TWI390034B - Novel anti-CD98 antibody - Google Patents
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Description
本專利申請案係伴隨基於先前申請之日本國專利申請即特願2006-105013號(申請日：2006年4月6日)之優先權之主張者。特願2006-105013號之全部揭示內容，藉由引用而成為本說明書之一部分。
本發明係獨立行政法人科學技術振興機構關於「胺基酸輸送蛋白抗體抗癌藥」之新技術開發委託之開發成果之發明。
本發明係關於一種單株抗體、以及使用其之腫瘤增殖抑制或者癌治療之醫藥用途，該單株抗體對來自癌細胞的細胞膜且與具有胺基酸輸送活性的蛋白質形成複合物之CD98具有特異性結合能力。
癌(惡性腫瘤)占日本國死亡原因的第一位。其患者數正逐年增加，因而業者強烈期望開發出有效性及安全性較高之藥劑或治療法。目前為止之抗癌劑，經常是其特異性殺癌細胞能力較低，亦作用於正常細胞，且引起許多藥物有害反應。近年來，以於癌細胞中高度表現的分子(癌相關抗原)為標的之抗癌劑之開發獲得進展，因而於白血病、乳癌、肺癌等方面成為有效之治療手段。
揭示有，對與於細胞的細胞膜上表現的癌相關抗原特異性結合之抗體，可用於經由抗體依賴性細胞性細胞傷害活性(antibody dependent cell cytotoxicity(ADCC))或補體依賴性細胞傷害活性(complement－dependent cell－mediated cytotoxicity(CDC))等免疫反應而攻擊癌細胞、或者抑制癌細胞增殖所必需的細胞增殖訊號傳遞之癌治療。
然而，於治療中使用抗體之癌種，係乳癌、難治性慢性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病等有限之癌種，又，可以一種抗體用於治療多種癌種之抗體尚不存在。因此，業者一直在謀求獲得可與多種癌細胞強力結合且具有抗癌活性之抗體。
CD98(4F2)，係由已知的於多種癌細胞中高表現的529胺基酸殘基所構成之約80 kDa之type Ⅱ膜貫通糖蛋白鏈。其經由二硫鍵與具有胺基酸輸送活性的約40 kDa的蛋白質形成雜二聚物，且於細胞膜上表現。作為一般認為與CD98結合之胺基酸輸送蛋白，目前已知有6種。CD98，被鑑定為淋巴球之活化抗原，但一般認為CD98與細胞增殖訊號傳遞、整合素(integrin)之活化、細胞融合等許多生物學功能有關(Haynes B.F等人，J.Immunol.,(1981),126，第1409－1414頁、Lindsten T.等人，Mol.Cell Biol.,(1988),8，第3820－3826頁，Teixeira S.等人，Eur.J.Biochem.,(1991),202，第819－826頁、L.A.Diaz Jr.等人，J Biol Regul Homeost Agents.,(1998)12,第25－32頁)。
癌細胞為確保增殖優勢性而具有各種結構。例如一般認為，其係癌細胞為了較周邊細胞優先攝取增殖所需的必須胺基酸而過量表現中性胺基酸運送體者之一。近年來，已選殖出於癌細胞上特異性表現之胺基酸運送體L－型胺基酸轉送體1(LAT1)(Kanai等人，J.Biol.Chem.(1998),273,第23629－23632頁)。LAT1與CD98形成複合物，且以非鈉離子依賴性方式輸送白胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、組胺酸等具有大型側鏈之中性胺基酸。又，並未確認LAT1於除腦、胎盤、骨髓、精巢以外的大部分正常組織中表現是否較低，但已知於大腸癌、胃癌、乳癌、胰癌、腎癌、喉頭癌、食道癌、肺癌等人類惡性腫瘤組織中與CD98同時表現亢進(Yanagida等人，Biochem.Biophys.Acta,(2001),1514,第291－302頁)。報告有一若使LAT1的表現降低而抑制胺基酸攝取，則抑制腫瘤增殖之癌移植小白鼠模型(日本專利特開2000－157286號公報)；一般認為抑制LAT1的活性係一有前途之癌治療法。
關於針對人類CD98之抗體，報告有藉由使人類CD98表現細胞株對小白鼠等非人類哺乳動物實施免疫而製造之小白鼠單株抗體(上述Haynes等人、Masuko T.等人，Cancer Res.,(1986),46,第1478－1484頁、以及Freidman AW.等人，Cell.Immunol.,(1994),154,第253－263頁)。但是，關於該等抗CD98抗體是否抑制LAT1之胺基酸攝入並不瞭解。進而，雖獲得LAT1之細胞內區域之抗體，但並未報告有可與生物細胞膜上的LAT1結合之抗體。因此，若獲得於癌細胞膜上表現的CD98或者與LAT1結合且抑制LAT1的胺基酸攝入之抗體，則認為係廣譜癌症之優異治療藥。
本發明者們此次成功地獲得對來自癌細胞的細胞膜且與具有胺基酸輸送活性的蛋白質形成複合物的CD98具有特異性結合能之抗體，發現該抗體具有抑制癌細胞增殖之作用，故利用該性質可用作醫藥組合物之有效成分，更具體而言可用作腫瘤之預防或治療劑之有效成分。本發明係基於該知見而成者。
因此，本發明之目的在於提供一種人類抗體及其功能性片段，該人類抗體對來自癌細胞細胞膜且與具有胺基酸輸送活性的蛋白質形成複合物之CD98具有特異性結合能。
進而，本發明之目的在於提供一種以上述本發明之人類抗體及其功能性片段為有效成分之醫藥組合物或者腫瘤之預防或治療劑。
另外，本發明之人類抗體及其功能性片段之特徵在於：對來自癌細胞的細胞膜且與具有胺基酸輸送活性的蛋白質形成複合物之CD98具有特異性結合能。
進而，本發明之醫藥組合物或者腫瘤之預防或治療劑，係含有上述本發明之人類抗體或其功能片段作為有效成分而成者。
微生物之寄託
將根據本發明所提供之含有編碼人類抗體的可變區核酸序列之質體載體C2IgG1/pCR4以及K3/pCR4分別作為FERM BP－10551(用以識別之標誌：C2IgG1/pCR4，國內寄存編號：BCRC 940530)、及FERM BP－10552(用以識別之標誌：K3/pCR4，國內寄存編號：BCRC 940529)，於2006年3月14日寄託於獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物委託中心(日本國茨城縣築波市東1丁目1番1中央第6)。
於本說明書或圖式中用以標記胺基酸之字母之一文字，分別意指如下所示之胺基酸。(G)甘胺酸、(A)丙胺酸、(V)纈胺酸、(L)白胺酸、(I)異白胺酸、(S)絲胺酸、(T)蘇胺酸、(D)天冬胺酸、(E)麩胺酸、(N)天冬醯胺酸、(Q)麩醯胺、(K)離胺酸、(R)精胺酸、(C)半胱胺酸、(M)甲硫胺酸、(F)苯丙胺酸、(Y)酪胺酸、(W)色胺酸、(H)組胺酸、(P)脯胺酸。又，用以標記DNA之字母之一文字之含意，分別揭示如下。(A)為腺嘌呤、(C)為胞嘧啶、(G)為鳥嘌呤、(T)為胸腺嘧啶。
與本發明之人類單株抗體及其功能性片段(以下，只要無特別說明，則於本說明書中簡稱為「本發明之抗體」)具有特異性結合能之CD98，如上所述，係由529胺基酸殘基所形成之type Ⅱ膜貫通糖蛋白鏈，係與具有胺基酸輸送活性的蛋白質於細胞膜上形成雜二聚物者。此處，作為具有胺基酸輸送活性之蛋白質之較佳具體例，可舉出LAT1。又，根據本發明之較佳態樣，CD98係人類CD98。再者，人類CD98之蛋白質之一級結構為眾所周知(序列號66，GenBank/EMBL/DDBJ accession No.AB018010)，又，人類LAT1之蛋白質亦眾所周知(序列號68，GenBank/EMBL/DDBJ accession No.AB018009)。
本發明之抗體，係對來自癌細胞細胞膜且與具有胺基酸輸送活性的蛋白質形成複合物之CD98具有特異性結合能，另一方面，與人類正常細胞例如正常人類血管內皮細胞、正常人類末梢血單核球、以及淋巴球並不結合。至於具有結合能之癌細胞之例，可列舉：構成大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、前列腺癌、黑色素瘤、腦腫瘤、淋巴瘤、膀胱癌、胰臟癌、多發性骨髓瘤、腎細胞癌、白血病、T細胞淋巴瘤、胃癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、食道癌、肝癌、頭頸部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、絨毛膜癌、咽頭癌、喉頭癌、鞘膜瘤、雄胚瘤、子宮內膜增生、子宮內膜症、胚組織瘤、纖維肉瘤、卡波西氏肉瘤、血管瘤、海綿狀血管瘤、血管母細胞瘤、視網膜胚細胞瘤、星狀細胞腫、神經纖維瘤、寡樹突細胞瘤、神經管胚細胞瘤、神經胚細胞瘤、神經膠質瘤、橫紋肌肉瘤、神經膠母細胞瘤、骨原性肉瘤、平滑肌肉瘤、甲狀肉瘤或者威爾姆斯瘤等癌細胞；更具體而言，可列舉：大腸癌細胞株(DLD-1、Colo205、SW480、SW620、LOVO、LS180及HT29)、肺癌細胞株(H226)、前列腺癌細胞株(DU145)、黑色素瘤細胞株(G361、SKMEL28、CRL1579)、非霍奇金淋巴瘤株(Ramos)、膀胱癌細胞株(T24)、乳癌細胞株
(MCF、MDA-MB-231)、胰臟癌細胞株(HS766T)、多發性骨髓瘤細胞株(IM9)、紅血球胚細胞系白血病株(K562)。本發明之抗體具有以下優點：對於如此的多種癌細胞具有結合能。
本發明之抗體之對癌細胞之特異性結合能，可提高本發明之抗體之有用性。即，如下所述，本發明之較佳態樣之抗體，可有意地抑制經由LAT1將胺基酸攝取細胞內，故而僅與癌細胞結合，較為有利，進而可有利地用作使本發明之抗體與其他藥劑結合而將其送達癌細胞之標靶劑。
又，本發明之抗體具有抗腫瘤活性。本發明之較佳態樣之抗體，具有有意地抑制經由LAT1將胺基酸攝取細胞內之性質。因此，一般認為，本發明之抗體之抗腫瘤活性，係除利用ADCC及CDC之免疫系統進行特異性傷害以外，藉由抑制如此之胺基酸攝入而形成者。根據本發明之更具體之態樣，本發明之抗體，可有意地抑制膀胱癌細胞株T24細胞攝取胺基酸。
根據本發明之較佳態樣，本發明之抗體具有下述(a)序列號29及31、(b)序列號41及47、以及(c)序列號43及47中之任意二序列作為重鏈可變區及輕鏈可變區。進而，根據其他態樣，本發明之抗體具有包含於質體載體K3/pCR4(FERM BP-10552)(國內寄存編號：BCRC 940529)或者C2IgG1/pCR4(FERM BP-10551)(國內寄存編號：BCRC 940530)中且被來自除載體pCR4的序列以外的序列所編碼之序列作為可變區。該態樣之抗體之可變區之胺基酸序列
係被獲自上述任一質體載體中且不含來自載體pcR4的序列之Bgl Ⅱ-BsiWI片段(輕鏈可變區)以及SalI-NheI片段(重鏈可變區)所編碼者。
所謂本發明之抗體之功能性片段，意指對本發明之抗體特異性結合的抗原特異性結合之抗體片段，更具體而言，可列舉：F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、二硫鍵連接FV(disulphide-linked FV)、單鏈FV(Single-Chain FV，scFV)以及該等之聚合物等(D.J.King.,Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies.,1998 T.J.International Ltd)。如此之抗體片段，可藉由慣用法例如使用木瓜酶(papain)、胃蛋白酶等蛋白酶進行抗體分子之消化，或者藉由公知的基因工程學方法而獲得。
於本發明中，所謂「人類抗體」，意指來自人類的抗體基因之表現產物即抗體。人類抗體，可藉由將抗原投與如下所述導入人類抗體基因座且具有產生來自人類的抗體的能力之基因轉殖動物，而獲得。可舉出小白鼠作為該基因轉殖動物；可產生人類抗體之小白鼠之製作方法，例如記載於國際公開WO 02/43478號公報中。
本發明之抗體亦包含如下之單株抗體，該單株抗體係由在構成抗體的重鏈及/或輕鏈的各胺基酸序列中有一個或數個胺基酸產生缺失、置換或加成的胺基酸序列的重鏈及/或輕鏈所構成。對本發明之抗體之胺基酸序列中的如此胺基酸進行部分性改變(缺失、置換、插入、加成)，可藉由將編碼其胺基酸序列的鹼基序列加以局部性改變而導入。該鹼基序列之局部性改變，可利用已知的部位特異性變異導入法(Site specific mutagenesis)且藉由常用方法而導入(Proc Natl Acsd Sci USA.,1984 Vol 815662，Sambrook等人，Molecular Cloning A Laboratory Manual (1989)Second edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
根據本發明之較佳態樣，本發明之抗體係輕鏈第117號異白胺酸被其他胺基酸殘基例如甲硫胺酸、天冬醯胺、白胺酸或半胱胺酸置換者。作為如此之抗體之較佳例，係具有(d)序列號43及77、(e)序列號43及79、(f)序列號43及81以及(g)序列號43及83中之任意二序列作為重鏈可變區及輕鏈可變區者。
本發明之抗體亦包含具有任意的免疫球蛋白類及其亞型之抗體，根據本發明之較佳態樣，係具有人類免疫球蛋白類及其亞型之抗體，較好的亞型為免疫球蛋白G(IgG)，尤其好的是IgG1，較好的輕鏈為。
又，本發明之抗體，亦包含藉由業者所周知的基因工程學改變(例如，EP 0 314 161公報)而變換成不同亞型者。即，可使用編碼本發明之抗體的可變區的DNA且利用基因工程學方法，而獲得與原來亞型不同的亞型之抗體。
ADCC，意指經由於巨噬細胞、NK細胞、嗜中性球等表面上所表現的Fc受體與抗體的恆定區結合，藉此識別細胞且藉由經識別細胞活化而被誘導之細胞毒殺活性，另一方面，CDC意指藉由抗原與抗體結合，由經活化的補體系所引起之細胞毒殺活性；目前已明瞭，該等活性根據抗體的亞型不同其活性的強弱亦不同，另外其係由於在抗體的恆定區的結構不同所致(Charles A.Janeway等人，Immunobiology,1997,Current Biology Ltd/Garland Publishing Inc.)。
因此，例如，可藉由將本發明之抗體亞型變換為IgG2或IgG4，而獲得對Fc受體的結合度較低之抗體。相反，可藉由將本件發明之抗體亞型變換為IgG1或IgG3，而獲得對Fc受體的結合度較高之抗體。於期待上述ADCC及CDC活性之情形時，較理想的是，抗體亞型為IgG1。
於將不同亞型的抗體變換為IgG1之情形時，例如可藉由自抗體產生融合瘤中僅分離出可變區，且導入含有人類IgG1恆定區之載體，例如N5KG1－Val Lark載體(IDEC Pharmaceuticals,N5KG1(美國專利US patent 6001358)而製造。
進而，可藉由將本發明之抗體之恆定區域的胺基酸序列進行基因工程學改變、或者與具有如此序列的恆定區序列結合，而改變對Fc受體之結合度(參照Janeway CA.Jr.and Travers P.(1997),Immunobiology,Third Edition,Current Biology Ltd./Garland Phulishing Inc.)，或者改變與補體之結合度(參照Mi－Hua Tao,等人，1993.J.Exp.Med)。例如，使將重鏈恆定部分之EU編號系統(參照Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91－3242)中編碼第331號脯胺酸(P)的序列CCC變異為編碼絲胺酸(S)的TCC，而將脯胺酸置換為絲胺酸，藉此可改變對補體之結合度。
例如，假定於本發明之抗體單獨情況下無誘導細胞死亡活性之情形時，較理想的是具有經由Fc受體的由抗體依賴性細胞毒性活性(ADCC)或補體依賴性細胞傷害活性(CDC)所產生的抗腫瘤活性之抗體；但於抗體單獨情況下具有誘導細胞死亡活性之情形時，亦存在如下情形：更理想的是與Fc受體的結合度較低之抗體。
又，於考慮免疫抑制劑之情形時，於僅立體性抑制T細胞與抗原呈現細胞的結合之情形等時，較理想的是不具有ADCC活性或CDC活性之抗體。又，於ADCC活性或CDC活性可變成毒性原因之情形時，亦存在如下情形：較理想的是，藉由變更Fc部分的變異或亞型而避免變成毒性原因之抗體。
考慮到以上情況，若有必要，可藉由對不同亞型進行基因工程學改變，而將本發明之抗體製成利用ADCC或CDC來特異性毒殺癌細胞者。
根據本發明之其他較佳態樣，較好的是，本發明之抗體，係識別由人類CD98的胺基酸序列(序列號66)中的連續或不連續的至少8個胺基酸殘基所構成之抗原決定基抗原決定基者。根據本發明之更佳態樣，較好的是本發明之抗體，係與人類CD98的胺基酸序列中的371~529胺基酸區域的一部分具有結合性、或者與1~371胺基酸區域的一部分具有結合性者。
根據本發明之其他態樣，可提供作為本發明之抗體之、具有對人類CD98及猴CD98顯示交叉反應的性質之抗體。如此之抗體，推測其係於人類CD98及猴CD98中識別相同或極類似的抗原決定基抗原決定基結構者，具有能夠於對人類進行臨床試驗前進行以猴作為實驗動物的各種試驗之優點。
本發明之抗體，例如可藉由下述方法而製造。
