TW202436622A

TW202436622A - 用於ｂ型肝炎病毒（ｈｂｖ）基因體編輯之組合物及方法

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Publication number: TW202436622A
Application number: TW113108209A
Authority: TW
Inventors: 威廉費德瑞克海琳頓; 艾什瓦亞普拉卡什賈塔
Original assignee: 美商英特利亞醫療公司
Priority date: 2023-03-06
Filing date: 2024-03-06
Publication date: 2024-09-16
Also published as: WO2024186890A1

Abstract

本文提供了用於修飾B型肝炎病毒基因體之組合物及方法。

Description

用於B型肝炎病毒(HBV)基因體編輯之組合物及方法

B型肝炎病毒(HBV)為一種有包膜的DNA病毒，其可感染肝臟，引起肝細胞壞死和炎症，且為肝硬化和肝細胞癌(HCC)發展的主要風險因素。世界衛生組織(WHO)估計，全球有2.4億慢性HBV感染個體，主要在中低收入國家中，且每年約有650,000人死於HBV感染之併發症。儘管已有有效的HBV疫苗，並且在出生時為嬰兒接種疫苗的努力已有效降低HBV感染的發病率和流行率，但此類計劃多年來並未對死亡率產生明顯影響(WHO關於患有慢性B型肝炎感染之人群的預防、護理和治療之指南，2015年於apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/154590/9789241549059_eng.pdf)。

已經開發出許多用於治療HBV之治療劑，可有效減輕HBV感染之疾病負擔，但它們通常沒有治癒作用，因為它們不能完全消除病毒的所有複製形式，包括共價閉合環狀DNA (cccDNA)，該cccDNA存在於肝細胞核中且成為病毒複製及病毒RNA轉錄之模板。核苷酸及核苷類似物因其安全性及有效性而通常被認為是用於治療慢性HBV感染之黃金標準，可有效抑制HBV複製，但不能消除cccDNA，不能阻止病毒蛋白的表現，必須長期給藥，並且可能導致抗藥性之產生。此外，用核苷酸(核苷)抑制劑治療並不能完全降低發生肝細胞癌(HCC)之風險，這一風險仍然很顯著(儘管接受治療，約7%之HBV感染者仍將在5-7年內發生HCC)。基於干擾素之療法可導致血清轉化並治癒約10-15%之患者，從而允許停止治療，但該等劑具有嚴重的副作用，必須冷藏以供長期儲存，這使得它們不太適合在許多HBV感染流行之國家中使用。

慢性HBV感染之治療因HBV逃避或抑制免疫反應從而導致感染持續存在之能力而更加複雜。一些HBV蛋白具有免疫抑制特性，其中B型肝炎s抗原(HBsAg)構成了HBV感染個體循環中絕大多數HBV蛋白。此外，雖然B型肝炎e抗原(HBeAg)之去除(經由血清轉化)或血清病毒血症的減輕與治療後HBV感染之持續控制的進展無關，但從HBV感染之血液中去除血清HBsAg (及血清轉化)為公認的抗病毒治療反應的預後指標，這將導致治療後HBV感染之控制。然而，這種情況只發生在一小部分接受免疫療法的患者身上。因此，雖然罕見，但患者有可能產生足夠穩健的免疫反應來抑制或清除HBV感染，從而至少實現該疾病之功能性治癒。

D型肝炎病毒(hepatitis D virus或hepatitis delta virus，HDV)為一種人類病原體。然而，該病毒為有缺陷的，並且依賴B型肝炎病毒(HBV)提供的強制性輔助功能來傳播；事實上，HDV需要同時感染HBV (共同感染)或疊加在先前存在之HBV感染上(重複感染)才能具有傳染性並大量繁殖。具體地，HDV需要含有B型肝炎表面抗原之HBV病毒包膜。因此，HBV感染之有效治療將提供HDV之有效治療。

本文提供了用於修飾B型肝炎病毒(HBV)基因體之組合物及方法。還提供了用於治療感染HBV之個體之方法。

在一些態樣，本文提供了一種嚮導RNA，其包含：A.靶向序列，其包含與SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460中之至少20個連續核苷酸至少80%、85%、較佳90%或95%一致或互補之序列；B.靶向序列，其包含與SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460中之至少24個連續核苷酸至少80%、85%、較佳90%或95%一致或互補之序列；C.靶向序列，其包含與SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846及核苷酸1821-2460中之至少17、18、較佳19或20個連續核苷酸一致或互補之序列；或D.靶向序列，其包含與SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846及核苷酸1821-2460中之至少20、21、22、較佳23或24個連續核苷酸一致或互補之序列。

在一些態樣，本文提供了一種嚮導RNA，其包含：A. 靶向序列，其包含與以下中之至少20個連續核苷酸至少80%、85%、較佳90%或95%一致或互補之序列：1. SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460；2. SEQ ID NO: 1之核苷酸57-76、66-85、126-145、153-173、153-172、154-173、240-269、240-259、245-264、248-267、250-269、269-288、356-392、356-375、361-380、364-383、373-392、423-445、423-442、426-445、574-593、608-627、621-655、621-640、622-641、629-648、629-648、630-649、635-654、636-655、686-705、694-716、694-713、695-714、697-716、713-732、725-744、1597-1616、1817-1836、1845-1864、1867-1886、1880-1903、1880-1899、1883-1902、1884-1903、2072-2094、2072-2091、2073-2092、2075-2094、2299-2318、2348-2367、2634-2653、2867-2887、2867-2886、2868-2887、2891-2910、2956-2975或2982-3001；視情況核苷酸153-173、153-172、154-173或250-269；或者3. 靶位點，其選自表1A中HBV編號S1-S93中任一者之靶位點，視情況表1A中之HBV編號S1-S6、S8、S11、S16、S17、S19、S21-25、S28-S30、S32、S39、S47、S49、S50、S52、S53、S57-58、S61-S64、S67、S70、S71、S74、S77、S78、S80-S87、S80、S90-S91及S93，視情況S1、S5或S6中任一者之靶位點；B. 靶向序列，其包含與選自SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460之序列的17、18、較佳19或20個連續核苷酸，或者與表1A中提供之S1-S6、S8、S11、S16、S17、S19、S21-25、S28-S30、S32、S39、S47、S49、S50、S52、S53、S57-58、S61-S64、S67、S70、S71、S74、S77、S78、S80-S87、S80、S90-S91及S93，視情況S1、S5或S6之靶向序列一致或互補的序列；C. 選自G028550、G028551、G028552、G028553、G028554、G028555、G030415、G030418、G030423、G030424、G030426、G030428、G030429、G030430、G030431、G030432、G030435、G030436、G030437、G030439、G030446、G030454、G030456、G030457、G030459、G030460、G030464、G030465、G030468、G030469、G030470、G030471、G030474、G030477、G030478、G030481、G030484、G030485、G030487、G030488、G030489、G030490、G030491、G030492、G030493、G030494、G030496、G030497、G030498或G030500，視情況G028550、G028554或G028555之靶向序列的靶向序列；或者D. 靶向序列，其包含與SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460；或核苷酸57-76、66-85、126-145、153-173、153-172、154-173、240-269、240-259、245-264、248-267、250-269、269-288、356-392、356-375、361-380、364-383、373-392、423-445、423-442、426-445、574-593、608-627、621-655、621-640、622-641、629-648、629-648、630-649、635-654、636-655、686-705、694-716、694-713、695-714、697-716、713-732、725-744、1597-1616、1817-1836、1845-1864、1867-1886、1880-1903、1880-1899、1883-1902、1884-1903、2072-2094、2072-2091、2073-2092、2075-2094、2299-2318、2348-2367、2634-2653、2867-2887、2867-2886、2868-2887、2891-2910、2956-2975或2982-3001；視情況核苷酸153-173、153-172、154-173或250-269中之至少20個連續核苷酸一致或互補之序列。

在一些實施例中，本文提供之嚮導RNA進一步包含以下中之一或多者：A.經縮短之髮夾1區，或經取代及視情況經縮短之髮夾1區，其中1.髮夾1中以下核苷酸對中之至少一者經沃森-克里克(Watson-Crick)配對核苷酸取代：H1-1與H1-12、H1-2與H1-11、H1-3與H1-10或H1-4與H1-9，且該髮夾1區視情況缺少a. H1-5至H1-8中之任一者或兩者，b.以下核苷酸對中之一者、兩者或三者：H1-1與H1-12、H1-2與H1-11、H1-3與H1-10及H1-4與H1-9，或c.髮夾1區之1-8個核苷酸；或2.該經縮短之髮夾1區缺少4-8個核苷酸，較佳4-6個核苷酸；且a.位置H1-1、H1-2或H1-3中之一或多者相對於示範性SpyCas9 sgRNA-1 (SEQ ID NO: 268)缺失或經取代，或b.位置H1-6至H1-10中之一或多者相對於示範性SpyCas9 sgRNA-1 (SEQ ID NO: 268)經取代；或者3.該經縮短之髮夾1區缺少5-10個核苷酸，較佳5-6個核苷酸，並且位置N18、H1-12或n中之一或多者相對於示範性SpyCas9 sgRNA-1 (SEQ ID NO: 268)經取代；或者B.經縮短之上部莖區，其中該經縮短之上部莖區缺少1-6個核苷酸且其中該經縮短之上部莖區之6、7、8、9、10或11個核苷酸包括相對於示範性SpyCas9 sgRNA-1 (SEQ ID NO: 268)之少於或等於4個取代；或者C.在LS6、LS7、US3、US10、B3、N7、N15、N17、H2-2及H2-14中之任一或多者處相對於示範性SpyCas9 sgRNA-1 (SEQ ID NO: 268)之取代，其中該取代核苷酸不為後面有腺嘌呤之嘧啶，亦不為前面有嘧啶之腺嘌呤；或者D.具有上部莖區之示範性SpyCas9 sgRNA-1 (SEQ ID NO: 268)，其中該上部莖修飾包含對該上部莖區中US1-US12中之任一或多者的修飾。

在一些實施例中，該嚮導RNA缺少經縮短之髮夾1中之6個核苷酸。

在一些實施例中，該嚮導RNA缺少經縮短之髮夾1中之8個核苷酸。

在一些實施例中，H-1及H-3缺失。

在一些實施例中，該嚮導RNA進一步包含3’尾。

在一些實施例中，該3'尾之長度為1-4個核苷酸，視情況長度為1個核苷酸。

在一些實施例中，該嚮導RNA包含上部莖區，其包含對該上部莖區中US1-US12中之任一或多者的修飾。

在一些實施例中，本文所述之嚮導RNA包含選自表3A中之序列之核苷酸序列。

在一些實施例中，該嚮導RNA包含選自表4中之經修飾之Spy嚮導支架序列的經修飾之核苷酸序列，其中該經修飾之核苷酸序列為該嚮導序列之3’。

在一些實施例中，本文所述之嚮導RNA根據選自表15中之經修飾之Spy嚮導RNA序列的核苷酸序列之模式進行修飾。

在一些實施例中，該嚮導包含選自表3B中之未經修飾之Spy嚮導RNA序列之核苷酸序列，其中N20共同為本文所述之靶向序列。

在一些實施例中，該等表3B中之未經修飾之Spy嚮導RNA序列中之各核苷酸為任何天然或非天然核苷酸。

在一些實施例中，該嚮導RNA根據選自表15中之修飾模式之模式進行修飾，其中(mN*)3N17係指本文所述之靶向序列，其中前三個核苷酸包含2’-O-Me修飾及硫代磷酸酯鍵聯。

在一些實施例中，本文所述之嚮導RNA包含選自如表12中所列之SEQ ID NO: 269、273、274、362、366或367之序列或修飾模式。

在一些態樣，提供了一種嚮導RNA (gRNA)，其包含嚮導區及保守區，其中：A.嚮導區包含核酸序列，該核酸序列包含與以下中之24個連續核苷酸至少80%、85%、較佳90%或95%一致或互補之序列：1. SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460；2. SEQ ID NO: 1之核苷酸35-58、146-169、153-176、216-239、330-356、330-353、333-356、342-365、447-470、666-689、713-736、740-763、755-778、1390-1413、1836-1859、2635-2658、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸146-169、153-176、330-356、330-353、333-356、447-470、713-736、740-763、755-778、1390-1413、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸447-470、330-353、755-778或713-736；或者3.選自表2A中之HBV編號N7、N8、N11、N24、N25、N32、N37、N40、N42、N47、N51、N55、N75、N79、N84、N97或N98；視情況N7、N8、N11、N24、N32、N37、N40、N42、N47、N79或N84；視情況N7、N24、N32或N37中任一者之靶位點；B.該嚮導區包含與以下中之21、22、較佳23或24個連續核苷酸一致或互補的核酸序列：選自SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460之序列；或者表2A中之N7、N8、N11、N24、N25、N32、N37、N40、N42、N47、N51、N55、N75、N79、N84、N97或N98；視情況N7、N8、N11、N24、N32、N37、N40、N42、N47、N79或N84；視情況N7、N24、N32或N37之靶向序列；C.該嚮導區選自G027224、G027225、G027228、G030107、G030108、G030115、G030120、G030123、G030125、G030130、G030134、G030138、G030158、G030162、G030167、G030180或G030181；視情況G027224、G027225、G027228、G030107、G030115、G030120、G030123、G030125、G030130、G030162或G030167；視情況G027224、G030107、G030115或G030120之靶向序列；或者D.該嚮導區包含與選自以下之序列中之24個連續核苷酸一致或互補之序列：SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846及核苷酸1821-2460；或者SEQ ID NO: 1之核苷酸35-58、146-169、153-176、216-239、330-356、330-353、333-356、342-365、447-470、666-689、713-736、740-763、755-778、1390-1413、1836-1859、2635-2658、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸146-169、153-176、330-356、330-353、333-356、447-470、713-736、740-763、755-778、1390-1413、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸447-470、330-353、755-778或713-736。

在一些實施例中，該保守區包含以下中之一或多者：(a)經縮短之重複/反重複區，其中該經縮短之重複/反重複區相對於SEQ ID NO: 455缺少2-24個核苷酸，其中(i)核苷酸37-48及53-64中之一或多者相對於SEQ ID NO: 455缺失且視情況核苷酸37-64中之一或多者相對於SEQ ID NO: 455經取代；且(ii)核苷酸36藉由至少2個核苷酸與核苷酸65連接；或者(b)經縮短之髮夾1區，其中該經縮短之髮夾1相對於SEQ ID NO: 455缺少2-10個核苷酸，視情況2-8個核苷酸，其中(i)核苷酸82-86及91-95中之一或多者相對於SEQ ID NO: 455缺失且視情況位置82-96中之一或多者相對於SEQ ID NO: 455經取代；且(ii)核苷酸81藉由至少4個核苷酸與核苷酸96連接；或者(c)經縮短之髮夾2區，其中該經縮短之髮夾2相對於SEQ ID NO: 455缺少2-18個核苷酸，視情況2-16個核苷酸，其中(i)核苷酸113-121及126-134中之一或多者相對於SEQ ID NO: 455缺失且視情況核苷酸113-134中之一或多者相對於SEQ ID NO: 455經取代；且(ii)核苷酸112藉由至少4個核苷酸與核苷酸135連接；其中核苷酸144-145中之一或兩個相對於SEQ ID NO: 455視情況缺失；視情況地，其中至少10個核苷酸為經修飾之核苷酸。

在一些實施例中，該保守區包含選自表5之核苷酸序列。

在一些實施例中，該嚮導RNA包含至少一個末端修飾。

在一些實施例中，該修飾包含5'末端修飾。

在一些實施例中，該修飾包含3'末端修飾。

在一些實施例中，該嚮導RNA包含髮夾區中之修飾。

在一些實施例中，該髮夾區中之修飾亦為末端修飾。

在一些實施例中，該修飾包含2’-O-甲基(2’-O-Me)修飾之核苷酸。

在一些實施例中，該修飾包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵。

在一些實施例中，該修飾包含2’-O-甲基(2’-O-Me)修飾之核苷酸，以硫代磷酸酯(PS)鍵連接至3’相鄰核苷酸。

在一些實施例中，該修飾包含2’-氟(2’F)修飾之核苷酸。

在一些實施例中，該5'末端修飾包含在該嚮導序列之5'末端之核苷酸1-3處之2’-O-甲基(2’-O-Me)修飾之核苷酸，以硫代磷酸酯(PS)鍵連接至3'相鄰核苷酸。

在一些實施例中，該保守區包含選自表6中之經修飾之保守區Nme嚮導RNA模體的經修飾之核苷酸序列，並且其中該保守區為該嚮導區的3'。

在一些實施例中，該嚮導RNA包含選自SEQ ID NO: 226-234中任一者之核苷酸序列，並且其中N表示N7、N8、N11、N24、N25、N32、N37、N40、N42、N47、N51、N55、N75、N79、N84、N97或N98；視情況N7、N8、N11、N24、N32、N37、N40、N42、N47、N79或N84；視情況N7、N24、N32或N37中任一者之嚮導序列。

在一些實施例中，各核苷酸為任何天然或非天然核苷酸。

在一些實施例中，該嚮導RNA根據選自SEQ ID NO: 670-678之模式進行修飾，其中N共同為本文所述之嚮導序列，其中N、A、C、G及U為核糖核苷酸(2'-OH)，其中「m」指示2’-O-Me修飾，「f」指示2’-氟修飾，且「*」指示核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵聯。

在一些態樣，本文提供了一種組合物，其包含本文所述之嚮導RNA。

在一些態樣，本文提供了一種組合物，其包含嚮導RNA之組合，該嚮導RNA包含嚮導區及保守區，其中：A.該嚮導區包含核酸序列，該核酸序列包含與選自N24及N37；N7及N24；N7及N32；N7及N37；N7及N40；N24及N37；N24及N40；N37及N40；N24及N32；N32及N37；N24及N79；N24、N32及N79；N24、N32及N37；以及N24、N32及N40；視情況N24及N37；N7及N32；N7及N37之靶位點之24個連續核苷酸至少80%、85%、較佳90%或95%一致或互補之序列；且B.該保守區包含本文所述之保守區。

在一些實施例中，該組合物進一步包含RNA指導的DNA結合劑或編碼RNA指導的DNA結合劑之核酸。

在一些實施例中，編碼該RNA指導的DNA結合劑之該核酸包含有包含編碼該RNA指導的DNA結合劑之開放閱讀框(ORF)之mRNA。

在一些實施例中，RNA指導的DNA結合劑為核酸酶。

在一些實施例中，RNA指導的DNA結合劑為Cas9核酸酶。

在一些實施例中，Cas9為釀膿鏈球菌( S. pyogenes) Cas9。

在一些實施例中，該釀膿鏈球菌Cas9包含與SEQ ID NO: 707及713具有至少90%一致性之胺基酸序列，或編碼與選自SEQ ID NO: 707及713之序列具有至少90%一致性之釀膿鏈球菌Cas9之ORF。

在一些實施例中，編碼該胺基酸序列之該ORF與SEQ ID NO: 706及712具有至少85%一致性。

在一些實施例中，該Cas9為Nme Cas9。

在一些實施例中，Nme Cas9包含與選自SEQ ID NO: 711、716、719、722或730之序列具有至少90%一致性之胺基酸序列，或編碼與選自600-620之序列具有至少90%一致性之Nme Cas9之ORF。

在一些實施例中，編碼該胺基酸序列之該ORF與選自SEQ ID NO: 705、710、715、718、721或729之序列具有至少85%一致性。

在一些實施例中，該核酸酶具有雙股核酸內切酶活性。

在一些實施例中，該核酸酶具有切口酶活性。

在一些實施例中，該核酸酶為無催化活性的。

在一些實施例中，該核酸酶進一步包含異源功能域。

在一些實施例中，該核酸酶為切口酶且該異源功能域為去胺酶。

在一些實施例中，該去胺酶為胞苷去胺酶或腺嘌呤去胺酶。

在一些實施例中，該去胺酶為胞苷去胺酶。

在一些實施例中，該去胺酶為脂蛋白元B mRNA編輯酶(APOBEC)去胺酶。

在一些實施例中，該核酸酶及該去胺酶包含與選自SEQ ID NO. 707、716、719、722或730之序列具有至少90%一致性之胺基酸序列或者編碼與SEQ ID NO: 707、716、719、722或730具有至少90%一致性之胺基酸序列之ORF。

在一些實施例中，編碼該胺基酸序列之該ORF與SEQ ID NO: 706、715、718、721或729具有至少85%一致性。

在一些實施例中，本文所述之組合物進一步包含尿嘧啶糖苷酶抑制劑(UGI)或編碼UGI之核酸，其中該核酸酶多肽不包含UGI或者編碼該多肽之該核酸不編碼UGI。

在一些實施例中，該UGI包含與SEQ ID NO: 709、725或733具有至少90%一致性之胺基酸序列，或者編碼與選自709、725或733之序列具有至少90%一致性之胺基酸序列之ORF。

在一些實施例中，編碼該胺基酸序列之該ORF與SEQ ID NO: 708、724、732，視情況SEQ ID NO: 708具有至少85%一致性。

在一些實施例中，該ORF為經修飾之ORF。

在一些實施例中，本文所述之組合物進一步包含醫藥賦形劑。

在一些實施例中，該嚮導RNA與脂質奈米顆粒(LNP)締合。

在一些實施例中，LNP包含陽離子脂質。

在一些實施例中，陽離子脂質為(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八烷-9,12-二烯酸酯，亦稱為(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯。

在一些實施例中，LNP包含輔助脂質。

在一些實施例中，輔助脂質為膽固醇。

在一些實施例中，LNP包含中性脂質。

在一些實施例中，中性脂質為1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DSPC)。

在一些實施例中，LNP包含隱形脂質。

在一些實施例中，隱形脂質為1,2-二肉豆蔻醯基-rac-甘油基-3-甲氧基聚乙二醇2000 (PEG2k-DMG)。

在一些實施例中，LNP包含(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八烷-9,12-二烯酸酯(亦稱為(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯)、DSPC、膽固醇及PEG2k-DMG。

在一些態樣，本文提供了一種包含本文所述之嚮導RNA或本文所述之組合物之醫藥組合物。

在一些態樣，本文提供了一種醫藥組合物，其包含本文所述之嚮導RNA或本文所述之組合物；或者本文所述之嚮導RNA或本文所述之組合物用於誘導細胞中HBV基因內之雙股斷裂或單股斷裂，修飾細胞中HBV基因之核酸序列，或減少細胞中HBV基因之表現之用途。

在一些實施例中，該HBV基因為S基因。

在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物或用途用於減少細胞或個體中該HBV基因之表現。

在一些態樣，本文提供了一種包含本文所述之嚮導RNA或本文所述之組合物之醫藥組合物；或者本文所述之嚮導RNA或本文所述之組合物用於治療患有B型肝炎之個體之用途。

在一些實施例中，在投與該醫藥組合物時，該個體沒有用降低血清HBsAg的劑例如核苷酸/核苷抑制劑進行治療。

在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物或用途係用於與免疫刺激劑組合使用。

在一些實施例中，該免疫刺激劑選自下組：聚乙二醇化干擾素α 2a (PEG-IFN-α-2a)、干擾素α-2b、PEG-IFN-α-2b、干擾素λ、重組人類介白素-7及類鐸受體3、7、8或9 (TLR3、TLR7、TLR8、TLR9)促效劑、病毒進入抑制劑、Myrcludex、抑制HBsAg分泌或釋放之寡核苷酸、REP 9AC、衣殼抑制劑、Bay41-4109、NVR-1221、cccDNA抑制劑、IHVR-25、病毒衣殼、MVA衣殼、免疫檢查點調節劑、CTLA-4抑制劑、伊匹單抗(ipilimumab)、PD-1抑制劑、納武利尤單抗(Nivolumab)、帕博利珠單抗(Pembrolizumab)、BGB-A317抗體、PD-L1抑制劑、阿替利珠單抗(atezolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)、度伐利尤單抗(durvalumab)或affimer生物治療劑。

在一些實施例中，該免疫刺激劑為疫苗。

在一些實施例中，該疫苗為核酸疫苗或基於蛋白質之疫苗。

在一些實施例中，該核酸疫苗為RNA疫苗。

在一些實施例中，該個體患有慢性HBV。

在一些實施例中，該個體為HBe抗原陽性。

在一些實施例中，該個體為HBe抗原陰性。

在一些實施例中，該個體患有D型肝炎。

在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物或用途用於治療D型肝炎。

在一些態樣，本文提供了一種誘導細胞中HBV基因內之雙股斷裂或單股斷裂或減少細胞中HBV蛋白之表現之方法，該方法包含使該細胞與本文所述之嚮導RNA及RNA指導的DNA結合劑或編碼RNA指導的DNA結合劑之核酸，或者本文所述之組合物接觸。

在一些實施例中，該HBV蛋白為HBsAg蛋白或HBcrAg蛋白。

在一些實施例中，該細胞在個體中。

在一些實施例中，在選自血液或血清之個體樣品中量測HBsAg蛋白水準或HBcrAg蛋白水準。

在一些實施例中，HBsAg之血清水準降低至小於1000 IU/ml，視情況小於100 IU/ml。

在一些實施例中，在投與該嚮導或醫藥組合物時，該個體沒有用降低血清HBsAg的劑例如核苷酸/核苷抑制劑進行治療。

在一些實施例中，本文所述之方法進一步包含投與免疫刺激劑。

在一些實施例中，該免疫刺激劑選自下組：聚乙二醇化干擾素α 2a (PEG-IFN-α-2a)、干擾素α-2b、PEG-IFN-α-2b、干擾素λ、重組人類介白素-7及類鐸受體3、7、8或9 (TLR3、TLR7、TLR8、TLR9)促效劑、病毒進入抑制劑、Myrcludex、抑制HBsAg分泌或釋放之寡核苷酸、REP 9AC、衣殼抑制劑、Bay41-4109、NVR-1221、cccDNA抑制劑、IHVR-25、病毒衣殼、MVA衣殼、免疫檢查點調節劑、CTLA-4抑制劑、伊匹單抗、PD-1抑制劑、納武利尤單抗、帕博利珠單抗、BGB-A317抗體、PD-L1抑制劑、阿替利珠單抗、阿維魯單抗、度伐利尤單抗或affimer生物治療劑。

在一些實施例中，該免疫刺激劑為疫苗。

在一些實施例中，該疫苗為核酸疫苗或基於蛋白質之疫苗。

在一些實施例中，該核酸疫苗為RNA疫苗。

在一些實施例中，該個體患有慢性HBV。

在一些實施例中，該個體為HBe抗原陽性。

在一些實施例中，該個體為HBe抗原陰性。

在一些實施例中，該個體患有D型肝炎。

在一些實施例中，本文所述之方法進一步包含治療個體之D型肝炎。

在一些實施例中，該方法包含向個體投與一或多個劑量之該嚮導RNA及該RNA指導的DNA結合劑、一或多個劑量之該編碼RNA指導的DNA結合劑之核酸或一或多個劑量之該組合物，視情況包含投與兩個、三個、四個或五個劑量。

在一些實施例中，本文所述之方法包含投與兩個或更多個劑量，其中至少兩個連續劑量在相隔至少或約1個月、3個月或6個月的時間投與。

在一些實施例中，本文所述之方法包含在投與第一劑量後，測定該個體之血液或血清中之HBsAg蛋白水準或HBcrAg蛋白水準；並且隨後若該HBsAg蛋白水準或該HBcrAg蛋白水準大於100 IU/ml、200 IU/ml、300 IU/ml、400 IU/ml、500 IU/ml、600 IU/ml、700 IU/ml、1800 IU/ml、900 IU/ml或1000 IU/ml，則向該個體投與第二劑量。

在一些實施例中，該第一劑量後至少或約1個月、3個月或6個月投與該第二劑量。

在一些態樣，提供了本文所述之嚮導RNA或本文所述之組合物在製備用於實施本文所述之方法中任一者的藥物中之用途。

在一些態樣，本文提供了一種包含HBV基因體之肝細胞，其中該HBV基因體包含與以下中之至少20個連續核苷酸具有至少80%、85%、視情況90%或95%一致性、視情況100%一致性之序列：SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460，例如SEQ ID NO: 1之核苷酸57-76、66-85、126-145、153-173、153-172、154-173、240-269、240-259、245-264、248-267、250-269、269-288、356-392、356-375、361-380、364-383、373-392、423-445、423-442、426-445、574-593、608-627、621-655、621-640、622-641、629-648、629-648、630-649、635-654、636-655、686-705、694-716、694-713、695-714、697-716、713-732、725-744、1597-1616、1817-1836、1845-1864、1867-1886、1880-1903、1880-1899、1883-1902、1884-1903、2072-2094、2072-2091、2073-2092、2075-2094、2299-2318、2348-2367、2634-2653、2867-2887、2867-2886、2868-2887、2891-2910、2956-2975或2982-3001；視情況核苷酸153-173、153-172、154-173或250-269；其中該HBV基因體包含該HBV基因體中與以下中之至少20個連續核苷酸具有至少80%、85%、視情況90%或95%一致性或者100%一致性之序列內之遺傳修飾：SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460，例如SEQ ID NO: 1之核苷酸57-76、66-85、126-145、153-173、153-172、154-173、240-269、240-259、245-264、248-267、250-269、269-288、356-392、356-375、361-380、364-383、373-392、423-445、423-442、426-445、574-593、608-627、621-655、621-640、622-641、629-648、629-648、630-649、635-654、636-655、686-705、694-716、694-713、695-714、697-716、713-732、725-744、1597-1616、1817-1836、1845-1864、1867-1886、1880-1903、1880-1899、1883-1902、1884-1903、2072-2094、2072-2091、2073-2092、2075-2094、2299-2318、2348-2367、2634-2653、2867-2887、2867-2886、2868-2887、2891-2910、2956-2975或2982-3001；視情況核苷酸153-173、153-172、154-173或250-269。

在一些實施例中，該遺傳修飾包含生成終止密碼子或破壞轉錄起始之突變。

在一些實施例中，該遺傳修飾包含插入缺失。

在一些實施例中，該HBV基因體包含與SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460；例如SEQ ID NO: 1之核苷酸57-76、66-85、126-145、153-173、153-172、154-173、240-269、240-259、245-264、248-267、250-269、269-288、356-392、356-375、361-380、364-383、373-392、423-445、423-442、426-445、574-593、608-627、621-655、621-640、622-641、629-648、629-648、630-649、635-654、636-655、686-705、694-716、694-713、695-714、697-716、713-732、725-744、1597-1616、1817-1836、1845-1864、1867-1886、1880-1903、1880-1899、1883-1902、1884-1903、2072-2094、2072-2091、2073-2092、2075-2094、2299-2318、2348-2367、2634-2653、2867-2887、2867-2886、2868-2887、2891-2910、2956-2975或2982-3001；視情況核苷酸153-173、153-172、154-173或250-269中之至少20個連續核苷酸具有至少90%、95%一致性或100%一致性之序列。

在一些實施例中，該肝細胞包含該HBV基因體中與以下中之至少20個連續核苷酸具有至少80%、85%、視情況90%或95%一致性或者100%一致性之序列內之第二遺傳修飾：SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460，例如SEQ ID NO: 1之核苷酸57-76、66-85、126-145、153-173、153-172、154-173、240-269、240-259、245-264、248-267、250-269、269-288、356-392、356-375、361-380、364-383、373-392、423-445、423-442、426-445、574-593、608-627、621-655、621-640、622-641、629-648、629-648、630-649、635-654、636-655、686-705、694-716、694-713、695-714、697-716、713-732、725-744、1597-1616、1817-1836、1845-1864、1867-1886、1880-1903、1880-1899、1883-1902、1884-1903、2072-2094、2072-2091、2073-2092、2075-2094、2299-2318、2348-2367、2634-2653、2867-2887、2867-2886、2868-2887、2891-2910、2956-2975或2982-3001；視情況核苷酸153-173、153-172、154-173或250-269。

在一些實施例中，該遺傳修飾在該HBV基因體內與表1A中之靶位點，視情況具有選自S1-S6、S8、S11、S16、S17、S19、S21-25、S28-S30、S32、S39、S47、S49、S50、S52、S53、S57-58、S61-S64、S67、S70、S71、S74、S77、S78、S80-S87、S80、S90-S91及S93，視情況S1、S5或S6之HBV編號之gRNA的靶位點中之至少20個連續核苷酸具有至少80%、85%、較佳90%或95%一致性或者100%一致性之序列內。

在一些實施例中，該HBV基因體包含與以下中之至少24個連續核苷酸具有100%一致性或者至少80%、85%、較佳90%或95%一致性或100%一致性之序列：SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460，例如SEQ ID NO: 1之核苷酸35-58、146-169、153-176、216-239、330-356、330-353、333-356、342-365、447-470、666-689、713-736、740-763、755-778、1390-1413、1836-1859、2635-2658、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸146-169、153-176、330-356、330-353、333-356、447-470、713-736、740-763、755-778、1390-1413、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸447-470、330-353、755-778或713-736。

在一些實施例中，該HBV基因體包含與以下中之至少24個連續核苷酸具有至少90%或95%一致性；或者100%一致性之序列：SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460，例如SEQ ID NO: 1之核苷酸35-58、146-169、153-176、216-239、330-356、330-353、333-356、342-365、447-470、666-689、713-736、740-763、755-778、1390-1413、1836-1859、2635-2658、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸146-169、153-176、330-356、330-353、333-356、447-470、713-736、740-763、755-778、1390-1413、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸447-470、330-353、755-778或713-736。

在一些實施例中，該遺傳修飾在與以下中之至少24個連續核苷酸具有至少80%、85%、視情況90%或95%一致性或者100%一致性之序列內：表2A中之靶位點，視情況具有選自N7、N8、N11、N24、N25、N32、N37、N40、N42、N47、N51、N55、N75、N79、N84、N97或N98；視情況N7、N8、N11、N24、N32、N37、N40、N42、N47、N79或N84；視情況N7、N24、N32或N37之HBV編號之gRNA的靶位點；或者具有選自N24及N37；N7及N24；N7及N32；N7及N37；N7及N40；N24及N37；N24及N40；N37及N40；N24及N32；N32及N37；N24及N79；N24、N32及N79；N24、N32及N37；以及N24、N32及N40；視情況N24及N37；N7及N32；N7及N37之HBV編號之組合的gRNA之靶位點。

在一些實施例中，將該HBV基因體整合至肝細胞基因體中。

在一些實施例中，該HBV基因體為cccDNA。

在一些態樣，本文提供了一種修飾HBV基因體之核酸序列之方法，該方法包含使HBV感染肝細胞與本文所述之嚮導RNA及RNA指導的DNA結合劑或編碼RNA指導的DNA結合劑之核酸，或者本文所述之組合物接觸。

在一些實施例中，該方法在活體內、在活體外或離體進行。

在一些實施例中，該細胞在感染HBV之個體中。

在一些態樣，本文提供了一種治療個體之HBV感染之方法，該方法包含向該個體投與本文所述之嚮導RNA及RNA指導的DNA結合劑或編碼RNA指導的DNA結合劑之核酸，或者本文所述之組合物。

在一些實施例中，該HBV基因體之核酸序列編碼HBV蛋白。

在一些實施例中，該HBV蛋白為HBsAg或HBcrAg蛋白。

在一些實施例中，該方法進一步包含測定個體血液或血清樣品中之HBsAg蛋白水準或HBcrAg蛋白水準。

在一些實施例中，本文所述之方法進一步包含向該個體投與免疫刺激劑。

相關申請案

本申請案主張2023年3月6日提出申請之美國臨時專利申請案序列第63/450,307號的優先權權益，該申請案特此以引用之方式整體併入。序列表

本申請案含有序列表，其以XML格式以電子方式提交，且特此以引用之方式整體併入。該XML副本創建於2024年2月26日，名為ILH-02825_SL.xml且大小為6,286,863位元組。

現將詳細參考本揭示案之某些實施例，在所附圖式中說明該等實施例之實例。儘管本教導結合各個實施例來進行描述，但並不意欲將本教導限於彼等實施例。相反，本教導涵蓋各種替代、修改及等效物，如熟習此項技術者應理解。

在詳細描述本教導之前，應理解本揭示案不限於特定組合物或過程步驟，因而可發生變化。應注意，除非上下文另有清楚說明，否則如在本說明書及所附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(個/種)(a/an)」及「該(the)」包括複數個指示物。因此，舉例而言，提及「一種結合物」包括複數種結合物並且提及「一個細胞」包括複數個細胞(例如細胞群體)及諸如此類。

數值範圍包括定義範圍之數字。考慮到有效數位及與量測相關之誤差，量測值及可量測值應理解為近似值。

「包含(comprise)」、「包含(comprises)」、「包含(comprising)」、「含有(contain)」、「含有(contains)」、「含有(containing)」、「包括(include)」、「包括(includes)」及「包括(including)」之使用不意欲具有限制性。應當理解，前述一般描述及詳細描述都只為示範性及解釋性的，而不為對教示之限制。除非在說明書中特別註明，否則說明書中列舉「包含」各種組件之實施例亦被認為係「由所列舉組件組成」或「基本上由所列舉組件組成」；說明書中列舉「由各種組件組成」之實施例亦被認為係「包含」所列舉組件或「基本上由所列舉組件組成」；並且說明書中列舉「基本上由各種組件組成」之實施例亦被認為係「由所列舉組件組成」或「包含」所列舉組件(此互換性不適用於此等術語在申請專利範圍中之使用)。

除非上下文另有明確說明，否則術語「或」在說明書中之使用具有包容性，亦即等同於「及/或」。

術語「約」當在清單前使用時，限定清單中之各成員。術語「約」應理解為涵蓋此項技術內的容許變化或誤差，例如，較之平均值或用於進行量測之方法的靈敏度有2個標準偏差。當「約」出現在系列中的第一個值之前時，其可理解為限定系列中的各值。

範圍應理解為包括範圍末尾之數值以及其間的所有邏輯值。舉例而言，5-10個核苷酸應理解為5、6、7、8、9或10個核苷酸，而5-10%應理解為包含5%及10%以及其間所有可能的值。

20個核苷酸之序列中的至少17個核苷酸應理解為包括所提供序列中的17、18、19或20個核苷酸，即使沒有特別提供，亦提供上限，如將被清楚地理解一般。類似地，至多3個核苷酸將理解為涵蓋0、1、2或3個核苷酸，即使沒有特別提供，亦提供下限。當「至少」、「至多」或其他類似語言修飾數字時，可理解為修飾系列中的各數字。

如本文所用，「不超過」或「小於」被理解為與片語相鄰之值及自上下文來看係合乎邏輯的邏輯較低值或整數直至零。例如，「不多於2個核苷酸鹼基對」之雙鏈區具有2、1或0個核苷酸鹼基對。當「不多於」或「小於」出現在一系列數字或範圍之前時，應理解該系列或範圍中之各數字均被修飾。

如本文所用，範圍包括上限及下限。

若申請案中之序列與指定登錄號或登錄號中之位置發生衝突，則以申請案中之序列為準。

如本文所用，「偵測分析物」及其類似表述應理解為執行其中可偵測到分析物(若存在)之檢定，其中分析物以高於檢定之偵測水準之量存在。

如本文所用，應理解當值之最大量由100% (例如，100%抑制或100%囊封)表示時，該值受偵測方法之限制。舉例而言，100%抑制應理解為抑制至低於檢定之偵測水準的水準，且100%囊封應理解為在囊泡外偵測不到旨在囊封之材料。

本文所用之章節標題僅用於組織目的，且不應解釋為以任何方式限制所需標的物。若以引用之方式併入之任何材料與本說明書中定義之任何術語或本說明書之任何其他明確內容相矛盾，則以本說明書為準。 I. 定義

除非另有說明，否則如本文所用之以下術語及片語意欲具有以下含義：「多核苷酸」及「核酸」在本文中用於指包含核苷或核苷類似物之多聚體化合物，其具有沿主鏈連接在一起之含氮雜環鹼基或鹼基類似物，包括習知RNA、DNA、混合RNA-DNA及作為其類似物之聚合物。核酸「主鏈」可由多種鍵聯構成，包括以下一或多者：糖-磷酸二酯鍵聯、肽-核酸鍵(「肽核酸」或PNA；PCT第WO 95/32305號)、硫代磷酸酯鍵聯、甲基膦酸酯鍵聯或其組合。核酸之糖部分可為核糖、去氧核糖或具有取代(例如，2’甲氧基、2’鹵化物或2’-O-(2-甲氧基乙基) (2’-O-moe)取代)之類似化合物。RNA可包含一或多個去氧核糖核苷酸，例如作為修飾，並且類似地，DNA可包含一或多個核糖核苷酸。含氮鹼基可為習知鹼基(A、G、C、T、U)、其類似物(例如，修飾之尿苷，如5-甲氧基尿苷、假尿苷或N1-甲基假尿苷等)；肌苷；嘌呤或嘧啶之衍生物(例如，N ⁴-甲基去氧鳥苷、去氮雜-或氮雜-嘌呤、去氮雜-或氮雜-嘧啶、在5或6位具有取代基之嘧啶鹼基(例如，5-甲基胞嘧啶)、在2、6或8位具有取代基之嘌呤鹼基、2-胺基-6-甲基胺基嘌呤、O ⁶-甲基鳥嘌呤、4-硫代嘧啶、4-胺基嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶及O ⁴-烷基嘧啶；美國專利第5,378,825號及PCT第WO 93/13121號)。對於一般性論述，參見 The Biochemistry of the Nucleic Acids5-36, Adams等人編,第11版, 1992)。核酸可包括一或多個「無鹼基」殘基，其中主鏈不包括針對聚合物位置之含氮鹼基(美國專利第5,585,481號)。核酸可僅包含習知RNA或DNA糖、鹼基及鍵聯，或可包括習知組分及取代兩者(例如，具有2'甲氧基取代基之習知核苷，或含有習知核苷及一或多種核苷類似物之聚合物)。核酸包括「鎖核酸」(LNA)，其為含有一或多個LNA核苷酸單體之類似物，該一或多個LNA核苷酸單體具有模擬糖構形的鎖定於RNA中之雙環呋喃糖單元，其增強針對互補RNA及DNA序列之雜交親和力(Vester及Wengel, 2004, Biochemistry43(42):13233-41)。核酸包括「解鎖核酸」，其使得能夠調節熱力學穩定性且亦提供核酸酶穩定性。RNA及DNA具有不同的糖部分，且可因RNA中存在尿嘧啶或其類似物且DNA中存在胸腺嘧啶或其類似物而不同。

如本文所用，「多肽」係指包含胺基酸殘基之多聚體化合物，其可採用三維構形。多肽包括但不限於酶、酶前驅蛋白、調節蛋白、結構蛋白、受體、核酸結合蛋白、抗體等。多肽可能但未必包含轉譯後修飾、非天然胺基酸、輔基及其類似物。

「嚮導RNA」、「gRNA」及簡稱「嚮導」在本文中可互換使用，係指例如單嚮導RNA或crRNA及trRNA之組合(亦稱為tracrRNA)。crRNA及trRNA可締合為單一RNA股(單嚮導RNA，sgRNA)，或例如，在兩個分開RNA股(雙嚮導RNA，dgRNA)中。「嚮導RNA」或「gRNA」係指每一類型。trRNA可為天然存在之序列或具有修飾或變化之trRNA序列。

如本文所用，「嚮導序列」係指嚮導RNA內之序列，該序列與靶序列互補並起到藉由RNA指導的DNA結合劑將嚮導RNA引導至靶序列以進行結合或修飾(例如裂解)的作用。

「嚮導序列」亦可稱為「靶向序列」或「間隔子序列」。嚮導序列之長度可以為約20個核苷酸，例如，在釀膿鏈球菌(亦即，Spy Cas9)的情況下，或者嚮導序列之長度可以為約24個核苷酸，例如，在腦膜炎雙球菌( Neisseria meningitidis) (Nme Cas9)，以及相關之Cas9同源物/異種同源物的情況下。亦可以使用更短或更長的序列。

舉例而言，Spy Cas9嚮導之長度可以為16、17、較佳18、19或20個核苷酸，使得在一些實施例中，Spy Cas9靶向序列包含選自SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、1-843、1-1205、2314-3188、1381-1846、1821-2460，例如核苷酸153-173、245-269、153-172、154-173、245-264、248-267、250-269、364-383、621-665、694-716、1176-1216、1187-1216、1383-1418、1398-1418、1424-1448、1701-1724、2296-2318、2867-2894、2901-2928、2976-3001、621-640、629-648、636-655、694-713、695-714、697-716、796-815、1191-1210、1197-1216、1383-1402、1398-1417、1399-1418、1424-1443、1429-1448、1529-1548、1540-1559、1569-1588、1605-1624、1701-1720、1705-1724、1867-1886、1880-1899、1883-1902、2072-2091、2296-2315、2299-2318、2867-2886、2868-2887、2875-2894、2875-2894、2901-2920、2902-2921、2909-2928、2948-2967、2956-2975、2976-2995、2982-3001、2982-3001或3048-3067，視情況核苷酸153-173、245-269、153-172、154-173、245-264、248-267、250-269或364-383之序列或其反向互補序列中之16、17、18、19或20個連續核苷酸；例如，表1A中提供之嚮導RNA之靶向序列中的16、17、18、19或20個連續核苷酸。

舉例而言，Spy Cas9嚮導之長度可以為16、17、較佳18、19或20個核苷酸，使得在一些實施例中，Spy Cas9靶向序列包含選自SEQ ID NO: 1之核苷酸57-76、66-85、126-145、153-173、153-172、154-173、240-269、240-259、245-264、248-267、250-269、269-288、356-392、356-375、361-380、364-383、373-392、423-445、423-442、426-445、574-593、608-627、621-655、621-640、622-641、629-648、629-648、630-649、635-654、636-655、686-705、694-716、694-713、695-714、697-716、713-732、725-744、1597-1616、1817-1836、1845-1864、1867-1886、1880-1903、1880-1899、1883-1902、1884-1903、2072-2094、2072-2091、2073-2092、2075-2094、2299-2318、2348-2367、2634-2653、2867-2887、2867-2886、2868-2887、2891-2910、2956-2975或2982-3001，視情況核苷酸153-173、153-172、154-173或250-269之序列或其反向互補序列中之16、17、18、19或20個連續核苷酸；例如，表1A中提供之嚮導RNA之靶向序列，例如選自S1-S6、S8、S11、S16、S17、S19、S21-25、S28-S30、S32、S39、S47、S49、S50、S52、S53、S57-58、S61-S64、S67、S70、S71、S74、S77、S78、S80-S87、S80、S90-S91及S93，視情況S1、S5或S6之嚮導RNA之靶向位點中的16、17、18、19或20個連續核苷酸。 表1A：HBV Spy-Cas9嚮導序列及序列坐 標

嚮導編號	嚮導靶向序列	SEQ ID NO	SEQ ID NO: 1 中之靶位點	HBV 編號
G028550	CACCACGAGUCUAGACUCUG	2	250-269	S1
G028551	UACCGCAGAGUCUAGACUCG	3	245-264	S2
G028552	CGCAGAGUCUAGACUCGUGG	4	248-267	S3
G028553	CAGCGAUAACCAGGACAAGU	5	364-383	S4
G028554	UGUUCUCCAUGUUCAGCGCA	6	153-172	S5
G028555	AUGUUCUCCAUGUUCAGCGC	7	154-173	S6
G030414	GAGGUGAAGCGAAGUGCACA	8	1586-1605	S7
G030415	AGAAGAUGAGGCAUAGCAGC	9	423-442	S8
G030416	GGGGCGCACCUCUCUUUACG	10	1529-1548	S9
G030417	GUAAAGAGAGGUGCGCCCCG	11	1528-1547	S10
G030418	UACUAGUGCCAUUUGUUCAG	12	686-705	S11
G030419	GCGAGGGAGUUCUUCUUCUA	13	2376-2395	S12
G030420	CGAGGGAGUUCUUCUUCUAG	14	2375-2394	S13
G030421	GGCGAGGGAGUUCUUCUUCU	15	2377-2396	S14
G030422	AGAGAGGUGCGCCCCGUGGU	16	1524-1543	S15
G030423	CCUACGAACCACUGAACAAA	17	697-716	S16
G030424	GGACUUCUCUCAAUUUUCUA	18	269-288	S17
G030425	UUUGCUGACGCAACCCCCAC	19	1191-1210	S18
G030426	CCAUUUGUUCAGUGGUUCGU	20	694-713	S19
G030427	GGGUUGCGUCAGCAAACACU	21	1187-1206	S20
G030428	CAUUUGUUCAGUGGUUCGUA	22	695-714	S21
G030429	AAGCCACCCAAGGCACAGCU	23	1883-1902	S22
G030430	CCACCCAAGGCACAGCUUGG	24	1880-1899	S23
G030431	GCUGUGCCUUGGGUGGCUUU	25	1884-1903	S24
G030432	AGCUUGGAGGCUUGAACAGU	26	1867-1886	S25
G030433	AGGAGGCUGUAGGCAUAAAU	27	1783-1802	S26
G030434	GGGUGGAGCCCUCAGGCUCA	28	3048-3067	S27
G030435	GUGAAAAAGUUGCAUGGUGC	29	1817-1836	S28
G030436	CUUCACCUCUGCACGUCGCA	30	1597-1616	S29
G030437	GCUAUGCCUCAUCUUCUUGU	31	426-445	S30
G030438	CCUGAACUGGAGCCACCAGC	32	67-86	S31
G030439	AGACACAUCCAGCGAUAACC	33	373-392	S32
G030440	UUUGAAGUAUGCCUCAAGGU	34	1701-1720	S33
G030441	AGUCUUUGAAGUAUGCCUCA	35	1705-1724	S34
G030442	GCUGCCAACUGGAUCCUGCG	36	1398-1417	S35
G030443	CUGCCAACUGGAUCCUGCGC	37	1399-1418	S36
G030444	AGGUUGGGGACUGCGAAUUU	38	315-334	S37
G030445	GAAGCGAAGUGCACACGGUC	39	1581-1600	S38
G030446	UAGGGCUUUCCCCCACUGUU	40	713-732	S39
G030447	CGCCGACGGGACGUAAACAA	41	1429-1448	S40
G030448	GUCCUUUGUUUACGUCCCGU	42	1424-1443	S41
G030449	GCAAACACUUGGCACAGACC	43	1176-1195	S42
G030450	ACACGGUCCGGCAGAUGAGA	44	1569-1588	S43
G030451	GGUCUCCAUGCGACGUGCAG	45	1605-1624	S44
G030452	GCAGCACAGCCUAGCAGCCA	46	1383-1402	S45
G030453	UGCUAGGCUGUGCUGCCAAC	47	1387-1406	S46
G030454	GACGCAACCCCCACUGGCUG	48	1197-1216	S47
G030455	CGGGGAGUCCGCGUAAAGAG	49	1540-1559	S48
G030456	AACUGAAAGCCAAACAGUGG	50	725-744	S49
G030457	CUAGACUCUGCGGUAUUGUG	51	240-259	S50
G030458	AACAUGGAGAACAUCACAUC	52	160-179	S51
G030459	CUGUUGUUAGACGACGAGGC	53	2348-2367	S52
G030460	GACAUGAACAAGAGAUGAUU	54	1845-1864	S53
G030461	AUUGGUAACAGCGGUAAAAA	55	796-815	S54
G030462	AAUUGGUAACAGCGGUAAAA	56	797-816	S55
G030463	UUGGGAUUGAAGUCCCAAUC	57	2946-2965	S56
G030464	GGGCUUUCGGAAAAUUCCUA	58	629-648	S57
G030465	GGCUUUCGGAAAAUUCCUAU	59	630-649	S58
G030466	GAAUCCCAGAGGAUUGCUGG	60	2875-2894	S59
G030467	UUGGGACUUCAAUCCCAACA	61	2948-2967	S60
G030468	CUGAACUGGAGCCACCAGCA	62	66-85	S61
G030469	CGAUAACCAGGACAAGUUGG	63	361-380	S62
G030470	UCGGAAAAUUCCUAUGGGAG	64	635-654	S63
G030471	CGGAAAAUUCCUAUGGGAGU	65	636-655	S64
G030472	GCUGGAUCCAACUGGUGGUC	66	2901-2920	S65
G030473	UGGUCGGGAAAGAAUCCCAG	67	2886-2905	S66
G030474	GUCAAUCUUCUCGAGGAUUG	68	126-145	S67
G030475	UGGCCAGACGCCAACAAGGU	69	2976-2995	S68
G030476	UGAAGGCUGGAUCCAACUGG	70	2906-2925	S69
G030477	AUUCUUUCCCGACCACCAGU	71	2891-2910	S70
G030478	CUUUCCACCAGCAAUCCUCU	72	2868-2887	S71
G030479	AAGGUAGGAGCUGGAGCAUU	73	2991-3010	S72
G030480	CUCUGAAGGCUGGAUCCAAC	74	2909-2928	S73
G030481	UCUUUCCACCAGCAAUCCUC	75	2867-2886	S74
G030482	GGCUGGAUCCAACUGGUGGU	76	2902-2921	S75
G030483	AGGUAGGAGCUGGAGCAUUC	77	2992-3011	S76
G030484	GACGCCAACAAGGUAGGAGC	78	2982-3001	S77
G030485	AGCCACCAGCAGGGAAAUAC	79	57-76	S78
G030486	GCUCCUACCUUGUUGGCGUC	80	2982-3001	S79
G030487	UCAAUCCCAACAAGGACACC	81	2956-2975	S80
G030488	GGAUGAUGGGAUGGGAAUAC	82	608-627	S81
G030489	UGCUGUACCAAACCUUCGGA	83	574-593	S82
G030490	ACCAGGACAAGUUGGAGGAC	84	356-375	S83
G030491	UAGGAAUUUUCCGAAAGCCC	85	629-648	S84
G030492	UUCCGAAAGCCCAGGAUGAU	86	621-640	S85
G030493	UUUCCGAAAGCCCAGGAUGA	87	622-641	S86
G030494	GCAUUUGGUGGUCUAUAAGC	88	2299-2318	S87
G030495	UUUGGUGGUCUAUAAGCUGG	89	2296-2315	S88
G030496	UCAGGCAAGCAAUUCUUUGC	90	2072-2091	S89
G030497	CAGGCAAGCAAUUCUUUGCU	91	2073-2092	S90
G030498	UGCAAUUGAUUAUGCCUGCU	92	2634-2653	S91
G030499	GCAAGCAAUUCUUUGCUGGG	93	2076-2095	S92
G030500	GGCAAGCAAUUCUUUGCUGG	94	2075-2094	S93

如表1B所示，與Spy-Cas9一起使用的gRNA之嚮導靶向序列顯示出對不同HBV株的顯著交叉反應。因此，單一gRNA可能適合Spy-Cas9介導的多於一種HBV株之基因體編輯。然而，若感染未知HBV株，可以投與多種gRNA以增加未知HBV株基因體經編輯的可能性。 表1B ： Spy-Cas9 嚮導與HBV株之交叉反應

	亞型內完美匹配(20mer)百分比
SEQ ID NO	嚮導ID	嚮導靶向序列	靶HBV基因	CFD總和	A	B	C	D	E	F	G	H	RF
2	G028550	CACCACGAGUCUAGACUCUG	S.mrna\|P.mrna	15.90	97.6%	97.7%	91.6%	90.9%	98.4%	95.6%	100.0%	61.5%	96.5%
3	G028551	UACCGCAGAGUCUAGACUCG	S.mrna\|P.mrna	3.94	94.5%	3.9%	1.7%	90.0%	97.6%	0.9%	94.7%	0.0%	55.2%
4	G028552	CGCAGAGUCUAGACUCGUGG	S.mrna\|P.mrna	8.28	94.6%	4.0%	1.7%	90.0%	98.4%	0.9%	94.7%	0.0%	55.2%
5	G028553	CAGCGAUAACCAGGACAAGU	S.mrna\|P.mrna	11.03	1.6%	4.8%	0.8%	88.0%	0.0%	0.4%	0.0%	0.0%	37.1%
6	G028554	UGUUCUCCAUGUUCAGCGCA	S.mrna\|P.mrna	16.55	2.6%	0.0%	0.0%	77.2%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	25.5%
7	G028555	AUGUUCUCCAUGUUCAGCGC	S.mrna\|P.mrna	9.50	2.6%	0.0%	0.0%	68.3%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	23.9%
8	G030414	GAGGUGAAGCGAAGUGCACA	X.mrna	28.76	98.2%	98.5%	98.4%	96.8%	97.6%	99.1%	94.7%	96.2%	95.6%
9	G030415	AGAAGAUGAGGCAUAGCAGC	S.mrna\|P.mrna	27.84	99.1%	97.4%	97.5%	96.0%	99.6%	99.1%	100.0%	96.2%	98.3%
10	G030416	GGGGCGCACCUCUCUUUACG	X.mrna	4.54	99.0%	95.3%	94.4%	98.2%	95.2%	0.4%	97.4%	0.0%	96.0%
11	G030417	GUAAAGAGAGGUGCGCCCCG	X.mrna	7.61	98.9%	93.1%	93.7%	98.2%	95.6%	0.4%	97.4%	0.0%	94.5%
12	G030418	UACUAGUGCCAUUUGUUCAG	S.mrna\|P.mrna	35.90	97.5%	94.6%	93.5%	97.6%	97.6%	0.9%	97.4%	3.8%	91.1%
13	G030419	GCGAGGGAGUUCUUCUUCUA	P.mrna\|C.mrna	9.31	96.3%	96.2%	97.2%	91.2%	88.8%	52.4%	5.3%	96.2%	92.4%
14	G030420	CGAGGGAGUUCUUCUUCUAG	P.mrna\|C.mrna	16.42	96.1%	96.3%	97.5%	90.4%	89.2%	52.4%	5.3%	96.2%	91.9%
15	G030421	GGCGAGGGAGUUCUUCUUCU	P.mrna\|C.mrna	28.72	96.2%	95.7%	96.9%	90.2%	88.8%	52.0%	5.3%	96.2%	91.9%
16	G030422	AGAGAGGUGCGCCCCGUGGU	X.mrna	8.67	97.9%	90.0%	91.5%	97.4%	92.0%	0.4%	92.1%	0.0%	86.8%
17	G030423	CCUACGAACCACUGAACAAA	S.mrna\|P.mrna	17.80	96.9%	97.9%	83.8%	96.7%	0.0%	0.0%	100.0%	0.0%	89.7%
18	G030424	GGACUUCUCUCAAUUUUCUA	S.mrna\|P.mrna	30.53	95.6%	87.4%	96.0%	93.9%	98.4%	96.5%	100.0%	96.2%	97.5%
19	G030425	UUUGCUGACGCAACCCCCAC	P.mrna	6.50	93.7%	96.7%	91.7%	90.7%	3.2%	97.8%	97.4%	100.0%	80.3%
20	G030426	CCAUUUGUUCAGUGGUUCGU	S.mrna\|P.mrna	18.78	96.1%	95.2%	83.7%	96.7%	4.8%	0.0%	100.0%	0.0%	89.8%
21	G030427	GGGUUGCGUCAGCAAACACU	P.mrna	7.25	93.5%	96.5%	91.0%	90.6%	3.2%	97.8%	97.4%	100.0%	79.9%
22	G030428	CAUUUGUUCAGUGGUUCGUA	S.mrna\|P.mrna	17.28	96.2%	94.8%	83.7%	96.4%	0.0%	0.0%	100.0%	0.0%	89.1%
23	G030429	AAGCCACCCAAGGCACAGCU	C.mrna	29.31	74.8%	98.1%	97.4%	99.0%	97.6%	99.1%	100.0%	100.0%	96.6%
24	G030430	CCACCCAAGGCACAGCUUGG	C.mrna	31.47	74.8%	97.6%	97.7%	98.6%	97.6%	99.1%	100.0%	100.0%	96.5%
25	G030431	GCUGUGCCUUGGGUGGCUUU	C.mrna	28.67	75.1%	98.2%	96.0%	99.1%	99.2%	98.7%	100.0%	100.0%	96.7%
26	G030432	AGCUUGGAGGCUUGAACAGU	C.mrna	14.50	76.3%	93.3%	94.7%	96.1%	96.4%	98.7%	100.0%	100.0%	95.6%
27	G030433	AGGAGGCUGUAGGCAUAAAU	X.mrna	21.03	84.4%	93.6%	82.5%	96.6%	98.4%	97.4%	94.7%	100.0%	91.8%
28	G030434	GGGUGGAGCCCUCAGGCUCA	P.mrna	33.42	97.5%	75.9%	86.9%	92.0%	92.4%	0.0%	5.3%	0.0%	81.6%
29	G030435	GUGAAAAAGUUGCAUGGUGC	X.mrna\|C.mrna	21.26	70.0%	90.8%	96.6%	90.6%	93.2%	93.4%	36.8%	88.5%	88.5%
30	G030436	CUUCACCUCUGCACGUCGCA	X.mrna	7.81	0.4%	97.6%	96.9%	94.8%	96.0%	96.5%	5.3%	92.3%	90.4%
31	G030437	GCUAUGCCUCAUCUUCUUGU	S.mrna\|P.mrna	25.09	1.9%	97.4%	94.8%	95.5%	98.8%	99.1%	100.0%	96.2%	95.9%
32	G030438	CCUGAACUGGAGCCACCAGC	S.mrna\|P.mrna	24.62	97.0%	95.7%	4.2%	92.3%	0.0%	30.0%	94.7%	0.0%	53.4%
33	G030439	AGACACAUCCAGCGAUAACC	S.mrna\|P.mrna	7.79	95.2%	86.0%	18.4%	86.8%	3.6%	0.4%	0.0%	0.0%	45.0%
34	G030440	UUUGAAGUAUGCCUCAAGGU	X.mrna	16.45	1.6%	97.2%	87.1%	93.8%	91.2%	0.9%	5.3%	0.0%	85.3%
35	G030441	AGUCUUUGAAGUAUGCCUCA	X.mrna	29.54	1.6%	96.5%	87.0%	93.8%	92.0%	0.9%	5.3%	0.0%	85.1%
36	G030442	GCUGCCAACUGGAUCCUGCG	X.mrna	11.62	0.1%	93.0%	92.0%	88.9%	83.2%	42.3%	5.3%	100.0%	85.3%
37	G030443	CUGCCAACUGGAUCCUGCGC	X.mrna	16.17	0.3%	93.4%	90.5%	89.0%	0.0%	41.9%	5.3%	100.0%	83.3%
38	G030444	AGGUUGGGGACUGCGAAUUU	S.mrna\|P.mrna	6.14	99.0%	0.1%	76.3%	97.3%	79.2%	99.6%	100.0%	0.0%	89.0%
39	G030445	GAAGCGAAGUGCACACGGUC	X.mrna	4.52	9.4%	91.9%	76.6%	93.3%	87.2%	79.3%	94.7%	0.0%	70.4%
40	G030446	UAGGGCUUUCCCCCACUGUU	S.mrna\|P.mrna	11.32	95.5%	1.9%	81.5%	89.9%	0.0%	2.6%	2.6%	3.8%	80.9%
41	G030447	CGCCGACGGGACGUAAACAA	X.mrna	1.53	77.6%	88.4%	5.8%	90.8%	0.4%	91.6%	2.6%	7.7%	39.1%
42	G030448	GUCCUUUGUUUACGUCCCGU	X.mrna	3.98	77.6%	88.4%	5.8%	90.7%	0.4%	91.6%	2.6%	7.7%	39.0%
43	G030449	GCAAACACUUGGCACAGACC	P.mrna	21.49	91.8%	78.4%	0.5%	89.9%	95.2%	0.0%	100.0%	0.0%	35.4%
44	G030450	ACACGGUCCGGCAGAUGAGA	X.mrna	17.25	8.8%	74.8%	71.7%	94.2%	82.4%	76.7%	97.4%	0.0%	68.7%
45	G030451	GGUCUCCAUGCGACGUGCAG	X.mrna	5.08	0.4%	83.4%	72.8%	88.4%	91.2%	93.8%	2.6%	96.2%	74.1%
46	G030452	GCAGCACAGCCUAGCAGCCA	X.mrna	34.20	2.0%	95.4%	24.2%	95.6%	95.2%	0.0%	92.1%	65.4%	41.2%
47	G030453	UGCUAGGCUGUGCUGCCAAC	X.mrna	16.70	2.0%	94.3%	24.2%	95.6%	94.4%	0.0%	86.8%	65.4%	41.2%
48	G030454	GACGCAACCCCCACUGGCUG	P.mrna	14.92	82.4%	11.2%	14.3%	89.1%	3.2%	1.8%	2.6%	100.0%	35.7%
49	G030455	CGGGGAGUCCGCGUAAAGAG	X.mrna	4.63	6.3%	91.7%	1.5%	95.9%	0.0%	50.7%	2.6%	100.0%	34.4%
50	G030456	AACUGAAAGCCAAACAGUGG	S.mrna\|P.mrna	39.87	15.5%	2.2%	89.5%	84.9%	2.4%	0.0%	0.0%	0.0%	84.8%
51	G030457	CUAGACUCUGCGGUAUUGUG	S.mrna\|P.mrna	9.99	94.8%	4.1%	1.6%	89.1%	97.2%	0.9%	94.7%	0.0%	55.0%
52	G030458	AACAUGGAGAACAUCACAUC	S.mrna\|P.mrna	21.47	91.3%	3.2%	0.1%	92.6%	0.0%	18.1%	94.7%	100.0%	50.8%
53	G030459	CUGUUGUUAGACGACGAGGC	P.mrna\|C.mrna	3.58	0.0%	18.1%	85.2%	76.4%	2.8%	87.2%	5.3%	0.0%	70.1%
54	G030460	GACAUGAACAAGAGAUGAUU	C.mrna	36.10	27.8%	19.1%	10.2%	82.7%	97.2%	3.5%	94.7%	0.0%	34.3%
55	G030461	AUUGGUAACAGCGGUAAAAA	S.mrna\|P.mrna	23.46	1.4%	0.0%	8.3%	92.4%	0.0%	0.0%	18.4%	0.0%	49.6%
56	G030462	AAUUGGUAACAGCGGUAAAA	S.mrna\|P.mrna	15.27	1.4%	0.0%	8.3%	92.2%	0.0%	0.0%	18.4%	0.0%	49.6%
57	G030463	UUGGGAUUGAAGUCCCAAUC	P.mrna	12.60	0.0%	0.0%	1.0%	97.6%	0.0%	0.0%	94.7%	0.0%	30.5%
58	G030464	GGGCUUUCGGAAAAUUCCUA	S.mrna\|P.mrna	13.16	0.0%	0.1%	0.0%	98.3%	97.2%	0.0%	0.0%	0.0%	45.3%
59	G030465	GGCUUUCGGAAAAUUCCUAU	S.mrna\|P.mrna	11.04	0.0%	0.1%	0.0%	98.2%	97.2%	0.0%	0.0%	0.0%	45.3%
60	G030466	GAAUCCCAGAGGAUUGCUGG	P.mrna	37.87	0.0%	0.0%	0.0%	98.0%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	27.6%
61	G030467	UUGGGACUUCAAUCCCAACA	P.mrna	15.44	0.0%	0.0%	1.0%	96.4%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	29.2%
62	G030468	CUGAACUGGAGCCACCAGCA	S.mrna\|P.mrna	28.92	1.3%	1.5%	0.5%	92.5%	0.0%	11.0%	0.0%	0.0%	44.1%
63	G030469	CGAUAACCAGGACAAGUUGG	S.mrna\|P.mrna	12.30	1.6%	3.4%	0.8%	89.3%	0.0%	2.6%	0.0%	0.0%	40.4%
64	G030470	UCGGAAAAUUCCUAUGGGAG	S.mrna\|P.mrna	13.84	0.0%	0.1%	0.0%	94.8%	93.2%	0.0%	0.0%	0.0%	44.5%
65	G030471	CGGAAAAUUCCUAUGGGAGU	S.mrna\|P.mrna	12.68	0.0%	0.1%	0.0%	94.8%	93.2%	0.0%	0.0%	0.0%	44.5%
66	G030472	GCUGGAUCCAACUGGUGGUC	P.mrna	13.71	0.1%	0.0%	0.0%	93.8%	96.4%	0.0%	0.0%	0.0%	28.3%
67	G030473	UGGUCGGGAAAGAAUCCCAG	P.mrna	29.74	0.3%	0.1%	0.1%	93.4%	0.0%	0.0%	0.0%	3.8%	26.9%
68	G030474	GUCAAUCUUCUCGAGGAUUG	S.mrna\|P.mrna	9.26	0.1%	0.0%	1.5%	91.6%	96.4%	0.0%	0.0%	0.0%	42.1%
69	G030475	UGGCCAGACGCCAACAAGGU	P.mrna	6.41	0.0%	0.9%	0.0%	92.2%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	28.9%
70	G030476	UGAAGGCUGGAUCCAACUGG	P.mrna	18.31	0.0%	0.0%	0.0%	92.9%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	26.6%
71	G030477	AUUCUUUCCCGACCACCAGU	P.mrna	17.97	0.0%	0.1%	0.1%	92.3%	0.0%	0.0%	0.0%	3.8%	26.6%
72	G030478	CUUUCCACCAGCAAUCCUCU	P.mrna	25.95	0.0%	0.0%	0.0%	92.3%	0.0%	0.0%	92.1%	0.0%	28.6%
73	G030479	AAGGUAGGAGCUGGAGCAUU	P.mrna	34.54	0.0%	0.0%	0.0%	92.3%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	27.2%
74	G030480	CUCUGAAGGCUGGAUCCAAC	P.mrna	14.56	0.0%	0.0%	0.0%	92.0%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	27.5%
75	G030481	UCUUUCCACCAGCAAUCCUC	P.mrna	24.20	0.0%	0.0%	0.0%	91.4%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	27.5%
76	G030482	GGCUGGAUCCAACUGGUGGU	P.mrna	14.46	0.0%	0.0%	0.0%	90.8%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	26.3%
77	G030483	AGGUAGGAGCUGGAGCAUUC	P.mrna	23.53	0.0%	0.0%	0.7%	90.1%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	26.6%
78	G030484	GACGCCAACAAGGUAGGAGC	P.mrna	11.96	0.0%	0.0%	0.0%	89.8%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	27.9%
79	G030485	AGCCACCAGCAGGGAAAUAC	S.mrna\|P.mrna	25.16	1.8%	0.0%	0.2%	87.5%	1.2%	0.0%	0.0%	0.0%	36.0%
80	G030486	GCUCCUACCUUGUUGGCGUC	P.mrna	6.46	0.0%	0.0%	0.0%	89.5%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	27.9%
81	G030487	UCAAUCCCAACAAGGACACC	P.mrna	15.33	0.0%	0.0%	0.0%	86.4%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	26.9%
82	G030488	GGAUGAUGGGAUGGGAAUAC	S.mrna\|P.mrna	27.39	5.0%	1.4%	1.5%	76.8%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	43.2%
83	G030489	UGCUGUACCAAACCUUCGGA	S.mrna\|P.mrna	7.73	0.0%	0.0%	1.2%	83.4%	0.0%	0.4%	0.0%	92.3%	11.8%
84	G030490	ACCAGGACAAGUUGGAGGAC	S.mrna\|P.mrna	30.71	1.5%	0.0%	0.0%	83.0%	0.0%	2.6%	0.0%	0.0%	38.0%
85	G030491	UAGGAAUUUUCCGAAAGCCC	S.mrna\|P.mrna	17.15	0.0%	0.0%	0.0%	78.1%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	42.8%
86	G030492	UUCCGAAAGCCCAGGAUGAU	S.mrna\|P.mrna	13.37	0.0%	0.0%	0.0%	77.4%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	42.8%
87	G030493	UUUCCGAAAGCCCAGGAUGA	S.mrna\|P.mrna	26.01	0.0%	0.0%	0.0%	77.4%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	42.8%
88	G030494	GCAUUUGGUGGUCUAUAAGC	P.mrna\|C.mrna	11.76	1.5%	0.2%	1.3%	58.6%	78.8%	75.3%	94.7%	80.8%	21.4%
89	G030495	UUUGGUGGUCUAUAAGCUGG	P.mrna\|C.mrna	17.04	1.5%	0.0%	0.0%	57.8%	75.2%	19.8%	0.0%	0.0%	19.3%
90	G030496	UCAGGCAAGCAAUUCUUUGC	C.mrna	19.26	0.0%	0.0%	0.0%	55.7%	0.4%	0.0%	0.0%	0.0%	14.7%
91	G030497	CAGGCAAGCAAUUCUUUGCU	C.mrna	29.07	0.0%	0.0%	0.0%	55.6%	0.4%	0.0%	0.0%	0.0%	14.7%
92	G030498	UGCAAUUGAUUAUGCCUGCU	P.mrna	16.14	0.0%	0.0%	0.0%	53.2%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	11.6%
93	G030499	GCAAGCAAUUCUUUGCUGGG	C.mrna	33.35	0.0%	0.0%	0.0%	50.7%	0.4%	0.0%	0.0%	0.0%	8.9%
94	G030500	GGCAAGCAAUUCUUUGCUGG	C.mrna	27.62	0.0%	0.0%	0.0%	50.5%	0.4%	0.0%	0.0%	0.0%	8.9%

