JP6568521B2

JP6568521B2 - 多価多重特異性分子の生物学的活性を決定するためのｓｐｒベースの架橋アッセイ

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Publication number: JP6568521B2
Application number: JP2016535214A
Authority: JP
Inventors: アポロンパパディミトリウ; ヨルグトーマスレグラ; フバートケッテンバーガー; ヨルグモーレケン; クリスチャンガスナー
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2013-12-13
Filing date: 2014-12-09
Publication date: 2019-08-28
Anticipated expiration: 2034-12-09
Also published as: KR20160098239A; CA2928101A1; CN105829889B; US20240077495A1; WO2015086549A1; JP2016540212A; MX2016006743A; CN105829889A; EP3080606B1; EP3080606A1; US20170003295A1; US20210199666A1

Description

本明細書では、オリゴマーの副産物の存在下でもアッセイの特異性およびロバスト性が増加する、多重特異性の多価の分子、例えば二重特異性の二価の分子の生物学的活性を決定するための架橋アッセイの改良された構成を報告する。

発明の背景
単一特異性抗体の生物学的活性を決定するためのアッセイは周知である。例えば、
・固定化された（固相に直接または間接的に固定化された）抗原を介した抗体の捕捉、および標識された抗Fc抗体による抗原-抗体複合体の検出、または
・固定化された（固相に直接または間接的に固定化された）抗体を介した抗原の捕捉、および抗原の異なる非重複エピトープに結合する標識された抗体による抗体-抗原複合体の検出
などの、異なるアッセイ構成が知られる。

生物学的活性アッセイは、試験システムの特異的、機能的な生物学的反応に基づく、試験物質の生物学的活性を測定するための分析手順である。生物学的活性は、インビボアッセイ、細胞ベースのインビトロアッセイ、または（受容体）結合アッセイを用いて評価され得る。

表面プラズモン共鳴（SPR）は、単一特異性抗体の抗体-抗原相互作用を決定するための周知の技術である。この技術は、抗体と各抗原との結合親和性を決定するために使用され得る。

WO 2011/117329（特許文献1）には、二重特異性二価抗VEGF/抗ANG2抗体が報告されている。

WO 2009/080251（特許文献2）には、二価二重特異性抗体が報告されている。二重特異性抗体は、US 2011/0293613（特許文献3）において報告されている。WO 2010/040508（特許文献4）には、二重特異性抗VEGF/抗ANG2抗体が報告されている。二重特異性IgG抗体を産生するための一般的アプローチとしての免疫グロブリンドメインクロスオーバー（crossover）は、Schaefer, W. et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108 (2011) 11187-11192）（非特許文献1）により報告されている。

WO 2011/117329 WO 2009/080251 US 2011/0293613 WO 2010/040508

Schaefer, W. et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108 (2011) 11187-11192）

先に概要を記載したような、本明細書において報告される発見を考慮に入れない一般的原理を用いて生物学的活性を決定するためのアッセイは、二価二重特異性抗体などの多価多重特異性抗体の「機能的」多量体（multimer）、すなわち、二量体、三量体、四量体、およびより高次の集合体（aggregate）に対し、この多量体の結合に基づく結合力（avidity）が理由で、感受性であることが見出されている。

本明細書に報告される1つの局面は、多価多重特異性抗体の生物学的活性、すなわち抗原への機能的結合を決定するための、固体表面への多価多重特異性抗体の固定化のためにその抗原との相互作用のためのより小さい（低い）k_D値（解離定数）を有する多価多重特異性抗体の結合部位の（インビトロの）使用である。

1つの態様において、生物学的活性の決定は、より大きい（より高い）k_D値（解離定数）を有する多価多重特異性抗体に対する抗原との（架橋）結合シグナルを決定することによる。

1つの態様において、生物学的活性は、結合親和性である。

1つの態様において、（架橋）結合シグナルの決定は、表面プラズモン共鳴またはELISAによる。

1つの態様において、多価多重特異性抗体は、二価二重特異性抗体、三価三重特異性抗体、四価四重特異性抗体、三価二重特異性抗体、および四価三重特異性抗体から選択される。1つの態様において、多価多重特異性抗体は、二価二重特異性抗体である。

本明細書に報告される1つの局面は、表面プラズモン共鳴またはELISA法における二価二重特異性抗体とその第1および第2の抗原との同時結合の使用であって、第1の抗原が、固体表面に捕捉試薬として固定化され、二価二重特異性抗体が、第2の抗原との相互作用のためのk_D値より小さい第1の抗原との相互作用のためのk_D値を有する、表面プラズモン共鳴またはELISA法における二価二重特異性抗体の機能的多量体形態の干渉を減少させるための使用である。