將與人類CD98/人類LAT1或其一部分或者用以提高抗原的抗原性的適當物質(例如，bovine serum albumin等)之結合物、或者於細胞表面大量表現人類CD98/人類LAT1之細胞，根據需要與免疫活化劑(Freund's Adjuvant等)一同對小白鼠、兔子、山羊、馬等非人類哺乳動物進行免疫之或者嵌入人類CD98/人類LAT1之表現載體投與非人類哺乳動物，藉此進行免疫致敏。本發明之抗體，可藉由以下操作而獲得：由自免疫作用動物獲得的抗體產生細胞及無自身抗體產生能的骨髓瘤系細胞(骨髓瘤細胞)製備融合瘤，且將融合瘤進行選殖，選擇產生針對用於免疫的抗原顯示特異性親和性的單株抗體之株。
以下，更具體地就本發明之抗體之製作法加以詳述，但抗體之製作法並不限定於此，例如亦可使用除脾細胞以外之抗體產生細胞及骨髓瘤。
作為抗原，可使用將編碼CD98的DNA嵌入動物細胞用表現載體，再將該表現載體導入動物細胞所獲得之轉形株。
可藉由使用轉形株作為抗原而期待獲得抑制LAT1的胺基酸攝入之抗體，該轉形株係因CD98於許多癌細胞表面與LAT1形成雜二聚物故同樣地將編碼LAT1的DNA嵌入表現載體，而使CD98與LAT1共表現者。
作為動物細胞用表現載體，例如可使用pEGF－N1(Becton Dickinson Biosciences Clontech公司製造)等載體、且以適當的限制酶將插入部位裂解，將被相同酶裂解的人類CD98或人類LAT1連接上，藉此可製備目標基因導入用載體。另外，可藉由以例如稱為L929細胞(American Type Culture Collection No.CCL－1)的細胞作為宿主將所製備的表現載體導入，而製作高表現人類CD98及人類LAT1之細胞。
向宿主導入基因之方法為眾所周知，可列舉任意方法(例如：使用鈣離子之方法、電穿孔法、原生質球法、醋酸鋰法、磷酸鈣法、微脂粒轉染法等)。
如此製作之轉形細胞，可作為用以製作CD98抗體之免疫原。進而，亦可將表現載體作為免疫原。
人類CD98，可藉由基於公知的鹼基序列或胺基酸序列，適當採用除基因重組技術外之如化學合成法、細胞培養方法等於技術領域所熟知的方法，而製造。另外，亦可將如此所獲得之人類CD98蛋白作為抗原而製作CD98抗體。人類CD98之部分序列，亦可依據後述技術領域中所熟知的方法，利用基因重組技術或化學合成法而製造，又藉由使用蛋白分解酶等適當地切斷人類CD98而製造。
以如下之方式將上述所獲得之抗原進行免疫。即，將所製作的抗原與用以提高抗原性的適當物質(例如，bovine serum albumin等)、以及根據需要的免疫活化劑(Freund之完全或不完全adjuvant等)同時加以混合，對小白鼠、兔子、山羊、馬等非人類哺乳動物進行免疫。又，較好的是，使用保持不經再排列之人類抗體基因、藉由免疫致敏而於該免疫原上產生特異性人類抗體之非人類動物，藉此本發明之抗體可為人類抗體。此時，作為人類抗體產生動物，例如可列舉富塚等人之文獻[Tomizuka等人.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000 Vol 97：第722頁]中所記載之人類抗體產生轉殖小白鼠。
分泌單株抗體之融合瘤之製備，可依據Kehler及Milstein等方法(Nature.,1975 Vol.256：第495－497頁)進行。即，藉由使於自如前述的經免疫致敏的動物中所獲得的脾臟、淋巴腺、骨髓或扁桃體等，較好的是淋巴節或脾臟中所含的抗體產生細胞，與來自較好的是小白鼠、大白鼠、土撥鼠、倉鼠、兔子或人類等哺乳動物的無自我抗體產生能的骨髓瘤細胞進行細胞融合，而製備。細胞融合，例如可藉由於聚乙二醇(例如分子量1500~6000)等高濃度聚合物溶液中，通常於約30~40℃下，將抗體產生細胞與骨髓瘤細胞進行約1~10分鐘之混合而進行。產生單株抗體之融合瘤株之篩選，例如係可藉由將融合瘤於微量滴定盤中進行培養，且利用例如ELISA等酶免疫測定法、放射免疫測定法、螢光抗體法等免疫學方法測定對增殖的可見之孔中培養上清液的免疫抗原之反應性，而進行。
來自融合瘤之單株抗體之製造，係將融合瘤於體外試管中進行培養後自培養上清液中分離。又，亦可於小白鼠、大白鼠、土撥鼠、倉鼠或者兔子等的腹水中等的體內進行培養，再自腹水中分離。又，可自融合瘤等抗體產生細胞中選殖出編碼單株抗體的基因，且與適當的載體組合，再將其導入宿主(例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞等哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆蟲細胞、植物細胞等)，利用基因重組技術而製備重組型抗體(P.J.Delves.,ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.,1997 WILEY、P.Shepherd and C.Dean.,Monoclonal Antibodies.,2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS,J.W.Goding.,Monoclonal Antibodies：principles and practice.,1993 ACADEMIC PRESS)。進而，亦可使用轉殖動物製作技術製造將目標抗體的基因嵌入內在性基因之轉殖的牛、山羊、羊或者豬，且自該轉殖動物的奶中獲得大量來自該抗體基因之單株抗體。於將融合瘤置於體外試管中進行培養之情形時，可使用以符合培養細胞種的特性、試驗研究目的以及培養方法等各種條件，使融合瘤得以增殖、維持及保存，自如於培養上清液中產生單株抗體之已知營養培養基或已知基本培養基中誘導製備的所有營養培養基，而實施。
所產生之單株抗體，可藉由將該領域中周知的方法加以組合，例如使用蛋白質A管柱之層析法、離子交換層析法、疏水層析法、硫酸銨鹽析法、凝膠過濾、親和層析法等，進行純化。
抗體之醫藥用途
本發明之抗體，首先，係對來自癌細胞的細胞膜且與具有胺基酸輸送活性的蛋白質形成複合物的CD98具有特異性結合能，此外可藉由與治療用藥劑複合，而形成可用於向癌細胞輸送藥物或者導彈療法等治療目的之複合物。
至於與抗體結合之治療用藥劑之例，並無特別限定，例如可列舉：碘(131
Iodine：131
I、125
Iodine：125
I)、釔(90
Yttrium：90
Y)、銦(111
Indium：111
In)、鎝(99m
Technetium：99m
TC)等放射核種(J.W.Goding.,Monoclonal Antibodies：principles and practice.,1993 ACADEMIC PRESS)，如綠膿桿菌毒素(Pseudomonas exotoxin)、白喉毒素(diphtheria toxin)、蓖麻毒蛋白(Ricin)之細菌毒素，以及Methotrexate、mitomycin、Calicheamicin等化學療法劑(D.J.King.,Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies.,1998 T.J.International Ltd、M.L.Grossbard.,Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer.,1998 Marcel Dekker Inc)等，更好的是，可列舉誘導自由基形成之硒化合物。
抗體與治療用藥劑之鍵結，係共價鍵或非共價鍵(例如離子鍵)中之任一鍵。例如，利用抗體分子中的反應性基(例如胺基、羧基、羥基等)或者配位性基，根據需要進一步將反應性基鍵結或者變換為反應性基，然後使具有與該反應性基反應而可形成鍵的官能基(細菌毒素、化學療法劑之情形)或者可於與該配位性基之間形成錯合物的離子性基(放射性核種之情形)之治療用藥劑與抗體接觸，藉此可獲得本發明之複合物。或者，於形成複合物時，亦可利用生物素－抗生素系。
又，於治療用藥劑為蛋白質或肽之情形時，亦可利用基因工程學方法生產抗體與上述蛋白質或肽之融合蛋白質。
又，本發明之抗體具有抗腫瘤活性，因此可將其自身用作抗腫瘤劑。進而，可用作醫藥組合物尤其是腫瘤的預防或治療劑之有效成分。
因此，本發明之抗體或者其醫藥組合物，可應用於治療或預防具有起因於表現人類CD98/人類LAT1的細胞的可能性之各種疾病或症狀。至於該疾病或者症狀，可列舉各種惡性腫瘤，至於腫瘤之例，係大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、前列腺癌、黑色素瘤、腦腫瘤、淋巴瘤、膀胱癌、胰臟癌、多發性骨髓瘤、腎細胞癌、白血病、T細胞淋巴瘤、胃癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、食道癌、肝癌、頭頸部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、絨毛膜癌、咽頭癌、喉頭癌、鞘膜瘤、雄胚瘤、子宮內膜增生、子宮內膜症、胚組織瘤、纖維肉瘤、卡波西氏肉瘤、血管瘤、海綿狀血管瘤、血管母細胞瘤、視網膜胚細胞瘤、星狀細胞瘤、神經纖維瘤、寡樹突細胞瘤、神經管胚細胞瘤、神經胚細胞瘤、神經膠質瘤、橫紋肌肉瘤、神經膠母細胞瘤、骨原性肉瘤、平滑肌肉瘤、甲狀肉瘤或者威爾姆斯瘤等，應用本發明之抗體時之腫瘤並不限定於1種，可為數種腫瘤併發。又，本發明之人類單株抗體，亦可用於延長患原發性局部癌的患者的壽命。又，可使本發明之醫藥組合物選擇性作用於CD98表現的免疫作用細胞。
含有本發明之抗體或者與治療用藥劑鍵結的抗體之藥物，較好的是作為醫藥組合物形式而提供。
如此之醫藥組合物中包含治療上有效量之治療用藥劑，將醫藥組合物製成口服、非口服投與用各種劑型。此處，所謂治療上有效量，係指對於所出現的症狀或投與計劃提供治療效果之量。
本發明之組合物，除抗體外，可含有生理學上容許之製劑中之添加物，例如稀釋劑、保存劑、溶解劑、乳化劑、佐劑、抗氧化劑、等張劑、賦形劑以及載體中之一或數種。又，本發明之組合物，亦可製成與其他抗體或如抗生物質的其他藥劑之混合物。
適當的載體中包含生理鹽水、磷酸緩衝生理鹽水、磷酸緩衝生理鹽水葡萄糖液、以及緩衝生理鹽水，但並不限定於該等。進而可含有該領域中周知的胺基酸、糖類、界面活性劑等穩定劑、對表面之抗吸附劑。
作為製劑之劑型，可視治療目的、治療計劃而選擇包含冷凍乾燥製劑(此時可藉由添加如上述之緩衝水溶液以進行再構成後使用)、緩釋製劑、腸溶性製劑、注射劑或點滴劑等之製劑。
可適當決定投與途徑，例如一般認為有口服途徑，以及包含靜脈內、肌肉內、皮下及腹腔內注射或施藥之非經腸途徑。或者，亦可採用直接使本發明之組合物與患者的患部接觸之方法。
根據使用動物的試驗、臨床試驗的實施來適當確定投與量，通常應考慮患者的狀態或嚴重程度、年齡、體重、性別等。通常，於口服投與時之投與量，對於成人而言1天約為0.01 mg~1000 mg，可將該等以1次或分數次投與。又，於非口服投與時，可經由皮下注射、肌肉注射或靜脈注射，1次投與約0.01 mg~1000 mg。
本發明亦包含使用本發明之抗體或醫藥組合物的上述疾病之預防或治療法，進而本發明亦包含將本發明之抗體用於製造上述疾病的預防或治療劑之用途。
根據本發明之較佳態樣，本發明之抗體，係作為溶解於水或除水以外的藥理學上容許之溶液中的無菌性溶液或者懸浮液的安瓿形式而使用。又，可將無菌粉末製劑(較好的是將本發明之分子進行冷凍乾燥)預先填充於安瓿中，於使用時以藥理學上可容許的溶液進行稀釋。
以下，根據實施例更詳細地說明本發明，但本發明並不限定於該等實施例中所記載之態樣。
以保持人類CD98(hCD98、GenBank/EMBL/DDBJ accession no.AB018010，序列號65)以及人類LAT1(hLAT1、GenBank/EMBL/DDBJ accession no.AB018009，序列號67)的DNA之質體載體pcDNA3.1－hCD98以及pcDNA3.1－hLAT1作為模板進行聚合酶鏈反應(PCR)。為了在全長人類CD98 cDNA的5'末端上附加EcoRI序列、且於其3'末端上附加NotI序列及終止密碼子，而使用引子5'－CCG GAA TTC CCA CCA TGA GCC AGG ACA CCG AGG TGG ATA TGA－3'(序列號59)以及5'－AAG GAA AAA AGC GGC CGC TCA TCA GGC CGC GTA GGG GAA GCG GAG CAG CAG－3'(序列號60)，以KOD－PlusDNA聚合酶(東洋紡公司製造)及hCD98 cDNA(約20 ng)作為模板，以94℃ 15秒、55℃ 30秒以及68℃ 1分鐘30秒之條件，進行30個循環之PCR反應。將經修飾之hCD98序列分離成EcoRI－NotI片段，繼而與被同一酶裂解之pTracer－EF/Bsd載體(Invitrogen公司製造)連接。以所獲得之質體作為模板，使用CD98 v2U(5'－AGT CTC TTG CAA TCG GCT AAG AAG AAG AGC ATC CGT GTC ATT CTG－3'(序列號61))引子及CD98 v2L(5'－CAG AAT GAC ACG GAT GCT CTT CTT CTT AGC CGA TTG CAA GAG ACT－3'(序列號62))引子，將hCD98DNA的第591號及第594號(序列號65之第702號以及第705號)之A變為G。自所獲得質體製備EcoRI－hCD98－NotI片段，且將其與被同一酶裂解的pEF6myc－His/Bsd(Invitrogen公司製造)載體連接。將所獲得質體命名為pEF6/hCD98。
同樣地，為了在全長人類LAT1 cDNA的5'末端上附加EcoRI序列、且在其3'末端上附加KpnI序列，而使用引子5'－CCG GAA TTC CCA CCA TGG CGG GTG CGG GCC CGA AGC GGC－3'(序列號63)以及5'－CGG GGT ACC GTC TCC TGG GGG ACC ACC TGC ATG AGC TTC－3'(序列號64)，以KOD－Plus DNA聚合酶及hLAT1 cDNA(約20 ng)作為模板，以94℃15秒、55℃30秒、以及68℃1分鐘30秒之條件，進行30個循環之PCR反應。將經修飾的hLAT1序列分離成EcoRI－KpnI片段，繼而與被同一酶裂解的pEGFP－N1(CLONTECH公司製造)載體連接。進而，將所獲得質體分離成EcoRI－NotI片段，繼而與被同一酶裂解的pEF1V5His/Neo(Invitrogen公司製造)載體連接。將所獲得質體命名為pEF1/hLAT1－EGFP。
hCD98/hLAT1表現細胞之製作，係使用Invitrogen公司製造之Lipofectamine及Plus試劑，將實施例1中製作的表現載體pEF6/hCD98及pEFl/hLAT1－EGFP(hLAT1－E)導入Colon26(CT26)細胞及L929細胞(American Type Culture Collection No.CCL－1)。依照手冊方法進行基因導入。使用細胞培養用培養皿(6孔培養皿，Becton Dickinson公司製造)將經基因導入的細胞於37℃、5%二氧化碳中培養24小時，然後於CT26細胞株之情形時，以加入殺稻瘟菌素(blasticidin)(5 μg/mL)及G418(500 μg/mL)之培養基，於L929細胞株之情形時，以加入殺稻瘟菌素(5 μg/mL)及G418(1 mg/mL)之培養基進一步培養3天。其次，以使用RPE螢光標記小白鼠抗人類CD98抗體(Becton Dickinson公司製造，Ca.No.556076)之FACS Vantage將hLAT1－E與CD98陽性細胞分離。以相同方法，製備hCD98表現L929細胞或者hLAT1－E表現L929細胞。
用於免疫之小白鼠，同時保持有對內源性Ig重鏈及輕鏈破壞兩者具有同基因合子的遺傳背景、且含有人類Ig重鏈基因座的14號染色體片段(SC20)及人類Ig鏈轉殖基因(KCo5)。該小白鼠，係藉由具有人類Ig重鏈基因座的系統A之小白鼠與具有人類Ig鏈基因轉殖的系統B之小白鼠的交配而製作。系統A，係對於內源性Ig重鏈及輕鏈破壞兩者為同基因合子、且保持可傳給後代的14號染色體片段(SC20)之小白鼠系統；例如於富塚等人之報告(Tomizuka.等人，Proc Natl Acad Sci USA.,2000 Vol 97：第722頁)中有記載。又，系統B，對於內源性Ig重鏈及輕鏈破壞兩者為同基因合子，係保持人類Ig鏈基因轉殖(KCo5)之小白鼠系統(轉殖小白鼠)，例如於Fishwild等人之報告(Nat Biotechnol.,1996 Vol 14：845)中有記載。
以富塚等人之報告(Tomizuka等人，Proc Natl Acad Sci USA.,2000 Vol 97：第722頁)中所記載之方法，對藉由系統A雄小白鼠與系統B雌小白鼠，或者系統A雌小白鼠與系統B雄小白鼠的交配而獲得之子小白鼠進行解析，選拔於血清中同時檢測出人類Ig重鏈及輕鏈之個體(人類抗體產生之白鼠)(Ishida & Lonberg、IBC & apos，s 11th Antibody Engineering,Abstract 2000；Ishida,I.等人，Cloning & Stem Cells 4,85－96(2002))將其用於以下免疫實驗。免疫實驗中，亦可使用改變上述小白鼠的遺傳背景之小白鼠等(石田功(2002)實驗醫學20,6846851)。
