JP5663790B2 - Ｒａｂ６ｋｉｆｌ／ｋｉｆ２０ａエピトープペプチドおよびそれを含むワクチン - Google Patents

Description

優先権
本出願は、２００８年１０月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／１９７，１０６号の恩典を主張し、その内容の全体は参照により本明細書に組み入れられる。

技術分野
本発明は、生物科学の分野、より具体的には癌治療の分野に関連する。特に本発明は、新規オリゴペプチドおよびその使用に関連する。

ＣＤ８陽性ＣＴＬは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子上に見出される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来のエピトープペプチドを認識し、その後、腫瘍細胞を殺傷することが実証されている。ＴＡＡの最初の例としてメラノーマ抗原（ＭＡＧＥ）ファミリーが発見されて以来、他の多くのＴＡＡが、主に免疫学的アプローチによって発見されている（Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80（非特許文献１）；Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9（非特許文献２））。ＴＡＡのいくつかは、現在、免疫療法の標的として臨床開発の過程にある。

強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導し得る新規ＴＡＡの同定により、様々な種類の癌に対するペプチドワクチン接種戦略のさらなる発展および臨床応用が保証される（Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55（非特許文献３）；Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42（非特許文献４）；Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9（非特許文献５）；van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14（非特許文献６）；Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8（非特許文献７）；Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72（非特許文献８）；Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66（非特許文献９）；Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94（非特許文献１０））。これまでに、これらの腫瘍関連抗原由来ペプチドを用いた臨床試験がいくつか報告されている。残念ながらこれまでのところ、これらの癌ワクチン試験では低い客観的奏功率しか観察されていない（Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80（非特許文献１１）；Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42（非特許文献１２）；Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15（非特許文献１３））。

最近では、アルゴリズムを用いて、ＨＬＡクラスＩ結合性ペプチド配列を予測することができる（Journal of Immunological Methods, (1995), Vol.185, pp.181-190（非特許文献１４）、J. Immunol., (1994), Vol.152, pp.163-175（非特許文献１５）、protein science, (2000), Vol.9, pp.1838-1846（非特許文献１６））。しかしながら、予測されたエピトープペプチドが標的細胞において天然でプロセシングされ、ＨＬＡ分子と共に標的細胞表面上に提示され得るとは言い難い。さらに、アルゴリズム、例えばＢＩＭＡＳ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｍｏｌｂｉｏ／ｋｅｎ＿ｐａｒｋｅｒ＿ｃｏｍｂｏｆｏｒｍ）（Parker KC, et al., (1994) J Immunol.;152(1):163-75（非特許文献１７）；Kuzushima K, et al., (2001) Blood.;98(6):1872-81（非特許文献１８））は、ＨＬＡ分子結合性ペプチドを示唆することができるが、示唆されたペプチドはそれほど厳密ではない（Bachinsky MM, et. al., Cancer Immun. 2005 Mar 22;5:6（非特許文献１９）)。したがって、ＴＡＡスクリーニングには依然として多くの課題および困難が残っている。

膵癌は予後が不良であり、全５年生存率は約５％である（１）。長期生存には外科的切除が依然として唯一の選択肢であるが、切除可能な膵癌を有する患者は少数である（９〜２２％）（Sener SF, et al. J Am Coll Surg 1999;189:1-7（非特許文献２０）、Eloubeidi MA, et al. Am J Surg 2006;192:322-9（非特許文献２１）、Goonetilleke KS, et al. Int J Surg 2007;5:147-51（非特許文献２２））。しかしながらこれらの患者でさえ、治癒目的で手術したにもかかわらず、５年生存率はおよそ２０％にとどまっている（Smeenk HG, et al. Langenbecks Arch Surg 2005;390:94-103（非特許文献２３）、Yeo CJ, et al. Ann Surg 1995;221:721-31（非特許文献２４））。最大８０％の患者は局所進行性または転移性の疾患を呈し、この患者らの生存期間中央値は６〜９カ月の範囲である（Lockhart AC, et al. Gastroenterology 2005;128:1642-54（非特許文献２５））。したがって、新規治療様式の開発は非常に重要な課題であり、免疫療法は膵癌の潜在的な治療法である可能性がある。

ＲＡＢ６ＫＩＦＬ（ＫＩＦ２０Ａ）は、Ｒａｂ６低分子ＧＴＰａｓｅとの直接的な相互作用を介して、ゴルジ体の動態において役割を果たすことが最初に確認された（Echard A, et al. Science 1998;279:580-5（非特許文献２６））。ＲＡＢ６ＫＩＦＬは、分子および細胞小器官の輸送において重要な機能を有するモータータンパク質のキネシンスーパーファミリーに属する（Echard A, et al. Science 1998;279:580-5（非特許文献２６）、Hirokawa N, et al. Curr Opin Cell Biol 1998;10:60-73（非特許文献２７）、Allan VJ, and Schroer TA. Curr Opin Cell Biol 1999;11:476-82（非特許文献２８））。最近、Ｔａｎｉｕｃｈｉ Ｋらは、ＲＡＢ６ＫＩＦＬが膵癌組織において過剰発現したことを報告した（Taniuchi K, et al. Cancer Res 2005;65:105-12（非特許文献２９））。彼らは、膵臓の発癌におけるＲＡＢ６ＫＩＦＬの重要な役割に関する証拠を見出した。

２３，０４０種の遺伝子を含むゲノムワイドｃＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現プロファイル解析を通して、膀胱癌（ＷＯ２００６／０８５６８４（特許文献１））、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）（ＷＯ２００７／０１３６６５（特許文献２））、およびホルモン不応性前立腺癌（ＨＲＰＣ）（ＷＯ２００８／１０２９０６（特許文献３））などのいくつかの癌においてＲＡＢ６ＫＩＦＬ（ＫＩＦ２０Ａ）が上方制御されることが最近示された（これらの開示は参照により本明細書に組み入れられる）。さらに、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子産物のいくつかのエピトープペプチドも同定された（ＷＯ２００８／１０２５５７（特許文献４））。

ＷＯ２００６／０８５６８４ ＷＯ２００７／０１３６６５ ＷＯ２００８／１０２９０６ ＷＯ２００８／１０２５５７

Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80 Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9 Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55 Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42 Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9 van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14 Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8 Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72 Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66 Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94 Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80 Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42 Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15 Jounal of Immunological Methods, (1995), Vol.185, pp.181-190 J. Immunol., (1994), Vol.152, pp.163-175 protein science, (2000), Vol.9, pp.1838-1846 Parker KC, et al., (1994) J Immunol.;152(1):163-75. Kuzushima K, et al., (2001) Blood.;98(6):1872-81. Bachinsky MM, et. al., Cancer Immun. 2005 Mar 22;5:6. Sener S F, et al. J Am Coll Surg 1999;189:1-7. Eloubeidi M A, et al. Am J Surg 2006;192:322-9. Goonetilleke K S,et al. Int J Surg 2007;5:147-51. Smeenk H G, et al. Langenbecks Arch Surg 2005;390:94-103. Yeo C J, et al. Ann Surg 1995;221:721-31. Lockhart A C, et al. Gastroenterology 2005;128:1642-54. Echard A, et al. Science 1998;279:580-5. Hirokawa N, et al. Curr Opin Cell Biol 1998;10:60-73. Allan VJ, and Schroer TA. Curr Opin Cell Biol 1999;11:476-82. Taniuchi K, et al. Cancer Res 2005;65:105-12.

本発明は、免疫療法の新規標的の発見に一部基づいている。ＴＡＡは免疫原性がない場合が多いため、適切な標的を発見することは極めて重要である。詳細には、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、食道癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膵癌、前立腺癌、腎癌、および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）などのいくつかの癌においてＲＡＢ６ＫＩＦＬが上方制御されると同定されたため、本発明は、ＮＭ＿００５７３３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）によっても示される、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１５３３２９またはＣＲ５９８５５５の遺伝子によってコードされるＲＡＢ６ＫＩＦＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を対象とする。本発明は、対応する分子に特異的な、驚くほど強力なＣＴＬ応答を引き起こすエピトープペプチドを含むＲＡＢ６ＫＩＦＬ遺伝子産物を提供する。健常ドナーから採取された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、本発明のペプチドを用いて刺激した。本発明はさらに、各ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２０１）陽性標的細胞を特異的に認識する樹立されたＣＴＬ、および腫瘍上に発現されたＲＡＢ６ＫＩＦＬに対して強力かつ特異的な免疫応答を誘導することができるＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２０１）拘束性エピトープペプチドを提供する。これらの結果から、ＲＡＢ６ＫＩＦＬは免疫原性が強く、そのエピトープは腫瘍免疫療法の有効な標的であることが実証される。

したがって、ＣＴＬ誘導能、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、および５の群より選択されるアミノ酸配列を有するオリゴペプチドを提供することが、本発明の目的である。加えて、本発明の別の態様では、得られた改変オリゴペプチドが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を保持する限り、１個、２個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されていてもよい。

対象に投与した場合、本発明のオリゴペプチドは抗原発現細胞の表面上に提示され、その後各ペプチドを標的とするＣＴＬを誘導する。したがって、本発明の目的は、本発明のペプチドのいずれかを提示する抗原提示細胞およびエキソソーム、ならびに抗原提示細胞を誘導する方法を提供することにある。

本発明のＲＡＢ６ＫＩＦＬオリゴペプチドまたは該オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにＲＡＢ６ＫＩＦＬオリゴペプチドを提示するエキソソームおよび抗原提示細胞の投与によって、抗腫瘍免疫応答が誘導される。したがって、本発明のさらなる別の目的は、有効成分として、該オリゴペプチドまたはそれらをコードするポリヌクレオチド、ならびに該エキソソームおよび抗原提示細胞を含む薬剤または薬学的組成物を提供することにある。本発明の薬剤または薬学的組成物はワクチンとして使用される。

さらに、本発明のさらなる目的は、ＲＡＢ６ＫＩＦＬオリゴペプチド、ＲＡＢ６ＫＩＦＬオリゴペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＲＡＢ６ＫＩＦＬポリペプチドを提示するエキソソームもしくは抗原提示細胞、または本発明の薬剤を投与する段階を含む、癌（腫瘍）の治療および／もしくは予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）（すなわち、ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、ならびに／またはその術後再発の予防のための方法、ならびにＣＴＬを誘導するための方法、抗腫瘍免疫を誘導するための方法を提供することにある。加えて、本発明のＣＴＬもまた、癌に対するワクチンとして使用される。標的となる癌の例には、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、食道癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膵癌、前立腺癌、腎癌、および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の前述の概要および以下の詳細な説明はいずれも例示的な態様のものであり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。
[本発明1001]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：3、4、および5からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたオリゴペプチド。
[本発明1002]
1個、2個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されているオリゴペプチドであって、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する、本発明1001のオリゴペプチド。
[本発明1003]
（ａ）Ｎ末端から2番目のアミノ酸がロイシンまたはメチオニンであること、および
（ｂ）Ｃ末端のアミノ酸がバリンまたはロイシンであること
からなる群より選択される少なくとも1つの置換を有する、本発明1002のオリゴペプチド。
[本発明1004]
薬学的に許容される担体と、本発明1001〜1003のいずれかの1つもしくは複数のオリゴペプチドまたは該オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含む、癌を治療および／もしくは予防するための、ならびに／またはその術後再発を予防するための薬剤。
[本発明1005]
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ2である対象に投与するために製剤化されている、本発明1004の薬剤。
[本発明1006]
癌が、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、食道癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膵癌、前立腺癌、腎癌、および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）からなる群より選択される、本発明1004の薬剤。
[本発明1007]
ワクチンである、本発明1004の薬剤。
[本発明1008]
本発明1001〜1003のいずれかのオリゴペプチドとＨＬＡ抗原とを含む複合体をその表面上に提示するエキソソーム。
[本発明1009]
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ2である、本発明1008のエキソソーム。
[本発明1010]
本発明1001〜1003のいずれかのオリゴペプチドを用いることにより抗原提示細胞を誘導するための方法。
[本発明1011]
（ａ）抗原提示細胞を、本発明1001〜1003のいずれかのオリゴペプチドと接触させる段階、および
（ｂ）本発明1001〜1003のいずれかのオリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドを抗原提示細胞に導入する段階
からなる群より選択される段階を含む、本発明1010の方法。
[本発明1012]
本発明1001〜1003のいずれかのオリゴペプチドを用いることによりＣＴＬを誘導するための方法。
[本発明1013]
（ａ）ＣＤ8陽性Ｔ細胞を、本発明1001〜1003のいずれかのオリゴペプチドをその表面上に提示する抗原提示細胞および／またはエキソソームと接触させる段階、ならびに
（ｂ）抗原提示細胞表面上の本発明1001〜1003のいずれかのオリゴペプチドとＨＬＡ抗原との複合体に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットを形成することが可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＣＤ8陽性Ｔ細胞に導入する段階
からなる群より選択される段階を含む、本発明1012の方法。
[本発明1014]
本発明1001〜1003のいずれかのオリゴペプチドを標的とする、単離されたＣＴＬ。
[本発明1015]
抗原提示細胞表面上の本発明1001〜1003のいずれかのオリゴペプチドとＨＬＡ抗原との複合体に結合することが可能である、本発明1014のＣＴＬ。
[本発明1016]
本発明1001〜1003のいずれかのオリゴペプチドを用いることによって誘導される、単離されたＣＴＬ。
[本発明1017]
本発明1013の方法により誘導される、本発明1016のＣＴＬ。
[本発明1018]
ＨＬＡ抗原と本発明1001〜1003のいずれかのオリゴペプチドとの複合体をその表面上に提示する、単離された抗原提示細胞。
[本発明1019]
本発明1010または1011の方法により誘導される、本発明1018の抗原提示細胞。
[本発明1020]
（ａ）本発明1001〜1003のいずれかの1つもしくは複数のオリゴペプチド、またはその免疫学的に活性のある断片；
（ｂ）本発明1001〜1003のいずれかのオリゴペプチドまたはその免疫学的に活性のある断片をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明1014〜1017のいずれかの1つまたは複数の単離されたＣＴＬ；
（ｄ）本発明1018または1019の1つまたは複数の単離された抗原提示細胞
からなる群より選択される少なくとも1つの有効成分を含むワクチンを対象に投与する段階を含む、対象において癌に対する免疫応答を誘導する方法。
[本発明1021]
薬学的に許容される担体と、本発明1001〜1003のいずれかの1つもしくは複数のオリゴペプチド、該オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチド、または本発明1018もしくは1019の単離された抗原提示細胞とを含む、ＣＴＬを誘導するための薬剤。
[本発明1022]
癌を治療するための薬学的組成物または薬剤の製造における、
（ａ）本発明1001〜1003のいずれかの1つまたは複数のオリゴペプチド；
（ｂ）本発明1001〜1003のいずれかのオリゴペプチドを発現可能な形態でコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明1001〜1003のいずれかのオリゴペプチドを提示する1つまたは複数の抗原提示細胞；および
（ｄ）抗原提示細胞表面上の本発明1001〜1003のいずれかのオリゴペプチドとＨＬＡ抗原との複合体に結合することが可能である、1つまたは複数のＣＴＬ
からなる群より選択される有効成分の使用。
[本発明1023]
本発明1001〜1003のいずれかのオリゴペプチドをコードするポリヌクレオチド。