1つの態様において、固体表面は、表面プラズモン共鳴チップである。

1つの態様において、第1の抗原は、二量体、三量体、または四量体である。

1つの態様において、機能的多量体は、機能的二量体である。

1つの好ましい態様において、第1の抗原は、二量体、三量体、または四量体であり、かつ機能的多量体は、機能的二量体である。

1つの態様において、その抗原との相互作用のためのより高いk_D値を有する結合部位のk_D値は、より小さいk_D値を有する二価二重特異性抗体の結合部位のk_D値よりも、少なくとも1.1倍高い。

1つの態様において、k_D値は少なくとも10倍高い。

1つの態様において、k_D値は少なくとも100倍高い。

本明細書に報告される1つの局面は、多価多重特異性抗体の生物学的活性、すなわち抗原への機能的結合の決定のための、多価多重特異性抗体とその第1および第2の抗原との同時結合（の架橋シグナル）の（インビトロの）使用であって、
多価多重特異性抗体の生物学的活性が、その第2の抗原により得られた（架橋）結合シグナルに由来し、
第2の抗原による（架橋）結合シグナルが、固体表面の捕捉試薬としての第1の固定化された抗原による表面プラズモン共鳴またはELISAによって決定され、かつ
多価多重特異性抗体が、第2の抗原との相互作用のためのk_D値（解離定数）より小さい、第1の抗原との相互作用のためのk_D値（解離定数）を有する。

1つの態様において、（架橋）結合シグナルの決定は、表面プラズモン共鳴による。

本明細書に報告される1つの局面は、多価多重特異性抗体の多量体形態からの干渉を減少させるための、多価多重特異性抗体の生物学的活性、すなわち第1および第2の抗原への同時の機能的結合の決定のための、多価多重特異性抗体とその第1および第2の抗原との同時結合の（インビトロの）使用であって、
多価多重特異性抗体の生物学的活性が、その第2の抗原により得られた（架橋）結合シグナルに由来し、
第2の抗原による（架橋）結合シグナルが、固体表面の捕捉試薬としての第1の固定化された抗原による表面プラズモン共鳴またはELISAによって決定され、かつ
多価多重特異性抗体が、第2の抗原との相互作用のためのk_D値（解離定数）より小さい、第1の抗原との相互作用のためのk_D値（解離定数）を有する。

先の全ての局面の1態様および態様において、多価多重特異性抗体と第1および第2の抗原との同時結合のための結合シグナルの決定は、二価二重特異性抗体の第2の抗原との結合に基づく。

先の全ての局面の1態様および複数の態様において、固体表面は、表面プラズモン共鳴チップまたはマルチウエルプレートのウエルの壁である。

先の全ての局面の1態様および複数の態様において、抗原との相互作用のためのより大きい（より高い）k_D値（解離定数）を有する結合部位のk_D値（解離定数）は、より小さい（より低い）k_D値（解離定数）を有する多価多重特異性抗体の結合部位のk_D値（解離定数）よりも、少なくとも1.1倍大きい（高い）。1つの態様において、k_D値（解離定数）は少なくとも1.5倍大きい（高い）。1つの態様において、k_D値（解離定数）は少なくとも2倍大きい（高い）。1つの態様において、k_D値（解離定数）は少なくとも10倍大きい（高い）。1つの態様において、k_D値（解離定数）は少なくとも100倍大きい（高い）。

先の全ての局面の1態様および複数の態様において、第1の抗原は、二量体、三量体、もしくは四量体であるか、または集合体になりやすい。

先の全ての局面の1態様および複数の態様において、機能的多量体は、機能的二量体である。

本明細書に報告される1つの局面は、以下の段階を含む、多価多重特異性抗体の生物学的活性、すなわち、抗原に対する機能的結合を決定するための（インビトロの）方法である：
多価多重特異性抗体とその第1および第2の抗原との同時結合のための（架橋）結合シグナルを決定する段階であって、
多価多重特異性抗体の生物学的活性が、第2の抗原により得られた（架橋）結合シグナルに由来し、
第2の抗原による（架橋）結合シグナルが、固体表面の捕捉試薬としての第1の固定化された抗原による表面プラズモン共鳴またはELISAによって決定され、かつ
多価多重特異性抗体が、第2の抗原との相互作用のためのk_D値（解離定数）より小さい、第1の抗原との相互作用のためのk_D値（解離定数）を有する、段階。

本明細書に報告される1つの局面は、以下の段階を含む、多価多重特異性抗体の生物学的活性、すなわち機能的結合の決定における、多価多重特異性抗体の機能的多量体形態からの干渉を減少させるための（インビトロの）方法である：
多価多重特異性抗体とその第1および第2の抗原との同時結合のための（架橋）結合シグナルを決定する段階であって、
多価多重特異性抗体の生物学的活性が、その第2の抗原により得られた（架橋）結合シグナルに由来し、
第2の抗原による（架橋）結合シグナルが、固体表面の捕捉試薬としての第1の固定化された抗原による表面プラズモン共鳴またはELISAによって決定され、かつ
多価多重特異性抗体が、第2の抗原との相互作用のためのk_D値（解離定数）より小さい、第1の抗原との相互作用のためのk_D値（解離定数）を有する、段階。