單株抗體之製作，係依照如單株抗體實驗操作入門(安東民衛等人著作，講談公司發行1991)等中所記載之通常方法而進行。
使用於實施例2中所製備的hCD98/hLAT1－E表現CT26細胞、以及確認有hCD98表現的人類大腸癌細胞株Colo205細胞，作為免疫原即hCD98/hLAT1。
被免疫動物，係使用於實施例3中所製作的產生人類免疫球蛋白之人類抗體產生小白鼠。
於使用hCD98/hLAT1－E表現CT26細胞之情形時，將5×106
個該細胞與RIBI佐劑(Corixa公司製造)混合，於腹腔內進行初次免疫。初次免疫後，於第7、24天將5×106
個細胞/小白鼠於腹腔內進行追加免疫。進而，於獲得以下所述之脾臟細胞的3天前，以同樣方式將細胞進行免疫。
於使用Colo205細胞之情形時，將5×106
個細胞於腹腔內進行初次免疫。於初次免疫後第14天，將5×106
個細胞/小白鼠於腹胺內進行追加免疫，於3天後獲得下述脾臟細胞。
以外科手術自經免疫的小白鼠中取得脾臟，將回收的脾臟細胞與小白鼠骨髓瘤SP2/0(ATCC No.CRL1581)以5：1之比例加以混合，使用聚乙二醇1500(Roche公司製造)作為融合劑進行細胞融合，而製作多數之融合瘤。融合瘤之選擇，係藉由於10%牛胎兒血清(Fetal Calf Serum,FCS)及含有次黃嘌呤(H)、胺喋呤(A)、胸苷(T)之HAT含有DMEM培養基(Gibco公司製造)中進行培養，而進行。進而，使用HT含有DMEM培養基、藉由極限稀釋法而製成單株。於96孔微量滴定盤(Becton Dickinson公司製造)中進行培養。產生目標人類單株抗體之融合瘤株之選擇(篩選)以及由各種融合瘤產生人類單株抗體之特徵化，係藉由利用後述的螢光活化細胞分選儀(FACS)進行測定而進行。
人類單株抗體產生融合瘤之篩選，係以如下方式進行。即，藉由以下所述之FACS解析，而獲得200個以上之具有人類免疫球蛋白μ鏈(hIgμ)、γ鏈(hIgγ)及人類免疫球蛋白輕鏈(hIg)且對hCD98/hLAT1－E表現CT26細胞具有特異性反應性的人類單株抗體之融合瘤。
再者，於本說明書之實施例中，於作為結果所表示之表或圖中，使用符號來命名產生人類單株抗體之融合瘤株。以下融合瘤株係表示單株：4－35－14(C2)、4－32－9(K3)、7－95－8、10－60－7、3－69－6、5－80－1(以上係將hCD98/hLAT1－E表現CT26細胞作為免疫原之株)、1－40－1(將以上將Colo205細胞作為免疫原之株)。
以FACS解析法對實施例4中所獲得之各單株抗體之亞型進行鑑定。使2×106
/ml之Colo205細胞浮游於含有1 mM EDTA、0.1% NaN3
、5%FCS之PBS的染色緩衝液(Staining Buffer)中。將細胞浮游液分注於96孔圓底培養皿(Becton Dickinson公司製造)(50 μl/孔)中。進而，添加於實施例4中培養之融合瘤之培養上清液(50 μl)，攪拌，於冰浴溫度下反應30分鐘，然後進行離心分離(2000 rpm、4℃、2分鐘)以除去上清液。將顆粒物以100 μl/孔之SB清洗1次，然後以SB將FITC螢光標記兔子抗人類Igμ F(ab')2
抗體(Dakocytomation公司製造)稀釋50倍，或者以SB將RPE螢光標記山羊抗人類Igγ F(ab')2
抗體(SuthernBiotech公司製造)稀釋200倍，或者以SB將RPE螢光標記兔子抗人類IgF(ab')2
抗體(Dakocytomation公司製造)稀釋200倍後再添加，於冰浴溫度下反應30分鐘。以SB清洗1次，然後懸浮於300 μl之SB中，以FACS(FACSCan，Becton Dickinson公司製造)測定顯示抗體鍵結之螢光強度。所獲得抗體之一部分結果示於表1。C2中重鏈為μ鏈輕鏈為鏈，K3、3－69－6、7－95－8、10－60－7、1－40－1以及5－80－1中之任一者中之重鏈為γ鏈輕鏈為鏈。
藉由以下方法實施C2、K3、7－95－8、10－60－7、3－69－6或者1－40－1之各抗體基因之選殖及表現載體之構築(1)抗體基因之cDNA選殖及表現載體之製作將融合瘤於含有10%FCS之DMEM培養基(Gibco公司製造)中進行培養，藉由離心分離收集細胞，然後添加ISOGEN(Nippongene公司製造)，依照操作說明書來萃取總RNA。抗體cDNA之可變區之選殖，係使用SMART RACE cDNA amplification Kit(CLONTECH公司製造)，且依照所附之說明書進行。
以5 μg總RNA作為模板，製作第一股cDNA。
(a)第一股cDNA之合成將包含5 μg/3 μl之總RNA、1 μl之5'CDS及1 μl之SMART oligo的組成之反應液於70℃下培養2分鐘，然後添加2 μl之5×Buffer、1 μl之DTT、1 μl之DNTP mix，繼而添加1 μl之Superscript Ⅱ，於42℃下培養15小時。進而，添加100 μl之Tricine Buffer，然後於72℃下培養7分鐘，獲得第一股cDNA。
(b)於利用PCR進行重鏈基因、輕鏈基因之擴增以及重組抗體表現載體的構築cDNA之擴增中，使用東洋紡公司之KOD－Plus。
以再蒸餾水將包含15 μl之cDNA、5 μl之10xKOD－Plus Buffer、5 μl之dNTP mix、1 μl之KOD－Plus、3 μl之25 mM的MgSO4
、引子1及引子2的組成之反應液，將最終容量調調整為50 μl，用於PCR。
關於K3、1－40－1、3－69－6、C2，若具體揭示其實驗例，係如下所述。
K3
為了擴增輕鏈，使用UMP及hk－2(5'－GTT GAA GCT CTT TGT GAC GGG CGA GC－3'(序列號1))引子，重複5次94℃ 5秒、72℃ 3分鐘之循環，繼而重複5次94℃ 5秒、70℃ 10秒、72℃ 3分鐘之循環，進而重複25次94℃ 5秒、68℃ 10秒、72℃ 3分鐘之循環。進而，以1 μl該反應液的5倍稀釋液作為模板，使用NUMP及hk5(5'－AGG CAC ACA ACA GAG GCA GTT CCA GAT TTC－3'(序列號2))引子，重複30次94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 1分鐘之循環。將該反應液加入2%瓊脂糖凝膠電泳，利用QIAquick gel extraction kit將經擴增的PCR產物(Qiagen公司製造)進行純化。將經純化的PCR產物與pCR4Blunt－TOPO載體(Invitrogen公司製造)連接，依照所附說明書進行次選殖。其次，以T3(5'－ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA－3'(序列號3))及hk5作為引子，來確定鹼基序列。基於序列資訊，合成DNPL15Bglp(5'－AGA GAG AGA GAT CTC TCA CCA TGG AAG CCC CAG CTC AGC TTC TCT－3'(序列號4))；以pCR4Blunt－TOPO載體，以經次選殖之輕鏈基因作為模板，使用DNPL15Bglp及202LR(5'－AGA GAG AGA GCG TAC GTT TAA TCT CCA GTC GTG TCC CTT GGC－3'(序列號5))引子，重複30次94℃ 15秒、55℃ 30秒、68℃ 1分鐘之循環。將該反應液加至2%瓊脂糖凝膠電泳中，藉由QIAquick gel extraction kit(Qiagen公司製造)將約400 bp之片段進行純化。以BglⅡ、BsiWI將輕鏈擴增cDNA片段進行消化，將其導入被同一酶解裂之N5KGl－Val Lark載體(IDEC Pharmaceuticals,N5KG1(US patent 6001358)之改變載體)。將所獲得載體命名為N5KG1－Val K3L。
為了擴增重鏈，使用UMP及IgG1p(5'－TCT TGT CCA CCT TGG TGT TGC TGG GCT TGT G－3'(序列號6))引子，重複5次94℃5秒、72℃3分鐘之循環，繼而重複5次94℃5秒、70℃10秒、72℃3分鐘之循環，進而重複25次94℃5秒、68℃10秒、72℃3分鐘之循環。進而，以1 μl該反應液的5倍稀釋液作為模板，使用NUMP及IgG2p(5'－TGC ACG CCG CTG GTC AGG GCG CCT GAG TTC C－3'(序列號7))，重複30次94℃15秒、60℃30秒、68℃1分鐘之循環。將該反應液加至2%瓊脂糖凝膠電泳中，利用QIAquick gel extraction kit將經擴增的PCR產物進行純化。將經純化的PCR產物與pCR4Blunt－TOPO載體連接，進行次選殖。其次，以T3及hh2(5'－GCT GGA GGG CAC GGT CAC CAC GCT G－3'(序列號8))為引子，來確定鹼基序列。基於序列資訊，合成K3HcSalI(5'－AGA GAG AGA GGT CGA CCA CCA TGG GGT CAA CCG CCA TCC TCG CCC TCC TC－3'(序列號9))，藉由pCR4Blunt－TOPO載體以經次選殖的重鏈基因為模板，使用K3HcSalI及F24HNhe(5'－AGA GAG AGA GGC TAG CTG AGG AGA CGG TGA CCA GGG TTC－3'(序列號10))，重複25次94℃ 15秒、55℃ 30秒、68℃ 1分鐘之循環。將該反應液加入2%瓊脂糖凝膠電泳，藉由QIAquick gel extraction kit將約450 bp之片段進行純化。以SalI、NheI將重鏈擴增cDNA片段加以消化，導入被相同酶解裂之N5KG1－Val K3L。確定插入部分之DNA鹼基序列，確認於進行PCR擴增而被插入的序列上與作為模板的基因序列無差異。將所獲得載體命名為N5KG1－Val K3IgG1。確認藉由將N5KG1－Val K3IgG1基因導入於下述FreeStyle293細胞而獲得之重組體K3抗體與來自K3融合瘤之抗體是否相同，係藉由調查與hCD98/hLAT1表現細胞株的結合活性而進行。
1－40－1
為了擴增重鏈，而使用UMP及IgG1p引子，重複5次94℃ 5秒、72℃ 3分鐘之循環，繼而重複5次94℃ 5秒、70℃ 10秒、72℃ 3分鐘之循環，進而重複25次94℃ 5秒、68℃ 10秒、72℃ 3分鐘之循環。進而，以1 μl該反應液之5倍稀釋液為模板，使用NUMP及IgG2p引子，重複30次94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 1分鐘之循環。將該反應液加入0.8%瓊脂糖凝膠電泳，藉由QIAquick gel extraction kit將經擴增之PCR產物進行純化。將經純化之PCR產物與pCR4Blunt－TOPO載體連接，且進行次選殖。其次，以T3與hh2為引子來確定鹼基序列。基於序列資訊，合成205HP5SalI(5'－AGA GAG AGA GGT CGA CCA CCA TGG AGT TTG GGC TGA GCT GGG TTT－3'(序列號11))，藉由pCR4Blunt－TOPO載體、以經次選殖之重鏈基因作為模板、使用205HP5SalI及F24Hnhe引子，重複25次94℃ 15秒、55℃ 30秒、68℃ 1分鐘之循環。將該反應液加入2%瓊脂糖凝膠電泳，藉由QIAquick gel extraction將約450 bp之片段kit進行純化。以SalI、NheI將重鏈擴增cDNA片段進行消化，導入被相同酶解裂之N5KG1－Val Lark載體。將所獲得載體命名為N5KG1－Val 1－40－1H。
為了擴增輕鏈，而使用UMP及hk－2引子，重複5次94℃ 5秒、72℃ 3分鐘之循環，繼而重複5次94℃ 5秒、70℃ 10秒、72℃ 3分鐘之循環，進而重複25次94℃ 5秒、68℃ 10秒、72℃ 3分鐘之循環。進而，以1 μl該反應液的5倍稀釋液為模板，使用NUMP及hk5，重複30次94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 1分鐘之循環。將該反應液加入2%瓊脂糖凝膠電泳，藉由QIAquick gel extraction kit將經擴增之PCR產物進行純化。將經純化之PCR產物與pCR4Blunt－TOPO載體連接，進行次選殖。其次以T3及hk5為引子來確定鹼基序列。基於序列資訊，合成A27RN202(5'－AGA GAG AGA GCG TAC GTT TGA TTT CCA CCT TGG TCC CTT GGC－3'(序列號12))，藉由pCR4Blunt－TOPO載體以經次選殖的輕鏈基因為模板使用DNPL15Bglp及A27RN202，重複25次94℃ 15秒、55℃ 30秒、68℃ 1分鐘之循環。將該反應液加入2%瓊脂糖凝膠電泳，藉由QIAquick gel extraction kit將約400 bp之片段進行純化。以Bgl Ⅱ、BsiWI將輕鏈擴增cDNA片段進行消化，導入被相同酶解裂之N5KG1－Val 1－40－1H載體。確定插入部分之DNA鹼基序列，以確認於進行PCR擴增而被插入之序列與作為模板之基因序列並無差異。將所獲得載體命名為N5KG1－Val 1－40－1IgG1。確認藉由將N5KG1－Val 1－40－1IgG1基因導入下述FreeStyle293細胞而獲得的重組體1－40－1抗體與來自1－40－1融合瘤的抗體是否相同，係藉由調查與hCD98/hLAT1表現細胞株的結合活性而進行。
3－69－6
為了擴增輕鏈，而使用UMP及hk－2引子，重複5次94℃ 15秒、72℃ 3分鐘之循環，繼而重複5次94℃ 15秒、70℃ 10秒、72℃ 3分鐘之循環，進而，重複25次94℃ 15秒、68℃ 15秒、72℃ 3分鐘之循環。進而，以2 μl該反應液的5倍稀釋液為模板，使用NUMP及hk5，重複30次94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 1分鐘之循環。將該反應液加入0.8%瓊脂糖凝膠電泳，藉由QIAquick gel extraction kit將經擴增之PCR產物進行純化。將經純化之PCR產物與pCR4Blunt－TOPO載體連接，進行次選殖。其次，以M13前置(－20)引子(5'－GTA AAA CGA CGG CCA G－3'(序列號13))、M13反置引子(5'－CAG GAA ACA GCT ATG AC－3'(序列號14))及hk5(5'－AGG CACACA ACA GAG GCAG TTCCAGA TTT C－3'(序列號2))為引子，來確定鹼基序列。基於序列資訊，合成A27_F(5'－AGA GAG AGA GAT CTC TCA CCA TGG AAA CCC CAG CGCAGC TTC TCT TC－3'(序列號15))及39_20_L3Bsi(5'－AGA GAG AGA GCG TAC GTT TGA TCT CCA GCT TGG TCC CCT G－3'(序列號16))，藉由pCR4Blunt－TOPO載體以經次選殖的輕鏈基因為模板使用A27_F與39_20_L3Bsi，重複25次94℃ 30秒、55℃ 30秒、68℃ 1分鐘之循環。將該反應液加入0.8%瓊脂糖凝膠電泳，藉由QIAquick gel extraction kit將約400 bp之片段進行純化。以Bgl Ⅱ、BsiWI將輕鏈擴增cDNA片段進行消化，導入被相同酶解裂之N5KG1－Val Lark載體。將所獲得載體命名為N5KG1－Val 3－69－6L。
為了擴增重鏈，而使用UMP及IgG1p(5'－TCT TGT CCA CCT TGG TGT TGC TGG GCT TGT G－3'(序列號6))引子，重複5次94℃ 15秒、72℃ 3分鐘之循環，繼而重複5次94℃ 15秒、70℃ 10秒、72℃ 3分鐘之循環，進而重複30次94℃ 15秒、68℃ 15秒、72℃ 3分鐘之循環。進而，以2 μl該反應液之5倍稀釋液為模板，使用NUMP及IgG2p(IgG1.3.4)(5'－TGC ACG CCG CTG GTCAGG GCG CCT GAG TTC C－3'(序列號7))，重複25次94℃ 30秒、55℃ 30秒、68℃ 1分鐘之循環。將該反應液加入0.8%瓊脂糖凝膠電泳，藉由QIAquick gel extraction kit將經擴增之PCR產物進行純化。將經純化之PCR產物與pCR4Blunt－TOPO載體加以連接且進行次選殖。其次以M13F、M13R及IgG2p為引子，來確定鹼基序列。基於序列資訊，合成Z3HP5Sal(5'－AGA GAG AGA GGT CGA CCCACCATG GAC TGG AGCATC CTT TT－3'(序列號17))及F24HNhe(5'－AGA GAG AGA GGC TAG CTG AGG AGA CGG TGA CCwGGG TTC－3'(序列號10))，藉由pCR4Blunt－TOPO載體以經次選殖之重鏈基因為模板使用Z3HP5SalF及F24HNhe，重複25次94℃ 30秒、55℃ 30秒、68℃ 1分鐘秒之循環。將該反應液加入0.8%瓊脂糖凝膠電泳，藉由QIAquick gel extraction kit將約450 bp之片段進行純化。以SalI、NheI將重鏈擴增cDNA片段加以消化，導入被相同酶解裂之N5KG1－Val 3－69－6L載體。確定插入部分之DNA鹼基序列，以確認於進行PCR擴增而被插入之序列上與作為模板之基因序列並無差異。將所獲得載體命名為N5KG1－Val 3－69－6IgG1。確認藉由將N5KG1－Val 3－69－6IgG1基因導入下述FreeStyle293細胞而獲得之重組體3－69－6抗體與來源於3－69－6融合瘤之抗體是否相同，係藉由調查與hCD98/hLAT1表現細胞株的結合活性而進行。
