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JP5288379B2 - タンパク質の高分泌生産方法 - Google Patents

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Description

本発明は、主に酵母におけるタンパク質の高分泌生産方法に関する。
分泌タンパク質は、発現した後、シグナル配列がＳＲＰ：ｓｉｇｎａｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｐａｒｔｉｃｌｅによって認識され、トランスロコンを通過して小胞体に入る。分泌タンパク質は、トランスロコンの通過時に高次構造がほどけて小胞体内でフォールディング（ｆｏｌｄｉｎｇ）される。タンパク質のフォールディングは、自発的に可能であるが、様々な分子シャペロンがフォールディングを助けている。小胞体内で形成されるネイティブな立体構造の形成は、分泌に重要であり、正しくフォールディングされなかったタンパク質は、下流の分泌経路に乗ることができなくなる。小胞体内で正しくフォールディングされなかった場合、高次構造の異常なタンパク質が蓄積してしまう。このような小胞体内で起こる修飾（糖鎖、ジスルフィド結合の付加）の障害、小胞体からの輸送の低下が原因となって、「小胞体ストレス」という状態が起こる。この小胞体ストレスに対応する手段として、真核生物の細胞は、「Ｕｎｆｏｌｄｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ（ＵＰＲ）」と呼ばれるストレス応答が誘導される。ＵＰＲにおける転写誘導・翻訳調節は、蓄積した異常タンパク質を修復しようとする応答であるが、異常タンパク質を分解し、排除して小胞体内の恒常性を維持するＥＲＡＤ：ＥＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎという機構もある。また、分子シャペロンには、小胞体内でのタンパク質のフォールディングを助けるものだけなく、凝集したタンパク質をフォールディングするためにほぐすものも知られている。例えば、ＨＳＰ１０４は、ＨＳＰ７０と協同して凝集体からタンパク質を可溶化する他のシャペロンでは不可能な反応を行うことができる（非特許文献１）。
一方、抗体分子は、抗体重鎖と軽鎖または抗体重鎖間でジスルフィド結合が形成されるとともに抗体重鎖、抗体軽鎖の分子内ジスルフィド結合を形成することによって、正しい立体構造の会合体（Ｈ２Ｌ２）が形成される。酵母などの真核細胞では、タンパク質の酸化的フォールディングによるジスルフィド結合の導入は、小胞体内で酸化型ＰＤＩ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）によって行われる（非特許文献２）。基質となるタンパク質を酸化し、還元型となったＰＤＩは、膜近傍に局在する酸化型ＥＲＯ１によって再酸化される（非特許文献３、４）。酵母の小胞体には、５種類（ＰＤＩ１、ＥＵＧ１、ＭＰＤ１、ＭＰＤ２、ＥＰＳ１）のＰＤＩファミリーが存在する（非特許文献５）。これらのＰＤＩファミリーの中で、ＥＲＯ１との分子間ジスルフィド結合を形成することが確認されているのは、ＰＤＩ１とＭＰＤ２である。また、タンパク質の酸化的フォールディングには、ＢｉＰ／Ｋａｒ２が、ＰＤＩと協同して効率を上げることもまた報告されている（非特許文献６）。ＢｉＰ／Ｋａｒ２は、前記のＵＰＲに関連する様々な遺伝子の活性型ＨＡＣ１による誘導にも関与する。活性型ＨＡＣ１は、膜貫通ｋｉｎａｓｅ／ｎｕｃｌｅａｓｅであるＩＲＥ１によってＨＡＣ１がスプライシングされることによって活性化される。ＢｉＰ／Ｋａｒ２が結合したＩＲＥ１は、小胞体内の異常構造をもつタンパク質にＢｉＰ／Ｋａｒ２が作用することによって解離し、２量体を形成することによってヌクレアーゼ活性を示し、ＨＡＣ１をスプライシングして活性型ＨＡＣ１を生成する（非特許文献７、８）。また、Ｂｉｐ／Ｋａｒ２は、小胞体に存在するＳＣＪ１と協同し、小胞体内でのタンパク質のフォールディングに関与している（非特許文献９）。
このように、分泌タンパク質の正しいフォールディングには、様々な分子シャペロンが関与していることが明らかにされている。一方、分子シャペロンによって、分泌タンパク質の生産量を上げるという試みも行なわている。例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓにおいてＳ−Ｓ結合がリッチなヒト血清アルブミンの生産する際に、ＥＲＯ１またはＰＤＩ１を導入すると、生産量が１５倍に向上することが報告される（非特許文献１０）。しかし、ＥＲＯ１とＰＤＩ１を同時に入れてもそれ以上の向上はなく、生産される時期が早くなるだけである。また、Ｓ−Ｓ結合を有さないＩＬ−１βには効果がない。また、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて単鎖抗体断片（ＳｃＦｖ）を生産する際に、ＲａｔＰＤＩとＢｉＰを共発現させることによって分泌生産量が８倍に増大したことが報告される（非特許文献１１）。本報告では、ＢｉＰは凝集を防ぎ、ＰＤＩはシャペロン活性ではなく、イソメラーゼ活性によって分泌生産量が増大したと結論づけている。また、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｒｉｓにおいて、単鎖抗体断片（ＳｃＦｖ）を生産するに際し、Ｂｉｐを共発現すると分泌生産量が３倍に向上したが、ＰＤＩまたはＰＤＩとＢｉＰの併用では、効果は認められなかったことが報告される（非特許文献１２）。さらに、ＣＨＯ細胞においてＰＤＩレベルの増加によるＩＬ−１５とｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：Ｆｃ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＮＦＲ：Ｆｃ）の分泌に対する効果を調べたところ、ＰＤＩの過剰発現によってＴＮＦＲ：Ｆｃ（ジスルフィド結合がリッチなタンパク質）は細胞内に保持されるが、ＩＬ−１５は細胞内に保持されなかったことが報告される（非特許文献１３）。これは、ＣＨＯ細胞では、ＰＤＩの過剰発現はかえって分泌生産量が減少してしまうことを示唆している。
以上のように、タンパク質のフォールディングを助ける分子シャペロン群を共発現させることによって抗体等のタンパク質の分泌生産性を向上させる試みが行われているが、宿主細胞や分子シャペロンの種類やそれらの組合せによってその効果が一律に得られるものではない。また、抗体産生例でも一本鎖の抗体を生産しているにすぎず、完全な抗体をはじめとする高分子量のタンパク質、会合体タンパク質を効率的に生産する方法は見出されていない。
Ｇｌｏｖｅｒ ＪＲ，Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ Ｓ，Ｈｓｐ１０４，Ｈｓｐ７０，ａｎｄ Ｈｓｐ４０：Ａ ｎｏｖｅｌ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｔｈａｔ ｒｅｓｃｕｅｓ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｅｌｌ（１９９８）９４：７３−８２ Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｐ．Ｔｕ ａｎｄ Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｓ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｉｎｇ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２００４）１６４：３４１−３４６ Ｍｅｚｇｈｒａｎｉ，Ａ．，Ｆａｓｓｉｏ，Ａ．，Ｂｅｎｈａｍ，Ａ．，Ｓｉｍｍｅｎ，Ｔ．，Ｂｒａａｋｍａｎ，Ｉ．，ａｎｄ Ｓｉｔｉａ，Ｒ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｉｎｇ Ａｎｄ ＰＤＩ ｒｅｄｏｘ ｓｔａｔｅ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．ＥＭＢＯ．Ｊ．（２００１）２０：６２８８−６２９６ Ｆｒａｎｄ，Ａ．Ｒ．ａｎｄ Ｃ．Ａ．Ｋａｉｓｅｒ，Ｅｒｏｌｐ ｏｘｉｄｉｚｅｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｉｎ ａ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ（１９９９）４：４６９−４７７ Ｐｅｒ Ｎｏｒｇａａｒｄ，Ｖｉｂｅｋｅ Ｗｅｓｔｐｈａｌ，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｔａｃｈｉｂａｎａ，Ｌｅｎｅ Ａｌｓｏｅ，Ｂｊｏｒｎ Ｈｏｌｓｔ，Ｊａｋｏｂ Ｒ．Ｗｉｎｔｈｅｒ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｉｓｏｍｅｒａｓｅｓ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００１）１５２（３）：５５３−５６２， Ｍａｒｃｕｓ Ｍａｙｅｒ，Ｕｒｓｕｌａ Ｋｉｅｓ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｋａｍｍｅｒｍｅｉｅｒ，ａｎｄ Ｊｏｈａｎｎｅｓ Ｂｕｃｈｎｅｒ，ＢｉＰ ａｎｄ ＰＤＩ Ｃｏｏｐｅｒａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００）２７５（３８）：２９４２１−２９４２５． Ｃｏｘ ＪＳ．，Ｓｈａｍｕ ＣＥ．，Ｗａｌｔｅｒ Ｐ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ａ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ．Ｃｅｌｌ（１９９３）７３：１１９７−１２０６ Ｓｉｄｒａｕｓｋｉ Ｃ．ａｎｄ Ｗａｌｔｅｒ Ｐ．，Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｋｉｎａｓｅ Ｉｒｅ１ｐ ｉｓ ａ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｔｈａｔ ｉｎｉｔｉａｔｅｓ ｍＲＮＡ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｃｅｌｌ（１９９７）９０（６）：１０３１−１０３９ Ｓｕｓａｎａ Ｓｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎ，Ｇａｂｒｉｅｌ Ｓｃｈｌｅｎｓｔｅｄｔ，Ｐａｍ Ａ．Ｓｉｌｖｅｒ，ａｎｄ Ｒｅｉｄ Ｇｉｌｍｏｒｅ，Ａ Ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ＤｎａＪ Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ Ｓｃｊ１ｐ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｏｌｄｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９９８）１４３（４）：９２１−９３３ Ｔｉｚｉａｎａ Ｌｏｄｉ，Ｂａｒｂａｒａ Ｎｅｇｌｉａ，ａｎｄ Ｃｌａｕｄｉａ Ｄｏｎｎｉｎｉ，Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ｂｙ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＫｌＰＤＩ１ ａｎｄ ＫｌＥＲＯ１．Ａｐｐｌｉｅｄ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００５）７１（８）：４３５９−４３６３ Ｓｈｕｓｔａ，Ｅ．Ｖ．，Ｒａｉｎｅｓ，Ｒ．Ｔ．，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，ａｎｄ Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｋ．Ｄ．，Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９８）１６：７７３−７７７ Ｄａｍａｓｃｅｎｏ，Ｌｅｏｎａｒｄｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｒｉｓ．Ａｐｐｌｉｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００７）７４（２）：３８１−３８９ Ｄａｖｉｓ Ｒ．，Ｓｃｈｏｏｌｅｙ Ｋ．，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ Ｂ．，Ｔｈｏｍａｓ Ｊ．，Ｒｅｄｄｙ Ｐ．，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＰＤＩ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．（２０００）１６：７３６−７４３
従って、本発明の課題は、酵母などの宿主細胞において、タンパク質、特には抗体などの構造が複雑なタンパク質を高分泌生産する手段を提供することにある。
そこで本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、酵母などの宿主細胞において分子シャペロン遺伝子の１種または２種以上を発現対象となる外来タンパク遺伝子と共発現させることによって、外来タンパク質の分泌生産性を向上できることを見出した。更に抗体などのヘテロ多量体の会合を阻害する、酵母特有のタンパク質へのＯ型糖鎖付加に関与するＰｒｏｔｅｉｎ Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰＭＴ）の活性を抑制することによって、約２〜４５倍生産性の向上が実現できることを見出した。本発明をかかる知見により完成されたものである。
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）下記の（ａ）〜（ｃ）のシャペロン遺伝子の１種または２種以上の組合せを導入した形質転換宿主細胞。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、または１３に示す塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、または１３に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ外来タンパク質分泌促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、または１３に示す塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ外来タンパク質分泌促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（２）下記の（ｄ）〜（ｆ）のシャペロンタンパク質をコードする遺伝子の１種または２種以上の組合せを導入した形質転換宿主細胞。
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ外来タンパク質分泌促進活性を有するタンパク質
（ｆ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ外来タンパク質分泌促進活性を有するタンパク質
（３）下記の（ｇ）または（ｈ）のシャペロン遺伝子の１種または２種以上の組合せを導入した形質転換宿主細胞。
（ｇ）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＰＤＩ１，ＭＰＤ１，ＳＣＪ１，ＥＲＯ１，ＦＫＢ２，ＪＥＭ１，ＬＨＳ１，ＭＰＤ２，ＥＲＪ５，若しくはＥＵＧ１をコードする遺伝子、またはその相同遺伝子
（ｈ）ヒト由来のＰＤＩ，ＥＲＯ１−Ｌα，ＥＲＯ１−Ｌβ，若しくはＧＲＰ７８をコードする遺伝子、またはその相同遺伝子、またはそのコドン改変型遺伝子
（４）下記の（ｉ）〜（ｘｉｉ）のシャペロン遺伝子の１種または２種以上の組合せからなる群から選択される遺伝子、またはその相同遺伝子、またはそのコドン改変型遺伝子を導入した形質転換宿主細胞。
（ｉ）Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来のＰＤＩ１をコードする遺伝子
（ｉｉ）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＰＤＩ１をコードする遺伝子
（ｉｉｉ）ヒト由来のＰＤＩをコードする遺伝子
（ｉｖ）Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来のＥＲＯ１をコードする遺伝子
（ｖ）ヒト由来のＥＲＯ１をコードする遺伝子
（ｖｉ）Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来のＫａｒ２をコードする遺伝子
（ｖｉｉ）Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来のＰＤＩ１をコードする遺伝子とＥＲＯ１をコードする遺伝子
（ｖｉｉｉ）Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来のＰＤＩ１をコードする遺伝子とＫａｒ２をコードする遺伝子
（ｉｘ）ヒト由来のＰＤＩをコードする遺伝子とＯ．ｍｉｎｕｔａ由来のＥＲＯ１をコードする遺伝子
（ｘ）Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来のＰＤＩ１をコードする遺伝子とＥＲＯ１をコードする遺伝子とＫａｒ２をコードする遺伝子
（ｘｉ）ヒト由来のＰＤＩをコードする遺伝子とＥＲＯ１−Ｌβをコードする遺伝子とＧＲＰ７８をコードする遺伝子
（ｘｉｉ）ヒト由来のＰＤＩをコードする遺伝子とＯ．ｍｉｎｕｔａ由来のＥＲＯ１をコードする遺伝子とヒト由来のＧＲＰ７８をコードする遺伝子
（５）宿主細胞が真核細胞である、（１）から（４）のいずれかに記載の形質転換宿主細胞。
（６）真核細胞が酵母である、（５）に記載の形質転換宿主細胞。
（７）酵母がメタノール資化性酵母である、（６）に記載の形質転換宿主細胞。
（８）メタノール資化性酵母がＯｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａである、（７）に記載の形質転換宿主細胞。
（９）酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、（６）に記載の形質転換宿主細胞。
（１０）外来タンパク質をコードする遺伝子を導入した、（１）から（９）のいずれかに記載の形質転換宿主細胞。
（１１）外来タンパク質が多量体タンパク質である、（１０）に記載の形質転換宿主細胞。
（１２）多量体タンパク質がヘテロ多量体である、（１１）に記載の形質転換宿主細胞。
（１３）ヘテロ多量体が抗体またはその機能的断片である、（１２）に記載の形質転換宿主細胞。
（１４）外来タンパク質が糖転移酵素である、（１０）に記載の形質転換宿主細胞。
（１５）（１０）から（１４）のいずれかに記載の形質転換宿主細胞を培地に培養し、培養物から目的タンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
（１６）培養をＰｒｏｔｅｉｎ Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰＭＴ）活性を抑制する条件下で行うことを特徴とする、（１５）に記載のタンパク質の製造方法。
（１７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰＭＴ）活性の抑制が、培地にＰＭＴ活性阻害剤を添加することにより行われる、（１６）に記載のタンパク質の製造方法。
（１８）ＰＭＴ活性阻害剤が、５−［［３，４−（１−ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ］−４−ｏｘｏ−２−ｔｈｉｏｘｏ−３−ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄである、（１７）に記載のタンパク質の製造方法。
（１９）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰＭＴ）活性の抑制が、ＰＭＴ遺伝子の破壊により行われる、（１６）に記載のタンパク質の製造方法。
（２０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰＭＴ）活性の抑制が、ＰＭＴ遺伝子を破壊し、かつ培地にＰＭＴ活性阻害剤を添加することにより行われる、（１６）に記載のタンパク質の製造方法。
（２１）ＰＭＴ活性阻害剤が、５−［［３，４−（１−ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ］−４−ｏｘｏ−２−ｔｈｉｏｘｏ−３−ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄである、（２０）に記載のタンパク質の製造方法。
（２２）ＰＭＴ遺伝子の破壊が、ＰＭＴ５遺伝子またはＰＭＴ６遺伝子の単独破壊、ＰＭＴ５遺伝子とＰＭＴ６遺伝子の二重破壊である、（１９）〜（２１）のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
（２３）下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＯｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ由来のシャペロン遺伝子。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、または１３に示す塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、または１３に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ外来タンパク質分泌促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、または１３に示す塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ外来タンパク質分泌促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（２４）下記の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのシャペロンタンパク質をコードする遺伝子。
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ外来タンパク質分泌促進活性を有するタンパク質
（ｆ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ外来タンパク質分泌促進活性を有するタンパク質
（２５）（２３）または（２４）に記載の遺伝子を含む発現ベクター。
（２６）下記の（ｇ）または（ｈ）の遺伝子を含む発現ベクター
（ｇ）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＰＤＩ１，ＭＰＤ１，ＳＣＪ１，ＥＲＯ１，ＦＫＢ２，ＪＥＭ１，ＬＨＳ１，ＭＰＤ２，ＥＲＪ５，またはＥＵＧ１をコードする遺伝子またはその相同遺伝子
（ｈ）ヒト由来のＰＤＩ，ＥＲＯ１−Ｌα，ＥＲＯ１−Ｌβ，若しくはＧＲＰ７８をコードする遺伝子、またはその相同遺伝子、またはそのコドン改変型遺伝子
図１は、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来各種シャペロンタンパク質発現ベクター（ｏｎａＰ０３６０６、ｏｎａＰ０９４０７、ｏｎａＰ０９５０７、ｏｎａＰ０９６０７、ｏｎａＰ０９７０７）の構築図を示す。
図２は、ヒト由来シャペロンタンパク質（コドン改変Ｈｕｍａｎ ＰＤＩ）とＯ．ｍｉｎｕｔａ由来シャペロンタンパク質（ＯｍＥＲＯ１）の共発現ベクター（ｏｎａＰ１１１０７）の構築図を示す。
図３は、ＰＧＫプロモーター制御によるＯｍＫａｒ２発現ベクター（ｐＯＵ１／Ｋａｒ２−Ｐｐｔ）の構築図を示す。
図４は、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来３種のシャペロンタンパク質（ＯｍＰＤＩ１、ＯｍＥＲＯ１、ＯｍＫａｒ２）の共発現ベクター（ｏｎａＰ１１００７）の構築図を示す。
図５は、Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌ化阻害剤（ロダニン−３−酢酸誘導体１ｃ）添加・無添加の条件下で培養した抗体生産酵母株（ｏｎａ０２３０６株）の抗体分泌量の測定結果を示したグラフである（１：１ｃ無添加、２：２０μＭの１ｃを含む培地１００μＬを３日目に添加、３：２０μＭの１ｃを含む培地１００μＬを２日目と３日目に添加）。
図６は、Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌ化阻害剤（ロダニン−３−酢酸誘導体１ｃ）添加・無添加の条件下で培養した抗体生産酵母株（ｏｎａ０２３０６株）の培養上清中に分泌された抗体のウェスタンブロット解析結果を示した図である（１：１ｃ無添加、２：２０μＭの１ｃを含む培地１００μＬを３日目に添加、３：２０μＭの１ｃを含む培地１００μＬを２日目と３日目に添加）。
図７は、単独のＯ．ｍｉｎｕｔａ由来シャペロンタンパク質（ＳＣＪ１，ＥＵＧ１，ＥＲＯ１，Ｋａｒ２，ＭＰＤ１，ＰＤＩ１，ＨＳＰ１０４）遺伝子を導入した抗体生産酵母株（Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌ化阻害剤（ロダニン−３−酢酸誘導体１ｃ）添加・無添加の条件下で培養）の抗体分泌量の測定結果を示したグラフである。
図８は、単独のＯ．ｍｉｎｕｔａ由来シャペロンタンパク質（ＳＣＪ１，ＥＵＧ１，ＥＲＯ１，Ｋａｒ２，ＭＰＤ１，ＰＤＩ１，ＨＳＰ１０４）遺伝子を導入した抗体生産酵母株（Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌ化阻害剤（ロダニン−３−酢酸誘導体１ｃ）添加・無添加の条件下で培養）の培養上清中に分泌された抗体のウェスタンブロット解析結果を示した図である（上：還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＷＢ抗体ＨｃとＬｃを同時に検出、下：非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＷＢ 抗体Ｌｃを検出）。
図９は、複数のＯ．ｍｉｎｕｔａ由来シャペロンタンパク質（２×ＰＤＩ１，ＰＤＩ１／ＨＳＰ１０４，ＰＤＩ１／Ｋａｒ２，ＰＤＩ１／ＥＲＯ１）遺伝子を導入した抗体生産酵母株の抗体分泌量（Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌ化阻害剤（ロダニン−３−酢酸誘導体１ｃ）添加・無添加の条件下で培養）の測定結果を示したグラフである。
図１０は、複数のＯ．ｍｉｎｕｔａ由来シャペロンタンパク質（２×ＰＤＩ１，ＰＤＩ１／ＨＳＰ１０４，ＰＤＩ１／Ｋａｒ２，ＰＤＩ１／ＥＲＯ１）遺伝子を導入した抗体生産酵母株（Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌ化阻害剤（ロダニン−３−酢酸誘導体１ｃ）添加・無添加の条件下で培養）の培養上清中に分泌された抗体のウェスタンブロット解析結果を示した図である（上：還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＷＢ 抗体ＨｃとＬｃを同時に検出、下：非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＷＢ 抗体Ｌｃを検出）。
図１１は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，ヒト，合成ヒト由来シャペロンタンパク質（ＰＤＩ１）遺伝子を導入した抗体生産酵母株（Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌ化阻害剤（ロダニン−３−酢酸誘導体１ｃ）添加・無添加の条件下で培養）の抗体分泌量の測定結果を示したグラフである。
図１２は、３種のＯ．ｍｉｎｕｔａ由来シャペロンタンパク質（ＰＤＩ１／ＥＰＯ１／Ｋａｒ２）遺伝子、および異種由来のシャペロンタンパク質（ｈｕｍａｎ ＰＤＩ／ＯｍＥＲＯ１）遺伝子の組合せを導入した抗体生産酵母株の抗体分泌量（Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌ化阻害剤（ロダニン−３−酢酸誘導体１ｃ）添加・無添加の条件下で培養）の測定結果を示したグラフである。
図１３は、抗体発現ベクターＹＥｐ３５２ ＧＡＰ−ＩＩ−ＳｃＫａｒＨｃ／ＳｃＫａｒＬｃの構築を示す。
図１４は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来シャペロンタンパク質（ＰＤＩ１）遺伝子を導入した抗体生産酵母株（Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌ化阻害剤（ロダニン−３−酢酸誘導体１ｃ）添加・無添加の条件下で培養）の抗体分泌量の測定結果を示したグラフである。
図１５は、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来シャペロンタンパク質（ＰＤＩ１）遺伝子非導入株（ＹＴ−２）、ＰＤＩ１遺伝子導入株（ＹＴ−３）において発現させたシアル酸転移酵素（ＳＴ３Ｇａｌ１）の活性値の経時変化を示す。
図１６は、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来シャペロンタンパク質（ＰＤＩ１）遺伝子非導入株（ＹＴ−２）、ＰＤＩ１遺伝子導入株（ＹＴ−３）において発現させたシアル酸転移酵素（ＳＴ３Ｇａｌ１）のウェスタンブロット解析結果を示す。
図１７は、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来シャペロンタンパク質（ＰＤＩ１ｘ２，ＰＤＩ１／ＯｍＫａｒ２，ＰＤＩ１／ＥＲＯ１，ＰＤＩ１／ＨＳＰ１０４）遺伝子導入株（ＹＴ−４，５，６，７）において発現させたシアル酸転移酵素（ＳＴ３Ｇａｌ１）の活性値の経時変化を示す。
図１８は、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来シャペロンタンパク質（ＰＤＩ１ｘ２，ＰＤＩ１／ＯｍＫａｒ２，ＰＤＩ１／ＥＲＯ１，ＰＤＩ１／ＨＳＰ１０４）遺伝子導入株（ＹＴ−４，５，６，７）において発現させたシアル酸転移酵素（ＳＴ３Ｇａｌ１）のウェスタンブロット解析結果を示す。
図１９は、ＣＨＯ細胞由来シャペロンタンパク質（ＣＨＯＢｉＰ，ＣＨＯＰＤＩ）、ヒト由来シャペロンタンパク質（ｈＥＲＯ１−Ｌβ）遺伝子を導入した抗体生産動物細胞株（ＣＯＳ−１細胞）の抗体分泌量の測定結果を示したグラフである。
図２０は、ヒト由来シャペロン蛋白質（ＰＤＩ，ＥＲＯ１−Ｌα，ＥＲＯ１−Ｌβ，ＧＲＰ７８）遺伝子を導入した抗体生産酵母株の抗体分泌量（Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌ化阻害剤（ロダニン−３−酢酸誘導体１ｃ）添加・無添加の条件下で培養）の測定結果を示したグラフである。
図２１は、ヒト由来シャペロン蛋白質（ＰＤＩ，ＥＲＯ１−Ｌα，ＥＲＯ１−Ｌβ，ＧＲＰ７８）遺伝子を導入した抗体生産酵母株（Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌ化阻害剤（ロダニン−３−酢酸誘導体１ｃ）添加・無添加の条件下で培養）の培養上清中に分泌された抗体のウェスタンブロット解析結果を示した図である。
図２２は、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来３種のシャペロンタンパク質（ＯｍＰＤＩ１、ＯｍＥＲＯ１、ＯｍＫａｒ２）共発現ベクターまたはヒト由来３種のシャペロン蛋白質（合成ｈＰＤＩ、合成ｈＥＲＯ１−Ｌβ、合成ｈＧＲＰ７８）共発現ベクターを導入した株で酵母ａＭＦシグナル融合ヒトリゾチームを発現させた場合のウェスタンブロット解析の結果である。
図２３は、ＰＭＴ遺伝子破壊株にＯ．ｍｉｎｕｔａ由来３種のシャペロンタンパク質（ＯｍＰＤＩ１、ＯｍＥＲＯ１、ＯｍＫａｒ２）共発現ベクターと抗体遺伝子を導入した株にＯ−ｍａｎｎｏｓｙｌ化阻害剤（ロダニン−３−酢酸誘導体１ｃ）添加・無添加の条件下で培養した時の抗体分泌量の測定結果を示したグラフである。
図２４は、Ｏ．ｍｉｎｕｔａのＰＭＴ破壊株の走査電子顕微鏡観察結果を示した写真である。
図２５は、Ｏ．ｍｉｎｕｔａのＰＭＴ破壊株の透過電子顕微鏡観察結果を示した写真である。
図２６は、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＰＭＴ４破壊株にＯ．ｍｉｎｕｔａ由来３種のシャペロンタンパク質（ＯｍＰＤＩ１、ＯｍＥＲＯ１、ＯｍＫａｒ２）の共発現ベクターと抗体遺伝子を導入した株のＯ−ｍａｎｎｏｓｙｌ化阻害剤（ロダニン−３−酢酸誘導体１ｃ）添加濃度を検討した結果を示した図である。
図２７は、精製した各種Ｏ．ｍｉｎｕｔａ産生抗体のＳｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＳＥＣ）−ＨＰＬＣの溶出パターンを示した図である。
図２８は、精製した各種Ｏ．ｍｉｎｕｔａ産生抗体の非還元電気泳動後のウェスタンブロット解析結果を示した図である。
図２９は、精製した各種Ｏ．ｍｉｎｕｔａ産生抗体の細胞障害活性の測定結果を示したグラフである。
図３０は、精製した各種Ｏ．ｍｉｎｕｔａ産生抗体の細胞障害活性の測定結果を示したグラフである。
本願は、２００７年１０月３１日に出願された日本国特許出願２００７−２８３７３１号、２００７年１１月６日に出願された日本国特許出願２００７−２８８８４５号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書に記載される内容を包含する。