本明細書に報告される1つの局面は、以下の段階を含む、試料中の多価多重特異性抗体の機能的多量体の存在を決定するための（インビトロの）方法である：
第1の抗原が固定化され、かつ多価多重特異性抗体の捕捉のために使用されるアッセイを用いて、多価多重特異性抗体に関して決定された生物学的活性、すなわち結合シグナルを、第2の抗原が固定化され、かつ多価多重特異性抗体の捕捉のために使用される同アッセイを用いて、多価多重特異性抗体に関して決定された生物学的活性、すなわち結合シグナルと比較する段階であって、
決定された生物学的活性、すなわち結合シグナルが、行われたアッセイの標準偏差を上回って異なるかどうかで、多価多重特異性抗体の機能的多量体の存在が決定される、段階。

先の全ての局面の1態様および複数の態様において、二価二重特異性抗体とその第1および第2の抗原との同時結合のための結合シグナルの決定は、二価二重特異性抗体とその第2の抗原との結合に基づく。

先の全ての局面の1態様および複数の態様において、固体表面は、表面プラズモン共鳴チップである。

発明の詳細な説明
本明細書に報告される発見を考慮に入れない原理を用いて生物学的活性を決定するためのアッセイは、多価多重特異性抗体の「機能的」多量体、すなわち機能的二量体、機能的三量体、機能的四量体、およびより高次の機能的集合体に対し、この多量体の結合に基づく結合力が理由で、感受性であることが見出されている。

本明細書に使用される「抗体」の用語は、最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体および多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を含むがこれらに限定されない、様々な抗体構造を含む。

抗体の「クラス」は、重鎖によって保持される定常ドメインまたは定常領域の種類を意味する。5つの抗体の主要クラス、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMが存在し、これらの幾つかを、サブクラス（アイソタイプ）、例えばIgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁、およびIgA₂にさらに分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。

本明細書に使用される「モノクローナル抗体」の用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を意味し、すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、一般的にわずかな量で存在する変異体のような、例えば天然に生じる変異を含むかまたはモノクローナル抗体調製物の産生の間に生じる、可能性のある変異抗体を除き、同一であるか、および／または同一のエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物における各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。したがって、「モノクローナル」との修飾語句は、抗体の実質的に均質な集団から得られるものとして抗体の特徴を示すものであって、如何なる特定の方法による抗体の産生を要求するように解釈されることはない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない、様々な技術によって作製され得、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的な方法は、本明細書に記載される。

特定の態様において、抗体は多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の態様において、結合特異性の1つは、第1の抗原に対するものであり、他は、異なる第2の抗原に対するものである。特定の態様において、多重特異性抗体は、同一抗原の2つの異なるエピトープに結合し得る。多重特異性抗体はまた、細胞傷害性物質を、抗原を発現する細胞に局在させるために使用され得る。多重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製され得る。

多重特異性抗体を作製する技術は、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の組換え共発現（Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540、WO 93/08829、およびTraunecker, A., et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659参照）、および「ノブ-イン-ホール（knob-in-hole）」操作（例えばUS 5,731,168参照）を含むがこれらに限定されない。多重特異性抗体はまた、抗体Fcヘテロ二量体分子を作製するために静電気的ステアリング効果を操作すること（WO 2009/089004）；2つまたはそれ以上の抗体または断片を架橋結合すること（例えばUS 4,676,980、およびBrennan, M., et al., Science 229 (1985) 81-83参照）；二重特異性抗体を作製するためにロイシンジッパーを使用すること（例えばKostelny, S.A., et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553参照）；二重特異性抗体断片を作製するために「ダイアボディ（diabody）」技術を使用すること（例えばHolliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448参照）；単鎖Fv（sFv）二量体を使用すること（例えばGruber, M., et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374参照）；ならびに例えばTutt, A., et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69に記載のように三重特異性抗体を調製することによって作製され得る。

抗体または断片はまた、WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792、またはWO 2010/145793に記載されるような多重特異性抗体であり得る。