C2IgG1
因融合瘤產生C2之亞型為IgM，故藉由使用以含有根據來自相同germ line的IgG而假定的可變區之方式而設計的引子之PCR，而分離C2抗體可變區(C2 IgG1)。
為了擴增輕鏈，而使用UMP及hk－2引子，重複5次94℃ 5秒、72℃ 3分鐘之循環，繼而重複5次94℃ 5秒、70℃ 10秒、72℃ 3分鐘之循環，進而重複25次94℃ 5秒、68℃ 10秒、72℃ 3分鐘之循環。進而，以1 μl該反應液之5倍稀釋液為模板，使用NUMP及hk5，重複30次94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 1分鐘之循環。將該反應液加入0.8%瓊脂糖凝膠電泳，藉由QIAquick gel extraction kit將經擴增之PCR產物進行純化。將經純化之PCR產物與pCR4Blunt－TOPO載體連接，進行次選殖。其次，以M13F、M13R與hk5為引子，來確定鹼基序列。基於序列資訊，合成C2－1 Lc Bgl Ⅱ F(5'－AGA GAG AGA GAT CTC TCA CCA TGG AAA CCC CAG CGCAGC TTC TCT TC－3'(序列號18))及C2－1 Lc BsiWIR(5'－AGA GAG AGA GCG TAC GTT TGA TAT CCA CTT TGG TCC CAG GG－3'(序列號19))，藉由pCR4Blunt－TOPO載體、以經次選殖的輕鏈基因為模板、使用C2－1 Lc Bgl Ⅱ F及C2－1 Lc BsiWIR，重複25次94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 1分鐘之循環。將該反應液加入0.8%瓊脂糖凝膠電泳，藉由QIAquick gel extraction kit將約400 bp之片段進行純化。以Bgl Ⅱ、BsiWI將輕鏈擴增cDNA片段進行消化，導入被相同酶解裂之N5KG1－Val Lark載體。將所獲得載體命名為N5KG1－Val C2L。
為了擴增重鏈，而使用UMP及M655R(5'－GGC GAA GAC CCG GAT GGC TAT GTC－3'(序列號20))引子，重複30次94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 1分鐘之循環。進而，以1 μl該反應液的5倍稀釋液為模板，使用NUMP及M393R(5'－AAA CCC GTG GCC TGG CAG ATG AGC－3'(序列號21))，重複30次94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 1分鐘之循環。將該反應液加入0.8%瓊脂糖凝膠電泳，藉由QIAquick gel extraction kit將經擴增之PCR產物進行純化。將經純化之PCR產物與pCR4Blunt－TOPO載體連接，進行次選殖。其次，以M13前置(－20)引子(5'－GTA AAA CGA CGG CCA G－3'(序列號13))、M13反置引子(5'－CAG GAA ACA GCT ATG AC－3'(序列號14))及M393R為引子，來確定鹼基序列。基於序列資訊，合成C2hcSalIF(5'－AGA GAG AGA GGT CGA CCA CCA TGA AGCACC TGT GGT TCT TCC TCC TGC T－3'(序列號22))及C2hcNheI(5'－AGA GAG AGA GGC TAG CTG AGG AGA CGG TGA CCA GGG TTC CCT GG－3'(序列號58))，藉由pCR4Blunt－TOPO載體以經次選殖之重鏈基因為模板使用C2hcSalIF及C2hcNheI，重複25次94℃15秒、60℃30秒、68℃30秒之循環。將該反應液加入0.8%瓊脂糖凝膠電泳，藉由QIAquick gel extraction kit將約450 bp之片段進行純化。以SalI、NheI將重鏈擴增cDNA片段進行消化，導入被相同酶解裂之N5KG1－Val C2L載體。確定插入部分之DNA鹼基序列，以確認於進行PCR擴增而被插入之序列上與作為模板之基因序列並無差異。將所獲得載體命名為N5KG1－Val C2IgG1。
C2IgG1NS
於如上述經選殖之C2IgG1基因中，在重鏈的框架區域有於原來的germ line中無法識別之變異進入。因此，藉由以下方法將具有原來germ line的序列之C2之可變區序列加以分離。
以如上所獲得載體N5KG1－Val C2IgG1為模板使用C2hc NSF(5'－CGT CCA AGA ACC AGT TCT CCC TGA AGC TGA－3'(序列號23))引子及C2hc NS R(5'－TCA GCT TCA GGG AGA ACT GGT TCT TGG ACG－3'(序列號24))引子，將C2抗體重鏈之第290與第299號之G及T分別變換為A及C，而製作N5KG1－Val C2IgG1NS。確認藉由將N5KG1－Val C2IgG1及N5KG1－Val C2IgG1NS基因導入下述FreeStyle293細胞而獲得之重組體C2IgG1及C2IgG1NS抗體與來自C2融合瘤之IgM抗體的特異形是否相同，係藉由調查與hCD98/hLAT1表現細胞株的結合活性而進行。C2IgG1及C2IgG1NS之結合活性為大致相同。
C2IgμG1
若係用於上述C2IgG1之方法，則有重鏈與輕鏈的結合部位形狀與原來的IgM不同之可能，故而進行以下序列轉換。即，根據位於IgG的γ鏈及IgM的μ鏈的CH1恆定區之共用序列(GCL序列)將於可變區側方向相鄰接之26胺基酸作為μ鏈序列，根據GCL序列將全部恆定區側轉換為γ鏈(C2 IgμG1)。藉由以下方法進行以上序列轉換。
為了擴增C2 cDNA之重鏈，而使用UMP及M655R引子，重複30次94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 1分之循環。進而，以1 μl該反應液的5倍稀釋液作為模板，使用NUMP及M393R，重複30次94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 1分鐘之循環。將該反應液加入0.8%瓊脂糖凝膠電泳，藉由QIAquick gel extraction kit將經擴增之PCR產物進行純化。將經純化之PCR產物與pCR4Blunt－TOPO載體連接，進行次選殖。繼而，以M13前置(－20)引子(5'－GTA AAA CGA CGG CCA G－3'(序列號13))、M13反置引子(5'－CAG GAA ACA GCT ATG AC－3'(序列號14))及M393R作為引子，來確定鹼基序列。基於序列資訊，合成C2hcSalIF(5'－AGA GAG AGA GGT CGA CCA CCA TGA AGCACC TGT GGT TCT TCC TCC TGC T－3'(序列號22))與Mu－GCL－Gamma L(5'－CAC CGG TTC GGG GAA GTA GTC CTT GAC GAG GCA GCA AAC GGC CAC GCT GCT CGT－3'(序列號25))，藉由pCR4Blunt－TOPO載體以經次選殖之重鏈基因作為模板、使用C2hcSalIF及Mu－GCL－Gamma L，重複25次94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 1分鐘之循環。將該反應液加入0.8%瓊脂糖凝膠電泳，藉由QIAquick gel extraction kit將PCR擴增產物進行純化。將該PCR擴增產物命名為C2Vμ。其次，以N5KG1－Val Lark載體為模板使用Mu－GCL－Gamma U(5'－ACG AGC AGC GTG GCC GTT GGC TGC CTC GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG－3'(序列號26))及hIgG1 BamHIL(5'－CGC GGA TCC TCA TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA GAG GCT－3'(序列號27))，重複25次94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 90秒之循環。將該反應液加入0.8%瓊脂糖凝膠電泳，藉由QIAquick gel extraction kit將PCR擴增產物進行純化。將該PCR擴增產物命名為Cγ1。各投入5 μl之C2Vμ及Cγ1之3倍稀釋液，於無引子下重複3次94℃ 15秒、55℃ 30秒、68℃ 2分鐘之循環。將該反應液於99℃下加熱5分鐘後稀釋10倍，以5 μl反應液為模板使用C2hcSalIF及hIgG1 BamHIL，重複25次94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 2分之循環。將該反應液加入0.8%瓊脂糖凝膠電泳，藉由QIAquick gel extraction kit將PCR擴增產物進行純化。以SalI、SmaI將該PCR擴增cDNA片段進行消化，導入被相同酶解裂的上述C2輕鏈基因加入之N5KG1－Val Lark載體。確定插入部分之DNA鹼基序列，確認於進行PCR擴增而被插入的序列上與作為模板的基因序列並無差異。將所獲得載體命名為N5KG1－Val C2IgμG1。C2IgμG1抗體之結合活性之確認，係藉由調查藉由將N5KG1－Val C2IgμG1基因導入下述FreeStyle293細胞而獲得的重組體與hCD98/hLAT1表現細胞株之結合活性而進行。
K3、1－40－1、3－69－6之含重鏈可變區及輕鏈可變區之DNA序列、以及含重鏈可變區及輕鏈可變區之胺基酸序列，分別係以下序列號之序列。
<K3重鏈可變區核酸序列>(序列號28)AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGGGTCAACCGCCATCCTCGCCCTCCTCCTGGCTGTTCTCCAAGGAGTCTGTGCCGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAAGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGGTTTACCGACTACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCTTCTATCCTGGTGACTCTGATGCCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAACACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTATTGTGCGAGACGGCGAGATATAGTGGGAGGTACTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
<K3重鏈可變區胺基酸序列>(序列號29)MGSTAILALLLAVLQGVCAEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYRFTDYWIGWVRQMPGKGLEWMGIFYPGDSDARYSPSFQGQVTISADKSINTAYLQWSSLKASDTAMYYCARRRDIVGGTDYWGQGTLVTVSS
<K3輕鏈可變區核酸序列>(序列號30)AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA
<K3輕鏈可變區>(序列號31)MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLDWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWITFGQGTRLEIK
<1－40－1重鏈可變區核酸序列>(序列號32)AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTGTGGTACGGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGGCATGACCTGGGTCCGCCAAGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCTACTATTAGTTGGAATGGTGGTGGCACAGGTTATGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCGGGATATTGTATTATTACCGGCTGCTATGCGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
<1－40－1重鏈可變區胺基酸序列>(序列號33)MEFGLSWVFLVAILKGVQCEVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMTWVRQAPGKGLEWVSTISWNGGGTGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAGYCIITGCYADYWGQGTLVTVSS
<1－40－1輕鏈可變區核酸序列>(序列號34)AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
<1－40－1輕鏈可變區胺基酸序列>(序列號35)MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWWTFGQGTKVEIK
<3－69－6重鏈可變區核酸序列>(序列號36)GTCGACCCACCATGGACTGGACCTGGAGCATCCTTTTCTTGGTGGCAGCAGCAACAGGTGCCCACTCCCAGGTTCAACTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGTAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACCAGCTATGGTATCAGCTGGATGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCTTACAATGGTAATACGAACTATGTACAGAAGTTCCAGGACAGAGTCACCATGACCAGAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGGGGCAGCAATTGGTATGGGTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
<3－69－6重鏈可變區>(序列號37)RRPTMDWTWSILFLVAAATGAHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWMRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYVQKFQDRVTMTRDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDRGSNWYGWFDPWGQGTLVTVSS
<3－69－6之輕鏈可變區核酸序列>(序列號38)AGATCTCTCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGG
<3－69－6之輕鏈可變區胺基酸序列>(序列號39)RSLTMETPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSYTFGQGTKLEIK
將含C2重鏈可變區及輕鏈可變區之DNA、以及含重鏈可變區及輕鏈可變區之胺基酸序列分別表示如下。
<C2IgG1重鏈可變區核酸序列>(序列號40)GTCGACCACCATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTAGTAGTTACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTATTATAGTGGGAGTACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAGCCAGTTCTTCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACAAGGGACGGGGCTCGCCCTATTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
