JP6075881B2

JP6075881B2 - 乳癌のバイオマーカー

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Publication number: JP6075881B2
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Authority: JP
Inventors: 仁遠藤; 岡安　勲; 勲岡安
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Filing date: 2012-04-13
Publication date: 2017-02-08
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Description

本発明は、乳癌のバイオマーカー、より詳しくは乳腺腫瘍の診断キットおよび診断方法に関する。

中性アミノ酸トランスポーター［Ｌ−ｔｙｐｅａｍｉｎｏａｃｉｄｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ（ＬＡＴ）］は、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、Ｌ−ドーパなどの中性アミノ酸を細胞内に取り込むための膜貫通型のタンパク質である。本発明者らは、各種のＬＡＴの探索を行ってきており、これまでＬＡＴ１およびそのアイソフォームであるＬＡＴ２、ＬＡＴ３およびＬＡＴ４を見出してきた。

これらのうちＬＡＴ１は、アミノ酸輸送活性化因子４Ｆ２ｈｃと共存することにより、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジンなどの大型の中性アミノ酸およびＬ−ドーパをＮａ^＋非依存的に輸送する能力を有する１２回膜貫通タンパク質である。また、ＬＡＴ１は生体内においては胎盤、脾臓、大腸、精巣および血液・脳関門に主に発現している。また、ＬＡＴ１はヒト胃印環細胞癌細胞株、肺小細胞癌細胞株、黒色腫細胞株、神経芽細胞腫瘍細胞株に発現が認められ、さらに、腎癌、膀胱癌および前立腺癌の腫瘍組織において、免疫組織化学染色により、その発現が確認されている（特許文献１、非特許文献１および非特許文献２参照）。ＬＡＴ１をメルファラン、ＢＣＨなどの抑制薬によって抑制することにより、ＬＡＴ１を発現する培養細胞の増殖速度が著しく低下することから、ＬＡＴ１による細胞内への必須アミノ酸取り込みは細胞増殖にとって必要不可欠であり、癌細胞は本ＬＡＴ１を高発現することにより正常細胞に比べ優位な栄養状態を獲得し、増殖を優位に行うことができると考えられている。

ＬＡＴ２はＬＡＴ１のアイソフォームであるが、ＬＡＴ１と同様、１２回膜貫通構造を有し、４Ｆ２ｈｃとの共存により大型のアミノ酸に加え、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミンなどの小型のアミノ酸も含めた中性アミノ酸全般をＮａ^＋非依存的に輸送する広い基質選択性を有する。ＬＡＴ２は脳、骨格筋、腎臓、空腸、回腸、精巣および胎盤の正常組織における発現が確認されているが、腫瘍組織においてはその発現は確認されていない（特許文献２および非特許文献３参照）。ＬＡＴ２の基質との親和性は、ＬＡＴ１に比べ低いことから、ＬＡＴ２は活発な細胞増殖を必要としない正常組織の細胞における中性アミノ酸の輸送を担っていると考えられている。

さらに、本発明者らは、Ｌ−体およびＤ−体アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性小型中性アミノ酸トランスポーター（特許文献３参照）、シスチン、塩基性アミノ酸および中性アミノ酸を基質とするトランスポーター（特許文献４参照）などの各種のトランスポーターも見出している。トランスポーターは、細胞が必要とする各種の物質を物質特異的に細胞に取り込むための機能を有する膜貫通型のタンパク質であり、生体組織の維持や増殖に不可決なものである。このために、各種のトランスポーターにより疾患を診断する方法も提案されている。例えば、腫瘍細胞、腫瘍組織または腫瘍を有する臓器若しくはその一部からなる試料中のタンパクの発現の有無または発現量を調べる方法（特許文献１参照）、アニオントランスポーターの抗体を使用することを特徴とする肺・胸部疾患の診断方法（特許文献５参照）、赤血球尿素トランスポーターのタンパク質若しくはその断片または核酸の定量値を指標として被験者が精神分裂病に罹患しているか否かを診断する方法（特許文献６参照）、体腔液から細胞学的調製物を調製し、膜貫通グルコーストランスポーターＧＬＵＴ−１に結合する抗体を用いて、同一タイプの組織からの非悪性組織の切片から取得された組織試料でのＧＬＵＴ−１発現レベルと比較して、ＧＬＵＴ−１を過剰発現する悪性腫瘍から良性腫瘍を識別する方法（特許文献７参照）などが報告されている。

乳癌の治療を対象としたバイオマーカーには、主に、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰｇＲ）およびＨＥＲ２（ＥＧＦＲ２とも呼ばれる、増殖要因の受容体）の３種類が知られている。それぞれを腫瘍組織の免疫組織化学またはＦＩＳＨ法で検査をして、反応を示した陽性例にはそれぞれを標的とした治療方法が選択されている。一方、これらの３種類のマーカーにいずれも陰性の乳癌（乳癌の腫瘍細胞にエストロゲンホルモン受容体、プロゲステロンホルモン受容体およびＨＥＲ２の３種類のタンパク質の表現がないこと）はトリプルネガティブ乳癌と呼ばれ、全乳癌症例の１２〜２５%を占めると報告されている（非特許文献７〜１０参照）。このトリプルネガティブ乳癌に対する適切な治療方法は未だ開発されておらず、患者の予後も既存の３マーカーいずれかに陽性の乳癌症例と比較して不良である（非特許文献９および１０参照）。

