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JP6778175B2 - 脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法 - Google Patents

脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法 Download PDF

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Description

本発明は概して、被封入核酸ナノ粒子組成物、ならびに一様に小さな粒径の被封入核酸ナノ粒子を生産するプロセスおよび系に関する。
対象への生物学的活性剤（治療上関係している化合物）の送達は多くの場合、化合物が標的細胞または組織に到達するのが困難であることにより妨げられている。特に、生細胞への多くの生物学的活性剤の輸送は、細胞の複雑な膜系により非常に制限される。これらの制限は、結果を達成するのに望ましい濃度よりもはるかに高い濃度の生物学的活性剤を使用する必要性をもたらす可能性があり、これは、毒性効果および副作用の危険性を増大させる。この問題に対する解決法の１つは、細胞への選択的進入を可能にさせる特異的な担体分子および担体組成物を利用することである。脂質担体、生分解性ポリマーおよび各種共役系を使用して、細胞への生物学的活性剤の送達を改善することができる。
細胞へ到達するのが特に困難である生物学的活性剤の種類の１つは、バイオ治療薬（bio therapeutic）（ｍＲＮＡおよびＲＮＡｉ剤などのヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸および誘導体を含む）である。概して、核酸は、細胞または原形質（plasma）において、ほんの限られた持続期間、安定である。とりわけ、ＲＮＡ干渉、ＲＮＡｉ療法、ｍＲＮＡ療法、ＲＮＡ薬、アンチセンス療法および遺伝子療法の開発は、活性核酸剤を細胞へ導入する有効な手段の必要性を増大させてきた。これらの理由で、核酸ベースの作用物質を安定化および送達することができる組成物は、特に興味が持たれている。
外来核酸の細胞への運搬を改善するための最もよく研究されたアプローチは、陽イオン性脂質を伴うウイルスベクターまたは配合物の使用を含む。ウイルスベクターを使用して、遺伝子を幾つかの細胞型へ効率的に移行させることができるが、それらは一般的に、化学的に合成された分子を細胞へ導入するのに使用することはできない。
代替的なアプローチは、ある部分で生物学的活性剤と接触して、かつ別の部分で膜系と相互作用する陽イオン性脂質を組み込んだ送達化合物を使用することである。かかる組成物は、組成および調製方法に依存して、リポソーム、ミセル、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を提供すると報告される（概説に関して、Felgner, 1990, Advanced Drug Delivery Reviews, 5, 162-187、Felgner, 1993, J. Liposome Res., 3, 3-16、Gallas, 2013, Chem. Soc. Rev., 42, 7983-7997、Falsini, 2013, J. Med. Chem. dx.doi.org/10.1021/jm400791q、およびその中の参照文献を参照）。
Ｂａｎｇｈａｍ（J. Mol. Biol. 13, 238-252）による１９６５年でのリポソームの第１の記述以来、生物学的活性剤の送達のための脂質ベースの担体系を開発することは、持続的な関心および努力の対象となっている（Allen, 2013, Advanced Drug Delivery Reviews, 65, 36-48）。まず、正に帯電したリポソームを使用することにより、機能的核酸を培養細胞へ導入するプロセスが、Philip Felgner et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413-7417 (1987)により記載された。そのプロセスは後に、K. L. Brigham et al., Am. J. Med. Sci., 298, 278-281 (1989)によりｉｎ ｖｉｖｏで実証された。より最近では、脂質ナノ粒子配合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで実証された有効性を伴って開発されている（Falsini, 2013, J. Med. Chem. dx.doi.org/10.1021/jm400791q、Morrissey, 2005, Nat. Biotech., 23, 1002-1007、Zimmerman, 2006, Nature, 441, 111-114.、Jayaraman, 2012, Angew. Chem. Int. Ed., 51, 8529-8533.）。
脂質配合物は、それらが、それらの細胞取込みを改善しながら生物学的分子を分解から防御することができるため、魅力的な担体である。様々な種類の脂質配合物の中から、陽イオン性脂質を含有する配合物が、ポリアニオン（例えば、核酸）を送達するのに一般的に使用される。かかる配合物は、陽イオン性脂質単独を使用して、任意に他の脂質およびホスファチジルエタノールアミンなどの両親媒性物質を含むように形成され得る。脂質配合物の組成ならびにその調製方法の両方が、得られる凝集体の構造およびサイズに影響を及ぼすことは、当該技術分野で周知である（Leung, 2012, J. Phys Chem. C, 116, 18440-18450）。
界面活性剤透析、押出、高速混合および段階的な希釈を含む幾つかの技法が、脂質ナノ粒子中に核酸を封入すると報告されている。しかしながら、核酸封入に対する既存のアプローチには、低い封入率または非スケーラビリティーの問題があり、高度の一様性を欠如するナノ粒子を生産し、および／または８０ｎｍ未満の平均粒径を達成しない。したがって、高度の封入をもたらし、スケーラブルであり、８０ｎｍ未満の平均粒子直径を有する一様なサイズのナノ粒子を生産する脂質ナノ粒子中に核酸を封入する新たな方法が必要とされる。
本発明は、脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する改善された方法に関する。上記方法は、スケーラブルであり、小さな平均粒径（例えば、８０ｎｍ未満）、粒径の改善された一様性、および高度の核酸封入（例えば、９０％を超える）を有する被封入核酸ナノ粒子の形成を提供する。本発明のプロセスにより生産されるナノ粒子は、長期安定性を有する。
本発明の第１の態様は、１つまたは複数の脂質流を１つまたは複数の核酸流と合流させるステップと、合流した流れを流動させて、被封入核酸ナノ粒子の第１の出口溶液を供給するステップにより、脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法を提供する。各脂質流は、有機溶媒（例えば、エタノール）中に１つまたは複数の脂質の混合物を含む。各核酸流は、水溶液中に１つまたは複数の核酸の混合物を含む。脂質および核酸流の交差ポイントで、各流れは、線速度を特徴とする。１つまたは複数の脂質ナノ粒子流は、約１．５メートル／秒よりも大きいか、またはそれに等しい複合線速度を有する。同様に、１つまたは複数の核酸流は、約１．５メートル／秒よりも大きいか、またはそれに等しい複合線速度を有する。脂質および核酸流の合流および混合後の有機溶媒の最終濃度は、凝集を最低限に抑える量（例えば、３３％未満）である。ある特定の実施形態では、第１の出口溶液中の有機溶媒の最終濃度は、約２０％〜約２５％である。第１の態様によるある特定の実施形態では、合流した脂質および核酸流は、希釈溶媒で希釈されて、第１の出口溶液を供給する。第１の態様による他の実施形態では、複合核酸流（複数可）の複合線速度は、約３〜約１４メートル／秒であり、脂質流（複数可）の複合線速度は、約１．５〜約７メートル／秒である。
本発明の第２の態様では、第１の出口溶液は、希釈、インキュベーション、濃縮、および透析によりさらに加工処理される。第２の態様によるある特定の実施形態では、透析された溶液はまた、滅菌ろ過されてもよい。第２の態様のプロセスにより生産される被封入核酸ナノ粒子は、長期安定性を有する。
本発明の第３の態様では、本発明のプロセスにより生産される封入性脂質ナノ粒子は、約８０ｎｍ未満の平均直径を有する。ある特定の実施形態では、ナノ粒子は、約３０〜約８０ｎＭの平均直径を有する。好ましい実施形態では、ナノ粒子は、約７０ｎｍ未満（例えば、約４０〜７０ｎｍ）の平均直径を有する。
本発明の第４の態様は、薬学的に許容される担体、脂質ナノ粒子ホスト、および核酸を含む被封入核酸ナノ粒子組成物であって、約４０ｎｍ〜約７０ｎｍの平均直径を有する、組成物を提供する。
被封入核酸ナノ粒子を調製および加工処理する例示的なプロセスの流れ図である。 被封入核酸ナノ粒子を生産するための代表的な系を示す図である。図２ａは、図２の系における使用のための希釈チャンバーの代替的な実施形態を示す。 図２の系における使用のための混合チャンバーの代替的な実施形態を示す図である。 ａ：十字形状の混合チャンバーならびにプロセス実施例２に記載するようなプロセスおよび材料を使用して生産されるｓｉＲＮＡ封入脂質ナノ粒子に関する粒子一様性を示す低温電子顕微鏡法により得られた画像である。 ｂ：Ｔ字形状の混合チャンバーならびにプロセス実施例２に記載するようなプロセスおよび材料を使用して生産されるｓｉＲＮＡ封入脂質ナノ粒子に関する粒子一様性を示す低温電子顕微鏡法により得られた画像である。
１．０ 概要
本発明は、一様に小さな粒径を有する被封入核酸ナノ粒子を生産するプロセスを提供する。本発明の１つの実施形態のステップを一般的に説明する代表的な流れ図が、図１に示される。ステップ１００では、１つまたは複数の脂質流は、第１の交差ポイントで１つまたは複数の核酸流と合流して、第１の合流した流れを供給する。次に、第１の合流した流れは、合流した流れの個々の流れの会合を可能にするように流動され（ステップ１１０）、すぐに脂質ナノ粒子構築および核酸封入のプロセスが起きる。初期核酸流（複数可）に関して選択される特定パラメーターに依存して、合流した流れは任意選択で、水性媒質でさらに希釈して（ステップ１２０）、第１の出口溶液を得てもよい（ステップ１３０）。あるいは、任意選択の希釈ステップ１２０を省略してもよく、第１の出口流は、ステップ１００において適切に希釈された核酸流（複数可）の使用により、流動している合流した流れから直接得てもよい。ステップ１３０で得られる第１の出口溶液は、被封入核酸ナノ粒子を含有する。
第１の出口溶液にさらなる加工処理を実施して、有機溶媒を除去し、それにより、長期安定性を有する配合物として被封入核酸ナノ粒子を提供し得る。最初に、第１の出口溶液を、室温である期間（例えば、６０分）インキュベートして（ステップ１４０）、続いて、水性媒質（例えば、水、クエン酸緩衝液）で希釈して（ステップ１５０）、濃縮および透析して（ステップ１６０）、最終的に滅菌ろ過する（ステップ１７０）。希釈ステップ１５０は、有機溶媒濃度を２倍に希釈し得る。濃縮は、タンジェンシャルフローフィルトレーションによるものであり得る。
驚くべきことに、小さくて、かつ一様な粒子が、１つまたは複数の脂質流を１つまたは複数の核酸流と合流／交差させることにより得られることが見出され、ここで、複合脂質流および複合核酸流はそれぞれ、１．５メートル／秒よりも大きい線速度を維持し、流れを合流／混合する際の有機溶媒の最終濃度は、３３容量％未満である。３３％未満の有機溶媒を保持することにより、ナノ粒子の凝集が阻害される一方で、本発明の高い流速が、粒径を小さく、かつ一様に保つ。上記プロセスは、核酸の効率的な封入を提供する。
幾つかの実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約１．５〜約１４メートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約１．５〜約７メートル／秒である。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約３〜約１４メートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約１．５〜約４．５メートル／秒である。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約８〜約１４メートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約１．５〜約４．５メートル／秒である。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約３〜約８メートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約１．５〜約４．５メートル／秒である。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約９〜約１４メートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約３〜約４メートル／秒である。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約１１〜約１４メートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約３〜約４メートル／秒である。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約９〜約１１メートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約３〜約４メートル／秒である。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約６〜約８メートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約３〜約４メートル／秒である。さらに他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約１０．２メートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約３．４メートル／秒である。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約６．８メートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約３．４メートル／秒である。さらに他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約１３．６メートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約３．４メートル／秒である。さらに他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約３．４メートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約１．７メートル／秒である。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約３メートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約１．５メートル／秒である。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約１４メートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約７メートル／秒である。
２．０ 核酸
本発明で使用するのに適した核酸として、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ組成物、キメラＤＮＡ：ＲＮＡ組成物、アロザイム、アプタマー、リボザイム、デコイおよびそれらの類似体、プラスミドおよび他のタイプの発現ベクター、および小核酸分子、ＲＮＡｉ剤、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、メッセンジャーリボ核酸（メッセンジャーＲＮＡ、ｍＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸リボヌクレオチド（ＬＮＡ）、モルホリノヌクレオチド、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ｓｉｓｉＲＮＡ（低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ）、ａｉＲＮＡ（非対称干渉ＲＮＡ）、および細胞培養物、対象または生物中などの関連細胞および／または組織に対してセンス鎖とアンチセンス鎖との間に１つ、２つまたはそれ以上のミスマッチを有するｓｉＲＮＡが挙げられる。かかる化合物は、精製されてもよく、または部分的に精製されてもよく、また天然に存在してもよく、または合成であってもよく、また化学的に修飾されてもよい。一実施形態では、生物学的活性剤は、ＲＮＡｉ剤、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子である。一実施形態では、生物学的核酸剤は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介するのに有用なＲＮＡｉ剤である。
「リボ核酸」（ＲＮＡ）は、ホスホジエステル結合により連結されるヌクレオチドのポリマーであり、ここで、ヌクレオチドはそれぞれ、糖構成成分としてリボースまたはその修飾を含有する。ヌクレオチドはそれぞれ、塩基としてアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）またはその修飾を含有する。ｍＲＮＡ分子における遺伝情報は、３つのヌクレオチド塩基それぞれで構成されるコドンへ配置されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド塩基の配列でコードされる。コドンはそれぞれ、翻訳（タンパク質合成）を終結させる停止コドンを除いて、ポリヌクレオチドの特異的なアミノ酸をコードする。生細胞内で、ｍＲＮＡは、タンパク質合成の部位であるリボソームへ輸送されて、そこで、ｍＲＮＡは、タンパク質合成（翻訳）に関する遺伝情報を提供する。より完全な説明に関しては、Alberts B et al. (2007) Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition, Garland Scienceを参照されたい。
真核生物では、ｍＲＮＡは、細胞酵素ＲＮＡポリメラーゼにより染色体でｉｎ ｖｉｖｏで翻訳される。ｉｎ ｖｉｖｏでの翻訳中または後に、５’キャップ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ ７−メチルグアノシンキャップ、またはＲＮＡ ｍ７Ｇキャップとも称される）が、ｍＲＮＡの５’末端へｉｎ ｖｉｖｏで付加される。５’キャップは、５’−５’−三リン酸結合によって第１の転写ヌクレオチドへ連結される末端７−メチルグアノシン残基である。さらに、ほとんどの真核生物ｍＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ分子の３’末端にポリアデニリル部分（「ポリ（Ａ）テール」）を有する。ｉｎ ｖｉｖｏで、真核細胞は、多くの場合約２５０アデノシン残基長で、転写後にポリ（Ａ）テールを付加する。したがって、典型的な成熟真核生物ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡキャップを伴う５’末端に始まる構造を、続いてヌクレオチドの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、次にヌクレオチド塩基のＡＵＧトリプレットである開始コドンに始まり、タンパク質に関するコード配列であり、ヌクレオチド塩基のＵＡＡ、ＵＡＧまたはＵＧＡトリプレットであり得る停止コドンに終わるオープンリーディングフレーム、続いてヌクレオチドの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を有し、ポリアデノシンテールで終わる。典型的な成熟真核生物ｍＲＮＡの特色は、ｉｎ ｖｉｖｏで真核細胞において自然に作られているのに対して、同じであるか、または構造的かつ機能的に等価な特色は、分子生物学の方法を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで作ることができる。したがって、典型的な成熟真核生物ｍＲＮＡに類似した構造を有する任意のＲＮＡは、ｍＲＮＡとして機能することができ、「メッセンジャーリボ核酸」という用語の範囲内である。
ｍＲＮＡ分子は一般的に、それを本発明の脂質ナノ粒子中に封入することができるサイズを有する。ｍＲＮＡ分子のサイズは、特定タンパク質をコードするｍＲＮＡ種の独自性に応じて、事実上多様である一方で、ｍＲＮＡ分子に関する平均サイズは、５００〜１０，０００塩基である。
「デオキシリボ酢酸」（ＤＮＡ）という用語は、本明細書中で使用する場合、生体および多くのウイルスの細胞において遺伝情報を有するポリマー核酸を指す。ｉｎ ｖｉｖｏで、ＤＮＡは、ＲＮＡの自己複製および合成が可能である。ＤＮＡは、二重らせんへとねじれ、かつ相補的塩基アデノシン（Ａ）とチミン（Ｔ）、またはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との間で水素結合により結合されたヌクレオチドの２つの長鎖で構成される。ヌクレオチドの配列が、個々の遺伝的特徴を決定する。The American Heritage（登録商標） Dictionary of the English Language, Fourth Edition（２００９年に改訂）. Houghton Mifflin Company.を参照されたい。
ＤＮＡポリマーのヌクレオチドそれぞれが、５’から３’方向でホスホジエステルにより連結される。ヌクレオチドはそれぞれ、糖構成成分としてデオキシリボースまたはその修飾を含有する。ヌクレオチドはそれぞれ、塩基としてアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）またはその修飾を含有する。
ｉｎ ｖｉｖｏで存在するほとんどのＤＮＡ分子は、逆平行形成で２つの長鎖ポリマーで構成される二重鎖らせんであり、一方の骨格は、３’（三ダッシュ）であり、他方が、５’（五ダッシュ）である。この二重鎖形成では、塩基は、水素結合により対形成され、アデニンは、チミンへ結合し、グアニンは、シトシンへ結合し、それが、二重らせん構造をもたらす。他のＤＮＡ分子は単鎖であるが、単鎖ＤＮＡ分子は、それらが相補的ヌクレオチド配列を伴う別の単鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子と適合する場合には二重鎖結合になる潜在力を有する。より完全な説明に関しては、Alberts B et al. (2007) Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition, Garland Scienceを参照されたい。
デオキシリボース骨格に沿ったヌクレオチド塩基の配列が、遺伝情報をコードする。タンパク質の合成に関して、遺伝情報は、ｍＲＮＡ分子が創出される場合、転写と呼ばれるプロセスでｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列へコピーされる。
ＤＮＡは、異なるサイズを有する少なくとも２つの形態で存在することができる。ＤＮＡの第１の形態は、染色体と呼ばれる非常に大きなサイズのポリマーである。染色は、細胞中にタンパク質の多くまたはほとんどに関する遺伝情報を含有し、また細胞がＤＮＡ分子の複製を制御することができる情報も含有する。細菌細胞は、１つまたは複数の染色体を含有し得る。真核細胞は通常、それぞれが染色体である１つよりも多い細胞染色体を含有する。
ＤＮＡの第２の形態は、より短いサイズの形態である。第２の形態の多くのＤＮＡ分子は、それを本発明の脂質ナノ粒子中に封入することができるサイズを有する。ＤＮＡのこれらのより短い形態の幾つかは、タンパク質を有用にコードするようなサイズを有し得る。ＤＮＡのこれらの第２のより短い有用な形態の例として、プラスミドおよび他のベクターが挙げられる。より完全な説明に関しては、Alberts B et al. (2007) Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition, Garland Scienceを参照されたい。
プラスミドは、細胞内で染色体ＤＮＡと物理的に離れており、染色体ＤＮＡとは無関係に複製することができる。プラスミドは一般的に、小さな環状の二重鎖ＤＮＡ分子としてｉｎ ｖｉｖｏで存在する。事実上、プラスミドは、生物の生存に有益であり得るタンパク質（例えば、抗生物質耐性）へ転写および翻訳することができる遺伝子を有する。事実上、プラスミドは頻繁に、水平遺伝子伝播によりある生物から別の生物へ伝達され得る。人工または組換えプラスミドは、分子生物学で広く使用されており、組換えＤＮＡ配列の複製、および宿主生物内の有用なタンパク質の発現を可能にするのに役立つ。プラスミドサイズは、１〜２５キロ塩基対を上回って様々であり得る。組換えプラスミドは、それを本発明の脂質ナノ粒子中に封入することができるサイズを有するように、組換え的に作製することができる。
分子生物学では、ベクターは、遺伝物質を、ある細胞から、または生化学反応から、ｉｎ ｖｉｔｒｏで別の細胞へ人工的に運搬するための媒体として使用されるＤＮＡ分子であり、そこで、ＤＮＡは、複製および／または発現させることができる。外来ＤＮＡを含有するベクターは、組換え体と称される。プラスミドおよびウイルスベクターは、中でも有用なベクターのタイプである。標的細胞へのベクターの挿入は通常、細菌細胞に関しては形質転換、真核細胞に関してはトランスフェクションと呼ばれるが、ウイルスベクターの挿入は多くの場合、形質導入と呼ばれる。
ウイルスベクターは概して、非感染性にしたが、ウイルスプロモーター、また導入遺伝子を依然として含有し、したがってウイルスプロモーターによって導入遺伝子の翻訳を可能にする修飾ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを有する組換えウイルスである。ウイルスベクターは多くの場合、挿入物の宿主ゲノムへの永続的な組込みのために設計され、したがって導入遺伝子が組み込まれた後に、宿主ゲノムにおいて明確な遺伝子マーカーが残る。ウイルスベクターは、それを本発明の脂質ナノ粒子中に封入することができるサイズを有するように、組換え的に作製することができる。
「ＲＮＡｉ剤」は、ＲＮＡ干渉を媒介することが可能な組成物または分子である。「ＲＮＡ干渉」（ＲＮＡｉ）という用語は、ＲＮＡｉ剤を使用して、ＲＮＡｉ剤と同じであるか、またはＲＮＡｉ剤に非常に類似している配列を含有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解する翻訳後標的遺伝子サイレシング技法である。Zamore and Haley 2005 Science 309: 1519-1524、Zamore et al. 2000 Cell 101: 25-33、Elbashir et al. 2001 Nature 411: 494-498、およびKreutzer et al., ＰＣＴ国際公開第００／４４８９５号パンフレット、Fire, ＰＣＴ国際公開第９９／３２６１９号パンフレット、Mello and Fire, ＰＣＴ国際公開第０１／２９０５８パンフレット等を参照されたい。
本明細書中で使用する場合、ＲＮＡｉは、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、転写阻害、またはエピジェネティクスなどの配列特異的なＲＮＡ干渉について記載するのに使用される他の用語と等価である。例えば、本発明の脂質を含有する配合物は、ｓｉＮＡ分子と併用して、転写後レベルおよび／または転写前レベルの両方で、エピジェネティックに遺伝子を発現停止させることができる。非限定的な例では、ｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の調節は、当該技術分野で公知であるように、ＲＩＳＣ、あるいは翻訳阻害を介したＲＮＡ（コードまたは非コードＲＮＡのいずれか）のｓｉＮＡ媒介性切断に起因し得る。別の実施形態では、ｓｉＮＡによる遺伝子発現の調節は、例えばJanowski et al. 2005 Nature Chemical Biology 1: 216-222で報告されるような転写阻害に起因し得る。
ＲＮＡｉ剤として、とりわけ、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＮＡ、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ、短鎖干渉オリゴヌクレオチドおよび化学的に修飾された短鎖干渉核酸分子が挙げられる。「短鎖干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）または「短鎖干渉核酸」（ｓｉＮＡ）等の用語は、本明細書中で使用する場合、配列特異的な様式で、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）または遺伝子サイレンシングを媒介することにより、遺伝子発現もしくはウイルス複製を阻害または下方制御することが可能な任意の分子を指す。ｓｉＲＮＡは、発現停止される遺伝子標的に相同的または特異的である、より長い二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）から、リボヌクレアーゼＩＩＩ切断により生成され得る。それらはまた、当該技術分野で公知の各種方法により人工的に作製することができる。
本開示のＲＮＡｉ剤は、任意の標的遺伝子を標的とすることができ、任意の配列を含み、幾つかの形式、構成成分、置換および／修飾のいずれかを有することができる。
ＲＮＡｉ剤は概して、２つの鎖であるアンチセンス（またはガイド）鎖およびセンス（またはパッセンジャー）鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ干渉サイレンシング複合体）へ取り込まれて、標的ｍＲＮＡの対応する配列を標的とする。アンチセンス鎖の配列（またはその一部）は、標的ｍＲＮＡの配列（またはその一部）と適合する。数個のミスマッチ（一般的には１５ｎｔ配列につき、１〜３つ程度）は、標的特異的なＲＮＡｉ活性を防止することなく存在し得る。アンチセンスおよびセンス鎖は、別々の分子であってもよく、またはリンカーもしくはループにより結合されていて（例えば、ｓｈＲＮＡを形成する）もよい。アンチセンス鎖は概して、４９量体またはそれよりも短く、多くの場合、１９量体〜２５量体である。センス鎖は、アンチセンス鎖と同じ長さであってもよく、またはそれよりも短くてもよく、もしくは長くてもよい。本明細書中に示されるように、アンチセンス鎖は、１８量体程度と短くてもよく、センス鎖は、１４量体程度と短くてもよい。
古典的なｓｉＲＮＡは、１９ｂｐ（塩基対）二重鎖領域および２つの２ｎｔ（ヌクレオチド）オーバーハングを有する、それぞれが２１量体であるＲＮＡの２つの鎖である。Elbashir et al. 2001 Nature 411: 494-498、Elbashir et al. 2001 EMBO J. 20: 6877-6888。オーバーハングは、ｄＴｄＴ、ＴＴ、ＵＵ、Ｕ（２’−ＯＭｅ）ｄＴ、Ｕ（２’−ＯＭｅ）Ｕ（２’−ＯＭｅ）、Ｔ（２’−ＯＭｅ）Ｔ（２’−ＯＭｅ）、Ｔ（２’−ＯＭｅ）ｄＴ等などのジヌクレオチドにより置き換えることができる。オーバーハングは、ヌクレアーゼによる切断から、ＲＮＡｉ剤を防御するよう作用する一方で、ＲＮＡｉ活性に干渉せず、また標的認識に寄与もしない。Elbashir et al. 2001 Nature 411: 494-498、Elbashir et al. 2001 EMBO J. 20: 6877-6888、およびKraynack et al. 2006 RNA 12:163-176。さらなる３’−末端ヌクレオチドオーバーハングとして、ｄＴ（デオキシチミジン）、２’−Ｏ、４’−Ｃ−エチレンチミジン（ｅＴ）、および２−ヒドロキシエチルリン酸（ｈｐ）が挙げられる。４−チオウラシルおよび５−ブロモウラシル置換もまた行うことができる。Parrish et al. 2000 Molecular Cell 6: 1077-1087。ヌクレオチドオーバーハングは、非ヌクレオチド３’末端キャップが、末端を切断から防御することが可能であり、分子のＲＮＡｉ活性が許容される場合には、かかるキャップにより置き換えることができる。例えば、米国特許第８，０９７，７１６号明細書、同第８，０８４，６００号明細書、同第８，４０４，８３１号明細書、同第８，４０４，８３２号明細書、および同第８，３４４，１２８号明細書、および米国特許出願公開第６１／８８６，７３９号明細書（これは、全体が参照により援用される）を参照されたい。
