MX2014008762A - Metodo para la deteccion de una molecula de union de un enlazador multiespecifico. - Google Patents

Abstract

En el presente documento se reporta un método para la detección de antígeno libre de un anticuerpo multiespecífico en una muestra, por lo que el antígeno que ha de ser detectado puede ser unido específicamente por un primer sitio de unión del anticuerpo multiespecífico, que comprende el paso de incubar una muestra que comprende antígeno libre y anticuerpo multiespecífico con un anticuerpo anti-idiotípico, que se une específicamente a una segunda especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión, por lo que el anticuerpo anti-idiotípico se une a una fase sólida.

Description

METODO PARA LA DETECCION DE UNA MOLECULA DE UNION DE UN ENLAZADOR MULTIESPECIFICO CAMPO DE LA INVENCION La presente invención está dirigida a un método para la detección/determinación de molécula de unión libre, es decir que no forma complejo, de un enlazador multiespecífico, que puede ser unida específicamente por un enlazador multiespecífico en una muestra, en donde la molécula de unión unida al enlazador multiespecífico es agotada de la muestra antes de la detección de la molécula de unión libre. El enlazador multiespecífico agotado se puede usar para la detección/determinación de molécula de unión que forma complejo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los inmunoensayos de fase sólida estándares con anticuerpos implican la formación de un complejo entre un anticuerpo adsorbido/inmovilizado en una fase sólida (anticuerpo de captura) , el antígeno, y un anticuerpo a otro epítopo del antígeno conjugado con una enzima o marcador detectable (anticuerpo rastreador) . En la prueba, se forma un intercalado: fase sólida/anticuerpo de captura/antígeno/ anticuerpo rastreador. En la reacción catalizada por el intercalado entre otras cosas la actividad de la enzima conjugada a anticuerpo es proporcional a la concentración de Ref. 249153 antígeno en el medio de incubación. Las pruebas de anticuerpo anti-idiotípico se mencionan, por ejemplo, en los documentos US 5,219,730; WO 87/002778; EP 0 139 389; y EP 0 170 302. Wadhwa, M. , et al. (J. Immunol . Methods 278 (2003) 1-17) reportan estrategias para la detección, medición y caracterización de anticuerpos no deseados inducidos por compuestos biológicos terapéuticos. Un método para producir anticuerpos anti-idiotípicos se reporta en el documento EP 1 917 854. Chen, Y.-P., et al. (Clin. Vac . Immunol. 14 (2007) 720-725) reportan la detección rápida de antígeno de superficie de virus de hepatitis B por una prueba de aglutinación mediada por un diacuerpo biespecífico contra eritrocitos humanos y antígeno de superficie de virus de hepatitis B. Porter, R. , et al reportan un sistema electro-activo de inmunoensayo (prueba EASI) utilizando electrodos modificados por monocapa ensamblados (Biosensors Bioelec. 16 (2001) 9-12). El desarrollo de un inmunoensayo de enzima para la medición de factor de necrosis tumoral alfa humano (hTNF-alfa) usando anticuerpos biespecíficos a hTNF-alfa y peroxidasa de rábano picante se reporta en Berkova, N. , et al. (Biotechnol. Appl. Biochem. 23 (1996) 163-171). En el documento EP 0 962 771, se reporta un aparato y método de detección para el mismo. Reinhartz, H.W., et al. (Analyst 121 (1996) 767-771) reportan anticuerpo multivalente biespecífico estudiado por análisis de interacción en tiempo real para el desarrollo de una prueba inmunoabsorbente ligada a enzima de inhibición de antígeno. La generación química de anticuerpos biespecíficos es reportada por Doppalapudi, V.R., et al. (Proc. Nati. Acad. Sci . 107 (2010) 22611-22616).

SUMARIO DE LA INVENCION En la presente se reporta un método para la detección de la presencia o para la determinación de la cantidad de una molécula de unión libre, es decir que no forma complejo en una muestra, por lo que la molécula de unión puede ser unida específicamente por lo menos por una especificidad de unión de un enlazador multiespecífico, es decir por una primera especificidad de unión.

Se ha encontrado que es ventajoso agotar la molécula de unión que es unida específicamente por el enlazador multiespecífico, es decir, el complejo de molécula de unión-enlazador multiespecífico, de la muestra previa a la determinación de la cantidad de molécula de unión libre.

De conformidad con los métodos como se reportan aquí el agotamiento del enlazador multiespecífico es logrado al incubar la muestra ya sea con una molécula de unión, es decir con una segunda molécula de unión, que puede ser unida específicamente por una especificidad de unión diferente, es decir segunda, del enlazador multiespecífico que no se une a la molécula de unión que se ha de determinar, es decir la primera molécula de unión, o con un enlazador monoespecífico que se une específicamente a una especificidad de unión del enlazador multiespecífico, por lo que el enlazador monoespecífico se une específicamente a una especificidad de unión del enlazador multiespecífico que no se une a la molécula de unión que se ha de determinar (véase figura 2) .

Un aspecto, como se reporta aquí, es un método in vitro para la determinación de la presencia y/o la cantidad de un (primer) antígeno de un anticuerpo biespecífico en una muestra, por lo que el antígeno que ha de ser detectado puede ser unido específicamente por una primera especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, y por lo que el antígeno forma complejo con el anticuerpo biespecífico (complejo antígeno-anticuerpo biespecífico), que comprende el paso de: - incubar una muestra que comprende el antígeno y el anticuerpo biespecífico con un anticuerpo anti-idiotípico, que se une específicamente a la segunda especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión, por lo que el anticuerpo anti-idiotípico se une a una fase sólida.

En una modalidad, el método comprende los pasos de: - incubar una muestra que comprende el antígeno y el anticuerpo biespecífico con un anticuerpo anti-idiotípico, que se une específicamente a la segunda especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión, por lo que el anticuerpo anti-idiotípico se une a una fase sólida, y detectar el complejo de antígeno-anticuerpo biespecífico-anticuerpo anti-idiotípico y por lo tanto determinar la presencia y/o la cantidad del antígeno de un anticuerpo biespecífico .

En una modalidad, el método comprende los pasos de: - incubar una muestra que comprende el antígeno y el anticuerpo biespecífico con un anticuerpo anti-idiotípico, que se une específicamente a la segunda especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión, por lo que el anticuerpo anti-idiotípico se une a una fase sólida, y - incubar el complejo formado en el primer paso con un anticuerpo que se une específicamente al antígeno en un epítopo diferente del epítopo unido por el anticuerpo biespecífico y por lo tanto determinar la presencia y/o la cantidad del antígeno de un anticuerpo biespecífico en una muestra .

En una modalidad, el método es para la determinación de la presencia y/o la cantidad de un antígeno de un anticuerpo biespecífico que forma complejo con el anticuerpo biespecífico.

En una modalidad, el método comprende los siguientes pasos: - proveer una muestra que comprende el antígeno y el anticuerpo biespecífico, en donde por lo menos 90% del antígeno son formados en complejo por el anticuerpo biespecífico, - incubar una muestra que comprende el antígeno y el anticuerpo biespecífico con un anticuerpo anti-idiotípico, que se une específicamente a la segunda especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión, por lo que el anticuerpo anti-idiotípico se une a una fase sólida, y - incubar el complejo formado en el primer paso con un anticuerpo que se une específicamente al antígeno en un epítopo diferente del epítopo unido por el anticuerpo biespecífico y por lo tanto determinar la presencia y/o la cantidad del antígeno de un anticuerpo biespecífico en una muestra.

En una modalidad, el método comprende los siguientes pasos: - incubar una muestra que comprende el antígeno y el anticuerpo biespecífico con una cantidad del anticuerpo biespecífico para proveer una muestra en donde por lo menos 90% del antígeno es formado en complejo por el anticuerpo biespecífico, incubar la muestra que comprende el antígeno formado en complejo por el anticuerpo biespecífico con un anticuerpo anti-idiotípico, que se une específicamente a la segunda especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión, por lo que el anticuerpo anti - idiotípico se une a una fase sólida, y - incubar el complejo formado en el paso anterior con un anticuerpo que se une específicamente al antígeno en un epítopo diferente del epítopo unido por el anticuerpo biespecífico y por lo tanto determinar la presencia y/o la cantidad del antígeno de un anticuerpo biespecífico en una muestra .

En una modalidad, la cantidad del anticuerpo biespecífico es aproximadamente 1 pg/ml a 10 µg/ml, preferiblemente aproximadamente 1.5 ug/ml.

En una modalidad, la cantidad del anticuerpo biespecífico es 1 mg/ml de muestra.

En una modalidad, por lo menos 95% del antígeno es formado en complejo por el anticuerpo biespecífico. En una modalidad, por lo menos 98% del antígeno es formado en complejo por el anticuerpo biespecífico.

Un aspecto como se reporta aquí es un método in vitro para la determinación de la cantidad de (primer) antígeno unido al anticuerpo de un anticuerpo biespecífico en una muestra, por lo que el antígeno puede ser unido específicamente por una primera especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, que comprende los pasos de: - incubar una primera alícuota de la muestra que comprende el antígeno y el anticuerpo biespecífico con una cantidad del anticuerpo biespecífico para proveer una muestra en donde por lo menos 90% del antígeno es formado en complejo por el anticuerpo biespecífico, - incubar la muestra que comprende el antígeno formado en complejo por el anticuerpo biespecífico con un anticuerpo anti-idiotípico, que se une específicamente a la segunda especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión, por lo que el anticuerpo anti-idiotípico se une a una fase sólida, y - incubar el complejo formado en el paso anterior con un anticuerpo que se une específicamente al antígeno en un epítopo diferente del epítopo unido por el anticuerpo biespecífico y por lo tanto determinar la presencia y/o la cantidad del antígeno de un anticuerpo biespecífico en una muestra y por lo tanto determinar la cantidad total del antígeno presente en la muestra, - incubar una segunda alícuota de la muestra que comprende el antígeno y el anticuerpo biespecífico con un anticuerpo anti-idiotípico, que se une específicamente a la segunda especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión, por lo que el anticuerpo anti-idiotípico se une a una fase sólida, y - incubar el complejo formado con un anticuerpo que se une específicamente al antígeno en un epítopo diferente del epítopo unido por el anticuerpo biespecífico y por lo tanto determinar la cantidad del antígeno libre de un anticuerpo biespecífico presente en la muestra, y determinar la cantidad de antígeno unido al anticuerpo de un anticuerpo biespecífico por la diferencia entre la cantidad total del antígeno presente en la muestra y la cantidad de antígeno libre presente en la muestra.

En una modalidad, la cantidad del anticuerpo biespecífico es aproximadamente 1 pg/ml a 10 pg/ml, preferiblemente aproximadamente 1.5 pg/ml.

En una modalidad, la cantidad del anticuerpo biespecífico es 1 mg/ml de muestra.

Un aspecto como se reporta aquí es un método para la determinación in vitro de la presencia y/o cantidad de una molécula de unión (antígeno, objetivo, analito) , que puede ser unida específicamente por una primera especificidad de unión de un enlazador multiespecífico, en donde la fracción de molécula de unión unida al enlazador multiespecífico presente en una muestra es agotada antes de la detección de la molécula de unión al incubar la muestra con una segunda molécula de unión, que puede ser unida específicamente por una segunda especificidad de unión del enlazador multiespecífico, o un enlazador monoespecífico que se une específicamente a una segunda especificidad de unión del enlazador multiespecífico .

En una modalidad, la molécula de unión que ha de ser detectada es molécula de unión que no forma complejo o molécula de unión libre.

Por lo tanto, un aspecto como se reporta aquí es un método in vitro para la determinación de la presencia y/o la cantidad de una (primera) molécula de unión de un enlazador multiespecífico, por lo que la molécula de unión puede ser unido específicamente por una primera especificidad de unión del enlazador multiespecífico, que comprende el paso de: - incubar una muestra que comprende (primera) molécula de unión y enlazador multiespecífico con una segunda molécula de unión que puede ser unida específicamente por una segunda especificidad de unión del enlazador multiespecífico que es diferente de la primera especificidad de unión.

En una modalidad, el método comprende los pasos de: incubar una muestra que comprende (primera) molécula de unión y enlazador multiespecífico con un enlazador monoespecífico que se une específicamente a una segunda especificidad de unión del enlazador multiespecífico que es diferente de la primera especificidad de unión, y determinar la cantidad de la (primera libre) molécula de unión en la muestra agotada de enlazador multiespecífico .