本発明の様々な局面および適用は、以下の図面の簡単な説明ならびに発明の詳細な説明およびその好ましい態様を考慮することで、当業者に明白となるであろう。
ｃＤＮＡマイクロアレイ解析に基づいた、膵癌組織におけるＲＡＢ６ＫＩＦＬ ｍＲＮＡの顕著でかつ高頻度に増強された発現を示す。Ａは、膵癌細胞における上方制御遺伝子のリストを示す。これらの遺伝子は、癌細胞においてそれらの正常対応物と比較して過剰発現していた。膵癌細胞におけるＲＡＢ６ＫＩＦＬ ｍＲＮＡの発現は、６名の膵癌患者の全員で顕著に増強されていた。Ｂは、ｃＤＮＡマイクロアレイ解析に基づいた、正常組織におけるＲＡＢ６ＫＩＦＬ遺伝子の相対発現比を示す。ＲＡＢ６ＫＩＦＬ遺伝子は、精巣および胸腺においてのみわずかに発現していた。Ｃは、以前のｃＤＮＡマイクロアレイ解析に基づくと、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ遺伝子の発現レベルが、膵癌に加えて、多くの肺癌および膀胱癌においても増強されていたことを示す。 ヒト正常組織、癌細胞株、および癌組織において発現されたＲＡＢ６ＫＩＦＬ ｍＲＮＡの解析を示す。Ａは、ＲＴ−ＰＣＲ解析を用いて、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ ｍＲＮＡの発現を様々な正常組織において調べたこと示す。ＲＡＢ６ＫＩＦＬ ｍＲＮＡは、精巣においてのみわずかに発現していた。Ｂは、様々な癌細胞株におけるＲＡＢ６ＫＩＦＬ発現のＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。Ｃは、膵臓腫瘍組織（Ｔ）およびそれらの正常対応物（Ｎ）におけるＲＡＢ６ＫＩＦＬ発現のＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。８例の膵癌組織のうち５例において、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ遺伝子の発現が検出された。対照的に、それらの正常対応物では発現はほとんど検出されなかった。 ウェスタンブロット解析により検出されたＲＡＢ６ＫＩＦＬタンパク質の膵癌特異的過剰発現を示す。Ａは、ＲＡＢ６ＫＩＦＬタンパク質が８例の正常組織において検出されなかったのに対し、精巣が、ＰＡＮＣ１細胞溶解物において確認された移動度と類似した移動度を有するかすかなバンドを示したことを示す。Ｂは、２名の膵癌患者において、ＲＡＢ６ＫＩＦＬタンパク質が癌組織（Ｔ）では検出されたが、隣接正常組織（Ｎ）では検出されなかったことを示す。等量のタンパク質をロードしたことをモニターするために、抗βアクチンブロットもまた行った。 膵癌（Ａ）および様々な正常組織（Ｂ）におけるＲＡＢ６ＫＩＦＬタンパク質の免疫組織化学解析を示す。Ａは、９例の症例のうち６例において、主に癌細胞の細胞質および核においてＲＡＢ６ＫＩＦＬの強い染色が観察されたのに対して、それらの正常隣接膵臓組織の腺房細胞および正常管上皮では非常に弱い染色が観察されたことを示す。腹膜の転移巣においても、同様の強い染色が観察された。腫瘤形成性膵炎では、染色はほとんど検出されなかった。Ｂは、正常な脳、肺、肝臓、腎臓、胃、小腸、結腸、脾臓、骨格筋、皮膚、および胸腺において、ＲＡＢ６ＫＩＦＬが染色されなかったことを示す。精巣において、かすかな染色の可能性が認められた。陽性染色シグナルは茶褐色で示される。スケールバーは１００μｍを示す。 ＨＬＡ−Ａ２．１（ＨＨＤ）Ｔｇｍを用いることによる、ヒトＲＡＢ６ＫＩＦＬのＨＬＡ−Ａ２拘束性マウスＣＴＬエピトープの同定を示す。Ａは、ＨＬＡ−Ａ２．１（ＨＨＤ）Ｔｇｍを、３６種の候補ペプチドより選択された３種のペプチドの混合物１２セットをパルスした５×１０^５個の同系のＢＭ−ＤＣで７日目および１４日目にインビボで免疫したことを示す。２１日目に、免疫したマウスから単離したＣＤ４−脾臓細胞を、各ペプチドをパルスしたＢＭ−ＤＣで６日間刺激した。ＣＴＬの産生したＩＦＮ−γをＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより検出した。ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−８０９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、およびＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−１０−２８４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）ペプチドがペプチド反応性ＣＴＬを誘導することが示された。これらのアッセイは２回行ったが、同様の結果が得られた。Ｂは、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−８０９ペプチドで免疫したＨＬＡ−Ａ２（ＨＨＤ）Ｔｇｍの組織標本における、抗ＣＤ４ ｍＡｂまたは抗ＣＤ８ ｍＡｂによる免疫組織化学染色を示す。２回のワクチン接種の後、これらの標本を切除し、解析した。 ＨＬＡ−Ａ２陽性健常ドナーのＰＢＭＣからのＲＡＢ６ＫＩＦＬ特異的ヒトＣＴＬの誘導を示す。Ａは、ＨＬＡ−Ａ２陽性健常ドナーのＰＢＭＣからＲＡＢ６ＫＩＦＬペプチド反応性ＣＴＬが作製されたことを示す。ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−８０９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、およびＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−１０−２８４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）ペプチドをパルスした自己単球由来ＤＣで３回刺激した後、各ペプチドをパルスしたＴ２細胞（ＨＬＡ−Ａ２^＋、ＴＡＰ欠失）またはペプチドをパルスしなかったＴ２細胞に対するＣＴＬの細胞傷害性を、標準的な^５１Ｃｒ放出アッセイにより検出した。これらのＣＴＬは、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−１２（左）、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−８０９（中央）、およびＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−１０−２８４（右）ペプチドをパルスしたＴ２細胞に対して細胞傷害性を示したが、無関係のＨＩＶペプチドをパルスしたＴ２細胞およびペプチドをパルスしなかったＴ２細胞に対しては細胞傷害性を示さなかった。Ｂは、これらのＣＴＬが、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ^＋ ＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２０１）^＋ヒト膵癌細胞株ＰＡＮＣ１および結腸癌細胞株ＣａＣｏ−２に対して細胞傷害性を示したが、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ^＋ ＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２０１）⁻ヒト膵癌細胞株ＰＫ８に対しては細胞傷害性を示さなかったことを示す。 ＨＬＡ−Ａ２陽性健常ドナーのＰＢＭＣからのＲＡＢ６ＫＩＦＬ特異的ヒトＣＴＬの誘導を示す。Ｃは、これらのＣＴＬの細胞傷害性がＲＡＢ６ＫＩＦＬ特異的であったことを示す。これらのＣＴＬは、ヒトＲＡＢ６ＫＩＦＬ遺伝子をトランスフェクトしたＲＡＢ６ＫＩＦＬ^ｌｏｗ ＨＬＡ−Ａ２＋ヒト肝癌細胞株ＳＫＨｅｐ１であるＳＫＨｅｐ１／ＲＡＢ６ＫＩＦＬを死滅させたが、ＳＫＨｅｐ１／モックは死滅させなかった。Ｄは、抗ＨＬＡクラスＩ ｍＡｂによる細胞傷害性の阻害を示す。標的細胞ＰＡＮＣ１をそれぞれ抗ＨＬＡクラスＩ ｍＡｂ（Ｗ６／３２、ＩｇＧ_２ａ）または抗ＨＬＡ−ＤＲ ｍＡｂ（Ｈ−ＤＲ−１、ＩｇＧ_２ａ）と共に１時間インキュベートした後、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−１２（上）、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−８０９（中央）、およびＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−１０−２８４（下）ペプチドによる刺激によって健常ドナーのＰＢＭＣから作製されたＣＴＬを添加した。ＩＦＮ−γ産生はＷ６／３２によって顕著に阻害されたが、Ｈ−ＤＲ−１では阻害されなかった。

態様の説明
本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等な任意の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料をここに記載する。しかしながら、本材料および方法について記載する前に、本明細書に記載の特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコール等は慣行的な実験法および最適化に従って変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。本記載に使用する専門用語は特定の型または態様のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも、同様に理解されるべきである。

本明細書において言及される各出版物、特許、または特許出願の開示は、その全体が参照により本明細書に明確に組み入れられる。しかしながら、本明細書中のいかなるものも、本発明が先の発明によるそのような開示に先行する権利を与えられないことを承認するものとしては解釈されるべきではない。

矛盾する場合には、定義を含めて本明細書に照らし合わせるものとする。加えて、材料、方法、および実施例は単に例示であり、限定することを意図しない。

Ｉ．定義
本明細書で用いる「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単語は、特に他に具体的に指示がない限り「少なくとも１つの」を意味する。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、１個または複数個のアミノ酸残基が修飾された残基であるか、または対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体などの非天然残基であるアミノ酸ポリマーと、天然アミノ酸ポリマーとに適用される。

本明細書において時折用いられる「オリゴペプチド」という用語は、２０残基またはそれ未満、典型的には１５残基またはそれ未満の長さであり、通常は約８〜約１１残基、多くの場合には９または１０残基からなる本発明のペプチドを指すために用いられる。

本明細書で用いる「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、および細胞内で翻訳後に修飾されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素）を有するが、修飾されたＲ基または修飾された骨格を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸とは異なる構造を有するが、同様の機能を有する化合物を指す。

アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）の推奨する、一般に公知の３文字表記または１文字表記により参照されてもよい。

「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、他に特記しない限り、これらは、一般に受け入れられている１文字コードにより参照されるアミノ酸と同様である。

特記しない限り、「癌」という用語は、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ遺伝子を過剰発現している癌を指す。ＲＡＢ６ＫＩＦＬを過剰発現している癌の例には、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、食道癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膵癌、前立腺癌、腎癌、および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）が含まれるが、これらに限定されない。

特記しない限り、「細胞傷害性Ｔリンパ球」、「細胞傷害性Ｔ細胞」、および「ＣＴＬ」という用語は本明細書において互換的に用いられ、特に別段の定めのない限り、非自己細胞（例えば、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞）を認識し、そのような細胞の死滅を誘導することができるＴリンパ球のサブグループを指す。

特記しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。

ＩＩ．ペプチド
ＲＡＢ６ＫＩＦＬ由来のペプチドが、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識される抗原として機能することを実証するために、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）由来のペプチドを解析して、それらが、一般的に遭遇するＨＬＡ対立遺伝子であるＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２０１)によって拘束される抗原エピトープであるかどうかを判定した（Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996；Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995；Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994）。ＲＡＢ６ＫＩＦＬ由来のＨＬＡ−Ａ２結合性ペプチドの候補を、ＨＬＡ−Ａ２に対するそれらの結合親和性に関する情報を用いて同定した。これらのペプチドを負荷した樹状細胞（ＤＣ）によってＴ細胞をインビトロで刺激した後、ペプチド、詳細には以下のペプチドのそれぞれを用いてＣＴＬの樹立に成功した：
ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、
ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−８０９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、
および
ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−１０−２８４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）。

樹立されたこれらのＣＴＬは、各ペプチドをパルスした標的細胞に対して強力な特異的ＣＴＬ活性を示す。本明細書における結果から、ＲＡＢ６ＫＩＦＬがＣＴＬによって認識される抗原であること、および前記ペプチドがＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２０１）によって拘束されるＲＡＢ６ＫＩＦＬのエピトープペプチドである可能性があることが実証される。

ＲＡＢ６ＫＩＦＬ遺伝子は、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、食道癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膵癌、前立腺癌、腎癌、および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）などの大部分の癌組織で過剰発現するため、これは免疫療法のための優れた標的である。したがって本発明は、ＣＴＬに認識されるＲＡＢ６ＫＩＦＬのエピトープに相当するノナペプチド（アミノ酸残基９個からなるペプチド）およびデカペプチド（アミノ酸残基１０個からなるペプチド）などのオリゴペプチドを提供する。本発明のオリゴペプチドの特に好ましい例には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、および５の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドが含まれる。

一般的に、インターネット上で現在利用可能なソフトウェアプログラム、例えばParker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75に記載されているソフトウェアプログラムなどを用いて、インシリコで種々のペプチドとＨＬＡ抗原との間の結合親和性を算出することができる。例えばParker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75；およびKuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81に記載されているように、ＨＬＡ抗原との結合親和性を測定することができる。結合親和性を判定するための方法は、例えばJournal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190.；Protein Science, 2000, 9: 1838-1846に記載されている。したがって本発明は、そのような公知のプログラムにより、ＨＬＡ抗原と結合すると判定されるＲＡＢ６ＫＩＦＬのペプチドを包含する。