また、乳管内腫瘍において、悪性の非浸潤性乳管癌（ｄｕｃｔａｌｃａｒｃｉｎｏｍａｉｎｓｉｔｕ；以下ＤＣＩＳということがある。）と、良性の乳管内乳頭腫（ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌｐａｐｉｌｌｏｍａ）との鑑別には従来のＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色標本による病理組織診断方法が行われているが、明確な鑑別要素が明らかでなく、鑑別困難な病変が多い。そのため、より明確に判別可能なマーカーの開発が待たれている。

特開２０００−１５７２８６号特開２０００−３４２２７０号特開２００１−２１１８８６号特開２００１−４６０７０号特開２００１−２２８１４６号特開２００１−２４５６６１号特表平１１−５１１２４５号

Kanai, Y., et al., J. Biol. Chem., 273, 23629-23632, 1998 Yanagida O., et al., Biochim. Biophys. Acta., 1514(2), 291-302, 2001 Segawa, H., et al., J. Biol. Chem., 274(28), 19745-19751, 1999 Sakata T., et al., Pathol. Int. 59, 7-18, 2009 Ichinohe M., et al., Pathol. Int., 2011 in press Oda K., et al., Cancer Sci., 101, 173-179, 2010 Rakha E. A., et al., Cancer 109, 25-32, 2007 Liedtke C., et al., J. Clin. Oncol. 26, 1275-1281, 2008 Sasaki Y., et al., Breast Cancer 16, 254-259, 2009 Iwase H., et al., Breast Cancer 17, 118-124, 2010 Sinicrope F. A., et al., Cancer Res. 55, 237-241, 1995

本発明は、乳腺腫瘍の診断方法および診断キットを提供する。詳細には、第一に、本発明はＥＲ、ＰｇＲ、ＨＥＲ２のいずれにも陰性であるトリプルネガティブ乳癌の診断キットおよび診断方法に関する。第二に、本発明は従来簡易な鑑別が困難であった乳管内腫瘍における悪性度の診断キットおよび診断方法に関する。

本発明者らは、癌細胞が特異的に使用している癌タイプアミノ酸トランスポーターに注目し、癌の分子標的癌療法の開発を目指して検索を行った。正常の細胞は主としてＬＡＴ２を使用し、癌細胞はアミノ酸取り込みの効率が良いＬＡＴ１を使用した。本発明者らは、ＬＡＴ１に対するマウスモノクローナル抗体を作製し、この抗体を使用した免疫組織科学的検索方法を開発した（非特許文献４参照）。この方法によって、前立腺癌や胃癌では、ＬＡＴ１高発現症例で、ＬＡＴ１低発現症例に比較して、予後が有意に不良であることを認め（非特許文献４および５参照）、ＬＡＴ１特異的抑制物質の開発とともに、診断と治療を一体化した対癌療法を開発している（非特許文献４〜６参照）。

本発明者らは、前述のようにＬＡＴ１が癌に高率に発現し、効率のよいアミノ酸の取り込みを行い、増殖する知見を生かし、このＬＡＴ１を対象とした乳癌の分子標的治療を目指して、抗ＬＡＴ１モノクローナル抗体を使用して、乳管内腫瘍のＬＡＴ１発現について免疫組織学的に鋭意研究を行った。その結果、非浸潤性乳管癌においては乳管内乳頭腫に比べてＬＡＴ１が高く発現しており、免疫染色方法が乳管内腫瘍の良性または悪性の鑑別に有用であることを見出した。

さらに、抗ＬＡＴ１モノクローナル抗体をＥＲ、ＰｇＲおよびＨＥＲ２のいずれにも陰性である、いわゆるトリプルネガティブ乳癌組織に使用することによって、その１７例中１４例という高割合においてＬＡＴ１が高発現していることを見出した。

すなわち、本発明者らは、腎や膀胱癌に特異的な必須アミノ酸トランスポーターのＬＡＴ１、および正常細胞に存在するＬＡＴ２を見出してきた。本発明者らは、驚くべきことに抗ＬＡＴ１モノクローナル抗体を用いることによって、乳管内腫瘍において腫瘍の悪性または良性の鑑別ができること、およびいわゆるトリプルネガティブの乳癌組織において高確率でＬＡＴ１が発現していることを見出した。

本発明（１）は、乳腺腫瘍の診断においてＬＡＴ１の検出、同定または定量のための、抗ＬＡＴ１モノクローナル抗体を含有する診断キットに関する。

本発明（２）は、前記乳腺腫瘍が乳管内腫瘍であって、その悪性度を診断するための、前項（１）記載の診断キットに関する。

本発明（３）は、前記乳腺腫瘍が、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびＨＥＲ２のいずれにも陰性であるトリプルネガティブの乳癌である、前項（１）記載の診断キットに関する。

本発明（４）は、エストロゲン受容体の免疫染色キット、プロゲステロン受容体の免疫染色キットおよびＨＥＲ２の免疫染色キットと、ＬＡＴ１の免疫染色キットからなる組み合わせを含有する、乳腺腫瘍の診断キットに関する。

本発明（５）は、被験者から摘出された乳腺組織に、抗ＬＡＴ１モノクローナル抗体を接触させ、前記組織中のＬＡＴ１を検出、同定または定量する工程を含む、乳腺腫瘍の診断方法に関する。

本発明（６）は、前記乳腺腫瘍が乳管内腫瘍であって、その悪性度を診断する、前項（５）記載の診断方法に関する。

本発明（７）は、前記乳腺腫瘍が、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびＨＥＲ２のいずれにも陰性であるトリプルネガティブの乳癌である、前項（５）記載の診断方法に関する。

