨおよびナノボディのクラスは、一般的に、５０位のシステイン残基（ＣＤＲ２の最初のアミノ酸残基）とＣＤＲ３に存在するシステイン残基との間に第２のジスルフィド橋を有する（このようなＶＨＨおよびナノボディは、また、４４位から４７位に配列モチーフＥＲＥＧを有することが多い）。また、ラクダに由来するいくつかのＶＨＨは、時に、ＣＤＲ１に存在するシステイン残基とＣＤＲ３に存在するシステイン残基との間に１つのジスルフィド橋を有する。
このようなＶＨＨ－１型ナノボディのいくつかの非限定的な例（説明のためだけに示される；他のターゲットに対する他のＶＨＨ－１型配列は、Ablynx N.V.のいくつかの他の特許出願に見られ得る）は、国際公開公報第２００９／０６８６２７号からの配列Ｐ２３ＩＬＰＭＰ３７Ｄ５（配列番号２４９０）およびＰ１２ＩＬＰＭＰ８０Ｆ１０（配列番号１９５４）；国際公開公報第２００８／０２００７９号からの配列ＰＭＰ３０Ａ２（配列番号４１９）、ＰＭＰ３１Ｃ５（配列番号４１３）およびＰＭＰ３０Ｇ１１（配列番号４１６）；並びに国際公開公報第２００９／１４７２４８号からの配列ＲＳＶＰＭＰ５Ａ２（配列番号２６２）、ＲＳＶＰＭＰ５Ｂ２（配列番号２６３）およびＲＳＶＰＭＰ５Ｃ３（配列番号２６４）である。
前以て公開されていない米国特許出願第６１／３８８，１７２号（２０１０年９月３０日に出願および題名は「Biological materials related to c-Met」）および米国特許第６１／４５１，８６９号（２０１１年３月１１日に出願および題名は「Biological materials related to c-Met」）（両方共にAblynx N.V.に帰する）は、治療ターゲットｃ－Ｍｅｔに対して指向されるＶＨＨおよびナノボディを記載し；そしてこれらのＶＨＨおよびナノボディのいくつか（例えば４Ｅ０９、米国特許第６１／４５１，８６９号における配列番号２６および本明細書における配列番号１２、並びに米国特許第６１／４５１，８６９号に記載された４Ｅ０９のいくつかの変異体）もまた、ＶＨＨ－１クラスに属する。
米国特許第６１／３８８，１７２号および米国特許第６１／４５１，８６９号はまた、このようなＶＨＨ－１型ナノボディを、ヒト血清アルブミンに対するナノボディと連結させて、その半減期を増加させることができることを記載する（米国特許第６１／３８８，１７２号および米国特許第６１／４５１，８６９号において使用されたヒト血清アルブミンに対するナノボディは「Ａｌｂ－１１」と呼ばれ、そして米国特許第６１／４５１，８６９号において配列番号５で示される。Ａｌｂ－１１は、Ａｌｂ－８と同じアミノ酸配列を有し、これは国際公開公報第０６／１２２７８７号において配列番号６２である）。Ａｌｂ－１１および４Ｅ０９を含むこのようなポリペプチドの一例が、米国特許第６１／４５１，８６９号の配列番号９に示されている。
ＶＨＨ－１型のＶＨＨ／ナノボディ（またはより一般的には２または３つのジスルフィド橋を含むＶＨＨ／ナノボディ）、並びにそれを含むポリペプチドおよび他のタンパク質構築物（増加した半減期を提供するために血清アルブミンに対する少なくとも１つのナノボディをさらに含むこのようなポリペプチドを含む）は任意の適切な宿主または宿主生物において発現させることができるが、このようなＶＨＨ、ナノボディ、ポリペプチドまたは構築物について得られた発現レベルは、ＶＨＨ－１クラスに属さないＶＨＨまたはナノボディを含む（またはより一般的には、唯一つのジスルフィド橋を有するＶＨＨ／ナノボディを含む）類似／同等なＶＨＨ、ナノボディ、ポリペプチドまたは構築物について得られた発現レベルよりも有意により低い場合があることが判明した。例えばであって限定するものではないが、Pichiaにおいて、Ａｌｂ－８およびＶＨＨ－１型ではない１つ以上の治療ナノボディを含むポリペプチドについて０．８ｇ/ｌ以上（例えば１ｇ/ｌ以上）の発現レベルを日常的に達成することができたが（ここでも、Ablynx N.V.のいくつかの公開特許出願を参照されたい）、抗ｃ－Ｍｅｔ ＶＨＨ－１型ナノボディ４Ｅ０９（米国特許第６１／４５１，８６９号における配列番号２６および本明細書における配列番号１２）またはそのヒト化変異体およびＡｌｂ－８を含むポリペプチドについては０．５ｇ/ｌを超える発現レベルを達成することは困難であることが判明した（以下の実験章を参照されたい）。驚くべきことに、今般、配列番号１のナノボディをこのようなポリペプチド中に（Ａｌｂ－８の代わりに）使用すると、有意により高い発現レベルを得ることができることが判明した（以下の実験章を参照されたい）。
記載されているように、第１の局面において、本発明は、本質的に以下のアミノ酸配列：
Figure 0007304375000001
からなるまたはである、（ヒト）血清アルブミンに対して指向されるアミノ酸配列に関する。
このアミノ酸配列はまた、本明細書において「Ａｌｂ－２３」または「本発明のアミノ酸配列」と称される。Ａｌｂ－２３は、アミノ酸配列「Ａｌｂ－１」のヒト化バージョンである（国際公開公報第０６／１２２７８７号からの配列番号５２、およびまた国際公開公報第０６／１２２７８７号においては「ＰＭＰ６Ａ６」と称される）。
便宜上、図１は、Ａｌｂ－２３と、国際公開公報第０６／１２２７８７号の表ＩＩＩに開示されたＡｌｂ－１およびＡｌｂ－１のヒト化バージョン（国際公開公報第０６／１２２７８７号においては「Ａｌｂ－３」から「Ａｌｂ－１０」と呼ばれる、また、国際公開公報第０６／１２２７８７号の配列番号５７～６４も参照されたい）のアラインメントを示す。Ａｌｂ－１のアミノ酸配列は：
Figure 0007304375000002
である。
上の配列において、Ａｌｂ１とＡｌｂ－２３との間の主な差異は太文字で示し、強調している。これらは（ナンバリングはKabatに従う、例えば国際公開公報第２００８／０２００７９号の表Ａ－５からＡ－８を参照されたい；各文字は、標準的な１文字アミノ酸コードに従ってアミノ酸残基を表示する、それは国際公開公報第２００８／０２００７９号の表Ａ－２に言及されている）、５位においてＶからＬへ；１６位においてＮからＧへ；４４位および４５位においてＥＰからＧＰへ；７４位から７６位においてＡＫＴからＳＫＮへ；８３位においてＫからＲへである。
従って、さらなる局面において、本発明は、配列Ａｌｂ－１（配列番号２）の変異体であるアミノ酸配列に関し、前記変異体は：
（ｉ）４４位および４５位においてアミノ酸モチーフＧＰ；
（ｉｉ）７４位から７６位においてアミノ酸モチーフＳＫＮ；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列SFGMS（配列番号２９）であるＣＤＲ１；
（ｉｖ）アミノ酸配列SISGSGSDTLYADSVKG（配列番号３０）であるＣＤＲ２；
（ｖ）アミノ酸配列GGSLSR（配列番号３１）であるＣＤＲ３
を含み、そして好ましくはまた、
（ｖｉ）１６位にＧ
を含み、
そして好ましくは（しかし限定するものではなく）：
（ｖｉｉ）８３位はＲ（しかし場合によりＫでもよい）であり；
そしてさらに（すなわち、１６位、４４位および４５位、７４位から７６位および８３位における前記のアミノ酸の相違に加えて、１６位および８３位におけるアミノ酸の相違は任意であるが好ましい）、配列番号２で示された配列に対して１～７つ、例えば１～５つのさらなる「アミノ酸の相違」（国際公開公報第２００８／０２００７９号に定義したような）を含み、これは、例えば、１つ以上のヒト化置換（国際公開公報第２００８／０２００７９号に定義したような；例えばここでも表Ａ－５からＡ－８を参照されたい）および／または他の置換であり得る（このようなヒト化または他の置換の非限定的な例は、１位においてＡからＥへ、１４位においてＰからＡへ、または１０８位においてＱからＬへである）。
同様に、本発明は、配列Ａｌｂ－２３（配列番号１）の変異体であるアミノ酸配列に関し、前記変異体は：
（ｉ）４４位および４５位においてアミノ酸モチーフＧＰ；
（ｉｉ）７４位から７６位においてアミノ酸モチーフＳＫＮ；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列SFGMS（配列番号２９）であるＣＤＲ１；
（ｉｖ）アミノ酸配列SISGSGSDTLYADSVKG（配列番号３０）であるＣＤＲ２；