以下に、本発明について詳細に述べる。
１．タンパク質高分泌生産に用いる遺伝子
本発明においては、タンパク質高分泌生産に、小胞体においてタンパク質のフォールディング、変性タンパク質の分解や凝集阻止などに働く一連の分子シャペロン群をコードする遺伝子（以下、「シャペロン遺伝子」という）を用いる。
本発明に用いるシャペロン遺伝子としては、例えば、本発明において新規に取得されたＯｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ（Ｏ．ｍｉｎｕｔａ）に由来するＰＤＩ１、ＭＰＤ１、ＳＣＪ１、ＥＵＧ１、ＥＲＯ１、ＨＳＰ１０４、Ｋａｒ２遺伝子が挙げられる。Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ（Ｏ．ｍｉｎｕｔａ）に由来するＰＤＩ１、ＭＰＤ１、ＳＣＪ１、ＥＵＧ１、ＥＲＯ１、ＨＳＰ１０４、Ｋａｒ２遺伝子は、それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１、１３の塩基配列からなり、該塩基配列より推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４に示すアミノ酸配列である。
本発明に使用するシャペロン遺伝子は、外来タンパク質分泌促進活性を保持する限り、配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
ここで、欠失、置換、および／または付加されてもよいアミノ酸の数としては、好ましくは、１個から数個である。「数個」の数は特には限定されないが、例えば２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下程度を意味する。また、ここにいう「変異」は、主には公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異であってもよい。
また、本発明に使用するシャペロン遺伝子は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ外来タンパク質分泌促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。上記８０％以上の相同性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性をいう。タンパク質のホモロジー検索は、例えば、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）等を対象に、ＦＡＳＴＡやＢＬＡＳＴなどのプログラムを用いて行うことができる。
ここで、「外来タンパク質分泌促進活性」とは、小胞体における分子シャペロンのタンパク質のフォールディング作用（ジスルフィド結合形成など）、変性タンパク質の正常型タンパク質へのリフォールディング作用、変性タンパク質の凝集抑制作用に基づき、正確にフォールディングされた外来タンパク質を宿主細胞内において高分泌させる活性をいう。
また、「外来タンパク質分泌促進活性を有する」とは、上記の活性が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が有する活性と実質的に同等であることをいう。
本発明に使用するシャペロン遺伝子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、または１３に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ外来タンパク質分泌促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸、すなわち配列番号１、３、５、７、９、１１、または１３に示す塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましく９５％以上の相同性を有する塩基配列からなる核酸の相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い塩基配列からなる核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。
当業者であれば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１０ Ｓｋｙｌｉｎｅ Ｄｒｉｖｅ Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ（１９８９））等を参照することにより、こうしたホモログ遺伝子を容易に取得することができる。また、上記の塩基配列の相同性は、同様に、ＦＡＳＴＡ検索やＢＬＡＳＴ検索により決定することができる。
上記アミノ酸の変異（欠失、置換、および／または付加）の導入は、Ｋｕｎｋｅｌ法若しくはＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の当該技術分野で公知の手法、またはこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（タカラバイオ社製）若しくはＭｕｔａｎｔ−Ｇ（タカラバイオ社製）、タカラバイオ社のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットなどが利用できる。
また、本発明に使用するシャペロン遺伝子は、他の酵母、カビ、ヒトなど他の生物種由来のシャペロン遺伝子であってもよい。他の生物種由来のシャペロン遺伝子としては、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａに由来する上記の各シャペロン遺伝子（ＰＤＩ１、ＭＰＤ１、ＳＣＪ１、ＥＵＧ１、ＥＲＯ１、ＨＳＰ１０４、Ｋａｒ２遺伝子）に対応するヒト由来の各シャペロン遺伝子が好ましい。また、上記の各シャペロン遺伝子以外のシャペロン遺伝子であってもよい。
例えば、ヒト由来のシャペロン遺伝子として、ＰＤＩ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＣ０１０８５９；配列番号１４０）、ＥＲＯ１−Ｌα（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ０８１８８６；配列番号１４３）、ＥＲＯ１−Ｌβ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＣ０４４５７３；配列番号１４６）、ＧＲＰ７８（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＬ３５４７１０；配列番号１４９）が挙げられる。
また、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のシャペロン遺伝子として、ＰＤＩ１（Ｐｒｉｍａｒｙ ＳＧＤＩＤ：Ｓ００００００５４８；配列番号１２０）、ＭＰＤ１（Ｐｒｉｍａｒｙ ＳＧＤＩＤ：Ｓ０００００５８１４；配列番号１２２）、ＳＣＪ１（Ｐｒｉｍａｒｙ ＳＧＤＩＤ：Ｓ０００００４８２７；配列番号１２４）、ＥＲＯ１（Ｐｒｉｍａｒｙ ＳＧＤＩＤ：Ｓ０００００４５９９；配列番号１２６）、ＦＫＢ２（Ｐｒｉｍａｒｙ ＳＧＤＩＤ：Ｓ０００００２９２７；配列番号１２８）、ＪＥＭ１（Ｐｒｉｍａｒｙ ＳＧＤＩＤ：Ｓ０００００３６０９配列番号１３０）、ＬＨＳ１（Ｐｒｉｍａｒｙ ＳＧＤＩＤ：Ｓ０００００１５５６；配列番号１３２）、ＭＰＤ２（Ｐｒｉｍａｒｙ ＳＧＤＩＤ：Ｓ０００００５４４８；配列番号１３４）、ＥＲＪ５（Ｐｒｉｍａｒｙ ＳＧＤＩＤ：Ｓ０００００１９３７；配列番号１３６）、ＥＵＧ１（Ｐｒｉｍａｒｙ ＳＧＤＴＤ：Ｓ０００００２９２６；配列番号１３８）が挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の上記遺伝子の配列情報は、ＳＧＤ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｇｅｎｏｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／）から入手できる。
これらの他の生物種由来のシャペロン遺伝子もまた、外来タンパク質分泌促進活性を有する限り、それらの相同遺伝子であってもよい。それらの配列の相同性の範囲、アミノ酸の欠失、置換、付加数の範囲、ストリンジェントな条件、変異導入法は、前記のとおりである。
また、これらの他の生物種由来のシャペロン遺伝子は、その塩基配列を、用いる宿主において使用頻度の高いコドンに置換することによって翻訳効率を高めるように改変されたコドン改変型遺伝子（本明細書において、「コドン改変型」を「合成」という場合はある）であってもよい。改変した塩基配列を有するＤＮＡは人為的に合成することができるが、長いＤＮＡの場合は、幾つかの断片にわけて予め合成し、最終的にそれらを結合して合成することもできる。
本発明においては、上記シャペロン遺伝子を１種または２種以上を組合せて用いる。２種以上を組合せる場合、同じ生物種由来のものであっても異なる生物種由来のものであってもよい。
本発明において使用する上記のシャペロン遺伝子の好ましい例として、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来のＰＤＩ１遺伝子、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＰＤＩ１遺伝子、ヒト由来のＰＤＩ遺伝子、ヒト由来のＰＤＩ遺伝子（コドン改変型）、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来のＥＲＯ１遺伝子、ヒト由来のＥＲＯ１遺伝子、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来のＫａｒ２遺伝子を挙げることができる。
また、本発明において使用する上記のシャペロン遺伝子のさらに好ましい例としては、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来のＰＤＩ１遺伝子とＥＲＯ１遺伝子の組合せ、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来のＰＤＩ１遺伝子とＫａｒ２遺伝子の組合せ、ヒト由来のＰＤＩ遺伝子（コドン改変型）とＯ．ｍｉｎｕｔａ由来のＥＲＯ１遺伝子の組合せ、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来のＰＤＩ１遺伝子とＥＲＯ１遺伝子とＫａｒ２遺伝子の組合せ、ヒト由来のＰＤＩ遺伝子とＥＲＯ１−Ｌβ遺伝子とＧＲＰ７８遺伝子（いずれもコドン改変型）の組み合わせ、ヒト由来のＰＤＩ遺伝子（コドン改変型）とＯ．ｍｉｎｕｔａ由来のＥＲＯ遺伝子とヒト由来のＧＲＰ７８遺伝子（コドン改変型）の組み合わせを挙げることができる。
上記のヒト由来のシャペロン遺伝子で、「コドン改変型」とあるのは、コドン使用頻度をＯ．ｍｉｎｕｔａのそれに合わせて最適化したものを意味する。
本発明において、タンパク質高分泌生産に用いる上記遺伝子や後記の高分泌発現の対象となる外来タンパク質をコードする遺伝子（以下、これらを「目的遺伝子」という）は、ｍＲＮＡを調製し、逆転写酵素でｃＤＮＡを合成する一般的な方法により取得することができる。上記の一般的な手法としては、例えば、目的遺伝子が発現している細胞や組織に由来するｃＤＮＡライブラリーを、当該遺伝子断片をもとにして合成したＤＮＡプローブを用いてスクリーニングすることにより単離することができる。ｍＲＮＡの調製は、当該技術分野において通常用いられる手法により行うことができる。例えば、上記細胞または組織を、グアニジニン試薬、フェノール試薬等で処理して全ＲＮＡを得、その後、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムやセファロース２Ｂを担体とするポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法により、あるいはバッチ法によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得る。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ（Ａ＋）ＲＮＡをさらに分画してもよい。次いで、得られたｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成し、該一本鎖ｃＤＮＡからＤＮＡ合成酵素Ｉ、ＤＮＡリガーゼ及びＲＮａｓｅＨ等を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成する。合成した二本鎖ｃＤＮＡをＴ４ＤＮＡ合成酵素によって平滑化後、アダプター（例えば、ＥｃｏＲＩアダプター）の連結、リン酸化等を経て、λｇｔ１１等のλファージに組み込んでｉｎ ｖｉｖｏパッケージングすることによってｃＤＮＡライブラリーを作製する。また、λファージ以外にもプラスミドベクターを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製することもできる。その後、ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを有する株（ポジティブクローン）を選択すればよい。
また、また目的遺伝子をゲノムＤＮＡから単離する場合、あるいは、プロモーター、ターミネーター領域を含む断片の単離は、一般的手法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９４（１９９１））に従い、採取源となる生物の細胞株よりゲノムＤＮＡを抽出し、目的遺伝子を選別することにより行う。ゲノムＤＮＡの抽出は、例えば、Ｃｒｙｅｒらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２，３９−４４（１９７５））およびＰ．Ｐｈｉｌｉｐｐｓｅｎらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１６９−１８２（１９９１））に従って行うことができる。例えば、採取源が酵母の場合は、酵母のプロトプラストを調製して、当該プロトプラストから、通常公知のＤＮＡ抽出法、高塩濃度下での細胞残さ除去後のアルコール沈殿法、フェノールやクロロホルム抽出後のアルコール沈殿法等の常法を用いて行えばよい。
目的遺伝子の取得は、例えばＰＣＲ法（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｈｅｎｒｙ Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，Ａｔｏｃｋｔｏｎ ｐｒｅｓｓ（１９８９））によって行うこともできる。ＰＣＲ法を用いた目的遺伝子の増幅には、プライマーとして２０〜３０ｍｅｒの合成１本鎖ＤＮＡを、鋳型としてゲノムＤＮＡを用いる。増幅された遺伝子は塩基配列を確認した後、用いる。
一方、配列未知の目的遺伝子を含む断片の取得は、（ａ）常法により遺伝子ライブラリーを作製し、（ｂ）作製された遺伝子ライブラリーから所望のクローンを選択し、当該クローンを増幅する、ことによって行うことができる。遺伝子ライブラリーは、採取源となる生物の細胞株から常法により得た染色体ＤＮＡを適当な制限酵素によって部分消化して断片化し、得られた断片を適当なベクターに連結し、該ベクターを適当な宿主に導入することによって調製することができる。また、細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ここからｃＤＮＡを合成後、適当なベクターに連結し、該ベクターを適当な宿主に導入することによっても調製することができる。この際用いられるベクターとしては、通常公知の遺伝子ライブラリー調製用ベクターとして知られるプラスミドを用いることができ、またファージベクターまたはコスミド等も広く用いることができる。形質転換または形質導入を行う宿主は、上記ベクターの種類に応じたものを用いればよい。
目的遺伝子断片を保持したクローンの選択は、上記遺伝子ライブラリーから、目的遺伝子に特有の配列を含む標識プローブを用いるコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法等によって行う。
また目的遺伝子を化学的に全合成することもできる。例えば相補的な２対のオリゴヌクレオチドを作製しこれらをアニールさせる方法や、数本のアニールされたＤＮＡをＤＮＡリガーゼにより連結する方法、または一部相補的な数本のオリゴヌクレオチドを作製しＰＣＲによりギャップを埋める方法等により、遺伝子を合成することができる。
遺伝子のＤＮＡ配列の決定等は通常の方法、例えばジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３−５４６７（１９７７））等により行うことができる。更に上記ＤＮＡ塩基配列の決定は、市販のシークエンスキット等を用いることによっても容易に行い得る。
２．発現ベクター
本発明のベクターは、上記のシャペロン遺伝子の１種を含むベクター、あるいは、上記のシャペロン遺伝子の１種を２以上のコピー数含むベクター、または上記のシャペロン遺伝子の２種以上の組合せを含むベクターが提供される。シャペロン遺伝子を宿主細胞内で発現させるために、各遺伝子を単独で含むベクターをそれぞれ用いて形質転換してもよく、また、複数の遺伝子を含む一つのベクターを用いて形質転換してもよい。また、同発現ベクターに外来タンパク質をコードする遺伝子を含んでいてもよい。あるいは、外来タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターを別に調製してもよく、別に調製した場合は、各ベクターを宿主細胞にコトランスフェクト（共導入）する。
外来タンパク質をコードする遺伝子としては、特に限定はされないが、リゾチーム遺伝子、α−アミラーゼ遺伝子、α−ガラクトシダーゼ遺伝子等の各種酵素遺伝子、特に、エリスロポエチン（ＥＰＯ）や顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）などの医薬上有用な糖タンパク質の生産に必要な糖転移酵素遺伝子、また医薬上有用な生理活性タンパク質であるインターフェロンα、インターフェロンγ等の各種インターフェロン遺伝子、ＩＬ１、ＩＬ２等の各種インターロイキン遺伝子、エリスロポエチン（ＥＰＯ）遺伝子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）遺伝子等の各種サイトカイン遺伝子、成長因子遺伝子等が挙げられる。これらの遺伝子はいかなる手法によって得られるものでもよい。
本発明は特に疎水性の高いタンパク質、複合体を形成するような分泌生産が困難なタンパク質に対して有効であり、よって、上記の外来タンパク質には、多量体タンパク質、例えば、抗体またはその機能的断片であるヘテロ多量体が含まれる。
シャペロン遺伝子及び外来タンパク質をコードする遺伝子は、発現制御領域を適宜付加してタンパク質発現ユニットとして発現ベクターを構築してもよい。タンパク質発現ユニットは、転写の読み枠の方向に、少なくともプロモーター領域、上記遺伝子、転写ターミネーター領域を有するものである。ここで使用し得るプロモーターとしては、誘導発現プロモーターであっても、恒常プロモーターであってもよい。誘導発現プロモーターとしては、例えばメタノール資化性酵母におけるメタノール代謝に関わる、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）遺伝子プロモーター、ジヒドロキシアセトン・シンターゼ（ＤＡＳ）遺伝子プロモーター、ギ酸脱水素酵素（ＦＤＨ）遺伝子プロモーター等が挙げられる。また他の誘導プロモーターとしては銅誘導（ＣＵＰ）プロモーター等も用いることができる。恒常発現プロモーターとしては、例えばグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＴＤＨ、ＧＡＰ）遺伝子、ホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）遺伝子、エノラーゼ（ＥＮＯ）遺伝子、アクチン（ＡＣＴ）遺伝子、シトクロムｃ（ＣＹＣ）遺伝子、トレハロース合成酵素（ＴＰＳ）遺伝子、アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）遺伝子等のプロモーターなどが挙げられる。また転写ターミネーターは、プロモーターからの転写に対して転写終結を起こす活性を有する配列であればよく、プロモーターの遺伝子と同じまたは異なる遺伝子のものであってもよい。
外来タンパク質を高分泌生産させるためには強力なプロモーターを用いることが必要であるが、高活性なプロモーターを用いてフォールドしにくいタンパク質や、分泌されにくいタンパク質の生産を試みた場合、かえって分泌不全が起こることがある。これは、タンパク質の生産が、翻訳が行われるリボソーム、フォールディング・分泌が行われる小胞体のキャパシティを越えることにより、過剰に生産されたタンパクが細胞内で変性し、蓄積、ユビキチン化され、プロテオソームにて分解するような状況になるためである。従って、生成するタンパク質が変性しアグリゲーションを起こさない、または生産されたタンパク質が分泌能のキャパシティを越えない程度の発現量を達成できるプロモーターを適宜採択するか、あるいは活性を弱めるなどの調整を行って使用することが好ましい。多量体タンパク質の中でも、ヘテロ多量体を形成する分子は上記の影響を受けやすく、特に抗体のような分子は重鎖、軽鎖が２分子ずつ会合したヘテロ４量体であるため、適切に会合させるためには発現度は重要な因子である。
また、本発明の発現ベクターには、形質転換体を選抜するための選択マーカーを含めることができる。例えば、酵母用発現ベクターには、Ｈｉｓ１、Ｈｉｓ２、Ｈｉｓ３、Ｈｉｓ４、Ｈｉｓ５、Ｈｉｓ６、Ｌｅｕ２、Ａｒｇ１、Ａｒｇ２、Ａｒｇ３、Ｔｒｐ１、Ｌｙｓ２、Ａｄｅ１、Ａｄｅ２、Ｕｒａ３、Ｕｒａ５遺伝子等から選ばれる栄養要求性マーカー遺伝子を用いることができる。
また、選択マーカーとしては、上記の栄養要求性マーカーのみならず、セルレニン、オーレオバシジン、ゼオシン、カナバニン、シクロヘキシミド、ハイグロマイシン、ブラストシジン、テトラサイクリン、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシンなどの薬剤に対して耐性を付与する薬剤耐性マーカーなどを使用することで、形質転換体の選抜を行うことも可能である。また、エタノール等に対する溶剤耐性や、グリセロールや塩等に対する浸透圧耐性、銅等の金属イオン耐性等を付与する遺伝子をマーカーにすることで、形質転換体の選抜を行うことも可能である。
３．形質転換宿主細胞
本発明の形質転換宿主細胞は、前記１．の遺伝子を、前記２．発現ベクターを用いて導入した形質転換宿主細胞である。
形質転換させる宿主細胞としては、真核細胞、好ましくは酵母である。酵母としては、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｉｒｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ等のメタノール資化性酵母株、あるいはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｙａｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ等の酵母株が挙げられる。より具体的には、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ株としてＯｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ ＹＫ３株（Δｏｃｈ１Δｐｅｐ４Δｐｒｂ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとしてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹ４７４１株（ＭＡＴａ Δｈｉｓ３Δ ｌｅｕ２Δｍｅｔ１５Δ ｕｒａ３）等を用いることができるが、これらに限定はされない。
さらに、本発明は分泌に必須である小胞体（ＥＲ）を補強した宿主細胞を得ることを目的としているため、動物細胞やその他の細胞にも適用可能である。
本発明において、宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、導入遺伝子が宿主内にて安定に存在し、かつ適宜発現させることができる方法であればいかなる方法でもよく、一般的に用いられている方法、例えば、リン酸カルシウム法（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，３４１）、エレクトロポレーション法（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２−１８７）、スフェロプラスト法（Ｃｒｅｇｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５，３３７６（１９８５））、酢酸リチウム法（Ｉｔｏｈ，Ｈ．（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３，１６３−１６８）、リポフェクション法等が挙げられる。
４．タンパク質の製造方法
本発明におけるタンパク質の製造は、上記の形質転換宿主細胞を公知の方法により培養し、その培養物から採取し、精製することにより行うことができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞、培養菌体、または細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
形質転換宿主細胞を培地に培養する方法は、その宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
形質転換宿主細胞が酵母などの微生物の場合は、培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー等が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。また、培地には、選択マーカーの種類に応じ、オーレオバシジン、アンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を適宜添加するか、あるいは、栄養要求性を相補する遺伝子（Ｌｅｕ、Ｕｒａ、Ｔｒｐ等）によって供給可能となるアミノ酸を除いてもよい。
形質転換宿主細胞の培養は、例えば酵母の場合、培地のｐＨは４〜７に調整するのが適当である。また、培養温度は１５〜３２℃、好ましくは２８℃前後である。抗体のように立体構造が複雑なタンパク質を発現する場合、細胞内でそのフォールディングをより効率的に行うために、低温で培養することが好ましい場合もある。培養時間は、２４〜１０００時間程度であり、培養は静置、振とう、攪拌、通気下の回分培養または連続培養等により実施することができる。
上記の培養物（培養液、培養菌体）から外来タンパク質遺伝子の発現産物の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタン解析、ＥＬＩＳＡ等により行うことができる。
また生産されたタンパク質を単離精製するためには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。培養後、目的タンパク質が菌体内または細胞内に生産される場合には、菌体または細胞を超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により破砕することにより、目的タンパク質を採取する。また、目的タンパク質が菌体外または細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体または細胞を除去する。その後、有機溶媒による抽出等により目的タンパク質を採取し、必要に応じて各種クロマトグラフィー（疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー等）、分子篩を用いたゲルろ過法、ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法などの手法を単独あるいは組合わせて用いて単離精製すればよい。
上記の培養法、精製法は一例であって、これらに限定されるものではない。なお、精製された遺伝子産物が有するアミノ酸配列の確認は、公知のアミノ酸分析、例えばエドマン分解法による自動アミノ酸配列決定法等により行うことができる。
本発明において、宿主細胞として酵母を用いる場合、上記の培養をＰｒｏｔｅｉｎ Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰＭＴ）活性を抑制する条件下で行うことがより好ましい。
哺乳類でのＯ型糖鎖の形成は、主にゴルジ体に存在するＰｅｐｔｉｄｅ Ｏ−ＧａｌＮＡｃ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅによってＧａｌＮＡｃが付加されることにより行われる。この糖鎖付加は、タンパク質のフォールディング後に起こる。これに対し、酵母およびカビでのＯ型糖鎖の形成は、ＰＭＴ遺伝子がコードするＰｒｏｔｅｉｎ−Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰＭＴ）によってタンパク質のセリンまたはトレオニン残基にマンノースが付加されることにより始まる。この付加反応をＰＭＴ活性という。このマンノース付加は、細胞中の小胞体（ＥＲ）においてタンパク質のフォールディングと並行して行われるため、哺乳類由来のタンパク質発現では本来起こらない部位に不要な糖鎖が付加されることがある。その結果、不要な修飾に起因する、会合体の形成不全、活性の低下をもたらす。
従って、培養をＰｒｏｔｅｉｎ Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰＭＴ）活性を抑制する条件下で行うことによって、不要なＯ型糖鎖形成を抑制でき、ひいては、タンパク質同士の会合を促進し、タンパク質が本来有する物性・活性を保持することが可能となる。本発明におけるシャペロン遺伝子の導入によるタンパク質の高分泌生産の効果は、ＵＰＲにより増大するＯ型糖鎖形成をＰＭＴ活性の抑制によって制御することによって、更に相乗的な効果を生むことができる。
酵母およびカビに特有のＯ型糖鎖付加を抑制する方法としては、例えば以下の２点が考えられる。またこれらの方法を組合せることもできる。
（１） 酵母およびカビに特有のＯ型糖鎖付加反応を行うＰＭＴ活性を抑制する条件下で培養及び生産を行う。
（２） 酵母およびカビに特有のＯ型糖鎖付加反応を行うＰＭＴ活性が抑制された細胞を用いる。
上記（１）のＰｒｏｔｅｉｎ Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰＭＴ）活性の抑制方法は、例えば、培地にＰＭＴ活性阻害剤（ＰＭＴ阻害剤）を添加することにより行うことができる。ＰＭＴ活性阻害剤としては、例えば、ロダニン−３−酢酸誘導体（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １４，ｐ３９７５−３９７８（２００４）等を用いることができる。より具体的には、ロダニン−３−酢酸誘導体として、５−［［３，４−（１−ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ］−４−ｏｘｏ−２−ｔｈｉｏｘｏ−３−ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．１４，ｐ３９７５，（２００４）中の化合物（１ｃ））または｛（５Ｚ）−４−ｏｘｏ−５−［３−（１−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｏｘｙ）−４−（２−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｏｘｙ）ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ］−２−ｔｈｉｏｘｏ−１，３−ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎ−３−ｙｌ｝ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．１４，ｐ３９７５，（２００４）中の化合物（５ａ））が挙げられる。ＰＭＴは酵母細胞壁を構成するマンノプロテインの生成に重要であり、ＰＭＴ活性を低下させすぎた場合、酵母の生育に影響を与える。従って誘導発現系を用いる場合には、ＰＭＴ活性阻害剤を、細胞の増殖後、外来タンパク質遺伝子の発現時に添加することがより効果的であり、Ｏ型糖鎖修飾が抑制された質の高い目的タンパク質を最大限に生産できる。
また、上記（２）のＰｒｏｔｅｉｎ Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰＭＴ）活性の抑制方法は、ＰＭＴ遺伝子自体を破壊、または遺伝子の発現を抑制することによっても可能である。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＰＭＴは、ＰＭＴ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｌ１９１６９）、ＰＭＴ２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｌ０５１４６）、ＰＭＴ３遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｘ８３７９７）、ＰＭＴ４遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｘ８３７９８）、ＰＭＴ５遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｘ９５６４４）及びＰＭＴ６遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｚ７２９８４）の少なくとも６遺伝子によってコードされており、それぞれがホモ二量体（ＰＭＴ４ｐ）やヘテロ二量体（ＰＭＴ１ｐ／ＰＭＴ２ｐ）を形成して活性を有する。ＰＭＴ遺伝子の破壊は、単独破壊であっても二重破壊であってもよい。上述のようにＰＭＴは酵母の生育にとって重要な遺伝子であり、ＰＭＴ遺伝子の破壊等、活性を消失、または極度に低下させた場合は、細胞壁が卑弱になるので、ＰＭＴ遺伝子の破壊株の利用については注意を要する。ＰＭＴ遺伝子破壊株は、好ましくはＰＭＴ５遺伝子またはＰＭＴ６遺伝子の単独破壊株、ＰＭＴ５遺伝子とＰＭＴ６遺伝子の二重破壊株である。