在一些實施例中，例如，靶向序列在開放閱讀框或基因體(例如病毒基因體)中，且與嚮導序列互補。在一些實施例中，靶向序列與其在基因體中之對應靶序列之間的互補性或一致性程度為至少80%、85%，較佳90%或95%，或者為100%。舉例而言，在一些實施例中，靶向序列包含序列，該序列與選自SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、1-843、1-1205、2314-3188、1381-1846、1821-2460，例如核苷酸57-76、66-85、126-145、153-173、153-172、154-173、240-269、240-259、245-264、248-267、250-269、269-288、356-392、356-375、361-380、364-383、373-392、423-445、423-442、426-445、574-593、608-627、621-655、621-640、622-641、629-648、629-648、630-649、635-654、636-655、686-705、694-716、694-713、695-714、697-716、713-732、725-744、1597-1616、1817-1836、1845-1864、1867-1886、1880-1903、1880-1899、1883-1902、1884-1903、2072-2094、2072-2091、2073-2092、2075-2094、2299-2318、2348-2367、2634-2653、2867-2887、2867-2886、2868-2887、2891-2910、2956-2975或2982-3001，視情況核苷酸153-173、153-172、154-173或250-269之序列中之20個連續核苷酸至少80%、85%、較佳90%或95%或者為100%一致或互補；例如與表1A中提供之嚮導RNA之靶向序列，例如選自S1-S6、S8、S11、S16、S17、S19、S21-25、S28-S30、S32、S39、S47、S49、S50、S52、S53、S57-58、S61-S64、S67、S70、S71、S74、S77、S78、S80-S87、S80、S90-S91及S93，視情況S1、S5或S6之嚮導RNA之靶向位點至少80%、85%、較佳90%或95%或者為100%一致。在一些實施例中，靶向序列及靶區域可與以下100%互補或一致：SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、1-843、1-1205、2314-3188、1381-1846、1821-2460，例如核苷酸57-76、66-85、126-145、153-173、153-172、154-173、240-269、240-259、245-264、248-267、250-269、269-288、356-392、356-375、361-380、364-383、373-392、423-445、423-442、426-445、574-593、608-627、621-655、621-640、622-641、629-648、629-648、630-649、635-654、636-655、686-705、694-716、694-713、695-714、697-716、713-732、725-744、1597-1616、1817-1836、1845-1864、1867-1886、1880-1903、1880-1899、1883-1902、1884-1903、2072-2094、2072-2091、2073-2092、2075-2094、2299-2318、2348-2367、2634-2653、2867-2887、2867-2886、2868-2887、2891-2910、2956-2975或2982-3001；視情況核苷酸153-173、153-172、154-173或250-269中之至少20個連續核苷酸，或者表1A中提供之嚮導RNA之靶向序列，例如具有S1-S6、S8、S11、S16、S17、S19、S21-25、S28-S30、S32、S39、S47、S49、S50、S52、S53、S57-58、S61-S64、S67、S70、S71、S74、S77、S78、S80-S87、S80、S90-S91或S93，視情況S1、S5或S6之HBV編號之嚮導RNA之靶位點。在其他實施例中，嚮導序列及靶區域可含有至少一個錯配，亦即一個核苷酸不一致或不互補，這取決於參考序列。舉例而言，嚮導序列及靶序列在嚮導與靶序列之間形成之雙鏈體內可含有1、2、3或4個錯配，其中靶序列之總長度為16、17、18、19、20個核苷酸或更多個核苷酸。在一些實施例中，嚮導序列及靶序列可含有1-4個錯配，其中嚮導序列包含至少20個核苷酸。在一些實施例中，嚮導序列及靶區域可含有1、2、3或4個錯配，其中嚮導序列包含20個核苷酸。換言之，嚮導序列及靶區域可形成具有16、17、18、19、20個鹼基對或更多個鹼基對之雙鏈體區域。在某些實施例中，雙鏈體區域可包括1、2、3或4個錯配，使得嚮導股與靶序列不完全互補。舉例而言，嚮導股與靶序列可在20個核苷酸區域內互補，包括2個錯配，使得嚮導序列與靶序列90%互補，從而提供20個鹼基對中之18個鹼基對之雙鏈體區域。更可容忍的錯配位置為此項技術中已知的，例如，PAM遠端錯配往往比PAM近端匹配更可容忍。其他位置的錯配容忍度(mismatch tolerance)為此項技術中已知的(參見例如，Sternberg等人，2015, Nature:527:110-113)

舉例而言，Nme嚮導靶向序列之長度可以為19、20、21、較佳22、23或24個核苷酸，使得在一些實施例中，Nme Cas9嚮導序列包含選自SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、1-843、1-1205、2314-3188、1381-1846、1821-2460，例如核苷酸35-58、146-169、153-176、216-239、330-356、330-353、333-356、342-365、447-470、666-689、713-736、740-763、755-778、1390-1413、1836-1859、2635-2658、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸146-169、153-176、330-356、330-353、333-356、447-470、713-736、740-763、755-778、1390-1413、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸447-470、330-353、755-778或713-736之序列或其反向互補序列中之至少22、23或24個連續核苷酸；例如，表2A中提供之嚮導RNA之靶向序列，例如來自具有N7、N8、N11、N24、N25、N32、N37、N40、N42、N47、N51、N55、N75、N79、N84、N97或N98；視情況N7、N8、N11、N24、N32、N37、N40、N42、N47、N79或N84；視情況N7、N24、N32或N37之HBV編號之嚮導的靶位點中之19、20、21、較佳22、23或24個連續核苷酸。 表2A：HBV Nme-Cas9嚮導序列及序列坐標

嚮導編號	嚮導靶向序列	SEQ ID NO	SEQ ID NO: 1 中之靶位點	HBV 編號
G027218	ACCGUGUGUCUUGGCCAAAAUUCG	95	298-321	N1
G027219	CCGUGUGUCUUGGCCAAAAUUCGC	96	299-322	N2
G027220	CGUGUGUCUUGGCCAAAAUUCGCA	97	300-323	N3
G027221	UGUCUUGGCCAAAAUUCGCAGUCC	98	304-327	N4
G027222	CUUGGCCAAAAUUCGCAGUCCCCA	99	307-330	N5
G027223	GUUCUUCUGGACUAUCAAGGUAUG	100	448-471	N6
G027224	GGUUCUUCUGGACUAUCAAGGUAU	101	447-470	N7
G027225	UCUCCAUGUUCAGCGCAGGGUCCC	102	146-169	N8
G027226	GAUGUUCUCCAUGUUCAGCGCAGG	103	151-174	N9
G027227	UGAUGUUCUCCAUGUUCAGCGCAG	104	152-175	N10
G027228	GUGAUGUUCUCCAUGUUCAGCGCA	105	153-176	N11
G030095	ACUGAACAAAUGGCACUAGUAAAC	106	683-706	N12
G030096	GAGGCGAGGGAGUUCUUCUUCUAG	107	2375-2398	N13
G030097	GGAUGUGUCUGCGGCGUUUUAUCA	108	383-406	N14
G030098	UUUGUUCAGUGGUUCGUAGGGCUU	109	697-720	N15
G030099	GGUUGCGUCAGCAAACACUUGGCA	110	1182-1205	N16
G030100	CCAUUUGUUCAGUGGUUCGUAGGG	111	694-717	N17
G030101	CAUUUGUUCAGUGGUUCGUAGGGC	112	695-718	N18
G030102	AAAACGCCGCAGACACAUCCAGCG	113	379-402	N19
G030103	CCAGCACCAUGCAACUUUUUCACC	114	1814-1837	N20
G030104	CUGAGCCUGAGGGCUCCACCCCAA	115	3045-3068	N21
G030105	AGGCUGUAGGCAUAAAUUGGUCUG	116	1786-1809	N22
G030106	CAGUCCCCAACCUCCAAUCACUCA	117	322-345	N23
G030107	AACCUCCAAUCACUCACCAACCUC	118	330-353	N24
G030108	AGGAUUCUUGUCAACAAGAAAAAC	119	216-239	N25
G030109	CUGUGCCAAGUGUUUGCUGACGCA	120	1179-1202	N26
G030110	UGUGAGGAUUCUUGUCAACAAGAA	121	220-243	N27
G030111	UUGUGAGGAUUCUUGUCAACAAGA	122	221-244	N28
G030112	UCUGUGCCAAGUGUUUGCUGACGC	123	1178-1201	N29
G030113	GUCCUACUGUUCAAGCCUCCAAGC	124	1862-1885	N30
G030114	CGAGGCAGGUCCCCUAGAAGAAGA	125	2362-2385	N31
G030115	ACAGACUUGGCCCCCAAUACCACA	126	755-778	N32
G030116	GGUCUGUGCCAAGUGUUUGCUGAC	127	1176-1199	N33
G030117	AUUGGAGGUUGGGGACUGCGAAUU	128	316-339	N34
G030118	UUCGCAGUCCCCAACCUCCAAUCA	129	318-341	N35
G030119	GCUGCCAACUGGAUCCUGCGCGGG	130	1398-1421	N36
G030120	GCCAAACAGUGGGGGAAAGCCCUA	131	713-736	N37
G030121	UGGGUGGCUUUGGGGCAUGGACAU	132	1893-1916	N38
G030122	UUGGGUGGCUUUGGGGCAUGGACA	133	1892-1915	N39
G030123	GGAUCCAGUUGGCAGCACAGCCUA	134	1390-1413	N40
G030124	GGCUGCUAGGCUGUGCUGCCAACU	135	1384-1407	N41
G030125	AAUACCACAUCAUCCAUAUAACUG	136	740-763	N42
G030126	UGCGGCGUUUUAUCAUCUUCCUCU	137	392-415	N43
G030127	GAGUCCAAGGAAUACUAACAUUGA	138	2451-2474	N44
G030128	AACUGAAAGCCAAACAGUGGGGGA	139	721-744	N45
G030129	UAACUGAAAGCCAAACAGUGGGGG	140	722-745	N46
G030130	CUCCAAUCACUCACCAACCUCCUG	141	333-356	N47
G030131	UCCCCAACCUCCAAUCACUCACCA	142	325-348	N48
G030132	ACGAGGCAGGUCCCCUAGAAGAAG	143	2361-2384	N49
G030133	GGUCCUAGGAAUCCUGAUGUGAUG	144	171-194	N50
G030134	CCGUUUCUCCUGGCUCAGUUUACU	145	666-689	N51
G030135	AAAAAGUUGCAUGGUGCUGGUGCG	146	1810-1833	N52
G030136	UGCGCACCAGCACCAUGCAACUUU	147	1808-1831	N53
G030137	UAGGCAUAAAUUGGUCUGCGCACC	148	1792-1815	N54
G030138	CCUCUGCCUAAUCAUCUCUUGUUC	149	1836-1859	N55
G030139	UCUUGUUCAUGUCCUACUGUUCAA	150	1852-1875	N56
G030140	AUCUCUUGUUCAUGUCCUACUGUU	151	1849-1872	N57
G030141	GGACGGAAAUUGCACCUGUAUUCC	152	591-614	N58
G030142	CGAAUUUUGGCCAAGACACACGGU	153	298-321	N59
G030143	CCAGCAAUCCUCUGGGAUUCUUUC	154	2875-2898	N60
G030144	GGAAAAUUCCUAUGGGAGUGGGCC	155	637-660	N61
G030145	CCCACUCCCAUAGGAAUUUUCCGA	156	635-658	N62
G030146	GCAAUCCUCUGGGAUUCUUUCCCG	157	2878-2901	N63
G030147	UGAACAUGGAGAACAUCACAUCAG	158	158-181	N64
G030148	UUCCACCAGCAAUCCUCUGGGAUU	159	2870-2893	N65
G030149	GGGAUUCUUUCCCGACCACCAGUU	160	2888-2911	N66
G030150	AGAGGAUUGCUGGUGGAAAGAUUC	161	2864-2887	N67
G030151	GAUUGGGACUUCAAUCCCAACAAG	162	2946-2969	N68
G030152	CUCCAGCUCCUACCUUGUUGGCGU	163	2983-3006	N69
G030153	CAGAGGAUUGCUGGUGGAAAGAUU	164	2865-2888	N70
G030154	UGGAUCCAACUGGUGGUCGGGAAA	165	2895-2918	N71
G030155	CCAGAGGAUUGCUGGUGGAAAGAU	166	2866-2889	N72
G030156	CAUGGGGCAGAAUCUUUCCACCAG	167	2855-2878	N73
G030157	GGAUCCAACUGGUGGUCGGGAAAG	168	2894-2917	N74
G030158	CUCACCAACCUCCUGUCCUCCAAC	169	342-365	N75
G030159	GGUGUCUUUCGGAGUGUGGAUUCG	170	2265-2288	N76
G030160	ACUGGAGCCACCAGCAGGGAAAUA	171	58-81	N77
G030161	UUCUUUCCCGACCACCAGUUGGAU	172	2892-2915	N78
G030162	GGACUUCAAUCCCAACAAGGACAC	173	2951-2974	N79
G030163	GCCAGGAGAAACGGGCUGAGGCCC	174	656-679	N80
G030164	AGCCAGGAGAAACGGGCUGAGGCC	175	657-680	N81
G030165	AACUGAGCCAGGAGAAACGGGCUG	176	662-685	N82
G030166	AAACUGAGCCAGGAGAAACGGGCU	177	663-686	N83
G030167	AAUCCCAACAAGGACACCUGGCCA	178	2958-2981	N84
G030168	AGGCCUUUCUGUGUAAACAAUACC	179	1120-1143	N85
G030169	UUCUGUGUAAACAAUACCUGAACC	180	1126-1149	N86
G030170	UCUGUGUAAACAAUACCUGAACCU	181	1127-1150	N87
G030171	AAACAAUACCUGAACCUUUACCCC	182	1134-1157	N88
G030172	GGGGCCAAGUCUGUACAGCAUCUU	183	765-788	N89
G030173	GGGCCAAGUCUGUACAGCAUCUUG	184	766-789	N90
G030174	AAUUUUGGCCAAGACACACGGUAG	185	296-319	N91
G030175	AUUUUGGCCAAGACACACGGUAGU	186	295-318	N92
G030176	UCAAUCUAAGCAGGCUUUCACUUU	187	1082-1105	N93
G030177	AAACUCUGCAAGAUCCCAGAGUGA	188	26-49	N94
G030178	AGAUCCCAGAGUGAGAGGCCUGUA	189	36-59	N95
G030179	CCUUCAGUACGAGAUCUUCUAGAU	190	1981-2004	N96
G030180	AAGAUCCCAGAGUGAGAGGCCUGU	191	35-58	N97
G030181	GCAAUUGAUUAUGCCUGCUAGGUU	192	2635-2658	N98

如表2B所示，與Nme-Cas9一起使用的gRNA之嚮導靶向序列顯示出對不同HBV株的顯著交叉反應。因此，單一gRNA可能適合Nme-Cas9介導的多於一種HBV株之基因體編輯。然而，若感染未知HBV株，可以投與多種gRNA以增加未知HBV株基因體經編輯的可能性。 表2B. Nme2-Cas9嚮導與HBV株之交叉反應

嚮導	亞型內完美匹配(24mer)百分比
SEQ ID NO	嚮導ID	靶序列	靶HBV基因	A	B	C	D	E	F	G	H	RF
98	G027221	UGUCUUGGCCAAAAUUCGCAGUCC	S.mrna\|P.mrna	95.6%	0.6%	1.2%	94.9%	70.0%	0.9%	5.3%	0.0%	55.8%
101	G027224	GGUUCUUCUGGACUAUCAAGGUAU	S.mrna\|P.mrna	1.1%	94.6%	10.4%	92.3%	92.4%	85.9%	94.7%	100.0%	50.7%
102	G027225	UCUCCAUGUUCAGCGCAGGGUCCC	S.mrna\|P.mrna	2.6%	0.0%	0.1%	66.8%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	23.8%
103	G027226	GAUGUUCUCCAUGUUCAGCGCAGG	S.mrna\|P.mrna	2.5%	0.0%	0.0%	66.6%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	23.9%
104	G027227	UGAUGUUCUCCAUGUUCAGCGCAG	S.mrna\|P.mrna	2.5%	0.0%	0.0%	67.5%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	23.9%
105	G027228	GUGAUGUUCUCCAUGUUCAGCGCA	S.mrna\|P.mrna	2.5%	0.0%	0.0%	76.8%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	25.5%
106	G030095	ACUGAACAAAUGGCACUAGUAAAC	S.mrna\|P.mrna	97.5%	94.2%	93.3%	96.4%	96.8%	0.9%	97.4%	3.8%	90.7%
107	G030096	GAGGCGAGGGAGUUCUUCUUCUAG	P.mrna\|C.mrna	96.2%	95.7%	97.4%	90.9%	88.8%	52.0%	5.3%	96.2%	92.1%
108	G030097	GGAUGUGUCUGCGGCGUUUUAUCA	S.mrna\|P.mrna	97.6%	87.9%	95.4%	95.1%	97.2%	97.8%	92.1%	100.0%	92.9%
109	G030098	UUUGUUCAGUGGUUCGUAGGGCUU	S.mrna\|P.mrna	96.5%	97.3%	83.7%	96.1%	0.0%	0.0%	100.0%	0.0%	89.5%
110	G030099	GGUUGCGUCAGCAAACACUUGGCA	P.mrna	93.2%	96.4%	90.8%	90.5%	3.2%	97.8%	97.4%	100.0%	79.9%
111	G030100	CCAUUUGUUCAGUGGUUCGUAGGG	S.mrna\|P.mrna	96.0%	94.7%	83.6%	96.1%	0.0%	0.0%	100.0%	0.0%	89.1%
112	G030101	CAUUUGUUCAGUGGUUCGUAGGGC	S.mrna\|P.mrna	96.1%	94.6%	83.4%	95.8%	0.0%	0.0%	100.0%	0.0%	89.1%
113	G030102	AAAACGCCGCAGACACAUCCAGCG	S.mrna\|P.mrna	96.2%	87.0%	90.2%	91.4%	96.8%	45.4%	92.1%	0.0%	83.0%
114	G030103	CCAGCACCAUGCAACUUUUUCACC	X.mrna\|C.mrna	69.9%	90.1%	95.9%	90.2%	93.2%	93.4%	36.8%	88.5%	87.8%
115	G030104	CUGAGCCUGAGGGCUCCACCCCAA	P.mrna	89.8%	72.5%	65.1%	89.2%	0.8%	0.0%	5.3%	0.0%	75.5%
116	G030105	AGGCUGUAGGCAUAAAUUGGUCUG	X.mrna	84.3%	27.4%	92.8%	94.2%	98.8%	97.4%	94.7%	100.0%	89.8%
117	G030106	CAGUCCCCAACCUCCAAUCACUCA	S.mrna\|P.mrna	98.5%	0.2%	95.6%	97.3%	60.8%	0.0%	5.3%	0.0%	89.9%
118	G030107	AACCUCCAAUCACUCACCAACCUC	S.mrna\|P.mrna	98.6%	0.2%	94.0%	97.6%	60.4%	0.0%	5.3%	0.0%	94.2%
119	G030108	AGGAUUCUUGUCAACAAGAAAAAC	S.mrna\|P.mrna	95.8%	0.4%	91.6%	93.4%	0.0%	0.9%	89.5%	0.0%	86.7%
120	G030109	CUGUGCCAAGUGUUUGCUGACGCA	P.mrna	94.2%	93.7%	1.9%	88.0%	3.2%	97.8%	97.4%	0.0%	27.6%
121	G030110	UGUGAGGAUUCUUGUCAACAAGAA	S.mrna\|P.mrna	95.8%	0.4%	89.0%	92.2%	0.0%	0.9%	92.1%	0.0%	81.4%
122	G030111	UUGUGAGGAUUCUUGUCAACAAGA	S.mrna\|P.mrna	95.6%	0.4%	89.0%	92.2%	0.0%	0.9%	92.1%	0.0%	81.3%
123	G030112	UCUGUGCCAAGUGUUUGCUGACGC	P.mrna	93.7%	93.4%	1.9%	87.8%	3.2%	0.0%	97.4%	0.0%	27.6%
124	G030113	GUCCUACUGUUCAAGCCUCCAAGC	C.mrna	3.3%	91.1%	89.1%	92.4%	95.6%	68.7%	73.7%	0.0%	91.5%
125	G030114	CGAGGCAGGUCCCCUAGAAGAAGA	P.mrna\|C.mrna	88.9%	19.4%	85.5%	81.7%	2.8%	42.7%	5.3%	0.0%	74.8%
126	G030115	ACAGACUUGGCCCCCAAUACCACA	S.mrna\|P.mrna	73.7%	29.7%	86.6%	82.7%	89.2%	0.0%	2.6%	0.0%	75.9%
127	G030116	GGUCUGUGCCAAGUGUUUGCUGAC	P.mrna	89.9%	93.0%	1.9%	87.8%	3.2%	0.0%	97.4%	0.0%	27.5%
128	G030117	AUUGGAGGUUGGGGACUGCGAAUU	S.mrna\|P.mrna	98.5%	0.1%	76.0%	96.9%	58.4%	99.6%	100.0%	0.0%	88.2%
129	G030118	UUCGCAGUCCCCAACCUCCAAUCA	S.mrna\|P.mrna	98.5%	0.1%	74.4%	97.1%	58.0%	99.1%	97.4%	0.0%	88.4%
130	G030119	GCUGCCAACUGGAUCCUGCGCGGG	X.mrna	0.1%	92.0%	89.7%	87.6%	0.0%	41.9%	5.3%	100.0%	82.6%
131	G030120	GCCAAACAGUGGGGGAAAGCCCUA	S.mrna\|P.mrna	95.2%	1.9%	80.6%	89.7%	0.0%	2.6%	2.6%	3.8%	80.9%
132	G030121	UGGGUGGCUUUGGGGCAUGGACAU	C.mrna	71.7%	56.5%	65.3%	53.4%	69.6%	87.2%	2.6%	92.3%	65.6%
133	G030122	UUGGGUGGCUUUGGGGCAUGGACA	C.mrna	71.8%	57.7%	65.9%	32.3%	64.8%	87.2%	2.6%	96.2%	65.2%
134	G030123	GGAUCCAGUUGGCAGCACAGCCUA	X.mrna	2.0%	93.2%	24.2%	94.3%	93.6%	0.0%	89.5%	69.2%	39.2%
135	G030124	GGCUGCUAGGCUGUGCUGCCAACU	X.mrna	1.9%	93.4%	24.1%	94.0%	93.6%	0.0%	86.8%	65.4%	39.2%
136	G030125	AAUACCACAUCAUCCAUAUAACUG	S.mrna\|P.mrna	11.1%	29.7%	83.5%	80.5%	96.4%	0.0%	5.3%	0.0%	75.9%
137	G030126	UGCGGCGUUUUAUCAUCUUCCUCU	S.mrna\|P.mrna	0.0%	87.4%	20.8%	88.9%	94.8%	98.2%	5.3%	100.0%	45.0%
138	G030127	GAGUCCAAGGAAUACUAACAUUGA	P.mrna\|C.mrna	94.5%	16.3%	5.7%	78.2%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	28.5%
139	G030128	AACUGAAAGCCAAACAGUGGGGGA	S.mrna\|P.mrna	15.4%	2.2%	89.2%	84.6%	2.4%	0.0%	0.0%	0.0%	84.8%
140	G030129	UAACUGAAAGCCAAACAGUGGGGG	S.mrna\|P.mrna	15.5%	1.9%	89.3%	84.6%	2.4%	0.0%	0.0%	0.0%	84.8%
141	G030130	CUCCAAUCACUCACCAACCUCCUG	S.mrna\|P.mrna	96.7%	0.1%	2.3%	91.5%	0.0%	0.0%	5.3%	0.0%	49.6%
142	G030131	UCCCCAACCUCCAAUCACUCACCA	S.mrna\|P.mrna	97.5%	0.1%	2.3%	90.7%	0.0%	0.0%	97.4%	0.0%	49.6%
143	G030132	ACGAGGCAGGUCCCCUAGAAGAAG	P.mrna\|C.mrna	0.0%	19.5%	84.6%	81.2%	2.8%	42.7%	5.3%	0.0%	72.5%
144	G030133	GGUCCUAGGAAUCCUGAUGUGAUG	S.mrna\|P.mrna	93.6%	0.0%	0.2%	89.0%	92.0%	0.9%	86.8%	0.0%	45.5%
145	G030134	CCGUUUCUCCUGGCUCAGUUUACU	S.mrna\|P.mrna	3.9%	0.3%	91.5%	85.9%	94.0%	0.9%	5.3%	0.0%	61.5%
146	G030135	AAAAAGUUGCAUGGUGCUGGUGCG	X.mrna\|C.mrna	67.6%	2.0%	1.7%	89.5%	90.4%	0.9%	7.9%	0.0%	32.7%
147	G030136	UGCGCACCAGCACCAUGCAACUUU	X.mrna\|C.mrna	67.8%	2.0%	1.7%	89.2%	90.4%	0.9%	7.9%	0.0%	30.3%
148	G030137	UAGGCAUAAAUUGGUCUGCGCACC	X.mrna	56.9%	1.9%	1.8%	93.0%	94.0%	0.9%	63.2%	0.0%	35.0%
149	G030138	CCUCUGCCUAAUCAUCUCUUGUUC	X.mrna\|C.mrna	28.1%	19.1%	10.3%	82.0%	96.8%	3.1%	94.7%	0.0%	34.7%
150	G030139	UCUUGUUCAUGUCCUACUGUUCAA	C.mrna	2.3%	23.2%	10.2%	79.7%	94.8%	0.9%	68.4%	0.0%	35.0%
151	G030140	AUCUCUUGUUCAUGUCCUACUGUU	X.mrna\|C.mrna	2.1%	22.9%	10.2%	78.9%	94.4%	0.9%	68.4%	0.0%	34.4%
152	G030141	GGACGGAAAUUGCACCUGUAUUCC	S.mrna\|P.mrna	8.7%	5.5%	0.9%	91.0%	1.6%	0.4%	92.1%	100.0%	35.0%
153	G030142	CGAAUUUUGGCCAAGACACACGGU	S.mrna\|P.mrna	1.4%	0.6%	0.0%	93.9%	0.0%	0.0%	2.6%	0.0%	46.3%
154	G030143	CCAGCAAUCCUCUGGGAUUCUUUC	P.mrna	0.0%	0.0%	0.0%	95.5%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	26.3%
155	G030144	GGAAAAUUCCUAUGGGAGUGGGCC	S.mrna\|P.mrna	0.0%	0.0%	0.0%	95.0%	93.6%	0.4%	0.0%	0.0%	44.5%
156	G030145	CCCACUCCCAUAGGAAUUUUCCGA	S.mrna\|P.mrna	0.0%	0.1%	0.0%	94.8%	93.2%	0.0%	0.0%	0.0%	44.5%
157	G030146	GCAAUCCUCUGGGAUUCUUUCCCG	P.mrna	0.0%	0.0%	0.0%	93.4%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	26.6%
158	G030147	UGAACAUGGAGAACAUCACAUCAG	S.mrna\|P.mrna	5.5%	0.0%	0.0%	87.8%	0.0%	18.1%	0.0%	100.0%	28.3%
159	G030148	UUCCACCAGCAAUCCUCUGGGAUU	P.mrna	0.0%	0.0%	0.0%	92.4%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	28.2%
160	G030149	GGGAUUCUUUCCCGACCACCAGUU	P.mrna	0.0%	0.1%	0.1%	92.0%	0.0%	0.0%	0.0%	3.8%	26.5%
161	G030150	AGAGGAUUGCUGGUGGAAAGAUUC	P.mrna	0.0%	0.0%	0.0%	91.3%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	27.3%
162	G030151	GAUUGGGACUUCAAUCCCAACAAG	P.mrna	0.0%	0.0%	0.0%	91.3%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	27.2%
163	G030152	CUCCAGCUCCUACCUUGUUGGCGU	P.mrna	0.0%	0.0%	0.0%	91.3%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	27.6%
164	G030153	CAGAGGAUUGCUGGUGGAAAGAUU	P.mrna	0.0%	0.0%	0.0%	91.0%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	27.2%
165	G030154	UGGAUCCAACUGGUGGUCGGGAAA	P.mrna	0.1%	0.0%	0.0%	90.7%	96.8%	0.0%	0.0%	3.8%	27.8%
166	G030155	CCAGAGGAUUGCUGGUGGAAAGAU	P.mrna	0.0%	0.0%	0.0%	90.8%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	27.2%
167	G030156	CAUGGGGCAGAAUCUUUCCACCAG	P.mrna	0.0%	0.0%	0.0%	90.4%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	27.8%
168	G030157	GGAUCCAACUGGUGGUCGGGAAAG	P.mrna	0.0%	0.0%	0.0%	90.4%	0.0%	0.0%	0.0%	3.8%	26.1%
169	G030158	CUCACCAACCUCCUGUCCUCCAAC	S.mrna\|P.mrna	1.5%	0.0%	0.2%	88.1%	0.0%	0.0%	2.6%	0.0%	42.2%
170	G030159	GGUGUCUUUCGGAGUGUGGAUUCG	C.mrna	0.3%	0.2%	1.7%	87.5%	0.8%	0.0%	2.6%	0.0%	15.7%
171	G030160	ACUGGAGCCACCAGCAGGGAAAUA	S.mrna\|P.mrna	1.3%	0.0%	2.0%	86.4%	1.2%	0.0%	0.0%	0.0%	39.2%
172	G030161	UUCUUUCCCGACCACCAGUUGGAU	P.mrna	0.0%	0.0%	0.0%	89.0%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	25.5%
173	G030162	GGACUUCAAUCCCAACAAGGACAC	P.mrna	0.0%	0.0%	0.0%	88.7%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	26.3%
174	G030163	GCCAGGAGAAACGGGCUGAGGCCC	S.mrna\|P.mrna	0.0%	0.0%	0.7%	87.0%	95.6%	92.1%	5.3%	0.0%	23.5%
175	G030164	AGCCAGGAGAAACGGGCUGAGGCC	S.mrna\|P.mrna	0.0%	0.0%	0.7%	87.0%	95.6%	92.1%	5.3%	0.0%	23.5%
176	G030165	AACUGAGCCAGGAGAAACGGGCUG	S.mrna\|P.mrna	0.0%	0.0%	0.7%	86.1%	94.8%	90.3%	5.3%	0.0%	23.4%
177	G030166	AAACUGAGCCAGGAGAAACGGGCU	S.mrna\|P.mrna	0.0%	0.0%	0.7%	85.8%	94.4%	90.3%	5.3%	0.0%	22.9%
178	G030167	AAUCCCAACAAGGACACCUGGCCA	P.mrna	0.0%	0.0%	0.0%	85.3%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	26.9%
179	G030168	AGGCCUUUCUGUGUAAACAAUACC	P.mrna	0.0%	0.0%	0.4%	75.7%	50.8%	0.0%	0.0%	0.0%	23.5%
180	G030169	UUCUGUGUAAACAAUACCUGAACC	P.mrna	0.0%	0.0%	0.4%	73.0%	50.0%	0.0%	0.0%	0.0%	23.2%
181	G030170	UCUGUGUAAACAAUACCUGAACCU	P.mrna	0.0%	0.0%	0.4%	73.0%	50.0%	0.0%	0.0%	0.0%	23.2%
182	G030171	AAACAAUACCUGAACCUUUACCCC	P.mrna	0.0%	0.0%	0.4%	72.9%	55.6%	0.0%	0.0%	0.0%	25.1%
183	G030172	GGGGCCAAGUCUGUACAGCAUCUU	S.mrna\|P.mrna	0.9%	0.3%	0.1%	70.5%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	37.4%
184	G030173	GGGCCAAGUCUGUACAGCAUCUUG	S.mrna\|P.mrna	0.9%	0.3%	0.1%	70.4%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	37.3%
185	G030174	AAUUUUGGCCAAGACACACGGUAG	S.mrna\|P.mrna	0.0%	0.0%	0.0%	63.8%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	37.3%
186	G030175	AUUUUGGCCAAGACACACGGUAGU	S.mrna\|P.mrna	0.0%	0.0%	0.0%	63.7%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	37.0%
187	G030176	UCAAUCUAAGCAGGCUUUCACUUU	P.mrna	0.0%	0.0%	0.3%	60.2%	80.4%	0.0%	0.0%	0.0%	18.7%
188	G030177	AAACUCUGCAAGAUCCCAGAGUGA	S.mrna\|P.mrna	0.0%	0.0%	0.0%	60.4%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	27.2%
189	G030178	AGAUCCCAGAGUGAGAGGCCUGUA	S.mrna\|P.mrna	0.0%	0.0%	0.0%	60.2%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	22.0%
190	G030179	CCUUCAGUACGAGAUCUUCUAGAU	C.mrna	0.0%	0.0%	0.0%	59.9%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	14.7%
191	G030180	AAGAUCCCAGAGUGAGAGGCCUGU	S.mrna\|P.mrna	0.0%	0.0%	0.0%	58.0%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	21.7%
192	G030181	GCAAUUGAUUAUGCCUGCUAGGUU	P.mrna	0.0%	0.0%	0.0%	53.2%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	11.6%

在一些實施例中，靶序列在開放閱讀框或基因體(例如病毒基因體)中，且與靶向序列互補。在一些實施例中，靶向序列與其在基因體中之對應靶序列之間的互補性或一致性程度為至少80%、85%，較佳90%或95%。舉例而言，在一些實施例中，嚮導序列包含以下中之24個連續核苷酸之序列：選自SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、1-843、1-1205、2314-3188、1381-1846、1821-2460，例如核苷酸35-58、146-169、153-176、216-239、330-356、330-353、333-356、342-365、447-470、666-689、713-736、740-763、755-778、1390-1413、1836-1859、2635-2658、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸146-169、153-176、330-356、330-353、333-356、447-470、713-736、740-763、755-778、1390-1413、2951-2974或2958-2981；視情況核苷酸146-169、153-176、330-356、330-353、333-356、447-470、713-736、740-763、755-778、1390-1413、2951-2974或2958-2981；視情況核苷酸447-470、330-353、755-778或713-736之序列或其反向互補序列；或者表2A中提供之嚮導RNA之靶向序列，例如來自具有N7、N8、N11、N24、N25、N32、N37、N40、N42、N47、N51、N55、N75、N79、N84、N97或N98；視情況N7、N8、N11、N24、N32、N37、N40、N42、N47、N79或N84；視情況N7、N8、N11、N24、N32、N37、N40、N42、N47、N79或N84；視情況N7、N24、N32或N37之HBV編號之嚮導的靶位點。在一些實施例中，靶向序列與靶序列可為100%互補或一致。在其他實施例中，靶向序列及靶序列可含有至少一個錯配，亦即一個核苷酸不一致或不互補，這取決於參考序列。舉例而言，靶向序列及靶序列可含有1-2個、較佳不超過1個錯配，其中靶序列之總長度為19、20、21、22、較佳23或24個核苷酸或更多個核苷酸。在一些實施例中，靶向序列及靶序列可含有1-2個錯配，其中靶向序列包含至少24個核苷酸。在一些實施例中，靶向序列及靶序列可含有1-2個錯配，其中靶向序列包含24個核苷酸。換言之，靶向序列及靶序列可形成具有24個鹼基對或更多個鹼基對之雙鏈體區域。在某些實施例中，雙鏈體區域可包括1-2個錯配，使得靶向序列與靶序列不完全互補。錯配位置為此項技術中已知的，例如，PAM遠端錯配往往比PAM近端匹配更可容忍。其他位置處之錯配容忍度為此項技術中已知的(參見例如，Edraki等人，2019. Mol. Cell, 73:1-13)。

RNA指導的DNA結合劑之靶序列(由嚮導RNA之靶向序列定義)可存在於正股或負股上。本文所提供之表格及其他揭示內容可列舉作為靶序列之核苷酸序列內之基因體坐標或位置。應理解，嚮導可與由核苷酸序列內之基因體坐標或位置定義之DNA的正股或負股互補。與嚮導互補之序列取決於相對股上RNA指導的DNA結合劑是否存在適當PAM。因此，在一些實施例中，當靶向序列結合靶序列之反向互補序列時，亦即，靶向序列與靶序列之有義(正)股之某些核苷酸一致，當PAM存在於有義股中時，除了在靶向序列中用U取代T之外。

如本文所用，「RNA指導的DNA結合劑」意謂具有RNA及DNA結合活性之多肽或多肽之複合物，或此種複合物之DNA結合次單元，其中DNA結合活性為序列特異性的，且取決於PAM之存在及嚮導RNA之序列。示範性RNA指導的DNA結合劑包括Cas裂解酶/切口酶及其不活化形式(「dCas DNA結合劑」)。如本文所用，「Cas核酸酶」涵蓋Cas裂解酶、Cas切口酶及dCas DNA結合劑。Cas切口酶包括其中Cas蛋白之RuvC或HNH域之一的核酸酶，使得僅單股經核酸酶裂解。dCas DNA結合劑可以為包含非功能性核酸酶域(RuvC或HNH域)之死核酸酶。在一些實施例中，Cas裂解酶或Cas切口酶涵蓋經修飾以允許DNA裂解，例如經由與FokI域融合之dCas DNA結合劑。Cas裂解酶/切口酶及dCas DNA結合劑包括III型CRISPR系統之Csm或Cmr複合物、其Cas10、Csm1或Cmr2次單元、I型CRISPR系統之級聯複合物、其Cas3次單元及2類Cas核酸酶。

如本文所用，「2類Cas核酸酶」係具有RNA指導的DNA結合活性之單鏈多肽。2類Cas核酸酶包括2類Cas裂解酶/切口酶(例如Spy Cas9之H840A或D10A變異體以及Nme Cas9例如Nme2 Cas9之D16A及H588A)，其進一步具有RNA指導的DNA裂解酶或切口酶活性，以及2類dCas DNA結合劑，其中裂解酶/切口酶活性係不活化的。2類Cas核酸酶包括，例如，Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9 (例如，N497A、R661A、Q695A、Q926A變異體)、HypaCas9 (例如，N692A、M694A、Q695A、H698A變異體)、eSPCas9(1.0) (例如，K810A、K1003A、R1060A變異體)及eSPCas9(1.1) (例如，K848A、K1003A、R1060A變異體)蛋白質及其修飾。Cpf1蛋白(Zetsche等人， Cell, 163: 1-13 (2015))與Cas9同源，且含有RuvC樣核酸酶域。Zetsche之Cpf1序列以引用之方式整體併入。參見例如Zetsche，表S1及表S3。參見，例如，Makarova等人， Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015)；Shmakov等人， Molecular Cell,60:385-397 (2015)。

下文提供了Cas9分子之示範性核苷酸及多肽序列。用於鑑定編碼Cas9多肽序列之替代核苷酸序列(包括替代的天然存在之變異體)的方法為此項技術中已知的。亦考慮與Cas9核酸序列或編碼本文所提供之胺基酸序列的核酸序列中之任一者具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的序列。在某些實施例中，編碼Cas9胺基酸序列之核苷酸序列並非天然存在之Cas9核苷酸序列。亦考慮與本文所提供之Cas9胺基酸序列中之任一者具有至少95%、96%、97%、98%或99%一致性的序列。在某些實施例中，Cas9胺基酸序列並非天然存在之Cas9序列。

表40中提供了Cas9之示範性開放閱讀框及胺基酸序列(SEQ ID NO: 705、706、707、710、711、712、713、715、716、718、719、721、722、729、730)及尿嘧啶糖苷酶抑制劑之示範性開放閱讀框及胺基酸序列(SEQ ID NO: 708、709、724、725、732、733)。

如本文所用，「胞苷去胺酶」意謂能夠具有胞苷去胺酶活性之多肽或多肽之複合物，其催化胞苷或去氧胞苷之水解去胺基作用，通常產生尿苷或去氧尿苷。胞苷去胺酶涵蓋胞苷去胺酶超家族中之酶，且特定而言，APOBEC家族之酶(APOBEC1、APOBEC2、APOBEC4及APOBEC3亞組之酶)、活化誘導之胞苷去胺酶(AID或AICDA)及CMP去胺酶(例如，參見Conticello等人，Mol. Biol. Evol. 22:367-77, 2005；Conticello, Genome Biol. 9:229, 2008；Muramatsu等人，J. Biol. Chem. 274: 18470-6, 1999)；Carrington等人，Cells 9:1690 (2020))。在一些實施例中，涵蓋任何已知之胞苷去胺酶或APOBEC蛋白之變異體。變異體包括具有因一個或若干個突變(亦即取代、缺失、插入，諸如一個或若干個單點取代)而與野生型蛋白質不同之序列的蛋白質。舉例而言，可使用縮短序列，例如藉由缺失N末端、C末端或內部胺基酸，較佳地缺失序列C末端之一至四個胺基酸。如本文所用，術語「變異體」係指與參考序列同源之等位基因變異體、剪接變異體以及天然或人工突變體。變異體具有「功能性」，此乃因其顯示出DNA編輯之催化活性。

如本文所用，術語「APOBEC3A」係指胞苷去胺酶，諸如由人類A3A基因表現之蛋白質。APOBEC3A可具有催化性DNA編輯活性。已經描述了APOBEC3A之胺基酸序列(UniPROT登錄ID：p31941)，且作為SEQ ID NO: 734包括在本文中。在一些實施例中，APOBEC3A蛋白為人類APOBEC3A蛋白或野生型蛋白。變異體包括具有因一個或若干個突變(亦即取代、缺失、插入，諸如一個或若干個單點取代)而與野生型APOBEC3A蛋白不同之序列的蛋白質。舉例而言，可使用縮短之APOBEC3A序列，例如藉由缺失N末端、C末端或內部胺基酸，較佳地缺失序列C末端之一至四個胺基酸。如本文所用，術語「變異體」係指與APOBEC3A參考序列同源之等位基因變異體、剪接變異體以及天然或人工突變體。變異體具有「功能性」，此乃因其顯示出DNA編輯之催化活性。在一些實施例中，APOBEC3A (諸如人類APOBEC3A)具有57位野生型胺基酸(如野生型序列中所編號)。在一些實施例中，APOBEC3A (諸如人類APOBEC3A)在胺基酸位置57處具有天冬醯胺(如野生型序列中所編號)。

已從腦膜炎雙球菌中獲得了幾種Cas9異種同源物(Esvelt等人，Nat. Meth.,第10卷, 2013, 1116 - 1121；Hou等人，PNAS,第110卷, 2013,第15644 - 15649頁) (Nme1Cas9、Nme2Cas9及Nme3Cas9)。Nme2Cas9異種同源物在哺乳動物細胞中有效發揮作用，識別N4CC PAM，且可用於活體內編輯(Ran等人，Nature,第520卷, 2015,第186 - 191頁；Kim等人，Nat. Commun.,第8卷, 2017,第14500頁)。Nme2Cas9已被證明對脫靶編輯具有天然抵抗力(Lee等人，Mol. Ther.,第24卷, 2016,第645 - 654頁；Kim等人，2017)。另見例如描述Nme2Cas9 D16A切口酶之WO/2020081568 (例如第28及42頁)，其內容特此以引用之方式整體併入。在全文中，「NmeCas9」或「Nme Cas9」是通用的，且涵蓋任何類型之NmeCas9，包括Nme1Cas9、Nme2Cas9及Nme3Cas9。

如本文所用，術語「融合蛋白」係指雜交多肽，其包含來自至少兩種不同蛋白質或來源之多肽。一種多肽可位於融合蛋白之胺基末端(N末端)部分處或羧基末端(C末端)蛋白處，由此分別形成「胺基末端融合蛋白」或「羧基末端融合蛋白」。本文所提供之任何蛋白質均可藉由此項技術中已知之任何方法來產生。舉例而言，本文所提供之蛋白質可經由重組蛋白質表現及純化而產生，重組蛋白質表現及純化尤其適於包含肽連接子之融合蛋白。重組蛋白質表現及純化之方法為熟知的，且包括由Green及Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第4版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))所述之彼等方法，該文獻之完整內容以引用之方式併入本文中。

如本文所用，術語「尿嘧啶糖苷酶抑制劑」、「尿嘧啶-DNA糖苷酶抑制劑」或「UGI」係指能夠抑制尿嘧啶-DNA糖苷酶(UDG)鹼基切除修復酶之蛋白質(例如UniPROT ID: P14739；SEQ ID NO: 735)。

如本文所用，術語「連接子」係指連接兩個相鄰分子或部分之化學基團或分子。通常，連接子位於兩個基團、分子或其他部分之間或兩側，且經由共價鍵彼此相連。在一些實施例中，連接子為一個胺基酸或複數個胺基酸(例如，肽或蛋白質)。示範性肽連接子在本文別處揭示。用於gRNA之示範性連接子在本文別處揭示。

「經修飾之尿苷」在本文中用於指除胸苷外與尿苷具有相同氫鍵受體且與尿苷具有一或多種結構差異之核苷。在一些實施例中，經修飾尿苷為經取代尿苷，亦即其中一或多個非質子取代基(例如烷氧基，諸如甲氧基)代替質子之尿苷。在一些實施例中，經修飾尿苷為假尿苷。在一些實施例中，經修飾尿苷為經取代假尿苷，亦即一或多個非質子取代基(例如烷基，諸如甲基)代替質子之假尿苷。在一些實施例中，經修飾尿苷為經取代之尿苷、假尿苷或經取代假尿苷(例如N1-甲基-假尿苷)中之任一者。

如本文所用，「尿苷位置」係指多核苷酸中由尿苷或經修飾尿苷佔據之位置。因此，舉例而言，其中「100%之尿苷位置為經修飾尿苷」的多核苷酸在同一序列之習知RNA (其中所有鹼基均為標準A、U、C或G鹼基)中的每個應為尿苷之位置處含有經修飾尿苷。除非另有指示，否則本揭示案中或伴隨本揭示案之序列表格或序列表之多核苷酸序列中的U可為尿苷或經修飾尿苷。

如本文所用，「核糖核蛋白」(RNP)或「RNP複合物」係指嚮導RNA連同RNA指導的DNA結合劑，諸如Cas核酸酶，例如Cas裂解酶、Cas切口酶或dCas DNA結合劑(例如Cas9)。在一些實施例中，嚮導RNA將RNA指導的DNA結合劑(諸如Cas9)指導至靶序列，且嚮導RNA與該靶序列雜交且該劑與該靶序列結合；在該劑為裂解酶或切口酶之情況下，結合後可進行裂解或刻切口。

如本文所用，「RNA指導的DNA結合劑」意謂具有RNA及DNA結合活性之多肽或多肽之複合物，或此種複合物之DNA結合次單元，其中DNA結合活性為序列特異性的，且取決於RNA之序列。示範性RNA指導的DNA結合劑包括Cas裂解酶(其具有雙股裂解活性)、切口酶(其具有單股裂解活性)及其不活化形式(「dCas DNA結合劑」)。如本文所用，「Cas核酸酶」涵蓋Cas裂解酶、Cas切口酶及dCas DNA結合劑。dCas DNA結合劑可為包含非功能性核酸酶域(RuvC或HNH域)之死核酸酶。在一些實施例中，Cas裂解酶或Cas切口酶涵蓋經修飾以允許DNA裂解，例如經由與FokI域融合之dCas DNA結合劑。在一些實施例中，RNA指導的DNA結合劑具有核酸酶活性，例如裂解酶或切口酶活性。

如本文所用，「對照」應理解為用於比較之適當匹配之樣品或個體。舉例而言，對照可為以與測試群體相同的方式處理的細胞群體，不同之處在於用於對照群體之處理缺乏至少一種活性劑，例如嚮導RNA、編碼核酸酶之mRNA、插入構築體或脂質調配物。在某些實施例中，對照可為內部對照，例如處理前之細胞群體或個體。

在某些實施例中，對照個體中之「對照」為量測結果之比較，例如疾病之徵象或症狀的診斷量測結果。在某些實施例中，對照可為來自同一個體在較早時間點(例如，在治療介入前)之個體樣品。在某些實施例中，對照可為來自正常個體(亦即，未患有所治療個體之疾病的個體)之量測結果，以提供正常對照，例如個體樣品中之酶濃度或活性。在某些實施例中，正常對照可為群體對照，亦即一般群體中個體之平均值。在某些實施例中，對照可為患有相同疾病之未治療個體。在某些實施例中，對照可為使用不同療法(例如照護標準)治療之個體。在某些實施例中，對照可為來自患有所比較之個體的疾病的個體自然病史研究的個體或個體群體。在某些實施例中，對照之某些因素與經測試之個體相匹配，例如年齡、性別。在某些實施例中，對照可為特定實驗室(例如臨床實驗室)之對照水準。設計或選擇適當對照之能力係在熟習此項技術者之能力範圍內。應理解，當提供相對值時，該等值可認為與適當對照相比的相對值。

如本文所用，諸如在「純化的蛋白質」或「純化的核酸」中的「純化的」應理解為基本上從製備它的混合物中去除，例如細胞、個體樣品、反應混合物。在某些實施例中，純化應理解為混合物的至少50重量%為純化的化合物，例如，純化的蛋白質或純化的核酸。在某些實施例中，純化應理解為混合物的至少80重量%為純化的化合物。

如本文所用，「個體」包括靈長類動物，包括人類及非人類靈長類動物、小鼠及大鼠。在某些實施例中，個體為人類個體。在某些實施例中，個體為非人類個體。在某些實施例中，個體為表現一或多種人類基因之非人類個體，例如表現人類基因之基因轉殖小鼠，其中肝臟中已重新植入人類肝細胞之小鼠(例如，PXB-mouse®)。此類模型為此項技術中熟知的。

如本文所用，「靶序列」係指靶基因體或開放閱讀框中、正股或負股中與gRNA之嚮導序列具有互補性(亦即與嚮導序列充分互補以允許嚮導序列之特異性結合)的核酸序列。靶序列與嚮導序列之相互作用引導RNA指導的DNA結合劑在靶序列內進行結合且潛在地刻切口或裂解(取決於該劑之活性)。靶序列之具體長度以及靶序列與嚮導序列之間可能的錯配數目取決於例如由gRNA引導之Cas核酸酶之屬性(identity)。

如本文所用，若第一序列與第二序列之比對表明整個第二序列之所有位置與第一序列匹配，則第一序列被視為與第二序列「一致」或具有「100%一致性」。例如，序列AAG與序列AAGA具有100%一致性，原因係由於第一序列之所有三個位置均存在匹配而無缺口，因此比對將給出100%一致性。可使用常規方法計算小於100%之一致性。例如，ACG與AAGA具有67%一致性，因為第一序列之三個位置中有兩個與第二序列匹配(2/3 = 67%)。RNA與DNA之間之差異(通常係尿苷交換為胸苷，反之亦然)及核苷類似物(如修飾之尿苷)之存在不會導致多核苷酸之間之一致性或互補性差異，只要相關核苷酸(如胸苷、尿苷或修飾之尿苷)具有相同互補序列(例如，對於胸苷、尿苷或修飾之尿苷全部，為腺苷；另一個實例係胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶，兩者都具有鳥苷或修飾之鳥苷作為互補序列)。因此，例如，序列5'-AXG (其中X係任何修飾之尿苷，諸如假尿苷、N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷)被認為與AUG 100%一致，因為兩者與同一序列(5'-CAU)完全互補。示範性比對演算法為此項技術中熟知的Smith-Waterman及Needleman-Wunsch演算法。熟習此項技術者將理解選擇哪一種演算法及參數設置適合於待比對之給定序列對；對於具有大體上類似長度並且預期胺基酸一致性＞50%或核苷酸一致性＞75%的序列，EBI在www.ebi.ac.uk網路伺服器上提供之Needleman-Wunsch演算法介面之帶有默認設置之Needleman-Wunsch演算法通常係合適的。

類似地，如本文所用，當第一序列之所有核苷酸與第二序列互補而無缺口時，第一序列被視為與第二序列「完全互補」或「100%互補」。例如，序列UCU將被視為與序列AAGA完全互補，因為來自第一序列之每個核鹼基皆與第二序列之核苷酸有鹼基配對，而無缺口。序列UGU被視為與序列AAGA有67%互補性，因為第一序列之三個核鹼基中的兩個與第二序列之核鹼基有鹼基配對。熟習此項技術者將理解，可利用具有各種參數設置之演算法，以便使用例如NCBI BLAST介面(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)或Needleman-Wunsch演算法來確定任何一對序列之互補百分比。

「傳訊RNA」或「mRNA」在本文中用於指包含可轉譯成多肽之開放閱讀框的多核苷酸(亦即，可充當由核糖體及胺基-醯化tRNA轉譯之受質)。mRNA可包含一或多種經化學修飾之核苷，諸如5-甲基-胞苷(5mC)、2-硫代-尿苷(2sU)、N1-甲基假尿苷(m1 ψU)及假尿苷(ψU)，或經修飾之帽結構，如下文所提供。

可用於本文所述之嚮導RNA組合物及方法中的示範性嚮導序列示於表1A及表2A及整個申請案中。舉例而言，在表1A及表2A展示嚮導序列之情況下，此嚮導序列可用於嚮導RNA中以將RNA指導的DNA結合劑(例如核酸酶，諸如Cas核酸酶，諸如Cas9)引導至靶序列。如表1A及表2A中藉由其在SEQ ID NO: 1內之位置所提供的靶序列包括對應於SEQ ID NO: 1中所示之DNA序列的正股及負股(亦即，給定之序列及該序列之反向互補序列)。在一些實施例中，在嚮導序列結合靶序列之反向互補序列之情況下，嚮導序列與靶序列之某些核苷酸一致，除了在嚮導序列中以U取代T以外。

如本文所用，「插入缺失(indel)」係指由許多核苷酸組成之插入/缺失突變，此等核苷酸在靶核酸之雙股斷裂(DSB)位點處插入或缺失。如本文所用，當插入缺失形成導致插入時，該插入係在雙股斷裂位點處之隨機插入，且不由模板序列引導或基於模板序列。

如本文所用，「抑制表現」及其類似者係指特定基因產物(例如蛋白質、mRNA或兩者)表現之減少(例如，減弱或剔除)。蛋白質(亦即基因產物)之表現可藉由以下來量測：偵測來自感興趣之組織樣品(例如生檢物)或細胞群體的蛋白質之總細胞量，偵測細胞群體之個別成員之蛋白質的表現，例如藉由細胞分選以限定表現蛋白質之細胞的百分比，或呈聚集體之細胞中蛋白質之表現，例如藉由ELISA或西方墨點法，包括對表現之蛋白質分泌至其中的體液(例如，源自其之血液或血清或血漿)進行之ELISA或西方墨點法。表現之抑制可由基因序列例如基因體序列之遺傳修飾引起，使得不再偵測到全長基因產物或任何基因產物，例如基因之減弱。某些遺傳修飾可造成框移或無意義突變之引入，從而阻止全長基因產物之轉譯。在剪接位點處，例如在足以靠近剪接受體位點或剪接供體位點以破壞剪接之位置處的遺傳修飾可阻止全長蛋白質之轉譯。表現之抑制可由基因產物表現所需的調節序列中之遺傳修飾引起(例如，啟動子序列、3' UTR序列、加帽序列、5' UTR序列、poly A序列及其類似者)。表現之抑制亦可由破壞基因產物轉譯所需的調節因子之表現或活性引起，例如，不產生基因產物。例如，抑制全長轉錄因子之表現的轉錄因子序列之遺傳修飾可具有下游效應且抑制由轉錄因子控制之一或多種基因產物之表現。因此，可藉由基因體或mRNA序列之變化來預測表現之抑制。如本文所用，抑制表現可以理解為抑制蛋白質活性之表現，即使蛋白質經表現。舉例而言，聚合酶中之突變可抑制聚合酶之活性而不降低聚合酶之表現水準，例如，如藉由蛋白質偵測檢定法(例如ELISA或西方墨點法)所測定的。舉例而言，如本文所用，對HBV聚合酶表現之抑制可藉由HBV聚合酶活性之降低來測定，例如使用本文提供之方法，並且不一定需要如藉由蛋白質偵測檢定法所測定的較低水準之蛋白質。如本文所用，蛋白質活性之抑制不需要完全抑制蛋白質活性。舉例而言，抑制HBV聚合酶活性可導致HBV DNA減少，例如治療相關的HBV DNA減少。

預期造成表現抑制之突變可藉由已知方法偵測，包括對自感興趣之組織樣品或細胞群體分離的DNA進行次世代定序。表現之抑制可確定為群體中具有預定水準之蛋白質表現的細胞之百分比，亦即群體中以至少一定水準表現感興趣之蛋白質的細胞之百分比或數量的減少。表現之抑制亦可藉由確定總蛋白質水準在例如細胞或組織樣品(例如生檢樣品)中之降低來評估。破壞蛋白質功能(例如破壞聚合酶活性)但蛋白質水準沒有相應降低之突變可或可不從已知的序列或結構中預測，且可能需要在經驗上進行鑑定。在某些實施例中，可在流體樣品例如細胞培養基或體液中評估所分泌蛋白質之表現的抑制。蛋白質可存在於體液例如血液或尿液中以允許分析蛋白質水準。在某些實施例中，蛋白質水準可藉由蛋白質活性或代謝產物在例如尿液或血液中之水準來確定。在一些實施例中，「表現之抑制」可係指特定基因產物表現之一些損失，例如在組織樣品中表現或由細胞群體表現之mRNA或蛋白質的量減少。在一些實施例中，「抑制」可係指特定基因產物之表現的一些損失，例如在細胞表面或分泌至體液(例如血液)中。在一些實施例中，「抑制」可係指一或多種細胞或組織類型但並非所有細胞或組織類型中表現的一些損失，例如抑制肝臟中之表現，但並不抑制其他器官中之表現。應理解，表現抑制水準係相對於相同類型之個體樣品中之起始水準。例如，與組織樣品(例如生檢樣品)相比，在來自個體之流體樣品(例如血液或尿液)中更容易進行蛋白質水準之常規監測。在某些實施例中，相關性為已知或已建立的，其中生物標記(例如，血液或尿液中)之水準與靶基因之表現的抑制水準相關。應理解，表現之抑制水準係針對所檢定之樣品。類似地，在可獲得連續組織樣品(例如肝臟組織)之動物研究中，靶標可在其他組織中表現。因此，表現之抑制水準未必為全身表現之抑制水準，而係在組織、細胞類型或所採樣之流體中之水準。

如本文所用，「遺傳修飾」為DNA水準之變化，例如由CRISPR/Cas gRNA及Cas系統例如CRISPR/Cas9 gRNA及Cas9系統誘導。遺傳修飾可包含插入、缺失或取代(亦即，鹼基序列取代，亦即突變)，通常在界定的序列或基因體基因座內。遺傳修飾改變了DNA之核酸序列。遺傳修飾可在單個核苷酸位置處。遺傳修飾可在多個核苷酸處，例如2、3、4、5或更多個核苷酸，通常彼此非常接近，例如連續核苷酸。在重疊之HBV基因體之背景下，遺傳修飾可能在基因體中之多個重疊之ORF處。遺傳修飾可在編碼序列，例如開放閱讀框(ORF)中。如本文所用，遺傳修飾可用於阻止在對界定的序列或基因體基因座進行遺傳修飾前具有全長蛋白質之胺基酸序列的內源全長蛋白質之轉譯。阻止全長蛋白質或基因產物之轉譯包括阻止任何長度之蛋白質或基因產物之轉譯。內源全長蛋白質之轉譯可受到阻止，例如，藉由導致過早終止密碼子之產生的框移突變或藉由無意義突變之產生。遺傳修飾可包括抑制蛋白質活性之修飾，其可能不會相應地降低藉由蛋白質偵測檢定法(例如ELISA或西方墨點法)測定的蛋白質水準。

如本文所用，「治療」應理解為減少疾病或適應症之至少一種徵象或症狀。減少可包括頻率或嚴重程度之降低，使得不再可偵測到疾病之徵象或症狀。治療可包括投與多於一個劑量之劑。舉例而言，在一些實施例中，治療可包括投與2、3、4、5、6、7、8、9或10個劑量。治療可包括與其他劑一起投與。有效治療不需要治癒或完全消除疾病或適應症。疾病之進展或發展速率可與適當匹配之對照(例如群體對照、來自自然病史研究之對照)中之疾病的進展或發展進行比較。如本文所用，術語「治療(treating)」或「治療(treatment)」係指有益的或期望的結果，包括但不限於減輕患有HBV感染之個體之一或多種徵象或症狀，包括但不限於存在血清HBV DNA或肝臟HBV ccc DNA，存在血清或肝臟HBV抗原(例如HBsAg或HBeAg)。徵象或症狀之存在或水準亦可用於監測治療之療效或確定治療之過程(例如，確定一或多個劑量或進一步劑量之投與或量)。舉例而言，在一些實施例中，在向患有HBV感染之個體投與第一劑量之本文提供之嚮導RNA或組合物後，量測臨床標記例如血清HBsAg水準，並且若血清HBsAg大於閾值，則投與後續劑量，視情況其中閾值為100 IU/ml、200 IU/ml、300 IU/ml、400 IU/ml、500 IU/ml、600 IU/ml、700 IU/ml、1800 IU/ml、900 IU/ml或1000 IU/ml。HBV感染之診斷標準為此項技術中熟知的。「治療」亦可意謂與沒有治療之情況下之預期生存期相比延長的生存期，或降低之HCC發生之風險。

在某些實施例中，HBV感染之治療導致B型肝炎之「功能性治癒」。如本文所用，術語「功能性治癒」應理解為循環HBsAg之清除，並且較佳伴隨轉變為HBsAg抗體變得使用臨床相關檢定法不可偵測的狀態。舉例而言，不可偵測之抗體可包括藉由化學發光微粒免疫檢定法(CMIA)或任何其他免疫檢定法量測之低於10 mIU/ml之訊號，並且可以稱為抗HBs血清轉化。功能性治癒不需要清除所有複製形式之HBV (例如，來自肝臟之cccDNA)。每年約0.2-1%之慢性感染患者會自發性發生抗HBs血清轉化。然而，即使在抗HBs血清轉化後，幾十年來仍然觀察到HBV之低水準持續存在，這表明發生了功能性治癒，而不是完全治癒。不受機制限制，提出免疫系統能夠控制HBV。功能性治癒允許停止任何HBV感染之治療。然而，應理解，HBV感染之「功能性治癒」可能不足以預防或治療由HBV感染引起之疾病或疾患，例如肝纖維化、HCC、肝硬化。

在某些實施例中，HBV感染之治療導致B型肝炎之「清除性治癒」。如本文所用，術語「清除性治癒」被理解為所有循環HBsAg之清除，較佳伴隨轉變為HBsAg抗體變得使用臨床相關檢定法不可偵測的狀態，並且藉由臨床相關檢定法(例如肝臟生檢分析)確定清除所有可偵測的HBV複製形式(例如，來自肝臟之cccDNA)。

如本文所用，「遞送」及「投與」可互換使用。

如本文所用，「共同投與」意謂複數種物質在時間上足夠接近地一起投與，使得該等劑一起發揮作用。共同投與涵蓋以單一調配物一起投與物質及以在時間上足夠接近的單獨調配物投與物質，使得該等劑一起發揮作用。

如本文所用，片語「醫藥學上可接受」意謂其可用於製備一般無毒且在生物學上合乎需要且在其他方面為醫藥用途可接受之醫藥組合物。醫藥學上可接受通常係指非熱原性物質。醫藥學上可接受可係指無菌物質，尤其用於注射或輸注之醫藥物質。

提供以下實例以說明某些所揭示之實施例，且不應解釋為以任何方式限制本揭示案之範疇。 II. 組合物 包含嚮導RNA (gRNA)之組合物

本文提供了可用於改變HBV ORF內，例如SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466內，或亦在SEQ ID NO: 1之核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460內之DNA序列(例如，誘導單股斷裂(SSB)或雙股斷裂(DSB))之組合物，例如使用嚮導RNA與RNA指導的DNA結合劑(例如，CRISPR/Cas系統)。靶向HBV ORF之嚮導序列在表1A及表2A中示出，此類嚮導RNA靶向之SEQ ID NO: 1內之靶位點亦在表1A及表2A中示出。

代表性HBV基因體之核酸序列提供為SEQ ID NO: 1： SEQ ID NO: 1

靶向與適當的PAM (例如，Spy Cas9 PAM)相鄰的位點之嚮導序列(例如，如表1A所示)可進一步包含額外的核苷酸，其可以被稱為支架序列或保守部分，以形成crRNA或與trRNA接合以形成sgRNA的crRNA，例如，具有在其3'末端之嚮導序列後的以下示範性核苷酸序列(表3A)。#mer係指當20個核苷酸的嚮導靶向序列包括在表3A中提供之支架序列的5'時crRNA或sgRNA之長度。 表3A：示範性未經修飾之Spy支架序列

#mer	未經修飾之核苷酸序列	SEQ ID NO
42	GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG	193
100	GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU	194
96	GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC	195
97	GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU	196
88	GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC	197
88	GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC	198
88	GGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC	199
90	GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC	200
91	GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	201

表3B：示範性未經修飾之Spy嚮導RNA序列

#mer	未經修飾之核苷酸序列	SEQ ID NO
100	(N)20GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU	202
96	(N)20GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC	203
97	(N)20GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU	204
88	(N)20GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC	205
88	(N)20GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC	206
88	(N)20GGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC	207
90	(N)20GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC	208
91	(N)20GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	209

其中N共同為本文所提供之嚮導序列。

在sgRNA的情況下，嚮導序列可整合到以下經修飾之嚮導支架模體中(表4)。#mer係指當20個核苷酸的嚮導靶向序列(經修飾或未經修飾之序列)包括在表4中提供的支架序列的5'時sgRNA之長度： 表4：示範性經修飾之Spy嚮導支架序列

#mer	經修飾序列	SEQ ID NO
100	GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmUmUmU*mU	210
96	GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC	211
97	GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU	212
88	GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGmUmG*mC	213
88	GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGmUmG*mC	214
88	GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmAmAmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmG*mC	215
90	GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmG*mC	216
90	GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmCmGmAmAmAmGmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmG*mC	217
91	GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUmGmC*mU	218
91	GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmC*mU	219
91	GUUUfUAGmAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCmAmAGUfUmAfAmAfAmUAmAmGmGmCmUmAGUmCmCGUfUAmUmCAmCmGmAmAmAmGmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC*mU	220
91	GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmC*mU	221

其中「m」表示2'-O-Me修飾，「f」表示2'-氟修飾，「*」表示核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵聯，且在經修飾之序列的上下文中無修飾表示RNA (2'-OH)及磷酸二酯酶鍵聯。

在某些實施例中，嚮導序列為經化學修飾之序列。在某些實施例中，經化學修飾之嚮導序列為(mN*)3(N)13-17。在某些實施例中，嚮導序列為(mN*)3(N)17，亦即mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNN。在某些實施例中，(N)13-17或(N)17之各N為未經修飾的。在某些實施例中，(N)13-17或(N)17中之各N獨立地經修飾，例如，獨立地經2'-O-甲基修飾進行修飾。

在sgRNA的情況下，嚮導序列可進一步包含SpyCas9 sgRNA支架序列。SpyCas9 sgRNA支架序列之實例示於下表11中(SEQ ID NO: 268：GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGC - 「示範性SpyCas9 sgRNA-1」)，其包括在嚮導序列之3’末端，且與下表中所示之域一起提供。LS為下部莖。B為凸起。US為上部莖。H1及H2分別為髮夾1及髮夾2。H1及H2統稱為髮夾區。該含有嚮導序列及支架序列之結構之模型在WO2019237069之圖10A中提供，該文獻以引用之方式併入本文中。

示範性SpyCas9 sgRNA-1之核苷酸序列可用作特定化學修飾、序列取代及截短之模板序列。

在某些實施例中，gRNA為例如sgRNA或dgRNA，且其視情況包含化學修飾。在一些實施例中，經修飾sgRNA包含嚮導序列及SpyCas9 sgRNA序列，例如示範性SpyCas9 sgRNA-1。gRNA (諸如sgRNA)可在嚮導序列之5’末端上或在SpyCas9 sgRNA序列之3’末端上包括修飾，諸如在一或多個末端核苷酸處(例如，在3’末端處或在5’末端處之1、2、3或4個核苷酸處)之示範性SpyCas9 sgRNA-1。在某些實施例中，經修飾核苷酸選自2’-O-甲基(2’-OMe)修飾之核苷酸、2’-O-(2-甲氧基乙基) (2’-O-moe)修飾之核苷酸、2’-氟(2’-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯或反向無鹼基修飾之核苷酸；或其組合。在某些實施例中，經修飾核苷酸包括2’-OMe修飾之核苷酸。在某些實施例中，經修飾核苷酸包括PS鍵聯。在某些實施例中，經修飾核苷酸包括2’-OMe修飾之核苷酸及PS鍵聯。