さらに、本発明のこれらのペプチドには、ペプチドがそのＣＴＬ誘導能を保持する限り、付加的アミノ酸残基を隣接させることができる。ＣＴＬ誘導能を有するそのようなペプチドは、例えば約４０アミノ酸未満であり、多くの場合には約２０アミノ酸未満であり、通常は約１５アミノ酸未満である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、および５の群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドに隣接するアミノ酸配列は、それが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を損なわない限り、限定されず、任意の種類のアミノ酸から構成され得る。したがって本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、および５の群より選択されるアミノ酸配列を含む、ＣＴＬ誘導能を有するペプチドを提供する。

一般的に、あるタンパク質中の１個、２個、または数個のアミノ酸の改変は、該タンパク質の機能に影響を及ぼさず、または、場合によっては元のタンパク質の所望の機能を増強することさえある。実際に、改変ペプチド（すなわち、元の参照配列と比較して、１個、２個、および／または数個のアミノ酸残基が改変された（すなわち、置換、欠失、付加、および／または挿入された）アミノ酸配列から構成されるペプチド）は、元のペプチドの生物活性を保持することが知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500；Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13）。したがって、１つの態様において、本発明のオリゴペプチドは、ＣＴＬ誘導能と、１個、２個、または数個のアミノ酸が付加、挿入、欠失、および／または置換されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、および５の群より選択されるアミノ酸配列との双方を有してよい。

当業者は、単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の付加または置換が、元のアミノ酸側鎖の特性の保存をもたらす傾向があることを認識する。したがって、それらは通常「保存的置換」または「保存的改変」と称され、この場合、タンパク質の変化により元のタンパク質と類似の特性および機能を有する改変タンパク質が生じる。機能的に類似しているアミノ酸を提示する保存的置換の表は、当技術分野において周知である。保存するのが望ましいアミノ酸側鎖の特性の例には、例えば、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、ならびに以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖が含まれる：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基含有側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子含有側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基含有側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；ならびに芳香族含有側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。加えて、以下の８群はそれぞれ、相互に保存的置換であるとして当技術分野で認められるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい）。

このような保存的改変ペプチドもまた、本発明のペプチドと見なされる。しかしながら、本発明のペプチドはこれらに限定されず、ペプチドが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を保持する限り、非保存的な改変を含み得る。さらに、改変ペプチドは、ＲＡＢ６ＫＩＦＬの多型バリアント、種間相同体、および対立遺伝子のＣＴＬ誘導可能なペプチドを排除しない。

必要なＣＴＬ誘導能を保持するために、少数の（例えば、１個、２個、または数個の）またはわずかな割合のアミノ酸を改変する（付加または置換する）ことができる。本明細書において、「数個」という用語は、５個またはそれ未満のアミノ酸、例えば３個またはそれ未満を意味する。改変するアミノ酸の割合は、２０％またはそれ未満、例えば１５％またはそれ未満、例えば１０％または１〜５％であってよい。

免疫療法との関連で用いられた場合、本発明のペプチドは、好ましくはＨＬＡ抗原との複合体として、細胞またはエキソソームの表面上に提示されるべきである。したがって、ＣＴＬを誘導するばかりでなく、ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を有するペプチドを選択することが好ましい。そのために、アミノ酸残基の置換、挿入、欠失、および／または付加によってペプチドを改変して、結合親和性が改善された改変ペプチドを得ることができる。天然に提示されるペプチドに加えて、ＨＬＡ抗原への結合によって提示されるペプチドの配列の規則性は既知であるため（J Immunol 1994, 152: 3913；Immunogenetics 1995, 41: 178；J Immunol 1994, 155: 4307）、そのような規則性に基づいた改変を本発明の免疫原性ペプチドに導入することができる。例えば、高いＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２０１）結合親和性を有するペプチドは、そのＮ末端から２番目のアミノ酸がロイシンまたはメチオニンで置換されており、ペプチドのＣ末端のアミノ酸がバリンまたはロイシンで置換されている。したがって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシンもしくはメチオニンで置換されている、および／またはＣ末端がバリンもしくはロイシンで置換されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、または５のアミノ酸配列を有するペプチドは、本発明によって包含される。末端のアミノ酸においてだけでなく、ペプチドの潜在的なＴＣＲ認識の部位においても、置換を導入することができる。いくつかの研究は、例えばＣＡＰ１、ｐ５３_{（２６４−２７２）}、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ_{（３６９−３７７）}、またはｇｐ１００_{（２０９−２１７）}など、ペプチド中のアミノ酸置換が元のものと同等であるかまたはより優れたものであり得ることを実証している（Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997、T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1;168(3):1338-47.、S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206、およびS. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314）。

本発明はまた、本明細書に開示の配列に対するアミノ酸の付加も意図する。例えば、１個、２個、または数個のアミノ酸はまた、本ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端にも付加され得る。高いＨＬＡ抗原結合親和性を有し、かつＣＴＬ誘導能を保持するそのような改変ペプチドもまた、本発明に包含される。

しかしながら、ペプチド配列が、異なる機能を有する内因性または外因性のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一である場合、自己免疫障害および／または特定の物質に対するアレルギー症状などの副作用が誘発される可能性がある。したがって、ペプチドの配列が別のタンパク質のアミノ酸配列と一致する状況を回避するために、まず、利用可能なデータベースを用いて相同性検索を行うことが好ましい。相同性検索から、対象ペプチドと比較してわずか１個または２個のアミノ酸しか相違しないペプチドが存在しないことが明らかになった場合には、前記副作用のいかなる危険も伴わずに、ＨＬＡ抗原とのその結合親和性を増大させるために、および／またはそのＣＴＬ誘導能を増大させるために、該対象ペプチドを改変することができる。

上記のようにＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を有するペプチドは非常に効果的であると予測されるが、指標として高い結合親和性の存在に従って選択された候補ペプチドを、さらにＣＴＬ誘導能の存在について試験する。本明細書において「ＣＴＬ誘導能」という語句は、抗原提示細胞上に提示された場合に、細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）を誘導するペプチドの能力を示す。さらに、「ＣＴＬ誘導能」は、ＣＴＬ活性化を誘導する、ＣＴＬ増殖を誘導する、ＣＴＬによる標的細胞の溶解を促進する、およびＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を増加させる、ペプチドの能力を含む。

ＣＴＬ誘導能の確認は、ヒトＭＨＣ抗原を保有する抗原提示細胞（例えば、Ｂリンパ球、マクロファージ、および樹状細胞（ＤＣ））、または、より具体的にはヒト末梢血単核白血球由来のＤＣを誘導し、ペプチドで刺激した後にＣＤ８陽性細胞と混合し、その後、標的細胞に対してＣＴＬによって産生および放出されたＩＦＮ−γを測定することにより達成される。反応系として、ヒトＨＬＡ抗原を発現するように作製されたトランスジェニック動物（例えば、BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) responseに記載のもの）を用いることができる。例えば、標的細胞を^５１Ｃｒ等で放射標識することが可能であり、標的細胞から放出された放射能から細胞傷害活性を算出することができる。あるいは、固定化したペプチドを保有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で、ＣＴＬによって産生かつ放出されたＩＦＮ−γを測定し、抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体を用いて培地上の阻害領域を可視化することによって、ＣＴＬ誘導能を評価することができる。

上記のようにペプチドのＣＴＬ誘導能を調べた結果として、ＨＬＡ抗原に対して高い結合親和性を有するこれらのペプチドが、必ずしも高いＣＴＬ誘導能を有するわけではないことが見出された。しかしながら、同定および評価したそれらのペプチドのうち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、および５によって示されるアミノ酸配列を有するペプチドより選択されるノナペプチドまたはデカペプチドは、ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性に加えて、特に高いＣＴＬ誘導能を示すことが判明した。したがって、これらのペプチドは本発明の好ましい態様として例示される。

上記の改変に加えて、本発明のペプチドは、結果として生じる連結ペプチドが元のペプチドの必要なＣＴＬ誘導能を保持する限り、他の物質に連結させることもできる。適切な物質の例には、限定するわけではないが、ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成のポリマー等が含まれる。前記ペプチドは、修飾によって元のペプチドの生物活性が損なわれない限り、例えば、糖鎖付加、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含み得る。このような種類の修飾を行って、付加的な機能（例えば、標的化機能および送達機能）を付与すること、またはポリペプチドを安定化することができる。

例えば、ポリペプチドのインビボ安定性を高めるために、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸模倣体、または非天然アミノ酸を導入することが当技術分野において公知であり、この概念を本ペプチドに適合させることもできる。ポリペプチドの安定性は、いくつかの方法でアッセイすることができる。例えば、ペプチダーゼ、ならびにヒトの血漿および血清などの様々な生物学的媒質を用いて、安定性を試験することができる（例えば、Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302を参照されたい）。

さらに、本発明のペプチドを、スペーサーまたはリンカーを介して他のペプチドに連結させてもよい。他のペプチドの例には、他のＴＡＡに由来するＣＴＬ誘導性ペプチドが含まれるが、これに限定されない。あるいは、本発明の２つまたはそれ以上のペプチドを、スペーサーまたはリンカーを介して連結させてもよい。スペーサーまたはリンカーを介して連結させるペプチドは、互いに同じであっても異なってもよい。スペーサーまたはリンカーは具体的に限定されないが、好ましくはペプチド、より好ましくは、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、およびプロテアソームなどの酵素によって切断され得る１つまたは複数の切断部位を有するペプチドである。リンカーまたはスペーサーの例には、ＡＡＹ（P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26)、ＡＡＡ、ＮＫＲＫ(R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315）、または１個〜数個のリジン残基（S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476、K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-5715）が含まれるが、これらに限定されない。本発明のペプチドは、スペーサーまたはリンカーを介して他のペプチドに連結されたペプチドも包含する。

本明細書において、本発明のペプチドは「ＲＡＢ６ＫＩＦＬペプチド」、「ＲＡＢ６ＫＩＦＬポリペプチド」、または「ＲＡＢ６ＫＩＦＬオリゴペプチド」と記載することもできる。

ＩＩＩ．ＲＡＢ６ＫＩＦＬペプチドの調製
周知の技法を用いて、本発明のペプチドを調製することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術または化学合成を用いて、ペプチドを合成的に調製することができる。本発明のペプチドは、個々に、または２つもしくはそれ以上のペプチドから構成されるより長いポリペプチドとして、合成することができる。その後ペプチドを単離すること、すなわち他の天然の宿主細胞タンパク質およびそれらの断片、または他の任意の化学物質を実質的に含まないように、精製または単離することができる。

選択されたアミノ酸配列に基づいた化学合成によって、本発明のペプチドを得ることができる。該合成に適合させることのできる従来のペプチド合成法の例には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない。
（ｉ）Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；
（ｉｉ）The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976；
（ｉｉｉ）Peptide Synthesis （日本語）， Maruzen Co., 1975；
（ｉｖ）Basics and Experiment of Peptide Synthesis （日本語）, Maruzen Co., 1985；
（ｖ）Development of Pharmaceuticals (second volume) （日本語）, Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991；
（ｖｉ）ＷＯ９９／６７２８８；および
（ｖｉｉ）Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, 「Solid Phase Peptide Synthesis」, Academic Press, New York, 1980, 100-118。

あるいは、ペプチドを作製するための任意の公知の遺伝子工学的方法（例えば、Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51；Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62）を適合させて、本発明のペプチドを得ることができる。例えば、最初に、発現可能な形態で（例えば、プロモーター配列に相当する調節配列の下流に）目的のペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞に入れて形質転換する。次いで、該宿主細胞を培養して、関心対象のペプチドを産生させる。インビトロ翻訳系を用いて、ペプチドをインビトロで作製することもできる。

ＩＶ．ポリヌクレオチド
本発明はまた、前述の本発明のペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらは、天然のＲＡＢ６ＫＩＦＬ／ＫＩＦ２０Ａ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５７３３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１））由来のポリヌクレオチド、およびその保存的に改変されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。本明細書において「保存的に改変されたヌクレオチド配列」という語句は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、数多くの機能的に同一な核酸が任意の特定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸のアラニンをコードする。したがって、あるコドンによってアラニンが指定されるあらゆる位置において、コードされるポリペプチドを変化させることなく、該コドンを記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。このような核酸の変異は「サイレント変異」であり、保存的に改変された変異の一種である。ペプチドをコードする本明細書中のあらゆる核酸配列は、該核酸の可能性のあるあらゆるサイレント変異をも表す。核酸中の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変して、機能的に同一な分子を得ることができることを、当業者は認識するであろう。したがって、ペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、公開した各配列において非明示的に記載されている。

本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの誘導体から構成され得る。ＤＮＡはＡ、Ｔ、Ｃ、およびＧなどの塩基から適切に構成され、ＲＮＡではＴはＵに置き換えられる。

本発明のポリヌクレオチドは、介在するアミノ酸配列を間に伴って、または伴わずに、本発明の複数のペプチドをコードし得る。例えば、介在するアミノ酸配列は、ポリヌクレオチドまたは翻訳されたペプチドの切断部位（例えば、酵素認識配列）を提供し得る。さらに、ポリヌクレオチドは、本発明のペプチドをコードするコード配列に対する任意の付加的配列を含み得る。例えば、ポリヌクレオチドは、ペプチドの発現に必要な調節配列を含む組換えポリヌクレオチドであってよく、またはマーカー遺伝子等を有する発現ベクター（プラスミド）であってもよい。一般に、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いる従来の組換え技法によりポリヌクレオチドを操作することによって、そのような組換えポリヌクレオチドを調製することができる。

組換え技法および化学合成技法の両方を用いて、本発明のポリヌクレオチドを作製することができる。例えば、適切なベクター内に挿入することによってポリヌクレオチドを作製することができ、これはコンピテント細胞にトランスフェクトした場合に発現され得る。あるいは、ＰＣＲ技法または適切な宿主内での発現を用いて、ポリヌクレオチドを増幅することができる（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989を参照されたい）。あるいは、Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311；Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5に記載されているような固相技法を用いて、ポリヌクレオチドを合成することができる。

本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、および該ベクターを有する宿主細胞もまた本発明に含まれる。