En una modalidad, el método comprende el paso de: - incubar una muestra que comprende (primera) molécula de unión y enlazador multiespecífico con un enlazador monoespecífico que se une específicamente a una segunda especificidad de unión del enlazador multiespecífico que es diferente de la primera especificidad de unión, - agotar el complejo de enlazador monoespecífico-enlazador multiespecífico de la muestra antes de la determinación de la presencia o la cantidad de molécula de unión libre, y determinar la cantidad de la (primera libre) molécula de unión en la muestra agotada de enlazador multiespecífico .

Mediante la incubación con la segunda molécula de unión que puede ser unida específicamente por una segunda especificidad de unión del enlazador multiespecífico el enlazador multiespecífico es removído/agotado de la muestra. En forma concomitante, también los complejos de (primera) molécula de unión-enlazador multiespecífico son removidos de la muestra.

En una modalidad, el enlazador multiespecífico se selecciona de un anticuerpo, un polipéptido de fusión que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y polipéptido que no es anticuerpo, un polipéptido de fusión que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y un receptor soluble, o un polipéptido de fusión que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y una molécula de unión a péptido.

En una modalidad, el enlazador multiespecífico es un anticuerpo. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico, o un anticuerpo triespecífico, o un anticuerpo tetraespecífico, o un anticuerpo pentaespecífico, o un anticuerpo hexaespecífico . En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico .

En una modalidad, el enlazador monoespecífico es un anticuerpo anti-idiotípico.

En una modalidad, la especificidad de unión es un sitio de unión o un par de un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo y un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo.

En una modalidad, la segunda molécula de unión o el enlazador monoespecífico se une a una fase sólida.

En una modalidad, la segunda molécula de unión es biotinilada y la fase sólida es revestida con estreptavidina . En una modalidad, la fase sólida es una microesfera paramagnética revestida con estreptavidina o una microesfera de sefarosa revestida con estreptavidina.

Un aspecto como se reporta aquí es un método para la determinación inmunológica de la presencia y/o cantidad de una molécula de unión de un enlazador multiespecífico en una muestra mediante el uso de un inmunoensayo, en donde el enlazador multiespecífico es agotado de la muestra antes de la determinación de la molécula de unión.

En una modalidad, de todos los aspectos como se reportan aquí, la molécula de unión es la molécula de unión libre, es decir molécula de unión que no es unida o formada en complejo por el enlazador multiespecífico .

En una modalidad, la segunda molécula de unión es una segunda molécula de unión biotinilada y es conjugada a una fase sólida por medio de estreptavidina .

En una modalidad, de los métodos como se reporta aquí, la segunda molécula de unión es una mezcla que comprende por lo menos dos segundas moléculas de unión que difieren en el sitio en el cual son conjugadas a la fase sólida. En una modalidad, el sitio es la posición del aminoácido de la secuencia de aminoácidos de la segunda molécula de unión.

En una modalidad, la primera molécula de unión es un polipéptido.

En una modalidad, la segunda molécula de unión es un polipéptido.

En una modalidad, la conjugación de un polipéptido a su pareja de conjugación es realizada mediante unión química a través de grupos N-terminal y/o e-amino (lisina) , grupos e-amino de diferentes lisinas, grupos carboxi-, sulfhidrilo- , hidroxilo- y/o fenólico funcionales del esqueleto de aminoácidos de los grupos polipéptido y/o alcohol de azúcar de la estructura de carbohidrato del polipéptido .

En una modalidad, la segunda molécula de unión es una mezcla que comprende la segunda molécula de unión conjugada a través de por lo menos dos diferentes grupos amino a la fase sólida. Ese acoplamiento a través de diferentes grupos amino se puede realizar por acilación de una parte de los grupos e-amino con agentes protectores químicos, v.gr., por citraconilacion, en un primer paso. En un Segundo paso, la conjugación se realiza a través de los grupos amino restantes. Posteriormente, la citraconilacion es removida y la molécula de unión es conjugada a la fase sólida a través de los grupos amino libres restantes, es decir la molécula de unión obtenida es conjugada a la fase sólida a través de grupos amino que no han sido protegidos por citraconilacion. Los agentes protectores químicos adecuados forman enlaces en aminas de cadena lateral no protegidas y son menos estables que y diferentes de aquellos enlaces en el N-terminal. Muchos de esos agentes protectores químicos son conocidos (véase por ejemplo el documento EP 0 651 761) . En una modalidad, los agentes protectores químicos incluyen anhídridos de ácido dicarboxílico cíclico como anhídridos de ácido maleico o citraconílico .

En una modalidad, la segunda molécula de unión es conjugada a la fase sólida mediante adsorción pasiva. La adsorción pasiva es descrita, v.gr.( por Butler, J.E., en "Solid Phases in Immunoassay" (1996) 205-225 y Diamandis, E.P., y Christopoulos, T.K. (Editors) , en "Immunoassay" (1996) Academic Press (San Diego) .

En una modalidad, la segunda molécula de unión es conjugada (inmovilizada) a través de un par de unión específico. Ese par de unión (primer componente/segundo componente) está en une modalidad seleccionada de estreptavidina o avidina/biotina , anticuerpo/antígeno (véase, por ejemplo, Hermanson, G.T., et al, Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996) ) , lectina/polisacárido, esteroide/ proteína de unión a esteroide, hormona/receptor de hormona, enzima/sustrato, IgG/Proteína A y/o G, etc. En una modalidad, la segunda molécula de unión es conjugada a biotina y la inmovilización se realiza a través de avidina o estreptavidina inmovilizada.

Un aspecto como se reporta aquí es un método in vitro para la determinación de la presencia y/o cantidad de un (primer) antígeno de un anticuerpo multiespecífico en una muestra, por lo que el antígeno que ha de ser detectado puede ser unido específicamente por una primera especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico, que comprende el paso de: - incubar una muestra que comprende el anticuerpo multiespecífico, anticuerpo (primer) antígeno unido al multiespecífico y (primer) antígeno libre con un segundo antígeno que puede ser unido específicamente por una segunda especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión.

En una modalidad, el método comprende los pasos de: - incubar una muestra que comprende el anticuerpo multiespecífico, (primer) antígeno unido a anticuerpo multiespecífico y (primer) antígeno libre con un segundo antígeno que puede ser unido específicamente por una segunda especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión, y - determinar la cantidad del (primer) antígeno en la muestra anticuerpo multiespecífico-agotada .

En una modalidad, el método comprende el paso de: - incubar una muestra que comprende (primer) antígeno y anticuerpo multiespecífico con el segundo antígeno que puede ser unido específicamente por la segunda especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico que es diferente de la primera especificidad de unión, - agotar el complejo de segundo antígeno-anticuerpo multiespecífico de la muestra antes de la determinación de la presencia o la cantidad de antígeno libre, y - determinar la cantidad del (primer) antígeno en la muestra anticuerpo multiespecífico-agotada .

Mediante la incubación con el segundo antígeno que puede ser unida específicamente por una segunda especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico, el anticuerpo multiespecífico es removido de la muestra. En forma concomitante también los complejos de (primer) antígeno-anticuerpo multiespecífico son removidos de la muestra.

En una modalidad, la muestra comprende anticuerpo multiespecífico, (primer) antígeno libre y complejos de anticuerpo multiespecífico-antígeno y la detección es del (primer) antígeno libre del anticuerpo multiespecífico .

En una modalidad, el segundo antígeno es conjugado a una microesfera paramagnética .

En una modalidad, el segundo antígeno es conjugado a una fase sólida.

En una modalidad, el segundo antígeno es biotinilado y la fase sólida es revestida con estreptavidin . En una modalidad, la fase sólida es una microesfera paramagnética revestida con estreptavidina o una microesfera de sefarosa revestida con estreptavidina.

En una modalidad, la especificidad de unión es un sitio de unión. En una modalidad, el sitio de unión es un par de un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo y un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo.

En una modalidad, el método comprende los siguientes pasos: - incubar una muestra que comprende el anticuerpo multiespecífico, (primer) antígeno unido al anticuerpo multiespecífico y (primer) antígeno libre con un segundo antígeno que puede ser unido específicamente por una segunda especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión, para formar un complejo de segundo antígeno-anticuerpo multiespecífico, y remover el complejo de segundo antígeno-anticuerpo multiespecífico de la muestra.

En una modalidad, el complejo de segundo antígeno-anticuerpo multiespecífico es una mezcla del complejo de segundo antígeno-anticuerpo multiespecífico y complejo de segundo antígeno-anticuerpo multiespecífico- (primer) antígeno .

En una modalidad, el método comprende los siguientes pasos: incubar una muestra que comprende (primer) antígeno y anticuerpo multiespecífico con un segundo antígeno que puede ser unida específicamente por una segunda especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión, para formar un complejo de segundo antígeno-anticuerpo multiespecífico, remover el complejo de segundo antígeno-anticuerpo multiespecífico de la muestra, y - determinar la cantidad del (primer) antígeno en la muestra anticuerpo multiespecífico-agotada .

En una modalidad, la determinación de la cantidad del (primer) antígeno comprende los siguientes pasos: - incubar una muestra anticuerpo multiespecífico-agotada con un anticuerpo de captura que se une específicamente al (primer) antígeno para formar un complejo de anticuerpo de captura- (primer) antígeno, y correlacionar el complejo de anticuerpo de captura- (primer) antígeno formado a la cantidad del (primer) antígeno en la muestra.

En una modalidad, la determinación de la cantidad del (primer) antígeno comprende los siguientes pasos: incubar una muestra anticuerpo multiespecífico-agotada con un anticuerpo de captura que se une específicamente al (primer) antígeno para formar un complejo de anticuerpo de captura- (primer) antígeno, - incubar el complejo de anticuerpo de captura- (primer) antígeno con a anticuerpo rastreador, por lo que el anticuerpo de captura y el anticuerpo rastreador se unen a un epítopo no traslapable en el (primer) antígeno, y - correlacionar el complejo de anticuerpo de captura- (primer) antígeno-anticuerpo rastreador formado a la cantidad del antígeno en la muestra.

En una modalidad, la determinación de la cantidad del (primer) antígeno comprende los siguientes pasos: - incubar una muestra anticuerpo multiespecífico- 0 agotada con un anticuerpo de captura que se une específicamente al (primer) antígeno para formar un complejo de anticuerpo de captura- (primer) antígeno, - incubar el complejo de anticuerpo de captura-(primer) antígeno con un anticuerpo rastreador, por lo que el anticuerpo de captura y el anticuerpo rastreador se unen a un epítopo no traslapable en el (primer) antígeno, incubar el anticuerpo de captura- (primer) antígeno-anticuerpo rastreador complejo con un anticuerpo de detección que comprende un marcador detectable, por lo que el anticuerpo de detección se une específicamente al anticuerpo rastreador en un epítopo fuera de los dominios variables del anticuerpo rastreador, y correlacionar el complejo de anticuerpo de captura- (primer) antígeno-anticuerpo rastreador formado a la cantidad del (primer) antígeno en la muestra.

En una modalidad, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo biespecífico que tiene una primera especificidad de unión que se une específicamente a un primer antígeno o primer epítopo en un antígeno y que tiene una segunda especificidad de unión que se une específicamente a un segundo antígeno o a un segundo epítopo en el antígeno.

En una modalidad, el primer antígeno y el segundo antígeno son el mismo antígeno y la primera especificidad de unión se une a un primer epítopo en el antígeno y la segunda especificidad de unión se une a un segundo epítopo en el antígeno por lo que el segundo epítopo es un epítopo no traslapable al primer epítopo y la unión de la primera especificidad de unión no interfiere con la unión de la segunda especificidad de unión.

En una modalidad, el método comprende el paso de: - agotar el complejo formado de la muestra antes de la determinación de la presencia o la cantidad del (primer) antígeno .

Un aspecto como se reporta aquí es un método in vitro para la determinación de la presencia y/o la cantidad de un (primer) antígeno de un anticuerpo multiespecífico en una muestra, por lo que el antígeno que ha de ser detectado puede ser unido específicamente por una primera especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico, que comprende el paso de: incubar una muestra que comprende el (primer) antígeno con un complejo de anticuerpo biespecífico y segundo antígeno o un complejo de anticuerpo biespecífico y anticuerpo anti-idiotípico, que se une específicamente a la segunda especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión.

En una modalidad, el segundo antígeno es un segundo antígeno marcado. En una modalidad, el segundo antígeno es inmovilizado a través de un par de unión específico a una fase sólida. En una modalidad, el par de unión específico es biotina y estreptavidina .