在某些實施例中，使用SEQ ID NO: 268：GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGC 「示範性SpyCas9 sgRNA-1」，參見WO2019237069，其內容以引用之方式併入本文中。示範性SpyCas9 sgRNA-1之各部分及位置編號方案在下表11中列出。

作為實例，示範性SpyCas9 sgRNA-1進一步包括以下中之一或多者： A. 經縮短之髮夾1區，或經取代及視情況經縮短之髮夾1區，其中 1. 髮夾1中以下核苷酸對中之至少一者經沃森-克里克配對核苷酸取代：H1-1與H1-12、H1-2與H1-11、H1-3與H1-10或H1-4與H1-9，且該髮夾1區視情況缺少 a. H1-5至H1-8中之任一者或兩者， b. 以下核苷酸對中之一者、兩者或三者：H1-1與H1-12、H1-2與H1-11、H1-3與H1-10及H1-4與H1-9，或 c. 髮夾1區之1-8個核苷酸；或 2. 該經縮短之髮夾1區缺少4-8個核苷酸，較佳4-6個核苷酸；且 a. 位置H1-1、H1-2或H1-3中之一或多者相對於示範性SpyCas9 sgRNA-1 (SEQ ID NO: 268)缺失或經取代，或 b. 位置H1-6至H1-10中之一或多者相對於示範性SpyCas9 sgRNA-1 (SEQ ID NO: 268)經取代；或者 3. 該經縮短之髮夾1區缺少5-10個核苷酸，較佳5-6個核苷酸，並且位置N18、H1-12或n中之一或多者相對於示範性SpyCas9 sgRNA-1 (SEQ ID NO: 268)經取代；或者 B. 經縮短之上部莖區，其中該經縮短之上部莖區缺少1-6個核苷酸且其中該經縮短之上部莖區之6、7、8、9、10或11個核苷酸包括相對於示範性SpyCas9 sgRNA-1 (SEQ ID NO: 268)之少於或等於4個取代；或者 C. 在LS6、LS7、US3、US10、B3、N7、N15、N17、H2-2及H2-14中之任一或多者處相對於示範性SpyCas9 sgRNA-1 (SEQ ID NO: 268)之取代，其中該取代核苷酸不為後面有腺嘌呤之嘧啶，亦不為前面有嘧啶之腺嘌呤；或者 D. 具有上部莖區之示範性SpyCas9 sgRNA-1 (SEQ ID NO: 268)，其中上部莖修飾包含對該上部莖區中US1-US12中之任一或多者的修飾，其中 1. 經修飾之核苷酸視情況選自2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、反向無鹼基修飾之核苷酸或其組合；或 2. 經修飾之核苷酸視情況包括2’-OMe修飾之核苷酸。

靶向與適當的PAM (例如，NmeCas9 PAM)相鄰的位點之嚮導序列(例如，如表2A所示)可進一步包含額外的核苷酸以形成crRNA或與trRNA接合以形成sgRNA之crRNA，例如具有在其3'末端之嚮導序列後的示範性核苷酸序列(如表5中所提供)。示範性NmeCas9 sgRNA之各部分及位置編號方案(包括嚮導序列及支架序列)在下表13中列出。

在某些實施例中，使用SEQ ID NO: 455 (「示範性NmeCas9 sgRNA-1」)作為實例，示範性NmeCas9 sgRNA-1包括： A. 一種嚮導RNA (gRNA)，其包含嚮導區及保守區，該保守區包含以下中之一或多者： (a) 經縮短之重複/反重複區，其中該經縮短之重複/反重複區缺少2-24個核苷酸，其中 (i) 相對於SEQ ID NO: 455，核苷酸37-48及53-64中之一或多者缺失，且視情況核苷酸37-64中之一或多者經取代；且 (ii) 核苷酸36藉由至少2個核苷酸與核苷酸65連接；或者 (b) 經縮短之髮夾1區，其中該經縮短之髮夾1缺少2-10，視情況2-8個核苷酸，其中 (i) 相對於SEQ ID NO: 455，核苷酸82-86及91-95中之一或多者缺失，且視情況位置82-96中之一或多者經取代；且 (ii) 核苷酸81藉由至少4個核苷酸與核苷酸96連接；或者 (c) 經縮短之髮夾2區，其中該經縮短之髮夾2缺少2-18，視情況2-16個核苷酸，其中 (i) 相對於SEQ ID NO: 455，核苷酸113-121及126-134中之一或多者缺失，且視情況核苷酸113-134中之一或多者經取代；且 (ii) 核苷酸112藉由至少4個核苷酸與核苷酸135連接；其中核苷酸144-145中之一或兩個相對於SEQ ID NO: 455視情況缺失；其中視情況至少10個核苷酸為經修飾之核苷酸。

示範性未經修飾之保守核苷酸序列亦稱為支架序列，示於表5中。#mer係指當24個核苷酸之嚮導靶向序列包括在表5中提供之支架序列的5'時sgRNA之長度。 表5：未經修飾之Nme保守區核苷酸序列

#mer	未經修飾之保守部分核苷酸序列	SEQ ID NO
145	GUUGUAGCUCCCUUUCUCAUUUCGGAAACGAAA UGAGAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCUGAAA AGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCCCUUAAAGCUU CUGCUUUAAGGGGCAUCGUUUA	222
101	GUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAU AAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUC UGCCUUCUGGCAUCGUU	223
105	GUUGUAGCUCCCUUCGAAAGACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	224
107	GUUGUAGCUCCCUGGAAACCCGUUGCUACA AUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGC UCUGCCUUCUGGCAUCGUUUAUU	225

在sgRNA之情況下，經修飾之嚮導序列可整合至以下示範性經修飾之保守部分模體(表6)之一中。#mer係指當24個核苷酸的嚮導靶向序列(經修飾或未經修飾之序列)包括在表6中提供的支架序列的5'時sgRNA之長度： 表6：示範性經修飾之保守區Nme嚮導RNA模體

#mer	經修飾之保守部分核苷酸序列	SEQ ID NO
101	mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUCmGmUmU	226
101	mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmU*mU	227
101	mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	228
101	mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmU*mU	229
101	mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	230
105	mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmU*mU	231
105	mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	232
105	mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmU*mU	233
105	mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	234

其中「m」指示2’-O-Me修飾，且「*」指示核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵聯，且在經修飾序列之上下文中無修飾指示RNA (2’-OH)及硫代磷酸酯鍵聯。靶向序列存在於嚮導RNA保守部分的5'末端。在某些實施例中，靶向序列之長度為20-25、較佳22-24個核苷酸。在某些實施例中，嚮導靶向序列包含一或多個化學修飾，例如嚮導RNA之5'末端的核苷酸1、2及3中之一或多個，視情況所有核苷酸1、2及3之修飾。在某些實施例中，修飾包含2'-O-Me修飾。在某些實施例中，修飾包含2'-O-Me修飾及與3'核苷酸之硫代磷酸酯鍵聯，例如(mN*)3(N)17-22、較佳(mN*)3(N)21，其中(N)21部分中之各核苷酸獨立地經修飾或未經修飾。在某些實施例中，示範性SpyCas9 sgRNA-1、示範性NmeCas9 sgRNA-1或sgRNA (諸如包含示範性SpyCas9 sgRNA-1之sgRNA)進一步包括3’尾，例如1、2、3、4或更多個核苷酸之3’尾。在某些實施例中，該尾包括一或多個經修飾核苷酸。在某些實施例中，經修飾核苷酸選自2’-O-甲基(2’-OMe)修飾之核苷酸、2’-O-(2-甲氧基乙基) (2’-O-moe)修飾之核苷酸、2’-氟(2’-F)修飾之核苷酸、2’去氧(2’H-)修飾之核苷酸、無鹼基核苷酸、鎖核酸(LNA)核苷酸、解鎖核酸(UNA)核苷酸或核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、末端反向無鹼基修飾之核苷酸；或其組合。在某些實施例中，經修飾核苷酸包括2’-OMe修飾之核苷酸。在某些實施例中，經修飾核苷酸包括核苷酸之間的PS鍵聯。在某些實施例中，經修飾核苷酸包括2’-OMe修飾之核苷酸及核苷酸之間的PS鍵聯。

在某些實施例中，髮夾區包括一或多個經修飾核苷酸。在某些實施例中，經修飾核苷酸選自2’-O-甲基(2’-OMe)修飾之核苷酸、2’-O-(2-甲氧基乙基) (2’-O-moe)修飾之核苷酸、2’-氟(2’-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、反向無鹼基修飾之核苷酸；或其組合。在某些實施例中，經修飾核苷酸包括2’-OMe修飾之核苷酸。

在某些實施例中，上部莖區包括一或多個經修飾核苷酸。在某些實施例中，經修飾核苷酸選自2’-O-甲基(2’-OMe)修飾之核苷酸、2’-O-(2-甲氧基乙基) (2’-O-moe)修飾之核苷酸、2’-氟(2’-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、反向無鹼基修飾之核苷酸；或其組合。在某些實施例中，經修飾核苷酸包括2’-OMe修飾之核苷酸。

在某些實施例中，示範性SpyCas9 sgRNA-1或示範性NmeCas9 sgRNA-1包含一或多個YA二核苷酸，其中Y為嘧啶，其中YA二核苷酸包括經修飾核苷酸。在某些實施例中，經修飾核苷酸選自2’-O-甲基(2’-OMe)修飾之核苷酸、2’-O-(2-甲氧基乙基) (2’-O-moe)修飾之核苷酸、2’-氟(2’-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、反向無鹼基修飾之核苷酸或其組合。在某些實施例中，經修飾核苷酸包括2’-OMe修飾之核苷酸。

在某些實施例中，示範性SpyCas9 sgRNA-1或示範性NmeCas9 sgRNA-1包含一或多個YA二核苷酸，其中Y為嘧啶，其中YA二核苷酸包括序列取代之核苷酸，其中嘧啶取代嘌呤。在某些實施例中，當嘧啶在單一嚮導中形成沃森-克里克鹼基對時，序列取代之嘧啶核苷酸的基於沃森-克里克之核苷酸經取代以維持沃森-克里克鹼基配對。 含有連接子之gRNA

在某些實施例中，gRNA包含一或多個內部連接子。如本文所用，「內部連接子」描述接合嚮導RNA內之兩個核苷酸之非核苷酸區段。若gRNA含有間隔區，則內部連接子位於間隔區外部(例如，在gRNA之支架或保守區中)。對於V型嚮導，應理解最後的髮夾為結構(亦即，重複-反重複區)中之唯一髮夾。內部連接子之長度可取決於例如由連接子替換之核苷酸數以及連接子在gRNA中之位置。WO2022261292中提供了內部連接子及其在gRNA背景下的用途。

本文所揭示之gRNA可包含內部連接子。一般而言，可使用與gRNA之功能相容之任何內部連接子。連接子具有一定程度之撓性可能是理想的。在一些實施例中，內部連接子包含至少兩個、三個、四個、五個、六個或更多個路徑上(on-pathway)單鍵。若某個鍵為5'及3'位置連接至連接子的兩個核苷酸之間鍵之最短路徑的一部分，則該鍵在路徑上。

如本文所用，內部連接子之長度可由其橋接長度來定義。如本文所用之內部連接子之「橋接長度」係指從連接子之第一個原子(與前面的核苷酸之3'取代基，諸如氧或磷酸基結合)至連接子之最後一個原子(與後面的核苷酸之5'取代基，諸如氧或磷酸基結合)的路徑上最短的原子鏈中之原子的距離或數量(例如，在下述式(I)之結構中從~至#)。下表提供了各種連接子之近似預測橋接長度。

示範性的按原子數、乙二醇單元數、假定乙二醇單體為約3.7埃之近似連接子長度(以埃為單位)預測的連接子長度以及取代髮夾結構之至少整個環部分之合適位置提供於下表7中。兩個核苷酸之取代需要至少約11埃之連接子長度。至少3個核苷酸之取代需要至少約16埃之連接子長度。表7

原子數	乙二醇單元數	近似長度(以埃為單位)	完整環取代之合適位置
3	1	3.7	重複-反重複(當不存在莖時，適用於環及莖)
6	2	7.4	重複-反重複(當不存在莖時，適用於環及莖)
9	3	11.1	重複-反重複(當不存在莖時，適用於環及莖)，連結(Nexus)
12	4	14.8	連結
15	5	18.5	重複-反重複，髮夾1，髮夾2
18	6	22.2	重複-反重複，髮夾1，髮夾2
21	7	25.9	重複-反重複，髮夾1，髮夾2
24	8	29.6	重複-反重複，髮夾1，髮夾2
27	9	33.3	重複-反重複，髮夾1，髮夾2
30	10	37	重複-反重複，髮夾1，髮夾2

在一些實施例中，內部連接子包含式(I)之結構： ~-L0-L1-L2-# (I) 其中： ~表示與前面的核苷酸之3'取代基之鍵； #表示與後面的核苷酸之5'取代基之鍵； L0為空或C _1-3脂族； L1為–[E ¹-(R ¹)] _m-，其中各R ¹獨立地為C _1-5脂族基，視情況經1或2個E ²取代，各E ¹及E ²獨立地為氫鍵受體，或各自獨立地選自環烴及雜環烴，且各m為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；且 L2為空，C _1-3脂族，或為氫鍵受體。

在一些實施例中，L1包含一或多個-CH ₂CH ₂O-、-CH ₂OCH ₂-或-OCH ₂CH ₂-單元(「乙二醇次單元」)。在一些實施例中，-CH ₂CH ₂O-、-CH ₂OCH ₂-或-OCH ₂CH ₂-單元之數目在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的範圍內。

在一些實施例中，m為1、2、3、4或5。在一些實施例中，m為1、2或3。在一些實施例中，m為6、7、8、9或10。

在一些實施例中，L0為空。在一些實施例中，L0為-CH ₂-或-CH ₂CH ₂-。

在一些實施例中，L2為空。在一些實施例中，L2為-O-、-S-或C _1-3脂族。在一些實施例中，L2為-O-。在一些實施例中，L2為-S-。在一些實施例中，L2為-CH ₂-或-CH ₂CH ₂-。

在本文的表中，L1及L2視情況分別為C9及C18，如下：

在某些實施例中，內部連接子具有約3-30個原子，視情況12-21個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少2個核苷酸。在某些實施例中，內部連接子具有約6-18個原子，視情況約6-12個原子之橋接長度，且連接子取代gRNA之至少2個核苷酸。在某些實施例中，內部連接子取代2-12個核苷酸。

在一些實施例中，嚮導RNA包含SEQ ID NO: 268或SEQ ID NO: 455之核酸序列，包括本文別處所揭示之修飾。表8顯示了具有可能數量之內部連接子及位置之gRNA結構及種類的各種實施例。 表8.

gRNA 結構	類型	# 內部連接子	內部連接子之位置
重複/反重複；連結；Hp1；Hp2	Spy	3	重複/反重複區；連結(髮夾內或替換髮夾)，髮夾1 (Hp1)
重複/反重複；連結；Hp1；Hp2	Spy	2	重複/反重複；連結(髮夾內或替換髮夾)，Hp1中之任兩個
重複/反重複；連結；Hp1；Hp2	Spy	1	重複/反重複；連結(髮夾內或替換髮夾)，Hp1中之任一個
重複/反重複；Hp1；Hp2	Nme	3	全部重複/反重複；Hp1；Hp2
重複/反重複；Hp1；Hp2	Nme	2	重複/反重複；Hp1；Hp2中之任兩個
重複/反重複；Hp1；Hp2	Nme	1	重複/反重複；Hp1；Hp2中之任一個

在某些實施例中，內部連接子在gRNA之重複-反重複區中。在某些實施例中，內部連接子取代gRNA之重複-反重複區之至少4個核苷酸。在某些實施例中，內部連接子取代Spy Cas9 gRNA之重複-反重複區中之環，對應於SEQ ID NO: 268中之核苷酸13-16。在某些實施例中，內部連接子取代Nme Cas9 gRNA之重複-反重複區中之環，對應於SEQ ID NO: 455中之核苷酸49-52。

在某些實施例中，內部連接子取代gRNA之連結區之2、3或4個核苷酸。在某些實施例中，內部連接子取代Spy Cas9 gRNA之連結區中之環，對應於SEQ ID NO: 268之核苷酸33-36。

在某些實施例中，內部連接子在gRNA之髮夾區中。在某些實施例中，內部連接子取代gRNA之髮夾區之至少4個核苷酸。在某些實施例中，內部連接子取代Spy Cas9 gRNA之髮夾1區中之環，對應於SEQ ID NO: 268中之核苷酸53-56。在某些實施例中，內部連接子取代Nme Cas9 gRNA之髮夾1區中之環，對應於SEQ ID NO: 455中之核苷酸87-90。在某些實施例中，內部連接子取代Nme Cas9 gRNA之髮夾2區中之環的至少4個核苷酸，對應於SEQ ID NO: 455中之核苷酸122-125。在某些實施例中，內部連接子取代Nme Cas9 gRNA之髮夾1區中之環(對應於SEQ ID NO: 455中之核苷酸87-90)，且取代Nme Cas9 gRNA之髮夾2區中之環的至少4個核苷酸(對應於SEQ ID NO: 455中之核苷酸122-125)。 表9. 包含連接子之示範性SpyCas9嚮導RNA

SEQ ID NO:	gRNA 序列
235、742、743及744	NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUA(L1)UAGCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCAACUU(L1)AAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
236、745、746及747	NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUA(L1)UAGCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGUGC
237、748、749及750	mNmNmNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmA(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGmUmGmC
238、751、752及753	mNmNmNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmA(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCA(L1)GGCACCGAGUCGGmUmGmC
239、754、755及756	mNmNmNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmU(L1)mAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGmUmGmC
240、757、758及759	mNmNmNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmU(L1)mAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCA(L1)GGCACCGAGUCGGmUmGmC
241、760、761及762	mNmNmNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmU(L1)mAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCA(L1)GGCACCGAGUCGGmUmGmC
242、763、764及765	mNmNmNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmU(L1)mAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCA(L1)GGCACCGAGUCGGmUmGmC
243、766、767及768	mNmNmNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmA(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGmUmGmC
244、769、770及771	mNmNmNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmA(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCA(L1)GGCACCGAGUCGGmUmGmC
245、772、773及774	mNmNmNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmU(L1)mAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGmUmGmC
246、775、776及777	mNmNmNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmU(L1)mAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC(L2)GUCCGUUAUCA(L1)GGCACCGAGUCGGmUmGmC
247及778	mNmNmNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGA(dS)AAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU
248及779	mNmNmNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGA(L4)AAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU
249及780	mNmNmNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGA(L3)AAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU
250及781	mNmNmNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGA(L2)AAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU
251及782	mNmNmNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGA(L1)AAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU
252、783及784	mNmNmNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmC(L1)mGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU
253、785及786	mNmNmNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmA(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU
254、787及788	mNmNmNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmA(L1)mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAC(L1)GGGCACCGAGUmCmGmGmUmGmCmU

經修飾之序列中的核苷酸修飾在表9中如下所示：其中「m」表示2'-O-Me修飾，「*」表示核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵聯，並且在單獨指定的核苷酸內，無修飾表示具有磷酸二酯酶主鏈之RNA (2'-OH)。(dS)表示具有1’,2’-二去氧核糖修飾之無鹼基位點，(L3)表示連接子為S6，且(L4)表示連接子為S3。 表10. 包含連接子之示範性NmeCas9嚮導RNA

SEQ ID NO:	gRNA 序列
255、789及790	(N) _20-25GUUGUAGCUCCCUUC (L1)GACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUC (L1)GAUGUGCCGCAACGCUCUGCC (L1)GGCAUCGUU
256、791及792	mNmNmNmNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmC( L1)mGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmC( L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC( L1)GGCAUCGmUmU
257、793及794	mNmNmNmNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmUmU
258、795及796	NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU
259、797及798	(N) _20-25GUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU
260、799及800	(N) _20-25GUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmG(L1)mCmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmUmU
261、801及802	(N) _20-25GUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmG(L1)mCmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmUmU
262、803及804	(N) _20-25GUUGmUmAmGmCUCCCmUmG(L1)mCmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmUmU
263、805及806	(N) _20-25GUUGmUmAmGmCUCCCmG(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmUmU
264、807及808	(N) _20-25GUUGmUmAmGmCUCCmG(L1)mCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmUmU
265、809及810	(N) _20-25GUUGmUmAmGmCUCC(L1)GUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmUmU
266、811及812	(N) _20-25GUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmG(L1)mCmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmU(L1)mAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmUmU
267、813、814及815	(N) _20-25GUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmG(L1)mCmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmU(L1)mAGGCAUCGmUmU

經修飾之序列中的核苷酸修飾在表10中如下所示：其中「m」表示2'-O-Me修飾，「*」表示核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵聯，並且在單獨指定的核苷酸內，無修飾表示具有磷酸二酯酶主鏈之RNA (2'-OH)。即使在經修飾之序列的情況下，(N)20-25之各核苷酸視情況獨立地經修飾。在某些實例中，至少前三個核苷酸經修飾，例如(mN*)3(N)17-22。 表11. 示範性spyCas9 sgRNA-1 (SEQ ID NO: 268)

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	21	22	23	24	25	26	27	28	29	30
G	U	U	U	U	A	G	A	G	C	U	A	G	A	A	A	U	A	G	C	A	A	G	U	U	A	A	A	A	U
LS1-LS6	B1-B2	US1-US12	B3-B6	LS7-LS12

31	32	33	34	35	36	37	38	39	40	41	42	43	44	45	46	47	48	49	50	51	52	53	54	55	56	57	58	59	60
A	A	G	G	C	U	A	G	U	C	C	G	U	U	A	U	C	A	A	C	U	U	G	A	A	A	A	A	G	U
連結	H1-1至H1-12

61	62	63	64	65	66	67	68	69	70	71	72	73	74	75	76
G	G	C	A	C	C	G	A	G	U	C	G	G	U	G	C
N	H2-1至H2-15

表12：靶向HBV之示範性Spy-Cas9 sgRNA序列

嚮導編號	股	未經修飾之完整嚮導序列	SEQ ID	經修飾之完整嚮導序列	SEQ ID
G028550	-	CACCACGAGUCUAGACUCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	269	mCmAmCCACGAGUCUAGACUCUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU	362
G028551	+	UACCGCAGAGUCUAGACUCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	270	mUmAmCCGCAGAGUCUAGACUCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU	363
G028552	+	CGCAGAGUCUAGACUCGUGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	271	mCmGmCAGAGUCUAGACUCGUGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU	364
G028553	-	CAGCGAUAACCAGGACAAGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	272	mCmAmGCGAUAACCAGGACAAGUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU	365
G028554	-	UGUUCUCCAUGUUCAGCGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	273	mUmGmUUCUCCAUGUUCAGCGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU	366
G028555	-	AUGUUCUCCAUGUUCAGCGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	274	mAmUmGUUCUCCAUGUUCAGCGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU	367
G030414	-	GAGGUGAAGCGAAGUGCACAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	275	mGmAmGGUGAAGCGAAGUGCACAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU	368
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G030481	+	UCUUUCCACCAGCAAUCCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	342	mUmCmUUUCCACCAGCAAUCCUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU	435
G030482	-	GGCUGGAUCCAACUGGUGGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	343	mGmGmCUGGAUCCAACUGGUGGUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU	436
G030483	+	AGGUAGGAGCUGGAGCAUUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	344	mAmGmGUAGGAGCUGGAGCAUUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU	437
G030484	+	GACGCCAACAAGGUAGGAGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	345	mGmAmCGCCAACAAGGUAGGAGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU	438
G030485	-	AGCCACCAGCAGGGAAAUACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	346	mAmGmCCACCAGCAGGGAAAUACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU	439
G030486	-	GCUCCUACCUUGUUGGCGUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	347	mGmCmUCCUACCUUGUUGGCGUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU	440
G030487	+	UCAAUCCCAACAAGGACACCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	348	mUmCmAAUCCCAACAAGGACACCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU	441
G030488	-	GGAUGAUGGGAUGGGAAUACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	349	mGmGmAUGAUGGGAUGGGAAUACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU	442
G030489	+	UGCUGUACCAAACCUUCGGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	350	mUmGmCUGUACCAAACCUUCGGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU	443
G030490	-	ACCAGGACAAGUUGGAGGACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	351	mAmCmCAGGACAAGUUGGAGGACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU	444
G030491	-	UAGGAAUUUUCCGAAAGCCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	352	mUmAmGGAAUUUUCCGAAAGCCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU	445
G030492	-	UUCCGAAAGCCCAGGAUGAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	353	mUmUmCCGAAAGCCCAGGAUGAUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU	446
G030493	-	UUUCCGAAAGCCCAGGAUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	354	mUmUmUCCGAAAGCCCAGGAUGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU	447
G030494	-	GCAUUUGGUGGUCUAUAAGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	355	mGmCmAUUUGGUGGUCUAUAAGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU	448
G030495	-	UUUGGUGGUCUAUAAGCUGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	356	mUmUmUGGUGGUCUAUAAGCUGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU	449
G030496	+	UCAGGCAAGCAAUUCUUUGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	357	mUmCmAGGCAAGCAAUUCUUUGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU	450
G030497	+	CAGGCAAGCAAUUCUUUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	358	mCmAmGGCAAGCAAUUCUUUGCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU	451
G030498	+	UGCAAUUGAUUAUGCCUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	359	mUmGmCAAUUGAUUAUGCCUGCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU	452
G030499	+	GCAAGCAAUUCUUUGCUGGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	360	mGmCmAAGCAAUUCUUUGCUGGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU	453
G030500	+	GGCAAGCAAUUCUUUGCUGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU	361	mGmGmCAAGCAAUUCUUUGCUGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU	454

經修飾之序列中的核苷酸修飾在表12中如下所示：其中「m」表示2'-O-Me修飾，「*」表示核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵聯，並且在單獨指定的核苷酸內，無修飾表示RNA (2'-OH)。 表13： 示範性NmeCas9 sgRNA (SEQ ID NO: 455)

1-24	25	26	27	28	29	30	31	32	33	34	35	36	37	38	39	40	41	42	43	44	45	46	47	48
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN	G	U	U	G	U	A	G	C	U	C	C	C	U	U	U	C	U	C	A	U	U	U	C	G
	下部莖		上部莖
嚮導區	重複/反重複區

49	50	51	52	53	54	55	56	57	58	59	60	61	62	63	64	65	66	67	68	69	70	71	72	73	74	75	76	77
G	A	A	A	C	G	A	A	A	U	G	A	G	A	A	C	C	G	U	U	G	C	U	A	C	A	A	U	A
環	上部莖		下部莖
重複/反重複區

78	79	80	81	82	83	84	85	86	87	88	89	90	91	92	93	94	95	96	97	98	99	100	101	102	103	104	105	106	107	108
A	G	G	C	C	G	U	C	U	G	A	A	A	A	G	A	U	G	U	G	C	C	G	C	A	A	C	G	C	U	C
莖	環	莖(96：未配對)		下部莖	凸起
髮夾1		髮夾2

109	110	111	112	113	114	115	116	117	118	119	120	121	122	123	124	125	126	127	128	129	130	131	132	133	134
U	G	C	C	C	C	U	U	A	A	A	G	C	U	U	C	U	G	C	U	U	U	A	A	G	G
上部莖	環	上部莖
髮夾2

135	136	137	138	139	140	141	142	143	144	145
G	G	C	A	U	C	G	U	U	U	A
上部莖	凸起	下部莖
髮夾2	尾

表14：靶向HBV之示範性Nme-Cas9 sgRNA序列

嚮導編號	股	未經修飾之完整嚮導序列	SEQ ID	經修飾之完整嚮導序列	SEQ ID
G027218	+	ACCGUGUGUCUUGGCCAAAAUUCGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	456	mAmCmCmGmUGUmGmUCmUUmGGCCAmAAAUmUCGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	554
G027219	+	CCGUGUGUCUUGGCCAAAAUUCGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	457	mCmCmGmUmGUGmUmCUmUGmGCCAAmAAUUmCGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	555
G027220	+	CGUGUGUCUUGGCCAAAAUUCGCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	458	mCmGmUmGmUGUmCmUUmGGmCCAAAmAUUCmGCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	556
G027221	+	UGUCUUGGCCAAAAUUCGCAGUCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	459	mUmGmUmCmUUGmGmCCmAAmAAUUCmGCAGmUCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	557
G027222	+	CUUGGCCAAAAUUCGCAGUCCCCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	460	mCmUmUmGmGCCmAmAAmAUmUCGCAmGUCCmCCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	558
G027223	+	GUUCUUCUGGACUAUCAAGGUAUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	461	mGmUmUmCmUUCmUmGGmACmUAUCAmAGGUmAUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	559
G027224	+	GGUUCUUCUGGACUAUCAAGGUAUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	462	mGmGmUmUmCUUmCmUGmGAmCUAUCmAAGGmUAUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	560
G027225	-	UCUCCAUGUUCAGCGCAGGGUCCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	463	mUmCmUmCmCAUmGmUUmCAmGCGCAmGGGUmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	561
G027226	-	GAUGUUCUCCAUGUUCAGCGCAGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	464	mGmAmUmGmUUCmUmCCmAUmGUUCAmGCGCmAGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	562
G027227	-	UGAUGUUCUCCAUGUUCAGCGCAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	465	mUmGmAmUmGUUmCmUCmCAmUGUUCmAGCGmCAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	563
G027228	-	GUGAUGUUCUCCAUGUUCAGCGCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	466	mGmUmGmAmUGUmUmCUmCCmAUGUUmCAGCmGCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	564
G030095	-	ACUGAACAAAUGGCACUAGUAAACGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	467	mAmCmUmGmAACmAmAAmUGmGCACUmAGUAmAACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	565
G030096	-	GAGGCGAGGGAGUUCUUCUUCUAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	468	mGmAmGmGmCGAmGmGGmAGmUUCUUmCUUCmUAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	566
G030097	+	GGAUGUGUCUGCGGCGUUUUAUCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	469	mGmGmAmUmGUGmUmCUmGCmGGCGUmUUUAmUCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	567
G030098	+	UUUGUUCAGUGGUUCGUAGGGCUUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	470	mUmUmUmGmUUCmAmGUmGGmUUCGUmAGGGmCUUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	568
G030099	-	GGUUGCGUCAGCAAACACUUGGCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	471	mGmGmUmUmGCGmUmCAmGCmAAACAmCUUGmGCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	569
G030100	+	CCAUUUGUUCAGUGGUUCGUAGGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	472	mCmCmAmUmUUGmUmUCmAGmUGGUUmCGUAmGGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	570
G030101	+	CAUUUGUUCAGUGGUUCGUAGGGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	473	mCmAmUmUmUGUmUmCAmGUmGGUUCmGUAGmGGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	571
G030102	-	AAAACGCCGCAGACACAUCCAGCGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	474	mAmAmAmAmCGCmCmGCmAGmACACAmUCCAmGCGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	572
G030103	+	CCAGCACCAUGCAACUUUUUCACCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	475	mCmCmAmGmCACmCmAUmGCmAACUUmUUUCmACCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	573
G030104	-	CUGAGCCUGAGGGCUCCACCCCAAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	476	mCmUmGmAmGCCmUmGAmGGmGCUCCmACCCmCAAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	574
G030105	+	AGGCUGUAGGCAUAAAUUGGUCUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	477	mAmGmGmCmUGUmAmGGmCAmUAAAUmUGGUmCUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	575
G030106	+	CAGUCCCCAACCUCCAAUCACUCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	478	mCmAmGmUmCCCmCmAAmCCmUCCAAmUCACmUCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	576
G030107	+	AACCUCCAAUCACUCACCAACCUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	479	mAmAmCmCmUCCmAmAUmCAmCUCACmCAACmCUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	577
G030108	-	AGGAUUCUUGUCAACAAGAAAAACGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	480	mAmGmGmAmUUCmUmUGmUCmAACAAmGAAAmAACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	578
G030109	+	CUGUGCCAAGUGUUUGCUGACGCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	481	mCmUmGmUmGCCmAmAGmUGmUUUGCmUGACmGCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	579
G030110	-	UGUGAGGAUUCUUGUCAACAAGAAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	482	mUmGmUmGmAGGmAmUUmCUmUGUCAmACAAmGAAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	580
G030111	-	UUGUGAGGAUUCUUGUCAACAAGAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	483	mUmUmGmUmGAGmGmAUmUCmUUGUCmAACAmAGAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	581
G030112	+	UCUGUGCCAAGUGUUUGCUGACGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	484	mUmCmUmGmUGCmCmAAmGUmGUUUGmCUGAmCGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	582
G030113	+	GUCCUACUGUUCAAGCCUCCAAGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	485	mGmUmCmCmUACmUmGUmUCmAAGCCmUCCAmAGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	583
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G030115	-	ACAGACUUGGCCCCCAAUACCACAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU	487	mAmCmAmGmACUmUmGGmCCmCCCAAmUACCmACAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	585
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經修飾之序列中的核苷酸修飾在表14中如下所示：其中「m」表示2'-O-Me修飾，「*」表示核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵聯，並且在單獨指定的核苷酸內，無修飾表示RNA (2'-OH)。在某些實施例中，基於上述示範性NmeCas9 sgRNA中提供的編號，經修飾之嚮導序列不包括核苷酸76與77之間的硫代磷酸酯鍵聯。

在一些實施例中，提供了一種包含一或多種嚮導RNA (gRNA)之組合物，該一或多種嚮導RNA包含靶向序列，該等靶向序列將RNA指導的DNA結合劑引導至HBV基因體中之靶DNA序列，該RNA指導的DNA結合劑可為核酸酶(例如，Cas核酸酶，諸如Cas9)。在一些實施例中，提供了一種包含HBV序列中之遺傳修飾的肝細胞，例如整合至細胞之內源基因體中之HBV序列，或作為細胞質中之cccDNA，在HBV之靶位點內。在一些實施例中，提供了在HBV序列中包含遺傳修飾之工程化細胞，其中該遺傳修飾包含對應於選自表1A、2A、8或9之HBV靶向序列，或者與SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、1-843、1-1205、2314-3188、1381-1846或1821-2460之至少17、18、19、20、21、22、23或24個連續核苷酸互補之基因體坐標內的至少一個核苷酸之修飾。例如，SEQ ID NO: 1之核苷酸57-76、66-85、126-145、153-173、153-172、154-173、240-269、240-259、245-264、248-267、250-269、269-288、356-392、356-375、361-380、364-383、373-392、423-445、423-442、426-445、574-593、608-627、621-655、621-640、622-641、629-648、629-648、630-649、635-654、636-655、686-705、694-716、694-713、695-714、697-716、713-732、725-744、1597-1616、1817-1836、1845-1864、1867-1886、1880-1903、1880-1899、1883-1902、1884-1903、2072-2094、2072-2091、2073-2092、2075-2094、2299-2318、2348-2367、2634-2653、2867-2887、2867-2886、2868-2887、2891-2910、2956-2975或2982-3001；視情況核苷酸153-173、153-172、154-173或250-269中之17、18、較佳19或20個連續核苷酸或者其互補序列，其中嚮導RNA為Spy Cas9嚮導RNA；或者例如SEQ ID NO: 1之核苷酸35-58、146-169、153-176、216-239、330-356、330-353、333-356、342-365、447-470、666-689、713-736、740-763、755-778、1390-1413、1836-1859、2635-2658、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸146-169、153-176、330-356、330-353、333-356、447-470、713-736、740-763、755-778、1390-1413、2951-2974或2958-2981；視情況核苷酸146-169、153-176、330-356、330-353、333-356、447-470、713-736、740-763、755-778、1390-1413、2951-2974或2958-2981；視情況核苷酸447-470、330-353、755-778或713-736中之20、21、較佳22、23或24個連續核苷酸或者其互補序列，其中嚮導RNA為Nme Cas9嚮導RNA。應理解，HBV基因型之間存在顯著的序列變異，並且為SEQ ID NO: 1提供之序列編號可能不對應於其他HBV基因體序列之核苷酸序列編號。如本文所用，SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、1-843、1-1205、2314-3188、1381-1846或1821-2460，例如SEQ ID NO: 1之核苷酸57-76、66-85、126-145、153-173、153-172、154-173、240-269、240-259、245-264、248-267、250-269、269-288、356-392、356-375、361-380、364-383、373-392、423-445、423-442、426-445、574-593、608-627、621-655、621-640、622-641、629-648、629-648、630-649、635-654、636-655、686-705、694-716、694-713、695-714、697-716、713-732、725-744、1597-1616、1817-1836、1845-1864、1867-1886、1880-1903、1880-1899、1883-1902、1884-1903、2072-2094、2072-2091、2073-2092、2075-2094、2299-2318、2348-2367、2634-2653、2867-2887、2867-2886、2868-2887、2891-2910、2956-2975或2982-3001；視情況核苷酸153-173、153-172、154-173或250-269；或者例如SEQ ID NO: 1之核苷酸35-58、146-169、153-176、216-239、330-356、330-353、333-356、342-365、447-470、666-689、713-736、740-763、755-778、1390-1413、1836-1859、2635-2658、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸146-169、153-176、330-356、330-353、333-356、447-470、713-736、740-763、755-778、1390-1413、2951-2974或2958-2981；視情況核苷酸447-470、330-353、755-778或713-736，或者對應於如表1A、2A、12或14中提供之HBV靶向序列之基因體坐標內的至少一個核苷酸之基因體修飾應理解為與上文提供之示範性靶向序列中之至少20個連續核苷酸至少80%、85%、較佳90%或95%一致或互補，或者與其中之至少24個連續核苷酸至少80%、85%、較佳90%或95%一致或互補的序列內之至少一個修飾。在一些實施例中，提供了在HBV序列中包含遺傳修飾之工程化細胞，其中該遺傳修飾包含靶位點內之至少一個核苷酸之修飾，亦即，在與分別在表1A及表2A中提供之示範性靶位點中之至少20個連續核苷酸至少80%、85%、較佳90%或95%一致或互補，或者與其中之至少24個連續核苷酸至少80%、85%、較佳90%或95%一致或互補之核苷酸序列內。應理解，HBV基因體之序列在不同基因型之間存在很大差異，且有時在個體內部也存在差異。因此，表1A及表2A中列舉之特定靶位點可或可不存在於患有HBV感染之特定個體之HBV基因體中。

本文所提供之嚮導RNA組合物經設計以識別HBV基因(例如，ORF)中之靶序列(例如，與之雜交)。例如，HBV靶序列可在一或兩條股上由所提供之Cas核酸酶識別且裂解，該Cas核酸酶由嚮導RNA指導至該序列。在一些實施例中，RNA指導的DNA結合劑諸如Cas核酸酶可藉由嚮導RNA引導至HBV基因之靶序列，其中嚮導RNA之嚮導序列與靶序列雜交並且RNA指導的DNA結合劑諸如Cas核酸酶將一或兩條股上的靶序列裂解。

在一些實施例中，一或多種嚮導RNA之選擇係基於HBV基因內之靶序列來確定的。在一些實施例中，一或多種嚮導RNA靶向SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、1-843、1-1205、2314-3188、1381-1846或1821-2460。在一些實施例中，一或多種嚮導RNA靶向SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466。在一些實施例中，嚮導RNA靶向SEQ ID NO: 1之核苷酸57-76、66-85、126-145、153-173、153-172、154-173、240-269、240-259、245-264、248-267、250-269、269-288、356-392、356-375、361-380、364-383、373-392、423-445、423-442、426-445、574-593、608-627、621-655、621-640、622-641、629-648、629-648、630-649、635-654、636-655、686-705、694-716、694-713、695-714、697-716、713-732、725-744、1597-1616、1817-1836、1845-1864、1867-1886、1880-1903、1880-1899、1883-1902、1884-1903、2072-2094、2072-2091、2073-2092、2075-2094、2299-2318、2348-2367、2634-2653、2867-2887、2867-2886、2868-2887、2891-2910、2956-2975或2982-3001；視情況核苷酸153-173、153-172、154-173或250-269，其中嚮導RNA為Spy Cas9嚮導RNA。在一些實施例中，嚮導RNA靶向SEQ ID NO: 1之核苷酸35-58、146-169、153-176、216-239、330-356、330-353、333-356、342-365、447-470、666-689、713-736、740-763、755-778、1390-1413、1836-1859、2635-2658、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸146-169、153-176、330-356、330-353、333-356、447-470、713-736、740-763、755-778、1390-1413、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸447-470、330-353、755-778或713-736，其中嚮導RNA為Nme Cas9嚮導RNA。

不受任何特定理論之束縛，基因某些區域中之突變(例如，由插入缺失亦即插入或缺失引起之框移突變，作為核酸酶介導之DSB的結果而發生，或者序列變化而長度不變化，例如作為鹼基編輯的結果而發生)可能比基因其他區域中之突變更不能容許，因此，突變之位置為可能產生的蛋白質減弱之量或類型的重要因素。類似地，不受理論的束縛，使用鹼基編輯器例如去胺酶來改變基因之某些區域中之核苷酸序列可能比基因之其他區域中之突變更不能容許，從而導致起始密碼子之破壞、終止密碼子之插入或蛋白質結構或功能(例如，聚合酶結構或功能)中必需的胺基酸之編碼序列之改變。在一些實施例中，與HBV內之靶序列互補或具有互補性之gRNA用於將RNA指導的DNA結合劑引導至適當的HBV基因中之特定位置。

在一些實施例中，Spy嚮導序列與存在於HBV基因中之靶序列之反向互補序列至少90%或95%；或者100%一致。在一些實施例中，靶序列與嚮導RNA之嚮導序列互補。在一些實施例中，Spy嚮導RNA之嚮導序列與其對應靶序列之間的互補性或一致性程度為至少80%、85%、較佳至少90%或95%；或者100%。在一些實施例中，靶序列與Spy gRNA之嚮導序列可100%互補或一致。

在一些實施例中，靶序列與Spy gRNA之嚮導序列可含有至少一個錯配。例如，靶序列與gRNA之嚮導序列可含有1、2、3或4個錯配，其中嚮導序列之總長度為20。在一些實施例中，靶序列與gRNA之嚮導序列可含有1至4個錯配，其中嚮導序列為20個核苷酸。

在一些實施例中，Spy嚮導序列包含：(A)與以下中之至少20個連續核苷酸至少80%、85%、較佳90%或95%一致或互補之序列：(1) SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460；(2) SEQ ID NO: 1之核苷酸57-76、66-85、126-145、153-173、153-172、154-173、240-269、240-259、245-264、248-267、250-269、269-288、356-392、356-375、361-380、364-383、373-392、423-445、423-442、426-445、574-593、608-627、621-655、621-640、622-641、629-648、629-648、630-649、635-654、636-655、686-705、694-716、694-713、695-714、697-716、713-732、725-744、1597-1616、1817-1836、1845-1864、1867-1886、1880-1903、1880-1899、1883-1902、1884-1903、2072-2094、2072-2091、2073-2092、2075-2094、2299-2318、2348-2367、2634-2653、2867-2887、2867-2886、2868-2887、2891-2910、2956-2975或2982-3001；視情況核苷酸153-173、153-172、154-173或250-269；或(3)靶位點，其選自表1A中之HBV編號S1-S93中任一者之靶位點，視情況表1A中之HBV編號S1-S6、S8、S11、S16、S17、S19、S21-25、S28-S30、S32、S39、S47、S49、S50、S52、S53、S57-58、S61-S64、S67、S70、S71、S74、S77、S78、S80-S87、S80、S90-S91及S93，視情況S1、S5或S6中任一者之靶位點；(B)與選自SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460之序列，或者與表1A中提供之靶位點，例如SEQ ID NO: 1之核苷酸57-76、66-85、126-145、153-173、153-172、154-173、240-269、240-259、245-264、248-267、250-269、269-288、356-392、356-375、361-380、364-383、373-392、423-445、423-442、426-445、574-593、608-627、621-655、621-640、622-641、629-648、629-648、630-649、635-654、636-655、686-705、694-716、694-713、695-714、697-716、713-732、725-744、1597-1616、1817-1836、1845-1864、1867-1886、1880-1903、1880-1899、1883-1902、1884-1903、2072-2094、2072-2091、2073-2092、2075-2094、2299-2318、2348-2367、2634-2653、2867-2887、2867-2886、2868-2887、2891-2910、2956-2975或2982-3001；視情況核苷酸153-173、153-172、154-173或250-269中之17、18、19或20個連續核苷酸一致或互補之序列；(C)選自G028550、G028551、G028552、G028553、G028554、G028555、G030415、G030418,G030423、G030424、G030426、G030428、G030429、G030430、G030431、G030432、G030435、G030436、G030437、G030439、G030446、G030454、G030456、G030457、G030459、G030460、G030464、G030465、G030468、G030469、G030470、G030471、G030474、G030477、G030478、G030481、G030484、G030485、G030487、G030488、G030489、G030490、G030491、G030492、G030493、G030494、G030496、G030497、G030498或G030500，視情況G028550、G028554或G028555之靶向序列之序列；或者(D)與SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460中之至少20個連續核苷酸一致或互補之序列。

在一些實施例中，Nme嚮導序列與存在於HBV基因中之靶序列之反向互補序列至少90%或95%；或者100%一致。在一些實施例中，靶向序列可與嚮導RNA之靶向序列互補。在一些實施例中，Nme嚮導RNA之靶向序列與其對應靶序列之間的互補性或一致性程度為至少80%、85%、較佳至少90%或95%；或者100%。在一些實施例中，靶序列與gRNA之靶向序列100%互補或一致。

在一些實施例中，靶序列與Nme gRNA之靶向序列在HBV基因體中可含有至少一個靶序列之錯配。舉例而言，靶序列與gRNA之靶向序列可含有1或2、次佳3或4個錯配，其中嚮導序列之總長度為24。在一些實施例中，靶序列與gRNA之靶向序列可含有1-2個錯配，其中嚮導序列之長度為24個核苷酸。

在一些實施例中，Nme靶向序列包含：(A)與以下中之24個連續核苷酸至少80%、85%、較佳至少90%或95%一致或互補之序列：(1) SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460；(2) SEQ ID NO: 1之核苷酸35-58、146-169、153-176、216-239、330-356、330-353、333-356、342-365、447-470、666-689、713-736、740-763、755-778、1390-1413、1836-1859、2635-2658、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸146-169、153-176、330-356、330-353、333-356、447-470、713-736、740-763、755-778、1390-1413、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸447-470、330-353、755-778或713-736；或者(3)選自表2A中之HBV編號N1-N98中任一者之靶位點，視情況表2A中之HBV編號N7、N8、N11、N24、N25、N32、N37、N40、N42、N47、N51、N55、N75、N79、N84、N97或N98；視情況N7、N8、N11、N24、N32、N37、N40、N42、N47、N79或N84；視情況N7、N24、N32或N37中任一者之靶位點中之核苷酸；(B)與選自SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460，例如核苷酸35-58、146-169、153-176、216-239、330-356、330-353、333-356、342-365、447-470、666-689、713-736、740-763、755-778、1390-1413、1836-1859、2635-2658、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸146-169、153-176、330-356、330-353、333-356、447-470、713-736、740-763、755-778、1390-1413、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸447-470、330-353、755-778或713-736之序列；或者表2A中提供之靶位點中之21、22、23或24個連續核苷酸，視情況表2A中HBV編號N7、N8、N11、N24、N25、N32、N37、N40、N42、N47、N51、N55、N75、N79、N84、N97或N98；視情況N7、N8、N11、N24、N32、N37、N40、N42、N47、N79或N84；視情況N7、N24、N32或N37中任一者之靶位點中之核苷酸一致或互補之核酸序列；(C)選自G027224、G027225、G027228、G030107、G030108、G030115、G030120、G030123、G030125、G030130、G030134、G030138、G030158、G030162、G030167、G030180或G030181；視情況G027224、G027225、G027228、G030107、G030115、G030120、G030123、G030125、G030130、G030162或G030167；視情況G027224、G030107、G030115或G030120之靶向序列之序列；或者(D)與選自SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846及核苷酸1821-2460之序列中之24個連續核苷酸一致或互補之序列。

在一些實施例中，本文所揭示之組合物或調配物包含有包含開放閱讀框(ORF)之mRNA，該開放閱讀框編碼RNA指導的DNA結合劑，諸如本文所描述之Cas核酸酶。在一些實施例中，提供、使用或投與包含編碼RNA指導的DNA結合劑諸如Cas核酸酶之ORF的mRNA。 RNA 指導的DNA結合劑；NmeCas9

本文所述之RNA指導的DNA結合劑涵蓋腦膜炎雙球菌Cas9 (NmeCas9)以及其經修飾形式及變異體。在一些實施例中，NmeCas9為Nme2 Cas9。在一些實施例中，NmeCas9為Nme1 Cas9。在一些實施例中，NmeCas9為Nme3 Cas9。

具有一個無活性催化域(RuvC或HNH)之經修飾之版本稱為「切口酶」。切口酶僅切割靶DNA上之一條股，從而產生單股斷裂。單股斷裂亦稱為“切口”。在一些實施例中，組合物及方法包含切口酶。在一些實施例中，組合物及方法包含切口酶RNA指導的DNA結合劑，諸如切口酶Cas，例如切口酶Cas9，其在靶DNA中誘導切口而不是雙股斷裂。

在一些實施例中，NmeCas9核酸酶可經修飾以僅含有一個功能性核酸酶域。舉例而言，RNA指導的DNA結合劑可經修飾，使得核酸酶域中之一者發生突變或者完全或部分缺失，以降低其核酸裂解活性。

在一些實施例中，使用具有活性降低之RuvC域之NmeCas9切口酶。在一些實施例中，使用具有無活性RuvC域之NmeCas9切口酶。在一些實施例中，使用具有活性降低之HNH域之NmeCas9切口酶。在一些實施例中，使用具有無活性HNH域之NmeCas9切口酶。

在一些實施例中，NmeCas9核酸酶域內之保守胺基酸經取代以降低或改變核酸酶活性。野生型Cas9具有兩個核酸酶域：RuvC及HNH。RuvC域將非靶DNA股裂解，且HNH域將靶DNA股裂解。在一些實施例中，Cas9核酸酶包含多於一個RuvC域或多於一個HNH域。在一些實施例中，Cas9核酸酶為野生型Cas9。在一些實施例中，Cas9能夠誘導靶DNA中之雙股斷裂。在某些實施例中，Cas核酸酶可裂解dsDNA，它可以裂解dsDNA之一條股，或者它可不具有DNA裂解酶或切口酶活性。在一些實施例中，NmeCas9可包含RuvC或RuvC樣核酸酶域中之胺基酸取代。RuvC或RuvC樣核酸酶域中之示範性胺基酸取代包括H588A (基於腦膜炎雙球菌Cas9蛋白)。在一些實施例中，Cas蛋白可包含HNH或HNH樣核酸酶域中之胺基酸取代。HNH或HNH樣核酸酶域中之示範性胺基酸取代包括D16A (基於NmeCas9蛋白)。

在一些實施例中，使用嵌合Cas蛋白，其中蛋白質之一個域或區域由不同蛋白質之一部分置換。在一些實施例中，NmeCas9核酸酶域可經來自不同核酸酶諸如Fok1之域置換。在一些實施例中，NmeCas9蛋白為經修飾之NmeCas9核酸酶。

在一些實施例中，核酸酶經修飾以誘導點突變或鹼基變化，例如透過去胺基作用。

在一些實施例中，Cas蛋白包含融合蛋白，該融合蛋白包含與異源功能域連接之Cas核酸酶(例如，NmeCas9)，其為切口酶或為無催化活性的。在一些實施例中，Cas蛋白包含融合蛋白，該融合蛋白包含與異源功能域連接之無催化活性的Cas核酸酶(例如，NmeCas9) (參見例如，WO2014152432)。在一些實施例中，無催化活性的Cas9來自腦膜炎雙球菌Cas9。在一些實施例中，無催化活性的Cas包含使Cas不活化的突變。

在一些實施例中，異源功能域為修飾基因表現、組蛋白或DNA之域。在一些實施例中，異源功能域為轉錄活化域或轉錄阻遏域。在一些實施例中，核酸酶為無催化活性的Cas核酸酶，諸如dCas9。

在一些實施例中，異源功能域為去胺酶，諸如胞苷去胺酶或腺嘌呤去胺酶。在某些實施例中，異源功能域為C至T鹼基轉換子(胞苷去胺酶)，諸如脂蛋白元B mRNA編輯酶(APOBEC)去胺酶。異源功能域諸如去胺酶可為與具有切口酶活性之Cas核酸酶或下文進一步討論之無催化活性的Cas核酸酶的融合蛋白的一部分。

在一些實施例中，Nme Cas9具有雙股核酸內切酶活性。

在一些實施例中，Nme Cas9具有切口酶活性。

在一些實施例中，Nme Cas9包含dCas9 DNA結合域。

在一些實施例中，Nme Cas9包含與SEQ ID NO: 711、716、719、722或730中任一者至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列(如表40所示)。在一些實施例中，Nme Cas9包含SEQ ID NO: 711、716、719、722或730中任一者之胺基酸序列(如表40所示)。

在一些實施例中，編碼NmeCas9之序列包含與SEQ ID NO: 703、704、710、715、717-718、720-721或728-729中任一者至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列(如表40所示)。在一些實施例中，編碼NmeCas9之序列包含SEQ ID NO: 703、704、710、715、717-718、720-721或728-729中任一者之核苷酸序列(如表40所示)。

在一些實施例中，前述一致性水準中任一者為至少95%、98%或99%；或者100%。

包含去胺酶及RNA指導的切口酶之示範性多核苷酸及組合物提供為下表40中之SEQ ID NO: 701、704、706、707、715-722或728-730。

本文所揭示之RNA指導的DNA結合劑可進一步包含鹼基編輯域，諸如去胺酶域，其將特異性修飾引入靶核酸中。

在一些實施例中，提供之核酸包含編碼多肽之開放閱讀框，該多肽包含胞苷去胺酶(例如，A3A)、C末端NmeCas9切口酶及第一核定位訊號(NLS)，其中該多肽不包含尿嘧啶糖苷酶抑制劑(UGI)。

在一些實施例中，第二NLS位於NmeCas9切口酶之N末端。在一些實施例中，去胺酶位於NLS (亦即，第一NLS或第二NLS)之N末端。在一些實施例中，去胺酶位於多肽中所有NLS之N末端。在一些實施例中，去胺酶位於多肽中所有NLS之N末端，其中多肽不包含尿嘧啶糖苷酶抑制劑(UGI)。

在一些實施例中，多核苷酸為DNA或RNA。在一些實施例中，多核苷酸為mRNA。在一些實施例中，提供了由mRNA編碼之多肽。

在一些實施例中，多肽從N末端至C末端包含視情況存在之NLS、胞苷去胺酶(例如，APOBEC3A)、視情況存在之連接子及在HNH或HNH樣核酸酶域中具有胺基酸取代之Nme Cas9切口酶，例如D16A NmeCas9切口酶。在一些實施例中，多肽從N末端至C末端包含視情況存在之NLS、胞苷去胺酶(例如，APOBEC3A)、視情況存在之連接子及在HNH或HNH樣核酸酶域中具有胺基酸取代之Nme Cas9切口酶，例如D16A Nme2Cas9切口酶。在一些實施例中，多肽從N末端至C末端包含第一及第二NLS、胞苷去胺酶(例如，APOBEC3A)、視情況存在之連接子及在HNH或HNH樣核酸酶域中具有胺基酸取代之Nme Cas9切口酶，例如D16A NmeCas9切口酶。在一些實施例中，多肽從N末端至C末端包含第一及第二NLS、胞苷去胺酶(例如，APOBEC3A)、視情況存在之連接子及在HNH或HNH樣核酸酶域中具有胺基酸取代之Nme Cas9切口酶，例如D16A Nme2Cas9切口酶。在一些實施例中，多肽從N末端至C末端包含第一NLS、胞苷去胺酶(例如，APOBEC3A)、第二NLS、視情況存在之連接子及在HNH或HNH樣核酸酶域中具有胺基酸取代之Nme Cas9切口酶，例如D16A NmeCas9切口酶。在一些實施例中，多肽從N末端至C末端包含第一NLS、胞苷去胺酶(例如，APOBEC3A)、第二NLS、視情況存在之連接子及在HNH或HNH樣核酸酶域中具有胺基酸取代之Nme Cas9切口酶，例如D16A Nme2Cas9切口酶。

在一些實施例中，包含A3A及RNA指導的切口酶的多肽不包含尿嘧啶糖苷酶抑制劑(UGI)。

在一些實施例中，提供了組合物，其包含第一多肽或編碼第一多肽之mRNA，該第一多肽包含胞苷去胺酶，其視情況為APOBEC3A去胺酶(A3A)；C末端NmeCas9切口酶；第一核定位訊號(NLS)；以及視情況存在之第二NLS；其中第一NLS及第二NLS (當存在時)位於編碼NmeCas9切口酶之序列之N末端，其中第一多肽不包含尿嘧啶糖苷酶抑制劑(UGI)；以及第二多肽或編碼第二多肽之mRNA，其包含尿嘧啶糖苷酶抑制劑(UGI)，其中第二多肽不同於第一多肽。

在一些實施例中，提供了修飾靶基因之方法，包含投與本文所述之組合物。在一些實施例中，該方法包含向細胞遞送包含編碼第一多肽之第一開放閱讀框之第一核酸，該第一多肽包含胞苷去胺酶，其視情況為APOBEC3A去胺酶(A3A)；C末端NmeCas9切口酶；第一核定位訊號(NLS)；以及視情況存在之第二NLS；其中第一NLS和第二NLS (當存在時)位於編碼NmeCas9切口酶之序列之N末端，其中第一多肽不包含尿嘧啶糖苷酶抑制劑(UGI)，以及包含編碼尿嘧啶糖苷酶抑制劑(UGI)之第二開放閱讀框之第二核酸，其中第二核酸不同於第一核酸。

在一些實施例中，該等方法包含向細胞遞送多肽，其包含去胺酶，該去胺酶視情況為APOBEC3A去胺酶(A3A)；C末端NmeCas9切口酶；第一核定位訊號(NLS)；及第二NLS；其中第一NLS及第二NLS位於編碼NmeCas9切口酶之序列之N末端，其中第一多肽不包含尿嘧啶糖苷酶抑制劑(UGI)，或編碼該多肽之核酸，以及向細胞遞送尿嘧啶糖苷酶抑制劑(UGI)或編碼UGI之核酸。

在一些實施例中，編碼UGI之mRNA與編碼APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導的切口酶之mRNA的莫耳比為約1:35至約30:1。在一些實施例中，編碼UGI之mRNA與編碼APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導的切口酶之mRNA的莫耳比不為約1:1。

類似地，在一些實施例中，若遞送蛋白質，則上文討論的編碼UGI蛋白之mRNA與編碼APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導的切口酶之mRNA的莫耳比是類似的。

在一些實施例中，本文所述之組合物進一步包含至少一種gRNA。在一些實施例中，本文所述之組合物進一步包含兩種gRNA。在一些實施例中，提供了包含本文所述之mRNA及至少一種gRNA (例如，兩種gRNA)之組合物。在一些實施例中，gRNA為單嚮導RNA (sgRNA)。在一些實施例中，gRNA為雙嚮導RNA (dgRNA)。

在一些實施例中，組合物在投與於個體後能夠實現基因體編輯。 胞苷去胺酶； APOBEC3A 去胺酶

胞苷去胺酶涵蓋胞苷去胺酶超家族中之酶，且特定而言，APOBEC家族之酶(APOBEC1、APOBEC2、APOBEC4及APOBEC3亞組之酶)、活化誘導之胞苷去胺酶(AID或AICDA)及CMP去胺酶(例如，參見Conticello等人，Mol. Biol. Evol. 22:367-77, 2005；Conticello, Genome Biol. 9:229, 2008；Muramatsu等人，J. Biol. Chem. 274: 18470-6, 1999)；及Carrington等人，Cells 9:1690 (2020))。

在一些實施例中，本文所揭示之胞苷去胺酶係APOBEC家族之酶。在一些實施例中，本文所揭示之胞苷去胺酶係APOBEC1、APOBEC2、APOBEC4及APOBEC3亞組之酶。在一些實施例中，本文所揭示之胞苷去胺酶係APOBEC3亞組之酶。在一些實施例中，本文所揭示之胞苷去胺酶為APOBEC3A去胺酶(A3A)。在一些實施例中，去胺酶包含APOBEC3A去胺酶。

在一些實施例中，本文所揭示之APOBEC3A去胺酶(A3A)係人類A3A。在一些實施例中，本文所揭示之APOBEC3A去胺酶(A3A)係人類A3A。在一些實施例中，A3A係野生型A3A。

在一些實施例中，A3A係A3A變異體。A3A變異體與野生型A3A或其片段共有同源性。在一些實施例中，A3A變異體與野生型A3A具有至少約80%一致性、至少約85%一致性、至少約90%一致性、至少約95%一致性、至少約96%一致性、至少約97%一致性、至少約98%一致性或至少約99%一致性。在一些實施例中，與野生型A3A相比，A3A變異體可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多個胺基酸變化。在一些實施例中，A3A變異體包含A3A之片段，使得該片段與野生型A3A之相應片段具有至少約80%一致性、至少約90%一致性、至少約95%一致性、至少約96%一致性、至少約97%一致性、至少約98%一致性、至少約99%一致性、至少約99.5%一致性或至少約99.9%一致性。

在一些實施例中，A3A變異體係具有因一個或若干個突變(諸如取代、缺失、插入、一個或若干個單點取代)而與野生型A3A蛋白不同之序列的蛋白質。在一些實施例中，可使用經縮短之A3A序列，例如藉由缺失N末端、C末端或內部胺基酸。在一些實施例中，使用經縮短之A3A序列，其中在序列C末端之一至四個胺基酸缺失。在一些實施例中，APOBEC3A (諸如人類APOBEC3A)具有57位野生型胺基酸(如野生型序列中所編號)。在一些實施例中，APOBEC3A (諸如人類APOBEC3A)在胺基酸位置57處具有天冬醯胺(如野生型序列中所編號)。

在一些實施例中，野生型A3A係人類A3A (UniPROT登錄ID：p31941，SEQ ID NO: 734)。

在一些實施例中，本文所揭示之A3A包含與SEQ ID NO: 734具有至少80%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，一致性水準為至少85%、至少87%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%。在一些實施例中，A3A包含與SEQ ID NO: 734具有至少87%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，A3A包含與SEQ ID NO: 734具有至少90%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，A3A包含與SEQ ID NO: 734具有至少95%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，A3A包含與SEQ ID NO: 734具有至少98%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，A3A包含與A3A ID NO: 734具有至少99%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，A3A包含SEQ ID NO: 734之胺基酸序列。

在一些實施例中，本文所揭示之胞苷去胺酶包含與SEQ ID NO: 734-216735中任一者具有至少80%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，前述一致性水準中之任一者為至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%。在一些實施例中，UGI包含與SEQ ID NO: 709或735具有至少90%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，UGI包含與SEQ ID NO: 709或735具有至少95%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，UGI包含與SEQ ID NO: 709或735具有至少98%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，UGI包含與SEQ ID NO: 709或735具有至少99%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，UGI包含SEQ ID NO: 709或735之胺基酸序列。 連接子

在一些實施例中，本文所述之包含去胺酶及RNA指導的切口酶之多肽進一步包含連接去胺酶與RNA指導的切口酶的連接子。在一些實施例中，連接子為肽連接子。在一些實施例中，編碼包含去胺酶及RNA指導的切口酶之多肽的核酸進一步包含編碼肽連接子之序列。在一些實施例中，提供了編碼去胺酶-連接子-RNA指導的切口酶融合蛋白之mRNA。

在一些實施例中，肽連接子為具有至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50或更多個胺基酸之任何胺基酸段。

在一些實施例中，肽連接子為16殘基「XTEN」連接子或其變異體(參見例如，實施例；以及Schellenberger等人，A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat. Biotechnol. 27, 1186-1190 (2009))。在一些實施例中，XTEN連接子包含序列SGSETPGTSESATPES (SEQ ID NO: 652)、SGSETPGTSESA (SEQ ID NO: 653)或SGSETPGTSESATPEGGSGGS (SEQ ID NO: 654)。

在一些實施例中，肽連接子包含(GGGGS)n (SEQ ID NO: 655)、(G)n (SEQ ID NO: 823)、(EAAAK)n(SEQ ID NO: 656)、(GGS)n (SEQ ID NO: 824)、SGSETPGTSESATPES (SEQ ID NO: 657)模體(參見例如，Guilinger J P, Thompson D B, Liu D R. Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nat. Biotechnol. 2014; 32(6): 577-82；全部內容係以引用的方式併入本文中)或(XP)n模體(SEQ ID NO: 825)，或此等序列中任一者之組合，其中n獨立地為介於1與30之間之整數。參見WO2015089406，例如段落[0012]，其全部內容以引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，肽連接子包含選自SEQ ID NO: 652-657之一或多個序列。 經修飾之gRNA及mRNA

在一些實施例中，gRNA經化學修飾。包含一或多個經修飾核苷或核苷酸之gRNA係稱為「經修飾之」gRNA或「經化學修飾之」gRNA，以描述一或多種非天然或天然存在之組分或組態的存在，該等組分或組態替代或加上規範A、G、C及U殘基使用。在一些實施例中，用非規範核苷或核苷酸(在此稱為「經修飾」)合成經修飾之gRNA。經修飾核苷及核苷酸可包括以下一或多者：(i)改變(例如置換)磷酸二酯主鏈鍵聯中之一或兩個非連接性磷酸酯氧或一或多個連接性磷酸酯氧(示範性主鏈修飾)；(ii)改變(例如置換)核糖之組分(例如核糖上之2'羥基) (示範性糖修飾)；(iii)修飾或置換天然存在之核鹼基，包括利用非規範核鹼基(示範性鹼基修飾)；及(iv)修飾寡核苷酸之3'末端或5'末端以提供核酸外切酶穩定性，例如經2’ O-me、2’鹵化物或2’去氧取代之核糖修飾；或反向無鹼基末端核苷酸，或用硫代磷酸酯置換磷酸二酯。

化學修飾(諸如上文列出之彼等修飾)可經組合以提供經修飾之gRNA或mRNA，其包含可具有兩個、三個、四個或更多個修飾之核苷及核苷酸(統稱為「殘基」)。舉例而言，經修飾殘基可具有經修飾之糖及經修飾之核鹼基。在某些實施例中，gRNA分子之至多15%之磷酸酯基團經硫代磷酸酯基團置換。在一些實施例中，經修飾之gRNA在RNA之5’末端處或附近包含至少一個經修飾之殘基。在一些實施例中，經修飾之gRNA在RNA之3'末端處或附近包含至少一個經修飾之殘基。

在一些實施例中，gRNA包含一個、兩個、三個或更多個經修飾之殘基。在一些實施例中，經修飾之gRNA中至少5% (例如至少5%、10%、15%，較佳至少20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%)之位置為經修飾核苷或核苷酸。在一些實施例中，經修飾之嚮導RNA中至少5%之位置為經修飾核苷酸或核苷。在一些實施例中，經修飾之嚮導RNA中的至少10%之位置為經修飾核苷酸或核苷。在一些實施例中，經修飾之gRNA中的至少15%之位置為經修飾核苷酸或核苷。在一些實施例中，經修飾之gRNA中的較佳至少20%之位置為經修飾核苷酸或核苷。在一些實施例中，經修飾之gRNA中的不超過65%之位置為經修飾核苷酸。在一些實施例中，經修飾之gRNA中的不超過55%之位置為經修飾核苷酸。在一些實施例中，經修飾之gRNA中的不超過50%之位置為經修飾核苷酸。在一些實施例中，經修飾之gRNA中的10-70%之位置為經修飾核苷酸。在一些實施例中，經修飾之gRNA中的20-70%之位置為經修飾核苷酸。在一些實施例中，經修飾之gRNA中20%-50%之位置為經修飾核苷酸，且核酸酶為Spy Cas9核酸酶。在一些實施例中，經修飾之gRNA中之30-70%範圍的位置為經修飾核苷酸，且核酸酶為Nme Cas9核酸酶。

未經修飾之核酸可易於由例如細胞內核酸酶或血清中所發現之彼等核酸酶降解。例如，核酸酶可水解核酸磷酸二酯鍵。因此，在一個態樣中，本文所描述之gRNA可含有一或多種經修飾之核苷或核苷酸，例如以引入對細胞內核酸酶或基於血清之核酸酶之穩定性。在一些實施例中，本文所述之經修飾gRNA分子在活體內及離體引入細胞群體時可表現出降低之先天免疫反應。術語「先天免疫反應」包括對外源核酸(包括單股核酸)之細胞反應，其涉及誘導細胞介素表現及釋放(尤其干擾素)及細胞死亡。

在主鏈修飾之一些實施例中，經修飾殘基之磷酸酯基團可藉由用不同取代基置換一或多個氧而經修飾。此外，經修飾之殘基(例如存在於經修飾之核酸中的經修飾之殘基)可包括用如本文所描述之經修飾之磷酸酯基團置換未經修飾之磷酸酯部分。在一些實施例中，磷酸主鏈之主鏈修飾可包括產生不帶電連接子或具有不對稱電荷分佈之帶電連接子的改變。

經修飾之磷酸酯基團之實例包括硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯、甲基膦酸酯、胺基磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯及磷酸三酯。未經修飾之磷酸酯基團中之磷原子為非對掌性的。然而，用上述原子或原子團之一置換非橋接氧之一可使磷原子具有對掌性。立體異構源磷原子可具有「R」組態(此處為Rp)或「S」組態(此處為Sp)。亦可藉由用氮(橋接磷醯胺酯)、硫(橋接硫代磷酸酯)及碳(橋接亞甲基膦酸酯)置換橋接氧(亦即，將磷酸酯連接至核苷之氧)來修飾主鏈。置換可在任一連接氧處或在兩個連接氧處發生。

在某些主鏈修飾中，磷酸酯基團可由不含磷之連接基團(例如，醯胺鍵聯)置換。在一些實施例中，帶電磷酸酯基團可由中性部分置換。可置換磷酸酯基團之部分之實例可包括但不限於例如甲基膦酸酯、羧基甲基、胺基甲酸酯、醯胺、硫醚。可置換磷酸酯基團之部分之其他實例可包括但不限於例如環氧乙烷連接子、磺酸酯、磺醯胺、硫代甲縮醛、甲縮醛、亞甲基亞胺基、亞甲基甲基亞胺基、亞甲基伸肼基、亞甲基二甲基伸肼基及亞甲基氧基甲基亞胺基。

亦可構建可模擬核酸之支架，其中磷酸酯連接子及核糖由核酸酶抗性核苷或核苷酸替代物置換。此類修飾可包含主鏈及糖修飾。在一些實施例中，核鹼基可由替代主鏈繫栓。實例可包括但不限於嗎啉基、環丁基、吡咯啶及肽核酸(PNA)核苷替代物。