Ｖ．エキソソーム
本発明は、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との間で形成された複合体を自身の表面上に提示する、エキソソームと称される細胞内小胞をさらに提供する。エキソソームは、例えば公表特許公報 特表平１１−５１０５０７号およびＷＯ９９／０３４９９に詳述されている方法を用いることによって調製することができ、治療および／または予防の対象となる患者から得られたＡＰＣを用いて調製することができる。本発明のエキソソームは、本発明のペプチドと同様の様式で、ワクチンとして接種することができる。

前記複合体中に含まれるＨＬＡ抗原の型は、治療および／または予防を必要とする対象のものと一致しなければならない。日本人および白人の間で高発現するＨＬＡ−Ａ２型の使用は、有効な結果を得るのに好ましく、ＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２０１）およびＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２０６）などのサブタイプも使用される。典型的には、臨床では、治療を必要とする患者のＨＬＡ抗原の型があらかじめ調べられ、これにより、この抗原に対して高レベルの結合親和性を有するか、または抗原提示によるＣＴＬ誘導能を有するペプチドの適切な選択が可能となる。さらに、高い結合親和性およびＣＴＬ誘導能を示すペプチドを取得するために、天然のＲＡＢ６ＫＩＦＬ部分ペプチドのアミノ酸配列に基づいて、１個、２個、または数個のアミノ酸の置換または付加を行うことができる。

本発明のエキソソームに対してＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２０１）抗原を用いる場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、および５の配列選択ペプチドを有するペプチドが使用される。

ＶＩ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）
本発明はまた、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの間に形成される複合体を自身の表面上に提示する単離されたＡＰＣを提供する。本発明のペプチドを接触させることによって、または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現可能な形態で導入することによって得られるＡＰＣは、治療および／または予防の対象となる患者に由来してよく、かつ、単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくは細胞傷害性Ｔ細胞を含む他の薬物と組み合わせて、ワクチンとして投与することができる。

前記ＡＰＣは、特定の種類の細胞に限定されず、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られている樹状細胞（ＤＣ）、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および活性化Ｔ細胞を含む。ＤＣは、ＡＰＣの中で最も強力なＣＴＬ誘導作用を有する代表的なＡＰＣであるため、ＤＣは本発明のＡＰＣとして使用される。

例えば、末梢血単球からＤＣを誘導し、次にそれらをインビトロ、エクスビボ、またはインビボで本発明のペプチドと接触させる（で刺激する）ことによってＡＰＣを得ることができる。本発明のペプチドを対象に投与した場合、本発明のペプチドを提示するＡＰＣが該対象の体内で誘導される。「ＡＰＣを誘導する」という語句は、細胞を本発明のペプチドまたは本発明のペプチドをコードするヌクレオチドと接触させて（で刺激して）、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの間に形成される複合体を細胞表面上に提示させることを含む。あるいは、ＡＰＣが本発明のペプチドを提示できるように該ペプチドをＡＰＣに導入した後、ＡＰＣをワクチンとして対象に投与することができる。例えば、エクスビボ投与は、以下の段階を含み得る：
ａ：第１の対象からＡＰＣを回収する段階；
ｂ：段階ａのＡＰＣとペプチドを接触させる段階；および
ｃ：前記ペプチドを負荷したＡＰＣを、第２の対象に投与する段階。

第１の対象と第２の対象は同一の個体であってよく、または異なる個体であってもよい。あるいは、本発明に従って、抗原提示細胞を誘導する薬学的組成物を製造するための本発明のペプチドの使用を提供する。加えて、本発明は、抗原提示細胞を誘導するための薬学的組成物を製造する方法またはプロセスであって、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体と共に混合するまたは製剤化する段階を含む方法を提供する。あるいは、本発明は、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、食道癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膵癌、前立腺癌、腎癌、および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を含む癌を治療するための薬学的組成物を製造する方法またはプロセスであって、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体と共に混合するまたは製剤化する段階を含む方法を提供する。さらに、本発明はまた、抗原提示細胞を誘導するための本発明のペプチドを提供する。段階ｂによって得られたＡＰＣを、ワクチンとして対象に投与することができる。あるいは、本発明は、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、食道癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膵癌、前立腺癌、腎癌、および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を含む癌を治療するためのペプチドを提供する。

本発明の１つの局面によると、本発明のＡＰＣは高レベルのＣＴＬ誘導能を有する。「高レベルのＣＴＬ誘導能」という用語において、高レベルとは、ペプチドと接触させていないＡＰＣ、またはＣＴＬを誘導することができないペプチドと接触させたＡＰＣによるＣＴＬ誘導能のレベルと比較したものである。高レベルのＣＴＬ誘導能を有するそのようなＡＰＣは、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をインビトロでＡＰＣに導入する段階を含む方法によって、調製することができる。導入する遺伝子は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態であってよい。導入のための方法の例には、特に限定されることなく、当分野において従来より実施される様々な方法が含まれ、例えばリポフェクション、エレクトロポレーション、およびリン酸カルシウム法などを用いることができる。より具体的には、Cancer Res 1996, 56: 5672-7；J Immunol 1998, 161: 5607-13；J Exp Med 1996, 184: 465-72；公表特許公報第２０００−５０９２８１号に記載されているように、それを実施することができる。遺伝子をＡＰＣに導入することによって、遺伝子は細胞内で転写、翻訳等を受け、次いで、得られたタンパク質はＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩによって処理されて、提示経路を経てペプチドが提示される。

好ましい態様において、本発明のＡＰＣはその表面上に、ＨＬＡ抗原とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、および５の中より選択されるアミノ酸配列を含むオリゴペプチドとの複合体を提示する。好ましくは、本発明のＡＰＣはＨＬＡ−Ａ２抗原、特にＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２０１）をその表面上に保有する。あるいは、ＨＬＡ抗原と共に複合体を形成するためのオリゴペプチドは、１個、２個、または数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失、および／または付加されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、および５の中より選択されるアミノ酸配列を含むオリゴペプチドであってよく、例えばＮ末端から２番目のアミノ酸がロイシンもしくはメチオニンで置換されていてもよく、および／またはＣ末端のアミノ酸がバリンもしくはロイシンで置換されていてもよい。

ＶＩＩ．細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）
本発明のペプチドのいずれかに対して誘導された細胞傷害性Ｔ細胞は、インビボで腫瘍関連内皮を標的とする免疫応答を増強させるため、ペプチド自体と同様の様式でワクチンとして用いることができる。したがって本発明はまた、本ペプチドのいずれかよって特異的に誘導または活性化された、単離された細胞傷害性Ｔ細胞を提供する。

そのような細胞傷害性Ｔ細胞は、（１）対象に投与し、次いで対象から細胞傷害性Ｔ細胞を回収すること、または（２）対象由来のＡＰＣおよびＣＤ８陽性細胞、もしくは末梢血単核白血球をインビトロで本発明のペプチドと接触させ（で刺激し）、次いで細胞傷害性Ｔ細胞を単離することにより得ることができる。

本発明のペプチドを提示するＡＰＣからの刺激によって誘導された細胞傷害性Ｔ細胞は、治療および／または予防の対象となる患者に由来してよく、かつ、単独で投与すること、または効果を調節する目的で本発明のペプチドもしくはエキソソームを含む他の薬物と組み合わせて投与することができる。得られた細胞傷害性Ｔ細胞は、本発明のペプチド、または例えば誘導に用いた同一のペプチドを提示する標的細胞に対して特異的に作用する。言い換えれば、細胞傷害性Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体により、標的細胞の表面上でＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの間に形成された複合体を認識（すなわち、これに結合）し、次いで該標的細胞を攻撃して標的細胞の死を誘導することができる。標的細胞は、ＲＡＢ６ＫＩＦＬを内因的に発現する細胞、またはＲＡＢ６ＫＩＦＬ遺伝子をトランスフェクトされた細胞であってよく、かつ、本発明のペプチドによる刺激によって該ペプチドを細胞表面上に提示する細胞もまた、活性化されたＣＴＬの攻撃の標的となり得る。好ましい態様において、標的細胞は、ＨＬＡ−Ａ２抗原、特にＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２０）をその表面上に保有する。

ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
本発明はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットを形成することが可能なポリペプチドをコードする核酸配列から構成される組成物、およびそれを使用する方法を提供する。ＴＣＲαおよびＴＣＲβは、ＲＡＢ６ＫＩＦＬを発現する腫瘍細胞に対する特異性をＴ細胞に付与するＴＣＲを形成する能力を有する。当技術分野における公知の方法を用いることにより、本発明の１種または複数種のペプチドで誘導されたＣＴＬにおいて発現したＴＣＲのＴＣＲα鎖およびβ鎖の核酸配列を単離し、初代ヒトリンパ球への高効率遺伝子導入を媒介し得る適切なベクターを構築することができる（ＷＯ２００７／０３２２５５、およびMorgan RA, et al., J Immunol, 171, 3287 (2003)）。例えば、これらのベクターはレトロウイルスベクターである。有利には、本発明は、患者自身のＴ細胞（または別の哺乳動物のＴ細胞）の迅速な改変を可能にして、優れた癌細胞殺傷特性を有する改変Ｔ細胞を迅速かつ容易に作製する、既製（ｏｆｆ−ｔｈｅ−ｓｈｅｌｆ）組成物を提供する。

また本発明は、ＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２０１）との関連で、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、および５のＲＡＢ６ＫＩＦＬペプチドに結合するＴＣＲサブユニットポリペプチドをコードする核酸を形質導入することによって調製されたＣＴＬを提供する。形質導入されたＣＴＬは、インビボで癌細胞にホーミングすることができ、かつ周知の培養法によってインビトロで増殖させることができる（例えば、Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)）。本発明のＴ細胞は、治療または予防を必要としている患者における癌の治療または予防に有用な免疫原性組成物を形成するために使用することができる（ＷＯ２００６／０３１２２１）。

ＩＸ．薬剤または薬学的組成物
「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」という用語は、本明細書で互換的に用いられ、疾患による死亡率または罹患率の負荷を軽減させる任意の行為を指す。予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、「第一次、第二次、および第三次の予防レベルで」行われ得る。第一次の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の発生を回避するのに対し、第二次および第三次レベルの予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の進行および症状の出現を予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）することに加え、機能を回復させ、かつ疾患関連の合併症を減少させることによって、既存の疾患の悪影響を低下させることを目的とした行為を包含する。あるいは、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、特定の障害の重症度を軽減すること、例えば腫瘍の増殖および転移を減少させることを目的とした広範囲の予防的治療を含み得る。

癌の治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防は、以下の段階、例えば癌細胞の外科的除去、癌性細胞の成長の阻害、腫瘍の退行または退縮、寛解の誘導および癌の発生の抑制、腫瘍の退縮、ならびに転移の低減または阻害などの段階のいずれかを含む。癌の効果的な治療および／または予防は、死亡率を減少させ、癌を有する個体の予後を改善し、血中の腫瘍マーカーのレベルを低下させ、かつ癌に伴う検出可能な症状を軽減する。例えば、症状の軽減または改善は効果的な治療を構成し、および／または予防は１０％、２０％、３０％、もしくはそれ以上の軽減または安定した疾患を含む。

ＲＡＢ６ＫＩＦＬの発現は、正常組織と比較していくつかの癌において上方制御されるため、本発明のペプチドまたはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドを、癌の治療および／もしくは予防のために、ならびに／または術後のその再発の予防に用いることができる。したがって本発明は、本発明のペプチドの１種もしくは複数種、または該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含む、癌の治療および／もしくは予防のための、ならびに／または術後のその再発の予防のための薬剤または薬学的組成物を提供する。あるいは、薬剤または薬学的組成物として用いるために、本発明のペプチドを、前述のエキソソームまたはＡＰＣなどの細胞のいずれかの表面上に発現させることができる。加えて、本発明のペプチドのいずれかを標的とする前述の細胞傷害性Ｔ細胞もまた、本薬剤または薬学的組成物の有効成分として用いることができる。本発明との関連において、「ペプチドを標的とする」という語句は、Ｔ細胞受容体により、標的細胞の表面上でＨＬＡ抗原とペプチドとの間に形成された複合体を認識（すなわち、これに結合）し、次いで該標的細胞を攻撃して標的細胞の死を誘導することを意味する。

別の態様において、本発明はまた、癌または腫瘍を治療するための薬学的組成物または薬剤の製造における、以下の中より選択される有効成分の使用を提供する：
（ａ）本発明のペプチド、
（ｂ）本明細書に開示する当該ペプチドを発現可能な形態でコードする核酸、
（ｃ）本発明のＡＰＣ、および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。

あるいは、本発明はさらに、癌の治療において用いるための、以下の中より選択される有効成分を提供する：
（ａ）本発明のペプチド、
（ｂ）本明細書に開示する当該ペプチドを発現可能な形態でコードする核酸、
（ｃ）本発明のＡＰＣ、および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。

あるいは、本発明はさらに、癌を治療するための薬学的組成物または薬剤を製造するための方法または工程であって、有効成分として以下の中より選択される有効成分と共に、薬学的にまたは生理学的に許容される担体を製剤化する段階を含む、方法または工程を提供する：
（ａ）本発明のペプチド、
（ｂ）本明細書に開示する当該ペプチドを発現可能な形態でコードする核酸、
（ｃ）本発明のＡＰＣ、および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。

別の態様において、本発明はまた、癌を治療するための薬学的組成物または薬剤を製造するための方法または工程であって、以下の中より選択される有効成分を薬学的にまたは生理学的に許容される担体と混合する段階を含む、方法または工程を提供する：
（ａ）本発明のペプチド、
（ｂ）本明細書に開示する当該ペプチドを発現可能な形態でコードする核酸、
（ｃ）本発明のＡＰＣ、および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。

あるいは、本発明の薬学的組成物または薬剤は、癌の予防および術後のその再発の予防のいずれかまたは双方に用いることができる。

本発明の薬剤または薬学的組成物は、ワクチンとして使用される。本発明の文脈において、「ワクチン」（免疫原性組成物とも称される）という語句は、動物に接種した際に、抗腫瘍免疫を誘導する機能を有する物質を指す。

本発明の薬剤または薬学的組成物は、ヒト、ならびに非限定的にマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、サル、ヒヒ、およびチンパンジー、特に商業的に重要な動物または家畜を含む任意の他の哺乳動物を含む対象または患者において、癌を治療および／もしくは予防するため、ならびに／または術後のその再発を予防するために用いることができる。

