CN102264897A

CN102264897A - Rab6kifl/kif20a表位肽及包含它的疫苗

Info

Publication number: CN102264897A
Application number: CN2009801518246A
Authority: CN
Inventors: 西村泰治; 今井克宪; 中村佑辅; 角田卓也
Original assignee: Oncotherapy Science Inc
Current assignee: Oncotherapy Science Inc
Priority date: 2008-10-22
Filing date: 2009-10-15
Publication date: 2011-11-30
Anticipated expiration: 2029-10-15
Also published as: KR20110074919A; BRPI0919766A2; AR073967A1; UA102274C2; RU2532105C2; ES2541325T3; AU2009305847A1; EP2362906A1; MX2011004176A; IL212046A0; CO6362049A2; SG195571A1; CN104086625A; EP2362906A4; IL212046A; US20150017193A1; HK1157397A1; US20110262471A1; CA2741399C; RU2011120447A

Abstract

本发明提供包含选自SEQ ID NO：3、4和5的氨基酸序列的寡肽。本发明还提供药物组合物，其包含选自SEQ ID NO：3、4和5的氨基酸序列，配制为用于治疗或预防受试者中的癌症。此外，本发明还提供使用这样的寡肽和药剂诱导免疫应答的方法。

Description

RAB6KIFL/KIF20A表位肽及包含它的疫苗

技术领域

优先权

本申请要求2008年10月22日提交的美国临时申请No.61/197,106的权益，通过述及将其全部内容收入本文。

技术领域

本发明涉及生物科学领域，更具体的说是癌症治疗领域。具体而言，本发明涉及新的寡肽和它们的用途。

背景技术

已经证明，CD8阳性CTL可识别主要组织相容性复合物(MHC)I类分子上出现的肿瘤相关抗原(TAA)所衍生的表位肽，然后杀死肿瘤细胞。从TAA的第一个例子——黑素瘤抗原(MAGE)家族被发现起，人们主要通过免疫学手段(NPL 1：Boon T，Int J Cancer 1993May 8，54(2)：177-80；NPL 2：Boon T &van der Bruggen P，J Exp Med 1996 Mar 1，183(3)：725-9)已经发现了许多其它TAA。这些TAA中的一些目前正在作为免疫治疗靶标接受临床开发。

能够诱导强力且特异性的抗肿瘤免疫应答的新TAA的鉴定保证了针对各种类型癌症的肽疫苗接种策略的进一步开发和临床应用(NPL 3：Harris CC，J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16，88(20)：1442-55；NPL 4：Butterfield LH et al.，Cancer Res 1999 Jul 1，59(13)：3134-42；NPL 5：Vissers JL et al.，Cancer Res1999 Nov 1，59(21)：5554-9；NPL 6：van der Burg SH et al.，J Immunol 1996May 1，156(9)：3308-14；NPL 7：Tanaka F et al.，Cancer Res 1997Oct 15，57(20)：4465-8；NPL 8：Fujie T et al.，Int J Cancer 1999 Jan 18，80(2)：169-72；NPL 9：Kikuchi M et al.，Int J Cancer 1999 May 5，81(3)：459-66；NPL 10：Oiso M et al.，Int J Cancer 1999 May 5，81(3)：387-94)。迄今为止，已经有数项使用这些肿瘤相关抗原衍生的肽进行临床试验的报告。不幸的是，迄今为止在这些癌症疫苗试验中只观察到较低的客观应答率(NPL 11：Belli F et al.，J Clin Oncol 2002Oct 15，20(20)：4169-80；NPL 12：Coulie PG et al.，Immunol Rev 2002 Oct，188：33-42；NPL 13：Rosenberg SA et al.，Nat Med 2004 Sep，10(9)：909-15)。

近来，可以使用算法来预计I类HLA结合肽序列(NPL 14：Journal ofImmunological Methods，(1995)，Vol.185，pp.181-190，NPL 15：J.Immunol.，(1994)，Vol.152，pp.163-175，NPL 16：protein science，(2000)，Vol.9，pp.1838-1846)。然而，很难说预计的表位肽能够在靶细胞中被天然地加工并与HLA分子一起表达在靶细胞表面。此外，所说的算法，例如BIMAS(http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)(NPL 17：Parker KC，et al.，(1994)J Immunol.；152(1)：163-75.；NPL 18：Kuzushima K，etal.，(2001)Blood.；98(6)：1872-81.))可以提示HLA分子结合肽，但被提示的肽不太强健(NPL 19：Bachinsky MM，et.al.，Cancer Immun.2005 Mar 22；5：6.)。因此，TAA筛选仍然存在诸多挑战和困难。

胰腺癌的预后不好，总体5年生存率为大约5％(1)。手术切除仍然是长期存活的唯一选项，但具有能手术切除的胰腺癌的患者是少数(9-22％)(NPL 20：Sener S F，et al.J Am Coll Surg 1999；189：1-7.，NPL 21：Eloubeidi M A，et al.AmJ Surg 2006；192：322-9.，NPL 22：Goonetilleke K S，et al.Int J Surg2007；5：147-51.)。然而，即使在这些患者中，即使经过以根治为目的的手术，5年生存率仍为大约20％(NPL 23：Smeenk H G，et al.Langenbecks Arch Surg2005；390：94-103.，NPL 24：Yeo C J，et al.Ann Surg 1995；221：721-31.)。大约80％的患者具有局部晚期或转移疾病，他们的中值生存期为6-9个月不等(NPL 25：Lockhart A C，et al.Gastroenterology 2005；128：1642-54.)。因此，开发新的治疗模态是非常重要的问题，而免疫治疗可能是一种有潜力的胰腺癌治疗方法。

RAB6KIFL(KIF20A)最初被鉴定为通过与Rab6小GTP酶直接相互作用而在高尔基体动力学中发挥作用(NPL 26：Echard A，et al.Science1998；279：580-5.)。RAB6KIFL属于运动蛋白的驱动蛋白超家族，运动蛋白在分子和细胞器的转运中发挥关键功能(NPL 26：Echard A，et al.Science1998；279：580-5.，NPL 27：Hirokawa N，et al.Curr Opin Cell Biol 1998；10：60-73.，NPL 28：Allan VJ，and Schroer TA.Curr Opin Cell Biol 1999；11：476-82.)。近来，Taniguchi K等人报道RAB6KIFL在胰腺癌中过表达(NPL 29：Taniuchi K，et al.Cancer Res 2005；65：105-12.)。他们发现了RAB6KIFL在胰腺癌致癌作用中发挥关键作用的证据。

近来通过利用含有23，040种基因的全基因组cDNA微阵列进行基因表达谱分析证明RAB6KIFL(KIF20A)在数种癌症例如膀胱癌(PTL 1：WO2006/085684)、小细胞肺癌(SCLC)(PTL 2：WO2007/013665)、和激素难治型前列腺癌(HRPC)(PTL 3：WO2008/102906)中上调，上述文献的公开内容通过提述并入本文。此外，还鉴定了KIF20A基因产物的某些表位肽(PTL 4：WO2008/102557)。

引用表

专利文献

[PTL 1]WO2006/085684

[PTL 2]WO2007/013665

[PTL 3]WO2008/102906

[PTL 4]WO2008/102557

非专利文献

[NPL 1]Boon T，Int J Cancer 1993 May 8，54(2)：177-80

[NPL 2]Boon T & van der Bruggen P，J Exp Med 1996 Mar 1，183(3)：725-9

[NPL 3]Harris CC，J Natl Cancer Inst 1996Oct 16，88(20)：1442-55

[NPL 4]Butterfield LH et al.，Cancer Res 1999 Jul 1，59(13)：3134-42

[NPL 5]Vissers JL et al.，Cancer Res 1999 Nov 1，59(21)：5554-9

[NPL 6]van der Burg SH et al.，J Immunol 1996 May 1，156(9)：3308-14

[NPL 7]Tanaka F et al.，Cancer Res 1997 Oct 15，57(20)：4465-8

[NPL 8]Fujie T et al.，Int J Cancer 1999 Jan 18，80(2)：169-72

[NPL 9]Kikuchi M et al.，Int J Cancer 1999 May 5，81(3)：459-66

[NPL 10]Oiso M et al.，Int J Cancer 1999 May 5，81(3)：387-94

[NPL 11]Belli F et al.，J Clin Oncol 2002 Oct 15，20(20)：4169-80

[NPL 12]Coulie PG et al.，Immunol Rev 2002 Oct，188：33-42

[NPL 13]Rosenberg SA et al.，Nat Med 2004 Sep，10(9)：909-15

[NPL 14]Jounal of Immunological Methods，(1995)，Vol.185，pp.181-190

[NPL 15]J.Immunol.，(1994)，Vol.152，pp.163-175

[NPL 16]protein science，(2000)，Vol.9，pp.1838-1846

[NPL 17]Parker KC，et al.，(1994)J Immunol.；152(1)：163-75.

[NPL 18]Kuzushima K，et al.，(2001)B1ood.；98(6)：1872-81.

[NPL 19]Bachinsky MM，et.al.，Cancer Immun.2005 Mar 22；5：6.

[NPL 20]Sener S F，et al.J Am Coll Surg 1999；189：1-7.

[NPL 21]Eloubeidi M A，et al.Am J Surg 2006；192：322-9.

[NPL 22]Goonetilleke K S，et al.Int J Surg 2007；5：147-51.

[NPL 23]Smeenk H G， et al.Langenbecks Arch Surg 2005；390：94-103.

[NPL 24]Yeo C J，et al.Ann Surg 1995；221：721-31.

[NPL 25]Lockhart A C，et al.Gastroenterology 2005；128：1642-54.

[NPL 26]Echard A，et al.Science 1998；279：580-5.

[NPL 27]Hirokawa N，et al.Curr Opin Cell Biol 1998；10：60-73.

[NPL 28]Allan VJ，and Schroer TA.Curr Opin Cell Biol 1999；11：476-82.

[NPL 29]Taniuchi K，et al.Cancer Res 2005；65：105-12.

发明内容

本发明部分地基于新的免疫治疗靶标的发现。由于TAA往往没有免疫原性，合适的靶标的发现是极为重要的。尤其是，本发明以RAB6KIFL(SEQ IDNO：2)为靶标，其由GenBank Accession No.AF153329或CR598555(又以NM 005733(SEQ ID NO：1)表示)的基因编码，因为RAB6KIFL已经被鉴定为在膀胱癌、乳腺癌、胆管细胞癌、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、肾癌和小细胞肺癌(SCLC)等数种癌症中上调。本发明提供含有表位肽的RAB6KIFL基因产物，这些表位肽可引发针对相应分子特异性的强度惊人的CTL应答。使用本发明的肽刺激了从健康供体获得的外周血单个核细胞(PBMC)。本发明还提供特异性地识别用相应的肽冲激过的HLA-A2(A*0201)阳性靶细胞的已建立的CTL，以及能够诱导针对肿瘤上表达的RAB6KIFL的强而特异性的免疫应答的HLA-A2(A*0201)限制性表位肽。这些结果显示RAB6KIFL有强免疫原性，而且它的表位是肿瘤免疫疗法的有效靶标。

因此，本发明的一个目的是提供具有CTL诱导能力以及选自SEQ ID NO：3、4和5的氨基酸序列的寡肽。此外，在本发明的另一个实施方案中，可以替代、删除、插入和/或添加一个、两个或几个氨基酸，只要所得的修饰寡肽保留原始肽的CTL诱导能力。

当被施用于受试者时，本发明的寡肽被呈递于抗原呈递细胞的表面上，然后诱导出靶向相应肽的CTL。因此，本发明的一个目的是提供呈递任何本发明肽的抗原呈递细胞及外来体，以及用于诱导抗原呈递细胞的方法。

通过施用本发明的RAB6KIFL寡肽或编码所述寡肽的多核苷酸，以及呈递RAB6KIFL寡肽的外来体和抗原呈递细胞，诱导出抗肿瘤免疫。因此，本发明的另一个目的是提供含有所述寡肽或编码它们的多核苷酸、以及所述外来体和抗原呈递细胞作为其活性成分的药剂或药物组合物。本发明的药剂或药物组合物可以用作疫苗。