（ｖ）アミノ酸配列GGSLSR（配列番号３１）であるＣＤＲ３
を含み、そして好ましくはまた、
（ｖｉ）１６位にＧ
を含み、
そして好ましくは（しかし限定するものではなく）：
（ｖｉｉ）８３位はＲ（しかし場合によりＫでもよい）であり；
そしてさらに配列番号１で示された配列に対して１～７つ、例えば１～５つのさらなる「アミノ酸の相違」（国際公開公報第２００８／０２００７９号に定義したような）を含み、これは、例えば、１つ以上のヒト化置換（国際公開公報第２００８／０２００７９号に定義したような；例えばここでも表Ａ－５からＡ－８を参照されたい）および／または他の置換であり得る（このようなヒト化または他の置換の非限定的な例は、１位においてＡからＥへ、１４位においてＰからＡへ、または１０８位においてＱからＬへである）。
当業者には明らかであるように、そしてＡｌｂ－２３（の使用）が一般的に本発明の文脈内で好ましいが、前の段落で記載された変異体は、Ａｌｂ－２３と、Ａｌｂ－２３に特徴的である（これもまた国際公開公報第０６／１２２７８７号に記載のＡｌｂ－１のヒト化変異体と比較して）いくつかの同じアミノ酸置換（すなわちＡｌｂ－１と比較して）を共有し、従って、Ａｌｂ－２３について本明細書において記載された利点の少なくともいくつかまたはさらには全てを提供すると予期される。これらの理由から、これらの変異体もまた、本明細書において「Ａｌｂ－２３様配列」または「Ａｌｂ－２３変異体」と称される。
１つの特定でしかし非限定的な局面において、Ａｌｂ－２３変異体は、実施例５に記載された保存安定性アッセイにおいて使用した場合（すなわち、ＩＧＥ０４５および９ＧＳリンカーをさらに含む構築物の一部として）、２５℃で１ヶ月間（実施例５に示されたさらなる条件下において）保存した後のＡｌｂ－２３変異体を含む構築物についてのＳＥ－ＨＰＬＣでのプレピークは、１０％未満、好ましくは５％未満であり；そして／または４０℃で１ヶ月間（実施例５に示されたさらなる条件下において）保存した後のＡｌｂ－２３変異体を含む構築物についてのＳＥ－ＨＰＬＣでのプレピークは２０％未満、好ましくは１５％未満である。例えば、表８の比較の結果に言及されている。
いくつかのＡｌｂ－２３様配列のいくつかの非限定的な例は、配列番号３～１１に示されている。配列番号６～１１の変異体（または、天然に存在するアミノ酸残基から各々独立して選択され得、そして例えばＡ、Ｇ、Ｖ、ＬおよびＩから独立して選択され得る、１～３つのアミノ酸残基をＣ末端に有する他のＡｌｂ－２３変異体）は、アルブミン結合ナノボディがポリペプチドまたはタンパク質構築物のＣ末端に付与された場合には特に使用され得る。Ａｌｂ－２３と、配列番号６～１１の配列とのアラインメントを図２に示す。
Figure 0007304375000003
Figure 0007304375000004
従って、１つの特定であるが非限定的な局面において、本発明は、本質的にアミノ酸配列Ａｌｂ－２３（または本明細書に記載されたＡｌｂ－２３変異体の１つ）からなるタンパク質またはポリペプチドを提供する。
本明細書においてさらに記載されているように、本明細書において記載されたアミノ酸配列Ａｌｂ－２３およびさらなるＡｌｂ－２３変異体は、ポリペプチド、タンパク質、化合物（小分子を含むがそれらに限定されない）または他の治療成分などの治療部分の半減期を増加させるために、部分、結合ユニットまたは融合対として有利に使用され得る。
従って、別の局面において、本発明は、アミノ酸配列Ａｌｂ－２３（または本明細書に記載されたＡｌｂ－２３変異体の１つ）および１つ以上の他のアミノ酸配列、（結合）ドメイン、結合ユニットまたは他の部分もしくは化学成分を含むまたは本質的にからなる、ポリペプチド、タンパク質、構築物、化合物または他の化学成分を提供する。
特に、本発明は、互いに直接的にまたは１つ以上の適切なリンカーもしくはスペーサーを介してのいずれかで適切に連結された、アミノ酸配列Ａｌｂ－２３（または本明細書に記載されたＡｌｂ－２３変異体の１つ）および１つ以上（例えば１または２つ）の治療部分（これは同じであってもまたは異なっていてもよく、そして例えば、同じターゲットに対して指向されていてもまたは異なるターゲットに対して指向されていてもよく、そして同じターゲットに指向されている場合には、前記ターゲットの同じまたは異なるエピトープ、部分、ドメインまたはサブユニットに対して指向され得る）を含む、ポリペプチド、タンパク質、構築物、化合物または他の化学成分を提供する。このようなポリペプチド、タンパク質または構築物は、例えばであってこれに限定されることはないが、本明細書においてさらに記載されているような、融合タンパク質であり得る。
本発明はさらに、このようなポリペプチド、タンパク質、構築物または化合物の治療使用、およびこのようなポリペプチド、タンパク質、構築物または化合物を含む薬学的組成物に関する。
１つの局面において、少なくとも１つの治療部分は、治療タンパク質、ポリペプチド、化合物、因子または他の成分を含むかまたは本質的にからなる。好ましい態様において、治療部分は、所望の抗原またはターゲットに対して指向され、所望の抗原に結合することができ（特に所望の抗原に特異的に結合することができ）、そして／または所望のターゲットと相互作用することができる。別の態様において、少なくとも１つの治療部分は、治療タンパク質またはポリペプチドを含むかまたは本質的にからなる。さらなる態様において、少なくとも１つの治療部分は、結合ドメインもしくは結合ユニット、例えば免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン配列（免疫グロブリンのフラグメントを含むがそれに限定されない）、例えば抗体もしくは抗体フラグメント（ＳｃＦｖフラグメントを含むがそれに限定されない）、または別の適切なタンパク質骨格、例えばプロテインＡドメイン（例えばAffibodies（登録商標））、テンダミスタット、フィブロネクチン、リポカリン、ＣＴＬＡ－４、Ｔ細胞レセプター、設計アンキリンリピート、アビマー（avimer）およびＰＤＺドメイン（Binz et al., Nat. Biotech 2005, Vol 23:1257）、並びにＤＮＡもしくはＲＮＡに基づいた結合部分（ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマーを含むがそれらに限定されない）（Ulrich et al., Comb Chem High Throughput Screen 2006 9(8):619-32）を含むかまたは本質的にからなる。
さらに別の局面において、少なくとも１つの治療部分は、抗体可変ドメイン、例えば重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインを含むかまたは本質的にからなる。
好ましい局面において、少なくとも１つの治療部分は、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばドメイン抗体、単一ドメイン抗体、「ｄＡｂ」またはナノボディ（例えばＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨまたはラクダ化ＶＨ）またはＩｇＮＡＲドメインを含むかまたは本質的にからなる。
特定の態様において、少なくとも１つの治療部分は、少なくとも１つの一価ナノボディまたは二価、多価、二重特異的または多重特異的ナノボディ構築物を含むかまたは本質的にからなる。
Ａｌｂ－２３（またはＡｌｂ－２３変異体）および１つ以上の治療部分を含む、ポリペプチド、（融合）タンパク質、構築物または化合物は、一般的に上で引用された従来技術（例えば国際公開公報第０４／０４１８６５号および国際公開公報第０６／１２２７８７号）に記載されているように、しかし前記の従来技術に記載された半減期を増加させる部分の代わりにＡｌｂ－２３またはＡｌｂ－２３変異体を用いて（調製および使用）され得る。
Ａｌｂ－２３（またはＡｌｂ－２３変異体）および１つ以上の治療部分を含む、ポリペプチド、（融合）タンパク質、構築物または化合物は、一般的にそして好ましくは、治療部分または部分群単独と比較して、増加した半減期を有するだろう。