二重特異性抗体は一般的に、同一抗原の重複しない2つの異なるエピトープ、または異なる抗原の2つエピトープに特異的に結合する抗体分子である。

異なる二重特異性抗体の形態が公知である。

本明細書に報告されるような方法に使用され得る例示的な二重特異性抗体の形態は、
- クロスマブ（crossmab）形態（＝クロスマブ）：第1のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第1の結合部位、および第2のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第2の結合部位を含む、全長IgG抗体であって、個々の鎖が、
- 軽鎖1（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖κ定常ドメイン）
- 軽鎖2（可変軽鎖ドメイン＋重鎖CH1ドメイン）
- 重鎖1（可変重鎖ドメイン＋CH1＋ヒンジ＋CH2＋CH3、ホール変異（hole mutation）を有する）
- 重鎖2（可変重鎖ドメイン＋軽鎖κ定常ドメイン＋ヒンジ＋CH2＋CH3、ノブ変異（knob mutation）を有する）
である；
- 1アーム単鎖形態（＝1アーム単鎖抗体）：第1のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第1の結合部位、および第2のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第2の結合部位を含む、抗体であって、個々の鎖が、
- 軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖κ定常ドメイン）
- 組み合わせた軽鎖／重鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖κ定常ドメイン＋G₄S-リンカー＋可変重鎖ドメイン＋CH1＋ヒンジ＋CH2＋CH3、ノブ変異を有する）
- 重鎖（可変重鎖ドメイン＋CH1＋ヒンジ＋CH2＋CH3、ホール変異を有する）
である；
- 2アーム単鎖形態（＝2アーム単鎖抗体）：第1のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第1の結合部位、および第2のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第2の結合部位を含む、抗体であって、個々の鎖が、
- 組み合わせた軽鎖／重鎖1（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖κ定常ドメイン＋G₄S-リンカー＋可変重鎖ドメイン＋CH1＋ヒンジ＋CH2＋CH3、ホール変異を有する）
- 組み合わせた軽鎖／重鎖2（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖κ定常ドメイン＋G₄S-リンカー＋可変重鎖ドメイン＋CH1＋ヒンジ＋CH2＋CH3、ノブ変異を有する）
である；
- 共通軽鎖二重特異性形態（＝共通軽鎖二重特異性抗体）：第1のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第1の結合部位、および第2のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第2の結合部位を含む、抗体であって、個々の鎖が、
- 軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖κ定常ドメイン）
- 重鎖1（可変重鎖ドメイン＋CH1＋ヒンジ＋CH2＋CH3、ホール変異を有する）
- 重鎖2（可変重鎖ドメイン＋CH1＋ヒンジ＋CH2＋CH3、ノブ変異を有する）
である。

1つの態様において、二価二重特異性抗体はクロスマブである。

1つの態様において、二価二重特異性抗体は1アーム単鎖抗体である。

1つの態様において、二価二重特異性抗体は2アーム単鎖抗体である。

1つの態様において、二価二重特異性抗体は共通軽鎖二重特異性抗体である。

「機能的多量体（functional multimer）」の用語は、多価多重特異性抗体分子の各々がその結合特異性を維持し、すなわちその抗原に依然として結合することが可能である、多価多重特異性抗体の非共有結合複合体または集合体を意味する。例えば、「機能的二量体」は、結合部位の各々がその結合特異性及び結合能力を維持し、すなわち例えば二価二重特異性抗体の機能的二量体は全体で、そのうちの各2つが同一抗原に結合する4つの結合部位を含み、4つ全ての結合部位が機能的である、多価多重特異性抗体の2つの分子からなる非共有結合複合体を意味する。しかし、抗体が機能的多量体として存在する場合、全ての抗体分子は、同時に、（多価多重特異性抗体を捕捉するために使用される）固定化された抗原分子に結合することができる。これは、単量体分子と比較して、機能的多量体の複合体安定性を増加させ、そして、より不安定な単量体分子は、アッセイ手順の間に解離し得る。これは、試料の初期状態と比較して、著しく減少した量の単量体分子が存在するという結果をもたらす。複合体の検出は、抗体の捕捉のためには使用されない、多価多重特異性抗体の第2の結合特異性との相互作用に基づくため、捕捉され固定化された機能的二量体は、アッセイ読み出し値（readout）の増加を生じるであろう（図1参照）。

例えば、試験された抗体調製物中の機能的多量体（二量体）の割合の変化は、より不安定な複合体の相互作用が固定化される場合、異なるアッセイ読み出し値を生じる。したがって、多価多重特異性抗体の生物学的活性を決定するためのアッセイは、結合力による生物学的活性の明らかな増加に対して感受性である。

試験物質の生物学的活性を測定するための分析手順は、試験システムの特異的、機能的な生物学的反応に基づく。

「生物学的アッセイ」の用語は、試験システムの特異的、機能的な生物学的反応に基づく、試験物質、例えば抗体の、生物学的活性を決定するための分析法を意味する。生物学的活性は、動物ベースのインビボアッセイ、細胞ベースのインビトロアッセイ、または（受容体）結合アッセイを用いて評価され得る。1つの態様において、「生物学的活性」の用語は、その相互作用パートナーに対する試験物質の結合を意味する。二重特異性抗体の場合、「生物学的活性」の用語は、個々に、すなわち各抗原に対して別々に決定されるか、または同時に、すなわち架橋アッセイにおいて両抗原に対して同時に決定される、その各抗原に対する抗体の結合を意味する。