經修飾核苷及經修飾核苷酸可包括對糖基之一或多種修飾，亦即糖修飾。例如，2'羥基(OH)可以經修飾，例如經許多不同「氧基」或「去氧」取代基替換。在一些實施例中，對2'羥基之修飾可增強核酸之穩定性，此乃因羥基不再能去質子化以形成2'-醇鹽離子。

2'羥基修飾之實例可包括烷氧基或芳氧基(OR，其中「R」可為例如烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)，O(CH ₂CH ₂O) _nCH ₂CH ₂OR，其中R可為例如H或視情況經取代之烷基，且n可為0至20之整數(例如0至4、0至8、0至10、0至16、1至4、1至8、1至10、1至16、1至20、2至4、2至8、2至10、2至16、2至20、4至8、4至10、4至16及4至20)。在一些實施例中，2'羥基修飾可為2'-O-Me。在一些實施例中，2'羥基修飾可為2'-氟修飾，該修飾用氟化物置換2'羥基。在一些實施例中，2'羥基修飾可以包括「鎖」核酸(LNA)，其中2'羥基可以例如藉由C ₁- ₆伸烷基或C _1-6伸雜烷基橋連接到相同核糖之4'碳，其中示範性橋可以包括亞甲基、伸丙基、醚或胺基橋；O-胺基(其中胺基可以係例如NH ₂；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基、乙二胺或聚胺基)及胺基烷氧基、O(CH ₂) _n-胺基(其中胺基可以係例如NH ₂；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基、乙二胺或聚胺基)。在一些實施例中，2'羥基修飾可包括「解鎖」核酸(UNA)，其中核糖環缺乏C2'-C3'鍵。在一些實施例中，2'羥基修飾可包括甲氧基乙基(MOE) (OCH ₂CH ₂OCH ₃，例如PEG衍生物)。2'修飾可包括氫(亦即去氧核糖)；鹵基(例如溴、氯、氟或碘)；胺基(其中胺基可為例如NH ₂；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基、二雜芳基胺基或胺基酸)；NH(CH ₂CH ₂NH) _nCH2CH ₂-胺基(其中胺基可例如如本文所描述)、-NHC(O)R (其中R可為例如烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)、氰基；巰基；烷基-硫基-烷基；硫代烷氧基；以及烷基、環烷基、芳基、烯基及炔基，其可視情況經例如如本文所描述之胺基取代。

糖修飾可包含糖基，該糖基亦可含有一或多個碳，該等碳所具有之立體化學組態與核糖中相應碳之立體化學組態相反。因此，經修飾之核酸可包括含有例如阿拉伯糖作為糖之核苷酸。經修飾核酸亦可包括無鹼基糖。此等無鹼基糖亦可在一或多個組成糖原子處進一步經修飾。經修飾之核酸亦可包括一或多種呈L形式之糖，例如L-核苷。如本文所用，單一無鹼基糖不應理解為導致雙鏈體中斷。

在某些實施例中，2’修飾包括例如包括2’-OMe、2’-F、2’-H在內之修飾，視情況包括2’-O-Me。

可併入經修飾核酸中的本文所述之經修飾核苷及經修飾核苷酸可包括經修飾鹼基，亦稱為核鹼基。核鹼基之實例包括但不限於腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)及尿苷(U)。此等核鹼基可經修飾或全部經置換以提供可併入經修飾核酸中之經修飾殘基。核苷酸之核鹼基可獨立地選自嘌呤、嘧啶、嘌呤類似物或嘧啶類似物。在一些實施例中，核鹼基可包括例如鹼基之天然存在及合成衍生物。

在採用雙嚮導RNA之實施例中，crRNA及tracr RNA中之每一者均可含有修飾。此類修飾可在crRNA或tracr RNA之一個或兩個末端處。在包含sgRNA之實施例中，可對sgRNA之一個或兩個末端處的一或多個殘基進行化學修飾，或可對內部核苷進行修飾，或可對整個sgRNA進行化學修飾。某些實施例包含5'末端修飾。某些實施例包含3'末端修飾。某些實施例包含5’末端修飾及3’末端修飾。

在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包含WO2018/107028中所揭示之修飾模式之一，該案之內容由此以引用之方式整體併入。在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包含US20170114334中所揭示之結構/修飾模式之一，該案之內容由此以引用之方式整體併入。在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包含WO2017/136794中所揭示之結構/修飾模式之一，該案之內容由此以引用之方式整體併入。在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包含WO2019/237069中所揭示之結構/修飾模式之一，該案之內容由此以引用之方式整體併入。在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包含WO2021/119275中所揭示之結構/修飾模式之一，該案之內容由此以引用之方式整體併入。在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包含Nme嚮導中所揭示之結構/修飾模式之一，其內容特此以引用之方式整體併入。

在一些實施例中，sgRNA包含本文所示之修飾模式中之任一者，其中N為任何天然或非天然核苷酸，且其中N之整體構成如本文表1A中所描述HBV嚮導序列。在一些實施例中，經修飾之sgRNA包含表15或表9中所示之序列。 表15：經修飾之Spy嚮導RNA序列

#mer	SEQ ID NO	經修飾序列
100	658	(mN)3N17GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmUmUmUmU
96	659	(mN*)3N17GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC
97	660	(mN*)3N17GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU
88	661	(mN)3N17GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGmUmGmC
88	662	(mN)3N17GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGmUmGmC
88	663	(mN)3N17GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmAmAmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC
90	664	(mN)3N17GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmC
90	665	(mN)3N17GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmCmGmAmAmAmGmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC
91	666	(mN)3N17GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUmGmCmU
91	667	(mN)3N17GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU
91	668	(mN)3N17GUUUfUAGmAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCmAmAGUfUmAfAmAfAmUAmAmGmGmCmUmAGUmCmCGUfUAmUmCAmCmGmAmAmAmGmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU
91	669	(mN)3N17GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmCmU

其中「m」表示2'-O-Me修飾，「f」表示2'-氟修飾，且「*」表示核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵聯，並且在經修飾之序列之上下文中無修飾表示RNA (2'-OH)，其中N之整體構成靶向序列，該靶向序列包含：(A)與以下中之至少20個連續核苷酸至少80%、85%、較佳90%或95%一致或互補之序列：(1) SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460；(2) SEQ ID NO: 1之核苷酸57-76、66-85、126-145、153-173、153-172、154-173、240-269、240-259、245-264、248-267、250-269、269-288、356-392、356-375、361-380、364-383、373-392、423-445、423-442、426-445、574-593、608-627、621-655、621-640、622-641、629-648、629-648、630-649、635-654、636-655、686-705、694-716、694-713、695-714、697-716、713-732、725-744、1597-1616、1817-1836、1845-1864、1867-1886、1880-1903、1880-1899、1883-1902、1884-1903、2072-2094、2072-2091、2073-2092、2075-2094、2299-2318、2348-2367、2634-2653、2867-2887、2867-2886、2868-2887、2891-2910、2956-2975或2982-3001；視情況核苷酸153-173、153-172、154-173或250-269；或者(3)靶位點，其選自表1A中HBV編號S1-S93中任一者之靶位點，視情況表1A中之HBV編號S1-S6、S8、S11、S16、S17、S19、S21-25、S28-S30、S32、S39、S47、S49、S50、S52、S53、S57-58、S61-S64、S67、S70、S71、S74、S77、S78、S80-S87、S80、S90-S91及S93，視情況S1、S5或S6中任一者之靶位點；(B)與選自SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460；例如核苷酸57-76、66-85、126-145、153-173、153-172、154-173、240-269、240-259、245-264、248-267、250-269、269-288、356-392、356-375、361-380、364-383、373-392、423-445、423-442、426-445、574-593、608-627、621-655、621-640、622-641、629-648、629-648、630-649、635-654、636-655、686-705、694-716、694-713、695-714、697-716、713-732、725-744、1597-1616、1817-1836、1845-1864、1867-1886、1880-1903、1880-1899、1883-1902、1884-1903、2072-2094、2072-2091、2073-2092、2075-2094、2299-2318、2348-2367、2634-2653、2867-2887、2867-2886、2868-2887、2891-2910、2956-2975或2982-3001；視情況核苷酸153-173、153-172、154-173或250-269之序列或者與表1A中提供之靶位點中之17、18、較佳19或20個連續核苷酸一致或互補的序列；(C)選自G028550、G028551、G028552、G028553、G028554、G028555、G030415、G030418、G030423、G030424、G030426、G030428、G030429、G030430、G030431、G030432、G030435、G030436、G030437、G030439、G030446、G030454、G030456、G030457、G030459、G030460、G030464、G030465、G030468、G030469、G030470、G030471、G030474、G030477、G030478、G030481、G030484、G030485、G030487、G030488、G030489、G030490、G030491、G030492、G030493、G030494、G030496、G030497、G030498或G030500，視情況G028550、G028554或G028555之靶向序列的序列；或者(D)與SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460；或(2) SEQ ID NO: 1之核苷酸57-76、66-85、126-145、153-173、153-172、154-173、240-269、240-259、245-264、248-267、250-269、269-288、356-392、356-375、361-380、364-383、373-392、423-445、423-442、426-445、574-593、608-627、621-655、621-640、622-641、629-648、629-648、630-649、635-654、636-655、686-705、694-716、694-713、695-714、697-716、713-732、725-744、1597-1616、1817-1836、1845-1864、1867-1886、1880-1903、1880-1899、1883-1902、1884-1903、2072-2094、2072-2091、2073-2092、2075-2094、2299-2318、2348-2367、2634-2653、2867-2887、2867-2886、2868-2887、2891-2910、2956-2975或2982-3001；視情況核苷酸153-173、153-172、154-173或250-269中之至少20個連續核苷酸一致或互補之序列。例如，其中N經如本文表1A中所揭示之嚮導序列中任一者置換。在某些實施例中，當N之整體構成N17內之嚮導序列時，N17之各N可獨立地經修飾，例如經2'-OMe修飾進行修飾。

在一些實施例中，sgRNA包含序列，其中N之整體構成如本文表2A所述之HBV靶向序列。在一些實施例中，經修飾之sgRNA包含表16或表10中提供之序列： 表16：示範性經修飾之Nme嚮導RNA模體

#mer	經修飾之核苷酸序列	SEQ ID NO
101	mNmNNNNNNNNmNNNmNNNNNNNNNNNN mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUCmGmU*mU	670
101	(N)20-25 mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmU*mU	671
101	(N)20-25 mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	672
101	(N)20-25 mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmU*mU	673
101	(N)20-25 mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	674
105	(N)20-25 mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmU*mU	675
105	(N)20-25 mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	676
105	(N)20-25 mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmU*mU	677
105	(N)20-25 mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCGmUmU	678

其中「m」指示2’-O-Me修飾，且「*」指示核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵聯，且在經修飾序列之上下文中無修飾指示RNA (2’-OH)及硫代磷酸酯鍵聯。靶向序列存在於嚮導RNA保守部分的5'末端。在某些實施例中，靶向序列之長度為20-25、較佳22-24個核苷酸。在某些實施例中，嚮導靶向序列包含一或多個化學修飾，例如嚮導RNA之5'末端的核苷酸1、2及3中之一或多個，視情況所有核苷酸1、2及3之修飾。在某些實施例中，修飾包含2'-O-Me修飾。在某些實施例中，修飾包含2'-O-Me修飾及與3'核苷酸之硫代磷酸酯鍵聯，例如(mN*)3(N)17-22、較佳(mN*)3(N)21，其中(N)21部分中之各核苷酸獨立地經修飾或未經修飾。在某些實施例中，(N)20-25具有以下序列及修飾模式mN*mN*mN*mNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNN。

在某些實施例中，N之整體構成HBV靶向序列，其包含：(A)與以下中之24個連續核苷酸至少80%、85%、較佳至少90%或95%一致或100%一致或互補之序列：(1) SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460；(2) SEQ ID NO: 1之核苷酸35-58、146-169、153-176、216-239、330-356、330-353、333-356、342-365、447-470、666-689、713-736、740-763、755-778、1390-1413、1836-1859、2635-2658、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸146-169、153-176、330-356、330-353、333-356、447-470、713-736、740-763、755-778、1390-1413、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸447-470、330-353、755-778或713-736；或(3)選自表2A中之HBV編號N1-N98中任一者之靶位點，視情況表2A中之HBV編號N7、N8、N11、N24、N25、N32、N37、N40、N42、N47、N51、N55、N75、N79、N84、N97或N98；視情況N7、N8、N11、N24、N32、N37、N40、N42、N47、N79或N84；視情況N7、N24、N32或N37中任一者之靶位點之核苷酸；(B)與選自SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460；例如SEQ ID NO: 1之核苷酸35-58、146-169、153-176、216-239、330-356、330-353、333-356、342-365、447-470、666-689、713-736、740-763、755-778、1390-1413、1836-1859、2635-2658、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸146-169、153-176、330-356、330-353、333-356、447-470、713-736、740-763、755-778、1390-1413、2951-2974或2958-2981；視情況核苷酸447-470、330-353、755-778或713-736之序列；或表2A中提供之靶位點中之21、22、23或24個連續核苷酸一致或互補之核酸序列；(C)選自G027224、G027225、G027228、G030107、G030108、G030115、G030120、G030123、G030125、G030130、G030134、G030138、G030158、G030162、G030167、G030180或G030181；視情況G027224、G027225、G027228、G030107、G030115、G030120、G030123、G030125、G030130、G030162或G030167；視情況G027224、G030107、G030115或G030120之靶向序列之序列；或者(D)與選自SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846及核苷酸1821-2460；例如SEQ ID NO: 1之核苷酸35-58、146-169、153-176、216-239、330-356、330-353、333-356、342-365、447-470、666-689、713-736、740-763、755-778、1390-1413、1836-1859、2635-2658、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸146-169、153-176、330-356、330-353、333-356、447-470、713-736、740-763、755-778、1390-1413、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸447-470、330-353、755-778或713-736之序列；或者表2A中提供之靶位點中之24個連續核苷酸一致或互補之序列。舉例而言，其中N經本文表2A中所揭示之嚮導序列中任一者置換。在某些實施例中，當N之整體構成(N)20-25內之嚮導序列時，(N)20-25中之各N可獨立地經修飾，例如經2'-OMe修飾進行修飾，視情況進一步具有PS修飾，特別是在1、2或3個末端核苷酸處。在某些實施例中，(N)20-25具有以下序列及修飾模式mN*mN*mN*mNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNN。

下文描述之修飾中之任一者均可存在於本文所描述之gRNA及mRNA中。

在經化學修飾之序列的上下文中，「A」、「C」、「G」、「N」及「U」表示RNA核苷酸，亦即具有與3'核苷酸之磷酸二酯酶鍵聯的2' -OH。

術語「mA」、「mC」、「mU」或「mG」分別用於表示已經2'-O-Me修飾之腺嘌呤、胞嘧啶、尿苷或胍核苷酸。

2'-O-甲基之修飾可描繪如下：

已展示影響核苷酸糖環之另一化學修飾為鹵素取代。例如，核苷酸糖環上之2'-氟(2'-F)取代可增加寡核苷酸結合親和力及核酸酶穩定性。

在本申請案中，術語「fA」、「fC」、「fU」或「fG」用於表示已經2'-F取代之核苷酸。

2'-F之取代可描繪如下：

硫代磷酸酯(PS)鍵聯或鍵係指其中硫取代磷酸二酯鍵聯中之一個非橋接磷酸氧的鍵，例如核苷酸鹼基之間的鍵。當硫代磷酸酯用於產生寡核苷酸時，經修飾之寡核苷酸亦可稱為S-寡核苷酸。

「*」用於表示PS修飾。在本申請案中，術語A*、C*、U*或G*可用於表示以PS鍵與下一(例如3’)核苷酸連接之核苷酸。

在本申請案中，術語「mA*」、「mC*」、「mU*」或「mG*」用於表示已經2'-O-Me取代且藉由PS鍵連接至下一個(例如，3')核苷酸的核苷酸。

下圖展示將S-取代至非橋接磷酸氧中，生成PS鍵代替磷酸二酯鍵：

無鹼基核苷酸係指彼等缺少含氮鹼基之核苷酸。下圖描繪了一個寡核苷酸，其無鹼基(亦稱為缺嘌呤)位點缺少鹼基。如本文所用，單一無鹼基位點之存在不應視為會破壞雙鏈體，例如嚮導RNA之靶向序列與基因體中之靶位點之間形成的雙鏈體：

反向鹼基係指具有自正常5'至3'鍵聯反向的鍵聯(亦即5'至5'鍵聯或3'至3'鍵聯)的彼等鹼基。此類反向鹼基僅作為末端核苷酸存在。在3'至5'進行的化學合成方法中，反向鹼基並不具有可用於使鏈生長之5'羥基。例如：

無鹼基核苷酸可藉由反向鍵聯來連接。例如，無鹼基核苷酸可經由5'至5'鍵聯連接至末端5'核苷酸，或無鹼基核苷酸可經由3'至3'鍵聯連接至末端3'核苷酸。在末端5'或3'核苷酸處之反向無鹼基核苷酸亦可稱為反向無鹼基端帽。

在一些實施例中，5'末端之前三個、四個或五個核苷酸中之一或多者及3'末端之後三個、四個或五個核苷酸中之一或多者經修飾。在一些實施例中，修飾為2'-O-Me、2'-F、反向無鹼基核苷酸、PS鍵或在此項技術中熟知的增加穩定性或性能的其他核苷酸修飾。

在一些實施例中，5'末端之前四個核苷酸及3'末端之後四個核苷酸藉由硫代磷酸酯(PS)鍵連接。

在一些實施例中，5'末端之前三個核苷酸及3'末端之後三個核苷酸包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。在一些實施例中，5'末端之前三個核苷酸及3'末端之後三個核苷酸包含2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。在一些實施例中，5'末端之前三個核苷酸及3'末端之後三個核苷酸包含反向無鹼基核苷酸。

在一些實施例中，嚮導RNA包含經修飾之sgRNA。在一些實施例中，sgRNA包含表4所示之修飾模式，例如mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU (SEQ ID NO: 669)，其中各A、C、G、U及N為RNA核苷酸、2'-OH及與3'核苷酸之磷酸二酯鍵聯，m表示2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸，且*表示核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵聯，其中N之整體構成嚮導序列，其將核酸酶引導至HBV中之靶序列，例如表1A中所示之靶序列。在某些實施例中，嚮導序列包含表1A所示之SEQ ID NO: 2-94中任一者之序列。

在一些實施例中，嚮導RNA包含經修飾之sgRNA。在一些實施例中，sgRNA包含表6所示之修飾模式，例如 mN*mN*mN*mNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNN mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 816) mN*mN*mN*mNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 817) mN *mN*mN*mNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNN mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 818) mN *mN*mN*mNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNN mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 819) 其中各A、C、G、U及N為RNA核苷酸、2'-OH及與3'核苷酸之磷酸二酯鍵聯，m表示2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸，且*表示核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵聯，其中N之整體構成嚮導序列，其將核酸酶引導至HBV中之靶序列，例如表2A中所示之靶序列。在某些實施例中，嚮導序列包含表2A所示之SEQ ID NO: 95-192中任一者之序列。

如上所示，在一些實施例中，本文揭示之組合物或調配物包含含有開放閱讀框(ORF)之mRNA，該開放閱讀框編碼RNA指導的DNA結合劑，諸如Cas核酸酶，例如本文所述之Cas9核酸酶。在一些實施例中，提供、使用或投與包含編碼RNA指導的DNA結合劑諸如Cas核酸酶例如Cas9核酸酶之ORF的mRNA。在一些實施例中，編碼RNA指導的DNA核酸酶之ORF為「經修飾之RNA指導的DNA結合劑ORF」或簡稱為「經修飾之ORF」，用作指示ORF經修飾之簡寫。

在一些實施例中，mRNA或經修飾之ORF可在至少一個、複數個或所有尿苷位置處包含經修飾尿苷。在一些實施例中，經修飾尿苷為在5位置處例如經鹵素、甲基或乙基修飾之尿苷。在一些實施例中，經修飾尿苷為在1位置處例如經鹵素、甲基或乙基修飾之假尿苷。經修飾尿苷可為例如假尿苷、N1-甲基-假尿苷、5-甲氧基尿苷、5-碘尿苷或其組合。在一些實施例中，經修飾尿苷為5-甲氧基尿苷。在一些實施例中，經修飾尿苷為5-碘尿苷。在一些實施例中，經修飾尿苷為假尿苷。在一些實施例中，經修飾尿苷為N1-甲基-假尿苷。在一些實施例中，經修飾尿苷為假尿苷與N1-甲基-假尿苷之組合。在一些實施例中，經修飾尿苷為假尿苷與5-甲氧基尿苷之組合。在一些實施例中，經修飾尿苷為N1-甲基假尿苷與5-甲氧基尿苷之組合。在一些實施例中，經修飾尿苷為5-碘尿苷與N1-甲基-假尿苷之組合。在一些實施例中，經修飾尿苷為假尿苷與5-碘尿苷之組合。在一些實施例中，經修飾尿苷為5-碘尿苷與5-甲氧基尿苷之組合。

在一些實施例中，本文所揭示之mRNA包含5'帽，諸如Cap0、Cap1或Cap2。5'帽通常係7-甲基鳥嘌呤核糖核苷酸(可進一步修飾，如下面例如關於ARCA所論述)，其經由5'-三磷酸連接至mRNA之5'至3'鏈之第一個核苷酸，亦即第一個帽近端核苷酸之5'位置。在Cap0中，mRNA之第一個及第二個帽近端核苷酸之核糖都包含2'-羥基。在Cap1中，mRNA之第一轉錄核苷酸及第二轉錄核苷酸之核糖分別包含2'-甲氧基及2'-羥基。在Cap2中，mRNA之第一個及第二個帽近端核苷酸之核糖均包含2’-甲氧基。參見，例如，Katibah等人(2014) Proc Natl Acad Sci USA111(33):12025-30；Abbas等人(2017) Proc Natl Acad Sci USA 114(11):E2106-E2115。大部分內源性高級真核生物mRNA (包括哺乳動物mRNA，諸如人類mRNA)包含Cap1或Cap2。Cap0以及不同於Cap1及Cap2之其他帽結構可能在哺乳動物(諸如人類)中具有免疫原性，因為先天免疫系統之組分(諸如IFIT-1及IFIT-5)將其識別為「非自身」，從而可能導致細胞介素水準升高，包括I型干擾素。先天免疫系統之組分(諸如IFIT-1及IFIT-5)亦可與eIF4E競爭結合具有除Cap1或Cap2以外之帽的mRNA，從而潛在地抑制mRNA之轉譯。

可共轉錄地包括帽。例如，ARCA (抗反向帽類似物；Thermo Fisher Scientific目錄號AM8045)係一種帽類似物，包含連接到鳥嘌呤核糖核苷酸5'位置之7-甲基鳥嘌呤3'-甲氧基-5'-三磷酸，它可以起始時在活體外被整合到轉錄物中。ARCA產生Cap0帽，其中第一帽近端核苷酸之2'位置為羥基。參見，例如，Stepinski等人，(2001) 「Synthesis and properties of mRNAs containing the novel 『anti-reverse』 cap analogs 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'deoxy)GpppG,」 RNA7: 1486–1495。ARCA結構示於下文中。

CleanCap ^TMAG (m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG；TriLink Biotechnologies目錄號N-7113)或CleanCap ^TMGG (m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG；TriLink Biotechnologies目錄號N-7133)可用於共轉錄地提供Cap1結構。CleanCap ^TMAG及CleanCap ^TMGG之3'-O-甲基化形式亦可自TriLink Biotechnologies分別以目錄號N-7413及N-7433獲得，或CleanCap AU可自TriLink Biotechnologies以目錄號N-7114獲得。CleanCap ^TMAG結構如下文所示。

或者，可在轉錄後將帽添加到RNA。例如，牛痘加帽酶為市售的(New England Biolabs目錄號M2080S)，且具有由其D1次單元提供之RNA三磷酸酯酶及鳥苷基轉移酶活性以及由其D12次單元提供之鳥嘌呤甲基轉移酶。因而，其可在S-腺苷甲硫胺酸及GTP存在下將7-甲基鳥嘌呤添加至RNA中，以便得到Cap0。參見例如Guo, P.及Moss, B. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA87, 4023-4027；Mao, X.及Shuman, S. (1994) J. Biol. Chem. 269, 24472-24479。

在一些實施例中，mRNA進一步包含多聚腺苷酸化(poly-A)尾。在一些實施例中，poly-A尾包含至少20、30、40、50、60、70、80、90或100個腺嘌呤，視情況至多300個腺嘌呤。在一些實施例中，poly-A尾包含95、96、97、98、99或100個腺嘌呤核苷酸。在一些實施例中，poly-A尾包括非腺嘌呤核苷酸，亦即，為間斷的poly-A尾。在某些實施例中，poly-A尾經約每40、50、60、70、80或90個核苷酸被非腺嘌呤核苷酸間斷。在某些實施例中，poly-A尾經約每50個核苷酸被非腺嘌呤核苷酸間斷。 核糖核蛋白複合物

在一些實施例中，涵蓋一種組合物，其包含一或多種sgRNA，該一或多種sgRNA包含來自表1A之一或多個嚮導序列或來自表2A之一或多種sgRNA，以及RNA指導的DNA結合劑，例如核酸酶，諸如Cas核酸酶，諸如Cas9。在一些實施例中，RNA指導的DNA結合劑具有裂解酶活性，其亦可稱為雙股核酸內切酶活性。在一些實施例中，RNA指導的DNA結合劑包含Cas核酸酶。Cas9核酸酶之實例包括釀膿鏈球菌、腦膜炎雙球菌及如此項技術中已知的其他原核生物之II型CRISPR系統之彼等核酸酶，及其經修飾(例如工程化或突變體)形式。

在一些實施例中，Cas核酸酶係來自釀膿鏈球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自腦膜炎雙球菌之Cas9核酸酶。

在一些實施例中，gRNA與RNA指導的DNA結合劑一起稱為核糖核蛋白複合物(RNP)。在一些實施例中，RNA指導的DNA結合劑為Cas核酸酶。在一些實施例中，gRNA連同Cas核酸酶一起被稱為Cas RNP。在一些實施例中，RNP包含I型、II型或III型組分。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自II型CRISPR/Cas系統之Cas9蛋白。在一些實施例中，gRNA與Cas9一起稱為Cas9 RNP。

野生型Cas9具有兩個核酸酶域：RuvC及HNH。RuvC域將非靶DNA股裂解，且HNH域將靶DNA股裂解。在一些實施例中，Cas9蛋白包含多於一個RuvC域或多於一個HNH域。在一些實施例中，Cas9蛋白係野生型Cas9。在組合物、用途及方法實施例之每一者中，Cas誘導靶DNA中之雙股斷裂。

在一些實施例中，使用嵌合Cas核酸酶，其中蛋白質之一個域或區域由不同蛋白質之一部分置換。在一些實施例中，Cas核酸酶域可經來自不同核酸酶諸如Fok1之域置換。在一些實施例中，Cas核酸酶可為經修飾之核酸酶。

在其他實施例中，Cas核酸酶可來自I型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas核酸酶可為I型CRISPR/Cas系統之級聯複合物之組分。在一些實施例中，Cas核酸酶可為Cas3蛋白。在一些實施例中，Cas核酸酶可來自III型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas核酸酶可具有RNA裂解活性。

在一些實施例中，RNA指導的DNA結合劑具有單股切口酶活性，亦即可切割一條DNA股以產生單股斷裂，亦稱為「切口」。在一些實施例中，RNA指導的DNA結合劑包含Cas切口酶。切口酶為在dsDNA中產生切口之酶，亦即，切割DNA雙螺旋之一條股但不切割另一條股。在一些實施例中，Cas切口酶係Cas核酸酶(例如，上文論述之Cas核酸酶)之一種形式，其中核酸內切活性位點被不活化，例如，藉由催化域中之一或多個改變(例如，點突變)。關於Cas切口酶及示範性催化域改變之論述，參見例如美國專利第8,889,356號。在一些實施例中，Cas切口酶(諸如Cas9切口酶)具有經不活化之RuvC或HNH域。

在一些實施例中，RNA指導的DNA結合劑經修飾以僅含有一個功能性核酸酶域。例如，可修飾劑蛋白，使得核酸酶域中之一者突變或完全或部分缺失，以降低其核酸裂解活性。在一些實施例中，使用具有活性降低之RuvC域之切口酶。在一些實施例中，使用具有無活性RuvC域之切口酶。在一些實施例中，使用具有活性降低之HNH域之切口酶。在一些實施例中，使用具有無活性HNH域之切口酶。

在一些實施例中，Cas蛋白核酸酶域內之保守胺基酸經取代以降低或改變核酸酶活性。在一些實施例中，Cas核酸酶可包含RuvC或RuvC樣核酸酶域中之胺基酸取代。RuvC或RuvC樣核酸酶域中之示範性胺基酸取代包括D10A (基於釀膿鏈球菌Cas9蛋白)。參見例如Zetsche等人. (2015) Cell10月22日:163(3): 759-771。在一些實施例中，Cas核酸酶可包含HNH或HNH樣核酸酶域中之胺基酸取代。HNH或HNH樣核酸酶域中之示範性胺基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A及D986A (基於釀膿鏈球菌Cas9蛋白)。參見，例如，Zetsche等人(2015)。腦膜炎雙球菌之HNH或HNH樣核酸酶域或RuvC或RuvC樣域中之示範性胺基酸取代包括Nme2Cas9D16A (HNH切口酶)及Nme2Cas9H588A (RuvC切口酶)。

在一些實施例中，編碼切口酶之mRNA與分別同靶序列之有義股及反義股互補之一對嚮導RNA組合提供。在該實施例中，嚮導RNA將切口酶引導至靶序列且藉由在靶序列之相對股上產生切口(亦即，雙切口)來引入DSB。在一些實施例中，雙切口之使用可提高特異性且減少脫靶效應。在一些實施例中，切口酶與靶向相對DNA股之兩個單獨的嚮導RNA一起使用以在靶DNA中產生雙切口。在一些實施例中，切口酶與兩個單獨的嚮導RNA一起使用，該兩個嚮導RNA經選擇為非常接近以在靶DNA中產生雙切口。

在一些實施例中，RNA指導的DNA結合劑缺乏裂解酶及切口酶活性。在一些實施例中，RNA指導的DNA結合劑包含dCas DNA結合多肽。dCas多肽具有DNA結合活性，但基本上缺乏催化(裂解酶/切口酶)活性。在一些實施例中，dCas多肽為dCas9多肽。在一些實施例中，缺乏裂解酶及切口酶活性的RNA指導的DNA結合劑或dCas DNA結合多肽為Cas核酸酶(例如，上文論述之Cas核酸酶)之一種形式，其中其核酸內切活性位點經不活化，例如，藉由其催化域中之一或多個改變(例如，點突變)。參見例如US 20140186958；US 20150166980；及US 20190338308。

在一些實施例中，RNA指導的DNA結合劑包含一或多個異源功能域(例如，係或包含融合多肽)。

在一些實施例中，異源功能域可促進RNA指導的DNA結合劑轉運至細胞核中。舉例而言，異源功能域可為核定位訊號(NLS)。在一些實施例中，RNA指導的DNA結合劑可與1-5個NLS融合。在一些實施例中，RNA指導的DNA結合劑可與2、3或4個NLS融合。在一些實施例中，RNA指導的DNA結合劑可與兩個NLS融合。在一些實施例中，RNA指導的DNA結合劑可與一個NLS融合。當使用一個NLS時，NLS可連接在RNA指導的DNA結合劑序列之N端或C端。在一些實施例中，NLS並不連接至C端。它亦可插入RNA指導的DNA結合劑序列中。在某些情況下，至少兩個NLS為相同的(例如，兩個SV40 NLS)。在某些實施例中，RNA指導的DNA結合劑存在至少兩個不同的NLS。在一些實施例中，RNA指導的DNA結合劑與在羧基末端連接的兩個SV40 NLS序列融合。在一些實施例中，RNA指導的DNA結合劑可與兩個NLS融合，一個連接在N端且一個連接在C端。在一些實施例中，RNA指導的DNA結合劑可與3個NLS融合。在一些實施例中，RNA指導的DNA結合劑可以不與NLS融合。

SV40 NLS、PKKKRKV (SEQ ID NO: 679)或PKKKRRV (SEQ ID NO: 680)。在一些實施例中，NLS可為二分序列，諸如核質蛋白、KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 681)之NLS。在一些實施例中，NLS序列可包含LAAKRSRTT (SEQ ID NO: 682)、QAAKRSRTT (SEQ ID NO: 683)、PAPAKRERTT (SEQ ID NO: 684)、QAAKRPRTT (SEQ ID NO: 685)、RAAKRPRTT (SEQ ID NO: 686)、AAAKRSWSMAA (SEQ ID NO: 687)、AAAKRVWSMAF (SEQ ID NO: 688)、AAAKRSWSMAF (SEQ ID NO: 689)、AAAKRKYFAA (SEQ ID NO: 690)、RAAKRKAFAA (SEQ ID NO: 691)或RAAKRKYFAV (SEQ ID NO: 692)。NLS可為snurportin-1內輸蛋白-β (IBB域，例如SPN1-impβ序列。參見Huber等人，2002, J. Cell Bio., 156, 467-479。在一個具體實施例中，單一PKKKRKV (SEQ ID NO: 693)。在一些實施例中，第一及第二NLS獨立地選自SV40 NLS、核質蛋白NLS、二分NLS、c-myc樣NLS及包含序列KTRAD (SEQ ID NO: 820)之NLS。在某些實施例中，第一及第二NLS可以為相同的(例如，兩個SV40 NLS)。在某些實施例中，第一及第二NLS可以不同。

在一些實施例中，第一NLS為SV40NLS且第二NLS為核質蛋白NLS。

在一些實施例中，SV40 NLS包含序列PKKKRKVE (SEQ ID NO: 694)或KKKRKVE (SEQ ID NO: 695)。在一些實施例中，核質蛋白NLS包含序列KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 696)。在一些實施例中，二分NLS包含序列KRTADGSEFESPKKKRKVE (SEQ ID NO: 697)。在一些實施例中，c-myc樣NLS包含序列PAAKKKKLD (SEQ ID NO: 698)。

視情況在NLS與核酸酶之融合位點或在NLS之間(存在多於一個NLS時)包括一或多個連接子。

在一些實施例中，根據前述實施例中任一者之一或多個NLS與一或多個額外異源功能域組合存在於RNA指導的DNA結合劑中。一或多個連接子視情況包括在融合位點處。

在一些實施例中，異源功能域可能夠改變RNA指導的DNA結合劑之細胞內半衰期。在一些實施例中，可增加RNA指導的DNA結合劑之半衰期。在一些實施例中，可減少RNA指導的DNA結合劑之半衰期。在一些實施例中，異源功能域可能夠提高RNA指導的DNA結合劑之穩定性。在一些實施例中，異源功能域可能夠降低RNA指導的DNA結合劑之穩定性。在一些實施例中，異源功能域可充當蛋白質降解之訊號肽。在一些實施例中，蛋白質降解可由蛋白水解酶，例如蛋白酶體、溶酶體蛋白酶或calpain蛋白酶介導。在一些實施例中，異源功能域可包含PEST序列。在一些實施例中，RNA指導的DNA結合劑可藉由添加泛素或多泛素鏈來修飾。在一些實施例中，泛素可為泛素樣蛋白(UBL)。泛素樣蛋白之非限制性實例包括小泛素樣修飾劑(SUMO)、泛素交叉反應蛋白(UCRP，亦稱為干擾素刺激基因-15 (ISG15))、泛素相關修飾劑-1 (URM1)、神經元前驅細胞表現之發育下調蛋白-8 (NEDD8，在 釀酒酵母中亦稱為Rub1)、人類白血球抗原F相關(FAT10)、自噬-8 (ATG8)及自噬-12 (ATG12)、Fau泛素樣蛋白(FUB1)、膜錨定UBL (MUB)、泛素折疊修飾劑-1 (UFM1)及泛素樣蛋白-5 (UBL5)。

在一些實施例中，異源功能域可為標記域。標記域之非限制性實例包括螢光蛋白、純化標籤、抗原決定基標籤及報告基因序列。在一些實施例中，標記域可為螢光蛋白。合適的螢光蛋白之非限制性實例包括綠色螢光蛋白(例如GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、sfGFP、EGFP、Emerald、Azami Green、Monomeric Azami Green、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黃色螢光蛋白(例如YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、藍色螢光蛋白(例如EBFP、EBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv、Sapphire、T-sapphire)、青色螢光蛋白(例如ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi-Cyan)、紅色螢光蛋白(例如mKate、mKate2、mPlum、DsRed monomer、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-Monomer、HcRed-Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)及橙色螢光蛋白(mOrange、mKO、Kusabira-Orange、Monomeric Kusabira-Orange、mTangerine、tdTomato)或任何其他合適的螢光蛋白。在其他實施例中，標記域可為純化標籤或抗原決定基標籤。非限制性示範性標籤包括麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、幾丁質結合蛋白(CBP)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、硫氧還蛋白(TRX)、聚(NANP)、串聯親和純化(TAP)標籤、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis (SEQ ID NO: 821)、8xHis (SEQ ID NO: 822)、生物素羧基載體蛋白(BCCP)、聚His及攜鈣蛋白。非限制性示範性報告基因包括麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、辣根過氧化物酶(HRP)、氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、螢光素酶或螢光蛋白。

在其他實施例中，異源功能域可為效應子域。當RNA指導的DNA結合劑被引導至其靶序列時，例如當Cas核酸酶由gRNA引導至靶序列時，效應子域可修飾或影響靶序列。在一些實施例中，效應域可選自核酸結合域、核酸酶域(例如，非Cas核酸酶域)、表觀遺傳修飾域、轉錄活化域或轉錄抑制域。在一些實施例中，異源功能域為核酸酶，諸如FokI核酸酶。參見例如美國專利第9,023,649號。在一些實施例中，異源功能域為轉錄活化物或抑制物。參見例如Qi等人，「Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression」, Cell152:1173-83 (2013)；Perez-Pinera等人，「RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors」, Nat. Methods10:973-6 (2013)；Mali等人，「CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering」, Nat. Biotechnol.31:833-8 (2013)；Gilbert等人，「CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes」, Cell154:442-51 (2013)。因此，RNA指導的DNA結合劑基本上變為轉錄因子，其可使用嚮導RNA引導以結合所需靶序列。在一些實施例中，異源功能域為去胺酶，諸如胞苷去胺酶或腺嘌呤去胺酶。在某些實施例中，異源功能域為C至T鹼基轉換子(胞苷去胺酶)，諸如脂蛋白元B mRNA編輯酶(APOBEC)去胺酶。 gRNA 功效之測定

在一些實施例中，當與形成RNP之其他組分一起遞送或表現時，測定gRNA之功效。在一些實施例中，gRNA與RNA指導的DNA結合劑(諸如Cas蛋白，例如Cas9)一起表現。在一些實施例中，gRNA經遞送至或表現於已穩定表現RNA指導的DNA核酸酶(諸如Cas核酸酶或切口酶，例如Cas9核酸酶或切口酶)的細胞株中。在一些實施例中，gRNA作為RNP之一部分遞送至細胞中。在一些實施例中，將gRNA連同編碼RNA指導的DNA核酸酶(諸如Cas核酸酶或切口酶，例如Cas9核酸酶或切口酶)之mRNA一起遞送至細胞。

如本文所述，使用本文所揭示之RNA指導的DNA核酸酶及嚮導RNA會造成DNA雙股斷裂，由此可在由細胞機制修復後產生插入/缺失(插入缺失)突變形式之錯誤。許多由插入缺失引起之突變改變閱讀框或引入過早終止密碼子，且因此產生非功能性蛋白質。在其他實施例中，RNA指導的DNA核酸酶的使用導致鹼基變化，導致過早終止密碼子、起始密碼子或調節序列之破壞，或引入破壞所編碼蛋白質之功能的突變，或其組合。在一些實施例中，特定gRNA之功效係基於活體外模型測定的。在一些實施例中，活體外模型為穩定表現Cas9之HEK293細胞(HEK293_Cas9，例如獲自ATCC)。在某些實施例中，細胞株為HepAD38細胞株。在一些實施例中，活體外模型為原代細胞株，例如原代肝細胞株，例如原代肝細胞。在一些實施例中，活體外模型為外周血單核細胞(PBMC)。在一些實施例中，活體外模型為T細胞，諸如原代人類T細胞。關於使用原代細胞，可使用市售原代細胞來提供實驗之間更大的一致性。在一些實施例中，活體外模型(例如，原代肝細胞、T細胞)中發生缺失或插入之脫靶位點之數量係例如藉由分析來自用Cas9 mRNA及嚮導RNA活體外轉染之細胞的基因體DNA來確定。在一些實施例中，此類確定包括分析來自用Cas9 mRNA、嚮導RNA及供體寡核苷酸在活體外轉染之細胞的基因體DNA。工作實例中提供了此類確定之示範性程序，其中使用各種細胞類型。

在一些實施例中，特定gRNA之功效係在用於gRNA選擇過程之多個活體外細胞模型中測定的。在一些實施例中，進行資料與所選gRNA之細胞株比較。在一些實施例中，進行多細胞模型中之交叉篩選。

在一些實施例中，嚮導RNA之功效藉由HBV基因體序列之插入缺失百分比或遺傳修飾百分比來量測，該HBV基因體序列整合至宿主細胞之基因體中或作為細胞質中之cccDNA。在一些實施例中，嚮導RNA之功效藉由HBV基因體基因座例如HepAD38 (基因型D)處插入缺失百分比或遺傳修飾百分比來量測(參見例如，Ladner SK等人，1997, AAC 41:1715–1720)。在一些實施例中，嚮導RNA之功效藉由表1A及表2A之HBV靶位點之插入缺失百分比或遺傳修飾百分比來量測。在一些實施例中，將HBV基因體基因座之編輯百分比與達成HBV蛋白產物之減少(例如減弱)所需的插入缺失或遺傳修飾百分比進行比較。在一些實施例中，嚮導RNA之功效藉由減少的HBV蛋白表現來量測。在實施例中，該減少的蛋白表現藉由例如像本文所述之ELISA來量測。在某些實施例中，蛋白質為分泌的蛋白質，例如在細胞培養基或血液或源自其的級分(例如血清)中。

在一些實施例中，使用本文所揭示之方法及組合物減少HBV蛋白表現。在一些實施例中，相對於未經修飾之細胞之對照群體，例如藉由ELISA測定之蛋白質水準減少至少55%、60%、65%、70%、75%，較佳至少80%、85%、90%，更佳至少95%或99%。在一些實施例中，藉由蛋白質活性檢定，例如聚合酶檢定來測定蛋白質水準。

「一種未經修飾之細胞」(或「多種未經修飾之細胞」)係指實驗或測試中相同細胞類型之一種對照細胞(或多種對照細胞)，其中「未經修飾之」對照細胞未與HBV嚮導接觸。因此，一種未經修飾之細胞(或多種細胞)可為未與嚮導RNA接觸之細胞，或已與不靶向HBV之嚮導RNA接觸之細胞。如本文所用，「未經修飾之細胞」可包括尚未與HBV嚮導接觸之HepAD38細胞株。

在一些實施例中，嚮導RNA之功效係藉由靶細胞類型(諸如原代肝細胞)之基因體內脫靶序列處插入缺失或遺傳修飾之數量或頻率來量測。在一些實施例中，提供有效的嚮導RNA，其在細胞群體中或相對於靶位點處之插入缺失生成頻率以極低頻率(例如，＜5%)在脫靶位點處產生插入缺失。因此，本揭露提供了在靶細胞類型(例如，原代肝細胞)中並不呈現脫靶插入缺失形成或在細胞群體中或相對於靶位點處之插入缺失生成頻率產生＜ 5%之脫靶插入缺失形成頻率的嚮導RNA。在一些實施例中，本揭露提供了與對照細胞相比，在靶細胞類型(例如，原代肝細胞)中並不呈現任何脫靶插入缺失形成的嚮導RNA。在一些實施例中，提供了在少於5個經驗證之脫靶位點處產生插入缺失之嚮導RNA。在一些實施例中，提供了在少於或等於4、3、2或1個經驗證之脫靶位點處產生插入缺失之嚮導RNA。在一些實施例中，一或多個脫靶位點不出現在靶細胞(例如，肝細胞)基因體的蛋白質編碼區中。

在一些實施例中，活體內量測嚮導RNA之功效，例如在具有易於由嚮導RNA靶向的核酸酶裂解的DNA序列(亦即，具有與嚮導RNA中鄰近嚮導及核酸酶的同源PAM之靶向序列充分互補的DNA序列)的動物或動物模型中。在某些實施例中，動物具有易於由經嚮導RNA靶向之核酸酶裂解的內源DNA序列。在某些實施例中，動物模型為基因轉殖模型，例如具有易於由經嚮導RNA靶向之核酸酶裂解之經插入之DNA序列的小鼠模型，例如具有經插入之DNA序列(例如，病毒DNA序列或人類DNA序列，例如來自人類白蛋白之序列)之小鼠。經插入之序列可包括或可不包括在其天然背景下存在於人類基因中之一或多種內含子序列或調節序列，例如3' UTR、5' UTR。在某些實施例中，人類DNA序列可置換同源內源性DNA序列，小鼠白蛋白基因由人類白蛋白基因置換。在某些實施例中，人類基因存在於人類肝細胞背景下之小鼠中，例如具有人源化肝臟之小鼠，例如可自PhoenixBio或Inotiv獲得。在某些實施例中，經插入之DNA序列為具有人源化肝臟之小鼠的人類肝細胞中之病毒DNA序列。在某些實施例中，經插入之DNA序列為含有插入不同病毒之病毒載體中的靶位點之病毒序列，例如AAV載體中之HBV DNA序列。

在一些實施例中，偵測基因編輯事件諸如插入/缺失(「插入缺失」)突變之形成及靶DNA中的插入或同源定向修復(HDR)事件利用帶有標記引子之線性擴增及分離標記擴增產物(以下稱為「LAM-PCR」或「線性擴增(LA)」方法)。在一些實施例中，偵測基因編輯事件為鹼基編輯事件，例如，沒有核苷酸插入或缺失之核苷酸序列之變化，其藉由次世代定序(NGS)來偵測。在一些實施例中，嚮導RNA之功效藉由包含基因表現之蛋白產物的功能性蛋白或蛋白複合物之水準(例如，聚合酶活性檢定)來量測。在一些實施例中，嚮導RNA之功效係藉由ELISA來量測。 用於抑制靶基因表現之遺傳修飾

細胞或細胞群體包含例如編碼HBV基因之核酸序列之遺傳修飾，例如整合到宿主基因體中或作為存在於細胞質中之cccDNA。

在一些實施例中，工程化細胞或細胞群體包含HBV基因之遺傳修飾，如藉由定序(例如，NGS)所評定，其中至少50%、55%、60%、65%、70%、75%，較佳至少80%、85%，更佳至少90%、95%或99%之細胞在HBV序列中包含插入、缺失或取代。應理解，存在多種HBV基因型，並且將遺傳修飾與細胞中存在之HBV序列進行比較，該序列可或可不不同於本文提供之HBV序列SEQ ID NO: 1。在一些實施例中，群體中至少50%之細胞在HBV序列中包含選自插入、缺失及取代之修飾。在一些實施例中，群體中至少55%之細胞包含修飾。在一些實施例中，群體中至少60%之細胞在HBV序列中包含選自插入、缺失及取代之修飾。在一些實施例中，群體中至少65%之細胞在HBV序列中包含選自插入、缺失及取代之修飾。在HBV序列中選自插入、缺失及取代。在一些實施例中，群體中至少70%之細胞在HBV序列中包含選自插入、缺失及取代之修飾。在一些實施例中，群體中至少75%之細胞在HBV序列中包含選自插入、缺失及取代之修飾。在一些實施例中，群體中至少80%之細胞在HBV序列中包含選自插入、缺失及取代之修飾。在一些實施例中，群體中至少85%之細胞在HBV序列中包含選自插入、缺失及取代之修飾。在一些較佳實施例中，群體中至少90%之細胞在HBV序列中包含選自插入、缺失及取代之修飾。在一些實施例中，群體中至少95%之細胞在HBV序列中包含選自插入、缺失及取代之修飾。在一些實施例中，群體中至少99%之細胞在HBV序列中包含選自插入、缺失及取代之修飾。

在一些實施例中，與其中HBV基因尚未經修飾之水準相比，HBV蛋白表現例如HBsAg蛋白表現減少了至少50%、55%、60%、65%、70%、75%，較佳至少80%、85%，更佳至少90%、95%或99%。在一些實施例中，與合適的對照(例如，其中HBV基因例如HBs基因尚未經修飾)相比，HBsAg之表現減少了至少70%或減少至低於檢定之偵測極限。在一些實施例中，與合適的對照(例如，其中HBV基因例如HBs基因尚未經修飾)相比，HBsAg之表現減少了至少75%或減少至低於檢定之偵測極限。在一些實施例中，與合適的對照(例如，其中HBV基因例如HBs基因尚未經修飾)相比，HBsAg之表現減少了至少80%或減少至低於檢定之偵測極限。在一些實施例中，與合適的對照(例如，其中HBV基因例如HBs基因尚未經修飾)相比，HBsAg之表現減少了至少85%或減少至低於檢定之偵測極限。在一些實施例中，與合適的對照(例如，其中HBV基因例如HBs基因尚未經修飾)相比，HBsAg之表現減少了至少90%或減少至低於檢定之偵測極限。在一些實施例中，與合適的對照(例如，其中HBV基因例如HBs基因尚未經修飾)相比，HBsAg之表現減少了至少95%或減少至低於檢定之偵測極限。在一些實施例中，與合適的對照(例如，其中HBV基因例如HBs基因尚未經修飾)相比，HBsAg之表現減少了不多於99%。HBsAg蛋白及mRNA表現之檢定為此項技術中已知的。

在一些實施例中，與其中HBV基因尚未經修飾之水準相比，HBV蛋白表現例如HB pol表現減少了至少50%、55%、60%、65%、70%、75%，較佳至少80%、85%，更佳至少90%、95%或99%，如藉由蛋白質水準或活性所證明。在一些實施例中，與合適的對照(例如，其中HBV基因例如HB P基因尚未經修飾)相比，HB P之表現減少了至少70%或減少至低於檢定之偵測極限。在一些實施例中，與合適的對照(例如，其中HBV基因例如HB P基因尚未經修飾)相比，HB P之表現減少了至少75%或減少至低於檢定之偵測極限。在一些實施例中，與合適的對照(例如，其中HBV基因例如HB P尚未經修飾)相比，HB P之表現減少了至少80%或減少至低於檢定之偵測極限。在一些實施例中，與合適的對照(例如，其中HBV基因例如HB P基因尚未經修飾)相比，HB P之表現減少了至少85%或減少至低於檢定之偵測極限。在一些實施例中，與合適的對照(例如，其中HBV基因例如HB P尚未經修飾)相比，HB P之表現較佳減少了至少90%或減少至低於檢定之偵測極限。在一些實施例中，與合適的對照(例如，其中HBV基因例如HB P基因尚未經修飾)相比，HB P之表現減少了至少95%或減少至低於檢定之偵測極限。在一些實施例中，與合適的對照(例如，其中HBV基因例如HB P基因尚未經修飾)相比，HB P之表現減少了至少99%或減少至低於檢定之偵測極限。在一些實施例中，與合適的對照(例如，其中HBV基因例如HB P尚未經修飾)相比，HB P之表現減少了不多於95%。在一些實施例中，與合適的對照(例如，其中HBV基因例如HB P尚未經修飾)相比，HB P之表現減少了不多於99%。HB P蛋白表現及活性，以及mRNA表現之檢定為此項技術中已知的。

在一些實施例中，與其中HBV基因尚未經修飾之水準相比，HBV蛋白表現例如HBsAg表現(例如，如藉由HBsAg水準所證明)以及HB P表現(例如，如藉由蛋白質水準或活性所證明)均減少了至少50%、55%、60%、65%、70%、75%，較佳至少80%、85%，更佳至少90%、95%或99%。在一些實施例中，HBsAg表現及HB P表現均藉由使用靶向HBsAg及HB P ORF之重疊區域內之單一位點的一種gRNA而降低，例如，在SEQ ID NO: 1中之HBsAg ORF及HB P ORF內。應當理解，由於HBV基因體之變異，有效靶向SEQ ID NO: 1中之HBsAg ORF及HB P ORF兩者的gRNA可能無法用於靶向所有HBV基因型中之兩個ORF。

在一些實施例中，藉由使用靶向HBsAg ORF及HB pol ORF中之不同位點(例如，非重疊位點)的至少兩種gRNA來降低HBsAg表現及HB pol表現。

應理解，在一些實施例中，活體內表現水準可在表現靶基因之一種但並非所有組織中受到抑制。在HBV的情況下，在一種但不是所有表現ORF之HBV基因型中，HBV蛋白之表現水準可能受到抑制。在某些實施例中，替代標記可用於監測表現之變化。例如，肝臟中產生之許多蛋白質被分泌至循環中；因此，表現之抑制水準可藉由血液中蛋白質水準之減少來測定或與該減少相關。在某些實施例中，抑制肝臟中之表現可導致體液例如血液或尿液中代謝物或其他生物標記之變化。代謝物水準之變化可與表現之抑制水準相關。此類相關性可用於監測表現之抑制水準，因為連續生檢物，例如連續肝臟生檢物對於在人類個體中或通常在動物模型中之監測而言並不實用。

在一些實施例中，使用嚮導RNA及RNA指導的DNA結合劑對靶基因進行遺傳修飾，從而導致細胞中之表現抑制。在一些實施例中，本文揭示藉由例如使用嚮導RNA與RNA指導的DNA結合劑(例如，CRISPR/Cas系統)在細胞之靶基因內誘導斷裂(例如，雙股斷裂(DSB)或單股斷裂(切口))而工程化之細胞。該等方法可在活體外使用，例如用於篩選嚮導，或在活體內使用，例如以提供治療益處。

在一些實施例中，嚮導RNA藉由RNA指導的DNA結合劑(例如，Cas核酸酶)在靶基因內之本文所述的位點處介導一個或兩個DNA股之標靶特異性切割。應理解，在一些實施例中，嚮導RNA包含結合至彼等區域或能夠結合至彼等區域之嚮導序列。 III. 包括基因體編輯劑之治療方法及用途的方法及用途

本文所揭示之gRNA以及相關方法及組合物可用於製備基因體編輯治療劑。

在一些實施例中，包含表1A及表2A之嚮導序列之gRNA與RNA指導的DNA核酸酶諸如Cas核酸酶一起誘導斷裂，單股斷裂或雙股斷裂。雙股斷裂導致修復過程中之非同源末端接合(NHEJ)，導致HBV基因之修飾，例如突變。在一些實施例中，NHEJ導致核苷酸之缺失或插入，從而在HBV基因中誘導框移或無意義突變。單股斷裂可與鹼基編輯偶合，導致序列改變，例如生成終止密碼子、破壞起始位點或破壞ORF功能之突變。在某些實施例中，包含靶向靶基因體序列之嚮導序列的gRNA亦與RNA指導的DNA核酸酶(諸如Cas核酸酶)一起或分別遞送至細胞，以在靶基因體序列中產生遺傳修飾，從而抑制來自靶基因之全長表現產物之表現。由於HBV基因體之重疊性質，一種嚮導RNA可能會導致HBV基因體中之多於一個ORF發生變化。在某些實施例中，gRNA為sgRNA。

在一些實施例中，個體為哺乳動物。在一些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，個體為非人類靈長類動物。在一些實施例中，個體為其中肝臟已重新植入人類肝細胞之小鼠。

在一些實施例中，嚮導RNA、組合物及調配物用於活體內產生細胞，例如肝臟細胞，例如HBV基因中具有遺傳修飾之肝細胞，該HBV基因可整合至宿主基因體中或作為游離拷貝存在，例如作為cccDNA。 gRNA 組合物之遞送

脂質奈米顆粒(LNP)係用於遞送核苷酸及蛋白質貨物之熟知手段，且可用於活體內及活體外遞送本文所揭示之嚮導RNA及組合物。在一些實施例中，LNP將核酸、蛋白質或核酸連同蛋白質一起遞送。

在一些實施例中，提供了一種用於將本文所揭示之細胞或細胞群體中之任一者遞送至個體的方法，其中gRNA經由LNP活體內遞送。在一些實施例中，gRNA/LNP亦與Cas9或編碼Cas9之mRNA締合。

在一些實施例中，提供了一種組合物，其包含所揭示之gRNA中任一者及LNP。在一些實施例中，該組合物進一步包含Cas9或編碼Cas9之mRNA。在一些實施例中，組合物進一步包含尿嘧啶糖苷酶抑制劑(UGI)或編碼UGI之mRNA。

在一些實施例中，與本文所揭示之gRNA締合的LNP用於製備供治療疾病或病症之用的藥劑。

在一些實施例中，提供了一種用於活體內遞送本文所揭示之gRNA中之任一者的方法，其中gRNA與LNP締合。在一些實施例中，gRNA不與LNP締合。在一些實施例中，gRNA/LNP或gRNA亦與Cas9或編碼Cas9之mRNA締合。在一些實施例中，gRNA/LNP、gRNA、Cas9或編碼Cas9之mRNA亦與UGI或編碼UGI之mRNA締合。

在一些實施例中，單獨或在一或多種載體上編碼之本文所述之嚮導RNA組合物調配於脂質奈米顆粒中或經由脂質奈米顆粒投與(參見例如，WO2017/173054及WO2021/222287，該等文獻中每一者之內容特此以引用之方式整體併入)。

在某些實施例中，提供了DNA或RNA載體，其編碼包含本文所描述之嚮導序列中之任一或多者的嚮導RNA中之任一者。在一些實施例中，除了嚮導RNA序列之外，載體進一步包含不編碼嚮導RNA之核酸。不編碼嚮導RNA之核酸包括但不限於啟動子、增強子、調節序列及編碼RNA指導的DNA核酸酶之核酸，該核酸酶可為諸如Cas9之核酸酶。在一些實施例中，載體包含編碼crRNA、trRNA或crRNA與trRNA之一或多個核苷酸序列。在一些實施例中，載體包含編碼sgRNA之一或多個核苷酸序列及編碼RNA指導的DNA核酸酶(其可為Cas核酸酶，諸如Cas9)之mRNA。在一些實施例中，載體包含編碼crRNA、trRNA之一或多個核苷酸序列及編碼RNA指導的DNA核酸酶(其可為Cas蛋白，諸如Cas9)的mRNA。在一個實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌(亦即，Spy Cas9)。在一個實施例中，Cas9來自腦膜炎雙球菌(亦即，Nme Cas9)。在一些實施例中，編碼crRNA、trRNA或crRNA與trRNA (其可為sgRNA)之核苷酸序列包含嚮導序列或由嚮導序列組成，該嚮導序列由來自天然存在之CRISPR/Cas系統的重複序列之全部或一部分側接。包含crRNA、trRNA或crRNA及trRNA或由其組成之核酸可進一步包含載體序列，其中載體序列包含或由不與crRNA、trRNA或crRNA及trRNA一起天然發現之核酸組成。

在一些實施例中，組分可作為裸核酸、作為與諸如脂質體或泊洛沙姆之試劑複合的核酸引入，或者它們可藉由病毒載體(例如，腺病毒、AAV、疱疹病毒、逆轉錄病毒、慢病毒)遞送。用於核酸之非病毒遞送之方法及組合物包括脂轉染、病毒體、脂質體、免疫脂質體、LNP、聚陽離子或脂質:核酸結合物，裸核酸(例如，裸DNA/RNA)、人工病毒粒子及試劑增強之DNA攝取。適用於活體外篩選之遞送方法可能不適用於活體內遞送。此類考慮為此項技術中熟知的。 IV. B 型肝炎病毒(HBV)感染及治療

如本文所用，「B型肝炎病毒」與術語「HBV」可互換使用，係指屬於肝病毒科(Hepadnaviridae family)之眾所周知的非致細胞病變、嗜肝DNA病毒。

HBV基因體為部分雙股環狀DNA，具有重疊之閱讀框。

根據大小，有四種由HBV基因體編碼之轉錄物(在本文中可稱為「基因」或「開放閱讀框」)。此等含有稱為C、X、P及S之開放閱讀框。核心蛋白由C基因(HBcAg)編碼。B型肝炎e抗原(HBeAg)為藉由前核心(pre-C)蛋白之蛋白水解加工產生。DNA聚合酶由P基因編碼。S基因為編碼表面抗原(HBsAg)之基因。HBsAg基因為一個長的開放閱讀框，包含三個框內「起始」(ATG)密碼子，產生三種不同大小之多肽，稱為大、中及小S抗原(pre-S1+pre-S2+S、pre-S2+S或S)。表面抗原除了裝飾HBV之包膜外，亦為亞病毒顆粒之一部分，與病毒顆粒相比，其產生量大大過量，並在免疫耐受及隔離抗HBsAg抗體中發揮作用，從而使傳染性顆粒能夠逃避免疫偵測。X基因編碼之非結構蛋白之功能尚不完全清楚，但它在轉錄反式活化及複製中發揮作用，並與肝癌之發生有關。

HBV為少數在複製過程中利用逆轉錄酶之DNA病毒之一，該複製過程涉及多個階段，包括病毒基因體進入、脫殼及病毒基因體轉運到細胞核。最初，HBV基因體之複製涉及RNA中間體之生成，然後該中間體經逆轉錄以產生DNA病毒基因體。

細胞感染HBV後，病毒基因體鬆弛環狀DNA (rcDNA)經轉運到細胞核中且轉化為游離共價閉合環狀DNA (cccDNA)，其充當病毒mRNA之轉錄模板。在轉錄及核輸出後，細胞質病毒前基因體RNA (pgRNA)與HBV聚合酶及衣殼蛋白組裝形成核衣殼，在核衣殼內聚合酶催化逆轉錄產生負股DNA，隨後將其複製到正股DNA中以形成後代rcDNA基因體。然後，成熟的核衣殼與病毒包膜蛋白一起包裝，以病毒顆粒之形式排出，或穿梭至細胞核，以透過細胞內cccDNA擴增途徑擴增cccDNA庫。cccDNA為HBV複製週期之重要組分，負責感染之建立及病毒的持續存在。

HBV感染導致產生兩種不同的顆粒：1)傳染性HBV病毒本身(或Dane顆粒)，其包括由HBcAg組裝而成之病毒衣殼，且被由帶有HBV表面抗原之脂質膜組成的包膜覆蓋，以及2)亞病毒顆粒(或SVP)，其含有小及中等形式之B型肝炎表面抗原HBsAg，不具傳染性。每產生一個病毒顆粒，就會有超過10,000個SVP釋放至血液中。因此，SVP (及其攜帶之HBsAg蛋白)代表了血液中絕大多數病毒蛋白。HBV感染細胞亦分泌一種前核心蛋白之可溶性蛋白水解產物，稱為HBV e抗原(HBeAg)。

已經確定了HBV之八種基因型(指定為A至I)，並提出了另一種基因型J，每種基因型都有不同的地理分佈(geographical distribution)。該病毒為非致細胞病變的，病毒特異性細胞免疫為暴露HBV急性感染(6個月內緩解肝病)或慢性HBV感染(通常與進行性肝損傷相關)結果之主要決定因素。

術語「HBV」包括任何HBV基因型(A至J)。HBV基因體之參考序列之完整編碼序列可在例如GenBank登錄號GI:21326584及GI:3582357中找到。C、X、P及S蛋白之胺基酸序列可在例如NCBI登錄號YP_009173857.1 (C蛋白)；YP_009173867.1及BAA32912.1 (X蛋白)；YP_009173866.1及BAA32913.1 (P蛋白)；以及YP_009173869.1、YP_009173870.1、YP_009173871.1及BAA32914.1 (S蛋白)中找到。

使用公共可用之資料庫，例如GenBank、UniProt及OMIM，可以容易地獲得HBV mRNA序列之其他實例。B型肝炎病毒株資料國際儲存庫可在www.hpa-bioinformatics.org.uk/HepSEQ/main.php訪問。

如本文所用，術語「HBV」亦指HBV基因體之天然存在的DNA序列變異，亦即基因型A-J及其變異體。進行了一項分析超過900份出版物之研究，並從涵蓋125個國家之213份記錄中提取了資料(Genes 2018, 9(10), 495; doi.org/10.3390/genes9100495)。使用先前發表之HBV盛行率及人口資料，粗略估計出每個國家每種HBV基因型之感染人數以及全球慢性HBV感染中之基因型分佈。據估計，全球96%之慢性HBV感染係由當時確認之九種基因型中之5種引起的：C基因型最常見(26%)，隨後為D基因型(22%)、E基因型(18%)、A基因型(17%)及B基因型(14%)。據估計，F至I基因型總共導致少於2%之全球慢性HBV感染。

如本文所用，術語「D型肝炎病毒」或「HDV」為環狀、單股RNA病毒，其範圍為1,672 (毒株dFr45，Genbank登錄號AX741144)至1,697個核苷酸(dFr47，GenBank登錄號AX741149)。獨特的開放閱讀框通過肝細胞核中之編輯步驟編碼小的及大的D型肝炎(分別為sHD及IHD)抗原。

HDV之遺傳多樣性與隔離群之地理起源有關，且至少有八種基因型，稱為HDV-1至HDV-8。除了無所不在的HDV-1之外，在日本、台灣及俄羅斯雅庫蒂亞發現HDV-2 (以前標記為HDV-IIa)；在台灣及日本發現HDV-4 (以前標記為HDV-IIb)；在亞馬遜地區(9)發現引起嚴重暴發性肝炎之流行的HDV-3；以及在非洲發現HDV-5、HDV-6、HDV-7及HDV-8 (LeGal等人，Emerg. Infect. Dis. 12:1447-1450, 2006)。

如本文所用，術語「D型肝炎病毒相關疾病」或「HDV相關疾病」為由HDV感染或複製引起或與HDV感染或複製相關之疾病或病症。術語「HDV相關疾病」包括受益於HDV基因表現或複製減少之疾病、病症或疾患。HDV相關疾病之非限制性實例包括例如B型肝炎病毒感染、急性B型肝炎、急性D型肝炎；急性爆發性D型肝炎；慢性D型肝炎；肝纖維化；末期肝病；肝細胞癌。

本文使用「WHO慢性B型肝炎感染者預防、護理及治療指南，2015」作為與B型肝炎病毒、B型肝炎感染以及治療B型肝炎感染之組合物及方法相關之資訊及定義的來源。其中提供了與此相關之更多資訊。

「急性HBV感染」在本文中用作新發B型肝炎感染，其可能是或可能不是黃疸或有症狀的。診斷基於偵測B型肝炎表面抗原(HBsAg)及B型肝炎核心抗原之IgM抗體(抗HBc)。康復伴隨著HBsAg之清除以及血清轉化為抗HBs (B型肝炎表面抗原之抗體)，通常在3個月內。

本文所用之「慢性HBV感染」或「慢性B型肝炎」係指在急性感染HBV後B型肝炎表面抗原(HBsAg)持續六個月或更久。

如本文所用之「免疫耐受期」為在出生時或幼兒期感染的人中在CHB早期階段觀察到的感染之高複製期。

如本文所用之「免疫活動期」為B型肝炎e抗原(HBeAg)陽性疾病之階段，其特徵在於轉胺酶波動及高HBV DNA濃度。可能導致HBeAg血清轉化為抗HBe (B型肝炎e抗原之抗體)。

如本文所用之「非活動期」或「免疫控制期」為慢性B型肝炎之低複製期，其特徵在於HBeAg陰性、抗-HBe陽性、丙胺酸轉胺酶(ALT)正常以及HBV DNA濃度低於2000 IU /mL。

如本文所用之「HBeAg血清轉化」為HBeAg損失以及血清轉化為抗HBe陽性。

如本文所用之「HBeAg陰性慢性B型肝炎(免疫逃脫期)」為HBeAg陰性但具有不同水準之HBV複製及肝損傷的抗HBe陽性疾病之個體的HBV感染。

如本文所用之「HBsAg血清轉化」應理解為HBsAg損失以及血清轉化為抗HBs陽性。

如本文所用之「HBeAg逆轉」應理解為HBeAg在先前HBeAg陰性之人中重新出現，並且通常與HBV複製增加有關。

如本文所用之「肝硬化」為肝病晚期，其特徵在於廣泛的肝纖維化、肝臟結節、肝臟結構改變及肝循環破壞。

「失代償性肝硬化」應理解為肝硬化出現明顯的臨床併發症，包括黃疸、腹水、自發性細菌性腹膜炎、食管靜脈曲張及出血、肝性腦病變、敗血症及腎衰竭。

「B型肝炎表面抗原(HBsAg)」為急慢性B型肝炎感染之血液中可偵測到的HBV包膜蛋白及過量的包被顆粒。

「B型肝炎核心抗原(HBcAg)」為HBV核心蛋白。該核心蛋白經HBsAg包被，因此在血清中未發現游離核心蛋白。

「B型肝炎e抗原(HBeAg)」為在B型肝炎之高複製期發現的病毒蛋白。HBeAg通常為野生型病毒高水準複製之標記，但對於病毒複製來說並不是必需的。

如本文所用之「B型肝炎表面抗體(抗HBs)」應理解為特異性結合HBsAg之抗體。抗HBs為在接種HBV疫苗後以及急性B型肝炎恢復過程中產生的，表明過去的感染及免疫力。

如本文所用之「B型肝炎e抗原抗體」或「抗HBe」應理解為特異性結合HBeAg之抗體，在具有較低水準之HBV複製的人中以及在HBeAg陰性疾病(亦即不表現HBeAg之HBV)中偵測到。

如本文所用之「B型肝炎核心抗體(抗HBc)」應理解為B型肝炎核心(衣殼)蛋白之抗體。抗HBc抗體不是中和抗體，且在急性及慢性感染中均偵測到。

「IgM抗HBc」為抗HBc之一個亞類，可在急性B型肝炎中偵測到，但亦可藉由靈敏檢定在活動性慢性HBV中偵測到。

「IgG抗HBc」為在過去或目前感染中偵測到之抗HBc的一個亞類。

「隱性HBV感染」為B型肝炎表面抗原已清除之人中存在的持續感染，亦即他們的HBsAg陰性但HBV DNA陽性，儘管水準非常低(始終＜200 IU/mL)。大多數人的抗HBc亦為陽性。

如本文所用之「治療失敗」包括一次或二次治療失敗。在可進行HBV DNA測試之環境中：一次抗病毒治療失敗可定義為抗病毒藥物在開始治療後3個月內未能將HBV DNA水準降低≥1 x log10 IU/mL。二次抗病毒治療失敗可定義為在初始抗病毒治療有效(血清HBV DNA下降≥1 x log10 IU/mL)之患者中，HBV DNA水準從最低點反彈≥1 x log10 IU/mL。