本発明（８）は、エストロゲン受容体の免疫染色、プロゲステロン受容体の免疫染色、ＨＥＲ２の免疫染色およびＬＡＴ１の免疫染色を含有してなる、乳腺腫瘍の診断方法。

本発明（１）および（５）によると、これまで困難であった、乳腺腫瘍における治療指針を示すための診断を容易に行うことができる。すなわち、乳腺腫瘍の抗ＬＡＴ１抗体を使った免疫染色で乳癌のＬＡＴ１発現を検査することにより、ＬＡＴ１を標的とする乳癌の抗癌療法が有効となる。

本発明（２）および（６）によると、診断困難な乳管内腫瘍の良性（乳管内乳頭腫）または悪性（非浸潤性乳管内癌）の鑑別を容易に行うことができる。

本発明（３）および（７）によると、ＥＲ、ＰｒＧおよびＨＥＲ２のいずれにも陰性であるトリプルネガティブ乳癌が予後不良のものが多かったところ、その治療指針を提供することができる。

本発明（４）および（８）によると、従来から知られるＥＲ、ＰｇＲおよびＨＥＲ２に加えて抗ＬＡＴ１モノクローナル抗体を合わせて用いることによって、乳癌の診断においてより精度の高い治療指針を与えることができる。

本発明において、乳腺腫瘍とは、乳腺組織に腫瘍が含まれるものであれば特に限定されないが、例えば、乳管内乳頭腫、乳頭部腺腫などの良性腫瘍、非浸潤癌（非浸潤性乳管癌など）、浸潤癌［浸潤性乳管癌（乳頭腺管癌、充実腺管癌、硬癌）、特殊型］、ページェット病などの悪性腫瘍が代表的なものとして挙げられる。また、乳腺腫瘍は別の分類により、悪性腫瘍である乳癌と、良性腫瘍とに分けられる。

前記乳管内腫瘍とは、乳管内に腫瘍が含まれるものであれば特に限定されないが、例えば、乳管内乳頭腫（良性腫瘍）および非浸潤性乳管癌（悪性腫瘍）が代表的なものとして挙げられる。

ＬＡＴ１発現強度の標準を示す。この染色度を基に、ＬＡＴ１の発現度を求める。乳管内乳頭腫と非浸潤性乳管内癌におけるＬＡＴ１発現の比較を示す。ＥＲ、ＰｇＲおよびＨＥＲ２のいずれにも陰性であるトリプルネガティブ乳癌組織においてＬＡＴ１が高く発現している例を示す。ＨＥＲ２陰性の乳癌組織においてＬＡＴ１が発現している例を示す。ＨＥＲ２陽性の乳癌組織においてＬＡＴ１が発現している例を示す。乳腺腫瘍性病変におけるＬＡＴ１発現の比較を示す。

本発明で用いるＬＡＴは、細胞の増殖に必要な必須アミノ酸の細胞膜輸送能を有する機能性タンパクで、とりわけ癌細胞に特異的に発現するＬＡＴは癌の増殖を裏づける必須アミノ酸の細胞膜輸送能と一致する機能性タンパクなので、これらのＬＡＴの異なる種類からなる２種以上を用いる本発明の方法により、癌の有無だけでなく、癌の悪性度を的確に評価することが可能となる。

本発明の特徴の一つは、乳腺腫瘍の抗ＬＡＴ１抗体を使った免疫染色で乳癌のＬＡＴ１発現を検査することにより、ＬＡＴ１を標的とする乳癌の抗癌療法が有効になることである。

本発明における正常細胞に発現するＬＡＴとしては、例えば、ＬＡＴ２が挙げられる。また、本発明における腫瘍細胞に発現するＬＡＴとしては、例えば、ＬＡＴ１が挙げられる。

本発明における試料としては、ヒトなどの哺乳動物の乳腺腫瘍細胞が挙げられる。本発明における試料中のＬＡＴの検出、同定または定量としては、ＬＡＴを検出、同定または定量できる方法であれば特に制限はないが、好ましい方法としては当該ＬＡＴの抗体を使用する方法が挙げられる。ＬＡＴの抗体としては、ＬＡＴタンパクの全長またはその一部に反応性を有する抗体であり、ＬＡＴに特異性があれば特に制限はないが、より精度よく行うためには特異性の高いモノクローナル抗体を使用するのが好ましい。

本発明の抗体は、公知の抗体の製造手法に準じて製造することができる。具体的には、本発明のＬＡＴ若しくはその一部（天然体、組換体、化学合成物を含む）、または該タンパクを発現している細胞を免疫原として用い、常法に従って、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどの非ヒト哺乳動物に免疫することにより得られる天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得る組換えキメラモノクローナル抗体および組換えヒト型モノクローナル抗体（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ抗体）、ならびにヒト抗体産生トランスジェニック動物などを用いて製造され得るヒト抗体のいずれであってもよい。モノクローナル抗体の場合には、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどのいずれのアイソタイプを有するモノクローナル抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧまたはＩｇＭである。

本発明の抗体を使用する場合には、この結果を検出、同定または定量可能なシグナルとさせるために、標識化または標識化可能なものとしておくことが好ましい。本発明の標識化抗体としては、酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジンまたは^３Ｈ、^１４Ｃ、^１２５Ｉなどの放射性同位体などで標識してなる抗体またはこのような標識化物質と結合能を有する抗体である。

本発明の抗体を標識するための「単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質」とは、それらを、前記した抗体に物理的または化学的な結合などにより結合させることにより該モノクローナル抗体の存在を検出可能にするために用いられる物質を意味する。具体的には、酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン、または前記放射性同位体などである。具体的には、ペルオキシダーゼ［例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）など］、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ、若しくはアセチルコリンエステラーゼなどの酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネートなどの蛍光物質、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１２５Ｉなどの放射性同位体、ビオチン、アビジンまたは化学発光物質が挙げられる。