特異性は、存在することが予測され得る干渉を起こす構成要素の存在下で、分析物を明確に評価するための能力である。典型的には、これらは、不純物、分解産物（修飾された分析物、分析物の断片、または分析物の集合体など）、マトリクス構成要素（例えば、血清由来のもの）、副産物（分析物の多量体など）などを含み得る。

多価多重特異性抗体は、異なる標的に特異的に結合し、各標的に対して異なる親和性および複合体安定性を有する可能性が高い。完全に活性な多価多重特異性抗体のみが、全ての標的に結合することができ、対応するアッセイにおいて完全な生物学的活性を示す。

「結合価（valency）」の用語は、抗原に対する抗体の異なる結合部位の数を意味する。一価抗体は、抗原に対して1つの結合部位を含む。二価抗体は、同一抗原に対して2つの結合部位を含む。

多重特異性分子（抗体）と固定化された標的＃1（その第1の抗原）との第1の結合、および溶液から標的＃1／多重特異性分子複合体（抗原＃1／多重特異性抗体複合体）への標的＃2（その第2の抗原）の第2の動員を含むアッセイ設計は、1つの活性読み出し値（架橋アッセイ、架橋結合シグナル）で両方の結合事象をカバーする。

多重特異性分子の可能性のある副産物は、分子の多量体形態、例えば二量体、三量体、四量体、およびより高次の多量体などである。多量体形態が、両標的に依然として結合することができる場合、各標的への結合は、一価ではなく多価である（＝機能的多量体）。

「結合親和性（バインディングアフィニティ（binding affinity））」の用語は、単一の結合部位とその各標的との相互作用の強さを意味する。実験的に、親和性は、例えば、平衡状態における抗体および抗原の会合（association）の速度定数（k_A）および解離（dissociation）の速度定数（k_D）を測定することによって、決定され得る（図2参照）。

「結合の結合力（バインディングアビディティ（binding avidity））」は、1つの分子（抗体）の複数の結合部位と同一標的との相互作用の組み合わされた強さを意味する。したがって、結合力は、結合の和ではなく、結合親和性の組み合わされた相乗的な強さである（図3参照）。結合力のための必要条件は、
- 抗体などの分子の多価性、または1つの標的（抗原）に対する機能的多量体の多価性、
- 1つの可溶性標的の複数のアクセス可能なエピトープ、または抗体と様々な固定化された各標的の1つのエピトープとの複数の結合
である。

複合体会合は、アフィン（affine）結合とアビド（avid）結合とで異ならない。しかし、アビド結合の場合の複合体解離は、関与する全ての結合部位の同時の解離による（図4参照）。したがって、（アフィン結合と比較した）アビド結合の場合の結合の強さの増加は、解離速度／複合体安定性による：
-複合体安定性が大きい（高い）ほど、関与する全ての結合部位の同時の解離の可能性は低くなる；非常に安定した複合体では、アフィン結合対アビド結合の差が本質的に零になる；
-複合体安定性が小さい（低い）ほど、関与する全ての結合部位の同時の解離の可能性は高くなる；アフィン結合対アビド結合の差は増加する。

そのような抗体を含む調製物に存在する、多価多重特異性抗体（例えば二価二重特異性抗体）の機能的多量体（例えば二量体）は、多価多重特異性抗体の生物学的活性を決定するためのアッセイの結果に影響することが見出された（図1参照）。機能的多量体（二量体）は、本明細書に報告されたような特定の枠組みのルールが使用されない場合、多価多重特異性抗体の生物学的活性を決定するためのアッセイの、正確でない（架橋）結合シグナル読み出し値の原因となる。

多価多重特異性抗体（例えば二価二重特異性抗体）の生物学的活性を決定するアッセイ（例えばSPRベースのアッセイ）は、以下の場合に、多価多重特異性抗体の機能的多量体（二量体）の存在によって影響されないことが見出された：
i）多価多重特異性抗体の2つの（異なる）結合機能性／特異性が、アッセイ読み出し値／シグナル（架橋結合シグナル）の生成において／生成のために、同時に使用され、
ii）抗体捕捉のために、抗体とより安定した相互作用を有する抗原が使用されて（すなわち、抗体とより安定した相互作用を有する抗原、または逆もまた同じで、その抗原との相互作用に関してより小さいk_D値（解離定数）を有する抗体の結合特異性が、抗原の固定化／捕捉のために使用され、それにより、この抗原が固相に固定化されて）、高い抗原／抗体複合体安定性を生じ、したがって、機能的多量体に対して感受性の減少／消失を生じ、
iii）読み出し値として、架橋結合シグナル、すなわち抗体の、2つの両抗原への結合によって生じるシグナルが、抗体と両抗原との同時の相互作用に依存することから、使用される。