<C2IgG1重鏈可變區胺基酸序列>(序列號41)STTMKHLWFFLLLVAAPRWVLSQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKSQFFLKLSSVTAADTAVYYCARQGTGLALFDYWGQGTLVTVSS
<C2IgG1NS重鏈可變區核酸序列>(序列號42)GTCGACCACCATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTAGTAGTTACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTATTATAGTGGGAGTACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACAAGGGACGGGGCTCGCCCTATTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
<C2IgGlNS重鏈可變區胺基酸序列>(序列號43)STTMKHLWFFLLLVAAPRWVLSQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARQGTGLALFDYWGQGTLVTVSS
<C2IgμG1自重鏈可變區至與人類IgG1的結合部位之核酸序列>(序列號44)GTCGACCACCATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTAGTAGTTACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTATTATAGTGGGAGTACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAGCCAGTTCTTCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACAAGGGACGGGGCTCGCCCTATTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCCGCCCCAACCCTTTTCCCCCTCGTCTCCTGTGAGAATTCCCCGTCGGATACGAGCAGCGTGGCCGTT
<C2IgμG1自重鏈可變區至與人類IgG1的結合部位之胺基酸序列>(序列號45)STTMKHLWFFLLLVAAPRWVLSQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKSQFFLKLSSVTAADTAVYYCARQGTGLALFDYWGQGTLVTVSSGSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAV
<C2IgG1及C2IgμG1之輕鏈可變區核酸序列>(序列號46)AGATCTCTCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTTCTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTCGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCTATATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA
<C2IgG1及C2IgμG1之輕鏈可變區胺基酸序列>(序列號47)RSLTMETPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPIFTFGPGTKVDIK
將上述各抗體序列內K3以及C2IgG1的輕鏈可變區及重鏈可變區(即，序列號28及30以及序列號40及46之序列之核酸)導入pCR4Blunt－TOPO載體者委託於獨立行政法人產業技術綜合研究所 專利生物委託中心，分別賦予FERM BP－10552(用以識別之標誌：K3/pCR4，國內寄存編號：BCRC 940529)以及FERM BP－10551(用以識別之標誌：C2IgG1/pCR4，國內寄存編號：BCRC 940530)之委託號。
上述各抗體可變區，除重鏈以及輕鏈部分外，尚含有用於結合及分離之限制酶識別序列；於分離各抗體之輕鏈可變區之情形時，可藉由使用Bgl Ⅱ及BsiWI而進行分離，於分離重鏈可變區之情形時，可藉由使用SalI及NheI之各自限制酶而進行分離。以下表示含有插入於pCR4Blunt－TOPO載體中之各抗體可變區及限制酶識別部位等之基因序列。
<K3/pCR4>(序列號48)AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAACGTACGCTCTCTCTCTAGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGGGTCAACCGCCATCCTCGCCCTCCTCCTGGCTGTTCTCCAAGGAGTCTGTGCCGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAAGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGGTTTACCGACTACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCTTCTATCCTGGTGACTCTGATGCCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAACACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTATTGTGCGAGACGGCGAGATATAGTGGGAGGTACTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCCTCTCTCTCT
<C2IgG1/pCR4>(序列號49)AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTTCTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTCGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCTATATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACGCTCTCTCTCTAGAGAGAGAGGTCGACCACCATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTAGTAGTTACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTATTATAGTGGGAGTACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAGCCAGTTCTTCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACAAGGGACGGGGCTCGCCCTATTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCCTCTCTCTCT
將實施例6中構築之重組型抗體表現載體導入宿主細胞，而製作重組型抗體表現細胞。使用CHO細胞之dhfr缺損株(ATCC CRL－9096)作為用以表現之宿主細胞。將載體導入宿主細胞，係藉由電穿孔法而實施。以限制酶將約2 μg抗體表現載體線狀化，使用Bio－Rad electrophoreter以350 V、500 μF之條件，將基因導入4×106
個CHO細胞中，播種於96孔培養皿中。添加與表現載體的選擇標記物相對應的藥劑再繼續進行培養。確認群落後，藉由實施例4中所揭示方法來挑選抗體表現株。來自經挑選的細胞中之抗體之純化，係依照實施例8進行。又，依照所附說明書將重組型抗體表現載體導入FreeStyle293細胞(Invitrogen公司製造)，使重組型抗體表現。
含人類IgG抗體之融合瘤培養上清液之製備，係藉由以下方法進行。將抗體產生融合瘤置於含有牛胰島素(5 μg/ml，Gibco公司製)、人類運鐵蛋白(5 μg/ml，Gibco公司製)、乙醇胺(0.01 mM，Sigma公司製)、亞硒酸鈉(2.5×10－5
mM，Sigma公司製)之eRDF培養基(極東製藥公司製)中進行適應化。以組織培養燒瓶進行培養，於融合瘤的活細胞率達到90%之時點回收培養上清液。將經回收的上清液加入10 μm及0.2 μm之過濾器(Gelman Sciebce公司製)，除去融合瘤等雜排物。使用蛋白A(Amersham)、使用PBS作為吸附緩衝液、使用20 mM檸檬酸鈉緩衝液(pH值為3.0)作為溶出緩衝液，將含抗體之培養上清液進行親和層析純化。於溶出部分中添加50 mM磷酸鈉緩衝液(pH值為7.0)將pH值調整為6.0附近。使用透析膜(10,000 cut，Spectrum Laboratories公司製造)將所製備之抗體溶液置換為PBS，以孔徑0.22 μm之膜濾器MILLEX－GV(Millipore公司製造)進行過濾滅菌，獲得純化抗體。純化抗體之濃度，係測定280 nm之吸光度，將1 mg/ml作為1.45最佳密度而算出。
以與實施例5中寫明的FACS解析相同之方法，進行對實施例4中所獲得之各單株抗體之反應性之研究。以Staining Buffer(SB)將實施例2中所製備之細胞株製備成2×106
/ml，將該細胞浮游液(50 μl/孔)分注入96孔圓底培養皿(Becton Dickinson公司製造)中。以SB將自實施例4至實施例8中所製備之各重組體抗體製成5 μg/ml，添加50 μl於各孔中再進行攪拌。陰性對照，係使用以KM小白鼠製作之抗二硝苯(dinitrophenyl，DNP)人類IgG1抗體。於冰浴溫度下反應30分鐘後，進行離心分離(2000 rpm、4℃、2分鐘)以除去上清液。以100 μl/孔之SB將顆粒物清洗1次，然後以50 μl/孔添加稀釋200倍的RPE螢光標記兔子抗人類IgF(ab')抗體(Dakocytomation公司製造)，於冰浴溫度下反應30分鐘。以SB清洗1次，然後懸浮於300 μl之SB中，以FACS測定表示抗體鍵結之螢光強度。
其結果為，任一抗體均對hCD98/hLAT1－E表現CT26細胞(圖1)或者hCD98/hLAT1－E表現L929細胞(圖2)具有較強的結合活性，另一方面，並未觀察到對CT26細胞及L929細胞之結合活性。進而，任一抗體均不與hLAT1－E之L929表現細胞結合，而與hCD98表現L929細胞結合，因此判定：C2、K3、7－95－8、10－60－7、3－69－6、1－40－1抗體之結合部位位於hCD98處(圖2)。
於各單株抗體之結合中，研究重要的hCD98分子之區域。
首先，以對衣黴素(tunicamycin)處理K562細胞株之反應性進行調查。將2×105
個K562細胞播種於六孔培養皿(4 ml/孔)中，於5 μg/ml衣黴素(Sigma公司製造)存在下、不存在下，於37℃、5% CO2
下培養72小時。藉由西方墨點法，確認於此條件下約為80 Kda之hCD98之分子量，於N－link糖鏈脫落之情形時之分子量理論值約為60 kDa。於培養後，回收細胞，使2×106
/ml之細胞株浮游於Staining Buffer(SB)中。將細胞浮游液分注於96孔圓底培養皿(Becton Dickinson公司製造)(50 μl/孔)中。以SB以50 μl/孔添加製備成5 μg/mL之各重組體抗體，於冰浴溫度下反應30分鐘。陰性對照係使用抗DNP人類IgG1抗體。以SB清洗1次後，以SB將RPE螢光標記山羊抗人類IgγF(ab')2
抗體(SuthernBiotech公司製造)稀釋200倍後進行添加，於冰浴溫度下培養30分鐘。以SB清洗1次後，懸浮於300 μl之FACS緩衝液中，以FACS測定表示抗體鍵結之螢光強度。
其結果為，任何抗體中均未觀察到：與衣黴素未處理之K562相比，處置細胞之結合活性降低(圖3)。由以上結果判定各抗體之結合部位並非N－link糖鏈，強烈暗示該等單株抗體係hCD98之抗體。進而，於實施例11中，研究於各單株抗體之結合中的重要的hCD98區域。
各抗體對小白鼠CD98(mCD98)並未顯示交叉反應性，因此利用將mCD98與hCD98進行人工結合之嵌合體CD98，於各抗體之結合反應中研究重要的人類CD98蛋白之區域。
嵌合體CD98係以如下方式製作。根據mCD98及hCD98之序列資訊，合成EcoRIhCD98U(5'－CCG GAA TTC CCA CCA TGA GCC AGG ACA CCG AGG TGG ATA TGA－3'(序列號50))、NotIhCD98(5'－AAG GAA AAA AGC GGC CGC TCA TCA GGC CGC GTA GGG GAA GCG GAG CAG CAG－3'(序列號51))、EcoRImCD98(5'－CCG GAA TTC CCA CCA TGA GCC AGG ACA CCG AAG TGG ACA TGA AA－3'(序列號52))、NotImCD98L(5'－AAG GAA AAA AGC GGC CGC TCA TCA GGC CAC AAA GGG GAA CTG TAA CAG CA－3'(序列號53))、cCD98D2－F(5'－TCA TTC TGG ACC TTA CTC CCA ACT ACC－3'(序列號54))、cCD98D2－R(5'－GGT AGT TGG GAG TAA GGT CCA GAA TGA－3'(序列號55))、cCD98D3－F(5'－TGC TCT TCA CCC TGC CAG GGA CCC CTG TTT T－3'(序列號56))、cCD98D3－R(5'－AAA ACA GGG GTC CCT GGC AGG GTG AAG AGC A－3'(序列號57))。進行PCR時用作模板者，係保持將mCD98(GenBank/EMBL/DDBJ accession no.U25708)及人類CD98加以編碼的cDNA之質體載體pcDNA3.1－mCD98以及實施例1中所製作之pEF6/hCD98。
cDNA之擴增中，使用東洋紡公司之KOD－P1us。以再蒸餾水將包含15 μl之cDNA、5 μl之10×KOD－Plus Buffer、5 μl之dNTP mix、1 μl之KOD－Plus、3 μl之25 mM MgSO4
、F引子及R引子的組成之反應液之最終容量調整為50 μl，用於PCR。
使用cDNA1及F引子1及R引子1、或者cDNA2及F引子2及R引子2，重複25次94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 90秒(94℃ 15秒、55℃ 30秒、68℃ 50秒)之循環。將該反應液加入0.8%瓊脂糖凝膠電泳，藉由QIAquick gel extraction kit將PCR擴增產物進行純化。將該PCR擴增產物分別命名為P1、P2。其次各投入5 μl之P1及P2的2~3倍稀釋液，於引子下，重複3次94℃ 15秒、55℃ 30秒、68℃ 2分鐘之循環。將該反應液於99℃下加熱5分鐘後稀釋5~10倍，使用5 μl之F引子1及R引子2作為模板，重複25次94℃ 15秒、60(55℃)℃ 30秒、68℃ 2分鐘之循環。將該反應液加入0.8%瓊脂糖凝膠電泳，藉由QIAquick gel extraction kit將PCR擴增產物進行純化。
嵌合體CD98－1、嵌合體CD98－2、嵌合體CD98－3，係分別以(cDNA1：F引子1：R引子1；cDNA2與F引子2：R引子2)之以下組合(pEF6/hCD98：EcoRIhCD98U：cCD98D2－R；pcDNA3.1－mCD98：cCD98D2－F：NotImCD98L)、(pEF6/hCD98：EcoRIhCD98U：cCD98D3－R；pcDNA3.1－mCD98：cCD98D3－F：NotImCD98L)、(pcDNA3.1－mCD98：EcoRImCD98U：cCD98D2－R；pEF6/hCD98：cCD98D2－F：NotIhCD98L)而製作。以EcoRI、NotI將各PCR擴增cDNA片段進行消化，與被相同酶解裂之pEF6myc－His/Bsd載體(Invitrogen公司製造)連接。確定插入部分之DNA鹼基序列，確認於進行PCR擴增而被插入之序列與作為模板之基因序列並無差異。以與實施例2相同方法將各載體與實施例1中所製作的pEF1/hLAT1－EGFP載體一併表現於L929細胞中，以與實施例10相同方法之FACS解析來調查各FITC標記抗體之結合。其結果(圖4)說明：K3、7－95－8、10－60－7、3－69－6、抗體，與市售之FITC標記抗人類CD98抗體(CloneUM7F8，Becton Dickinson公司製，Ca.No.556076)同樣，僅結合於表現嵌合體CD98－3之L929細胞且hCD98之372胺基酸殘基至530胺基酸殘基的區域與該等抗體之結合上為重要。另一方面，判定：C2抗體與1－40－1中和抗體，僅與嵌合體CD98－2有較強結合，且hCD98之104胺基酸殘基至371胺基酸殘基與該等抗體之結合上為重要。