此外，本发明的另一个目的是提供用于治疗和/或预防(即防范)癌症(肿瘤)，和/或防范它们的手术后复发的方法，以及用于诱导CTL的方法、用于诱导抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括施用本发明的RAB6KIFL寡肽、编码RAB6KIFL寡肽的多核苷酸、呈递RAB6KIFL多肽的外来体或抗原呈递细胞，或药剂的步骤。此外，本发明的CTL还可以用作抗癌症疫苗。目标癌症的例子包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、胆管细胞癌、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、肾癌和小细胞肺癌(SCLC)。

应当理解前面的发明内容和下面的详细描述均为示例性的实施方案，并不对本发明或本发明的其他可替代实施方案构成限制。

附图简述

本领域技术人员在考虑了下文的附图简要说明及对本发明及其优选实施方案的详细说明后将清楚地得知本发明的各个方面的应用：

[图1]图1描述了基于cDNA微阵列分析的RAB6KIFL mRNA在胰腺癌组织中显著且频繁地上调的表达。A描述了一系列在胰腺癌细胞中上调的基因。这些基因在癌细胞相比于它们正常的对应物过表达。在所有6例胰腺癌患者中，RAB6KIFL mRNA在胰腺癌细胞中的表达均显著上升。B描述了基于cDNA微阵列分析的RAB6KIFL基因在正常组织中的相对表达比。RAB6KIFL基因仅在睾丸和胸腺中微弱表达。C描绘了RAB6KIFL基因的表达水平不但在胰腺癌中，在许多肺癌和膀胱癌中也上升，基于前面的cDNA微阵列分析。

[图2]图2描绘了在人体正常组织、癌细胞系和癌症组织中表达的RAB6KIFL mRNA的分析。A描绘了利用RT-PCR分析考察多种正常组织中RAB6KIFL mRNA表达的情况。RAB6KIFL mRNA仅在睾丸中有微弱表达。B描绘了在多种癌细胞系中RAB6KIFL表达的RT-PCR分析。C描绘了对胰腺肿瘤组织(T)及它们的正常对应物(N)中RAB6KIFL表达的RT-PCR分析。在8个胰腺癌组织中的5个中检出了RAB6KIFL基因的表达。相比之下，在它们正常的对应物中几乎没有检出表达。

[图3]图3描绘了用Western印迹分析检出的RAB6KIFL蛋白胰腺癌特异性过表达。A描绘了RAB6KIFL在8种正常组织中没有检出，而睾丸呈现一条微弱条带，其迁移率与PANC1细胞裂解物中观察到的相似。B描绘了在两名胰腺癌患者中，RAB6KIFL蛋白在癌症组织(T)但不在临近的正常组织(N)中被检出。还进行了抗β-肌动蛋白印迹以监控相同的蛋白上样量。

[图4]图4描绘了胰腺癌(A)与多种正常组织(B)中RAB6KIFL蛋白的免疫组织化学分析。A描绘了在9例中的6例中，RAB6KIFL的强染色主要在癌细胞的胞质和核处观察到，而在腺泡细胞及其正常的邻近胰组织的正常上皮导管细胞中观察到非常弱的染色。在腹膜的转移灶中观察到相似的强染色。肿瘤形成性胰腺炎(tumor-forming pancreatitis)中几乎观察不到染色。B描绘了RAB6KIFL在正常的脑、肺、肝、肾、胃、小肠、结肠、脾、骨骼肌、皮肤和胸腺中没有染色。在睾丸中观察到可能的弱染色。强染色信号以棕色显示。定标线表示100微米。

[图5]图5描绘了使用HLA-A2.1(HHD)转基因小鼠(Tgm)HLA-A2限制性的小鼠CTL表位的鉴定。A描绘了在第7天和第14天用5x 10⁵个经冲激的同基因BM-DC体内免疫HLA-A2.1(HHD)转基因小鼠，所述冲激是用选自36种候选肽中的2种肽的混合物共12组进行冲激。在第21天，对来自经免疫的小鼠的CD4-脾细胞，用经过每种肽冲激的BM-DC进行刺激，历时6天。用ELISPOT测定系统检测CTL产生的IFN-γ。RAB6KIFL-A2-9-12(SEQID NO：3)、RAB6KIFL-A2-9-809(SEQ ID NO：4)和RAB6KIFL-A2-10-284(SEQ ID NO：5)肽显示出可以诱导对肽有反应性的CTL。这些测定进行了两次，得到了同样结果。B描绘了在经RAB6KIFL-A2-9-809免疫的HLA-A2(HHD)转基因小鼠的组织样本中用抗CD4或抗CD8单抗进行的免疫组织化学染色。两次免疫后，切出这些样本并进行分析。

[图6A-B]图6描绘了从来自HLA-A2阳性供体的PBMC诱导RAB6KIFL特异性的人CTL。A描绘了从HLA-A2阳性的健康供体的PBMC生成了RAB6KIFL肽反应性CTL。用经RAB6KIFL-A2-9-12(SEQ ID NO：3)，RAB6KIFL-A2-9-809(SEQ ID NO：4)和RAB6KIFL-A2-10-284(SEQ ID NO：5)肽冲激过的源自自体单核细胞的DC刺激三次后，用标准⁵¹Cr释放测定检测了CTL针对经每种肽冲激的T2细胞(HLA-A2+，TAP缺陷)或未经肽冲激的T2细胞的细胞毒性。这些CTL针对RAB6KIFL-A2-9-12(左)，RAB6KIFL-A2-9-809(中)，和RAB6KIFL-A2-10-284(右)肽冲激过的T2细胞显示出细胞毒性，但对用无关的HIV肽冲激或未用肽冲激的T2细胞不显示细胞毒性。B描绘了这些CTL对RAB6KIFL⁺HLA-A2(A*0201)⁺的人胰腺癌细胞系PANC1和结肠癌细胞系CaCo-2显示细胞毒性，但不对RAB6KIFL⁺HLA-A2(A*0201)-的人胰腺癌细胞系PK8显示细胞毒性。

[图6C-D]C描绘了这些CTL的细胞毒性是RAB6KIFL特异性的。这些CTL杀死了SKHep1/RAB6KIFL，即用人RAB6KIFL基因转染过的RAB6KIFL^低HLA-A2+人肝癌细胞系SKHep1，但未杀死SKHep1/模拟。D描绘了抗-I类HLA单抗对细胞毒性的抑制。靶细胞PANC1分别与抗-I类HLA单抗(W6/32，IgG_2a)或抗HLA-DR单抗(H-DR-1，IgG_2a)温育1小时后，加入用RAB6KIFL-A2-9-12(上)，RAB6KIFL-A2-9-809(中)、RAB6KIFL-A2-10-284(下)刺激来自健康供体的PBMC而生成的CTL。IFN-γ的产生被W6/32而不被H-DR-1显著抑制。

实施方案的描述

现在描述优选的方法、装置、和材料，不过在实施或检验本发明的实施方案时可使用与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料。然而，在描述本发明材料和方法之前，要理解本发明不限于特定大小、性状、尺度、材料、方法、方案等，因为它们可因循例行实验和优化而变化。还要理解，所述描述中使用的术语只是出于描述特定样式或实施方案的目的，而非意图限制本发明的范围，本发明的范围只会由所附权利要求来限制。

通过提述明确地将本说明书中提到的每一篇出版物、专利或专利申请的公开文本完整收入本文。然而，本文中无一处可解释为承认本发明没有资格凭借发明在先而早于此类公开文本。

如果有冲突，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实例仅为举例说明而不构成限制。

I.定义

如本文中使用的，词语“一个/种”、“该”、和“所述”意味着“至少一个/种”，除非另有明确说明。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是经过修饰的残基或非天然存在型残基(诸如相应的天然存在型氨基酸的人工化学模拟物)的氨基酸聚合物，以及天然存在型氨基酸聚合物。

如本说明书中有时使用的，术语“寡肽”用于指长度为20个残基或更少，典型地为15个残基或更少的本发明的肽，通常由约8个-约11个残基，经常为9个或10个残基组成。

如本文中使用的，术语“氨基酸”指天然存在型和合成型氨基酸，以及与天然存在型氨基酸相似地发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在型氨基酸指由遗传密码编码的氨基酸，以及在细胞中在翻译后被修饰的氨基酸(例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、和O-磷酸丝氨酸)。短语“氨基酸类似物”指与天然存在型氨基酸具有相同的基础化学结构(α碳与氢、羧基、氨基、和R基团结合)但具有经过修饰的R基团或经过修饰的主链的化合物(例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍)。短语“氨基酸模拟物”指与具有与一般氨基酸不同的结构但发挥与一般氨基酸相似的功能的化学化合物。

氨基酸在本文中可以通过它们公知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来指称。

术语“基因”、“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”在本文中除非另有明确说明可互换使用，而且与氨基酸类似地通过它们普遍接受的单字母代码来指称。

除非另有定义，术语“癌症”指过表达RAB6KIFL基因的癌症，过表达RAB6KIFL的癌症的实例包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、胆管细胞癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、前列腺癌、肾癌和小细胞肺癌(SCLC)。

除非另有定义，术语“细胞毒性T淋巴细胞”、“细胞毒性T细胞”和“CTL”在本文中可互换使用，而且除非另有明确说明，指能够识别非自身细胞(例如肿瘤细胞、病毒感染的细胞)并诱导此类细胞死亡的T淋巴细胞亚群。

除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员的普遍理解相同的含义。

II肽

为了证明衍生自RAB6KIFL的肽发挥被细胞毒性T淋巴细胞(CTL)所识别的抗原的功能，对衍生自RAB6KIFL(SEQ ID NO：2)的肽进行了分析以确定它们是否为HLA-A2(A*0201)限制性的抗原表位，HLA-A2(A*0201)是经常遇到的HLA等位基因(Date Y et al.，Tissue Antigens 47：93-101，1996；KondoA et al.，J Immunol 155：4307-12，1995；Kubo RT et al.，J Immunol 152：3913-24，1994)。利用关于它们对HLA-A2的结合亲和力的信息，鉴定了衍生自RAB6KIFL的HLA-A2结合肽的候选者。用加载了这些肽的树突细胞(DC)体外刺激T细胞后，使用每个肽，尤其是下述肽，成功地建立了CTL：

RAB6KIFL-A2-9-12(SEQ ID NO：3)，

RAB6KIFL-A2-9-809(SEQ ID NO：4)，

和

RAB6KIFL-A2-10-284(SEQ ID NO：5)。

这些建立的CTL针对经相应肽冲激的靶细胞显示强且特异性的CTL活性。本文中的这些结果证明RAB6KIFL是被CTL识别的抗原，且这些肽可能是RAB6KIFL的受HLA-A2(A*0201)限制的表位肽。

由于RAB6KIFL基因在大多数癌症组织中过表达，例如膀胱癌、乳腺癌、胆管细胞癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、前列腺癌、肾癌和小细胞肺癌(SCLC)，它是良好的免疫治疗靶标。因此，本发明提供对应于RAB6KIFL的被CTL识别的表位的寡肽，诸如九肽(由九个氨基酸残基组成的肽)和十肽(由十个氨基酸残基组成的肽)。本发明的寡肽的特别优选例子包括那些具有选自SEQ ID NO：3、4和5的氨基酸序列的肽。

一般而言，目前可以通过互联网访问的软件程序，如Parker KC et al.，JImmunol 1994 Jan 1，152(1)：163-75等中描述的那些，可以用来在计算机上计算不同肽与HLA抗原之间的结合亲和力。与HLA抗原的结合亲和力可以按照例如Parker KC et al.，J Immunol 1994Jan 1，152(1)：163-75和Kuzushima K etal.，Blood 2001，98(6)：1872-81中描述的那样进行测定。用于测定结合亲和力的方法在例如Journal of Immunological Methods，1995，185：181-190.；ProteinScience，2000，9：1838-1846中有描述。因此，本发明涵盖通过这些已知程序被确定为可与HLA抗原结合的RAB6KIFL的肽。

此外，本发明的这些肽的侧翼可以具有额外的氨基酸残基，只要所述肽保持其CTL诱导能力即可。这样的具有CTL诱导能力的肽为，例如，少于约40个氨基酸，经常少于约20个氨基酸，通常少于约15个氨基酸。由选自SEQID NO：3、4和5的氨基酸序列组成的肽的侧翼的氨基酸序列没有限制，可以由任何种类的氨基酸构成，只要其不损害原来的肽的CTL诱导能力。因此，本发明还提供具有CTL诱导能力的肽，其包含选自SEQ ID NO：3、4和5的氨基酸序列。