より詳細には、単量体の多価多重特異性抗体のように、機能的多量体（二量体）は、異なる複合体安定性を伴って両標的に結合する。機能的多量体（二量体）は、定義により多価（二価）である。

架橋形態を使用して多価多重特異性抗体の生物学的活性を決定するアッセイは、2つの異なる方向性を用いて構成され得る：標的＃1および標的＃2のいずれかが、表面に固定化され得、第2の固定化されていない標的が、溶液から標的／多重特異性分子複合体へ動員される。形成された複合体の相互作用の強さおよびそれによる安定性により、アッセイ読み出し値は異なる（図5参照）。

アッセイ構成は、機能的多量体の存在下でも、多価多重特異性抗体の生物学的活性を決定するアッセイの特異性およびロバスト性に強い影響を有することが見出された：
- 小さい（低い）複合体安定性を有する相互作用が、抗体の捕捉のために使用される、すなわち表面上にある場合、親和性による結合と比較して、結合力による結合の影響が高くなる；これは、機能的多量体（例えば二量体）を過度に強調し、アッセイは、多価多重特異性抗体に対して、より特異性が低いか、または全く適合しない；これは、多重特異性分子と機能的多量体の混合物の分析によって示されることができる：この場合、生物学的活性の読み出し値は過度に大きい（over-proportional）（すなわち、1％の多量体は、1％を超える（＞）、検出される生物学的活性の増加を生じる）；（図6参照）；
- 大きい（高い）複合体安定性を有する相互作用が、抗体の捕捉のために使用される、すなわち表面上にある場合、親和性による結合と比較して、結合力による結合の影響が低くなる；これは、機能的多量体を過度に強調することはなく、アッセイは、多価多重特異性抗体に対して、より特異性が高い；この場合、生物学的活性の読み出し値は比例的（proportional）である（すなわち、1％の多量体は、約1％の、検出される生物学的活性の増加を生じる）；（図7参照）。

抗体の捕捉のために使用される、すなわち表面上での低い複合体安定性は、機能的多量体を過度に強調するアッセイシグナルを生じることが見出された。

抗体の捕捉のために使用される、すなわち表面上での高い複合体安定性は、機能的多量体を過度に強調しないアッセイシグナルを生じることが見出された。

多価多重特異性抗体の生物学的活性に関する読み出し値に加え、固定化された抗原に対する多価多重特異性抗体の個々の生物学的活性も、決定され得る。

多価多重特異性抗体の生物学的活性に関する読み出し値に加え、架橋抗原に対する多価多重特異性抗体の個々の生物学的活性も、抗原のいずれかへの結合に影響する修飾が、互いから独立して生じることを推測することで、かつ抗体全てが両抗原に結合することを推測することで決定され得る。

図9において、機能的多量体の濃度の増加を有するアッセイ構成によるELISAアッセイ（構成を図8に示す）の結果の例示的な比較を示す（試料は二価二重特異性抗体の試料中に機能的多量体をスパイクする（spike）ことにより得られた）。多価多重特異性抗体と標的＃1との相互作用は、標的＃2との相互作用より強い（標的＃1との相互作用のk_D値（解離定数）は、標的＃2との相互作用のk_D値より小さい）。標的＃2が固定化された（捕捉物質として使用された）アッセイの方向性は、機能的多量体に対する感受性の増加を示し（1より大きな傾き）、標的#1が固定化された場合の方向性は、機能的多量体の濃度の増加に伴う変動を示さないことが分かる。

図11において、機能的多量体の濃度の増加を有するアッセイ構成によるSPRベースのアッセイ（構成を図10に示す）の結果の例示的な比較を示す（試料は二価二重特異性抗体の試料中に機能的多量体をスパイクすることにより得られた）。多価多重特異性抗体と標的＃1との相互作用は、標的＃2との相互作用より強い（標的＃1との相互作用のk_D値（解離定数）は、標的＃2との相互作用のk_D値より小さい）。標的#1が固定化されたアッセイの方向性は、機能的多量体の濃度の増加に伴う変動を示さないことが分かる。

SPRの使用は、リアルタイムでの生物学的活性の決定を可能にする。

多価多重特異性抗体の生物学的活性を決定するアッセイにおける、架橋アッセイそれ自体と本明細書に報告されたような基本的な発見の使用は、抗体を捕捉するために、より高い複合体安定性、すなわちより小さいk_D値（解離定数）を有する相互作用を使用することによって、アッセイが、機能的多量体（二量体、三量体、四量体、またはオリゴマー）に対して、より低感受性であるという結果に基づく。全読み出し値（＝架橋結合シグナル；図12、シグナルR2（8））は、多価多重特異性抗体の両方の相互作用に依存し、多価多重特異性抗体の2つの機能性をカバーする。