En una modalidad, el método comprende como segundo paso : - incubar el complejo formado en el primer paso con un anticuerpo que se une específicamente al primer antígeno en un epítopo diferente del epítopo unido por el anticuerpo biespecífico .

Un aspecto como se reporta aquí es un método in vitro para la determinación de la presencia y/o la cantidad de un (primer) antígeno de un anticuerpo biespecífico en una muestra, por lo que el antígeno que ha de ser detectado puede ser unido específicamente por una primera especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, que comprende el paso de: - incubar una muestra que comprende el (primer) antígeno con anticuerpo biespecífico y segundo antígeno o anticuerpo biespecífico y anticuerpo anti-idiotípico, que se une específicamente a la segunda especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión, por lo que el segundo antígeno o el anticuerpo anti-idiotípico se une a una fase sólida.

En una modalidad, el método comprende como segundo paso : - incubar el complejo formado en el primer paso con un anticuerpo que se une específicamente al primer antígeno en un epítopo diferente del epítopo unido por el anticuerpo biespecífico y por lo tanto determinar la cantidad de un (primer) antígeno de un anticuerpo biespecífico en una muestra .

Un aspecto como se reporta aquí es un método in vitro para la determinación de la presencia y/o la cantidad de un (primer) antígeno de un anticuerpo biespecífico en una muestra que forma complejo con el anticuerpo biespecífico (complejo de primer antígeno-anticuerpo biespecífico) , por lo que el antígeno que ha de ser detectado puede ser unido específicamente por una primera especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, que comprende el paso de: - incubar una muestra que comprende el (primer) antígeno y el anticuerpo biespecífico con un anticuerpo anti-idiotípico, que se une específicamente a la segunda especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión, por lo que el anticuerpo anti-idiotípico se une a una fase sólida.

En una modalidad, el método comprende como segundo paso: - incubar el complejo formado en el primer paso con un anticuerpo que se une específicamente al primer antígeno en un epítopo diferente del epítopo unido por el anticuerpo biespecífico y por lo tanto determinar la cantidad de un (primer) antígeno de un anticuerpo biespecífico que forma complejo con el anticuerpo biespecífico (complejo de primer antígeno-anticuerpo biespecífico) en una muestra.

En una modalidad, el método comprende el paso de: - agotar el complejo formado de la muestra antes de la determinación de la presencia o la cantidad del (primer) antígeno .

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1. Equilibrio entre objetivo unido a fármaco (antígeno unido a anticuerpo biespecífico) y objetivo libre (antígeno libre) .

Figura 2. Agotamiento de c-MET unido a un anticuerpo anti-c-MET/HER3 biespecífico mediante el uso de HER3 ; HER3 biotinilado inmovilizado sobre microesferas magnéticas revestidas con estreptavidina ; después de la incubación de estas microesferas magnéticas con una muestra, v.gr., muestra de suero, el anticuerpo anti-C-MET/HER3 biespecífico es unido y agotado por HER3 inmovilizado; c-MET unido al anticuerpo biespecífico es co-agotado; c-MET libre (no unido al anticuerpo biespecífico) permanece en el sobrenadante de la muestra.

Figura 3. ELISA intercalada para detección de c-MET: anticuerpo anti-c-MET biotinilado se une a una placa de microtitulación revestida con estreptavidina; anticuerpo anti-c-MET inmovilizado específicamente se une a c-MET libre y un segundo, anticuerpo anti-c-MET marcado con DIG permite la detección de c-MET unido; la prueba se usa para detectar c- ET "libre" en el sobrenadante de una muestra después del agotamiento .

Figura 4A. Niveles de señal de prueba de c-MET antes y después de agotamiento inmunológico en regulador de pH: muestras con 100 ng/ml de c-MET y cantidad cada vez mayor de anticuerpo anti-c-MET/HER3 biespecífico se prepararon; complejos de bsmAb y c-MET unido se agotaron con HER3 biotinilado, unido a microesferas magnéticas; el diagrama muestra concentraciones de c-MET antes y después de agotamiento determinado por una prueba de ELISA.

Figura 4B. Niveles de señal de prueba de c-MET antes y después de agotamiento inmunológico en suero: muestras con 100 ng/ml de c-MET y cantidad cada vez mayor de anticuerpo anti -c-MET/HER3 biespecífico se prepararon; complejos de bsmAb y c-MET unido se agotaron con HER3 biotinilado, unido a microesferas magnéticas; el diagrama muestra concentraciones de c-MET antes y después de agotamiento determinado por una prueba de ELISA.

Figura 5A. ELISA para detectar el antígeno de un anticuerpo biespecífico mediante la ayuda del otro antígeno: HER3 biotinilado se une a una placa de microtitulación revestida con estreptavidina y se usa para inmovilizar anticuerpo anti -C-MET/HER3 biespecífico; c-MET se une a anticuerpo anti -C-MET/HER3 biespecífico inmovilizado; un segundo anticuerpo anti-c-MET (marcado con DIG) junto con un anticuerpo anti-DIG marcado con HRP, policlonal, permite la detección de c-MET unido.

Figura 5B. ELISA para detectar el antígeno de un anticuerpo biespecífico mediante la ayuda de un anticuerpo anti-idiotípico contra la otra especificidad de unión de este anticuerpo biespecífico: anticuerpo biotinilado anti-idiotípico contra la especificidad de unión, que se une específicamente a HER3 (idmAb<HER3>-BI) se une a una placa de microtitulación revestida con estreptavidina y se usa para inmovilizar anticuerpo anti-C-MET/HER3 biespecífico; c-MET se une a anticuerpo anti-C-MET/HER3 biespecífico inmovilizado; un segundo anticuerpo anti-c-MET (marcado con DIG) junto con un anticuerpo anti-DIG marcado con HRP, policlonal, permite la detección de c-MET unido.

Figura 6. Curva de calibración de ELISA para detectar el antígeno de un anticuerpo biespecífico mediante la ayuda del otro antígeno.

Figura 7. ELISA intercalada para detección de VEGF con un anticuerpo anti-A G2/VEGF (VEGF unido por un anticuerpo biespecífico) : Un anticuerpo biotinilado anti-idiotípico contra la especificidad de unión a ANG2 del anticuerpo biespecífico se une a una placa de microtitulación revestida con estreptavidina. El anticuerpo anti-A G2 anti-idiotípico inmovilizado forma un complejo con el anticuerpo anti-A G2/VEGF . Un segundo anticuerpo anti-VEGF marcado con digoxigenina se usa para la detección de VEGF unido a anticuerpo biespecífico .

Figura 8. Curva de calibración de ELISA para la detección de complejos de VEGF con un anticuerpo anti-ANG2/VEGF. Una serie de dilución de 0 ng/ml a 50 ng/ml de VEGF se añadió a suero que contenía 500 yg/ml de anticuerpo anti-A G2/VEGF y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las muestras se analizaron como se describe en el ejemplo 6.

Figura 9. ELISA intercalada para detección de complejos de ANG2 con anticuerpo anti -ANG2/VEGF (ANG2 -unido por anticuerpo biespecífico) : Un anticuerpo anti - idiotípico biotinilado contra la especificidad de unión a VEGF del anticuerpo biespecífico se une a una placa de microtitulación revestida con estreptavidina . El anticuerpo anti-VEGF anti-idiotípico inmovilizado forma un complejo con el anticuerpo anti-ANG2/VEGF . Un segundo anticuerpo anti-A G2 marcado con digoxigenina se usa para la detección de ANG2 unido.

Figura 10. Curva de calibración de ELISA para la detección de complejos de ANG2 con anticuerpo anti -ANG2/VEGF. Una serie de dilución de 0 ng/ml a 5000 ng/ml ANG2 se añadió a suero que contenía 5 ug/ml de anticuerpo anti-ANG2/VEGF y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las muestras se analizaron como se describe en el ejemplo 7.

Figura 11. ELISA intercalada para detección de complejos de VEGF con anticuerpo anti-A G2/VEGF (VEGF-unido por anticuerpo biespecífico) : Un anticuerpo anti-VEGF biotinilado se une a una placa de microtitulación revestida con estreptavidina . El anticuerpo anti-VEGF inmovilizado forma un complejo con el complejo anticuerpo anti -ANG2/VEGF-VEGF. Un anticuerpo anti-ANG2 anti-idiotípico marcado con digoxigenina se usa para la detección de complejo unido a anticuerpo .

Figura 12. Curva de calibración de ELISA para la detección de complejos de VEGF con anticuerpo anti-ANG2/VEGF . Una serie de dilución de 0 ng/ml a 10 ng/ml VEGF se añadió a suero que contenía anticuerpo anti -ANG2/VEGF y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente.

Figura 13. ELISA intercalada para detección de complejos de A G2 con anticuerpo anti-ANG2/VEGF (A G2-unido por anticuerpo biespecífico) : ANG2 libre es convertido a A G2 unido a anticuerpo mediante la incubación de la muestra con un anticuerpo anti-ANG2/VEGF biespecífico . Un anticuerpo anti-idiotípico biotinilado contra la especificidad de unión a VEGF del anticuerpo biespecífico se une a una placa de microtitulación revestida con estreptavidina. El anticuerpo anti-VEGF anti-idiotípico inmovilizado forma un complejo con el complejo de ANG2-anticuerpo anti-ANG2/VEGF . Un anticuerpo anti-A G2 marcado con digoxigenina que se une específicamente a un epítopo diferente en ANG2 que el anticuerpo anti-ANG2/VEGF se usa para la detección de ANG2 total.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION En la presente se reporta un método in vitro para el pre-tratamiento de una muestra para detectar "molécula de unión libre y/o total" de enlazadores multiespecífieos, tales como anticuerpos biespecíficos/fármacos , en muestras pre-clínicas y clínicas.

Se ha encontrado que es ventajoso que sea agotado el enlazador multiespecífico de la muestra antes de la detección de la molécula de unión libre.

Se ha encontrado que es ventajoso incubar la muestra con muestras enlazador multiespecífico con el fin de convertir aproximadamente la molécula de unión total en la muestra en un complejo definido.

Se ha encontrado que la captura del enlazador multiespecífico con el uso de un anticuerpo anti - idiotípico es ventajosa.

En la presente se reporta el uso de una segunda molécula de unión que puede ser unida específicamente por una segunda especificidad de unión de un anticuerpo multiespecífico terapéutico en la determinación del nivel de (primer libre) antígeno que puede ser pero no es unido por una primera especificidad de unión del anticuerpo terapéutico multiespecífico . El segundo antígeno se usa para el agotamiento del anticuerpo multiespecífico y complejos de anticuerpo multiespecífico-antígeno que ha de ser detectado a partir de una muestra.

Por lo tanto, aquí se reporta un método in vi tro para la determinación de (primera) molécula de unión libre (antígeno, objetivo, analito) de un enlazador multiespecífico que puede ser unida específicamente por una primera especificidad de unión del enlazador multiespecífico, en donde el enlazador multiespecífico es agotado de la muestra antes de la determinación de la molécula de unión libre al incubar la muestra con una segunda molécula de unión que puede ser unida específicamente por una segunda especificidad de unión del enlazador multiespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión, y con la misma agota el enlazador multiespecífico y complejos de enlazador multiespecífico- (primera) molécula de unión de la muestra.

A continuación, el método como se reporta aquí es ejemplificado con un anticuerpo multiespecífico que se une específicamente a una multitud de antígenos o epítopos en el mismo antígeno que la modalidad de un enlazador multiespecífico y con un (primer) antígeno que puede ser unido específicamente por una primera especificidad de unión de un anticuerpo multiespecífico como modalidad de la (primera) molécula de unión.

El término "anticuerpo" se usa aquí en el sentido más amplio y abarca varias estructuras de anticuerpo, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales , anticuerpo multiespecífieos (v.gr., anticuerpos biespecíficos) , y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada .

En ciertas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo multiespecífico, v.gr., un anticuerpo biespecífico . Los anticuerpos multiespecífieos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión para por lo menos dos sitios diferentes. En ciertas modalidades, una de las especificidades de unión es para un primer antígeno y la otra es para un segundo antígeno diferente. En ciertas modalidades, los anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos epítopos diferentes del mismo antígeno. Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a un primer y un segundo antígeno. En una modalidad, el anticuerpo biespecífico tiene i) una primera especificidad de unión que se une específicamente a un primer antígeno o un primer epítopo en un antígeno, y ii) una segunda especificidad de unión que se une específicamente a un segundo antígeno o un segundo epítopo en el mismo antígeno. En una modalidad, el segundo epítopo en el mismo antígeno es un epítopo no traslapable .