使用白胺酸作為基質、依照金井等人的方法(Kim等人，Biochim.Biophys.Acta 1565：第112－122頁,2002)、以如下方式進行基質之攝取實驗，以判斷各單株抗體是否對人類膀胱癌細胞株T24細胞的胺基酸攝取產生影響。將1×105
個T24細胞株播種於24孔培養培養皿中，以加入10%FCS之MEM培養基(SIGMA ALDRICH公司製造)於37℃、5% CO2
下培養2天。培養後除去培養基，以0.25 mL/孔添加含200 μg/mL的抗體之HBSS(－)(無鈉)，於37℃、5% CO2
下進一步培養10分鐘。C2、K3、7－95－8、10－60－7、3－69－6、1－40－1、抗DNP人類抗體，係使用重組體抗體；5－80－1，係使用來自融合瘤之抗體。其後，除去上清液，以0.5mL/孔添加含1 μM之14
C－Leu(MORAVEK BIOCHEMICALS公司製造)之HBSS(－)(無鈉)，再培養1分鐘。以冰浴冷卻之HBSS(－)(Na＋－free)溶液清洗3次後，以0.5 mL/穴添加0.1 N氫氧化鈉，回收細胞。經回收之溶液中之14
C－Leu量，係以液體閃爍計數器(Liquid scintillation counter)型號LSC－5100(ALOKA公司製造)進行測定。各細胞之14
C－Leu攝入量，係以BCA法測定經回收溶液中之蛋白質濃度，且以蛋白質量進行標準化。其結果(圖5)為，1－40－1、K3、C2IgG1、10－60－7、3－69－6，比對照抗體(DNP人類抗體)更有意地抑制白胺酸之攝入。以下實驗，係使用有意地抑制白胺酸攝入的1－40－1、K3、C2IgG1、10－60－7及3－69－6而實施。
各抗體之螢光標記化係依以下方法進行。依照所附說明書，使螢光物質螢光異硫氰酸鹽(Fluorescein isothiocyanate)(FITC，Sigma公司製)與實施例4至實施例8中所製備的各重組體抗體相結合。於200 mM碳酸鈉緩衝液(pH值為8.3~8.5)中於1~2 mg/ml的抗體中添加抗體分子的20~40倍量的溶解於二甲基甲醯胺中之FITC，一面攪拌一面於室溫下反應2~3小時。將混合液加入以PBS實施平衡化之凝膠過濾管柱(NAP5，Amersham Pharmacia Biotech 公司製造)中，除去未與抗體結合之FITC。於此條件下，1分子抗體與約3個FITC結合。經螢光標記之抗體，與任何確認有hCD98表現之人類大腸癌細胞株DLD－1細胞株相結合。
已知，於單核球細胞、活化T細胞、培養的正常內皮細胞中有CD98表現。因此，調查各抗體對來自人類末梢血之T細胞、B細胞、單核球細胞及人類大動脈內皮細胞(HAEC)之反應性。來自人類末梢血之細胞，係依以下方法製備。以PBS將10 ml加入有1 ml肝素(Novo公司製造)的人類末梢血稀釋2倍，再疊層於20 ml之Ficoll－Paque PLUS液(Amersham Pharmacia Biotech公司製)上，以1500 rpm進行30分鐘離心後進行回收。以PBS清洗2次，製備單核球細胞。一部分單核球細胞，於加入10 μg/ml之Phytohaemagglutinin(Sigma公司製，PH A)、10%FCS、0.1 mM非必需胺基酸溶液(Gibco公司製)、5.5×10－6
M之2－巰基乙醇(Gibco公司製)、Penicillin/Streptomycin/Glutamine(Gibco公司製)之RPMI培養基(Gibco公司製造)中，於5% CO2
、37℃下培養72小時。使用藉由PHA刺激使來自人類末梢血的T細胞、B細胞中觀察到作為活化標記物之CD25表現(使用FITC標記抗人類CD25抗體(Becton Dickinson公司製Ca.555431)之FACS解析)。將製備之各細胞以2×106
/ml浮游於Staining Buffer(SB)中，將細胞浮游液分注於96－孔圓底培養皿(Becton Dickinson公司製造)(50 μl/孔)中。以5 μg/ml之濃度，使實施例13中所製作之各FITC標記抗體與抗人類CD3抗體(Becton Dickinson公司製造Ca.No.555340)或者抗人類CD14抗體(Becton Dickinson公司製造Ca.No.347497)或者抗人類CD19抗體(Immunotech公司製造Ca.No.IM1285)共同於冰浴溫度下反應30分鐘。使用市售之FITC標記抗人類CD98抗體(CloneUM7F8)作為陽性對照，使用FITC標記抗DNP人類IgG1抗體作為陰性對照。以SB清洗1次後，懸浮於300 μl之FACS緩衝液中，以FAGS調查各抗體之反應性。
其結果為，C2IgG1以外之抗體，顯示與UM7F8同樣的結合模式，有意地與單核球細胞、活化T細胞、活化B細胞(圖6及圖7)結合。另一方面，未觀察到C2IgG1對任一細胞有意之結合(圖6及圖7)。
HAEC(Cambrex公司製)，係使用依照所附說明書進行培養且繼代數為4次以內之細胞。以與上述相同方法，調查C2IgG1、K3、7－95－8、10－60－7、3－69－6及1－40－1抗體對所培養之HAEC之反應性。以3.2 ng/ml~50 μg/ml之濃度進行各抗體反應之結果為：K3、7－95－8、10－60－7、3－69－6、1－40－1與HAEC結合，但C2IgG1並未與HAEC結合(圖8)。
另一方面，若於相同條件下進行針對人類大腸癌細胞株DLD－1之反應，則於亦存在任何抗體之條件下(本實施例中，3 μg/ml以下之抗體濃度)，可判定抗體之DLD－1癌細胞特異性高於UM7F8(圖8)。尤其強烈暗示C2IgG1係癌特異形較高之抗體。使用C2IgG1、K3、3－69－6，實施以下實驗。
以與實施例9相同方法之FACS解析，進行各抗體對C2IgG1、K3、及3－69－6之大腸癌細胞株(DLD－1)、肺癌細胞株(H226)、前列腺癌細胞株(DU145)、黑色素瘤細胞株(G361、SKMEL28、CRL1579)、非霍奇金淋巴瘤株(Ramos)、膀胱癌細胞株(T24)、乳癌細胞株(MCF、MDA－MB－231)、胰臟癌細胞株(HS766T)、多發性骨髓瘤細胞株(IM9)、紅血球胚細胞系白血病株(K562、參照圖3)的反應性之研究。以染色緩衝液(Staining Buffer，SB)將細胞株製備成2×106
/ml，將該細胞浮游液分注於96孔圓底培養皿(Becton Dickinson公司製造)中(50 μl/孔)。以50 μl/孔添加製備成5 μg/ml之抗體或者FITC標記抗體，於冰浴溫度下反應30分鐘。陰性對照，係使用抗DNP人類IgG1抗體或者FITC標記抗DNP人類IgG1抗體。以SB清洗1次後，添加50 μl以SB將RPE螢光標記山羊抗人類Igγ F(ab')2
抗體(SuthernBiotech公司製造)稀釋200倍者，於冰浴溫度下培養30分鐘。於FITC標記抗體之情形時，不實施該操作。以SB清洗1次後，懸浮於300 μl之FACS緩衝液中，以FACS測定各細胞之平均螢光強度。
其結果為，可知任一抗體均係對各種癌細胞株具有結合活性之抗體(圖9、圖10)。又，任一抗體均與Colo205、SW480、SW620、LOVO、LS180及HT29之人類大腸癌細胞株有較強結合。
依據以下記載之方法，使用小白鼠癌模型，研究實施例4至實施例8中所製備的重組體單株抗體K3、C2IgG1及3－69－6之抗腫瘤效果。
以各個體的體重為基礎，以5隻為1群，將5週齡Balb/c裸小白鼠(自日本CLEA(股)公司購入)進行分群。將於100 μl之PBS中混合入5×106
個大腸癌細胞Colo205及5 μg抗體的溶液移植於腹部皮下。於移植後第2天、第4天、第6天將溶解於100 μg/100 μl溶劑(投入1%小白鼠血清之PBS)的抗體投與小白鼠腹腔內，測定腫瘤大小。使用溶劑作為抗體之陰性對照。
以上實驗之結果係如圖11所示。圖中之各折線表示個別小白鼠之資料。對照群中，於第5天於全部個體中觀察到癌細胞株之生長附著，第12天之腫瘤平均體積(藉由長徑×短徑×短徑×0.5算出)±SE為165.55±31.71 mm3
。另一方面，於C2IgG1群中，僅有1個體顯示與對照群同樣之腫瘤增殖(於第12天腫瘤塊為169.44 mm3
)，但另一個體藉由C2IgG1抗體投與而觀察到更強的抗腫瘤活性，第28天之對照群之腫瘤塊之平均體積±SE為1977.64±442.04，C2IgG1抗體投與群為775.31±622.47，C2IgG1抗體有意地抑制來自Colo205癌細胞之腫瘤之增殖(p<0.01)。於K3群與3－69－6群，於全部個體中即使經過30天以上亦未觀察到癌之生長附著。又，各群之平均體重，僅於對照群中有降低(於移植第30天，比K3群約降低20%)。
由該等結果觀察到：K3、C2IgG1及3－69－6係具有癌細胞增殖抑制活性之抗體。
依照以下記載之方法，使用小白鼠同系癌模型，研究實施例4至實施例8中所製備的重組體單株抗體C2IgG1之抗腫瘤效果。
根據腫瘤體積，將移植入5×106
個於實施例2中所製備的hCD98/hLAT1－E表現CT26細胞之Balb/c(雌)以每5隻1群分為2群。於腫瘤體積成長為約90 mm3
(以長徑×短徑×短徑×0.5算出)之時點(第0天)、及第3天、第5天，將100 μg/100 μl之溶劑(加入1%小白鼠血清之PBS)的C2IgG1投與小白鼠腹腔內。於對照群中投與溶劑。其結果為，觀察到C2IgG1具有有意地強力抑制生長附著腫瘤之增殖之活性(圖12)。
以FACS解析調查C2IgG1、及K3對猴細胞(COS－7細胞)之交叉反應性。將2×106
/ml細胞浮游於Staining Buffer(SB)中。將細胞浮游液分注於96孔圓底培養皿(Becton Dickinson公司製造)中(50 μl/孔)。添加50 μl以SB製備成5 μg/mL之抗體，於冰浴溫度下反應30分鐘。陰性對照係使用DNP人類IgG1抗體。以SB清洗1次後，以50 μl/孔添加以SB稀釋200倍之RPE螢光標記山羊抗人類IgγF(ab')2
抗體(SuthernBiotech公司製造)，於冰浴溫度下反應30分鐘。以SB清洗1次後，懸浮於300 μl之FACS緩衝液中，以FAGS測定表示抗體鍵結之螢光強度。其結果為，可知任一抗體均與COS－7細胞株結合，C2IgG1、K3係對猴細胞具有交叉反應性之抗體(圖13)。
依照以下記載之方法，使用小白鼠荷癌模型，研究C2IgG1之抗腫瘤活性。
以3×106
/小白鼠個體，將伯奇氏淋巴瘤細胞株Ramos(自ATCC購入)移植入6週齡Balb/c－SCID小白鼠(購自日本CLEA(股)公司)之背部皮下。於移植13天後，測定生長附著之腫瘤的大小，將腫瘤大小為30~140 mm3
之荷癌小白鼠以6隻1群進行分群。以100 mg/小白鼠個體(溶解於200 ml之PBS者)分別以3次/週將C2IgG1投與入荷癌小白鼠腹腔內。使用Rituximab(全藥工業股份有限公司)作為陽性對照，使用PBS作為陰性對照。以1週3次測定腫瘤體積以及體重。測定腫瘤塊之長徑、短徑、高度，將(長徑)×(短徑)×(高度)÷2之值作為腫瘤體積。
結果示於圖14。藉由投與C2IgG1，而自腫瘤移植後第16天確認有意之腫瘤增殖抑制效果。
C2IgG1以及C2IgG1NS於製備重組抗體時凝集體含量均較高。因此，以序列號47所表示的C2IgG1NS之輕鏈可變區序列中，將相當於起始轉譯密碼子ATG的第5號M(甲硫胺酸)作為1位胺基酸，製作將自此處數起至第117號的I(異白胺酸)置換成其他胺基酸之改變體。
C2IgG1NS/I117N載體之製備
以製備將輕鏈117位異白胺酸置換為天冬醯胺酸之C2IgG1NS/I117N為目的，以實施例6中所製備的N5KG1－Val C2IgG1NS載體作為模板，藉由使用GeneEditorTM
in vitro Site－Directed Mutagenesis System(Promega公司No.Q9280)之部位特異性變異導入法，製備編碼胺基酸置換體之各種變異DNA。
使用C2NS Lc 117I/HYND－p：(5'－TCAGTATGGT AGCTCACCTN ATTTCACTTT CGGCCCTGGG ACC－3'(N＝A．T．G．C)(序列號69))作為變異導入用寡核苷酸(5'末端已磷酸化)。使目標變異導入用寡核苷酸及上述套組附屬的選擇性寡核苷酸與模板DNA黏接而合成變異導入鏈，然後於GeneEditorTM
Antibiotic Selection Mix存在下，利用僅有變異體增殖來選擇變異體。更具體而言，將dsDNA模板於鹼性條件下(0.2 M NaOH、0.2 mM EDTA(最終濃度))於室溫下培養5分鐘，然後添加十分之一容量的2 M乙酸銨(pH值為4.6)進行中和，然後藉由乙醇沈澱進行回收。於經鹼性改性處理之模板DNA中，添加變異導入用寡核苷酸及新的抗生素抗性獲得用選擇性寡核苷酸(Bottom Select Oligo，5'末端磷酸化5'－CCGCGAGACC CACCCTTGGA GGCTCCAGAT TTATC－3'(序列號85))及套組附屬之黏接緩衝液，然後藉由於75℃下保溫5分鐘再緩慢下降至37℃，而進行黏接。其次，為進行變異鏈之合成及連接，添加套組附屬之Synthesis 10×buffer、T4 DNA Polymerase、T4 DNA ligase，於37℃下進行90分鐘反應。於GeneEditorTM
Antibiotic Selection Mix存在下，由轉形為勝任細胞BMH 71－18 muts再進行培養之轉形體大腸菌來製備質體DNA，進而藉由電穿孔法將ElectroMAX.DH10B Cells(Invitrogen 公司No.18290－015)進行轉形，然後播種於含GeneEditorTM
Antibiotic Selection Mix之LB培養皿中。對培養皿中產生的轉形體進行培養，將質體DNA進行純化，解析DNA鹼基序列。解析DNA鹼基序列之結果為：獲得導入目標胺基酸變異的C2IgG1NS變異體之表現載體。將所獲得之表現1胺基酸置換變異體蛋白之質體DNA命名為N5KG1－Val C2IgG1NS/I117N載體。
C2IgG1NS/I117C載體之製備
以製備將輕鏈117位異白胺酸置換為半胱胺酸之C2IgG1NS/I117C為目的，以實施例6中所製備的N5KG1－Val C2IgG1NS載體為模板，藉由使用GeneEditorTM
in vitro Site－Directed Mutagenesis System(promega公司No.Q9280)之部位特異性變異導入法，製備編碼胺基酸置換體之各種變異DNA。
使用C2NS Lc 117I/GRC－p(5'－TCAGTATGGT AGCTCACCTB GTTTCACTTT CGGCCCTGGG ACC－3'(B＝C．G．T)(序列號70))，作為變異導入用寡核苷酸(5'末端已磷酸化)。使目標變異導入用寡核苷酸及上述套組附屬的選擇性寡核苷酸與模板DNA黏接而合成變異導入鏈，然後於GeneEditorTM
Antibiotic Selection Mix存在下，利用僅有變異體產生增殖來選擇變異體。更具體而言，將dsDNA模板於鹼性條件下(0.2 M NaOH、0.2 mM EDTA(最終濃度))於室溫下培養5分鐘，然後添加十分之一容量的2M乙酸銨(pH值為4.6)進行中和，然後藉由乙醇沈澱進行回收。於經鹼性變性處理之模板DNA中，添加變異導入用寡核苷酸、新的抗生素抗性獲得用選擇性寡核苷酸(Bottom Select Oligo，5'末端磷酸化5'－CCGCGAGACC CACCCTTGGA GGCTCCAGAT TTATC－3'(序列號85))、及套組附屬之黏接緩衝液，然後藉由於75℃下保溫5分鐘再緩慢降至37℃，而進行黏接。其次，為進行變異鏈之合成及連接，而添加套組附屬之Synthesis 10×buffer、T4 DNA Polymerase、及T4 DNA ligase，於37℃下進行90分鐘反應。於 GeneEditorTM
Antibiotic Selection Mix存在下，由轉形為勝任細胞BMH 71－18 mutS而培養之轉形體大腸菌來製備質體DNA，進而藉由電穿孔法將ElectroMAX.DH10B Cells(Invitrogen公司No.18290－015)進行轉形，然後將該DNA播種於含GeneEditorTM
Antibiotic Selection Mix之LB培養皿中。對培養皿中所產生的轉形體進行培養，將質體DNA進行純化，解析DNA鹼基序列。解析DNA鹼基序列之結果為：獲得導入目標胺基酸變異的C2IgG1NS變異體之表現載體。將所獲得之表現1胺基酸置換變異體蛋白之質體DNA命名為N5KG1－Val C2IgG1NS/I117C載體。
C2IgG1NS/117IL載體之製備
以實施例6中所製備之N5KG1－Val C2IgG1NS載體作為模板，藉由以下方法製備將輕鏈117位異白胺酸置換為白胺酸之C2IgG1NS/I117L。