ここで、放射性同位体および蛍光物質は、単独で検出可能なシグナルをもたらすことができるが、酵素、化学発光物質、ビオチンおよびアビジンは、単独では検出可能なシグナルをもたらすことができないため、さらに１種以上の他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことが可能となる。例えば、酵素の場合には少なくとも基質が必要であり、酵素活性を測定する方法（比色法、蛍光法、生物発光法または化学発光法など）に依存して種々の基質が用いられる。例えば、ペルオキシダーゼの場合には、基質として過酸化水素を用いる。また、ビオチンの場合には少なくともアビジンまたは酵素修飾アビジン（例えば、ストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼ）を基質として反応させるのが一般的であるが、この限りではない。必要に応じてさらに該基質に依存する種々の発色物質が用いられる。例えば、ビオチンの基質としてストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼを用いる場合には、発色物質として４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドを用いることができる。

本発明の標識化抗体は、本発明のＬＡＴを検出、同定または定量するために用いることができ、そのための測定方法としては、慣用されている免疫組織学的技術を用いて常法に従って実施することができる（例えば、実験医学別冊、「細胞工学ハンドブック」、羊土社、２０１〜２１３頁、１９９２年参照）。また、本発明の標識化抗体は、前記の免疫組織学的試験だけでなく、試料中の細胞、組織または臓器若しくはその一部から、常法に従って可溶性膜タンパクを調製し、当該可溶性膜タンパクに標識化抗体を反応させることにより可溶性膜タンパク中の本発明のＬＡＴの存否を確認するウェスタンブロッティング法においても用いることができる。前記のような免疫学的測定方法においては、上記のいずれの標識物質で標識した標識化抗体をも使用可能であるが、検出感度または定量感度の高さおよび操作の利便性の点を考慮すると、ペルオキシダーゼなどの酵素またはビオチンで標識したモノクローナル抗体を用いるのが好ましい。

本発明のＬＡＴの検出、同定または定量する方法としては、前記免疫組織学的技術などにより行うことができるが、具体的には、例えば下記（１）および（２）の工程を含む方法が挙げられる。
（１）試料に本発明の標識化抗ＬＡＴ抗体を接触させる工程；および
（２）当該試料中のＬＡＴに結合した標識化抗体を、当該標識化抗体に結合している標識物質の種類に応じて、蛍光、化学発光または放射活性を検出することにより測定する工程。

さらに具体的には、例えば下記のような工程を含むことができる。
（工程１）被検体から採取された試料を、パラフォルムアルデヒドなどにより固定化し、固定化試料を作製する工程；
（工程２）当該固定化試料に、ビオチンまたはペルオキシダーゼなどの酵素により標識した本発明の標識化抗体を加え抗原抗体反応を行わせる工程；
（工程３）次いで、当該固定化試料を必要に応じ洗浄した後、用いた酵素の種類に応じて種々の基質またはアビジンまたはストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼなどの酵素修飾アビジンを加え、該基質、アビジンまたは酵素修飾アビジンと標識抗体上の標識物質とを反応させる工程；
（工程４）工程３で酵素修飾アビジンを加えた場合には、該修飾に用いた酵素の種類に応じて種々の基質（例えば、４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドなど）を加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工程；
（工程５）必要に応じ、固定化試料を洗浄し、酵素反応および発色反応を停止させる工程；および
（工程６）固定化試料を顕微鏡下で観察することにより、比色強度、蛍光強度または発光強度を測定する工程。

本発明の検出、同定または定量方法として、免疫染色法を用いた、乳腺組織中の癌細胞の検出法を例としてさらに詳細に説明する。本発明の方法は、乳腺組織から癌細胞およびその破片を検出し、その悪性度を診断するものである。本発明の方法ではＬＡＴ１の有無を免疫染色により直接視覚的に観察することができることから、陰性または陽性の判断に特殊な能力を必要とせず、簡便にかつ確実に行うことができる。

本発明の検出、同定または定量方法の具体例としては、例えば、次の（１）〜（４）に挙げる方法が挙げられるが、特に限定されない。

（１）組織及びスメア法による癌細胞の検出
摘出組織をホルマリン固定・パラフィン包埋後に３μｍ厚さの組織切片を作製して、スライドガラス上に乗せる。この切片を脱パラフィン後に、それぞれアミノ酸トランスポーターに特異的に結合する抗ＬＡＴ１およびＬＡＴ２抗体で処理する（一次抗体処理）。一次抗体処理後、サンプルをそれぞれの一次抗体に特異的に結合する酵素またはＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン４塩酸塩）、メチルグリーン、メイヤーズヘマトキシリンなどの蛍光色素などで標識された二次抗体により処理する（標識二次抗体処理）。酵素標識した二次抗体を用いた場合は基質溶液を加え、発色させた後、光学顕微鏡を用いて細胞を観察し陽性または陰性の判定を行う。蛍光色素により標識した二次抗体を用いる場合は二次抗体処理後、蛍光顕微鏡を用いて観察し、癌細胞の有無を判定する。なお、スメア法では、摘出細胞をそのままガラスに塗布ないし遠心分離機で分離し、細胞成分と液成分に分け、細胞成分（沈渣）について免疫染色を行う。すなわち、沈渣をスライドガラス上に塗布し、エタノール液または１０％ホルマリン液などで固定した後、組織切片と同様の免疫染色を行って判定する。