在無法進行HBV DNA測試之環境中：可能會根據包括以下之特徵懷疑治療失敗及抗藥性：接受抗藥性屏障(barrier to resistance)較低之抗病毒藥物，並且記錄或懷疑依從性較差，實驗室量測結果諸如血清轉胺酶升高，或進行性肝病之證據。然而，ALT水準升高往往發生較晚，並且是抗藥性之相對較差之預測標記。例如，可以藉由對HBV DNA聚合酶進行定序且識別抗病毒藥物抗藥性之特定遺傳標記來確認抗病毒藥物失敗。

如本文所用之「持續異常或正常ALT水準」為隨時間推移對ALT水準之評估。慢性B型肝炎患者之ALT水準存在波動，且需要縱向監測以確定趨勢。正常ALT之上限定義為男性低於30 U/L，女性低於19 U/L，但應採用當地實驗室正常範圍。持續異常或正常可定義為在6-12個月期間以未指定之間隔或在12個月期間以預定義間隔進行的三次ALT測定分別高於或低於正常上限。

如本文所用，術語「核苷酸(核苷)類似物」或「逆轉錄酶抑制劑」為DNA複製之抑制劑，其在結構上與核苷酸或核苷類似，且特異性抑制HBV cccDNA之複製，而不顯著抑制宿主(例如，人類) DNA之複製。此類抑制劑包括富馬酸替諾福韋二吡呋酯(Tenofovir disoproxil fumarate，TDF)、替諾福韋埃拉酚胺(Tenofovir alafenamide，TAF)、拉米夫定(Lamivudine)、阿德福韋酯(Adefovir dipivoxil)、恩替卡韋(Entecavir，ETV)、替比夫定(Telbivudine)、AGX-1009、恩曲他濱(emtricitabine)、克拉夫定(clevudine)、利托那韋(ritonavir)、二吡呋酯(dipivoxil)、洛布卡韋(lobucavir)、famvir、FTC、N-乙醯基-半胱胺酸(NAC)、PC1323、theradigm-HBV、胸腺素-α、更昔洛韋(ganciclovir)、貝西福韋(besifovir) (ANA-380/LB-80380)及替諾福韋-抑利德斯(tenofvir-exaliades) (TLX/CMX157)。在某些實施例中，核苷酸(核苷)類似物為恩替卡韋(ETV)。核苷酸(核苷)類似物可從多種來源商購獲得，並根據其標籤指示(例如，通常以特定劑量口服投與)或由治療HBV之技術人員確定用於本文提供之方法。

如本文所用，「治療性HBV疫苗」及其類似者可為肽疫苗、DNA疫苗(包括基於載體之疫苗)或針對一或多種HBV蛋白誘導免疫反應(較佳效應T細胞誘導之反應)之基於細胞的疫苗。較佳地，疫苗為一種與多種HBV血清型、較佳所有HBV血清型交叉反應之多抗原決定基疫苗。許多治療性HBV疫苗為此項技術中已知的並且處於臨床前及臨床開發之不同階段。基於蛋白質之疫苗包括B型肝炎表面抗原(HBsAg)及核心抗原(HBcAg)疫苗(例如，Li等人，2015, Vaccine. 33:4247-4254，其以引用之方式併入本文)。示範性DNA疫苗包括HB-110 (Genexine, Kim等人，2008. Exp Mol Med. 40: 669-676)、pDPSC18 (PowderMed)、INO-1800 (Inovio Pharmaceuticals)、HBO2 VAC-AND (ANRS)及CVI-HBV-002 (CHA Vaccine Institute Co., Ltd.)。示範性基於蛋白質之疫苗包括Theravax/DV-601 (Dynavax Technologies Corp.)、EPA-44 (Chongqing Jiachen Biotechnology Ltd.)及ABX 203 (ABIVAX S.A.)。示範性基於細胞之疫苗包括HPDCs-T免疫療法(Sun Yat-Sen University)。組合疫苗及產品亦為已知的且包括HepTcell™ (FP-02.2疫苗(肽)+IC310佐劑(組合肽-寡核苷酸佐劑)，(參見美國專利公開案第2013/0330382號、第2012/0276138號及第2015/0216967號，其各自之全部內容均以引用之方式併入本文))；GS-4774 (Gilead，融合蛋白S.核心X疫苗+Tarmogen T細胞免疫刺激劑)、pSG2.HBs/MVA.HBs (蛋白初免/病毒載體加強，Oxxon Therapeutics)及蛋白初免/修飾痘苗病毒Ankara載體加強(HBsAg及HBsAg蛋白+MVA表現載體中之HBcAg及HBsAg，Backes等人，2016, Vaccine. 34:923-32及WO2017121791，兩者均以引用之方式併入本文)。

如本文所用，術語「佐劑」應理解為促進(例如，增強、加速或延長)針對抗原之免疫反應之劑，與其一起投與以引發長期保護性免疫。針對佐劑本身沒有明顯的免疫反應。佐劑包括但不限於病原體組分、顆粒佐劑及組合佐劑(參見例如，www.niaid.nih.gov/research/vaccine-adjuvants-types)。病原體組分(例如，單磷醯脂質A (MPL)、聚(I:C)、聚ICLC佐劑、CpG DNA、c-di-AMP、c-di-GMP、c-di-CMP；短、平端5'-三磷酸dsRNA (3pRNA) RIG-1配體及乳液諸如聚[二(羧基乙基苯氧基鈉)磷腈] (poly[di(sodiumcarboxylatoethylphenoxy)phosphazene]，PCEP))可藉由靶向先天免疫細胞內部或表面之各種受體，幫助觸發針對疫苗之早期非特異性或先天免疫反應。先天免疫系統影響適應性免疫反應，從而提供針對疫苗靶向之病原體之持久保護。顆粒佐劑(例如，明礬、病毒體、細胞介素，例如，IL-12)形成非常小的顆粒，可以刺激免疫系統並且亦可增強抗原向免疫細胞之遞送。組合佐劑(例如，AS02、AS03及AS04 (均為GSK)；MF59 (Novartis)；ISCOMATRIX® (CSL Limited)；以及IC31® (Altimmune))引發多種保護性免疫反應。單獨使用時效果適中之佐劑一起使用時可能會誘導更有效的免疫反應。在某些實施例中，佐劑促進體液以及細胞免疫反應。為此，需要平衡的Th1/Th2輔助T細胞反應來支持中和抗體反應以及效應細胞毒性T細胞反應。此類佐劑包括例如polyI:C佐劑、polyICLC佐劑、CpG佐劑、STING促效劑(c-di-AMP佐劑、c-di-GMP佐劑或c-di-CMP佐劑)、ISCOMATRIX®佐劑、PCEP佐劑及Rig-I-配體佐劑。在某些實施例中，佐劑為polyI:C佐劑、CpG佐劑、STING促效劑或PCEP佐劑。在某些實施例中，佐劑不為明礬。

如本文所用，「免疫刺激劑」為刺激免疫反應之劑，其可或可不獨立於抗原而投與。免疫刺激劑包括但不限於聚乙二醇化干擾素α 2a (PEG-IFN-α-2a)、干擾素α-2b、PEG-IFN-α-2b、干擾素λ、重組人類介白素7及類鐸受體3、7、8或9 (TLR3、TLR7、TLR8、TLR9)促效劑、病毒進入抑制劑(例如，Myrcludex)、抑制HBsAg分泌或釋放之寡核苷酸(例如，REP 9AC)、衣殼抑制劑(例如，Bay41-4109及NVR-1221)、cccDNA抑制劑(例如，IHVR-25)。在某些實施例中，免疫刺激劑可包括病毒衣殼，視情況空病毒衣殼，例如MVA衣殼。

免疫刺激劑亦可包括免疫檢查點調節劑。免疫檢查點調節劑可為刺激性的或抑制性的。如本文所用，免疫檢查點調節劑增強免疫反應。免疫檢查點調節劑包括但不限於CTLA-4抑制劑，諸如伊匹單抗；PD-1抑制劑，諸如納武利尤單抗、帕博利珠單抗，以及BGB-A317抗體。PD-L1抑制劑包括阿替利珠單抗、阿維魯單抗及度伐利尤單抗以及affimer生物治療劑。

在某些實施例中，HBV相關疾病為慢性B型肝炎(CHB)。在某些實施例中，個體已感染HBV至少五年。在某些實施例中，個體已感染HBV至少十年。在某些實施例中，個體在出生時就感染了HBV。在某些實施例中，HBV相關疾病為HDV。

患有慢性B型肝炎疾病之個體具有免疫耐受性，患有活動性慢性感染並伴有壞死性炎症性肝病，在沒有可偵測到的壞死性炎症的情況下肝細胞週轉率增加，或患有非活動性慢性感染而沒有任何活動性疾病的證據，而且他們亦為無症狀的。患有慢性B型肝炎疾病之個體為HBsAg陽性且有高病毒血症(＞10e4 HBV-DNA拷貝/ml血液)或低病毒血症(＜10e3 HBV-DNA拷貝/ml血液)。慢性活動性肝炎患者(尤其是在高複製狀態期間)可能會有與急性肝炎相似之症狀。CHB個體中HBV感染之持續存在為ccc HBV DNA持續存在之結果。在某些實施例中，患有CHB之個體為HBeAg陽性。在其他實施例中，患有CHB之個體為HBeAg陰性。

在個體中之HBV基因表現或HBV複製水準，或者疾病標記或症狀的上下文中，術語「降低(lower)」係指此種水準之統計上顯著之減少。此減少可以為例如至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或更多。在監測HBV感染時，通常使用log 10標度來描述抗原血症水準(例如，血清中之HBsAg水準)或病毒血症水準(血清中之HBV DNA水準)。應理解，1 log 10減少為減少90% (剩餘10%)，2 log 10減少為減少99% (剩餘1%)，等等。在某些實施例中，疾病標記降低至低於偵測水準。

在某些實施例中，疾病標記之表現經正規化，亦即，減少至對於沒有此種病症之個體而言被認為在正常範圍內之水準，例如，疾病標記諸如ALT或AST之水準減少至對於沒有此種病症之個體而言被認為在正常範圍內之水準，較佳持續減少至該水準。當疾病相關水準自正常水準升高時，自正常上限(ULN)計算變化。當疾病相關水準自正常水準減少時，自正常下限(LLN)計算變化。降低為個體值與正常值之間變化之差異百分比。舉例而言，正常AST水準可報告為10至40個單位/公升。若在治療前，個體之AST水準為200個單位/公升(亦即，ULN之5倍，比正常上限高160個單位/公升)，且在治療後，個體之AST水準為120個單位/公升(亦即，ULN之3倍，比正常上限高80個單位/公升)，升高的AST將朝向正常降低50% (80/160)。應理解，AST水準為可變的，特別是在患有HBV之個體中。持續異常或正常可定義為在6-12個月期間以未指定之間隔或在12個月期間以預定義間隔進行的三次AST測定分別高於或低於正常上限。

片語「抑制HBV基因之表現」意欲係指編碼一或多種HBV病毒蛋白(例如像preS1/2-S、preS、S、P、X、preC及C)之任何HBV轉錄物(例如，3.5 kb、2.4 kb、2.1 kb或0.7 kb轉錄物)，以及HBV基因之變異體或突變體之減弱。

「抑制HBV基因之表現」包括對HBV基因或轉錄物之任何顯著水準之抑制，例如對HBV基因S、P、X或C或其任何組合(例如，S、P及C)之表現之至少部分抑制。HBV基因之表現可以基於與HBV基因表現相關之任何變量的水準或水準之變化來評估，例如HBV mRNA水準、HBV蛋白水準或HBV cccDNA水準。可以在單個細胞或一組細胞中評估此水準，包括例如源自個體之樣品，例如可在血清中監測水準。

在一些實施例中，僅向患有HBV感染之個體投與一個劑量的本文提供之嚮導RNA或組合物以治療HBV感染。在一些實施例中，投與多於一個劑量(例如，2、3、4或5個劑量)的本文提供之嚮導RNA或組合物，並且每個劑量可間隔4週、8週、12週、16週、20週或24週。舉例而言，在一些實施例中，將兩個劑量的本文提供之嚮導RNA或組合物投與於患有HBV感染之個體，並且在第一劑量後約1個月、3個月或6個月後投與第二劑量。

在一些實施例中，本文提供之方法包含(1)向患有HBV感染之個體投與第一劑量的本文提供之靶向HBV的嚮導RNA及RNA指導的DNA結合劑或編碼RNA指導的DNA結合劑之核酸，或本文提供的組合物，(2)測定與HBV感染相關之臨床標記(例如，血清HBV DNA或肝臟HBV ccc DNA、血清或肝臟HBV抗原，例如HBsAg或HBeAg)，以及(3)若臨床標記表明存在HBV感染(例如，若HBsAg蛋白水準或HBcrAg蛋白水準超過100 IU/ml、200 IU/ml、300 IU/ml、400 IU/ml、500 IU/ml、600 IU/ml、700 IU/ml、1800 IU/ml、900 IU/ml或1000 IU/ml)，則投與第二劑量之劑。在一些實施例中，在第一劑量後一段時間(例如，第一劑量後1個月、3個月或6個月)量測與HBV感染相關之臨床標記。在一些實施例中，在第一劑量後至少或約1個月、3個月或6個月投與第二劑量。在一些實施例中，步驟(2)及步驟(3)可重複多輪，直到臨床標記指示不存在HBV感染或指示較低HBV感染，例如，若HBsAg蛋白水準或HBcrAg蛋白水準降低至小於1000 IU/ ml，視情況小於100 IU/ml。

此描述及示範性實施例不應被視為限制。出於本說明書及所附申請專利範圍之目的，除非另有說明，否則表示數量、百分比或比例之所有數字，以及說明書及申請專利範圍中所用之其他數值，應理解為在所有情況下均由術語「約」修飾，只要其尚未經如此修飾。因此，除非有相反指示，否則在以下說明書及所附申請專利範圍中闡述之數值參數為近似值，其可視尋求獲得所需特性及此項技術內接受的公差而變化。至少且不試圖將等同準則之應用局限於申請專利範圍之範疇，各數值參數至少應根據所報告之有效數位的數量且藉由應用普通捨入技術來解釋。 V. 實例 實例1. 材料及方法 實例1.1. 下 一代定序(「NGS」)及在靶(on-target)裂解效率分析

根據製造商方案，使用QuickExtract™ DNA提取溶液(Lucigen，目錄號QE09050)提取基因體DNA。為了定量測定基因體中靶位置之編輯效率，利用深度定序來鑑定藉由基因編輯引入之插入及缺失的存在。PCR引子圍繞感興趣之基因內之靶位點設計，並擴增感興趣之基因體區域。按照本領域中之標準進行引子序列設計。

根據製造商之方案(Illumina)進行額外PCR，以添加用於定序之化學物質。在Illumina MiSeq儀器上對擴增子進行定序。在消除品質評分較低之讀段之後，將讀段與人類參考基因體(例如hg38)或包含在HepAD38中之HBV D基因型序列進行比對。將與感興趣之靶區域重疊的讀段與局部基因體序列進行再比對，以改良比對。接著計算野生型讀段之數量與含有C至T突變、C至A/G突變或插入缺失之讀段之數量。在以所預測之Cas9裂解位點為中心的20 bp區域中對插入及缺失進行評分。插入缺失百分比定義為在20 bp評分區域內插入或缺失一或多個鹼基之定序讀段總數除以定序讀段總數，包括野生型。在40 bp區域中對C至T突變或C至A/G突變進行評分，該區域包括該20 bp sgRNA靶序列之上游10 bp及下游10 bp。C至T編輯百分比定義為在40 bp區域內具有一或多個C至T突變之定序讀段總數除以定序讀段總數，包括野生型。類似地計算C至A/G突變之百分比。

對NGS資料進行了額外的計算分析，以預測C至T編輯之潛在表型結果(亦即終止密碼子獲得百分比或起始密碼子損失百分比)。根據每個同功型之讀段水準評估編輯結果。 實例1.2. 脂 質奈米顆粒之製備

一般而言，將脂質奈米顆粒(LNP)組分以各種莫耳比溶解於100%乙醇中。將RNA貨物(例如，Cas9 mRNA及sgRNA)溶解於25 mM檸檬酸鹽、100 mM NaCl (pH 5.0)中，使得RNA貨物之濃度為大約0.45 mg/mL。所用LNP含有可離子化脂質((9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八烷-9,12-二烯酸酯，亦稱為(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯) (本文中亦稱為脂質A)、膽固醇、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)及1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷醯乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000] (PEG2k-DMG) (目錄號880150P，來自Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA)，其莫耳比為50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG。LNP以約6之脂質胺與RNA磷酸鹽(N:P)莫耳比來調配。所用LNP包含單一RNA種類，諸如Cas9 mRNA或sgRNA。LNP用Cas9 mRNA及嚮導RNA之混合物類似地製備。

LNP係使用錯流技術製備的，該技術利用乙醇中之脂質與兩體積之RNA溶液及一體積之水進行碰撞噴射混合。首先，透過十字混合器將乙醇中之脂質與兩體積之RNA溶液混合。接著，使第四水流經由直列三通與十字管之出口流混合(參見WO2016010840之圖2)。使該等LNP在室溫下保持1小時，且進一步用水稀釋(大約1:1 v/v)。將經稀釋之LNP用緩衝液交換至50 mM Tris、45 mM NaCl、5% (w/v)蔗糖(pH 7.5) (TSS)中，且視需要藉由此項技術中已知之方法進行濃縮。接著，使用0.2 μm無菌過濾器過濾所得混合物。對最終LNP進行表徵以確定囊封效率、多分散指數及平均粒徑。將最終LNP儲存在4℃或-80℃下直至進一步使用。實例1.3. mRNA之活體外轉錄(「IVT」)

藉由活體外轉錄使用線性化質體DNA模板及T7 RNA聚合酶來生成含有N1-甲基假U之加帽及多聚腺苷酸化mRNA。藉由限制性核酸內切酶消化，隨後反應混合物之熱不活化使含有T7啟動子及轉錄序列之線性化質體DNA線性化，且自酶及緩衝鹽中純化。使用此項技術中已知的標準技術合成且純化傳訊RNA。

由編碼根據SEQ ID NO:706或712 (參見表40中之序列)之開放閱讀框之質體DNA生成釀膿鏈球菌(「Spy」) Cas9 mRNA。當SEQ ID NO: 706、712或其他編碼開放閱讀框之SEQ ID NO在下文中關於RNA提及時，應理解T應替換為U (其為如上所述之N1-甲基假尿苷)。實例中使用之傳訊RNA包括5'帽及3’ poly-A尾，例如，最多100個核苷酸，且由表40中之SEQ ID NO: 701標識。

腦膜炎雙球菌(Nme) Cas 9 mRNA自編碼根據SEQ ID NO: 710或715 (參見表40中之序列)之開放閱讀框之質體DNA生成。當SEQ ID NO: 710、715或其他編碼開放閱讀框之SEQ ID NO在下文中關於RNA提及時，應理解T應替換為U (其為如上所述之N1-甲基假尿苷)。實例中使用之傳訊RNA包括5'帽及3’ poly-A尾，例如，最多100個核苷酸，且由表40中之SEQ ID NO: 703及704標識。

自編碼根據SEQ ID NO: 708之開放閱讀框之質體DNA生成尿嘧啶糖苷酶抑制劑(UGI)。當SEQ ID NO: 708或其他編碼開放閱讀框之SEQ ID NO在下文中關於RNA提及時，應理解T應替換為U (其為如上所述之N1-甲基假尿苷)。實例中使用之傳訊RNA包括5'帽及3’ poly-A尾，例如，最多100個核苷酸，且由表40中之SEQ ID NO: 702標識。

嚮導RNA藉由在此項技術中已知之方法化學合成。實例 1.4. HepAD38 轉染製備及實驗時間表

HepAD38 (Ladner等人，1997 Antimicrobial Agents and Chemotherapy41(8): 1715-1720)是一種從Fox Chase Cancer Center獲得許可之人類肝細胞株，其含有整合的、四環素響應的、CMV-IE啟動子驅動的HBV D基因型拷貝，ayw株。HepAD38細胞株之完全培養基由含有10% Tet安全胎牛血清(Gibco, A4736401)、1X非必需胺基酸(Corning, 25-025-C1)、1 mM丙酮酸鈉(Corning 25-000-Cl)及1X青黴素-鏈黴素(Gibco 15070-063)之DMEM/F12 1:1培養基(Corning 10-092-CM)構成。完全培養基中補充有1 mg/mL多西環素(Sigma-Aldrich，D9891)以抑制誘導型表面抗原產生，且補充有250 μg/mL G418硫酸鹽選擇標記(Corning，30-234-CR)以消除不攜帶HBV整合拷貝之細胞。將HepAD38細胞解凍並在10 cm膠原蛋白包被的培養皿中在含補充劑之完全培養基中傳代。在鋪板細胞進行轉染之前，製備不含補充劑之完全培養基，並將細胞以20,000個細胞/孔之密度鋪板在96孔膠原蛋白包被的板中。在轉染前去除補充劑以誘導表面抗原產生且去除可能干擾轉染或細胞健康的元素。

HepAD38實驗之典型實驗時間表如下。在第0天，如上所述將細胞鋪板。24小時後，在第1天進行轉染。在第4天，編輯完成後，從板中取出轉染培養基，且用不含補充劑之新鮮完全培養基更換。將細胞再維持7天，使表面抗原在細胞培養基中累積。在第11天，收集細胞培養基且儲存在-80℃下以供下游檢定。將細胞在50 μL/孔QuickExtract™ DNA提取溶液(Lucigen，QE09050)中裂解，且儲存在-80℃下以供下游檢定。若進行下游免疫螢光檢定，則製備一組重複板，且使細胞經受固定及染色，如實例1.7中所述。實例 1.5. 病毒接種物之製備

HepAD38細胞攜帶整合至基因體中之B型肝炎病毒。為了收穫病毒顆粒，將300萬個HepAD38細胞鋪板在膠原蛋白包被的10 cm培養皿中，其含有實例1.4中所述之完全細胞培養基(無補充劑)。在7天后，收穫培養基且更換為新鮮培養基(細胞未分裂)。在7天后，再次收穫培養基。將收穫之培養基儲存在-80℃下。

為了沉澱病毒顆粒，將收穫的培養基以1,500 x g離心10 min以沉澱細胞碎片。將上清液移至新管中，且將一體積之PEG-it™病毒沉澱溶液(System Biosciences，LV810A-1)添加到4體積之上清液中。將管倒置數次且在4℃下儲存隔夜。第二天，將混合物在4℃下以1,500 x g離心30 min以沉澱病毒沉澱。吸出上清液，且將沉澱物以1/10之原始體積重懸於完全培養基中。將所得病毒接種物等分並儲存在-80℃下。藉由使用DNA minprep套組(Zymo Research D4003)分離病毒基因體，對純化之病毒顆粒樣品進行滴定(病毒顆粒/mL)，並使用qPCR針對編碼相同HBV DNA序列之質體標準品進行量化，其中引子序列Fwd：5’- GTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTC-3’ (SEQ ID NO: 699)，Rev：5’- GGAGGGATACATAGAGGTTCCTTGA-3’ (SEQ ID NO: 700)。實例 1.6. HBsAg MSD ELISA 方案

此MSD檢定用於測定細胞培養基樣品或小鼠血清樣品中之HBsAg濃度。

使用前，使用Amicon離心裝置(Sigma, UFC5050)將捕獲抗體(小鼠產生之單株抗HBV抗原HBsAg抗體，Sigma，SAB4700767)及偵測劑抗體(小鼠產生之抗B型肝炎病毒表面抗原抗體，Abcam，ab8256)緩衝液交換至PBS。

生物素化：將含有生物素化標記試劑(Thermo Fisher，A39259)之一支管在4℃下解凍。將6.7 μl生物素溶液混合到100 μl 1 mg/ml緩衝液交換捕獲抗體中來製備2 nmol/μL捕獲溶液。捕獲溶液在室溫下避光孵育2小時，然後在4℃下保存隔夜。

使用Amicon離心裝置去除殘留生物素。

磺基標籤綴合：在冷dH2O中製備3 nmol/μL磺基標籤(Meso Scale Discovery，R91AO-1)溶液。將13.4 μL磺基標籤溶液添加到100 μL 1 mg/mL緩衝液交換偵測劑抗體中。將偵測劑溶液在室溫下避光孵育2小時，然後在4℃下保存隔夜。使用Amicon離心裝置去除殘留磺基標籤。

封閉劑B緩衝液：在PBST中製備1%及0.5%封閉劑B緩衝液(Sigma，RPN2125V)溶液。在0.5%封閉劑B緩衝液中製備2 μg/mL捕獲抗體溶液。使用25 μL/孔之捕獲溶液包被板(Meso Scale Discovery，L15SA-1)。將密封板在室溫下以700 rpm振盪1小時。

去除捕獲溶液，且每孔添加150 μL之1%封閉劑B緩衝液。將密封板在室溫下以700 rpm振盪30 min。用200 μL/孔PBST將板洗滌3次。

活體外標準品與樣品製備：使用(CellBioLabs-重組HBsAg標準品，50043C)以0.5%封閉劑B緩衝液製備標準曲線。使用5倍連續稀釋方案，標準品範圍為500 ng/mL至0 ng/mL。活體外樣品在0.5%封閉劑B緩衝液中以1:5稀釋。將50 μL/孔之標準品或樣品添加到板中(標準品一式兩份運行)。將密封板在室溫下以700 rpm振盪1小時。用200 μL/孔PBST將板洗滌3次。

活體內標準品及樣品製備：將20 μL小鼠血清(BioIVT，MSE01SRMPNN)添加到980 μL之0.5%封閉劑B緩衝液中。如活體外標準品製備所描述，使用小鼠血清緩衝液製備標準品。活體內樣品在0.5%封閉劑B緩衝液中以1:50稀釋。將50 μL/孔之標準品或樣品添加到板中(標準品一式兩份運行)。將密封板在室溫下以700 rpm振盪1小時。用200 μL/孔PBST將板洗滌3次。

偵測劑：在0.5%封閉劑B緩衝液中製備2 μg/mL之偵測劑抗體溶液。每孔添加25 μL之偵測劑溶液。將密封板在室溫下以700 rpm振盪1小時。用200 μL/孔PBST將板洗滌3次。

讀數：將150 μL/孔之1x MSD讀數緩衝液(Meso Scale Discovery，R92TC-1)添加到板中並在QuickPlex SQ120系統上讀取。實例 1.7. 經由顯微鏡進行細胞內HBsAg偵測之免疫螢光檢定

HepAD38細胞如實例1.4中進行製備，固定且染色以用於轉染後經由顯微鏡之細胞內HBsAg偵測。藉由高內涵顯微鏡(CX7 LZR，ThermoFisher)對用S抗原減弱嚮導處理之細胞中之HBsAg水準進行評估(較未處理之細胞)。

用PBS沖洗細胞，然後使用4%多聚甲醛的PBS溶液固定，並在室溫下孵育十五分鐘。用PBS洗滌細胞兩次。為了透化細胞，製備0.5% TritonX100的PBS溶液並在室溫下在細胞上孵育二十分鐘。用100 uL PBS洗滌細胞兩次。使用DAKO封閉緩衝液(DAKO，X090930-2)在室溫下緩慢搖動三十分鐘進行封閉。一抗為小鼠抗HBsAg抗體(Sigma，SAB4700767)，在DAKO抗體稀釋緩衝液(DAKO，K800621-2)中以1:400稀釋。從板中去除封閉緩衝液，添加50 μL之一抗溶液，並在4℃下搖動孵育隔夜。第二天，用0.05% Tween20的PBS溶液洗滌板兩次，然後用PBS洗滌兩次。在抗體稀釋緩衝液中以1:500稀釋山羊抗小鼠Alexa Fluor™ Plus 488抗體(ThermoFisher Scientific，A32723)且以1:10,000稀釋Hoechst染色劑(ThermoFisher Scientific，33342)來製備二抗溶液。將二抗/Hoechst溶液添加到板中並在室溫下緩慢振盪孵育約兩小時。將板用0.05% Tween20的PBS溶液洗滌兩次，並在室溫下與第二Tween20洗滌液一起孵育十五分鐘。將PBS添加到板中，並使用CX7高內涵顯微鏡與SpotDetector生物檢定進行成像及分析，以偵測細胞內HBsAg。 實例2. 使用Spy及Nme2鹼基編輯器及裂解酶之HepAD38細胞中之HBV S抗原剔除嚮導篩選

為了評估釀膿鏈球菌(SpyCas9) C至T編輯，將Spy-BC22n、編碼Spy Cas9鹼基編輯器之mRNA (開放閱讀框SEQ ID NO: 706)、編碼UGI之mRNA (開放閱讀框SEQ ID NO: 708)以及來自一組靶向整合的HBV基因體之Spy gRNA之各gRNA ( 表17)一起轉染。類似地，為了評估腦膜炎雙球菌(Nme2Cas9) C至T編輯，將Nme2-BC22n、編碼Nme2 Cas9鹼基編輯器之mRNA (開放閱讀框SEQ ID NO: 715)、編碼UGI之mRNA (開放閱讀框SEQ ID NO: 708)以及來自一組靶向整合的HBV基因體之Nme2 gRNA之各gRNA ( 表17)轉染。另外，將以Spy及Nme2進行之C至T編輯與用它們各自的裂解酶(編碼Spy Cas9之mRNA (開放閱讀框SEQ ID NO: 712)或編碼Nme2 Cas9之mRNA (開放閱讀框SEQ ID NO: 710))形成的插入缺失進行比較。Spy sgRNA包括表12所示之化學修飾。Nme sgRNA包括表14所示之化學修飾。 表17：測試之嚮導RNA清單

Cas9 種類	嚮導ID	靶向序列	靶向序列SEQ ID NO:
Spy	G028550	CACCACGAGUCUAGACUCUG	2
Spy	G028551	UACCGCAGAGUCUAGACUCG	3
Spy	G028552	CGCAGAGUCUAGACUCGUGG	4
Spy	G028554	UGUUCUCCAUGUUCAGCGCA	6
Spy	G028555	AUGUUCUCCAUGUUCAGCGC	7
Nme2	G027218	ACCGUGUGUCUUGGCCAAAAUUCG	95
Nme2	G027219	CCGUGUGUCUUGGCCAAAAUUCGC	96
Nme2	G027220	CGUGUGUCUUGGCCAAAAUUCGCA	97
Nme2	G027221	UGUCUUGGCCAAAAUUCGCAGUCC	98
Nme2	G027222	CUUGGCCAAAAUUCGCAGUCCCCA	99
Nme2	G027223	GUUCUUCUGGACUAUCAAGGUAUG	100
Nme2	G027224	GGUUCUUCUGGACUAUCAAGGUAU	101
Nme2	G027225	UCUCCAUGUUCAGCGCAGGGUCCC	102
Nme2	G027226	GAUGUUCUCCAUGUUCAGCGCAGG	103
Nme2	G027227	UGAUGUUCUCCAUGUUCAGCGCAG	104
Nme2	G027228	GUGAUGUUCUCCAUGUUCAGCGCA	105

實例2.1. 細胞製備及轉染

如實例1.4所述，將HepAD38細胞解凍、傳代且用UGI、靶向HepAD38之整合的HBV基因體中之HBV表面抗原的gRNA以及嚮導RNA之適當核酸酶Spy-BC22n或Nme2-BC22n形成的脂質複合物來轉染。裂解酶脂質複合物亦含有相同RNA比率之裂解酶mRNA、UGI mRNA及嚮導。

如實例1.2所述，將脂轉染試劑製備為比率為50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG之脂質混合物。藉由以1:1:1 (效應mRNA (鹼基編輯器或裂解酶):UGI mRNA:gRNA)之重量比混合各脂質調配之RNA種類，將脂轉染試劑與貨物組合。將該等材料以約6之脂質胺與RNA磷酸鹽(N:P)莫耳比組合。在添加到HepAD38細胞之前，將所得大量混合脂質複合物材料(脂質套組)與含10% FBS (Corning，35-101-CV)之完全培養基(加多西環素)在37℃下一起預孵育10分鐘。

對於篩選，每個孔在100 μL之完全培養基中接受100 ng之各個別RNA貨物。 實例2.2. 藉由下一代定序(NGS)對C至T編輯結果之評估

轉染後九十六小時，使細胞經受裂解、整合之HBV基因體中之靶位點的PCR擴增以及隨後的NGS分析，如實例1.1所述。所有實驗均以生物重複份進行。 表18及圖1示出了使用Spy-BC22n或Spy-裂解酶之靶向HBV S抗原之所有嚮導的NGS定序及預測表型結果。 表19及圖2示出了使用Nme2-BC22n及Nme2-裂解酶之靶向HBV S抗原之所有嚮導的NGS定序及預測表型結果。 表18 - 使用Spy-BC22n及Spy-裂解酶之靶向HBV S抗原之嚮導的基因體編輯及預測表型結果

使用Spy-BC22n之基因體編輯
嚮導	C 至T %	C 至A/G %	插入缺失%	STOP 獲得	START 損失
平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD
G028550	72.4	17.5	4.2	0.4	2.6	0.3	71.1	16.1	0	0
G028551	78.5	1	0.9	0.2	7.5	0.6	79.5	0.7	0	0
G028552	70.5	0	5.3	0.1	14.3	0.7	58.8	0.8	0	0
G028554	90.1	0.9	3	0.4	2.4	0.1	2.2	0.8	93.8	1.5
G028555	75.9	7.4	3.5	1.3	4.6	1.2	2.2	0.8	79.3	5.6
使用Spy-裂解酶之基因體編輯
嚮導	C 至T %	C 至A/G %	插入缺失%
平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD
G028550	0.1	0.1	1.1	0.1	62.3	9.6
G028551	0.1	0.1	0.3	0.1	40.2	30.3
G028552	0.1	0	1.4	0.2	45.2	9.5
G028554	0.1	0.1	1	0.3	61.4	15.6
G028555	0	0	1.3	0.6	37.2	14.4

表19 - 使用Nme2-BC22n及Nme2-裂解酶之靶向HBV S抗原之嚮導的基因體編輯及預測表型結果

使用Nme2-BC22n之基因體編輯
嚮導	C 至T %	C 至A/G %	插入缺失%	STOP 獲得	START 損失
平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD
G027218	3.3	0.2	1.8	0	0.2	0	2.1	0.4	0	0
G027219	0.2	0.1	1.9	0	0.2	0	1.2	0.2	0	0
G027220	9.6	0.7	2	0.1	0.3	0	3.7	0.1	0	0
G027221	0.6	0.1	2.5	0.1	0.3	0	1.2	0.1	0	0
G027222	38.9	0.4	3.3	1.1	0.8	0.1	16.1	0.8	0	0
G027223	4.4	1.3	12.6	0.4	0.5	0.1	10.2	1.6	0	0
G027224	65.9	1.4	3.8	0.1	5.3	0.7	67.9	1.4	0	0
G027225	0.3	0.3	1.3	0.2	0.1	0	1.4	0	1.3	0.1
G027226	14	2.4	1.7	0.1	0.6	0.3	1.2	0.1	12.4	1.6
G027227	4.3	0.6	2	0.2	0.1	0	1.6	0.2	4.8	0.6
G027228	57.4	12.3	2	0.3	1.3	0.3	1.3	0.2	55.4	11.4
使用Nme2-裂解酶之基因體編輯
嚮導	C 至T %	C 至A/G %	插入缺失%
平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD
G027218	0.1	0	1.7	0.2	0.3	0.1
G027219	0.2	0.1	1.8	0.5	0.2	0
G027220	0.1	0.1	1.7	0.1	0.8	0.3
G027221	0.1	0.1	3.5	1.2	0.9	0.8
G027222	0.1	0.1	3	0.6	4.3	0.8
G027223	0.3	0.1	8.2	6.6	0.5	0.1
G027224	0.3	0.4	3.8	5	39.6	0.2
G027225	0.2	0.2	2	1.1	0.2	0.1
G027226	0.1	0.1	2.3	0.1	0.4	0.1
G027227	0.1	0.1	1.8	0.1	1.2	1.5
G027228	0.1	0.1	1.5	0.1	13.9	1.8

實例3. 在HepAD38細胞中使用鹼基編輯器HBV嚮導之劑量依賴性編輯

以gRNA劑量反應曲線轉染HepAD38細胞，以確定靶向HepAD38之整合的S抗原基因座之gRNA的相對效力、最大C至T編輯及最大預測剔除水準。 實例3.1：細胞製備及轉染

如實例1.4所述，將HepAD38細胞解凍、傳代且用編碼Spy Cas9鹼基編輯器之mRNA (SEQ ID NO:706)、編碼UGI之mRNA (SEQ ID NO: 708)及靶向HepAD38之整合的S抗原基因座之Spy gRNA的組合，或者編碼Nme2 Cas9鹼基編輯器之mRNA (SEQ ID NO: 715)、編碼UGI之mRNA (SEQ ID NO: 708)及靶向HepAD38之整合的S抗原基因座之gRNA的組合來轉染。

如實例1.2所述，將脂轉染試劑製備為比率為50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG之脂質混合物。藉由單獨混合各RNA種類來組合脂轉染試劑：鹼基編輯器mRNA (Spy-BC22n或Nme2-BC22n)、UGI mRNA或gRNA。將材料以約6之脂質胺與RNA磷酸鹽(N:P)莫耳比組合。將所得大量混合脂質複合物材料與含10% FBS (Corning，35-101-CV)之完全培養基(加多西環素)在37℃下一起預孵育10 min，然後添加到HepAD38細胞中。

對於嚮導滴定，各孔接受Spy-BC22n或Nme2-BC22n及UGI，各自最終濃度為100 ng/孔。使用2倍稀釋方案滴定，以100 nM至0 nM或10 nM至0 nM範圍內之濃度繪製兩條嚮導RNA劑量反應曲線。所遞送之所有三種組分之總體積為100 μL/孔。 實例3.2：藉由下一代定序(NGS)對C至T編輯結果之評 估

轉染後七十二小時，使細胞經受裂解、HBV S抗原基因座之PCR擴增以及隨後的NGS分析，如實例1.1所述。所有實驗均以生物重複份(n=2)進行。示出了兩條劑量反應曲線，嚮導滴定範圍為100 nM至0 nM或10 nM至0 nM。

圖3A及圖3B以及表20A及表20B示出了使用Spy-BC22n或Nme2-BC22n鹼基編輯器以恆定劑量從100 nM嚮導劑量開始之編輯。

圖4A及圖4B以及表21A及表21B示出了對於Spy-BC22n及Nme2-BC22n HBV S抗原嚮導從10 nM劑量開始之編輯。 表20A - Spy-BC22n 100 nM劑量反應曲線之C至T編輯百分比

嚮導劑量(nM)	G028550	G028551	G028554	G028555
平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD
100	92.00	0.00	N/A	N/A	96.00	0.00	96.00	0.00
50	93.00	0.00	N/A	N/A	96.00	0.00	96.50	0.71
25	93.50	0.71	86.00	1.41	96.50	0.71	96.00	0.00
12.5	93.50	0.71	91.00	4.24	97.00	0.00	96.00	1.41
6.25	94.00	0.00	90.00	0.00	96.00	0.00	95.50	0.71
3.13	92.00	1.41	89.00	0.00	95.50	0.71	94.00	0.00
1.56	89.50	0.71	86.00	1.41	93.00	0.00	88.50	0.71
0	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00

表20B - Nme2-BC22n 100 nM劑量反應曲線之C至T編輯百分比

嚮導劑量(nM)	G027224	G027228
平均值	SD	平均值	SD
100	87.00	1.41	94.50	0.71
50	89.00	0.00	95.00	0.00
25	89.50	0.71	94.50	0.71
12.5	89.00	1.41	92.50	0.71
6.25	86.50	0.71	87.00	0.00
3.13	79.00	1.41	75.50	2.12
1.56	64.00	1.41	58.50	2.12
0	0.00	0.00	0.00	0.00

表21A - Spy-BC22n 10 nM劑量反應曲線之C至T編輯百分比

嚮導劑量(nM)	G028550	G028551	G028554	G028555
平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD
0	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00
0.15	28.50	0.71	18.00	0.00	34.00	1.41	28.00	1.41
0.31	43.50	0.71	29.50	2.12	49.50	0.71	40.50	0.71
0.63	61.50	0.71	43.00	1.41	64.50	9.19	58.50	0.71
1.25	77.00	1.41	64.00	8.49	78.00	2.83	77.00	1.41
2.5	83.00	4.24	74.50	4.95	88.00	2.83	88.00	1.41
5	91.50	0.71	86.00	1.41	93.50	2.12	93.50	2.12
10	93.00	1.41	86.50	6.36	93.00	2.83	94.00	1.41

表21B - Nme2-BC22n 10 nM劑量反應曲線之C至T編輯百分比

嚮導劑量	G027224	G027228
平均值	SD	平均值	SD
0	0.00	0.00	0.00	0.00
0.15	8.50	0.71	4.00	0.00
0.31	16.50	0.71	8.00	0.00
0.63	28.50	0.71	15.50	0.71
1.25	46.00	0.00	28.50	0.71
2.5	59.00	1.41	46.00	2.83
5	72.50	3.54	60.00	2.83
10	82.50	3.54	77.50	0.71

實例4 - 使用Nme2及Spy鹼基編輯器篩選以鑑定減少HepAD38中HBsAg及總HBV DNA之gRNA

以下方法適用於兩個嚮導篩選，一個使用Nme2鹼基編輯器(Nme2-BC22n)，而另一個使用Spy鹼基編輯器(Spy-BC22n)。在每次篩選中，評估了靶向HBV基因體之多個區域之gRNA的NGS定序結果以及HBsAg及總HBV DNA減弱。

如實例1.4所述，將HepAD38細胞解凍、傳代、鋪板且轉染。每個板中之一個背景對照孔以與HepAD38細胞相同之密度鋪板HepG2 (親代)細胞。HepG2細胞用作下游檢定之背景扣除對照。製備兩組生物重復份(總共四塊板)。一組在透明膠原蛋白包被之96孔板中製備，用於編輯、qPCR及分泌的HBsAg，而另一組在黑壁膠原蛋白包被之96孔板中製備，用於下游免疫螢光檢定。

24小時後，用編碼Spy Cas9鹼基編輯器之mRNA (開放閱讀框SEQ ID NO:706)或編碼Nme2 Cas9鹼基編輯器之mRNA (開放閱讀框SEQ ID NO: 715)、編碼UGI之mRNA (開放閱讀框SEQ ID NO: 708)及靶向HepAD38中之HBV D基因型序列之gRNA各別形成的單獨脂質複合物同時轉染細胞。如實例1.2所述，將脂轉染試劑製備為比率為50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG之脂質混合物。藉由單獨混合以下各RNA種類來製備單一貨物脂轉染試劑：鹼基編輯器mRNA (Spy-BC22n或Nme2-BC22n)、UGI mRNA或gRNA。各孔接受稀釋於完全培養基中之100 ng鹼基編輯器mRNA、100 ng UGI mRNA及25 nM gRNA。將培養基-脂轉染試劑混合物在37℃下孵育10 min，然後添加到細胞中。所有三種組分之總體積為100 μL/孔。

如實例1.4所述進行培養基更換、培養基收集及細胞裂解。準備一組黑壁板用於細胞固定及染色以用於細胞內HBsAg免疫螢光檢定，如實例1.7所述。如實例1.6所述，對收集之細胞培養基進行評估HBsAg減弱之MSD檢定。使用實例1.5中所述之qPCR檢定，使用細胞裂解物來量化細胞內總HBV DNA。亦製備了細胞裂解物用於NGS分析，如實例1.1所述。

表22A-表22B及表23A-表23B分別示出了使用Spy鹼基編輯器或Nme2鹼基編輯器測試之所有嚮導的NGS結果、細胞內HBsAg減弱百分比、分泌的HBsAg減弱百分比及細胞內總HBV DNA減弱百分比。 圖5A-圖5B及 圖6A-圖6B分別示出了Nme2鹼基編輯器及Spy鹼基編輯器篩選的HBsAg及總細胞內HBV DNA的減弱水準。選擇HBsAg減弱＞90%或總HBV DNA減弱＞90%之嚮導用於後續實驗。 表22A：針對HBV之Spy-Cas9嚮導(G025427、G027938及G028178為人類對照)

嚮導	細胞內HBsAg減弱%	分泌的HBsAg減弱%	總HBV DNA減弱% (引子1)	總HBV DNA減弱% (引子2)
SEQ ID NO	嚮導ID	靶序列	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD
736	G025427	ACACAAAUACCAGUCCAGCG	19.4%	5.8%	-12.6%	2.4%	41.7%	47.2%	41.6%	57.9%
738	G027938	AAUCCUAAUUGCCUCCUGCA	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A
737	G028178	ACAGGCAGAGCUCGCCCUGC	0.0%	0.0%	20.2%	3.0%	-4.2%	5.9%	-0.4%	0.5%
2	G028550	CACCACGAGUCUAGACUCUG	80.3%	1.3%	98.2%	0.6%	93.8%	0.1%	92.7%	3.9%
3	G028551	UACCGCAGAGUCUAGACUCG	98.1%	0.1%	98.5%	0.4%	-124.6%	214.9%	-122.8%	187.2%
4	G028552	CGCAGAGUCUAGACUCGUGG	95.4%	1.0%	96.1%	0.7%	92.9%	1.1%	91.3%	0.6%
5	G028553	CAGCGAUAACCAGGACAAGU	98.8%	0.2%	98.6%	0.0%	95.1%	0.7%	91.9%	0.5%
6	G028554	UGUUCUCCAUGUUCAGCGCA	98.4%	0.1%	98.0%	0.5%	95.0%	1.9%	93.0%	1.1%
7	G028555	AUGUUCUCCAUGUUCAGCGC	95.8%	1.1%	97.7%	0.5%	96.6%	2.1%	95.7%	0.6%
8	G030414	GAGGUGAAGCGAAGUGCACA	66.2%	0.8%	-56.3%	17.8%	60.3%	9.0%	44.5%	6.5%
9	G030415	AGAAGAUGAGGCAUAGCAGC	91.7%	2.0%	71.9%	2.3%	81.0%	3.3%	79.6%	2.3%
10	G030416	GGGGCGCACCUCUCUUUACG	52.8%	10.9%	-38.8%	4.5%	64.1%	1.9%	38.6%	32.7%
11	G030417	GUAAAGAGAGGUGCGCCCCG	53.3%	4.1%	-12.9%	5.5%	61.5%	5.2%	54.1%	17.9%
12	G030418	UACUAGUGCCAUUUGUUCAG	87.2%	7.5%	94.0%	0.1%	82.4%	2.4%	79.4%	0.1%
13	G030419	GCGAGGGAGUUCUUCUUCUA	44.8%	5.3%	-66.0%	3.7%	71.5%	15.9%	62.5%	22.8%
14	G030420	CGAGGGAGUUCUUCUUCUAG	39.6%	0.4%	-62.8%	18.4%	83.3%	0.3%	79.5%	5.1%
15	G030421	GGCGAGGGAGUUCUUCUUCU	44.8%	3.8%	-52.9%	15.7%	85.5%	0.7%	86.6%	0.8%
16	G030422	AGAGAGGUGCGCCCCGUGGU	53.8%	22.8%	-14.7%	6.5%	61.4%	4.1%	58.6%	0.3%
17	G030423	CCUACGAACCACUGAACAAA	83.9%	3.2%	74.7%	4.1%	95.2%	0.2%	95.4%	2.6%
18	G030424	GGACUUCUCUCAAUUUUCUA	97.3%	0.3%	99.0%	0.2%	95.6%	0.5%	94.9%	2.2%
19	G030425	UUUGCUGACGCAACCCCCAC	72.4%	1.6%	14.8%	13.7%	65.2%	11.8%	57.5%	7.7%
20	G030426	CCAUUUGUUCAGUGGUUCGU	99.1%	0.1%	96.6%	0.0%	95.1%	1.5%	94.1%	1.3%
21	G030427	GGGUUGCGUCAGCAAACACU	69.6%	23.6%	34.2%	9.4%	77.1%	14.6%	70.9%	11.9%
22	G030428	CAUUUGUUCAGUGGUUCGUA	98.0%	0.5%	96.8%	0.6%	94.3%	2.0%	94.1%	1.2%
23	G030429	AAGCCACCCAAGGCACAGCU	72.6%	15.7%	55.0%	4.4%	96.7%	1.0%	95.1%	1.2%
24	G030430	CCACCCAAGGCACAGCUUGG	43.7%	44.4%	20.7%	6.3%	92.1%	0.0%	90.8%	1.0%
25	G030431	GCUGUGCCUUGGGUGGCUUU	54.0%	40.2%	-4.9%	10.4%	92.8%	2.1%	91.4%	2.6%
26	G030432	AGCUUGGAGGCUUGAACAGU	23.5%	55.9%	2.2%	2.8%	94.7%	1.5%	93.9%	2.6%
27	G030433	AGGAGGCUGUAGGCAUAAAU	33.8%	16.7%	25.4%	10.1%	48.6%	23.1%	16.5%	3.5%
28	G030434	GGGUGGAGCCCUCAGGCUCA	89.4%	7.3%	9.9%	4.4%	1.8%	62.3%	-5.3%	28.3%
29	G030435	GUGAAAAAGUUGCAUGGUGC	52.0%	28.7%	51.5%	3.9%	94.5%	1.5%	93.4%	1.4%
30	G030436	CUUCACCUCUGCACGUCGCA	54.4%	22.5%	26.6%	6.5%	92.8%	3.0%	92.4%	5.1%
31	G030437	GCUAUGCCUCAUCUUCUUGU	53.7%	23.9%	44.5%	6.5%	95.3%	1.7%	94.5%	1.0%
32	G030438	CCUGAACUGGAGCCACCAGC	56.9%	19.1%	21.6%	3.0%	24.8%	54.3%	-2.9%	6.9%
33	G030439	AGACACAUCCAGCGAUAACC	98.8%	0.1%	96.6%	1.3%	95.5%	1.6%	95.1%	2.0%
34	G030440	UUUGAAGUAUGCCUCAAGGU	60.6%	20.7%	16.7%	3.0%	-19.7%	24.7%	-29.4%	4.9%
35	G030441	AGUCUUUGAAGUAUGCCUCA	58.2%	7.1%	3.5%	12.2%	-32.9%	14.6%	-71.7%	4.3%
36	G030442	GCUGCCAACUGGAUCCUGCG	42.5%	12.8%	2.7%	4.7%	-28.1%	8.8%	-27.0%	10.1%
37	G030443	CUGCCAACUGGAUCCUGCGC	-3.4%	67.0%	-5.8%	1.4%	-12.1%	27.5%	-30.5%	0.9%
38	G030444	AGGUUGGGGACUGCGAAUUU	53.1%	15.0%	1.5%	2.9%	-37.5%	6.2%	-64.9%	11.0%
39	G030445	GAAGCGAAGUGCACACGGUC	43.9%	21.6%	41.5%	4.5%	80.5%	0.1%	66.9%	12.8%
40	G030446	UAGGGCUUUCCCCCACUGUU	98.8%	0.3%	97.8%	1.1%	74.0%	7.4%	48.8%	36.5%
41	G030447	CGCCGACGGGACGUAAACAA	73.7%	13.6%	58.2%	0.8%	55.7%	8.6%	53.4%	1.3%
42	G030448	GUCCUUUGUUUACGUCCCGU	71.0%	1.9%	47.7%	0.5%	89.4%	10.2%	83.7%	17.6%
43	G030449	GCAAACACUUGGCACAGACC	88.8%	4.5%	60.4%	12.1%	47.6%	53.6%	31.7%	72.5%
44	G030450	ACACGGUCCGGCAGAUGAGA	35.3%	1.0%	12.1%	16.2%	-211.6%	304.9%	-99.3%	107.8%
45	G030451	GGUCUCCAUGCGACGUGCAG	63.8%	14.9%	28.0%	16.9%	-46.5%	156.3%	-54.4%	152.7%
46	G030452	GCAGCACAGCCUAGCAGCCA	52.0%	4.5%	30.4%	16.3%	86.1%	6.6%	85.3%	9.1%
47	G030453	UGCUAGGCUGUGCUGCCAAC	58.1%	11.6%	26.5%	22.9%	-126.5%	194.3%	-397.8%	507.1%
48	G030454	GACGCAACCCCCACUGGCUG	89.8%	0.3%	83.9%	6.3%	88.7%	3.3%	91.1%	5.3%
49	G030455	CGGGGAGUCCGCGUAAAGAG	-8.3%	5.3%	-10.6%	27.6%	-433.1%	470.5%	-444.8%	432.0%
50	G030456	AACUGAAAGCCAAACAGUGG	98.3%	0.3%	97.6%	0.2%	62.9%	34.9%	68.6%	16.9%
51	G030457	CUAGACUCUGCGGUAUUGUG	90.4%	1.6%	95.3%	1.2%	94.7%	0.9%	93.9%	2.5%
52	G030458	AACAUGGAGAACAUCACAUC	50.0%	15.1%	13.0%	24.1%	-83.4%	105.7%	-81.7%	102.7%
53	G030459	CUGUUGUUAGACGACGAGGC	28.3%	23.4%	-41.5%	18.1%	92.8%	1.8%	89.8%	2.4%
54	G030460	GACAUGAACAAGAGAUGAUU	16.8%	41.6%	-21.2%	0.8%	95.7%	0.5%	94.6%	2.1%
55	G030461	AUUGGUAACAGCGGUAAAAA	26.3%	18.2%	-23.2%	4.6%	18.3%	20.7%	-37.6%	15.6%
56	G030462	AAUUGGUAACAGCGGUAAAA	22.2%	0.1%	-23.5%	14.8%	-17.8%	27.7%	-108.1%	37.9%
57	G030463	UUGGGAUUGAAGUCCCAAUC	73.3%	10.6%	-41.9%	19.2%	-22.5%	47.8%	-44.4%	18.0%
58	G030464	GGGCUUUCGGAAAAUUCCUA	98.0%	0.6%	96.1%	0.1%	95.5%	1.2%	94.7%	0.3%
59	G030465	GGCUUUCGGAAAAUUCCUAU	88.3%	6.9%	84.8%	0.1%	95.7%	0.3%	93.8%	2.2%
60	G030466	GAAUCCCAGAGGAUUGCUGG	19.6%	5.9%	-50.7%	10.5%	-99.9%	215.9%	13.0%	1.8%
61	G030467	UUGGGACUUCAAUCCCAACA	27.2%	13.9%	42.9%	11.5%	89.5%	1.7%	88.5%	5.5%
62	G030468	CUGAACUGGAGCCACCAGCA	67.5%	10.1%	50.8%	6.1%	90.6%	2.7%	87.6%	2.2%
63	G030469	CGAUAACCAGGACAAGUUGG	99.0%	0.1%	99.2%	1.1%	94.0%	0.3%	89.3%	0.5%
64	G030470	UCGGAAAAUUCCUAUGGGAG	64.8%	5.9%	-5.0%	13.1%	93.5%	1.6%	92.2%	0.2%
65	G030471	CGGAAAAUUCCUAUGGGAGU	60.8%	20.4%	37.0%	4.9%	95.9%	0.3%	95.0%	1.0%
66	G030472	GCUGGAUCCAACUGGUGGUC	40.1%	6.5%	-52.7%	12.9%	-9.8%	32.3%	-64.9%	57.6%
67	G030473	UGGUCGGGAAAGAAUCCCAG	69.7%	10.0%	-89.3%	42.3%	56.4%	3.9%	49.0%	5.2%
68	G030474	GUCAAUCUUCUCGAGGAUUG	90.4%	2.2%	-43.8%	18.9%	83.2%	3.0%	85.0%	0.5%
69	G030475	UGGCCAGACGCCAACAAGGU	41.6%	2.2%	2.2%	11.5%	26.6%	8.4%	-9.1%	45.2%
70	G030476	UGAAGGCUGGAUCCAACUGG	37.5%	14.8%	-69.2%	26.8%	-28.4%	8.0%	-58.0%	2.7%
71	G030477	AUUCUUUCCCGACCACCAGU	54.5%	5.1%	-43.6%	6.7%	91.3%	0.6%	90.7%	3.4%
72	G030478	CUUUCCACCAGCAAUCCUCU	75.5%	1.0%	-53.2%	13.5%	94.5%	1.3%	90.4%	2.5%
73	G030479	AAGGUAGGAGCUGGAGCAUU	72.9%	14.2%	25.2%	3.5%	85.9%	2.0%	84.0%	1.6%
74	G030480	CUCUGAAGGCUGGAUCCAAC	57.7%	9.6%	-17.6%	9.5%	-32.0%	72.0%	-33.7%	26.9%
75	G030481	UCUUUCCACCAGCAAUCCUC	51.6%	2.6%	-54.4%	15.3%	92.9%	3.0%	92.0%	1.2%
76	G030482	GGCUGGAUCCAACUGGUGGU	41.6%	25.1%	-70.5%	11.7%	24.6%	72.5%	18.2%	62.4%
77	G030483	AGGUAGGAGCUGGAGCAUUC	80.3%	3.8%	-7.2%	3.0%	88.0%	4.3%	79.3%	4.2%
78	G030484	GACGCCAACAAGGUAGGAGC	50.6%	8.5%	27.6%	5.1%	95.8%	1.9%	93.4%	0.1%
79	G030485	AGCCACCAGCAGGGAAAUAC	88.8%	3.9%	73.7%	0.8%	97.0%	0.2%	94.3%	0.7%
80	G030486	GCUCCUACCUUGUUGGCGUC	66.7%	4.3%	-35.0%	0.3%	18.1%	27.9%	30.0%	12.9%
81	G030487	UCAAUCCCAACAAGGACACC	49.6%	22.5%	46.0%	2.0%	96.0%	0.2%	93.5%	2.4%
82	G030488	GGAUGAUGGGAUGGGAAUAC	98.0%	0.9%	97.3%	0.0%	94.4%	1.9%	92.3%	0.5%
83	G030489	UGCUGUACCAAACCUUCGGA	24.0%	1.4%	43.8%	2.2%	94.1%	1.3%	92.2%	0.0%
84	G030490	ACCAGGACAAGUUGGAGGAC	99.3%	0.1%	98.3%	0.4%	95.4%	0.6%	93.6%	2.4%
85	G030491	UAGGAAUUUUCCGAAAGCCC	98.2%	0.1%	94.4%	1.2%	43.1%	5.2%	41.5%	2.2%
86	G030492	UUCCGAAAGCCCAGGAUGAU	98.3%	0.2%	99.3%	0.2%	95.1%	0.5%	95.5%	1.0%
87	G030493	UUUCCGAAAGCCCAGGAUGA	97.1%	0.0%	97.3%	0.0%	98.3%	0.0%	97.1%	0.6%
88	G030494	GCAUUUGGUGGUCUAUAAGC	12.2%	21.2%	-25.9%	15.6%	95.4%	0.7%	94.9%	2.9%
89	G030495	UUUGGUGGUCUAUAAGCUGG	-6.7%	13.8%	-53.2%	9.9%	86.1%	2.9%	85.4%	5.4%
90	G030496	UCAGGCAAGCAAUUCUUUGC	40.1%	22.1%	18.4%	3.6%	95.9%	0.6%	94.6%	1.3%
91	G030497	CAGGCAAGCAAUUCUUUGCU	14.1%	10.6%	17.3%	6.7%	96.8%	0.1%	60.6%	44.7%
92	G030498	UGCAAUUGAUUAUGCCUGCU	23.9%	10.2%	-2.5%	9.0%	96.7%	0.5%	95.4%	1.9%
93	G030499	GCAAGCAAUUCUUUGCUGGG	38.9%	13.1%	15.2%	2.6%	73.1%	0.6%	70.8%	0.2%
94	G030500	GGCAAGCAAUUCUUUGCUGG	35.2%	1.1%	27.4%	0.9%	94.2%	1.2%	89.1%	2.1%

表22B：針對HBV之Spy-Cas9嚮導(G025427、G027938及G028178為人類對照)

嚮導	C＞T %	C＞A/G %	插入缺失%	純度%	STOP 獲得%	START 損失%
SEQ ID NO	嚮導ID	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD
736	G025427	81.4%	0.3%	3.7%	0.0%	14.8%	0.4%	81.6%	0.3%	0.2%	0.2%	0.0%	0.0%
738	G027938	15.4%	21.7%	1.8%	0.1%	0.0%	0.0%	47.4%	67.0%	0.5%	0.1%	0.0%	0.0%
737	G028178	86.1%	1.7%	2.1%	0.5%	11.2%	0.9%	86.6%	1.5%	79.4%	2.7%	0.0%	0.0%
2	G028550	95.1%	0.8%	1.3%	0.2%	3.3%	0.5%	95.4%	0.7%	93.8%	1.7%	0.0%	0.0%
3	G028551	95.3%	0.2%	1.9%	0.0%	1.8%	0.4%	96.2%	0.4%	98.4%	0.4%	0.0%	0.0%
4	G028552	75.8%	6.9%	2.9%	0.4%	19.3%	5.7%	77.3%	6.4%	72.2%	6.0%	0.0%	0.0%
5	G028553	95.7%	1.1%	1.5%	0.2%	2.5%	1.3%	96.0%	1.0%	96.8%	0.5%	0.0%	0.0%
6	G028554	53.0%	23.0%	3.4%	0.6%	0.7%	0.5%	92.6%	1.2%	2.7%	1.2%	55.2%	24.0%
7	G028555	77.8%	25.7%	3.0%	0.6%	0.5%	0.3%	95.3%	1.8%	1.8%	0.1%	78.3%	24.3%
8	G030414	95.9%	0.5%	1.0%	0.4%	2.1%	0.2%	96.9%	0.2%	5.5%	0.0%	0.0%	0.0%
9	G030415	87.9%	0.9%	1.3%	0.0%	2.1%	0.7%	96.2%	0.7%	0.5%	0.3%	0.0%	0.0%
10	G030416	96.1%	0.3%	1.8%	0.1%	1.0%	0.4%	97.1%	0.5%	2.5%	0.2%	0.0%	0.0%
11	G030417	90.8%	0.4%	1.6%	0.5%	5.4%	0.4%	92.8%	0.2%	0.5%	0.1%	0.0%	0.0%
12	G030418	89.3%	1.6%	2.2%	0.2%	6.6%	1.1%	91.1%	1.4%	10.2%	5.2%	0.0%	0.0%
13	G030419	85.7%	0.7%	1.0%	0.0%	12.4%	0.1%	86.5%	0.2%	1.4%	0.0%	0.0%	0.0%
14	G030420	88.5%	1.4%	1.1%	0.1%	9.8%	0.8%	89.1%	1.0%	1.0%	0.5%	0.0%	0.0%
15	G030421	68.5%	2.3%	1.1%	0.1%	30.0%	2.0%	68.8%	2.0%	2.1%	1.3%	0.0%	0.0%
16	G030422	90.3%	1.4%	1.6%	0.0%	6.7%	1.1%	91.5%	1.1%	0.3%	0.1%	0.0%	0.0%
17	G030423	94.7%	1.6%	2.8%	0.5%	2.0%	0.9%	95.1%	1.5%	81.9%	3.8%	0.0%	0.0%
18	G030424	86.8%	0.8%	2.6%	0.2%	8.8%	2.0%	88.4%	1.7%	62.1%	0.3%	0.0%	0.0%
19	G030425	90.9%	0.8%	7.7%	0.1%	0.8%	0.3%	91.4%	0.4%	0.6%	0.1%	0.0%	0.0%
20	G030426	87.9%	2.7%	2.2%	0.1%	1.9%	0.9%	95.5%	1.0%	90.5%	2.3%	0.0%	0.0%
21	G030427	94.1%	0.5%	3.2%	0.0%	2.1%	0.7%	94.7%	0.7%	0.2%	0.3%	0.0%	0.0%
22	G030428	94.4%	0.1%	2.0%	0.1%	1.8%	0.9%	96.1%	0.8%	96.8%	0.1%	0.0%	0.0%
23	G030429	93.0%	2.2%	3.2%	0.1%	1.1%	1.3%	95.6%	1.5%	96.0%	0.1%	0.0%	0.0%
24	G030430	96.5%	0.0%	2.3%	0.3%	0.6%	0.9%	97.1%	0.6%	10.1%	1.7%	0.0%	0.0%
25	G030431	94.6%	0.6%	0.6%	0.1%	3.3%	2.9%	96.1%	2.7%	13.1%	6.9%	0.0%	0.0%
26	G030432	NA	NA	1.7%	2.4%	0.0%	0.0%	NA	NA	NA	NA	NA	NA
27	G030433	74.7%	1.1%	3.2%	0.8%	22.0%	0.3%	74.8%	1.1%	0.4%	0.1%	0.0%	0.0%
28	G030434	90.1%	1.4%	0.6%	0.2%	1.4%	0.0%	97.8%	0.2%	0.3%	0.0%	0.0%	0.0%
29	G030435	74.3%	4.9%	0.2%	0.0%	2.5%	0.5%	96.3%	0.9%	0.1%	0.1%	61.9%	9.8%
30	G030436	91.3%	2.1%	1.9%	1.0%	6.2%	1.1%	91.9%	2.0%	0.2%	0.0%	0.0%	0.0%
31	G030437	74.1%	12.6%	2.8%	0.1%	8.4%	3.3%	87.0%	1.6%	0.4%	0.0%	0.0%	0.0%
32	G030438	NA	NA	NA	NA	NA	NA	NA	NA	NA	NA	NA	NA
33	G030439	96.8%	0.9%	1.8%	1.4%	0.8%	0.3%	97.3%	1.1%	98.9%	0.6%	0.0%	0.0%
34	G030440	95.3%	0.0%	2.3%	0.1%	1.7%	0.3%	96.0%	0.2%	1.1%	0.1%	0.0%	0.0%
35	G030441	89.9%	1.1%	1.3%	0.1%	7.7%	2.3%	90.9%	2.4%	0.9%	0.1%	0.0%	0.0%
36	G030442	94.4%	0.4%	4.3%	0.0%	0.4%	0.2%	95.3%	0.1%	98.0%	0.2%	0.3%	0.1%
37	G030443	94.5%	0.7%	4.4%	0.3%	0.4%	0.3%	95.1%	0.6%	97.4%	0.5%	0.4%	0.1%
38	G030444	51.2%	6.2%	0.9%	0.1%	0.2%	0.1%	97.9%	0.2%	1.2%	0.1%	0.0%	0.0%
39	G030445	87.4%	0.6%	1.7%	0.4%	10.1%	0.1%	88.1%	0.5%	0.5%	0.1%	0.0%	0.0%
40	G030446	93.1%	0.5%	1.6%	0.1%	3.6%	1.0%	94.7%	0.8%	23.0%	0.7%	0.0%	0.0%
41	G030447	97.2%	0.1%	1.2%	0.1%	0.6%	0.3%	98.2%	0.4%	0.6%	0.1%	0.0%	0.0%
42	G030448	92.5%	2.8%	2.5%	0.8%	2.5%	0.5%	94.8%	1.4%	3.1%	0.0%	0.0%	0.0%
43	G030449	94.0%	0.6%	4.7%	0.4%	0.7%	0.4%	94.5%	0.1%	0.1%	0.0%	0.0%	0.0%
44	G030450	99.0%	0.1%	0.7%	0.2%	0.2%	0.0%	99.1%	0.2%	0.4%	0.0%	0.0%	0.0%
45	G030451	93.3%	1.2%	2.8%	0.0%	3.7%	0.9%	93.5%	1.0%	96.6%	0.8%	0.0%	0.0%
46	G030452	83.1%	12.9%	0.8%	0.1%	2.1%	0.2%	96.6%	0.4%	9.7%	1.1%	0.2%	0.0%
47	G030453	72.7%	5.7%	2.2%	0.2%	1.0%	1.0%	95.7%	1.1%	3.5%	0.8%	0.8%	0.6%
48	G030454	84.5%	3.0%	9.3%	0.3%	3.6%	0.6%	86.7%	0.7%	0.5%	0.0%	0.0%	0.0%
49	G030455	96.6%	2.6%	1.0%	0.1%	0.3%	0.1%	98.7%	0.0%	0.8%	0.0%	0.0%	0.0%
50	G030456	82.9%	9.3%	1.8%	0.1%	14.1%	8.8%	83.9%	9.1%	87.5%	6.3%	0.0%	0.0%
51	G030457	94.5%	0.0%	2.9%	0.4%	1.6%	0.3%	95.4%	0.7%	7.7%	1.0%	0.0%	0.0%
52	G030458	93.6%	1.4%	3.1%	0.1%	1.3%	0.4%	95.5%	0.5%	1.8%	0.4%	1.2%	0.1%
53	G030459	76.4%	8.3%	1.6%	0.1%	7.7%	1.4%	89.0%	2.5%	52.8%	9.9%	0.0%	0.0%
54	G030460	88.7%	0.1%	1.8%	0.3%	9.3%	0.2%	88.8%	0.2%	34.6%	0.5%	0.0%	0.0%
55	G030461	96.2%	2.1%	0.6%	0.0%	0.6%	0.3%	98.8%	0.3%	1.2%	0.6%	0.0%	0.0%
56	G030462	71.6%	15.1%	0.9%	0.1%	0.5%	0.2%	98.1%	0.0%	1.1%	0.6%	0.0%	0.0%
57	G030463	83.2%	4.5%	2.9%	0.1%	4.0%	1.8%	92.4%	1.6%	0.8%	0.4%	0.0%	0.0%
58	G030464	72.0%	4.0%	7.8%	0.0%	17.8%	3.0%	73.8%	3.4%	1.3%	0.2%	0.0%	0.0%
59	G030465	70.7%	1.2%	7.6%	0.5%	17.5%	0.8%	73.8%	0.6%	3.6%	0.1%	0.0%	0.0%
60	G030466	96.8%	0.1%	1.0%	0.1%	2.1%	0.2%	96.9%	0.1%	1.5%	1.3%	0.0%	0.0%
61	G030467	50.6%	42.8%	2.9%	0.8%	11.4%	7.2%	74.3%	9.5%	49.4%	41.7%	0.0%	0.0%
62	G030468	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A
63	G030469	77.5%	2.7%	20.7%	2.3%	1.4%	0.1%	77.8%	2.5%	40.5%	0.7%	0.0%	0.0%
64	G030470	70.0%	7.1%	2.7%	0.2%	4.9%	0.1%	90.0%	1.2%	2.6%	0.8%	0.0%	0.0%
65	G030471	91.4%	0.2%	1.8%	0.6%	5.7%	0.4%	92.4%	0.2%	8.0%	1.5%	0.0%	0.0%
66	G030472	94.1%	1.5%	4.0%	0.0%	1.7%	1.1%	94.3%	1.2%	4.8%	0.8%	0.0%	0.0%
67	G030473	72.3%	0.3%	0.9%	0.3%	26.4%	0.8%	72.6%	0.5%	0.6%	0.0%	0.0%	0.0%
68	G030474	78.0%	8.1%	2.6%	0.8%	13.4%	2.0%	82.8%	3.9%	0.4%	0.1%	0.0%	0.0%
69	G030475	86.6%	1.5%	10.4%	1.6%	2.3%	0.7%	87.3%	1.0%	10.7%	0.4%	0.0%	0.0%
70	G030476	89.1%	2.3%	7.9%	2.1%	2.7%	0.4%	89.4%	2.5%	0.6%	0.1%	0.0%	0.0%
71	G030477	57.7%	1.2%	1.9%	0.9%	39.3%	0.6%	58.3%	0.7%	53.1%	2.1%	0.0%	0.0%
72	G030478	95.0%	2.1%	1.9%	0.4%	2.5%	1.3%	95.6%	1.7%	94.7%	2.3%	0.0%	0.0%
73	G030479	NA	NA	3.5%	0.4%	19.0%	5.1%	NA	NA	NA	NA	NA	NA
74	G030480	88.8%	0.4%	6.5%	0.0%	4.4%	0.6%	89.1%	0.6%	0.7%	0.0%	0.0%	0.0%
75	G030481	90.6%	3.0%	2.1%	0.2%	6.3%	2.7%	91.5%	2.6%	79.5%	0.4%	0.0%	0.0%
76	G030482	93.4%	0.5%	4.3%	1.1%	2.2%	0.4%	93.6%	0.7%	2.0%	0.3%	0.0%	0.0%
77	G030483	77.1%	9.8%	7.0%	0.2%	9.1%	1.7%	82.6%	3.4%	20.0%	5.7%	0.0%	0.0%
78	G030484	83.3%	0.0%	10.8%	0.4%	5.1%	0.4%	83.9%	0.0%	95.1%	1.1%	0.0%	0.0%
79	G030485	NA	NA	NA	NA	NA	NA	NA	NA	NA	NA	NA	NA
80	G030486	90.3%	0.3%	7.2%	0.3%	1.8%	0.1%	90.9%	0.2%	9.7%	3.2%	0.0%	0.0%
81	G030487	91.6%	5.8%	2.1%	0.6%	5.2%	4.4%	92.6%	5.1%	94.2%	5.2%	0.0%	0.0%
82	G030488	60.5%	1.1%	2.9%	0.4%	19.6%	0.9%	72.9%	0.1%	60.5%	0.6%	0.0%	0.0%
83	G030489	55.0%	12.1%	3.4%	1.2%	4.5%	0.9%	87.2%	2.8%	48.7%	13.2%	0.0%	0.0%
84	G030490	91.2%	0.9%	4.7%	2.0%	3.6%	0.9%	91.6%	1.1%	96.5%	2.5%	0.0%	0.0%
85	G030491	94.6%	1.0%	1.7%	0.2%	0.4%	0.1%	97.8%	0.1%	2.7%	0.2%	0.0%	0.0%
86	G030492	81.6%	0.8%	11.9%	0.8%	5.9%	1.5%	82.1%	0.8%	90.6%	0.3%	0.0%	0.0%
87	G030493	90.8%	2.8%	3.6%	0.5%	4.9%	2.3%	91.5%	2.8%	50.2%	1.6%	0.0%	0.0%
88	G030494	96.2%	0.6%	0.6%	0.0%	1.7%	0.4%	97.7%	0.3%	3.3%	0.1%	89.7%	1.0%
89	G030495	95.4%	1.8%	1.9%	0.5%	2.3%	1.1%	95.8%	1.6%	4.8%	0.5%	8.7%	3.7%
90	G030496	89.3%	1.4%	2.4%	0.7%	6.6%	1.1%	90.8%	1.9%	82.0%	5.9%	0.0%	0.0%
91	G030497	89.1%	2.2%	5.8%	0.4%	4.8%	1.8%	89.3%	2.2%	90.2%	2.4%	0.0%	0.0%
92	G030498	92.5%	1.8%	1.8%	0.3%	4.9%	1.4%	93.2%	1.7%	96.4%	1.3%	0.0%	0.0%
93	G030499	82.0%	2.5%	1.5%	0.4%	15.5%	2.8%	82.8%	3.1%	20.4%	0.1%	0.0%	0.0%
94	G030500	82.9%	0.9%	2.2%	1.6%	5.8%	0.1%	91.2%	1.6%	63.4%	1.1%	0.0%	0.0%