SPRを使用する場合、センソグラム（sensogram）は、架橋シグナルだけでなく、追加の読み出し値を有する：固定化された抗原に対する結合シグナルは、固定化された第1の抗原に結合可能な分子を定量化するための機会を与える（図12、シグナルR2（8））。全濃度に対する相対的結合シグナルを計算することができ、平均相対反応を、多価多重特異性抗体とその第1の抗原との結合活性を評価するために使用することができる。この方法において、第1の抗原に対する個々の活性を得ることが可能であり、また全体の結合活性を得ることも可能である。

以下の実施例および図面は、本発明を理解する助けとなるように提供されるが、真の範囲は特許請求の範囲に記載される。本発明の主旨から逸脱することなく、記載された手順に改変が行われ得ることが理解される。

アッセイ結果に対する、二価二重特異性抗体の機能的二量体（機能的多量体の例として）の存在の影響。抗体親和性；白矢印：事象の順序；黒矢印：読み出し値はこの差に基づく。抗体結合力；白矢印：事象の順序；黒矢印：読み出し値はこの差に基づく。抗体親和性および抗体結合力の比較。低い複合体安定性および高い複合体安定性（高いk_D値および低いk_D値）を有する抗体相互作用の比較。表面の低い複合体安定性は、機能的オリゴマーを過度に強調するアッセイシグナルを生じる。表面の高い複合体安定性は、機能的オリゴマーを過度に強調しない。模式的なELISA結合アッセイ。 ELISAでのアッセイ方向性に対する、二価二重特異性抗体に機能的多量体をスパイクすることによる影響の比較；（A）固定化された標的＃1；（B）固定化された標的＃2。模式的なSPRベースの架橋アッセイ。 SPRベースのアッセイにおける、二価二重特異性抗体に機能的多量体をスパイクすることによる影響。センソグラムからの架橋シグナルの取得；1：センサー表面に固定された第1の抗原の存在；2：二価二重特異性抗体の結合開始；3：二価二重特異性抗体の結合停止；4：第2の抗原の結合開始；5：第2の抗原の結合停止；6：レポートポイント架橋シグナル；7：R1；8：R2；9：センサーチップの再生。センソグラムは濃度ベースの関数に変換され得る。（A）0.35〜30μｇ／mlの二重特異性二価抗体（1:1.5希釈シリーズ）に対して決定されたセンソグラムオーバーレイ。（B）架橋シグナル（R2）（第2の抗原）。（C）シグナル（R1）（第1の抗原）。

実施例1
一般的アッセイの構成
表面プラズモン共鳴ベースのアッセイ（SPRベースのアッセイ）
本方法は、BIAcoreテクノロジー（GE Healthcare）を用いたSPRベースのアッセイに基づく。第一段階において、VEGFをCM5センサーチップに固定化した。第二に、抗ANG2/VEGF二価二重特異性抗体を規定された濃度範囲内で注入した。第三に、ヒトANG2（受容体結合ドメインRBD）を注入した。ヒトANG2の注入後に得られた結合反応（共鳴単位、RU、図12参照）は、VEGFおよびANG2の両方に結合した抗ANG2/VEGF抗体の量と相関するものであり（ANG2関連架橋シグナルR2（8）は生物学的活性の計算のためのベースである；VEGF結合シグナルR1（7）は考慮されない；図12参照）、使用された抗体濃度範囲に対してプロットされた（図13参照）。2次パラメトリック線にあてはめ、したがって生物学的活性の読み出し値としてy軸切片の決定を可能にする適切なコンピューターソフトウェア（例えば、XLfit4、IDBSソフトウェア）によって、得られた線形プロットを分析した。

酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）
第一段階において、ヒトANG2をマイクロタイタープレート（Nunc Maxisorb-MTP）に固定化した。第二に、抗ANG2/VEGF二価二重特異性抗体を、規定された濃度範囲内で固定化されたヒトANG2に添加した。第三に、一定量のヒトVEGFを添加した。第四に、マウス抗VEGF抗体およびヤギ抗マウスIgG抗体-POD複合体（POD＝西洋ワサビペルオキシダーゼ）の複合体を、プレインキュベーション後に添加した。最後に、2,2'-アジノ-ビス（3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸、ABTS）を添加し、規定された時間の後、リン酸の添加によって反応を停止させた。発色性ABTSシグナルをELISAリーダーによって測定した。吸光度シグナルは、ヒトANG2およびヒトVEGFの両方に結合した二価二重特異性抗体の量と関連するものであり、使用された抗体濃度に対してプロットされた。4次パラメトリックロジスティック曲線にあてはめ、したがって生物学的活性の読み出し値としてEC₅₀の決定を可能にする、XLfit4（IDBSソフトウェア）によって、このシグモイドプロットを分析した。