Los anticuerpos multiespecíficos se describen en los documentos WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792, o WO 2010/145793.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une el antígeno al cual se une el anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen pero no se limitan a Fv, Fab, Fab' , Fab' -SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de una sola cadena (v.gr., scFv) ; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo.

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseída por su cadena pesada. Hay cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, y varias de éstas se pueden dividir en subclases (isotipos) , v.gr., IgGi, IgG2, IgG3 IgG4f IgAi y IgA2. Los dominios constantes cadena pesada que corresponden a las clases diferentes de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, ?, y µ, respectivamente.

El término "antígeno libre" denota el antígeno que puede ser unido específicamente por una especificidad de unión de un anticuerpo pero que actualmente no está unida a esta especificidad de unión. En una modalidad, el antígeno libre es un antígeno no unido a anticuerpo o un antígeno que no forma complejo con anticuerpo.

El término "región Fe" se usa aquí para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene por lo menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fe de secuencia nativa y regiones de Fe variables. En una modalidad, una región Fe de cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, al carboxilo-terminal de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C-terminal (Lys447) de la región Fe puede o estar presente. A menos que se especifique de otra manera aquí, la numeración de residuos de aminoácidos en la región Fe o región constante es de conformidad con el sistema de numeración de EU, también llamado el índice de EU, como se describe en Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. , Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, D (1991) , NIH Publicación 91-3242.

"Marco" o "FR" se refiere a residuos de dominio variables distintos de los residuos de región hipervariable (HVR) . El FR de un dominio variable generalmente consiste de cuatro dominios de FR: FR1 , FR2 , FR3 y FR4. Por consiguiente, las secuencias de HVR y FR generalmente aparecen en la siguiente secuencia en VH (o VL) : FR1-H1 (Ll) -FR2-H2 (L2) -FR3- H3 (L3) -FR4.

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpo humano u otras secuencias que codifican anticuerpo humano. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente a un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácidos de HVRs no humanos y residuos de aminoácidos de FRs humanos. En ciertas modalidades, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos o por lo menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los HVRs (v.gr., CDRs) corresponden a aquellos de un anticuerpo no humano, y todos o sustancialmente todos los FRs corresponden a aquellos de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender por lo menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, v.gr. , a anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que ha sufrido humanización.

El término "región hipervariable" o "HVR" , como se usa aquí, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariable" ) . Generalmente, los anticuerpos de cuatro cadenas nativos comprenden seis HVRs; tres en la VH (Hl, H2, H3) , y tres en la VL (Ll, L2 , L3) . Las HVRs generalmente comprenden residuos de aminoácidos de los bucles hipervariables y/o de las "regiones determinantes de complementariedad" (CDRs) , las últimas son de variabilidad de secuencia más alta y/o implicadas en reconocimiento de antígeno. Los bucles hipervariables ilustrativos aparecen en los residuos de aminoácidos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) , 91-96 (L3) , 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) , y 96-101 (H3) (Chothia, C. y Lesk, A.M., J. Mol. Biol . 196 (1987) 901-917). Las CDRs ilustrativas (CDR-L1, CDR-L2 , CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 , y CDR-H3) aparecen en los residuos de aminoácidos 24-34 de Ll, 50-56 de L2, 89-97 de L3 , 31-35B de Hl, 50-65 de H2, y 95-102 de H3 (Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), Publicación de NIH 91-3242). Con la excepción de CDR1 en VH, las CDRs generalmente comprenden los residuos de aminoácidos que forman los bucles hipervariables. Las CDRs también comprenden "residuos determinantes de especificidad," o "SDRs," que son residuos que hacen contacto con antígeno. Los SDRs están contenidos dentro de las regiones de las CDRs llamadas CDRs abreviadas, o a-CDRs. Las a-CDRs ilustrativas (a-CDR-Ll, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-Hl, a-CDR-H2, y a-CDR-H3) aparecen en residuos de aminoácidos 31-34 de Ll, 50-55 de L2 , 89-96 de L3 , 31-35B de Hl, 50-58 de H2 , y 95-102 de H3 (Almagro, J.C. y Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633). A menos que se indique otra cosa, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (v.gr., residuos de FR) son numerados aquí de conformidad con Kabat et al., antes citado.

El término "anticuerpo monoclonal" , como se usa aquí, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos de variante, v.gr., que contienen mutaciones que ocurren de manera natural o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpo monoclonal, esas variantes generalmente estando presentes en cantidades menores. A diferencia de las preparaciones de anticuerpo policlonal, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) , cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal es dirigido contra un solo determinante en un antígeno. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como se obtiene de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no es construida como que requiere la producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se han de usar de conformidad con la presente invención se pueden hacer por una variedad de técnicas, incluyendo pero sin limitarse al método de hibridoma, métodos de ADN recombinante, métodos de presentación en fagos, y métodos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los loci de inmunoglobulina humana, esos métodos y otros métodos ilustrativos para hacer anticuerpos monoclonales se describen en el presente documento.

Un "polipéptido" es un polímero que consiste de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, ya sea producidos naturalmente o sintéticamente. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 20 residuos de aminoácidos pueden referirse como "péptidos" , mientras que las moléculas que consisten de dos o más polipéptidos o que comprende un polipéptido de más de 100 residuos de aminoácidos pueden referirse como "proteínas" . Un polipéptido también puede comprender componentes que no son aminoácidos, tales como grupos carbohidrato, iones de metal, ésteres de ácido o carboxílico. Los componentes que no son aminoácidos pueden ser añadidos por la célula, en la cual el polipéptido es expresado, y pueden variar con el tipo de célula. Los polipéptidos se definen aquí en términos de su estructura de esqueleto de aminoácidos o el ácido nucleico que codifica los mismos.

Adiciones tales como grupos carbohidrato generalmente no son especif cados, pero sin embargo pueden estar presentes.

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicada en unir el anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo nativo generalmente tienen estructuras similares, en donde cada dominio comprende cuatro regiones de marco conservadas (FRs) y tres regiones hipervariables (HVRs) (véase, v.gr., Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6a. ed. , W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007) , página 91) . Un solo dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular se pueden aislar mediante el uso de un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para tamizar una biblioteca de dominios VL o VH de complementariedad, respectivamente (véase, v.gr., Portolano, S. et al, J. Immunol . 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al, Nature 352 (1991) 624-628) .

El término "anticuerpo anti-idiotípico" denota un anticuerpo, que se une específicamente a una especificidad de unión tal como un sitio de unión de un anticuerpo progenitor, es decir, que es dirigido, v.gr., contra un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo progenitor. En una modalidad, el anticuerpo anti-idiotípico se une específicamente a una o más de las CDRs del anticuerpo progenitor. En una modalidad, el anticuerpo progenitor es un anticuerpo terapéutico. En una modalidad, el anticuerpo progenitor es un anticuerpo multiespecífico. En una modalidad, el anticuerpo progenitor es un anticuerpo biespecífico .

Dos epítopos son traslapables si una reducción de señal de 50% o más, en una modalidad de 75% o más, es detectada por una prueba de resonancia de plasmón de superficie (SPR) mediante el uso del anticuerpo inmovilizado y antígeno soluble, o viceversa, con el epítopo en cuestión a una concentración de 20-50 nM y el anticuerpo para el cual el traslape de epítopo tiene que ser detectado a una concentración de 100 nM. Alternativamente, se puede usar un método en el cual el traslape de epítopo de dos anticuerpos que se unen al mismo antígeno es determinado con la ayuda de un sistema de prueba competitivo. Para este propósito, por ejemplo con la ayuda de un inmunoensayo de enzima basado en células (ELISA) que utiliza células que expresan epítopos de antígeno recombinante, es probado si el anticuerpo para el cual el traslape de epítopo tiene que ser detectado compite con el otro anticuerpo para la unión al antígeno inmovilizado. Para este propósito, el antígeno inmovilizado es incubado con el anticuerpo en forma marcada y un exceso del anticuerpo para el cual el traslape de epítopo se tiene que determinar. Mediante la detección del mareaje de unión se 0 puede determinar fácilmente el traslape de epítopo. Si una reducción de señal de más de 70%, en una modalidad de más de 80%, a la misma concentración, o un desplazamiento de más de 80%, en una modalidad de más de 90%, a concentraciones superiores, en un caso con un exceso de 105 veces del anticuerpo para el cual el traslape de epítopo se tiene que de determinar, referido al anticuerpo conocido se determina, entonces la identidad o traslape de epítopo está presente y ambos anticuerpos se unen al mismo o epítopo o a uno traslapable en el mismo antígeno.

Los principios de diferentes inmunoensayos se describen, por ejemplo, en Hage, D.S. (Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304R) . Lu, B., et al. (Analyst 121 (1996) 29R-32R) reporta la inmovilización orientada de anticuerpos para usarse en inmunoensayos. Los inmunoensayos mediados por avidina-biotina son reportados, por ejemplo, por Wilchek, M . , y Bayer, E.A., en Methods Enzymol . 184 (1990) 467-469.

Los polipéptidos y anticuerpos monoclonales y sus dominios constantes contienen varias cadenas laterales de aminoácido reactivas para acoplarse a una molécula de unión, tal como una superficie, una proteína, un polímero (v.gr. , PEG, celulosa o poliestirol) , una enzima, o un miembro de un par de unión. Los grupos reactivos químicos de aminoácidos son, por ejemplo, grupos amino (lisinas, grupos alfa-amino) , grupos tiol (cistinas, cisteínas y metioninas) , grupos ácido carboxílico (ácidos aspártico, ácidos glutámicos) , y grupos de azúcar-alcohólicos. Esos métodos son descritos v.gr. , por Aslam M. , y Dent, A., en "Bioconjugation" , MacMillan Ref. Ltd. 1999, pp. 50-100.

Uno de los grupos reactivos más comunes de polipéptidos y anticuerpos es la -amina alifática del aminoácido lisina. En general, así todos los polipéptidos y anticuerpos contienen abundante lisina. Las aminas de lisina son razonablemente buenos nucleofilos arriba de pH 8.0 (pKa = 9.18) y por lo tanto reaccionan fácilmente y limpiamente con una variedad de reactivos para formar enlaces estables. Los reactivos reactivos a amina reaccionan principalmente con lisinas y los grupos a-amino de proteínas. Los esteres reactivos, particularmente esteres de N-hidroxi-succinimida (NHS) , están entre los reactivos más comúnmente utilizados para modificación de grupos amina. El pH óptimo para reacción en un ambiente acuoso es pH 8.0 a 9.0. Los isotiocianatos son reactivos de modificación de amina y forman enlaces de tiourea con proteínas. Reaccionan con aminas de proteína en solución acuosa (en forma óptima a pH 9.0 a 9.5) . Los aldehidos reaccionan bajo condiciones acuosas leves con aminas alifáticas y aromáticas, hidrazinas e hidrazidas para formar un intermediario de imina (base de Schiff) . Una base de Schiff puede ser selectivamente reducida con agentes reductores ligeros o fuertes (tales como borohidruro de sodio o cianoborohidruro de sodio) para derivar un enlace de alquilamina estable. Otros reactivos que se han usado para modificar aminas son anhídridos ácidos. Por ejemplo, anhídrido dietilentriaminopentaacético (DTPA) es un agente quelatador bifuncional que contiene dos grupos anhídrido reactivos a amina. Puede reaccionar con grupos N-terminal y e -amina de aminoácidos para formar enlaces de amida. Los anillos de anhídrido se abren para crear brazos quelatadores de metal multivalentes , capaces de unirse apretadamente a metales en un complejo de coordinación.