一般的に、本明細書に記載された構築物または融合タンパク質は、好ましくは、対応する治療部分単独の半減期に対して（ヒトまたは適切な動物、例えばマウスまたはカニクイザルのいずれかで測定されるような）、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍、または２０倍を超えた半減期を有する。
また、好ましくは、任意のこのような融合タンパク質または構築物は、ヒトにおいて、対応する治療部分単独の半減期と比較して、１時間を超える、好ましくは２時間を超える、より好ましくは６時間を超える、例えば１２時間を超えて増加した半減期を有する。
また、好ましくは、任意の融合タンパク質または構築物は、ヒトにおいて、１時間を超える、好ましくは２時間を超える、より好ましくは６時間を超える、例えば１２時間を超える、例えば約１日間、２日間、１週間、２週間または３週間、好ましくは２ヶ月間を超えない半減期を有するが、後者はあまり重要ではない場合がある。
半減期は、一般的に、例えばリガンドの分解および／または自然機序によるリガンドのクリアランスまたは捕獲に因り、血清中ポリペプチド濃度が、in vivoにおいて５０％減少する時間と定義することができる。特に、半減期は国際公開公報第２００９／０６８６２７号に定義されている通りであり得る。
薬物動態解析および半減期の決定のための方法は、当業者にはよく知られている。詳細は、Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for PharmacistsおよびPeters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996)に見出され得る。Marcel Dekkerによって刊行された「Pharmacokinetics」, M Gibaldi & D Perron、改訂第２版(1982)にも言及されている。
記載されているように、１つの局面において、アミノ酸配列Ａｌｂ－２３（または本明細書に記載されたＡｌｂ－２３変異体の１つ）を使用して、（１つ以上の）免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばドメイン抗体、単一ドメイン抗体、「ｄＡｂ」、ＶＨＨまたはナノボディ（例えばＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨまたはラクダ化ＶＨ、例えばラクダ化ヒトＶＨ）の半減期を増加させることができる。
特に、本明細書に記載されているように、アミノ酸配列Ａｌｂ－２３（または本明細書に記載されたＡｌｂ－２３変異体の１つ）を有利に使用して、２つ以上（例えば２または３つ）のジスルフィド橋を含む免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばＶＨＨ－１クラスのＶＨＨ／ナノボディの半減期を増加させることができる。
従って、本発明の１つの態様は、互いに直接的にまたは場合により１つ以上の適切なリンカーもしくはスペーサーを介してのいずれかで適切に連結された、アミノ酸配列Ａｌｂ－２３（または本明細書に記載されたＡｌｂ－２３変異体の１つ）および１つ以上（例えば１または２つ）の免疫グロブリン単一可変ドメイン配列を含む、ポリペプチド、構築物または融合タンパク質に関する。本明細書に記載されているように、このようなポリペプチド、構築物または融合タンパク質に存在する各々のこのような免疫グロブリン単一可変ドメインは、独立して、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体、「ｄＡｂ」またはナノボディ（例えばＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨまたはラクダ化ＶＨ、例えばラクダ化ヒトＶＨ）であり得；そして１つの特定であるが非限定的な局面によると、これらの免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つ（および最大全部）は、２または３つのジスルフィド橋を含む。
好ましくは、各々のこのような免疫グロブリン単一可変ドメインはナノボディであり；そして１つの特定であるが非限定的な局面によると、これらの免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つ（および最大全部）は、ＶＨＨ－１クラスのナノボディである。
例えばであって限定するものではないが、このような構築物、融合タンパク質またはポリペプチドは：
－ １コピーのＡｌｂ－２３（または本明細書に記載されたＡｌｂ－２３変異体の１つ）および１つのこのような免疫グロブリン単一可変ドメイン配列；
－ １コピーのＡｌｂ－２３（または本明細書に記載されたＡｌｂ－２３変異体の１つ）および２つのこのような免疫グロブリン単一可変ドメイン配列（これは同じであっても異なっていてもよい）；
またはさらには（通常必要とされずあまり好ましくはないが、なぜなら得られるタンパク質がより大きいからである）
－ ２コピーのＡｌｂ－２３（または本明細書に記載された２コピーのＡｌｂ－２３変異体、これは同じであっても異なっていてもよい）および１つのこのような免疫グロブリン単一可変ドメイン配列；
－ ２コピーのＡｌｂ－２３（または本明細書に記載された２コピーのＡｌｂ－２３変異体、これは同じであっても異なっていてもよい）および２つのこのような免疫グロブリン単一可変ドメイン配列（これは同じであっても異なっていてもよい）；
－ １コピーのＡｌｂ－２３および３つのこのような免疫グロブリン単一可変ドメイン配列（これは同じであっても異なっていてもよい）
を含み得る。
本発明の構築物、融合タンパク質またはポリペプチドのいくつかの非限定的な例は、以下のように図で示され得、「［Ａｌｂ－２３］」はＡｌｂ－２３（または本明細書に記載されたＡｌｂ－２３変異体の１つ）を示し、「［治療部分１］」および「［治療部分２］」は治療部分（これは記載されているように、各々独立して、免疫グロブリン単一可変ドメインであり得る）を示し、「－」は適切なリンカー（これは任意である）を示し、そしてＮ末端は左手側であり、そしてＣ末端は右手側である：
［Ａｌｂ－２３］－［治療部分１］
［治療部分１］－［Ａｌｂ－２３］
［Ａｌｂ－２３］－［治療部分１］－［治療部分１］
［治療部分１］－［治療部分１］－［Ａｌｂ－２３］
［治療部分１］－［Ａｌｂ－２３］－［治療部分１］
［Ａｌｂ－２３］－［治療部分１］－［治療部分２］
［治療部分１］－［治療部分２］－［Ａｌｂ－２３］
［治療部分１］－［Ａｌｂ－２３］－［治療部分２］。
２つ以上の異なる治療部分（例えば２つ以上の異なる免疫グロブリン単一可変ドメイン）が本発明の構築物またはポリペプチドに存在する場合、それらは同じであってもまたは異なっていてもよく、そしてそれらが異なっている場合には、同じターゲットに対して（例えば、前記ターゲットの同じまたは異なる部分、ドメイン、サブユニットまたはエピトープに対して）指向されていてもまたは異なるターゲットに対して指向されていてもよい。
従って、別の局面において、本発明は、Ａｌｂ－２３（または本明細書に記載されたＡｌｂ－２３変異体の１つ）並びに少なくとも１つの他のナノボディ（例えば１または２つの他のナノボディ、これは同じであってもまたは異なっていてもよい）（前記の少なくとも１つの他のナノボディは、好ましくは、所望のターゲット（これは好ましくは治療ターゲットである）に対して指向される）および／または別のナノボディ（治療、予防および／または診断目的に有用または適切である）を含む、多重特異的（特に二重特異的）ナノボディ構築物に関する。ここでも、Ａｌｂ－２３および他のナノボディは、互いに直接的にまたは場合により１つ以上の適切なリンカーもしくはスペーサーを介してのいずれかで適切に連結され得、そして１つの特定であるが非限定的な局面によると、他のナノボディの少なくとも１つ（および最大全部）は、ＶＨＨ－１クラスであり得る。
１つ以上のナノボディを含む多価および多重特異的ポリペプチドおよびその調製の一般的な記載については、Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001; Muyldermans, Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001), 277-302；並びに例えば国際公開公報第９６／３４１０３号、国際公開公報第９９／２３２２１号、国際公開公報第０４／０４１８６２号、国際公開公報第２００６／１２２７８６号、国際公開公報第２００８／０２００７９号、国際公開公報第２００８／１４２１６４号または国際公開公報第２００９／０６８６２７号にも言及されている。