一方の鎖において、１つまたは複数の位置を、スペーサーにより置き換えることができる。これらとして、糖、アルキル、シクロアルキル、リビトールまたは他のタイプの脱塩基ヌクレオチド、２’−デオキシリビトール、ジリビトール、２’−メトキシエトキシリビトール（２’−ＭＯＥを伴うリビトール）、Ｃ３〜６アルキル、または４−メトキシブタン−１，３−ジオール（５３００）が挙げられるが、限定されない。幾つかの分子では、ギャップをセンス鎖に導入することができ、２つのより短いセンス鎖を生じる。これは、ｓｉｓｉＲＮＡと呼ばれる。ＷｅｎｇｅｌｓおよびＫｊｅｍｓに対する国際公開第２００７／１０７１６２号パンフレット。センス鎖とアンチセンス鎖との間の１つまたは複数のミスマッチおよびバルジもまた導入することができる。Ｋｈｖｏｒｏｖａに対する米国特許出願公開第２００９／０２０９６２６号明細書。
ＲＮＡｉ剤は、古典的なｓｉＲＮＡで見られるように、ＲＮＡから構築され得る。しかしながら、ＲＮＡヌクレオチドは、様々なＲＮＡｉ剤で置換または修飾され得る。１つまたは複数の位置で、ＲＮＡヌクレオチドは、ＤＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノヌクレオチド、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、アラビノース核酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロアラビノース核酸（ＦＡＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、またはアンロックド核酸（ＵＮＡ）により置き換えることができる。特に、シード領域（アンチセンス鎖のおよそ位置２〜７およびセンス鎖の対応する位置）で、一方または両方の鎖におけるヌクレオチドは、ＤＮＡにより置き換えることができる。全体的なシード領域は、ＤＮＡにより置き換えることができ、ＲＮＡ干渉を媒介することが可能なＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成する。Yamato et al. 2011. Cancer Gene Ther. 18: 587-597。
ＲＮＡヌクレオチドは、他の構成成分（上述するような）で置換および／または修飾することができる。修飾および／または置換は、糖、リン酸および／または塩基で行われ得る。各種態様では、ＲＮＡｉ剤は、糖の２’−修飾、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）を含み、他のＲＮＡ修飾は、当該技術分野で公知である。例えば、Usman and Cedergren 1992 TIBS. 17: 34、Usman et al. 1994 Nucleic Acids Symp. Ser. 31: 163、Burgin et al. 1996 Biochemistry 35: 14090を参照されたい。幾つかの実施形態では、一方または両方の鎖の３’末端上の２つのＲＮＡヌクレオチドは、２’−ＭＯＥで修飾されて、２’−ＭＯＥクランプを形成する。米国特許第８，０９７，７１６号明細書、および同第８，０８４，６００号明細書。
糖−リン酸骨格の１つまたは複数のリン酸を、例えば、修飾ヌクレオシド間リンカーにより置き換えることができる。これとしては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、ボラノホスホノエート、アミドリンカー、および式（Ｉａ）：
（Ｉａ）（式中、Ｒ３は、Ｏ−、Ｓ−、ＮＨ２、ＢＨ３、ＣＨ３、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、Ｃ１〜６アルコキシおよびＣ１〜６アリールオキシから選択され、ここで、Ｃ１〜６アルキルおよびＣ６〜１０アリールは、無置換であるか、または任意選択で独立して、ハロ、ヒドロキシルおよびＮＨ２から独立して選択される１つ〜３つの基で置換され、Ｒ４は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＣＨ２から選択される）
を有する化合物が挙げられ得るが、限定されない。
塩基もまた、例えば、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンで修飾または置換され得る。ある特定の態様では、ＲＮＡｉ剤は、非天然核酸塩基を含むことができ、ここで非天然核酸塩基は、ジフルオロトリル、ニトロインドリル、ニトロピロリル、またはニトロイミダゾリルである。多くの他の修飾が、当該技術分野で公知である。例えば、Usman et al. 1992 TIBS 17:34、Usman et al. 1994 Nucl. Acids Symp. Ser. 31: 163、Burgin et al. 1996 Biochem. 35: 14090を参照されたい。
例えば、１つまたは複数の位置が、２’−Ｏ−メチルシチジン−５’−リン酸、２’−Ｏ−メチルウリジン−５’−リン酸で表すことができる。簡潔に述べると、任意の１つまたは複数の位置が、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’ホスホロチオエート基を含むヌクレオシド、コレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結した末端ヌクレオシド、ロックドヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオシド、２’−アミノ修飾ヌクレオシド、２’−アルキル修飾ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、アンロックドリボヌクレオチド（例えば、非環状ヌクレオチド単量体、国際公開第２００８／１４７８２４号パンフレットに記載されるような）、ホスホルアミデートまたは非天然塩基を含むヌクレオシド、またはそれらの任意の組合せを含むが限定されない、当該技術分野で公知の任意の修飾または置換で表すことができる。
これらの様々な方式、構成成分、置換および／または修飾のいずれも、種々の方法で、混合して、適合させるか、または組み合わせて、任意の標的に対し、かつ任意の配列を含むＲＮＡｉ剤を形成することができる。例えば、本開示は、２つの鎖を含むＲＮＡｉ剤に関し、ここで一方または両方の鎖が、リン酸または修飾ヌクレオシド間リンカーにおいて３’末端で終結する１８量体であり、５’から３’の順序で、スペーサー、第２のリン酸または修飾ヌクレオシド間リンカー、および３’末端キャップをさらに含む。別の実施形態では、本開示は、センスおよびアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤に関し、ここでアンチセンス鎖は、５’から３’の順序で、リン酸または修飾ヌクレオシド間リンカーにおいて３’末端で終結する１８量体を含み、５’から３’の順序で、スペーサー、第２のリン酸または修飾ヌクレオシド間リンカー、および３’末端キャップをさらに含み、ここでセンス鎖は、５’から３’の順序で、リン酸または修飾ヌクレオシド間リンカーにおいて３’末端で終結する１４量体（またはそれよりも長い）を含み、５’から３’の順序で、スペーサー、第２のリン酸または修飾ヌクレオシド間リンカー、および３’末端キャップをさらに含む。
本開示の各種実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、任意の標的遺伝子を標的とし、任意の配列を有することができ、本明細書中に記載するか、または当該技術分野で公知であるような任意の方式、構成成分、置換および／または修飾を有することができる。
「ＲＮＡｉ阻害剤」という用語は、細胞または患者においてＲＮＡ干渉機能または活性を下方調節する（例えば、低減させるか、または阻害する）ことができる任意の分子である。ＲＮＡｉ阻害剤は、ＲＩＳＣなどのタンパク質構成成分、またはｍｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡなどの核酸構成成分を含むＲＮＡｉ経路の任意の構成成分との相互作用、あるいはそれらの機能を妨げることにより、ＲＮＡｉ（例えば、標的ポリヌクレオチドのＲＮＡｉ媒介性切断、翻訳阻害、または転写サイレンシング）を、下方制御するか、低減させるか、または阻害することができる。ＲＮＡｉ阻害剤は、細胞または患者において、ＲＮＡｉ経路のＲＩＳＣ、ｍｉＲＮＡ、もしくはｓｉＲＮＡまたは任意の他の構成成分と相互作用するか、あるいはそれらの機能を妨げる、ｓｉＮＡ分子、アンチセンス分子、アプタマー、または小分子であり得る。ＲＮＡｉ（例えば、標的ポリヌクレオチドのＲＮＡｉ媒介性切断、翻訳阻害、または転写サイレンシング）を阻害することによって、ＲＮＡｉ阻害剤を使用して、標的遺伝その発現を調節する（例えば、上方制御するか、または下方制御する）ことができる。一実施形態では、ＲＮＡ阻害剤を使用して、翻訳阻害、転写サイレンシング、またはポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）のＲＩＳＣ媒介性切断による遺伝子発現の内因性下方制御または阻害を妨げる（例えば、低減させるか、または防止する）ことにより、遺伝子発現を上方制御する。したがって、遺伝子発現の内因性抑制、サイレンシング、または阻害のメカニズムを妨げることによって、本発明のＲＮｉ阻害剤を使用して、機能の損失に起因する疾患または状態の治療のために遺伝子発現を上方制御することができる。「ＲＮＡｉ阻害剤」という用語は、本明細書中の各種実施形態において「ｓｉＮＡ」という用語と交換可能に使用される。
「酵素核酸」という用語は、本明細書中で使用する場合、基質結合領域において、指定した遺伝子標的に対して相補性を有し、また標的ＲＮＡを特異的に切断するように作用する酵素活性も有し、それにより標的ＲＮＡ分子を失活させる核酸分子を指す。相補領域は、酵素核酸分子の、標的ＲＮＡへの十分なハイブリダイゼーションを可能にし、したがって切断を可能にする。１００％の相補性が好ましいが、５０〜７５％程度の低い相補性もまた、本発明で有用であり得る（例えば、Werner and Uhlenbeck, 1995, Nucleic Acids Research, 23, 2092-2096、Hammann et al., 1999, Antisense and Nucleic Acid Drug Dev., 9, 25-31を参照）。核酸は、塩基、糖、および／またはリン酸基で修飾され得る。酵素核酸という用語は、リボザイム、触媒ＲＮＡ、酵素ＲＮＡ、触媒ＤＮＡ、アプタマーまたはアプタマー結合リボザイム、調節可能リボザイム、触媒オリゴヌクレオチド、ヌクレオザイム（nucleozyme）、ＤＮＡザイム（DNAzyme）、ＲＮＡ酵素、エンドリボヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ミニザイム（minizyme）、リードザイム（leadzyme）、オリゴザイム（oligozyme）またはＤＮＡ酵素などの語句と交換可能に使用される。これらの専門用語は全て、酵素活性を有する核酸分子について記載している。酵素核酸分子の重要な特色は、それが、標的核酸領域の１つまたは複数に対して相補的である特異的な基質結合部位を有すること、およびそれが、分子に核酸切断および／またはライゲーション活性を付与する当該基質結合部位内のまたは周囲のヌクレオチド配列を有することである（例えば、Cech et al., 米国特許第４，９８７，０７１号明細書、Cech et al., 1988, 260 JAMA 3030を参照）。本発明のリボザイムおよび酵素核酸分子は、例えば当該技術分野で、および本明細書中の他の箇所で記載されるように、化学的に修飾することができる。
「アンチセンス核酸」という用語は、本明細書中で使用する場合、ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＰＮＡ（タンパク質核酸、Egholm et al., 1993 Nature 365, 566）相互作用を用いて、標的ＲＮＡへ結合して、標的ＲＮＡの活性を変更させる非酵素核酸分子を指す（概説に関しては、Stein and Cheng, 1993 Science 261, 1004、およびWoolf et al., 米国特許第５，８４９，９０２号明細書を参照）。アンチセンスＤＮＡは、化学的に合成することができるか、または単鎖ＤＮＡ発現ベクターもしくはそれらの等価体の使用によって発現させることができる。本発明のアンチセンス分子は、例えば当該技術分野で記載されるように、化学的に修飾することができる。
「ＲＮアーゼＨ活性化領域」という用語は、本明細書中で使用する場合、標的ＲＮＡへ結合して、細胞ＲＮアーゼＨ酵素により認識される非共有結合的複合体を形成することが可能な核酸分子の領域（一般的に、４〜２５ヌクレオチド長、好ましくは５〜１１ヌクレオチド長よりも長いか、またはそれらに等しい）を指す（例えば、Arrow et al., 米国特許第５，８４９，９０２号明細書、Arrow et al., 米国特許第５，９８９，９１２号明細書を参照）。ＲＮアーゼＨ酵素は、核酸分子−標的ＲＮＡ複合体へ結合して、標的ＲＮＡ配列を切断する。
「２−５Ａアンチセンスキメラ」という用語は、本明細書中で使用する場合、５’−リン酸化２’−５’−連結アデニル酸残基を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。これらのキメラは、配列特異的な様式で、標的ＲＮＡへ結合して、細胞２−５Ａ依存性リボヌクレアーゼを活性化して、続いて標的ＲＮＡを切断する（Torrence et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1300、Silverman et al., 2000, Methods Enzymol., 313, 522-533、Player and Torrence, 1998, Pharmacol. Ther., 78, 55-113）。２−５Ａアンチセンスキメラ分子は、例えば当該技術分野で記載されるように、化学的に修飾することができる。
「三重鎖形成オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書中で使用する場合、配列特異的な様式で二重鎖ＤＮＡへ結合して、三重鎖らせんを形成することができるオリゴヌクレオチドを指す。かかる三重鎖らせん構造の形成は、標的遺伝子の転写を阻害することが知られている（Duval-Valentin et al., 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 504、Fox, 2000, Curr. Med. Chem., 7, 17-37、Praseuth et. al., 2000, Biochim. Biophys. Acta, 1489, 181-206）。本発明の三重鎖形成オリゴヌクレオチド分子は、例えば当該技術分野で記載されるように、化学的に修飾することができる。
「デコイＲＮＡ」という用語は、本明細書中で使用する場合、所定のリガンドへ優先的に結合するように設計されるＲＮＡ分子またはアプタマーを指す。かかる結合は、標的分子の阻害または活性化をもたらし得る。デコイＲＮＡまたはアプタマーは、特異的なリガンドの結合に関して、天然に存在する結合標的と競合し得る。同様に、デコイＲＮＡは、受容体へ結合して、エフェクター分子の結合を阻止するよう設計され得るか、または目的の受容体へ結合して、受容体との相互作用を防止するよう設計され得る。本発明のデコイ分子は、例えば当該技術分野で記載されるように、化学的に修飾することができる。
「単鎖ＤＮＡ」（ｓｓＤＮＡ）という用語は、本明細書中で使用する場合、直鎖状単鎖を含む天然に存在するか、または合成のデオキシリボ核酸分子を指し、例えば、ｓｓＤＮＡは、センスもしくはアンチセンス遺伝子配列またはＥＳＴ（発現配列タグ）であり得る。
「アロザイム」という用語は、本明細書中で使用する場合、例えば米国特許第５，８３４，１８６号明細書、同第５，７４１，６７９号明細書、同第５，５８９，３３２号明細書、同第５，８７１，９１４号明細書、およびＰＣＴ国際公開第００／２４９３１号パンフレット、同第００／２６２２６号パンフレット、同第９８／２７１０４号パンフレット、同第９９／２９８４２号パンフレットを含む、アロステリック酵素核酸分子を指す。
「アプタマー」という用語は、本明細書中で使用する場合、標的分子へ特異的に結合するポリヌクレオチド組成物を意味し、ここでポリヌクレオチドは、細胞において標的分子により一般的に認識される配列と異なる配列を有する。あるいは、アプタマーは、標的分子が天然では核酸へ結合しない標的分子へ結合する核酸分子であり得る。標的分子は、任意の目的の分子であり得る。本発明のアプタマー分子は、例えば当該技術分野で記載されるように、化学的に修飾することができる。
３．０ 脂質
３．１ 陽イオン性脂質
脂質組成物における使用に適した陽イオン性脂質として、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ）クロリド、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジオレオイルカルバミル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＣＤＡＰ）、１，２−ジリネオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＬＩＮＤＡＰ）、トリフルオロ酢酸ジオレオイルオキシ−Ｎ−（２−スペルミンカルボキシアミド（2-spenninecarboxamido））エチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−プロパンアミニウム（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（spennine）（ＤＯＧＳ）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２−［５’−（コレスタ−５−エン−３−オキシ）−３’−オキサペントキシ］−３−ジメチル−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９’，１２’−オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−ジメチアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）および／またはそれらの混合物が挙げられるが、それらに限定されない。
他の適した陽イオン性脂質は、米国仮出願公開第６１／９１８，９２７号明細書（これは、その全体が参照により本明細書に援用される）に開示されている。適切な脂質は、式（Ｉ）：
（式中、ｎおよびｐはそれぞれ独立して、１または２であり、Ｒ１は、ヘテロシクリル、ヘテロシクリル−Ｃ１〜８−アルキルまたはヘテロシクリル−Ｃ１〜８−アルコキシルであり、それらはそれぞれ、Ｃ１〜８−アルキル、Ｃ３〜７−シクロアルキル、Ｃ３〜７−シクロアルキル−Ｃ１〜８−アルキル、ヘテロシクリル、−［（Ｃ１〜Ｃ４）アルキレン］ｖ−Ｎ（Ｒ’）Ｒ”、−Ｏ−［（Ｃ１〜Ｃ４）アルキレン］ｖ−Ｎ（Ｒ’）Ｒ”または−Ｎ（Ｈ）−［（Ｃ１〜Ｃ４）アルキレン］ｖ−Ｎ（Ｒ’）（Ｒ”）から独立して選択される１つ、２つまたは３つの基で任意選択で置換されてもよく、ここで上記（Ｃ１〜Ｃ４）アルキレンは、１つまたは複数のＲ基で任意選択で置換され、ｖは、０、１、２、３または４であり、Ｒは、水素または−Ｃ１〜８−アルキルであるか、またはｖが０である場合、Ｒは存在せず、Ｒ’およびＲ”はそれぞれ独立して、水素、−Ｃ１〜８−アルキルであるか、またはＲ’およびＲ”は、それらが結合する窒素と合わせて、Ｎ、ＯおよびＳから選択される別のヘテロ原子を任意選択で含み、−Ｃ１〜８−アルキル、ヒドロキシもしくはシクロアルキル−Ｃ１〜８−で任意選択で置換される５〜８員環の複素環またはヘテロアリールを形成し、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して、Ｃ１２〜２２アルキル、Ｃ１２〜２２アルケニル、
であり、Ｒ４は、水素、Ｃ１〜１４アルキル、
から選択される）
を有する化合物、またはその塩である。
他の陽イオン性脂質として、式（ＩＩ）：
に従う化合物、またはその塩が挙げられる。
他の適した陽イオン性脂質として、式（Ｉ）および式（ＩＩ）（式中、Ｒ４は、水素であるか、またはＲ４は、
である）を有するものが挙げられる。
他の適した陽イオン性脂質として、上述の脂質（式中、Ｒ１は、
から選択される）が挙げられる。
他の適した陽イオン性脂質として、上述の脂質（式中、Ｒ２は、
から選択される）が挙げられる。
他の適した陽イオン性脂質として、上述の脂質（式中、Ｒ３は、
から選択される）が挙げられる。
上述の脂質に従う他の適した脂質として、Ｒ２およびＲ３が同一であるものが挙げられる。
特定の陽イオン性脂質として、下記：
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（１，３−ジメチルピロリジン−３−カルボニル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（３−（４−メチルピペラジン−１−イル）プロパノイル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（４−（ピロリジン−１−イル）ブタノイル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（４−（ピペリジン−１−イル）ブタノイル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（３−（ジメチルアミノ）プロパノイル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（２−（ジメチルアミノ）アセトキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（３−（ジエチルアミノ）プロパノイル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（１，４−ジメチルピペリジン−４−カルボニル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（１−（シクロプロピルメチル）ピペリジン−４−カルボニル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（３−モルホリノプロパノイル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
２−（（（１，３−ジメチルピロリジン−３−カルボニル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（８−（オクタノイルオキシ）オクタノエート）；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（（１−エチルピペリジン−３−イル）メトキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
２−（（（（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（２−ヘプチルウンデカノエート）；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）カルボニル）オキシ）−２−（（（２−ヘプチルウンデカノイル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
２−（（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（２−ヘプチルウンデカノエート）；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−２−（（（２−ヘプチルウンデカノイル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）カルボニル）オキシ）−２−（（（３−オクチルウンデカノイル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（３−オクチルウンデカノエート）；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−２−（（（３−オクチルウンデカノイル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−２−（（（９−ペンチルテトラデカノイル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−２−（（（５−ヘプチルドデカノイル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（２，２−ビス（ヘプチルオキシ）アセトキシ）−２−（（（（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；および
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（６，６−ビス（オクチルオキシ）ヘキサノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエート
から成る群から選択される化合物が挙げられる。
他の適した陽イオン性脂質は、米国仮出願公開第６１／９１８，９４１号明細書（これは、その全体が参照により本明細書に援用される）に開示されている。適切な脂質は、式（ＩＩＩ）：
（式中、ｎは、０、１、２、３または４であり、ｐは、０、１、２、３、４、５、６、７または８であり、Ｌ１は、−Ｏ−または結合であり、Ｌ２は、−ＯＣ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）Ｏ−であり、Ｒ１は、下記：
から選択され、ｖは、０、１、２、３または４であり、ｗは、０、１、２または３であり、Ｃｙｌは、１つまたは２つのアルキル基で任意選択で置換される５〜７員環窒素含有複素環であり、ＲおよびＲ’はそれぞれ独立して、水素またはＣ１〜８アルキルであり、Ｒ２は、ヒドロキシルで任意選択で置換されるＣ６〜２０アルキル、Ｃ１５〜１９アルケニル、Ｃ１〜１２アルキル−ＯＣ（Ｏ）−Ｃ５〜２０アルキル、Ｃ１〜１２アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ５〜２０アルキル、および
から選択され、Ｒ３は、Ｃ４〜２２アルキル、Ｃ１２〜２２アルケニル、
から選択される）
を有する化合物、またはその塩である。
他の適した陽イオン性脂質として、式（ＩＶ）、またはその塩を有するものが挙げられる：
他の適した陽イオン性脂質として、式（Ｖ）を有するものが挙げられる：
他の適した陽イオン性脂質として、式（ＩＩＩ）〜（Ｖ）（式中、Ｒ２は、下記：
から選択される）を有するものが挙げられる。
他の適した陽イオン性脂質として、式（ＩＩＩ）〜（Ｖ）（式中、Ｒ２は、下記：
である）を有するものが挙げられる。
他の適した陽イオン性脂質として、式（ＩＩＩ）〜（Ｖ）を有するものが挙げられ、ここで上記化合物は、式（ＶＩ）：
である。
他の適した陽イオン性脂質として、式（ＩＩＩ）〜（ＶＩ）（式中、Ｒ３は、下記：
から選択される）を有するものが挙げられる。
他の適した陽イオン性脂質として、式（ＩＩＩ）〜（ＶＩ）（式中、Ｒ３は、下記：
である）を有するものが挙げられる。
他の適した陽イオン性脂質として、式（ＩＩＩ）〜（ＶＩ）（式中、Ｒ３は、下記：
である）を有するものが挙げられる。
他の適した陽イオン性脂質として、式（ＩＩＩ）〜（ＶＩ）を有するものが挙げられ、ここで上記化合物は、式（ＶＩＩ）：
である。
他の適した陽イオン性脂質として、式（ＩＩＩ）〜（ＶＩＩ）を有するものが挙げられ、ここで上記化合物は、式（ＶＩＩＩ）：
である。
他の適した陽イオン性脂質として、式（ＩＩＩ）〜（ＶＩＩＩ）を有するものが挙げられ、ここで上記化合物は、式（ＩＸ）：
である。
他の適した陽イオン性脂質として、式（ＩＩＩ）〜（ＩＸ）（式中、Ｒ１は、下記：
から選択される）を有するものが挙げられる。
他の適した陽イオン性脂質として、式（ＩＩＩ）〜（ＩＸ）（式中、Ｒ１は、下記：
である）を有するものが挙げられる。
他の適した陽イオン性脂質として、式（ＩＩＩ）〜（ＩＸ）（式中、Ｒ１は、下記：
である）を有するものが挙げられる。
他の適した陽イオン性脂質は、下記：
２−（１０−ドデシル−３−エチル−８，１４−ジオキソ−７，９，１３−トリオキサ−３−アザオクタデカン−１８−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（９−ドデシル−２−メチル−７，１３−ジオキソ−６，８，１２−トリオキサ−２−アザヘプタデカン−１７−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（９−ドデシル−２−メチル−７，１３−ジオキソ−６，８，１２−トリオキサ−２−アザペンタデカン−１５−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（１０−ドデシル−３−エチル−８，１４−ジオキソ−７，９，１３−トリオキサ−３−アザヘキサデカン−１６−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（８−ドデシル−２−メチル−６，１２−ジオキソ−５，７，１１−トリオキサ−２−アザヘプタデカン−１７−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（１０−ドデシル−３−エチル−８，１４−ジオキソ−７，９，１３−トリオキサ−３−アザノナデカン−１９−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（９−ドデシル−２−メチル−７，１３−ジオキソ−６，８，１２−トリオキサ−２−アザオクタデカン−１８−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（８−ドデシル−２−メチル−６，１２−ジオキソ−５，７，１１−トリオキサ−２−アザオクタデカン−１８−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（１０−ドデシル−３−エチル−８，１４−ジオキソ−７，９，１３−トリオキサ−３−アザイコサン−２０−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（９−ドデシル−２−メチル−７，１３−ジオキソ−６，８，１２−トリオキサ−２−アザノナデカン−１９−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル４，４−ビス（（２−エチルヘキシル）オキシ）ブタノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル４，４−ビス（（２−プロピルペンチル）オキシ）ブタノエート；