Otro grupo reactivo común en polipéptidos y anticuerpos es el residuo tiol del aminoácido cistina que contiene azufre y su producto de reducción cisteína (o media cistina) . La cisteína contiene un grupo tiol libre, que es más nucleofílico que las aminas y es generalmente el grupo funcional más reactivo en una proteína. Los tioles generalmente son reactivos a pH neutro, y por lo tanto pueden ser acoplados a otras moléculas selectivamente en presencia de aminas. Puesto que los grupos sulfhidrilo libres son relativamente reactivos, las proteínas con estos grupos a menudo existen con ellos en su forma oxidada como grupos disulfuro o enlaces de disulfuro. En esas proteínas, la reducción de los enlaces de disulfuro con un reactivo tal como ditiotreitol (DTT) se requiere para generar el tiol libre reactivo. Los agentes reactivos a tiol son aquellos que se acoplarán a grupos tiol en polipéptidos , al formar productos acoplados a tioéter. Estos reactivos reaccionan rápidamente a pH ligeramente ácido a neutro y por lo tanto puede reaccionar selectivamente en presencia de grupos amina. La literatura reporta el uso de varios reactivos entrelazadores de tiolación tales como el reactivo de Traut (2-iminotiolano) , acetato de succinimidilo (acetiltio) (SATA) , y 6- [3- (2 -piridilditio) propionamido] hexanoato de sulfosuccinimidilo (Sulfo-LC-SPDP) para proveer formas eficientes de introducir múltiples grupos sulfhidrilo a través de grupos amino reactivos. Los derivados de haloacetilo, v.gr. , yodoacetamidas , forman enlaces de tioéter y también son reactivos para modificación de tiol. Otros reactivos útiles son las maleimidas . La reacción de maleimidas con reactivos que son reactivos a tiol es esencialmente la misma que con yodoacetamidas. Las maleimidas reaccionan rápidamente a pH ligeramente ácido a neutro.

Otro grupo reactivo común en polipéptidos y anticuerpos son ácidos carboxílicos . Los polipéptidos y anticuerpos contienen grupos ácido carboxílico en la posición C-terminal y dentro de las cadenas laterales de ácido aspártico y ácido glutámico. La reactividad relativamente baja de ácidos carboxílicos en agua habitualmente hace difícil usar estos grupos para modificar selectivamente polipéptidos y anticuerpos. Cuando se hace esto, el grupo ácido carboxílico habitualmente es convertido a un éster reactivo mediante el uso de una carbodiimida soluble en agua y reacciona con un reactivo nucleofílico tal como una amina, hidrazida o hidrazina. El reactivo que contiene amina debe ser débilmente básico con el fin de reaccionar selectivamente con el ácido carboxílico activado en presencia de las e-aminas más altamente básicas de lisina para formar un enlace de amida adecuado. El entrelazamiento de proteína puede ocurrir cuando el pH es elevado por arriba de 8.0.

Se puede usar peryodato de sodio para oxidar la parte alcohol de un azúcar dentro de una porción carbohidrato unida a un anticuerpo a un aldehido. Cada grupo aldehido se puede hacer reaccionar con una amina, hidrazida o hidrazina como se describe para ácidos carboxílieos . Puesto que la porción carbohidrato se encuentra predominantemente en la región del fragmento cristalizable (Fe) de un anticuerpo, la conjugación se puede lograr a través de modificación dirigida al sitio del carbohidrato en alejamiento del sitio de unión a antígeno. Se forma una base de Schiff intermediaria, que puede ser reducida a una alquilamina a través de la reducción del intermediario con cianoborhidruro de sodio (ligero y selectivo) o agentes reductores solubles en agua de borhidruro de sodio (fuerte) .

El término "muestra" incluye, pero no se limita a, cualquier cantidad de una sustancia desde algo vivo o algo anteriormente vivo. Ese algo vivo incluye, pero no se limitan a, humanos, ratones, monos, ratas, conejos y otros animales. En una modalidad, la muestra se obtiene de un mono, especialmente un mono cynomolgus, o un conejo, o ratón o una rata. Esas sustancias incluyen, pero no se limitan a, en una modalidad, sangre entera, suero o plasma de un individuo, que son las fuentes de muestra más ampliamente usadas en rutina clínica .

El término "fase sólida" denota una sustancia no fluida, e incluye partículas (que incluyen micropartículas y microesferas) hechas de materiales tales como polímero, metal (partículas paramagnéticas , ferromagnéticas) , vidrio y cerámica; sustancias en gel tales como sílice, alúmina y geles de polímero; capilares, que se pueden hacer de polímero, metal, vidrio y/o cerámica; zeolitas y otras sustancias porosas; electrodos; placas de microtitulación; tiras sólidas; y cubetas, tubos o otros contenedores de muestras de espectrómetro. Un componente de fase sólida se distingue de superficies sólidas inertes en que una "fase sólida" contiene por lo menos una porción sobre su superficie, que está diseñada para interactuar con una sustancia en una muestra. Una fase sólida puede ser un componente estacionario, tal como un tubo, tira, cubeta o placa de microtitulación, o puede ser componentes no estacionarios, tales como microesferas y micropartículas . Una variedad de micropartículas que permiten ya sea la unión no covalente o covalente de proteínas y otras sustancias se pueden usar. Esas partículas incluyen partículas de polímero tales como poliestireno y poli (metilmetacrilato) ; partículas de oro tales como nanopartículas de oro y coloides de oro; y partículas de cerámica tales como partículas de sílice, vidrio y óxido de metal. Véase, por ejemplo, Martin, C.R., et al., Analytical Chemistry-News & Features, 70 (1998) 322A-327A, o Butler, J.E., Methods 22 (2000) 4-23.

De los cromógenos (grupos fluorescentes o luminiscentes y colorantes) , enzimas, grupos activos para NMR, partículas de metal o haptenos, tales como digoxigenina, el marcador detectable se selecciona en una modalidad. El marcador detectable también puede ser un grupo entrelazador fotoactivable, v.gr., un grupo azido o azirina. Los quelatos de metal que pueden ser detectados por electroquimioluminiscencia también están en grupos emisores de señal de una modalidad, con particular preferencia dada a quelatos de rutenio, v.gr., un quelato de rutenio (bispiridilo) 32+ . Los grupos de mareaje de rutenio adecuados se describen, por ejemplo, en EP 0 580 979, O 90/05301, WO 90/11511 y WO 92/14138.

En la presente se reporta un método para la determinación de la presencia y/o la cantidad de (primer libre) antígeno de un anticuerpo multiespecífico en una muestra que comprende un segundo antígeno inmovilizado por fase sólida que puede ser unido específicamente por una especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico que no es la especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico que se une específicamente a la (primer libre) antígeno que se ha de determinar para el agotamiento del anticuerpo multiespecífico, ya sea en forma de complejo o en forma que no es complejo, de la muestra antes de la determinación de la cantidad del (primer libre) antígeno.

En una modalidad, el método comprende el agotamiento del complejo de segundo antígeno-anticuerpo multiespecífico de la muestra antes de la determinación de la presencia o la cantidad de (primer) antígeno libre.

En una modalidad, la determinación de la presencia y/o la cantidad del (primer libre) antígeno en la muestra anticuerpo multiespecífico-agotada es por un inmunoensayo de puente de antígeno. En una modalidad, el inmunoensayo comprende un anticuerpo de captura y un anticuerpo rastreador, en donde la captura es conjugada a una fase sólida, y el anticuerpo rastreador es conjugado a un marcador detectable .

Un aspecto, como se reporta aquí, es un método in vítro para la determinación de la presencia y/o la cantidad de un (primer libre) antígeno de un anticuerpo multiespecífico en una muestra, por lo que el antígeno que ha de ser detectado puede ser unido específicamente por una primera especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico, que comprende el paso de: - incubar una muestra que comprende el (primer) antígeno y el anticuerpo multiespecífico con un segundo antígeno que puede ser unido específicamente por una segunda especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión, y al remover así el anticuerpo multiespecífico de la muestra.

Un experto en la técnica sabe que una muestra que comprende un antígeno y un anticuerpo que puede unirse específicamente al antígeno comprende una mezcla de antígeno libre, antígeno unido al anticuerpo y anticuerpo libre debido a termodinámica de equilibrio.

En una modalidad, el método comprende los siguientes pasos: - incubar una muestra que comprende el (primer) antígeno y el anticuerpo multiespecífico con un segundo antígeno que puede ser unida específicamente por una segunda especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión, para formar un complejo de segundo antígeno-anticuerpo multiespecífico, y remover el complejo de segundo antígeno-anticuerpo multiespecífico de la muestra.

En una modalidad, el método comprende los siguientes pasos: - incubar una muestra que comprende el (primer) antígeno y el anticuerpo multiespecífico con un segundo antígeno que puede ser unido específicamente por una segunda especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión, para formar un segundo complejo de anticuerpo-anticuerpo multiespecífico, remover el complejo de segundo antígeno-anticuerpo multiespecífico de la muestra, y - determinar la cantidad del (primer) antígeno en la muestra anticuerpo multiespecífico-agotada .

En una modalidad, el método comprende el paso de: - agotar el complejo de segundo antígeno-anticuerpo multiespecífico de la muestra antes de la determinación de la presencia o la cantidad de (primer) antígeno libre.

En una modalidad, el método comprende el paso de: incubar una muestra que comprende el (primer) antígeno y anticuerpo multiespecífico con un segundo antígeno que puede ser unido específicamente por una segunda especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico que es diferente de la primera especificidad de unión, - agotar el complejo de segundo antígeno-anticuerpo multiespecífico de la muestra antes de la determinación de la presencia o la cantidad de (primer) antígeno libre, y - determinar la cantidad del (primer) antígeno en la muestra anticuerpo multiespecífico-agotada .

En una modalidad, la determinación de la presencia y/o la cantidad del (primer) antígeno es por un inmunoensayo de puente de antígeno.

En una modalidad, la determinación de la presencia y/o la cantidad del (primer) antígeno es la determinación de la cantidad del (primer) antígeno libre.

En una modalidad, la determinación de la presencia y/o la cantidad del (primer) antígeno comprende los siguientes pasos: - incubar una muestra anticuerpo multiespecífico-agotada con un anticuerpo de captura que se une específicamente al (primer) antígeno para formar un complejo de anticuerpo de captura-antígeno, y - correlacionar la cantidad de complejo de anticuerpo de captura- (primer) antígeno formado a la cantidad del antígeno en la muestra.

En una modalidad, la determinación de la presencia y/o la cantidad del (primer) antígeno comprende los siguientes pasos: - incubar una muestra anticuerpo multiespecífico-agotada con un anticuerpo de captura que se une específicamente al (primer) antígeno para formar un complejo de anticuerpo de captura- (primer) antígeno, - incubar el complejo de anticuerpo de captura- (primer) antígeno con un anticuerpo rastreador, por lo que el anticuerpo de captura y el anticuerpo rastreador se unen a un epítopo no traslapable en el (primer) antígeno, y correlacionar el complejo de anticuerpo de captura- (primer) antígeno-anticuerpo rastreador formado a la cantidad del (primer) antígeno en la muestra.

En una modalidad, el anticuerpo rastreador comprende un marcador detectable .

En una modalidad, la determinación de la presencia y/o la cantidad del (primer) antígeno comprende los siguientes pasos: - incubar una muestra anticuerpo multiespecífico-agotada con un anticuerpo de captura que se une específicamente al (primer) antígeno para formar un complejo de anticuerpo de captura- (primer) antígeno, - incubar el complejo de anticuerpo de captura-(primer) antígeno con un anticuerpo rastreador, por lo que el anticuerpo de captura y el anticuerpo rastreador se unen a un epítopo no traslapable en el (primer) antígeno, - incubar el anticuerpo de captura- (primer) antígeno-anticuerpo rastreador complejo con un anticuerpo de detección que comprende un marcador detectable, por lo que el anticuerpo de detección se une específicamente al anticuerpo rastreador en un epítopo fuera de los dominios variables del anticuerpo rastreador, y correlacionar el complejo de anticuerpo de captura- (primer) antígeno-anticuerpo rastreador formado a la cantidad del (primer) antígeno en la muestra.

En una modalidad, el anticuerpo de captura y el anticuerpo rastreador se unen a epítopos no traslapables en el (primer) antígeno.

En una modalidad, de los métodos como se reporta aquí, el (primer) antígeno es (primer) antígeno libre.

En una modalidad, el segundo antígeno y/o el anticuerpo de captura son conjugados a una fase sólida.