本発明のいくつかの特定の多重特異的および／または多価ポリペプチドのいくつかの他の例は、本明細書に記載されたAblynx N.V.による出願にも見出すことができる。特に、半減期を増加させるための血清タンパク質に対する少なくとも１つのナノボディを含む多価および多重特異的構築物、それをコードする核酸、それを含む組成物、前記の調製、および前記の使用の一般的な記載については、上記の国際出願の国際公開公報第０４／０４１８６５号および国際公開公報第０６／１２２７８７号（本明細書に記載されたＡｌｂ－２３およびＡｌｂ－２３変異体は、一般的に、Ａｌｂ－８などのそこに記載された半減期を延長するナノボディと同じように使用することができる）、並びに国際公開公報第０４／０４１８６２号、国際公開公報第２００６／１２２７８６号、国際公開公報第２００８／０２００７９号、国際公開公報第２００８／１４２１６４号または国際公開公報第２００９／０６８６２７号に示されたこのような構築物の一般的な記載および具体例に言及されている。
１つの非限定的な態様において、このようなポリペプチドまたはタンパク質構築物に存在する１つ以上の他のナノボディは、ｃ－Ｍｅｔに対して指向され得、そして特に、ｃ－－Ｍｅｔに対して指向されるＩ型ナノボディであり得る。このようなポリペプチドまたはタンパク質構築物に存在し得るｃ－Ｍｅｔに対するナノボディのいくつかの非限定的な例は、例えば、本明細書に記載された前以て公開されていない米国出願の米国特許第６１／３８８，１７２号および米国特許第６１／４５１，８６９号に見出され得る。
このような多価および／または多重特異的ポリペプチドに存在し得るｃ－Ｍｅｔに対する１つの特に好ましいＩ型ナノボディ（Ａｌｂ－２３またはＡｌｂ－２３変異体の次に）は、４Ｅ０９（米国特許第６１／４５１，８６９号の配列番号２６および本明細書の配列番号１２）またはその変異体である。このような４Ｅ０９の変異体は、一般的に、米国特許第６１／４５１，８６９号に記載されている通りであり得（そして一般的に、４Ｅ０９に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％またはそれ以上、例えば９５％またはそれ以上の配列同一性を有する）、そして好ましくは（ｉ）それがｃ－Ｍｅｔへの結合に関して４Ｅ０９と競合する（実施例７に記載されたalphascreenアッセイなどの適切な結合アッセイにおいて、しかし実施例７に使用されたようなＨＧＦの代わりに４Ｅ０９を使用して）；および／または（ｉｉ）それがｃ－Ｍｅｔ上の４Ｅ０９と同じエピトープと結合する；および／または（ｉｉｉ）ｃ－Ｍｅｔに対する４Ｅ０９の結合を交差遮断する（国際公開公報第２００９／０６８６２７号に定義されているように）ようなものである。このような４Ｅ０９の変異体は、例えば、４Ｅ０９のヒト化および／または配列最適化変異体（米国特許第６１／４５１，８６９号にさらに記載されているような）であり得る。このようなタンパク質またはポリペプチドに存在し得る４Ｅ０９の変異体のいくつかの好ましいが非限定的な例は、以下であり、これはまた米国特許第６１／４５１，８６９号にも記載されている；０４Ｅ０９（Ｌ４９Ｓ）；０４Ｅ０９（Ｃ５０Ｓ／Ｃ１００ｂＧ）；０４Ｅ０９（Ｃ２２Ａ／Ｃ９２Ｓ）；Ａ００７９００６７ ＝４Ｅ０９（Ｑ１０８Ｌ）；Ａ００７９００６８＝４Ｅ０９（Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｑ１０８Ｌ）；Ａ００７９００６９＝４Ｅ０９（Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｇ８８Ａ，Ｑ１０８Ｌ）およびＡ００７９０１０５＝４Ｅ０９（Ｅ１Ｄ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｇ８８Ａ，Ｑ１０８Ｌ）（後者が特に好ましい）。４Ｅ０９およびこれらの変異体のアミノ酸配列は、配列番号１２～１９に示される。
従って、１つの特定であるが非限定的な局面において、本発明は、ｃ－Ｍｅｔに対する１または２つのナノボディに適切に連結された（直接的にまたは１つ以上の適切なリンカーを介してのいずれかで）、Ａｌｂ－２３（好ましい）またはＡｌｂ－２３変異体（本明細書において記載したような）を含むかまたは本質的にからなるポリペプチドまたはタンパク質構築物に関する。記載されているように、特定であるが非限定的な局面によると、ｃ－Ｍｅｔに対する前記の１または２つのナノボディは、２つのジスルフィド橋を含む（すなわち「クラスＩ」である）。
特に、本発明は、４Ｅ０９（配列番号１２）または４Ｅ０９の変異体（本明細書および米国特許第６１／４５１，８６９号に記載されているような）、好ましくは４Ｅ０９のヒト化または配列最適化変異体、より好ましくはＡ００７９０１０５（配列番号１９）である、ｃ－Ｍｅｔに対する１または２つ（好ましくは唯１つ）のナノボディに適切に連結された（直接的にまたは１つ以上の適切なリンカーを介してのいずれかで）、Ａｌｂ－２３（好ましい）またはＡｌｂ－２３変異体（本明細書に記載されているような）を含むかまたは本質的にからなる、ポリペプチドまたはタンパク質構築物に関する。
このようなタンパク質およびポリペプチドのいくつかの特定であるが非限定的な例は、構築物Ａｌｂ２３－９ＧＳ－４Ｅ０９、４Ｅ０９－９ＧＳ－Ａｌｂ２３、Ａｌｂ２３－９ＧＳ－Ａ００７９０１０５、Ａ００７９０１０５－９ＧＳ－Ａｌｂ２３、Ａｌｂ２３－３５ＧＳ－４Ｅ０９、４Ｅ０９－３５ＧＳ－Ａｌｂ２３、Ａｌｂ２３－３５ＧＳ－Ａ００７９０１０５、Ａ００７９０１０５－３５ＧＳ－Ａｌｂ２３およびＡ００７９０１０５－３５ＧＳ－Ａ００７９０１０５－３５ＧＳ－Ａｌｂ２３である。これらの配列は、それぞれ配列番号２０～２８に示される。これらの中で、構築物Ａ００７９０１０５－９ＧＳ－Ａｌｂ２３（配列番号２３）が特に好ましく、従って、本発明の１つの局面はまた、配列番号２３のポリペプチドに対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドに関する。
本発明はまた、本明細書に記載されたアミノ酸配列、融合タンパク質および構築物をコードするヌクレオチド配列または核酸に関する。本発明はさらに、前記のヌクレオチド配列または核酸およびそれ自体公知である遺伝子構築物のための１つ以上のエレメントを含む遺伝子構築物を含む。遺伝子構築物は、プラスミドまたはベクターの形態であり得る。ここでも、このような構築物は、一般的に、Ablynx N.V.の公開特許出願、例えば国際公開公報第０４／０４１８６２号、国際公開公報第２００６／１２２７８６号、国際公開公報第２００８／０２００７９号、国際公開公報第２００８／１４２１６４号または国際公開公報第２００９／０６８６２７号に記載された通りであり得る。
本発明はまた、このようなヌクレオチド配列もしくは核酸を含む、および／または本明細書に記載されたアミノ酸配列、融合タンパク質および構築物を発現する（または発現することのできる）、宿主もしくは宿主細胞に関する。ここでも、このような宿主細胞は、一般的に、Ablynx N.V.の公開特許出願、例えば国際公開公報第０４／０４１８６２号、国際公開公報第２００６／１２２７８６号、国際公開公報第２００８／０２００７９号、国際公開公報第２００８／１４２１６４号または国際公開公報第２００９／０６８６２７号に記載された通りであり得る。
本発明はまた、本明細書に記載されたようなアミノ酸配列、融合タンパク質または構築物を調製するための方法に関し、前記方法は、本明細書に記載されたような宿主細胞を、前記宿主細胞が、本明細書に記載されたようなアミノ酸配列、融合タンパク質または構築物を産生または発現する条件下で培養または維持することを含み、そして場合によりさらに、このようにして産生されたアミノ酸配列、融合タンパク質または構築物を単離することを含む。ここでも、このような方法は、Ablynx N.V.の公開特許出願、例えば国際公開公報第０４／０４１８６２号、国際公開公報第２００６／１２２７８６号、国際公開公報第２００８／０２００７９号、国際公開公報第２００８／１４２１６４号または国際公開公報第２００９／０６８６２７号に一般的に記載された通りに実施され得る。