３−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル４，４−ビス（（２−プロピルペンチル）オキシ）ブタノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル４，４−ビス（（２−プロピルペンチル）オキシ）ブタノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル６，６−ビス（オクチルオキシ）ヘキサノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル６，６−ビス（ヘキシルオキシ）ヘキサノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル６，６−ビス（（２−エチルヘキシル）オキシ）ヘキサノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル８，８−ビス（ヘキシルオキシ）オクタノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル８，８−ジブトキシオクタノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル８，８−ビス（（２−プロピルペンチル）オキシ）オクタノエート；
３−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル８，８−ビス（（２−プロピルペンチル）オキシ）オクタノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル８，８−ビス（（２−プロピルペンチル）オキシ）オクタノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル３−オクチルウンデカノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル３−オクチルウンデカ−２−エノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル７−ヘキシルトリデカ−６−エノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル９−ペンチルテトラデカノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル９−ペンチルテトラデカ−８−エノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル５−ヘプチルドデカノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）トリデシル５−ヘプチルドデカノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ウンデシル５−ヘプチルドデカノエート；
１，３−ビス（オクタノイルオキシ）プロパン−２−イル（３−（（（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル）スクシネート；
１，３−ビス（オクタノイルオキシ）プロパン−２−イル（３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル）スクシネート；
１−（３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル）１０−オクチルデカンジオエート；
１−（３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル）１０−オクチルデカンジオエート；
１−（３−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル）１０−オクチルデカンジオエート；
１−（３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル）１０−（２−エチルヘキシル）デカンジオエート；
１−（３−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル）１０−（２−エチルヘキシル）デカンジオエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル１０−（オクタノイルオキシ）デカノエート；
８−ドデシル−２−メチル−６，１２−ジオキソ−５，７，１１−トリオキサ−２−アザノナデカン−１９−イルデカノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル１０−（オクタノイルオキシ）デカノエート；
３−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル１０−（オクタノイルオキシ）デカノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
１−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノイルオキシ）ペンタデカン−３−イル１，４−ジメチルピペリジン−４−カルボキシレート；
２−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）テトラデシル４，４−ビス（（２−エチルヘキシル）オキシ）ブタノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−（１２Ｚ，１５Ｚ）−３−（（３−（ジメチルアミノ）プロパノイル）オキシ）ヘンイコサ−１２，１５−ジエン−１−イルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
（１２Ｚ，１５Ｚ）−３−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘンイコサ−１２，１５−ジエン−１−イル３−オクチルウンデカノエート；
（１２Ｚ，１５Ｚ）−３−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘンイコサ−１２，１５−ジエン−１−イル５−ヘプチルドデカノエート；
（１２Ｚ，１５Ｚ）−３−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘンイコサ−１２，１５−ジエン−１−イル７−ヘキシルトリデカノエート；
（１２Ｚ，１５Ｚ）−３−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘンイコサ−１２，１５−ジエン−１−イル９−ペンチルテトラデカノエート；
（１２Ｚ，１５Ｚ）−１−（（（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ）カルボニル）オキシ）ヘンイコサ−１２，１５−ジエン−３−イル３−（ジメチルアミノ）プロパノエート；
（１３Ｚ，１６Ｚ）−４−（（（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）カルボニル）オキシ）ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イル２，２−ビス（ヘプチルオキシ）アセテート；
（１３Ｚ，１６Ｚ）−４−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イル２，２−ビス（ヘプチルオキシ）アセテート；
２，２−ビス（ヘプチルオキシ）エチル３−（（３−エチル−１０−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）−８，１５−ジオキソ−７，９，１４−トリオキサ−３−アザヘプタデカン−１７−イル）ジスルファニル）プロパノエート；
（１３Ｚ，１６Ｚ）−４−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イルヘプタデカン−９−イルスクシネート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−２−（（（１１Ｚ，１４Ｚ）−２−（（３−（ジメチルアミノ）プロパノイル）オキシ）イコサ−１１，１４−ジエン−１−イル）オキシ）エチルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−（オクタノイルオキシ）トリデシルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−（オクタノイルオキシ）トリデシル３−オクチルウンデカノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−ヒドロキシトリデシル５−ヘプチルドデカノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−（オクタノイルオキシ）トリデシル５−ヘプチルドデカノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−（オクタノイルオキシ）トリデシル７−ヘキシルトリデカノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−ヒドロキシトリデシル９−ペンチルテトラデカノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−（オクタノイルオキシ）トリデシル９−ペンチルテトラデカノエート；
１−（３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−（オクタノイルオキシ）トリデシル）１０−オクチルデカンジオエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−（オクタノイルオキシ）トリデシル１０−（オクタノイルオキシ）デカノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−５−オクチルトリデシルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−５−オクチルトリデシルデカノエート；
５−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−７−オクチルペンタデシルオクタノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−５−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−７−オクチルペンタデシルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
９−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１１−オクチルノナデシルオクタノエート；
９−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１１−オクチルノナデシルデカノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−９−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ノナデシルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
９−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ノナデシルヘキサノエート；
９−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ノナデシル３−オクチルウンデカノエート；
９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ノナデシルヘキサノエート；
９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ノナデシル３−オクチルウンデカノエート；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（４−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（４−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ，１５Ｚ，１５’Ｚ）−２−（（４−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２，１５−トリエノエート）；
（Ｚ）−２−（（４−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジオレエート；
２−（（４−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジテトラデカノエート；
２−（（４−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジテトラデカノエート；
２−（（４−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジテトラデカノエート；
２−（（４−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジドデカノエート；
２−（（４−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジドデカノエート；
２−（（４−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジドデカノエート；
２−（（４−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルビス（デカノエート）；
２−（（４−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルビス（デカノエート）；
２−（（４−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（（４−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（（（１３Ｚ，１６Ｚ）−４−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ドコサ−１３，１６−ジエノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（（（１３Ｚ，１６Ｚ）−４−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ドコサ−１３，１６−ジエノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（２−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）テトラデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（２−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ドデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（２−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）テトラデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（２−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ドデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
２−（（２−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）テトラデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
４，４−ビス（オクチルオキシ）ブチル４−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノエート；
４，４−ビス（オクチルオキシ）ブチル２−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ドデカノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−１０−ドデシル−３−エチル−１４−（２−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノイルオキシ）エチル）−８，１３−ジオキソ−７，９−ジオキサ−３，１４−ジアザヘキサデカン−１６−イルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
２−（（４−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１１−（オクタノイルオキシ）ウンデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；および
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（９−ドデシル−２−メチル−７，１２−ジオキソ−６，８，１３−トリオキサ−２−アザテトラデカン−１４−イル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）
から選択される。
本明細書中で使用する場合、「アルキル」という用語は、指数数の炭素原子を有する完全に飽和した分岐状または未分岐状炭化水素鎖を指す。例えば、Ｃ１〜８アルキルは、１〜８個の炭素原子を有するアルキル基を指す。例えば、Ｃ４〜２２アルキルは、４〜２２個の炭素原子を有するアルキル基を指す。例えば、Ｃ６〜１０アルキルは、６〜１０個の炭素原子を有するアルキル基を指す。例えば、Ｃ１２〜２２アルキルは、１２〜２２個の炭素原子を有するアルキル基を指す。アルキルの代表的な例として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、３−メチルヘキシル、２，２−ジメチルペンチル、２，３−ジメチルペンチル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル、ｎ−ウンデカニル、ｎ−ドデカニル、ｎ−トリデカニル、９−メチルヘプタデカニル、１−ヘプチルデシル、２−オクチルデシル、６−ヘキシルドデシル、４−ヘプチルウンデシル等が挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書中で使用する場合、「アルキレン」という用語は、本明細書中で上記で規定するような二価アルキル基を指す。アルキレンの代表的な例として、メチレン、エチレン、ｎ−プロピレン、イソ−プロピレン、ｎ−ブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、イソ−ブチレン、ｔｅｒｔ−ブチレン、ｎ−ペンチレン、イソペンチレン、ネオペンチレン、ｎ−へキシレン、３−メチルへキシレン、２，２−ジメチルペンチレン、２，３−ジメチルペンチレン、ｎ−ヘプチレン、ｎ−オクチレン、ｎ−ノニレン、ｎ−デシレン等が挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書中で使用する場合、「アルケニル」という用語は、鎖内に指定数の炭素原子および１つまたは複数の炭素間二重結合を有する不飽和の分岐状または未分岐状炭化水素鎖を指す。例えば、Ｃ１２〜２２アルケニルは、鎖内に１つまたは複数の炭素間二重結合を有する１２〜２２個の炭素原子を有するアルケニル基を指す。ある特定の実施形態では、アルケニル基は、鎖内に１つの炭素間二重結合を有する。他の実施形態では、アルケニル基は、鎖内に１つよりも多い炭素間二重結合を有する。アルケニル基は、式（Ｉ）または（ＩＩＩ）で規定するように、１つまたは複数の置換基で任意選択で置換されてもよい。アルケニルの代表的な例として、エチレニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル等が挙げられるが、それらに限定されない。アルケニルの他の例として、Ｚ−オクタデカ−９−エニル、Ｚ−ウンデカ−７−エニル、Ｚ−ヘプタデカ−８−エニル、（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル、（８Ｚ，１１Ｚ）−ヘプタデカ−８，１１−ジエニル、（８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）−ヘプタデカ−８，１１，１４−トリエニル、リノレニル、２−オクチルデカ−１−エニル、リノレイルおよびオレリルが挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書中で使用する場合、「アルケニレン」という用語は、本明細書中で上記で規定するような二価アルケニル基を指す。アルケニレンの代表的な例として、エテニレン、プロペニレン、ブテニレン、ペンテニレン、ヘキセニレン等が挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書中で使用する場合、「アルコキシ」という用語は、酸素架橋によって結合した任意のアルキル部分（即ち、−Ｏ−Ｃ１−３アルキル基、ここでＣ１〜３アルキルは、本明細書中で規定する通りである）を指す。かかる基の例として、メトキシ、エトキシおよびプロポキシが挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書中で使用する場合、「シクロアルキル」という用語は、指定数の炭素原子を有する飽和した単環式、二環式または三環式炭化水素を指す。例えば、Ｃ３〜７シクロアルキルは、３〜７個の炭素原子を有するシクロアルキル環を指す。シクロアルキル基は、式（Ｉ）で規定するように、１つまたは複数の置換基で任意選択で置換されてもよい。シクロアルキルの代表的な例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、ビシクロ［２．１．１］ヘキシル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、アダマンチル等が挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書中で使用する場合、「ハロ」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを指す。
本明細書中で使用する場合、「複素環式」という用語は、１〜４個のヘテロ原子を含有する、４〜１２員環の飽和もしくは不飽和の単環式または二環式環を指す。複素環系は、芳香族ではない。１つよりも多いヘテロ原子を含有する複素環式基は、異なるヘテロ原子を含有してもよい。複素環式基は、単環式、スピロ、または融合もしくは架橋二環式環系である。単環式複素環式基の例として、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、１，４−ジオキサニル、モルホリニル、１，４−ジチアニル、アゼチジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、１，３−ジオキソラニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピロリニル、ピロリジニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、１，２，３，６−テトラヒドロピリジニル、オキサチオラニル、ジチオラニル、１，３−ジオキサニル、１，３−ジチアニル、オキサチアニル、チオモルホリニル、１，４，７−トリオキサ−１０−アザシクロドデカニル、アザパニル等が挙げられる。スピロ複素環の例として、１，５−ジオキサ−９−アザスピロ［５．５］ウデンカニル、１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカニル、２−オキサ−７−アザスピロ［３．５］ノナニル等が挙げられるが、それらに限定されない。融合複素環系は、８〜１１個の環原子を有し、複素環がフェニル環に融合される基を含む。融合複素環の例として、デカヒドロクニリニル（qunilinyl）、（４ａＳ，８ａＲ）−デカヒドロイソキノリニル、（４ａＳ，８ａＳ）−デカヒドロイソキノリニル、オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロリル、イソイノリニル、（３ａＲ，７ａＳ）−ヘキサヒドロ−［１，３］ジオキソロ［４．５−ｃ］ピリジニル、オクタヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｂ］ピリジニル、テトラヒドロイソキノリニル等が挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書中で使用する場合、「ヘテロシクリルＣ１〜８アルキル」という用語は、単結合により、または上記で規定するようなＣ１〜８アルキル基により、分子の残部に結合された、上記で規定するような複素環を指す。
本明細書中で使用する場合、「ヘテロアリール」という用語は、窒素、酸素および硫黄から個々に選択される１、２、３または４つのヘテロ原子を含む５または６員環の芳香族単環式環基を指す。ヘテロアリール基は、炭素原子またはヘテロ原子を介して結合され得る。ヘテロアリールの例として、フリル、ピロリル、チエニル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジルまたはピリジルが挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書中で使用する場合、「ヘテロアリールＣ１〜８アルキル」は、単結合により、または上記で規定するようなＣ１〜８アルキル基により、分子の残部に結合された、上記で規定するようなヘテロアリール環を指す。
３．２ 中性脂質
本発明の脂質組成物における使用に適した中性脂質として、例えば、様々な中性、非荷電または両性イオン性脂質が挙げられる。本発明における使用に適した中性リン脂質の例として、５−ヘプタデシルベンゼン−１，３−ジオール（レゾルシノール）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウリルオイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１，２−ジアラキドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リゾホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、リゾホスファチジルエタノールアミンおよびそれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。一実施形態では、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）およびジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）から成る群から選択される。
３．３ 陰イオン性脂質
本発明における使用に適した陰イオン性脂質として、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミンコハク酸水素コレステロール（ＣＨＥＭＳ）、およびリジルホスファチジルグリセロールが挙げられるが、それらに限定されない。
３．４ ヘルパー脂質
ヘルパー脂質は、トランスフェクション（例えば、生物学的活性剤を含むナノ粒子のトランスフェクション）をある程度高める脂質である。ヘルパー脂質がトランスフェクションを高めるメカニズムは、例えば、粒子安定性を高めること、および／または膜融合性を高めることを含み得る。ヘルパー脂質として、ステロイドおよびアルキルレゾルシノールが挙げられる。本発明における使用に適したヘルパー脂質として、コレステロール、５−ヘプタデシルレゾルシノール、およびコハク酸水素コレステロールが挙げられるが、それらに限定されない。
３．４ ステルス脂質
ステルス脂質は、ナノ粒子がｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、血中で）存在することができる間、増加する脂質である。本発明の脂質組成物における使用に適したステルス脂質として、脂質部分に連結される親水性ヘッド基を有するステルス脂質が挙げられるが、それらに限定されない。かかるステルス脂質の例として、国際公開第２０１１／０７６８０７号パンフレットに記載されるような、式（ＸＩ）
を有する化合物、またはそれらの塩もしくは薬学的に許容される誘導体
（式中、
Ｚは、ＰＥＧならびにポリ（オキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］、多糖およびポリ（アミノ酸）ベースのポリマーから選択され、ここでポリマーは、直鎖状であってもよく、または分岐状であってもよく、ポリマーは、任意選択で置換されてもよく、
Ｚは、ｎ個のサブユニットにより重合され、
ｎは、１０〜２００ユニットのＺ間の数平均重合度であり、ｎは、種々のポリマータイプに関して最適化され、
Ｌ１は、エーテル（例えば、−Ｏ−）、エステル（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−）、スクシネート（例えば、−Ｏ（Ｏ）Ｃ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−）、カルバメート（例えば、−ＯＣ（Ｏ）−ＮＲ’−）、カーボネート（例えば、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−）、ケトン（例えば、−Ｃ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ−）、カルボニル（例えば、−Ｃ（Ｏ）−）、尿素（例えば、−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ’−）、アミン（例えば、−ＮＲ’−）、アミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−）、イミン（例えば、−Ｃ（ＮＲ’）−）、チオエーテル（例えば、−Ｓ−）、キサントエート（例えば、−ＯＣ（Ｓ）Ｓ−）、およびホスホジエステル（例えば、−ＯＰ（Ｏ２）Ｏ−）のうちの０、１つ、２つまたはそれ以上を含む、任意選択で置換されるＣ１〜１０アルキレンまたはＣ１〜１０ヘテロアルキレンリンカーであり、それらのいずれも、０、１つまたは複数のＺ基により置換されてもよく、
Ｒ’は、−Ｈ、−ＮＨ、−ＮＨ２、−Ｏ−、−Ｓ−、ホスフェートまたは任意選択で置換されるＣ１〜１０アルキレンから独立して選択され、
Ｘ１およびＸ２は、炭素または−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−もしくはホスフェートから選択されるヘテロ原子から独立して選択され、
Ａ１およびＡ２は、Ｃ６〜３０アルキル、Ｃ６〜３０アルケニル、およびＣ６〜３０アルキニルから独立して選択され、ここでＡ１およびＡ２は、同じであってもよく、または異なってもよく、あるいは、
Ａ１およびＡ２は、それらが結合する炭素と一緒に、任意選択で置換されるステロイドを形成する）が挙げられる。
特定のステルス脂質として、表１に列挙するものが挙げられるが、それらに限定されない。
本発明の脂質組成物における使用に適した他のステルス脂質およびかかる脂質の生化学に関する情報は、Romberg et al., Pharmaceutical Research, Vol. 25, No. 1, 2008, p.55-71、およびHoekstra et al., Biochimica et Biophysica Acta 1660 (2004) 41-52に見出すことができる。
一実施形態では、適したステルス脂質は、ＰＥＧ（場合によっては、ポリ（エチレンオキシド）と称される）ならびにポリ（オキサゾリン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリアミノ酸およびポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］ベースのポリマーから選択される基を含む。さらなる適したＰＥＧ脂質は、例えば国際公開第２００６／００７７１２号パンフレットに開示されている。