本発明により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、および５の中より選択されるアミノ酸配列を有するオリゴペプチドが、強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２０１）拘束性エピトープペプチドであることが判明した。したがって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、または５のアミノ酸配列を有するこれらのオリゴペプチドのいずれかを含む本発明の薬剤または薬学的組成物は、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２０１）である対象に投与するのに特に適している。同じことが、これらのオリゴペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む薬剤または薬学的組成物にも当てはまる。

本発明の薬剤または薬学的組成物によって治療される癌は限定されず、これには、例えば膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、食道癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膵癌、前立腺癌、腎癌、および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を含む、ＲＡＢ６ＫＩＦＬが関与するすべての種類の癌が含まれる。詳細には、本発明の薬剤または薬学的組成物は、好ましくは膵癌に適用される。

本薬剤または薬学的組成物は、前述の有効成分に加えて、癌性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有するその他のペプチド、該その他のペプチドをコードするその他のポリヌクレオチド、該その他のペプチドを提示するその他の細胞等を含み得る。本明細書において、癌性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有するその他のペプチドは、癌特異的抗原（例えば、同定されたＴＡＡ）が例示されるが、これに限定されない。

必要に応じて、本発明の薬剤または薬学的組成物は、例えば本発明のペプチドのいずれかといった有効成分の抗腫瘍効果をその他の治療物質が阻害しない限り、有効成分として該治療物質を任意に含み得る。例えば、製剤は、抗炎症剤または組成物、鎮痛剤、化学療法剤等を含み得る。医薬自体に他の治療物質を含めることに加えて、本発明の医薬を、１つまたは複数の他の薬理学的な剤または組成物と連続してまたは同時に投与することもできる。医薬および薬理学的な剤または組成物の量は、例えば、使用される薬理学的な剤または組成物の種類、治療する疾患、ならびに投与のスケジュールおよび投与経路に依存する。

本明細書において特に言及される成分に加えて、本発明の薬剤または薬学的組成物は、問題の製剤の種類を考慮して、当技術分野において慣例的な他の剤または組成物も含み得ることが理解されるべきである。

本発明の１つの態様において、本薬剤または薬学的組成物を、例えば癌のような治療されるべき疾患の病態を治療するのに有用な材料を含む製品およびキットに含めることができる。該製品は、ラベルを有する本薬剤または薬学的組成物のいずれかの容器を含み得る。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器上のラベルには、剤または組成物が、疾患の１つまたは複数の状態の治療または予防のために用いられることが示されるべきである。ラベルはまた、投与等に関する指示も示し得る。

上記の容器に加えて、本発明の薬剤または薬学的組成物を含むキットは、任意で、薬学的に許容される希釈剤を収容した第２の容器をさらに含み得る。それは、使用のための説明書と共に、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジ、および添付文書を含む、商業上および使用者の立場から見て望ましい他の材料をさらに含み得る。

必要に応じて、有効成分を含む１つまたは複数の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置にて、薬学的組成物を提供することができる。該パックは、例えば、ブリスターパックのように金属またはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与に関する説明書が添付され得る。

（１）有効成分としてペプチドを含む薬剤または薬学的組成物
本発明のペプチドは、薬剤もしくは薬学的組成物として直接投与することができ、または必要であれば、従来の製剤方法によって製剤化される。後者の場合、本発明のペプチドに加えて、薬物に通常用いられる担体、賦形剤等が特に制限なく適宜含まれ得る。そのような担体の例は、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液等である。さらに、薬剤または薬学的組成物は、必要に応じて、安定剤、懸濁液、保存剤、界面活性剤等を含み得る。本発明の薬剤または薬学的組成物は、抗癌目的に用いることができる。

インビボでＣＴＬを誘導するために、本発明のペプチドを、本発明のペプチドの２種またはそれ以上から構成される組み合わせとして調製することができる。ペプチドの組み合わせはカクテルの形態をとってよく、または標準的な技法を用いて互いにコンジュゲートしてもよい。例えば、該ペプチドを化学的に結合させても、または単一の融合ポリペプチド配列として発現させてもよい。組み合わせにおけるペプチドは、同一であっても異なっていてもよい。本発明のペプチドを投与することにより、ペプチドはＡＰＣ上のＨＬＡ抗原によって高密度で提示され、次いで、提示されたペプチドとＨＬＡ抗原との間に形成された複合体に対して特異的に反応するＣＴＬが誘導される。あるいは、本発明のペプチドで刺激した対象からＡＰＣ（例えば、ＤＣ）を取り出すことにより、本発明のペプチドのいずれかをその細胞表面上に提示するＡＰＣを得て、これらのＡＰＣ（例えば、ＤＣ）を対象に再度投与することにより対象においてＣＴＬを誘導し、結果として、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、食道癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膵癌、前立腺癌、腎癌、および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）などの癌細胞に対する攻撃性を増大させることができる。

有効成分として本発明のペプチドを含む、癌の治療および／または予防のための薬剤または薬学的組成物は、効率的に細胞性免疫を確立させることが知られているアジュバントもまた含み得る。あるいは、これらは、他の有効成分と共に投与することができ、顆粒内への製剤化によって投与することもできる。アジュバントとは、免疫学的活性を有するタンパク質と共に（または連続して）投与した場合に、該タンパク質に対する免疫応答を増強させる化合物を指す。本明細書において意図されるアジュバントには、文献（Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89）に記載されているものが含まれる。適切なアジュバントの例には、これに限定されないが、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン、コレラ毒素、サルモネラ毒素等が含まれるが、これらに限定されない。

さらに、リポソーム製剤、直径数マイクロメートルのビーズにペプチドが結合している顆粒製剤、およびペプチドに脂質が結合している製剤を好都合に用いてもよい。

いくつかの態様において、本発明の薬剤または薬学的組成物は、ＣＴＬを刺激する（ｐｒｉｍｅ）成分をさらに含み得る。脂質は、ウイルス抗原に対してインビボでＣＴＬを刺激し得る剤または組成物として同定された。例えば、パルミチン酸残基をリジン残基のεアミノ基およびαアミノ基に付着させ、次に本発明のペプチドに連結させることができる。次いで、脂質付加したペプチドを、ミセルもしくは粒子の状態で直接投与すること、リポソーム中に取り込ませること、またはアジュバント中に乳化させることができる。ＣＴＬ応答の脂質による刺激の別の例として、適切なペプチドに共有結合している場合、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リポタンパク質を用いてＣＴＬを刺激することができる（例えば、Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4を参照されたい）。

投与方法は、経口、皮内、皮下、静脈内注射等、および全身投与または標的部位の近傍への局所投与であってよい。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によって強化することもできる。本発明のペプチドの用量を、治療する疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に従って適切に調節することができ、これは通常０．００１ ｍｇ〜１０００ ｍｇ、例えば０．００１ ｍｇ〜１０００ ｍｇ、例えば０．１ ｍｇ〜１０ ｍｇであり、数日から数ヶ月に１度投与することができる。当業者は、適切な用量を適切に選択することができる。

（２）有効成分としてポリヌクレオチドを含む薬剤または薬学的組成物
本発明の薬剤または薬学的組成物はまた、本明細書に開示するペプチドをコードする核酸を発現可能な形態で含み得る。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、ポリヌクレオチドが、細胞内に導入された場合に、抗腫瘍免疫を誘導するポリペプチドとしてインビボで発現され得ることを意味する。例示的な態様において、関心対象のポリヌクレオチドの核酸配列は、該ポリヌクレオチドの発現に必要な調節エレメントを含む。ポリヌクレオチドには、標的細胞のゲノム中への安定的な組み込みが達成されるように、必要なものを備えさせることができる（相同組換えカセットベクターの説明に関しては、例えばThomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい）。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8；米国特許第５，５８０，８５９号；第５，５８９，４６６号；第５，８０４，５６６号；第５，７３９，１１８号；第５，７３６，５２４号；第５，６７９，６４７号；およびＷＯ ９８／０４７２０を参照されたい。ＤＮＡに基づく送達技術の例には、「裸のＤＮＡ（ｎａｋｅｄ ＤＮＡ）」、促進された（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性の送達が含まれる（例えば、米国特許第５，９２２，６８７号を参照されたい）。

ウイルスベクターまたは細菌ベクターによって、本発明のペプチドを発現させることもできる。発現ベクターの例には、ワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルスなどの弱毒化ウイルス宿主が含まれる。このアプローチは、例えば、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとして、ワクシニアウイルスの使用を伴う。宿主内に導入すると、組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それによって免疫応答を引き起こす。免疫化プロトコールに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターの例はＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載されている。治療的投与または免疫化に有用である多種多様な他のベクター、例えばアデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）ベクター、無毒化炭疽毒素ベクター等が明らかであろう。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71；Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806；Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。

ポリヌクレオチドの対象内への送達は、直接的であってもよいし（この場合、ポリヌクレオチドを保有するベクターに対象を直接曝露する）、または間接的であってもよい（この場合、まずインビトロで細胞を関心対象のポリヌクレオチドで形質転換し、次いで該細胞を対象内に移植する）。これら２つのアプローチはそれぞれ、インビボおよびエクスビボの遺伝子治療として公知である。

遺伝子治療の方法の一般的な総説に関しては、Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505；Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95；Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96；Mulligan, Science 1993, 260: 926-32；Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217；Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215を参照されたい。本発明にも用いることのできる、組換えＤＮＡ技術の分野において一般に公知の方法は、eds. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993；およびKrieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990に記載されている。

投与方法は、経口、皮内、皮下、静脈内注射等であってよく、全身投与または標的部位の近傍への局所投与が用いられる。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によって強化することもできる。適切な担体中のポリヌクレオチドの用量、または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換した細胞の用量を、治療する疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に従って適切に調節することができ、これは通常０．００１ ｍｇ〜１０００ ｍｇ、例えば０．００１ ｍｇ〜１０００ ｍｇ、例えば０．１ ｍｇ〜１０ ｍｇであり、数日に１度〜数ヶ月に１度投与することができる。当業者は、適切な用量を適切に選択することができる。

Ｘ．ペプチド、エキソソーム、ＡＰＣ、およびＣＴＬを用いる方法
ＡＰＣおよびＣＴＬを誘導するために、本発明のペプチドおよびそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることができる。ＣＴＬを誘導するために、本発明のエキソソームおよびＡＰＣを用いることもできる。ペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、およびＡＰＣは、任意の他の化合物がそれらのＣＴＬ誘導能を阻害しない限り、該化合物と組み合わせて用いることができる。したがって、前述の本発明の薬剤または薬学的組成物のいずれかをＣＴＬを誘導するために用いることができ、それに加えて、前記ペプチドおよびポリヌクレオチドを含むそれらを、以下に議論されるように、ＡＰＣを誘導するために用いることもできる。

（１）抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導する方法
本発明は、本発明のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いた、ＡＰＣを誘導する方法を提供する。ＡＰＣの誘導は、「ＶＩ．抗原提示細胞」の章に上記したように行うことができる。本発明はまた、高レベルのＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導するための方法も提供し、その誘導もまた上記の「ＶＩ．抗原提示細胞」の項目で言及されている。

好ましくは、ＡＰＣを誘導するための方法は、以下の中より選択される少なくとも１つの段階を含む：
ａ：ＡＰＣを本発明のペプチドと接触させる段階、および
ｂ：発現可能な形態で本発明のポリペプチドを、ＡＰＣに導入する段階。

ＡＰＣを誘導するそのような方法は、好ましくはインビトロまたはエクスビボで行う。この方法をインビトロまたはエクスビボで行う場合、誘導すべきＡＰＣは、治療すべき対象、またはＨＬＡ抗原が対象のものと同じである他者から取得してよい。好ましい態様において、本発明の方法によって誘導されるＡＰＣは、ＨＬＡ−Ａ２抗原、特にＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２０１）をその表面上に保有する。

（２）ＣＴＬを誘導する方法
さらに本発明は、本発明のペプチド、該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、または該ペプチドを提示するエキソソームもしくはＡＰＣを用いてＣＴＬを誘導するための方法を提供する。

本発明はまた、細胞表面上の本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識する（すなわち、これに結合する）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットを形成し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いてＣＴＬを誘導するための方法を提供する。好ましくは、ＣＴＬを誘導するための方法は、以下の中より選択される少なくとも１つの段階を含む：
ａ：ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドの複合体を自身の表面上に提示する抗原提示細胞および／またはエキソソームと接触させる段階、ならびに
ｂ：本発明のペプチドとＨＬＡ抗原の複合体を認識するＴＣＲサブユニットを形成し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に導入する段階。

本発明のペプチドを対象に投与した場合、該対象の体内でＣＴＬが誘導され、腫瘍関連内皮を標的とする免疫応答の強度が増強される。あるいは、対象由来のＡＰＣ、およびＣＤ８陽性細胞、または末梢血単核白血球を、インビトロで本発明のペプチドと接触させ（で刺激し）、ＣＴＬを誘導した後、活性化したＣＴＬ細胞を該対象に戻すエクスビボ治療法に、前記ペプチドおよび前記ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることができる。例えば、本方法は以下の段階を含み得る：
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階；
ｂ：段階ａのＡＰＣと前記ペプチドとを接触させる段階；
ｃ：段階ｂのＡＰＣをＣＤ８^＋ Ｔ細胞と混合し、ＣＴＬを誘導するために共培養する段階；および
ｄ：段階ｃの共培養物からＣＤ８^＋ Ｔ細胞を回収する段階。

あるいは、本発明に従って、ＣＴＬを誘導する薬学的組成物を製造するための本発明のペプチドの使用を提供する。加えて、本発明は、ＣＴＬを誘導する薬剤または薬学的組成物を製造するための方法または工程を提供し、ここで、該方法は、薬学的に許容される担体と共に本発明のペプチドを混合または製剤化する工程を含む。さらに、本発明はまた、ＣＴＬを誘導するための本発明のペプチドを提供する。