（２）凍結包埋法による癌細胞の検出
摘出組織をＯＣＴコンパウンド包埋後に液体窒素で急速凍結して、クリオスタットで薄切してスライド標本を作製する。この標本を１０％ホルマリンやエタノール液などで固定後に、前記（１）に記載した方法で免疫染色を行う。摘出細胞の場合には遠心分離機で分離し、沈渣成分に１０％ホルマリンで固定した後、再度遠心して、上清を捨てて細胞成分得る。細胞成分をヒートブロックなどで温めながら、２％アガロースを５０μＬ加えて混和し、４℃下で固化させ、沈渣成分をゲル内に封入する。固化したゲルをＯＣＴコンパウンドで封入し、凍結ブロックを作製し、凍結ブロックをクリオスタットで薄切してスライド標本を作製する。スライド標本上の細胞を定法に従って処理し、免疫組織蛍光染色を行った後、染色後の標本を蛍光顕微鏡で観察し、癌細胞の有無を判定する。

（３）摘出細胞のパラフィン包埋法による癌細胞の検出
状況に応じ、沈渣を封入したゲルを以下の方法で処理し、パラフィン標本での検査も可能である。ゲルを４％ホルマリンにより４℃で一晩処理した後、ＰＢＳで洗浄し、定法に従って脱水、透徹を行う。透徹後、ゲルを定法に従い、パラフィンに包埋してパラフィンブロックを作製する。作製したブロックをミクロトームで薄切し、スライド標本を作製する。作製したスライド標本を定法に従って脱パラフィン処理した後、免疫組織蛍光染色を行った後、染色後の標本を蛍光顕微鏡で観察し、癌細胞の有無を判定する。本方法により、乳癌組織を免疫組織化学の手法などで識別することができる。

（４）ＥＬＩＳＡ法を用いた癌細胞の検出
ＥＬＩＳＡ法を用いて、摘出組織に含まれるＬＡＴタンパクを検出することにより、摘出組織中のＬＡＴタンパク質量を数値化することができ、より定量的な判定が可能になる。サンプルを界面活性剤および超音波で処理した後、超遠心で４℃、１００，０００×ｇで遠心分離し、上清を捨ててタンパクペレットを得る。ペレットに１０％ＢＳＡ／ＰＢＳＴを適量加えて、超音波処理により懸濁させる。これをサンプルとして、ＥＬＩＳＡ法を行う。

まず、サンプルをイムノプレートに１００μＬ／ウェル添加し、４℃下で一晩放置する。サンプル溶液を捨て、ブロッキング溶液を添加し、室温で１時間放置する。ウェル内のブロッキング溶液を捨て、適宜希釈した抗ＬＡＴ一次抗体溶液を添加して、室温で２時間放置する（この間に抗ＬＡＴ抗体が、ウェルの底面の各ＬＡＴタンパク質に結合する）。一次抗体液を捨て、ＰＢＳＴで洗浄した後、適宜希釈した標識二次抗体を加え、室温で１時間放置する。ウェル内をＰＢＳＴで洗浄し、基質溶液を加えて発色または化学発光させ、その色素量、または発光の度合いを分光光度計またはルミノメーターで測定することにより、ＬＡＴタンパク質の存在の有無を確認し、判定する。

本発明の他の特徴は、乳管内腫瘍組織中の腫瘍の悪性度を判定することができることである。本発明の試料中の乳管内腫瘍中の腫瘍の悪性度を判定する方法は、正常細胞に発現するＬＡＴを定量することにより、正常細胞の量を知ることができる。また腫瘍細胞に発現するＬＡＴを定量することにより、腫瘍細胞の量を知ることができる。しかも、これらの細胞は同種のＬＡＴを必要とするものであるから、この両者の定量値から、全体のどの程度が腫瘍細胞化しているかを知ることができる。したがって、本発明は、試料中の正常細胞に発現するＬＡＴ２を定量し、かつ腫瘍細胞に発現するＬＡＴ１を定量し、両者の定量値を比較することからなる試料中の細胞の腫瘍の悪性度を判定する方法をも提供する。

本発明の他の特徴は、乳腺腫瘍が、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびＨＥＲ２のいずれにも陰性であるトリプルネガティブ乳癌である、乳腺腫瘍の治療指針を与えることができることである。トリプルネガティブ乳癌の大多数においてＬＡＴ１が高発現していることから、これまで治療が困難であったトリプルネガティブ乳癌にＬＡＴ１を標的とした治療が有効であることが分かる。なお、トリプルネガティブか否かにかかわらず、乳癌全般においてＬＡＴ１発現の有無を調べることにより、ＬＡＴ１を標的とした治療が有効である。

本発明の他の特徴は、ＥＲ（エストロゲン受容体）の免疫染色、ＰｇＲ（プロゲステロン受容体）の免疫染色およびＨＥＲ２の免疫染色とＬＡＴ１の免疫染色を組み合わせることにより、乳癌の診断ができることである。本発明において、ＥＲ、ＰｇＲおよびＨＥＲ２の免疫染色に加えて抗ＬＡＴ１モノクローナル抗体を用いたＬＡＴ１の免疫染色を用いると、より正確に乳癌を診断することができる。ＥＲ、ＰｇＲおよびＨＥＲ２の免疫染色には市販のものを用いることができる。例えば、ＥＲおよびＰｇＲの免疫染色にはベンタナＸＴシステム（ベンタナジャパン、東京、日本）を用いることができ、また、ＨＥＲ２の免疫染色キットとしてはＤＡＫＯＥＧＦＲｐｈａｒｍＤｘｋｉｔ（ＤａｋｏＮｏｒｔｈＡｍｅｒｉｃａＩｎｃ．，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いることができるが、ＥＲ、ＰｇＲおよびＨＥＲ２を測定することができる手段であれば、これらに限定されない。ＥＲおよびＰｇＲ発現状態の有無を評価することにより、エストロゲン、プロゲステロンまたはこれらの類縁体などのホルモン療法の効果を推定することができる。ＨＥＲ２遺伝子発現状態の有無を評価することにより、乳癌での抗ＨＥＲ２薬剤の効果を推定することができる。これらと同様に、抗ＬＡＴ１モノクローナル抗体を用いたＬＡＴ１の免疫染色キットによりＬＡＴ１発現状態の有無を評価することにより、ＬＡＴ１トランスポーター制御剤の効果を推定することができる。これらの免疫染色は、同時に行ってもよく、それぞれ独立に行ってもよい。