特定の適したステルス脂質として、約Ｃ４〜約Ｃ４０の飽和または不飽和炭素原子を独立して含むアルキル鎖長を有するジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基を含むものを含む、ポリエチレングリコール−ジアシルグリセロールまたはポリエチレングリコール−ジアシルグリカミド（ＰＥＧ−ＤＡＧ）が挙げられる。ジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基は、１つまたは複数の置換アルキル基を含む。本明細書中に記載する実施形態のいずれかにおいて、ＰＥＧ複合体は、ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）（NOF, Tokyo, Japanからのカタログ＃ＧＭ−０２０）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ−ジステリルグリセロール、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド、およびＰＥＧ−ジステリルグリカミド、ＰＥＧ−コレステロール（１−［８’−（コレスタ−５−エン−３［ベータ］−オキシ］カルボキシアミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−［オメガ］−メチル−ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ−ＤＭＢ（３，４−ジテトラデコキシルベンジル−［オメガ］−メチル−ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USAからのカタログ＃８８０１５０Ｐ）から選択することができる。
一実施形態では、ステルス脂質は、Ｓ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３である。
別の実施形態では、ステルス脂質はＳ０２４である。
別記しない限り、「ＰＥＧ」という用語は、本明細書中で使用する場合、任意のポリエチレングリコールまたは他のポリアルキレンエーテルポリマーを意味する。一実施形態では、ＰＥＧは、エチレングリコールまたはエチレンオキシドの任意選択で置換される直鎖状または分岐状ポリマーである。一実施形態では、ＰＥＧは無置換である。一実施形態では、ＰＥＧは、例えば、１つまたは複数のアルキル、アルコキシ、アシル、ヒドロキシまたはアリール基により置換される。一実施形態では、上記用語は、ＰＥＧ−ポリウレタンまたはＰＥＧ−ポリプロピレンなどのＰＥＧ共重合体を含み（例えば、J. Milton Harris, Poly(ethylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications (1992)を参照）、別の実施形態では、上記用語は、ＰＥＧ共重合体を含まない。一実施形態では、ＰＥＧは、約１３０〜約５０，０００、亜実施形態では、約１５０〜約３０，０００、亜実施形態では、約１５０〜約２０，０００、亜実施形態では、約１５０〜約１５，０００、亜実施形態では、約１５０〜約１０，０００、亜実施形態では、約１５０〜約６０００、亜実施形態では、約１５０〜約５０００、亜実施形態では、約１５０〜約４０００、亜実施形態では、約１５０〜約３０００、亜実施形態では、約３００〜約３０００、亜実施形態では、約１０００〜約３０００、および亜実施形態では、約１５００〜約２５００の分子量を有する。
ある特定の実施形態では、ＰＥＧは、「ＰＥＧ ２０００」とも称される「ＰＥＧ−２Ｋ」であり、それは、約２０００ダルトンの平均分子量を有する。ＰＥＧ−２Ｋは、本明細書中では、下記式（ＸＩＩａ）により表され、ここではｎは４５であり、数平均重合度が約４５個のサブユニットを含むことを意味する。しかしながら、例えば、数平均重合度が、約２３個のサブユニット（ｎ＝２３）および／または６８個のサブユニット（ｎ＝６８）を含むものを含む、当該技術分野で公知の他のＰＥＧ実施形態が使用されてもよい。
本発明のプロセスにおける使用のための式（Ｉ）〜式（ＩＸ）の好ましい化合物は、以下の実施例１〜３６である。
４．０ 被封入核酸ナノ粒子
「脂質ナノ粒子」とは、分子間力によって互いに物理的に結合された複数の（即ち、１つよりも多い）脂質分子を含む粒子を意味する。脂質ナノ粒子は、例えば、ミクロスフェア（単層および多層ベシクル、例えばリポソームを含む）、エマルジョン中の分散相、ミセルまたは懸濁液中の内部相であり得る。
「脂質ナノ粒子ホスト」という用語は、ｓｉＲＮＡなどの１つまたは複数の核酸分子を封入するための分子間力／静電相互作用によって互いに物理的に結合された複数の脂質分子を指す。
ある特定の実施形態は、薬学的に許容される担体および被封入核酸ナノ粒子を含む被封入核酸ナノ粒子組成物を提供する。被封入核酸ナノ粒子は、脂質ナノ粒子ホストおよび脂質ナノ粒子ホスト中に封入される核酸を含む。「薬学的に許容される担体」という用語は、本明細書中で使用する場合、無毒性の不活性希釈剤を意味する。薬学的に許容される担体として作用し得る材料として、発熱物質除去水（pyrogen-free water）、脱イオン水、等張生理食塩水、リンゲル溶液、およびリン酸緩衝溶液が挙げられるが、それらに限定されない。好ましい実施形態では、被封入核酸ナノ粒子は、約４０〜約７０ｎｍの平均サイズ、および例えばＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを使用して、動的光散乱により決定される場合の約０．１未満の多分散指数を有する。脂質ナノ粒子ホストは、本明細書中の他の箇所で記載されるように、分解性陽イオン性脂質、脂質付加された（lipidated）ポリエチレングリコール、コレステロール、および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン構成成分を含む。
本発明の実施形態は、陽イオン性脂質および別の脂質構成成分を含む被封入核酸ナノ粒子組成物を調製する方法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂質およびヘルパー脂質、例えばコレステロールを使用する方法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂質、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、および中性脂質、例えばＤＳＰＣを使用する方法を提供する。本発明の別の実施形態は、陽イオン性脂質、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する方法を提供する。本発明の別の実施形態は、脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法を提供し、ここでナノ粒子は、陽イオン性脂質、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、ステルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を含み、核酸は、例えばＲＮＡまたはＤＮＡである。本発明の別の実施形態は、陽イオン性脂質、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する方法を提供し、ここで核酸は、例えばｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはＤＮＡである。
本発明の幾つかの実施形態では、脂質溶液／流（複数可）は、陽イオン性脂質化合物、ヘルパー脂質（コレステロール）、任意選択の中性脂質（ＤＳＰＣ）およびステルス脂質（例えば、Ｓ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、またはＳ０３１）を含有する。配合物が４つの脂質構成成分を含有する場合、脂質のモル比は、４０〜６０の標的を有する陽イオン性脂質に関して２０〜７０モルパーセントの範囲であってもよく、ヘルパー脂質のモルパーセントは、３０〜５０の標的で２０〜７０の範囲であり、中性脂質のモルパーセントは、０〜３０の範囲であり、ＰＥＧ脂質のモルパーセントは、２〜５の標的で１〜６の範囲を有する。
幾つかの実施形態では、脂質溶液／流（複数可）は、式（ＩＩＩ）を有する化合物３０〜６０％、コレステロール３０〜６０％／ＤＳＰＣ５〜１０％、およびＰＥＧ−ＤＭＧ、Ｓ０１０、Ｓ０１１またはＳ０２４ １〜５％を含有する。
本発明の別の実施形態は、陽イオン性脂質約４０〜５５／ヘルパー脂質約４０〜５５の脂質モル比で、陽イオン性脂質およびヘルパー脂質、例えばコレステロールを使用して、脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂質約４０〜５５／ヘルパー脂質約４０〜５５／中性脂質約５〜１５の脂質モル比で、陽イオン性脂質、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、および中性脂質、例えばＤＳＰＣを使用する方法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂質約４０〜５５／ヘルパー脂質約４０〜５５／中性脂質約５〜１５／ステルス脂質約１〜１０の脂質モル比で、陽イオン性脂質、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する方法を提供する。
本発明の別の実施形態は、陽イオン性脂質約４０〜５０／ヘルパー脂質約４０〜５０の脂質モル比で、陽イオン性脂質およびヘルパー脂質、例えばコレステロールを使用して、脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂質約４０〜５０／ヘルパー脂質約４０〜５０／中性脂質約５〜１５の脂質モル比で、陽イオン性脂質、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、および中性脂質、例えばＤＳＰＣを使用する方法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂質約４０〜５０／ヘルパー脂質約４０〜５０／中性脂質約５〜１５／ステルス脂質約１〜５の脂質モル比で、陽イオン性脂質、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する方法を提供する。
本発明の別の実施形態は、陽イオン性脂質約４３〜４７／ヘルパー脂質約４３〜４７の脂質モル比で、陽イオン性脂質およびヘルパー脂質、例えばコレステロールを使用して、脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂質約４３〜４７／ヘルパー脂質約４３〜４７／中性脂質約７〜１２の脂質モル比で、陽イオン性脂質、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、および中性脂質、例えばＤＳＰＣを使用する方法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂質約４３〜４７／ヘルパー脂質約４３〜４７／中性脂質約７〜１２／ステルス脂質約１〜４の脂質モル比で、陽イオン性脂質、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する方法を提供する。
本発明の別の実施形態は、陽イオン性脂質約４５％およびヘルパー脂質約４４％の脂質モル比で、陽イオン性脂質およびヘルパー脂質、例えばコレステロールを使用して、脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂質約４５％、ヘルパー脂質約４４％、および中性脂質約９％の脂質モル比で、陽イオン性脂質、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、および中性脂質、例えばＤＳＰＣを使用する方法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂質約４５％、ヘルパー脂質約４４％、中性脂質約９％、およびステルス脂質約２％の脂質モル比で、陽イオン性脂質、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する方法を提供する。
本発明の一実施形態は、式（Ｉ）を有する化合物および別の脂質構成成分を含む被封入核酸ナノ粒子組成物を調製する方法を提供する。別の実施形態は、式（Ｉ）を有する化合物およびヘルパー脂質、例えばコレステロールを使用する方法を提供する。別の実施形態は、式（Ｉ）を有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、および中性脂質、例えばＤＳＰＣを使用する方法を提供する。本発明の別の実施形態は、式（Ｉ）を有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する方法を提供する。本発明の別の実施形態は、脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法を提供し、ここでナノ粒子は、式（Ｉ）を有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、ステルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３０３を含み、核酸は、例えばＲＮＡまたはＤＮＡである。本発明の別の実施形態は、式（Ｉ）を有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３０３を使用する方法を提供し、ここで核酸は、例えばｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはＤＮＡである。
本発明の別の実施形態は、式（Ｉ）を有する化合物約４０〜５５／ヘルパー脂質約４０〜５５の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物およびヘルパー脂質、例えばコレステロールを使用して、脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法を提供する。別の実施形態は、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物約４０〜５５／ヘルパー脂質約４０〜５５／中性脂質約５〜１５の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、および中性脂質、例えばＤＳＰＣを使用する方法を提供する。別の実施形態は、式（Ｉ）を有する化合物約４０〜５５／ヘルパー脂質約４０〜５５／中性脂質約５〜１５／ステルス脂質約１〜１０の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する方法を提供する。
本発明の別の実施形態は、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物約４０〜５０／ヘルパー脂質約４０〜５０の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物およびヘルパー脂質、例えばコレステロールを使用して、脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法を提供する。別の実施形態は、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物約４０〜５０／ヘルパー脂質約４０〜５０／中性脂質約５〜１５の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、および中性脂質、例えばＤＳＰＣを使用する方法を提供する。別の実施形態は、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物約４０〜５０／ヘルパー脂質約４０〜５０／中性脂質約５〜１５／ステルス脂質約１〜５の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する方法を提供する。
本発明の別の実施形態は、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物約４３〜４７／ヘルパー脂質約４３〜４７の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物およびヘルパー脂質、例えばコレステロールを使用して、脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法を提供する。別の実施形態は、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物約４３〜４７／ヘルパー脂質約４３〜４７／中性脂質約７〜１２の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、および中性脂質、例えばＤＳＰＣを使用する方法を提供する。別の実施形態は、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物約４３〜４７／ヘルパー脂質約４３〜４７／中性脂質約７〜１２／ステルス脂質約１〜４の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する方法を提供する。
本発明の別の実施形態は、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物約４５％およびヘルパー脂質約４４％の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物およびヘルパー脂質、例えばコレステロールを使用して、脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法を提供する。別の実施形態は、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物約４５％、ヘルパー脂質約４４％、および中性脂質約９％の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、および中性脂質、例えばＤＳＰＣを使用する方法を提供する。別の実施形態は、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物約４５％、ヘルパー脂質約４４％、中性脂質約９％、およびステルス脂質約２％の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する方法を提供する。
本発明のプロセスにおける脂質：核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）の比は、およそ１５〜２０：１（ｗｔ／ｗｔ）であり得る。ある特定の実施形態では、脂質：核酸の比は、約１７〜１９：１である。他の実施形態では、脂質：核酸の比は、約１８．５：１である。
本発明のプロセスにより生産されるナノ粒子は、平均／平均値直径、およびおよそ平均値のサイズの分布を有する。より狭い範囲の粒径は、粒径のより一様な分布に対応する。粒径は、インキュベーション後、またはナノ粒子配合物を完全に加工処理（例えば、希釈、ろ過、透析等）した後に、ナノ粒子の収集時に決定され得る。例えば、粒径決定は通常、６０分のインキュベーション期間後、および／または完全な試料の加工処理後に実施される。平均粒径は、Ｚ−平均値または数平均値のいずれかとして報告される。Ｚ−平均値は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒで動的光散乱により測定される。ナノ粒子試料は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に希釈されて、その結果、カウントレート（count rate）は、およそ２００〜４００ｋｃｔである。データは、強度測定の加重平均値として表される。動的光散乱はまた、粒径分布の幅を定量化する多分散指数（ＰＤＩ）を提供する。より大きなＰＤＩは、より大きな粒径分布と相関し、また逆の場合も同様である。他方で、数平均値は、顕微鏡下での測定により決定することができる。
幾つかの実施形態では、本発明のプロセスにより生産される被封入核酸ナノ粒子は、約３０〜約１５０ｎｍの平均直径を有する。他の実施形態では、粒子は、約３０〜約４０ｎｍの平均直径を有する。他の実施形態では、粒子は、約４０〜約７０ｎｍの平均直径を有する。他の実施形態では、粒子は、約６５〜約８０ｎｍの平均直径を有する。他の実施形態では、粒子は、約５０〜約８０ｎｍのＺ平均値および／または約４０〜約８０ｎｍの数平均値を有する。さらなる他の実施形態では、粒子は、約５０〜約７０ｎｍのＺ平均値および／または約４０〜６５ｎｍの数平均値を有する。さらに他の実施形態では、粒子は、約７０〜約８０ｎｍのＺ平均値および／または約６０〜８０ｎｍの数平均値を有する。得られる粒子の特定サイズは、核酸および脂質流の線速度、任意選択の希釈ステップの使用、および使用する特定核酸または脂質に依存し得る。より大きな線速度、および第１の出口溶液中の有機溶媒濃度を３３％未満に維持することが、より小さな粒径を生じる傾向にある。
幾つかの実施形態では、本発明のプロセスにより生産される被封入ｓｉＲＮＡナノ粒子は、約３０〜約１５０ｎｍの平均直径を有する。他の実施形態では、粒子は、約３０〜約４０ｎｍの平均直径を有する。他の実施形態では、粒子は、約４０〜約７０ｎｍの平均直径を有する。他の実施形態では、粒子は、約６５〜約８０ｎｍの平均直径を有する。他の実施形態では、粒子は、約５０〜約８０ｎｍのＺ平均値および／または約４０〜約８０ｎｍの数平均値を有する。さらなる他の実施形態では、粒子は、約５０〜約７０ｎｍのＺ平均値および／または約４０〜６５ｎｍの数平均値を有する。さらに他の実施形態では、粒子は、約７０〜約８０ｎｍのＺ平均値および／または約６０〜８０ｎｍの数平均値を有する。さらなる他の実施形態では、本発明のプロセスにより生産される被封入ｓｉＲＮＡナノ粒子は、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、または約８０ｎｍの平均直径を有し得る。
動的光散乱（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＮａｎｏＺＳ）を使用して、多分散指数（ＰＤＩ）は、０〜１．０の範囲であり得る。特定の好ましい実施形態では、ＰＤＩは、約０．２未満である。他の好ましい実施形態では、ＰＤＩは、約０．１未満である。
本発明のプロセスは、陽イオン性脂質を、所望のｐＫａ範囲、ステルス脂質、ヘルパー脂質、および中性脂質と組み合わせることにより、特定の細胞および組織へのｉｎ ｖｉｖｏでの送達のために、例えばリポソーム配合物、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）配合物等を含む配合物へとさらに最適化されてもよい。一実施形態では、さらなる最適化は、これら各種タイプの脂質間の脂質モル比を調節することにより得られる。一実施形態では、さらなる最適化は、所望の粒径、Ｎ／Ｐ比、および／またはプロセスパラメーターの１つまたは複数を調節することにより得られる。上記で列挙する実施形態に関する当業者に公知の各種最適化技法は、本発明の一部とみなされる。
５．０ 脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入するプロセス
下記方法を使用して、本発明の脂質ナノ粒子を作製することができる。粒子におけるサイズ低減を達成するために、および／またはサイズの均質性を増加させるために、当業者は、以下に提示する方法ステップを使用して、種々の組合せを実験してもよい。さらに、当業者は、リポソーム配合物で使用される超音波処理、ろ過または他のサイジング技法を用いることができる。
本発明の組成物を作製するプロセスは通常、第１のリザーバ中に核酸を含む、クエン酸緩衝液などの水溶液を供給するステップ、脂質（複数可）の有機アルコール、例えばエタノールなどの有機溶液を含む第２のリザーバを供給するステップ、続いて水溶液を有機脂質溶液と混合するステップを含む。第１のリザーバは、任意選択で、第２のリザーバと液洛している。混合ステップに続いて、任意選択で、インキュベーションステップ、ろ過または透析ステップ、ならびに希釈および／または濃縮ステップが行われる。インキュベーションステップは、混合ステップからの溶液を、およそ室温で約０〜約２４時間（好ましくは、約１時間）容器中で、および任意選択で光から防御して静置させるステップを含む。一実施形態では、希釈ステップに続いて、インキュベーションステップが行われる。希釈ステップは、例えばポンピング装置（例えば、ぜん道ポンプ）を使用した、水性緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液または純水）を用いた希釈を包含し得る。ろ過ステップは、限外ろ過または透析であってもよい。限外ろ過は、適切な限外ろ過膜（例えば、ＧＥ中空繊維カートリッジまたはそれらの等価体）と併用して適切なポンピングシステム（例えば、ぜん動ポンプまたはそれらの等価体などのポンピング装置）を使用した、希釈した溶液の濃縮、続くダイアフィルトレーションを含む。透析は、適切な膜（例えば、１０，０００ ｍｗｃ スネークスキン膜）に通した溶媒（緩衝液）交換を含む。
一実施形態では、混合ステップは、透明な単一相を供給する。
一実施形態では、混合ステップ後、有機溶媒を除去して、粒子の懸濁液を供給し、ここで核酸は、脂質（複数可）により封入される。
有機溶媒の選択は通常、溶媒極性および粒子形成の後期段階で、溶媒を除去することができる容易さの考慮を含む。可溶化剤としても使用される有機溶媒は好ましくは、核酸および脂質の透明な単一相混合物を供給するのに十分な量で存在する。適切な有機溶媒として、注射用製剤用の共溶媒としての使用に関して、Strickley, Pharmaceutical Res. (2004), 21, 201-230により記載されるものが挙げられる。例えば、有機溶媒は、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００、グリセリン、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチル-２−ピロリドン（ＮＭＰ）、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のうちの１つまたは複数（例えば、２つ）から選択され得る。好ましくは、有機溶媒は、エタノールである。
本発明の組成物を作製するための装置が、本明細書中に開示される。装置は通常、核酸を含む水溶液を保持するための少なくとも１つのリザーバ、および有機脂質溶液を保持するための別の１つまたは複数のリザーバを含む。装置はまた、水溶液および有機脂質溶液を、混合領域または混合チャンバーへポンピングするよう設定されたポンプメカニズムを通常含む。幾つかの実施形態では、混合領域または混合チャンバーは、クロスカップリング、または等価体を含み、それにより、水性および有機流体流を、十字コネクターへの入力として組み合わせることが可能であり、得られた複合水性および有機溶液を、十字コネクターから、収集リザーバまたはその等価体へ出すことが可能である。他の実施形態では、混合領域または混合チャンバーは、Ｔカップリングまたはその等価体を含み、それにより、水性および有機流体流を、Ｔコネクターへの入力として組み合わせることが可能であり、得られた複合水性および有機溶液を、Ｔコネクターから、収集リザーバまたはその等価体へ出すことが可能である。
本発明によるプロセスは、被封入核酸ナノ粒子を形成する例示的な方法における使用のためのシステムを示す図２を参照することにより、より良好に理解され得る。装置１は、それぞれ第１の核酸流１０、第２の核酸流２０、および脂質流３０を受けるための通路１２、通路２２および通路３２を有する十字１６を含有する。流れ１０、流れ２０、および流れ３０は、核酸溶液を含有する１つまたは複数のリザーバ、および脂質の溶液を含有する１つまたは複数のリザーバに通じる適切なチューブを通って各々の流れをポンピングすることにより、通路１２、通路２２および通路３２へ送達され得る（チューブおよびリザーバは示していない）。図２における通路１２、通路２２、および通路３２は、ほぼ等しい内径を有する。流１０、流２０、および流３０は、交差ポイント１４で集まって、複合流４０を形成する。十字１６の幾何学のため、脂質流３０は、核酸流１０および核酸流２０に対して直角の方向で流動し、核酸流１０および核酸流２０は、交差ポイント１４に向かって互いに対して約１８０°で反対方向で流動する。複合流４０は、通路４２を通って、プロセスチャンバー７０へと流動し、プロセスチャンバーの本体（７２）は、通路４２よりも大きな直径を有し得る。プロセスチャンバー７０はまた、様々な長さを有してもよい。例えば、プロセスチャンバー７０は、通路１２、通路２２、および通路３２の直径の約１００〜２０００倍の長さ、および通路１２、通路２２、および通路３２の直径の約４倍の直径を有し得る。
図２の実施形態では、合流した流れ４０は、通路５２を通って入ってくる希釈流５０と交差する。希釈流５０は、希釈溶液を含有する希釈リザーバからチューブを通って送達され得る。図２では、通路５２は、通路１２、通路２２、および通路３２よりも約２倍大きな直径を有する。合流した流れ４０および希釈流５０は、Ｔチャンバー５４で交差する。合流した流れ４０および希釈流５０の交差により生じる流れは、被封入核酸ナノ粒子を含有する第１の出口溶液６０である。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の核酸流中の核酸の濃度は、約０．１〜約１．５ｍｇ／ｍＬであり、１つまたは複数の脂質流中の脂質の濃度は、約１０〜約２５ｍｇ／ｍＬである。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流中の核酸の濃度は、約０．２〜約０．９ｍｇ／ｍＬであり、１つまたは複数の脂質流中の脂質の濃度は、約１５〜約２０ｍｇ／ｍＬである。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流中の核酸の濃度は、約０．２２５、０．３、０．３３、または０．４５〜約０．６７５ｍｇ／ｍＬであり、１つまたは複数の脂質流中の脂質の濃度は、約１６〜約１８ｍｇ／ｍＬである。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流中の核酸の濃度は、約０．２２５、０．３、０．３３、０．４５、または０．６７５ｍｇ／ｍＬであり、１つまたは複数の脂質流中の脂質の濃度は、約１６．７ｍｇ／ｍＬである。
脂質流は、有機溶媒中に１つまたは複数の脂質の混合物を含む。１つまたは複数の脂質は、陽イオン性脂質、中性脂質、ヘルパー脂質、およびステルス脂質の混合物であってもよく、それらはそれぞれ、最終的な被封入核酸ナノ粒子に関して、本明細書中で上記の他の箇所で記載されるように、ほぼ同じ相対量で存在し得る。脂質流に使用される有機溶媒は、脂質を可溶化させることが可能なものであり、即ち水性媒質と混和性である。適切な有機溶媒として、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００、グリセリン、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が挙げられる。好ましくは、有機溶媒は、約８０％またはそれ以上のエタノールを含む。好ましくは、有機溶媒は、約９０％またはそれ以上のエタノールを含む。より好ましくは、有機溶媒はエタノールである。ある特定の実施形態では、脂質流は、クエン酸ナトリウムの緩衝溶液（例えば、２５ｍＭ）などの任意選択の緩衝溶液を含む。
核酸流は、第１の水溶液中に適切な核酸の混合物を含む。第１の水溶液は、塩を含まなくてもよく、または少なくとも１つの塩を含んでもよい。例えば、第１の水溶液は、添加塩を伴わずに、脱イオンまたは蒸留水中に適切な核酸を含んでもよい。ある特定の実施形態では、第１の水溶液は、例えば塩化ナトリウムおよび／またはクエン酸ナトリウムなどの少なくとも１つの塩を含む第１の緩衝溶液である。第１の水溶液において、塩化ナトリウムは、約０〜約３００ｍＭの範囲の濃度で存在し得る。ある特定の実施形態では、塩化ナトリウムの濃度は、約５０、６６、７５、１００、または１５０ｍＭである。第１の水溶液は、約０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度でクエン酸ナトリウムを含み得る。第１の緩衝溶液は好ましくは、ｐＨ約４〜約６．５、より好ましくは約４．５〜５．５を有する。幾つかの実施形態では、第１の緩衝溶液のｐＨは、約５であり、クエン酸ナトリウム濃度は、約２５ｍＭである。他の実施形態では、第１の緩衝溶液のｐＨは、約６であり、クエン酸ナトリウムの濃度は、約１００ｍＭである。好ましくは、第１の緩衝溶液は、陽イオン性脂質のｐＫａ未満であるｐＨを有する。水溶液中に塩を含まない本発明の実施形態に関して、脂質流は、任意選択の緩衝溶液を含む。核酸流または脂質流のいずれかにおける塩（例えば、クエン酸ナトリウム）の非存在下では、封入は起きない。