ＰＭＴ遺伝子を抑制する方法としては、例えばアンチセンスＲＮＡやＲＮＡｉを利用する方法、プロモーターを減弱化させる方法等が挙げられる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし、これらの実施例は本発明の技術的範囲をなんら限定するものではない。本発明の実施例で用いるプラスミド，制限酵素，ＤＮＡ修飾酵素等は市販のものであり、常法に従って使用することができる。また、ＤＮＡのクローニング，塩基配列の決定，宿主細胞の形質転換，形質転極宿主細胞の培養，得られる培養物からの酵素の採取，精製等に用いた操作についても当業者によく知られているものであるか、文献により知ることのできるものである。
抗体遺伝子導入用ベクターの構築
（１）ゼオシン耐性遺伝子を選択マーカーとしたＧＡＰ遺伝子プロモーター及びターミネーターカセットからなる抗体遺伝子導入用ベクターの構築
ゼオシン耐性遺伝子マーカーを作製するため、配列番号１５に示す合成ＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩと制限酵素ＫｐｎＩで二重消化しゼオシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得した。
一方、ＷＯ２００３／０９１４３１記載のｐＯＭｅｘＧＰ１ＵをＳｐｅＩ切断、平滑末端処理後、ライゲーションして得られたプラスミドのＳａｌＩサイトとＥｃｏＴ２２Ｉサイトを、それぞれＳｐｅＩサイト、ＢａｍＨＩサイトへリンカーチェンジすることによってプラスミドｐＯＭｅｘＧＰ１ＵΔＳｐを得た。このｐＯＭｅｘＧＰ１ＵΔＳｐを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩと制限酵素ＫｐｎＩで二重消化して、ＧＡＰ遺伝子プロモーターとターミネーターを含む断片を単離し、これに上記ゼオシン耐性遺伝子マーカーを含むＤＮＡ断片を導入し、プラスミドｐＯＭｅｘＧＰ１Ｚを得た。
抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体遺伝子（ＷＯ２００１／０８３５６０，タカラバイオ社でＯ．ｍｉｎｕｔａのコドン使用頻度を考慮して合成）の重鎖遺伝子の両端に制限酵素サイト（５’側にＸｂａＩサイト、３’側にＢａｍＨＩサイト）の塩基配列を付加した後、ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩで消化することによって抗体重鎖遺伝子断片を得た。
得られた人工合成抗体重鎖遺伝子をテンプレートとして、下記のプライマーＳｙｎＣＨ−ＦとプライマーＳｙｎＣＨ−Ｒを用いてＰＣＲを行ない［（９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分）×２０サイクル］、抗体重鎖遺伝子の定常領域を取得した。
得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｃＩと制限酵素ＢｇｌＩＩで二重消化し、制限酵素ＳａｃＩと制限酵素ＢａｍＨＩで二重消化したｐＯＭｅｘＧＰ１Ｚへ導入した。得られたベクターをｐＯＭｅｘＧＰＺ／ＳｙｎＣＨと命名した。このベクターは制限酵素ＳａｃＩ部位と制限酵素ＮｈｅＩ部位の間に抗体重鎖遺伝子の可変領域を導入することができる。
（２）ＡＤＥ１遺伝子を選択マーカーとしたＧＡＰ遺伝子プロモーター及びターミネーターカセットからなる抗体遺伝子導入用ベクターの構築
ＷＯ２００３／０９１４３１記載のｐＯＭｅｘＧＰ１ＵをＥｃｏＴ２２Ｉで処理し、平滑末端処理後、ＢａｍＨＩリンカーを導入してｐＯＭｅｘＧＰ２Ｕを得た。ｐＯＭｅｘＧＰ２ＵをＳａｌＩで処理し、平滑末端処理後、ＳｐｅＩリンカーを導入してｐＯＭｅｘＧＰ３Ｕを得た。ｐＯＭｅｘＧＰ３ＵをＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩで消化し、ＧＡＰ発現カセットを含む約２．０ｋｂの断片を単離した。この断片を、ｐＯＭｅｘ４Ａ（ＷＯ２００３／０９１４３１に記載）をＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩで処理し単離したＡＤＥ１マーカーを含む約５．０ｋｂの断片とライゲーションし、ベクターｐＯＭｅｘＧＰ１Ａを得た。このｐＯＭｅｘＧＰ１Ａを制限酵素ＢｓｉＷＩで切断して得られた断片を、平滑末端処理した後、ＮｄｅＩリンカー（タカラバイオ社）を導入した。得られたプラスミドをｐＯＭｅｘＧＰ２Ａとした。
抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体遺伝子（ＷＯ２００１／０８３５６０，タカラバイオ社でＯ．ｍｉｎｕｔａのコドン使用頻度を考慮して合成）の軽鎖遺伝子の両端に制限酵素サイト（５’側にＸｂａＩサイト、３’側にＢａｍＨＩサイト）の塩基配列を付加した後、ＸｂａＩ−ＢａｍＨで消化することによって抗体軽鎖遺伝子断片を得た。
得られた人工合成抗体軽鎖遺伝子をテンプレートとして、下記のプライマーＳｙｎＣＬ−ＦとプライマーＳｙｎＣＬ−Ｒを用いてＰＣＲを行ない［（９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分）×２０サイクル］、抗体軽鎖遺伝子の定常領域を取得した。
プライマーＳｙｎＣＬ−Ｆ：５’−ＧＡＣＴＡＧＴＡＡＡＡＡＣＧＴＡＣＧＧＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＴＣＣＧＴＴＴＴＣＡＴＣ−３’（配列番号１８）プライマーＳｙｎＣＬ−Ｒ：５’−ＣＡＧＡＴＣＴＴＴＡＧＣＡＣＴＣＡＣＣＴＣＴＧＴＴＧＡＡＧＧＡＣ−３’（配列番号１９）得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｅＩとＢｇｌＩＩで二重消化し、制限酵素ＳｐｅＩとＢａｍＨＩで二重消化したｐＯＭｅｘＧＰ２Ａへ導入し、得られたベクターをｐＯＭｅｘＧＰＡ／ＳｙｎＣＬとした。このベクターは制限酵素ＳｐｅＩ部位と制限酵素ＢｓｉＷＩ部位間に抗体軽鎖遺伝子の可変領域を導入することができる。
抗体遺伝子発現ベクターの構築
Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来のＫａｒ２シグナル（以下、「ＯｍＫａｒ２シグナル」いう）と抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体の軽鎖、及び重鎖を融合タンパク質として発現させるため、ＯｍＫａｒ２シグナル配列と抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体遺伝子（ＷＯ２００１／０８３５６０，タカラバイオ社でＯ．ｍｉｎｕｔａのコドン使用頻度を考慮して合成）を以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ法によって連結した。
ＯｍＫａｒ２シグナル−抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体の重鎖用
ＯｍＫａｒ２シグナル−抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体の軽鎖用
ＯｍＫａｒ２シグナル配列領域は、Ｙ−ＤＥＲ Ｙｅａｓｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社，７８８７０）によって調製したＯ．ｍｉｎｕｔａのゲノムＤＮＡを鋳型として増幅した。ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して、重鎖用として、プライマーＯｍ−Ｋａｒ２−ＳａｃとＯｍＫａｒ−ＳａｎＨ−Ｒ３を用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で３０秒）×３０サイクル］を、軽鎖用として、プライマーＯｍ−Ｋａｒ２−ＳｐｅとＯｍＫａｒ−ＳａｎＬ−Ｒ３を用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で３０秒）×３０サイクル］を行ない、それぞれ増幅された約０．１ｋｂの目的ＤＮＡ断片を回収した。
抗体遺伝子領域は、抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体ｃＤＮＡ（ＷＯ２００１／０８３５６０）のコドンをＯ．ｍｉｎｕｔａのコドン使用頻度に合わせて合成したＤＮＡを鋳型として増幅した。重鎖用として、プライマーＯｍＫａｒ−ＳａｎＨ−Ｆ３とＳａｎＨ−Ｎｈｅを用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で３０秒）×３０サイクル］を、軽鎖用として、プライマーＯｍＫａｒ−ＳａｎＬ−Ｆ３とＳａｎＬ−Ｂｓｉを用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で３０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、それぞれ増幅された約０．３６ｋｂの重鎖可変領域と約０．３３ｋｂの軽鎖可変領域の目的ＤＮＡ断片を回収した。
次に、増幅した重鎖用ＯｍＫａｒ２シグナル領域と重鎖可変領域を鋳型として、プライマーＯｍ−Ｋａｒ２−ＳａｃとＳａｎＨ−Ｎｈｅを用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で３０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、増幅された約０．４７ｋｂの目的ＤＮＡ断片を回収した。また、増幅された軽鎖用ＯｍＫａｒ２シグナル領域と軽鎖可変領域を鋳型として、プライマーＯｍ−Ｋａｒ２−ＳｐｅとＳａｎＬ−Ｂｓｉを用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で３０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、増幅された約０．４３ｋｂの目的ＤＮＡ断片を回収した。それぞれ回収したＤＮＡ断片は、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした。挿入ＤＮＡ断片の塩基配列より、それぞれＯｍＫａｒ２シグナル−抗体重鎖可変領域及びＯｍＫａｒ２シグナル−抗体軽鎖可変領域が、ｉｎ−ｆｒａｍｅで融合している遺伝子を有していることを確認した。塩基配列を確認したＤＮＡ断片を保持するプラスミドから、プライマーＯｍ−Ｋａｒ２−Ｓａｃに導入したＳａｃＩ制限酵素部位とプライマーＳａｎＨ−Ｎｈｅに導入したＮｈｅＩ制限酵素部位を利用して、ＳａｃＩ−ＮｈｅＩ消化でＯｍＫａｒシグナル−抗体重鎖可変領域を含むＤＮＡ断片を回収した。一方、プライマーＯｍ−Ｋａｒ２−Ｓｐｅに導入したＳｐｅＩ制限酵素部位とプライマーＳａｎＬ−Ｂｓｉに導入したＢｓｉＷＩ制限酵素部位を利用して、ＳｐｅＩ−ＢｓｉＷＩ消化でＯｍＫａｒシグナル−抗体軽鎖可変領域を含むＤＮＡ断片を回収した。
Ｏ．ｍｉｎｕｔａにおいて抗体重鎖と抗体軽鎖を発現させるために、制限酵素ＳａｃＩとＮｈｅＩで二重消化して回収したＯｍＫａｒシグナル−抗体重鎖可変領域をコードするＤＮＡ断片、および制限酵素ＳｐｅＩと制限酵素ＢｓｉＷＩの二重消化で回収したＯｍＫａｒシグナル−抗体軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ断片を、制限酵素ＳａｃＩと制限酵素ＮｈｅＩで二重消化したヒトＩｇＧ１γ鎖定常領域発現ベクターｐＯＭｅｘＧＰＺ／ＳｙｎＣＨ（実施例１にて作成）、および制限酵素ＳｐｅＩと制限酵素ＢｓｉＷＩで二重消化したヒトＩｇＧ１κ鎖定常領域発現ベクターｐＯＭｅｘＧＰＡ／ＳｙｎＣＬ（実施例１にて作成）にそれぞれライゲーションした。それぞれ得られたプラスミドをｏｎａＰ０２７０６とｏｎａＰ０３１０６と命名した。
シャペロン遺伝子単独発現ベクターの構築
（１）ＯｍＰＤＩ１遺伝子恒常発現ベクターの構築
配列番号１に示す塩基配列（１５５１ｂｐ）からなる遺伝子は、配列番号２に示すアミノ酸配列（５１６アミノ酸残基）からなるタンパク質をコードすると推定される。
上記タンパク質は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰＤＩ１（ＹＣＬ０４３Ｃ）とは、塩基配列で約６０．５％の相同性、推定アミノ酸配列で約４６．９％の相同性を有する。上記タンパク質を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＰＤＩ１に含まれる２箇所のチオレドキシン様ドメインＣＧＨＣ（Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ）を同様に含む機能ホモログと推定し、Ｏ．ｍｉｎｕｔａのＰＤＩ１としてＯｍＰＤＩ１と命名した。ＯｍＰＤＩ１の塩基配列は、内部に制限酵素ＥｃｏＴ２２ＩとＳａｌＩの切断部位を含んでいるため、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ法によって制限酵素ＥｃｏＴ２２ＩとＳａｌＩ部位を改変した。
Ｙ−ＤＥＲ Ｙｅａｓｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社，７８８７０）によって調製したＯ．ｍｉｎｕｔａのゲノムＤＮＡを鋳型としてプライマーＯＭＰＤＩ１ＳＡＬとＯＭＰＤＩ９３６Ｒ、ＯＭＰＤＩ９１２ＦとＯＭＰＤＩ１３４３Ｒ、ＯＭＰＤＩ１３２１ＦとＯＭＰＤＩ１Ｔ２２Ｉを用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で６０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、約０．９４ｋｂ、約０．４３ｋｂ、約０．２３ｋｂの目的ＤＮＡ断片を増幅した。次に、上記増幅断片とプライマーＯＭＰＤＩ１ＳＡＬとＯＭＰＤＩ１Ｔ２２Ｉを用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で９０秒）×３０サイクル］を行ない、増幅された約１．６ｋｂの目的ＤＮＡ断片を増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした。挿入ＤＮＡ断片の塩基配列より、ＯｍＰＤＩ１遺伝子を有していることを確認した。塩基配列を確認したＤＮＡ断片を保持するプラスミドから、プライマーＯＭＰＤＩ１ＳＡＬに導入したＳａｌＩ制限酵素部位とプライマーＯＭＰＤＩ１Ｔ２２Ｉに導入したＥｃｏＴ２２Ｉ制限酵素部位を利用して、ＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ消化でＯｍＰＤＩ１を含むＤＮＡ断片を回収した。Ｏ．ｍｉｎｕｔａにおいて恒常的にＯｍＰＤＩ１を発現させるために、ＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ消化で回収したＷＯ２００３／０９１４３１記載のｐＯＭｅｘＧＰ１Ｕにライゲーションした。得られたプラスミドをｏｎａＰ０３６０６と命名した。
（２）ＯｍＭＰＤ１遺伝子恒常発現ベクターの構築
配列番号３に示す塩基配列（９３６ｂｐ）からなる遺伝子は、配列番号４に示すアミノ酸配列（３１１アミノ酸残基）からなるタンパク質をコードすると推定される。
上記タンパク質は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＭＰＤ１（ＹＯＲ２８８Ｃ）とは、塩基配列で約４７．３％の相同性、推定アミノ酸配列で約３１．２％の相同性を有する。上記タンパク質を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＰＤ１に含まれる１箇所のチオレドキシン様ドメインＣＧＨＣ（Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ）を同様に含む機能ホモログと推定し、Ｏ．ｍｉｎｕｔａのＭＰＤ１としてＯｍＭＰＤ１と命名し、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法によって増幅した。
Ｙ−ＤＥＲ Ｙｅａｓｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社，７８８７０）によって調製したＯ．ｍｉｎｕｔａのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で６０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、約０．９４ｋｂの目的ＤＮＡ断片を増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした。挿入ＤＮＡ断片の塩基配列より、ＯｍＭＰＤ１遺伝子を有していることを確認した。塩基配列を確認したＤＮＡ断片を保持するプラスミドから、プライマーＯＭＩＣ１３７９ＳＡＬに導入したＳａｌＩ制限酵素部位とプライマーＯＭＩＣ１３７９Ｔ２２Ｉに導入したＥｃｏＴ２２Ｉ制限酵素部位を利用して、ＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ消化でＯｍＭＰＤ１を含むＤＮＡ断片を回収した。Ｏ．ｍｉｎｕｔａにおいて恒常的にＯｍＰＤＩ１を発現させるために、ＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ消化で回収したＷＯ２００３／０９１４３１記載のｐＯＭｅｘＧＰ１Ｕにライゲーションした。得られたプラスミドをｏｎａＰ０４００６と命名した。
（３）ＯｍＳＣＪ１遺伝子恒常発現ベクターの構築
配列番号５に示す塩基配列（９３０ｂｐ）からなる遺伝子は、配列番号６に示すアミノ酸配列（３０９アミノ酸残基）からなるタンパク質をコードすると推定される。
上記タンパク質は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＣＪ１（ＹＭＲ２１４Ｗ）とは、塩基配列で約５４．８％の相同性、推定アミノ酸配列で約３６．６％の相同性を有する。上記タンパク質を、ＣＸＸＣＸＧＸＧのＤｎａＪタンパク質のｃｅｎｔｒａｌ ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ（ＣＲ）ｄｏｍａｉｎと部分的にＤｎａＪ−Ｃ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｇｉｏｎに相同な領域を含む機能ホモログと推定し、Ｏ．ｍｉｎｕｔａのＳＣＪ１としてＯｍＳＣＪ１と命名し、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法によって増幅した。
Ｙ−ＤＥＲ Ｙｅａｓｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社，７８８７０）によって調製したＯ．ｍｉｎｕｔａのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で６０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、約０．９３ｋｂの目的ＤＮＡ断片を増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした。挿入ＤＮＡ断片の塩基配列より、ＯｍＳＣＪ１遺伝子を有していることを確認した。塩基配列を確認したＤＮＡ断片を保持するプラスミドから、プライマーＯＭＳＣＪ１ＳＡＬに導入したＳａｌＩ制限酵素部位とプライマーＯＭＳＣＪ１Ｔ２２Ｉに導入したＥｃｏＴ２２Ｉ制限酵素部位を利用して、ＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ消化でＯｍＳＣＪ１を含むＤＮＡ断片を回収した。Ｏ．ｍｉｎｕｔａにおいて恒常的にＯｍＳＣＪ１を発現させるために、ＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ消化で回収したＷＯ２００３／０９１４３１記載のｐＯＭｅｘＧＰ１Ｕにライゲーションした。得られたプラスミドをｏｎａＰ０３８０６と命名した。
（４）ＯｍＥＵＧ１遺伝子恒常発現ベクターの構築
配列番号７に示す塩基配列（１１３７ｂｐ）からなる遺伝子は、配列番号８に示すアミノ酸配列（３７８アミノ酸残基）からなるタンパク質をコードすると推定される。
上記タンパク質は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｆａｍｉｌｙと明瞭な相同性は示さないが、Ｎ末端より５２−５５番目にＣＨＳＣ、１７４−１７７番目にＣＧＹＣのチオレドキシン様ドメインを有していた。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、チオレドキシン様ドメインを有するＰｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅは５種知られているが、分子内に２つのチオレドキシン様ドメインを有するのはＰＤＩ１とＥＵＧ１のみである。また、２つのチオレドキシン様ドメインがＮ末端から分子の中央にかけて存在するのはｈｕｍａｎ ＰＤＩ ｆａｍｉｌｙに属するＰ５（Ｇｅｎｅ，１９９５，１６４，ｐ３７７−３７８）のみであることから、上記タンパク質は、Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅとして機能することが推察される。また、Ｃ末端にＫＤＥＬのＥＲ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎを有しており、酵母の小胞体内でＰｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅとして機能していることも推察された。
従って、上記タンパク質を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＥＵＧ１の機能ホモログと推定し、Ｏ．ｍｉｎｕｔａのＥＵＧ１としてＯｍＥＵＧ１と命名した。ＯｍＥＵＧ１の塩基配列は、内部に制限酵素ＥｃｏＴ２２ＩとＳａｌＩの切断部位を含んでいるため、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ法によって制限酵素ＥｃｏＴ２２ＩとＳａｌＩ部位を改変した。
Ｙ−ＤＥＲ Ｙｅａｓｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社，７８８７０）によって調製したＯ．ｍｉｎｕｔａのゲノムＤＮＡを鋳型としてプライマーＯＭＥＵＧ１ＳＡＬとＯＭＥＵＧ８４０Ｒ、ＯＭＥＵＧ８１９ＦとＯＭＥＵＧ９４６Ｒ、ＯＭＥＵＧ９２５ＦとＯＭＥＵＧ１Ｔ２２Ｉを用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で６０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、約０．８４ｋｂ、約０．１３ｋｂ、約０．２１ｋｂの目的ＤＮＡ断片を増幅した。次に、上記増幅断片とプライマーＯＭＥＵＧ１ＳＡＬとＯＭＥＵＧ１Ｔ２２Ｉを用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で９０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ ＰｆｘＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、約１．１ｋｂの目的ＤＮＡ断片を増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした。挿入ＤＮＡ断片の塩基配列より、ＯｍＥＵＧ１遺伝子を有していることを確認した。塩基配列を確認したＤＮＡ断片を保持するプラスミドから、プライマーＯＭＥＵＧ１ＳＡＬに導入したＳａｌＩ制限酵素部位とプライマーＯＭＥＵＧ１Ｔ２２Ｉに導入したＥｃｏＴ２２Ｉ制限酵素部位を利用して、ＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ消化でＯｍＥＵＧ１を含むＤＮＡ断片を回収した。Ｏ．ｍｉｎｕｔａにおいて恒常的にＯｍＥＵＧ１を発現させるために、ＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ消化で回収したＷＯ２００３／０９１４３１記載のｐＯＭｅｘＧＰ１Ｕにライゲーションした。得られたプラスミドをｏｎａＰ０３７０６と命名した。
（５）ＯｍＥＲＯ１遺伝子恒常発現ベクターの構築
配列番号９に示す塩基配列（１７２８ｂｐ）からなる遺伝子は、配列番号１０に示すアミノ酸配列（５７５アミノ酸残基）からなるタンパク質をコードすると推定される。
上記タンパク質は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲＯ１（ＹＭＬ１３０Ｃ）とは、塩基配列で約３７．４％の相同性、推定アミノ酸配列で約３５．１％の相同性を有する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲＯ１においては、１４のＣｙｓ残基が存在し、少なくとも１０箇所のＣｙｓ残基がジスルフィド結合に関与していることが知られている（Ｃｅｌｌ，２００７，１２９，ｐ３３３−３４４）。その中で、４箇所のＣｙｓ残基がＥＲＯ１の活性には重要であり、Ｃｙｓ１００−Ｃｙｓ１０５は、ｓｈｕｔｔｌｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅと呼ばれ、ＰＤＩ１の酸化に、Ｃｙｓ３５２−Ｃｙｓ３５５は、還元されたｓｈｕｔｔｌｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅの再酸化に関与することが明らかにされている（Ｍｏｌｌ．Ｃｅｌｌ，１９９９，４，ｐ４６９−４７７）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＥＲＯ１と配列番号１０との相同検索によって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣｙｓ１００−Ｃｙｓ１０５のｓｈｕｔｔｌｅ Ｃｙｓに相当するＣｙｓ１２５−Ｃｙｓ１３０とＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣｙｓ３５２−Ｃｙｓ３５５のａｃｔｉｖｅ Ｃｙｓに相当するＣｙｓ３８４−Ｃｙｓ３８７は、保存されていることから、上記タンパク質は、Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ様活性を有することが推察される。従って、上記タンパク質を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＥＲＯ１の機能ホモログと推定し、Ｏ．ｍｉｎｕｔａのＥＲＯ１としてＯｍＥＲＯ１と命名した。ＯｍＥＲＯ１の塩基配列は、内部に制限酵素ＳａｌＩの切断部位を含んでいるため、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ法によって制限酵素ＳａｌＩ部位を改変した。
Ｙ−ＤＥＲ Ｙｅａｓｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社，７８８７０）によって調製したＯ．ｍｉｎｕｔａのゲノムＤＮＡを鋳型としてプライマーＯＭＥＲＯＳＡＬとＯＭＥＲＯ１９０Ｒ、ＯＭＥＲＯ１６６ＦとＯＭＥＲＯＴ２２Ｉを用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で６０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、約０．１９ｋｂ、約１．５６ｋｂの目的ＤＮＡ断片を増幅した。次に、上記増幅断片とプライマーＯＭＥＲＯＳＡＬとＯＭＥＲＯＴ２２Ｉを用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で１２０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ ＰｆｘＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、約１．７３ｋｂの目的ＤＮＡ断片を増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした。挿入ＤＮＡ断片の塩基配列より、ＯｍＥＲＯ１遺伝子を有していることを確認した。塩基配列を確認したＤＮＡ断片を保持するプラスミドから、プライマーＯＭＥＲＯＳＡＬに導入したＳａｌＩ制限酵素部位とプライマーＯＭＥＲＯＴ２２Ｉに導入したＥｃｏＴ２２Ｉ制限酵素部位を利用して、ＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ消化でＯｍＥＲＯ１を含むＤＮＡ断片を回収した。Ｏ．ｍｉｎｕｔａにおいて恒常的にＯｍＥＲＯ１を発現させるために、ＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ消化で回収したＷＯ２００３／０９１４３１記載のｐＯＭｅｘＧＰ１Ｕにライゲーションした。得られたプラスミドをｏｎａＰ０３９０６と命名した。
（６）ＯｍＨＳＰ１０４遺伝子恒常発現ベクターの構築
配列番号１１に示す塩基配列（２７００ｂｐ）からなる遺伝子は、配列番号１２に示すアミノ酸配列（８９９アミノ酸残基）からなるタンパク質をコードすると推定される。
上記タンパク質は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＨＳＰ１０４（ＹＬＬ０２６Ｗ）とは、塩基配列で約６０．４％の相同性、推定アミノ酸配列で約６３．４％の相同性を有する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＨＳＰ１０４は、ＨＳＰ１００／Ｃｌｐファミリーに属する分子シャペロンで、ＨＳＰ７０／ＨＳＰ４０ファミリーに属する分子シャペロンとその補助シャペロンと協調して、凝集してしまったタンパク質を再生させる役割がある。上記タンパク質は、分子内にＣｌｐ ａｍｉｎｏｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎとＡＡＡ＋ｄｏｍａｉｎを２箇所有しており、ＨＳＰ１０４様活性を有することが推察される。従って、上記タンパク質を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＨＳＰ１０４の機能ホモログと推定し、Ｏ．ｍｉｎｕｔａのＨＳＰ１０４としてＯｍＨＳＰ１０４と命名した。
Ｙ−ＤＥＲ Ｙｅａｓｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社，７８８７０）によって調製したＯ．ｍｉｎｕｔａのゲノムＤＮＡを鋳型としてプライマーＯｍＨＳＰ１０４ｓａｌＦ（５’−ＧＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＴＴＣＴＡＣＧＣＡＡＴＴＴＡＣ−３’：配列番号４８）とＯｍＨＳＰ１０４ＥｃｏＴＲ（５’−ＧＡＴＧＣＡＴＴＴＡＡＴＣＧＡＧＡＴＣＡＧＧＡＣＴＧＣ−３’：配列番号４９）を用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で１８０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、約２．７ｋｂの目的ＤＮＡ断片を増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした。挿入ＤＮＡ断片の塩基配列より、ＯｍＨＳＰ１０４遺伝子を有していることを確認した。塩基配列を確認したＤＮＡ断片を保持するプラスミドから、プライマーＯｍＨＳＰ１０４ｓａｌＦに導入したＳａｌＩ制限酵素部位とプライマーＯｍＨＳＰ１０４ＥｃｏＴＲに導入したＥｃｏＴ２２Ｉ制限酵素部位を利用して、ＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ消化でＯｍＨＳＰ１０４を含むＤＮＡ断片を回収した。Ｏ．ｍｉｎｕｔａにおいて恒常的にＯｍＨＳＰ１０４を発現させるために、ＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ消化で回収したＷＯ２００３／０９１４３１記載のｐＯＭｅｘＧＰ１Ｕにライゲーションした。得られたプラスミドをｏｎａＰ０７１０７と命名した。
（７）ＯｍＫａｒ２遺伝子恒常発現ベクターの構築
配列番号１３に示す塩基配列（１９９８ｂｐ）からなる遺伝子は、配列番号１４に示すアミノ酸配列（６６５アミノ酸残基）からなるタンパク質をコードすると推定される。
上記タンパク質は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＫａｒ２（ＹＪＬ０３４Ｗ）とは、塩基配列で約６０．４％の相同性、推定アミノ酸配列で約７４．６％の相同性から機能ホモログと推定し、Ｏ．ｍｉｎｕｔａのＫａｒ２としてＯｍＫａｒ２と命名した。ＯｍＫａｒ２の塩基配列は、内部に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩの切断部位を含んでいる。ｐＯＭＥＧＰＵ−１にクローニング後、プロモーターからターミネーターまで含む発現カセットを回収するために、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ法によって制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩ部位を改変した。