一般而言，蛋白质中一个、两个、或更多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能，或者在有些情况下甚至会增强原始蛋白质的期望功能。事实上，已知有经过修饰的肽(即由与原始参照序列相比其中修饰(即替代、删除、添加和/或插入)一个、两个或数个氨基酸残基的氨基酸序列构成的肽)保留原始肽的生物学活性(Mark et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1984，81：5662-6；Zoller and Smith，Nucleic Acids Res 1982，10：6487-500；Dalbadie-McFarland etal.，Proc Natl Acad Sci USA 1982，79：6409-13)。因此，在一个实施方案中，本发明的寡肽可既具有CTL诱导能力，又具有选自SEQ ID NO：3、4和5的氨基酸序列中添加、插入、删除、和/或替代一个、两个或甚至更多个氨基酸而得到的氨基酸序列。

本领域技术人员认可，改变氨基酸序列中的单个氨基酸或少数百分比氨基酸的个别添加或替换往往会导致原始氨基酸侧链的特性得以保留。因此，它们常规上称作“保守替代”或“保守修饰”，其中对蛋白质的改变导致具有与原始蛋白质类似的性质和功能的修饰蛋白质。提供功能上相似的氨基酸的保守替代表是本领域公知的。期望保留的氨基酸侧链特征的例子包括例如疏水性氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)、亲水性氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G， H，K，S，T)、和具有下面的共同官能团或特征的侧链：脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P)；含羟基侧链(S，T，Y)；含硫原子侧链(C，M)；含羧酸和酰胺侧链(D，N，E，Q)；含碱侧链(R，K，H)；和含芳香族侧链(H，F，Y，W)。另外，下面的八组各自含有本领域公认互为保守替代的氨基酸：

1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；

2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；

6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；

7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和

8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton，Proteins 1984)。

此类保守修饰肽也被视为本发明的肽。然而，本发明的肽不限于此，可包括非保守修饰，只要该肽保留原始肽的CTL诱导能力。另外，经过修饰的肽不应排除RAB6KIFL的多态变体、种间同源物、和等位基因中的可诱导CTL的肽。

为了保持所需的CTL诱导能力，可以修饰(添加或替换)少数(例如，1个、2个或数个)或小百分比的氨基酸。这里，术语“数个”意指5个以下的氨基酸，如3个以下。要被修饰的氨基酸的百分比可以为20％以下，例如15％以下，例如10％或1-5％。

当在免疫疗法的语境中使用时，本发明的肽应呈递在细胞或外来体的表面上，优选作为与HLA抗原的复合物。因此，优选选择不仅诱导CTL而且拥有对HLA抗原的高结合亲和力的肽。为此，可通过替代、插入、删除和/或添加氨基酸残基来对肽进行修饰，产生具有改良的结合亲和力的修饰肽。除了天然被展示的肽之外，由于已经知道通过结合HLA抗原而被展示的肽的序列规律(J Immunol 1994，152：3913；Immunogenetics 1995，41：178；J Immunol1994，155：4307)，可将基于此类规律的修饰引入本发明的免疫原性肽。例如，具有高的HLA-A2(A*0201)结合亲和力的肽的自N端起的第二个氨基酸被替代为亮氨酸或甲硫氨酸，以及C末端氨基酸被替代为缬氨酸或亮氨酸的肽。因此，具有SEQ ID NO：3、4或5的氨基酸序列，其中自N端起的第二个氨基酸被替换为亮氨酸或甲硫氨酸和/或其中C端被替换为缬氨酸或亮氨酸的肽涵盖在本发明之内。不仅可以在肽的末端氨基酸处引入替代，而且可以在潜在TCR识别位置处引入替代。数项研究证明了肽中的氨基酸替代可等同于或好于原来，例如CAP1、p53_(264-272)、Her-2/neu_(369-377)或gp100_(209-217)(Zarembaet al.Cancer Res.57，4570-4577，1997，T.K.Hoffmann et al.J Immunol.(2002)Feb 1；168(3)：1338-47.，S.O.Dionne et al.Cancer Immunol immunother.(2003)52：199-206及S.O.Dionne et al.Cancer Immunology，Immunotherapy(2004)53，307-314)。

本发明还考虑向本文中公开的序列添加氨基酸。例如，还可以向本发明的肽的N和/或C端添加一个、两个或数个氨基酸。此类具有高HLA抗原结合亲和力且保留CTL诱导能力的修饰肽也包含在本发明之内。

然而，当肽序列与具有不同功能的内源或外源蛋白质的氨基酸序列的一部分相同时，可能诱导副作用，诸如自身免疫性病症和/或针对特定物质的变应性症状。因此，优选的是，首先利用可得的数据库实施同源性搜索，以避免肽的序列与另一种蛋白质的氨基酸序列匹配的情况。当根据同源性搜索清楚了即使与目标肽相比差1个或2个氨基酸的肽亦不存在时，可以修饰目标肽以提高其与HLA抗原的结合亲和力，和/或提高其CTL诱导能力，而没有任何发生此类副作用的危险。

虽然预期如上所述的对HLA抗原具有高结合亲和力的肽是高度有效的，但还是对根据高结合亲和力的存在为指标选出的候选肽检查了CTL诱导能力的存在。这里，短语“CTL诱导能力”指肽被呈递到抗原呈递细胞上时诱导细胞毒性淋巴细胞(CTL)的能力。另外，“CTL诱导能力”包括肽诱导CTL活化、CTL增殖、促进CTL溶解靶细胞、和提高CTL IFN-γ生成的能力。

CTL诱导能力的确认如下来实现，诱导携带人MHC抗原的抗原呈递细胞(例如B-淋巴细胞、巨噬细胞、和树突细胞(DC))，或者更具体地说，衍生自人外周血单核白细胞的DC，并且在用肽诱导后，与CD8阳性细胞混合，然后测量由CTL针对靶细胞生成和释放的IFN-γ。作为反应系统，可使用已经制成的表达人HLA抗原的转基因动物(例如BenMohamed L，Krishnan R，LongmateJ，Auge C，Low L，Primus J，Diamond DJ，Hum Immunol 2000Aug，61(8)：764-79，Related Articles，Books，Linkout Induction of CTL response by aminimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR 1transgenic mice：dependence onHLA class II restricted T(H)response中描述的那些)。例如，可以用⁵¹Cr等放射性标记靶细胞，并且可以自靶细胞释放的放射性计算细胞毒性活性。或者，CTL诱导能力可以如下评估：测量在携带固定化肽的抗原呈递细胞(APC)存在下由CTL生成和释放的IFN-γ，并使用抗IFN-γ单克隆抗体显现培养基上的抑制区。

作为如上所述检查肽的CTL诱导能力的结果，发现具有高的HLA抗原结合亲和力的肽不一定具有高的CTL诱导能力。然而，在被鉴定和评估的那些肽中，选自具有如SEQ ID NO：3、4和5所示的氨基酸序列的肽的九肽或十肽被发现不但具有对HLA抗原的高亲和力，还具有特别高的CTL诱导能力。因此，例举这些肽为本发明优选的实施方案。

除上文所述修饰之外，还可将本发明的肽连接至其它物质，只要所得的连接肽保留原始肽的必需的CTL诱导能力。合适物质的例子包括但不限于：肽、脂质、糖和糖链、乙酰基、天然的和合成的聚合物、等。肽可含有修饰，诸如糖基化、侧链氧化、或磷酸化等，前提是该修饰不破坏原始肽的生物学活性。可实施这些种类的修饰以赋予额外的功能(例如靶向功能和投递功能)或使多肽稳定。

例如，为了提高多肽的体内稳定性，本领域已知引入D-氨基酸、氨基酸模拟物或非天然氨基酸；此构思也可适用于本发明多肽。可以以多种方式测定多肽的稳定性。例如，可使用肽酶和各种生物学介质(诸如人血浆和血清)来测试稳定性(参见例如Verhoef et al.，Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986，11：291-302)。

此外，本发明的肽可以藉由接头(linker)或间隔物(spacers)与其他的肽相连。所述其他的肽的例子包括但不限于从其他TAA衍生的能诱导CTL的肽。或者，两个或更多个本发明的肽可以藉由接头或间隔物连接起来。这些由接头或间隔物连接起来的肽可以是彼此相同或不同的。接头或间隔物没有特殊限制，但优选的是肽，更优选的是具有一个或多个能够被酶(如肽酶、蛋白酶和蛋白酶体等)切割的切割位点的肽。接头或间隔物的例子包括但不限于：AAY(P.M.Daftarian et al.，J Trans Med 2007，5：26)，AAA，NKRK(R.P.M.Sutmuller et al.，J Immunol.2000，165：7308-7315)或一个到数个赖氨酸残基(S.Ota et al.，Can Res.62，1471-1476，K.S.Kawamura et al.，J Immunol.2002，168：5709-5715)。本发明的肽涵盖那些肽藉由间隔物或接头与其他的肽相连而成的肽。

本文中，本发明的肽也可以记为“RAB6KIFL肽”、“RAB6KIFL多肽”或“RAB6KIFL寡肽”。

III.RAB6KIFL肽的制备

本发明的肽可使用公知技术来制备。例如，肽可以通过合成、使用重组DNA技术或化学合成来制备。本发明的肽可个别地合成，或合成为由两个或更多个肽构成的较长多肽。然后可以分离，即纯化或分离所述肽，使其基本上不含其它天然存在的宿主细胞蛋白质及其片段或任何其它化学物质。

可以根据选定的氨基酸序列，借助化学合成来获得本发明的肽。可适用于合成的常规肽合成法的例子包括但不限于：

(i)Peptide Synthesis，Interscience，New York，1966；

(ii)The Proteins，Vol.2，Academic Press，New York，1976；

(iii)Peptide Synthesis(日文)，Maruzen Co.，1975；

(iv)Basics and Experiment of Peptide Synthesis(日文)，Maruzen Co.，1985；

(v)Development of Pharmaceuticals(second volume)(in Japanese)，Vol.14(peptide synthesis)，Hirokawa，1991；

(vi)WO99/67288；和

(vii)Barany G. & Merrifield R.B.，Peptides Vol.2，″Solid Phase PeptideSynthesis″，Academic Press，New York，1980，100-118。

或者，可应用任何已知的遗传工程肽生产方法来获得本发明的肽(例如Morrison J，J Bacteriology 1977，132：349-51；Clark-Curtiss & Curtiss，Methodsin Enzymology(eds.Wu et al.)1983，101：347-62)。例如，首先，制备包含处于可表达形式(例如处于相当于启动子序列的调节序列下游)的编码目标肽的多核苷酸的合适载体，并转移入合适宿主细胞。然后培养宿主细胞以生成感兴趣的肽。也可以采用体外翻译系统在体外生产肽。

IV多核苷酸

本发明还提供编码任何上述本发明肽的多核苷酸。这些包括由天然存在型RAB6KIFL/KIF20A基因(GenBank Accession No.NM 005733(SEQ ID NO：1))衍生的多核苷酸以及具有它们的经过保守修饰的核苷酸序列的多核苷酸。在本文中，短语“经过保守修饰的核苷酸序列”指编码相同或本质上相同的氨基酸序列的序列。由于遗传密码的简并性，对于任何给定蛋白质都有极其多种功能上相同的核酸来编码它。例如，密码子GCA、GCC、GCG、和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子规定为丙氨酸的任何位置处，该密码子可改变成任何相应所述密码子，而不改变所编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，是保守修饰变异的一种。本文中编码肽的每一种核酸序列也涵盖该核酸的每一种可能的沉默变异。本领域普通技术人员会认识到，可以修饰核酸中的每一个密码子(AUG和TGG除外，AUG在正常情况下是甲硫氨酸的唯一密码子，而TGG在正常情况下是色氨酸的唯一密码子)以产生功能上相同的分子。因而，每一种所公开的序列隐含涵盖了编码肽的核酸的每一种沉默变异。

本发明的多核苷酸可以由DNA、RNA、及其衍生物构成。DNA由碱基诸如A、T、C、和G合适地构成，而T在RNA中被U替换。

本发明的多核苷酸可编码多个本发明肽，其中它们之间有或无居间氨基酸序列存在。例如，居间氨基酸序列可提供多核苷酸的或所翻译的肽的切割位点(例如酶识别序列)。另外，多核苷酸除编码本发明肽的编码序列以外还可包括任何额外的序列。例如，多核苷酸可以是包括表达肽所需要的调节序列的重组多核苷酸，或者可以是具有标志基因等等的表达载体(质粒)。一般而言，此类重组多核苷酸可通过常规重组技术操作多核苷酸来制备，例如通过使用聚合酶和内切核酸酶。