DNA之擴增中，使用東洋紡公司之KOD－Plus。以再蒸餾水將包含1 μl之cDNA、5 μl之10×KOD－Plus Buffer、5 μl之dNTP mix、1 μl之KOD－Plus、2 μl之25 mM MgSO4
、F引子及R引子之組成之反應液之最終容量調整為50 μl，用於PCR。
合成C2NS Lc 117IL R(5'－GGTCCCAGGG CCGAAAGTGA ATAGAGGTGA GCTACCATAC TGCTG－3'序列號71))，使用C2NS Lc 117IL R及C2－1 Lc Bgl Ⅱ F(5'－AGA GAG AGA GAT CTC TCA CCA TGG AAA CCC CAG CGCAGC TTC TCT TC－3'(序列號18))，以N5KG1－Val C2IgG1NS載體作為模板，重複25次94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 1分鐘之循環。將該反應液加入0.8%瓊脂糖凝膠電泳，藉由QIAquick gel extraction kit將PCR擴增產物進行純化。將該PCR擴增產物命名為C2NSI117L－F。其次，使用C2NS Lc 117IL F(5'－GCAGTATGGT AGCTCACCTC TATTCACTTT CGGCCCTGGG ACC－3'(序列號72))及C2NS EcoRIR(5'－CCGGAATTCA ACACTCTCCC CTGTTGAAGC TCTTTGTGAC GG－3'(序列號73))，以N5KG1－Val C2IgG1NS載體作為模板，重複25次94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 1分鐘之循環。將該反應液加入0.8%瓊脂糖凝膠電泳，藉由QIAquick gel extraction kit將PCR擴增產物進行純化。將該PCR擴增產物命名為C2NSI117L－R。其次，各投入5 μl之C2NSI117L－F及C2NSI117L－R之2倍稀釋液，於無引子下重複3次94℃ 15秒、55℃ 30秒、68℃ 60秒之循環。將該反應液於99℃下加熱5分鐘後稀釋5倍，以5 μl溶液作為模板使用C2－1 Lc Bgl Ⅱ F引子及C2NS EcoRIR引子，重複25次94℃ 15秒、55℃ 30秒、68℃ 60秒之循環。將該反應液加入0.8%瓊脂糖凝膠電泳，藉由QIAquick gel extraction kit將PCR擴增產物進行純化。以Bgl Ⅱ、EcoRI將該PCR擴增cDNA片段進行消化，將其導入被相同酶解裂的插入上述C2重鏈基因之N5KG1－Val Lark載體中。確定插入部分之DNA鹼基序列，以確認於進行PCR擴增而被插入的序列上與作為模板之基因序列並無差異。將所獲得之表現1胺基酸置換變異體蛋白之質體DNA命名為N5KG1－Val C2IgG1NS/I117L載體。
C2IgG1NS/117IM載體之製備
以實施例6中所製備之N5KG1－Val C2IgG1NS載體作為模板，藉由以下方法，製備將輕鏈117位異白胺酸置換為甲硫胺酸之C2IgG1NS/I117M。
DNA之擴增中，使用東洋紡公司之KOD－Plus。以再蒸餾水將包含1 μl之cDNA、5 μl之10×KOD－Plus Buffer、5 μl之dNTP mix、1 μl之KOD－Plus、2 μl之25 mM MgSO4
、F引子及R引子之組成之反應液之最終容量調整為50 μl，用於PCR。
合成C2NS Lc 117IM R(5'－GGTCCCAGGG CCGAAAGTGA ACATAGGTGA GCTACCATAC TGCTG－3'序列號74))，使用C2NS Lc 117IM R與C2－1 Lc Bgl Ⅱ F(5'－AGA GAG AGA GAT CTC TCA CCA TGG AAA CCC CAG CGCAGC TTC TCT TC－3'(序列號18))，以N5KG1－Val C2IgG1NS載體作為模板重複25次94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 1分鐘之循環。將該反應液加入0.8%瓊脂糖凝膠電泳中，藉由QIAquick gel extraction kit將PCR擴增產物進行純化。將該PCR擴增產物命名為C2NSI117M－F。其次，使用C2NS Lc 117IM F(5'－GCAGTATGGT AGCTCACCTA TGTTCACTTT CGGCCCTGGG ACC－3'(序列號75))及C2NS EcoRIR(5'－CCGGAATTCA ACACTCTCCC CTGTTGAAGC TCTTTGTGAC GG－3'(序列號76))，以N5KG1－Val C2IgG1NS載體作為模板重複25次94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 1分鐘之循環。將該反應液加入0.8%瓊脂糖凝膠電泳，藉由QIAquick gel extraction kit將PCR擴增產物進行純化。將該PCR擴增產物命名為C2NSI117M－R。其次，各加入5 μl之C2NSI117M－F及C2NSI117M－R之2倍稀釋液，於無引子下重複3次94℃ 15秒、55℃ 30秒、68℃ 60秒之循環。將該反應液於99℃下加熱5分鐘後稀釋5倍，以5 μl作為模板使用C2－1 Lc Bgl Ⅱ F引子及C2NS EcoRIR引子，重複25次94℃ 15秒、55℃ 30秒、68℃ 60秒之循環。將該反應液加入0.8%瓊脂糖凝膠電泳中，藉由QIAquick gel extraction kit將PCR擴增產物進行純化。以Bgl Ⅱ、EcoRI將該PCR擴增cDNA片段進行消化，導入被相同酶解裂的插入上述C2重鏈基因之N5KG1－Val Lark載體中。確定插入部分之DNA鹼基序列，以確認於進行PCR擴增而被插入的序列上與作為模板的基因序列並無差異。將所獲得之表現1胺基酸置換變異體蛋白之質體DNA命名為N5KG1－Val C2IgG1NS/I117M載體。
C2IgG1NS胺基酸改變體之製作
藉由實施例7中所揭示之方法，依照所附說明書，於FreeStyle293細胞(Invitrogen公司製造)中導入C2IgG1NS/I117L載體、C2IgG1NS/I117M載體、C2IgG1NS/I117N、C2IgG1NS/I117C載體，使重組型抗體表現。抗體之純化，係將實施例8中所揭示之方法加以部分改良而進行。將第6天之培養上清液回收，藉由以無菌過濾器(Steriflip－GP，MILLIPORE，SCGP00525)進行過濾，而除去細胞等殘渣。使用蛋白A(Amersham)，使用PBS作為吸附緩衝液，使用20 mM檸檬酸鈉緩衝液(pH值為3.4)作為溶出緩衝液，將含抗體之培養上清液進行親和層析純化。於溶出餾分中添加200 mM磷酸鈉緩衝液(pH值為7.0)將pH值調整為5.5附近。使用超濾濃縮離心管(vivaspin)6(10 KMW cut VIVASCIENCE、VS0601)將所製備之抗體溶液進行濃縮(3000 rpm)，進而添加PBS，進行離心，藉此獲得被置換為PBS之純化抗體。純化抗體之濃度，係測定280 nm處之吸光度，將1 mg/ml作為1.45最佳密度而算出。
C2IgG1NS胺基酸改變體之凝集體含有率之測定
使用10 ug(0.1 mg/ml)所獲得之胺基酸改變抗體，測定各純化抗體之凝集體含有率。
抗體溶液之凝集體含有率，係使用高效液相層析(high performance liquid chromatography)裝置(島津公司製造)及TSK－G3000SW管柱(Tosoh公司製造)、使用20 mM磷酸鈉、500 mM NaCl pH值7.0作為溶劑進行分析。藉由將溶出位置與凝膠過濾HPLC用分子量標記物(Oriental酵母公司)(Cat No.40403701)進行比較，而鑑定抗體蛋白的單體及單體以上的凝集體之峰值，由各自的峰值面積算出凝集體之含有率。
結果示於圖15。根據圖15可明瞭，藉由改變上述胺基酸而使凝集體含有率減少。
C2IgG1NS胺基酸改變體之凝集體含量之測定
依照實施例14及15之方法，藉由FACS對C2IgG1NS胺基酸改變體對於腫瘤細胞株、人類CD98/人類LAT1強制表現株、以及HAEC之反應性進行解析。
結果示於圖16A及圖16B。上述胺基酸改變抗體尤其是C2IgG1NS/I117L與使人類CD98及LAT1強制表現之L929細胞相結合，並不與未處理之L929相結合(圖16A)。又，該等胺基酸改變抗體，並不與HAEC結合，對Colo205、Ramos以及DLD－1之各種癌細胞顯示結合性(圖16B)。
該等結果與圖2A及圖8中所示之C2IgG1之結合特性相同，因此上述胺基酸改變抗體尤其是C2IgG1NS/I117L可稱為凝集體含有率較低、對癌細胞具有與C2IgG1相同的結合特異形、且可期待具有與C2IgG1相同的抗腫瘤活性之抗體。
<C2IgG1NS胺基酸改變體之重鏈可變區胺基酸序列(與C2IgG1重鏈可變區胺基酸序列相同)>(序列號43)STTMKHLWFFLLLVAAPRWVLSQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKSQFFLKLSSVTAADTAVYYCARQGTGLALFDYWGQGTLVTVSS
<C2IgG1NS胺基酸改變體之重鏈可變區核酸序列(與C2IgG1NS重鏈可變區核酸序列相同)>(序列號42)GTCGACCACCATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTAGTAGTTACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTATTATAGTGGGAGTACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACAAGGGACGGGGCTCGCCCTATTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
<C2IgG1NS/117IL之輕鏈可變區胺基酸序列>(序列號77)RSLTMETPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLFTFGPGTKVDIK
<C2IgG1NS/117IL之輕鏈可變區核酸序列>(序列號78)AGATCTCTCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTTCTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTCGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCTCTATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA
<C2IgG1NS/117IM之輕鏈可變區胺基酸序列>(序列號79)RSLTMETPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPMFTFGPGTKVDIK
<C2IgG1NS/117IM之輕鏈可變區核酸序列>(序列號80)AGATCTCTCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTTCTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTCGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCTATGTTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA
<C2IgG1NS/117IN之輕鏈可變區胺基酸序列>(序列號81)RSLTMETPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPNFTFGPGTKVDIK
<C2IgG1NS/117IN之輕鏈可變區核酸序列>(序列號82)AGATCTCTCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTTCTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTCGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCTAATTTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA
<C2IgG1NS/117IC之輕鏈可變區胺基酸序列>(序列號83)RSLTMETPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPCFTFGPGTKVDIK
<C2IgG1NS/117IC之輕鏈可變區核酸序列>(序列號84)AGATCTCTCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTTCTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTCGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCTTGTTTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA
圖1係表示人類抗CD98單株抗體對人類CD98/人類LAT1表現CT26細胞株之結合性之圖。
圖2A係表示人類抗CD98單株抗體對人類CD98表現L929細胞株之結合性之圖。
圖2B係表示人類抗CD98單株抗體對人類CD98表現L929細胞株之結合性之圖。
圖3係表示人類抗CD98單株抗體對衣黴素處理K562人類細胞株之結合性之圖。
圖4A係表示人類抗CD98單株抗體對各種小白鼠、人類嵌合體CD98表現L929細胞株之結合性之圖。
圖4B係表示人類抗CD98單株抗體對各種小白鼠、人類嵌合體CD98表現L929細胞株之結合性之圖。
圖5係表示人類抗CD98單株抗體對T24人類膀胱癌細胞株之胺基酸攝入之抑制活性之圖。
圖6A係表示人類抗CD98單株抗體對人類末梢血T細胞、B細胞、單核球細胞之結合性之圖。
圖6B係表示人類抗CD98單株抗體對人類末梢血T細胞、B細胞、單核球細胞之結合性之圖。
圖7係表示人類抗CD98單株抗體對PHA活化人類末梢血T細胞、B細胞之結合性之圖。
圖8係表示人類抗CD98單株抗體對人類大動脈內皮細胞(HAEC)及人類大腸癌細胞株(DLD－1)之結合性之圖。
圖9A係表示人類抗CD98單株抗體對各種癌細胞株之結合性之圖。
圖9B係表示人類抗CD98單株抗體對各種癌細胞株之結合性之圖。
圖10A係表示人類抗CD98單株抗體對各種癌細胞株之結合性之圖。
圖10B係表示人類抗CD98單株抗體對各種癌細胞株之結合性之圖。
圖11係表示將人類抗CD98單株抗體K3、3－69－6、C2IgG1投與移植腫瘤細胞的裸小白鼠時每個小白鼠之腫瘤塊大小之圖。
圖12係表示給具有長成90 mm3
的腫瘤之荷癌小白鼠，以100 μg/小白鼠個體以隔日3次投與人類抗CD98單株抗體C2IgGl時腫瘤大小之結果之圖。
圖13係表示人類抗CD98單株抗體K3、C2IgGl對猴細胞株COS－7之交叉反應性之圖。
圖14係表示於移植伯奇氏淋巴瘤細胞株Ramos之荷癌小白鼠中，於腫瘤成長為30~140 mm3
後以100 mg/小白鼠個體分別以3次/週投與人類抗CD98單株抗體C2IgGl及Rituximab時腫瘤大小之結果之圖。
圖15係表示以HPLC測定之人類抗CD98單株抗體C2IgGlNS胺基酸改變抗體純化後之凝集體含有率之圖。
圖16A係表示人類抗CD98單株抗體K3及C2IgGl、以及C2IgGl之各胺基酸改變抗體對人類CD98或人類LATl強制表現L929細胞之結合性之圖。
圖16B係表示人類抗CD98單株抗體K3及C2IgGl、C2IgGl之各胺基酸改變抗體對人類大腸癌細胞株(DLD－1)、伯奇氏淋巴瘤細胞株(Ramos)、人類大腸癌細胞株(Colo205)以及人類大動脈內皮細胞(HAEC)之結合性之圖。