本発明はまた、本明細書に記載されたような少なくとも１つのアミノ酸配列、融合タンパク質または構築物、および場合により少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む、薬学的組成物に関する。このような調製物、担体、賦形剤および希釈剤は、一般的に、Ablynx N.V.の公開特許出願、例えば国際公開公報第０４／０４１８６２号、国際公開公報第２００６／１２２７８６号、国際公開公報第２００８／０２００７９号、国際公開公報第２００８／１４２１６４号または国際公開公報第２００９／０６８６２７号に記載された通りであり得る。
しかしながら、本明細書に記載されたアミノ酸配列、融合タンパク質または構築物は増加した半減期を有するので、それらは好ましくは循環中に投与される。従って、それらは、アミノ酸配列、融合タンパク質または構築物が循環中に入ることを可能とする任意の適切な方法で、例えば注射または点滴を介して静脈内に、あるいは、アミノ酸配列、融合タンパク質または構築物が循環中に入ることを可能とする任意の他の適切な方法で（経口投与、皮下投与、筋肉内投与、皮膚を通した投与、鼻腔内投与、肺を介した投与などを含む）投与され得る。適切な投与法および投与経路は、ここでもまた、例えばAblynx N.V.の公開特許出願、例えば国際公開公報第０４／０４１８６２号、国際公開公報第２００６／１２２７８６号、国際公開公報第２００８／０２００７９号、国際公開公報第２００８／１４２１６４号または国際公開公報第２００９／０６８６２７号の教義から当業者には明らかであろう。
従って、別の局面において、本発明は、本明細書に記載されたような融合タンパク質または構築物の使用によって予防または治療することのできる少なくとも１つの疾病または疾患の予防および／または治療のための方法に関し、前記方法は、それを必要とする被験体に、薬学的に有効な量の本発明の融合タンパク質または構築物、および／またはそれを含む薬学的組成物を投与することを含む。本明細書に記載されたような融合タンパク質または構築物の使用によって予防または治療することのできる疾病および疾患は、一般的には、本発明の融合タンパク質または構築物に存在する治療部分の使用によって予防または治療することのできる疾病および疾患と同じである。
本発明の文脈において、「予防および／または治療」という用語は、疾病を予防および／または治療することを含むだけでなく、一般的に、疾病の発症の予防、疾病の進行の遅延もしくは逆行、疾病に関連した１つ以上の症状の発症の予防もしくは遅延、疾病に関連した１つ以上の症状の低減および／または寛解、疾病および／またはそれに関連した任意の症状の重度および／または持続期間の低減、および／または疾病および／またはそれに関連した任意の症状の重度のさらなる増加の予防、疾病によって引き起こされた任意の生理学的損傷の予防、低減もしくは逆行、並びに一般的には処置される患者に対して有益なあらゆる薬理学的作用を含む。
処置しようとする被験体は、任意の恒温動物であり得るが、特に哺乳動物であり、より特定するとヒトである。当業者には明らかであるように、処置しようとする被験体は、特に、本明細書に記載された疾病および疾患を患うまたはそのリスクがあるヒトである。
別の態様において、本発明は、免疫療法のための、特に受動免疫療法のための方法に関し、前記方法は、本明細書に記載された疾病および疾患を患うまたはそのリスクのある被験体に、薬学的に有効な量の本発明の融合タンパク質もしくは構築物および／またはそれを含む薬学的組成物を投与することを含む。
融合タンパク質もしくは構築物および／またはそれを含む組成物は、予防または治療しようとする疾病または疾患を予防および／または治療するに適した処置計画に従って投与される。臨床医は、一般的に、予防または治療しようとする疾病または疾患、処置しようとする疾病の重度および／またはその症状の重度、使用しようとする本発明の具体的なポリペプチド、具体的な投与経路、並びに使用しようとする薬学的製剤または組成物、患者の年齢、性別、体重、食事、全般的な状態、並びに臨床医には公知の類似の因子などの、因子に依存して、適切な処置計画を決定することができる。
一般的に、処置計画は、１つ以上の薬学的に有効な量または投与量での、本発明の１つ以上の融合タンパク質もしくは構築物、またはそれを含む１つ以上の組成物の投与を含む。投与しようとする具体的な量または投与量は、ここでも上で引用した因子に基づいて臨床医によって決定され得る。
一般的に、本明細書において記載された疾病および疾患の予防および／または処置のために、処置しようとする具体的な疾病または疾患、使用しようとする具体的な融合タンパク質または構築物の作用強度および／または半減期、具体的な投与経路、並びに使用される具体的な薬学的製剤または組成物に依存して、本発明のナノボディおよびポリペプチドは、一般的に、連続的に（例えば点滴によって）、１日１回量としてまたは１日の中に複数回分割した投与量としてのいずれかで、一日あたり１ｇ～０．０１μg/kg（体重）、好ましくは一日あたり０．１ｇ～０．１μg/kg（体重）、例えば一日あたり約１、１０、１００または１０００μg/kg（体重）の量で投与される。臨床医は、一般的に、本明細書に記載された因子に依存して適切な１日量を決定することができるだろう。また、特定の場合、臨床医は、例えば上に引用した因子および臨床医の専門的な判断に基づいて、これらの量から逸脱することを選択し得ることも明らかである。一般的には、投与しようとする量に対するいくつかのアドバイスを、同じ経路を本質的に介して投与される同じターゲットに対する同等な慣用的な抗体または抗体フラグメントのために通常投与される量から、しかしながら当業者には公知の親和性／結合力、効力、体内分布、半減期および類似の因子の差異を考慮して得ることができる。
通常、上の方法において、本発明の単一のポリペプチドが使用される。しかしながら、本発明の２つ以上のポリペプチドを組み合わせて使用することも本発明の範囲内である。
本発明のポリペプチドはまた、１つ以上のさらなる薬学的に活性な化合物または成分と組み合わせて、すなわち組合せ処置計画として使用されてもよく、これは相乗作用をもたらしてももたらさなくてもよい。ここでも臨床医は、このようなさらなる化合物または成分、並びに適切な組合せ処置計画を、上で引用した因子および臨床医の専門的な判断に基づいて選択することができるだろう。
特に、本発明のポリペプチドは、本発明の融合タンパク質または構築物を用いて予防または治療することのできる疾病および疾患の予防および／または治療のために使用されるまたは使用することのできる他の薬学的に活性な化合物または成分と組合せて使用され得、その結果として、相乗作用が得られても得られなくてもよい。
本発明に従って使用される処置計画の効力は、臨床医には明らかであるように、関与する疾病または疾患についてそれ自体公知である任意の方法で決定および／または追跡され得る。臨床医は、適宜またはケースバイケースで、特定の処置計画を変更または改変することができ、これにより、所望の治療効果を達成し、望ましくない副作用を回避、制限または減少させ、そして／または、一方で所望の治療効果を達成することと、他方で望ましくない副作用を回避、制限もしくは減少させることの間の適切なバランスを達成することができる。
一般的には、処置計画は、所望の治療効果が達成されるまで、そして／または所望の治療効果を維持しようとする限り続けられる。ここでも、これは臨床医によって決定され得る。
処置しようとする被験体は任意の恒温動物、特に哺乳動物、より特定するとヒトであり得る。当業者には明らかであるように、処置しようとする被験体は、特に、本明細書に記載された疾病および疾患を患うまたはそのリスクがあるヒトである。
本発明の他の局面、態様、利点および適用は、本明細書のさらなる記載から明らかとなろう。
本発明は、ここで、非限定的な実験部および図面によってさらに説明されるだろう。