段階ｄによって得られた細胞傷害活性を有するＣＤ８^＋ Ｔ細胞を、ワクチンとして前記対象に投与することができる。上記の段階ｃにおいてＣＤ８^＋ Ｔ細胞と混合するＡＰＣは、上記の「ＶＩ．抗原提示細胞」の章で詳述されているように、本ペプチドをコードする遺伝子をＡＰＣに導入することによって調製することもできるが、これに限定されず、本発明のペプチドをＴ細胞に対して効果的に提示する任意のＡＰＣまたはエキソソームを、本発明の方法に用いることができる。

本発明を実施または試験するにあたって、本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を用いることができるが、適切な方法および材料は記載のものである。本明細書において言及した出版物、特許出願、特許、およびその他の参考文献はすべて、その全体が参照により組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書に照らし合わせるものとする。加えて、材料、方法、および実施例は例示に過ぎず、限定を意図するものではない。

以下の実施例は、本発明を例証し、当業者がそれを作製および使用するのを補助するために提供される。実施例は、いかなる形であれ他の方法で本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

材料および方法
ｃＤＮＡマイクロアレイ解析
ｃＤＮＡマイクロアレイ解析による遺伝子発現のプロファイリングは、以前に記載された通りに行った（Nakamura T, et al. Oncogene 2004;23:2385-400）。膵癌および隣接する非癌性正常膵臓組織からの組織試料は外科検体から採取し、患者は全員、本研究に参加するために書面によるインフォームドコンセントを提出した。図１Ｃでは、癌細胞におけるＲＡＢ６ＫＩＦＬ ｍＲＮＡの発現の値を、正常対応物におけるｍＲＮＡの発現の値で割ることにより、相対発現比を算出した。図１Ｂでは、各正常組織におけるＲＡＢ６ＫＩＦＬ ｍＲＮＡの発現の値を、図１Ｂに示した４０例の正常組織からのＲＮＡ試料の等量の混合物である対照ＲＮＡにおけるＲＡＢ６ＫＩＦＬ ｍＲＮＡの発現の値で割ることにより、正常組織の相対発現比を算出した。

マウス
ＨＬＡ−Ａ２．１（ＨＨＤ）Ｔｇｍ；ヒトβ２ｍ−ＨＬＡ−Ａ２．１（α１、α２）−Ｈ−２Ｄ^ｂ（α３膜貫通細胞質；ＨＨＤ）単鎖構築遺伝子を導入したＨ−２Ｄ^ｂ−／− β２ｍ^−／−ダブルノックアウトマウスは、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ＳＩＤＡ−Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ， Ｕｎｉｔｅ ｄ’ Ｉｍｍｕｎｉｔｅ Ｃｅｌｌｕｌａｉｒｅ Ａｎｔｉｖｉｒａｌｅ， Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐａｓｔｅｕｒ、Ｆｒａｎｃｅにおいて作製され（Pascolo S, et al. J Exp Med 1997;185:2043-51、Firat H, et al. Eur J Immunol 1999;29:3112-21）、Ｆ．Ａ． Ｌｅｍｏｎｎｉｅｒ博士により供与された。マウスは熊本大学の動物資源開発研究部門において維持し、熊本大学の動物の取り扱いに関するガイドラインに従って取り扱った。

細胞株およびＨＬＡ発現
ヒト膵癌細胞株ＰＡＮＣ１、ヒト結腸癌細胞株ＣａＣｏ−２、およびＴＡＰ欠損かつＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２０１）陽性細胞株Ｔ２は、理研細胞バンク（つくば、日本）から購入した。ヒト膵癌細胞株ＰＫ８は、東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センター（仙台、日本）により供与された。ヒト肝癌細胞株ＳＫＨｅｐ１は、久留米大学（久留米、日本）、伊東恭悟博士により供与された。ＨＬＡ−Ａ２陽性血液ドナーおよび細胞傷害性アッセイ用の標的細胞株を選択するために、抗ＨＬＡ−Ａ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ＢＢ７．２（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ， Ｉｎｃ．、Ｃａｎｏｇａ Ｐａｒｋ， ＣＡ）を用いたフローサイトメトリーを使用して、ＨＬＡ−Ａ２の発現を調べた。これらの細胞は、５％ ＣＯ_２雰囲気中、３７℃にて、１０％ ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ １６４０またはＤＭＥＭ培地中でインビトロで維持した。

患者、血液試料、および腫瘍組織
ドナー由来のＰＢＭＣを用いた臨床研究は、熊本大学（熊本、日本）の施設内治験審査委員会によって承認された。血液試料、ならびに癌組織および隣接非癌性組織は、熊本大学医学部付属病院において患者より正式な書面によるインフォームドコンセントを得た後に、慣行的な診断手順の中で採取された。血液試料は、書面によるインフォームドコンセントを得たのち、健常ドナーからも採取された。試料はすべて無記名であり、ランダムに番号をつけ、使用時まで−８０℃で保存した。患者および健常ドナーは全員、日本国籍であった。

逆転写ＰＣＲおよびノーザンブロット解析
正常組織および癌組織ならびに細胞株の逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）解析を行い、ＲＡＢ６ＫＩＦＬの発現をｍＲＮＡレベルで評価した。プライマー配列は以下の通りであった：
ＲＡＢ６ＫＩＦＬ、センス
５’−ＣＴＡＣＡＡＧＣＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴＣＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
およびアンチセンス
５’−ＡＧＡＴＧＧＡＧＡＡＧＣＧＡＡＴＧＴＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
、ならびにβアクチン、センス
５’−ＣＡＴＣＣＡＣＧＡＡＡＣＴＡＣＣＴＴＣＡＡＣＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
およびアンチセンス
５’−ＴＣＴＣＣＴＴＡＧＡＧＡＧＡＡＧＴＧＧＧＧＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）。
９４℃で５分間の最初の変性、および５８℃のアニーリング温度での３２〜３５回の増幅サイクルからなるＲＴ−ＰＣＲ反応を使用した。対照としてのβアクチンｍＲＮＡにより正規化した後、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ ｍＲＮＡの発現を組織および細胞株において比較した。

ウェスタンブロット解析および免疫組織化学検査
ＲＡＢ６ＫＩＦＬタンパク質のウェスタンブロットおよび免疫組織化学染色は、以前に記載された通りに行った（Nakatsura T, et al. Biochem Biophys Res Commun 2001;281:936-44、Yoshitake Y, et al. Clin Cancer Res 2004;10:6437-48）。ヒト正常組織のウェスタンブロット解析については、予め作製されたヒト成人正常組織ブロット（Ｂｉｏｃｈａｉｎ、Ｈａｙｗａｒｄ， ＣＡ）を使用した。本明細書で使用した一次抗体である抗ＲＡＢ６ＫＩＦＬポリクローナル抗体およびモノクローナル抗ｂアクチン抗体は、それぞれＢｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ， ＴＸ， ＵＳＡ）およびＳｉｇｍａ（Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−１０−２８４ペプチドで免疫したＨＬＡ−Ａ２．１（ＨＨＤ）Ｔｇｍの組織標本におけるＣＤ４またはＣＤ８の免疫組織化学染色は、以前に記載された通りに行った（Matsuyoshi H, et al. 2004;172:776-86）。

レンチウイルス遺伝子導入
レンチウイルスベクターを介した遺伝子導入は、以前に記載された通りに行った（Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008;14:6487-95、Tahara-Hanaoka S, et al. Exp Hematol 2002;30:11-7）。簡潔に説明すると、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ ｃＤＮＡを保有する１７μｇのＣＳＩＩ−ＣＭＶ−ＲｆＡおよびＣＳＩＩＥＦ−ＲｆＡ自己不活化ベクター（Miyoshi H, et al. J Virol 1998;72:8150-7）、ならびに１０μｇのｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ−ＲＳＶ−ＲｅｖおよびｐＣＡＧ−ＨＩＶｇｐを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて、１０ｃｍ培養ディッシュ中で増殖させた２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの６０時間後に培地を回収し、超遠心（５０，０００×ｇ、２時間）によりウイルス粒子をペレット化した。ペレットを５０μＬのＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁し、１０μＬのウイルス懸濁液を平底９６ウェルプレート中の１ウェル当たり５×１０^４個のＳＫＨｅｐ１細胞に添加した。トランスフェクトしたＲＡＢ６ＫＩＦＬ遺伝子の発現を、ウェスタンブロット解析により確認した。

ＲＡＢ６ＫＩＦＬ反応性マウスＣＴＬの誘導、およびＩＦＮ−γ酵素結合免疫スポットアッセイ
ＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２０１）コード分子に対する結合モチーフを保有するヒトＲＡＢ６ＫＩＦＬ由来のペプチド（純度＞９５％）を、ＢＩＭＡＳソフトウェアプログラム（ＢｉｏＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ， Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）を用いて選択し、３６種のペプチドを合成した（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＣＡ， ＵＳＡ）。ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＨＩＶペプチド（ＳＬＹＮＴＹＡＴＬ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）を無関係のペプチドとして使用した。ペプチドによるマウスの免疫化は、以前に記載された通りに行った（Nakatsura T, et al. Biochem Biophys Res Commun 2003;306:16-25）。各ペプチドをパルスしたまたはパルスしていない同系ＢＭ−ＤＣ（１×１０^４個／ウェル）で刺激した場合の、ＣＤ４−脾臓細胞１×１０^５個あたりのＩＦＮ−γ産生細胞の頻度を、以前に記載されている通りに酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイにより解析した（Komori H, et al. Clin Cancer Res 2006;12:2689-97）。

ＲＡＢ６ＫＩＦＬ反応性ヒトＣＴＬの誘導
ＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２０１）コード分子に対する結合モチーフを保有するヒトＲＡＢ６ＫＩＦＬ由来ペプチド（純度＞９５％）を、ＢＩＭＡＳソフトウェアプログラム（ＢｉｏＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ， Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）を用いて選択し、３６種のペプチドを合成した（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＣＡ， ＵＳＡ）（表１ＡおよびＢ）。単球由来のＤＣを抗原提示細胞として用いて、ＨＬＡと関連して提示されたペプチドに対するＣＴＬ応答を誘導した。ＤＣは、以前に記載された通りにインビトロ培養で作製した（Yoshitake Y, et al. Clin Cancer Res 2004;10:6437-48、Harao M, et al. Int J Cancer 2008；in press、Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008；in press）。簡潔に説明すると、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ， Ｌｔｄ．、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ， ＵＫ）溶液を用いて、ＨＬＡ−Ａ２に関して陽性である正常ボランティアから単離されたＰＢＭＣを、マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）によりＣＤ８^＋集団とＣＤ１４^＋集団に分別した。ＤＣを作製するために、２％加熱非働化自己血清を含むＡＩＭ−Ｖ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、１００ ｎｇ／ｍＬ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ；ＰｅｐｒｏＴｅｃ Ｉｎｃ．、ＮＪ， ＵＳＡ）および１０ ｎｇ／ｍＬインターロイキン（ＩＬ）−４（ＰｅｐｒｏＴｅｃ）の存在下、ＣＤ１４^＋集団を培養した。培養の５日後、ＤＣを成熟させるためにＯＫ−４３２をディッシュに添加した。サイトカインで作製したＤＣの培養を開始してから７日後に、ＡＩＭ−Ｖ中で、４μｇ／ｍＬ β２ミクログロブリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）の存在下、ＤＣに２０ ｎｇ／ｍＬ ＨＬＡ−Ａ２結合性ペプチドを３７℃にて２時間パルスした。次いで、ペプチドパルスしたこれらのＤＣに放射線照射（４０ Ｇｙ）を行い、抗ＣＤ８マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いたＰＢＭＣの陽性選択によって得られた自己ＣＤ８^＋ Ｔ細胞と１：５０の比率で混合した。これらの培養物を２４ウェルプレート中に準備したが、各ウェルは、２％自己血漿を含むＡＩＭ−Ｖ ２ ｍＬ中に、ペプチドパルスしたＤＣ １×１０^５個、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞 ２×１０^６個、および５ ｎｇ／ｍＬヒト組換えＩＬ−７（和光純薬工業株式会社、大阪、日本）を含んだ。２日後、これらの培養物に、ヒト組換えＩＬ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃ Ｉｎｃ．）を最終濃度２０ ＩＵ／ｍＬになるように補充した。７日目および１４日目に、同じ手順を用いて、ペプチド負荷した自己ＤＣによる週に１度の刺激をさらに２回行った。最終刺激の６日後、^５１Ｃｒ放出アッセイおよびＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、誘導されたＣＴＬの抗原特異的応答を調べた。

癌細胞株に対するＣＴＬ応答
ＣＴＬを、標的細胞（５×１０^３個／ウェル）としての癌細胞またはペプチドパルスしたＴ２細胞の各々と共に指示されたエフェクター／標的比で共培養し、以前に記載された通りに標準的な^５１Ｃｒ放出アッセイを行った（Yoshitake Y, et al. Clin Cancer Res 2004;10:6437-48、Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008；in press）。簡潔に説明すると、ＣＯ_２インキュベーター中で、標的細胞を３．７ ＫＢｑ Ｎａ_２ ^５１Ｃｒ^４（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により３７℃で１時間標識した。標識した標的細胞を３回リンスし、細胞を２０μｇ／ｍＬペプチドと共に３７℃で３時間インキュベートすることによりペプチドパルスした標的細胞を調製した。平底マイクロタイタープレート中、最終量２００μＬ中で標的細胞をエフェクター細胞と混合し、インキュベートした。６時間のインキュベーション後、各ウェルから上清５０μＬを回収し、γカウンターを用いて放射活性を定量した。特異的な^５１Ｃｒ放出の割合を算出することにより、特異的細胞傷害性を評価した。

ＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡ−ＤＲのブロッキングは、以前に記載された通りに行った（Yoshitake Y, et al. Clin Cancer Res 2004;10:6437-48、Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008；in press）。簡潔に説明すると、^５１Ｃｒ放出アッセイまたはＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてＣＴＬと癌細胞株を共培養する前に、標的癌細胞を１０μｇ／ｍＬ抗クラスＩ ｍＡｂ、Ｗ６／３２または１０μｇ／ｍＬ抗ＨＬＡ−ＤＲ ｍＡｂ、Ｈ−ＤＲ−１と共に１時間インキュベートし、次いでＣＴＬによる細胞傷害活性またはＩＦＮ−γ産生のいずれかに及ぼすｍＡｂの効果を調べた。