重组和化学合成技术都可用来生成本发明的多核苷酸。例如，可以通过插入在转染入感受态细胞后能表达的适宜载体来生成多核苷酸。或者，可借助PCR技术或通过在合适宿主中的表达来扩增多核苷酸(参见例如Sambrooket al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1989)。或者，可使用固相技术来合成多核苷酸，如Beaucage SL &Iyer RP，Tetrahedron 1992，48：2223-311；Matthes et al.，EMBO J 1984，3：801-5中记载的。

含有本发明的多核苷酸的载体以及携带所述载体的宿主细胞也包含在本发明之内。

V.外来体(exosomes)

本发明进一步提供了称作外来体的细胞内囊泡，这些外来体在它们的表面上呈递本发明肽与HLA抗原之间形成的复合体。外来体可以通过，例如在日本专利申请公表公报平11-510507和WO99/03499中详细描述的方法来制备，并可以用从治疗和/或预防所针对的患者获得的APC制备。本发明的外来体可以作为疫苗以与本发明的肽相似的方式进行接种。

复合体中包含的HLA抗原的类型必须与需要治疗和/或预防的受试者的类型匹配。使用在日本人和白种人中高表达的HLA-A2型有利于获得有效的结果，且可以使用HLA-A2(A*0201)和HLA-A2(A*0206)等亚型。典型的，在临床上，预先考察需要治疗的患者的HLA抗原类型，这样就能够合适地选择对这种抗原具有高水平的结合亲和力、或者具有藉由抗原呈递的CTL诱导能力的肽。此外，为了获得显示高结合亲和力和CTL诱导能力的肽，可以在天然存在的RAB6KIFL部分肽的氨基酸序列的基础上进行1个、2个或几个氨基酸的取代或者添加。

当本发明的外来体使用HLA-A2(A*0201)抗原时，具有从SEQ ID NO：3、4和5选出的肽序列的肽是有用的。

VI.抗原呈递细胞(APC)

本发明还提供在其表面上呈递在HLA抗原与本发明肽之间形成的复合物的分离的APC。通过接触本发明的肽或导入处于可表达形式的编码本发明肽的核苷酸而获得的APC可衍生自要进行治疗和/或预防的患者，而且可作为疫苗以它们自身或与其它药物(包括本发明的肽、外来体、或细胞毒性T细胞)组合来施用。

APC不限于特定种类的细胞，包括树突细胞(DC)、Langerhans细胞、巨噬细胞、B细胞、和活化的T细胞，已知它们在它们的细胞表面上呈递蛋白质性质的抗原，从而被淋巴细胞识别。由于DC是APC中具有最强CTL诱导作用的代表性APC，DC可以用作本发明的APC。

例如，可通过自外周血单核细胞诱导DC，然后在体外、离体或在体内用本发明的肽接触(刺激)它们来获得APC。当对受试者施用本发明的肽时，在受试者的身体中诱导出呈递本发明肽的APC。短语“诱导APC”包括用本发明的肽或编码本发明肽的核苷酸接触(刺激)细胞，以在细胞的表面上呈递在HLA抗原与本发明肽之间形成的复合物。或者，在将本发明的肽给予APC以容许APC呈递该肽后，可以将这些APC作为疫苗施用给受试者。例如，离体施用可包括下述步骤：

a：自受试者收集APC；

b：使肽接触步骤a的APC；并

c：对第二受试者施用加载了所述肽的APC。

第一受试者和第二受试者可以是同一个体，或者可以是不同个体。或者，依照本发明，提供本发明的肽在制备用于诱导抗原呈递细胞的药物组合物中的用途。另外，本发明提供一种制备用于诱导抗原呈递细胞的药物组合物的方法或工艺，其中所述方法包括将本发明的肽与药学可接受的载体混合或配制的步骤。或者，本发明提供用于制备用于治疗癌症，包括膀胱癌、乳腺癌、胆管细胞癌、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、前列腺癌、肾癌和小细胞肺癌(SCLC)的药物组合物的方法，其中该方法包括将本发明的肽与药学可接受的载体混合或配制的步骤。另外，本发明还提供用于诱导抗原呈递细胞的本发明肽。通过步骤b获得的APC可作为疫苗施用于受试者。通过步骤b获得的肽可以作为疫苗施用给受试者。或者，本发明提供用于治疗癌症的肽，所述癌症包括膀胱癌、乳腺癌、胆管细胞癌、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、前列腺癌、肾癌和小细胞肺癌(SCLC)。

依照本发明的一个方面，本发明的APC具有高水平的CTL诱导能力。在术语“高水平的CTL诱导能力”中，高水平是相对于未与肽接触或与不能诱导CTL的肽接触的APC的该水平而言的。这样的具有高水平CTL诱导能力的APC可通过下述方法来制备，该方法包括在体外将含有编码本发明肽的多核苷酸的基因转移至APC的步骤。所导入的基因可以是DNA或RNA的形式。用于进行导入的方法的例子包括但不具体限于本领域中常规实施的各种方法，诸如可使用脂质体转染、电穿孔、和磷酸钙法。更具体的说，可以如CancerRes 1996，56：5672-7；J Immunol 1998，161：5607-13；J Exp Med 1996，184：465-72；国际公开文本No.2000-509281的已公开日文翻译中所述来实施。通过将基因转移入APC，基因在细胞中经历转录、翻译、等等，然后得到的蛋白质被MHC I类或II类加工，并经由呈递途径呈递给本发明的肽。

在一个优选的实施方案中，本发明的APC在其表面上呈递HLA抗原与包含选自SEQ ID NO：3、4和5的氨基酸序列的寡肽的复合物。优选地，本发明的APC在其表面上携带HLA-A2抗原，特别是HLA-A2(A*0201)。或者，将与HLA抗原形成复合物的寡肽可以是这样的寡肽，其包含选自SEQ ID NO：3、4和5的氨基酸序列中替代、插入、删去和/或添加了一个、两个或者几个氨基酸残基，例如从N端起的第二个氨基酸可替换为亮氨酸或甲硫氨酸，和/或C端的氨基酸可以替换为缬氨酸或亮氨酸，而得到的氨基酸序列。

VII.细胞毒性T细胞(CTL)

被诱导的针对任何本发明肽的细胞毒性T细胞可在体内加强靶向肿瘤相关内皮的免疫应答，并且因此可以以与肽本身相似的方式用作疫苗。因此，本发明还提供由任何本发明肽特异性诱导或活化的、分离的细胞毒性T细胞。

此类细胞毒性T细胞可通过下述步骤来获得：(1)对受试者施用本发明的肽然后从该受试者收集细胞毒性T细胞，或(2)在体外用本发明的肽接触(刺激)受试者衍生的APC和CD8阳性细胞、或外周血单核白细胞，然后分离细胞毒性T细胞。

可以从要进行治疗和/或预防的患者获取在来自呈递本发明肽的APC的刺激下诱导出的细胞毒性T细胞，而且可以将它们单独施用，或者与其它药物(包括本发明的肽或外来体)组合施用以调节效果。所得到的细胞毒性T细胞特异性针对呈递本发明的肽或例如与用于诱导的肽相同的肽的靶细胞起作用。换言之，细胞毒性T细胞可以通过T细胞受体来识别(即结合)靶细胞表面上的HLA抗原与本发明肽之间形成的复合物，然后攻击该靶细胞以诱导该靶细胞死亡。靶细胞可以是内源表达RAB6KIFL的细胞，或被RAB6KIFL基因转染的细胞；而且因肽的刺激而在细胞表面上呈递本发明肽的细胞也可充当活化CTL攻击的靶标。在优选的实施方案中，靶细胞在其表面上携带HLA-A2抗原，尤其是HLA-A2(A*020)。

VIII T细胞受体(TCR)

本发明还提供包含编码能够形成T细胞受体(TCR)的亚单位的多肽的核酸序列的多核苷酸，及使用该组合物的方法。TCRα和β具有形成赋予T细胞针对表达RAB6KIFL的肿瘤细胞的特异性的TCR的能力。通过使用本领域已知的方法，可鉴定出用一种或多种本发明的肽诱导的CTL中表达的TCR的α和β链的核酸序列，并用来构建能够介导对原代人淋巴细胞的高效率基因转移的合适载体(WO2007/032255及Morgan et al.，J Immunol，171，3288(2003))。例如，这些载体是逆转录病毒载体。有利的是，本发明提供一种即配即用型(off-the-shelf)组合物，其容许快速修饰患者自己的T细胞(或其他哺乳动物的T细胞)以快速且容易地生成具有卓越的癌细胞杀伤特性的修饰型T细胞。

此外，本发明提供通过用编码在HLA-A2(A*0201)的背景下结合RAB6KIFL肽，如SEQ ID NO：3、4和5的TCR亚单位的核酸转导而制备的CTL。经过转导的CTL在体内能够归巢(homing)到癌细胞，并且可以利用公知的培养方法体外扩增(例如Kawakami et al.，J Immunol.，142，3452-3461(1989))。可以利用本发明的T细胞来形成免疫原性组合物，所述组合物可以用来在需要治疗或保护的患者中治疗或预防癌症(WO2006/031221)。

IX.药剂或药物组合物

术语“预防”和“防范”在本文中可互换使用，指降低来自疾病的死亡率或发病率负担的任何活动。预防和防范可发生于“一级、二级和三级预防水平”。一级预防和防范避免疾病的发生，而二级和三级预防和防范水平涵盖旨在预防和防范疾病进展和症状出现以及降低已建立的疾病的负面影响的活动，这通过恢复功能和减轻疾病相关并发症来实现。或者，预防和防范可包括广泛的预防疗法，它们旨在减轻特定病症的严重性，例如降低肿瘤的增殖和转移。

治疗和/或预防癌症或肿瘤，和/或预防其手术后复发包括任何下述步骤，诸如手术清除癌细胞、抑制癌性细胞生长、肿瘤衰退或消退、诱导癌症减退和遏制癌症发生、肿瘤消退、及降低或抑制转移。癌症的有效治疗和/或预防降低患癌个体的死亡率并改善其预后，降低血液中肿瘤标志物的水平，及减轻伴随癌症的可检测症状。例如，症状的减轻或改善构成有效治疗和/或预防包括10％、20％、30％或更多降低，或病情稳定。

由于RAB6KIFL表达在数种癌症中与正常组织相比上调，本发明的肽或编码所述肽的多核苷酸可用于治疗和/或预防癌症，和/或预防它们的手术后复发。因此，本发明提供用于治疗和/或预防癌症，和/或预防它们的手术后复发的药剂或药物组合物，其包括一种或多种本发明肽或编码所述肽的多核苷酸作为活性组分。或者，可以在任何上述外来体或细胞诸如APC的表面上表达本发明的肽，以用作药剂或药物组合物。另外，上述靶向任何本发明的肽的细胞毒性T细胞也可用作本发明药剂或药物组合物的活性组分。在本发明的语境中，短语“靶向某个肽”是指通过T细胞受体识别(即结合)靶细胞上的HLA抗原与肽之间形成的复合物，然后攻击该靶细胞以诱导该靶细胞的死亡。

在另一个实施方案中，本发明还提供选自下组的活性组分在制备用于治疗癌症的药物组合物或药剂中的用途：

(a)本发明的肽，

(b)处于可表达形式的编码如本文中公开的肽的核酸，

(c)本发明的APC，和

(d)本发明的细胞毒性T细胞。

或者，本发明进一步提供用于治疗癌症的选自下组的活性组分：

(a)本发明的肽，

(b)处于可表达形式的编码如本文中公开的肽的核酸，

(c)本发明的APC，和

(d)本发明的细胞毒性T细胞。

或者，本发明进一步提供一种制备用于治疗癌症的药物组合物或药剂的方法或工艺，其中该方法或工艺包括配制药学或生理学可接受载体与选自下组的活性组分作为活性组分的步骤：

(a)本发明的肽，

(b)处于可表达形式的编码如本文中公开的肽的核酸，

(c)本发明的APC，和

(d)本发明的细胞毒性T细胞。

在另一个实施方案中，本发明还提供一种制备用于治疗癌症的药物组合物或药剂的方法或工艺，其中该方法或工艺包括混合活性组分与药学或生理学可接受载体的步骤，其中所述活性组分选自下组：