（キット）
さらに本発明は、前記本発明の各方法のいずれかを行うための診断キットを提供する。すなわち本発明は、乳腺腫瘍の診断においてＬＡＴ１の検出、同定または定量のための、抗ＬＡＴ１モノクローナル抗体を含有する診断キットに関する。かかる診断キットは、乳腺腫瘍が乳管内腫瘍であって、その悪性度を診断するためのものであってもよく、乳腺腫瘍がエストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびＨＥＲ２のいずれにも陰性であるトリプルネガティブ乳癌であるものであってもよい。また、本発明は、エストロゲン受容体の免疫染色キット、プロゲステロン受容体の免疫染色キットおよびＨＥＲ２の免疫染色キットと、ＬＡＴ１の免疫染色キットからなる組み合わせを含有する、乳腺腫瘍の診断キットにも関する。なお、本発明は、乳腺腫瘍のエストロゲン受容体、プロゲステロン受容体やＨＥＲ２の検索結果が陽性・陰性にかかわらず、ＬＡＴ１の発現を同定するキットにも関する。

詳細には、試料中の正常細胞に発現するＬＡＴ２を検出、同定または定量するためのキット、および資料中の腫瘍細胞に発現するＬＡＴ１を検出、同定または定量するためのキットを含有してなる、被検体から採取した試料中の腫瘍細胞を検出、同定または定量するためのキットを提供する。

本発明のＬＡＴを検出、同定または定量するための診断キットは、ＬＡＴを検出、同定または定量することができるための資材を含んでなり、例えば、前記の、単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識化抗体などを含有するものである。本発明のキットにおける、正常細胞に発現するＬＡＴを検出、同定または定量するためのキット、および腫瘍細胞に発現するＬＡＴを検出、同定または定量するためのキットは、いずれもＬＡＴを検出、同定または定量するためのキットの１種であり、定量するためには同じ種類の測定用のセットとすることが好ましいが、これに限定されるものではない。

例えば、正常細胞に発現するＬＡＴ（例えば、ＬＡＴ２）を検出、同定または定量するためのキットを蛍光物質で標識化したものとし、腫瘍細胞に発現するＬＡＴ（例えば、ＬＡＴ１）を検出、同定または定量するためのキットを放射性同位体で標識化したものとすることができるが、波長の異なる蛍光物質で標識化したものとは、異なる放射性同位体で標識化したものとすることが好ましい。

（実験方法）
本発明におけるＬＡＴの作用についてより具体的に説明する。まず、本発明者らは、ＬＡＴの免疫組織学的検討を行った。外科的処置により摘出し、パラフィン包埋した乳腺腫瘍細胞の組織標本を脱パラフィンおよびブロッキングを行った後、最終濃度２μｇ／ｍＬの抗ＬＡＴ抗体（ＬＡＴ１はマウス抗ヒトＬＡＴ１モノクローナル抗体（非特許文献１の２３，６３１頁図３Ａ参照）、ＬＡＴ２はラビット抗ヒトＬＡＴ２ポリクローナル抗体（抗ｈＥＳＴ３Ａ−Ｎ抗体、株式会社トランスジェニック、熊本）で４℃下一晩処理する。ＰＢＳによる洗浄の後、いずれもＣｈｅｍＭａｔｅＤＡＫＯＥＮＶＩＳＩＯＮＳｙｓｔｅｍＫｉｔ（ＤＡＫＯＣｈｅｍＭａｔｅＥＮＶＩＳＩＯＮＳｙｓｔｅｍＨＲＰｋｉｔ）のユニバーサル抗体を添加し、室温で３０分間処理後、ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン４塩酸塩）基質溶液により発色する。

この結果、ＬＡＴ１抗体での癌細胞の特異的な染色が認められる一方、ＬＡＴ２については特異的な染色は認められなかった。図１〜図５に抗ＬＡＴ１モノクローナル抗体を用いた染色試験の結果を示す。例えば、図１は、ＬＡＴ１発現強度を示す標準、図２では、悪性の非浸潤性乳管内癌におけるＬＡＴ１の発現例、図３では、トリプルネガティブ乳癌におけるＬＡＴ１の高発現例、図４ではＨＥＲ２陰性である乳癌におけるＬＡＴ１の発現例、図５はＨＥＲ２陽性である乳癌におけるＬＡＴ１の発現例を示す。以下、それぞれについて説明する。

図１は、ＬＡＴ１発現強度の標準を示す。ＬＡＴ１発現はＳｉｎｉｃｒｏｐｅの方法（非特許文献１１参照）を改変した方法（非特許文献４参照）により、発現の強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）［０（陰性）、１（軽度の陽性）、２（中度の陽性）および３（強度の陽性）］と発現領域の面積（ａｒｅａ）［０（陰性）、１（局所的、１０％以下)、２（部分的、１０％より大、３０％以下）および３（び漫性、３０％より大）］の積により得られた値を評価値（スコア）とする。この染色度を基に、ＬＡＴ１の発現度を求める。図１はＬＡＴ１発現強度の目安を表し、左から順に強度０、強度１、強度２、強度３を表す。