Ｙ−ＤＥＲ Ｙｅａｓｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社，７８８７０）によって調製したＯ．ｍｉｎｕｔａのゲノムＤＮＡを鋳型としてプライマーＯＭＫＡＲ−ＦとＫａｒ１−Ｒ、Ｋａｒ１−ＦとＫａｒ２−Ｒ、Ｋａｒ２−ＦとＫａｒ３−Ｒ、Ｋａｒ３−ＦとＯＭＫＡＲ−Ｒを用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で６０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、約０．６ｋｂ、約０．９５ｋｂ、約０．３ｋｂ、約０．２ｋｂの目的ＤＮＡ断片を増幅した。次に、上記増幅断片とプライマーＯＭＫＡＲ−ＦとＯＭＫＡＲ−Ｒを用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で９０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ ＰｆｘＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、約２．０ｋｂの目的ＤＮＡ断片を増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした。挿入ＤＮＡ断片の塩基配列より、ＯｍＫａｒ２遺伝子を有していることを確認した。塩基配列を確認したＤＮＡ断片を保持するプラスミドから、プライマーＯＭＫＡＲ−Ｆに導入したＳａｌＩ制限酵素部位とプライマーＯＭＫＡＲ−Ｒに導入したＥｃｏＴ２２Ｉ制限酵素部位を利用して、ＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ消化でＯｍＫａｒ２を含むＤＮＡ断片を回収した。Ｏ．ｍｉｎｕｔａにおいて恒常的にＯｍＫａｒ２を発現させるために、ＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ消化で回収したＷＯ２００３／０９１４３１記載のｐＯＭｅｘＧＰ１Ｕにライゲーションした。得られたプラスミドをｏｎａＰ０９００７と命名した。
（８）ＳｃＰＤＩ１遺伝子恒常発現ベクターの構築
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰＤＩ１（ＹＣＬ０４３Ｃ）は、１５６９ｂｐの塩基配列によりコードされる５２２アミノ酸残基のアミノ酸配列からなる（配列番号１２０、１２１）。Ｙ−ＤＥＲ Ｙｅａｓｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社，７８８７０）によって調製したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型としてプライマーＳｃＰＤＩ−ｓａｌ−Ｆ（５’−ＧＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＣＴＧＣＴＧＧＴＧ−３’：配列番号５８）とＳｃＰＤＩ−ＥｃｏＴ−Ｒ（５’−ＧＡＴＧＣＡＴＴＴＡＣＡＡＴＴＣＡＴＣＧＴＧＡＡＴＧ−３’配列番号５９）を用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で９０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、約１．６ｋｂの目的ＤＮＡ断片を増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした。挿入ＤＮＡ断片の塩基配列より、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＰＤＩ１（ＳｃＰＤＩ１）遺伝子を有していることを確認した。塩基配列を確認したＤＮＡ断片を保持するプラスミドから、プライマーＳｃＰＤＩ−ｓａｌ−Ｆに導入したＳａｌＩ制限酵素部位とプライマーＳｃＰＤＩ−ＥｃｏＴ−Ｒに導入したＥｃｏＴ２２Ｉ制限酵素部位を利用して、ＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ消化でＳｃＰＤＩ１を含むＤＮＡ断片を回収した。Ｏ．ｍｉｎｕｔａにおいて恒常的にＳｃＰＤＩ１を発現させるために、ＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ消化で回収したＷＯ２００３／０９１４３１記載のｐＯＭｅｘＧＰ１Ｕにライゲーションした。得られたプラスミドをｏｎａＰ０９３０７と命名した。
（９）Ｈｕｍａｎ ＰＤＩ遺伝子恒常発現ベクターの構築
Ｈｕｍａｎ ＰＤＩ（ｈＰＤＩ，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．Ｐ０７２３７）は、１５２７ｂｐの塩基配列によりコードされる５０８アミノ酸残基のアミノ酸配列からなる（配列番号１４０、１４１）。Ｈｕｍａｎ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅ ＡＫ０９５９３８は、開始コドンから１２６番目−１４５番目まで２０ｂｐ（５’−ＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＴＣＴ−３’）のＤＮＡ配列が欠失している。ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ法によってＡＫ０９５９３８を鋳型として欠失している２０ｂｐの領域を修復した。次に、プライマーＳａｌｍｏｄｉｆｉｅｄＰＤＩ−Ｆ（５’−ＧＧＴＣＧＡＣＡＴＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＧＣＴＣＴＧＣ−３’：配列番号６０）とＥｃｏＴｍｏｄｉｆｉｅｄＰＤＩ−Ｒ（５’−ＧＡＴＧＣＡＴＴＴＡＣＡＧＴＴＣＡＴＣＴＴＴＣＡＣＡＧ−３’：配列番号６１）を用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で９０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、約１．５ｋｂの目的ＤＮＡ断片を増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした。挿入ＤＮＡ断片の塩基配列より、ｈＰＤＩ遺伝子を有していることを確認した。塩基配列を確認したＤＮＡ断片を保持するプラスミドから、プライマーＳａｌｍｏｄｉｆｉｅｄＰＤＩ−Ｆに導入したＳａｌＩ制限酵素部位とプライマーＥｃｏＴｍｏｄｉｆｉｅｄＰＤＩ−Ｒに導入したＥｃｏＴ２２Ｉ制限酵素部位を利用して、ＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ消化でｈＰＤＩを含むＤＮＡ断片を回収した。Ｏ．ｍｉｎｕｔａにおいて恒常的にｈＰＤＩを発現させるために、ＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ消化で回収したＷＯ２００３／０９１４３１記載のｐＯＭｅｘＧＰ１Ｕにライゲーションした。得られたプラスミドをｏｎａＰ０９２０７と命名した。
（１０）コドン改変Ｈｕｍａｎ ＰＤＩ遺伝子恒常発現ベクターの構築
Ｈｕｍａｎ ＰＤＩ（ｈＰＤＩ，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．Ｐ０７２３７）は、１５２７ｂｐの塩基配列によりコードされる５０８アミノ酸残基のアミノ酸配列からなる。Ｏ．ｍｉｎｕｔａのＣｏｄｏｎ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅを考慮してｈＰＤＩ遺伝子を合成した（オペロンバイオテクノロジー社）。塩基配列を確認したＤＮＡ断片を保持するプラスミドから、合成時に導入したＳａｌＩ制限酵素部位とＥｃｏＴ２２Ｉ制限酵素部位を利用して、ＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ消化で合成ｈＰＤＩを含むＤＮＡ断片（配列番号１４２）を回収した。Ｏ．ｍｉｎｕｔａにおいて恒常的に合成ｈＰＤＩを発現させるために、ＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ消化で回収したＷＯ２００３／０９１４３１記載のｐＯＭｅｘＧＰ１Ｕにライゲーションした。得られたプラスミドをｏｎａＰ０９１０７と命名した。
シャペロン遺伝子組合せ発現ベクターの構築
（１）２つ目のシャペロン導入用ベクターｐＺ／ＧｐＧｔの構築
２つのシャペロン遺伝子を共発現させるために、ＧＡＰプロモーターとＧＡＰターミネーターを有し、選択マーカーとしてゼオシン耐性遺伝子を保持するベクターを以下のように構築した。ｐＯＭｅｘＧＰ１ＵのＧＡＰプロモーター上流のＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位とＧＡＰターミネーター下流のＫｐｎＩ制限酵素切断部位を制限酵素ＡｐａＩ認識配列ＧＧＧＣＣＣに置き換えるために、プライマーＧＡＰｐ−０２Ａｐａ（５’−ＧＣＡＧＧＧＣＣＣＴＡＣＴＧＧＴＴＣＡＡＧＧ−３’：配列番号６２）とＧＡＰｔ−０２Ａｐａ（５’−ＧＣＡＧＧＧＣＣＣＧＣＴＣＧＡＡＴＣＧＡＣ−３’：配列番号６３）を用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で１２０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、約２．１ｋｂの目的ＤＮＡ断片をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした。挿入ＤＮＡ断片の塩基配列より、ＧＡＰプロモーターとＧＡＰターミネーター領域を含んでいることを確認した。塩基配列を確認したＤＮＡ断片を、ｐＯＭｅｘＧＰＺ／ＳｙｎＣＨのＧＡＰプロモーター上流の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列とＧＡＰターミネーター下流の制限酵素ＫｐｎＩ認識配列にｐＡｐａＩリンカー（タカラバイオ社，４６０５Ｐ）を挿入することによって、制限酵素ＡｐａＩ認識配列に置き換えたベクターｐＯＭｅｘＧＰＺ／ＳｙｎＣＨ−ＡＡのＡｐａＩサイトに導入し、ゼオシン耐性遺伝子マーカーで選択できるＧＡＰプロモーターとＧＡＰターミネーターを保持するベクターｐＺ／ＧｐＧｔを構築した。
（２）ＯｍＰＤＩ１遺伝子とＯｍＥＲＯ１遺伝子の共発現および恒常発現ベクターの構築
ＯｍＥＲＯ１恒常発現ベクターｏｎａＰ０３９０６から制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＴ２２ＩによってＯｍＥＲＯ１領域を回収した。ｐＺ／ＧｐＧｔを制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＴ２２Ｉで消化した後、ＯｍＥＲＯ１を含むＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ断片を導入し、ｐＺ／ＧｐＧｔ／ＯｍＥＲＯ１を構築した。次に、ｐＺ／ＧｐＧｔ／ＯｍＥＲＯ１を制限酵素ＡｐａＩで消化した後、ＧＡＰプロモーター−ＯｍＥＲＯ１−ＧＡＰターミネーター（ＯｍＥＲＯ１発現カセット）を含む断片を回収した。回収したＯｍＥＲＯ１発現カセットは、ＯｍＰＤＩ１発現ベクターｏｎａＰ０３６０６の制限酵素ＡｐａＩ
部位に導入後、ＰＣＲ法によって挿入方向を確認し、ＯｍＰＤＩ１発現ベクターｏｎａＰ０３６０６のＵＲＡ３マーカーを中心に逆向きにＯｍＰＤＩ１とＯｍＥＲＯ１の発現カセットが導入されているベクターを選抜した。得られたＯｍＰＤＩ１とＯｍＥＲＯ１の共発現ベクターをｏｎａＰ０９５０７と命名した（図１）。
（３）ＯｍＰＤＩ１遺伝子とＯｍＫａｒ２遺伝子の共発現および恒常発現ベクターの構築
ＯｍＫａｒ２恒常発現ベクターｏｎａＰ０９００７から制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＴ２２ＩによってＯｍＫａｒ２領域を回収した。ｐＺ／ＧｐＧｔを制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＴ２２Ｉで消化した後、ＯｍＫａｒ２を含むＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ断片を導入し、ｐＺ／ＧｐＧｔ／ＯｍＫａｒ２を構築した。次に、ｐＺ／ＧｐＧｔ／ＯｍＫａｒ２を制限酵素ＡｐａＩで消化した後、ＧＡＰプロモーター−ＯｍＫａｒ２−ＧＡＰターミネーター（ＯｍＫａｒ２発現カセット）を含む断片を回収した。回収したＯｍＫａｒ２発現カセットは、ＯｍＰＤＩ１発現ベクターｏｎａＰ０３６０６の制限酵素ＡｐａＩ
部位に導入後、ＰＣＲ法によって挿入方向を確認し、ＯｍＰＤＩ１発現ベクターｏｎａＰ０３６０６のＵＲＡ３マーカーを中心に逆向きにＯｍＰＤＩ１とＯｍＫａｒ２の発現カセットが導入されているベクターを選抜した。得られたＯｍＰＤＩ１とＯｍＫａｒ２の共発現ベクターをｏｎａＰ０９７０７と命名した（図１）。
（４）ＯｍＰＤＩ１遺伝子とＯｍＨＳＰ１０４遺伝子の共発現および恒常発現ベクターの構築
ＯｍＨＳＰ１０４恒常発現ベクターｏｎａＰ０７１０７から制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＴ２２ＩによってＯｍＨＳＰ１０４領域を回収した。ｐＺ／ＧｐＧｔを制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＴ２２Ｉで消化した後、ＯｍＨＳＰ１０４を含むＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ断片を導入し、ｐＺ／ＧｐＧｔ／ＯｍＨＳＰ１０４を構築した。次に、ｐＺ／ＧｐＧｔ／ＯｍＨＳＰ１０４を制限酵素ＡｐａＩで消化した後、ＧＡＰプロモーター−ＯｍＨＳＰ１０４−ＧＡＰターミネーター（ＯｍＨＳＰ１０４発現カセット）を含む断片を回収した。回収したＯｍＨＳＰ１０４発現カセットは、ＯｍＰＤＩ１発現ベクターｏｎａＰ０３６０６の制限酵素ＡｐａＩ部位に導入後、ＰＣＲ法によって挿入方向を確認し、ＯｍＰＤＩ１発現ベクターｏｎａＰ０３６０６のＵＲＡ３マーカーを中心に逆向きにＯｍＰＤＩ１とＯｍＨＳＰ１０４の発現カセットが導入されているベクターを選抜した。得られたＯｍＰＤＩ１とＯｍＨＳＰ１０４の共発現ベクターをｏｎａＰ０９６０７と命名した（図１）。
（５）ＯｍＰＤＩ１遺伝子の発現カセットを２コピー保持する恒常発現ベクターの構築
ＯｍＰＤＩ１恒常発現ベクターｏｎａＰ０３６０６から制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＴ２２ＩによってＯｍＰＤＩ１領域を回収した。ｐＺ／ＧｐＧｔを制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＴ２２Ｉで消化した後、ＯｍＰＤＩ１を含むＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ断片を導入し、ｐＺ／ＧｐＧｔ／ＯｍＰＤＩ１を構築した。次に、ｐＺ／ＧｐＧｔ／ＯｍＰＤＩ１を制限酵素ＡｐａＩで消化した後、ＧＡＰプロモーター−ＯｍＰＤＩ１−ＧＡＰターミネーター（ＯｍＰＤＩ１発現カセット）を含む断片を回収した。回収したＯｍＰＤＩ１発現カセットは、ＯｍＰＤＩ１発現ベクターｏｎａＰ０３６０６の制限酵素ＡｐａＩ
部位に導入後、ＰＣＲ法によって挿入方向を確認し、ＯｍＰＤＩ１発現ベクターｏｎａＰ０３６０６のＵＲＡ３マーカーを中心に逆向きに１コピー目のＯｍＰＤＩ１と２コピー目のＯｍＰＤＩ１の発現カセットが導入されているベクターを選抜した。得られた２コピーのＯｍＰＤＩ１発現カセットを保持する共発現ベクターをｏｎａＰ０９４０７と命名した（図１）。
（６）ｈＰＤＩ遺伝子とＯｍＥＲＯ１遺伝子の共発現および恒常発現ベクターの構築
ＯｍＥＲＯ１恒常発現ベクターｏｎａＰ０３９０６から制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＴ２２ＩによってＯｍＥＲＯ１領域を回収した。ｐＺ／ＧｐＧｔを制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＴ２２Ｉで消化した後、ＯｍＥＲＯ１を含むＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ断片を導入し、ｐＺ／ＧｐＧｔ／ＯｍＥＲＯ１を構築した。次に、ｐＺ／ＧｐＧｔ／ＯｍＥＲＯ１を制限酵素ＡｐａＩで消化した後、ＧＡＰプロモーター−ＯｍＥＲＯ１−ＧＡＰターミネーター（ＯｍＥＲＯ１発現カセット）を含む断片を回収した。回収したＯｍＥＲＯ１発現カセットは、コドン改変Ｈｕｍａｎ ＰＤＩ遺伝子恒常発現ベクターｏｎａＰ０９１０７の制限酵素ＡｐａＩ部位に導入後、ＰＣＲ法によって挿入方向を確認し、コドン改変Ｈｕｍａｎ ＰＤＩ恒常発現ベクターｏｎａＰ０９１０７のＵＲＡ３マーカーを中心に逆向きにコドン改変Ｈｕｍａｎ ＰＤＩとＯｍＥＲＯ１の発現カセットが導入されているベクターを選抜した。得られたコドン改変Ｈｕｍａｎ ＰＤＩとＯｍＥＲＯ１の共発現ベクターをｏｎａＰ１１１０７と命名した（図２）。
（７）ＯｍＰＤＩ１遺伝子、ＯｍＥＲＯ１遺伝子とＯｍＫａｒ２遺伝子の共発現および恒常発現ベクターの構築
３つのシャペロン遺伝子の共発現ベクターを以下のように構築した。
（７−１）ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を選択マーカーとしたホスホグリセリンキナーゼ（ＰＧＫ１）プロモーター及びターミネーターによる外来遺伝子発現ベクター（ｐＯＭｅｘＰＧＨｙ）の構築
Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ ＩＦＯ１０７４６株よりホスホグリセリンキナーゼをコードするＰＧＫ１遺伝子の取得、及びその塩基配列決定を行った。
（ｉ）プローブの作成
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号；Ｐ００５６０）及びＣａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号；Ｐ４１７５７）由来の保存されているアミノ酸配列ＲＶＤＦＮＶＰＬＤ，ＥＧＫＥＬＰＧＶＡに対応する塩基配列のＤＮＡ縮重プライマーを以下のように合成した。
プライマーＰＰＧ５（配列番号６４）はアミノ酸配列ＲＶＤＦＮＶＰＬＤに対応し、プライマーＰＰＧ３（配列番号６５）はアミノ酸配列ＥＧＫＥＬＰＧＶＡに対応する塩基配列の相補鎖の配列である。Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＩＦＯ１０７４６株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマーＰＰＧ５、ＰＰＧ３を用いて、ＰＣＲ［９４℃で３０秒、５０℃で１分、７２℃で１分）×２５サイクル］を行った。増幅された約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いてクローニングした。得られたクローンよりプラスミドＤＮＡを単離し、塩基配列を決定することで、プラスミドの挿入ＤＮＡ断片に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＣ．ｍａｌｔｏｓａ由来のＰＧＫ１遺伝子のアミノ酸配列と高い相同性を持つアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するクローンを選抜した。１．２ｋｂの挿入ＤＮＡ断片は、プラスミドをＥｃｏＲＩで切断し、アガロース電気泳動後、回収した。
（ｉｉ）ライブラリーの作成、及びスクリーニング
Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＩＦＯ１０７４６株の染色体ＤＮＡを種々の制限酵素で切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動を行った。分離したＤＮＡをＨｙｂｏｎｄＮ＋ナイロンメンブレン（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）にトランスファーした。上記で得られたＤＮＡ断片をＡｌｋＰｈｏｓ ＤＩＲＥＣＴ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社，ＲＰＮ３６９０）を用いて標識し、サザンハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは、常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｎ．，ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８９）に従って行った。その結果、約９．０ｋｂのＢａｍＨＩ断片にＰＧＫ１遺伝子が存在すると考えられた。そこでそのＤＮＡ断片をクローニングすべく、ゲノムライブラリーを作成した。Ｏ．ｍｉｎｕｔａの染色体ＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、アガロース電気泳動後、約９．０ｋｂ付近のＤＮＡ断片をゲルから回収した。回収したＤＮＡ断片をＢａｍＨＩで切断したｐＵＣ１１８とライゲーションした後、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｇｅｎｅ，１０，６３（１９８０））で大腸菌ＤＨ５α株に形質転換して、ライブラリーを作成した。約４０００クローンを前述のＤＮＡ断片をプローブとしたコロニー・ハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。得られた陽性クローンの中から、ＰＧＫ１遺伝子を保持したプラスミドｐＯＭＰＧＫ１を選抜した。
（ｉｉｉ）塩基配列決定
プラスミドｐＯＭＰＧＫ１内のＢａｍＨＩ領域間塩基配列を、プライマーウォーキング法によって決定したところ、配列番号６６に示す塩基配列を有していた。配列番号６６の塩基配列には、４７６６番目から始まり、６０１６番目で終わる１２５４塩基対からなるオープンリーディングフレームが存在する。このオープンリーディングフレームから推定される配列番号６７に示すアミノ酸配列とＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＣａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ由来のホスホグリセリンキナーゼとの相同性を調べたところ、それぞれ７４％、８１％であった。
（ｉｖ）ＰＧＫ１遺伝子プロモーターとターミネーターとを使った外来遺伝子発現カセットの構築
Ｏ．ｍｉｎｕｔａのＰＧＫ１遺伝子プロモーターを含む断片とターミネーターを含む断片との間に外来遺伝子を導入する発現カセットを作製した。ＰＧＫ１遺伝子プロモーターとターミネーターとの間にＳｐｅＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩ部位を導入するために、以下のプライマーを合成した。
上記ｐＯＭＰＧＫ１を鋳型とし、プライマーＯＰＧＫ−Ｐ−Ｆ（配列番号６８）とＯＰＧＫ−Ｐ−Ｒ（配列番号６９）を用いたＰＣＲ［９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１分）×２０サイクル］、プライマーＯＰＧＫ−Ｔ−Ｆ（配列番号７０）とＯＰＧＫ−Ｔ−Ｒ（配列番号７１）を用いたＰＣＲ［９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１分）×２０サイクル］を行った。それぞれ増幅された１．５ｋｂ、１．０ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いてクローニングした。挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、正しい塩基配列を有するクローンを選抜した。１．５ｋｂ、１．０ｋｂの挿入ＤＮＡ断片はそれぞれ、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片及びＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ断片として単離した。
ＷＯ２００３／０９１４３１に記載のｐＯＭｅｘ５ＨのＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ間に、上記１．０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ断片を導入した。その後得られたプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ間に、上記１．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を導入した。得られたプラスミドをｐＯＭｅｘＰＧＨｙと命名した。ｐＯＭｅｘＰＧＨｙはＰＧＫ１遺伝子発現カセット内にＳｐｅＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩ部位を持つ外来遺伝子発現ベクターである。
（７−２）ＧＡＰプロモーター発現制御によるＯｍＰＤＩ１、ＯｍＥＲＯ１とＰＧＫプロモーター発現制御によるＯｍＫａｒ２の共発現ベクターの構築
上記のようにして調製したｐＯＭｅｘＰＧＨｙベクターよりＰＧＫプロモーターとＰＧＫターミネーター領域をベクターよりＰＣＲ法によってクローニングした。ＰＧＫプロモーター領域は、プライマーＯｍＰＧＫｐ−０１Ｈｄ（５’−ＧＧＡＡＧＣＴＴＧＡＣＡＡＴＧＴＡＧＧＡＧＡＴＣＡＴＡＡＡＣＡ−３’：配列番号７２）とプライマーＯｍＰＧＫｐ−０２Ｓａｌ（５’−ＧＧＴＣＧＡＣＴＧＣＴＡＧＴＴＣＴＡＴＧＣＧＧＣ−３’：配列番号７３）をＰＧＫターミネーター領域は、プライマーＯｍＰＧＫｔ−０１ＥｃｏＴ（５’−ＧＧＡＴＧＣＡＴＧＴＧＧＧＡＴＴＴＧＣＧＴＧＡＴＣＴＡＣ−３’：配列番号７４）とプライマーＯｍＰＧＫｔ−０２Ｋｐｎ（５’−ＧＧＧＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＧＡＴＴＴＴＣＴＴＧＧＴＣＧ−３’：配列番号７５）を用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で９０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、それぞれ約１．５ｋｂと約０．５ｋｂの目的ＤＮＡ断片をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした。挿入ＤＮＡ断片の塩基配列より、ＰＧＫプロモーターとＰＧＫターミネーター領域を含んでいることを確認した。
次に、ＯｍＫａｒ２遺伝子恒常発現ベクターｏｎａＰ０９００７を制限酵素ＥｃｏＴ２２ＩとＫｐｎＩで消化し、制限酵素ＥｃｏＴ２２ＩとＫｐｎＩで消化して回収したＰＧＫターミネーター領域をライゲーションした。さらに、得られたプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで消化し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで消化して回収したＰＧＫプロモーター領域をライゲーションした。得られたプラスミドは、ＧＡＰプロモーターとＧＡＰターミネーターがＰＧＫプロモーターとＰＧＫターミネーターに置換され、ＰＧＫプロモーターによってＯｍＫａｒ２の発現が制御されるベクターとして、ｐＯＵ１／Ｋａｒ２Ｐｐｔと命名した（図３）。ｐＯＵ１／Ｋａｒ２Ｐｐｔは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ部位を平滑化した後、ｐＫｐｎＩリンカー（タカラバイオ社，４６６８Ｐ）によって制限酵素ＫｐｎＩ切断部位を導入し得られたベクターをｐＯＵ１／Ｋａｒ２−ＰｐｔＫとした。
次に、ｐＯＵ１／Ｋａｒ２−ＰｐｔＫを制限酵素ＫｐｎＩで消化し、ＰＧＫプロモーター−ＯｍＫａｒ２−ＰＧＫターミネーター（ＯｍＫａｒ２発現カセット）を含む断片を回収し、ＯｍＰＤＩ１とＯｍＥＲＯ１の共発現ベクターｏｎａＰ０９５０７の制限酵素ＫｐｎＩ部位に導入することによってＯｍＰＤＩ１、ＯｍＥＲＯ１とＯｍＫａｒ２の共発現ベクターｏｎａＰ１１００７を構築した（図４）。
シャペロン導入酵母株（Ｏ．ｍｉｎｕｔａ）の作製
実施例４で構築した全てのシャペロン恒常発現ベクターは制限酵素ＮｏｔＩで消化した後、エレクトロポレーション法により、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＹＫ５株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１：Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａプロテアーゼＹＰＳ１遺伝子破壊株）へ導入した。エレクトロポレーションは、ＷＯ２００３／０９１４３１に記載の条件を使用した。エレクトロポレーション後、高圧蒸気滅菌したカザミノ−Ｕ寒天培地（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ Ｗ／Ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ６．７ｇ／Ｌ，Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ０．５ｇ／Ｌ，Ｇｌｕｃｏｓｅ ２０ｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン ２０ｍｇ／Ｌ，アデニン ２０ｍｇ／Ｌ，Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ ２０ｇ／Ｌ）上に塗沫し、３０℃で約２−３日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度カザミノ−Ｕ寒天培地上にて増殖させた後、ＧＡＰプロモーターによって発現制御されているシャペロンが導入されている形質転換体をコロニーＰＣＲ法によって選抜した。カザミノ−Ｕ寒天培地上で増殖した酵母の一部を１０μＬの０．２５％ＳＤＳ溶液に懸濁し、９０μＬの滅菌水を加えた後、遠心分離（２，７００ｘｇ，４℃，５分間）によって菌体を除去した。得られた上清をＤＮＡ溶液とした。ＧＡＰプロモーター配列内に設計したプライマーＧＡＰｐｆｏｒＳ−Ｆ（５’−ＧＡＴＣＴＣＡＧＧＣＣＧＡＧＴＣＡＡＧＡＣ−３’：配列番号７６）と以下のプライマーを使用して増幅が確認されたものをシャペロン恒常発現ベクター導入株とした。また、３つのシャペロン遺伝子の共発現ベクターを構築する際にＯｍＫａｒ２は、ＰＧＫプロモーターを使用して発現させたため、ＰＧＫプロモーター−ＯｍＫａｒ２−ＰＧＫターミネーターの発現カセットの導入は、ＰＧＫプロモーター配列内に設計したプライマーＰＧＫｐｆｏｒＳ−Ｆ（５’−ＴＡＡＣＧＣＣＧＣＡＴＡＧＡＡＣＴＡＧＣ−３’：配列番号７７）とプライマーＯＭＫＡＲ−Ｒ：５’−ＧＡＴＧＣＡＴＴＣＡＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＧＡＴＣＣＣＡＧ−３’（配列番号５１）を使用して導入を確認した。
（ｐ１）ＯｍＰＤＩ１および２コピーＯｍＰＤＩ１導入確認用プライマー
（ｐ２）ＯｍＭＰＤ１導入確認用プライマー
（ｐ３）ＯｍＳＣＪ１導入確認用プライマー
（ｐ４）ＯｍＥＵＧ１導入確認用プライマー
（ｐ５）ＯｍＥＲＯ１導入確認用プライマー
（ｐ６）ＯｍＨＳＰ１０４導入確認用プライマー
（ｐ７）ＯｍＫａｒ２導入確認用プライマー
（ｐ８）ＳｃＰＤＩ１導入確認用プライマー
（ｐ９）ｈＰＤＩ導入確認用プライマー
（ｐ１０）合成ｈＰＤＩ導入確認用プライマー
（ｐ１１）ＯｍＰＤＩ１＋ＯｍＥＲＯ１導入確認用プライマー
（ｐ１２）ＯｍＰＤＩ１＋ＯｍＫａｒ２導入確認プライマー
（ｐ１３）ＯｍＰＤＩ１＋ＯｍＨＳＰ１０４導入確認用プライマー
（ｐ１４）合成ｈＰＤＩ＋ＯｍＥＲＯ１導入確認用プライマー
（ｐ１５）ＯｍＰＤＩ１＋ＯｍＥＲＯ１＋ＯｍＫａｒ２導入確認用プライマー
ＰＣＲはＴａＫａＲａ ＬＡ ＴａｑＴＭ ｗｉｔｈ ＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社，ＲＲＯ２ＡＧ）を使用して目的断片を増幅させた［（９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で６０〜１８０秒）×３０サイクル］。増幅を確認した以下の形質転換体をそれぞれシャペロン恒常発現株とした。
（Ｅ１）ＯｍＰＤＩ１恒常発現株，ｏｎａ０３３０６株
（Ｅ２）ＯｍＭＰＤ１恒常発現株，ｏｎａ０３４０６株
（Ｅ３）ＯｍＳＣＪ１恒常発現株，ｏｎａ０３５０６株
（Ｅ４）ＯｍＥＵＧ１恒常発現株，ｏｎａ０３７０６株
（Ｅ５）ＯｍＥＲＯ１恒常発現株，ｏｎａ０３６０６株
（Ｅ６）ＯｍＨＳＰ１０４恒常発現株，ｏｎａ１３４０７株
（Ｅ７）ＯｍＫａｒ２恒常発現株，ｏｎａ２３００７株
（Ｅ８）ＳｃＰＤＩ１恒常発現株，ｏｎａ２６９０７株
（Ｅ９）ｈＰＤＩ恒常発現株，ｏｎａ３１１０７株
（Ｅ１０）合成ｈＰＤＩ恒常発現株，ｏｎａ３０８０７株
（Ｅ１１）ＯｍＰＤＩ１＋ＯｍＥＲＯ１恒常発現株，ｏｎａ２７６０７株
（Ｅ１２）ＯｍＰＤＩ１＋ＯｍＫａｒ２恒常発現株，ｏｎａ３０５０７株
（Ｅ１３）ＯｍＰＤＩ１＋ＯｍＨＳＰ１０４恒常発現株，ｏｎａ２７７０７株
（Ｅ１４）２コピーＯｍＰＤＩ１恒常発現株，ｏｎａ２７２０７株
（Ｅ１５）合成ｈＰＤＩ＋ＯｍＥＲＯ１恒常発現株，ｏｎａ４５００７株
（Ｅ１６）ＯｍＰＤＩ１＋ＯｍＥＲＯ１＋ＯｍＫａｒ２恒常発現株，ｏｎａ４４６０７株
抗体生産酵母株（Ｏ．ｍｉｎｕｔａ）の構築
実施例２で構築した抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体遺伝子（ＷＯ２００１／０８３５６０）発現ベクターを酵母株（Ｏ．ｍｉｎｕｔａ）に導入することによって抗体生産酵母株を作成した。酵母株（Ｏ．ｍｉｎｕｔａ）として、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＹＫ５株から以下のようにして調製したｏｎａ０１２０６株を用いた。
Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＹＫ５株はｕｒａ３欠失変異を相補しなかった場合、増殖能が低下し、また、ｕｒａ３遺伝子の開始コドンが欠失している。そこで、ｕｒａ３欠失変異を相補するために、ＯｍＵＲＡ３断片を用いた相同組換えによりｕｒａ３欠失変異を相補した。エレクトロポレーション法によってＯｍＵＲＡ３断片にてＯ．ｍｉｎｕｔａ ＹＫ５株を形質転換した後、高圧蒸気滅菌したカザミノ−Ｕ寒天培地上に塗沫し、３０℃で約２−３日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度カザミノ−Ｕ寒天培地上にて増殖させた後、カザミノ−Ｕ寒天培地上で増殖した酵母の一部を１０μＬの０．２５％ＳＤＳ溶液に懸濁し、９０μＬの滅菌水を加えた後、遠心分離（２，７００ｘｇ，４℃，５分間）によって菌体を除去した。得られた上清をＤＮＡ溶液とした。ｕｒａ３遺伝子開始コドン側と終始コドン側でそれぞれ設計したプライマーＯｍＵＲＡ３Ｆ（５’−ＡＴＧＴＣＣＴＣＧＡＣＴＡＡＧＡＣＡＴＡＣＧＣ−３’：配列番号７９）とＯｍＵＲＡ３Ｒ（５’−ＴＣＡＴＧＣＧＡＣＡＣＧＡＣＴＣＡＡＡＴＡＡＧ−３’：配列番号８０）を使用し、ＴａＫａＲａ ＬＡ ＴａｑＴＭｗｉｔｈ ＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社，ＲＲＯ２ＡＧ）によって、約０．８ｋｂの目的断片を増幅させた［（９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で６０秒）×３０サイクル］。増幅を確認した形質転換体をｕｒａ３相補株としてｏｎａ０１２０６株とした。
次に、実施例２で構築した抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体遺伝子（ＷＯ２００１／０８３５６０）発現ベクターを上記ｏｎａ０１２０６株にエレクトロポレーション法にて導入した。抗体重鎖としては、制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉで消化した１μｇのｏｎａＰ０２７０６を、抗体軽鎖としては、制限酵素ＮｏｔＩで消化した１μｇのｏｎａＰ０３１０６を使用した。エレクトロポレーション後、１００μｇ／ｍＬの濃度でＺｅｏｃｉｎＴＭ（インビトロジェン社，Ｒ２５０−０１）を添加したカザミノ−Ｕ−Ａ寒天培地（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ Ｗ／Ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ６．７ｇ／Ｌ，Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ０．５ｇ／Ｌ，Ｇｌｕｃｏｓｅ ２０ｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン ２０ｍｇ／Ｌ，Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ ２０ｇ／Ｌ）上に塗沫し、３０℃で約２−３日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度、１００μｇ／ｍＬの濃度でＺｅｏｃｉｎＴＭ（インビトロジェン社，Ｒ２５０−０１）を添加したカザミノ−Ｕ−Ａ寒天培地寒天培地上にて増殖させた後、抗体分泌生産株とした。抗体生産株は、以下のように培養した。２ｘＹＰ−Ｐ６−ＧＧ培地［２０ｇのＤｉｆｃｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔと４０ｇのＢａｃｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅを９００ｍＬの純水に溶解し、高圧蒸気滅菌した後、別滅菌した１０ｘリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）（１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４，０．１５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，０．３７５Ｎ ＫＯＨ）を１００ｍＬ、別滅菌した５０％グルコース溶液を１０ｍＬ、別滅菌した８０％グリセリンを２５ｍＬ添加して調製した。］を使用し、９６−ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（グライナー社，７８０２７１）に、８００μＬ〜１０００μＬの２ｘＹＰ−Ｐ６−ＧＧ培地を仕込み、爪楊枝で接種した後、ＣＯ２透過性プレートシール（グライナー社，６７６０５１）でプレート上部をシールした。攪拌速度３１０ｒｐｍ、振幅５０ｍｍ、培養温度３０℃で３〜４日間培養した。培養終了液から遠心分離（２，７００ｘｇ，４℃，５分間）によって菌体を除去して培養上清を調製し分泌抗体試料とした。
分泌生産された抗体の定量的アッセイは、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によって行った。９６ｗｅｌｌプレートに抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体の抗原であるＴＲＡＩＬレセプタータンパク質を吸着させ、分泌抗体試料を添加し、ペルオキシダーゼ標識ヒトＩｇＧ特異的Ｆｃ抗体（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−Ｌａｂｅｌｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｏ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆｃ）（ＫＰＬ社，０４−１０−２０））とＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ社，５０−６６−０１）を使用して検出した。選抜された抗体生産酵母ｏｎａ０２３０６株は、約０．８ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産能を示した（図５）。
ＰＭＴ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｎｎｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）阻害剤の添加による酵母産生抗体上のＯ型糖鎖付加抑制効果が抗体生産へ及ぼす効果
実施例６で得られた抗体生産酵母をＰＭＴ阻害剤の添加によるＯ型糖鎖形成が抑制された条件下（ＰＭＴ阻害剤，ロダニン−３−酢酸誘導体：５−［［３，４−（１−ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ］−４−ｏｘｏ−２−ｔｈｉｏｘｏ−３−ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．１４，ｐ３９７５，（２００４）中の化合物１ｃ）を培地に添加）において培養した。２ｘＹＰ−Ｐ６−ＧＧ培地［２０ｇのＤｉｆｃｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔと４０ｇのＢａｃｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅを９００ｍＬの純水に溶解し、高圧蒸気滅菌した後、別滅菌した１０ｘリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）（１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４，０．１５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，０．３７５Ｎ ＫＯＨ）を１００ｍＬ、別滅菌した５０％グルコース溶液を１０ｍＬ、別滅菌した８０％グリセリンを２５ｍＬ添加して調製］を使用し、９６−ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（グライナー社，７８０２７１）に、８００μＬの２ｘＹＰ−Ｐ６−ＧＧ培地を仕込み、爪楊枝で接種した後、ＣＯ２透過性プレートシール（グライナー社，６７６０５１）でプレート上部をシールした。コントロール培養では、攪拌速度３１０ｒｐｍ、振幅５０ｍｍ、培養温度３０℃で２日間培養後、２ｘＹＰ−Ｐ６−ＧＧ培地を１００μＬ添加し、さらに、３日目に２ｘＹＰ−Ｐ６−ＧＧ培地を１００μＬ添加した。また、ロダニン−３−酢酸誘導体１ｃの１回添加培養では、攪拌速度３１０ｒｐｍ、振幅５０ｍｍ、培養温度３０℃で２日間培養後、２ｘＹＰ−Ｐ６−ＧＧ培地を１００μＬ添加し、さらに、３日目に２０μＭの１ｃ含む２ｘＹＰ−Ｐ６−ＧＧ培地を１００μＬ添加した。ロダニン−３−酢酸誘導体１ｃの２回添加培養では、攪拌速度３１０ｒｐｍ、振幅５０ｍｍ、培養温度３０℃で２日間培養後、２０μＭの１ｃ含む２ｘＹＰ−Ｐ６−ＧＧ培地を１００μＬ添加し、さらに、３日目に２０μＭの１ｃ含む２ｘＹＰ−Ｐ６−ＧＧ培地を１００μＬ添加した。
抗体の分泌生産は、サンドイッチＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットによって確認した。培養終了液から遠心分離（２，７００ｘｇ，４℃，５分間）によって菌体を除去して培養上清を調製し分泌抗体試料とした。分泌生産された抗体の定量的アッセイは、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によって行った。９６ｗｅｌｌプレートに抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体の抗原であるＴＲＡＩＬレセプタータンパク質を吸着させ、分泌抗体試料を添加し、ペルオキシダーゼ標識ヒトＩｇＧ特異的Ｆｃ抗体（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−Ｌａｂｅｌｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｏ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆｃ）（ＫＰＬ社，０４−１０−２０））とＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ社，５０−６６−０１）を使用して検出した。
ウェスタンブロットは、還元条件下、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜にブロッティングし、抗体重鎖と軽鎖の検出は、一次抗体として、それぞれ、Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（γ−ｃｈａｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）（Ｓｉｇｍａ社，Ｉ−３３８２）とＧｏａｔ ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ｋａｐｐａ ｂ＆ｆ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ（Ｂｅｔｈｙｌ社，Ａ−８０−１１５Ａ）を使用した。また、二次抗体としては、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ−ｇｏａｔ ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）（Ｒａｂｂｉｔ）（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，＃６０５−４３１３）を使用した。検出は、ＥＣＬ Ａｄｖａｎｃｅウェスタンブロッティング検出キット（ＧＥ社，ＲＰＮ２１３５）を使用した。
図５に示すように、コントロール（ｏｎａ０２３０６株）が０．８ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産量を示すのに対して、ＰＭＴ阻害剤１回添加条件において約１．７ｍｇ／Ｌ、ＰＭＴ阻害剤２回添加条件において、約１．９ｍｇ／ＬとＰＭＴ阻害剤を添加することによって約２．１〜約２．４倍に抗体生産量が増加した（図５）。また、ウェスタンブロットによる解析において、コントロール培養では、還元電気泳動において抗体重鎖より移動度が小さい高分子の抗体重鎖が、抗体重鎖特異的抗体によって検出されるが、ＰＭＴ阻害剤を培養に添加することによってその高分子抗体重鎖が減少していることが確認された（図６：還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＷＢ，抗体ＨｃとＬｃを同時に検出）。従って、９６−ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（グライナー社，７８０２７１）を使用してＰＭＴ阻害剤添加条件下、形質転換酵母を培養する場合、培養温度３０℃で２日間培養後、２０μＭの１ｃ含む２ｘＹＰ−Ｐ６−ＧＧ培地を１００μＬ添加し、さらに、３日目に２０μＭの１ｃ含む２ｘＹＰ−Ｐ６−ＧＧ培地を１００μＬ添加して培養することとした。
シャペロン恒常発現抗体生産酵母株（Ｏ．ｍｉｎｕｔａ）の構築
実施例５にて育種したそれぞれのシャペロン単独恒常発現株に実施例２で構築した抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体遺伝子（ＷＯ２００１／０８３５６０）発現ベクターを上記のエレクトロポレーション法にて導入した。抗体重鎖としては、制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉで消化した１μｇのｏｎａＰ０２７０６を、抗体軽鎖としては、制限酵素ＮｏｔＩで消化した１μｇのｏｎａＰ０３１０６を使用した。エレクトロポレーション後、１００μｇ／ｍＬの濃度でＺｅｏｃｉｎＴＭ（インビトロジェン社，Ｒ２５０−０１）を添加したカザミノ−Ｕ−Ａ寒天培地（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ Ｗ／Ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ６．７ｇ／Ｌ，Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ０．５ｇ／Ｌ，Ｇｌｕｃｏｓｅ ２０ｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン ２０ｍｇ／Ｌ，Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ ２０ｇ／Ｌ）上に塗沫し、３０℃で約２−３日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度、１００μｇ／ｍＬの濃度でＺｅｏｃｉｎＴＭ（インビトロジェン社，Ｒ２５０−０１）を添加したカザミノ−Ｕ−Ａ寒天培地寒天培地上にて増殖させた後、抗体分泌生産株をスクリーニングした。ＯｍＳＣＪ１恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ０８９０６株を、ＯｍＥＵＧ１恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ０９２０６株を、ＯｍＥＲＯ１恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ０９４０６株を、ＯｍＫａｒ２恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ２６４０７株を、ＯｍＭＰＤ１恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ０９５０６株を、ＯｍＰＤＩ１恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ０９８０６株を、ＯｍＨＳＰ１０４恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ１５８０７株を選抜した。
抗体の分泌生産に及ぼすシャペロンの効果
実施例８で得られたシャペロン恒常発現抗体遺伝子導入株を用いて抗体の分泌生産におけるシャペロンの導入効果を検証した。また、実施例７で明らかとなったＰＭＴ阻害剤の添加による抗体の分泌生産増強効果の検証を行った。図７に示すように、コントロール（ｏｎａ０２３０６株）が約０．８ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産量を示すのに対して、ＯｍＳＣＪ１恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ０８９０６株）で約２．６ｍｇ／Ｌ、ＯｍＥＵＧ１恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ０９２０６株）で１．４ｍｇ／Ｌ、ＯｍＥＲＯ１恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ０９４０６株）で２．４ｍｇ／Ｌ、ＯｍＫａｒ２恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ２６４０７株）で３．６ｍｇ／Ｌ、ＯｍＭＰＤ１恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ０９５０６株）で１．３ｍｇ／Ｌ、ＯｍＰＤＩ１恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ０９８０６株）で４．２ｍｇ／Ｌ、ＯｍＨＳＰ１０４恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ１５８０７株）で１．８ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産量を示した。シャペロンの発現を強化することによって、約２から５倍に抗体分泌生産能が向上した。さらに、ＰＭＴ阻害剤を培養へ添加することによって、図７に示すように全ての生産株で抗体分泌生産量が向上することが明らかとなった。特に、ＯｍＰＤＩ１恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ０９８０６株）では、実施例６で構築した抗体遺伝子導入株（ｏｎａ０２３０６株）のコントロール培養と比較して約１５倍に抗体分泌生産量が向上することを見出した。また、図８に示すように非還元電気泳動後のウェスタンブロット解析によって完全長抗体（Ｈ２Ｌ２）が明らかに分泌生産されることが確認された。
シャペロンの組合せ効果
実施例５にて育種した２種類のシャペロン恒常発現株に実施例２で構築した抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体遺伝子（ＷＯ２００１／０８３５６０）発現ベクターを上記のエレクトロポレーション法にて導入した。抗体重鎖としては、制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉで消化した１μｇのｏｎａＰ０２７０６を、抗体軽鎖としては、制限酵素ＮｏｔＩで消化した１μｇのｏｎａＰ０３１０６を使用した。エレクトロポレーション後、１００μｇ／ｍＬの濃度でＺｅｏｃｉｎＴＭ（インビトロジェン社，Ｒ２５０−０１）を添加したカザミノ−Ｕ−Ａ寒天培地（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ Ｗ／Ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ６．７ｇ／Ｌ，Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ０．５ｇ／Ｌ，Ｇｌｕｃｏｓｅ ２０ｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン ２０ｍｇ／Ｌ，Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ ２０ｇ／Ｌ）上に塗沫し、３０℃で約２−３日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度、１００μｇ／ｍＬの濃度でＺｅｏｃｉｎＴＭ（インビトロジェン社，Ｒ２５０−０１）を添加したカザミノ−Ｕ−Ａ寒天培地寒天培地上にて増殖させた後、抗体分泌生産株をスクリーニングした。ＯｍＰＤＩ１発現ユニットを２つ保持しているＯｍＰＤＩ１恒常発現抗体遺伝子導入株（２ｘＯｍＰＤＩ１株）としてｏｎａ３２５０７株を、ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＨＳＰ１０４恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ３３４０７株を、ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＫａｒ２恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ４０００７株を、ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ３３１０７株を選抜した。
図９に示すように、コントロールである抗体遺伝子導入株（ｏｎａ０２３０６株）が約０．８ｍｇ／Ｌ、ＰＭＴ阻害剤添加条件で約１．９ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産量を、ＯｍＨＳＰ１０４恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ１５８０７株）で約１．８ｍｇ／Ｌ、ＰＭＴ阻害剤添加条件で約４．６ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産量を、ＯｍＫａｒ２恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ２６４０７株）で約３．６ｍｇ／Ｌ、ＰＭＴ阻害剤添加条件で約８．９ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産量を、ＯｍＥＲＯ１恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ０９４０６株）で約２．４ｍｇ／Ｌ、ＰＭＴ阻害剤添加条件で約７．６ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産量を、ＯｍＰＤＩ１恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ０９８０６株）で約４．２ｍｇ／Ｌ、ＰＭＴ阻害剤添加条件で約１２．２ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産量を示すのに対して、２ｘＯｍＰＤＩ１恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ３２５０７株）で約６．８ｍｇ／Ｌ、ＰＭＴ阻害剤添加条件で約１５．８ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産量を、ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＨＳＰ１０４恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ３３４０７株）で約４．８ｍｇ／Ｌ、ＰＭＴ阻害剤添加条件で約１３．６ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産量を、ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＫａｒ２恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ４０００７株）で約９．５ｍｇ／Ｌ、ＰＭＴ阻害剤添加条件で約１８．２ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産量を、ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ３３１０７株）で約１７．７ｍｇ／Ｌ、ＰＭＴ阻害剤添加条件で約２６．２ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産量を示した。シャペロンの発現を単独で強化することによって、約２から５倍に向上した抗体分泌生産能が、シャペロンの発現を組合せて強化した場合にさらに向上した。特に、ＯｍＰＤＩ１とＯｍＥＲＯ１の発現を強化した場合、約２２倍に、さらに、ＰＭＴ阻害剤を培養へ添加することによって、約３３倍に抗体分泌生産能が向上した。
また、図１０に示すように非還元電気泳動後のウェスタンブロット解析によってより正しいフォールディングをしていることが予想される完全長抗体（Ｈ２Ｌ２）の分泌量が明らかに向上していることが確認された。
異種ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ（ＰＤＩ）の恒常発現による抗体分泌生産に及ぼす効果
実施例５にて育種した異種ＰＤＩ単独恒常発現株に実施例２で構築した抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体遺伝子（ＷＯ２００１／０８３５６０）発現ベクターを上記のエレクトロポレーション法にて導入した。抗体重鎖としては、制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉで消化した１μｇのｏｎａＰ０２７０６を、抗体軽鎖としては、制限酵素ＮｏｔＩで消化した１μｇのｏｎａＰ０３１０６を使用した。エレクトロポレーション後、１００μｇ／ｍＬの濃度でＺｅｏｃｉｎＴＭ（インビトロジェン社，Ｒ２５０−０１）を添加したカザミノ−Ｕ−Ａ寒天培地（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ Ｗ／Ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ６．７ｇ／Ｌ，Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ０．５ｇ／Ｌ，Ｇｌｕｃｏｓｅ ２０ｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン ２０ｍｇ／Ｌ，Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ ２０ｇ／Ｌ）上に塗沫し、３０℃で約２−３日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度、１００μｇ／ｍＬの濃度でＺｅｏｃｉｎＴＭ（インビトロジェン社，Ｒ２５０−０１）を添加したカザミノ−Ｕ−Ａ寒天培地寒天培地上にて増殖させた後、抗体分泌生産株をスクリーニングした。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳｃＰＤＩ１恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ３２２０７株を、ｈｕｍａｎＰＤＩ恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ３８９０７株を、合成ｈｕｍａｎ ＰＤＩ（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅをＯ．ｍｉｎｕｔａのそれに合わせて最適化したｈｕｍａｎ ＰＤＩ）恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ３９３０７株を選抜した。
図１１に示すように、コントロールである抗体遺伝子導入株（ｏｎａ０２３０６株）が約０．８ｍｇ／Ｌ、ＰＭＴ阻害剤添加条件で約１．９ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産量を、ＯｍＰＤＩ１恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ０９８０６株）で約４．２ｍｇ／Ｌ、ＰＭＴ阻害剤添加条件で約１２．２ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産量を、２ｘＯｍＰＤＩ１恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ３２５０７株）で約６．８ｍｇ／Ｌ、ＰＭＴ阻害剤添加条件で約１５．８ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産量を示すのに対して、ＳｃＰＤＩ１恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ３２２０７株）で約３．７ｍｇ／Ｌ、ＰＭＴ阻害剤添加条件で約１１．３ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産量を、ｈＰＤＩ恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ３８９０７株）で約４．０ｍｇ／Ｌ、ＰＭＴ阻害剤添加条件で約１０．４ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産量を、合成ｈＰＤＩ恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ３９３０７株）で約９．５ｍｇ／Ｌ、ＰＭＴ阻害剤添加条件で約２０．１ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産量を示した。Ｏ．ｍｉｎｕｔａのＰＤＩ１の恒常発現だけでなく機能ホモログである異種ＰＤＩの発現を強化した場合でも同様に抗体分泌生産能を向上させることが明らかとなった。特に、Ｏ．ｍｉｎｕｔａのコドン使用頻度を考慮して合成したｈＰＤＩでは、ＰＭＴ阻害剤を培養へ添加することによって、コントロールの約２５倍、ＯｍＰＤＩ１を導入しＰＭＴ阻害剤を培養へ添加した場合の約１．６倍に抗体分泌生産能が向上した。
シャペロンの組合せ効果
実施例５にて育種した合成ｈｕｍａｎ ＰＤＩとＯｍＥＲＯ１恒常発現株およびＯｍＰＤＩ１とＯｍＥＲＯ１とＯｍＫａｒ２恒常発現株に実施例２で構築した抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体遺伝子（ＷＯ２００１／０８３５６０）発現ベクターを上記のエレクトロポレーション法にて導入した。抗体重鎖としては、制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉで消化した１μｇのｏｎａＰ０２７０６を、抗体軽鎖としては、制限酵素ＮｏｔＩで消化した１μｇのｏｎａＰ０３１０６を使用した。エレクトロポレーション後、１００μｇ／ｍＬの濃度でＺｅｏｃｉｎＴＭ（インビトロジェン社，Ｒ２５０−０１）を添加したカザミノ−Ｕ−Ａ寒天培地（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ Ｗ／Ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ６．７ｇ／Ｌ，Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ０．５ｇ／Ｌ，Ｇｌｕｃｏｓｅ ２０ｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン ２０ｍｇ／Ｌ，Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ ２０ｇ／Ｌ）上に塗沫し、３０℃で約２−３日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度、１００μｇ／ｍＬの濃度でＺｅｏｃｉｎＴＭ（インビトロジェン社，Ｒ２５０−０１）を添加したカザミノ−Ｕ−Ａ寒天培地寒天培地上にて増殖させた後、抗体分泌生産株をスクリーニングした。合成ｈｕｍａｎ ＰＤＩ／ＯｍＥＲＯ１恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ４９７０７株を、ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ４８７０７株を選抜した。
図１２に示すように、コントロールである抗体遺伝子導入株（ｏｎａ０２３０６株）は約０．６５ｍｇ／Ｌ、ＰＭＴ阻害剤添加条件で約２．２ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産量を、合成ｈｕｍａｎ ＰＤＩ恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ３９３０７株）は約５．１ｍｇ／Ｌ、ＰＭＴ阻害剤添加条件で約１２．３ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産量を、ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ３３１０７株）は約９．２ｍｇ／Ｌ、ＰＭＴ阻害剤添加条件で約１８．９ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産量を示した。これに対し、合成ｈｕｍａｎ ＰＤＩ／ＯｍＥＲＯ１恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ４９７０７株）は約１０．８ｍｇ／Ｌ、ＰＭＴ阻害剤添加条件で約２３．４ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産量を、ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ４８７０７株）は約１６．２ｍｇ／Ｌ、ＰＭＴ阻害剤添加条件で約２９．８ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産量を示した。異種ＰＤＩである合成ｈｕｍａｎ ＰＤＩとＯｍＥＲＯ１の発現を強化した場合は、ＯｍＰＤＩ１とＯｍＥＲＯ１の発現を強化した場合より、２０％以上抗体分泌生産能が向上し、コントロールの約３６倍の抗体分泌生産能を示した。また、ＯｍＰＤＩ１とＯｍＥＲＯ１とＯｍＫａｒ２を組合せて発現を強化した場合は、さらに抗体分泌生産能が向上し、コントロールの約４５．８倍の抗体分泌生産能を示した。
抗体遺伝子発現ベクターの構築
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＫａｒ２（ＹＪＬ０３４Ｗ）の分泌シグナル（以下、「ＳｃＫａｒ２シグナル」という）と抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体の軽鎖、及び重鎖を融合タンパク質として発現させるため、ＳｃＫａｒ２シグナル遺伝子と抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体遺伝子（ＷＯ２００１／０８３５６０）を以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ法によって連結した。