(a)本发明的肽，

(b)处于可表达形式的编码如本文中公开的肽的核酸，

(c)本发明的APC，和

(d)本发明的细胞毒性T细胞。

或者，本发明的药物组合物或制剂可用于防范癌症和/或预防其手术后复发。

本发明的药剂或药物组合物可用作疫苗。在本发明的语境中，短语“疫苗”(也称作“免疫原性组合物”)指具有在接种入动物后诱导抗肿瘤免疫力的功能的物质。

本发明的药剂或药物组合物可用于在受试者或患者(包括人和任何其它哺乳动物，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猫、犬、绵羊、山羊、猪、牛、马、猴、狒狒、和黑猩猩，特别是商业上重要的动物或驯养的动物)中治疗和/或预防癌症，和/或预防其手术后复发。

依照本发明，已经发现具有选自SEQ ID NO：3、4和5的氨基酸序列的寡肽是能诱导针对表达强且特异性的免疫应答的HLA-A2(A*0201)限制性表位肽。因此，包括任何这些具有选自SEQ ID NO：3、4或5的氨基酸序列的寡肽的本发明药剂或药物组合物特别适合于对其HLA抗原为HLA-A2(A*0201)的受试者施用。这同样适用于含有编码任何这些寡肽的多核苷酸的药剂或药物组合物。

要用本发明的药剂或药物组合物治疗的癌症不受限制，包括其中涉及RAB6KIFL的所有种类的癌症，包括例如膀胱癌、乳腺癌、胆管细胞癌、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、前列腺癌、肾癌和小细胞肺癌(SCLC)。特别是，本发明的药剂或药物组合物优选应用于胰腺癌。

除上述活性组分之外，本发明的药剂或药物组合物还可含有其它具有诱导针对癌性细胞的CTL的能力的肽、编码所述其它肽的其它多核苷酸、呈递所述其它肽的其它细胞等等。在本文中，其它具有诱导针对癌性细胞的CTL的能力的肽以癌症特异性抗原(例如已鉴定的TAA)为例，但是不限于此。

如果需要，本发明的药剂或药物组合物可任选包括其它治疗性物质作为活性组分，只要该物质不抑制活性组分例如任何本发明肽的抗肿瘤效果。例如，配制剂可包括抗炎剂或组合物、镇痛剂、化疗剂、诸如此类。除了在药物自身中包括其它治疗性物质之外，本发明的药物还可以与一种或多种其它药理学作用剂或组合物顺序或同时施用。药物和药理学作用剂或组合物的量取决于例如所使用的药理学作用剂或组合物的类型、所治疗的疾病、及施用的时序安排和路径。

应当理解，除在本文中具体提及的组分之外，本发明的药剂或药物组合物可包括与所讨论的配制剂类型相关的本领域常规的其它制剂或组合物。

在本发明的一个实施方案中，本发明的药剂或药物组合物可包括在制品和试剂盒中，该制品和试剂盒含有可用于治疗要治疗的疾病(例如癌症)的病理状况的材料。制品可包括任何本发明药剂或药物组合物的容器及标签。合适的容器包括瓶、管形瓶、和试管。容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。容器上的标签应指明该药剂或组合物用于治疗或预防一种或多种疾病状况。标签还可指明关于施用的指导等等。

除上文描述的容器之外，包括本发明药剂或药物组合物的试剂盒还可任选进一步包括第二容器，其中装有药学可接受稀释剂。它可进一步包括从商业和用户立场看期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器、和载有使用说明的包装插页。

如果期望的话，药物组合物可存在于药包或分配器装置中，该药包或分配器装置可装有一个或多个含有活性组分的单位剂型。例如，药包可包括金属或塑料箔，诸如泡罩包。药包或分配器装置可附有施用说明书。

(1)含有肽作为活性组分的药剂或药物组合物

本发明的肽可以作为药剂或药物组合物直接施用，或者如果必要，通过常规配制方法来配制。在后一种情况中，除本发明的肽之外，还可以视情况包括通常用于药物的载体、赋形剂、等等，没有特别限制。此类载体的例子有灭菌水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、培养液、等等。另外，药剂或药物组合物可在必要时含有稳定剂、悬浮液、防腐剂、表面活性剂等等。本发明的药剂或药物组合物可用于抗癌目的。

本发明的肽可制备成由两种或更多种本发明肽构成的组合以在体内诱导CTL。肽组合可采取鸡尾酒的形式，或者可使用标准技术彼此缀合。例如，可以将各个肽化学连接或表达成为单一融合多肽序列。组合中的各个肽可以是相同的或不同的。通过施用本发明的肽，肽被HLA抗原以高密度展示在APC上，然后诱导出与所展示的肽与HLA抗原之间形成的复合物特异性起反应的CTL。或者，可以通过从受试者分离APC(例如DC)，并用本发明的肽刺激它们，来获得在其细胞表面上展示任何本发明的肽的APC，通过将这些APC(例如DC)重新施用给受试者而在受试者体内诱导出CTL，结果，可提高针对癌细胞，诸如膀胱癌、乳腺癌、胆管细胞癌、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、前列腺癌、肾癌和小细胞肺癌(SCLC)的攻击性。

包括本发明的肽作为活性组分、用于治疗和/或预防癌症的药剂或药物组合物还可包括已知可有效建立细胞免疫的佐剂。或者，它们可以与其它活性组分一起施用，而且它们可以通过配制成颗粒来施用。佐剂指在与具有免疫学活性的蛋白质一起(或顺序)施用时增强针对该蛋白质的免疫应答的化合物。本文中涵盖的佐剂包括文献中记载的那些(Clin Microbiol Rev 1994，7：277-89)。合适佐剂的例子包括但不限于磷酸铝、氢氧化铝、明矾、霍乱毒素、沙门氏菌毒素、诸如此类，但不限于此。

另外，可方便地使用脂质体配制剂、其中肽结合至几微米直径的珠子的颗粒配制剂、和其中脂质结合至肽的配制剂。

在一些实施方案中，本发明的药剂或药物组合物可进一步包括引发(prime)CTL的成分。已经确认脂质是能够在体内引发针对病毒抗原的CTL的作用剂或组合物。例如，可将棕榈酸残基连接至赖氨酸残基的ε-和α-氨基，然后连接至本发明的肽。然后脂化肽可以在胶束或颗粒中直接施用，掺入脂质体，或在佐剂中乳化。作为脂质引发CTL应答的另一个例子，大肠杆菌(E.coli)脂蛋白，诸如三棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酰丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)，当与适宜的肽共价连接时，可用来引发CTL(参见例如Deres et al.，Nature 1989，342：561-4)。

施用的方法可以是口服、皮内、皮下、静脉内注射等等，及系统施用或局部施用至靶位点附近。施用可以通过单次施用来实施，或者通过多次施用来强化。本发明肽的剂量可以依据要治疗的疾病、患者的年龄、重量、施用的方法等等恰当加以调整，通常是0.001mg至1000mg，例如0.001mg至1000mg，例如0.1mg至10mg，而且可以每少数天施用一次至每少数月施用一次。本领域技术人员能恰当选择合适的剂量。

(2)含有多核苷酸作为活性组分的药剂或药物组合物

本发明的药剂或药物组合物也可含有处于可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸。在本文中，短语“处于可表达形式的”意味着多核苷酸在导入细胞时会在体内表达成诱导抗肿瘤免疫力的多肽。在一个例示性的实施方案中，感兴趣的多核苷酸的核酸序列包括多核苷酸表达所必需的调节元件。多核苷酸可具有为实现稳定插入靶细胞的基因组所需的配置(关于同源重组盒载体的描述参见例如Thomas KR & Capecchi MR，Cell 1987，51：503-12)。参见例如Wolff et al.，Science 1990，247：1465-8；美国专利No.5,580,859；5,589,466；5,804,566；5,739,118；5,736,524；5,679,647；及WO 98/04720。基于DNA的投递技术的例子包括“裸DNA”、易化(布比卡因、聚合物、肽介导的)投递、阳离子脂质复合物、和颗粒介导的(“基因枪”)或压力介导的投递(参见例如美国专利No.5,922,687)。

本发明的肽还可用病毒或细菌载体来表达。表达载体的例子包括减毒病毒宿主，诸如牛痘或禽痘。这种办法涉及使用例如痘苗病毒作为载体来表达编码肽的核苷酸序列。在导入宿主后，重组牛痘病毒表达表达免疫原性肽，并由此引发免疫应答。可用于免疫接种方案的牛痘载体和方法记载于例如美国专利No.4,722,848。另一种载体的例子包括卡介苗(BC G，Bacille CalmetteGuerin)。BCG载体记载于Stover et al.，Nature 1991，351：456-60。有很多种可用于治疗性施用或免疫接种的其它载体是显而易见的，例如腺病毒和腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、去毒炭疽毒素载体、诸如此类。参见例如Shata et al.，Mol Med Today 2000，6：66-71；Shedlock et al.，J Leukoc Biol 2000，68：793-806；Hipp et al.，In Vivo 2000，14：571-85。

将多核苷酸投递入受试者可以是直接的，其中受试者直接暴露于携带多核苷酸的载体，或者是间接的，其中首先在体外用感兴趣多核苷酸转化细胞，然后将细胞移植入受试者。这两种办法分别称作体内和离体基因疗法。

关于基因疗法的方法的一般综述参见Goldspiel et al.，Clinical Pharmacy1993，12：488-505；Wu and Wu，Biotherapy 1991，3：87-95；Tolstoshev，Ann RevPharmacol Toxicol 1993，33：573-96；Mulligan，Science 1993，260：926-32；Morgan & Anderson，Ann Rev Biochem 1993，62：191-217；Trends inBiotechnology 1993，11(5)：155-215。在eds.Ausubel et al.，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，NY，1993；及Krieger，Gene Transfer andExpression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY，1990中描述的重组DNA技术领域的公知方法也可用于本发明。

施用的方法可以是口服、皮内、皮下、静脉内注射等等，而且可使用系统施用或局部施用至靶位点附近。施用可以通过单次施用来实施，或者通过多次施用来强化。可以依据要治疗的疾病、患者的年龄、重量、施用的方法等等恰当调整合适载体或经编码本发明肽的多核苷酸转化的细胞中的多核苷酸的剂量，而且通常是0.001mg至1000mg，例如0.001mg至1000mg，例如0.1mg至10mg，而且可以每数天施用一次至每数月施用一次。本领域技术人员能恰当选择合适的剂量。

X.使用肽、外来体、APC和CTL的方法

本发明的肽和编码此类肽的多核苷酸可用于诱导APC和CTL。本发明的外来体和APC也可用于诱导CTL。肽、多核苷酸、外来体和APC可以与任何其它化合物组合使用，只要该化合物不抑制它们的CTL诱导能力。因此，任何前文所述的本发明药剂或药物组合物均可用于诱导CTL，而且除它们之外，那些包括肽和多核苷酸的也可用于诱导APC，如下文讨论的。

(1)诱导抗原呈递细胞(APC)的方法

本发明提供了使用本发明的肽或编码所述肽的多核苷酸来诱导APC的方法。诱导APC可以如上文“VI.抗原呈递细胞”部分所述来实施。本发明还提供了用于诱导具有高水平CTL诱导能力的APC的方法，上文“VI.抗原呈递细胞”项目下也提到了其诱导。

优选的是，诱导APC的方法包括选自下组的至少一个步骤：

a：使APC与本发明的肽接触，和

b：将本发明的多肽以可表达的形式导入APC。

这样的APC诱导方法优选地以体外或离体的方式实施。当以体外或离体方式实施所述方法时，要诱导的APC可以从待治疗的受试者或者与受试者HLA抗原相同的其他人获得。在优选的实施方案中，通过本方法诱导的APC在其表面上携带HLA-A2抗原，尤其是HLA-A2(A*0201)。

(2)诱导CTL的方法

另外，本发明提供了使用本发明的肽、编码所述肽的多核苷酸、或呈递所述肽的外来体或APC来诱导CTL的方法。

本发明还提供了使用编码能形成T细胞受体(TCR)亚单位的多肽的多核苷酸来诱导CTL的方法，所述TCR亚单位识别(即结合)细胞表面上的本发明的肽与HLA抗原之间形成的复合物。优选地，所述诱导CTL的方法包括选自下组的至少一个步骤：