表23A：針對HBV之Nme2-Cas9嚮導

嚮導	細胞內HBsAg減弱%	分泌的HBsAg減弱%	總HBV DNA減弱% (引子1)	總HBV DNA減弱% (引子2)
SEQ ID NO	嚮導ID	靶序列	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD
739	G021514	GUCUGUAACAGGUCCCCGUAGUUU	4.9%	1.1%	1.3%	1.4%	11.2%	4.1%	10.2%	5.6%
740	G021516	GUGCUGGCCAGUGGAGGACAAGAU	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A
741	G026004	UGCCUUUGCUCAGUAUCUUCAGCA	-4.9%	1.1%	-1.3%	1.4%	-11.2%	4.1%	-10.2%	5.6%
98	G027221	UGUCUUGGCCAAAAUUCGCAGUCC	21.9%	16.3%	10.1%	2.2%	-17.5%	8.1%	-11.1%	15.8%
101	G027224	GGUUCUUCUGGACUAUCAAGGUAU	90.0%	0.7%	93.1%	1.3%	87.4%	8.0%	82.9%	3.6%
102	G027225	UCUCCAUGUUCAGCGCAGGGUCCC	93.3%	0.2%	97.3%	0.5%	93.3%	1.0%	95.2%	0.3%
103	G027226	GAUGUUCUCCAUGUUCAGCGCAGG	34.4%	2.4%	16.2%	2.7%	77.2%	2.3%	78.3%	1.1%
104	G027227	UGAUGUUCUCCAUGUUCAGCGCAG	26.2%	10.1%	26.8%	3.5%	-18.6%	30.5%	5.7%	4.8%
105	G027228	GUGAUGUUCUCCAUGUUCAGCGCA	90.5%	1.6%	93.8%	4.0%	89.2%	3.9%	66.5%	38.4%
106	G030095	ACUGAACAAAUGGCACUAGUAAAC	35.5%	3.4%	-75.3%	9.7%	73.8%	1.7%	76.9%	2.3%
107	G030096	GAGGCGAGGGAGUUCUUCUUCUAG	22.6%	12.3%	-37.8%	8.0%	60.6%	16.8%	53.2%	21.1%
108	G030097	GGAUGUGUCUGCGGCGUUUUAUCA	30.1%	18.0%	-18.2%	12.8%	18.6%	33.4%	22.3%	25.6%
109	G030098	UUUGUUCAGUGGUUCGUAGGGCUU	52.2%	0.2%	25.7%	19.3%	52.6%	21.1%	57.6%	6.6%
110	G030099	GGUUGCGUCAGCAAACACUUGGCA	54.3%	14.9%	2.9%	17.0%	71.4%	5.6%	63.6%	5.5%
111	G030100	CCAUUUGUUCAGUGGUUCGUAGGG	82.6%	5.8%	67.9%	18.8%	89.5%	4.6%	82.4%	3.5%
112	G030101	CAUUUGUUCAGUGGUUCGUAGGGC	34.5%	9.9%	-1.2%	12.6%	11.6%	15.2%	7.5%	14.2%
113	G030102	AAAACGCCGCAGACACAUCCAGCG	82.5%	0.0%	78.2%	4.6%	76.2%	10.4%	61.9%	6.2%
114	G030103	CCAGCACCAUGCAACUUUUUCACC	14.5%	1.8%	-46.6%	40.3%	14.5%	5.2%	8.6%	10.8%
115	G030104	CUGAGCCUGAGGGCUCCACCCCAA	74.7%	7.0%	55.9%	8.6%	-29.1%	8.2%	-60.1%	23.5%
116	G030105	AGGCUGUAGGCAUAAAUUGGUCUG	11.6%	19.1%	-20.2%	7.5%	-31.7%	2.3%	-5.1%	22.4%
117	G030106	CAGUCCCCAACCUCCAAUCACUCA	11.3%	11.1%	-64.3%	23.5%	20.2%	5.5%	-14.7%	10.3%
118	G030107	AACCUCCAAUCACUCACCAACCUC	92.3%	2.0%	90.5%	7.6%	92.6%	3.3%	97.9%	0.8%
119	G030108	AGGAUUCUUGUCAACAAGAAAAAC	78.1%	8.0%	78.5%	3.1%	87.8%	2.5%	92.0%	0.1%
120	G030109	CUGUGCCAAGUGUUUGCUGACGCA	26.5%	32.3%	14.3%	12.9%	49.2%	5.9%	51.8%	5.6%
121	G030110	UGUGAGGAUUCUUGUCAACAAGAA	32.1%	21.9%	16.8%	33.7%	17.4%	40.9%	32.7%	22.3%
122	G030111	UUGUGAGGAUUCUUGUCAACAAGA	11.8%	32.7%	7.7%	11.2%	44.6%	18.9%	36.3%	3.7%
123	G030112	UCUGUGCCAAGUGUUUGCUGACGC	16.5%	17.3%	-2.5%	15.3%	51.4%	18.0%	41.5%	2.3%
124	G030113	GUCCUACUGUUCAAGCCUCCAAGC	14.3%	13.1%	13.4%	6.9%	47.2%	1.1%	49.2%	5.7%
125	G030114	CGAGGCAGGUCCCCUAGAAGAAGA	10.3%	11.0%	-9.3%	13.2%	23.9%	25.5%	3.4%	5.8%
126	G030115	ACAGACUUGGCCCCCAAUACCACA	89.5%	0.7%	94.9%	0.2%	82.6%	4.6%	81.5%	4.4%
127	G030116	GGUCUGUGCCAAGUGUUUGCUGAC	14.7%	2.6%	-6.7%	36.4%	6.9%	18.3%	10.6%	16.8%
128	G030117	AUUGGAGGUUGGGGACUGCGAAUU	23.7%	13.9%	6.2%	14.0%	-51.8%	11.2%	-36.2%	23.7%
129	G030118	UUCGCAGUCCCCAACCUCCAAUCA	5.0%	3.6%	-27.1%	26.2%	7.1%	3.7%	4.9%	9.3%
130	G030119	GCUGCCAACUGGAUCCUGCGCGGG	47.2%	9.4%	27.1%	15.6%	64.3%	26.6%	71.5%	19.6%
131	G030120	GCCAAACAGUGGGGGAAAGCCCUA	90.8%	2.9%	93.7%	5.1%	93.9%	2.2%	95.5%	2.4%
132	G030121	UGGGUGGCUUUGGGGCAUGGACAU	-4.3%	25.8%	-3.6%	36.4%	52.2%	29.9%	52.7%	39.1%
133	G030122	UUGGGUGGCUUUGGGGCAUGGACA	-8.6%	30.4%	4.5%	35.0%	13.7%	46.4%	67.8%	27.2%
134	G030123	GGAUCCAGUUGGCAGCACAGCCUA	34.1%	0.1%	31.9%	25.3%	92.3%	1.9%	89.7%	1.6%
135	G030124	GGCUGCUAGGCUGUGCUGCCAACU	1.8%	25.3%	-0.8%	31.5%	53.0%	5.5%	39.0%	27.3%
136	G030125	AAUACCACAUCAUCCAUAUAACUG	80.1%	6.2%	88.6%	2.8%	90.6%	2.9%	89.0%	4.2%
137	G030126	UGCGGCGUUUUAUCAUCUUCCUCU	-27.9%	15.0%	4.2%	8.3%	-2.4%	6.1%	-3.5%	7.7%
138	G030127	GAGUCCAAGGAAUACUAACAUUGA	-1.5%	19.8%	-0.8%	2.2%	10.0%	10.4%	15.9%	7.2%
139	G030128	AACUGAAAGCCAAACAGUGGGGGA	64.6%	4.9%	61.1%	2.5%	58.4%	3.3%	58.5%	7.8%
140	G030129	UAACUGAAAGCCAAACAGUGGGGG	76.8%	4.0%	69.9%	5.8%	80.1%	6.7%	83.0%	5.0%
141	G030130	CUCCAAUCACUCACCAACCUCCUG	86.7%	2.1%	88.5%	5.3%	74.8%	5.5%	94.5%	1.0%
142	G030131	UCCCCAACCUCCAAUCACUCACCA	16.4%	19.9%	35.6%	19.2%	55.0%	9.5%	59.7%	6.2%
143	G030132	ACGAGGCAGGUCCCCUAGAAGAAG	-19.7%	39.4%	7.1%	35.8%	54.6%	11.1%	53.3%	15.5%
144	G030133	GGUCCUAGGAAUCCUGAUGUGAUG	76.0%	7.9%	74.7%	16.7%	42.4%	40.5%	33.9%	22.8%
145	G030134	CCGUUUCUCCUGGCUCAGUUUACU	75.4%	4.8%	76.7%	13.8%	94.2%	2.0%	92.9%	1.0%
146	G030135	AAAAAGUUGCAUGGUGCUGGUGCG	-31.7%	54.5%	-15.5%	26.2%	13.7%	44.0%	17.5%	41.0%
147	G030136	UGCGCACCAGCACCAUGCAACUUU	-33.2%	14.6%	-26.3%	9.9%	32.2%	4.6%	-0.5%	28.1%
148	G030137	UAGGCAUAAAUUGGUCUGCGCACC	-38.3%	47.9%	-24.5%	28.5%	18.0%	36.7%	19.5%	34.1%
149	G030138	CCUCUGCCUAAUCAUCUCUUGUUC	-45.5%	15.0%	-9.9%	28.6%	59.8%	16.7%	61.8%	11.3%
150	G030139	UCUUGUUCAUGUCCUACUGUUCAA	-13.7%	11.7%	6.2%	19.8%	83.4%	4.6%	83.9%	5.3%
151	G030140	AUCUCUUGUUCAUGUCCUACUGUU	-27.5%	0.7%	-32.5%	20.6%	83.0%	0.5%	85.0%	0.3%
152	G030141	GGACGGAAAUUGCACCUGUAUUCC	23.7%	12.8%	-0.4%	8.5%	47.3%	20.2%	61.6%	17.8%
153	G030142	CGAAUUUUGGCCAAGACACACGGU	14.4%	36.2%	19.9%	26.6%	41.4%	6.2%	55.0%	3.5%
154	G030143	CCAGCAAUCCUCUGGGAUUCUUUC	2.4%	33.2%	1.5%	17.1%	76.0%	4.6%	79.6%	3.0%
155	G030144	GGAAAAUUCCUAUGGGAGUGGGCC	3.3%	12.8%	12.9%	16.7%	27.2%	23.1%	59.0%	7.4%
156	G030145	CCCACUCCCAUAGGAAUUUUCCGA	76.4%	4.3%	82.7%	9.9%	83.4%	3.0%	80.7%	13.5%
157	G030146	GCAAUCCUCUGGGAUUCUUUCCCG	-5.0%	24.3%	-1.9%	20.1%	69.8%	3.4%	69.0%	7.9%
158	G030147	UGAACAUGGAGAACAUCACAUCAG	10.9%	10.5%	2.2%	3.1%	-15.9%	54.7%	-5.2%	53.9%
159	G030148	UUCCACCAGCAAUCCUCUGGGAUU	-0.2%	19.0%	-6.9%	11.2%	72.4%	19.8%	72.3%	20.3%
160	G030149	GGGAUUCUUUCCCGACCACCAGUU	24.5%	11.9%	-8.3%	9.3%	85.8%	0.9%	86.4%	1.4%
161	G030150	AGAGGAUUGCUGGUGGAAAGAUUC	-20.6%	12.6%	-31.1%	15.7%	28.4%	24.0%	39.5%	23.7%
162	G030151	GAUUGGGACUUCAAUCCCAACAAG	10.0%	20.4%	15.3%	9.7%	-29.5%	68.2%	-4.4%	56.1%
163	G030152	CUCCAGCUCCUACCUUGUUGGCGU	35.4%	7.8%	-43.6%	41.1%	77.3%	1.9%	81.6%	2.6%
164	G030153	CAGAGGAUUGCUGGUGGAAAGAUU	16.0%	26.7%	-10.3%	12.2%	51.9%	12.2%	60.5%	11.8%
165	G030154	UGGAUCCAACUGGUGGUCGGGAAA	37.3%	10.2%	-52.9%	25.0%	39.6%	4.4%	49.9%	1.7%
166	G030155	CCAGAGGAUUGCUGGUGGAAAGAU	-3.6%	33.5%	8.3%	14.0%	16.0%	3.8%	23.6%	0.4%
167	G030156	CAUGGGGCAGAAUCUUUCCACCAG	12.2%	29.1%	4.7%	26.5%	15.4%	25.1%	28.9%	17.9%
168	G030157	GGAUCCAACUGGUGGUCGGGAAAG	18.6%	4.9%	-62.7%	17.3%	24.8%	43.7%	23.2%	14.9%
169	G030158	CUCACCAACCUCCUGUCCUCCAAC	89.4%	2.2%	93.2%	6.8%	79.1%	8.4%	97.6%	0.0%
170	G030159	GGUGUCUUUCGGAGUGUGGAUUCG	-6.2%	26.1%	4.2%	5.9%	-27.0%	24.0%	1.2%	5.5%
171	G030160	ACUGGAGCCACCAGCAGGGAAAUA	51.1%	7.9%	51.7%	2.4%	89.8%	4.1%	87.7%	1.7%
172	G030161	UUCUUUCCCGACCACCAGUUGGAU	45.2%	11.7%	-10.6%	6.0%	53.7%	7.2%	57.9%	6.0%
173	G030162	GGACUUCAAUCCCAACAAGGACAC	37.4%	7.7%	49.4%	4.0%	92.8%	0.4%	92.4%	0.1%
174	G030163	GCCAGGAGAAACGGGCUGAGGCCC	64.2%	7.7%	69.8%	6.6%	51.7%	9.0%	55.5%	8.1%
175	G030164	AGCCAGGAGAAACGGGCUGAGGCC	77.4%	3.1%	70.1%	7.0%	-0.3%	33.4%	10.2%	36.8%
176	G030165	AACUGAGCCAGGAGAAACGGGCUG	85.1%	0.8%	86.1%	3.9%	39.3%	2.5%	55.5%	0.4%
177	G030166	AAACUGAGCCAGGAGAAACGGGCU	45.5%	0.4%	59.5%	8.7%	32.2%	5.9%	57.0%	4.1%
178	G030167	AAUCCCAACAAGGACACCUGGCCA	49.1%	27.3%	49.4%	0.3%	91.4%	1.7%	91.8%	2.1%
179	G030168	AGGCCUUUCUGUGUAAACAAUACC	4.1%	2.0%	19.4%	2.0%	22.3%	29.3%	28.0%	3.4%
180	G030169	UUCUGUGUAAACAAUACCUGAACC	13.9%	23.4%	19.4%	9.4%	10.9%	18.2%	38.2%	2.0%
181	G030170	UCUGUGUAAACAAUACCUGAACCU	10.7%	21.6%	26.0%	5.5%	-16.3%	22.3%	13.8%	7.3%
182	G030171	AAACAAUACCUGAACCUUUACCCC	36.1%	2.4%	38.1%	7.1%	26.0%	34.8%	51.2%	1.5%
183	G030172	GGGGCCAAGUCUGUACAGCAUCUU	36.4%	19.2%	39.6%	3.1%	56.0%	7.9%	65.5%	2.9%
184	G030173	GGGCCAAGUCUGUACAGCAUCUUG	19.8%	7.7%	21.0%	7.0%	15.3%	13.9%	45.9%	6.0%
185	G030174	AAUUUUGGCCAAGACACACGGUAG	30.7%	10.2%	-7.4%	2.4%	48.0%	16.5%	48.1%	14.7%
186	G030175	AUUUUGGCCAAGACACACGGUAGU	27.3%	4.2%	0.7%	6.1%	40.9%	8.2%	45.0%	8.1%
187	G030176	UCAAUCUAAGCAGGCUUUCACUUU	29.4%	17.4%	18.1%	0.1%	75.9%	5.5%	74.7%	0.2%
188	G030177	AAACUCUGCAAGAUCCCAGAGUGA	59.5%	15.0%	39.5%	3.4%	78.1%	9.0%	79.4%	2.6%
189	G030178	AGAUCCCAGAGUGAGAGGCCUGUA	67.8%	6.2%	37.7%	11.1%	88.9%	2.5%	89.4%	2.3%
190	G030179	CCUUCAGUACGAGAUCUUCUAGAU	10.5%	8.3%	2.1%	4.1%	49.1%	4.5%	52.7%	3.5%
191	G030180	AAGAUCCCAGAGUGAGAGGCCUGU	58.5%	14.0%	40.2%	5.9%	91.3%	1.8%	88.8%	0.5%
192	G030181	GCAAUUGAUUAUGCCUGCUAGGUU	18.6%	9.5%	17.7%	4.4%	90.5%	1.2%	89.9%	1.0%

表23B - 針對HBV之Nme2-Cas9嚮導

嚮導	C＞T %	C＞A/G %	插入缺失%	純度%	STOP 獲得%	START 損失%
SEQ ID NO	嚮導ID	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD
739	G021514	94.3%	0.3%	1.5%	0.0%	2.9%	0.0%	95.5%	0.0%	0.5%	0.1%	0.0%	0.0%
740	G021516	90.8%	0.9%	1.9%	0.1%	4.5%	0.1%	93.4%	0.2%	28.5%	0.8%	0.0%	0.0%
741	G026004	94.0%	0.1%	1.8%	0.3%	3.6%	0.1%	94.6%	0.2%	97.0%	0.4%	0.0%	0.0%
98	G027221	1.9%	0.1%	2.1%	0.3%	0.3%	0.0%	43.9%	4.2%	1.2%	0.1%	0.0%	0.0%
101	G027224	81.2%	3.4%	3.6%	0.1%	4.0%	0.1%	91.4%	0.3%	86.2%	2.9%	0.0%	0.0%
102	G027225	89.9%	7.0%	2.3%	0.5%	1.8%	0.9%	95.6%	1.8%	0.8%	0.1%	84.3%	7.2%
103	G027226	26.2%	7.9%	1.4%	0.1%	0.5%	0.2%	93.0%	1.7%	0.8%	0.1%	12.7%	7.1%
104	G027227	2.0%	0.1%	1.7%	0.4%	0.2%	0.0%	52.8%	4.7%	0.8%	0.3%	0.8%	0.0%
105	G027228	81.9%	3.5%	1.8%	0.1%	1.3%	0.1%	96.3%	0.1%	0.7%	0.1%	65.0%	6.6%
106	G030095	24.3%	3.2%	0.6%	0.1%	0.3%	0.1%	96.5%	0.1%	4.7%	0.2%	0.0%	0.0%
107	G030096	12.0%	0.2%	0.8%	0.0%	1.1%	0.0%	86.1%	0.1%	0.6%	0.1%	0.0%	0.0%
108	G030097	0.0%	0.0%	0.6%	0.1%	0.1%	0.0%	0.0%	0.0%	0.8%	0.1%	0.0%	0.0%
109	G030098	5.4%	0.2%	2.1%	0.1%	0.3%	0.0%	68.5%	0.5%	6.6%	0.2%	0.0%	0.0%
110	G030099	47.0%	1.1%	1.4%	0.0%	0.4%	0.0%	96.2%	0.0%	0.2%	0.0%	0.0%	0.0%
111	G030100	29.7%	4.9%	2.0%	0.4%	0.7%	0.0%	91.5%	2.5%	28.8%	4.0%	0.0%	0.0%
112	G030101	2.2%	0.2%	2.2%	0.8%	0.3%	0.0%	47.1%	6.0%	3.8%	0.4%	0.0%	0.0%
113	G030102	74.0%	0.3%	0.6%	0.0%	0.5%	0.0%	98.4%	0.1%	16.5%	0.3%	0.0%	0.0%
114	G030103	11.2%	0.8%	0.5%	0.0%	18.2%	0.2%	37.4%	1.9%	3.3%	0.1%	0.3%	0.0%
115	G030104	76.7%	2.5%	0.9%	0.0%	1.5%	0.1%	97.0%	0.2%	0.1%	0.0%	0.0%	0.0%
116	G030105	10.0%	2.3%	0.2%	0.0%	0.8%	0.0%	90.7%	1.6%	0.2%	0.1%	0.4%	0.1%
117	G030106	1.7%	0.1%	3.7%	0.0%	0.9%	0.0%	26.9%	1.6%	2.8%	0.2%	0.0%	0.0%
118	G030107	82.3%	2.3%	4.3%	0.1%	6.0%	0.5%	88.9%	0.9%	60.7%	2.7%	0.0%	0.0%
119	G030108	3.7%	0.4%	0.5%	0.0%	0.9%	0.1%	71.6%	0.9%	0.5%	0.1%	0.0%	0.0%
120	G030109	5.3%	0.6%	2.5%	0.4%	0.2%	0.0%	66.3%	1.3%	0.7%	0.2%	0.0%	0.0%
121	G030110	0.7%	0.0%	0.8%	0.0%	0.3%	0.0%	39.7%	0.8%	0.5%	0.1%	0.0%	0.0%
122	G030111	0.8%	0.1%	0.7%	0.1%	0.3%	0.1%	42.3%	5.1%	0.4%	0.1%	0.0%	0.0%
123	G030112	1.4%	0.1%	1.4%	0.1%	0.2%	0.0%	46.5%	2.0%	0.4%	0.0%	0.0%	0.0%
124	G030113	7.4%	0.6%	0.8%	0.0%	0.3%	0.1%	86.6%	0.0%	7.8%	0.6%	0.0%	0.0%
125	G030114	4.9%	0.6%	0.7%	0.0%	0.2%	0.0%	83.8%	1.3%	0.6%	0.1%	0.0%	0.0%
126	G030115	88.3%	4.6%	1.5%	0.1%	1.0%	0.2%	97.3%	0.2%	89.5%	7.8%	0.0%	0.0%
127	G030116	6.5%	0.2%	1.4%	0.0%	0.2%	0.0%	80.5%	0.7%	0.3%	0.1%	0.0%	0.0%
128	G030117	1.7%	0.1%	2.0%	0.2%	0.6%	0.0%	39.9%	3.7%	2.0%	0.1%	0.0%	0.0%
129	G030118	2.8%	0.7%	3.4%	0.0%	0.7%	0.0%	39.9%	6.1%	3.1%	0.4%	0.0%	0.0%
130	G030119	41.4%	0.6%	1.8%	0.2%	0.3%	0.0%	95.1%	0.4%	5.5%	0.0%	0.3%	0.1%
131	G030120	83.3%	0.5%	2.8%	0.2%	8.6%	1.3%	87.9%	1.3%	74.2%	5.8%	0.0%	0.0%
132	G030121	11.6%	0.6%	0.3%	0.0%	0.3%	0.1%	95.3%	0.2%	0.5%	0.0%	0.0%	0.0%
133	G030122	1.8%	0.1%	0.3%	0.0%	0.3%	0.0%	75.2%	0.3%	0.6%	0.1%	0.0%	0.0%
134	G030123	88.9%	0.6%	1.8%	0.2%	1.2%	0.1%	96.7%	0.3%	61.0%	1.1%	0.2%	0.0%
135	G030124	16.8%	0.4%	0.4%	0.0%	0.4%	0.1%	95.2%	0.3%	3.6%	0.5%	0.4%	0.1%
136	G030125	51.4%	11.9%	1.0%	0.3%	3.4%	0.3%	91.9%	1.8%	52.3%	12.0%	0.0%	0.0%
137	G030126	1.1%	0.3%	0.8%	0.0%	0.2%	0.0%	53.1%	6.1%	1.0%	0.0%	0.0%	0.0%
138	G030127	4.3%	0.7%	1.3%	0.0%	0.2%	0.0%	73.4%	3.1%	2.2%	0.3%	0.0%	0.0%
139	G030128	29.6%	2.9%	1.3%	0.0%	0.8%	0.1%	93.4%	0.8%	28.1%	2.0%	0.0%	0.0%
140	G030129	49.4%	0.5%	1.5%	0.1%	2.4%	0.1%	92.8%	0.4%	45.1%	0.4%	0.0%	0.0%
141	G030130	83.9%	0.1%	1.1%	0.2%	1.0%	0.1%	97.6%	0.1%	12.0%	0.8%	0.0%	0.0%
142	G030131	11.6%	0.8%	2.9%	0.3%	0.9%	0.0%	75.3%	2.6%	6.8%	0.7%	0.0%	0.0%
143	G030132	37.0%	0.9%	0.9%	0.1%	0.5%	0.1%	96.2%	0.3%	3.1%	0.1%	0.0%	0.0%
144	G030133	90.5%	3.8%	2.3%	0.2%	0.3%	0.0%	97.2%	0.3%	0.7%	0.1%	1.4%	0.1%
145	G030134	75.1%	1.1%	2.2%	0.1%	10.0%	0.0%	86.1%	0.0%	73.7%	3.6%	0.0%	0.0%
146	G030135	85.3%	11.2%	0.5%	0.1%	3.0%	0.1%	96.0%	0.7%	0.3%	0.0%	78.2%	10.6%
147	G030136	9.5%	3.3%	0.8%	0.1%	1.6%	0.1%	79.1%	5.7%	1.8%	0.5%	0.3%	0.0%
148	G030137	33.6%	3.0%	0.8%	0.0%	1.4%	0.1%	94.0%	0.6%	0.2%	0.1%	0.5%	0.1%
149	G030138	87.5%	2.5%	1.6%	0.4%	8.3%	1.5%	89.8%	2.0%	0.3%	0.0%	0.7%	0.1%
150	G030139	84.7%	3.2%	2.8%	0.0%	6.7%	0.2%	89.9%	0.2%	2.3%	0.2%	0.0%	0.0%
151	G030140	65.5%	4.2%	2.4%	0.1%	4.7%	0.0%	90.2%	0.7%	0.9%	0.1%	0.0%	0.0%
152	G030141	4.7%	0.8%	0.8%	0.0%	0.2%	0.1%	81.5%	1.3%	0.4%	0.0%	0.0%	0.0%
153	G030142	15.7%	0.1%	0.6%	0.1%	0.2%	0.0%	95.2%	0.5%	2.4%	0.5%	0.0%	0.0%
154	G030143	87.1%	0.1%	3.0%	0.1%	7.7%	0.2%	89.0%	0.1%	15.4%	8.7%	0.0%	0.0%
155	G030144	3.0%	0.5%	1.6%	0.0%	0.3%	0.0%	60.7%	4.4%	2.3%	0.4%	0.0%	0.0%
156	G030145	75.2%	3.6%	3.0%	0.2%	0.5%	0.1%	95.6%	0.2%	17.5%	6.3%	0.0%	0.0%
157	G030146	69.6%	1.3%	2.6%	0.2%	2.2%	0.2%	93.6%	0.1%	2.0%	0.7%	0.0%	0.0%
158	G030147	16.2%	0.7%	2.5%	0.1%	0.2%	0.0%	85.8%	0.2%	1.4%	0.1%	0.4%	0.0%
159	G030148	87.4%	1.8%	0.8%	0.2%	2.2%	0.3%	96.7%	0.5%	9.4%	4.8%	0.0%	0.0%
160	G030149	34.2%	0.2%	2.3%	0.2%	46.8%	18.9%	42.1%	9.3%	36.9%	1.8%	0.0%	0.0%
161	G030150	65.2%	2.5%	0.7%	0.0%	1.0%	0.0%	97.4%	0.2%	0.4%	0.1%	0.0%	0.0%
162	G030151	0.0%	0.0%	0.7%	0.0%	0.2%	0.1%	0.0%	0.0%	0.3%	0.0%	0.0%	0.0%
163	G030152	84.2%	5.5%	3.1%	0.2%	2.8%	0.3%	93.4%	0.5%	27.7%	4.7%	0.0%	0.0%
164	G030153	56.2%	5.4%	1.0%	0.1%	3.7%	0.8%	92.3%	0.7%	0.7%	0.4%	0.0%	0.0%
165	G030154	96.0%	0.1%	1.3%	0.1%	1.9%	0.1%	96.7%	0.0%	1.7%	0.6%	0.0%	0.0%
166	G030155	15.2%	1.1%	0.5%	0.0%	2.1%	0.1%	85.1%	0.0%	0.3%	0.1%	0.0%	0.0%
167	G030156	64.2%	3.3%	0.8%	0.1%	3.3%	0.4%	93.9%	0.1%	0.8%	0.1%	0.0%	0.0%
168	G030157	94.9%	0.1%	1.4%	0.1%	3.1%	0.1%	95.4%	0.1%	1.1%	0.1%	0.0%	0.0%
169	G030158	83.1%	1.8%	1.2%	0.1%	1.1%	0.2%	97.3%	0.1%	1.7%	0.1%	0.0%	0.0%
170	G030159	5.7%	0.1%	2.3%	0.2%	0.2%	0.0%	69.5%	1.2%	0.7%	0.1%	0.0%	0.0%
171	G030160	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A
172	G030161	48.9%	0.9%	0.9%	0.3%	3.4%	0.0%	92.0%	0.7%	7.3%	0.5%	0.0%	0.0%
173	G030162	77.4%	4.8%	2.0%	0.1%	8.1%	2.3%	88.3%	3.1%	79.3%	5.1%	0.0%	0.0%
174	G030163	56.4%	0.4%	1.0%	0.0%	0.4%	0.1%	97.6%	0.1%	36.6%	0.1%	0.0%	0.0%
175	G030164	77.7%	6.1%	1.2%	0.2%	0.4%	0.1%	98.0%	0.0%	44.9%	4.3%	0.0%	0.0%
176	G030165	92.3%	0.5%	0.7%	0.1%	0.3%	0.1%	98.9%	0.1%	84.2%	0.6%	0.0%	0.0%
177	G030166	74.9%	1.6%	0.7%	0.0%	0.3%	0.0%	98.7%	0.1%	64.5%	1.8%	0.0%	0.0%
178	G030167	79.6%	2.7%	1.5%	0.0%	10.1%	1.6%	87.2%	1.9%	58.6%	5.4%	0.0%	0.0%
179	G030168	7.8%	0.4%	2.0%	0.1%	0.2%	0.0%	78.3%	1.6%	0.6%	0.0%	0.0%	0.0%
180	G030169	4.8%	0.4%	2.6%	0.2%	0.2%	0.0%	63.3%	0.1%	0.5%	0.1%	0.0%	0.0%
181	G030170	26.2%	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	0.5%	#N/A	0.0%	#N/A
182	G030171	55.2%	2.1%	1.1%	0.1%	0.5%	0.1%	97.2%	0.1%	1.0%	0.1%	0.0%	0.0%
183	G030172	24.0%	1.1%	0.8%	0.0%	0.8%	0.1%	93.9%	0.0%	13.9%	0.3%	0.0%	0.0%
184	G030173	5.2%	0.1%	0.5%	0.0%	0.5%	0.1%	83.3%	0.9%	4.6%	0.4%	0.0%	0.0%
185	G030174	2.2%	0.1%	0.6%	0.0%	0.3%	0.0%	72.0%	0.4%	0.8%	0.1%	0.0%	0.0%
186	G030175	1.8%	0.1%	0.6%	0.0%	0.2%	0.0%	68.1%	1.5%	0.9%	0.1%	0.0%	0.0%
187	G030176	38.2%	22.9%	1.4%	0.5%	1.0%	0.5%	93.8%	1.1%	25.8%	18.2%	0.0%	0.0%
188	G030177	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A
189	G030178	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A
190	G030179	6.1%	0.2%	0.9%	0.0%	0.5%	0.0%	81.9%	0.4%	0.8%	0.1%	0.0%	0.0%
191	G030180	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A	#N/A
192	G030181	93.2%	0.6%	2.9%	0.5%	1.5%	0.1%	95.4%	0.7%	27.0%	1.6%	0.0%	0.0%

實例5 - 在原代人類肝細胞HBV感染模型中分泌的HBV HBsAg減弱的Nme2-BC22n /UGI + gRNA LNP效力之活體外評估

如上所述，將藉由在HepAD38細胞中篩選鑑定出之嚮導RNA使用活體外感染模型進一步分析原代人類肝細胞(PHH)中之效力。簡而言之，PHH首先被B型肝炎接種物感染，且在孵育期後，將含有GFP-mRNA或Nme2-BC22n mRNA + UGI mRNA +靶向HBV之gRNA之組合的LNP遞送至細胞中。在LNP遞送後，將培養基更換為新鮮培養基，並量測編輯孔或對照孔產生的分泌的HBsAg，以計算HBsAg之相對減弱，如下詳述。如實例1.5中製備病毒接種物。 5.1. 原代人類肝細胞之感染

將原代人類肝細胞(PHH)解凍並在CHRM培養基(Gibco，CM7000)中回收。將細胞重懸於由William's E培養基(Gibco，A1217601)、肝細胞鋪板補充劑(Gibco，CM3000)及5%胎牛血清(Gibco，A13450)組成之原代人類肝細胞鋪板培養基中。將PHH以30,000個細胞/孔的密度鋪板在膠原蛋白包被之96孔板中。在十八小時後，去除鋪板培養基並更換為由William's E培養基及肝細胞維持補充劑(Gibco，CM4000)組成的原代肝細胞維持培養基。

一天后，去除培養基並更換為含有2% DMSO之維持培養基，持續三小時。去除培養基並更換為含有HBV接種物之培養基，該培養基由維持培養基、4% PEG-8000、2% DMSO及MOI為50之病毒接種物組成。然後將板以1000xg離心三十分鐘，之後返回培養箱。二十四小時後，去除病毒培養基並更換為含有2% DMSO及2% FBS之培養基。第二天，重複相同的培養基更換。 5.2. LNP 轉染

HBV感染後三天，用含有編碼GFP之mRNA (開放閱讀框SEQ ID NO: 727；陰性對照)，或者重量比為1:2:1的gRNA、編碼Nme2 Cas9鹼基編輯器之mRNA (開放閱讀框SEQ ID NO: 721)及編碼UGI之mRNA (開放閱讀框SEQ ID NO: 724)之組合的單一LNP調配物(如實例1.2中所述調配)轉染感染的PHH細胞。將一種Spy-BC22n調配物與Nme2嚮導進行了比較。在這種情況下，Spy-BC22n及gRNA包裝在一種調配物中，而UGI mRNA調配在單獨的調配物中。在所有鹼基編輯條件下，gRNA:BC22n:UGI以1:2:1之重量比遞送。各孔接受11、33或100 ng之總RNA貨物。LNP在含有2% DMSO及6% FBS之維持培養基中預孵育10分鐘，然後添加到細胞中。將細胞與LNP一起孵育四天，然後去除培養基並更換為含有2% DMSO及2% FBS之新鮮培養基。 5.3. 量測分泌的HBsAg及相對減弱

在最後一次更換培養基後四天，即實驗的第17天，根據製造商之方案，使用市售ELISA套組(LSBio，LS-F37979)量測分泌的HBV S抗原(HBsAg)。所有條件下的培養基最初均以1:10稀釋。然而，由於許多樣品未落入檢定的偵測極限內，因此使用1:200稀釋之培養基重新進行檢定。兩次實驗均處於線性範圍內的橋接樣品(bridging sample)表明，兩次ELISA運行之間的HBsAg偵測絕對值平均下降了6.1倍。此因子用於正規化兩個實驗的值。在正規化後，計算絕對HBsAg水準(ng/mL)。將HBV gRNA處理組之平均HBsAg水準與GFP-mRNA組之平均HBsAg水準進行比較，以計算HBsAg減弱相對百分比。 表24及圖7示出了所有實驗組之HBsAg減弱相對百分比。 表24： 第17天相對於LNP-GFP mRNA條件之HBsAg減弱百分比

mRNA- 嚮導	LNP 劑量	HBsAg 減弱%
n	Avg	STD
GFP mRNA	11	2	0.0%	4.9%
33	2	0.0%	6.9%
100	2	0.0%	21.0%
Spy-BC22n G028550	11	2	95.7%	0.3%
33	2	95.2%	1.9%
100	2	94.2%	0.1%
Nme2-BC22n G028224	11	2	90.7%	1.1%
33	2	87.0%	3.8%
100	2	81.5%	11.2%
Nme2-BC22n G028228	11	2	91.9%	1.5%
33	2	93.3%	1.3%
100	2	93.5%	0.2%
Nme2-BC22n G030107	11	2	90.1%	0.3%
33	2	90.5%	2.2%
100	2	90.7%	2.0%
Nme2-BC22n G030115	11	2	89.8%	1.6%
33	2	91.4%	2.0%
100	2	91.6%	0.7%
Nme2-BC22n G030120	11	2	91.2%	1.7%
33	2	92.2%	1.0%
100	2	92.5%	0.5%
Nme2-BC22n G030123	11	2	59.5%	0.6%
33	2	57.0%	4.3%
100	2	93.7%	0.2%
Nme2-BC22n G030130	11	2	70.7%	3.7%
33	2	87.9%	1.7%
100	2	90.9%	1.6%
Nme2-BC22n G030162	11	2	36.3%	10.2%
33	1	48.3%	-
100	2	90.4%	1.5%
Nme2-BC22n G107/120	11	2	94.1%	0.1%
33	2	95.2%	0.7%
100	2	94.4%	0.3%

實例6 - AAV8-HBV1.2小鼠模型中Nme2-BC22n及Spy-BC22n LNP之評估

來自Jackson Labs之NSG (NOD.Cg-Prkdc ^scidIl2rg ^tm1Wjl/SzJ)雄性小鼠在6-10週齡時隨後按指示經由側尾靜脈給予AAV8及LNP，或媒劑(對於AAV媒劑，PBS + 0.001% Pluronic；對於LNP媒劑，TSS)。以每隻動物0.1 mL之體積及如本文所述之量(載體基因體/小鼠，「vg/ms」)投與AAV。將LNP在TSS中稀釋，並按本文所示之量以10 μl/公克體重投與。在治療後之不同時間點，收集血液且分離血清用於如下文進一步描述的某些分析。 6.1. 人類B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg) ELISA及總DNA qPCR分析

對於活體內研究，按指示收集血液，並分離血清。使用HBsAg (人類) ELISA套組(LifeSpan Bio，目錄號LS-F37979)根據製造商的方案測定總人類B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)水準。使用4參數邏輯擬合從標準曲線量化血清HBsAg水準並表示為μg/mL血清。對於qPCR，將血清以1:50稀釋，並使用QE裂解方案(Lucigen，目錄號QE09050)分離DNA。使用絕對qPCR SYBR Green Rox Mix (Thermo Scientific，目錄號AB-1163/A)用針對未經測試的gRNA編輯的HBV基因體之高度保守區域之引子組(Fwd-5’-GTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTC-3’ (SEQ ID NO: 699)，Rev- 5’-GGAGGGATACATAGAGGTTCCTTGA-3’ (SEQ ID NO: 700))運行qPCR。使用編碼相同HBV序列之標準質體來確定DNA拷貝數/mL。

經由減弱來自AAV8-HBV1.2 (SignaGen Laboratories目錄號SL100862)之人類B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)之游離型表現，對7種sgRNA (一種對照、兩種Nme2-BC22n、四種Spy-BC22n)之編輯進行評估，如本文所述以1.2e11 vg/小鼠的劑量投與，如藉由ELISA量測。投與AAV8-HBV材料後三週，經由HBsAg ELISA評估血清HBsAg表現之基線水準。製備本實例中測試之LNP，並在評估HBsAg基線後一週將其遞送至如本文所述的小鼠。將兩種LNP (一種含有gRNA及編碼Nme2 Cas9鹼基編輯器之mRNA (開放閱讀框SEQ ID NO: 729)或編碼Spy Cas9鹼基編輯器之mRNA (開放閱讀框SEQ ID NO: 706)，而另一種含有編碼UGI之mRNA (開放閱讀框SEQ ID NO: 732))預混合且以每動物體重0.5 mg/kg (相對於總RNA貨物含量)之劑量水準投與。gRNA:BC22n:UGI之重量比為1:2:0.3。此後，在sgRNA投與後一週、兩週及四週藉由ELISA測定血清HBsAg表現。LNP給藥後五週，對動物實施安樂死；收集血液以評估血清中之終末HBsAg及HBV DNA水準。收集肝臟用於HBV靶位點的下一代定序(NGS)及編輯評估。如實例1.1所述藉由NGS測定C至T %、C至A/G %及插入缺失%。 表25及 表26示出了嚮導特異性靶位點之表型量測結果及編輯。HBsAg時間過程如圖8所示。第5週時總HBV DNA之Log10減弱如圖9所示。最後，如 圖10所示，在研究終點時血清中之HBsAg與總DNA水準之間的減弱水準高度相關。 表25 - 血清HBsAg時間過程、終點時的血清HBV DNA及終點時的編輯概況。

嚮導	注射後週數	分泌的μl/mL	相對於基線之Log10變化
平均值	SD	平均值	SD
僅AAV N=5	0	401.52	164.37	0.00	0.00
1	435.09	111.46	0.06	0.08
2	410.65	153.65	0.02	0.07
4	467.24	181.82	0.07	0.05
5	314.25	92.25	-0.09	0.10
Spy-BC22n 對照 N=5	0	350.31	56.85	0.00	0.00
1	341.87	52.12	-0.01	0.08
2	339.46	65.55	-0.02	0.14
4	282.84	37.57	-0.09	0.08
5	262.83	58.94	-0.13	0.07
Nme2-BC22n G027224 N=5	0	437.45	80.71	0.00	0.00
1	34.29	6.28	-1.11	0.05
2	19.83	4.53	-1.35	0.06
4	21.84	3.78	-1.30	0.02
5	15.53	2.31	-1.45	0.05
Nme2-BC22n G027228 N=5	0	396.83	54.63	0.00	0.00
1	14.17	3.15	-1.45	0.12
2	8.65	1.24	-1.66	0.06
4	12.68	2.38	-1.50	0.11
5	7.43	2.10	-1.74	0.14
Spy-BC22n G028550 N=5	0	337.36	62.38	0.00	0.00
1	3.19	0.72	-2.03	0.06
2	1.06	0.22	-2.51	0.09
4	1.54	0.28	-2.34	0.05
5	0.78	0.25	-2.65	0.11
Spy-BC22n G028551 N=5	0	413.42	64.19	0.00	0.00
1	229.89	43.68	-0.26	0.06
2	197.93	36.80	-0.32	0.05
4	220.88	31.05	-0.27	0.05
5	149.38	63.43	-0.47	0.14
Spy-BC22n G028554 N=5	0	370.96	51.27	0.00	0.00
1	2.79	0.54	-2.13	0.05
2	1.40	0.26	-2.43	0.08
4	2.62	0.47	-2.15	0.03
5	1.76	1.40	-2.41	0.25
Spy-BC22n G028555 N=5	0	336.91	56.25	0.00	0.00
1	6.50	1.16	-1.72	0.11
2	4.16	0.41	-1.91	0.10
4	6.32	0.38	-1.72	0.09
5	2.34	0.60	-2.17	0.11

表26：NGS C至T %、C至A/G %及插入缺失%

嚮導	注射後週數	C＞T %	C＞A/G %	插入缺失%	STOP 獲得%	START 損失%
平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD
僅AAV N=5	5	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A
Spy-BC22n 對照 N=5	5	65.24	1.49	2.62	0.28	9.18	1.04	0.00	0.00	0.00	0.00
Nme2-BC22n G027224 N=5	5	48.44	2.74	7.92	1.27	26.66	2.21	55.16	2.64	0.00	0.00
Nme2-BC22n G027228 N=5	5	81.50	3.02	2.88	0.31	3.08	0.53	0.60	0.29	77.84	2.82
Spy-BC22n G028550 N=5	5	87.78	0.42	2.20	0.54	5.26	0.55	81.64	2.08	0.00	0.00
Spy-BC22n G028551 N=5	5	14.48	2.16	0.70	0.20	13.10	2.20	13.78	1.76	0.00	0.00
Spy-BC22n G028554 N=5	5	93.93	0.53	1.54	0.34	2.22	0.46	0.40	0.19	94.58	0.38
Spy-BC22n G028555 N=5	5	90.16	0.56	2.06	0.51	3.88	0.31	0.34	0.17	88.30	1.19

實例6.2. Nme2-BC22n LNP在多劑量實驗中之評估

在多劑量實驗中，經由減弱人類B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)之表現，評估了四種個別sgRNA (G027224、G030107、G030115、G030120)及一種多重sgRNA對(G030107/G030120)之編輯。如實例6.1所述進行人類B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg) ELISA及總DNA qPCR分析。

進行ELISA以量測AAV8-HBV1.2 (SignaGen Laboratories目錄號SL100862)之游離型表現，其如本文所述在第0天以5e10 vg/小鼠之劑量投與。第13天，經由HBsAg ELISA評估血清HBsAg表現之基線水準。將貨物單獨調配在LNP中，各LNP含有個別gRNA或編碼Nme2 Cas9鹼基編輯器之mRNA (開放閱讀框SEQ ID NO: 729)，而另一種含有編碼UGI之mRNA (開放閱讀框SEQ ID NO: 732)。將LNP預先混合，並在第15天及第42天以每動物體重0.5 mg/kg (相對於總RNA貨物含量)之劑量水準投與。gRNA:BC22n:UGI之重量比為1:2:0.3。在第0、15、28、42及63天收集血液，並藉由ELISA測定血清HBsAg表現。第84天，對動物實施安樂死；收集血液以評估血清中之終末HBsAg及HBV DNA水準。收集肝臟用於HBV靶位點的下一代定序(NGS)及編輯評估。如實例1.1所述藉由NGS測定C至T %、C至A/G %及插入缺失% 。

第一LNP劑量後，所有組的HBsAg水準均降低，且第二劑量後，所有組的HBsAg水準均進一步降低。第63天之原始資料及第84天之正規化減弱表明，多次給藥對於5個組中之4個組的HBsAg減弱具有顯著益處。 實例7 - 使用Nme2嚮導之劑量反應曲線

進行嚮導RNA之劑量反應轉染，以比較從gRNA篩選(實例4)中選擇的嚮導與先前鑑定的靶向HBV D基因型(導致HBsAg減弱)之高活性Nme2嚮導的效力。

如實例1.4所述，將HepAD38細胞解凍、傳代、鋪板並用編碼Nme2 Cas9鹼基編輯器之mRNA (開放閱讀框SEQ ID NO: 715)、編碼UGI之mRNA (開放閱讀框SEQ ID NO: 708)或靶向HepAD38之整合的S抗原、聚合酶或Epsilon基因座之gRNA各別形成的單獨脂質複合物轉染。

如實例1.2所述，將脂轉染試劑製備為比率為50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG之脂質混合物。藉由單獨混合以下各RNA種類來製備單一貨物脂轉染試劑：Nme2-BC22n鹼基編輯器mRNA、UGI mRNA或gRNA。各孔接受稀釋於完全培養基中之100 ng鹼基編輯器及100 ng UGI。使用3倍稀釋方案滴定，以50 nM至0 nM範圍內之濃度在完全培養基中形成各所測試之嚮導的嚮導RNA劑量反應曲線。將培養基-脂轉染試劑混合物在37℃下孵育10分鐘，然後添加到HepAD38細胞中。所有三種組分之總體積為100 μL/孔。

如實例1.4所述進行培養基更換、培養基收集及細胞裂解。如實例1.6所述，對收集之細胞培養基進行評估前兩個劑量之DRC的HBsAg減弱之MSD檢定。使用實例1.5中所述之qPCR檢定，使用細胞裂解物來量化細胞內總HBV DNA。亦製備了細胞裂解物用於NGS分析，如實例1.1所述。

表27及 圖11中之NGS結果示出了C至T編輯結果。 圖11中之劑量反應曲線之EC50值如 表28所示。使用劑量反應曲線中使用的前兩個劑量之分泌的HBsAg百分比如 圖12及 表29所示。 表27：擴展Nme2先導嚮導DRC之NGS結果。

嚮導	C＞T %	C＞A/G %	插入缺失%	純度%	STOP 獲得%	START 損失%
嚮導	嚮導劑量	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD
G030107 N=2	50.00	85.5%	0.7%	3.0%	0.0%	5.5%	0.7%	90.5%	0.7%	41.4%	13.1%	0.0%	0.0%
16.67	81.0%	NA	NA	NA	NA	NA	NA	NA	23.7%	NA	0.0%	NA
5.56	67.0%	8.5%	1.5%	0.7%	2.5%	0.7%	94.0%	2.8%	13.6%	5.9%	0.0%	0.0%
1.85	27.0%	4.2%	1.0%	0.0%	1.0%	0.0%	92.0%	1.4%	5.6%	1.8%	0.0%	0.0%
0.62	9.5%	0.7%	1.0%	0.0%	0.5%	0.7%	87.0%	1.4%	1.1%	0.4%	0.0%	0.0%
0.21	3.5%	0.7%	1.0%	0.0%	1.0%	0.0%	69.5%	3.5%	1.2%	0.5%	0.0%	0.0%
0.07	1.0%	0.0%	1.0%	0.0%	0.0%	0.0%	42.5%	2.1%	0.7%	0.1%	0.0%	0.0%
0.00	0.0%	0.0%	1.0%	0.0%	0.0%	0.0%	6.5%	9.2%	0.5%	0.1%	0.0%	0.0%
G030115 N=2	50.00	90.5%	0.7%	2.0%	0.0%	2.0%	0.0%	96.0%	0.0%	94.0%	0.6%	0.0%	0.0%
16.67	87.5%	0.7%	1.5%	0.7%	1.0%	0.0%	97.0%	0.0%	87.9%	0.9%	0.0%	0.0%
5.56	71.5%	0.7%	1.5%	0.7%	1.0%	0.0%	96.5%	0.7%	70.3%	0.3%	0.0%	0.0%
1.85	48.0%	1.4%	1.0%	0.0%	1.0%	0.0%	96.0%	0.0%	45.1%	1.1%	0.0%	0.0%
0.62	24.5%	0.7%	1.0%	0.0%	1.0%	0.0%	92.5%	0.7%	23.2%	0.1%	0.0%	0.0%
0.21	11.0%	1.4%	1.0%	0.0%	1.0%	0.0%	84.0%	1.4%	11.0%	0.6%	0.0%	0.0%
0.07	4.5%	0.7%	1.0%	0.0%	1.0%	0.0%	69.0%	0.0%	4.3%	0.1%	0.0%	0.0%
0.00	0.0%	0.0%	1.0%	0.0%	1.0%	0.0%	13.5%	6.4%	0.9%	0.1%	0.0%	0.0%
G030120 N=2	50.00	79.5%	0.7%	4.5%	0.7%	12.5%	0.7%	82.0%	0.0%	63.0%	1.6%	0.0%	0.0%
16.67	89.5%	0.7%	4.0%	0.0%	3.0%	0.0%	92.5%	0.7%	49.4%	0.4%	0.0%	0.0%
5.56	86.5%	0.7%	3.0%	0.0%	1.0%	0.0%	95.5%	0.7%	43.2%	0.0%	0.0%	0.0%
1.85	66.0%	2.8%	2.0%	0.0%	1.0%	0.0%	96.0%	0.0%	39.7%	0.4%	0.0%	0.0%
0.62	44.0%	1.4%	2.5%	0.7%	0.0%	0.0%	94.5%	0.7%	34.0%	0.7%	0.0%	0.0%
0.21	26.5%	0.7%	2.0%	0.0%	0.0%	0.0%	91.0%	0.0%	23.4%	0.5%	0.0%	0.0%
0.07	13.0%	0.0%	2.0%	0.0%	0.0%	0.0%	84.5%	0.7%	13.5%	0.0%	0.0%	0.0%
0.00	0.0%	0.0%	2.0%	0.0%	0.0%	0.0%	6.0%	2.8%	1.7%	0.4%	0.0%	0.0%
G030125 N=2	50.00	75.5%	0.7%	1.0%	0.0%	3.5%	0.7%	94.0%	1.4%	76.7%	0.1%	0.0%	0.0%
16.67	17.0%	4.2%	1.0%	0.0%	2.0%	0.0%	85.5%	2.1%	17.9%	3.5%	0.0%	0.0%
5.56	3.0%	1.4%	0.0%	0.0%	2.0%	0.0%	56.0%	19.8%	3.5%	1.7%	0.0%	0.0%
1.85	1.0%	0.0%	0.5%	0.7%	2.0%	0.0%	33.0%	8.5%	1.8%	0.4%	0.0%	0.0%
0.62	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	2.0%	0.0%	13.0%	0.0%	1.1%	0.4%	0.0%	0.0%
0.21	0.5%	0.7%	0.0%	0.0%	2.0%	0.0%	21.5%	4.9%	0.9%	0.1%	0.0%	0.0%
0.07	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	2.0%	0.0%	12.5%	0.7%	0.8%	0.2%	0.0%	0.0%
0.00	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	2.0%	0.0%	15.0%	1.4%	0.9%	0.1%	0.0%	0.0%
G027224 N=2	50.00	87.0%	1.4%	3.5%	0.7%	5.5%	0.7%	90.0%	1.4%	93.2%	0.4%	0.0%	0.0%
16.67	85.5%	2.1%	3.5%	0.7%	2.0%	0.0%	93.5%	0.7%	89.4%	2.4%	0.0%	0.0%
5.56	68.0%	1.4%	2.5%	0.7%	2.0%	0.0%	94.5%	0.7%	70.3%	1.4%	0.0%	0.0%
1.85	32.0%	0.0%	2.0%	0.0%	1.0%	0.0%	91.0%	0.0%	33.4%	0.7%	0.0%	0.0%
0.62	11.5%	0.7%	2.0%	0.0%	1.0%	0.0%	81.5%	0.7%	12.4%	0.7%	0.0%	0.0%
0.21	4.0%	0.0%	2.0%	0.0%	1.0%	0.0%	59.5%	3.5%	6.0%	0.4%	0.0%	0.0%
0.07	1.5%	0.7%	2.0%	0.0%	1.0%	0.0%	37.0%	1.4%	3.4%	0.1%	0.0%	0.0%
0.00	0.0%	0.0%	2.0%	0.0%	0.5%	0.7%	2.0%	2.8%	1.6%	0.3%	0.0%	0.0%
G030130 N=2	50.00	87.5%	2.1%	1.5%	0.7%	1.0%	0.0%	97.5%	0.7%	7.8%	1.4%	0.0%	0.0%
16.67	74.0%	2.8%	1.0%	0.0%	1.0%	0.0%	97.0%	1.4%	4.1%	3.0%	0.0%	0.0%
5.56	48.0%	2.8%	1.0%	0.0%	1.0%	0.0%	96.0%	0.0%	3.0%	1.6%	0.0%	0.0%
1.85	22.0%	1.4%	1.0%	0.0%	0.5%	0.7%	92.0%	1.4%	1.8%	0.8%	0.0%	0.0%
0.62	9.5%	0.7%	1.0%	0.0%	0.0%	0.0%	87.5%	0.7%	1.2%	0.6%	0.0%	0.0%
0.21	4.0%	0.0%	1.0%	0.0%	0.0%	0.0%	72.0%	2.8%	1.0%	0.4%	0.0%	0.0%
0.07	1.0%	0.0%	1.0%	0.0%	0.0%	0.0%	44.5%	3.5%	0.8%	0.1%	0.0%	0.0%
0.00	0.0%	0.0%	1.0%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	0.7%	0.0%	0.0%	0.0%
G027228 N=2	50.00	84.5%	0.7%	1.5%	0.7%	1.0%	0.0%	97.0%	0.0%	1.1%	0.3%	49.3%	3.7%
16.67	62.0%	0.0%	1.0%	0.0%	1.0%	0.0%	97.0%	0.0%	0.6%	0.0%	33.3%	12.6%
5.56	23.5%	0.7%	1.0%	0.0%	0.0%	0.0%	93.5%	0.7%	0.7%	0.1%	10.8%	2.5%
1.85	9.0%	0.0%	1.0%	0.0%	0.0%	0.0%	84.5%	0.7%	0.9%	0.1%	3.6%	1.2%
0.62	4.5%	0.7%	1.0%	0.0%	0.0%	0.0%	76.5%	3.5%	0.5%	0.0%	1.6%	0.5%
0.21	2.5%	0.7%	1.0%	0.0%	0.0%	0.0%	61.5%	2.1%	0.9%	0.1%	0.8%	0.1%
0.07	1.5%	0.7%	1.5%	0.7%	0.0%	0.0%	47.5%	2.1%	1.1%	0.2%	0.6%	0.1%
0.00	1.5%	0.7%	1.0%	0.0%	0.0%	0.0%	48.0%	1.4%	1.4%	0.1%	0.5%	0.1%
G027225 N=2	50.00	96.0%	0.0%	2.5%	0.7%	1.5%	0.7%	96.0%	1.4%	4.9%	4.0%	92.4%	1.3%
16.67	95.5%	0.7%	3.0%	0.0%	1.5%	0.7%	95.5%	0.7%	1.4%	0.8%	87.4%	5.8%
5.56	93.5%	3.5%	2.0%	0.0%	1.0%	0.0%	97.0%	0.0%	1.0%	0.8%	78.5%	8.3%
1.85	69.0%	5.7%	2.0%	0.0%	0.5%	0.7%	96.0%	0.0%	1.3%	0.4%	40.4%	8.3%
0.62	26.5%	0.7%	1.0%	0.0%	0.0%	0.0%	94.0%	1.4%	1.1%	0.1%	9.8%	0.4%
0.21	9.0%	1.4%	1.0%	0.0%	0.0%	0.0%	88.0%	0.0%	0.9%	0.1%	3.3%	1.3%
0.07	4.0%	0.0%	1.0%	0.0%	0.0%	0.0%	73.0%	2.8%	1.3%	0.3%	2.1%	0.1%
0.00	1.5%	0.7%	1.0%	0.0%	0.0%	0.0%	58.0%	5.7%	1.2%	0.4%	0.9%	0.1%
G030167 N=2	50.00	73.5%	4.9%	1.0%	0.0%	18.5%	2.1%	79.0%	2.8%	31.3%	4.5%	0.0%	0.0%
16.67	70.5%	0.7%	1.0%	0.0%	21.0%	2.8%	76.0%	2.8%	15.6%	1.0%	0.0%	0.0%
5.56	56.5%	0.7%	1.0%	0.0%	17.0%	0.0%	76.5%	0.7%	12.0%	1.1%	0.0%	0.0%
1.85	26.5%	0.7%	0.5%	0.7%	6.5%	0.7%	79.0%	1.4%	5.0%	0.4%	0.0%	0.0%
0.62	9.0%	0.0%	1.0%	0.0%	2.0%	0.0%	76.5%	0.7%	2.1%	0.2%	0.0%	0.0%
0.21	3.0%	0.0%	0.0%	0.0%	1.0%	0.0%	69.5%	2.1%	0.7%	0.1%	0.0%	0.0%
0.07	1.0%	0.0%	0.0%	0.0%	0.5%	0.7%	55.5%	4.9%	0.4%	0.1%	0.0%	0.0%
0.00	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	0.2%	0.1%	0.0%	0.0%
G030162 N=2	50.00	84.5%	3.5%	3.5%	0.7%	10.5%	0.7%	86.0%	2.8%	87.7%	4.1%	0.0%	0.0%
16.67	44.5%	21.9%	1.5%	0.7%	48.5%	24.7%	47.5%	24.7%	45.6%	25.3%	0.0%	0.0%
5.56	53.5%	17.7%	1.5%	0.7%	32.5%	16.3%	61.0%	18.4%	52.5%	18.7%	0.0%	0.0%
1.85	35.0%	2.8%	2.0%	0.0%	14.0%	1.4%	69.0%	2.8%	30.9%	1.9%	0.0%	0.0%
0.62	10.5%	0.7%	1.0%	0.0%	3.5%	0.7%	69.0%	2.8%	9.1%	0.8%	0.0%	0.0%
0.21	3.5%	0.7%	1.0%	0.0%	1.0%	0.0%	60.0%	1.4%	4.3%	0.9%	0.0%	0.0%
0.07	1.0%	0.0%	1.0%	0.0%	1.0%	0.0%	38.5%	3.5%	2.5%	0.4%	0.0%	0.0%
0.00	0.0%	0.0%	1.0%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	1.8%	0.1%	0.0%	0.0%
G030123 N=2	50.00	89.5%	0.7%	2.5%	0.7%	1.0%	0.0%	96.0%	0.0%	53.6%	1.3%	0.3%	0.1%
16.67	86.0%	0.0%	2.0%	0.0%	1.0%	0.0%	97.0%	0.0%	28.4%	0.3%	0.3%	0.0%
5.56	62.5%	0.7%	1.0%	0.0%	0.0%	0.0%	97.0%	0.0%	15.3%	0.5%	0.4%	0.1%
1.85	30.5%	0.7%	1.0%	0.0%	0.0%	0.0%	97.0%	0.0%	6.2%	1.4%	0.3%	0.0%
0.62	12.5%	0.7%	1.0%	0.0%	0.0%	0.0%	94.0%	0.0%	3.1%	0.3%	0.4%	0.0%
0.21	5.5%	0.7%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	92.0%	0.0%	2.0%	0.6%	0.5%	0.1%
0.07	2.0%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	83.0%	2.8%	1.5%	0.1%	0.4%	0.1%
0.00	1.0%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	0.0%	62.5%	6.4%	1.2%	0.1%	0.5%	0.0%
G021514 N=2	50.00	93.5%	0.7%	2.0%	0.0%	3.5%	0.7%	94.0%	0.0%	0.4%	0.0%	0.0%	0.0%
16.67	94.0%	1.4%	1.5%	0.7%	3.5%	0.7%	95.0%	1.4%	0.5%	0.1%	0.0%	0.0%
5.56	93.0%	0.0%	2.0%	0.0%	3.0%	0.0%	95.0%	0.0%	0.5%	0.1%	0.0%	0.0%
1.85	84.5%	0.7%	2.0%	0.0%	3.0%	0.0%	95.0%	0.0%	0.6%	0.1%	0.0%	0.0%
0.62	64.5%	2.1%	1.0%	0.0%	2.0%	0.0%	95.0%	0.0%	0.4%	0.1%	0.0%	0.0%
0.21	37.0%	0.0%	1.5%	0.7%	1.5%	0.7%	93.0%	1.4%	0.4%	0.1%	0.0%	0.0%
0.07	18.0%	1.4%	1.0%	0.0%	1.0%	0.0%	90.0%	1.4%	0.4%	0.0%	0.0%	0.0%
0.00	0.0%	0.0%	1.0%	0.0%	0.0%	0.0%	6.0%	8.5%	0.3%	0.0%	0.0%	0.0%

表28：擴展Nme2嚮導DRC中所包括的先導Nme2嚮導之EC50值。

嚮導	G030107	G030115	G030120	G030125	G027224	G030130	G027228	G027225	G030167	G030162	G030123	G021514
EC50	2.856	2.046	1.153	77.34	2.692	5.234	10.98	1.416	2.727	7.560	3.267	0.677

表29：擴展Nme2先導嚮導DRC之分泌的HBsAg百分比(僅前兩個劑量之gRNA)。

嚮導	分泌的HBsAg減弱%
嚮導	嚮導劑量	平均值	SD
G030107 N=2	50.00	100.0%	0.0%
16.67	100.0%	0.0%
G030115 N=2	50.00	99.1%	0.2%
16.67	98.0%	0.6%
G030120 N=2	50.00	95.6%	0.1%
16.67	96.2%	0.1%
G030125 N=2	50.00	96.8%	1.1%
16.67	94.1%	1.5%
G027224 N=2	50.00	99.6%	0.3%
16.67	99.5%	0.1%
G030130 N=2	50.00	92.2%	1.1%
16.67	88.2%	0.3%
G027228 N=2	50.00	98.9%	0.2%
16.67	98.5%	0.2%
G027225 N=2	50.00	26.2%	0.5%
16.67	20.7%	0.4%
G030167 N=2	50.00	47.3%	0.3%
16.67	37.7%	0.1%
G030162 N=2	50.00	18.4%	3.5%
16.67	20.2%	3.4%
G030123 N=2	50.00	95.0%	2.3%
16.67	86.1%	0.9%
G021514 N=2	50.00	0.0%	6.8%
16.67	0.0%	2.3%

實例8 - 在HepAD38中以多重組合測試之Nme2-BC22n嚮導

Nme2-BC22n先導嚮導在多重組合中進行了測試，以評估多嚮導治療相對於單一嚮導治療對NGS結果以及HBsAg及總HBV DNA減弱之組合效果。

如實例1.4所述，將HepAD38細胞以20,000個細胞/孔的密度鋪板在膠原蛋白包被的96孔板中之完全培養基(不含多西環素及G418硫酸鹽補充劑)中。二十四小時後，用脂質奈米顆粒(基本上如實例1.2所述製備)轉染細胞。脂質奈米顆粒按莫耳濃度使用50%脂質A、38%膽固醇、9% DSPC及3% PEG2k-DMG。脂質核酸組裝體以約6之脂質胺與RNA磷酸鹽(N:P)莫耳比以及gRNA:Nme2-BC22 (編碼Nme2 Cas9鹼基編輯器之mRNA (開放閱讀框SEQ ID NO: 721)):UGI (編碼UGI之mRNA (開放閱讀框SEQ ID NO: 724))為1:2:1之貨物進行調配。

以總LNP貨物質量範圍為80 ng至0 ng的完全培養基形成劑量反應曲線，使用2倍稀釋方案進行滴定。將培養基-LNP混合物在37℃下孵育10分鐘，然後添加到HepAD38細胞中。遞送總體積為100 μL/孔之培養基-LNP混合物。

如實例1.4所述進行培養基更換、培養基收集及細胞裂解。如實例1.6所述，對收集之細胞培養基進行評估HBsAg減弱之MSD檢定。亦製備細胞裂解物用於NGS分析，如實例3.2所述。NGS資料如 表30所示。 圖13及圖14以及表31示出了藉由MSD檢定量測之分泌的HBsAg減弱百分比。 表30- 所有測試的Nme2嚮導組合之NGS結果。