統計解析
両側スチューデントｔ検定を用いて、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって得られたデータの差、および処置群間の腫瘍サイズの差についての統計的有意性を評価した。Ｐ値＜０．０５を有意であるとみなした。統計解析は、市販の統計ソフトウェアパッケージ（ＳＰＳＳ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ， ｖｅｒｓｉｏｎ １１．０、Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ， ＵＳＡ）を用いて実施した。

結果
ｃＤＮＡマイクロアレイに基づいた、膵癌および様々な悪性腫瘍において上方制御されるＲＡＢ６ＫＩＦＬ遺伝子の同定
２７，６４８種の遺伝子を含むゲノムワイドｃＤＮＡマイクロアレイを用いて、６例の膵癌組織およびそれらの隣接正常対応物の遺伝子発現プロファイルを以前に調べていた。解析後、６種の遺伝子が選択された。これらの遺伝子の相対発現比は、膵癌組織において、その正常対応物と比較して５倍超高かった（図１Ａ）（Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008;14:6487-95）。４例の胎児組織を含む２９種の正常組織において、ｃＤＮＡマイクロアレイ解析を用いてこれらの遺伝子の発現を解析した（図１Ｂ）。結果として、膵癌の新規ＴＡＡとしてＲＡＢ６ＫＩＦＬ／ＫＩＦ２０Ａに着目した。膵癌組織におけるＲＡＢ６ＫＩＦＬ遺伝子の発現は、調べた６名の患者の全員で顕著に増強されていた（相対発現比の平均値：３２，０００、範囲：１５〜７２，０００）。加えて、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ遺伝子は、精巣および胸腺においてのみかすかに発現していた（図１Ｂ）。以前のｃＤＮＡマイクロアレイ解析に基づくと、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ遺伝子の発現レベルは、肺癌および膀胱癌においても増強されていた（図１Ｃ）（Nakamura T, et al. Oncogene 2004;23:2385-400、Kitahara O, et al. Cancer Res 2001;61:3544-9、Hasegawa S, et al. Cancer Res 2002;62:7012-7、Kikuchi T, et al. Oncogene 2003;22:2192-205、Obama K, et al. Hepatology 2005;41:1339-48）。

正常器官、癌細胞株、および膵癌組織におけるＲＡＢ６ＫＩＦＬのｍＲＮＡおよびタンパク質の発現
ＲＴ−ＰＣＲ解析を用いて、正常組織におけるＲＡＢ６ＫＩＦＬ遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現を解析した。正常組織におけるＲＡＢ６ＫＩＦＬの半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析から、これが精巣においてのみ発現したことが明らかになった（図２Ａ）。ＲＴ−ＰＣＲ解析を用いて、ほとんどすべての膵癌細胞株およびその他のＨＬＡ−Ａ２陽性癌細胞株において、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ遺伝子の発現が検出された（図２Ｂ）。

続いて、外科的に切除された膵癌組織およびそれらの隣接正常対応物において、ＲＴ−ＰＣＲ解析を用いてＲＡＢ６ＫＩＦＬ遺伝子の発現を解析した。８例の膵癌組織のうち５例でＲＡＢ６ＫＩＦＬ遺伝子の発現が検出されたが、それらの正常対応物では発現はほとんど検出されなかった（図２Ｃ）。加えて、その発現は皮膚および腹膜の転移巣でも検出された。

ウェスタンブロットにより、癌性組織およびいくつかの正常組織におけるＲＡＢ６ＫＩＦＬタンパク質の発現もまた調べた（図３Ａ、Ｂ）。ＲＡＢ６ＫＩＦＬタンパク質は８例の正常組織では検出され得ず、精巣は、ＰＡＮＣ１細胞の溶解物において観察された移動度と類似した移動度を有する非常にかすかなバンドを示した（図３Ａ）。一方、ＲＡＢ６ＫＩＦＬタンパク質は調べた２名の患者の膵癌組織において検出されたが、隣接正常組織では検出されなかった（図３Ｂ）。

ＲＡＢ６ＫＩＦＬタンパク質の腫瘍に関連した過剰発現を確認するために、次に、多くのパラフィン包埋膵癌組織標本を免疫組織化学解析により調べた。ＲＡＢ６ＫＩＦＬの強い染色が主に膵癌の癌細胞の細胞質で観察されたのに対し、それらの正常隣接膵臓組織の腺房細胞および正常管上皮では非常に弱い染色が観察された（図４Ａ）。加えて、腹膜の転移巣においても類似の強い染色が観察された（図４Ａ）。腫瘤形成性膵炎の組織標本では、染色は検出されなかった（図４Ａ）。ＲＡＢ６ＫＩＦＬは、正常な脳、肺、肝臓、腎臓、胃、小腸、結腸、脾臓、骨格筋、皮膚、胸腺、および精巣では染色されなかった（図４Ｂ）。

ＲＡＢ６ＫＩＦＬ由来のＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２０１）結合性ペプチドの予測
表１ＡおよびＢは、ＲＡＢ６ＫＩＦＬタンパク質のＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２０１）結合性ペプチドを、予測される高い結合親和性のスコア順に示す。潜在的なＨＬＡ−Ａ２結合能を有する全部で３６種のペプチドを選択した。

（表１Ａ）ＲＡＢ６ＫＩＦＬ由来のＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２０１）結合性９ｍｅｒペプチド

開始位置は、ＲＡＢ６ＫＩＦＬのＮ末端からのアミノ酸数を示す。
結合スコアは材料および方法に由来する。

（表１Ｂ）ＲＡＢ６ＫＩＦＬ由来のＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２０１）結合性１０ｍｅｒペプチド

開始位置は、ＲＡＢ６ＫＩＦＬのＮ末端からのアミノ酸数を示す。
結合スコアは材料および方法に由来する。

ＨＬＡ−Ａ２．１（ＨＨＤ）トランスジェニックマウスを用いた、ＲＡＢ６ＫＩＦＬに由来しかつＨＬＡ−Ａ２拘束性のマウスＣＴＬエピトープの同定
ＲＡＢ６ＫＩＦＬに由来しかつＨＬＡ−Ａ２拘束性のＣＴＬエピトープを同定するために、３６種の異なる候補ペプチドを選択した。それぞれが、ＮＩＨ ＢＩＭＡＳによって提供されるＨＬＡペプチド結合予測アルゴリズムに基づき、世界中で最もよく見られるＨＬＡ対立遺伝子産物であるＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２０１）に対して高い予測結合スコアを有する９アミノ酸または１０アミノ酸からなった（表１Ａ、Ｂ）。どれがペプチド反応性ＣＴＬを誘導することが可能であるかを判定するために、これら３６種のペプチドより選択された３種のペプチドの混合物１２セットをパルスしたＢＭ−ＤＣで２回腹腔内免疫したＨＬＡ−Ａ２．１（ＨＨＤ）Ｔｇｍから単離したＣＤ４⁻脾臓細胞を、各ペプチドをパルスしたＢＭ−ＤＣでインビトロにて再度刺激した。結果から、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−１２、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−８０９、およびＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−１０−２８４ペプチドで刺激したＣＤ４⁻脾臓細胞が、有意な量のＩＦＮ−γをペプチド特異的様式で産生することが示された（図５Ａ）。これらのＣＤ４⁻脾臓細胞（２×１０^４個）は、ペプチドを負荷していないＢＭ−ＤＣの存在下では３２．６ ＋／− ９．９スポットカウント／ウェルを示したのに対し、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−１２ペプチドをパルスしたＢＭ−ＤＣに応答して１４９．０ ＋／− ２２．２スポットカウント／ウェルを示した（Ｐ＜０．０１）。同様に、ＣＤ４⁻脾臓細胞は、ペプチドを負荷していないＢＭ−ＤＣの存在下では５１．４ ＋／− ７．８スポットカウント／ウェルを示したのに対し、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−８０９ペプチドをパルスしたＢＭ−ＤＣで刺激したＣＤ４⁻脾臓細胞は１１７．２ ＋／− ２３．４スポットカウント／ウェルを示した（Ｐ＜０．０１）。さらに、ＣＤ４⁻脾臓細胞は、ペプチドを負荷していないＢＭ−ＤＣの存在下では１９．２ ＋／− ５．２スポットカウント／ウェルを示したのに対し、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−１０−２８４ペプチドをパルスしたＢＭ−ＤＣで刺激したＣＤ４⁻脾臓細胞もまた１４１．２ ＋／− ５．５スポットカウント／ウェルを示した（Ｐ＜０．０１）。他のペプチドでは、有意なペプチド特異的応答は認められなかった。これらの結果から、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−１２、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−８０９、およびＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−１０−２８４ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２．１（ＨＨＤ）ＴｇｍにおけるＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬエピトープペプチドであり得ることが示唆され、これらのペプチドがヒトＣＴＬのエピトープであることが予測された。

ＨＬＡ−Ａ２．１（ＨＨＤ）Ｔｇｍにおいて、エピトープペプチドであるＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−８０９による免疫化によって誘導されない自己免疫現象
ＲＡＢ６ＫＩＦＬペプチドによる免疫化が自己免疫応答を誘導するか否かを調べることは非常に重要である。したがって本発明者らは、アミノ酸配列がヒトとマウスのＲＡＢ６ＫＩＦＬ間で完全に保存されているＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−８０９ペプチドを２回ワクチン接種した後、ＨＬＡ−Ａ２（ＨＨＤ）Ｔｇｍにおいて、抗ＣＤ４ ｍＡｂおよび抗ＣＤ８ ｍＡｂによるいくつかの重要器官の免疫組織化学解析を行った。結果として、自己免疫状態を示唆するリンパ球浸潤または組織破壊などの病的変化は認められなかった（図５Ｂ）。異常な毛および皮膚、下痢、ならびに体重減少などの、自己免疫疾患に罹患したマウスにおいて頻繁に認められる異常もまた、これらのマウスでは認められなかった。これらの結果から、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−８０９ペプチドで刺激されたリンパ球は、少なくともＨＬＡ−Ａ２ Ｔｇｍにおいて正常組織を攻撃しなかったことが示される。

ＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２０１）陽性健常ドナーのＰＢＭＣからのＲＡＢ６ＫＩＦＬ反応性ＣＴＬの誘導
ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−８０９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、およびＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−１０−２８４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）ペプチドによる刺激によって、ＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２０１）陽性健常ドナーのＰＢＭＣからＲＡＢ６ＫＩＦＬ特異的ＣＴＬを作製することを試みた。ＨＬＡ−Ａ２陽性健常ドナーからＰＢＭＣを単離し、ＰＢＭＣから分別したＣＤ８^＋ Ｔ細胞を、各ペプチドをパルスした自己単球由来ＤＣと共にインキュベートした。３回刺激した後、ペプチドをパルスしたＴ２細胞に対する細胞傷害活性を、^５１Ｃｒ放出アッセイ（図６Ａ）およびＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（データは示さず）によって調べた。２名の健常ドナーのＰＢＭＣから誘導されたＣＴＬは、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−８０９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、またはＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−１０−２８４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）ペプチドをパルスしたＴ２細胞に対して細胞傷害活性を示したが、無関係のＨＬＡ−Ａ２拘束性ＨＩＶペプチドをパルスした、またはペプチドを負荷しなかったＴ２細胞に対しては細胞傷害活性を示さなかった。他のドナーにおいても同様の応答が認められた（データは示さず）。これらの結果から、これらのＣＴＬがペプチド特異的な細胞傷害性を有したことが示される。

続いて、これらのＣＴＬが、ＲＡＢ６ＫＩＦＬおよびＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２０１）を発現しているヒト癌細胞株を死滅させることができるかどうかを調べた。図６Ｂに示したように、健常ドナーにおいて、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−１２（左）、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−８０９（中央）、またはＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−１０−２８４（右）ペプチドで刺激したＲＡＢ６ＫＩＦＬ反応性ＣＴＬは、ＰＡＮＣ１（ＲＡＢ６ＫＩＦＬ^＋、ＨＬＡ−Ａ２^＋）、ＣａＣｏ−２（ＲＡＢ６ＫＩＦＬ^＋、ＨＬＡ−Ａ２^＋）に対して細胞傷害性を示したが、ＰＫ８（ＲＡＢ６ＫＩＦＬ^＋， ＨＬＡ−Ａ２⁻）に対しては細胞傷害性を示さなかった。

さらに、癌細胞においてこれらのペプチドがＲＡＢ６ＫＩＦＬタンパク質から天然でプロセシングされることを確認するために、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ遺伝子をトランスフェクトしたＳＫＨｅｐ１細胞（ＲＡＢ６ＫＩＦＬ^ｌｏｗ、ＨＬＡ−Ａ２^＋）であるＳＫＨｅｐ１／ＲＡＢ６ＫＩＦＬ細胞（ＲＡＢ６ＫＩＦＬ^ｈｉｇｈ、ＨＬＡ−Ａ２^＋）（図２Ｂ）を標的細胞として使用した。図６Ｃに示したように、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−１２（左）、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−８０９（中央）、およびＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−１０−２８４（右）ペプチドによる刺激によって誘導されたＣＴＬは、ＳＫＨｅｐ１／ＲＡＢ６ＫＩＦＬに対して細胞傷害性を示したが、ＳＫＨｅｐ１／モックに対しては細胞傷害性を示さなかった。これらの結果から、これらのペプチドが天然でプロセシングされ、ＨＬＡ−Ａ２分子と関連して癌細胞の表面上に提示され得ることが示唆される。

誘導されたＣＴＬがＨＬＡクラスＩ拘束性様式で標的細胞を認識したことを確認するために、ＨＬＡクラスＩに対するｍＡｂ（Ｗ６／３２）を用いてＣＴＬによる癌細胞の認識を阻止することにより、ＨＬＡクラスＩブロッキングアッセイを行った（図６Ｄ）。結果として、抗ＨＬＡクラスＩ抗体は、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−１２（左）、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−８０９（中央）、またはＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−１０−２８４（右）ペプチドによる刺激によって作製されたＣＴＬのＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、ＰＡＮＣ１細胞により刺激されるＩＦＮ−γ産生を統計的有意性をもって顕著に阻害することができた（図６Ｄ、Ｐ＜０．０１）。これらの結果は、誘導されたこれらのＣＴＬが、ＨＬＡクラスＩ拘束性様式で、ＲＡＢ６ＫＩＦＬを発現している標的細胞を認識したことを明らかに示している。