(a)使CD8-阳性T细胞与抗原呈递细胞和/或外来体接触，所述抗原呈递细胞和外来体在其表面上呈递HLA抗原与本发明的肽之间形成的复合物；和

(b)向CD8-阳性T细胞中导入编码能够形成TCR亚单位的多肽的多核苷酸，所述TCR亚单位可识别HLA抗原与本发明的肽之间形成的复合物。

当本发明的肽被施用给受试者后，受试者的身体中诱导出CTL，而且靶向肿瘤相关内皮的免疫应答的强度增强。或者，肽和编码肽的多核苷酸可用于离体治疗方法，其中在体外用本发明的肽接触(刺激)受试者衍生的APC和CD8阳性细胞或外周血单核白细胞，并在诱导CTL后，将活化的CTL细胞返还给受试者。例如，该方法可包括下述步骤：

a：自受试者收集APC；

b：用本发明的肽接触步骤a的APC；

c：将步骤b的APC与CD⁸⁺T细胞混合，并共培养以诱导CTL；并

d：自步骤c的共培养物收集CD⁸⁺T细胞。

或者，依照本发明，提供了本发明的肽在制备用于诱导CTL的药物组合物中的用途。另外，本发明提供了一种制备用于诱导CTL的药物制剂或药物组合物的方法或工艺，其中所述方法包括将本发明的肽与药学可接受的载体混合或配制的步骤。另外，本发明还提供了用于诱导CTL的本发明的肽。

通过步骤d获得的具有细胞毒性活性的CD⁸⁺T细胞可作为疫苗施用于受试者。上文步骤c中要与CD⁸⁺T细胞混合的APC也可通过将编码本发明肽的基因转移入APC来制备，如上文“VI.抗原呈递细胞”部分中详述的；但是不限于此，任何将本发明的肽有效呈递给T细胞的APC或外来体均可用于本发明的方法。

描述了合适的方法和材料，虽然与在此描述的相似或等同的方法和材料亦可用于实践或测试本发明。本文通过提述并入本文中提及的所有出版物、专利申请、专利及其他参考文献的全部内容。如果有冲突，当以本说明书包括定义在内为准。此外，所述材料、方法和实施例均只是例示的目的，而不意在构成限制。

提供下面的实施例来例示本发明及帮助本领域普通技术人员来制备和使用本发明。实施例并非意图以任何方式限制本发明的范围。

实施例

材料和方法

cDNA微阵列分析

如前人所述(Nakamura T，et al.Oncogene 2004；23：2385-400)利用cDNA微阵列分析进行了基因表达谱分析。从手术标本获取了来自胰腺癌和邻近非癌性正常胰腺组织的组织样品，且所有的患者均提供了参与该项研究的知情同意书。在图1C中，用癌细胞中RAB6KIFL mRNA表达的值除以其正常对应物中的值算出了相对表达比。在图1B中，用每个正常组织中RAB6KIFL mRNA的表达值除以对照RNA(来自图1B中所示的40份正常组织的RNA样品的等量混合物)中RAB6KIFL mRNA的表达值算出了正常组织的相对表达比。

小鼠

HLA-A2.1(HHD)转基因小鼠；H-2D^b-/-β2m^-/-双敲除小鼠，导入了人β2m-HLA-A2.1(α1，α2)-H-2D^b(α3跨膜胞质；HHD)单链构建体基因，是在Department SIDA-Retrovirus，Unite d′Immunite Cellulaire Antivirale，InstitutePasteur，France构建的(Pascolo S，et al.J Exp Med 1997；185：2043-51，Firat H，etal.Eur J Immunol 1999；29：3112-21)，并且由F.A.Lemonnier博士惠赠。该小鼠在熊本大学动物资源与开发中心饲养，其操作符合熊本大学的动物照看指南。

细胞系和HLA表达

人胰腺癌细胞系PANC1、人结肠癌细胞系CaCo-2、和TAP缺陷及HLA-A2(A*0201)阳性细胞系T2均购自Riken Cell Bank(筑波，日本)。人胰腺癌细胞系PK8由日本东北大学发育、衰老和癌症生化研究所细胞资源中心(仙台，日本)惠赠。人肝癌细胞系SKHep1由久留美大学Kyogo Ito博士(久留美，日本)惠赠。使用一种抗HLA-A2单克隆抗体(mAb)，BB7.2(One Lambda，Inc.，Canoga Park，CA)进行流式细胞术来检查HLA-A2的表达，以选择HLA-A2阳性的供血者及靶细胞系用于细胞毒性测定。将这些细胞在添加了10％FCS的RPMI 1640或DMEM培养基中，37℃、5％CO₂气氛下体外保持。

患者、血液样品和肿瘤组织

利用来自供体的PMBC进行的临床研究得到了熊本大学机构评审委员会(Institutional Review Board of Kumamoto University，Kumamoto，Japan)的批准。在熊本大学医院，在获得了患者的知情同意书后，在常规诊断程序中获取了血液样品和癌症以及邻近的非癌性组织。还在获得了知情同意书后从健康供体获取了血液样品。所有样品都是匿名的，随机编号，储存于-80℃直到使用。所有患者和健康供体均为日本国籍。

逆转录-PCR和Northern印迹分析

对正常和癌症组织和细胞系进行了逆转录-PCR(RT-PCR)分析以在mRNA水平上评估RAB6KIFL的表达。引物序列如下：RAB6KIFL，有义5′-CTACAAGCACCCAAGGACTCT -3′(SEQ ID NO：6)和反义5′-AGATGGAGAAGCGAATGTTT-3′(SEQ ID NO：7)，以及β-肌动蛋白，有义5′-CATCCACGAAACTACCTTCAACT-3′(SEQ ID NO：8)和反义5′-TCTCCTTAGAGAGAAGTGGGGTG-3′(SEQ ID NO：9)，并使用了组成如下的RT-PCR反应：最先在94℃变性5分钟，然后32-35个扩增循环，退火温度为58℃。利用β-肌动蛋白mRNA作为对照进行标准化后，对组织和细胞系中的RAB6KIFL mRNA的表达进行了比较。

Western印迹和免疫组织化学检查

RAB6KIFL蛋白的Western印迹和免疫组织化学染色如前人所描述地进行(Nakatsura T，et al.Biochem Biophys Res Commun 2001；281：936-44.Yoshitake T，et al.Clin Cancer Res 2004；10：6437-48.)。对于正常人组织的Western印迹分析，使用了预先制好的成人正常组织印迹(Biochain，Hayward，CA)。这里用到的第一抗体，抗RAB6KIFL多克隆抗体，以及单克隆抗β-肌动蛋白分别购自Bethyl Laboratories，Inc.(Montgomery，TX，USA)和Sigma(Steinheim，Germany)。如前人所述(Matsuyoshi H，et al.2004；172：776-86)，对于用RAB6KIFL-A2-10-284肽免疫的HLA-A2.1(HHD)转基因小鼠的组织样本进行CD4或CD8的免疫组织染色。

慢病毒基因转移

如前人所述(Imai K，et al.Clin Cancer Res 2008；14：6487-95，Tahara-Hanaoka S，et al.Exp Hematol 2002；30：11-7)进行了慢病毒载体介导的基因转移。简而言之，使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA，USA)将17μg携带RAB6KIFL cDNA的CSII-CMV-RfA和CSIIEF-RfA载体(Miyoshi H，et al.J Virol 1998；72：8150-7)，和10μgpCMV-VSV-G-RSV-Rev与pCAG-HIVgp转染到10cm培养皿中生长的293T细胞中。转染60小时后，回收培养基并通过超离心(50,000x g，2小时)沉降病毒颗粒。将离心沉淀悬浮在50μLRPMI 1640培养基中，将10μL病毒悬液加入96孔平板上每孔5x 10⁴个SKHep1细胞中。通过Western印迹分析确认了被转染的RAB6KIFL基因的表达。

RAB6KIFL反应性小鼠CTL的诱导和IFN-γ酶联免疫斑点测定

利用BIMAS软件程序(BioInformatics and Molecular Analysis Section，Center for information Technology，NIH，Bethesda，MD)选出携带针对HLA-A2(A*0201)编码的分子的结合基序的源自人RAB6KIFL的肽(纯度＞95％)，并合成了36种肽(American Peptide Company，CA，USA)。使用HLA-A2限制性的HIV肽(SLYNTYATL)(SEQ ID NO：10)作为无关肽。如前人所述(Nakatsura T，et al.Biochem Biophys Res Commun 2003；306：16-25)用肽来免疫小鼠。如前人所述(Komori H，et al.Clin Cancer Res 2006；12：2689-97)利用酶联免疫斑点(ELISPOT)来测定用经过或未经每种肽冲激的同基因BM-DC(1x 10⁴/孔)刺激CD4-脾细胞后，产生IFN-γ的细胞数/1x 10⁵个CD4-脾细胞的频率。

RAB6KIFL反应性人CTL的诱导

利用BIMAS软件程序(BioInformatics and Molecular Analysis Section，Center for information Technology，NIH，Bethesda，MD)选出携带针对HLA-A2(A*0201)编码的分子的结合基序的源自人RAB6KIFL的肽(纯度＞95％)，并合成了36种肽(American Peptide Company，CA，USA)(表1A和B)。使用源自单核细胞的DC作为抗原呈递细胞来诱导针对在HLA背景下被呈递的肽的CTL应答。DC如前人所述在体外培养中产生(Yoshitake Y，et al.Clin Cancer Res2004；10：6437-48，Harao M，et al.Int J Cancer 2008；in press.，Imai K，et al.ClinCancer Res 2008；付印中)。简单地说，将利用Ficoll-Plaque(GE Healthcare UK，Ltd.，Buckinghamshire，UK)溶液从HLA-A2阳性正常志愿者分离的PBMC用微珠(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)分成CD8⁺和CD14⁺群体。为了产生DC，在含2％热灭活的自体血清的AIM-V(Invitrogen)中，在100ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF；PeproTec Inc.，NJ，USA)和10ng/mL白细胞介素(IL)-4(PeproTec)存在下培养所述CD14⁺群体。培养5天后，向皿中加入OK-432以使DC成熟。在开始培养细胞因子产生的DC后7天时，在AIM-V中，4μg/mL β2-微球蛋白(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)存在下，用20ng/mL HLA-A2结合肽于37℃冲激2小时。然后对这些用肽冲激过的DC进行照射(40Gy)，并以1：50的比例与自体CD8+T细胞(用抗-CD8微珠(Miltenyi Biotec)对PBMC正选择而获得)混合。将这些培养物在24孔平板中设立，每个孔含有1X 10⁵个肽冲激过的DC、2X 10⁶个CD8⁺T细胞，和5ng/mL人重组IL-7(Wako，Osaka，Japan)，溶于2mL含2％自体血清的AIM-V中。2天后，向这些培养物中加入人重组IL-2(PeproTec Inc.)至终浓度20IU/mL。使用相同的程序用加载了肽的自体DC额外进行两次刺激，每周一次(于第7天和第14天)。最后一次刺激6天后，通过⁵¹Cr释放测定和IFN-γELISPOT测定来考察诱导出的CTL的抗原特异性应答。

针对癌细胞系的CTL应答

将CTL与作为靶细胞的每种癌细胞或经肽冲激的T2细胞(5X 10³/孔)以示明的效应细胞/靶细胞比共温育，并如前人所述进行标准⁵¹Cr释放测定(Yoshitake Y，et al.Clin Cancer Res 2004；10：6437-48.Imai K，et al.Clin CancerRes 2008；付印中)。简单地说，在CO2培养箱中将靶细胞用3.7KBqNa₂ ⁵¹Cr⁴(Perkin Elmer Life Sciences)37℃下标记一小时。将标记的靶细胞洗涤3次，并将细胞与20μg/mL的肽在37℃温育3小时来制备经过肽冲激的靶细胞。在平底微量滴定板中将靶细胞与效应细胞以200μL终浓度混合，并温育。温育6小时后，从每个孔采取50μL上清并利用伽马计数器定量放射性。通过计算特异性⁵¹Cr释放来评估特异性细胞毒活性。