ＳｃＫａｒ２シグナル−抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体の重鎖用
ＳｃＫａｒ２シグナル−抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体の軽鎖用
ＳｃＫａｒ２シグナル遺伝子領域は、Ｙ−ＤＥＲ Ｙｅａｓｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）によって調製したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型として増幅した。重鎖用として、プライマーＢｉｐＸｂａ−ＦとプライマーＢｉｐＴｒａＨ−Ｒを用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で６０秒）×３０サイクル］を、軽鎖用として、プライマーＢｉｐＸｂａ−ＦとプライマーＢｉｐＴｒａＬ−Ｒを用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で６０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、それぞれ増幅された約０．１５ｋｂの目的ＤＮＡ断片を回収した。
抗体遺伝子領域は、抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体ｃＤＮＡ（ＷＯ２００１／０８３５６０）を鋳型として増幅した。重鎖用としてプライマーＢｉｐＴｒａＨ−ＦとプライマーＨ０４を用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で９０秒）×３０サイクル］を、軽鎖用として、プライマーＢｉｐＴｒａＬ−ＦとＬ０４を用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で９０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、それぞれ増幅された約１．３５ｋｂの重鎖領域と約０．６５ｋｂの軽鎖領域の目的ＤＮＡ断片を回収した。
次に、重鎖用ＳｃＫａｒ２シグナル領域と約１．３５ｋｂの重鎖領域を鋳型として、プライマーＢｉｐＸｂａ−ＦとＨ０４を用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で９０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、増幅された約１．５ｋｂの目的ＤＮＡ断片を回収した。また、軽鎖用ＳｃＫａｒ２シグナル領域と約０．６５ｋｂの軽鎖領域を鋳型として、プライマーＢｉｐＸｂａ−ＦとＬ０４を用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で６０秒）×３０サイクル］を行ない、増幅された約０．８ｋｂの目的ＤＮＡ断片を回収した。それぞれ回収したＤＮＡ断片は、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした。挿入ＤＮＡ断片の塩基配列より、それぞれＳｃＫａｒシグナル−抗体重鎖及びＳｃＫａｒ２シグナル−抗体軽鎖が、ｉｎ−ｆｒａｍｅで融合している遺伝子を有していることを確認した。プライマーＢｉｐＸｂａ−Ｆに導入したＸｂａＩ制限酵素部位とプライマーＨ０４とプライマーＬ０４に導入したＳａｌＩ制限酵素部位を利用して、ＸｂａＩ−ＳａｌＩ消化でＳｃＫａｒ２シグナル−抗体重鎖とＳｃＫａｒ２シグナル−抗体軽鎖をコードするＤＮＡ断片を回収した。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて抗体重鎖と抗体軽鎖を発現させるために、ＸｂａＩ−ＳａｌＩ消化で回収したＳｃＫａｒ２シグナル−抗体重鎖とＳｃＫａｒ２シグナル−抗体軽鎖をコードするＤＮＡ断片を大腸菌−酵母シャトルベクターＹＥｐ３５２（Ｙｅａｓｔ２，ｐ１６３−１６７（１９８６））に導入されたグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素遺伝子（ＴＤＨ３、ＧＡＰ）プロモーター−ターミネーターカセット中のＸｂａＩ−ＳａｌＩ部位にライゲーションした。それぞれ得られたプラスミドをＹＥｐ３５２ＧＡＰ−ＩＩ−ＳｃＫａｒＨｃとＹＥｐ３５２ＧＡＰ−ＩＩ−ＳｃＫａｒＬｃと命名した。
次に、ＧＡＰプロモーター−ターミネーターカセットの両末端にあるＢａｍＨＩ制限酵素部位を利用し、ＹＥｐ３５２ＧＡＰ−ＩＩ−ＳｃＫａｒＬｃから、ＢａｍＨＩ−ＧＡＰプロモーター−ＳｃＫａｒ２シグナル−抗体軽鎖−ＧＡＰターミネーター−ＢａｍＨＩをコードする遺伝子断片を回収した。次に、ＹＥｐ３５２ＧＡＰ−ＩＩ−ＳｃＫａｒＨｃを制限酵素ＨｐａＩで消化した。両断片を平滑末端処理した後、ライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９へ形質転換した。得られたクローンを任意に選抜し、プライマー３５２−ＨｐａＩ−Ｒ２（５’−ＣＡＡＡＡＴＧＡＡＧＣＡＣＡＧＡＴＧＣ−３’：配列番号８９）とプライマーＬ０４（５’−ＧＧＴＣＧＡＣＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴ−３’：配列番号８８）を用いたコロニーＰＣＲ法［（９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で６０秒）×３０サイクル］をＴａＫａＲａ ＬＡ ＴａｑＴＭ ｗｉｔｈ ＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社，ＲＲＯ２ＡＧ）を使用して行い、ＧＡＰプロモーター−ＳｃＫａｒ２シグナル−抗体重鎖−ＧＡＰターミネーターとＧＡＰプロモーター−ＳｃＫａｒ２シグナル−抗体軽鎖−ＧＡＰターミネーターが逆向きに挿入されたクローンを選抜した。増幅が確認された形質転換体から、ＹＥｐ３５２ＧＡＰ−ＩＩ−ＳｃＫａｒＨｃの平滑化した制限酵素ＨｐａＩ部位にＢａｍＨＩ−ＧＡＰプロモーター−ＳｃＫａｒ２シグナル−抗体軽鎖−ＧＡＰターミネーター−ＢａｍＨＩが導入されたベクターを回収し、ＹＥｐ３５２ＧＡＰ−ＩＩ−ＳｃＫａｒＨｃ／ＳｃＫａｒＬｃと命名した（図１３）。
シャペロン遺伝子単独発現ベクターの構築
（１）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＰＤＩ１（Ｓｃ ＰＤＩ１）遺伝子恒常発現ベクターの構築
ＳｃのＰＤＩ１（ＹＣＬ０４３Ｃ：配列番号１２０（塩基配列）、配列番号１２１（アミノ酸配列））は、Ｙ−ＤＥＲ Ｙｅａｓｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）によって調製したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型として増幅した。プライマーＰＤＩ１−ｓａｃ（５’−ＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＣＴＧＣＴＧＧＴＧ−３’：配列番号９０）とプライマーＰＤＩ１−ｓｍａ（５’−ＧＣＣＣＧＧＧＴＴＡＣＡＡＴＴＣＡＴＣＧＴＧＡＡＴＧ−３’：配列番号９１）を用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で９０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、約１．６ｋｂの断片の目的ＤＮＡ断片を回収した。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした後、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を確認した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＳｃＰＤＩ１を発現させるために、プライマーＰＤＩ１−ｓａｃとプライマーＰＤＩ１−ｓｍａに導入した制限酵素部位ＳａｃＩとＳｍａＩを使用し、ＳａｃＩ−ＳｍａＩ消化で回収したＳｃＰＤＩ１をコードしている遺伝子を大腸菌−酵母シャトルベクターＹＥｐ３５１（Ｙｅａｓｔ ２，ｐ１６３−１６７（１９８６））に導入されたグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素遺伝子（ＴＤＨ３、ＧＡＰ）プロモーター−ターミネーターカセット中のＳａｃＩ−ＳｍａＩ部位にライゲーションした。得られたプラスミドをＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ＳｃＰＤＩ１と命名した。
（２）ＳｃＭＰＤ１遺伝子恒常発現ベクターの構築
ＳｃＭＰＤ１（ＹＯＲ２８８Ｃ：配列番号１２２（塩基配列）、配列番号１２３（アミノ酸配列））は、Ｙ−ＤＥＲ Ｙｅａｓｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）によって調製したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型として増幅した。プライマーＭＰＤ１−ｓａｃ（５’−ＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧＴＴＡＴＴＴＣＴＴＡＡＴＡＴＴＡＴＴＡＡＧ−３’：配列番号９２）とプライマーＭＰＤ１−ｓｍａ（５’−ＧＣＣＣＧＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＣＧＴＣＧＴＧＣＴＴＧＴＴＴＣＣ−３’：配列番号９３）を用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で６０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、約０．９６ｋｂの断片の目的ＤＮＡ断片を回収した。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした後、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を確認した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＳｃＭＰＤ１を発現させるために、プライマーＭＰＤ１−ｓａｃとプライマーＭＰＤ１−ｓｍａに導入した制限酵素部位ＳａｃＩとＳｍａＩを使用し、ＳａｃＩ−ＳｍａＩ消化で回収したＳｃＭＰＤ１をコードしている遺伝子を大腸菌−酵母シャトルベクターＹＥｐ３５１（Ｙｅａｓｔ ２，ｐ１６３−１６７（１９８６））に導入されたグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素遺伝子（ＴＤＨ３、ＧＡＰ）プロモーター−ターミネーターカセット中のＳａｃＩ−ＳｍａＩ部位にライゲーションした。得られたプラスミドをＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ＳｃＭＰＤ１と命名した。
（３）ＳｃＳＣＪ１遺伝子恒常発現ベクターの構築
ＳｃＳＣＪ１（ＹＭＲ２１４Ｗ：配列番号１２４（塩基配列）、配列番号１２５（アミノ酸配列））は、Ｙ−ＤＥＲ Ｙｅａｓｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）によって調製したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型として増幅した。プライマーＳＣＪ１−ｓａｃ（５’−ＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧＡＴＴＣＣＡＡＡＡＴＴＡＴＡＴＡＴＡＣ−３’：配列番号９４）とプライマーＳＣＪ１−ｓｍａ（５’−ＧＣＣＣＧＧＧＣＴＡＣＡＡＣＴＣＡＴＣＴＴＴＧＡＧＣ−３’：配列番号９５）を用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で６０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、約１．１ｋｂの断片の目的ＤＮＡ断片を回収した。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした後、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を確認した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＳｃＳＣＪ１を発現させるために、プライマーＳＣＪ１−ｓａｃとプライマーＳＣＪ１−ｓｍａに導入した制限酵素部位ＳａｃＩとＳｍａＩを使用し、ＳａｃＩ−ＳｍａＩ消化で回収したＳｃＳＣＪ１をコードしている遺伝子を大腸菌−酵母シャトルベクターＹＥｐ３５１（Ｙｅａｓｔ ２，ｐ１６３−１６７（１９８６））に導入されたグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素遺伝子（ＴＤＨ３、ＧＡＰ）プロモーター−ターミネーターカセット中のＳａｃＩ−ＳｍａＩ部位にライゲーションした。得られたプラスミドをＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ＳｃＳＣＪ１と命名した。
（４）ＳｃＥＲＯ１遺伝子恒常発現ベクターの構築
ＳｃＥＲＯ１（ＹＭＬ１３０Ｃ：配列番号１２６（塩基配列）、配列番号１２７（アミノ酸配列））は、Ｙ−ＤＥＲ Ｙｅａｓｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）によって調製したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型として増幅した。プライマーＥＲＯ１−ｓａｃ２（５’−ＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴＡＡＧＡＡＣＣＧＣＣＡＴＴＧ−３’：配列番号９６）とプライマーＥＲＯ１−ｓｍａ２（５’−ＧＣＣＣＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＡＴＡＴＣＴＡＧＣＴＴＡＴＡＧ−３’：配列番号９７）を用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で１２０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、約１．７ｋｂの断片の目的ＤＮＡ断片を回収した。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした後、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を確認した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＳｃＥＲＯ１を発現させるために、プライマーＥＲＯ１−ｓａｃ２とプライマーＥＲＯ１−ｓｍａ２に導入した制限酵素部位ＳａｃＩとＳｍａＩを使用し、ＳａｃＩ−ＳｍａＩ消化で回収したＳｃＥＲＯ１をコードしている遺伝子を大腸菌−酵母シャトルベクターＹＥｐ３５１（Ｙｅａｓｔ ２，ｐ１６３−１６７（１９８６））に導入されたグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素遺伝子（ＴＤＨ３、ＧＡＰ）プロモーター−ターミネーターカセット中のＳａｃＩ−ＳｍａＩ部位にライゲーションした。得られたプラスミドをＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ＳｃＥＲＯ１と命名した。
（５）ＳｃＦＫＢ２遺伝子恒常発現ベクターの構築
ＳｃＦＫＢ２（ＦＰＲ２／ＹＤＲ５１９Ｗ：配列番号１２８（塩基配列）、配列番号１２９（アミノ酸配列））は、Ｙ−ＤＥＲ Ｙｅａｓｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）によって調製したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型として増幅した。プライマーＦＫＢ２−ｓａｃ（５’−ＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＴＴＴＡＡＴＡＴＴＴＡＣＣ−３’：配列番号９８）とプライマーＦＫＢ２−ｓｍａ（５’−ＧＣＣＣＧＧＧＣＴＡＧＧＣＧＧＣＴＧＡＴＴＴＣＡＣＧ−３’：配列番号９９）を用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で３０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、約０．５ｋｂの断片の目的ＤＮＡ断片を回収した。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした後、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を確認した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＳｃＦＫＢ２を発現させるために、プライマーＦＫＢ２−ｓａｃとプライマーＦＫＢ２−ｓｍａに導入した制限酵素部位ＳａｃＩとＳｍａＩを使用し、ＳａｃＩ−ＳｍａＩ消化で回収したＳｃＦＫＢ２をコードしている遺伝子を大腸菌−酵母シャトルベクターＹＥｐ３５１（Ｙｅａｓｔ ２，ｐ１６３−１６７（１９８６））に導入されたグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素遺伝子（ＴＤＨ３、ＧＡＰ）プロモーター−ターミネーターカセット中のＳａｃＩ−ＳｍａＩ部位にライゲーションした。得られたプラスミドをＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ＳｃＦＫＢ２と命名した。
（６）ＳｃＪＥＭ１遺伝子恒常発現ベクターの構築
ＳｃＪＥＭ１（ＹＪＬ０７３Ｗ：配列番号１３０（塩基配列）、配列番号１３１（アミノ酸配列））は、Ｙ−ＤＥＲ Ｙｅａｓｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）によって調製したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型として増幅した。プライマーＪＥＭ１−ｓａｃ（５’−ＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧＡＴＡＣＴＧＡＴＣＴＣＧＧＧＡＴＡＣＴＧＴＣ−３’：配列番号１００）とプライマーＪＥＭ１−ｓｍａ（５’−ＧＣＣＣＧＧＧＴＣＡＡＡＧＣＣＣＡＡＡＡＴＴＣＡＴＴＴＴＡＡＡＧ−３’：配列番号１０１）を用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で１２０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、約１．９ｋｂの断片の目的ＤＮＡ断片を回収した。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした後、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を確認した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＳｃＪＥＭ１を発現させるために、プライマーＪＥＭ１−ｓａｃとプライマーＪＥＭ１−ｓｍａに導入した制限酵素部位ＳａｃＩとＳｍａＩを使用し、ＳａｃＩ−ＳｍａＩ消化で回収したＳｃＪＥＭ１をコードしている遺伝子を大腸菌−酵母シャトルベクターＹＥｐ３５１（Ｙｅａｓｔ ２，ｐ１６３−１６７（１９８６））に導入されたグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素遺伝子（ＴＤＨ３、ＧＡＰ）プロモーター−ターミネーターカセット中のＳａｃＩ−ＳｍａＩ部位にライゲーションした。得られたプラスミドをＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ＳｃＪＥＭ１と命名した。
（７）ＳｃＬＨＳ１遺伝子恒常発現ベクターの構築
ＳｃＬＨＳ１（ＹＫＬ０７３Ｗ：配列番号１３２（塩基配列）、配列番号１３３（アミノ酸配列））は、Ｙ−ＤＥＲ Ｙｅａｓｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）によって調製したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型として増幅した。プライマーＬＨＳ１．１−ｓａｃ（５’−ＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧＣＧＡＡＡＣＧＴＴＴＴＡＡＧＧＣＴＴＴ−３’：配列番号１０２）とプライマーＬＨＳ１−ｓｍａ（５’−ＧＣＣＣＧＧＧＣＴＡＴＡＡＴＴＣＡＴＣＡＴＧＣＡＡＡＡＴＧ−３’：配列番号１０３）を用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で１８０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、約２．６５ｋｂの断片の目的ＤＮＡ断片を回収した。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした後、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を確認した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＳｃＬＨＳ１を発現させるために、プライマーＬＨＳ１．１−ｓａｃとプライマーＬＨＳ１−ｓｍａに導入した制限酵素部位ＳａｃＩとＳｍａＩを使用し、ＳａｃＩ−ＳｍａＩ消化で回収したＳｃＬＨＳ１をコードしている遺伝子を大腸菌−酵母シャトルベクターＹＥｐ３５１（Ｙｅａｓｔ ２，ｐ１６３−１６７（１９８６））に導入されたグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素遺伝子（ＴＤＨ３、ＧＡＰ）プロモーター−ターミネーターカセット中のＳａｃＩ−ＳｍａＩ部位にライゲーションした。得られたプラスミドをＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ＳｃＬＨＳ１と命名した。
（８）ＳｃＭＰＤ２遺伝子恒常発現ベクターの構築
ＳｃＭＰＤ２（ＹＯＬ０８８Ｃ：配列番号１３４（塩基配列）、配列番号１３５（アミノ酸配列））は、Ｙ−ＤＥＲ Ｙｅａｓｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）によって調製したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型として増幅した。プライマーＭＰＤ２−ｓａｃ（５’−ＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧＡＡＡＴＴＧＣＡＣＧＧＣＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＣ−３’：配列番号１０４）とプライマーＭＰＤ２−ｓｍａ（５’−ＧＣＣＣＧＧＧＴＣＡＡＡＧＣＴＣＧＴＣＡＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧ−３’：配列番号１０５）を用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で６０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、約０．８ｋｂの断片の目的ＤＮＡ断片を回収した。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした後、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を確認した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＳｃ ＭＰＤ２を発現させるために、プライマーＭＰＤ２−ｓａｃとプライマーＭＰＤ２−ｓｍａに導入した制限酵素部位ＳａｃＩとＳｍａＩを使用し、ＳａｃＩ−ＳｍａＩ消化で回収したＳｃＭＰＤ２をコードしている遺伝子を大腸菌−酵母シャトルベクターＹＥｐ３５１（Ｙｅａｓｔ ２，ｐ１６３−１６７（１９８６））に導入されたグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素遺伝子（ＴＤＨ３、ＧＡＰ）プロモーター−ターミネーターカセット中のＳａｃＩ−ＳｍａＩ部位にライゲーションした。得られたプラスミドをＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ＳｃＭＰＤ２と命名した。
（９）ＳｃＥＲＪ５遺伝子恒常発現ベクターの構築
ＳｃＥＲＪ５（ＹＦＲ０４１Ｃ：配列番号１３６（塩基配列）、配列番号１３７（アミノ酸配列））は、Ｙ−ＤＥＲ Ｙｅａｓｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）によって調製したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型として増幅した。プライマーＹＦＲ０４１Ｃ−ｓａｃ（５’−ＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧＡＡＣＧＧＴＴＡＣＴＧＧＡＡＡＣ−３’：配列番号１０６）とプライマーＹＦＲ０４１Ｃ−ｓｍａ（５’−ＧＣＣＣＧＧＧＴＣＡＴＴＴＡＣＧＴＧＡＡＴＡＧＡＴＣ−３’：配列番号１０７）を用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で６０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、約０．９ｋｂの断片の目的ＤＮＡ断片を回収した。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした後、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を確認した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＳｃＥＲＪ５を発現させるために、プライマーＹＦＲ０４１Ｃ−ｓａｃとプライマーＹＦＲ０４１Ｃ−ｓｍａに導入した制限酵素部位ＳａｃＩとＳｍａＩを使用し、ＳａｃＩ−ＳｍａＩ消化で回収したＳｃＥＲＪ５をコードしている遺伝子を大腸菌−酵母シャトルベクターＹＥｐ３５１（Ｙｅａｓｔ ２，ｐ１６３−１６７（１９８６））に導入されたグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素遺伝子（ＴＤＨ３、ＧＡＰ）プロモーター−ターミネーターカセット中のＳａｃＩ−ＳｍａＩ部位にライゲーションした。得られたプラスミドをＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ＳｃＥＲＪ５と命名した。
（１０）ＳｃＥＵＧ１遺伝子恒常発現ベクターの構築
ＳｃＥＵＧ１（ＹＤＲ５１８Ｗ：配列番号１３８（塩基配列）、配列番号１３９（アミノ酸配列））は、Ｙ−ＤＥＲ Ｙｅａｓｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）によって調製したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型として増幅した。プライマーＥＵＧ１−ｓａｃ（５’−ＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧＣＡＡＧＴＧＡＣＣＡＣＡＡＧＡＴＴ−３’：配列番号１０８）とプライマーＥＵＧ１−ｓｍａ（５’−ＧＣＣＣＧＧＧＴＴＡＴＡＡＴＴＣＡＴＣＡＴＧＴＡＣＧＧ−３’：配列番号１０９）を用いたＰＣＲ［（９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で９０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行ない、約１．５ｋｂの断片の目的ＤＮＡ断片を回収した。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした後、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を確認した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＳｃＥＵＧ１を発現させるために、プライマーＥＵＧ１−ｓａｃとプライマーＥＵＧ１−ｓｍａに導入した制限酵素部位ＳａｃＩとＳｍａＩを使用し、ＳａｃＩ−ＳｍａＩ消化で回収したＳｃＥＵＧ１をコードしている遺伝子を大腸菌−酵母シャトルベクターＹＥｐ３５１（Ｙｅａｓｔ ２，ｐ１６３−１６７（１９８６））に導入されたグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素遺伝子（ＴＤＨ３、ＧＡＰ）プロモーター−ターミネーターカセット中のＳａｃＩ−ＳｍａＩ部位にライゲーションした。得られたプラスミドをＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ＳｃＥＵＧ１と命名した。
抗体の分泌生産に及ぼすシャペロンの効果
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹ４７４１株から派生したＺＵ０１／ＹＧＲ２８５Ｃ株（ＭＡＴａ Δｈｉｓ３ Δｌｅｕ２ Δｍｅｔ１５ Δ ｕｒａ３Δ ｚｕｏ１）のコンピテントセルは、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩ Ｋｉｔ（ＺＹＭＯ ＲＥＳＡＲＣＨ社）によって調製した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＺＵＯ１／ＹＧＲ２８５Ｃ株を、５ｍｌのＹＰＡＤ培地［０．０４％のアデニンを含むＹＰＤ培地（Ｓｉｇｍａ社）］に接種し、終夜培養（３０℃、３１０ｒｐｍ）によって得た菌体を使用した。実施例１３と実施例１４によって構築した発現ベクターは、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩ Ｋｉｔ（ＺＹＭＯ ＲＥＳＡＲＣＨ社）によってＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＺＵＯ１／ＹＧＲ２８５Ｃ株に導入し、２％の寒天を含むＳＴ寒天培地［２％のグルコース、０．０４％のアデニン、０．３ＭのＫＣｌを含みウラシルとロイシンを欠失したＹｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ａｎｄ Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ培地（Ｓｉｇｍａ社）］上で増殖した形質転換体をそれぞれシャペロン恒常発現抗体発現酵母株として選抜した。
抗体重鎖と軽鎖の発現ユニットを保持するＹＥｐ３５２ＧＡＰ−ＩＩ−ＳｃＫａｒＨｃ／ＳｃＫａｒＬｃは、宿主のウラシル要求変異を相補するＵＲＡ３マーカー遺伝子を有している。一方、ＹＥｐ３５１ ＧＡＰ−ＩＩ（遺伝子が導入されていないコントロールベクター）、ＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ＳｃＰＤＩ１（ＳｃＰＤＩ１発現ベクター）、ＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ＳｃＭＰＤ１（ＳｃＭＰＤ１発現ベクター）、ＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ＳｃＳＣＪ１（ＳｃＳＣＪ１発現ベクター）、ＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ＳｃＥＲＯ１（ＳｃＥＲＯ１発現ベクター）、ＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ＳｃＦＫＢ２（ＳｃＦＫＢ２発現ベクター）、ＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ＳｃＪＥＭ１（ＳｃＪＥＭ１発現ベクター）、ＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ＳｃＬＨＳ１（ＳｃＬＨＳ１発現ベクター）、ＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ＳｃＭＰＤ２（ＳｃＭＰＤ２発現ベクター）、ＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ＳｃＥＲＪ５（ＳｃＥＲＪ５発現ベクター）、ＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ＳｃＥＵＧ１（ＳｃＥＵＧ１発現ベクター）は、宿主のロイシン要求変異を相補するＬＥＵ２マーカー遺伝子を有している。そこで、抗体遺伝子発現ベクターとシャペロン恒常発現ベクターが導入されたときのみ増殖できるように宿主に形質転換し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＺＵＯ１／ＹＧＲ２８５Ｃ株から１０種類ずつシャペロン恒常発現抗体発現酵母株を構築した。