他の考え得る緩衝液として、酢酸ナトリウム／酢酸、Ｎａ２ＨＰＯ４／クエン酸、フタル酸水素カリウム／水酸化ナトリウム、フタル酸水素二ナトリウム／オルトリン酸二水素ナトリウム、フタル酸水素二カリウム／オルトリン酸二水素カリウム、オルトリン酸二水素カリウム／水酸化ナトリウムが挙げられるが、それらに限定されない。
ある特定の実施形態では、有機溶媒はエタノールを含み、第１の出口溶液は、約２０〜２５％エタノール、約０．１５〜０．２５ｍｇ／ｍＬの核酸、および約３〜４．５ｍｇ／ｍＬの脂質を含む。他の実施形態では、有機溶媒はエタノールを含み、第１の出口溶液は、約２０％エタノール、約０．１５〜０．２ｍｇ／ｍＬの核酸、および約３〜３．５ｍｇ／ｍＬの脂質を含む。さらに他の実施形態では、有機溶媒はエタノールを含み、第１の出口溶液は、約２０％エタノール、約０．１８ｍｇ／ｍＬの核酸、および約３．３ｍｇ／ｍＬの脂質を含む。他の実施形態では、有機溶媒はエタノールを含み、第１の出口溶液は、約２５％エタノール、約０．２〜０．２５ｍｇ／ｍＬの核酸、および約４〜４．５ｍｇ／ｍＬの脂質を含む。さらなる他の実施形態では、有機溶媒はエタノールを含み、第１の出口溶液は、約２５％エタノール、約０．２３ｍｇ／ｍＬの核酸、および約４．２ｍｇ／ｍＬの脂質を含む。
図２によるある特定の実施形態では、核酸流１０および核酸流２０は、約３〜約８メートル／秒の複合線速度を有し、脂質流３０は、１秒当たり約１．５〜約４．５メートルの線速度を有し、脂質：核酸の質量による比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液６０中の有機溶媒の濃度は、３３％未満である。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１５〜２０：１または約１７〜１９：１であり、出口溶液６０中の有機溶媒の濃度は、約２０〜２５％である。他の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１８．５：１であり、出口溶液６０中の有機溶媒の濃度は、約２５％である。上記範囲からの核酸流および脂質流に関する線速度の選択は、本明細書中に規定するように、脂質対核酸の比を維持するための要件により制限されることが理解されよう。したがって、他のパラメーター（例えば、核酸濃度（ｍｇ／ｍＬ）、流速（ｍＬ／分））の調節は、標的脂質対核酸比を達成するのに必要であり得る。
図２による他の実施形態では、核酸流１０および核酸流２０は、約６〜約８メートル／秒の複合線速度を有し、脂質流３０は、１秒当たり約３〜約４メートルの線速度を有し、脂質：核酸の質量による比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液６０中の有機溶媒の濃度は、３３％未満である。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１５〜２０：１または約１７〜１９：１であり、出口溶液６０中の有機溶媒の濃度は、約２０〜２５％である。他の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１８．５：１であり、出口溶液６０中の有機溶媒の濃度は、約２５％である。
図２による一実施形態では、核酸流１０および核酸流２０は、約６．８メートル／秒の複合線速度を有し、脂質流３０は、１秒当たり約３．４メートルの線速度を有し、各流れ１０／２０／３０／５０は、ほぼ同じ流速（ｍＬ／分）を有し、脂質：核酸の質量による比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液６０中の有機溶媒の濃度は、約２５％である。ほぼ等しい容量の２つの核酸流、１つの脂質流および１つの希釈流を供給することにより、第１の出口溶液中の脂質流（１００％有機溶媒中の脂質）に由来する有機溶媒の総濃度は、約２５％である。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１７〜１９：１である。他の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、１８．５：１である。
本発明の典型的な実施形態では、各核酸流１０／２０は、約０．４５ｍｇ／ｍＬの核酸濃度、および３．４メートル／秒の線速度を有してもよく、脂質流３０は、約１６．７ｍｇ／ｍＬの総脂質濃度、および約３．４メートル／秒の線速度を有してもよく、個々の流れの流速はほぼ等しい。例えば、通路１２、通路２２、および通路３２は、内径０．５ｍｍを有してもよく、流１０、流２０、および流３０はそれぞれ、約４０ｍＬ／分の流速、および約３．４メートル／秒の対応する線速度を有する。あるいは、通路１２、通路２２、および通路３２は、内径１．０ｍｍを有してもよく、流１０、流２０、および流３０はそれぞれ、約１６０ｍＬ／分の流速を有するのに対して、対応する線速度は、約３．４メートル／秒のままである。さらなる代替物では、通路１２、通路２２、および通路３２は、内径約２．０ｍｍを有してもよく、流１０、流２０、および流３０はそれぞれ、約６４０ｍＬ／分の流速を有するのに対して、線速度は、約３．４メートル／秒のままである。上述の例から明らかであるように、通路および流れの直径の倍増は、一定の線速度を維持するために流速の４倍増加を要する。これらの例では、希釈流５０は、流１０、流２０、および流３０と同じ流速を有するが、通路５２の２倍よりも大きい直径が、各プロセススケールで、希釈流に関して５０％よりも低い線速度をもたらす。驚くべきことに、同じ高度の核酸封入および小さくて、かつ一様な粒径を維持しながら、本発明のプロセスは、上述するように縮尺され得ることが見出されている。
脂質流３０に対する複合核酸流１０／２０の線速度は、各々の流れ中の核酸および脂質濃度、ならびに希釈流５０を含む、個々の流れの流速（ｍＬ／分）に関する。しかしながら、核酸および脂質の濃度は、上記で付与される特定の値に限定されず、流速が相応して調節されるのであれば、必要に応じて、一般的に脂質：核酸の比を約１５〜２０：１に維持するように上下に調節してもよい。例えば、０．４５ｍｇ／ｍＬから０．４０５ｍｇ／ｍＬへの核酸濃度の１０％減少は、一定の核酸の全体的な送達を保持するために流速（ｍＬ／分）の約１．１１倍増加により遂行される。一定の核酸流の直径を保持して、ｍＬ／分の流速の１．１１倍増加は、メートル／秒の線速度の１．１１倍増加をもたらす。同様に、一定の希釈流の流速を保持して、出口溶液６０中の脂質流からの有機溶媒の全体的な濃度は、約２３．５％へ減少する。当然のことながら、希釈流５０の流速は同様に、そのように望まれる場合には、有機溶媒濃度を約２５％に保持するように低減させることができる。最終的に、核酸濃度の十分な低減および核酸流の流速の対応する増加が、有機溶媒濃度を第１の出口溶液６０中で約２５％に維持するための希釈流５０の必要性を不要にし得る。逆に、核酸濃度を増加させてもよい（例えば、０．９ｍｇ／ｍＬへ）。しかしながら、かかる２倍増加は、有機溶媒の濃度を約２５％に、また脂質：核酸の比を約１５〜２０：１に保持するのに、核酸流の流速（複数可）の対応する減少、および希釈流の速度の増加を必要とする。核酸もしくは脂質濃度、流速、または流れ１０、流れ２０、流れ３０、および流れ５０の線速度のさらなる変動は、上述の原理に従って行われてもよい。
本発明の他の実施形態では、核酸流１０／２０および脂質流３０の流速および／または線速度はともに、一緒に低減または上昇させてもよい。したがって、各流れに関して一定の直径および濃度を保持して、複合核酸流の線速度は３．４メートル／秒へ、脂質流の線速度は１．７メートル／秒へ低減されてもよい。他の実施形態では、複合核酸流の線速度は約３メートル／秒へ、脂質流の線速度は約１．５メートル／秒へ低減されてもよい。同様に、複合核酸流の線速度は約１４メートル／秒へ、脂質流の線速度は約７メートル／秒へ上昇されてもよい。一般的に、速度の上限範囲は、流れをポンピングするのに使用する設備の機械的制限によってのみ対象となる。非常に高い流速／速度は、設備故障を引き起こす背圧を生じ得る。概して、図２による複合核酸流の速度は、約３メートル／秒〜１秒当たり約１４メートル、脂質流に関しては、約１．５〜約４．５メートル／秒の範囲であり得る。好ましくは、複合核酸流の速度は、約６〜８メートル／秒、脂質流に関しては、約３〜約４メートル／秒である。ある特定の実施形態では、複合核酸流の複合速度は、約６．８メートル／秒、脂質流に関しては、約３．４メートル／秒である。
本発明の幾つかの実施形態では、核酸および脂質の濃度はともに、一緒に低減または上昇させてもよい。例えば、より効率的なプロセスのために可能な限り高い濃度を保持することが一般的に望ましいが、核酸の濃度を約０．０４５ｍｇ／ｍＬへ、および脂質の濃度を約１．６７ｍｇ／ｍＬへ低減させることが可能である。しかしながら、さらに低い濃度では、粒子凝集が増加する傾向にある。
図２によるある特定の実施形態では、１つまたは複数の核酸流中の核酸の濃度は、約０．１〜約１．５ｍｇ／ｍＬであり、１つまたは複数の脂質流中の脂質の濃度は、約１０〜約２５ｍｇ／ｍＬである。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流中の核酸の濃度は、約０．２〜約０．９ｍｇ／ｍＬであり、１つまたは複数の脂質流中の脂質の濃度は、約１５〜約２０ｍｇ／ｍＬである。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流中の核酸の濃度は、約０．２２５、０．３、０．３３、または０．４５〜約０．６７５ｍｇ／ｍＬであり、１つまたは複数の脂質流中の脂質の濃度は、約１６〜１８ｍｇ／ｍＬである。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流中の核酸の濃度は、約０．２２５、０．３、０．３３、０．４５または０．６７５ｍｇ／ｍＬであり、１つまたは複数の脂質流中の脂質の濃度は、約１６．７ｍｇ／ｍＬである。概して、より高い核酸濃度は、好ましい範囲（例えば、約０．１５〜０．２５ｍｇ／ｍＬ）で第１の出口流６０中の核酸濃度を維持するために、相応して増加されるレベルの希釈流５０からの希釈を要する。
他の実施形態では、図２におけるＴ接合部５４は、２つの希釈流５０ａおよび５０ｂが、合流した流れ（例えば、流れ４０）と交差し得るように、十字５４ａで置き換えてもよい（図２ａ）。希釈流５０ａおよび５０ｂは、十字５４ａの通路５２ａおよび通路５２ｂを通って入る。単一希釈流ではなく、２つの希釈流を使用することで、合流した流れ４０のより大きな希釈倍数が可能となる。第１の出口流６０の得られたより大きな希釈は、いくらか小さな粒径を提供し得る。例えば、図２に関連した上述の核酸流／脂質流の流速および速度を使用するが、図２ａ由来の十字５４ａを代用することで、希釈溶媒の容量を２倍にすることができる。第１の合流した流れ４０の得られたより大きな希釈は、より低濃度の脂質流由来の有機溶媒（例えば、エタノール）を有する第１の出口流６０を生じる。例えば、十字５４ａを使用して、第１の出口溶液中の有機溶媒濃度は、約２０％に低減され得る。他の点で、核酸濃度、脂質濃度、流速、速度等は、図２に関連して上述するのと同じ十字５４ａを使用して変動させてもよい。
あるいは、上述の実施形態のいずれか由来の合流した流れは、希釈流５０、５０ａ、または５０ｂにより供給されるものと等しい容量の希釈溶媒を含有する希釈プール中で単に希釈されてもよい。
代替的な実施形態では、図２における十字１６は、図３ａに示すように、Ｔ形状のチャンバー８６で置き換えてもよい。チャンバー８６を使用したプロセスは、１つの核酸流８０および１つの脂質流９０に関して、２つの流入通路８２および９２を有する。混合チャンバー８６を使用したプロセスでは、核酸流および脂質流は、互いに対して約１８０°の反対方向の流動を有する。チャンバー８６を使用して、２つの核酸流を利用する十字１６を使用して達成され得る脂質：核酸の同じ比を維持するために、単一の核酸流の流速および速度は、脂質流の流速および速度の２倍となり得る。例えば、Ｔチャンバー８６（例えば、０．５ｍｍ直径の通路８２および９２）を使用した一実施形態では、約０．４５ｍｇ／ｍＬの核酸を有する核酸流は、約８０ｍＬ／分の流速および６．８メートル／秒の線速度を有してもよく、脂質流は、約１６．７ｍｇ／ｍＬの濃度および３．４メートル／秒の線速度を有し得る。チャンバー８６を使用したプロセスにおいて、４０ｍＬ／分の流速で図２に示すような希釈流５０を用いることで、約２５％の第１の出口溶液中の有機溶媒の濃度をもたらす。驚くべきことに、小さな粒径および一様性の同じ有益な特性が、十字１６を使用して得ることができるように、Ｔチャンバー８６を使用して得られ得る。Ｔチャンバー８６を使用することは、図２における個々の核酸流の流速と比較して、核酸流の流速を２倍にする点が異なる。全体的な核酸流の流速は、両方のプロセスに関して依然として同じであり、したがって、実質的に等価な特性を有するナノ粒子を生じる。
Ｔチャンバー８６および希釈流５０を使用したある特定の実施形態では、核酸流８０は、約３〜約８メートル／秒の線速度を有し、脂質流９０は、１秒当たり約１．５〜約４．５メートルの線速度を有し、脂質：核酸の質量による比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、３３％未満である。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１５〜２０：１または約１７〜１９：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２０〜２５％である。他の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１８．５：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２５％である。
Ｔチャンバー８６および希釈流５０を使用した他の実施形態では、核酸流８０は、約６〜約８メートル／秒の線速度を有し、脂質流９０は、１秒当たり約３〜約４メートルの線速度を有し、脂質：核酸の質量による比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、３３％未満である。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１５〜２０：１または約１７〜１９：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２０〜２５％である。他の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１８．５：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２５％である。
Ｔチャンバー８６および希釈流５０を使用した一実施形態では、核酸流８０は、約６．８メートル／秒の線速度を有し、脂質流９０は、１秒当たり約３．４メートルの線速度を有し、流れ８０は、流れ９０および希釈流５０の２倍の流速（ｍＬ／分）を有し、脂質：核酸の質量による比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２５％である。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１７〜１９：１である。他の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１８．５：１である。
希釈流５０を有さずにＴチャンバー８６を使用したある特定の実施形態では、核酸流８０は、約８〜約１４メートル／秒の線速度を有し、脂質流９０は、１秒当たり約１．５〜約４．５メートルの線速度を有し、脂質：核酸の質量による比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、３３％未満である。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１５〜２０：１または約１７〜１９：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２０〜２５％である。他の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１８．５：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２０％または２５％である。
希釈流５０を有さずにＴチャンバー８６を使用した他の実施形態では、核酸流８０は、約９〜約１１メートル／秒の線速度を有し、脂質流９０は、１秒当たり約３〜約４メートルの線速度を有し、脂質：核酸の質量による比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、３３％未満である。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１５〜２０：１または約１７〜１９：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２０〜２５％である。他の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１８．５：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２５％である。
希釈流５０を有さずにＴチャンバー８６を使用した一実施形態では、核酸流８０は、約１０．２メートル／秒の線速度を有し、脂質流９０は、１秒当たり約３．４メートルの線速度を有し、流れ８０は、流れ９０の３倍の流速（ｍＬ／分）を有し、脂質：核酸の質量による比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２５％である。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１７〜１９：１である。他の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１８．５：１である。
希釈流５０を有さずにＴチャンバー８６を使用した他の実施形態では、核酸流８０は、約１１〜約１４メートル／秒の線速度を有し、脂質流９０は、１秒当たり約３〜約４メートルの線速度を有し、脂質：核酸の質量による比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、３３％未満である。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１５〜２０：１または約１７〜１９：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２０〜２５％である。他の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１８．５：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２０％である。
希釈流５０を有さずにＴチャンバー８６を使用した一実施形態では、核酸流８０は、約１３．６メートル／秒の線速度を有し、脂質流９０は、１秒当たり約３．４メートルの線速度を有し、流れ８０は、流れ９０の４倍の流速（ｍＬ／分）を有し、脂質：核酸の質量による比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２０％である。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１７〜１９：１である。他の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１８．５：１である。
図２に関連して上記で論述するように、核酸流８０および脂質流９０の規模、濃度、流速、および線速度は同様に、Ｔチャンバー８６を使用して変化させてもよい。特に、図２に関連して上述する核酸濃度、脂質濃度、およびエタノール濃度はまた、Ｔチャンバー８６を用いた本発明の実施形態にも当てはまる。１つの例示的な実施形態では、核酸の同じ全体的な送達（約３６ｍｇ／分）を維持するために、核酸濃度を、３分の１に（例えば、０．４５から０．３ｍｇ／ｍＬへ）低減させてもよく、核酸流の流速を、５０％（例えば、８０ｍＬ／分から１２０ｍＬ／分へ）増加させてもよい。線速度は同様に、約１０．２メートル／秒へ増加される。核酸流のより大きな希釈のため、出口溶液中の約２５％の有機溶媒の濃度は、補足的な希釈流を使用することなく得られ得る。核酸流の流速を１６０ｍＬ／分（０．５ｍｍの流に関して速度１３．６メートル／秒）へさらに増加させることにより、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２０％へ低減される。この後者のプロセスでは、粒径および一様性の著しい変化を伴わずに、核酸流の速度は、約６．８メートル／秒へ低減されてもよく、脂質流の速度は、約１．７メートル／秒へ低減されてもよい。
図２および図３における、および上記で一般的に記載する様々な核酸、脂質、および希釈流は、直角または正面のいずれかで交差するが、これらの角度は重要ではない。例えば、図３におけるＴチャンバー８６は、Ｙ形状チャンバー８４により置き換えてもよい（図３ｂ）。あるいは、Ｔチャンバーの方向付けは、チャンバー９４で示されるように回転させてもよい（図３ｃ）。図３ｃは、脂質流９０の前方向の流動と交差する核酸流８０を示すが、核酸および脂質流の位置は、図３ｃで入れ替えてもよい。
さらなる他の実施形態では、濃度および流速の適した調節で、核酸および脂質流の数をさらに変化させてもよい。例えば、適切な設備を用いて、２、３、または４つの脂質流を、１、２、３または４つの核酸流と合流させてもよい。
本明細書中に記載する本発明のプロセスは、高い割合の核酸封入を提供する。概して、封入の割合は、７０％を上回る。本発明の幾つかの実施形態では、７５％またはそれ以上の核酸が封入される。他の実施形態では、８０％または８５％の核酸が封入される。さらなる他の実施形態では、９０％またはそれ以上の核酸が封入される。他の実施形態では、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または約１００の核酸が封入される。
本明細書中に記載するような被封入核酸ナノ粒子の形成後に、第１の出口溶液を、室温で約６０分間インキュベートしてもよい。インキュベーション後、溶液を第２の希釈溶媒と混合して、第１の出口溶液を約２倍希釈して、第２の出口溶液を供給してもよい。第２の希釈溶媒は、第３の緩衝溶液または水であり得る。希釈ステップは、図３ａにおけるＴチャンバー８６のようなＴコネクター中で、インキュベートした第１の出口溶液を、第２の希釈溶媒（水）と混合することにより実施され得る。インキュベートした第１の出口溶液および第２の希釈溶媒は、例えば約０．５〜１メートル／秒などの任意の適切な流速または速度で、Ｔコネクターへ供給され得る。希釈ステップ後に、第２の出口溶液中の有機溶媒の濃度は、第１の出口溶液に対して、半分低減される。したがって、幾つかの実施形態では、第２の出口溶液中の有機溶媒（例えば、エタノール）の濃度は、１６．５％未満である。他の実施形態では、第２の出口溶液中の有機溶媒（例えば、エタノール）の濃度は、約１０〜１５％、約１０〜１２．５％、約１２．５％、または約１０％である。第２の出口溶液は、タンジェンシャルフローフィルトレーションにより濃縮されて、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いた１５Ｘダイアフィルトレーションに付して、出発緩衝液およびエタノールを除去してもよく、出発緩衝液およびエタノールは、ＰＢＳで置き換えられる。タンジェンシャルフローフィルトレーション後、以下の実施例でより詳細に記載するように、ＰＢＳ中の濃縮された被封入核酸ナノ粒子のプールを収集して、滅菌ろ過してもよい。上述のさらなるプロセスステップにより生産される配合物中に存在する被封入核酸ナノ粒子は、４℃で６カ月間を上回って安定に保存され得る。
本明細書中に開示する実施形態それぞれによれば、核酸がｓｉＲＮＡであるさらなる実施形態が存在する。例えば、本明細書中に記載する実施形態によれば、核酸流が、緩衝溶液中に１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子の混合物を含み、かつ本明細書中に開示する線速度を有するｓｉＲＮＡ流であるさらなる実施形態が存在する。
６．０ プロセス実施例
６．１ ｓｉＲＮＡ脂質配合物
被封入ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子は、図２〜図３ｂで一般に示され、また上記で一般的に記載されるシステムおよび装置により、エタノール中に溶解した脂質の溶液を、クエン酸緩衝液中に溶解したｓｉＲＮＡと混合することにより形成した。内径０．５、１．０、または２．０ｍｍを有する通路を有する混合チャンバーを使用した。プロセシングチャンバーは、５０ｍｍ〜１０００ｍｍの長さを有していた。希釈チャンバーは、約０．５または１．０または２．０または４．０ｍｍの混合チャンバーの内径に等しいか、またはその少なくとも２倍の内径を有する通路を有していた。脂質溶液は、陽イオン性脂質、ヘルパー脂質（コレステロール）、中性脂質（ＤＳＰＣ）およびステルス脂質を含有していた。
総脂質の濃度は、１６．７ｍｇ／ｍＬまたは２５ｍｇ／ｍＬのいずれかであった。これらの実験に関する総脂質対ｓｉＲＮＡの比は、約１８．３：１であった。ｓｉＲＮＡ溶液の濃度は、ｐＨ５を有するクエン酸ナトリウム：塩化ナトリウム緩衝液中で０．２２５、０．３、０．３３７５、または０．４５ｍｇ／ｍＬであった。ＮａＣｌの濃度は、５０ｍＭ、６６ｍＭ、７５ｍＭ、または１００ｍＭであった。流速および線速度は、以下に記載するように変動させた。
ｓｉＲＮＡ封入実験に関して、使用する陽イオン性脂質およびステルス脂質（即ち、ＰＥＧ脂質）を以下の表に示す。
これらの実験に使用したｓｉＲＮＡは、以下の表に示すような配列および配列番号を有していた。
６．２ プロセス実施例１ ｓｉＲＮＡの封入
６．２．１ エタノール中の脂質混合物の調製
下記は、陽イオン性脂質アミン対ｓｉＲＮＡリン酸（Ｎ：Ｐ）モル比４．５：１で封入されるｓｉＲＮＡの例である。表４に示す量の脂質（陽イオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロールおよび脂質付加されたＰＥＧ）を、エタノール１５０ｍＬ中に溶解する。脂質のモル比は、それぞれ４５：９：４４：２である。混合物を短期間超音波処理した後、５分間穏やかに攪拌して、続いて使用するまで３７℃で維持する。
６．２．２ クエン酸緩衝液中のｓｉＲＮＡ配列番号１の調製
ｓｉＲＮＡ流用の緩衝液は、ｐＨ５の１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび２５ｍＭクエン酸ナトリウムである。まず、クエン酸緩衝液のｐＨがｐＨ５．００であることを確認する。そうでない場合は、加工処理前に、ｐＨを調製する。封入用の水中の十分なｓｉＲＮＡを、−８０℃の保存から解凍させる。ｓｉＲＮＡ配列番号１をクエン酸緩衝溶液へ添加して、溶解したｓｉＲＮＡの濃度を、ＵＶ分光光度計で２６０ｎｍにて、光学密度により測定する。ｓｉＲＮＡの最終濃度を、滅菌ＰＥＴＧボトルにおいてクエン酸緩衝液１５０ｍｌ中で０．４５ｍｇ／ｍｌへ調節して、使用するまで室温で保持する。
６．２．３ 脂質ナノ粒子中のｓｉＲＮＡの封入
ｓｉＲＮＡ封入は、図２に一般的に示すようなシステムを用いて実施する。滅菌シリンジに、等量（２５ｍｌ）のエタノール中の脂質（シリンジ（ａ））、クエン酸緩衝液中のｓｉＲＮＡ（シリンジ（ｂ１）および（ｂ２））、および水単独（シリンジ（ｃ））を充填する。１６．７ｍｇ／ｍＬの脂質を含有するシリンジ（ａ）上のルアーフィッティングから通じるチューブを、内径０．５ｍｍを有する十字接合部の中央入力へ取り付ける。０．４５ｍｇ／ｍｌでｓｉＲＮＡを含有するシリンジ（ｂ１）および（ｂ２）上のルアーフィッティングから通じるチューブを、十字接合部の側面入力へ取り付ける。チューブは、内径１．５５ｍｍを有するフッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）チューブである。シリンジ（ａ）、（ｂ１）および（ｂ２）を、シリンジポンプＡ上に設置する。脂質入力の反対側の十字の中央入力からつながるチューブを、内径１ｍｍを有するＴ接合部へ取り付ける（例えば、図２、Ｔ接合部５４を参照）。水単独を含有するシリンジ（ｃ）上のルアーフィッティングから通じるチューブを、Ｔ接合部へ取り付けて、ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子のインライン希釈を可能にして、シリンジ（ｃ）を、シリンジポンプＢ上に設置する。Ｔ接合部からの出力ラインを、希釈したｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子の収集用の滅菌ＰＥＴＧボトルより上に位置させる。全てのフィッティングがシリンジ上で締まっていることを確認することが重要である。シリンジポンプを、適したシリンジ製造業者（syringe manufacturer）およびサイズおよび１分当たり４０ｍｌの流速に設定する。両方のポンプを同時に始動させて、およそ０．５秒後に材料を収集し始める。被封入ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子およそ９０ｍｌを収集して、それは、２５容量％のエタノール、０．２３ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ、４．２ｍｇ／ｍＬの脂質、および５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する。６０分後、混合インキュベーション期間後に、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを使用して、粒径を決定する。
６．２．４ ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子の希釈
内径１．０ｍｍのＴ接合部を、ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液のさらなる希釈用に設定する。この希釈ステップは、１つのシリンジポンプ上で２つのシリンジを用いて実行する。１つの１４０ｍＬのシリンジは、ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子を含有し、第２の１４０ｍＬのシリンジは、水を含有する。流速は、１分当たり２５ｍｌに設定する。ｓｉＲＮＡ流および水流は、互いに１８０度でＴ接合部に入る。希釈したｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液を、滅菌ＰＥＴＧボトルへ収集する。最終容量は、およそ２８０ｍｌであり、エタノール濃度１２．５％を有する。
６．２．５ タンジェンシャルフローフィルトレーションによるｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子の透析および濃縮
封入の実行におけるあらゆる５０ｍｇのｓｉＲＮＡに関しては、Ｖｉｖａｆｌｏｗ ５０カートリッジを使用する。１００ｍｇのｓｉＲＮＡ封入の実行に関しては、直列に取り付けた２つのＶｉｖａｆｌｏｗ ５０カートリッジを使用する。まず、再生セルロースカートリッジをすすいで、製造業者からの任意の保存溶液を除去しなくてはならない。これは、空のＴＦＦリザーバにＤＩ水５００ｍｌを注ぐことにより行われ、流速１１５ｍｌ／分でぜん動ポンプにより再循環させる。透過物（permeate）は制限されるべきではなく、水５００ｍｌ全体を膜に通して流したら、すすぎプロセスは、完了である。
ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液を、Ｍｉｎｉｍａｔｅ ＴＦＦリザーバへ充填する。全体的な圧力２０〜２５ｐｓｉを維持しながら、混合物を濃縮する。ろ液は、濃縮ステップ全体にわたって、１分当たりおよそ４ｍｌで溶出されるべきである。この速度は、適正な流速が達成されるまで、ピンチ弁で透過物ラインを制限することにより達成される。リザーバ中の液体レベルが、目盛り１５ｍｌになるまで濃縮する。濃縮したｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液を、発熱物質を含まず、ヌクレアーゼを含まない１×ＰＢＳ ２２５ｍｌに対してダイアフィルトレーションする（Diafilter）。流速を８０ｍｌ／分に増加する。ダイアフィルトレーション後、ＴＦＦシステムのホールドアップ容量へ、材料の濃縮を再開する。ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液をリザーバから収集する。さらに２ｍｌの１×ＰＢＳでＴＦＦシステムをすすいで、希釈したｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液を含有するこの洗浄液を収集することが可能であるが、この洗浄液は、濃縮したｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液とは別個に収集されるべきである。分析するまで材料を４℃で保存する。
６．２．６ 滅菌ろ過ステップ
５０℃で１０分間予熱したアルミニウム蓄熱ヒーターに配置されるガラスバイアル中の懸濁液およそ１０ｍｌを加熱することにより、ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子をろ過する。次に、バイアルを取り出して、溶液をシリンジで取り出して、滅菌バイアルへ直接、０．２２μｍのＰＥＳシリンジフィルターに通してろ過する。この最終的な生成物を４℃で保存する。
６．２．７ 封入パーセントの決定（ＳＹＢＲ ＧＯＬＤ）
脂質ナノ粒子へのｓｉＲＮＡ配合の効率を決定するために、ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ蛍光を測定することにより、ｓｉＲＮＡの封入パーセントを決定することができる。ｓｉＲＮＡに結合されると、ｓｙｂｒ ｇｏｌｄは蛍光を発する。ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ蛍光の強度は、ｓｉＲＮＡの量に比例する。
およそ０．９ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡストックの標準溶液をＰＢＳ中に調製する。ｓｉＲＮＡストックの濃度は、ＵＶ測定により検証される。ｓｉＲＮＡストックを、ＰＢＳで８μｇ／ｍＬへ希釈する。段階希釈を行って、４、２、１、０．５および０．２５μｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ溶液を調製する。等量の８μｇ／ｍＬおよび４μｇ／ｍＬの溶液を混合することにより、６μｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡを調製する。
試験試料を調製するために、ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液１０μＬを、ＰＢＳ ９９０μＬで希釈する（これが、この段階で溶液Ａである）。注記：この第１の希釈ステップは、およそ３．６ｍｇ／ｍＬまたはそれ未満の予想ｓｉＲＮＡ濃度を有する配合物に当てはまる。濃度がおよそ３．６ｍｇ／ｍＬよりも高い場合には、希釈はより大きくすべきである。溶液Ａ ４０μＬを、ＰＢＳ １６０μＬで希釈する（これが、この段階で溶液１である）。
配合物中の遊離のｓｉＲＮＡの測定に関して、ＰＢＳ中０．０２％ｓｙｂｒ ｇｏｌｄの溶液を調製する（例えば、ＰＢＳ １５ｍＬ中ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ ３μＬ）（溶液２）。９６ウェルの黒色の透明底プレートにおいて、溶液１ １０μＬを、溶液２ １９０μＬと混合して、試料混合物１を供給する。このミックス中では、ｓｙｂｒ ｇｏｌｄは、封入されていない（即ち、遊離の）ｓｉＲＮＡへのみ結合する。リポソーム中に封入されたｓｉＲＮＡへ接近は見られない。
配合物中の総ｓｉＲＮＡの測定に関して、ＰＢＳ中０．０２％ｓｙｂｒ ｇｏｌｄおよび０．２％トリトン−ｘの溶液を調製する（例えば、ＰＢＳ中０．２％トリトン１５ｍＬ中のｓｙｂｒ ｇｏｌｄ ３μＬ）。９６ウェルの黒色の透明底プレートにおいて、溶液１ １０μＬを、溶液３ １９０μＬと混合して、試料混合物２を供給する。このミックス中では、トリトン−ｘは、リポソームを崩壊して、予め封入されたｓｉＲＮＡを、ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ結合へと露出させる。したがって、ｓｙｂｒ ｇｏｌｄは、封入されていない（即ち、遊離の）ｓｉＲＮＡ、および全ての新たに露出されたｓｉＲＮＡへ結合する。遊離のｓｉＲＮＡ＋新たに露出されたｓｉＲＮＡ＝総ｓｉＲＮＡ。
上述の標準溶液（それぞれ１０μＬ）を、溶液２ １９０μＬと混合して、標準混合物１を供給するか、または溶液３ １９０μＬと混合して、標準混合物２を供給する。
全てのミックスの蛍光を、ソフトウェアＳｏｆｔＭａｘ ｐｒｏ ５．２および下記パラメーターを使用したＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５分光光度計で測定する：
λｅｘ＝４８５ｎｍ λｅｍ＝５３０ｎｍ
リードモード： 蛍光、トップリード
波長： Ｅｘ ４８５ｎｍ、Ｅｍ ５３０ｎｍ、オートカットオフオン ５３０ｎｍ
感度： 読取り６、ＰＭＴ：オート
オートミックス： 前：オフ
オートキャリブレート： オン
アッセイプレートタイプ： ９６ウェルｃｏｓｔａｒｂｌｋ／ｃｌｒｂｔｍ
読み取るべきウェル： プレート全体を読み取る
修正時間： オフ
カラム波長優先： カラム優先
キャリッジ速度： 標準
オートリード： オフ
標準混合物１から得られる蛍光強度値を使用して、遊離のｓｉＲＮＡに関する検量線を作成する。次に、試料１混合物の蛍光強度は、遊離のｓｉＲＮＡに関する検量線により提供される方程式へ代入する。続いて、試料の実測した濃度に、希釈規模を乗じて、脂質ナノ粒子配合物中の遊離のｓｉＲＮＡを得る。
標準混合物２から得られる蛍光強度値を使用して、総ｓｉＲＮＡに関する検量線を作成する。次に、試料２混合物の蛍光強度は、総ｓｉＲＮＡに関する検量線により提供される方程式へ代入する。続いて、試料の実測した濃度に、希釈規模を乗じて、脂質ナノ粒子配合物中の総ｓｉＲＮＡを得る。
被封入ｓｉＲＮＡは、式：［（総ｓｉＲＮＡ−遊離のｓｉＲＮＡ）／（総ｓｉＲＮＡ）］×１００％により算出される。
６．２．８ サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用した封入パーセントの決定
遊離のｓｉＲＮＡのサイズ（５ｎｍ）は、リポソームのサイズ（５０〜２００ｎｍ）と異なるので、それらは、サイズ排除カラムでは異なる時間で溶出する。遊離のｓｉＲＮＡは、リポソーム後に溶出する。ｓｉＲＮＡに関する保持時間は、およそ１７分であるのに対して、リポソームに関する保持時間は、およそ１０分である。溶出したｓｉＲＮＡの検出は、２６０ｎｍで設定した吸収波長を有するＵＶ検出器によって実施する。
およそ０．９ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡストックをＰＢＳ中に調製する。ストックの２００μＬ分取量へ、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００ １０μＬを添加する。ｓｉＲＮＡストックの濃度は、ＵＶ測定により検証される。段階希釈を行って、ｓｉＲＮＡストックの１／２、１／４、１／８、１／１６および１／３２濃度で標準物質を調製する。ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００ １０μＬを、各標準物質２００μＬへ添加する。各標準物質の濃度は、ＵＶ測定により検証される。
ＨＰＬＣバイアル中で、脂質ナノ粒子配合物２５μＬを、１×ＰＢＳ（脱イオン水で１０×ＰＢＳ（ＦＩＳＨＥＲ、ＢＰ３９９）を１×へ希釈）へ添加する。分散液を、均質になるまで穏やかにボルテックスする（分散液１）。別のＨＰＬＣバイアル中では、脂質ナノ粒子配合物２５μＬを、２０％ＴＲＩＴＯＮ−Ｘ １８５μＬへ添加する。分散液を、透明かつ均質になるまで穏やかにボルテックスする（分散液２）。
サイズ排除クロマトグラフィーは、ＥＭＰＯＷＥＲ ＰＲＯソフトウェアを使用したＡＧＩＬＥＮＴ １２００ ＨＰＬＣで実施する。パラメーターは、下記である：
カラム温度： ３０℃
移動相の流速 １ｍｌ／分で３０分間
ＵＶ検出器の波長： ２６０ｎｍ
注入容量： ２０μＬ
注入の数： ２
標準物質および分散液２０μＬを、サイズ排除カラム上へ注入し、７．７に調製したｐＨを有する移動相１×ＰＢＳは、１ｍＬ／分で３０分間流動している。溶出した材料は、吸収波長２６０ｎｍを有するＵＶ検出器により検出される。
ｓｉＲＮＡ標準物質から、およそ１７分のピークは、ｓｉＲＮＡを表す。分散液１から、およそ１０分のピークは、被封入ｓｉＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子を表し、およそ１７分のピークは、封入されていない（即ち、遊離の）ｓｉＲＮＡを表す。
分散液２では、ＴＲＩＴＯＮ−Ｘは、脂質ナノ粒子を崩壊して、予め封入されたｓｉＲＮＡが、１７分ですでに遊離のｓｉＲＮＡと一緒に溶出することが可能となる。およそ１０分のピークが消失し、クロマトグラム中に唯一のピーク、即ちおよそ１７分のピークが残り、封入されていない（即ち、遊離の）ｓｉＲＮＡおよび新たに遊離のｓｉＲＮＡの両方を表す。遊離のｓｉＲＮＡ＋新たに遊離のｓｉＲＮＡ＝総ｓｉＲＮＡ。
ｓｉＲＮＡ標準物質から得られるピーク面積値を使用して、ｓｉＲＮＡ濃度検量線を作成する。分散１におけるおよそ１７分のピークの積算面積を、遊離のｓｉＲＮＡに関する検量線により提供される方程式へ代入して、分散液中の遊離のｓｉＲＮＡの濃度を得る。続いて、試料の実測した濃度に、希釈規模を乗じて、脂質ナノ粒子配合物中の遊離のｓｉＲＮＡを得る。
分散２におけるおよそ１７分のピークの積算面積を、遊離のｓｉＲＮＡに関する検量線により提供される方程式へ代入して、分散液中の総ｓｉＲＮＡの濃度を得る。続いて、試料の実測した濃度に、希釈規模を乗じて、脂質ナノ粒子配合物中の総ｓｉＲＮＡを得る。
被封入ｓｉＲＮＡは、式：［（総ｓｉＲＮＡ−遊離のｓｉＲＮＡ）／（総ｓｉＲＮＡ）］×１００％により算出される。
６．２．９ 粒子分析論
ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子を、Ｍａｌｖｅｒｎ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓからのＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを使用して、サイズおよび多分散性に関して分析する。１ｍｇ／ｍｌを上回る被封入ｓｉＲＮＡ濃度で配合したｓｉＲＮＡに関して、試料５μｌを１×ＰＢＳ １１５μｌで希釈する。小容量の使い捨てマイクロキュベットへ添加する。キュベットをＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳへ挿入する。機械設定に関して、材料はポリスチレンラテックスであると、分散剤は水であると、また細胞はＺＥＮ０４０であると設定する。待ち時間なしで、試料を２５℃で測定する。Ｚ−Ａｖｅ（直径として設定、ナノメートル単位で）および多分散性指数（ＰＤＩ）を記録する。
表５では、上述の手順を使用してｓｉＲＮＡおよび脂質ナノ粒子の組合せに関して得られる結果を示す。封入のパーセンテージは、ＳＥＣ法を使用して決定した。
６．３ プロセス実施例２ 希釈の効果
図２に実質的に示すようなシステムを使用して、濃度０．４５ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ配列番号１、ｐＨ５の１００ｍＬ ＮａＣｌ、および２５ｍＭクエン酸ナトリウムを有する２つの水性核酸流を、反対方向から、内径０．５ｍｍを有する通路を有する十字形状の混合チャンバーへ、それぞれ流速４０ｍＬ／分で導入した。同時に、脂質流を、十字形状の混合チャンバーへ、２つの核酸流に直角の方向から、流速４０ｍＬ／分で導入した。脂質流は、エタノール中４５％陽イオン性脂質Ａ１、４４％コレステロール、９％ＤＳＰＣ、および２％ＰＥＧ−脂質Ｂ１で構成されていた。脂質の総濃度は、１６．７ｍｇ／ｍＬであった。１回の実行で、交差形状の混合チャンバーからの合流した流れを、図２におけるチャンバー５４に類似したＴ形状のチャンバー（内径１．０ｍｍ）を使用して、水を用いた希釈ステップに付した。水を、Ｔ形状チャンバーへ、速度４０ｍＬ／分で導入した。得られた溶液を収集して、被封入核酸ナノ粒子を、サイズおよび一様性に関して分析して、結果を表６のエントリー１に示した。エントリー１から得られる溶液は、２５容量％のエタノール、０．２３ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ、４．２ｍｇ／ｍＬの脂質、および５０ｍＭ ＮａＣｌを含んでいた。同じ濃度、流速、および初期の十字形状の混合チャンバーを用いた別個の実験では、混合チャンバーからの合流した流れを、エントリー１で使用する希釈容量に等しい容量の水で希釈した。これらの結果を表６のエントリー２に示す。収集した溶液の濃度は、エントリー１と同じであった。比較のために、同じプロセス条件下であるが、いかなる希釈ステップも伴わない別の実験を行った。これらの結果を表６のエントリー３に示す。いかなる希釈ステップも伴わない場合、エントリー３の収集した溶液は、３３％エタノール、０．３ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ、５．６ｍｇ／ｍＬの脂質および６６ｍＭのＮａＣｌを含んでいた。エントリー１およびエントリー２に関するＺ−Ａｖｇ、＃−Ａｖｇ、ならびにＰＤＩは、希釈ステップを欠如したエントリー３よりも小さかった。表中のＺ−Ａｖｇ、＃−Ａｖｇ、ならびにＰＤＩは、混合の６０分後に決定した。
表６のエントリー１に関して記載するのと同じプロセスおよび脂質混合物を使用するが、ｓｉＲＮＡ配列番号３を用いて、図４ａに示す一様のサイズの脂質ナノ粒子を生産した。流速４０ｍｇ／ｍＬで、ｓｉＲＮＡ配列番号３の濃度を０．９ｍｇ／ｍＬへ増加させると同時に、十字形状の混合チャンバーを、図３ａのＴ形状の混合チャンバー（内径０．５ｍｍ）で置き換えることで（半分の容量中に同じ総量のｓｉＲＮＡ）、図４ｂに示すあまり一様でないサイズの脂質ナノ粒子を生産した。Ｔ形状の混合チャンバーおよび０．９ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡを使用した類似のプロセスをプロセス実施例４に記載する。
６．４ プロセス実施例３ 流速、速度、および溶液濃度の影響
図３ａに示すようなチャンバーに類似した、かつ内径０．５ｍｍを有するＴ形状の混合チャンバーを使用した一連の実験において、単一の核酸流および単一の脂質流を、様々な流速／速度および濃度で混合した。核酸および脂質流は、プロセス実施例２において上述するのと同じ成分を含んでいた。これらの例では、希釈ステップを使用せず、初期ｓｉＲＮＡ濃度は、表６のエントリー１と同じ最終溶液濃度を得るように調節した。これらの実験におけるエタノール中の脂質の濃度は、１６．７ｍｇ／ｍＬ（１×）または２５ｍｇ／ｍＬ（１．５×）のいずれかであった。結果を以下の表７に示し、Ｚ−Ａｖｇ、＃−Ａｖｇ、およびＰＤＩは、混合の６０分後に決定した。
６．５ プロセス実施例４ 流速および速度の影響
図３ａに示すようなチャンバーに類似し、かつプロセス実施例３で使用するＴ形状の混合チャンバー（内径０．５ｍｍ）を使用した一連の実験において、単一の核酸流および単一の脂質流を、反対方向から、様々な流速／線速度で混合して、続いて図２で一般的に示すように、内径１ｍｍの希釈ｔｅｅ水で希釈した。ｓｉＲＮＡ配列番号４、陽イオン性脂質Ａ１、ＰＥＧ脂質Ｂ１、コレステロール、およびＤＳＰＣは、上述するような量で、プロセス実施例４で使用した。エタノール流中の脂質の総濃度は、１６．７ｍｇ／ｍＬであった。核酸流中のｓｉＲＮＡの濃度は、０．９ｍｇ／ｍＬであった。表８の結果により、線速度を増加させると、粒径およびＰＤＩが減少することが示される。
６．６ プロセス実施例５ Ｔ形状の混合チャンバーの方向付けの影響
表９は、図３ｃに示すチャンバーに類似した代替的な混合チャンバー（内径０．５ｍｍ）を使用した２つの実験からの結果を示す。エントリー１では、ｓｉＲＮＡが分岐から入る、得られた結果を示し、エントリー２では、脂質が分岐から入る、得られた結果を示す。両方の実験に関して、ｓｉＲＮＡおよび脂質は、プロセス実施例２で上述するのと同じであった。ｓｉＲＮＡ流に関する流速は、１２０ｍＬ／分であり、脂質流の流速は、４０ｍＬ／分であった。ｓｉＲＮＡ濃度は、６６ｍＭ ＮａＣｌを含有する緩衝溶液中で０．３ｍｇ／ｍＬであった。脂質の濃度は、１６．７ｍｇ／ｍＬであった。Ｚ−Ａｖｅ、＃−Ａｖｇ、およびＰＤＩは、混合の６０分後に決定した。
６．７ プロセス実施例６ 混合チャンバー形状の影響
３〜６の範囲の流れの総数を有する核酸および脂質流の様々な形状を有する混合チャンバーを使用して、一連の実験を行った。それぞれの場合で、混合チャンバーは、内径１ｍｍのチャンバーを有し、流速は、ｓｉＲＮＡ流に関しては２４０ｍＬ／分、および脂質流に関しては８０ｍＬ／分の複合流量を維持するように調節した。これらの実験におけるｓｉＲＮＡの濃度は、０．３ｍｇ／ｍＬであり、脂質の濃度は、１６．７ｍｇ／ｍＬであった。複合ｓｉＲＮＡ流の線速度は、５．１メートル／秒であった。複合脂質流の線速度は、１．７メートル／秒であった。流れの数が、流れの１つを上回る配置を可能にする場合、表１０は、脂質またはｓｉＲＮＡ流間の角度を示す。例えば、３つの脂質流および３つのｓｉＲＮＡ流の場合、各脂質流は、６０度（即ち、３つの隣接した脂質流）または１２０度（即ち、脂質流は、１２０度で分離されており、介在するｓｉＲＮＡ流も１２０度で分離される）のいずれかによって、次の脂質流と分離される。表１０に概要する実験結果に関して、４５：９：４４：２の比での陽イオン性脂質Ａ４、ＤＳＣＰ、コレステロールおよびＰＥＧ脂質Ｂ１とともに、ｓｉＲＮＡ配列番号５を使用した。表１０に示す結果により、総流速／速度が一定のままである様々な混合形状に関して、実質的に同じ結果が得られることが示される。
６．８ プロセス実施例７ ｍＲＮＡの封入
６．８．１ 材料および試薬
ＴＥＶ−ｈレプチン−ＧＡｏｐｔ−２ｘｈＢＧ−１２０Ａ（配列番号６）
配列の特色：
タバコエッチウイルス（Tobacco Etch Virus）（ＴＥＶ）５’ＵＴＲ：１４〜１５４
最適コザック（Kozak）配列：１５５〜１６３
タンパク質受託番号＃ＮＰ＿０００２２１のヒトレプチンコードアミノ酸１〜１６７、ＧｅｎｅＡｒｔにより最適化された配列コドン：１６４〜６６４
２つの停止コドン：６６５〜６７０
ヒトベータ−グロブリン３’ＵＴＲの２つのコピー：６８９〜９５４
１２０個のヌクレオチドポリＡテール：９６１〜１０８０
６．８．２ エタノール中の脂質混合物の調製
下記は、陽イオン性脂質アミン対ｍＲＮＡリン酸（Ｎ：Ｐ）モル比４：１で封入されるｍＲＮＡの例である。脂質（陽イオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロールおよび脂質付加されたＰＥＧ）をエタノール中に溶解する。脂質のモル比は、それぞれ４０：１０：４８：２である。例えば、表１２では、エタノール中の容量６３ｍｌの脂質に関する全ての構成成分の量および最終濃度が見られる。容量６３ｍｌは、確実に標的容量が、シリンジへ充填するのに利用可能であるのに必要とされる容量の１．０５倍を表す。混合物を秤量して、滅菌ポリエチレンテレフタレートグリコール修飾（ＰＥＴＧ）の１２５ｍｌのボトルに入れて、エタノールを添加する。混合物を短期間超音波処理した後、５分間穏やかに攪拌して、続いて使用するまで３７℃で維持する。
６．８．３ クエン酸緩衝液中のｍＲＮＡの調製
まず、クエン酸緩衝液のｐＨがｐＨ６．００であることを確認する。そうでない場合は、加工処理前に、ｐＨを調整する。封入用の水中の十分なｍＲＮＡを、−８０℃の保存から解凍させて、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５遠心濃縮器を用いて、水からクエン酸緩衝液ｐＨ６．０へ交換する。ｍＲＮＡ １０〜１２ｍｇを各濃縮器へ充填することができ、それを４，０００ｒｐｍで４℃にて５分間遠心分離する。容量は、クエン酸緩衝液ｐＨ６．０の添加により増加させる。所望の緩衝液条件を達成するには、クエン酸緩衝液ｐＨ６．０による１０倍以上の容量の交換を推奨する。ｍＲＮＡの濃度を、ＵＶ分光光度計で２６０ｎｍにて、光学密度により測定する。ｍＲＮＡの最終濃度を、滅菌した２５０ｍｌのＰＥＴＧボトルにおいてクエン酸緩衝液１２６ｍｌ中で０．２５ｍｇ／ｍｌへ調節して、使用するまで室温で保持する。容量１２６ｍｌは、確実に標的容量が、シリンジへ充填するのに利用可能であるのに必要とされる容量の１．０５倍を表す。
６．８．４ 脂質ナノ粒子中のｍＲＮＡの封入
ｍＲＮＡ封入は、図２に一般的に示すようなシステムを用いて実施する。滅菌した６０ｍｌシリンジに、等量（６０ｍｌ）のエタノール中の脂質（シリンジ（ａ））、クエン酸緩衝液中のｍＲＮＡ（シリンジ（ｂ１）および（ｂ２））、およびクエン酸緩衝液単独（シリンジ（ｃ））を充填する。脂質を含有するシリンジ（ａ）上のルアーフィッティングから通じるチューブを、内径０．５ｍｍを有する十字接合部の中央入力へ取り付ける。０．２５ｍｇ／ｍｌでｍＲＮＡを含有するシリンジ（ｂ１）および（ｂ２）上のルアーフィッティングから通じるチューブを、十字接合部の側面入力へ取り付ける。チューブは、内径０．８ｍｍを有するＰＴＦＥチューブである。シリンジ（ａ）、（ｂ１）および（ｂ２）を、シリンジポンプＡ上に設置する。脂質入力の反対側の十字の中央入力からつながるチューブを、Ｔ接合部へ取り付ける（例えば、図２、Ｔ接合部５４を参照）。クエン酸緩衝液単独を含有するシリンジ（ｃ）上のルアーフィッティングから通じるチューブを、Ｔ接合部へ取り付けて、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子のインライン希釈を可能にして、シリンジ（ｃ）を、シリンジポンプＢ上に設置する。Ｔ接合部からの出力ラインを、希釈したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の収集用の滅菌した５００ｍｌのＰＥＴＧボトルより上に位置させる。全てのフィッティングがシリンジ上で締まっていることを確認することが重要である。シリンジポンプを、適したシリンジ製造業者およびサイズ（ＢＤ、Ｐｌａｓｔｉｐａｋ、６０ｍｌ）および１分当たり最大１６ｍｌの流速に設定した。両方のポンプを同時に始動させて、およそ０．５秒後に材料を収集し始める。被封入ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子およそ２２０〜２３０ｍｌを収集する。
６．８．５ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の希釈
ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液１３５ｍｌを吸引するのに１４０ｍｌのシリンジを使用する。残りの８５〜９５ｍｌを第２の１４０ｍｌのシリンジへ移す。同容量のクエン酸緩衝液を用いて、１４０ｍｌのシリンジを調製する。別のＴ接合部を、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液の別の希釈用に設定する。この希釈ステップは、唯一のシリンジポンプ上で両方のシリンジを用いて実行する。容量１３５ｍｌを有する１４０ｍｌのシリンジ（一方は、脂質ナノ粒子を含有し、他方は、クエン酸緩衝液を含有する）をまず実行して、より小さな容量を有する１４０ｍｌのシリンジは、２番目に実行する。全てのフィッティングがシリンジ上で締まっていることを確認することが重要である。最初の実行に関して、正確なサイズおよび製造業者（１４０ｍｌ、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ−Ｍｏｎｏｊｅｃｔ）に合わせて、シリンジポンプに関する設定を変化させる。流速は、１分当たり２５ｍｌに設定する。希釈したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液を、滅菌した５００ｍｌのＰＥＴＧボトルへ収集する。最終容量は、およそ４４０〜４６０ｍｌである。
６．８．６ タンジェンシャルフローフィルトレーションによるｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の透析および濃縮
封入の実行におけるあらゆる１５ｍｇのｍＲＮＡに関しては、Ｖｉｖａｆｌｏｗ ５０カートリッジを使用する。３０ｍｇのｍＲＮＡ封入の実行に関しては、直列に取り付けた２つのＶｉｖａｆｌｏｗ ５０カートリッジを使用する。まず、再生セルロースカートリッジを、発熱物質を含まないようにしなくてはならない。この手順は、封入の前日に始めるべきである。Ｍｉｎｉｍａｔｅ ＴＦＦシステムを使用して、２つのＶｉｖａｆｌｏｗ ５０カートリッジを直列で設定して、チューブを取り付ける。発熱物質を含まず、ヌクレアーゼを含まない水５００ｍｌをリザーバへ充填して、それを圧力２０ｐｓｉでカートリッジに通して流す。０．１ＭのＮａＯＨ／１．０ＭのＮａＣｌ １００ｍｌをリザーバへ充填して、５０ｍｌをカートリッジに通して流す。残りの５０ｍｌをカートリッジで一晩静置させる。翌朝、残りの５０ｍｌを２０ｐｓｉでカートリッジに通して流す。発熱物質をより含まず、ヌクレアーゼを含まない水をリザーバへ充填して、５０ｍｌをカートリッジに通して流す。この水洗浄を２回以上繰り返す。最終的なすすぎ水の分取量を試験して、エンドトキシンが検出可能な量以下であることを確認する。
ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液を、Ｍｉｎｉｍａｔｅ ＴＦＦリザーバへ充填する。全体的な圧力２０〜２５ｐｓｉを維持しながら、混合物を濃縮する。ろ液は、１分当たりおよそ４ｍｌで溶出させて、始動させるべきであるが、減速する。リザーバ中の液体レベルが、目盛り４０ｍｌになるまで濃縮する。濃縮したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液を、発熱物質を含まず、ヌクレアーゼを含まない１×ＰＢＳ ３００ｍｌに対してダイアフィルトレーションする。圧力２０〜１５ｐｓｉを保持する。ダイアフィルトレーション後、リザーバ上の目盛り１０ｍｌ線のすぐ下まで、材料の濃縮を再開する。ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液をリザーバから収集する。さらに５ｍｌの１×ＰＢＳでＴＦＦシステムをすすいで、希釈したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液を含有するこの洗浄液を収集することが可能であるが、この洗浄液は、濃縮したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液とは別個に収集されるべきである。分析するまで材料を４℃で保存する。
６．８．７ ３８４ウェルプレートアッセイ方式で決定した封入パーセント
脂質ナノ粒子へのｍＲＮＡ配合の効率を決定するために、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＱｕａｎｔ−ＩＴ ｒｉｂｏｇｒｅｅｎＲＮＡアッセイキットを使用して、ｍＲＮＡの封入パーセントを測定する。ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液は、ヌクレアーゼを含まないＴＥ緩衝液中でアッセイして、脂質ナノ粒子の外側のｍＲＮＡの濃度を決定し、またＴＥ緩衝液＋０．７５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００界面活性剤中でもアッセイして、脂質ナノ粒子を分解させて、脂質ナノ粒子懸濁液全体中のｍＲＮＡの濃度を決定する。２つの濃度の関係を使用して、封入パーセントを算出する。
ＴＥ緩衝液およびＴＥ緩衝液＋０．７５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００界面活性剤の両方中で、キット中に提供される１００μｇ／ｍｌのストック標準物質ＲＮＡからＲＮＡの１０００ｎｇ／ｍｌ溶液を調製する。表１３に従って、ＴＥ緩衝液およびＴＥ緩衝液＋０．７５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００界面活性剤の両方において、このストックを使用して、標準曲線を作成する。
４００〜２，０００倍の範囲の希釈を使用して、ＴＥ緩衝液およびＴＥ緩衝液＋０．７５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００界面活性剤の両方中に、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子試料を慎重に調製する。２ステップの希釈に関して、ＴＥまたはＴＥ＋Ｔｒｉｔｏｎではなく、確実にＰＢＳ中で第１のステップを実施する。各緩衝液条件において各試料に関して２組の希釈を行い、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子試料１つにつき、緩衝液条件１つ当たり総計６個のウェルに関して、三重反復で各組の希釈をアッセイする。標準曲線用試料を作製し、９６ディープウェルプレートにおいてｍＲＮＡ脂質ナノ粒子試料を希釈して、それらを調製する際に試料の完全な混合を確実にする。より大きな容量の標準曲線用試料を準備して、後の使用のために、密封した９６ディープウェルプレート中で、４℃で最大３日間保存することができる。
ウェル１つ当たり標準物質および試料４０μｌを、黒色３８４ウェルアッセイプレート（未処理のＣｏｓｔａｒ、＃３５７３）へ添加する。２５０μｌの自動多チャネルピペットを使用して、標準曲線用試料８５μｌを吸引して、４０μｌをアッセイプレートの２つのウェルへ分取する。各希釈したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子試料１２５μｌを吸引して、４０μｌを、アッセイプレートの３つのウェルへ分取する。
ＴＥ緩衝液中で、キット中のｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を２４０倍希釈して、アッセイプレートの各ウェルへ６０μｌを添加する。標準曲線用試料の各ウェル中に６０μｌを分取して、その結果、ＴＥおよびＴＥ＋界面活性剤標準曲線試料との間でチップを交換するようにしながら、１２５μｌの自動多チャネルピペットを使用して、希釈したｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬１２５μｌを吸引する。各希釈したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子試料間でチップを交換する。
上下にピペットを動かすこと（pipetting）により、ウェル中で試料を混合する。例えば、Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸ ｒｏｂｏｔ上に黒色３８４ウェルアッセイプレートを配置させて、３０μｌのＸＬチップを使用することにより、これを行うことができる。混合後、４８０ｎｍでの励起および５２０ｎｍでの発光で、蛍光マイクロプレートーリーダーを使用して蛍光を測定する。
試薬ブランクの蛍光値を、各ＲＮＡ試料に関する蛍光値から差し引いて、ＴＥおよびＴＥ＋Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００条件に関して、蛍光対ＲＮＡ濃度の標準曲線を作成する。試薬ブランクの蛍光値を、試料それぞれの蛍光値から差し引いて、続いて適切な標準曲線から試料それぞれのＲＮＡ濃度を決定する。ＴＥ＋Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中の試料と、ＴＥ緩衝液単独中の試料との間の濃度の差を、ＴＥ＋Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００界面活性剤中の試料の濃度で除算することにより、試料の封入パーセントを決定する。
６．８．８ 粒子分析論
ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子を、Ｍａｌｖｅｒｎ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓからのＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを使用して、サイズおよび多分散性に関して分析する。１ｍｇ／ｍｌを上回る被封入ｍＲＮＡ濃度で配合したｍＲＮＡに関して、試料５μｌを１×ＰＢＳ １１５μｌで希釈する。小容量の使い捨てマイクロキュベット（Ｂｒａｎｄ、＃７５９２００）へ添加する。キュベットをＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳへ挿入する。機械設定に関して、材料はポリスチレンラテックスであると、分散剤は水であると、また細胞はＺＥＮ０４０であると設定する。待ち時間なしで、試料を２５℃で測定する。Ｚ−Ａｖｅ（直径として設定、ナノメートル単位で）および多分散性指数（ＰＤＩ）を記録する。
本発明の実施例および実施形態の上記説明は、事実上単に例示であり、したがって、そ
れらの変更は、本発明の趣旨および範囲からの逸脱とみなされるべきではない。

本発明は下記の態様も含む。
＜１＞
脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入して、被封入核酸ナノ粒子を提供する方法であって
、
１つまたは複数の核酸流を供給するステップであって、前記１つまたは複数の核酸流が
、第１の水溶液中に核酸の混合物を含み、かつ約１．５メートル／秒よりも大きいか、ま
たはそれに等しい複合線速度を有する、ステップと、
１つまたは複数の脂質流を供給するステップであって、前記１つまたは複数の脂質流が
、有機溶媒中に１つまたは複数の脂質の混合物を含み、かつ約１．５メートル／秒よりも
大きいか、またはそれに等しい複合線速度を有する、ステップと、
第１の交差ポイントで前記１つまたは複数の脂質流を前記１つまたは複数の核酸流と合
流させて、第１の合流した流れを供給するステップと、
第１の方向で前記第１の合流した流れを流動させ、それらの構成成分を混合して、前記
被封入核酸ナノ粒子を含む第１の出口溶液を供給するステップと
を含み、前記第１の水溶液および前記有機溶媒が混和性であり、前記第１の水溶液または
前記有機溶媒のうちの片方が、緩衝液を含有し、前記第１の出口溶液中の前記有機溶媒の
濃度が、３３％未満である、方法。
＜２＞
前記第１の水溶液が、アルカリ金属塩の水溶液を含む第１の緩衝溶液であり、
前記有機溶媒が、アルコール溶媒を含む、＜１＞に記載の方法。
＜３＞
前記第１の合流した流れを、第２の緩衝溶液および水から選択される希釈溶媒で希釈し
て、第１の出口流を供給するステップ
をさらに含む、＜１＞または＜２＞に記載の方法。
＜４＞
前記アルカリ金属塩が、ＮａＣｌおよびクエン酸ナトリウムの１つまたは複数から選択
され、
前記有機溶媒がエタノールを含む、＜３＞に記載の方法。
＜５＞
前記第１の出口溶液中の前記有機溶媒の濃度が、約２０〜約２５％である、＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の方法。
＜６＞
前記１つまたは複数の脂質流の複合線速度が、約１．５〜約４．５メートル／秒であり
、
前記１つまたは複数の核酸流の複合線速度が、約３〜約１４メートル／秒である、
＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の方法。
＜７＞
前記１つまたは複数の脂質流の複合線速度が、約３〜約４メートル／秒であり、
前記１つまたは複数の核酸流の複合線速度が、約９〜約１４メートル／秒である、
＜１＞または＜３＞〜＜６＞のいずれかに記載の方法。
＜８＞
前記第１の合流した流れを、希釈溶媒で希釈するステップが、
希釈流を供給するステップであって、前記希釈流が、第２の緩衝溶液および水から選択
される水性溶媒を含む、ステップと、
前記第１の合流した流れを前記希釈流と合流させて、前記第１の出口流を供給するステ
ップと
を含み、前記１つまたは複数の脂質流の複合線速度が、約３〜約４メートル／秒であり、
前記１つまたは複数の核酸流の複合線速度が、約６〜約８メートル／秒である、
＜２＞〜＜６＞のいずれかに記載の方法。
＜９＞
前記第１の出口溶液をインキュベートするステップをさらに含む、＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の方法。
＜１０＞
前記インキュベートした第１の出口溶液を、第３の緩衝溶液および水から選択される第
２の希釈溶媒で希釈して、第２の出口溶液を供給するステップと、
前記第２の出口溶液を濃縮するステップおよび透析するステップ
をさらに含む、＜９＞に記載の方法。
＜１１＞
前記濃縮するステップが、タンジェンシャルフローフィルトレーションにより濃縮する
ステップを含む、＜１０＞に記載の方法。
＜１２＞
濃縮した透析溶液を滅菌ろ過するステップをさらに含む、＜１０＞または＜１１＞に記載の方法。
＜１３＞
前記核酸がｓｉＲＮＡである、＜１＞〜＜１２＞のいずれかに記載の方法。
＜１４＞
前記核酸がｍＲＮＡである、＜１＞〜＜１２＞のいずれかに記載の方法。
＜１５＞
前記脂質ナノ粒子ホストが、表２から選択される脂質の１つまたは複数を含む、＜１＞〜＜１４＞のいずれかに記載の方法。
＜１６＞
前記被封入核酸ナノ粒子が、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍの平均粒径直径（average partic
le size diameter）を有する、＜１＞〜＜１５＞のいずれかに記載の方法。
＜１７＞
前記被封入核酸ナノ粒子が、約４０ｎｍ〜約７０ｎｍの平均粒径直径、および動的光散
乱により決定される場合の約０．１未満の多分散指数を有する、＜１＞〜＜１６＞のいずれかに記載の方法。
＜１８＞
脂質：核酸の質量による比が、約１５〜２０：１である、＜１＞〜＜１７＞のいずれかに記載の方法。
＜１９＞
前記１つまたは複数の核酸流中の核酸の濃度が、約０．１〜約１．５ｍｇ／ｍＬであり
、前記１つまたは複数の脂質流中の脂質の濃度が、約１０〜約２５ｍｇ／ｍＬである、＜１＞〜＜１８＞のいずれかに記載の方法。
＜２０＞
前記第２の出口溶液中のエタノールの濃度が、約１０〜１５％である、＜９＞〜＜１９＞のいずれかに記載の方法。
＜２１＞
２つの核酸流および１つの脂質流を供給するステップと、
十字コネクターで前記２つの核酸流を前記１つの脂質流と合流させて、前記第１の合流
した流れを供給するステップと
を含む、＜１＞〜＜２０＞のいずれかに記載の方法。
＜２２＞
前記２つの核酸流が、互いに対して約１８０°で反対方向から前記十字コネクターに入
り、前記脂質流が、前記２つの核酸流に対して約９０°で前記十字コネクターに入る、＜２１＞に記載の方法。
＜２３＞
前記第１の方向での前記第１の合流した流れを流動させるステップが、前記脂質流と実
質的に同じ方向で、かつ前記２つの核酸流に対して約９０°で前記十字コネクターから外
へ前記第１の合流した流れを流動させるステップを含む、＜２２＞に記載の方法。
＜２４＞
前記第１の合流した流れを前記希釈流と合流させるステップが、前記第１の合流した流
れを、前記第１の合流した流れの方向に対して約９０°から前記希釈流と交差させるステ
ップを含む、＜８＞〜＜２３＞のいずれかに記載の方法。
＜２５＞
前記核酸流由来の核酸の約９０％超が、前記第１の出口溶液中に封入される、＜１＞〜＜２４＞のいずれかに記載の方法。
＜２６＞
薬学的に許容される担体、ならびに
脂質ナノ粒子ホストおよび核酸を含む被封入核酸ナノ粒子であって、前記核酸が、前記
脂質ナノ粒子ホスト中に封入されている、被封入核酸ナノ粒子
を含む被封入核酸ナノ粒子組成物であって、前記被封入核酸ナノ粒子が、約４０ｎｍ〜約
７０ｎｍの平均粒径、および動的光散乱により決定される場合の約０．１未満の多分散指
数を有する、被封入核酸ナノ粒子組成物。
＜２７＞
前記脂質ナノ粒子ホストが、分解性陽イオン性脂質、脂質付加されたポリエチレングリコール、コレステロールおよび１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを含む、＜２６＞に記載の組成物。
１ 装置
１０ 第１の核酸流
１２ 通路
１４ 交差ポイント
１６ 十字
２０ 第２の核酸流
２２ 通路
３０ 脂質流
３２ 通路
４０ 複合流
４２ 通路
５０ 希釈流
５０ａ 希釈流
５０ｂ 希釈流
５２ 通路
５２ａ 通路
５２ｂ 通路
５４ Ｔチャンバー
５４ａ 十字
６０ 第１の出口溶液
７０ プロセスチャンバー
７２ プロセスチャンバーの本体
８０ 核酸流
８２ 流入通路
８４ Ｙ形状チャンバー
８６ チャンバー
９０ 脂質流
９２ 流入通路
９４ チャンバー

Claims (17)

  1. 脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入して、被封入核酸ナノ粒子を提供する方法であって
    、
    ２つの核酸流を供給するステップであって、前記２つの核酸流のそれぞれが、第１の水溶液中に核酸の混合物を含み、かつ約３〜約１４メートル／秒の複合線速度を共に有する、ステップと、
    １つの脂質流を供給するステップであって、前記脂質流が、有機溶媒中に１つまたは複数の脂質の混合物を含み、かつ約１．５〜約４．５メートル／秒の複合線速度を有する、ステップと、
    十字コネクターとして構成される第１の交差ポイントで前記脂質流を前記２つの核酸流と合流させて、第１の合流した流れを供給するステップであって、前記２つの核酸流が、互いに対して約１８０°で反対方向から前記十字コネクターに入り、前記脂質流が、前記２つの核酸流に対して約９０°で前記十字コネクターに入る、ステップと、
    第１の方向で前記第１の合流した流れを流動させるステップであって、前記脂質流と実質的に同じ方向で、かつ前記２つの核酸流に対して約９０°で前記十字コネクターから外へ前記第１の合流した流れを流動させる、ステップと、
    それらの構成成分を混合して、前記被封入核酸ナノ粒子を含む第１の出口溶液を供給するステップと
    を含み、前記第１の水溶液および前記有機溶媒が混和性であり、前記第１の水溶液または前記有機溶媒のうちの片方が、緩衝液を含有し、前記第１の出口溶液中の前記有機溶媒の濃度が、凝集を最低限にする濃度である、方法。
  2. 前記第１の水溶液が、アルカリ金属塩の水溶液を含む第１の緩衝溶液であり、
    前記有機溶媒が、アルコール溶媒を含む、
    請求項１に記載の方法。
  3. 前記第１の合流した流れを、第２の緩衝溶液および水から選択される希釈溶媒で希釈し
    て、第１の出口流を供給するステップ
    をさらに含み、
    前記第２の緩衝溶液が少なくとも１つのアルカリ金属塩を含み、
    前記アルカリ金属塩が、ＮａＣｌおよびクエン酸ナトリウムの１つまたは複数から選択
    され、
    前記第１の出口溶液中の前記有機溶媒の濃度が、約３３％未満である、
    請求項１に記載の方法。
  4. 前記１つの脂質流の複合線速度が、約３〜約４メートル／秒であり、
    前記２つの核酸流の複合線速度が、約９〜約１４メートル／秒である、
    請求項１に記載の方法。
  5. 前記第１の合流した流れを、希釈溶媒で希釈するステップが、
    希釈流を供給するステップであって、前記希釈流が、第２の緩衝溶液および水から選択
    される水性溶媒を含む、ステップと、
    前記第１の合流した流れを前記希釈流と合流させて、前記第１の出口流を供給するステ
    ップと
    を含み、前記１つの脂質流の複合線速度が、約３〜約４メートル／秒であり
    、前記２つの核酸流の複合線速度が、約６〜約８メートル／秒である、請求項３に記載の方法。
  6. 前記第１の出口溶液をインキュベートするステップと、
    前記インキュベートした第１の出口溶液を、第３の緩衝溶液および水から選択される第
    ２の希釈溶媒で希釈して、第２の出口溶液を供給するステップと、
    前記第２の出口溶液を濃縮および透析することにより、濃縮した透析溶液を提供するステップと
    をさらに含む、
    請求項１に記載の方法。
  7. 前記濃縮するステップが、タンジェンシャルフローフィルトレーションにより濃縮する
    ステップを含む、請求項６に記載の方法。
  8. 濃縮した透析溶液を滅菌ろ過するステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記核酸がｓｉＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
  10. 前記核酸がｍＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
  11. 前記脂質ナノ粒子ホストが、
    ((5-((ジメチルアミノ)メチル)-1,3-フェニレン)ビス(オキシ))ビス(オクタン-8,1-ジ
    イル)ビス(デカノエート)；
    (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((4-(((3-(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ヘキ
    サデカノイル)オキシ)プロパン-1,3-ジイル ビス(オクタデカ-9,12-ジエノエート)；
    (9Z,12Z)-3-((4,4-ビス(オクチルオキシ)ブタノイル)オキシ)-2-((((3-(ジエチルアミ
    ノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)メチル)プロピル オクタデカ-9,12-ジエノエート；
    (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-((5-((ジメチルアミノ)メチル)-1,3-フェニレン)ビス(オキシ))ビ
    ス(ブタン-4,1-ジイル) ビス(オクタデカ-9,12-ジエノエート)；
    PEG-ジミリスチルグリセリン；および
    2,3-ビス(テトラデシルオキシ)プロピル (158-ヒドロキシ-3,6,9,12,15,18,21,24,27,3
    0,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78,81,84,87,90,93,96,99,102,105,1
    08,111,114,117,120,123,126,129,132,135,138,141,144,147,150,153,156-ドペンタコン
    タオキサオクタペンタコンタヘクチル)カルバメート
    から選択される脂質の１つまたは複数を含む、請求項１に記載の方法。
  12. 前記被封入核酸ナノ粒子が、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍの平均粒径直径（average partic
    le size diameter）を有する、請求項１に記載の方法。
  13. 前記被封入核酸ナノ粒子が、約４０ｎｍ〜約７０ｎｍの平均粒径直径、および動的光散
    乱により決定される場合の約０．１未満の多分散指数を有する、請求項１に記載の方法。
  14. 脂質：核酸の質量による比が、約１５〜２０：１であり、
    前記２つの核酸流中の核酸の濃度が、約０．１〜約１．５ｍｇ／ｍＬであり、
    前記１つの脂質流中の脂質の濃度が、約１０〜約２５ｍｇ／ｍＬであり、
    前記第２の出口溶液中のエタノールの濃度が、約１０〜１５％である、請求項１に記載の方法。
  15. 前記第１の合流した流れを前記希釈流と合流させるステップが、前記第１の合流した流
    れを、前記第１の合流した流れの方向に対して約９０°から前記希釈流と交差させるステ
    ップを含む、請求項５に記載の方法。
  16. 前記核酸流由来の核酸の約９０％超が、前記第１の出口溶液中に封入される、請求項１に記載の方法。
  17. 凝集を最低限にする量の前記第１の出口溶液中の前記有機溶媒の濃度が、約３３％未満である、請求項１に記載の方法。
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Families Citing this family (165)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
EP2971165A4 (en) 2013-03-15 2016-11-23 Moderna Therapeutics Inc DISSOLUTION OF DNA FRAGMENTS IN MRNA MANUFACTURING METHODS
WO2014152031A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Ribonucleic acid purification
EP2983804A4 (en) 2013-03-15 2017-03-01 Moderna Therapeutics, Inc. Ion exchange purification of mrna
RS62529B1 (sr) 2013-07-11 2021-11-30 Modernatx Inc Kompozicije koje sadrže sintetičke polinukleotide koji kodiraju proteine povezane sa crispr i sintetičke sgrnk i postupci upotrebe
US10385088B2 (en) 2013-10-02 2019-08-20 Modernatx, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
CA3188691A1 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Novartis Ag 3'end caps for rnai agents for use in rna interference
EP3052627B1 (en) 2013-10-04 2018-08-22 Novartis AG Novel formats for organic compounds for use in rna interference
WO2015050871A2 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Novartis Ag Organic compounds to treat hepatitis b virus
WO2015196128A2 (en) 2014-06-19 2015-12-23 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
PT3766916T (pt) 2014-06-25 2022-11-28 Acuitas Therapeutics Inc Novos lípidos e formulações de nanopartículas lipídicas para distribuição de ácidos nucleicos
JP2017522028A (ja) 2014-07-16 2017-08-10 モデルナティエックス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａＴＸ，Ｉｎｃ． 環状ポリヌクレオチド
EP3283059B1 (en) 2015-04-13 2024-01-03 CureVac Manufacturing GmbH Method for producing rna compositions
CN107922364B (zh) 2015-06-29 2021-12-31 爱康泰生治疗公司 用于递送核酸的脂质和脂质纳米颗粒制剂
PL3350333T3 (pl) 2015-09-17 2022-03-07 Modernatx, Inc. Polinukleotydy zawierające region stabilizujący ogon
US11434486B2 (en) 2015-09-17 2022-09-06 Modernatx, Inc. Polynucleotides containing a morpholino linker
PT3368507T (pt) 2015-10-28 2023-02-07 Acuitas Therapeutics Inc Novos lípidos e formulações de nanopartículas lipídicas para distribuição de ácidos nucleicos
US20200315967A1 (en) * 2016-06-24 2020-10-08 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles
CN118108847A (zh) 2016-08-07 2024-05-31 诺华股份有限公司 mRNA介导的免疫方法
WO2018041921A1 (en) * 2016-08-31 2018-03-08 Curevac Ag Mixing device for the production of a liquid nucleic acid composition
EP3532103B1 (en) * 2016-10-26 2025-12-03 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations
US12491261B2 (en) 2016-10-26 2025-12-09 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations
WO2018112456A1 (en) * 2016-12-16 2018-06-21 Delphi Scientific, Llc Layered particles and processes thereof
US11357856B2 (en) 2017-04-13 2022-06-14 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for delivery of active agents
US11471420B2 (en) 2017-04-21 2022-10-18 Coastar Therapeutics Inc. Membrane lipid coated nanoparticles and method of use
US11413252B2 (en) 2017-04-21 2022-08-16 Coastar Therapeutics Inc. Membrane lipid coated viral nanoparticles and method of use
JP7297676B2 (ja) 2017-04-28 2023-06-26 アクイタス セラピューティクス インコーポレイテッド 新規なカルボニル脂質、および核酸を送達するための脂質ナノ粒子製剤
ES2996886T3 (en) 2017-06-27 2025-02-13 Regeneron Pharma Rodents comprising a humanized asgr1 locus
JP2020530990A (ja) 2017-07-31 2020-11-05 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ｉｎ ｖｉｖｏでの外因性ドナー核酸とのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性組換えの評価
SG11201912236YA (en) 2017-07-31 2020-01-30 Regeneron Pharma Crispr reporter non-human animals and uses thereof
KR102712142B1 (ko) 2017-07-31 2024-10-07 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 Cas-형질전환 마우스 배아 줄기 세포 및 마우스 및 이것의 용도
WO2019036008A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICULAR FORMULATIONS
US11542225B2 (en) 2017-08-17 2023-01-03 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
US11524932B2 (en) 2017-08-17 2022-12-13 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
WO2019036000A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS
SG11202002565YA (en) 2017-09-29 2020-04-29 Intellia Therapeutics Inc Compositions and methods for ttr gene editing and treating attr amyloidosis
CN111630177A (zh) 2017-09-29 2020-09-04 英特利亚治疗股份有限公司 使用脂质纳米粒子的体外mrna递送方法
KR20250093420A (ko) 2017-09-29 2025-06-24 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. 게놈 편집을 위한 폴리뉴클레오티드, 조성물 및 방법
EP3585162B1 (en) 2017-09-29 2023-08-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rodents comprising a humanized ttr locus and methods of use
HUE066630T2 (hu) 2017-09-29 2024-08-28 Intellia Therapeutics Inc Készítmények
IL274740B2 (en) 2017-11-30 2024-06-01 Regeneron Pharma Non-human animals comprising a humanized trkb locus
KR102647714B1 (ko) 2018-03-19 2024-03-18 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 CRISPR/Cas 시스템을 사용한 동물에서의 전사 조절
US12357580B2 (en) 2018-06-19 2025-07-15 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Lipid nanoparticle compositions for delivery of mRNA and long nucleic acids
AU2019308231B2 (en) * 2018-07-16 2022-12-22 The Scripps Research Institute Opioid haptens, conjugates, vaccines, and methods of generating antibodies
WO2020028327A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for hydroxyacid oxidase 1 ( hao1) gene editing for treating primary hyperoxaluria type 1 (ph1)
EP3843709A1 (en) 2018-08-29 2021-07-07 Translate Bio, Inc. Improved process of preparing mrna-loaded lipid nanoparticles
JP2021535226A (ja) * 2018-09-04 2021-12-16 ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム 核酸を臓器特異的送達するための組成物および方法
GB2617430B (en) 2018-09-04 2023-12-27 Univ Texas Compositions and methods for organ specific delivery of nucleic acids
CA3113449A1 (en) 2018-09-21 2020-03-26 Acuitas Therapeutics, Inc. Systems and methods for manufacturing lipid nanoparticles and liposomes
MX2021003457A (es) 2018-09-28 2021-07-16 Intellia Therapeutics Inc Composiciones y métodos para la edición génica de lactato deshidrogenasa (ldha).
IL281948B2 (en) 2018-10-02 2025-05-01 Intellia Therapeutics Inc Ionizable amine lipids
JP7578590B2 (ja) 2018-10-18 2024-11-06 インテリア セラピューティクス，インコーポレーテッド 第ｉｘ因子を発現するための組成物及び方法
KR20210102883A (ko) 2018-10-18 2021-08-20 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. 알부민 좌위로부터 트랜스진을 발현하기 위한 조성물 및 방법
EP4667576A2 (en) 2018-10-18 2025-12-24 Intellia Therapeutics, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
EP3867378A1 (en) 2018-10-18 2021-08-25 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating alpha-1 antitrypsin deficiencey
MX2021006150A (es) * 2018-12-05 2021-11-12 Intellia Therapeutics Inc Lípidos con amina modificados.
EP3732291A1 (en) 2018-12-20 2020-11-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated repeat expansion
PT3908568T (pt) 2019-01-11 2024-09-30 Acuitas Therapeutics Inc Lípidos para a administração de agentes ativos por nanopartículas lipídicas
EP3942050A4 (en) 2019-03-19 2023-02-22 Arcturus Therapeutics, Inc. PROCEDURE FOR THE PRODUCTION OF LIPID-COATED RNA NANOPARTICLES
EP3711749A1 (en) * 2019-03-19 2020-09-23 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH Method of making lipid nanoparticles
KR20220004984A (ko) 2019-03-28 2022-01-12 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. Ttr 유전자 편집을 위한 조성물 및 방법 및 코르티코스테로이드를 포함하는 attr 아밀로이드증의 치료 또는 그의 용도
MX2021011565A (es) 2019-03-28 2021-11-12 Intellia Therapeutics Inc Composiciones y métodos que comprenden un arn guía de ttr y un polinucleótido que codifica un agente de fijacion a adn guiado por arn.