嚮導	C＞T %	C＞A/G %	插入缺失%	純度%	STOP 獲得%	START 損失%
嚮導組合	嚮導劑量	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD
G030107/G030120 (LNP 共同調配物) N=2	20.00	74.6%	4.3%	4.1%	0.3%	10.9%	2.1%	83.3%	0.9%	73.3%	2.1%	0.0%	0.0%
10.00	67.5%	6.6%	4.7%	1.2%	8.1%	1.2%	84.2%	1.2%	69.1%	8.3%	0.0%	0.0%
5.00	56.1%	4.5%	3.6%	0.2%	7.0%	0.5%	84.1%	1.4%	54.5%	2.9%	0.0%	0.0%
2.50	37.6%	6.6%	2.8%	0.4%	4.7%	0.4%	83.3%	0.9%	37.8%	7.6%	0.0%	0.0%
1.25	19.0%	0.3%	1.8%	0.1%	2.4%	0.0%	81.6%	0.0%	18.1%	0.4%	0.0%	0.0%
0.63	7.9%	0.1%	1.3%	0.2%	1.1%	0.0%	76.2%	1.8%	7.5%	0.2%	0.0%	0.0%
0.31	2.7%	0.4%	1.1%	0.1%	0.5%	0.0%	63.4%	2.3%	2.6%	0.1%	0.0%	0.0%
0.00	0.0%	0.0%	0.8%	0.1%	0.3%	0.0%	0.0%	0.0%	0.7%	0.1%	0.0%	0.0%
20.00	79.9%	5.2%	3.7%	0.6%	10.7%	1.3%	84.7%	1.5%	76.5%	4.8%
10.00	78.1%	3.7%	3.2%	0.3%	7.2%	1.1%	88.3%	1.0%	73.0%	4.9%
5.00	75.9%	2.3%	2.7%	0.2%	4.8%	0.3%	91.1%	0.1%	67.8%	0.8%
2.50	62.2%	5.1%	2.4%	0.1%	2.6%	0.2%	92.4%	0.1%	53.9%	3.5%
1.25	47.7%	0.6%	2.4%	0.0%	1.3%	0.1%	92.8%	0.3%	39.3%	0.4%
0.63	32.7%	1.4%	2.5%	0.2%	0.7%	0.0%	91.2%	0.8%	27.6%	1.3%
0.31	19.7%	1.0%	2.6%	0.2%	0.4%	0.1%	87.0%	0.1%	17.8%	0.8%
0.00	0.1%	0.1%	2.5%	0.3%	0.3%	0.0%	3.1%	4.4%	1.5%	0.2%
G027224/G030107 N=2	20.00	84.0%	3.6%	3.4%	0.3%	8.7%	2.1%	87.4%	2.7%	88.1%	3.7%	0.0%	0.0%
10.00	81.6%	1.1%	3.5%	0.7%	6.4%	0.9%	89.1%	0.4%	85.2%	2.2%	0.0%	0.0%
5.00	48.6%	14.6%	2.5%	0.4%	3.4%	0.8%	89.0%	0.9%	50.1%	15.7%	0.0%	0.0%
2.50	27.6%	7.8%	1.8%	0.3%	2.0%	0.5%	87.4%	2.6%	28.1%	7.6%	0.0%	0.0%
1.25	17.1%	2.3%	1.5%	0.3%	1.2%	0.0%	86.2%	0.5%	17.3%	2.3%	0.0%	0.0%
0.63	8.9%	1.4%	1.3%	0.1%	0.8%	0.1%	81.4%	2.2%	9.6%	1.5%	0.0%	0.0%
0.31	3.7%	0.1%	1.2%	0.0%	0.5%	0.0%	68.4%	0.1%	4.5%	0.1%	0.0%	0.0%
0.00	0.0%	0.0%	1.0%	0.1%	0.3%	0.0%	0.0%	0.0%	0.8%	0.1%	0.0%	0.0%
20.00	54.6%	23.3%	3.3%	2.4%	5.7%	2.7%	86.2%	1.8%	49.3%	23.2%	0.0%	0.0%
10.00	52.1%	9.5%	3.4%	0.6%	4.6%	2.1%	86.9%	1.9%	43.0%	15.4%	0.0%	0.0%
5.00	23.2%	7.2%	1.6%	0.3%	2.0%	0.7%	86.6%	0.3%	14.3%	6.6%	0.0%	0.0%
2.50	11.2%	3.7%	1.2%	0.3%	0.9%	0.2%	83.6%	1.7%	6.5%	2.3%	0.0%	0.0%
1.25	6.8%	1.5%	1.1%	0.1%	0.7%	0.0%	78.5%	3.3%	4.5%	1.1%	0.0%	0.0%
0.63	4.4%	0.8%	0.9%	0.1%	0.5%	0.0%	74.9%	2.6%	2.8%	0.4%	0.0%	0.0%
0.31	2.1%	0.2%	1.0%	0.2%	0.3%	0.0%	60.9%	4.6%	1.3%	0.1%	0.0%	0.0%
0.00	0.0%	0.0%	0.7%	0.1%	0.2%	0.0%	0.0%	0.0%	0.3%	0.1%	0.0%	0.0%
G027224/G030120 N=2	20.00	81.9%	3.7%	4.3%	1.3%	8.3%	1.1%	86.8%	1.7%	87.0%	4.8%	0.0%	0.0%
10.00	83.0%	2.1%	3.1%	0.0%	7.6%	0.3%	88.6%	0.5%	87.2%	2.3%	0.0%	0.0%
5.00	72.1%	1.2%	2.6%	0.2%	6.0%	0.5%	89.3%	0.6%	74.5%	1.5%	0.0%	0.0%
2.50	48.8%	1.3%	2.1%	0.0%	3.8%	0.2%	89.2%	0.2%	49.6%	1.3%	0.0%	0.0%
1.25	25.9%	3.5%	1.6%	0.1%	1.8%	0.1%	88.3%	0.9%	25.7%	3.6%	0.0%	0.0%
0.63	11.6%	0.2%	1.5%	0.1%	0.9%	0.1%	82.5%	0.1%	12.1%	0.2%	0.0%	0.0%
0.31	7.4%	0.4%	1.3%	0.1%	0.7%	0.0%	78.1%	2.0%	8.0%	0.2%	0.0%	0.0%
0.00	0.0%	0.0%	1.1%	0.0%	0.3%	0.0%	0.0%	0.0%	0.8%	0.0%	0.0%	0.0%
20.00	82.9%	7.6%	3.2%	0.5%	8.1%	0.6%	88.0%	2.0%	78.9%	11.5%	0.0%	0.0%
10.00	83.4%	1.0%	3.1%	0.2%	8.4%	1.0%	87.8%	1.2%	77.1%	0.2%	0.0%	0.0%
5.00	80.1%	1.7%	2.6%	0.2%	5.8%	0.1%	90.5%	0.1%	70.6%	2.6%	0.0%	0.0%
2.50	69.1%	0.6%	2.2%	0.0%	3.5%	0.4%	92.3%	0.5%	58.9%	1.8%	0.0%	0.0%
1.25	49.9%	1.5%	1.9%	0.1%	1.4%	0.0%	93.9%	0.3%	40.6%	1.7%	0.0%	0.0%
0.63	35.9%	1.5%	1.9%	0.0%	0.7%	0.2%	93.3%	0.2%	29.7%	0.6%	0.0%	0.0%
0.31	22.0%	0.1%	1.7%	0.1%	0.4%	0.0%	91.2%	0.6%	19.5%	0.6%	0.0%	0.0%
0.00	0.3%	0.1%	1.7%	0.1%	0.3%	0.0%	11.3%	3.5%	1.6%	0.4%	0.0%	0.0%
G027224/G030123 N=2	20.00	84.0%	8.1%	5.0%	2.7%	7.3%	2.9%	87.1%	6.2%	90.5%	5.4%	0.0%	0.0%
10.00	68.0%	2.6%	3.1%	0.2%	5.4%	0.9%	89.0%	0.4%	70.3%	2.1%	0.0%	0.0%
5.00	51.7%	4.4%	2.4%	0.2%	3.4%	0.6%	89.9%	0.5%	53.0%	4.3%	0.0%	0.0%
2.50	32.2%	0.4%	1.8%	0.0%	1.9%	0.1%	89.9%	0.1%	32.7%	0.6%	0.0%	0.0%
1.25	16.8%	0.3%	1.4%	0.0%	0.8%	0.0%	88.2%	0.1%	17.1%	0.2%	0.0%	0.0%
0.63	9.2%	0.2%	1.3%	0.0%	0.6%	0.0%	83.4%	0.0%	9.8%	0.3%	0.0%	0.0%
0.31	4.0%	0.4%	1.2%	0.0%	0.4%	0.0%	71.8%	1.5%	4.6%	0.3%	0.0%	0.0%
0.00	0.0%	0.0%	1.0%	0.0%	0.3%	0.0%	0.0%	0.0%	0.9%	0.1%	0.0%	0.0%
20.00	91.9%	4.0%	1.3%	0.4%	1.3%	0.1%	97.3%	0.2%	85.0%	2.5%	0.2%	0.0%
10.00	77.5%	5.6%	0.9%	0.1%	1.2%	0.5%	97.4%	0.5%	70.2%	6.0%	0.3%	0.1%
5.00	55.9%	2.4%	0.9%	0.3%	0.8%	0.1%	97.1%	0.6%	48.7%	2.3%	0.4%	0.1%
2.50	33.8%	0.6%	0.6%	0.1%	0.5%	0.0%	96.9%	0.0%	28.4%	0.1%	0.5%	0.1%
1.25	16.4%	0.2%	0.6%	0.0%	0.3%	0.0%	94.9%	0.3%	12.9%	0.0%	0.4%	0.0%
0.63	7.8%	0.1%	0.4%	0.0%	0.2%	0.0%	92.3%	0.5%	6.3%	0.1%	0.3%	0.0%
0.31	3.8%	1.4%	0.4%	0.0%	0.1%	0.0%	86.7%	4.4%	3.2%	1.2%	0.4%	0.0%
0.00	0.3%	0.1%	0.4%	0.0%	0.1%	0.0%	34.1%	10.0%	0.6%	0.0%	0.4%	0.1%
G030107/G030120 N=2	20.00	81.0%	4.0%	5.2%	1.5%	7.7%	0.1%	86.3%	0.9%	80.0%	6.0%	0.0%	0.0%
10.00	73.3%	7.1%	4.3%	0.0%	9.1%	0.2%	84.5%	1.0%	73.5%	8.5%	0.0%	0.0%
5.00	57.2%	0.3%	3.4%	0.2%	7.3%	0.8%	84.2%	0.8%	56.7%	1.1%	0.0%	0.0%
2.50	37.1%	5.7%	2.5%	0.3%	4.0%	0.6%	85.0%	0.2%	36.2%	6.4%	0.0%	0.0%
1.25	17.8%	0.9%	1.8%	0.0%	2.1%	0.1%	82.3%	0.5%	16.8%	0.1%	0.0%	0.0%
0.63	7.8%	0.1%	1.2%	0.0%	1.1%	0.1%	77.2%	0.3%	6.7%	0.6%	0.0%	0.0%
0.31	3.3%	0.2%	0.9%	0.1%	0.5%	0.0%	69.7%	0.7%	2.9%	0.5%	0.0%	0.0%
0.00	0.0%	0.0%	0.7%	0.0%	0.2%	0.0%	0.0%	0.0%	0.3%	0.0%	0.0%	0.0%
20.00	83.6%	1.3%	3.2%	0.3%	9.8%	1.9%	86.6%	1.8%	79.1%	0.1%	0.0%	0.0%
10.00	80.4%	NA	NA	NA	NA	NA	NA	NA	75.5%	NA	0.0%	NA
5.00	75.5%	0.4%	2.3%	0.1%	5.9%	0.4%	90.2%	0.5%	67.3%	0.6%	0.0%	0.0%
2.50	61.7%	4.7%	2.2%	0.3%	2.9%	0.3%	92.5%	0.3%	53.2%	5.0%	0.0%	0.0%
1.25	46.0%	1.3%	1.9%	0.2%	1.4%	0.2%	93.2%	0.2%	38.2%	1.6%	0.0%	0.0%
0.63	35.1%	1.1%	1.9%	0.0%	0.8%	0.1%	92.9%	0.3%	28.5%	1.3%	0.0%	0.0%
0.31	21.7%	1.2%	1.8%	0.0%	0.4%	0.0%	90.9%	0.4%	18.9%	0.8%	0.0%	0.0%
0.00	0.2%	0.1%	1.6%	0.0%	0.3%	0.0%	7.2%	3.0%	1.5%	0.4%	0.0%	0.0%
G030107/G030123 N=2	20.00	83.3%	NA	NA	NA	NA	NA	NA	NA	79.0%	NA	0.0%	NA
10.00	64.5%	3.3%	3.9%	0.0%	6.2%	0.2%	86.4%	0.4%	60.4%	5.9%	0.0%	0.0%
5.00	46.7%	3.3%	3.1%	0.0%	4.3%	0.4%	86.3%	0.2%	40.3%	2.7%	0.0%	0.0%
2.50	32.1%	3.1%	2.2%	0.1%	3.1%	0.1%	85.9%	0.7%	26.7%	4.7%	0.0%	0.0%
1.25	17.7%	1.3%	1.4%	0.2%	1.5%	0.1%	85.6%	0.5%	13.4%	1.0%	0.0%	0.0%
0.63	8.7%	0.5%	1.2%	0.1%	0.8%	0.0%	81.3%	1.4%	5.8%	0.2%	0.0%	0.0%
0.31	3.0%	0.1%	1.0%	0.0%	0.4%	0.0%	68.9%	0.3%	1.5%	0.1%	0.0%	0.0%
0.00	0.0%	0.0%	0.7%	0.1%	0.2%	0.0%	0.0%	0.0%	0.3%	0.0%	0.0%	0.0%
20.00	94.6%	0.0%	1.0%	0.0%	1.3%	0.1%	97.7%	0.2%	86.6%	0.8%	0.3%	0.1%
10.00	80.9%	3.6%	1.1%	0.2%	1.0%	0.0%	97.6%	0.1%	73.4%	3.4%	0.2%	0.0%
5.00	64.9%	1.0%	0.9%	0.1%	1.0%	0.1%	97.2%	0.3%	58.0%	1.3%	0.3%	0.1%
2.50	45.4%	4.8%	0.8%	0.1%	0.7%	0.1%	96.8%	0.7%	40.4%	4.5%	0.3%	0.0%
1.25	22.5%	0.7%	0.6%	0.0%	0.3%	0.0%	96.1%	0.2%	19.2%	0.2%	0.3%	0.0%
0.63	9.6%	0.2%	0.5%	0.0%	0.2%	0.1%	93.3%	0.6%	8.0%	0.6%	0.3%	0.0%
0.31	3.2%	0.0%	0.4%	0.1%	0.2%	0.0%	84.4%	1.5%	3.0%	0.2%	0.4%	0.0%
0.00	0.2%	0.0%	0.3%	0.1%	0.1%	0.0%	29.8%	4.0%	0.6%	0.0%	0.4%	0.1%
G030120/G030123 N=2	20.00	81.5%	1.2%	3.4%	1.1%	10.6%	3.5%	85.4%	4.2%	77.6%	0.3%	0.0%	0.0%
10.00	78.6%	2.1%	2.6%	0.0%	7.0%	1.7%	89.1%	1.5%	71.1%	2.2%	0.0%	0.0%
5.00	68.7%	4.9%	2.3%	0.3%	3.6%	0.3%	92.2%	0.1%	56.2%	3.5%	0.0%	0.0%
2.50	55.1%	4.0%	2.3%	0.4%	2.2%	0.4%	92.5%	0.7%	46.6%	2.8%	0.0%	0.0%
1.25	46.4%	0.0%	2.1%	0.0%	1.4%	0.3%	93.0%	0.5%	38.1%	1.1%	0.0%	0.0%
0.63	34.3%	3.0%	1.8%	0.0%	0.8%	0.0%	92.9%	0.5%	28.3%	1.8%	0.0%	0.0%
0.31	24.0%	2.9%	1.9%	0.1%	0.5%	0.0%	90.9%	1.4%	20.4%	1.9%	0.0%	0.0%
0.00	0.3%	0.2%	2.1%	0.5%	0.3%	0.1%	8.5%	5.4%	2.2%	0.5%	0.0%	0.0%
20.00	92.2%	2.6%	1.3%	0.1%	1.0%	0.3%	97.6%	0.4%	83.3%	3.8%	0.3%	0.1%
10.00	78.9%	7.6%	0.8%	0.0%	1.1%	0.4%	97.6%	0.3%	70.9%	6.4%	0.3%	0.1%
5.00	59.4%	7.1%	0.9%	0.1%	1.0%	0.1%	97.0%	0.3%	53.0%	5.8%	0.4%	0.1%
2.50	39.7%	3.5%	0.6%	0.1%	0.8%	0.0%	96.6%	0.5%	35.4%	2.9%	0.5%	0.1%
1.25	32.0%	0.4%	0.7%	0.0%	0.6%	0.0%	96.1%	0.1%	28.5%	0.5%	0.4%	0.1%
0.63	14.6%	0.4%	0.4%	0.0%	0.3%	0.0%	95.2%	0.2%	12.9%	0.5%	0.4%	0.1%
0.31	5.5%	0.3%	0.4%	0.0%	0.2%	0.0%	89.9%	1.0%	5.1%	0.4%	0.4%	0.0%
0.00	0.2%	0.0%	0.4%	0.0%	0.1%	0.0%	29.5%	1.5%	0.6%	0.1%	0.3%	0.0%
G030107/G030115 N=2	20.00	75.4%	11.8%	5.7%	0.8%	7.7%	0.2%	84.8%	1.1%	69.5%	11.8%	0.0%	0.0%
10.00	63.1%	17.7%	3.8%	1.8%	6.2%	3.5%	86.7%	3.0%	56.5%	25.6%	0.0%	0.0%
5.00	40.4%	23.4%	2.5%	1.1%	3.4%	2.3%	87.1%	0.1%	32.1%	22.6%	0.0%	0.0%
2.50	22.2%	8.6%	1.8%	0.4%	1.8%	0.8%	85.8%	0.5%	17.2%	7.8%	0.0%	0.0%
1.25	13.3%	6.9%	1.4%	0.5%	1.2%	0.5%	83.3%	2.3%	9.8%	5.8%	0.0%	0.0%
0.63	6.0%	0.6%	1.1%	0.0%	0.6%	0.1%	78.1%	2.3%	4.1%	0.2%	0.0%	0.0%
0.31	3.0%	0.8%	1.0%	0.1%	0.4%	0.1%	67.9%	4.1%	2.2%	0.5%	0.0%	0.0%
0.00	0.0%	0.0%	0.7%	0.0%	0.2%	0.0%	0.0%	0.0%	0.3%	0.0%	0.0%	0.0%
20.00	85.1%	7.4%	2.1%	0.1%	2.4%	1.2%	95.1%	1.0%	87.1%	7.5%	0.0%	0.0%
10.00	81.0%	8.1%	1.4%	0.0%	1.7%	0.2%	96.4%	0.1%	83.3%	9.1%	0.0%	0.0%
5.00	57.9%	4.1%	1.3%	0.0%	1.4%	0.1%	95.5%	0.5%	58.5%	4.9%	0.0%	0.0%
2.50	37.2%	12.7%	1.2%	0.2%	1.1%	0.2%	94.1%	0.9%	38.1%	12.5%	0.0%	0.0%
1.25	22.0%	5.2%	1.0%	0.0%	0.9%	0.2%	91.8%	1.0%	22.6%	4.9%	0.0%	0.0%
0.63	11.7%	2.5%	1.1%	0.0%	0.9%	0.1%	85.4%	2.1%	12.0%	2.2%	0.0%	0.0%
0.31	6.5%	1.6%	1.1%	0.0%	0.8%	0.0%	77.0%	4.0%	7.6%	1.3%	0.0%	0.0%
0.00	0.2%	0.1%	0.9%	0.1%	0.8%	0.0%	8.1%	3.3%	1.1%	0.0%	0.0%	0.0%
G030120/G030115 N=2	20.00	78.8%	0.1%	3.2%	1.1%	14.3%	3.0%	81.9%	3.4%	71.8%	1.3%	0.0%	0.0%
10.00	78.6%	6.2%	2.7%	0.2%	10.0%	1.5%	86.2%	0.6%	64.2%	6.4%	0.0%	0.0%
5.00	79.4%	3.6%	2.1%	0.0%	7.6%	1.1%	89.1%	0.7%	63.7%	5.7%	0.0%	0.0%
2.50	69.2%	0.6%	1.9%	0.0%	4.2%	0.1%	91.9%	0.1%	53.4%	1.1%	0.0%	0.0%
1.25	55.2%	3.9%	1.9%	0.1%	1.6%	0.4%	94.0%	0.4%	39.7%	4.9%	0.0%	0.0%
0.63	37.4%	0.8%	2.0%	0.2%	0.9%	0.0%	92.9%	0.5%	29.2%	0.2%	0.0%	0.0%
0.31	24.6%	1.2%	1.9%	0.0%	0.5%	0.0%	91.2%	0.4%	21.1%	0.6%	0.0%	0.0%
0.00	0.2%	0.1%	1.8%	0.1%	0.2%	0.0%	6.8%	3.1%	1.6%	0.2%	0.0%	0.0%
20.00	80.9%	2.3%	1.8%	0.4%	10.7%	2.8%	86.7%	2.6%	84.4%	6.5%	0.0%	0.0%
10.00	47.2%	27.3%	3.5%	3.0%	11.7%	7.1%	72.5%	23.8%	44.2%	38.9%	0.0%	0.0%
5.00	61.1%	2.1%	1.2%	0.0%	5.7%	0.6%	89.8%	1.0%	66.5%	1.3%	0.0%	0.0%
2.50	49.6%	3.3%	1.4%	0.1%	4.0%	0.0%	90.3%	0.5%	52.9%	2.8%	0.0%	0.0%
1.25	29.5%	3.7%	1.2%	0.0%	2.2%	0.0%	89.6%	1.2%	30.1%	3.6%	0.0%	0.0%
0.63	16.4%	0.1%	1.1%	0.1%	1.7%	0.4%	85.5%	1.5%	16.9%	0.6%	0.0%	0.0%
0.31	7.5%	0.6%	1.1%	0.0%	1.1%	0.1%	77.1%	0.6%	8.1%	0.8%	0.0%	0.0%
0.00	0.2%	0.1%	1.0%	0.1%	0.9%	0.0%	7.2%	2.9%	1.1%	0.1%	0.0%	0.0%
G030107/G030162 N=2	20.00	85.1%	3.5%	5.2%	1.4%	7.5%	1.0%	87.0%	2.5%	85.6%	0.1%	0.0%	0.0%
10.00	81.2%	0.9%	5.6%	0.1%	8.4%	1.7%	85.3%	1.6%	83.1%	0.6%	0.0%	0.0%
5.00	71.9%	2.3%	4.4%	0.0%	8.1%	0.3%	85.2%	0.2%	73.2%	2.6%	0.0%	0.0%
2.50	58.2%	1.3%	4.2%	0.4%	6.3%	0.4%	84.7%	0.7%	59.6%	1.3%	0.0%	0.0%
1.25	24.0%	0.6%	2.2%	0.0%	2.5%	0.1%	83.8%	0.1%	24.6%	1.1%	0.0%	0.0%
0.63	9.7%	1.8%	1.4%	0.0%	1.1%	0.3%	79.2%	0.8%	9.6%	1.7%	0.0%	0.0%
0.31	3.5%	0.2%	1.2%	0.1%	0.6%	0.0%	66.4%	3.0%	3.7%	0.2%	0.0%	0.0%
0.00	0.0%	0.0%	0.7%	0.1%	0.2%	0.0%	0.0%	0.0%	0.4%	0.1%	0.0%	0.0%
20.00	93.9%	0.1%	3.1%	1.2%	1.1%	0.7%	95.8%	1.8%	97.3%	1.1%	0.0%	0.0%
10.00	93.3%	0.8%	2.5%	0.3%	2.1%	0.6%	95.3%	0.9%	96.6%	0.1%	0.0%	0.0%
5.00	85.1%	6.6%	2.2%	0.2%	1.7%	0.0%	95.6%	0.5%	88.0%	6.6%	0.0%	0.0%
2.50	75.1%	2.7%	2.2%	0.1%	1.5%	0.0%	95.2%	0.3%	77.9%	2.8%	0.0%	0.0%
1.25	37.6%	0.4%	1.8%	0.3%	1.0%	0.1%	93.1%	0.8%	39.0%	0.9%	0.0%	0.0%
0.63	16.0%	2.3%	1.4%	0.1%	0.9%	0.3%	87.9%	0.1%	17.6%	2.3%	0.0%	0.0%
0.31	7.3%	2.0%	1.3%	0.1%	0.6%	0.0%	79.5%	4.6%	8.3%	2.4%	0.0%	0.0%
0.00	0.0%	0.0%	0.8%	0.0%	0.2%	0.0%	0.0%	0.0%	0.9%	0.4%	0.0%	0.0%
G030107/G030115/G030162 N=2	20.00	82.3%	0.4%	5.0%	1.2%	8.1%	3.0%	86.3%	3.8%	81.9%	3.4%	0.0%	0.0%
10.00	75.3%	3.9%	4.6%	0.2%	8.7%	0.5%	85.0%	1.4%	76.9%	2.5%	0.0%	0.0%
5.00	56.7%	0.1%	4.0%	0.0%	6.6%	0.6%	84.3%	0.7%	58.2%	0.6%	0.0%	0.0%
2.50	42.1%	1.8%	3.2%	0.1%	4.5%	0.1%	84.6%	0.7%	42.9%	1.7%	0.0%	0.0%
1.25	20.0%	0.5%	1.8%	0.2%	2.1%	0.3%	83.8%	1.4%	19.2%	2.0%	0.0%	0.0%
0.63	6.3%	0.4%	1.2%	0.1%	0.9%	0.1%	74.8%	1.6%	6.4%	0.1%	0.0%	0.0%
0.31	2.7%	0.2%	1.0%	0.1%	0.5%	0.0%	64.6%	3.2%	2.7%	0.2%	0.0%	0.0%
0.00	0.0%	0.0%	0.8%	0.0%	0.2%	0.0%	0.0%	0.0%	0.4%	0.1%	0.0%	0.0%
20.00	87.3%	3.8%	1.7%	0.6%	2.0%	0.6%	95.9%	1.0%	84.6%	10.4%	0.0%	0.0%
10.00	81.9%	3.7%	1.8%	0.3%	1.7%	0.4%	95.8%	0.3%	84.8%	3.0%	0.0%	0.0%
5.00	67.8%	5.7%	1.2%	0.0%	1.8%	0.1%	95.7%	0.1%	69.8%	5.9%	0.0%	0.0%
2.50	52.0%	1.7%	1.5%	0.3%	1.5%	0.3%	94.4%	0.8%	53.6%	1.8%	0.0%	0.0%
1.25	26.6%	1.4%	1.1%	0.1%	1.1%	0.2%	92.6%	0.7%	27.2%	1.3%	0.0%	0.0%
0.63	11.4%	0.1%	1.0%	0.1%	0.9%	0.1%	85.7%	1.7%	12.0%	0.0%	0.0%	0.0%
0.31	5.1%	0.4%	1.1%	0.2%	1.0%	0.2%	70.5%	5.8%	6.2%	0.1%	0.0%	0.0%
0.00	0.2%	0.0%	1.1%	0.1%	0.9%	0.1%	9.2%	0.6%	1.2%	0.4%	0.0%	0.0%
20.00	93.7%	0.4%	2.7%	0.2%	2.4%	0.9%	94.8%	1.1%	97.5%	0.1%	0.0%	0.0%
10.00	86.7%	NA	NA	NA	NA	NA	NA	NA	90.3%	NA	0.0%	NA
5.00	82.0%	2.7%	2.5%	0.1%	1.7%	0.0%	95.2%	0.0%	85.3%	3.4%	0.0%	0.0%
2.50	57.5%	1.3%	1.9%	0.3%	1.2%	0.2%	94.9%	0.7%	59.5%	1.4%	0.0%	0.0%
1.25	30.4%	0.1%	1.4%	0.0%	0.9%	0.0%	92.8%	0.1%	31.8%	0.4%	0.0%	0.0%
0.63	10.7%	0.1%	1.1%	0.1%	0.7%	0.0%	85.6%	0.5%	11.8%	0.3%	0.0%	0.0%
0.31	5.1%	0.1%	1.0%	0.0%	0.5%	0.1%	77.2%	1.0%	6.2%	0.5%	0.0%	0.0%
0.00	0.0%	0.0%	0.8%	0.0%	0.3%	0.1%	0.0%	0.0%	0.9%	0.4%	0.0%	0.0%
G030107/G030120/G030115 N=2	20.00	80.0%	1.3%	5.6%	0.5%	9.3%	0.1%	84.3%	0.6%	81.0%	4.2%	0.0%	0.0%
10.00	75.9%	0.6%	4.9%	0.5%	10.6%	0.9%	83.0%	1.2%	76.7%	0.4%	0.0%	0.0%
5.00	60.7%	6.7%	3.7%	0.7%	7.7%	0.3%	84.3%	0.4%	61.4%	7.6%	0.0%	0.0%
2.50	50.4%	1.7%	3.2%	0.2%	5.5%	0.4%	85.2%	0.8%	51.0%	2.5%	0.0%	0.0%
1.25	19.1%	2.4%	1.6%	0.2%	2.7%	0.3%	81.6%	0.2%	19.2%	2.5%	0.0%	0.0%
0.63	8.1%	1.9%	1.3%	0.0%	1.2%	0.3%	76.5%	2.2%	7.9%	1.8%	0.0%	0.0%
0.31	3.2%	0.1%	1.0%	0.1%	0.6%	0.1%	67.5%	2.7%	2.9%	0.1%	0.0%	0.0%
0.00	0.0%	0.0%	0.7%	0.0%	0.2%	0.0%	0.0%	0.0%	0.3%	0.0%	0.0%	0.0%
20.00	83.4%	0.9%	2.2%	0.8%	12.3%	0.3%	85.2%	0.5%	75.8%	3.9%	0.0%	0.0%
10.00	82.9%	1.6%	2.0%	0.2%	11.1%	1.4%	86.4%	1.3%	76.6%	0.2%	0.0%	0.0%
5.00	78.5%	4.4%	2.3%	0.7%	7.3%	0.1%	89.0%	0.0%	70.2%	5.1%	0.0%	0.0%
2.50	72.2%	0.6%	2.0%	0.1%	5.1%	0.4%	91.1%	0.6%	62.0%	0.1%	0.0%	0.0%
1.25	50.3%	2.2%	1.9%	0.2%	2.2%	0.1%	92.4%	0.8%	41.6%	2.0%	0.0%	0.0%
0.63	33.4%	4.7%	1.7%	0.1%	0.9%	0.1%	92.6%	0.6%	27.6%	3.7%	0.0%	0.0%
0.31	22.2%	0.8%	1.8%	0.1%	0.5%	0.0%	90.7%	0.5%	19.4%	0.4%	0.0%	0.0%
0.00	0.1%	0.0%	1.7%	0.1%	0.3%	0.0%	4.7%	0.3%	1.8%	0.0%	0.0%	0.0%
20.00	83.4%	2.8%	1.3%	0.5%	8.8%	1.1%	89.2%	0.2%	87.6%	3.8%	0.0%	0.0%
10.00	76.6%	0.2%	1.7%	0.2%	8.6%	0.8%	88.1%	0.6%	83.5%	0.9%	0.0%	0.0%
5.00	67.9%	7.3%	1.4%	0.1%	6.2%	0.5%	90.0%	0.5%	73.6%	7.5%	0.0%	0.0%
2.50	55.5%	1.0%	1.1%	0.0%	4.3%	0.2%	91.0%	0.2%	58.6%	1.6%	0.0%	0.0%
1.25	27.7%	5.0%	1.1%	0.2%	2.1%	0.3%	89.6%	0.3%	28.5%	4.8%	0.0%	0.0%
0.63	13.6%	3.2%	1.1%	0.1%	1.3%	0.0%	84.7%	2.5%	14.2%	2.5%	0.0%	0.0%
0.31	6.7%	0.4%	1.1%	0.1%	1.1%	0.0%	75.9%	1.6%	7.2%	0.2%	0.0%	0.0%
0.00	0.2%	0.1%	1.0%	0.1%	0.8%	0.0%	7.6%	3.5%	1.0%	0.1%	0.0%	0.0%
G030107/G030120/G030123 N=2	20.00	80.6%	4.0%	4.9%	1.3%	9.9%	2.1%	84.4%	3.7%	79.2%	1.0%	0.0%	0.0%
10.00	66.1%	14.6%	4.5%	0.9%	8.5%	2.5%	83.7%	0.6%	67.1%	14.3%	0.0%	0.0%
5.00	44.5%	4.2%	2.9%	0.5%	5.1%	1.5%	84.8%	2.1%	44.8%	4.7%	0.0%	0.0%
2.50	38.2%	6.3%	2.6%	0.4%	4.7%	0.1%	83.9%	1.3%	38.4%	5.4%	0.0%	0.0%
1.25	17.3%	9.1%	1.7%	0.3%	2.0%	0.9%	81.4%	3.5%	17.9%	9.2%	0.0%	0.0%
0.63	9.3%	0.2%	1.3%	0.1%	1.4%	0.1%	77.4%	0.6%	9.5%	0.8%	0.0%	0.0%
0.31	3.4%	0.4%	0.9%	0.1%	0.6%	0.0%	68.8%	1.3%	3.5%	0.8%	0.0%	0.0%
0.00	0.1%	0.1%	0.7%	0.1%	0.2%	0.0%	4.5%	6.4%	0.3%	0.1%	0.0%	0.0%
20.00	86.1%	1.8%	3.5%	0.7%	9.0%	1.5%	87.3%	0.9%	79.8%	2.8%	0.0%	0.0%
10.00	79.5%	7.5%	2.5%	0.4%	5.6%	0.6%	90.7%	0.2%	73.3%	9.8%	0.0%	0.0%
5.00	64.4%	10.3%	2.1%	0.1%	4.6%	1.8%	90.6%	1.2%	58.1%	10.7%	0.0%	0.0%
2.50	64.6%	1.0%	2.2%	0.0%	3.4%	0.7%	92.0%	1.1%	56.8%	0.0%	0.0%	0.0%
1.25	41.4%	11.6%	1.9%	0.0%	1.2%	0.2%	92.8%	1.5%	35.9%	9.3%	0.0%	0.0%
0.63	31.6%	1.2%	1.9%	0.0%	0.9%	0.1%	92.0%	0.6%	26.5%	0.8%	0.0%	0.0%
0.31	20.0%	0.4%	1.8%	0.1%	0.5%	0.1%	89.6%	0.6%	17.4%	0.4%	0.0%	0.0%
0.00	0.2%	0.1%	1.8%	0.0%	0.3%	0.0%	6.6%	2.9%	1.5%	0.4%	0.0%	0.0%
20.00	91.3%	1.3%	1.4%	0.6%	1.2%	0.0%	97.2%	0.7%	82.1%	2.7%	0.3%	0.0%
10.00	79.7%	9.8%	0.8%	0.1%	1.5%	0.0%	97.2%	0.3%	69.6%	5.9%	0.3%	0.1%
5.00	59.9%	10.5%	0.7%	0.0%	0.9%	0.0%	97.4%	0.4%	53.8%	9.5%	0.4%	0.2%
2.50	52.6%	3.3%	0.8%	0.1%	0.9%	0.1%	97.0%	0.1%	47.4%	2.5%	0.3%	0.0%
1.25	25.5%	10.0%	0.6%	0.2%	0.4%	0.2%	96.1%	0.0%	22.3%	8.6%	0.4%	0.1%
0.63	14.7%	1.5%	0.5%	0.0%	0.3%	0.0%	94.8%	0.5%	13.5%	1.1%	0.4%	0.1%
0.31	5.3%	1.6%	0.4%	0.0%	0.2%	0.0%	89.1%	2.1%	5.0%	1.3%	0.3%	0.0%
0.00	0.3%	0.1%	0.4%	0.0%	0.1%	0.0%	32.5%	7.7%	0.7%	0.0%	0.4%	0.1%

表31 - 藉由MSD檢定量測之分泌的HBsAg減弱百分比。

嚮導	G030107/ G030115	G030120/ G030115	G030107/ G030162	G030107/ G030115/ G030162	G030107/ G030120/ G030115	G030107/ G030120/ G030123
劑量	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD
20			97.20	0.42	97.20	0.42	97.45	0.78	97.45	0.78	98.00	0.00
10	97.70	0.00	98.15	0.64	98.15	1.34	99.10	0.71	98.40	0.28	99.10	0.35
5	95.50	1.56	96.55	1.48	98.00	0.00	98.65	1.48	99.00	0.99	97.30	0.99
2.5	90.65	5.44	94.50	0.42	95.40	0.42	93.60	0.85	97.80	0.00	93.50	2.19
1.25	77.30	7.50	87.25	2.19	87.65	1.63	84.80	1.56	91.00	1.13	85.90	4.17
0.625	61.30	7.21	67.25	2.47	68.45	2.47	62.90	3.25	76.50	3.68	71.05	2.86
0.3125	41.85	2.05	45.85	2.05	46.60	1.84	18.00	33.66	57.70	3.82	56.70	4.24
0	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00
嚮導	G027224/ G030107	G027224/ G030120	G027224/ G030123	G030107/ G030120	G030107/ G030123	G030120/ G030123
劑量	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD
20	99.05	0.78	96.40	n/a	99.60	n/a	99.00	n/a
10	98.65	0.64	98.40	0.99	98.60	n/a	99.10	0.71			99.60	n/a
5	96.35	1.77	98.15	1.20	98.35	0.49	99.05	0.49	99.00	0.99	98.50	0.71
2.5	92.45	2.05	96.30	0.42	91.60	1.27	97.65	0.21	95.40	0.42	94.05	0.64
1.25	82.85	4.03	90.45	0.78	74.60	0.42	90.45	1.20	85.80	0.14	84.50	2.40
0.625	70.15	5.73	78.00	2.83	57.35	1.63	82.45	0.64	69.30	0.85	74.50	2.83
0.3125	46.10	8.91	54.40	0.00	29.45	4.45	61.40	0.57	48.30	1.41	54.60	3.82
0	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00
嚮導	G030107/ G030120 ( 共同調配物)
劑量	平均值	SD
20
10
5
2.5	98.35	0.35
1.25	91.85	0.78
0.625	79.55	0.64
0.3125	58.55	0.21
0	0.00	0.00

實例9 - 使用脂質奈米顆粒在HBV感染之原代人類肝細胞中以單一及多重組合測試之Nme2-BC22n嚮導

Nme2-BC22n先導嚮導在HBV感染之PHH模型中以單一及多重組合進行了測試。遞送連續稀釋之LNP，以經由分泌的HBsAg減弱(MSD)及總細胞內HBV DNA減弱(ddPCR)評估多嚮導處理相對於單嚮導處理之組合效果。 9.1. 細 胞培養、感染及LNP遞送

將原代人類肝細胞(ThermoFisher，HU8345)解凍並在CHRM培養基(Gibco，CM7000)中回收。將細胞重懸於由William's E培養基(Gibco，A1217601)、肝細胞鋪板補充劑(Gibco，CM3000)及5%胎牛血清(Gibco，A13450)組成之原代人類肝細胞鋪板培養基中。將它們以30,000個細胞/孔的密度鋪板在膠原蛋白包被之96孔板中。在六小時後，去除鋪板培養基並更換為由William's E培養基、肝細胞維持補充劑(Gibco，CM4000)組成的原代肝細胞維持培養基。

在一天后，去除培養基並更換為含有2% DMSO之維持培養基，持續兩小時。去除培養基並更換為含有HBV接種物之培養基，該培養基由維持培養基、4% PEG-8000及病毒接種物(MOI 50) (病毒接種物根據實例1.5製備)組成。未感染之細胞僅接受含有4% PEG-8000之維持培養基。將板在37℃下以1000g離心30分鐘，然後移至培養箱。二十四小時及四十八小時後，去除培養基並更換為補充有2% DMSO及2% FBS之維持培養基。

上次培養基更換後四天，在補充有6% FBS之維持培養基中遞送連續稀釋之LNP，總貨物質量範圍為300 ng至0 ng，使用10-pt、3倍稀釋方案進行滴定。所有LNP，包括靶向人類SCAP之對照gRNA，均以1:2:0.3 gRNA:Nme2-BC22n:UGI之貨物比調配。藉由在連續稀釋之前以1:1之比率添加不同的gRNA LNP來形成多重組合。將培養基-LNP混合物在37℃下孵育10分鐘，然後添加到HBV感染的PHH細胞中。遞送總體積為100 μL/孔之培養基-LNP混合物。

在三天及五天時以補充有2% DMSO及2% FBS之新鮮維持培養基更換培養基。最後一次培養基更換後，將細胞再孵育五天，然後收集培養基進行HBsAg量測，並使用QE緩衝液裂解細胞以獲得總HBV DNA拷貝數。 9.2. 量 測分泌的HbsAg及細胞內HBV DNA減弱

如實例1.6所述進行分泌的HbsAg之量測。為了確定各樣品水準之HbsAg絕對水準，使用標準HbsAg蛋白之四參數非線性曲線對每個孔之背景扣除訊號進行插值(interpolated)。為了確定分泌的HbsAg之相對減弱，將各樣品之絕對水準除以相同劑量之LNP的SCAP對照重複份之平均值。

以ddPCR (Bio-Rad)量測細胞內HBV DNA拷貝數。按照製造商的方案，使用針對HBV基因體及Hs肌動蛋白β (ACTB)基因之保守區設計之引子，使用ddPCR Supermix探針(Bio-Rad，1863024)準備ddPCR反應，並在液滴讀數器上讀出。藉由將HBV拷貝數/uL以ACTB拷貝數/uL作正規化來分析各樣品之HBV水準。為了確定相對減弱，將各樣品之管家正規化的HBV拷貝數除以相同劑量之LNP的SCAP對照重複份之平均值。

HbsAg減弱百分比資料如 表32及 圖15所示。HBV DNA拷貝數減少百分比如 表33及 圖16所示。 表32：使用單一及多重HBV嚮導之HbsAg減弱百分比

嚮導劑量(ng)	G027224	G030107	G030115	G030120
平均值	SD	N	平均值	SD	N	平均值	SD	N	平均值	SD	N
90.90	91.2	2.6	3	94.9	0.6	3	95.4	0.3	3	95.8	0.3	3
30.30	97.6	0.7	3	98.2	0.4	3	98.6	0.3	3	98.5	0.2	3
10.10	96.0	1.1	3	96.6	1.0	3	93.3	0.8	3	97.2	0.3	3
3.37	97.3	0.4	3	97.1	0.3	3	91.6	0.9	3	96.5	0.5	3
1.12	96.4	0.6	3	89.1	2.1	3	74.2	3.0	3	93.4	0.2	3
0.37	79.6	0.6	3	48.6	8.9	3	21.1	3.5	3	76.6	2.2	3
0.12	38.9	1.6	3	0.9	1.6	3	0.0	0.0	3	26.4	8.1	3
0.04	9.9	8.6	3	0.0	0.0	3	0.0	0.0	3	0.0	0.0	3
0.01	9.1	15.7	3	0.0	0.0	3	0.0	0.0	3	0.0	0.0	3
0.00	9.0	3.4	3	0.0	0.0	3	0.0	0.0	3	1.3	2.3	3
嚮導劑量(ng)	G030107/G030120	G027224/G030115	G027224/G030120	G021514 SCAP
平均值	SD	N	平均值	SD	N	平均值	SD	N	平均值	SD	N
90.90	96.0	0.2	3	LLOD	N/A	3	LLOD	N/A	3	17.3	18.4	3
30.30	99.0	0.0	3	99.1	0.0	3	99.1	0.0	3	6.2	10.7	3
10.10	98.2	0.4	3	98.2	0.2	3	98.4	0.2	3	2.7	3.4	3
3.37	98.6	0.1	3	98.6	0.2	3	98.7	0.3	3	3.4	3.5	3
1.12	97.6	0.3	3	94.1	0.7	3	97.9	0.3	3	2.8	4.6	3
0.37	81.1	0.8	3	67.8	4.5	3	83.2	4.8	3	4.1	7.1	3
0.12	20.4	3.2	3	31.9	18.0	3	40.8	1.9	3	2.0	3.5	3
0.04	0.0	0.0	3	33.1	5.9	3	33.8	3.1	3	0.2	0.4	3
0.01	0.0	0.0	3	23.8	15.7	3	24.3	1.2	3	1.2	1.9	3
0.00	0.0	0.0	3	50.2	41.7	3	23.8	6.4	3	6.0	9.8	3

表33：使用單一及多重HBV嚮導之HBV DNA拷貝數減少百分比

嚮導劑量(ng)	G027224	G030107	G030115	G030120
平均值	SD	N	平均值	SD	N	平均值	SD	N	平均值	SD	N
90.90	78.9	6.3	3	55.0	6.3	3	58.7	4.4	3	73.8	3.1	3
30.30	83.6	6.5	3	75.7	3.1	3	74.1	3.8	3	83.0	2.1	3
10.10	77.0	1.0	3	81.5	1.5	3	80.4	2.0	3	82.3	4.0	3
3.37	79.6	1.9	3	87.4	5.6	3	82.4	1.3	3	87.9	1.8	3
1.12	85.2	7.0	3	81.4	4.5	3	70.4	3.2	3	88.5	0.6	3
0.37	45.3	8.7	3	61.6	3.3	3	39.7	3.9	3	74.9	1.7	3
0.12	20.8	3.2	3	21.8	3.7	3	20.6	9.2	3	40.8	3.4	3
0.04	4.4	7.6	3	20.0	4.4	3	11.4	14.7	3	7.2	12.4	3
0.01	16.4	13.6	3	16.5	11.0	3	16.7	0.6	3	20.0	12.5	3
0.00	2.9	2.6	3	13.1	18.5	3	9.2	15.9	3	0.0	0.0	3
嚮導劑量(ng)	G030107/G030120	G027224/G030115	G027224/G030120	G021514 SCAP
平均值	SD	N	平均值	SD	N	平均值	SD	N	平均值	SD	N
90.90	7.9	13.7	3	61.8	9.9	3	64.4	9.8	3	0.9	1.5	3
30.30	28.2	23.9	3	81.4	4.0	3	79.8	2.5	3	3.5	6.0	3
10.10	85.6	2.9	3	82.4	1.7	3	80.9	3.9	3	3.9	4.0	3
3.37	87.8	1.3	3	85.9	2.3	3	85.2	1.6	3	0.8	1.4	3
1.12	87.4	2.2	3	80.2	4.1	3	84.0	1.8	3	3.9	6.6	3
0.37	74.1	1.8	3	42.5	12.0	3	67.9	1.3	3	1.8	1.6	3
0.12	43.1	11.0	3	9.1	9.4	3	23.7	6.6	3	5.0	8.6	3
0.04	19.0	7.9	3	16.4	14.7	3	17.7	3.5	3	2.7	3.2	3
0.01	14.0	7.8	3	17.9	19.7	3	14.3	6.2	3	3.0	2.6	3
0.00	5.2	4.6	3	17.9	15.5	3	3.1	5.3	3	4.5	5.2	3

實例10 - 使用脂質奈米顆粒在HBV感染之原代人類肝細胞中比較不同修飾模式之有效HBV靶向Nme2-BC22n gRNA

針對不同的支架修飾模式對三種不同的Nme2-BC22n先導間隔子序列進行了頭對頭測試，以確定HBV感染的PHH中的效力差異。LNP劑量反應曲線經由分泌的HBsAg減弱(MSD)來評估效力。

如實例9.1中進行細胞培養、感染及LNP遞送。 10.1. 量 測分泌的HBsAg減弱

如實例1.6所述進行分泌的HBsAg之量測。為了確定各樣品水準之HBsAg絕對水準，使用標準HBsAg蛋白之四參數非線性曲線對各孔之背景扣除訊號進行插值。根據各HBsAg減弱曲線計算gRNA減弱IC50 (nM gRNA)，並將一種修飾模式之IC50與另一種修飾模式進行比較以確定統計學顯著性。不同修飾模式之間的HBsAg減弱效力沒有統計學差異。

HBsAg濃度(ng/ml)如 表34及 圖17所示。HBsAg IC50資料如 表35及 圖18所示。 表34：使用不同修飾模式之嚮導進行處理後之HBsAg濃度(ng/mL)

濃度(nM)	G027224	G021514 (SCAP)	G030115	G030120
平均值	SD	N	平均值	SD	N	平均值	SD	N	平均值	SD	N
45.834	0.008	0.002	3	0.018	0.005	3	0.008	0.001	3	0.008	0.001	3
15.278	0.010	0.003	3	0.268	0.253	3	0.008	0.001	3	0.009	0.002	3
5.093	0.016	0.007	3	0.980	0.265	3	0.021	0.009	3	0.020	0.005	3
1.698	0.019	0.006	3	1.019	0.313	3	0.046	0.014	3	0.025	0.004	3
0.566	0.059	0.018	3	0.912	0.233	3	0.129	0.038	3	0.042	0.006	3
0.189	0.322	0.104	3	0.929	0.298	3	0.428	0.164	3	0.177	0.082	3
0.063	0.832	0.266	3	0.874	0.257	3	0.860	0.259	3	0.596	0.192	3
0.021	0.875	0.304	3	0.810	0.162	3	0.774	0.217	3	0.849	0.252	3
0.007	0.999	0.207	3	0.828	0.240	3	0.917	0.228	3	0.877	0.217	3
0.002	1.038	0.254	3	0.936	0.176	3	1.032	0.220	3	0.930	0.189	3
0.0008	1.183	0.241	3	0.984	0.237	3	1.078	0.139	3	1.037	0.109	3
0.000	0.834	0.092	3	1.134	0.311	3	1.041	0.079	3	1.300	0.168	3
濃度(nM)	G034393/G027224 Equiv	G034395/G030115 Equiv	G034396/G030120 Equiv
平均值	SD	N	平均值	SD	N	平均值	SD	N
45.834	0.011	0.003	3	0.008	0.001	3	0.008	0.001	3
15.278	0.011	0.003	3	0.008	0.001	3	0.011	0.002	3
5.093	0.018	0.002	3	0.024	0.009	3	0.019	0.006	3
1.698	0.020	0.007	3	0.047	0.015	3	0.024	0.004	3
0.566	0.110	0.044	3	0.140	0.057	3	0.052	0.018	3
0.189	0.479	0.222	3	0.489	0.173	3	0.185	0.062	3
0.063	0.731	0.229	3	0.819	0.242	3	0.594	0.184	3
0.021	0.858	0.199	3	0.878	0.281	3	0.803	0.266	3
0.007	0.893	0.204	3	0.898	0.274	3	0.945	0.224	3
0.002	0.967	0.191	3	0.965	0.165	3	0.897	0.089	3
0.0008	1.004	0.145	3	0.979	0.166	3	0.984	0.193	3
0.000	1.141	0.079	3	1.180	0.188	3	1.017	0.143	3

表35：HBsAg嚮導IC50 (nM)比較

比較1	嚮導	平均值	SD	N
G027224	0.10	0.07	3
G034393	0.16	0.08	3
比較2	G030115	0.12	0.08	3
G034395	0.17	0.07	3
比較3	G030120	0.07	0.04	3
G034396	0.08	0.03	3

實例11 - 在兩個連續劑量之LNP後評估AAV8-HBV1.2小鼠模型中靶向HBV之三種不同的Nme2-BC22n gRNA LNP

來自Jackson Labs (品系號005557)之NSG (NOD.Cg-Prkdc ^scidIl2rg ^tm1Wjl/SzJ)雄性小鼠在6-10週齡時隨後按指示經由側尾靜脈給予AAV8-HBV1.2 D基因型(Signagen，目錄號SL100862)及LNP，或媒劑(對於AAV媒劑，PBS + 0.001% Pluronic；對於LNP媒劑，TSS)。以每隻動物0.1 mL之體積及如本文所述之量(載體基因體/小鼠，「vg/ms」)投與AAV。將LNP在TSS中稀釋，並按本文所示之量以10 μl/公克體重投與。在治療後之不同時間點，收集血液且分離血清用於如下文進一步描述的某些分析。 11.1. 人類B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg) ELISA及總DNA qPCR分析

對於活體內研究，按指示收集血液，並分離血清。使用HBsAg (人類) ELISA套組(LifeSpan Bio，目錄號LS-F37979)根據製造商的方案測定總人類B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)水準。使用4參數邏輯擬合從標準曲線量化血清HBsAg水準並表示為μg/mL血清。對於ddPCR，將血清以1:50稀釋，並使用QE裂解方案(Lucigen，目錄號QE09050)分離DNA。使用ddPCR Supermix探針(Bio-Rad，目錄號1863024)用針對未經測試的gRNA編輯的HBV基因體之高度保守區域之引子組(Fwd-5’- ACTCACCAACCTCTTGTCCT-3’ (SEQ ID NO:X)，Rev- 5’- GACAAACGGGCAACATACCT-3’ (SEQ ID NO: X))運行ddPCR。使用編碼相同HBV序列之標準質體來測定DNA拷貝數/mL，這允許線性偵測下限為2.73e7個拷貝/mL。

經由減弱來自AAV8-HBV1.2 (SignaGen Laboratories目錄號SL100862)之人類B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)之游離型表現，對四種sgRNA (一種靶向SCAP之對照，三種靶向HBV)之編輯進行評估，如本文所述以1e11 vg/小鼠的劑量投與，如藉由ELISA量測。投與AAV8-HBV材料後兩週，經由HBsAg ELISA評估血清HBsAg表現之基線水準。製備本實例中測試之LNP，並在評估HBsAg基線後三天將其遞送至如本文所述的小鼠。將含有1:2:0.3比率之gRNA:Nme2-BC22n:UGI之LNP預先混合，並以每動物體重2 mg/kg (相對於總RNA貨物含量)之劑量水準投與。此後，在第一次LNP投與後兩週藉由ELISA測定血清HBsAg表現。同一天，再次以2 mg/kg之劑量水準向動物投與其各自LNP。

第一次LNP給藥後六週，對動物實施安樂死；收集血液以評估血清中之終末HBsAg及HBV DNA水準。各嚮導特異性靶位點之表型量測結果如 表36及 表37所示。相對於個別動物基線之血清HBsAg log10減少時間過程如 圖19所示。第6週時相對於TSS組之總血清HBV DNA之Log10減弱如 圖20所示。G027224及G030115相對於基線之平均HBsAg log10減弱＞2 log10。所有嚮導均導致＞2 log之血清HBV DNA減弱，但由於檢定敏感性，這轉化為最大可偵測減弱2.2 log10。 表36：血清HBsAg相對於基線之Log10減少

天數	G027224	G030115	G030120
平均值	SD	N	平均值	SD	N	平均值	SD	N
14	0	0	5	0	0	5	0	0	5
35	-2.00	0.25	5	-1.54	0.30	5	-1.37	0.14	5
42	-2.22	0.39	5	-2.17	0.18	5	-1.85	0.26	4
天數	G021514 (SCAP)	TSS
平均值	SD	N	平均值	SD	N
14	0	0	5	0	0	5
35	0.21	0.16	5	0.03	0.05	5
42	-0.01	0.17	5	-0.33	0.45	5

圖37：第6週時相對於TSS之總血清HBV DNA之Log10減少

嚮導	平均值	SD	N
TSS	0.0	0.3	5
G021514	0.0	0.2	5
G027224	-3.2	0.4	4
G030115	-3.1	0.7	5
G030120	-3.1	0.3	4

實例12 - 在比較對HBV A及C基因型之編輯的AAV8-HBV1.2小鼠模型中評估靶向HBV之三種不同的Nme2-BC22n gRNA LNP

來自Jackson Labs (品系號005557)之NSG (NOD.Cg-Prkdc ^scidIl2rg ^tm1Wjl/SzJ)雄性小鼠在12週齡時隨後按指示經由側尾靜脈給予AAV8-HBV1.2 (Signagen，SL100865)基因型A (AB246338.1)或基因型C (AB246345.1)及LNP，或媒劑(對於AAV媒劑，PBS + 0.001% Pluronic；對於LNP媒劑，TSS)。以每隻動物0.1 mL之體積及如本文所述之量(載體基因體/小鼠，「vg/ms」)投與AAV。將LNP在TSS中稀釋，並按本文所示之量以10 μl/公克體重投與。在治療後之不同時間點，收集血液且分離血清用於如下文進一步描述的某些分析。 12.1. 人類B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)分析

對於活體內研究，按指示收集血液，並分離血清。使用HBsAg (人類) ELISA套組(LifeSpan Bio，目錄號LS-F37979)根據製造商的方案測定總人類B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)水準。使用4參數邏輯擬合從標準曲線量化血清HBsAg水準並表示為μg/mL血清。

經由減弱來自AAV8-HBV1.2基因型A (AB246338.1)或AAV-HBV1.2基因型C (AB246345.1) (SignaGen Laboratories目錄號SL100865)之人類B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)之游離型表現，對四種sgRNA (一種靶向Scap之對照、三種靶向HBV)之編輯進行評估，如本文所述以1e11 vg/小鼠的劑量投與，如藉由ELISA量測。G027224與本實驗中使用的HBV基因型不完全同源，且相對於基因型A在嚮導位置13處具有1 bp錯配，相對於基因型C在嚮導位置16處具有1 bp錯配。投與AAV8-HBV材料後兩週，經由HBsAg ELISA評估血清HBsAg表現之基線水準。製備本實例中測試之LNP，並在評估HBsAg基線後七天將其遞送至如本文所述的小鼠。將含有1:2:0.3比率之gRNA:Nme2-BC22n:UGI之LNP預先混合，並以每動物體重1 mg/kg (相對於總RNA貨物含量)之劑量水準投與。此後，在第一次LNP投與後兩週藉由ELISA測定血清HBsAg表現。

第一次LNP給藥後四週，對動物實施安樂死；收集血液以評估血清中之終末HBsAg水準。相對於個別動物基線之血清HBsAg水準及log10減少時間過程如 圖21A及圖21B以及表37及表38所示。終點比較如 圖22所述。G030115及G030120與基因型A及C序列具有完美的間隔子匹配，導致HBsAg減弱效果顯著優於G027224 (1 bp錯配)，表明在靶特異性。此外，在兩種基因型中，嚮導表現之排名順序都保持不變，並且嚮導在兩種基因型中具有非常相似的HBsAg減弱幅度，儘管G030115及G030120在靶向基因型C時，分泌的HBsAg表現出稍微更大的降低(顯著的Welch’s T檢驗) ( 圖22)。 表37：HBV基因型A之Log10血清HBsAg較基線之降低

天數	G027224	G030115	G030120	G021514 (SCAP)
平均值	SD	N	SD	SD	N	平均值	SD	N	平均值	SD	N
14	0.00	0.00	3	0.00	0.00	4	0.00	0.00	4	0.00	0.00	4
35	-0.30	0.15	3	-0.93	0.06	4	-1.30	-1.30	4	0.15	0.05	4
49	-0.46	0.13	3	-0.98	0.03	4	-1.24	-1.24	4	0.14	0.10	4

表38：HBV基因型C之Log10血清HBsAg較基線之降低

天數	G027224	G030115	G030120	G021514 (SCAP)
平均值	SD	N	SD	SD	N	平均值	SD	N	平均值	SD	N
14	0.00	0.00	3	0.00	0.00	4	0.00	0.00	4	0.00	0.00	4
35	-0.57	0.15	3	-1.29	0.10	4	-1.37	-1.37	4	0.30	0.05	4
49	-0.71	0.19	3	-1.25	0.03	4	-1.40	-1.40	4	0.25	0.07	4

表39：log10血清HBsAg較基線之降低之終點比較

嚮導及HBV基因型	平均值	SD	N
G027224 A	-0.46	0.13	3
G027224 C	-0.71	0.19	3
G030115 A	-0.98	0.03	4
G030115 C	-1.25	0.03	4
G030120 A	-1.24	0.08	4
G030120 C	-1.40	0.04	4