図１は、Ａｌｂ－２３（配列番号１）と、国際公開公報第０６／１２２７８７号に記載されたＡｌｂ－１およびその種々のヒト化変異体のアラインメントである。 図２は、Ａｌｂ－２３（配列番号１）と、本明細書に記載されたいくつかのＡｌｂ－２３変異体のアラインメントである。 図３は、本明細書に言及された種々の配列を示す。 図３は、本明細書に言及された種々の配列を示す。 図３は、本明細書に言及された種々の配列を示す。 図３は、本明細書に言及された種々の配列を示す。 図３は、本明細書に言及された種々の配列を示す。 図３は、本明細書に言及された種々の配列を示す。 図３は、本明細書に言及された種々の配列を示す。 図３は、本明細書に言及された種々の配列を示す。 図３は、本明細書に言及された種々の配列を示す。 図３は、本明細書に言及された種々の配列を示す。 図４は、低い（Ｌ＝１）および高い（Ｈ＝１を超える）コピー数（ＣＮ）の発現カセットを用いてPichiaクローンによって産生されたＡ００７９００００９のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を使用した発現プロファイルを示す。 図５は、低い（Ｌ＝１）および高い（Ｈ＝１を超える）コピー数（ＣＮ）の発現カセットを用いてPichiaクローンによって産生されたＡ００７９００１７１のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を使用した発現プロファイルを示す。 図６は、低い（Ｌ＝１）および高い（Ｈ＝１を超える）コピー数（ＣＮ）の発現カセットを用いてPichiaクローンによって産生されたＡ００７９０００５７およびＡ００７９０００５８のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を使用した発現プロファイルを示す。 図７は、低い（Ｌ＝１）および高い（Ｈ＝１を超える）コピー数（ＣＮ）の発現カセットを用いてPichiaクローンによって産生されたＡ００７９０１２１９変異体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を使用した発現プロファイルを示す。 図８は、Pichia pastorisにおけるＡ００７００１７１およびＡ００７０１２１９の発現の誘導終了時の発酵試料のＳＤＳ－Ｐａｇｅ（非還元条件）を示す。５μLの無細胞培地をゲル上にローディングする（レーン１～４）。レーン５～７は種々の量でローディングされた対照ナノボディを含む。左のレーンは分子量マーカーを含む。
実験部：
実施例１：Ａｌｂ１１またはＡｌｂ２３と組み合わせた４Ｅ０９の発現プロファイル
表１は、Ａｌｂ１１およびＡｌｂ２３と組み合わせた抗ｃ－Ｍｅｔ４Ｅ０９ＶＨＨ１ナノボディビルディングブロック（配列番号１２）に基づいたフォーマットの概要を示す。種々のナノボディをpPiczalpha発現ベクターにクローニングし、そしてPichia pastoris X-33株（Invitrogen/RCTから市販されている発現系）において形質転換した。クローンを、ゼオシン含有プレート上で選択し、そしてｑＰＣＲを実施して、そのコピー数に従ってクローンを順位付けした。振とうフラスコ実験において低いコピー数のクローンと高いコピー数のクローンとの間の発現レベルを比較した。発現レベルとコピー数との間の逆相関がＡｌｂ１１含有フォーマットにおいて観察された（図４および５）。対照的に、発現レベルとコピー数の間の正の相関が、Ａｌｂ２３ナノボディを含むナノボディフォーマットで観察された（図６および７）。
Figure 0007304375000005
実施例２：Ａｌｂ１１またはＡｌｂ２３と組み合わせた４Ｅ０９の発酵収量
Ａ００７９００１７１（最適化された４Ｅ９配列－９ＧＳ－Ａｌｂ１１）およびＡ００７９０１２１９（最適化された４Ｅ９配列－９ＧＳ－Ａｌｂ２３）Nanobody（登録商標）の発現を、宿主生物としてPichia pastoris X33を使用して評価した。ＡＯＸプロモーター（ＭｅＯＨ誘導性プロモーター）およびＧＡＰプロモーター（構成性誘導性プロモーター）の両方を評価した。
ペプトンをベースとした複合培地を、発酵プロセスに使用した。ＡＯＸプロモーターを使用したＸ３３クローンを用いての発酵のために、ＭｅＯＨを、ナノボディの発現のために使用した。要するに、このプロセスは３つの期間に分類することができる：バッチ期、グリセロールフェッドバッチ期、およびＭｅＯＨ誘導期。バッチ期およびグリセロールフェッドバッチ期の間、バイオマスは約４０％まで構築された（湿重量／容量）。その後、ＭｅＯＨ適応期および誘導期を開始し、その間にNanobody（登録商標）が発現されそして培地中に分泌された。
ＧＡＰプロモーターを使用したＸ３３クローンを用いての発酵のために、グルコースを使用してNanobody（登録商標）の発現を誘導した。このプロセスもまた３つの期間に分類することができる：グリセロール上でのバッチ期、約４０％（湿重量／容量）までバイオマスを構築する高いフィード速度を使用したグルコースフェッドバッチ期、およびNanobody（登録商標）の発現／分泌をさらに誘導するためのより低いフィード速度での２回目のグルコースフェッドバッチ期。
全ての発酵を、Sartorius装置（Biostat（登録商標）Aplus、Biostat（登録商標）BplusおよびBiostat（登録商標）Bplusツインコントローラー、2L Univessel（登録商標）リアクター、ＭＦＣＳｗｉｎソフトウェアを介してコントロール）を使用して２Ｌの発酵規模で実施した。発酵中、以下のパラメーターをモニタリング／導いた：ＤＯ（溶存酸素）、ｐＨ、気泡化、バイオマス（E.coliについてはＯＤ６００およびPichia pastorisについては湿細胞重量（ＷＣＷ））、発現レベル、および産物の品質。ＤＯは典型的には３０％であり、そして撹拌カスケードを介してコントロールされ、そして必要に応じて純粋な酸素の添加によりさらに補われた。ｐＨはｐＨ電極を介してモニタリングされ、そしてベースポンプ（base pump）を介したアンモニアの添加を介して調整された。オフラインでのｐＨ測定を行ない、オートクレーブ後に機能しているｐＨ電極を確認した。
表２は、宿主生物としてPichia pastorisを使用してＡ００７９００１７１およびＡ００７９０１２１９の発現のために実施された発酵の操作の概要を示す。
図８は、Pichia pastorisを用いての種々の発酵の誘導終了時の試料のＳＤＳ－Ｐａｇｅ分析（非還元条件）を示す。
表３において、種々のPichia pastorisを用いての発酵と、そのそれぞれのパラメーター設定、発酵特徴、およびＳＤＳ－Ｐａｇｅ分析に基づいた誘導終了時の試料の推定される発現収量の概要が示されている。
発酵終了時に産生されるNanobody（登録商標）の力価および純度は、小規模のプロテインＡクリーンアップ手順、その後のＲＰ－ＨＰＬＣ分析を介して決定された。要するに、試料の調製は、培地からNanobody（登録商標）を精製するプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーに基づく。溶出画分のタンパク質濃度は、ＵＶ分光光度法を使用して決定され、そして逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって追跡され、これにより産物の力価および産物の純度／不均一性の決定が可能となる。表４はＲＰＣの結果を要約する。
Figure 0007304375000006
Figure 0007304375000007
Figure 0007304375000008
実施例３：Ａ００７９００１７１およびＡ００７９０１２１９の精製
Ａ００７９００１７１分子およびＡ００７９０１２１９分子の両方を、表５に示されたスキームに従って精製した。
Figure 0007304375000009
実施例４：Ａｌｂ－１、Ａｌｂ－８（＝Ａｌｂ－１１）およびＡｌｂ－２３の特性の比較
Ａｌｂ－１、Ａｌｂ－８およびＡｌｂ－２３の種々の特性を決定し、そして比較した。結果を表６に示す。
また、Ａｌｂ－８およびＡｌｂ－２３が二量体を形成する傾向の対照比較のために、ＰＢＳバッファー中での種々の温度における一価Ａｌｂ－８（Ｅａ＝７３．０kcal/mol）およびＡｌｂ－２３（Ｅａ＝５０．８kcal/mol）の二量体化動態を、アレニウスプロットから計算した。結果を表７に示し、そしてＡｌｂ－１１について、動態は、特にＡｌｂ－２３と比較して、室温から上昇し始めることを示す。