WO2020198641A2 (en) 2019-03-28 2020-10-01 Intellia Therapeutics, Inc. Polynucleotides, compositions, and methods for polypeptide expression
EP3945800A1 (en) 2019-04-03 2022-02-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for insertion of antibody coding sequences into a safe harbor locus
SG11202108454RA (en) 2019-04-04 2021-09-29 Regeneron Pharma Non-human animals comprising a humanized coagulation factor 12 locus
PH12021500045A1 (en) 2019-04-25 2023-01-23 Intellia Therapeutics Inc Ionizable amine lipids and lipid nanoparticles
US11891618B2 (en) 2019-06-04 2024-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mouse comprising a humanized TTR locus with a beta-slip mutation and methods of use
EP3796776A1 (en) 2019-06-07 2021-03-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized albumin locus
JP7664854B2 (ja) 2019-06-14 2025-04-18 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド タウオパチーのモデル
US20200404890A1 (en) 2019-06-27 2020-12-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modeling tdp-43 proteinopathy
US20210023005A1 (en) 2019-07-26 2021-01-28 Landsteiner Scientific S.A. De C.V. Cannabinoid-containing compositions in the form of spheres or sphere-like particles, methods for their preparation, and therapeutic applications
KR20220062079A (ko) 2019-09-13 2022-05-13 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 지질 나노입자에 의해 전달되는 CRISPR/Cas 시스템을 사용한 동물에서의 전사 조절
US20220397570A1 (en) * 2019-09-27 2022-12-15 Merck Sharp & Dohme Corp. Method for measuring nucleic acid content in lipid nanoparticles using ultraviolet spectrometry
EP4054651A1 (en) 2019-11-08 2022-09-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr and aav strategies for x-linked juvenile retinoschisis therapy
WO2021108363A1 (en) 2019-11-25 2021-06-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-mediated upregulation of humanized ttr allele
AU2020401206A1 (en) 2019-12-11 2022-07-14 Intellia Therapeutics, Inc. Modified guide RNAs for gene editing
KR20220133248A (ko) 2020-01-28 2022-10-04 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 pnpla3 좌위를 포함하는 비-인간 동물 및 사용 방법
EP4100528A1 (en) 2020-02-07 2022-12-14 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for kallikrein (klkb1) gene editing
US20230081547A1 (en) 2020-02-07 2023-03-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized klkb1 locus and methods of use
EP3865122A1 (en) * 2020-02-11 2021-08-18 Pantherna Therapeutics GmbH Lipid composition and use thereof for delivery of a therapeutically active agent to endothelium
WO2021195079A1 (en) 2020-03-23 2021-09-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use
EP3901260A1 (en) 2020-04-22 2021-10-27 BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH Coronavirus vaccine
KR20230017783A (ko) 2020-04-28 2023-02-06 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. 시험관내 세포 전달 방법
EP3915544A1 (en) * 2020-05-25 2021-12-01 Leon-Nanodrugs GmbH Method for producing a liposome dispersion
WO2022016070A1 (en) 2020-07-16 2022-01-20 Acuitas Therapeutics, Inc. Cationic lipids for use in lipid nanoparticles
WO2022060871A1 (en) * 2020-09-15 2022-03-24 Verve Therapeutics, Inc. Lipid formulations for gene editing
EP4256052A1 (en) 2020-12-02 2023-10-11 Decibel Therapeutics, Inc. Crispr sam biosensor cell lines and methods of use thereof
MX2023006878A (es) 2020-12-11 2023-07-31 Intellia Therapeutics Inc Composiciones y métodos para reducir el mhc de clase ii en una célula.
AU2021394998A1 (en) 2020-12-11 2023-06-29 Intellia Therapeutics, Inc. Polynucleotides, compositions, and methods for genome editing involving deamination
CR20230320A (es) 2020-12-23 2023-10-23 Intellia Therapeutics Inc Composiciones y métodos para reducir los hla-a en una célula
TW202242101A (zh) 2020-12-23 2022-11-01 美商英特利亞醫療公司 用於細胞中基因修飾ciita之組合物及方法
JP2024502036A (ja) 2020-12-30 2024-01-17 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド 操作されたｔ細胞
CN117042793A (zh) 2021-02-08 2023-11-10 因特利亚治疗公司 用于免疫疗法的淋巴细胞活化基因3(lag3)组合物和方法
CN117042794A (zh) 2021-02-08 2023-11-10 因特利亚治疗公司 用于免疫疗法的t细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(tim3)组合物和方法
CN117098840A (zh) 2021-02-08 2023-11-21 因特利亚治疗公司 用于免疫疗法的自然杀伤细胞受体2b4组合物和方法
BR112023021445A2 (pt) 2021-04-17 2024-01-23 Intellia Therapeutics Inc Composições de nanopartículas lipídicas
TW202309034A (zh) 2021-04-17 2023-03-01 美商英特利亞醫療公司 Dna依賴性蛋白質激酶抑制劑以及其組合物及用途
JP2024515650A (ja) 2021-04-17 2024-04-10 インテリア セラピューティクス，インコーポレーテッド 脂質ナノ粒子組成物
IL308774A (en) 2021-06-10 2024-01-01 Intellia Therapeutics Inc Modified guide RNA molecules containing an internal linker for gene editing
JP2024527525A (ja) 2021-06-22 2024-07-25 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド 肝遺伝子のインビボ編集のための方法
WO2023028471A1 (en) 2021-08-24 2023-03-02 Intellia Therapeutics, Inc. Programmed cell death protein 1 (pd1) compositions and methods for cell-based therapy
JP2024542982A (ja) 2021-10-26 2024-11-19 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド タウオパチーの治療様式としてのｌｅｍｄ２、ｌｅｍｄ３、又はｃｈｍｐ７の過剰発現
CN118251491A (zh) 2021-10-28 2024-06-25 瑞泽恩制药公司 用于敲除C5的CRISPR/Cas相关方法及组合物
MX2024005242A (es) 2021-11-03 2024-07-02 Intellia Therapeutics Inc Polinucleotidos, composiciones y metodos para la edicion del genoma.
CN118369110A (zh) 2021-11-03 2024-07-19 英特利亚治疗股份有限公司 用于免疫疗法的cd38组合物和方法
US12186387B2 (en) 2021-11-29 2025-01-07 BioNTech SE Coronavirus vaccine
US20250040522A1 (en) 2021-12-08 2025-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutant myocilin disease model and uses thereof
WO2023114943A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
KR20240135629A (ko) 2022-02-02 2024-09-11 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 폼페병의 치료를 위한 항-TfR:GAA 및 항-CD63:GAA 삽입
EP4476342A1 (en) 2022-02-10 2024-12-18 Christiana Care Gene Editing Institute, Inc. Methods for lipid nanoparticle delivery of crispr/cas system
AU2023218391A1 (en) 2022-02-11 2024-07-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for screening 4r tau targeting agents
US20250268940A1 (en) 2022-04-19 2025-08-28 Intellia Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor compositions and uses
JP2025514304A (ja) 2022-04-29 2025-05-02 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 遺伝子治療法のための組織特異的遺伝子外セーフハーバーの同定
JP2025516527A (ja) 2022-05-09 2025-05-30 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド インビボ抗体産生のためのベクター及び方法
WO2023235725A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-based therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
US20250344681A1 (en) 2022-05-31 2025-11-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Animal model of tdp-43 proteinopathy
EP4532720A2 (en) 2022-05-31 2025-04-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr interference therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
TW202408595A (zh) 2022-06-16 2024-03-01 美商英特利亞醫療公司 用於對細胞進行遺傳修飾之方法及組合物
WO2024002985A1 (en) 2022-06-26 2024-01-04 BioNTech SE Coronavirus vaccine
JP2025525437A (ja) 2022-06-29 2025-08-05 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド 操作されたｔ細胞
KR20250054842A (ko) 2022-07-29 2025-04-23 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 뇌 및 근육으로의 트랜스페린 수용체(tfr)-매개 전달을 위한 조성물 및 방법
CN119562964A (zh) 2022-08-05 2025-03-04 瑞泽恩制药公司 tdp-43的抗聚集变体
CA3268237A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Nchroma Bio, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE EPIGENETIC REGULATION OF HBV GENE EXPRESSION
EP4612184A1 (en) 2022-11-04 2025-09-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 1 (cacng1) binding proteins and cacng1-mediated delivery to skeletal muscle
WO2024107765A2 (en) 2022-11-14 2024-05-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for fibroblast growth factor receptor 3-mediated delivery to astrocytes
WO2024107670A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Chimeric proteins comprising membrane bound il-12 with protease cleavable linkers
CN120322555A (zh) 2022-12-21 2025-07-15 因特利亚治疗公司 用于前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin 9(pcsk9)编辑的组合物和方法
CN120641573A (zh) 2022-12-22 2025-09-12 英特利亚治疗股份有限公司 用于分析脂质核酸组装体的核酸运载物的方法
TW202428878A (zh) 2022-12-23 2024-07-16 美商英特利亞醫療公司 用於基因體編輯之系統及方法
US20240309380A1 (en) * 2023-03-03 2024-09-19 Sanegene Bio Usa Inc. Small interfering rna targeting apoc3 and uses thereof
TW202436622A (zh) 2023-03-06 2024-09-16 美商英特利亞醫療公司 用於ｂ型肝炎病毒（ｈｂｖ）基因體編輯之組合物及方法
WO2024186971A1 (en) 2023-03-07 2024-09-12 Intellia Therapeutics, Inc. Cish compositions and methods for immunotherapy
AU2024270764A1 (en) 2023-05-15 2025-12-04 Nchroma Bio, Inc. Compositions and methods for epigenetic regulation of hbv gene expression
WO2024238700A1 (en) 2023-05-15 2024-11-21 Chroma Medicine, Inc. Compositions and methods for epigenetic regulation of hbv gene expression
WO2024243031A2 (en) 2023-05-19 2024-11-28 Intellia Therapeutics, Inc. Ionizable amine lipids
CN116370437A (zh) * 2023-05-26 2023-07-04 北京因诺惟康医药科技有限公司 包含胆固醇琥珀酸单酯的核酸脂质纳米颗粒组合物及其用途
AU2024285988A1 (en) 2023-06-08 2025-11-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Animal model with rapid onset of alzheimer's amyloid beta plaque pathology
WO2024259135A1 (en) 2023-06-13 2024-12-19 Intellia Therapeutics, Inc. Assays for analysis of ribonucleic acid (rna) molecules
WO2024259309A1 (en) 2023-06-15 2024-12-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Gene therapy for hearing disorders
WO2025007140A2 (en) 2023-06-30 2025-01-02 Christiana Care Gene Editing Institute, Inc. Nras gene knockout for treatment of cancer
AU2024309884A1 (en) 2023-06-30 2025-12-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for increasing homology-directed repair
US20250049896A1 (en) 2023-07-28 2025-02-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-tfr:acid sphingomyelinase for treatment of acid sphingomyelinase deficiency
WO2025029654A2 (en) 2023-07-28 2025-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of bgh-sv40l tandem polya to enhance transgene expression during unidirectional gene insertion
WO2025038637A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for genetically modifying transforming growth factor beta receptor type 2 (tgfβr2)
TW202521564A (zh) 2023-08-14 2025-06-01 美商英特利亞醫療公司 用於基於細胞之療法的ｃｄ７０ ｃａｒ－ｔ組合物及方法
TW202515992A (zh) 2023-08-14 2025-04-16 美商英特利亞醫療公司 用於對轉形生長因子β受體２型（ＴＧＦβＲ２）進行基因修飾之組合物及方法
WO2025038642A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for genetically modifying cd70
WO2025049481A1 (en) 2023-08-28 2025-03-06 Intellia Therapeutics, Inc. Methods of editing an hla-a gene in vitro
WO2025049432A1 (en) 2023-08-28 2025-03-06 Intellia Therapeutics, Inc. Methods for editing hla-a in cells pre-screened for the absence of one or both alleles of hla-h*01
WO2025064401A1 (en) 2023-09-18 2025-03-27 Intellia Therapeutics, Inc. Nuclease resistant single stranded dna product for non-viral delivery to a cell and methods of production thereof
WO2025064396A1 (en) 2023-09-18 2025-03-27 Intellia Therapeutics, Inc. Nuclease resistant double stranded dna product for non-viral delivery to a cell and methods of production thereof
WO2025137439A2 (en) 2023-12-20 2025-06-26 Intellia Therapeutics, Inc. Engineered t cells
WO2025137301A1 (en) 2023-12-20 2025-06-26 Intellia Therapeutics, Inc. Methods for rapid engineering of cells
WO2025160340A2 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Combination immunosuppression for inhibiting an immune response and enabling immunogen administration and re-administration
WO2025169954A1 (ja) * 2024-02-09 2025-08-14 旭化成株式会社 脂質ナノ粒子含有液の濃縮方法、脂質ナノ粒子含有液の溶媒交換方法及び脂質ナノ粒子濃縮液の製造方法
WO2025184520A1 (en) 2024-02-29 2025-09-04 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for angiopoietin like 3 (angptl3) editing
WO2025186788A1 (en) * 2024-03-08 2025-09-12 Waters Technologies Corporation Methods for chromatographic characterization of lipid nanoparticle compositions
US20250298009A1 (en) * 2024-03-22 2025-09-25 Waters Technologies Corporation Methods for characterizing lipid nanoparticle compositions
WO2025207959A1 (en) 2024-03-27 2025-10-02 Biogen Ma Inc. Anti-transferrin receptor antibodies and uses thereof
US20250319206A1 (en) 2024-04-04 2025-10-16 Christina Care Gene Editing Institute, Inc. Crispr/cas gene editing of neh4 and/or neh5 domains in nrf2
WO2025226816A1 (en) 2024-04-23 2025-10-30 Christiana Care Gene Editing Institute, Inc. Methods of identifying and correlating crispr-induced exon skipping to phenotypic outcomes
WO2025240946A1 (en) 2024-05-17 2025-11-20 Intellia Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticles and lipid nanoparticle compositions
WO2025255308A1 (en) 2024-06-07 2025-12-11 Intellia Therapeutics, Inc. Cd8 co-receptor chimeric polypeptides in tcr cell therapy
US20250388890A1 (en) 2024-06-20 2025-12-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. ASS1 Gene Insertion For The Treatment Of Citrullinemia Type I
WO2026003582A2 (en) 2024-06-27 2026-01-02 Axelyf ehf. Lipids and lipid nanoparticles

Family Cites Families (100)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5345374B2 (ja) 1974-12-28 1978-12-06
US4166132A (en) 1977-08-18 1979-08-28 Pfizer Inc. Antiviral amine derivatives of glycerol and propanediols
DE3144150A1 (de) 1981-04-10 1982-12-09 Basf Ag, 6700 Ludwigshafen (omega)-cyan-1,(omega)-diphenyl-azaalkan-derivate, ihre herstellung und diese enthaltende arzneimittel
EP0188311A3 (en) 1985-01-07 1988-07-20 Syntex (U.S.A.) Inc. Pharmaceutical formulation of nicardipine and 1,2-dioxy-omega-trialkylammonium compounds
ZA8681B (en) 1985-01-07 1987-08-26 Syntex Inc 1,2-dialkoxy-omega-trialkylammonium cationic surfactants
DE3542994A1 (de) 1985-12-05 1987-06-11 Basf Ag Basisch substituierte phenylacetaldehyde, ihre herstellung und diese enthaltende arzneimittel
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
JPH08507203A (ja) 1992-12-04 1996-08-06 イノーバー ラボラトリーズ，インコーポレイテッド 調節可能な核酸治療およびそれらの使用方法
WO1994013833A1 (en) 1992-12-04 1994-06-23 Innovir Laboratories, Inc. Ribozyme amplified diagnostics
EP0685457B1 (en) 1993-02-19 1999-12-15 Nippon Shinyaku Company, Limited Glycerol derivative, device and pharmaceutical composition
US5871914A (en) 1993-06-03 1999-02-16 Intelligene Ltd. Method for detecting a nucleic acid involving the production of a triggering RNA and transcription amplification
EP0721328A4 (en) 1993-09-27 1997-09-17 Smithkline Beecham Corp CAMPTOTHECIN FORMULATIONS
US6166197A (en) 1995-03-06 2000-12-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds having pyrimidine nucleotide (S) with 2'and 5 substitutions
AU3107497A (en) 1996-06-17 1998-01-07 Nippon Shinyaku Co. Ltd. Asialotrisaccharide moranoline derivatives and drugs
US5989912A (en) 1996-11-21 1999-11-23 Oligos Etc. Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
US5849902A (en) 1996-09-26 1998-12-15 Oligos Etc. Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
US5837282A (en) 1996-10-30 1998-11-17 University Of British Columbia Ionophore-mediated liposome loading
EP0958303A4 (en) 1996-12-19 2004-03-31 Univ Yale BIOREACTIVE ALLOSTERIC POLYNUCLEOTIDES
JPH10251152A (ja) 1997-03-14 1998-09-22 Nippon Shinyaku Co Ltd 虚血再灌流障害治療剤
TW589189B (en) 1997-08-04 2004-06-01 Scras Kit containing at least one double-stranded RNA combined with at least one anti-viral agent for therapeutic use in the treatment of a viral disease, notably of viral hepatitis
AU752802C (en) * 1997-11-14 2006-04-13 Pacira Pharmaceuticals, Inc. Production of multivesicular liposomes
CA2312006A1 (en) 1997-12-05 1999-06-17 Lynn Milich Nucleic acid mediated rna tagging and rna revision
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
WO1999033791A1 (en) 1997-12-26 1999-07-08 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Aliphatic derivatives
GB9827152D0 (en) 1998-07-03 1999-02-03 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
IL126731A0 (en) 1998-10-23 1999-08-17 Intelligene Ltd A method of detection
JP2002528109A (ja) 1998-11-03 2002-09-03 エール ユニバーシティ マルチドメインポリヌクレオチド分子センサ
AU1830200A (en) 1998-11-25 2000-06-13 Vanderbilt University Cationic liposomes for gene transfer
EP2314700A1 (en) 1999-01-28 2011-04-27 Medical College of Georgia Research Institute, Inc Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded RNA
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
JP2000281569A (ja) 1999-03-25 2000-10-10 Nippon Shinyaku Co Ltd 脊髄障害治療剤
JP2003516124A (ja) 1999-10-15 2003-05-13 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ 標的とした遺伝的干渉の手段としてのｒｎａ干渉経路遺伝子
GB9927444D0 (en) 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression
CN1311189A (zh) 2000-03-01 2001-09-05 沈阳药科大学 聚乙二醇单甲醚胆固醇琥珀酸酯衍生物的合成及其制剂
DE60139690D1 (de) 2000-07-03 2009-10-08 Novartis Vaccines & Diagnostic Immunisierung gegen chlamydia pneumoniae
CA2425303A1 (en) 2000-10-27 2002-05-02 John Telford Nucleic acids and proteins from streptococcus groups a & b
JP2002212477A (ja) 2001-01-19 2002-07-31 Fuji Photo Film Co Ltd インクジェット用インク
US20050175629A1 (en) 2001-08-31 2005-08-11 Giuseppe Del Giudice Helicobacter pylori vaccination
US20040006061A1 (en) 2001-10-04 2004-01-08 Wolfgang Haap Alkoxybenzylamine
DE10163098B4 (de) 2001-10-12 2005-06-02 Alnylam Europe Ag Verfahren zur Hemmung der Replikation von Viren
US20080207542A1 (en) 2002-03-26 2008-08-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA inteference mediated inhibition of hepatitis C virus (HVC) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
AU2003240978A1 (en) 2002-05-31 2003-12-19 Genteric, Inc. Multi-functional polyamines for delivery of biologically-active polynucleotides
US20080214437A1 (en) 2002-09-06 2008-09-04 Mohapatra Shyam S Methods and compositions for reducing activity of the atrial natriuretic peptide receptor and for treatment of diseases
CA2526106A1 (en) 2003-06-26 2005-01-13 Chiron Corporation Immunogenic compositions for chlamydia trachomatis
WO2005032582A2 (en) 2003-07-31 2005-04-14 Chiron Corporation Immunogenic compositions for streptococcus pyogenes
CA2536333C (en) 2003-08-28 2013-01-08 Jan Weiler Interfering rna duplex having blunt-ends and 3'-modifications
GB0410866D0 (en) 2004-05-14 2004-06-16 Chiron Srl Haemophilius influenzae
AU2005251691A1 (en) 2004-05-17 2005-12-22 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Liposomal formulations comprising dihydrosphingomyelin and methods of use thereof
US7799565B2 (en) 2004-06-07 2010-09-21 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering RNA
WO2006007712A1 (en) 2004-07-19 2006-01-26 Protiva Biotherapeutics, Inc. Methods comprising polyethylene glycol-lipid conjugates for delivery of therapeutic agents
GB0418172D0 (en) 2004-08-13 2004-09-15 Ic Vec Ltd Vector
WO2007086881A2 (en) 2005-02-14 2007-08-02 Sirna Therapeutics, Inc. Cationic lipids and formulated molecular compositions containing them
US7404969B2 (en) 2005-02-14 2008-07-29 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
EP1858919B1 (en) 2005-02-18 2012-04-04 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Immunogens from uropathogenic escherichia coli
WO2006089264A2 (en) 2005-02-18 2006-08-24 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Proteins and nucleic acids from meningitis/sepsis-associated escherichia coli
AU2006235045A1 (en) 2005-03-30 2006-10-19 J. Craig Venter Institute, Inc. Haemophilus influenzae type b
WO2006138004A2 (en) 2005-05-12 2006-12-28 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Immunogenic compositions for chlamydia trachomatis
CN103989633A (zh) * 2005-07-27 2014-08-20 普洛体维生物治疗公司 制造脂质体的系统和方法
CN101277921B (zh) 2005-09-20 2013-05-22 Jitsubo株式会社 分离用载体、化合物的分离方法以及利用其的肽合成方法
CA2627302A1 (en) 2005-10-25 2007-05-03 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Compositions comprising yersinia pestis antigens
US8329888B2 (en) 2006-03-23 2012-12-11 Santaris Pharma A/S Small internally segmented interfering RNA
GB0608838D0 (en) 2006-05-04 2006-06-14 Novartis Ag Organic compounds
WO2008020330A2 (en) 2006-08-16 2008-02-21 Novartis Ag Immunogens from uropathogenic escherichia coli
DE102006040276A1 (de) 2006-08-17 2008-02-21 Technische Universität Dresden Verwendung von Mono- oder Disacchariden zur Maskierung von Gerüchen sowie Verfahren und Zusammensetzung zur Maskierung von Gerüchen
JP5347510B2 (ja) 2007-02-05 2013-11-20 日本新薬株式会社 ポリエチレングリコール誘導体
US20100015218A1 (en) 2007-02-16 2010-01-21 Vasant Jadhav Compositions and methods for potentiated activity of biologically active molecules
CA2686735A1 (en) 2007-05-04 2008-11-13 Mdrna, Inc. Amino acid lipids and uses thereof
NZ580712A (en) 2007-05-22 2011-12-22 Marina Biotech Inc Hydroxymethyl substituted rna oligonucleotides and rna complexes containing acyclic monomers
GB0714963D0 (en) 2007-08-01 2007-09-12 Novartis Ag Compositions comprising antigens
GB0717187D0 (en) 2007-09-04 2007-10-17 Novartis Ag Compositions comprising yersinia pestis antigens
CN101468203B (zh) 2007-12-25 2012-06-27 沈阳药科大学 可断裂聚乙二醇脂质衍生物的制备方法以及应用
AU2008342535B2 (en) 2007-12-27 2015-02-05 Arbutus Biopharma Corporation Silencing of polo-like kinase expression using interfering RNA
US20110117125A1 (en) 2008-01-02 2011-05-19 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Compositions and methods for the delivery of nucleic acids
US8188060B2 (en) 2008-02-11 2012-05-29 Dharmacon, Inc. Duplex oligonucleotides with enhanced functionality in gene regulation
ITMI20081249A1 (it) 2008-07-09 2010-01-09 Novartis Vaccines & Diagnostic Immunogeni di escherichia coli con solubilità migliorata.
WO2009109860A2 (en) 2008-03-06 2009-09-11 Novartis Ag Mutant forms of chlamydia htra
NZ588583A (en) * 2008-04-15 2012-08-31 Protiva Biotherapeutics Inc Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
WO2009129395A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Abbott Laboratories Cationic lipids and uses thereof
WO2009129387A2 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Abbott Laboratories Cationic lipids and uses thereof
WO2010009065A2 (en) 2008-07-15 2010-01-21 Novartis Ag Amphipathic peptide compositions
WO2010021865A1 (en) 2008-08-18 2010-02-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel lipid nanoparticles and novel components for delivery of nucleic acids
CA2743136C (en) 2008-11-10 2019-02-26 Muthiah Manoharan Novel lipids and compositions for the delivery of therapeutics
CA2758490C (en) 2009-04-14 2023-05-02 Novartis Ag Compositions for immunising against staphylococcus aureus
EP2449106B1 (en) * 2009-07-01 2015-04-08 Protiva Biotherapeutics Inc. Compositions and methods for silencing apolipoprotein b
EP2451475A2 (en) 2009-07-06 2012-05-16 Novartis AG Self replicating rna molecules and uses thereof
EP2467357B1 (en) 2009-08-20 2016-03-30 Sirna Therapeutics, Inc. Novel cationic lipids with various head groups for oligonucleotide delivery
JP5823405B2 (ja) * 2009-11-04 2015-11-25 ザ ユニバーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア 核酸含有脂質粒子および関連方法
US20110200582A1 (en) 2009-12-23 2011-08-18 Novartis Ag Lipids, lipid compositions, and methods of using them
WO2011141704A1 (en) 2010-05-12 2011-11-17 Protiva Biotherapeutics, Inc Novel cyclic cationic lipids and methods of use
US20120004310A1 (en) 2010-05-28 2012-01-05 Longo Frank M Non-peptide bdnf neurotrophin mimetics
US9770463B2 (en) 2010-07-06 2017-09-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Delivery of RNA to different cell types
JP6133883B2 (ja) * 2011-11-04 2017-05-24 日東電工株式会社 薬物送達用の脂質ナノ粒子の生成方法
CA3165769A1 (en) 2011-12-07 2013-06-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Biodegradable lipids for the delivery of active agents
WO2014093178A2 (en) 2012-12-14 2014-06-19 Boston Scientific Neuromodulation Corporation Method for automation of therapy-based programming in a tissue stimulator user interface
US10124065B2 (en) * 2013-03-08 2018-11-13 Novartis Ag Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
US9504747B2 (en) 2013-03-08 2016-11-29 Novartis Ag Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
CN105143456A (zh) * 2013-03-15 2015-12-09 不列颠哥伦比亚大学 用于转染的脂质纳米粒子和相关方法
EP3052627B1 (en) 2013-10-04 2018-08-22 Novartis AG Novel formats for organic compounds for use in rna interference
WO2015051044A2 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Novartis Ag Novel formats for organic compounds for use in rna interference
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