如前人所述(Yoshitake Y，et al.Clin Cancer Res 2004；10：6437-48.，Imai K，et al.Clin Cancer Res 2008；in press.)进行HLA I类或HLA-DR的封闭。简而言之，在⁵¹Cr释放测定或ELISPOT测定中将CTL与癌细胞系共培养之前，将靶癌细胞与10μg/mL抗I类单抗W6/32或10μg/mL抗HLA-DR单抗H-DR-1温育1小时，然后检查所述单抗对CTL的细胞毒活性或者IFN-γ产生的影响。

统计分析

利用双尾Stundent t检验来评估通过处理组之间ELISPOT测定得到的数据以及肿瘤大小的差异的统计学显著性。P＜0.05的值认为是显著的。统计学分析使用商品化的软件包(SPSS for Windows，version 11.0，Chicago，IL，USA)来进行。

结果

基于cDNA微阵列鉴定RAB6KIFL基因在胰腺癌和多种恶性肿瘤中上调

使用含有27,648个基因的全基因组cDNA微阵列，先前已经检查了6个胰腺癌组织和它们邻近的正常对应物的基因表达谱。在分析后，选择了6个基因。因为这些基因在胰腺癌组织中的相对表达比较之其正常对应物中高5倍(图1A)(Imai K，et al.Clin Cancer Res 2008；14：6487-95)。利用cDNA微阵列分析分析了这些基因在29种正常组织(包括胚胎组织)中的表达(图1B)。结果，集中关注RAB6KIFL/KIF20A作为一个新的胰腺癌TAA。在所有6名被测试的患者中，胰腺癌组织中RAB6KIFL基因的表达都显著增强(相对表达比的平均值：32,000；范围：15-72,000)。此外，RAB6KIFL基因仅在睾丸和胸腺中微弱表达(图1B)。根据先前的cDNA微阵列分析，RAB6KIFL基因的表达水平也在肺癌和膀胱癌中增强(图1C)(Nakamura T，et al.Oncogene 2004；23：2385-400，Kitahara O，et al.Cancer Res 2001；61：3544-9，Hasegawa S，etal.Cancer Res 2002；62：7012-7，Kikuchi T，et al.Oncogene 2003；22：2192-205，Obama K，et al.Hepatology 2005；41：1339-48)。

RAB6KIFL mRNA和蛋白在正常器官、癌细胞系和胰腺癌组织中的表达

利用RT-PCR分析，在mRNA水平上分析了RAB6KIFL基因在正常组织中的表达。对正常组织中RAB6KIFL的半定量RT-PCR分析揭示了它仅在睾丸中表达(图2A)。利用RT-PCR分析在几乎所有的胰腺癌和其他HLA-A2阳性的癌细胞系中检测出了RAB6KIFL基因的表达(图2B)。

接下来，利用RT-PCR分析分析了手术切除的胰腺癌组织及其邻近的正常对应物中RAB6KIFL基因的表达。在8例胰腺癌组织中的5例中检出了RAB6KIFL基因的表达，但在它们的正常对应物中几乎没有检出表达(图2C)。此外，在皮肤和腹膜的转移灶中检出了其表达。

还使用Western印迹检查了RAB6KIFL蛋白在癌性组织和几种正常组织中的表达(图3A、B)。在8种正常组织中未能检出RAB6KIFL蛋白，而睾丸中可见一非常微弱的条带，其迁移率与PAC1细胞裂解物种观察到的条带相似(图3A)。另一方面，在两名受检的患者的胰腺癌组织中检出了RAB6KIFL蛋白，但在邻近的正常组织对应物中则未检出(图3B)。

为了确认RAB6KIFL蛋白的肿瘤相关性过表达，接下来利用免疫组织化学分析来检查多个石蜡包埋的胰腺癌组织标本。强RAB6KIFL染色主要可见于胰腺癌的癌细胞的细胞质，而在它们的正常邻近胰腺组织的正常导管上皮以及腺泡细胞中见到极微弱的染色(图4A)。此外，在腹膜的转移灶内观察到类似的强染色(图4A)。在成肿瘤性胰腺炎的组织标本中没有检测到染色(图4A)。RAB6KIFL在正常脑、肺、肝、肾、胃、小肠、结肠、脾、骨骼肌、皮肤、胸腺和睾丸中没有染色(图4B)。

源自RAB6KIFL的HLA-A2(A*0201)结合肽的预测

表1A和B显示了RAB6KIFL蛋白的HLA-A2(A*0201)结合肽，以高结合亲和性预测得分排序。总共选择了36个具有潜在的HLA-A2结合活性的肽。

表1A源自RAB6KIFL的HLA-A2(A*0201)结合性9聚体肽

命名	起始位置	子序列	得分	SEQ ID
						204	LLSNEVIWL	459
RAB6KIFL-A2-9-12	12	LLSDDDVVV	199	SEQIDNO：3
						715	KMLEPPPSA	191
	750	KLGESLQSA	164
						300	SIWISFFEI	131
	38	NLLSDCSVV	106
						688	QLQEVKAKL	88
	695	KLQQCKAEL	75
					RAB6KIFL-A2-9-809	809	CIAEQYHTV	59	SEQIDN0：4
	11	GLLSDDDVV	52
						436	TLGRCIAAL	49
	179	ILPRSLALI	41
						183	SLALIFNSL	41
	625	KLNILKESL	37
						781	ILIKQDQTL	36
	231	GLQEEELST	31
						494	TLHVAKFSA	29
	556	SMYGKEELL	24
						788	TLAELQNNM	20
	209	VIWLDSKQI	20

起始位置标示自RAB6KIFL的N末端起的氨基酸数。

结合得分在“材料与方法”中求出。

表1B源自RAB6KIFL的HLA-A2(A*0201)结合性10聚体肽

命名	起始位置	子序列	得分	SEQ ID
						654	LLQEARQQSV	485
	788	TLAELQNNMV	285
						742	RLLRTELQKL	182
	39	LLSDCSVVST	119
						11	GLLSDDDVVV	106
	400	KISELSLCDL	97
						573	LLLKERQEKL	66
	97	VLQAPKDSFA	46
					RAB6KIFL-A2-10-284	284	AQPDTAPLPV	29	SEQ ID NO：5
	132	GQASFFNLTV	27
						625	KLNILKESLT	26
	382	SIFSIRILHL	25
						203	PLLSNEVIWL	22
	455	NLVPFRDSKL	21
						506	QLVHAPPMQL	21
	98	LQAPKDSFAL	21
						66	KVYLRVRPLL	21

起始位置标示自RAB6KIFL的N末端起的氨基酸数。

结合得分在“材料与方法”中求出。

利用HLA-A2.1(HHD)转基因小鼠鉴定源自RAB6KIFL的HLA-A2限制性的小鼠CTL表位

为了鉴定源自RAB6KIFL的HLA-A2限制性CTL表位，选择了36个不同的候选肽。每个由9个或10个氨基酸组成，这些氨基酸具有对HLA-A2(A*0201)的高预测结合得分(基于由NIH BIMAS提供的HLA肽结合预测算法)(表1A和B)，HLA-A2(A*0201)是全世界最常见的HLA等位基因产物。为了确定哪些肽能够诱导肽反应性的CTL，用从这36种肽选出的3种肽的混合物共12组冲激BM-DC，用经冲激的BM-DC腹膜内免疫HLA-A2.1(HHD)转基因小鼠两次，从小鼠分离CD4^-脾细胞后将其在体外用每种肽冲激过的BM-DC再次刺激。结果显示，在ELISPOT测定中，用RAB6KIFL-A2-9-12、RAB6KIFL-A2-9-809和RAB6KIFL-A2-10-284刺激的CD4^-脾细胞以肽特异性的方式产生了显著量的IFN-γ(图5A)。CD4^-脾细胞(2x 10⁴个)应答于用RAB6KIFL-A2-9-12肽冲激过的BM-DC显示了149.0+/-22.2个斑点计数/孔，而在未加载肽的BM-DC的存在下它们显示32.6+/-9.9个斑点计数/孔(P＜0.01)。类似地，CD4^-脾细胞应答于用RAB6KIFL-A2-9-809肽冲激过的BM-DC显示了117.2+/-23.4个斑点计数/孔，而在未加载肽的BM-DC的存在下它们显示51.4+/-7.8个斑点计数/孔(P＜0.01)。此外，用经RAB6KIFL-A2-10-284肽冲激的BM-DC刺激过的CD4^-脾细胞也显示了141.2+/-5.5个斑点计数/孔，而在未加载肽的BM-DC的存在下它们显示19.2+/-5.2个斑点计数/孔(P＜0.01)。其他肽没有观察到显著的肽特异性应答。这些结果提示RAB6KIFL-A2-9-12、RAB6KIFL-A2-9-809和RAB6KIFL-A2-10-284肽可能是HLA-A2.1(HHD)转基因小鼠中HLA-A2限制性的CTL表位肽，且这些肽预计是人CTL的表位。

在HLA-A2.1(HHD)转基因小鼠中表位肽RAB6KIFL-A2-9-809免疫接种没有诱发自身免疫现象

调查用RAB6KIFL肽免疫接种是否会诱发自身免疫反应是非常重要的。因此我们在HLA-A2.1(HHD)转基因小鼠中用RAB6KIFL-A2-9-809肽(其氨基酸序列在人与小鼠RAB6KIFL间完全保守)接种两次之后，用抗-CD4和抗-CD8单抗对于数种生命器官进行了免疫组织化学分析。结果，没有观察到提示自身免疫性的病理学改变，例如组织破坏或淋巴细胞浸润(图5B)。在这些小鼠中也没有观察到患有自身免疫病的小鼠中常见的异常，如毛发和皮肤异常，腹泻和体重减轻。这些结果表明至少在HLA-A2转基因小鼠中用RAB6KIFL-A2-9-809刺激的淋巴细胞没有攻击正常组织。

从HLA-A2(A*0201)日性健康供体的PBMC诱导RAB6KIFL反应性CTL

通过用RAB6KIFL-A2-9-12(SEQ ID NO：3)，RAB6KIFL-A2-9-809(SEQ ID NO：4)和RAB6KIFL-A2-10-284(SEQ ID NO：5)肽刺激来试图从HLA-A2(A*0201)阳性的健康供体的PBMC诱导生成RAB6KIFL特异性的CTL。从HLA-A2阳性健康供体分离PBMC，将从这些PBMC中分选出的CD8⁺T细胞与用每种肽冲激过的源自自身单核细胞的DC一起温育。刺激3次后，通过⁵¹Cr释放测定(图6A)和IFN-γELISPOT测定(数据未显示)来检查针对经过肽冲激的T2细胞的细胞毒活性。从两名健康供体的PBMC诱导的CTL针对经RAB6KIFL-A2-9-12(SEQ ID NO：3)，RAB6KIFL-A2-9-809(SEQ ID NO：4)和RAB6KIFL-A2-10-284(SEQ ID NO：5)肽冲激的T2细胞显示了细胞毒活性，但对用无关的HLA-A2限制性HIV肽冲激(或没有加载肽)的T2细胞则不显示。在其他供体中显示了类似的应答(数据未显示)。这些结果提示这些CTL具有肽特异性的细胞毒性。

接下来，调查这些CTL是否能够杀死表达RAB6KIFL和HLA-A2(A*0201)的人癌细胞系。如图6B中所示，用RAB6KIFL-A2-9-12(左)、RAB6KIFL-A2-9-809(中)、或RAB6KIFL-A2-10-284(右)肽刺激的RAB6KIFL反应性CTL对PANC 1(RAB6KIFL⁺，HLA-A2⁺)，CaCo-2(RAB6KIFL⁺，HLA-A2⁺)显示细胞毒活性，但对健康供体中的PK8(RAB6KIFL⁺，HLA-A2^-)则没有。

此外，利用转染了RAB6KIFL基因(图2B)的SKHep1/RAB6KIFL(RAB6KIFL^高，HLA-A2⁺)、SKHep1(RAB6KIFL^低，HLA-A2⁺)细胞作为靶细胞来确认这些肽在癌细胞中是从RAB6KIFL蛋白天然加工而来的。如图6C所示，用RAB6KIFL-A2-9-12(左)，RAB6KIFL-A2-9-809(中)或RAB6KIFL-A2-10-284(右)肽刺激而诱导的CTL针对SKHep1/RAB6KIFL，而不对SKHep1/模拟显示了细胞毒性。这些结果提示这些肽可能被天然地加工并在HLA-A2分子的背景下表达在癌细胞的表面。