考察
実施例に従って、ＲＡＢ６ＫＩＦＬが膵癌の抗癌免疫療法の有望な標的としてのＴＡＡであることが示された。抗癌免疫療法を確立するには、腫瘍細胞では強く発現するが、正常細胞ではそうではないＴＡＡを同定することが重要である。ｃＤＮＡマイクロアレイ解析から、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ ｍＲＮＡが膵癌細胞で過剰発現し（Imai K, Hirata S, Irie A, Senju S, Ikuta Y, Yokomine K, Harao M, Inoue M, Tsunoda T, Nakatsuru S, Nakagawa H, Nakamura Y, et al. Clin Cancer Res 2008;14:6487-95）、それらの正常対応物、ならびに精巣および胸腺を除く多くの正常成人組織ではほとんど発現しないことが示された（図１Ｂ）。加えて、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ遺伝子は、膵癌のほかに肺癌および膀胱癌でも過剰発現した（図１Ｃ）。ＲＴ−ＰＣＲ解析により、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ ｍＲＮＡはいくつかの癌細胞株および膵癌組織では高頻度で発現するが、骨髄を含み精巣を除く成人正常組織ではそうではないことが実証された（図２）。同様に、ウェスタンブロット解析および免疫組織化学解析から、ＲＡＢ６ＫＩＦＬタンパク質は膵癌細胞では検出されるが、それらの正常対応物、および胸腺を含み精巣を除く正常成人組織では検出されないことが明らかになった（図３、４）。これらの知見により、癌精巣様ＴＡＡとしてのＲＡＢ６ＫＩＦＬの特徴がタンパク質レベルで裏付けられる。

抗癌免疫療法の有用な標的としてＴＡＡを同定することに関して、別の重要な点は、癌細胞の増殖、浸潤、転移、および生存に不可欠である抗原を選択することである。最近、Ｔａｎｉｕｃｈｉらは、ＲＡＢ６ＫＩＦＬが、膜輸送（Echard A, et al. Science 1998;279:580-5）およびサイトカイン（Fontijn RD, et al. Mol Cell Biol 2001;21:2944-55、Hill E, Clarke M, Barr FA. EMBO J 2000;19:5711-9）における以前に記載された役割に加えて、膵臓の発癌にも関与することを報告した（Taniuchi K, et al. Cancer Res 2005;65:105-12）。彼らは、低分子干渉ＲＮＡによる膵癌細胞における内因性ＲＡＢ６ＫＩＦＬの下方制御によって、ＲＡＢ６ＫＩＦＬのカーゴタンパク質であるｄｉｓｃ， ｌａｒｇｅ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ５（ＤＬＧ５）との相互作用を介した癌細胞増殖の劇的な減弱が起こることを示し（Taniuchi K, et al. Cancer Res 2005;65:105-12）、ＲＡＢ６ＫＩＦＬがこのようにして膵臓の発癌において重要な役割を果たすように見え、したがって抗癌免疫療法の潜在的に有用な標的であることを示唆した。

ＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープペプチドを同定し、それらの免疫原性を評価することにより、免疫療法の標的としてのＲＡＢ６ＫＩＦＬの可能性を本明細書において検証した。ＨＬＡ−Ａ２（ＨＨＤ）Ｔｇｍを用いる実験から、ＢＩＭＡＳアルゴリズムによりＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２０１）に対する結合親和性を有すると予測された３６種の候補ペプチドをワクチン接種することによって、リンパ球浸潤または組織破壊などの自己免疫現象を引き起こすことなく、ＨＬＡ−Ａ２拘束性マウスＣＴＬの作製を促進することが可能な３種のＨＬＡ−Ａ２拘束性ＲＡＢ６ＫＩＦＬエピトープペプチドが同定された（図５）。さらに、３名の独立した健常ドナーにおいて、これら３種のどのペプチドにより刺激したＰＢＭＣからも、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ反応性ＣＴＬを作製することができた（図６）。これらのＣＴＬは、その同族ペプチドでパルスしたＴ２細胞ばかりでなく、ＲＡＢ６ＫＩＦＬおよびＨＬＡ−Ａ２の両方を発現している癌細胞株もまた死滅させることができた。これらのＣＴＬはヒトＲＡＢ６ＫＩＦＬ遺伝子をトランスフェクトしたＳＫＨｅｐ１細胞に対して細胞傷害性を示したが、モックをトランスフェクトしたＳＫＨｅｐ１に対しては細胞傷害性を示さなかったという知見により、これらのペプチドに対するＣＴＬの抗原特異性が確認された。これらのデータから、これらのＲＡＢ６ＫＩＦＬペプチド（ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−１２、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−８０９、およびＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−１０−２８４）は癌細胞においてＲＡＢ６ＫＩＦＬタンパク質から天然でプロセシングされ、ＨＬＡ−Ａ２分子と共に細胞表面上に提示され、ＣＴＬによって認識されることが示唆される。加えて、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−８０９ペプチドで誘導されたＣＴＬが、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−１２またはＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−１０−２８４ペプチドによる刺激によって誘導されたＣＴＬにより媒介される細胞傷害性と比較して、ＲＡＢ６ＫＩＦＬおよびＨＬＡ−Ａ２の両方を発現している癌細胞に対してより強力な細胞傷害性を示したため、癌細胞においてＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−８０９ペプチドは、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−１２およびＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−１０−２８４ペプチドと比較して、ＲＡＢ６ＫＩＦＬタンパク質からより効率的にプロセシングされ得る可能性がある。

内因性マウスＨ−２^ｂコードクラスＩ分子の発現を欠いているＨＬＡ−Ａ２．１（ＨＨＤ）Ｔｇｍを用いて、ＲＡＢ６ＫＩＦＬのＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬエピトープペプチドを同定した。ＨＬＡ−Ａ２．１（ＨＨＤ）Ｔｇｍは、ペプチドに基づいた免疫療法の前臨床評価の汎用動物モデルであることが報告された（Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008;14:6487-95、Komori H, et al. Clin Cancer Res 2006;12:2689-97、Harao M, et al. Int J Cancer 2008;123:2616-25、Pascolo S, et al. J Exp Med 1997;185:2043-51、Firat H, et al. Eur J Immunol 1999;29:3112-21）。

ＴＡＡのワクチン接種によって誘導される有害作用を回避するために、成人正常組織においてほとんど発現しない標的としてＲＡＢ６ＫＩＦＬを選択した。しかしながら、ＲＡＢ６ＫＩＦＬのワクチン接種が抗癌免疫療法中またはその後のいずれかに自己免疫疾患を誘導することが可能であるかどうかを判定することは非常に重要であった。ここで、３種のエピトープペプチドのうち２種のアミノ酸配列は、ヒトとマウスの間で保存されていない（ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−１２、ヒト：ＬＬＳＤＤＤＶＶＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、マウス：ＬＬＳＤＥＤＶＶＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；ＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−１０−２８４、ヒト：ＡＱＰＤＴＡＰＬＰＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、マウス：ＡＱＰＤＴＶＰＶＳＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２））。したがって、アミノ酸配列がヒトとマウスの間で完全に保存されているＲＡＢ６ＫＩＦＬ−Ａ２−９−８０９ペプチドを２回ワクチン接種した後に、ＨＬＡ−Ａ２ Ｔｇｍにおける自己免疫現象を調べた。ＨＬＡ−Ａ２ Ｔｇｍを使用することの利点の１つは、自己免疫現象の可能性をインビボで調べることができることである。当然のことながら、本明細書において調べた正常組織の数は限られているため、本明細書で調べていないいくつかの正常組織におけるＲＡＢ６ＫＩＦＬの発現の可能性を排除することは不可能である。したがって、癌免疫療法にＲＡＢ６ＫＩＦＬペプチドを使用する場合には、自己免疫疾患の誘導に関して注意しなければならない。

結論として、現在の結果から、ＲＡＢ６ＫＩＦＬが、ＲＡＢ６ＫＩＦＬおよびＨＬＡ−Ａ２の両方を発現している癌細胞に対して反応するＣＴＬを生じさせることができるエピトープペプチドを含むＴＡＡであることが示唆される。ＲＡＢ６ＫＩＦＬは様々なヒト悪性腫瘍において高度に発現するため、ＲＡＢ６ＫＩＦＬは、幅広い悪性腫瘍、特に膵癌の治療のためのペプチドに基づいた免疫療法の有望な標的である。したがって、膵癌患者においてＲＡＢ６ＫＩＦＬ特異的ＣＴＬを誘導する能力に関するさらなる研究が、臨床応用に関する非常な重要な課題として残っている。

産業上の利用可能性
本発明は、強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導し、幅広い癌のタイプに対する適用性を有する新規ＴＡＡ、詳細にはＲＡＢ６ＫＩＦＬ由来の新規ＴＡＡについて記載する。このようなＴＡＡは、ＲＡＢ６ＫＩＦＬに関連した疾患、例えば膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、食道癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膵癌、前立腺癌、腎癌、および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）などの癌に対するペプチドワクチンとしてのさらなる発展を保証する。

本発明はその特定の態様に関して本明細書において詳細に記載されるが、前述の説明は本質的に例示的かつ説明的なものであって、本発明およびその好ましい態様を説明することを意図していることが理解されるべきである。慣行的な実験を通して、当業者は、その境域および境界が添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更および修正がなされ得ることを容易に認識するであろう。

Claims (22)

1. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、３、および５からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、単離されたオリゴペプチド。
2. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、３、および５からなる群より選択されるアミノ酸配列において１個、または２個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなる、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する、オリゴペプチドであって、前記置換が以下の（ａ）および（ｂ）のいずれかまたは両方である、単離されたオリゴペプチド；
   （ａ）Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４および３のアミノ酸配列についてはメチオニンであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列については、ロイシンまたはメチオニンであること、および
   （ｂ）Ｃ末端のアミノ酸がロイシンであること。
3. 薬学的に許容される担体と、請求項１または２記載の１つもしくは複数のオリゴペプチドまたは該オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含む、癌を治療および／もしくは予防するための、ならびに／またはその術後再発を予防するための薬剤。
4. ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である対象に投与するために製剤化されている、請求項３記載の薬剤。
5. 癌が、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、食道癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膵癌、前立腺癌、腎癌、および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）からなる群より選択される、請求項３または４記載の薬剤。
6. ワクチンである、請求項３〜５のいずれか一項記載の薬剤。
7. 請求項１または２記載のオリゴペプチドとＨＬＡ抗原とを含む複合体をその表面上に提示するエキソソーム。
8. ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である、請求項７記載のエキソソーム。
9. 請求項１または２記載のオリゴペプチドを用いることによりインビトロで抗原提示細胞を誘導するための方法。
10. （ａ）抗原提示細胞を、請求項１または２記載のオリゴペプチドとインビトロで接触させる段階、および
    （ｂ）請求項１または２記載のオリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドをインビトロで抗原提示細胞に導入する段階
    からなる群より選択される段階を含む、請求項９記載の方法。
11. 請求項１または２記載のオリゴペプチドを用いることによりインビトロでＣＴＬを誘導するための方法。
12. （ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、請求項１または２記載のオリゴペプチドをその表面上に提示する抗原提示細胞とインビトロで接触させる段階、
    （ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、請求項１または２記載のオリゴペプチドをその表面上に提示するエキソソームとインビトロで接触させる段階、および
    （ｃ）抗原提示細胞表面上の請求項１または２記載のオリゴペプチドとＨＬＡ抗原との複合体に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットを形成することが可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、インビトロでＣＤ８陽性Ｔ細胞に導入する段階
    からなる群より選択される段階を含む、請求項１１記載の方法。
13. 請求項１または２記載のオリゴペプチドを標的とする、単離されたＣＴＬ。
14. 抗原提示細胞表面上の請求項１または２記載のオリゴペプチドとＨＬＡ抗原との複合体に結合することが可能である、請求項１３記載のＣＴＬ。
15. 請求項１または２記載のオリゴペプチドを用いることによって誘導される、単離されたＣＴＬ。
16. 請求項１２記載の方法により誘導される、請求項１５記載のＣＴＬ。
17. ＨＬＡ抗原と請求項１または２記載のオリゴペプチドとの複合体をその表面上に提示する、単離された抗原提示細胞。
18. 請求項９または１０記載の方法により誘導される、請求項１７記載の抗原提示細胞。
19. （ａ）請求項１または２記載の１つもしくは複数のオリゴペプチド；
    （ｂ）請求項１または２記載のオリゴペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド；
    （ｃ）請求項１３〜１６のいずれか一項記載の１つまたは複数の単離されたＣＴＬ；
    （ｄ）請求項１７または１８記載の１つまたは複数の単離された抗原提示細胞
    からなる群より選択される少なくとも１つの有効成分を含む、癌に対する免疫応答を誘導するためのワクチン。
20. 薬学的に許容される担体と、請求項１または２記載の１つもしくは複数のオリゴペプチド、該オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチド、または請求項１７もしくは１８記載の単離された抗原提示細胞とを含む、ＣＴＬを誘導するための薬剤。
21. 癌を治療するための薬学的組成物または薬剤の製造における、
    （ａ）請求項１または２記載の１つまたは複数のオリゴペプチド；
    （ｂ）請求項１または２記載のオリゴペプチドを発現可能な形態でコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド；
    （ｃ）請求項１または２記載のオリゴペプチドを提示する１つまたは複数の抗原提示細胞；および
    （ｄ）抗原提示細胞表面上の請求項１または２記載のオリゴペプチドとＨＬＡ抗原との複合体に結合することが可能である、１つまたは複数のＣＴＬ
    からなる群より選択される有効成分の使用。
22. 請求項１または２記載のオリゴペプチドをコードするポリヌクレオチド。

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