９６−ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（グライナー社，７８０２７１）に、５００μＬのＳＴ培地［２％のグルコース、０．０４％のアデニン、０．３ＭのＫＣｌを含みウラシルとロイシンを欠失したＹｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ａｎｄ Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ培地（Ｓｉｇｍａ社）］を仕込み、形質転換体を爪楊枝で接種した後、ＣＯ２透過性プレートシール（グライナー社，６７６０５１）でプレート上部をシールした後、攪拌速度３１０ｒｐｍ、振幅５０ｍｍ、培養温度３０℃で３日間培養した。コントロール培養では、９６−ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（グライナー社，７８０２７１）に、１ｍＬのＹＰＡＤ培地を仕込み、ＰＭＴ阻害剤添加培養では、終濃度１０μＭになるようにロダニン−３−酢酸誘導体１ｃを初発添加した１ｍＬのＹＰＡＤ培地を仕込んだ。ＳＴ培地で培養した培養液を終濃度５％になるように接種し、ＣＯ２透過性プレートシール（グライナー社，６７６０５１）でプレート上部をシールした後、攪拌速度３１０ｒｐｍ、振幅５０ｍｍ、培養温度３０℃で３日間培養した。培養液より培養上清を調製し、酵母によって分泌生産された抗体を含む試料とした。抗体の分泌生産は、サンドイッチＥＬＩＳＡによって確認した。培養終了液から遠心分離（２，７００ｘｇ，４℃，５分間）によって菌体を除去して培養上清を調製し分泌抗体試料とした。サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、９６ｗｅｌｌプレートに抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体の抗原であるＴＲＡＩＬレセプタータンパク質を吸着させ、分泌抗体試料を添加し、ペルオキシダーゼ標識ヒトＩｇＧ特異的Ｆｃ抗体（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−Ｌａｂｅｌｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｏ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆｃ）（ＫＰＬ社，０４−１０−２０））とＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ社，５０−６６−０１）を使用して検出した。
図１４に示すように、コントロール株が３．９ｎｇ／ｍＬの抗体分泌生産量を示すのに対して、Ｏ型糖鎖付加抑制条件下、コントロール株は１０ｎｇ／ｍＬと約２．５倍の抗体分泌生産量を示し、Ｏ型糖鎖付加抑制効果が認められた。また、ＳｃＥＲＯ１およびＳｃＰＤＩ１導入株は、Ｏ型糖鎖付加抑制条件下、２６．４ｎｇ／ｍＬ、７９．２ｎｇ／ｍＬとそれぞれコントロール株の約７倍、約２０倍の抗体分泌生産量を示した。
ＯｍＰＤＩ１とヒトａｌｐｈａ−２，３−シアル酸転移酵素（ＳＴ３ＧａｌＩ）の共発現株の構築
（１）ＳＴ３ＧａｌＩ発現ベクターの構築
ＦＬＡＧ配列を３連続させた配列（３×ＦＬＡＧ）をコードする遺伝子の増幅を行った。Ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｉｇｍａ社，Ｅ４７７６）をテンプレートとし、それぞれＳｒｆＩ部位とＢａｍＨＩ部位を付加したプライマー５’−３ＸＦＬＡＧ（５’−ａｔｃａｔｃａｔｃａｔｇｃｃｃｇｇｇｃｃｇａｃｔａｃａａａｇａｃｃａｔ−３’：配列番号１１０）とプライマー３’−３ＸＦＬＡＧ（５’−ｇｃａｃｃｇｔｃｔｃｇｇａｔｃｃｃｔｔｇｔｃａｔｃｇｔｃａｔｃｃｔｔ−３’：配列番号１１１）を用いてＰＣＲにて増幅した。得られた断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｄｒｙ−Ｄｏｗｎ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社，Ｚ９６０２Ｎ）を用いて、ＳｒｆＩとＢａｍＨＩで切断したＯ．ｍｉｎｕｔａ発現ベクターｐＯＭＥＡ１−Ｈｉｓ６（Ａｋｅｂｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７３：４８０５−４８１２）に挿入した。得られたベクターをｐＯＭＥＡ１−６Ｈ３Ｆとした。
次にＳＴ３ＧａｌＩの触媒部位をコードする遺伝子の増幅を行った。ＳＴ３ＧａｌＩ遺伝子は、ヒト第８番染色体に位置しており、そのｃＤＮＡ塩基配列は公共のデータベースであるＧｅｎＢａｎｋにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｌ２９５５５として登録されている。まず、このＳＴ３ＧａｌＩ遺伝子の触媒ドメインを、プライマー３ＦＬＡＧ−ＳＴ３Ｇａｌ１−Ｆ（５’−ＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＧＡＴＣＣａａｃｔａｃｔｃｃｃａｃａｃｃａｔｇｇ−３’：（配列番号１１２）とプライマー３ＦＬＡＧ−ＳＴ３Ｇａｌ１−Ｒ（５’−ＧＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＧＡＴＣＣｔｃａｔｃｔｃｃｃｃｔｔｇａａｇａｔｃｃｇｇａｔ−３’：配列番号１１３）を用いてＰＣＲで増幅した。鋳型にはＮＥＤＯ ＳＧプロジェクトで作製したヒト糖転移酵素ライブラリーのエントリークローンを用いた（Ｓｈｉｍｍａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７２，７００３−７０１２）。得られた断片をｐＯＭＥＡ１−６Ｈ３ＦのＢａｍＨＩ部位にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｄｒｙ−Ｄｏｗｎ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社，Ｚ９６０２Ｎ）を用いて挿入した。塩基配列を確認した後、発現ベクターｐＯＭＥＡ１−６Ｈ３Ｆ−ＳＴ３Ｇａｌ１とした。
（２）ＳＴ３ＧａｌＩ発現株の構築
プラスミドｐＯＭＥＡ１−６Ｈ３Ｆ−ＳＴ３Ｇａｌ１を制限酵素ＮｏｔＩにて切断後、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＴＫ１０−１−２株を形質転換した。形質転換は酢酸リチウム法を用いて行った。形質転換後、ＳＤ−Ａｄｅ（２％グルコース、０．１７％Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、アデニンをのぞく核酸塩基及びアミノ酸混合物（２０−４００ｍｇ／Ｌ））培地上に塗沫し、３０℃にて２日間培養した。得られた形質転換体を実施例５で示したコロニーＰＣＲ法にて染色体上への組み込みを確認し、ＹＴ−１株とした。
次に、実施例３にて構築したＯ．ｍｉｎｕｔａ由来のＰＤＩ１発現ベクター（ｏｎａＰ０３６０６）を導入した。またコントロールとしてＯｍＰＤＩ１の入っていないｐＯＭｅｘＧＰ１Ｕを用いて形質転換を行った。上記と同様にＹＴ−１株の形質転換を行った後、ＳＤ−Ｕｒａ（２％グルコース、０．１７％Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、ウラシルをのぞく核酸塩基及びアミノ酸混合物（２０−４００ｍｇ／Ｌ））培地上に塗沫し、３０℃にて２日間培養した。得られた形質転換体を実施例５で示したコロニーＰＣＲ法にて染色体上への組み込みを確認し、ｐＯＭｅｘＧＰ１Ｕ（コントロールプラスミド）が導入された株をＹＴ−２株、ｏｎａＰ０３６０６が導入された株をＹＴ−３株とした。
ヒトａｌｐｈａ−２，３−シアル酸転移酵素（ＳＴ３ＧａｌＩ）の発現
ＹＴ−２株およびＹＴ−３株を５ｍｌのＹＰＡＤ＋ＫＣｌ培地（２％ポリペプトン、１％酵母エキス、２％グルコース、アデニン（４０ｍｇ／Ｌ），０．３Ｍ塩化カリウム）に植菌し、３０℃、一晩前培養した。次に１５０ｍｌのＹＰＡＤ＋ＫＣｌ培地に１ｍｌの前培養液を植菌し、３０℃、４８時間培養した。集菌後、１００ｍｌのＢＭＭＹ＋２％カザミノ酸培地（１％酵母エキス，２％ポリペプトン，１．３４％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製），０．１Ｍ ＫＰｉ（ｐＨ６．０），２％カザミノ酸，１％メタノール）に再懸濁し、２０℃、９６時間培養した。なお、１２時間ごとに０．５％になるようにメタノールを添加した。培養終了後遠心して菌体を除き、粗酵素液とした。
酵素活性測定は以下のように行った。反応液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ ＭｎＣｌ２，５ｍＭ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ，５０μＭ ｃｏｒｅ１−ｐＮＰ）１８μｌに対し、粗酵素液を２μｌ加え反応を開始した。３７℃，３０分反応後、煮沸することで反応を停止し、ＨＰＬＣによる解析を行った。カラムはコスモシル５Ｃ１８−ＡＲＩＩ（４．６ｘ２５０ｍｍ：ナカライテスク社）を使用し、移動相は０．２Ｍトリエチルアミン−酢酸（ｐＨ７．０）（Ａ液）とアセトニトリル（Ｂ液）を９：１で混合したものを用いた。カラムを平衡化し、試料注入後２０分で溶出を行った。検出はＵＶ検出器（検出波長３００ｎｍ）にて行った。基質であるｃｏｒｅ１−ｐＮＰは１４．５分に、反応産物であるｓｉａｌｙｌｃｏｒｅ１−ｐＮＰは１７分に溶出される。ピーク面積から得られた反応産物を定量し、活性（Ｕ）とした。なお１Ｕは、１分間に１μｍｏｌの反応産物を生成する酵素量と定義した。培養中の経時的な酵素の発現量の変化を図１５に示した。その結果、ＯｍＰＤＩ１非導入株（ＹＴ−２）に対し、ＯｍＰＤＩ１を導入したＳＴ３ＧａｌＩ発現株（ＹＴ−３）では、酵素活性の発現増加が確認され、９６時間後においては約３．４倍の差が確認された。
次にウェスタンブロット解析を行った。ＹＴ−２株およびＹＴ−３株について、１０μＵ分の培養上清を添付のプロトコールに従ってＥｎｄｏＨｆ処理（ＮＥＢ社，Ｐ０７０３Ｓ）を行った後アプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動終了後、ＰＶＤＦ膜に転写し、常法に従いウェスタンブロッティングを行った。なお、一次抗体としてマウス抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ社，Ｆ１８０４）、二次抗体として抗マウスＩｇＧ抗体−アルカリホスファターゼ複合体を用いた。検出はＣＤＰ−Ｓｔａｒを用い、イメージアナライザーＬＡＳ１０００（富士フィルム社）で検出した。さらに各シグナルについて、Ｉｍａｇｅ Ｇａｕｇｅ（富士フィルム社）を用いて数値化した。
その結果を図１６およびに表１に示した。酵素活性を合わせてウェスタンブロット解析を行ったにも関わらず、ＯｍＰＤＩ１導入株（ＹＴ−３）由来のＳＴ３ＧａｌＩシグナルが０．６倍と弱くなっていることから、ＯｍＰＤＩ１を導入したことにより、ＳＴ３ＧａｌＩの分子内での正常なジスルフィド結合の形成が促進され、正しいフォールディングのタンパク質が増加したことにより比活性が約１．６倍高くなったと考えられた。
シャペロン遺伝子組合せ発現ベクターおよびヒトａｌｐｈａ−２，３−シアル酸転移酵素（ＳＴ３ＧａｌＩ）発現ベクター共発現株の構築
実施例１７のＹＴ−１株に、実施例４にて作製したＯ．ｍｉｎｕｔａ由来の各種シャペロン遺伝子組合せ発現ベクターを導入した。実施例１６と同様に各プラスミドをＮｏｔＩで切断し、ＹＴ−１株の形質転換を行った。形質転換後、ＳＤ−Ｕｒａ（２％グルコース、０．１７％Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、ウラシルをのぞく核酸塩基及びアミノ酸混合物（２０−４００ｍｇ／Ｌ））培地上に塗沫し、３０℃にて２日間培養した。得られた形質転換体を、実施例５で示したコロニーＰＣＲ法にて染色体上への組み込みを確認し、２コピーのＯｍＰＤＩ１発現カセットを保持する共発現ベクター（ｏｎａＰ０９４０７）を有する発現株をＹＴ−４株、ＯｍＰＤＩ１とＯｍＫａｒ２の共発現ベクター（ｏｎａＰ０９７０７）を有する発現株をＹＴ−５株、ＯｍＰＤＩ１とＯｍＥＲＯ１の共発現ベクター（ｏｎａＰ０９５０７）を有する発現株をＹＴ−６株、ＯｍＰＤＩ１と０ｍＨＳＰ１０４の共発現ベクター（ｏｎａＰ０９６０７）を有する発現株をＹＴ−７株とした。実施例１７と同様に培養を行ない、各株からの酵素の経時的な発現を測定し、図１７に示した。また培養上清３０μｌを添付のプロトコールに従ってＥｎｄｏＨｆ処理（ＮＥＢ社，Ｐ０７０３Ｓ）を行ない、ウェスタンブロット解析を行った結果を図１８に、各シグナルを数値化した値とそれらから求められる比活性を表２に示した。
酵素の発現は、ＹＴ−４，−５，−７では誘導２日目からほとんど増加しなくなるが、ＹＴ−６株では４日目まで活性の大幅な増加が確認され、最終的に培養上清１ｍｌあたりの活性が最も高かった。またＹＴ−４，−５発現株では明確な比活性の増加は確認されないが、ＹＴ−６、−７株では経時的に比活性の増加がみられ、ＥＲＯ１やＨＳＰ１０４の共発現により正しいフォールディングされた酵素分子が増加していると考えられた。
シャペロン遺伝子単独発現ベクターの構築
（１）Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ＧＲＰ７８／ＢｉＰ遺伝子恒常発現ベクターの構築
Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒのＧＲＰ７８遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ１７１６９：配列番号１５２）は、以下のようにクローニングし、発現ベクターを構築した。
まず、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアライフサイエンス社，２７−９２７１−０１）を用いて、Ｅｘ３２５培地で培養して得られたＣＨＯ／ｄｈＦｒ−株（ＡＴＣＣＣＲＬ−９０９６）細胞より、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。精製したｔｏｔａｌ ＲＮＡを６００ｎｇ使用し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ−α−（ＴＯＹＯＢＯ社，ＦＳＫ−１０１）による逆転写反応によってｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、プライマーＣＨＯＧＲＰ７８−Ｆ（５’−ＡＣＣＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＡＧＴＴＣＣＣＴＡＴＧＧＴＧＧ−３’：配列番号１１４）とプライマーＣＨＯＧＲＰ７８−Ｒ（５’−ＡＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＣＡＡＣＴＣＡＴＣ−３’：配列番号１１５）を用いたＰＣＲ［９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で１２０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行い、約２ｋｂの断片の目的ＤＮＡ断片を回収した。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした後、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を確認した。プライマーＣＨＯＧＲＰ７８−ＦとプライマーＣＨＯＧＲＰ７８−Ｒに導入した制限酵素部位ＸｈｏＩとＮｏｔＩを使用しＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ消化で回収したＣＨＯ ＧＲＰ７８遺伝子をｐＭＥ１８ｓ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ００９８６４）のＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ部位にライゲーションした。得られたプラスミドをｐＭＥ１８ｓ／ｃｈｏＧＲＰ７８と命名した。
（２）Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ＰＤＩ遺伝子恒常発現ベクターの構築
Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒのＰＤＩ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ３６４３１７：配列番号１５３）は、以下のようにクローニングし、発現ベクターを構築した。
上記（１）と同様に、得られたｃＤＮＡを鋳型として、プライマーＣＨＯＰＤＩ−Ｆ（５’−ＡＣＣＣＴＣＧＡＧＡＴＧＣＴＧＡＧＣＣＧＴＴＣＴＣ−３’：配列番号１１６）とプライマーＣＨＯＰＤＩ−Ｒ（５’−ＡＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＣＡＡＴＴＣＧＴＣＣＴＴＴＡＣ−３’：配列番号１１７）を用いたＰＣＲ［９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で９０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行い、約１．５ｋｂの断片の目的ＤＮＡ断片を回収した。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした後、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を確認した。プライマーＣＨＯＰＤＩ−ＦとプライマーＣＨＯＰＤＩ−Ｒに導入した制限酵素部位ＸｈｏＩとＮｏｔＩを使用しＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ消化で回収したＣＨＯ ＰＤＩ遺伝子をｐＭＥ１８ｓ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ００９８６４）のＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ部位にライゲーションした。得られたプラスミドをｐＭＥ１８ｓ／ｃｈｏＰＤＩと命名した。
（３）Ｈｕｍａｎ ＥＲＯ１−Ｌβ遺伝子恒常発現ベクターの構築
ヒトのＥＲＯ１−Ｌβ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０１９８９１：配列番号１４６）は、以下のようにクローニングし、発現ベクターを構築した。
まず、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥライフサイエンス社，２７−９２７１−０１）を用いて、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ Ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン社，１２３３８−０１８）で培養して得られたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３−Ｆ細胞（インビトロジェン社，Ｒ７９０−０７）より、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。精製したｔｏｔａｌ ＲＮＡを６００ｎｇ使用し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ−α−（ＴＯＹＯＢＯ社，ＦＳＫ−１０１）による逆転写反応によってｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、プライマーｈＥＲＯ−Ｆ（５’−ＡＣＣＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＧＣＣＡＡＧＧＧ−３’：配列番号１１８）とプライマーｈＥＲＯ−Ｒ（５’−ＡＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＣＴＡＣＴＧＴＧＴＴＧＴＡＡＴＡＡＧＡＣ−３’：配列番号１１９）を用いたＰＣＲ［９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で９０秒）×３０サイクル］をＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社，１２３４４−０２４）を使用して行い、約１．４ｋｂの断片の目的ＤＮＡ断片を回収した。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした後、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を確認した。プライマーｈＥＲＯ−ＦとプライマーｈＥＲＯ−Ｒに導入した制限酵素部位ＸｈｏＩを使用し、ＸｈｏＩ消化で回収したｈｕｍａｎ ＥＲＯ１−Ｌβ遺伝子をｐＭＥ１８ｓ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ００９８６４）のＸｈｏＩ部位にライゲーションした。得られたプラスミドをｐＭＥ１８ｓ／ｈＥＲＯ１−Ｌβと命名した。
（４）抗体発現ベクターの構築
発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社，Ｖ７９０−２０）に、抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体遺伝子（ＷＯ２００１／０８３５６０）の軽鎖および重鎖を導入しｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ｅｘｐＡＢと命名した。
抗体の分泌生産に及ぼすシャペロンの効果
実施例１９で構築した（１）〜（３）の各種シャペロン遺伝子恒常発現ベクターをＣＯＳ−１細胞に導入して、抗体の分泌生産におけるシャペロンの導入効果を検証した。
２４−ｗｅｌｌマイクロプレート（ＩＷＡＫＩサイテック社，３８２０−０２４Ｎ）に１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでＣＯＳ−１細胞を播種し、培養２４時間後にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン社，１１６６８−０２７）を用いて、抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ｅｘｐＡＢと各種シャペロン恒常発現ベクターをコトランスフェクトした。遺伝子導入後、４８時間培養した後、培養上清を遠心分離（２１，６００ｘｇ，４℃，３分）によって清澄化し、分泌抗体試料とした。
分泌生産された抗体の定量的アッセイは、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によって行った。９６ｗｅｌｌプレートに抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体の抗原であるＴＲＡＩＬレセプター蛋白質を吸着させ、分泌抗体試料を添加し、ペルオキシダーゼ標識ヒトＩｇＧ特異的Ｆｃ抗体（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−Ｌａｂｅｌｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｏ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆｃ）（ＫＰＬ社，０４−１０−２０））とＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ社，５０−６６−０１）を使用して検出した。図１９に示すように、ＣＨＯ ＢｉＰ導入株とＣＨＯ ＰＤＩ導入株では、コントロール株（抗体遺伝子のみ導入した株）の抗体分泌生産量より、それぞれ約１９％と約１３％の生産量の向上が確認された。また、シャペロンを組合せて導入した場合、ＣＨＯ ＢｉＰ＋ｈｕｍａｎ ＥＲＯ１−ＬβとＣＨＯ ＰＤＩ＋ｈｕｍａｎ ＥＲＯ １−Ｌβ導入株では、コントロール株（抗体遺伝子のみ導入した株）の抗体分泌生産量より、それぞれ約３０％分泌生産量が向上することが確認された。
シャペロン遺伝子単独発現ベクターの構築
（１）Ｈｕｍａｎ ＥＲＯ１−Ｌα遺伝子恒常発現ベクターの構築
Ｈｕｍａｎ ＥＲＯ１−Ｌα（ｈＥＲＯ１−Ｌα，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．Ｑ９６ＨＥ７）は、ＯｍＥＲＯ１の機能ホモログであり、１４０７ｂｐの塩基配列によりコードされる４６８アミノ酸残基のアミノ酸配列からなる（配列番号１４３、１４４）。Ｏ．ｍｉｎｕｔａのＣｏｄｏｎ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅを考慮してｈＥＲＯ１−Ｌα遺伝子を合成した（オペロンバイオテクノロジー社）。塩基配列を確認したＤＮＡ断片を保持するプラスミドから、合成時に導入したＳａｌＩ制限酵素部位とＥｃｏＴ２２Ｉ制限酵素部位を利用して、ＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ消化で合成ｈＥＲＯ１−Ｌαを含むＤＮＡ断片（配列番号１４５）を回収した。Ｏ．ｍｉｎｕｔａにおいて恒常的に合成ｈＥＲＯ１−Ｌαを発現させるために、ＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ消化で回収したＷＯ２００３／０９１４３１記載のｐＯＭｅｘＧＰ１Ｕにライゲーションした。得られたプラスミドをｏｎａＰ１７６０８と命名した。
（２）Ｈｕｍａｎ ＥＲＯ１−Ｌβ遺伝子恒常発現ベクターの構築
Ｈｕｍａｎ ＥＲＯ１−Ｌβ（ｈＥＲＯ１−Ｌβ，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿０６３９４４）は、ＯｍＥＲＯ１の機能ホモログであり、１４０４ｂｐの塩基配列によりコードされる４６７アミノ酸残基のアミノ酸配列からなる（配列番号１４６、１４７）。Ｏ．ｍｉｎｕｔａのＣｏｄｏｎ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅを考慮してｈＥＲＯ１−Ｌβ遺伝子を合成した（オペロンバイオテクノロジー社）。塩基配列を確認したＤＮＡ断片を保持するプラスミドから、合成時に導入したＳａｌＩ制限酵素部位とＥｃｏＴ２２Ｉ制限酵素部位を利用して、ＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ消化で合成ｈＥＲＯ１−Ｌαを含むＤＮＡ断片（配列番号１４８）を回収した。Ｏ．ｍｉｎｕｔａにおいて恒常的に合成ｈＥＲＯ１−Ｌβを発現させるために、ＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ消化で回収したＷＯ２００３／０９１４３１記載のｐＯＭｅｘＧＰ１Ｕにライゲーションした。得られたプラスミドをｏｎａＰ１７８０８と命名した。
（３）Ｈｕｍａｎ ＧＲＰ７８遺伝子恒常発現ベクターの構築
Ｈｕｍａｎ ＧＲＰ７８（ｈＧＲＰ７８，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿００５３３８）は、ＯｍＫａｒ２の機能ホモログであり、１９６５ｂｐの塩基配列によりコードされる６５４アミノ酸残基のアミノ酸配列からなる（配列番号１４９、１５０）。Ｏ．ｍｉｎｕｔａのＣｏｄｏｎ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅを考慮してｈＧＲＰ７８遺伝子を合成した（オペロンバイオテクノロジー社）。塩基配列を確認したＤＮＡ断片を保持するプラスミドから、合成時に導入したＳａｌＩ制限酵素部位とＥｃｏＴ２２Ｉ制限酵素部位を利用して、ＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ消化で合成ｈＧＲＰ７８を含むＤＮＡ断片（配列番号１５１）を回収した。Ｏ．ｍｉｎｕｔａにおいて恒常的に合成ｈＧＲＰ７８を発現させるために、ＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ消化で回収したＷＯ２００３／０９１４３１記載のｐＯＭｅｘＧＰ１Ｕにライゲーションした。得られたプラスミドをｏｎａＰ１７４０８と命名した。
シャペロン遺伝子組合せ発現ベクターの構築
（１）合成ｈＰＤＩ遺伝子と合成ｈＥＲＯ１−Ｌα遺伝子の共発現および恒常発現ベクターの構築
合成ｈＥＲＯ１−Ｌα恒常発現ベクターｏｎａＰ１７６０８から制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＴ２２Ｉによって合成ｈＥＲＯ１−Ｌα領域を回収した。実施例４で構築したベクターｐＺ／ＧｐＧｔを制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＴ２２Ｉで消化した後、合成ｈＥＲＯ１−Ｌαを含むＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ断片を導入し、ｐＺ／ＧｐＧｔ／合成ｈＥＲＯ１−Ｌαを構築した。次に、ｐＺ／ＧｐＧｔ／合成ｈＥＲＯ１−Ｌαを制限酵素ＡｐａＩで消化した後、ＧＡＰプロモーター−合成ｈＥＲＯ１−Ｌα−ＧＡＰターミネーター（合成ｈＥＲＯ１−Ｌα発現カセット）を含む断片を回収した。回収した合成ｈＥＲＯ１−Ｌα発現カセットは、合成ｈＰＤＩ発現ベクターｏｎａＰ０９１０７の制限酵素ＡｐａＩ部位に導入後、ＰＣＲ法によって挿入方向を確認し、合成ｈＰＤＩ発現ベクターｏｎａＰ０９１０７のＵＲＡ３マーカーを中心に逆向きに合成ｈＰＤＩと合成ｈＥＲＯ１−Ｌαの発現カセットが導入されているベクターを選抜した。得られた合成ｈＰＤＩと合成ｈＥＲＯ１−Ｌαの共発現ベクターをｏｎａＰ１８２０８と命名した。
（２）合成ｈＰＤＩ遺伝子と合成ｈＥＲＯ１−Ｌβ遺伝子の共発現および恒常発現ベクターの構築
合成ｈＥＲＯ１−Ｌβ恒常発現ベクターｏｎａＰ１７８０８から制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＴ２２Ｉによって合成ｈＥＲＯ１−Ｌβ領域を回収した。実施例４で構築したベクターｐＺ／ＧｐＧｔを制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＴ２２Ｉで消化した後、合成ｈＥＲＯ１−Ｌβを含むＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ断片を導入し、ｐＺ／ＧｐＧｔ／合成ｈＥＲＯ１−Ｌβを構築した。次に、ｐＺ／ＧｐＧｔ／合成ｈＥＲＯ１−Ｌβを制限酵素ＡｐａＩで消化した後、ＧＡＰプロモーター−合成ｈＥＲＯ１−Ｌβ−ＧＡＰターミネーター（合成ｈＥＲＯ１−Ｌβ発現カセット）を含む断片を回収した。回収した合成ｈＥＲＯ１−Ｌβ発現カセットは、合成ｈＰＤＩ発現ベクターｏｎａＰ０９１０７の制限酵素ＡｐａＩ部位に導入後、ＰＣＲ法によって挿入方向を確認し、合成ｈＰＤＩ発現ベクターｏｎａＰ０９１０７のＵＲＡ３マーカーを中心に逆向きに合成ｈＰＤＩと合成ｈＥＲＯ１−Ｌβの発現カセットが導入されているベクターを選抜した。得られた合成ｈＰＤＩ１と合成ｈＥＲＯ１−Ｌβの共発現ベクターをｏｎａＰ１８３０８と命名した。
（３）合成ｈＰＤＩ遺伝子と合成ｈＧＲＰ７８遺伝子の共発現および恒常発現ベクターの構築
合成ｈＧＲＰ７８恒常発現ベクターｏｎａＰ１７４０８から制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＴ２２Ｉによって合成ｈＧＲＰ７８領域を回収した。実施例４で構築したベクターｐＺ／ＧｐＧｔを制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＴ２２Ｉで消化した後、合成ｈＧＲＰ７８を含むＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ断片を導入し、ｐＺ／ＧｐＧｔ／合成ｈＧＲＰ７８を構築した。次に、ｐＺ／ＧｐＧｔ／合成ｈＧＲＰ７８を制限酵素ＡｐａＩで消化した後、ＧＡＰプロモーター−合成ｈＧＲＰ７８−ＧＡＰターミネーター（合成ｈＧＲＰ７８発現カセット）を含む断片を回収した。回収した合成ｈＧＲＰ７８発現カセットは、合成ｈＰＤＩ発現ベクターｏｎａＰ０９１０７の制限酵素ＡｐａＩ部位に導入後、ＰＣＲ法によって挿入方向を確認し、合成ｈＰＤＩ発現ベクターｏｎａＰ０９１０７のＵＲＡ３マーカーを中心に逆向きに合成ｈＰＤＩと合成ｈＧＲＰ７８の発現カセットが導入されているベクターを選抜した。得られた合成ｈＰＤＩ１と合成ｈＧＲＰ７８の共発現ベクターをｏｎａＰ１８１０８と命名した。
（４）合成ｈＰＤＩ遺伝子と合成ｈＥＲＯ１−Ｌα遺伝子と合成ｈＧＲＰ７８遺伝子の共発現および恒常発現ベクターの構築
ＧＡＰプロモーター発現制御による合成ｈＰＤＩ、合成ｈＥＲＯ１−ＬαとＰＧＫプロモーター発現制御による合成ｈＧＲＰ７８の共発現ベクターを以下のように構築した。
実施例４で構築したプラスミドｐＯＵ１／Ｋａｒ２−ＰｐｔＫより制限酵素ＥｃｏＴ２２ＩとＫｐｎＩによってＰＧＫターミネーター領域を回収した。また、合成ｈＧＲＰ７８領域をプラスミドｏｎａＰ１７４０８より制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＴ２２Ｉによって回収した。制限酵素ＳａｌＩとＫｐｎＩによって調製したプラスミドｐＵＣ１１９（タカラバイオ社，ＴＫＲ−３３１９）、制限酵素ＥｃｏＴ２２ＩとＫｐｎＩで消化して回収したＰＧＫターミネーター領域と制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＴ２２Ｉで消化して回収した合成ｈＧＲＰ７８領域を３断片ライゲーションし、ｐＵＣ１１９／合成ｈＧＲＰ７８＋ＰＧＫｔを構築した。次に、ｐＯＵ１／Ｋａｒ２−ＰｐｔＫから制限酵素ＫｐｎＩとＳａｌＩによってＰＧＫプロモーター領域を回収し、ｐＵＣ１１９／合成ｈＧＲＰ７８＋ＰＧＫｔから制限酵素ＳａｌＩとＫｐｎＩによって回収した合成ｈＧＲＰ７８とＰＧＫターミネーター領域を制限酵素ＫｐｎＩによって調製したプラスミドｐＵＣ１１９（タカラバイオ社，ＴＫＲ−３３１９）の３断片ライゲーションによってｐＵＣ１１９／ＰＧＫｐ＋合成ｈＧＲＰ７８＋ＰＧＫｔを得た。次に、ｐＵＣ１１９／ＰＧＫｐ＋合成ｈＧＲＰ７８＋ＰＧＫｔを制限酵素ＫｐｎＩで消化し、ＰＧＫプロモーター−合成ｈＧＲＰ７８−ＰＧＫターミネーター（合成ｈＧＲＰ７８発現カセット）を含む断片を回収し、合成ｈＰＤＩと合成ｈＥＲＯ１−Ｌαの共発現ベクターｏｎａＰ１８２０８の制限酵素ＫｐｎＩ部位に導入することによって合成ｈＰＤＩ、合成ｈＥＲＯ１−Ｌα、および合成ｈＧＲＰ７８の共発現ベクターｏｎａＰ１８５０８を構築した。
（５）合成ｈＰＤＩ遺伝子と合成ｈＥＲＯ１−Ｌβ遺伝子と合成ｈＧＲＰ７８遺伝子の共発現および恒常発現ベクターの構築