El segundo antígeno y/o el anticuerpo de captura útil en un método como se reporta aquí pueden ser conjugados a una fase sólida. La conjugación es en una modalidad realizada por enlace químico a través de grupos N-terminal y/o e-amino (lisina) , grupos e-amino de diferentes lisinas, grupos funcionales carboxi-, sulfhidrilo- , hidroxilo- y/o fenólicos del esqueleto de aminoácidos del antígeno o anticuerpo y/o grupos alcohol de azúcar de la estructura de carbohidrato del antígeno y/o anticuerpo. El segundo antígeno y/o el anticuerpo de captura es en una modalidad una mezcla de por lo menos dos segundos antígenos y/o anticuerpos conjugados a una fase sólida, en donde los por lo menos dos segundos antígenos y/o anticuerpos conjugados a una fase sólida difieren en el sitio en el cual son conjugados a la fase sólida. Por ejemplo, la mezcla de por lo menos dos segundos antígenos y/o dos anticuerpos conjugados a una fase sólida pueden comprender un conjugación a través de un aminoácido del esqueleto de aminoácidos a la fase sólida y una conjugación a través de un grupo alcohol de azúcar de una estructura de carbohidrato a la fase sólida. También, por ejemplo, la mezcla de por lo menos dos segundos antígenos y/o dos anticuerpos conjugados a una fase sólida puede comprender segundos antígenos y/o anticuerpos conjugados a la fase sólida a través de diferentes residuos de aminoácidos de su esqueleto de aminoácidos. La expresión "diferente residuo de aminoácidos" denota ya sea dos diferentes tipos de aminoácidos, tales como v.gr., lisina y ácido aspártico, o tirosina y ácido glutámico, o dos residuos de aminoácidos del esqueleto de aminoácidos que difieren en su posición en la secuencia de aminoácidos del segundo antígeno y/o anticuerpo. En el último caso, el aminoácido puede ser del mismo tipo o de diferente tipo. La expresión "difiere en el sitio del anticuerpo" denota una diferencia ya sea en el tipo de sitio, v.gr., aminoácido o grupo alcohol de azúcar, o en el número del aminoácido del esqueleto de aminoácidos, v.gr., en el cual el segundo antígeno y/o anticuerpo es conjugado a la fase sólida. Lo mismo aplica viceversa al anticuerpo rastreador útil en un método como se reporta aquí.

En una modalidad del método, el inmunoensayo comprende un anticuerpo de captura, un anticuerpo rastreador y un anticuerpo de detección, en donde el anticuerpo de captura es un anticuerpo biotinilado contra el antígeno conjugado a una fase sólida por medio de estreptavidina, el anticuerpo rastreador es un anticuerpo contra el antígeno conjugado a digoxigenina, y el anticuerpo de detección es un anticuerpo contra digoxigenina conjugada a peroxidasa de rábano picante.

El método general para agotamiento de complejos que consisten de anticuerpos biespecífieos que se unen específicamente a antígeno X y antígeno Y y de muestras que comprenden antígeno X y/o antígeno Y para la determinación de antígeno X o antígeno Y, respectivamente, comprende los siguientes pasos: ensamble de complejos entre anticuerpo biespecífico que se une específicamente a antígeno X y antígeno Y (anticuerpo anti-X/Y) : Una concentración constante de antígeno X es incubada con cantidad cada vez mayor del anticuerpo monoclonal biespecífico, que se une específicamente a antígeno X con una primera especificidad de unión y que se une específicamente a antígeno Y con una segunda especificidad de unión (anticuerpo anti-X/Y) , a temperatura ambiente durante 1 hora. Posteriormente, esta muestra se usa como control positivo en el paso de agotamiento. - paso de agotamiento: Para el agotamiento de antígeno X unido a un anticuerpo anti-X/Y, el antígeno Y-BI biotinilado se une a microesferas revestidas con estreptavidina magnéticas (microesferas SA) a aproximadamente 10 g/ml . Para cada muestra, 600 µ? de microesferas SA son lavadas y separadas del sobrenadante con un separador magnético. 600 µ? de una solución que contiene antígeno Y biotinilado se mezcla con las microesferas SA y se incuba durante aproximadamente una hora a temperatura ambiente. El exceso de antígeno no unido es removido por lavado 3 veces de las microesferas con un separador magnético. Posteriormente, las microesferas revestidas con antígeno Y son incubadas con aproximadamente 250 µ? de una muestra que contiene complejos de anticuerpo anti-X/Y y antígeno X. La mezcla se incuba a temperatura ambiente con agitación durante aproximadamente una hora. Después de la incubación, las microesferas se separan de la muestra con un separador magnético. El sobrenadante se toma para análisis de antígeno X "libre" en ELISA (véase, v.gr., ejemplo 2) . Las microesferas restantes fueron transferidas a contenedores ELECSYS y antígeno X unido a microesferas (antígeno X unido a anticuerpo biespecífico) es analizado con analizador ELECSYS 2010 de acuerdo con procedimientos operativos estándares de la guía de usuario.

Para el agotamiento de antígeno Y unido a un anticuerpo anti-X/Y, el antígeno X biotinilado (X-BI) se une a microesferas revestidas con estreptavidiva magnéticas (microesferas SA) a aproximadamente 10 pg/ml. Para cada muestra, 600 µ? de microesferas SA son lavadas y separadas del sobrenadante con un separador magnético. 600 µ? de una solución que contiene antígeno X biotinilado se mezcla con las microesferas SA y se incuba durante aproximadamente una hora a temperatura ambiente. El exceso de antígeno X no unido es removido por lavado 3 veces de las microesferas con un separador magnético. Posteriormente, las microesferas revestidas con antígeno X son incubadas con aproximadamente 250 µ? de una muestra que contiene complejos de anticuerpo anti-X/Y y antígeno Y. La mezcla se incuba a temperatura ambiente con agitación durante aproximadamente una hora. Después de la incubación, las microesferas se separan de la muestra con un separador magnético. El sobrenadante se toma para análisis de antígeno Y "libre" en en ELISA (véase, v.gr., ejemplo 2). Las microesferas restantes fueron transferidas a contenedores ELECSYS y antígeno Y unido a microesferas (antígeno Y unido a anticuerpo biespecífico) es analizado con analizador ELECSYS 2010 de acuerdo con procedimientos operativos estándares de la guía de usuario.

Para la determinación de las propiedades farmacocinéticas de un anticuerpo multiespecífico in vivo, la distribución o cantidad de primer antígeno libre, segundo antígeno libre, anticuerpo multiespecífico libre, así como complejo de anticuerpo multiespecífico-primer y/o segundo antígeno se puede determinar.

Un aspecto, como se reporta aquí, es un método in vitro adecuado para la determinación de la presencia y/o la cantidad de (primer) antígeno libre de un anticuerpo biespecífico, por lo que el (primer) antígeno puede ser unido específicamente por una primera especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, que comprende el paso de: incubar una muestra que comprende (primer) antígeno y anticuerpo biespecífico con un anticuerpo anti-idiotípico que se une específicamente a una segunda especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión.

En una modalidad, el método comprende los pasos de: - incubar una muestra que comprende (primer) antígeno y anticuerpo biespecífico con un anticuerpo anti-idiotípico que se une específicamente a una segunda especificidad de unión del anticuerpo biespecífico que es diferente de la primera especificidad de unión, - remover el complejo de anticuerpo anti-idiotípico-anticuerpo biespecífico de la muestra, y - determinar la cantidad del antígeno en la muestra anticuerpo biespecífico-agotada .

El anticuerpo anti-idiotípico se puede unir a una fase sólida.

La detección del anticuerpo biespecífico se puede realizar como determinación inmunológica mediante el uso de una prueba de puente que comprende una molécula de captura, una molécula de rastreo y una molécula de detección.

La molécula de captura se puede unir a una fase sólida. La molécula de captura puede ser en general cualquiera de una molécula de unión del anticuerpo biespecífico (v.gr., uno de los antígenos) , un agente formador de complejo general del anticuerpo biespecífico (v.gr., un receptor de Fe o un anticuerpo anti-región Fe en el caso de un anticuerpo de longitud completa) , o un anticuerpo anti-idiotípico que se une específicamente a una especificidad de unión del anticuerpo biespecífico.

La molécula de rastreo puede ser cualquiera de una molécula de unión del enlazador multiespecífico (v.gr., uno de los antígenos del anticuerpo biespecífico, pero si se usa un antígeno como molécula de captura, un antígeno diferente se tiene que usar como molécula de rastreo) , un agente formador de complejo general del anticuerpo biespecífico (v.gr., un receptor de Fe en el caso de un anticuerpo de longitud completa con la condición de que esta molécula no es ya usada como molécula de captura, o un anticuerpo anti-región Fe en el caso de un anticuerpo de longitud completa con la condición de que este anticuerpo se una a un epítopo diferente si el mismo tipo de anticuerpo también se usa como molécula de captura) , o una primera pareja de un par de unión si el anticuerpo biespecífico es derivado con la segunda pareja de un par de unión (con la condición de que un par de unión diferente se use como aquel usado para inmovilizar la molécula de captura) , o un anticuerpo anti - idiotípico que se une específicamente a una especificidad de unión del anticuerpo biespecífico (con la condición de que éste se una a una especificidad de unión diferente que un anticuerpo anti-idiotípico si se usa como molécula de captura) .

Un aspecto, como se reporta aquí, es un método in vitro para la determinación de la presencia y/o la cantidad de un (primer) antígeno de un anticuerpo biespecífico en una muestra que forma complejo con el anticuerpo biespecífico (complejo de primer antígeno-anticuerpo biespecífico) , por lo que el antígeno que ha de ser detectado puede ser unido específicamente por una primera especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, que comprende el paso de: - incubar una muestra que comprende el (primer) antígeno y el anticuerpo biespecífico con un anticuerpo anti-idiotípico, que se une específicamente a la segunda especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión, por lo que el anticuerpo anti-idiotípico se une a una fase sólida.

En una modalidad, un comple o de anticuerpo anti-idiotípico-anticuerpo biespecífico- (primer) antígeno se forma en el primer paso del método.

En una modalidad, el método comprende como segundo paso : - incubar el complejo formado en el primer paso con un anticuerpo que se une específicamente al (primer) antígeno en un epítopo diferente del epítopo unido por el anticuerpo biespecífico y por lo tanto determinar la presencia y/o la cantidad de un (primer) antígeno de un anticuerpo biespecífico que forma complejo con el anticuerpo biespecífico ((primer) complejo antígeno-anticuerpo biespecífico) en una muestra.

La determinación de antígeno total, unido a anticuerpo y libre, es valioso para monitorear terapias con anticuerpos terapéuticos. Por ejemplo, en el caso de un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a ANG2 y VEGF, el mecanismo de acción es el bloqueo de ambos antígenos para unirse en sus receptores correspondientes. En ausencia de ligando libre, la trayectoria de señal es bloqueada. Por lo tanto, una posibilidad para determinar la fracción de antígeno libre y antígeno unido al anticuerpo tiene influencia sobre terapia, en particular para hallazgo de dosis y frecuencia de dosificación. El antígeno total representa la suma de antígeno libre y unido (a anticuerpo) .

Durante el tratamiento de pacientes, el antígeno y el anticuerpo terapéutico en paralelo están presentes en el paciente y se forman complejos de los mismos. Por lo tanto, el equilibrio entre antígeno unido a anticuerpo y libre existe in vivo. El lugar del equilibrio puede ser influenciado in vitro, v.gr., por dilución de la muestra o por los anticuerpos seleccionados para detección o captura. En particular para antígeno libre, puede haber una discrepancia potencial entre cantidad "in vivo" presente e "in vitro" determinada. Además de los métodos de pre-tratamiento, éste puede ser superado, por determinación analítica de antígeno unido a anticuerpo y antígeno total, y la determinación subsiguiente de antígeno libre basado en el mismo. A menudo, los formatos de prueba para la determinación de antígeno unido a anticuerpo y antígeno total se preparan de manera diferente, por ejemplo, el tipo de prueba podría ser diferente, los anticuerpos usados para captura y detección podrían ser diferentes, los pasos de secuencia y tiempo de incubación podrían ser diferentes entre la prueba usada para la determinación de antígeno unido al anticuerpo y la prueba usada para la determinación de total antígeno.

Por el contrario, en el ejemplo 9 y figura 13 se describe una prueba, que se puede usar para la determinación de antígeno total y antígeno unido al anticuerpo. Esta característica única es permitida por la biespecificidad del anticuerpo (terapéutico) y hace uso de un anticuerpo anti-idiotípico a la segunda especificidad de unión.

El objetivo unido se determina directamente en la muestra in vivo, v.gr., muestra de plasma.

Simplemente, por adición in vitro de un exceso de anticuerpo biespecífico, el antígeno libre presente en la muestra es convertido a antígeno unido al anticuerpo. Por lo tanto, al llevar a cabo exactamente la misma prueba que para el objetivo unido anteriormente por segunda vez, se determina el antígeno total. La diferencia entre los resultados de prueba con y sin adición in vitro de anticuerpo biespecífico refleja la cantidad de objetivo convertido, es decir objetivo libre originalmente presente.