Figure 0007304375000010
Figure 0007304375000011
実施例５：Ａｌｂ－１１と比較してＡｌｂ－２３を含む構築物の保存安定性
Ａｌｂ－８およびＡｌｂ－２３をそれぞれ含む二重特異的構築物の保存安定性を比較するために、Ａｌｂ－２３（ＩＧＥ０４５－９ＧＳ－ＡＬＢ２３；配列番号４１）およびＡｌｂ－１１（ＩＧＥ０４５－９ＧＳ－ＡＬＢ１１；配列番号４２）に連結されたＩｇＥ（ＩｇＥ０４５、配列番号４３）に対する同じナノボディを含む２つの二重特異的ナノボディ構築物を調製し、５０mg/mlの濃度でＤ－ＰＢＳバッファー中で製剤化し、そしてプラスチックＰＣＲチューブ中で暗闇下で１ヶ月間、種々の温度で保存した。その後、プレピークの量（二量体の形成に相当する）を決定し、そしてＳＥ－ＨＰＬＣを使用して比較した。ＳＥ－ＨＰＬＣ分析を、ＢｉｏＳｅｐ ＳＥＣ－２０００カラム（Phenomenex）およびランニングバッファーとしてＤ－ＰＢＳを使用して、０．２ml/分の流速で実施した。１０μgの材料を注入し、そしてデータをChromeleonソフトウェアを使用して分析した。結果を表８に示す。
類似の実験において、２つの三価二重特異的構築物の保存安定性を比較した（２０mM Ｈｉｓバッファー、ｐＨ６．５、８％スクロース中５０mg/mlの濃度で）。構築物は、Ａｌｂ－１１およびＯＸ４０Ｌに対する２つのナノボディ（２０１０年１２月１４日に出願されたAblynx N.V.のＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６９６０６の配列番号２２９を参照されたい）を含む三価二重特異的ナノボディ構築物であるＯＸ４０Ｌ０７９（配列番号４４）、およびＯＸ４０Ｌに対する同じ２つのナノボディと、Ａｌｂ－１１の代わりにＡｌｂ－２３とを含む対応する構築物であるＯＸ４０Ｌ０８９（配列番号４５）であった。結果をまた表８Ａに示す。
Figure 0007304375000012
別の実験において、ｃ－Ｍｅｔに対する４つの異なるナノボディ構築物（Ａ００７９０１２２２／配列番号４６；Ａ００７９０１２５６／配列番号４７；Ａ００７９０１２５９／配列番号４８およびＡ００７９０１２６０／配列番号４９）の発酵収量と保存安定性を比較した。これらの構築物の中で、Ａ００７９０１２２２は、Ａｌｂ－２３アルブミン結合ナノボディ（本発明）並びに「ＶＨＨ－１型」抗ｃ－Ｍｅｔナノボディ（４Ｅ０９－ここでも、上で言及した米国特許出願第６１／３８８，１７２号および米国特許第６１／４５１，８６９号を参照されたい）を含み、一方、他の構築物（比較参照として使用される）は、Ａｌｂ－１１アルブミン結合ナノボディおよびＶＨＨ－１型ではない抗ｃ－Ｍｅｔナノボディを含む。使用される構築物のより詳細な説明については、２０１２年３月３０日に出願された出願人による同時係属中の米国特許出願第１３／４３５，５６７号（Beste et al.）に言及されている。
種々のナノボディ構築物がPichia pastorisにおいて産生され（ここでも米国特許第１３／４３５，５６７号、米国特許第６１／３８８，１７２号および米国特許第６１／４５１，８６９号を参照されたい）、そして幅広く同等な発酵収量をもたらし（１．０３ｇ/Ｌ；Ａ００７９０１２５６については１．４３ｇ/Ｌ；Ａ００７９０１２５９については０．９１ｇ/ＬおよびＡ００７９０１２６０については１．４５ｇ/Ｌ）、このことは本発明が、ＶＨＨ－１型ナノボディを含まない構築物の発現収量と同等である発現収量を有するＶＨＨ－１型ナノボディを含む構築物を提供することを可能とすることを確認する。
その後、ナノボディ構築物を精製し（ＳＥＣで９９％超の純度およびＲＰＣで９０％超の純度）、そして－７０℃、－２０℃、５℃、２５℃および４０℃でＤ－ＰＢＳ中約１５mg/mlの濃度で７．５週間かけてインキュベーションした。試料を、濁度測定（ＯＤ５００）、ＲＰ－ＨＰＬＣおよびＳＥ－ＨＰＬＣによって評価した。結果を表８Ｂに要約する。安定性は、－７０℃、－２０℃または５℃で７．５週間保存した場合に試験した全ての試料について許容可能であった。
Figure 0007304375000013
実施例６：表面プラズモン共鳴を使用した親和性の決定
ヒト、カニクイザルおよびマウスの血清アルブミンに対する抗ｃ－Ｍｅｔナノボディ－Ａｌｂ融合構築物Ａ００７９００１７１（配列番号４０）およびＡ００７９０１２１９（配列番号２３）の動態解析を、Biacore T100装置で表面プラズモン共鳴を使用して実施した。ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファー（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３mM ＥＤＴＡおよび０．０５％界面活性物質ｐ２０を含む０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．４）をランニングバッファーとして使用し、そして実験は２５℃で実施された。血清アルブミンを、５μl/分の流速で流れる手作業による固定化によってカルボキシメチル化デキストラン表面を有するシリーズＳセンサーチップチップＣＭ５に化学的に結合させた。表面をまず、７５mg/mlのＥＤＣおよび１１．５mg/mlのＮＨＳの１：１混合物（Biacoreアミンカップリングキット）の７分間かけての注入を用いて活性化した。ヒト、カニクイザルおよびマウス血清アルブミンについてそれぞれ９７０ＲＵ（フローセル２）、８９０ＲＵ（フローセル３）および１３６０ＲＵ（フローセル４）のレベルに到達するまで、１０mMアセテートｐＨ４．５中１０μg/mlの血清アルブミンを注入した。固定化後、表面を、１ＭエタノールアミンｐＨ８．５の７分間かけての注入を用いて不活性化した。ブランクのリファレンス表面（フローセル１）を前記のように活性化および不活性化した。一連のナノボディ濃度をＨＢＳ－ＥＰ＋（すなわち０nM、１．９nM、７．８nM、３１．２５nM、１２５nM、５００nM、０nM、７．８nM、１２５nM）中で調製し、４５μl/分で２分間かけて注入し（流路１、２、３および４）、そしてランニングバッファー中で１０分間かけて解離させた。種々の試料の間では、表面を、４５μl/分で１００秒間かけて再生バッファー１０mMグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．５）を用いて再生した。データは、リファレンスチャネルでの曲線およびブランクランニングバッファー注入曲線の減算によって二重参照した。加工された曲線は、Biacore T100評価ソフトウェアの結合曲線に１：１の結合モデルを当てはめることによって評価された。結合速度（on-rates）（ｋａ）、解離速度（off-rates）（ｋｄ）および親和性（ＫＤ）を報告し、そして表９に示す。
Figure 0007304375000014
実施例７：AlphascreenアッセイにおけるＭＥＴ－リガンドＨＧＦの結合
抗ｃ－ＭＥＴ／抗血清アルブミンナノボディ構築物を、ＨＧＦ－ｃＭＥＴ競合AlphaScreenアッセイにおいて特徴付けて、その遮断作用強度および効力を評価し、そしてこれを、基準抗体フラグメント（５Ｄ５ Ｆａｂ ｖ２）と比較した。２５０nMから始まり０．９pMまでの抗ｃ－ＭＥＴナノボディおよび基準５Ｄ５ Ｆａｂ ｖ２の希釈シリーズを、１００pMのビオチニル化ｈＨＧＦと共に１５分間かけて室温でインキュベーションした。この混合物に、抗ヒトＦｃコンジュゲートアクセプタービーズおよびｃ－ＭＥＴ／Ｆｃ（１００pMの最終濃度）を加え、そして室温で２時間インキュベーションした。次に、ストレプトアビジンドナービーズを加え、そして混合物をさらに１時間インキュベーションした。６８０nmの励起波長および５２０nmの発光波長を使用してEnVisionマルチラベルプレートリーダーでプレートを解読することによって蛍光を測定した。
２つの構築物が、用量依存的にｃ－ＭＥＴレセプターへのＨＧＦの結合を効率的に阻害する。計算されたＩＣ５０値および対応する９５％信頼区間を表１０に示す。Ａ００７９００１７１および２つのバッチのＡ００７９０１２１９は、類似したＩＣ５０値を有し；その９５％ＣＩは重複し、このことは、差異が統計学的に有意ではないことを示唆する。ナノボディは、基準５Ｄ５ Ｆａｂ ｖ２と比較して５倍を超える改善された作用強度を示した。