（乳管内腫瘍における悪性、良性の鑑別）
図２は、ともに乳管内腫瘍である、乳管内乳頭腫と非浸潤性乳管内癌の比較を示す。上段はＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色、下段はＬＡＴ１免疫染色による処理を行ったものである。左上が良性である乳管内乳頭腫、右上が悪性である非浸潤性乳管内癌のＨＥ染色写真である。左下がＬＡＴ１処理を行った乳管内乳頭腫、右下がＬＡＴ１処理を行った非浸潤性乳管内癌の写真である。図２から明らかなように、乳管内乳頭腫においては、ＬＡＴ１の発現がほとんど見られない一方、非浸潤性乳管内癌の細胞膜にＬＡＴ１の強い発現が見られる。非浸潤乳管内癌群のＬＡＴ１発現スコアは、乳管内乳頭腫群のＬＡＴ１発現スコアと比較して有意に高い。したがって、ＬＡＴ１をバイオマーカーとすることによって、これまで鑑別が困難であった乳管内乳頭腫と非浸潤性乳管内癌を簡便な方法で診断することができる。

乳管内腫瘍のうち、良性である乳管内乳頭腫と悪性である非浸潤乳管内癌との鑑別は組織診断上重要であり、手術的切除の必要性の判断に不可欠である。しかしながら、両腫瘍の鑑別には従来のＨＥ染色標本による病理組織診断方法では確かな鑑別要素が明らかでなく、鑑別困難な病変が多い。本発明により、良性の乳管内乳頭腫ではＬＡＴ１発現が極めて低く、高発現していた悪性の非浸潤乳管内癌とは対照的であることが見出された。したがって、ＬＡＴ１の免疫組織学的発現の評価によって、良性または悪性の鑑別が可能となる。

（トリプルネガティブ乳癌の診断）
図３は、ＥＲ（エストロゲン受容体）、ＰｇＲ（プロゲステロン受容体）、ＨＥＲ２のいずれにも陰性であるトリプルネガティブ乳癌細胞におけるＬＡＴ１発現の所見を示す。左から順にＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色（標準染色）、ＨＥＲ２、ＥＲ、ＰｇＲ、ＬＡＴ１で処理した場合を示す。この例は、ＥＲ、ＰｇＲおよびＨＥＲ２のいずれにも陰性であったトリプルネガティブ乳癌細胞がＬＡＴ１においては強度３（高強度）の陽性を示した例である。トリプルネガティブ群１７例のうち１４例（約８３％）がＬＡＴ１高発現（スコア６以上）していることから、ＬＡＴ１がトリプルネガティブ乳癌のバイオマーカーとして有用であると考えられる。

浸潤癌の中で、トリプルネガティブ乳癌には有効な分子標的治療がこれまでなかったところ、このトリプルネガティブ乳癌群の多くにＬＡＴ１の高発現が認められた。トリプルネガティブ乳癌は臨床的に予後不良の症例が多いことから、この所見は、ＬＡＴ１高発現の前立腺癌例がＬＡＴ１低発現例と比較して予後が不良であったことと一致する。従って、トリプルネガティブ乳癌に抗ＬＡＴ１分子標的療法（抗ＬＡＴ１抗体、ＬＡＴ１トランスポーターに作用する物質など）が有用であることを示唆しており、今後ＬＡＴ１を標的とした抗癌療法の導入が期待される。

図４は、浸潤性癌のうち、ＨＥＲ２陰性例（ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔにおけるスコア０）であってＬＡＴ１陽性である乳癌の例を示す。左から順にＥＲ、ＰｇＲ、ＨＥＲ２およびＬＡＴ１で処理した場合である。この例では、ＥＲおよびＰｇＲでは核に陽性、ＨＥＲ２では陰性、ＬＡＴ１では細胞膜に中強度の陽性（強度２）を示した。

図５は、浸潤性癌のうち、ＨＥＲ２陽性例（ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔにおけるスコア３）であってＬＡＴ１が高発現の陽性である乳癌の例を示す。左から順にＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色、ＨＥＲ２で処理した場合、ＬＡＴ１で処理した場合である。この結果、ＨＥＲ２陽性例（ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔにおけるスコア３）においてＬＡＴ１抗体でも強度３（高強度）の染色が認められた。図４および図５において、浸潤性癌のうち、ＨＥＲ２陽性例（ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔにおけるスコア３）群におけるＬＡＴ１発現スコアはＨＥＲ２陰性例（ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔにおけるスコア０）群と比較して有意に高かった。

以上より、ＬＡＴ１は従来診断困難であった乳管内腫瘍の良性または悪性の鑑別のための新たな診断ツールとなりうる。また、ＬＡＴ１はこれまでのＥＲ、ＰｒＧおよびＨＥＲ２のいずれにも陰性のトリプルネガティブ乳癌の治療において極めて有望なバイオマーカーとなりうる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。

参考例１実験サンプルの抽出
本発明者らが所属する施設において2005年から2009年までに外科的に切除された乳腺の腫瘍性病変を無作為的に抽出し、乳管内乳頭腫（ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌｐａｐｉｌｌｏｍａ）１０例、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）１０例および浸潤癌（ｉｎｖａｓｉｖｅｃａｒｃｉｎｏｍａ）６７例の計８７例の手術材料の病理検体を使用した。このうち、ＥＲ、ＰｇＲ、ＨＥＲ２とも陰性のトリプルネガティブ浸潤癌は１７例であった。