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引子<400> 15<210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 16<210> 17 <211> 41 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 17<210> 18 <211> 47 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 18<210> 19 <211> 41 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 19<210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 20<210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 21<210> 22 <211> 49 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 22<210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 23<210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 24<210> 25 <211> 54 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 25<210> 26 <211> 54 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 26<210> 27 <211> 39 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 27<210> 28 <211> 434 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 抗體K3之重鏈可變區<400> 28 <210> 29 <211> 138 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 抗體K3之重鏈可變區<400> 29 <210> 30 <211> 398 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 抗體K3之輕鏈可變區<400> 30<210> 31 <211> 126 <212> PRT <213> 人造<220><223> 抗體K3之輕鏈可變區<400> 31 <210> 32 <211> 437 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 抗體1－40－1之重鏈可變區<400> 32 <210> 33 <211> 139 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 抗體1－40－1之重鏈可變區<400> 33<210> 34 <211> 398 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 抗體1－40－1之輕鏈可變區<400> 34<210> 35 <211> 126 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 抗體1－40－1之輕鏈可變區<400> 35 <210> 36 <211> 431 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 抗體3－69－6之重鏈可變區<400> 36<210> 37 <211> 144 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 抗體3－69－6之重鏈可變區<400> 37<210> 38 <211> 393 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 抗體3－69－6之輕鏈可變區<400> 38 <210> 39 <211> 131 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 抗體3－69－6之輕鏈可變區<400> 39 <210> 40 <211> 427 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 抗體C2IgG1之重鏈可變區<400> 40<210> 41 <211> 142 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 抗體C2IgG1之重鏈可變區<400> 41 <210> 42 <211> 427 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 抗體C2IgG1NS之重鏈可變區<400> 42 <210> 43 <211> 142 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 抗體C2IgG1NS之重鏈可變區<400> 43<210> 44 <211> 505 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 抗體C2IgμG1自重鏈可變區至IgG1之結合部位之部分序列<400> 44<210> 45 <211> 168 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 抗體C2IgμG1自重鏈可變區至IgG1之結合部位之部分序列<400> 45 <210> 46 <211> 399 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 抗體C2IgG1或C2IgμG1之輕鏈可變區<400> 46 <210> 47 <211> 133 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 抗體C2IgG1或C2IgμG1之輕鏈可變區<400> 47 <210> 48 <211> 864 <212> DNA <213> 人造<220> <223> K3/pCR4中包含可變區與限制部位之插入物之序列<400> 48<210> 49 <211> 876 <212> DNA <213> 人造<220> <223> C2IgG1/pCR4中包含可變區及限制部位插入物之序列<400> 49<210> 50 <211> 42 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 50<210> 51 <211> 51 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 51<210> 52 <211> 44 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 52<210> 53 <211> 50 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 53<210> 54 <211> 27 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 54<210> 55 <211> 27 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 55<210> 56 <211> 31 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 56<210> 57 <211> 31 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 57<210> 58 <211> 44 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 58<210> 59 <211> 42 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<4o0> 59<210> 60 <211> 51 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 60<210> 61 <211> 45 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 61<210> 62 <211> 45 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<40o> 62<210> 63 <211> 39 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 63<210> 64 <211> 39 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 64<210> 65 <211> 1879 <212> DNA <213> 智人<220> <221> CDS <222> (112)..(1698) <400> 65 <210> 66 <211> 529 <212> PRT <213> 智人<400> 66 <210> 67 <211> 4539 <212> DNA <213> 智人<220> <221> CDS <222> (66)..(1586) <400> 67 <210> 68 <211> 507 <212> PRT <213> 智人<400> 68 <210> 69 <211> 43 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 寡核苷酸<220> <221> 其他重要生物功能區<222> (20)..(20) <223> n is a,t,c or g. <400> 69<210> 70 <211> 43 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 寡核苷酸<400> 70<210> 71 <211> 45 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 71<210> 72 <211> 43 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 72<210> 73 <211> 42 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 73<210> 74 <211> 45 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 74<210> 75 <211> 43 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 75<210> 76 <211> 42 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 引子<400> 76<210> 77 <211> 133 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 抗體C2IgG1Ns/117IL之輕鏈可變區<400> 77<210> 78 <211> 399 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 抗體C2IgG1Ns/117IL之輕鏈可變區<400> 78<210> 79 <211> 133 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 抗體C2IgG1NS/117IM之輕鏈可變區<400> 79 <210> 80 <211> 399 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 抗體C2IgG1NS/117IM之輕鏈可變區<400> 80<210> 81 <211> 133 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 抗體C2IgG1NS/117IN之輕鏈可變區<400> 81 <210> 82 <211> 399 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 抗體C2IgG1NS/117IN之輕鏈可變區<400> 82 <210> 83 <211> 133 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 抗體C2IgG1NS/117IC之輕鏈可變區<400> 83 <210> 84 <211> 399 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 抗體C2IgG1NS/117IC之輕鏈可變區<400> 84<210> 85 <211> 35 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 寡核苷酸<400> 85
(無元件符號說明)
Claims (28)
- 一種人類單株抗體或其功能性片段，其對CD98具有特異性結合能力，該CD98係來自癌細胞的細胞膜且與具有胺基酸輸送活性的蛋白質形成複合物，該人類單株抗體或其功能性片段具有下述(b)至(g)中任意之二序列作為重鏈可變區及輕鏈可變區：(b)序列號41及47、(c)序列號43及47、(d)序列號43及77、(e)序列號43及79、(f)序列號43及81、(g)序列號43及83。
- 如請求項1之人類單株抗體或者其功能性片段，其具有抗腫瘤活性。
- 如請求項1之人類單株抗體或者其功能性片段，其抑制向上述CD98表現之細胞內輸送胺基酸。
- 如請求項1之人類單株抗體或者其功能性片段，其不與正常人類血管內皮細胞、正常人類末梢血單核球以及淋巴球結合。
- 如請求項1之人類單株抗體或者其功能性片段，其中具有胺基酸輸送活性之蛋白質為LAT1。
- 如請求項1之人類單株抗體或者其功能性片段，其中CD98為人類CD98。
- 如請求項1之人類單株抗體或者其功能性片段，其中抗 體重鏈恆定區之亞型為IgG。
- 如請求項1之人類單株抗體或者其功能性片段，其中可變區之胺基酸序列係被Bgl Ⅱ-BsiWI片段及SalI-NheI片段編碼，該Bgl Ⅱ-BsiWI片段及SalI-NheI片段係獲自質體載體C2IgG1/pCR4(FERM BP-10551)(國內寄存編號：BCRC 940530)且不含來自載體pCR4的序列。
- 如請求項1之人類單株抗體或其功能性片段，其中上述功能性片段係選自由抗體的重鏈及輕鏈可變區(VH 以及VL )、Fab、Fab'、(Fab')2 、Fv、Fd、scFv、sdFv及其等之組合所組成之群者。
- 一種結合物，其係如請求項1至9中任一項之人類單株抗體或其功能性片段與包含結合蛋白質、酶、藥物、毒素、免疫調節物、可檢測部分或標記之不同區域之結合者。
- 一種核酸，其具有於質體載體C2IgG1/pCR4(FERM BP-10551)(國內寄存編號：BCRC 940530)中所含有之除來自載體pCR4之序列以外之序列。
- 一種載體，其係含有如請求項11之核酸。
- 一種細胞，其表現如請求項1至9中任一項之人類單株抗體或其功能性片段。
- 一種醫藥組合物，其係含有如請求項1至9中任一項之人類單株抗體或其功能性片段作為有效成分。
- 一種腫瘤之治療劑，其係含有如請求項1至9中任一項之人類單株抗體或者其功能性片段作為有效成分。
- 如請求項15之治療劑，其中上述腫瘤係含有表現與LAT1形成複合物的CD98之癌細胞。
- 如請求項15之腫瘤之治療劑，其中上述腫瘤係大腸癌或結腸癌。
- 一種腫瘤之預防劑，其係含有如請求項1至9中任一項之人類單株抗體或者其功能性片段作為有效成分。
- 如請求項18之預防劑，其中上述腫瘤係含有表現與LAT1形成複合物的CD98之癌細胞。
- 如請求項18之腫瘤之預防劑，其中上述腫瘤係大腸癌或結腸癌。
- 一種抗體之製造方法，其特徵在於：將如請求項12之載體導入宿主後將該宿主加以培養，且自培養物中獲得該抗體。
- 一種抗體之製造方法，其特徵在於：將包含下述(b)至(g)中任意二序列或者其核酸序列縮聚物之表現載體導入宿主後將該宿主加以培養，且自培養物中獲得該抗體：(b)序列號40及46、(c)序列號42及46、(d)序列號42及78、(e)序列號42及80、(f)序列號42及82、(g)序列號42及84。
- 如請求項21或22之製造方法，其中宿主係選自由大腸菌、酵母細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、 植物以及哺乳動物所組成之群者。
- 一種獲得如請求項1至9中任一項之人類單株抗體或其功能性片段之方法，其係包含將編碼CD98以及LAT1之核酸導入而獲得之CD98/LAT1表現細胞對動物進行免疫。
- 如請求項24之方法，其中導入之CD98以及LAT1係人類之CD98以及人類LAT1。
- 一種如請求項1至9中任一項之人類單株抗體或其功能性片段之用途，其係用於製造腫瘤之預防劑或治療劑。
- 如請求項26之用途，其中上述腫瘤係含有表現與LAT1形成複合物之CD98之癌細胞。
- 如請求項26之用途，其中上述腫瘤為大腸癌或結腸癌。
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