Figure 0007304375000015
実施例８：Ａ５４９ガン細胞株におけるＨＧＦにより誘導されたＭＥＴリン酸化の遮断
精製された抗ｃ－ＭＥＴ／抗血清アルブミンナノボディ構築物は、ＨＧＦ依存性リン酸化アッセイにおいて特徴付けられた。１μMから開始して０．２３nMまでの抗ｃＭＥＴ構築物または抗ｃＭＥＴ基準５Ｄ５ Ｆａｂ ｖ２の希釈シリーズを、１nMのＨＧＦと共に、Ａ５４９細胞上で１５分間の間、３７℃で共にインキュベーションした。その後、溶解細胞溶液の１／３をホスホｃ－ＭＥＴ ＭＳＤアッセイプレートにアプライした。細胞培養レベルに関して２つの同じものがＭＳＤレベルにプールされた。結合していない材料を洗浄除去した後、スルホでタグ化した検出用ｃＭＥＴ抗体は、リン酸化されたレセプター並びにリン酸化されていないレセプターの両方を検出した。解読は、sectorイメージャー２４００を用いて実施された。
２つの抗ｃ－ＭＥＴ／抗血清アルブミンナノボディ構築物が、ＨＧＦ依存性ｃ－ＭＥＴレセプターリン酸化を用量依存的に効率的に阻害する。計算されたＩＣ５０値および対応する９５％信頼区間を１１に示す。Ａ００７９００１７１および２つのバッチのＡ００７９０１２１９は類似したＩＣ５０値を有し；その９５％ＣＩは重複し、このことは、差異が統計学的に有意ではないことを示唆する。ナノボディは、基準５Ｄ５ Ｆａｂ ｖ２と比較して約２倍の改善された作用強度を示した。さらに、９５％信頼区間内で、刺激された細胞へのヒト血清アルブミンの添加は、試験されたナノボディのＩＣ５０値を変化させなかった。
Figure 0007304375000016
本出願全体を通して引用した全ての参考文献（参考文献、発行された特許、公開特許出願、および同時係属中の特許出願を含む）の全内容が、特に本明細書において参照された教義のために、本明細書において参照により明確に組み入れられる。

Claims (19)

  1. 互いに直接的にまたは場合により１つ以上の適切なリンカーもしくはスペーサーを介してのいずれかで適切に連結された、ヒト血清アルブミンに結合する、配列番号１記載のアミノ酸配列Ａｌｂ－２３またはＡｌｂ－２３の変異体、および１つ以上の他のアミノ酸配列、結合ドメイン、結合ユニットまたは他の部分もしくは化学成分を含む、ポリペプチド、タンパク質、構築物、化合物または他の化学成分であって、
    前記Ａｌｂ－２３の変異体が、
    （ｉ）４４位および４５位にアミノ酸モチーフＧＰ；
    （ｉｉ）７４位から７６位にアミノ酸モチーフＳＫＮ；
    （ｉｉｉ）配列番号２９記載のアミノ酸配列SFGMSであるＣＤＲ１；
    （ｉｖ）配列番号３０記載のアミノ酸配列SISGSGSDTLYADSVKGであるＣＤＲ２；
    （ｖ）配列番号３１記載のアミノ酸配列GGSLSRであるＣＤＲ３
    を含み；
    そして前記Ａｌｂ－２３の変異体が、さらに、配列番号１に示された配列に対して１～７個のさらなるアミノ酸の相違を含み、
    前記Ａｌｂ－２３の変異体が、配列：
    EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
    を有するＡｌｂ－８と比較したＴｍを測定することによって決定される改善された熱安定性を有する、前記ポリペプチド、タンパク質、構築物、化合物または他の化学成分。
  2. 前記Ａｌｂ－２３の変異体が、位置１６にＧおよび／または位置８３にＲをさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド、タンパク質、構築物、化合物または他の化学成分。
  3. 前記Ａｌｂ－２３の変異体が、位置１６にＧ及び位置８３にＲをさらに含む、、請求項１または２に記載のポリペプチド、タンパク質、構築物、化合物または他の化学成分。
  4. 互いに直接的にまたは場合により１つ以上の適切なリンカーもしくはスペーサーを介してのいずれかで適切に連結された、配列番号１記載のアミノ酸配列Ａｌｂ－２３および１つ以上の他のアミノ酸配列、ドメイン、結合ユニットまたは他の部分もしくは化学成分を含むかまたは本質的にからなる、請求項１～３のいずれか記載のポリペプチド、タンパク質、構築物、化合物または他の化学成分。
  5. 前記１つ以上の他のアミノ酸配列、ドメイン、結合ユニットまたは他の部分もしくは化学成分が、１つ以上の治療アミノ酸配列、ドメイン、結合ユニット、部分または成分である、請求項１～４のいずれか記載のポリペプチド、タンパク質、構築物、化合物または他の化学成分。
  6. １つ以上の他のアミノ酸配列、ドメイン、結合ユニットまたは他の部分もしくは化学成分が、１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインである、請求項１～５のいずれか記載のポリペプチド、タンパク質または構築物。
  7. １つ以上の他のアミノ酸配列、ドメイン、結合ユニットまたは他の部分もしくは化学成分が、１つ以上のＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ又はラクダ化ＶＨである、請求項６記載のポリペプチド、タンパク質または構築物。
  8. 免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つが、少なくとも２つのジスルフィド橋を含む、請求項６または７記載のポリペプチド、タンパク質または構築物。
  9. ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、ラクダ化ＶＨ又は免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つがＶＨＨクラスＩである、請求項７または８記載のポリペプチド、タンパク質または構築物。
  10. 免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つがｃ－ｍｅｔに結合する、請求項６～９のいずれか記載のポリペプチド、タンパク質または構築物。
  11. ｃ－ｍｅｔに結合する免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つが２つのジスルフィド橋を含む、請求項１０記載のポリペプチド、タンパク質または構築物。
  12. ｃ－ｍｅｔに対する前記の免疫グロブリン単一可変ドメインが配列番号１２記載の４Ｅ０９である、請求項１０または１１記載のポリペプチド、タンパク質または構築物。
  13. ｃ－ｍｅｔに対する前記の免疫グロブリン単一可変ドメインが配列番号１９記載のＡ００７９０１０５である、請求項１０～１２のいずれかに記載のポリペプチド、タンパク質または構築物。
  14. 配列番号２３記載のＡ００７９０１０５－９ＧＳ－Ａｌｂ２３または配列番号２３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドである、請求項１～１２のいずれか記載のポリペプチド、タンパク質または構築物。
  15. 請求項１～１４のいずれかに記載の少なくとも１つのポリペプチド、タンパク質、構築物または化合物、および場合により少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む、医薬組成物。
  16. ポリペプチド、タンパク質、構築物、化合物または他の化学成分が循環中に入ることを可能にする方法において投与するための、請求項１５記載の医薬組成物。
  17. 請求項１～１４のいずれかに記載のポリペプチド、タンパク質または構築物をコードするヌクレオチド配列または核酸。
  18. 請求項１７記載のヌクレオチド配列または核酸を含み、かつ発現することが可能な宿主細胞。
  19. ポリペプチド、タンパク質または構築物を産生または発現する条件下で請求項１８記載の宿主細胞を培養または維持すること、および場合により産生されたポリペプチド、タンパク質または構築物を単離することをさらに含む、請求項１～１４記載のポリペプチド、タンパク質または構築物を調製するための方法。
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