実施例2
二価二重特異性抗ANG2/VEGF抗体の結合特性
表面プラズモン共鳴（SPR）分析により特徴付けられる結合特性
両抗原の同時の結合を、BIAcore T100装置（GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Sweden）を用いた表面プラズモン共鳴（SPR）を適用することによって確認した。VEGFを、標準的なアミンカップリング化学を用いてCM5センサーチップに固定化した。第一段階において、二価二重特異性抗体を、25℃でHBS緩衝液（10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、pH 7.4）中10μg／mlの濃度で注入した。抗体と固定化されたVEGFとの結合の後、第二段階においてヒトANG2を10μg／mlで注入した。

さらなる実験において、二価二重特異性抗体の親和性および結合速度を決定した。簡単に述べると、ヤギ抗huIgG-Fcγポリクローナル抗体を、ANG2およびVEGFに対する二重特異性抗体の提示のために、アミンカップリングを介してCM4チップに固定化した。結合は、25℃または37℃で、HBS緩衝液中で測定された。精製されたANG2-HisまたはVEGFを、溶液中0.37 nM〜30 nMまたは3.7 nM〜200 nMの様々な濃度で添加した。会合は3分の注入によって測定され；解離は10分間のHBS緩衝液でのチップ表面の洗浄によって測定され、K_D値は1:1ラングミュア結合モデルを用いて推定された。ANG2調製物の不均一性のために、1:1結合を観察することができなかった。したがって、K_D値は見かけの値である。二価二重特異性抗体とVEGFの決定された親和性は極めて高く、計算されたオフレートは、37℃でさえBIAcoreの説明書の範囲外であった。表1において、両抗原のオフレートを要約する。

（表１）ANG2およびVEGFへの結合の速度パラメーター

活性二価二重特異性抗体の結合の定量化のためのアッセイ
SPRベースの分析に加えて、ELISAが、活性二価二重特異性抗体の結合を決定するために確立された。このアッセイにおいて、ヒトANG2を、第一段階において、Maxisorbマイクロタイタープレート（MTP）のウエルに直接コートする。一方、試料／参照標準（二価二重特異性抗体）を、ジゴキシゲニル化VEGFと共に、別のMTPのウエル中でプレインキュベートした。プレインキュベーションとコーティングの後、ANG2でコートされたMTPを洗浄することによって、過剰な未結合ANG2を除去した。その後、二価二重特異性抗体とVEGF-Digのプレインキュベートされた混合物を、ヒトANG2でコートされたMTPに移動し、インキュベートした。インキュベーションの後、過剰なプレインキュベーション溶液を洗浄によって除去し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された抗ジゴキシゲニン抗体と共にインキュベートした。抗体-酵素複合体は、ABTS（登録商標）基質の呈色反応を触媒する。シグナルは、405 nm波長（参照波長：490 nm（[405/490] nm））でELISAリーダーによって測定された。

Claims

表面プラズモン共鳴またはELISA法における、二価二重特異性抗体とその第1および第2の抗原との同時結合の使用であって、該第1の抗原が、固体表面に捕捉試薬として固定化され、該二価二重特異性抗体が、該第2の抗原との相互作用のためのk_D値より小さい該第1の抗原との相互作用のためのk_D値を有する、表面プラズモン共鳴またはELISA法における、二価二重特異性抗体の機能的多量体形態の干渉を減少させるための使用。
固体表面が、表面プラズモン共鳴チップである、請求項1に記載の使用。
第1の抗原が、二量体、三量体、または四量体である、請求項1または2に記載の使用。
機能的多量体が、機能的二量体である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用。
その抗原との相互作用のためのより高いk_D値を有する結合部位のk_D値が、より小さいk_D値を有する二価二重特異性抗体の結合部位のk_D値よりも、少なくとも1.1倍高い、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用。
k_D値が、少なくとも10倍高い、請求項5に記載の使用。
k_D値が、少なくとも100倍高い、請求項5または6に記載の使用。
以下の段階を含む、試料中の二価二重特異性抗体の機能的多量体の存在を決定する方法：
第1の抗原が固定化され、かつ二価二重特異性抗体の捕捉のために使用されるアッセイを用いて、二価二重特異性抗体に関して決定された結合シグナルを、第2の抗原が固定化され、かつ二価二重特異性抗体の捕捉のために使用される同アッセイを用いて、二価二重特異性抗体に関して決定された結合シグナルと比較する段階であって、
決定された結合シグナルが、行われたアッセイの標準偏差を上回って異なるかどうかで、該二価二重特異性抗体の機能的多量体の存在が決定される、段階。
二価二重特異性抗体とその第1および第2の抗原との同時結合のための結合シグナルを決定する段階が、二価二重特異性抗体とその第2の抗原との結合に基づく、請求項8に記載の方法。
固体表面が、表面プラズモン共鳴チップである、請求項8または9に記載の方法。
第1の抗原が、二量体、三量体、または四量体である、請求項8〜10のいずれか一項に記載の方法。
機能的多量体が、機能的二量体である、請求項8〜11のいずれか一項に記載の方法。