表40：額外序列

SEQ ID NO	序列
1	CAGTGGAATTCCACAACCTTTCACCAAACTCTGCAAGATCCCAGAGTGAGAGGCCTGTATTTCCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAGCAGTAAACCCTGTTCCGACTACTGCCTCTCCCTTATCGTCAATCTTCTCGAGGATTGGGGACCCTGCGCTGAACATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTTCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAACTACCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAACTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCCTCAACCACCAGCACGGGACCATGCCGAACCTGCATGACTACTGCTCAAGGAACCTCTATGTATCCCTCCTGTTGCTGTACCAAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCTTGAGTCCCTTTTTACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTAAACCCTAACAAAACAAAGAGATGGGGTTACTCTCTGAATTTTATGGGTTATGTCATTGGAAGTTATGGGTCCTTGCCACAAGAACACATCATACAAAAAATCAAAGAATGTTTTAGAAAACTTCCTATTAACAGGCCTATTGATTGGAAAGTATGTCAACGAATTGTGGGTCTTTTGGGTTTTGCTGCCCCATTTACACAATGTGGTTATCCTGCGTTAATGCCCTTGTATGCATGTATTCAATCTAAGCAGGCTTTCACTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTGTGTAAACAATACCTGAACCTTTACCCCGTTGCCCGGCAACGGCCAGGTCTGTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCTTGGTCATGGGCCATCAGCGCGTGCGTGGAACCTTTTCGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCCGCTTGTTTTGCTCGCAGCAGGTCTGGAGCAAACATTATCGGGACTGATAACTCTGTTGTCCTCTCCCGCAAATATACATCGTATCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCTGCGGACGACCCTTCTCGGGGTCGCTTGGGACTCTCTCGTCCCCTTCTCCGTCTGCCGTTCCGACCGACCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGACTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCCCACCGAATGTTGCCCAAGGTCTTACATAAGAGGACTCTTGGACTCTCTGCAATGTCAACGACCGACCTTGAGGCATACTTCAAAGACTGTTTGTTTAAAGACTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGATTAGATTAAAGGTCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGCGCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCAGTACGAGATCTTCTAGATACCGCCTCAGCTCTGTATCGGGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGTTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCAATTCTTTGCTGGGGGGAACTAATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTGTTAATTTGGAAGATCCAGCATCTAGAGACCTAGTAGTCAGTTATGTCAACACTAATATGGGCCTAAAGTTCAGGCAACTCTTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGGAAGAGAAACCGTTATAGAGTATTTGGTGTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCTTATAGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAACCTCAATGTTAGTATTCCTTGGACTCATAAGGTGGGGAACTTTACTGGTCTTTATTCTTCTACTGTACCTGTCTTTAATCCTCATTGGAAAACACCATCTTTTCCTAATATACATTTACACCAAGACATTATCAAAAAATGTGAACAGTTTGTAGGCCCACTTACAGTTAATGAGAAAAGAAGATTGCAATTGATTATGCCTGCTAGGTTTTATCCAAAGGTTACCAAATATTTACCATTGGATAAGGGTATTAAACCTTATTATCCAGAACATCTAGTTAATCATTACTTCCAAACTAGACACTATTTACACACTCTATGGAAGGCGGGTATATTATATAAGAGAGAAACAACACATAGCGCCTCATTTTGTGGGTCACCATATTCTTGGGAACAAGATCTACAGCATGGGGCAGAATCTTTCCACCAGCAATCCTCTGGGATTCTTTCCCGACCACCAGTTGGATCCAGCCTTCAGAGCAAACACAGCAAATCCAGATTGGGACTTCAATCCCAACAAGGACACCTGGCCAGACGCCAACAAGGTAGGAGCTGGAGCATTCGGGCTGGGTTTCACCCCACCGCACGGAGGCCTTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCATACTACAAACTTTGCCAGCAAATCCGCCTCCTGCCTCCACCAATCGCCAGACAGGAAGGCAGCCTACCCCGCTGTCTCCACCTTTGAGAAACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGG
701	GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGAGGCCUCCCCCGCCUCCGGCCCCCGGCACCUGAUGGACCCCCACAUCUUCACCUCCAACUUCAACAACGGCAUCGGCCGGCACAAGACCUACCUGUGCUACGAGGUGGAGCGGCUGGACAACGGCACCUCCGUGAAGAUGGACCAGCACCGGGGCUUCCUGCACAACCAGGCCAAGAACCUGCUGUGCGGCUUCUACGGCCGGCACGCCGAGCUGCGGUUCCUGGACCUGGUGCCCUCCCUGCAGCUGGACCCCGCCCAGAUCUACCGGGUGACCUGGUUCAUCUCCUGGUCCCCCUGCUUCUCCUGGGGCUGCGCCGGCGAGGUGCGGGCCUUCCUGCAGGAGAACACCCACGUGCGGCUGCGGAUCUUCGCCGCCCGGAUCUACGACUACGACCCCCUGUACAAGGAGGCCCUGCAGAUGCUGCGGGACGCCGGCGCCCAGGUGUCCAUCAUGACCUACGACGAGUUCAAGCACUGCUGGGACACCUUCGUGGACCACCAGGGCUGCCCCUUCCAGCCCUGGGACGGCCUGGACGAGCACUCCCAGGCCCUGUCCGGCCGGCUGCGGGCCAUCCUGCAGAACCAGGGCAACUCCGGCUCCGAGACCCCCGGCACCUCCGAGUCCGCCACCCCCGAGUCCGACAAGAAGUACUCCAUCGGCCUGGCCAUCGGCACCAACUCCGUGGGCUGGGCCGUGAUCACCGACGAGUACAAGGUGCCCUCCAAGAAGUUCAAGGUGCUGGGCAACACCGACCGGCACUCCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGCGCCCUGCUGUUCGACUCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCUGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGUACACCCGGCGGAAGAACCGGAUCUGCUACCUGCAGGAGAUCUUCUCCAACGAGAUGGCCAAGGUGGACGACUCCUUCUUCCACCGGCUGGAGGAGUCCUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCAUCUUCGGCAACAUCGUGGACGAGGUGGCCUACCACGAGAAGUACCCCACCAUCUACCACCUGCGGAAGAAGCUGGUGGACUCCACCGACAAGGCCGACCUGCGGCUGAUCUACCUGGCCCUGGCCCACAUGAUCAAGUUCCGGGGCCACUUCCUGAUCGAGGGCGACCUGAACCCCGACAACUCCGACGUGGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUGCAGACCUACAACCAGCUGUUCGAGGAGAACCCCAUCAACGCCUCCGGCGUGGACGCCAAGGCCAUCCUGUCCGCCCGGCUGUCCAAGUCCCGGCGGCUGGAGAACCUGAUCGCCCAGCUGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCUGUUCGGCAACCUGAUCGCCCUGUCCCUGGGCCUGACCCCCAACUUCAAGUCCAACUUCGACCUGGCCGAGGACGCCAAGCUGCAGCUGUCCAAGGACACCUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCCCAGAUCGGCGACCAGUACGCCGACCUGUUCCUGGCCGCCAAGAACCUGUCCGACGCCAUCCUGCUGUCCGACAUCCUGCGGGUGAACACCGAGAUCACCAAGGCCCCCCUGUCCGCCUCCAUGAUCAAGCGGUACGACGAGCACCACCAGGACCUGACCCUGCUGAAGGCCCUGGUGCGGCAGCAGCUGCCCGAGAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGUCCAAGAACGGCUACGCCGGCUACAUCGACGGCGGCGCCUCCCAGGAGGAGUUCUACAAGUUCAUCAAGCCCAUCCUGGAGAAGAUGGACGGCACCGAGGAGCUGCUGGUGAAGCUGAACCGGGAGGACCUGCUGCGGAAGCAGCGGACCUUCGACAACGGCUCCAUCCCCCACCAGAUCCACCUGGGCGAGCUGCACGCCAUCCUGCGGCGGCAGGAGGACUUCUACCCCUUCCUGAAGGACAACCGGGAGAAGAUCGAGAAGAUCCUGACCUUCCGGAUCCCCUACUACGUGGGCCCCCUGGCCCGGGGCAACUCCCGGUUCGCCUGGAUGACCCGGAAGUCCGAGGAGACCAUCACCCCCUGGAACUUCGAGGAGGUGGUGGACAAGGGCGCCUCCGCCCAGUCCUUCAUCGAGCGGAUGACCAACUUCGACAAGAACCUGCCCAACGAGAAGGUGCUGCCCAAGCACUCCCUGCUGUACGAGUACUUCACCGUGUACAACGAGCUGACCAAGGUGAAGUACGUGACCGAGGGCAUGCGGAAGCCCGCCUUCCUGUCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCAUCGUGGACCUGCUGUUCAAGACCAACCGGAAGGUGACCGUGAAGCAGCUGAAGGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGCUUCGACUCCGUGGAGAUCUCCGGCGUGGAGGACCGGUUCAACGCCUCCCUGGGCACCUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUGGAGGACAUCGUGCUGACCCUGACCCUGUUCGAGGACCGGGAGAUGAUCGAGGAGCGGCUGAAGACCUACGCCCACCUGUUCGACGACAAGGUGAUGAAGCAGCUGAAGCGGCGGCGGUACACCGGCUGGGGCCGGCUGUCCCGGAAGCUGAUCAACGGCAUCCGGGACAAGCAGUCCGGCAAGACCAUCCUGGACUUCCUGAAGUCCGACGGCUUCGCCAACCGGAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACUCCCUGACCUUCAAGGAGGACAUCCAGAAGGCCCAGGUGUCCGGCCAGGGCGACUCCCUGCACGAGCACAUCGCCAACCUGGCCGGCUCCCCCGCCAUCAAGAAGGGCAUCCUGCAGACCGUGAAGGUGGUGGACGAGCUGGUGAAGGUGAUGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACAUCGUGAUCGAGAUGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACUCCCGGGAGCGGAUGAAGCGGAUCGAGGAGGGCAUCAAGGAGCUGGGCUCCCAGAUCCUGAAGGAGCACCCCGUGGAGAACACCCAGCUGCAGAACGAGAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGCCGGGACAUGUACGUGGACCAGGAGCUGGACAUCAACCGGCUGUCCGACUACGACGUGGACCACAUCGUGCCCCAGUCCUUCCUGAAGGACGACUCCAUCGACAACAAGGUGCUGACCCGGUCCGACAAGAACCGGGGCAAGUCCGACAACGUGCCCUCCGAGGAGGUGGUGAAGAAGAUGAAGAACUACUGGCGGCAGCUGCUGAACGCCAAGCUGAUCACCCAGCGGAAGUUCGACAACCUGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCUGUCCGAGCUGGACAAGGCCGGCUUCAUCAAGCGGCAGCUGGUGGAGACCCGGCAGAUCACCAAGCACGUGGCCCAGAUCCUGGACUCCCGGAUGAACACCAAGUACGACGAGAACGACAAGCUGAUCCGGGAGGUGAAGGUGAUCACCCUGAAGUCCAAGCUGGUGUCCGACUUCCGGAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUGCGGGAGAUCAACAACUACCACCACGCCCACGACGCCUACCUGAACGCCGUGGUGGGCACCGCCCUGAUCAAGAAGUACCCCAAGCUGGAGUCCGAGUUCGUGUACGGCGACUACAAGGUGUACGACGUGCGGAAGAUGAUCGCCAAGUCCGAGCAGGAGAUCGGCAAGGCCACCGCCAAGUACUUCUUCUACUCCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACCGAGAUCACCCUGGCCAACGGCGAGAUCCGGAAGCGGCCCCUGAUCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGAUCGUGUGGGACAAGGGCCGGGACUUCGCCACCGUGCGGAAGGUGCUGUCCAUGCCCCAGGUGAACAUCGUGAAGAAGACCGAGGUGCAGACCGGCGGCUUCUCCAAGGAGUCCAUCCUGCCCAAGCGGAACUCCGACAAGCUGAUCGCCCGGAAGAAGGACUGGGACCCCAAGAAGUACGGCGGCUUCGACUCCCCCACCGUGGCCUACUCCGUGCUGGUGGUGGCCAAGGUGGAGAAGGGCAAGUCCAAGAAGCUGAAGUCCGUGAAGGAGCUGCUGGGCAUCACCAUCAUGGAGCGGUCCUCCUUCGAGAAGAACCCCAUCGACUUCCUGGAGGCCAAGGGCUACAAGGAGGUGAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCCAAGUACUCCCUGUUCGAGCUGGAGAACGGCCGGAAGCGGAUGCUGGCCUCCGCCGGCGAGCUGCAGAAGGGCAACGAGCUGGCCCUGCCCUCCAAGUACGUGAACUUCCUGUACCUGGCCUCCCACUACGAGAAGCUGAAGGGCUCCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCUGUUCGUGGAGCAGCACAAGCACUACCUGGACGAGAUCAUCGAGCAGAUCUCCGAGUUCUCCAAGCGGGUGAUCCUGGCCGACGCCAACCUGGACAAGGUGCUGUCCGCCUACAACAAGCACCGGGACAAGCCCAUCCGGGAGCAGGCCGAGAACAUCAUCCACCUGUUCACCCUGACCAACCUGGGCGCCCCCGCCGCCUUCAAGUACUUCGACACCACCAUCGACCGGAAGCGGUACACCUCCACCAAGGAGGUGCUGGACGCCACCCUGAUCCACCAGUCCAUCACCGGCCUGUACGAGACCCGGAUCGACCUGUCCCAGCUGGGCGGCGACGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGUGACUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACG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702	GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGACCAACCUGUCCGACAUCAUCGAGAAGGAGACCGGCAAGCAGCUGGUGAUCCAGGAGUCCAUCCUGAUGCUGCCCGAGGAGGUGGAGGAGGUGAUCGGCAACAAGCCCGAGUCCGACAUCCUGGUGCACACCGCCUACGACGAGUCCACCGACGAGAACGUGAUGCUGCUGACCUCCGACGCCCCCGAGUACAAGCCCUGGGCCCUGGUGAUCCAGGACUCCAACGGCGAGAACAAGAUCAAGAUGCUGUCCGGCGGCUCCAAGCGGACCGCCGACGGCUCCGAGUUCGAGUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGUGAUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUAG
703	GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGACGGCUCCGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGGACAAGCGGCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAGGGCGGCUCCGGCGGCGGCGCCGCCUUCAAGCCCAACCCCAUCAACUACAUCCUGGGCCUGGACAUCGGCAUCGCCUCCGUGGGCUGGGCCAUGGUGGAGAUCGACGAGGAGGAGAACCCCAUCCGGCUGAUCGACCUGGGCGUGCGGGUGUUCGAGCGGGCCGAGGUGCCCAAGACCGGCGACUCCCUGGCCAUGGCCCGGCGGCUGGCCCGGUCCGUGCGGCGGCUGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCUGCUGCGGGCCCGGCGGCUGCUGAAGCGGGAGGGCGUGCUGCAGGCCGCCGACUUCGACGAGAACGGCCUGAUCAAGUCCCUGCCCAACACCCCCUGGCAGCUGCGGGCCGCCGCCCUGGACCGGAAGCUGACCCCCCUGGAGUGGUCCGCCGUGCUGCUGCACCUGAUCAAGCACCGGGGCUACCUGUCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCUGGGCGCCCUGCUGAAGGGCGUGGCCAACAACGCCCACGCCCUGCAGACCGGCGACUUCCGGACCCCCGCCGAGCUGGCCCUGAACAAGUUCGAGAAGGAGUCCGGCCACAUCCGGAACCAGCGGGGCGACUACUCCCACACCUUCUCCCGGAAGGACCUGCAGGCCGAGCUGAUCCUGCUGUUCGAGAAGCAGAAGGAGUUCGGCAACCCCCACGUGUCCGGCGGCCUGAAGGAGGGCAUCGAGACCCUGCUGAUGACCCAGCGGCCCGCCCUGUCCGGCGACGCCGUGCAGAAGAUGCUGGGCCACUGCACCUUCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCUACACCGCCGAGCGGUUCAUCUGGCUGACCAAGCUGAACAACCUGCGGAUCCUGGAGCAGGGCUCCGAGCGGCCCCUGACCGACACCGAGCGGGCCACCCUGAUGGACGAGCCCUACCGGAAGUCCAAGCUGACCUACGCCCAGGCCCGGAAGCUGCUGGGCCUGGAGGACACCGCCUUCUUCAAGGGCCUGCGGUACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCUCCACCCUGAUGGAGAUGAAGGCCUACCACGCCAUCUCCCGGGCCCUGGAGAAGGAGGGCCUGAAGGACAAGAAGUCCCCCCUGAACCUGUCCUCCGAGCUGCAGGACGAGAUCGGCACCGCCUUCUCCCUGUUCAAGACCGACGAGGACAUCACCGGCCGGCUGAAGGACCGGGUGCAGCCCGAGAUCCUGGAGGCCCUGCUGAAGCACAUCUCCUUCGACAAGUUCGUGCAGAUCUCCCUGAAGGCCCUGCGGCGGAUCGUGCCCCUGAUGGAGCAGGGCAAGCGGUACGACGAGGCCUGCGCCGAGAUCUACGGCGACCACUACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGAUCUACCUGCCCCCCAUCCCCGCCGACGAGAUCCGGAACCCCGUGGUGCUGCGGGCCCUGUCCCAGGCCCGGAAGGUGAUCAACGGCGUGGUGCGGCGGUACGGCUCCCCCGCCCGGAUCCACAUCGAGACCGCCCGGGAGGUGGGCAAGUCCUUCAAGGACCGGAAGGAGAUCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGUUCCGGGAGUACUUCCCCAACUUCGUGGGCGAGCCCAAGUCCAAGGACAUCCUGAAGCUGCGGCUGUACGAGCAGCAGCACGGCAAGUGCCUGUACUCCGGCAAGGAGAUCAACCUGGUGCGGCUGAACGAGAAGGGCUACGUGGAGAUCGACCACGCCCUGCCCUUCUCCCGGACCUGGGACGACUCCUUCAACAACAAGGUGCUGGUGCUGGGCUCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCUACGAGUACUUCAACGGCAAGGACAACUCCCGGGAGUGGCAGGAGUUCAAGGCCCGGGUGGAGACCUCCCGGUUCCCCCGGUCCAAGAAGCAGCGGAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAGGACGGCUUCAAGGAGUGCAACCUGAACGACACCCGGUACGUGAACCGGUUCCUGUGCCAGUUCGUGGCCGACCACAUCCUGCUGACCGGCAAGGGCAAGCGGCGGGUGUUCGCCUCCAACGGCCAGAUCACCAACCUGCUGCGGGGCUUCUGGGGCCUGCGGAAGGUGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCUGGACGCCGUGGUGGUGGCCUGCUCCACCGUGGCCAUGCAGCAGAAGAUCACCCGGUUCGUGCGGUACAAGGAGAUGAACGCCUUCGACGGCAAGACCAUCGACAAGGAGACCGGCAAGGUGCUGCACCAGAAGACCCACUUCCCCCAGCCCUGGGAGUUCUUCGCCCAGGAGGUGAUGAUCCGGGUGUUCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGUUCGAGGAGGCCGACACCCCCGAGAAGCUGCGGACCCUGCUGGCCGAGAAGCUGUCCUCCCGGCCCGAGGCCGUGCACGAGUACGUGACCCCCCUGUUCGUGUCCCGGGCCCCCAACCGGAAGAUGUCCGGCGCCCACAAGGACACCCUGCGGUCCGCCAAGCGGUUCGUGAAGCACAACGAGAAGAUCUCCGUGAAGCGGGUGUGGCUGACCGAGAUCAAGCUGGCCGACCUGGAGAACAUGGUGAACUACAAGAACGGCCGGGAGAUCGAGCUGUACGAGGCCCUGAAGGCCCGGCUGGAGGCCUACGGCGGCAACGCCAAGCAGGCCUUCGACCCCAAGGACAACCCCUUCUACAAGAAGGGCGGCCAGCUGGUGAAGGCCGUGCGGGUGGAGAAGACCCAGGAGUCCGGCGUGCUGCUGAACAAGAAGAACGCCUACACCAUCGCCGACAACGGCGACAUGGUGCGGGUGGACGUGUUCUGCAAGGUGGACAAGAAGGGCAAGAACCAGUACUUCAUCGUGCCCAUCUACGCCUGGCAGGUGGCCGAGAACAUCCUGCCCGACAUCGACUGCAAGGGCUACCGGAUCGACGACUCCUACACCUUCUGCUUCUCCCUGCACAAGUACGACCUGAUCGCCUUCCAGAAGGACGAGAAGUCCAAGGUGGAGUUCGCCUACUACAUCAACUGCGACUCCUCCAACGGCCGGUUCUACCUGGCCUGGCACGACAAGGGCUCCAAGGAGCAGCAGUUCCGGAUCUCCACCCAGAACCUGGUGCUGAUCCAGAAGUACCAGGUGAACGAGCUGGGCAAGGAGAUCCGGCCCUGCCGGCUGAAGAAGCGGCCCCCCGUGCGGUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUAG
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727	ATGGTGTCCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGCGTGGTGCCCATCCTGGTGGAGCTGGACGGCGACGTGAACGGCCACAAGTTCTCCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGACGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTGGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCTCCCGGTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAGGGCTACGTGCAGGAGCGGACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGGGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGGATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGCCACAAGCTGGAGTACAACTACAACTCCCACAACGTGTACATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGGCACAACATCGAGGACGGCTCCGTGCAGCTGGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGTCCACCCAGTCCGCCCTGTCCAAGGACCCCAACGAGAAGCGGGACCACATGGTGCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGCATCACCCTGGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGA
728	AAGCTCAGAATAAACGCTCAACTTTGGCCGGATCTGCCACCATGGACGGCTCCGGCGGCGGCTCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGGAGGACAAGCGGCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAGGGCGGCTCCGGCGGCGGCGAGGCCTCCCCCGCCTCCGGCCCCCGGCACCTGATGGACCCCCACATCTTCACCTCCAACTTCAACAACGGCATCGGCCGGCACAAGACCTACCTGTGCTACGAGGTGGAGCGGCTGGACAACGGCACCTCCGTGAAGATGGACCAGCACCGGGGCTTCCTGCACAACCAGGCCAAGAACCTGCTGTGCGGCTTCTACGGCCGGCACGCCGAGCTGCGGTTCCTGGACCTGGTGCCCTCCCTGCAGCTGGACCCCGCCCAGATCTACCGGGTGACCTGGTTCATCTCCTGGTCCCCCTGCTTCTCCTGGGGCTGCGCCGGCGAGGTGCGGGCCTTCCTGCAGGAGAACACCCACGTGCGGCTGCGGATCTTCGCCGCCCGGATCTACGACTACGACCCCCTGTACAAGGAGGCCCTGCAGATGCTGCGGGACGCCGGCGCCCAGGTGTCCATCATGACCTACGACGAGTTCAAGCACTGCTGGGACACCTTCGTGGACCACCAGGGCTGCCCCTTCCAGCCCTGGGACGGCCTGGACGAGCACTCCCAGGCCCTGTCCGGCCGGCTGCGGGCCATCCTGCAGAACCAGGGCAACGGCACCAAGGACTCCACCAAGGACATCCCCGAGACCCCCTCCAAGGACGCAGCGTTCAAACCAAATCCCATCAACTACATCCTGGGCCTGGCCATCGGCATCGCCTCCGTGGGCTGGGCCATGGTGGAGATCGACGAGGAGGAGAACCCCATCCGGCTGATCGACCTGGGCGTGCGGGTGTTCGAGCGGGCCGAGGTGCCCAAGACCGGCGACTCCCTGGCCATGGCCCGGCGGCTGGCCCGGTCCGTGCGGCGGCTGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCTGCTGCGGGCCCGGCGGCTGCTGAAGCGGGAGGGCGTGCTGCAGGCCGCCGACTTCGACGAGAACGGCCTGATCAAGTCCCTGCCCAACACCCCCTGGCAGCTGCGGGCCGCCGCCCTGGACCGGAAGCTGACCCCCCTGGAGTGGTCCGCCGTGCTGCTGCACCTGATCAAGCACCGGGGCTACCTGTCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCTGGGCGCCCTGCTGAAGGGCGTGGCCAACAACGCCCACGCCCTGCAGACCGGCGACTTCCGGACCCCCGCCGAGCTGGCCCTGAACAAGTTCGAGAAGGAGTCCGGCCACATCCGGAACCAGCGGGGCGACTACTCCCACACCTTCTCCCGGAAGGACCTGCAGGCCGAGCTGATCCTGCTGTTCGAGAAGCAGAAGGAGTTCGGCAACCCCCACGTGTCCGGCGGCCTGAAGGAGGGCATCGAGACCCTGCTGATGACCCAGCGGCCCGCCCTGTCCGGCGACGCCGTGCAGAAGATGCTGGGCCACTGCACCTTCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCTACACCGCCGAGCGGTTCATCTGGCTGACCAAGCTGAACAACCTGCGGATCCTGGAGCAGGGCTCCGAGCGGCCCCTGACCGACACCGAGCGGGCCACCCTGATGGACGAGCCCTACCGGAAGTCCAAGCTGACCTACGCCCAGGCCCGGAAGCTGCTGGGCCTGGAGGACACCGCCTTCTTCAAGGGCCTGCGGTACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCTCCACCCTGATGGAGATGAAGGCCTACCACGCCATCTCCCGGGCCCTGGAGAAGGAGGGCCTGAAGGACAAGAAGTCCCCCCTGAACCTGTCCTCCGAGCTGCAGGACGAGATCGGCACCGCCTTCTCCCTGTTCAAGACCGACGAGGACATCACCGGCCGGCTGAAGGACCGGGTGCAGCCCGAGATCCTGGAGGCCCTGCTGAAGCACATCTCCTTCGACAAGTTCGTGCAGATCTCCCTGAAGGCCCTGCGGCGGATCGTGCCCCTGATGGAGCAGGGCAAGCGGTACGACGAGGCCTGCGCCGAGATCTACGGCGACCACTACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGATCTACCTGCCCCCCATCCCCGCCGACGAGATCCGGAACCCCGTGGTGCTGCGGGCCCTGTCCCAGGCCCGGAAGGTGATCAACGGCGTGGTGCGGCGGTACGGCTCCCCCGCCCGGATCCACATCGAGACCGCCCGGGAGGTGGGCAAGTCCTTCAAGGACCGGAAGGAGATCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGTTCCGGGAGTACTTCCCCAACTTCGTGGGCGAGCCCAAGTCCAAGGACATCCTGAAGCTGCGGCTGTACGAGCAGCAGCACGGCAAGTGCCTGTACTCCGGCAAGGAGATCAACCTGGTGCGGCTGAACGAGAAGGGCTACGTGGAGATCGACCACGCCCTGCCCTTCTCCCGGACCTGGGACGACTCCTTCAACAACAAGGTGCTGGTGCTGGGCTCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCTACGAGTACTTCAACGGCAAGGACAACTCCCGGGAGTGGCAGGAGTTCAAGGCCCGGGTGGAGACCTCCCGGTTCCCCCGGTCCAAGAAGCAGCGGATCCTGCTGCAGAAGTTCGACGAGGACGGCTTCAAGGAGTGCAACCTGAACGACACCCGGTACGTGAACCGCTTCCTGTGCCAGTTCGTGGCCGACCACATCCTGCTGACCGGCAAGGGCAAGCGGCGGGTGTTCGCCTCCAACGGCCAGATCACCAACCTGCTGCGGGGCTTCTGGGGCCTGCGGAAGGTGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCTGGACGCCGTGGTGGTGGCCTGCTCCACCGTGGCCATGCAGCAGAAGATCACCCGGTTCGTGCGGTACAAGGAGATGAACGCCTTCGACGGCAAGACCATCGACAAGGAGACCGGCAAGGTGCTGCACCAGAAGACCCACTTCCCCCAGCCCTGGGAGTTCTTCGCCCAGGAGGTGATGATCCGGGTGTTCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGTTCGAGGAGGCCGACACCCCCGAGAAGCTGCGGACCCTGCTGGCCGAGAAGCTGTCCTCCCGGCCCGAGGCCGTGCACGAGTACGTGACCCCCCTGTTCGTGTCCCGGGCCCCCAACCGGAAGATGTCCGGCGCCCACAAGGACACCCTGCGGTCCGCCAAGCGGTTCGTGAAGCACAACGAGAAGATCTCCGTGAAGCGGGTGTGGCTGACCGAGATCAAGCTGGCCGACCTGGAGAACATGGTGAACTACAAGAACGGCCGGGAGATCGAGCTGTACGAGGCCCTGAAGGCCCGGCTGGAGGCCTACGGCGGCAACGCCAAGCAGGCCTTCGACCCCAAGGACAACCCCTTCTACAAGAAGGGCGGCCAGCTGGTGAAGGCCGTGCGGGTGGAGAAGACCCAGGAGTCCGGCGTGCTGCTGAACAAGAAGAACGCCTACACCATCGCCGACAACGGCGACATGGTGCGGGTGGACGTGTTCTGCAAGGTGGACAAGAAGGGCAAGAACCAGTACTTCATCGTGCCCATCTACGCCTGGCAGGTGGCCGAGAACATCCTGCCCGACATCGACTGCAAGGGCTACCGGATCGACGACTCCTACACCTTCTGCTTCTCCCTGCACAAGTACGACCTGATCGCCTTCCAGAAGGACGAGAAGTCCAAGGTGGAGTTCGCCTACTACATCAACTGCGACTCCTCCAACGGCCGGTTCTACCTGGCCTGGCACGACAAGGGCTCCAAGGAGCAGCAGTTCCGGATCTCCACCCAGAACCTGGTGCTGATCCAGAAGTACCAGGTGAACGAGCTGGGCAAGGAGATCCGGCCCTGCCGGCTGAAGAAGCGGCCCCCCGTGCGGTAGCTAGCACCAGCCTCAAGAACACCCGAATGGAGTCTCTAAGCTACATAATACCAACTTACACTTTACAAAATGTTGTCCCCCAAAATGTAGCCATTCGTATCTGCTCCTAATAAAAAGAAAGTTTCTTCACATTCT
729	ATGGACGGCTCCGGCGGCGGCTCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGGAGGACAAGCGGCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAGGGCGGCTCCGGCGGCGGCGAGGCCTCCCCCGCCTCCGGCCCCCGGCACCTGATGGACCCCCACATCTTCACCTCCAACTTCAACAACGGCATCGGCCGGCACAAGACCTACCTGTGCTACGAGGTGGAGCGGCTGGACAACGGCACCTCCGTGAAGATGGACCAGCACCGGGGCTTCCTGCACAACCAGGCCAAGAACCTGCTGTGCGGCTTCTACGGCCGGCACGCCGAGCTGCGGTTCCTGGACCTGGTGCCCTCCCTGCAGCTGGACCCCGCCCAGATCTACCGGGTGACCTGGTTCATCTCCTGGTCCCCCTGCTTCTCCTGGGGCTGCGCCGGCGAGGTGCGGGCCTTCCTGCAGGAGAACACCCACGTGCGGCTGCGGATCTTCGCCGCCCGGATCTACGACTACGACCCCCTGTACAAGGAGGCCCTGCAGATGCTGCGGGACGCCGGCGCCCAGGTGTCCATCATGACCTACGACGAGTTCAAGCACTGCTGGGACACCTTCGTGGACCACCAGGGCTGCCCCTTCCAGCCCTGGGACGGCCTGGACGAGCACTCCCAGGCCCTGTCCGGCCGGCTGCGGGCCATCCTGCAGAACCAGGGCAACGGCACCAAGGACTCCACCAAGGACATCCCCGAGACCCCCTCCAAGGACGCAGCGTTCAAACCAAATCCCATCAACTACATCCTGGGCCTGGCCATCGGCATCGCCTCCGTGGGCTGGGCCATGGTGGAGATCGACGAGGAGGAGAACCCCATCCGGCTGATCGACCTGGGCGTGCGGGTGTTCGAGCGGGCCGAGGTGCCCAAGACCGGCGACTCCCTGGCCATGGCCCGGCGGCTGGCCCGGTCCGTGCGGCGGCTGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCTGCTGCGGGCCCGGCGGCTGCTGAAGCGGGAGGGCGTGCTGCAGGCCGCCGACTTCGACGAGAACGGCCTGATCAAGTCCCTGCCCAACACCCCCTGGCAGCTGCGGGCCGCCGCCCTGGACCGGAAGCTGACCCCCCTGGAGTGGTCCGCCGTGCTGCTGCACCTGATCAAGCACCGGGGCTACCTGTCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCTGGGCGCCCTGCTGAAGGGCGTGGCCAACAACGCCCACGCCCTGCAGACCGGCGACTTCCGGACCCCCGCCGAGCTGGCCCTGAACAAGTTCGAGAAGGAGTCCGGCCACATCCGGAACCAGCGGGGCGACTACTCCCACACCTTCTCCCGGAAGGACCTGCAGGCCGAGCTGATCCTGCTGTTCGAGAAGCAGAAGGAGTTCGGCAACCCCCACGTGTCCGGCGGCCTGAAGGAGGGCATCGAGACCCTGCTGATGACCCAGCGGCCCGCCCTGTCCGGCGACGCCGTGCAGAAGATGCTGGGCCACTGCACCTTCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCTACACCGCCGAGCGGTTCATCTGGCTGACCAAGCTGAACAACCTGCGGATCCTGGAGCAGGGCTCCGAGCGGCCCCTGACCGACACCGAGCGGGCCACCCTGATGGACGAGCCCTACCGGAAGTCCAAGCTGACCTACGCCCAGGCCCGGAAGCTGCTGGGCCTGGAGGACACCGCCTTCTTCAAGGGCCTGCGGTACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCTCCACCCTGATGGAGATGAAGGCCTACCACGCCATCTCCCGGGCCCTGGAGAAGGAGGGCCTGAAGGACAAGAAGTCCCCCCTGAACCTGTCCTCCGAGCTGCAGGACGAGATCGGCACCGCCTTCTCCCTGTTCAAGACCGACGAGGACATCACCGGCCGGCTGAAGGACCGGGTGCAGCCCGAGATCCTGGAGGCCCTGCTGAAGCACATCTCCTTCGACAAGTTCGTGCAGATCTCCCTGAAGGCCCTGCGGCGGATCGTGCCCCTGATGGAGCAGGGCAAGCGGTACGACGAGGCCTGCGCCGAGATCTACGGCGACCACTACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGATCTACCTGCCCCCCATCCCCGCCGACGAGATCCGGAACCCCGTGGTGCTGCGGGCCCTGTCCCAGGCCCGGAAGGTGATCAACGGCGTGGTGCGGCGGTACGGCTCCCCCGCCCGGATCCACATCGAGACCGCCCGGGAGGTGGGCAAGTCCTTCAAGGACCGGAAGGAGATCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGTTCCGGGAGTACTTCCCCAACTTCGTGGGCGAGCCCAAGTCCAAGGACATCCTGAAGCTGCGGCTGTACGAGCAGCAGCACGGCAAGTGCCTGTACTCCGGCAAGGAGATCAACCTGGTGCGGCTGAACGAGAAGGGCTACGTGGAGATCGACCACGCCCTGCCCTTCTCCCGGACCTGGGACGACTCCTTCAACAACAAGGTGCTGGTGCTGGGCTCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCTACGAGTACTTCAACGGCAAGGACAACTCCCGGGAGTGGCAGGAGTTCAAGGCCCGGGTGGAGACCTCCCGGTTCCCCCGGTCCAAGAAGCAGCGGATCCTGCTGCAGAAGTTCGACGAGGACGGCTTCAAGGAGTGCAACCTGAACGACACCCGGTACGTGAACCGCTTCCTGTGCCAGTTCGTGGCCGACCACATCCTGCTGACCGGCAAGGGCAAGCGGCGGGTGTTCGCCTCCAACGGCCAGATCACCAACCTGCTGCGGGGCTTCTGGGGCCTGCGGAAGGTGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCTGGACGCCGTGGTGGTGGCCTGCTCCACCGTGGCCATGCAGCAGAAGATCACCCGGTTCGTGCGGTACAAGGAGATGAACGCCTTCGACGGCAAGACCATCGACAAGGAGACCGGCAAGGTGCTGCACCAGAAGACCCACTTCCCCCAGCCCTGGGAGTTCTTCGCCCAGGAGGTGATGATCCGGGTGTTCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGTTCGAGGAGGCCGACACCCCCGAGAAGCTGCGGACCCTGCTGGCCGAGAAGCTGTCCTCCCGGCCCGAGGCCGTGCACGAGTACGTGACCCCCCTGTTCGTGTCCCGGGCCCCCAACCGGAAGATGTCCGGCGCCCACAAGGACACCCTGCGGTCCGCCAAGCGGTTCGTGAAGCACAACGAGAAGATCTCCGTGAAGCGGGTGTGGCTGACCGAGATCAAGCTGGCCGACCTGGAGAACATGGTGAACTACAAGAACGGCCGGGAGATCGAGCTGTACGAGGCCCTGAAGGCCCGGCTGGAGGCCTACGGCGGCAACGCCAAGCAGGCCTTCGACCCCAAGGACAACCCCTTCTACAAGAAGGGCGGCCAGCTGGTGAAGGCCGTGCGGGTGGAGAAGACCCAGGAGTCCGGCGTGCTGCTGAACAAGAAGAACGCCTACACCATCGCCGACAACGGCGACATGGTGCGGGTGGACGTGTTCTGCAAGGTGGACAAGAAGGGCAAGAACCAGTACTTCATCGTGCCCATCTACGCCTGGCAGGTGGCCGAGAACATCCTGCCCGACATCGACTGCAAGGGCTACCGGATCGACGACTCCTACACCTTCTGCTTCTCCCTGCACAAGTACGACCTGATCGCCTTCCAGAAGGACGAGAAGTCCAAGGTGGAGTTCGCCTACTACATCAACTGCGACTCCTCCAACGGCCGGTTCTACCTGGCCTGGCACGACAAGGGCTCCAAGGAGCAGCAGTTCCGGATCTCCACCCAGAACCTGGTGCTGATCCAGAAGTACCAGGTGAACGAGCTGGGCAAGGAGATCCGGCCCTGCCGGCTGAAGAAGCGGCCCCCCGTGCGGTAG
730	MDGSGGGSPKKKRKVEDKRPAATKKAGQAKKKKGGSGGGEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHNQAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGNGTKDSTKDIPETPSKDAAFKPNPINYILGLAIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVANNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSSELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLVRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKECNLNDTRYVNRFLCQFVADHILLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGKVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGAHKDTLRSAKRFVKHNEKISVKRVWLTEIKLADLENMVNYKNGREIELYEALKARLEAYGGNAKQAFDPKDNPFYKKGGQLVKAVRVEKTQESGVLLNKKNAYTIADNGDMVRVDVFCKVDKKGKNQYFIVPIYAWQVAENILPDIDCKGYRIDDSYTFCFSLHKYDLIAFQKDEKSKVEFAYYINCDSSNGRFYLAWHDKGSKEQQFRISTQNLVLIQKYQVNELGKEIRPCRLKKRPPVR*
731	AAGCTCAGAATAAACGCTCAACTTTGGCCGGATCTGCCACCATGACCAACCTGTCCGACATCATCGAGAAGGAGACCGGCAAGCAGCTGGTGATCCAGGAGTCCATCCTGATGCTGCCCGAGGAGGTGGAGGAGGTGATCGGCAACAAGCCCGAGTCCGACATCCTGGTGCACACCGCCTACGACGAGTCCACCGACGAGAACGTGATGCTGCTGACCTCCGACGCCCCCGAGTACAAGCCCTGGGCCCTGGTGATCCAGGACTCCAACGGCGAGAACAAGATCAAGATGCTGTCCGGCGGCTCCAAGCGGACCGCCGACGGCTCCGAGTTCGAGTCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGGAGTGATAGCTAGCACCAGCCTCAAGAACACCCGAATGGAGTCTCTAAGCTACATAATACCAACTTACACTTTACAAAATGTTGTCCCCCAAAATGTAGCCATTCGTATCTGCTCCTAATAAAAAGAAAGTTTCTTCACATTCT
732	ATGACCAACCTGTCCGACATCATCGAGAAGGAGACCGGCAAGCAGCTGGTGATCCAGGAGTCCATCCTGATGCTGCCCGAGGAGGTGGAGGAGGTGATCGGCAACAAGCCCGAGTCCGACATCCTGGTGCACACCGCCTACGACGAGTCCACCGACGAGAACGTGATGCTGCTGACCTCCGACGCCCCCGAGTACAAGCCCTGGGCCCTGGTGATCCAGGACTCCAACGGCGAGAACAAGATCAAGATGCTGTCCGGCGGCTCCAAGCGGACCGCCGACGGCTCCGAGTTCGAGTCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGGAGTGATAG
733	MTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSKRTADGSEFESPKKKRKVE**
734	MEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHNQAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGN
735	MTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML

圖1為示出藉由次世代定序(NGS)確定之HepAD38細胞株中存在之B型肝炎編碼序列的編輯百分比之圖表。示出了使用固定劑量之sgRNA與編碼Spy-BC22n及UGI或Spy-裂解酶之mRNA的組合測試針對靶向HBV S抗原之Spy-Cas9嚮導之編輯(C至T%、C至A/G%及插入缺失形成)及預測編輯結果(STOP獲得或START損失)。圖2為示出藉由NGS確定之HepAD38細胞株中存在之B型肝炎編碼序列的編輯百分比之圖表。示出了使用固定劑量之sgRNA與編碼Nme2-BC22n及UGI或Nme2-裂解酶之mRNA的組合測試針對靶向HBV S抗原之Nme2-Cas9嚮導之編輯及預測編輯結果。 圖3A及圖3B為示出藉由NGS確定之HepAD38細胞株中存在之B型肝炎編碼序列的C至T編輯百分比之圖表。在固定濃度的編碼(A) Spy-BC22n及UGI，或(B) Nme2-BC22n及UGI之mRNA的情況下，將細胞與以100 nM至1.56 nM之2倍連續稀釋之靶向HBV S抗原之嚮導接觸。 圖3A示出了針對各劑量之Spy-BC22n嚮導RNA的C至T編輯百分比。 圖3B示出了針對各劑量之Nme2-BC22n嚮導RNA的C至T編輯百分比。 圖4A及圖4B為示出藉由NGS確定之HepAD38細胞株中存在之B型肝炎編碼序列的C至T編輯百分比之圖表。在固定濃度的編碼(A) Spy-BC22n及UGI，或(B) Nme2-BC22n及UGI之mRNA的情況下，將細胞與以10 nM至0.156 nM之2倍連續稀釋之靶向HBV S抗原之嚮導接觸。 圖4A示出了針對各劑量之Spy-BC22n嚮導RNA之C至T編輯百分比。 圖4B示出了針對各劑量之Nme2-BC22n嚮導RNA之C至T編輯百分比。 圖5A及圖5B示出了Nme2鹼基編輯器嚮導RNA相對於對照嚮導RNA之HBsAg水準減弱百分比。圖5A示出了細胞內總HBsAg及分泌的HBsAg總量。圖5B示出了引子組1及引子組2之細胞內HBV拷貝數(CN)減弱百分比。虛線表示90%減弱水準。 圖6A及圖6B示出了Spy鹼基編輯器嚮導RNA相對於對照嚮導RNA之HBsAg水準減弱百分比。圖6A示出了細胞內總HBsAg及分泌的HBsAg總量。圖6B示出了引子組1及引子組2之細胞內HBV拷貝數(CN)減弱百分比。圖7示出了PHH中相對於LNP-GFP mRNA之HBsAg減弱相對百分比。嚮導以11、33或100 ng/孔進行篩選。圖8示出了使用Spy-BC22n或Nme2-BC22n嚮導注射LNP後5週的時段內HBsAg水準相對於基線之Log10變化之時間過程。圖9示出了使用Spy-BC22n或Nme2-BC22n嚮導注射LNP後五週時血清總HBV DNA減弱之Log10變化。 圖10示出了LNP注射後五週時血清中HBsAg與總HBV DNA水準之間的相關性(相對於僅AAV)。示出了非常高的相關性，其中R ²值為0.9652。 圖11示出了如藉由NGS確定之C至T編輯。在使用濃度範圍為50 nM至0 nM之3倍稀釋方案的劑量反應曲線中，用靶向HBV之Nme2-BC22n或Spy-BC22n嚮導處理細胞。 圖12示出了使用50 nM或16 nM劑量之Spy-BC22n或Nme2-BC22n嚮導之劑量反應曲線中的兩個最高劑量時分泌的HBsAg減弱百分比。 圖13示出了由藉由MSD檢定量測的Nme2-BC22n HBV嚮導之多重組合靶向的HepAD38細胞中分泌的HBsAg減弱百分比。 圖14示出了由藉由MSD檢定量測的Nme2-BC22n HBV嚮導之額外多重組合靶向的HepAD38細胞中分泌的HBsAg減弱百分比。 圖15示出了使用單一或多重HBV嚮導之分泌的HBsAg減弱百分比。 圖16示出了使用單一或多重HBV嚮導之總HBV DNA拷貝數減弱百分比。 圖17示出了使用不同修飾模式之嚮導進行處理後之HBsAg濃度(ng/ml)。 圖18示出了使用不同修飾模式之嚮導之平均HBsAg減弱IC50 (nM)。 圖19示出了相對於個別動物基線之血清HBsAg log10減少時間過程。 圖20示出了第6週時相對於TSS組之總血清HBV DNA之log10減弱。 圖21A示出了相對於HBV基因型A之個別動物基線之血清HBsAg log10降低時間過程。 圖21B示出了相對於HBV基因型C之個別動物基線之血清HBsAg log10降低時間過程。 圖22示出了log10血清HBsAg較基線降低之終點比較。

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Claims

一種嚮導RNA，其包含： A. 靶向序列，其包含與SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460中之至少20個連續核苷酸至少80%、85%、較佳90%或95%一致或互補之序列； B. 靶向序列，其包含與SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460中之至少24個連續核苷酸至少80%、85%、較佳90%或95%一致或互補之序列； C. 靶向序列，其包含與SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846及核苷酸1821-2460中之至少17、18、較佳19或20個連續核苷酸一致或互補之序列；或 D. 靶向序列，其包含與SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846及核苷酸1821-2460中之至少20、21、22、較佳23或24個連續核苷酸一致或互補之序列。
一種嚮導RNA，其包含： A. 靶向序列，其包含與以下中之至少20個連續核苷酸至少80%、85%、較佳90%或95%一致或互補之序列： 1. SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460； 2. SEQ ID NO: 1之核苷酸57-76、66-85、126-145、153-173、153-172、154-173、240-269、240-259、245-264、248-267、250-269、269-288、356-392、356-375、361-380、364-383、373-392、423-445、423-442、426-445、574-593、608-627、621-655、621-640、622-641、629-648、629-648、630-649、635-654、636-655、686-705、694-716、694-713、695-714、697-716、713-732、725-744、1597-1616、1817-1836、1845-1864、1867-1886、1880-1903、1880-1899、1883-1902、1884-1903、2072-2094、2072-2091、2073-2092、2075-2094、2299-2318、2348-2367、2634-2653、2867-2887、2867-2886、2868-2887、2891-2910、2956-2975或2982-3001；視情況核苷酸153-173、153-172、154-173或250-269；或者 3. 靶位點，其選自表1A中HBV編號S1-S93中任一者之靶位點，視情況表1A中之HBV編號S1-S6、S8、S11、S16、S17、S19、S21-25、S28-S30、S32、S39、S47、S49、S50、S52、S53、S57-58、S61-S64、S67、S70、S71、S74、S77、S78、S80-S87、S80、S90-S91及S93，視情況S1、S5或S6中任一者之靶位點； B. 靶向序列，其包含與選自SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460之序列的17、18、較佳19或20個連續核苷酸，或者與表1A中提供之S1-S6、S8、S11、S16、S17、S19、S21-25、S28-S30、S32、S39、S47、S49、S50、S52、S53、S57-58、S61-S64、S67、S70、S71、S74、S77、S78、S80-S87、S80、S90-S91及S93，視情況S1、S5或S6之靶向序列一致或互補的序列； C. 選自G028550、G028551、G028552、G028553、G028554、G028555、G030415、G030418、G030423、G030424、G030426、G030428、G030429、G030430、G030431、G030432、G030435、G030436、G030437、G030439、G030446、G030454、G030456、G030457、G030459、G030460、G030464、G030465、G030468、G030469、G030470、G030471、G030474、G030477、G030478、G030481、G030484、G030485、G030487、G030488、G030489、G030490、G030491、G030492、G030493、G030494、G030496、G030497、G030498或G030500，視情況G028550、G028554或G028555之靶向序列的靶向序列；或者 D. 靶向序列，其包含與SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460；或核苷酸57-76、66-85、126-145、153-173、153-172、154-173、240-269、240-259、245-264、248-267、250-269、269-288、356-392、356-375、361-380、364-383、373-392、423-445、423-442、426-445、574-593、608-627、621-655、621-640、622-641、629-648、629-648、630-649、635-654、636-655、686-705、694-716、694-713、695-714、697-716、713-732、725-744、1597-1616、1817-1836、1845-1864、1867-1886、1880-1903、1880-1899、1883-1902、1884-1903、2072-2094、2072-2091、2073-2092、2075-2094、2299-2318、2348-2367、2634-2653、2867-2887、2867-2886、2868-2887、2891-2910、2956-2975或2982-3001；視情況核苷酸153-173、153-172、154-173或250-269中之至少20個連續核苷酸一致或互補之序列。
如請求項1或2之嚮導RNA，其進一步包含以下中之一或多者： A. 經縮短之髮夾1區，或經取代及視情況經縮短之髮夾1區，其中 1. 髮夾1中以下核苷酸對中之至少一者經沃森-克里克(Watson-Crick)配對核苷酸取代：H1-1與H1-12、H1-2與H1-11、H1-3與H1-10或H1-4與H1-9，且該髮夾1區視情況缺少 a. H1-5至H1-8中之任一者或兩者， b. 以下核苷酸對中之一者、兩者或三者：H1-1與H1-12、H1-2與H1-11、H1-3與H1-10及H1-4與H1-9，或 c. 髮夾1區之1-8個核苷酸；或 2. 該經縮短之髮夾1區缺少4-8個核苷酸，較佳4-6個核苷酸；且 a. 位置H1-1、H1-2或H1-3中之一或多者相對於示範性SpyCas9 sgRNA-1 (SEQ ID NO: 268)缺失或經取代，或 b. 位置H1-6至H1-10中之一或多者相對於示範性SpyCas9 sgRNA-1 (SEQ ID NO: 268)經取代；或者 3. 該經縮短之髮夾1區缺少5-10個核苷酸，較佳5-6個核苷酸，並且位置N18、H1-12或n中之一或多者相對於示範性SpyCas9 sgRNA-1 (SEQ ID NO: 268)經取代；或者 B. 經縮短之上部莖區，其中該經縮短之上部莖區缺少1-6個核苷酸且其中該經縮短之上部莖區之6、7、8、9、10或11個核苷酸包括相對於示範性SpyCas9 sgRNA-1 (SEQ ID NO: 268)之少於或等於4個取代；或者 C. 在LS6、LS7、US3、US10、B3、N7、N15、N17、H2-2及H2-14中之任一或多者處相對於示範性SpyCas9 sgRNA-1 (SEQ ID NO: 268)之取代，其中該取代核苷酸不為後面有腺嘌呤之嘧啶，亦不為前面有嘧啶之腺嘌呤；或者 D. 具有上部莖區之示範性SpyCas9 sgRNA-1 (SEQ ID NO: 268)，其中該上部莖修飾包含對該上部莖區中US1-US12中之任一或多者的修飾。
如請求項3之嚮導RNA，其中該嚮導RNA缺少經縮短之髮夾1中之6個核苷酸。
如請求項3之嚮導RNA，其中該嚮導RNA缺少經縮短之髮夾1中之8個核苷酸。
如請求項3至5中任一項之嚮導RNA，其中缺失H-1及H-3。
如請求項3至6中任一項之嚮導RNA，其中該嚮導RNA進一步包含3’尾。
如請求項7之嚮導RNA，其中該3'尾之長度為1-4個核苷酸，視情況長度為1個核苷酸。
如請求項3至8中任一項之嚮導RNA，其中該嚮導RNA包含上部莖區，其包含對該上部莖區中US1-US12中之任一或多者的修飾。
如請求項1或2之嚮導RNA，其包含選自表3A中之序列之核苷酸序列。
如請求項1或2之嚮導RNA，其中該嚮導RNA包含選自表4中之經修飾之Spy嚮導支架序列的經修飾之核苷酸序列，其中該經修飾之核苷酸序列為該嚮導序列之3’。
如請求項11之嚮導RNA，其根據選自表15中之經修飾之Spy嚮導RNA序列的核苷酸序列之模式進行修飾。
如請求項1至12中任一項之嚮導RNA，其中該嚮導包含選自表3B中之未經修飾之Spy嚮導RNA序列之核苷酸序列，其中N20共同為如請求項2之靶向序列。
如請求項13之嚮導RNA，其中該等表3B中之未經修飾之Spy嚮導RNA序列中之各核苷酸為任何天然或非天然核苷酸。
如請求項2至10中任一項之嚮導RNA，其中該嚮導RNA根據選自表15中之修飾模式之模式進行修飾，其中(mN*)3N17係指如請求項2之靶向序列，其中前三個核苷酸包含2’-O-Me修飾及硫代磷酸酯鍵聯。
如請求項1或2之嚮導RNA，其包含選自如表12中所列之SEQ ID NO: 269、273、274、362、366或367之序列或修飾模式。
一種嚮導RNA (gRNA)，其包含嚮導區及保守區，其中： A. 該嚮導區包含核酸序列，該核酸序列包含與以下中之24個連續核苷酸至少80%、85%、較佳90%或95%一致或互補之序列： 1. SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460； 2. SEQ ID NO: 1之核苷酸35-58、146-169、153-176、216-239、330-356、330-353、333-356、342-365、447-470、666-689、713-736、740-763、755-778、1390-1413、1836-1859、2635-2658、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸146-169、153-176、330-356、330-353、333-356、447-470、713-736、740-763、755-778、1390-1413、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸447-470、330-353、755-778或713-736；或者 3. 選自表2A中之HBV編號N7、N8、N11、N24、N25、N32、N37、N40、N42、N47、N51、N55、N75、N79、N84、N97或N98；視情況N7、N8、N11、N24、N32、N37、N40、N42、N47、N79或N84；視情況N7、N24、N32或N37中任一者之靶位點； B. 該嚮導區包含與以下中之21、22、較佳23或24個連續核苷酸一致或互補的核酸序列：選自SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460之序列；或者表2A中之N7、N8、N11、N24、N25、N32、N37、N40、N42、N47、N51、N55、N75、N79、N84、N97或N98；視情況N7、N8、N11、N24、N32、N37、N40、N42、N47、N79或N84；視情況N7、N24、N32或N37之靶向序列； C. 該嚮導區選自G027224、G027225、G027228、G030107、G030108、G030115、G030120、G030123、G030125、G030130、G030134、G030138、G030158、G030162、G030167、G030180或G030181；視情況G027224、G027225、G027228、G030107、G030115、G030120、G030123、G030125、G030130、G030162或G030167；視情況G027224、G030107、G030115或G030120之靶向序列；或者 D. 該嚮導區包含與選自以下之序列中之24個連續核苷酸一致或互補之序列：SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846及核苷酸1821-2460；或者SEQ ID NO: 1之核苷酸35-58、146-169、153-176、216-239、330-356、330-353、333-356、342-365、447-470、666-689、713-736、740-763、755-778、1390-1413、1836-1859、2635-2658、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸146-169、153-176、330-356、330-353、333-356、447-470、713-736、740-763、755-778、1390-1413、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸447-470、330-353、755-778或713-736。
如請求項17之嚮導RNA (gRNA )，其中該保守區包含以下中之一或多者： (a) 經縮短之重複/反重複區，其中該經縮短之重複/反重複區相對於SEQ ID NO: 455缺少2-24個核苷酸，其中 (i) 核苷酸37-48及53-64中之一或多者相對於SEQ ID NO: 455缺失且視情況核苷酸37-64中之一或多者相對於SEQ ID NO: 455經取代；且 (ii) 核苷酸36藉由至少2個核苷酸與核苷酸65連接；或者 (b) 經縮短之髮夾1區，其中該經縮短之髮夾1相對於SEQ ID NO: 455缺少2-10個核苷酸，視情況2-8個核苷酸，其中 (i) 核苷酸82-86及91-95中之一或多者相對於SEQ ID NO: 455缺失且視情況位置82-96中之一或多者相對於SEQ ID NO: 455經取代；且 (ii) 核苷酸81藉由至少4個核苷酸與核苷酸96連接；或者 (c) 經縮短之髮夾2區，其中該經縮短之髮夾2相對於SEQ ID NO: 455缺少2-18個核苷酸，視情況2-16個核苷酸，其中 (i) 核苷酸113-121及126-134中之一或多者相對於SEQ ID NO: 455缺失且視情況核苷酸113-134中之一或多者相對於SEQ ID NO: 455經取代；且 (ii) 核苷酸112藉由至少4個核苷酸與核苷酸135連接；其中核苷酸144-145中之一或兩個相對於SEQ ID NO: 455視情況缺失；視情況地，其中至少10個核苷酸為經修飾之核苷酸。
如請求項17或18之嚮導RNA，其中該保守區包含選自表5之核苷酸序列。
如請求項1至19中任一項之嚮導RNA，其中該嚮導RNA包含至少一個末端修飾。
如請求項20之嚮導RNA，其中該修飾包含5'末端修飾。
如請求項20或21之嚮導RNA，其中該修飾包含3'末端修飾。
如請求項3至22中任一項之嚮導RNA，其中該嚮導RNA包含髮夾區中之修飾。
如請求項23之嚮導，其中髮夾區中之該修飾亦為末端修飾。
如請求項19至24中任一項之嚮導RNA，其中該修飾包含2’-O-甲基(2’-O-Me)修飾之核苷酸。
如請求項19至25中任一項之嚮導RNA，其中該修飾包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵。
如請求項19至26中任一項之嚮導RNA，其中該修飾包含2’-O-甲基(2’-O-Me)修飾之核苷酸，以硫代磷酸酯(PS)鍵連接至3’相鄰核苷酸。
如請求項19至26中任一項之嚮導RNA，其中該修飾包含2’-氟(2’F)修飾之核苷酸。
如請求項21之嚮導RNA，其中該5'末端修飾包含在該嚮導序列之5'末端之核苷酸1-3處之2’-O-甲基(2’-O-Me)修飾之核苷酸，以硫代磷酸酯(PS)鍵連接至3'相鄰核苷酸。
如請求項17之嚮導RNA，其中該保守區包含選自表6中之經修飾之保守區Nme嚮導RNA模體的經修飾之核苷酸序列，並且其中該保守區為該嚮導區的3'。
如請求項17之嚮導RNA，其中該嚮導RNA包含選自SEQ ID NO: 226-234中任一者之核苷酸序列，並且其中N表示N7、N8、N11、N24、N25、N32、N37、N40、N42、N47、N51、N55、N75、N79、N84、N97或N98；視情況N7、N8、N11、N24、N32、N37、N40、N42、N47、N79或N84；視情況N7、N24、N32或N37中任一者之嚮導序列。
如請求項31之嚮導RNA，其中各核苷酸為任何天然或非天然核苷酸。
如請求項17之嚮導RNA，其中該嚮導RNA根據選自SEQ ID NO: 670-678之模式進行修飾，其中N共同為如請求項17之嚮導序列，其中N、A、C、G及U為核糖核苷酸(2'-OH)，其中「m」指示2’-O-Me修飾，「f」指示2’-氟修飾，且「*」指示核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵聯。
一種組合物，其包含如請求項1至33中任一項之嚮導RNA。
一種組合物，其包含嚮導RNA之組合，該嚮導RNA包含嚮導區及保守區，其中： A. 該嚮導區包含核酸序列，該核酸序列包含與選自N24及N37；N7及N24；N7及N32；N7及N37；N7及N40；N24及N37；N24及N40；N37及N40；N24及N32；N32及N37；N24及N79；N24、N32及N79；N24、N32及N37；以及N24、N32及N40；視情況N24及N37；N7及N32；N7及N37之靶位點之24個連續核苷酸至少80%、85%、較佳90%或95%一致或互補之序列；且 B. 該保守區包含如請求項18至33中任一項之保守區。
如請求項34或35之組合物，其進一步包含RNA指導的DNA結合劑或編碼RNA指導的DNA結合劑之核酸。
如請求項36之組合物，其中編碼該RNA指導的DNA結合劑之該核酸包含有包含編碼該RNA指導的DNA結合劑之開放閱讀框(ORF)之mRNA。
如請求項36或37之組合物，其中該RNA指導的DNA結合劑為核酸酶。
如請求項36至38中任一項之組合物，其中該RNA指導的DNA結合劑為Cas9核酸酶。
如請求項39之組合物，其中該Cas9為釀膿鏈球菌( S. pyogenes) Cas9。
如請求項40之組合物，其中該釀膿鏈球菌Cas9包含與SEQ ID NO: 707及713具有至少90%一致性之胺基酸序列，或編碼與選自SEQ ID NO: 707及713之序列具有至少90%一致性之釀膿鏈球菌Cas9之ORF。
如請求項41之組合物，其中編碼該胺基酸序列之該ORF與SEQ ID NO: 706及712具有至少85%一致性。
如請求項39之組合物，其中該Cas9為Nme Cas9。
如請求項43之組合物，其中Nme Cas9包含與選自SEQ ID NO: 711、716、719、722或730之序列具有至少90%一致性之胺基酸序列，或編碼與選自600-620之序列具有至少90%一致性之Nme Cas9之ORF。
如請求項44之組合物，其中編碼該胺基酸序列之該ORF與選自SEQ ID NO: 705、710、715、718、721或729之序列具有至少85%一致性。
如請求項38至45中任一項之組合物，其中該核酸酶具有雙股核酸內切酶活性。
如請求項38至45中任一項之組合物，其中該核酸酶具有切口酶活性。
如請求項38至45中任一項之組合物，其中該核酸酶為無催化活性的。
如請求項38至48中任一項之組合物，其中該核酸酶進一步包含異源功能域。
如請求項49之組合物，其中該核酸酶為切口酶且該異源功能域為去胺酶。
如請求項50之組合物，其中該去胺酶為胞苷去胺酶或腺嘌呤去胺酶。
如請求項51之組合物，其中該去胺酶為胞苷去胺酶。
如請求項52之組合物，其中該去胺酶為脂蛋白元B mRNA編輯酶(APOBEC)去胺酶。
如請求項53之組合物，其中該核酸酶及該去胺酶包含與選自SEQ ID NO. 707、716、719、722或730之序列具有至少90%一致性之胺基酸序列，或編碼與SEQ ID NO: 707、716、719、722或730具有至少90%一致性之胺基酸序列之ORF。
如請求項54之組合物，其中編碼該胺基酸序列之該ORF與SEQ ID NO: 706、715、718、721或729具有至少85%一致性。
如請求項50至55中任一項之組合物，其進一步包含尿嘧啶糖苷酶抑制劑(UGI)或編碼UGI之核酸，其中該核酸酶多肽不包含UGI或者編碼該多肽之該核酸不編碼UGI。
如請求項56之組合物，其中該UGI包含與SEQ ID NO: 709、725或733具有至少90%一致性之胺基酸序列，或者編碼與選自709、725或733之序列具有至少90%一致性之胺基酸序列之ORF。
如請求項57之組合物，其中編碼該胺基酸序列之該ORF與SEQ ID NO: 708、724、732，視情況SEQ ID NO: 708具有至少85%一致性。
如請求項37至58中任一項之組合物，其中該ORF為經修飾之ORF。
如請求項34至59中任一項之組合物，其進一步包含醫藥賦形劑。
如請求項34至60中任一項之組合物，其中該嚮導RNA與脂質奈米顆粒(LNP)締合。
如請求項61之組合物，其中該LNP包含陽離子脂質。
如請求項62之組合物，其中該陽離子脂質為(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八烷-9,12-二烯酸酯，亦稱為(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯。
如請求項61至63中任一項之組合物，其中該LNP包含輔助脂質。
如請求項64之組合物，其中該輔助脂質為膽固醇。
如請求項61至66中任一項之組合物，其中該LNP包含中性脂質。
如請求項66之組合物，其中該中性脂質為1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DSPC)。
如請求項61至67中任一項之組合物，其中該LNP包含隱形脂質。
如請求項68之組合物，其中該隱形脂質為1,2-二肉豆蔻醯基-rac-甘油基-3-甲氧基聚乙二醇2000 (PEG2k-DMG)。
如請求項61之組合物，其中該LNP包含(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八烷-9,12-二烯酸酯(亦稱為(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯)、DSPC、膽固醇及PEG2k-DMG。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至33中任一項之嚮導RNA或如請求項34至70中任一項之組合物。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至33中任一項之嚮導RNA或如請求項34至70中任一項之組合物；或者一種如請求項1至33中任一項之嚮導RNA或如請求項34至70中任一項之組合物之用途，其用於誘導細胞中HBV基因內之雙股斷裂或單股斷裂，修飾細胞中HBV基因之核酸序列，或減少細胞中HBV基因之表現。
如請求項72之醫藥組合物或用途，其中該HBV基因為S基因。
如請求項72之醫藥組合物或用途，其用於減少細胞或個體中該HBV基因之表現。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至33中任一項之嚮導RNA或如請求項34至70中任一項之組合物；或者一種如請求項1至33中任一項之嚮導RNA或如請求項34至70中任一項之組合物之用途，其用於治療患有B型肝炎之個體。
如請求項75之醫藥組合物或用途，其中在投與該醫藥組合物時，該個體沒有用降低血清HBsAg的劑例如核苷酸/核苷抑制劑進行治療。
如請求項75或76之醫藥組合物或用途，其用於與免疫刺激劑組合使用。
如請求項77之醫藥組合物或用途，其中該免疫刺激劑選自下組：聚乙二醇化干擾素α 2a (PEG-IFN-α-2a)、干擾素α-2b、PEG-IFN-α-2b、干擾素λ、重組人類介白素-7及類鐸受體3、7、8或9 (TLR3、TLR7、TLR8、TLR9)促效劑、病毒進入抑制劑、Myrcludex、抑制HBsAg分泌或釋放之寡核苷酸、REP 9AC、衣殼抑制劑、Bay41-4109、NVR-1221、cccDNA抑制劑、IHVR-25、病毒衣殼、MVA衣殼、免疫檢查點調節劑、CTLA-4抑制劑、伊匹單抗(ipilimumab)、PD-1抑制劑、納武利尤單抗(Nivolumab)、帕博利珠單抗(Pembrolizumab)、BGB-A317抗體、PD-L1抑制劑、阿替利珠單抗(atezolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)、度伐利尤單抗(durvalumab)或affimer生物治療劑。
如請求項77之醫藥組合物或用途，其中該免疫刺激劑為疫苗。
如請求項79之醫藥組合物或用途，其中該疫苗為核酸疫苗或基於蛋白質之疫苗。
如請求項80之醫藥組合物或用途，其中該核酸疫苗為RNA疫苗。
如請求項71至82中任一項之醫藥組合物或用途，其中該個體患有慢性HBV。
如請求項71至82中任一項之醫藥組合物或用途，其中該個體為HBe抗原陽性。
如請求項71至82中任一項之醫藥組合物或用途，其中該個體為HBe抗原陰性。
如請求項71至84中任一項之醫藥組合物或用途，其中該個體患有D型肝炎。
如請求項85之醫藥組合物或用途，其用於治療D型肝炎。
一種誘導細胞中HBV基因內之雙股斷裂或單股斷裂或減少細胞中HBV蛋白之表現之方法，該方法包含使該細胞與如請求項1至33中任一項之嚮導RNA及RNA指導的DNA結合劑或編碼RNA指導的DNA結合劑之核酸，或者如請求項34至70中任一項之組合物接觸。
如請求項87之方法，其中該HBV蛋白為HBsAg蛋白或HBcrAg蛋白。
如請求項87或88之方法，其中該細胞在個體中。
如請求項87之方法，其中在選自血液或血清之個體樣品中量測HBsAg蛋白水準或HBcrAg蛋白水準。
如請求項90之方法，其中HBsAg之血清水準降低至小於1000 IU/ml，視情況小於100 IU/ml。
如請求項87至91中任一項之方法，其中在投與該嚮導或醫藥組合物時，該個體沒有用降低血清HBsAg之劑例如核苷酸/核苷抑制劑進行治療。
如請求項87至92中任一項之方法，其進一步包含投與免疫刺激劑。
如請求項93之方法，其中該免疫刺激劑選自下組：聚乙二醇化干擾素α 2a (PEG-IFN-α-2a)、干擾素α-2b、PEG-IFN-α-2b、干擾素λ、重組人類介白素-7及類鐸受體3、7、8或9 (TLR3、TLR7、TLR8、TLR9)促效劑、病毒進入抑制劑、Myrcludex、抑制HBsAg分泌或釋放之寡核苷酸、REP 9AC、衣殼抑制劑、Bay41-4109、NVR-1221、cccDNA抑制劑、IHVR-25、病毒衣殼、MVA衣殼、免疫檢查點調節劑、CTLA-4抑制劑、伊匹單抗、PD-1抑制劑、納武利尤單抗、帕博利珠單抗、BGB-A317抗體、PD-L1抑制劑、阿替利珠單抗、阿維魯單抗、度伐利尤單抗或affimer生物治療劑。
如請求項94之方法，其中該免疫刺激劑為疫苗。
如請求項95之方法，其中該疫苗為核酸疫苗或基於蛋白質之疫苗。
如請求項96之方法，其中該核酸疫苗為RNA疫苗。
如請求項87至97中任一項之方法，其中該個體患有慢性HBV。
如請求項87至97中任一項之方法，其中該個體為HBe抗原陽性。
如請求項87至97中任一項之方法，其中該個體為HBe抗原陰性。
如請求項87至100中任一項之方法，其中該個體患有D型肝炎。
如請求項101之方法，其進一步包含治療該個體之D型肝炎。
如請求項87至102中任一項之方法，其中該方法包含向個體投與一或多個劑量之該嚮導RNA及該RNA指導的DNA結合劑、一或多個劑量之該編碼RNA指導的DNA結合劑之核酸或一或多個劑量之該組合物，視情況包含投與兩個、三個、四個或五個劑量。
如請求項103之方法，其包含投與兩個或更多個該劑量，其中至少兩個連續劑量在相隔至少或約1個月、3個月或6個月的時間投與。
如請求項103之方法，其包含在投與第一劑量後，測定該個體之血液或血清中之HBsAg蛋白水準或HBcrAg蛋白水準；並且隨後若該HBsAg蛋白水準或該HBcrAg蛋白水準大於100 IU/ml、200 IU/ml、300 IU/ml、400 IU/ml、500 IU/ml、600 IU/ml、700 IU/ml、1800 IU/ml、900 IU/ml或1000 IU/ml，則向該個體投與第二劑量。
如請求項105之方法，其中在該第一劑量後至少或約1個月、3個月或6個月投與該第二劑量。
一種如請求項1至33中任一項之嚮導RNA或如請求項34至70中任一項之組合物之用途，其用於製備用於實施如請求項87至106之方法中任一者的藥劑。
一種包含HBV基因體之肝細胞，其中該HBV基因體包含與以下中之至少20個連續核苷酸具有至少80%、85%、視情況90%或95%一致性、視情況100%一致性之序列：SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460，例如SEQ ID NO: 1之核苷酸57-76、66-85、126-145、153-173、153-172、154-173、240-269、240-259、245-264、248-267、250-269、269-288、356-392、356-375、361-380、364-383、373-392、423-445、423-442、426-445、574-593、608-627、621-655、621-640、622-641、629-648、629-648、630-649、635-654、636-655、686-705、694-716、694-713、695-714、697-716、713-732、725-744、1597-1616、1817-1836、1845-1864、1867-1886、1880-1903、1880-1899、1883-1902、1884-1903、2072-2094、2072-2091、2073-2092、2075-2094、2299-2318、2348-2367、2634-2653、2867-2887、2867-2886、2868-2887、2891-2910、2956-2975或2982-3001；視情況核苷酸153-173、153-172、154-173或250-269；其中該HBV基因體包含該HBV基因體中與以下中之至少20個連續核苷酸具有至少80%、85%、視情況90%或95%一致性或者100%一致性之序列內之遺傳修飾：SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460，例如SEQ ID NO: 1之核苷酸57-76、66-85、126-145、153-173、153-172、154-173、240-269、240-259、245-264、248-267、250-269、269-288、356-392、356-375、361-380、364-383、373-392、423-445、423-442、426-445、574-593、608-627、621-655、621-640、622-641、629-648、629-648、630-649、635-654、636-655、686-705、694-716、694-713、695-714、697-716、713-732、725-744、1597-1616、1817-1836、1845-1864、1867-1886、1880-1903、1880-1899、1883-1902、1884-1903、2072-2094、2072-2091、2073-2092、2075-2094、2299-2318、2348-2367、2634-2653、2867-2887、2867-2886、2868-2887、2891-2910、2956-2975或2982-3001；視情況核苷酸153-173、153-172、154-173或250-269。
如請求項108之肝細胞，其中該遺傳修飾包含生成終止密碼子或破壞轉錄起始之突變。
如請求項108之肝細胞，其中該遺傳修飾包含插入缺失。
如請求項108至110中任一項之肝細胞，其中該HBV基因體包含與以下中之至少20個連續核苷酸具有至少90%、95%一致性或100%一致性之序列：SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460，例如SEQ ID NO: 1之核苷酸57-76、66-85、126-145、153-173、153-172、154-173、240-269、240-259、245-264、248-267、250-269、269-288、356-392、356-375、361-380、364-383、373-392、423-445、423-442、426-445、574-593、608-627、621-655、621-640、622-641、629-648、629-648、630-649、635-654、636-655、686-705、694-716、694-713、695-714、697-716、713-732、725-744、1597-1616、1817-1836、1845-1864、1867-1886、1880-1903、1880-1899、1883-1902、1884-1903、2072-2094、2072-2091、2073-2092、2075-2094、2299-2318、2348-2367、2634-2653、2867-2887、2867-2886、2868-2887、2891-2910、2956-2975或2982-3001；視情況核苷酸153-173、153-172、154-173或250-269。
如請求項108至110中任一項之肝細胞，其中該肝細胞包含該HBV基因體中與以下中之至少20個連續核苷酸具有至少80%、85%、視情況90%或95%一致性或者100%一致性之序列內之第二遺傳修飾：SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460，例如SEQ ID NO: 1之核苷酸57-76、66-85、126-145、153-173、153-172、154-173、240-269、240-259、245-264、248-267、250-269、269-288、356-392、356-375、361-380、364-383、373-392、423-445、423-442、426-445、574-593、608-627、621-655、621-640、622-641、629-648、629-648、630-649、635-654、636-655、686-705、694-716、694-713、695-714、697-716、713-732、725-744、1597-1616、1817-1836、1845-1864、1867-1886、1880-1903、1880-1899、1883-1902、1884-1903、2072-2094、2072-2091、2073-2092、2075-2094、2299-2318、2348-2367、2634-2653、2867-2887、2867-2886、2868-2887、2891-2910、2956-2975或2982-3001；視情況核苷酸153-173、153-172、154-173或250-269。
如請求項108至112中任一項之肝細胞，其中該遺傳修飾在該HBV基因體內與表1A中之靶位點，視情況具有選自S1-S6、S8、S11、S16、S17、S19、S21-25、S28-S30、S32、S39、S47、S49、S50、S52、S53、S57-58、S61-S64、S67、S70、S71、S74、S77、S78、S80-S87、S80、S90-S91及S93，視情況S1、S5或S6之HBV編號之gRNA的靶位點中之至少20個連續核苷酸具有至少80%、85%、較佳90%或95%一致性或者100%一致性之序列內。
如請求項108至113中任一項之肝細胞，其中該HBV基因體包含與以下中之至少24個連續核苷酸具有100%一致性或者至少80%、85%、較佳90%或95%一致性或100%一致性之序列：SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460，例如SEQ ID NO: 1之核苷酸35-58、146-169、153-176、216-239、330-356、330-353、333-356、342-365、447-470、666-689、713-736、740-763、755-778、1390-1413、1836-1859、2635-2658、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸146-169、153-176、330-356、330-353、333-356、447-470、713-736、740-763、755-778、1390-1413、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸447-470、330-353、755-778或713-736。
如請求項114之肝細胞，其中該HBV基因體包含與以下中之至少24個連續核苷酸具有至少90%或95%一致性；或者100%一致性之序列：SEQ ID NO: 1之核苷酸163-466、核苷酸1-843、核苷酸1-1205、核苷酸2314-3188、核苷酸1381-1846或核苷酸1821-2460，例如SEQ ID NO: 1之核苷酸35-58、146-169、153-176、216-239、330-356、330-353、333-356、342-365、447-470、666-689、713-736、740-763、755-778、1390-1413、1836-1859、2635-2658、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸146-169、153-176、330-356、330-353、333-356、447-470、713-736、740-763、755-778、1390-1413、2951-2974或2958-2981，視情況核苷酸447-470、330-353、755-778或713-736。
如請求項108至115中任一項之肝細胞，其中該遺傳修飾在與以下中之至少24個連續核苷酸具有至少80%、85%、視情況90%或95%一致性或者100%一致性之序列內：表2A中之靶位點，視情況具有選自N7、N8、N11、N24、N25、N32、N37、N40、N42、N47、N51、N55、N75、N79、N84、N97或N98；視情況N7、N8、N11、N24、N32、N37、N40、N42、N47、N79或N84；視情況N7、N24、N32或N37之HBV編號之gRNA的靶位點；或者具有選自N24及N37；N7及N24；N7及N32；N7及N37；N7及N40；N24及N37；N24及N40；N37及N40；N24及N32；N32及N37；N24及N79；N24、N32及N79；N24、N32及N37；以及N24、N32及N40；視情況N24及N37；N7及N32；N7及N37之HBV編號之組合的gRNA之靶位點。
如請求項108至116中任一項之肝細胞，其中將該HBV基因體整合至該肝細胞基因體中。
如請求項108至116中任一項之肝細胞，其中該HBV基因體為cccDNA。
一種修飾HBV基因體之核酸序列之方法，該方法包含使HBV感染肝細胞與如請求項1至33中任一項之嚮導RNA及RNA指導的DNA結合劑或編碼RNA指導的DNA結合劑之核酸，或者如請求項34至70中任一項之組合物接觸。
如請求項119之方法，其中該方法在活體內、在活體外或離體進行。
如請求項119或120之方法，其中該細胞在感染HBV之個體中。
一種治療個體之HBV感染之方法，該方法包含向該個體投與如請求項1至33中任一項之嚮導RNA及RNA指導的DNA結合劑或編碼RNA指導的DNA結合劑之核酸，或者如請求項34至70中任一項之組合物。
如請求項119至122中任一項之方法，其中該HBV基因體之核酸序列編碼HBV蛋白。
如請求項123之方法，其中該HBV蛋白為HBsAg或HBcrAg蛋白。
如請求項122或124之方法，其進一步包含測定個體血液或血清樣品中之HBsAg蛋白水準或HBcrAg蛋白水準。
如請求項125之方法，其中HBsAg之血清水準降低至小於1000 IU/ml，視情況小於100 IU/ml。
如請求項121至126中任一項之方法，其中在投與該嚮導或醫藥組合物時，該個體沒有用降低血清HBsAg之劑例如核苷酸/核苷抑制劑進行治療。
如請求項121至127中任一項之方法，其進一步包含向該個體投與免疫刺激劑。
如請求項128之方法，其中該免疫刺激劑選自下組：聚乙二醇化干擾素α 2a (PEG-IFN-α-2a)、干擾素α-2b、PEG-IFN-α-2b、干擾素λ、重組人類介白素-7及類鐸受體3、7、8或9 (TLR3、TLR7、TLR8、TLR9)促效劑、病毒進入抑制劑、Myrcludex、抑制HBsAg分泌或釋放之寡核苷酸、REP 9AC、衣殼抑制劑、Bay41-4109、NVR-1221、cccDNA抑制劑、IHVR-25、病毒衣殼、MVA衣殼、免疫檢查點調節劑、CTLA-4抑制劑、伊匹單抗、PD-1抑制劑、納武利尤單抗、帕博利珠單抗、BGB-A317抗體、PD-L1抑制劑、阿替利珠單抗、阿維魯單抗、度伐利尤單抗或affimer生物治療劑。
如請求項128之方法，其中該免疫刺激劑為疫苗。
如請求項130之方法，其中該疫苗為核酸疫苗或基於蛋白質之疫苗。
如請求項130之方法，其中該核酸疫苗為RNA疫苗。
如請求項121至132中任一項之方法，其中該個體患有慢性HBV。
如請求項121至133中任一項之方法，其中該個體為HBe抗原陽性。
如請求項121至134中任一項之方法，其中該個體為HBe抗原陰性。
如請求項121至135中任一項之方法，其中該個體患有D型肝炎。
如請求項136之方法，其進一步包含治療該個體之D型肝炎。
如請求項119至137中任一項之方法，其中該方法包含向個體投與一或多個劑量之該嚮導RNA及該RNA指導的DNA結合劑、一或多個劑量之該編碼RNA指導的DNA結合劑之核酸或一或多個劑量之該組合物，視情況包含投與兩個、三個、四個或五個劑量。
如請求項138之方法，其包含投與兩個或更多個該劑量，其中至少兩個連續劑量在相隔至少或約1個月、3個月或6個月的時間投與。
如請求項138之方法，其包含在投與第一劑量後，測定該個體之血液或血清中之HBsAg蛋白水準或HBcrAg蛋白水準；並且隨後若該HBsAg蛋白水準或該HBcrAg蛋白水準大於100 IU/ml、200 IU/ml、300 IU/ml、400 IU/ml、500 IU/ml、600 IU/ml、700 IU/ml、1800 IU/ml、900 IU/ml或1000 IU/ml，則向該個體投與第二劑量。
如請求項121至140中任一項之方法，其中在該第一劑量後至少或約1個月、3個月或6個月投與該第二劑量。
一種如請求項1至33中任一項之嚮導RNA或如請求項34至70中任一項之組合物之用途，其用於製備用於實施如請求項119至141之方法中任一者的藥劑。