実施例１抗ＬＡＴ抗体を用いた染色
参考例１で抽出した乳腺の腫瘍性病変についてすべて、１０％ホルマリン固定パラフィン包埋ブロックを作製し、さらに腫瘍性病変の最大割面の代表的ブロックから３μｍの薄切切片を作製して、５分間のマイクロウェーブによる賦活後に本発明者らが作製したマウス抗ＬＡＴ１モノクローナル抗体（非特許文献１の２３，６３１頁図３Ａ参照）を４℃以下の温度で一晩反応させた。ＤＡＫＯＣｈｅｍＭａｔｅＥＮＶＩＳＩＯＮＳｙｓｔｅｍＨＲＰｋｉｔのユニバーサル抗体を添加し、室温で３０分間反応させた後に、ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン４塩酸塩）基質溶液により発色させた。核染色にはメチルグリーンまたはメイヤーズヘマトキシリン染色を施工した。ＥＲおよびＰｇＲの免疫染色にはベンタナＸＴシステム（ベンタナジャパン、東京、日本）を用い、ＨＥＲ２の免疫染色はＤＡＫＯＥＧＦＲｐｈａｒｍＤｘｋｉｔ（ＤａｋｏＮｏｒｔｈＡｍｅｒｉｃａＩｎｃ．，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）により行った。なお、ＬＡＴ２については、ラビット抗ヒトＬＡＴ２ポリクローナル抗体（抗ｈＥＳＴ３Ａ−Ｎ抗体、株式会社トランスジェニック、熊本）を使用した。

この結果、多くの乳癌細胞にはＬＡＴ１が発現しており（ＬＡＴ１発現スコアは０〜９）、ＬＡＴ２も軽度ながら発現していた（ＬＡＴ２発現スコアは０〜３）。一方、正常細胞におけるＬＡＴ１発現スコアは０〜１であり、ＬＡＴ２スコアは１〜４であった。

ＬＡＴ１発現はＳｉｎｉｃｒｏｐｅの方法（非特許文献１１参照）を改変した方法（非特許文献４参照）により、発現の強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）［０（陰性）、１（軽度の陽性）、２（中度の陽性）、３（強度の陽性）］と発現領域の面積（ａｒｅａ)［０（陰性）、１（局所的、１０％以下)、２（部分的、１０％より大、３０％以下）、３（び漫性、３０％より大）］の積により得られた値を評価値（スコア）とした。統計処理は、各群の平均値±標準偏差として表現し、２群間の比較はノンパラメトリック、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙＵｔｅｓｔによって、危険率５％以下で有意とした。

結果
実施例１の結果を図６に示す。図６は、乳腺腫瘍におけるＬＡＴ１発現の比較を示す。

（１）非浸潤性乳管内癌と乳管内乳頭腫のＬＡＴ１発現の比較
悪性の非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）群のＬＡＴ１発現スコアは5.1±3.2であり、良性の乳管内乳頭腫（ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌｐａｐｉｌｌｏｍａ）群の1.5±2.1と比較して有意に高かった（p=0.0156）。

（２）ＨＥＲ２陽性例と陰性例のＬＡＴ１発現の比較
浸潤性癌（ｉｎｖａｓｉｖｅｃａｒｃｉｎｏｍａ）のうち、ＨＥＲ２陽性例（ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔにおけるスコア３）群におけるＬＡＴ１発現スコアは6.6±2.8であり、ＨＥＲ２陰性例（ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔにおけるスコア０）群の3.6±2.4と比較して有意に高かった（p=0.0008）。このことから、ＨＥＲ２陽性例はＬＡＴ１スコアが高く、細胞増殖の面から、悪性度が高いといえる。

（３）トリプルネガティブ乳癌群におけるＬＡＴ１発現
ＥＲ、ＰｇＲおよびＨＥＲ２のいずれも陰性である、トリプルネガティブ乳癌群の多くはＬＡＴ１高発現症例（スコアが６以上だったのが１７例のうち１４例、すなわち約８３％）であり、その１７例のＬＡＴ１発現スコアは6.8±2.6と高値を示した。このことから、トリプルネガティブ乳癌群の多くはＬＡＴ１スコアが高く、ＬＡＴ１を対象とした分子標的治療が有効であると考えられる。

Claims

抗ＬＡＴ１モノクローナル抗体を含有する、乳腺腫瘍の診断用の診断キットであって、前記乳腺腫瘍が、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびＨＥＲ２のいずれにも陰性であるトリプルネガティブ乳癌である、前記診断キット。
前記乳腺腫瘍が乳管内腫瘍であって、その悪性度を診断するための、請求項１記載の診断キット。
エストロゲン受容体の免疫染色キット、プロゲステロン受容体の免疫染色キットおよびＨＥＲ２の免疫染色キットと、ＬＡＴ１の免疫染色キットからなる組み合わせを含有する、乳腺腫瘍の診断用の診断キットであって、前記乳腺腫瘍が、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびＨＥＲ２のいずれにも陰性であるトリプルネガティブ乳癌である、前記診断キット。
被験者から摘出された乳腺組織に、抗ＬＡＴ１モノクローナル抗体を接触させ、前記組織中のＬＡＴ１を検出、同定または定量する工程を含む、乳腺腫瘍の検出方法であって、前記乳腺腫瘍が、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびＨＥＲ２のいずれにも陰性であるトリプルネガティブ乳癌である、前記検出方法。
前記乳腺腫瘍が乳管内腫瘍であって、その悪性度を診断するための、請求項４記載の検出方法。
エストロゲン受容体の免疫染色、プロゲステロン受容体の免疫染色、ＨＥＲ２の免疫染色、およびＬＡＴ１の免疫染色を含有してなる、乳腺腫瘍の検出方法であって、前記乳腺腫瘍が、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびＨＥＲ２のいずれにも陰性であるトリプルネガティブ乳癌である、前記検出方法。