Los siguientes ejemplos y figuras se proveen para ayudar a entender la presente invención, el verdadero alcance que se expone en las reivindicaciones anexas. Se entiende que se pueden hacer modificaciones en los procedimientos expuestos sin apartarse de la esencia de la invención.

Ejemplo 1 Agotamiento de objetivo unido a fármaco (antígeno unido al anticuerpo) en casos de moléculas de fármaco biespecíficas A) Ensamble de complejos de anticuerpo anti-c- MET/HER3 biespecífico y c-MET .

Una concentración constante de c-MET se incubó con cantidad cada vez mayor de anticuerpo biespecífico que se une específicamente a c-MET con una primera especificidad de unión y que se une específicamente a HER3 con una segunda especificidad de unión (anticuerpo anti-c-MET/HER3 biespecífico) a temperatura ambiente durante 1 hora. Posteriormente, estas muestras se usaron como controles positivos en paso de agotamiento.

B) Paso de agotamiento Para agotamiento de c-MET unido a un anticuerpo anti-c-MET/HER3 biespecífico, HER3 biotinilado (HER3-BI) fue unido a microesferas revestidas con estreptavidiva magnéticas (microesferas SA) a 10 yg/ml. Para cada muestra, 600 µ? de microesferas SA se lavaron y se separaron del sobrenadante con un separador magnético. Aproximadamente 600 µ? de un solución que contenía HER3-BI se mezcló con las microesferas SA y incubadas durante 1 hr a temperatura ambiente. El exceso de HER3-BI no unido fue removido por lavado 3 veces de las microesferas con un separador magnético. Posteriormente, microesferas revestidas con antígeno se incubaron con 250 µ? de muestras que contenían complejos de anticuerpo anti-c-MET/HER3 biespecífico y c-MET. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente con agitación durante 1 hora. Después de la incubación, las microesferas se separaron de la muestra con un separador magnético. El sobrenadante se tomó para análisis de c-MET "libre" en ELISA (véase ejemplo 2).

E emplo 2 ELISA para detección de c-MET Un anticuerpo monoclonal biotinilado contra c-MET fue revestido a una placa de microtitulación de estreptavidina en el primer paso. La muestra de sobrenadante del paso de agotamiento (véase ejemplo 1) se diluyó 10 veces y se añadió a los pozos de la microplaca revestida con anticuerpo anti-c-MET. El c-MET libre contenido en la muestra fue unido por el anticuerpo anti-c-MET revestido a pozos de la microplaca. Después de un tiempo de incubación de 1 hora a temperatura ambiente, la muestra fue removida por lavado 3 veces de la placa. Posteriormente, un anticuerpo anti-c-MET marcado con DIG monoclonal con una especificidad diferente, es decir epítopo, que el anticuerpo de revestimiento se añadió a los pozos y se incubó durante otra hora a temperatura ambiente . Después de otro paso de lavado, un anticuerpo anti-DIG marcado con HRP policlonal se añadió a la placa y se incubó durante otra hora. Una solución de sustrato de ABTS se usó para activar una reacción de color (véase figura 3) .

Ejemplo 3 Agotamiento de c-MET unido a fármaco en suero humano y regulador de pH De conformidad con el ejemplo 1, el anticuerpo anti-c-MET/HER3 biespecífico se diluyó a una concentración de 20/10/5/1/0.5/0.1 y 0 g/ml, respectivamente, y se incubó con una concentración de constante de 100 ng/ml de c-MET. Las diluciones se generaron en dos matrices diferentes: · regulador de pH PBS/BSA • suero de acervo humano (Trina, NHS Base matrix) Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Posteriormente, las muestras se agotaron como se describe en el ejemplo 1.

Se usó HER3-BI para capturar complejos de c- ET con anticuerpo anti-c-MET/HER3 biespecífico .

Después del agotamiento, el sobrenadante se midió en c-MET ELISA como se describe en el ejemplo 2.

Como se muestra en la figura 4a, c-MET, unido al anticuerpo anti-c-MET/HER3 biespecífico es removido por agotamiento inmunológico . En presencia de 5 yg/ml de anticuerpo biespecífico o mayor, las señales de c-MET después del agotamiento están cerca de las señales de fondo de prueba.

Un comportamiento similar se observó en muestras de suero como se muestra en la figura 4B.

Ejemplo 4 ELISA para detectar el antígeno de un anticuerpo biespecífico mediante la ayuda del otro antígeno a) Detección de la cantidad de (total) c-MET en una muestra El HER3 biotinilado fue unido a una placa de microtitulación de estreptavidina en el primer paso. En paralelo, el anticuerpo anti-c-MET/HER3 biespecífico fue pre-incubado durante 1 hora con una muestra/estándar. c-MET en la muestra fue unido a anticuerpo anti -c-MET/HER3 bifuncional durante la pre-incubación. Después del lavado de la placa revestida con estreptavidina, la mezcla pre-incubada de c-MET y anticuerpo anti-c-MET/HER3 se añadió a la placa y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de otro paso de lavado para remover componentes no unidos de la muestra, un anticuerpo anti-c-MET marcado con digoxigenina (unión a un epítopo diferente a c-MET como el anticuerpo anti-c-MET/HER3 bifuncional) se añadió y se incubó durante una hora. Después de otro paso de lavado, un anticuerpo anti-DIG marcado con peroxidasa de rábano picante (HRP) policlonal se añadió a la placa y se incubó durante una hora. Una solución de sustrato de ABTS se usó para activar una reacción de color (véase figura 5A. b) Detección de complejos de anticuerpo anti-c-MET/HER3 biespecífico (pre-existentes) y c-MET en una muestra El HER3 biotinilado fue unido a una placa de microtitulación de estreptavidina en el primer paso. Después del lavado de la placa, muestras y estándares se añadieron a la placa y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Los complejos de anticuerpo anti-c-MET/HER3 biespecífico y c-MET se unieron a HER3-BI inmovilizado. Después de otro paso de lavado, un anticuerpo anti-c-MET marcado con digoxigenina que se une específicamente a un epítopo diferente de c-MET como el anticuerpo anti - C-MET/HER3 bifuncional se añadió y se incubó durante una hora. Después de otro paso de lavado, un anticuerpo anti-DIG marcado con HRP policlonal se añadió a la placa y se incubó durante una hora. Una solución de sustrato de ABTS se usó para activar una reacción de color (véase figura 5A) .

Ejemplo 5 ELISA para detectar el primer antígeno de un anticuerpo biespecífico mediante la ayuda de un anticuerpo anti- idiotípico contra la segunda especificidad de unión de este anticuerpo biespecífico a) Detección de la cantidad de c-MET (total) en una muestra Un anticuerpo anti-idiotípico biotinilado contra la especificidad de unión que se une específicamente a HER3 (anticuerpo anti-HER3 anti-idiotípico, anticuerpo-BI ) se une a una placa de microtitulación revestida con estreptavidina en el primer paso. En paralelo, el anticuerpo anti-c-MET/HER3 biespecífico es pre- incubado durante una hora con una muestra o estándar. c-MET en la muestra es unido específicamente por el anticuerpo anti-c-MET/HER3 biespecífico en el paso de pre-incubación. Después de lavar la placa revestida con estreptavidina, una mezcla pre- incubada de c-MET y anticuerpo anti-c-MET/HER3 biespecífico se añade a la placa y se incuba durante una hora a temperatura ambiente. Después de otro paso de lavado para remover componentes no unidos a anticuerpo anti-c-MET marcado con digoxigenina (que se une específicamente a un epítopo diferente de c-MET como el anticuerpo anti-c-MET/HER3 biespecífico se añade y se incuba durante una hora. Después de otro paso de lavado, un anticuerpo anti-DIG marcado con HRP policlonal se añade a la placa y se incuba durante otra hora. Una solución de sustrato de ABTS se usa para activar una reacción de color (véase figura 5B) . b) Detección de complejos (pre-existentes) de anticuerpo anti-c-MET/HER3 y c-MET en una muestra Un anticuerpo anti - idiotípico biotinilado contra la especificidad de unión que se une específicamente a HER3 (anticuerpo anti-HER3 anti-idiotípico, anticuerpo-BI ) se une a una placa de microtitulación revestida con estreptavidina en el primer paso. Después de lavar la capa, muestras y estándares se añaden a la placa durante una hora a temperatura ambiente. Los complejos de anticuerpo anti-c-MET/HER3 y c-MET son capturados por anticuerpo inmovilizado anti-idiotípico. Después de otro paso de lavado, un anticuerpo anti-c-MET marcado con digoxigenina con que se une específicamente a un epítopo diferente de c-MET como el anticuerpo anti-c-MET/HER3 biespecífico se añade y se incuba durante una hora. Después de otro paso de lavado, un anticuerpo anti-DIG marcado con HRP policlonal se añade a la placa y se incuba durante una hora. Una solución de sustrato de ABTS se usa para activar una reacción de color (véase figura 5B) .

E emplo 6 ELISA para detección de complejos de VEGF con un anticuerpo biespecífico anti -ANG2/VE GF Un anticuerpo anti-ANG2 anti-idiotiotípico monoclonal biotinilado que se une específicamente a la especificidad de unión a ANG2 de un anticuerpo anti-ANG2/VEGF fue revestido a una placa de microtitulación revestida con estreptavidina (MTP) . Una muestra con cantidad desconocida de un complejo de VEGF con el anticuerpo anti-ANG2/VEGF se diluyó 10 veces y se añadió a los pozos del MTP revestido con anticuerpo anti-ANG2 anti-idiotípico. El anticuerpo biespecífico que se une específicamente a ANG2 y VEGF fue formado en complejo por el anticuerpo inmovilizado anti-idiotípico contra las CDRs de la especificidad de unión a ANG2 del anticuerpo biespecífico. Complejos de anticuerpo biespecífico y VEGF también se unieron. Después de un tiempo de incubación de una hora a temperatura ambiente, la muestra/sobrenadante fue removida, seguido por 3 veces de lavado de la placa. Posteriormente, un anticuerpo anti-VEGF marcado con digoxigenina monoclonal (que se une a un epítopo diferente en VEGF que el anticuerpo anti-ANG2/VEGF biespecífico que ha de ser detectada) se añadió a los pozos y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Después de un paso de lavado, un anticuerpo anti -digoxigenina marcado con peroxidasa de rábano picante (HRP) policlonal (anti-DIG anticuerpo) se añadió a la placa y se incubó durante una hora. Después de remover el sobrenadante y del lavado, una solución de sustrato de ABTS se añadió para la reacción de color (véase figura 7) .

Ejemplo 7 ELISA para detección de complejos de ANG2 con un anticuerpo anti -ANG2/VEGF biespecífico Un anticuerpo monoclonal biotinilado anti-idiotípico que se une específicamente a la especificidad de unión a VEGF de un anticuerpo anti- G2/VEGF fue revestido a una placa de microtitulación revestida con estreptavidina (MTP) . Una muestra con cantidad desconocida de complejos de ANG2 con el anticuerpo anti-A G2/VEGF se diluyó 10 veces y se añadió a los pozos del MTP revestido con anticuerpo anti-VEGF anti-idiotípico. El anticuerpo biespecífico que se une específicamente a ANG2 y VEGF fue formado en complejo por el anticuerpo inmovilizado anti-idiotípico contra las CDRs de especificidad de unión a VEGF del anticuerpo anti -ANG2/VEGF biespecífico. Complejos de anticuerpo biespecífico y ANG2 también se unieron. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, la muestra/sobrenadante fue removida, seguido por 3 veces de lavado de la placa. Posteriormente, un anticuerpo anti-ANG2 marcado con digoxigenina monoclonal (que se une específicamente a un epítopo diferente que la especificidad de unión a ANG2 del anticuerpo anti-ANG2/VEGF biespecífico) se añadió a los pozos y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Después de un paso de lavado, un anticuerpo anti-digoxigenina marcado con HRP policlonal se añadió a la placa y se incubó durante una hora. Después de remover el sobrenadante y del lavado, una solución de sustrato de ABTS se añadió para la reacción de color (véase figura 9) .