为了确认被诱导的CTL以HLA-I类限制性的方式识别靶细胞，进行了HLA-I类阻断测定，利用针对HLA I类的单抗(W6/32)来阻断CTL对癌细胞的识别(图6D)。结果，在ELISPOT测定中，抗HLA I类抗体能够显著地抑制RAB6KIFL-A2-9-12(左)，RAB6KIFL-A2-9-809(中)和RAB6KIFL-A2-10-284(右)肽刺激而产生的CTL在PANC1细胞刺激下的IFN-γ产生，具有统计学显著性(图6D，P＜0.01)。这些结果清楚地表明这些被诱导的CTL以HLA I类限制性的方式识别表达RAB6KIFL的靶细胞。

讨论

根据实施例，显示了RAB6KIFL是一种TAA，有希望成为胰腺癌抗癌免疫疗法的靶标。为了建立抗癌免疫疗法，鉴定在肿瘤细胞而不在正常细胞中强烈表达的TAA是重要的。cDNA微阵列分析显示RAB6KIFL mRNA在胰腺癌细胞中过表达(Imai K，Hirata S，Irie A，Senju S，Ikuta Y，Yokomine K，Harao M，Inoue M，Tsunoda T，Nakatsuru S，Nakagawa H，Nakamura Y，et al.Clin Cancer Res 2008；14：6487-95)而在它们的正常对应物以及除睾丸和胸腺之外的许多正常成年组织中几乎不表达(图1B)。此外，除了胰腺癌中，RAB6KIFL还在肺癌和膀胱癌中过表达(图1C)。RT-PCR分析显示RAB6KIFL mRNA在数种癌细胞系和胰腺癌细胞系中频繁上调，但成体正常组织(包括骨，不包括睾丸)中则不然(图2)。类似地，Western印迹分析和免疫组织化学分析揭示了RAB6KIFL蛋白在胰腺癌细胞中被检测到，但在它们的正常对应物和成体正常组织(包括骨，不包括睾丸)中则不然(图3、4)。这些观察结果支持了RAB6KIFL在蛋白水平上作为癌症睾丸样TAA的特征。

为了鉴定作为抗癌症免疫疗法的有用靶标的TAA，另一个关键点是选择对于癌细胞的扩增、侵袭、转移和生存必不可少的抗原。近来，Taniuchi等人报道了RAB6KIFL参与了胰腺的致癌作用(Taniuchi K，et al.Cancer Res2005；65：105-12)，其此前报道在膜转运(Echard A，et al.Science 1998；279：580-5)和细胞分裂(Fontijn RD，et al.Mol Cell Biol 2001；21：2944-55，HillE，Clarke M，Barr FA.EMBO J 2000；19：5711-9)中起作用。他们显示，用小干扰RNA下调胰腺癌细胞中的内源RAB6KIFL，导致通过与disc大同源物5(DLG5)——RAB6KIFL的一种装载蛋白的相互作用而进行的癌细胞生长的显著弱化(Taniuchi K，et al.Cancer Res 2005；65：105-12)，提示RAB6KIFL可能在胰腺致癌作用中起关键作用，因此可能是潜在有用的癌症免疫治疗靶标。

本文中，通过鉴定HLA-A2限制性的表位肽并评估它们的免疫原性，证实了RAB6KIFL作为免疫治疗靶标的潜力。利用HLA-A2(HHD)转基因小鼠进行实验，用36种按照BIMAS算法被预测为具有对HLA-A2(A*0201)的结合亲和力的候选肽进行接种，鉴定了三种HLA-A2限制性的RAB6KIFL表位肽，它们能够刺激HLA-A2限制性的小鼠CTL生成而不导致自身免疫现象如淋巴细胞浸润或组织破坏(图5)。此外，在三个独立的健康供体中，从用所有这三种肽刺激过的PBMC均能产生RAB6KIFL反应性的CTL(图6)。这些CTL不但可以杀死用它们的天然关联肽冲激过的T2细胞，而且还可以杀死表达RAB6KIFL和HLA-A2二者的癌细胞系。这些CTL对用人RAB6KIFL基因转染的SKHep1细胞而不对模拟转染SKHep1展现细胞毒性，这一发现确认了CTL对这些肽的抗原特异性。这些数据提示这些RAB6KIFL肽(RAB6KIFL-A2-9-12、RAB6KIFL-A2-9-809和RAB6KIFL-A2-10-284)在癌细胞中是从RAB6KIFL蛋白天然地加工而来，并与HLA-A2分子一起被呈递到细胞表面，以被CTL识别。此外，还有可能的是，在癌细胞中从RAB6KIFL蛋白加工RAB6KIFL-A2-9-809相比于RAB6KIFL-A2-9-12和RAB6KIFL-A2-10-284更有效，因为RAB6KIFL-A2-9-809肽诱导的CTL针对表达RAB6KIFL和HLA-A2的癌细胞的细胞毒性强于通过用RAB6KIFL-A2-9-12或RAB6KIFL-A2-10-284刺激而诱导出来的CTL所介导的细胞毒性。

利用缺少内源小鼠H-2^b编码的I类分子的表达的HLA-A2.1(HHD)转基因小鼠来鉴定RAB6KIFL的HLA-A2限制性CTL表位肽。HLA-A2.1(HHD)转基因小鼠据报道是一种多用途的动物模型，用于基于肽的免疫疗法的前临床评估(Imai K，et al.Clin Cancer Res 2008；14：6487-95，Komori H，et al.ClinCancer Res 2006；12：2689-97，Harao M，et al.Int J Cancer 2008；123：2616-25，Pascolo S，et al.J Exp Med 1997；185：2043-51，Firat H，et al.Eur J Immunol1999；29：3112-21)。

为了避免TAA接种所诱发的不良影响，选择了在成体正常组织中几乎不表达的RAB6KIFL作为靶标。然而，确定RAB6KIFL接种在抗癌免疫疗法的过程中或之后是否可以诱导自身免疫疾病，是非常重要的。这里，三条表位肽中的两条的氨基酸序列在人和小鼠之间是不保守的(RAB6KIFL-A2-9-12，人：LLSDDDVVV(SEQ ID NO：3)，小鼠：LLSDEDVVD(SEQ ID NO：11)；RAB6KIFL-A2-10-284，人：AQPDTAPLPV(SEQ ID NO：5)，小鼠：AQPDTVPVSV)(SEQ ID NO：12)。因此，考察了在用RAB6KIFL-A2-9-809肽(其中氨基酸序列在人和小鼠之间完全保守)接种两次后在HLA-A2转基因小鼠中的自身免疫现象。使用HLA-A2转基因小鼠的一个优势是能够在体内考察自身免疫现象。当然，由于本文中考察的正常组织数有限，无法排除RAB6KIFL在本文中没有考察的某些正常组织中表达的可能性。因此，当使用RAB6KIFL肽进行癌症免疫治疗时，必须留意对自身免疫病的诱导。

总而言之，现在的结果提示RAB6KIFL是一种TAA，含有能够引发对表达RAB6KIFL和HLA-A2的癌细胞有反应性的CTL的表位肽。由于RAB6KIFL在广泛的人恶性肿瘤中高度表达，因此RAB6KIFL是基于肽的免疫疗法的有希望的靶标，用于治疗广谱的恶性肿瘤，尤其是胰腺癌。因此，对在胰腺癌患者中诱导RAB6KIFL特异性CTL的能力的进一步调查对于临床应用而言仍然是非常重要的问题。

工业应用性

本发明描述了新的TAA，尤其是源自RAB6KIFL的，它们能够诱导强而特异性的抗肿瘤免疫应答，并且可应用于广泛的癌症类型。这样的TAA保证了作为针对与RAB6KIFL相关的疾病的肽疫苗的进一步开发，这样的疾病例如癌症，如膀胱癌、宫颈癌、胆管细胞癌、食道癌、胃癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、骨肉瘤、胰腺癌、肾癌和软组织肿瘤。

虽然本文中参照具体实施方案详细地描述了本发明，但是要理解，上面的描述本质上是例示性的和解释性的，而且意图例示本发明及其优选实施方案。经由常规实验，本领域技术人员会容易地认识到，可以对本发明进行各种变化和修饰，而不偏离本发明的精神和范围，本发明的边界和范围由所附权利要求来限定。

Claims

1.一种分离的寡肽，其包含选自SEQ ID NO：3、4和5的氨基酸序列。

2.权利要求1的寡肽，其中替代、删除、插入和/或添加了1个、2个或几个氨基酸，其中所述寡肽具有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)诱导能力。

3.权利要求2的寡肽，其中所述寡肽具有选自下组的至少一种替代：

(a)从N端起的第二个氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸，和

(b)C端氨基酸是缬氨酸或亮氨酸。

4.一种用于治疗和/或预防癌症和/或防止其手术后复发的药剂，其中该药剂包含可药用载体和一种或多种权利要求1-3中任一项的寡肽，或编码所述寡肽的多核苷酸。

5.权利要求4的药剂，其配制为用于对HLA抗原为HLA-A2的受试者施用。

6.权利要求4的药剂，其中所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、胆管细胞癌、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、前列腺癌、肾癌和小细胞肺癌(SCLC)。

7.权利要求4的药剂，其是疫苗。

8.一种外来体，该外来体在其表面上呈递包含权利要求1-3中任一项的寡肽以及HLA抗原的复合体。

9.权利要求8的外来体，其中所述HLA抗原是HLA-A2。

10.通过使用权利要求1-3中任一项的寡肽来诱导抗原呈递细胞的方法。

11.权利要求10的方法，其中所述方法包括选自下组的步骤：

(a)使抗原呈递细胞与权利要求1-3中任一项的寡肽接触，和

(b)将编码权利要求1-3中任一项的寡肽的多核苷酸导入抗原呈递细胞。

12.一种使用权利要求1-3中任一项的寡肽来诱导CTL的方法。

13.权利要求12的方法，其中所述方法包括选自下组的步骤：

(a)使CD8-阳性T细胞接触在其表面上呈递权利要求1-3中任一项的寡肽的抗原呈递细胞和/或外来体；和

(b)向CD8-阳性T细胞中导入编码能够形成T细胞受体(TCR)亚单位的多肽的多核苷酸，所述亚单位结合抗原呈递细胞表面上的权利要求1-3中任一项的寡肽与HLA抗原的复合体。

14.一种分离的CTL，其靶向权利要求1-3中任一项的寡肽。

15.权利要求14的CTL，其能够结合抗原呈递细胞表面上的权利要求1-3中任一项的寡肽与HLA抗原的复合体。

16.分离的CTL，其是使用权利要求1-3中任一项的寡肽诱导的。

17.权利要求16的CTL，其是使用权利要求13的方法诱导的。

18.一种分离的抗原呈递细胞，该细胞在其表面呈递HLA抗原与权利要求1-3中任一项的寡肽的复合物。

19.权利要求18的抗原呈递细胞，其是通过权利要求10或11的方法诱导的。

20.一种在受试者中诱导抗癌症免疫应答的方法，包括对所述受试者施用疫苗的步骤，所述疫苗包含选自下组的至少一种活性成分：

(a)一种或多种权利要求1-3中任一项所述的寡肽，或其免疫学活性片段；

(b)一种或多种编码权利要求1-3中任一项所述的寡肽或其免疫学活性片段的多核苷酸；

(c)一种或多种权利要求14-17中任一项的分离的CTL；

(d)一种或多种权利要求18或19的分离的抗原呈递细胞。

21.一种用于诱导CTL的药剂，其中该药剂包含可药用载体和一种或多种权利要求1-3中任一项的寡肽、编码所述寡肽的多核苷酸，或者权利要求18或19的分离的抗原呈递细胞。

22.选自下组的活性成分在制备用于治疗癌症的药物组合物或药剂中的用途：

(a)一种或多种权利要求1-3中任一项所述的寡肽；

(b)一种或多种处于可表达形式的编码权利要求1-3中任一项所述的寡肽的多核苷酸；

(c)一种或多种呈递权利要求1-3中任一项所述的寡肽的抗原呈递细胞；和

(d)一种或多种能够结合抗原呈递细胞表面上的权利要求1-3中任一项的寡肽与HLA抗原的复合体的CTL。

23.编码权利要求1-3中任一项的寡肽的多核苷酸。