Ejemplo 8 ELISA para detección de complejos de VEGF con un anticuerpo anti -ANG2/VEGF biespecífico Un anticuerpo monoclonal biotinilado contra VEGF fue revestido a una placa de microtitulación revestida con estreptavidina (MTP) . Después del lavado, una muestra con cantidad desconocida de complejos de VEGF con un anticuerpo anti-ANG2/VEGF se diluyó 10 veces y se añadió a los pozos del MTP revestido con anticuerpo anti-VEGF. El anticuerpo inmovilizado contra VEGF se une a VEGF en un sitio de unión diferente comparado con el anticuerpo anti ANG2/VEGF biespecífico. Complejos de VEGF con un anticuerpo anti-A G2/VEGF se une al anticuerpo anti-VEGF inmovilizado. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, la muestra/sobrenadante fue removida, seguido por 3 veces de lavado de la placa. Posteriormente, un anticuerpo monoclonal anti-idiotípico marcado con digoxigenina que se une específicamente a la especificidad de unión a ANG2 del anticuerpo anti -ANG2/VEGF se añadió a los pozos y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Después de un paso de lavado, un anticuerpo anti-digoxigenina marcado con HRP policlonal se añadió a la placa y se incubó durante una hora. Después de remover el sobrenadante y de lavado, una solución de sustrato de ABTS se añadió para la reacción de color (véase figura 11) . Una curva de calibración correspondiente se muestra en la figura 12.

Ejemplo 9 ELISA para detección de ANG2 total por conversión de ANG2 libre a ANG2 unido a anticuerpo e incubación con un anticuerpo anti-ANG2/VEGF biespecifico A anticuerpo monoclonal biotinilado anti-idiotípico que se une específicamente a la especificidad de unión a VEGF de un anticuerpo anti-A G2/VEGF fue unido a una placa de microtitulación revestida con estreptavidina (MTP) . Una primera alícuota de una muestra con cantidad desconocida de ANG2 se incubó durante una hora con 1.5 pg/mL de anticuerpo anti -ANG2/VEGF biespecifico con el fin de convertir A G2 libre a A G2 unido a anticuerpo an i -ANG2/VEGF . La segunda alícuota (es decir, el no incubada) de la muestra y la alícuota incubada con anticuerpo de la muestra se diluyeron 10 veces y se añadieron a los pozos del MTP revestido con el anticuerpo anti-idiotípico que se une específicamente a la especificidad de unión a VEGF del anticuerpo biespecífico . El anticuerpo biespecífico fue unido por el anticuerpo inmovilizado anti - idiotípico . Asimismo, el A G2 en complejo fue unido mediante el anticuerpo biespecífico. Después de un tiempo de incubación de una hora a temperatura ambiente, el sobrenadante (=muestra) fue removido, seguido por 3 veces de lavado de la placa. Posteriormente, un anticuerpo anti-A G2 marcado con digoxigenina monoclonal (que se une específicamente a un epítopo diferente que la especificidad de unión a ANG2 del anticuerpo anti -A G2/VEGF biespecífico) se añadió a los pozos y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Después de un paso de lavado, a anticuerpo anti -digoxigenina marcado con HRP policlonal se añadió a la placa y se incubó durante una hora. Después de remover el sobrenadante y de lavado, una solución de sustrato de ABTS se añadió para la reacción de color (véase figura 13) . A partir de la diferencia entre el resultado obtenido para la primera alícuota y el resultado obtenido para la segunda alícuota, la cantidad de A G2 libre se calculó. Por lo tanto, con esta prueba, la cantidad de A G2 unido a anticuerpo y A G2 libre se determinó.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (21)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para la determinación de la presencia y/o la cantidad de un antígeno de un anticuerpo biespecífico en una muestra, por lo que el antígeno que ha de ser detectado puede ser unido específicamente por una primera especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, y por lo que el antígeno forma complejo con el anticuerpo biespecífico (complejo antígeno-anticuerpo biespecífico) , caracterizado porque comprende el paso de: - incubar una muestra que comprende el antígeno y el anticuerpo biespecífico con un anticuerpo anti-idiotípico, que se une específicamente a la segunda especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión, por lo que el anticuerpo anti-idiotípico se une a una fase sólida.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el método comprende los pasos de: - incubar una muestra que comprende el antígeno y el anticuerpo biespecífico con un anticuerpo anti-idiotípico, que se une específicamente a la segunda especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión, por lo que el anticuerpo anti -idiotípico se une a una fase sólida, y detectar el complejo de antígeno-anticuerpo biespecífico-anticuerpo anti -idiotípico y por lo tanto determinar la presencia y/o la cantidad del antígeno de un anticuerpo biespecífico.

3. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el método comprende los pasos de : - incubar una muestra que comprende el antígeno y el anticuerpo biespecífico con un anticuerpo anti-idiotípico, que se une específicamente a la segunda especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión, por lo que el anticuerpo anti-idiotípico se une a una fase sólida, y - incubar el complejo formado en el primer paso con un anticuerpo que se une específicamente al antígeno en un epítopo diferente del epítopo unido por el anticuerpo biespecífico y por lo tanto determinar la presencia y/o la cantidad del antígeno de un anticuerpo biespecífico en una muestra .

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el método es para la determinación de la presencia y/o la cantidad de un antígeno de un anticuerpo biespecífico que forma complejo con el anticuerpo biespecífico .

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el método comprende los siguientes pasos: - proveer una muestra que comprende el antígeno y el anticuerpo biespecífico, en donde por lo menos 90% del antígeno son formados en complejo por el anticuerpo biespecífico, - incubar una muestra que comprende el antígeno y el anticuerpo biespecífico con un anticuerpo anti-idiotípico, que se une específicamente a la segunda especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión, por lo que el anticuerpo anti-idiotípico se une a una fase sólida, y - incubar el complejo formado en el primer paso con un anticuerpo que se une específicamente al antígeno en un epítopo diferente del epítopo unido por el anticuerpo biespecífico y por lo tanto determinar la presencia y/o la cantidad del antígeno de un anticuerpo biespecífico en una muestra.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el método comprende los siguientes pasos: - incubar una muestra que comprende el antígeno y el anticuerpo biespecífico con una cantidad del anticuerpo biespecífico para proveer una muestra en donde por lo menos 90% del antígeno es formado en complejo por el anticuerpo biespecífico, incubar la muestra que comprende el antígeno formado en complejo por el anticuerpo biespecífico con un anticuerpo anti-idiotípico, que se une específicamente a la segunda especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión, por lo que el anticuerpo anti-idiotípico se une a una fase sólida, y - incubar el complejo formado en el paso anterior con un anticuerpo que se une específicamente al antígeno en un epítopo diferente del epítopo unido por el anticuerpo biespecífico y por lo tanto determinar la presencia y/o la cantidad del antígeno de un anticuerpo biespecífico en una muestra .

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la cantidad del anticuerpo biespecífico es entre 1 g/ml y 10 yg/ml de muestra.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, caracterizado porque por lo menos 95% del antígeno es formado en complejo por el anticuerpo biespecífico .

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque por lo menos 98% del antígeno es formado en complejo por el anticuerpo biespecífico.

10. Un método para la determinación de la cantidad de antígeno unido al anticuerpo de un anticuerpo biespecífico en una muestra, por lo que el antígeno puede ser unido específicamente por una primera especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, caracterizado porque comprende los pasos de : - incubar una primera alícuota de la muestra que comprende el antígeno y el anticuerpo biespecífico con una cantidad del anticuerpo biespecífico para proveer una muestra en donde por lo menos 90% del antígeno es formado en complejo por el anticuerpo biespecífico, incubar la muestra que comprende el antígeno formado en complejo por el anticuerpo biespecífico con un anticuerpo anti-idiotípico, que se une específicamente a la segunda especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión, por lo que el anticuerpo anti-idiotípico se une a una fase sólida, y - incubar el complejo formado en el paso anterior con un anticuerpo que se une específicamente al antígeno en un epítopo diferente del epítopo unido por el anticuerpo biespecífico y por lo tanto determinar la presencia y/o la cantidad del antígeno de un anticuerpo biespecífico en una muestra y por lo tanto determinar la cantidad total del antígeno presente en la muestra, - incubar una segunda alícuota de la muestra que comprende el antígeno y el anticuerpo biespecífico con un anticuerpo anti-idiotípico, que se une específicamente a la segunda especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión, por lo que el anticuerpo anti-idiotípico se une a una fase sólida, y - incubar el complejo formado con un anticuerpo que se une específicamente al antígeno en un epítopo diferente del epítopo unido por el anticuerpo biespecífico y por lo tanto determinar la cantidad del antígeno libre de un anticuerpo biespecífico presente en la muestra, y - determinar la cantidad de antígeno unido al anticuerpo de un anticuerpo biespecífico por la diferencia entre la cantidad total del antígeno presente en la muestra y la cantidad de antígeno libre presente en la muestra.

11. Un método para la determinación de la presencia y/o cantidad de un antígeno de un anticuerpo multiespecífico en una muestra, por lo que el antígeno puede ser unido específicamente por una primera especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico, caracterizado porque comprende el paso de: - incubar la muestra que comprende antígeno y anticuerpo multiespecífico con un segundo antígeno que puede ser unida específicamente por una segunda especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión, y - remover el complejo de segundo antígeno- anticuerpo multiespecífico de la muestra antes de la determinación de la presencia y/o cantidad del antígeno.

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el segundo antígeno es conjugado a una fase sólida.

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, caracterizado porque el segundo antígeno es conjugado a una microesfera paramagnética .

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque comprende los siguientes pasos: - incubar una muestra que comprende el antígeno y el anticuerpo multiespecífico con un segundo antígeno que puede ser unido específicamente por una segunda especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión, para formar un complejo de segundo antígeno-anticuerpo multiespecífico, remover el complejo de segundo antígeno-anticuerpo multiespecífico de la muestra, y - determinar el antígeno en la muestra anticuerpo multiespecífico-agotada .

15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizado porque la determinación del antígeno comprende los siguientes pasos: - incubar la muestra anticuerpo multiespecífico- agotada con un anticuerpo de captura que se une específicamente al antígeno para formar un complejo de anticuerpo de captura-antígeno, y correlacionar el complejo de anticuerpo de captura-antígeno formado a la cantidad del antígeno en la muestra .

16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, caracterizado porque la determinación del antígeno comprende los siguientes pasos: - incubar la muestra anticuerpo multiespecífico-agotada con un anticuerpo de captura que se une específicamente al antígeno para formar un complejo de anticuerpo de captura-antígeno, incubar el complejo de anticuerpo de capturáantígeno con un anticuerpo rastreador, por lo que el anticuerpo de captura y el anticuerpo rastreador se unen a un epítopo no traslapable en el antígeno, y correlacionar el complejo de anticuerpo de captura-antígeno-anticuerpo rastreador formado a la cantidad del antígeno en la muestra.

17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, caracterizado porque la determinación del antígeno comprende los siguientes pasos: incubar la muestra anticuerpo multiespecífico-agotada con un anticuerpo de captura que se une específicamente al antígeno para formar un complejo de anticuerpo de captura-antígeno, incubar el complejo de anticuerpo de captura-antígeno con un anticuerpo rastreador, por lo que el anticuerpo de captura y el anticuerpo rastreador se unen a un epítopo no traslapable en el antígeno, incubar el anticuerpo de captura-antígeno-anticuerpo rastreador complejo con un anticuerpo de detección que comprende un marcador detectable, por lo que el anticuerpo de detección se une específicamente al anticuerpo rastreador en un epítopo fuera de los dominios variables del anticuerpo rastreador, y correlacionar el complejo de anticuerpo de captura-antígeno-anticuerpo rastreador formado a la cantidad del antígeno en la muestra.

18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17, caracterizado porque el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo biespecífico que tiene una primera especificidad de unión que se une específicamente a un primer antígeno o primer epítopo en un antígeno y que tiene una segunda especificidad de unión que se une específicamente a un segundo antígeno o a un segundo epítopo en el antígeno.

19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, caracterizado porque la determinación es de un antígeno libre de un anticuerpo multiespecífico.

20. Un método para la determinación de la cantidad de un antígeno de un anticuerpo biespecífico que forma complejo con el anticuerpo biespecífico en una muestra caracterizado porque comprende el paso de: - incubar una muestra que comprende el antígeno y el anticuerpo biespecífico con un anticuerpo anti-idiotípico, que se une específicamente a una especificidad de unión del anticuerpo biespecífico, que es diferente de la especificidad de unión por la cual el antígeno se une, por lo que el anticuerpo anti-idiotípico se une a una fase sólida.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el método comprende como segundo paso : - incubar el complejo formado en el primer paso con un anticuerpo que se une específicamente al antígeno en un epítopo que es diferente del epítopo unido por el anticuerpo biespecífico y por lo tanto determinar la cantidad de un antígeno de un anticuerpo biespecífico que forma complejo con el anticuerpo biespecífico en una muestra.