ＧＡＰプロモーター発現制御による合成ｈＰＤＩ、合成ｈＥＲＯ１−ＬβとＰＧＫプロモーター発現制御による合成ｈＧＲＰ７８の共発現ベクターを以下のように構築した。
前記（４）で構築したｐＵＣ１１９／ＰＧＫｐ＋合成ｈＧＲＰ７８＋ＰＧＫｔを制限酵素ＫｐｎＩで消化し、ＰＧＫプロモーター−合成ｈＧＲＰ７８−ＰＧＫターミネーター（合成ｈＧＲＰ７８発現カセット）を含む断片を回収し、合成ｈＰＤＩと合成ｈＥＲＯ１−Ｌβの共発現ベクターｏｎａＰ１８３０８の制限酵素ＫｐｎＩ部位に導入することによって合成ｈＰＤＩ、合成ｈＥＲＯ１−Ｌβ、および合成ｈＧＲＰ７８の共発現ベクターｏｎａＰ１８６０８を構築した。
（６）合成ｈＰＤＩ遺伝子とＯｍＥＲＯ１遺伝子と合成ｈＧＲＰ７８遺伝子の共発現および恒常発現ベクターの構築
ＧＡＰプロモーター発現制御による合成ｈＰＤＩ、ＯｍＥＲＯ１とＰＧＫプロモーター発現制御による合成ｈＧＲＰ７８の共発現ベクターを以下のように構築した。
前記（４）で構築したｐＵＣ１１９／ＰＧＫｐ＋合成ｈＧＲＰ７８＋ＰＧＫｔを制限酵素ＫｐｎＩで消化し、ＰＧＫプロモーター−合成ｈＧＲＰ７８−ＰＧＫターミネーター（合成ｈＧＲＰ７８発現カセット）を含む断片を回収し、合成ｈＰＤＩとＯｍＥＲＯ１の共発現ベクターｏｎａＰ１１１０７の制限酵素ＫｐｎＩ部位に導入することによって合成ｈＰＤＩ、ＯｍＥＲＯ１、および合成ｈＧＲＰ７８の共発現ベクターｏｎａＰ１８７０８を構築した。
シャペロン導入酵母株（Ｏ．ｍｉｎｕｔａ）の作製
実施例２１と実施例２２で構築した全てのシャペロン恒常発現ベクターは制限酵素ＮｏｔＩで消化した後、エレクトロポレーション法により、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＹＫ５株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１：Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａプロテアーゼＹＰＳ１遺伝子破壊株）へ導入した。エレクトロポレーションは、ＷＯ２００３／０９１４３１に記載の条件を使用した。エレクトロポレーション後、高圧蒸気滅菌したカザミノ−Ｕ寒天培地（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ Ｗ／Ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ６．７ｇ／Ｌ，Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ０．５ｇ／Ｌ，Ｇｌｕｃｏｓｅ ２０ｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン ２０ｍｇ／Ｌ，アデニン ２０ｍｇ／Ｌ，Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ ２０ｇ／Ｌ）上に塗沫し、３０℃で約２−３日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度カザミノ−Ｕ寒天培地上にて増殖させた後、ＧＡＰプロモーターによって発現制御されているシャペロンが導入されている形質転換体をコロニーＰＣＲ法によって選抜した。カザミノ−Ｕ寒天培地上で増殖した酵母の一部を１０μＬの０．２５％ＳＤＳ溶液に懸濁し、９０μＬの滅菌水を加えた後、遠心分離（２，７００ｘｇ，４℃，５分間）によって菌体を除去した。得られた上清をＤＮＡ溶液とした。ＧＡＰプロモーター配列内に設計したプライマーＧＡＰｐｆｏｒＳ−Ｆ（５’−ＧＡＴＣＴＣＡＧＧＣＣＧＡＧＴＣＡＡＧＡＣ−３’：配列番号７６）と以下のプライマーを使用して増幅が確認されたものをシャペロン恒常発現ベクター導入株とした。また、３つのシャペロン遺伝子の共発現ベクターを構築する際に合成ｈＧＲＰ７８は、ＰＧＫプロモーターを使用して発現させたため、ＰＧＫプロモーター−合成ｈＧＲＰ７８−ＰＧＫターミネーターの発現カセットの導入は、ＰＧＫプロモーター配列内に設計したプライマーＰＧＫｐｆｏｒＳ−Ｆ（５’−ＴＡＡＣＧＣＣＧＣＡＴＡＧＡＡＣＴＡＧＣ−３’：配列番号７７）とプライマーＧ７８−ＥｃｏＴ−Ｒ：５’−ＡＴＧＣＡＴＴＴＡＣＡＡＣＴＣＧＴＣＣ−３’（配列番号１５４）を使用して導入を確認した。
（ｐ１０）合成ｈＰＤＩ導入確認用プライマー
（ｐ１６）合成ｈＥＲＯ１−Ｌα導入確認用プライマー
（ｐ１７）合成ｈＥＲＯ１−Ｌβ導入確認用プライマー
（ｐ１８）合成ｈＰＤＩ＋合成ｈＥＲＯ１−Ｌα導入確認プライマー
（ｐ１９）合成ｈＰＤＩ＋合成ｈＥＲＯ１−Ｌβ導入確認プライマー
（ｐ２０）合成ｈＰＤＩ＋合成ｈＧＲＰ７８導入確認プライマー
（ｐ２１）合成ｈＰＤＩ＋合成ｈＥＲＯ１−Ｌα＋合成ｈＧＲＰ７８導入確認プライマー
（ｐ２２）合成ｈＰＤＩ＋合成ｈＥＲＯ１−Ｌβ＋合成ｈＧＲＰ７８導入確認プライマー
（ｐ２３）合成ｈＰＤＩ＋ＯｍＥＲＯ１＋合成ｈＧＲＰ７８導入確認プライマー
ＰＣＲはＴａＫａＲａ ＬＡ ＴａｑＴＭ ｗｉｔｈ ＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社，ＲＲＯ２ＡＧ）を使用して目的断片を増幅させた［（９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で６０〜１８０秒）×３０サイクル］。増幅を確認した以下の形質転換体をそれぞれシャペロン恒常発現株とした。
（Ｅ１７）合成ｈＥＲＯ１−Ｌα恒常発現株，ｏｎａ５６４０７株
（Ｅ１８）合成ｈＥＲＯ１−Ｌβ恒常発現株，ｏｎａ５６９０７株
（Ｅ１９）合成ｈＧＲＰ７８恒常発現株，ｏｎａ５７００７株
（Ｅ２０）合成ｈＰＤＴ＋合成ｈＥＲＯ１−Ｌα恒常発現株，ｏｎａ６５７０８株
（Ｅ２１）合成ｈＰＤＩ＋合成ｈＥＲＯ１−Ｌβ恒常発現株，ｏｎａ６６００８株
（Ｅ２２）合成ｈＰＤＩ＋合成ｈＧＲＰ７８恒常発現株，ｏｎａ６６１０８株
（Ｅ２３）合成ｈＰＤＩ＋合成ｈＥＲＯ１−Ｌα＋合成ｈＧＲＰ７８恒常発現株，ｏｎａ６８７０８株
（Ｅ２４）合成ｈＰＤＩ＋合成ｈＥＲＯ１−Ｌβ＋合成ｈＧＲＰ７８恒常発現株，ｏｎａ６８９０８株
（Ｅ２５）合成ｈＰＤＩ＋ＯｍＥＲＯ１＋合成ｈＧＲＰ７８恒常発現株，ｏｎａ６９１０８株
シャペロン恒常発現抗体生産酵母株（Ｏ．ｍｉｎｕｔａ）の構築
実施例２３にて育種したそれぞれのシャペロン単独恒常発現株、２種類のシャペロン恒常発現株、３種類のシャペロン恒常発現株に実施例２で構築した抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体遺伝子（ＷＯ２００１／０８３５６０）発現ベクターを上記のエレクトロポレーション法にて導入した。抗体重鎖としては、制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉで消化した１μｇのｏｎａＰ０２７０６を、抗体軽鎖としては、制限酵素ＮｏｔＩで消化した１μｇのｏｎａＰ０３１０６を使用した。エレクトロポレーション後、１００μｇ／ｍＬの濃度でＺｅｏｃｉｎＴＭ（インビトロジェン社，Ｒ２５０−０１）を添加したカザミノ−Ｕ−Ａ寒天培地（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ Ｗ／Ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ６．７ｇ／Ｌ，Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ０．５ｇ／Ｌ，Ｇｌｕｃｏｓｅ ２０ｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン ２０ｍｇ／Ｌ，Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ ２０ｇ／Ｌ）上に塗沫し、３０℃で約２−３日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度、１００μｇ／ｍＬの濃度でＺｅｏｃｉｎＴＭ（インビトロジェン社，Ｒ２５０−０１）を添加したカザミノ−Ｕ−Ａ寒天培地寒天培地上にて増殖させた後、抗体分泌生産株をスクリーニングした。合成ｈＥＲＯ１−Ｌα恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ７７１０８株を、合成ｈＥＲＯ１−Ｌβ恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ６２５０８株を、合成ｈＧＲＰ７８恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ６１８０８株を、合成ｈＰＤＩ／合成ｈＥＲＯ１−Ｌα恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ７７４０８株を、合成ｈＰＤＩ／合成ｈＥＲＯ１−Ｌβ恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ７７８０８株を、合成ｈＰＤＩ／合成ｈＧＲＰ７８恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ７８２０８株を、合成ｈＰＤＩ／合成ｈＥＲＯ１−Ｌα／合成ｈＧＲＰ７８恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ７８８０８株を、合成ｈＰＤＩ／合成ｈＥＲＯ１−Ｌβ／合成ｈＧＲＰ７８恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ７９６０８株を、合成ｈＰＤＩ／ＯｍＥＲＯ１／合成ｈＧＲＰ７８恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ８０３０８株を選抜した。
抗体の分泌生産に及ぼすシャペロンの効果
実施例２４で得られたヒト由来シャペロン恒常発現抗体遺伝子導入株を用いて抗体の分泌生産におけるヒト由来シャペロンの導入効果を検証した。また、実施例７で明らかとなったＰＭＴ阻害剤の添加による抗体の分泌生産増強効果の検証を行った。図２０に示すように、コントロール（ｏｎａ０２３０６株）が約０．４ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産量を示すのに対して、合成ｈＰＤＩ恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ３９３０７株）で約３．１ｍｇ／Ｌ、合成ｈＥＲＯ１−Ｌα恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ７７１０８株）で約０．７ｍｇ／Ｌ、合成ｈＥＲＯ１−Ｌβ恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ６２５０８株）で約１．４ｍｇ／Ｌ、合成ｈＧＲＰ７８恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ６１８０８株）で約１．０ｍｇ／Ｌ、合成ｈＰＤＩ／合成ｈＥＲＯ１−Ｌα恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ７７４０８株）で約１．４ｍｇ／Ｌ、合成ｈＰＤＩ／合成ｈＥＲＯ１−Ｌβ恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ７７８０８株）で約１．０ｍｇ／Ｌ、合成ｈＰＤＩ／合成ｈＧＲＰ７８恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ７８２０８株）で約２．３ｍｇ／Ｌ、合成ｈＰＤＩ／合成ｈＥＲＯ１−Ｌα／合成ｈＧＲＰ７８恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ７８８０８株）で約０．８ｍｇ／Ｌ、合成ｈＰＤＩ／合成ｈＥＲＯ１−Ｌβ／合成ｈＧＲＰ７８恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ７９６０８株）で４．１ｍｇ／Ｌ、合成ｈＰＤＩ／ＯｍＥＲＯ１／合成ｈＧＲＰ７８恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ８０３０８株）で約５．６ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産量を示した。ヒト由来シャペロンの発現を強化することによって、約２から１３倍に抗体分泌生産能が向上した。さらに、ＰＭＴ阻害剤を培養へ添加することによって、図２０に示すように全ての生産株で抗体分泌生産量が向上した。特に、合成ｈＰＤＩ／合成ｈＥＲＯ１−Ｌβ／合成ｈＧＲＰ７８恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ７９６０８株）で９．７ｍｇ／Ｌ、合成ｈＰＤＩ／ＯｍＥＲＯ１／合成ｈＧＲＰ７８恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ８０３０８株）で約１２．５ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産量を示し、それぞれのコントロール培養と比較して約２３倍、約３０倍に抗体分泌生産量が向上することを見出した。また、図２１に示すように非還元電気泳動後のウェスタンブロット解析によって完全長抗体（Ｈ２Ｌ２）が明らかに分泌生産されることが確認された。Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来のシャペロンの単独および組合せで発現を強化した場合同様、ヒト由来シャペロンを単独および組合せで発現を強化した場合に抗体分泌生産能が向上し、さらに、ＰＭＴ阻害剤を培養へ添加することによって、約２３〜３０倍に抗体分泌生産能が向上した。
ヒトリゾチームの発現に及ぼすシャペロンの効果
（１）ヒトリゾチーム発現ベクターの構築
ヒトリゾチーム（ｈＬｙｚ，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＭ＿０００２３９）は、４４７ｂｐからなる遺伝子でコードされ、１４８アミノ酸残基からなる。Ｏ．ｍｉｎｕｔａで効率よく発現させるため、また、効率よく分泌させるために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＭＦ ａｌｐｈａ１（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号；Ｐ０１１４９）の分泌シグナル（以下ａＭＦ分泌シグナル）との融合蛋白質として発現させるように、Ｏ．ｍｉｎｕｔａのＣｏｄｏｎ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅを考慮してａＭＦ分泌シグナル融合ｈＬｙｚ遺伝子を合成した。発現ベクターは、ＷＯ２００３／０９１４３１記載のｐＯＭｅｘＧＰ１Ｕを制限酵素ＫｐｎＩとＡｐａＩで消化して得られるＧＡＰプロモーターとＧＡＰターミネーターを含む断片に、ＷＯ２００３／０９１４３１に記載のｐＯＭｅｘ４Ａを制限酵素ＫｐｎＩとＡｐａＩで消化して得られるＡＤＥ１マーカーを含む断片をライゲーションして構築し、ベクターｐＯＭＥＧＰＡ−１（ＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ）と命名した。制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＴ２２Ｉによって回収したａＭＦ分泌シグナル融合ｈＬｙｚ遺伝子を制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＴ２２Ｉによって調製したｐＯＭＥＧＰＡ−１（ＳａｌＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉ）へ導入し、ａＭＦ分泌シグナル融合ｈＬｙｚ遺伝子発現ベクターを構築した（ｏｎａＰ２１８０８）。
（２）ａＭＦ分泌シグナル融合ｈＬｙｚ生産酵母株（Ｏ．ｍｉｎｕｔａ）の構築
実施例６で構築したＯ．ｍｉｎｕｔａ ＹＫ５株のｕｒａ３欠失変異を相補したｏｎａ０１２０６株、実施例５にて育種したＯ．ｍｉｎｕｔａ ＹＫ５株のシャペロン組合せＯｍＰＤＩ１＋ＯｍＥＲＯ１＋ＯｍＫａｒ２恒常発現株（ｏｎａ４４６０７株）、実施例２３にて育種したヒト由来シャペロン組合せ合成ｈＰＤＩ＋合成ｈＥＲＯ１−Ｌβ＋合成ｈＧＲＰ７８恒常発現株（ｏｎａ６８９０８株）に、（１）で構築したａＭＦ分泌シグナル融合ｈＬｙｚ遺伝子発現ベクターｏｎａＰ２１８０８を上記のエレクトロポレーション法にて導入した。制限酵素ＮｏｔＩで消化した１μｇのｏｎａＰ２１８０８を使用し、エレクトロポレーション後、カザミノ−Ｕ−Ａ寒天培地（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ Ｗ／Ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ６．７ｇ／Ｌ，Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ０．５ｇ／Ｌ，Ｇｌｕｃｏｓｅ ２０ｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン ２０ｍｇ／Ｌ，Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ ２０ｇ／Ｌ）上に塗沫し、３０℃で約２−３日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度、カザミノ−Ｕ−Ａ寒天培地上にて増殖させた後、培養した。
（３）ヒトリゾチームの分泌生産に及ぼすシャペロンの効果
シャペロン組合せ未導入株ｏｎａ０１２０６株、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来シャペロン組合せＯｍＰＤＩ１＋ＯｍＥＲＯ１＋ＯｍＫａｒ２恒常発現株（ｏｎａ４４６０７株）、ヒト由来シャペロン組合せ合成ｈＰＤＩ＋合成ｈＥＲＯ１−Ｌβ＋合成ｈＧＲＰ７８恒常発現株（ｏｎａ６８９０８株）に、ａＭＦ分泌シグナル融合ｈＬｙｚ遺伝子発現ベクターｏｎａＰ２１８０８を導入して得られたコロニーより、任意に３クローンずつ培養した。２ｘＹＰ−Ｐ６−ＧＧ培地［２０ｇのＤｉｆｃｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔと４０ｇのＢａｃｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅを９００ｍＬの純水に溶解し、高圧蒸気滅菌した後、別滅菌した１０ｘリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）（１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４，０．１５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，０．３７５Ｎ ＫＯＨ）を１００ｍＬ、別滅菌した５０％グルコース溶液を１０ｍＬ、別滅菌した８０％グリセリンを２５ｍＬ添加して調製した。］を使用し、９６−ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（グライナー社，７８０２７１）に、８００μＬの２ｘＹＰ−Ｐ６−ＧＧ培地を仕込み、爪楊枝で接種した後、ＣＯ２透過性プレートシール（グライナー社，６７６０５１）でプレート上部をシールした。攪拌速度３１０ｒｐｍ、振幅５０ｍｍ、培養温度３０℃で２日間培養後、２０μＭのロダニン−３−酢酸誘導体１ｃ含む２ｘＹＰ−Ｐ６−ＧＧ培地を１００μＬ添加し、さらに、３日目に２０μＭの１ｃ含む２ｘＹＰ−Ｐ６−ＧＧ培地を１００μＬ添加した。培養終了液から遠心分離（２，７００ｘｇ，４℃，５分間）によって菌体を除去して培養上清を調製し分泌ヒトリゾチーム試料とした。
分泌生産されたヒトリゾチームは、ウェスタンブロットおよびに溶菌活性によって評価した。ウェスタンブロットは、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜にブロッティングし、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＩｇＧ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｌｙｓｏｚｙｍｅ（ＮＯＲＤＩＣ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社，ＲＡＨｕ／Ｌｙｓ／ＰＯ）を使用してＥＣＬ Ａｄｖａｎｃｅウェスタンブロッティング検出キット（ＧＥ社，ＲＰＮ２１３５）によって検出した。
また、溶菌活性は次のようにして測定した。基質に細菌Ｍ．Ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓを使用し、これを５０ｍＭＭリン酸バッファーで懸濁し、０．１６ｍｇ／ｍｌ濃度の基質溶液を調製した。この基質溶液２４０μｌに、１０μｌの培養上清（分泌ヒトリゾチーム）を加え、室温で１０分間インキュベートした。その後、波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。ヒトリゾチームは細菌の細胞壁を分解するので、活性が高いほど吸光度は減少するため、リゾチーム活性１ｕｎｉｔは１分間当たりに４５０ｎｍの吸光度が０．００１減少する酵素量と定義した。また、培養上清の総蛋白量は、ウシ血清アルブミンをスタンダードとしてＤＣプロテインアッセイキットＩＩ（バイオラッド社，５００−０１１２ＪＡ）によって測定した。
ウェスタンブロットの結果より、試験した全ての株でヒトリゾチームが発現していることが確認された（図２２）。また、溶菌活性より、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来のシャペロンＯｍＰＤＩ１＋ＯｍＥＲＯ１＋ＯｍＫａｒ２導入株またはヒト由来のシャペロン合成ｈＰＤＩ＋合成ｈＥＲＯ１−Ｌβ＋合成ｈＧＲＰ７８導入株では、シャペロン非導入株の約１．５倍以上にヒトリゾチームの分泌生産能が向上することが確認された（表３）。
Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＰＭＴ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｎｎｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）破壊株におけるシャペロンの組合せ恒常発現株の構築
（１）Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来シャペロンタンパク質（ＰＤＩ１／ＥＰＯ１／Ｋａｒ２）遺伝子を導入したＰＭＴ４遺伝子破壊株の作製
（１−１）ＰＭＴ４遺伝子破壊ベクターの作製
Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＩＦＯ１０７４６株の染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマーＰＭＴ４ｉｎｆ５’ａｒｍＦ（５’−ＣＧＧＧＣＣＣＣＣＣＣＴＣＧＡＧＴＣＴＡＴＧＣＴＣＣＡＡＧＡＣＣＴ−３’：配列番号１５７）とプライマーＰＭＴ４ ｉｎｆ５’ａｒｍＲ（５’−ＴＡＣＣＧＴＣＧＡＣＣＴＣＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＡＣＴＧＡＴＴＣＣ−３’：配列番号１５８）を用いて、ＰＣＲ［（９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で２分）×２５サイクル］を行った。増幅された約２．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、制限酵素ＸｈｏＩで調製したｒＵＲＡｐＢＫＳへＩｎ−ｆｕｓｉｏｎキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社，６３１７７４）を用いて導入し、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を確認した。得られたプラスミドをＰＭＴ４Ｋ／０５ａｒｍｒＵＲＡ３と命名した。さらに、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＩＦＯ１０７４６株の染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマーＰＭＴ４ ｉｎｆ３’ａｒｍＦ（５’−ＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＡＴＣＣＴＡＴＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＴ−３’：配列番号１５９）とプライマーＰＭＴ４ ｉｎｆ３’ａｒｍＲ（５’−ＡＣＣＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧＴＧＴＴＧＴＴＣＣＡＧＧＴＡＡＴＣＣ−３’：配列番号１６０）を用いて、ＰＣＲ［（９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で２分）×２５サイクル］を行い、増幅された約２．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、制限酵素ＮｏｔＩで調製したＰＭＴ４Ｋ／０５ａｒｍｒＵＲＡ３へＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社，６３１７７４）を用いて導入し、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を確認した。得られたベクターをＰＭＴ４Ｋ／Ｏ／ｒＵＲＡ３と命名した。
（１−２）Ｏ．ｍｉｎｕｔａＰＭＴ４破壊株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｐｍｔ４）の作製
上記（１−１）で構築したＰＭＴ４遺伝子破壊ベクターＰＭＴ４Ｋ／Ｏ／ｒＵＲＡ３を制限酵素ＸｈｏＩとＮｏｔＩで消化後、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＹＫ５（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１）へエレクトロポレーション法にて導入した。この株のＰＭＴ４遺伝子が破壊されたことを確認するために、以下のプライマーを合成した。
カザミノ−Ｕ寒天培地上で増殖した形質転換酵母の一部を１０μＬの０．２５％ＳＤＳ溶液に懸濁し、９０μＬの滅菌水を加えた後、遠心分離（２，７００ｘｇ，４℃，５分間）によって菌体を除去した。得られた上清をＤＮＡ溶液とした。プライマーＰＭＴ４ＰＣＲ５’ａｒｍＦ（配列番号１６１）とＰＭＴ４ＰＣＲ５’ａｒｍＲ（配列番号１６２）を用いて、ＰＣＲ［（９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で２分）×２５サイクル］を行った。導入断片がＰＭＴ４座に組み込まれた株からは、５．８ｋｂの予想増幅断片が検出された。同様に、プライマーＰＭＴ４ＰＣＲ３’ａｒｍＦ（配列番号１６３）とＰＭＴ４ＰＣＲ３’ａｒｍＲ（配列番号１６４）を用いて、ＰＣＲ［（９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で３分）×２５サイクル］を行った。導入断片がＰＭＴ４座に組み込まれた株からは、７．４ｋｂの予想増幅断片が検出された。選抜した株をＯ．ｍｉｎｕｔａ ＹＫ４１株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｐｍｔ４：：ｒＵＲＡ３）と命名した。
（１−３）Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＰＭＴ４破壊株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｐｍｔ４）のシャペロン導入株の作製
上記（１−２）で作製したＯ．ｍｉｎｕｔａ ＹＫ４１株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｐｍｔ４：：ｒＵＲＡ３）をＹＰＤＡ培地で培養した後、５−Ｆｌｕｏｒｏｏｒｏｔｉｃ Ａｃｉｄ（５−ＦＯＡ）培地（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ社，Ｆ９００２）に塗沫し、増殖したウラシル要求株を取得した。取得した株をｏｎａ９３６０８株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｐｍｔ４）とした。次に、実施例４で構築したＯｍＰＤＩ１、ＯｍＥＲＯ１、およびＯｍＫａｒ２の恒常発現ベクターｏｎａＰ１１００７を制限酵素ＮｏｔＩで消化した後、エレクトロポレーション法によってｏｎａ９３６０８株に導入した。カザミノ−Ｕ寒天培地上に塗沫し、３０℃で約２−３日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度カザミノ−Ｕ寒天培地上にて増殖させた後、シャペロンが導入されている形質転換体をコロニーＰＣＲ法によって選抜した。ＯｍＰＤＩ１は、ＧＡＰプロモーター配列内に設計したプライマーＧＡＰｐｆｏｒＳ−Ｆ（５’−ＧＡＴＣＴＣＡＧＧＣＣＧＡＧＴＣＡＡＧＡＣ−３’：配列番号７６）とＯＭＰＤＩ１Ｔ２２Ｉ：５’−ＧＡＴＧＣＡＴＴＴＡＣＡＡＣＴＣＧＴＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣ−３’（配列番号２９）で、ＯｍＥＲＯ１は、ＧＡＰｐｆｏｒＳ−Ｆ（５’−ＧＡＴＣＴＣＡＧＧＣＣＧＡＧＴＣＡＡＧＡＣ−３’：配列番号７６）とＯＭＥＲＯＴ２２Ｉ：５’−ＧＡＴＧＣＡＴＴＴＡＴＡＧＣＴＣＣＡＡＡＣＧＡＴＡＣＡＧ−３’（配列番号４５）で、ＯｍＫａｒ２は、ＰＧＫプロモーター配列内に設計したプライマーＰＧＫｐｆｏｒＳ−Ｆ（５’−ＴＡＡＣＧＣＣＧＣＡＴＡＧＡＡＣＴＡＧＣ−３’：配列番号７７）とプライマーＯＭＫＡＲ−Ｒ：５’−ＧＡＴＧＣＡＴＴＣＡＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＧＡＴＣＣＣＡＧ−３’（配列番号５１）を使用して導入を確認した。得られたＯ．ｍｉｎｕｔａ ＰＭＴ４破壊株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｐｍｔ４）のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）導入株をｏｎａ９６７０８株とした。
（２）Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来シャペロンタンパク質（ＰＤＩ１／ＥＰＯ１／Ｋａｒ２）遺伝子を導入したＰＭＴ５遺伝子破壊株の作製
ＷＯ２００７／１３２９４９に記載のＯ．ｍｉｎｕｔａ ＹＫ６株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｐｍｔ５：：ｒＵＲＡ３）をＹＰＤＡ培地で培養した後、５−Ｆｌｕｏｒｏｏｒｏｔｉｃ Ａｃｉｄ（５−ＦＯＡ）培地（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ社，Ｆ９００２）に塗沫し、増殖したウラシル要求株を取得した。取得した株をｏｎａ６４９０８株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｐｍｔ５）とした。次に、実施例４で構築したＯｍＰＤＩ１、ＯｍＥＲＯ１、およびＯｍＫａｒ２の恒常発現ベクターｏｎａＰ１１００７を制限酵素ＮｏｔＩで消化した後、エレクトロポレーション法によってｏｎａ６４９０８株に導入した。カザミノ−Ｕ寒天培地上に塗沫し、３０℃で約２−３日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度カザミノ−Ｕ寒天培地上にて増殖させた後、シャペロンが導入されている形質転換体をコロニーＰＣＲ法によって選抜した。ＯｍＰＤＩ１は、ＧＡＰプロモーター配列内に設計したプライマーＧＡＰｐｆｏｒＳ−Ｆ（５’−ＧＡＴＣＴＣＡＧＧＣＣＧＡＧＴＣＡＡＧＡＣ−３’：配列番号７６）とＯＭＰＤＩ１Ｔ２２Ｉ：５’−ＧＡＴＧＣＡＴＴＴＡＣＡＡＣＴＣＧＴＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣ−３’（配列番号２９）で、ＯｍＥＲＯ１は、ＧＡＰｐｆｏｒＳ−Ｆ（５’−ＧＡＴＣＴＣＡＧＧＣＣＧＡＧＴＣＡＡＧＡＣ−３’：配列番号７６）とＯＭＥＲＯＴ２２Ｉ：５’−ＧＡＴＧＣＡＴＴＴＡＴＡＧＣＴＣＣＡＡＡＣＧＡＴＡＣＡＧ−３’（配列番号４５）で、ＯｍＫａｒ２は、ＰＧＫプロモーター配列内に設計したプライマーＰＧＫｐｆｏｒＳ−Ｆ（５’−ＴＡＡＣＧＣＣＧＣＡＴＡＧＡＡＣＴＡＧＣ−３’：配列番号７７）とプライマーＯＭＫＡＲ−Ｒ：５’−ＧＡＴＧＣＡＴＴＣＡＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＧＡＴＣＣＣＡＧ−３’（配列番号５１）を使用して導入を確認した。得られたＯ．ｍｉｎｕｔａ ＰＭＴ５破壊株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｐｍｔ５）のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）導入株をｏｎａ６９３０８株とした。
（３）Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来シャペロンタンパク質（ＰＤＩ１／ＥＰＯ１／Ｋａｒ２）遺伝子を導入したＰＭＴ６遺伝子破壊株の作製
ＷＯ２００７／１３２９４９に記載のＯ．ｍｉｎｕｔａ ＹＫ７株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｐｍｔ６：：ｒＵＲＡ３）をＹＰＤＡ培地で培養した後、５−Ｆｌｕｏｒｏｏｒｏｔｉｃ Ａｃｉｄ（５−ＦＯＡ）培地（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ社，Ｆ９００２）に塗沫し、増殖したウラシル要求株を取得した。取得した株をｏｎａ６５００８株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｐｍｔ６）とした。次に、実施例４で構築したＯｍＰＤＩ１、ＯｍＥＲＯ１、およびＯｍＫａｒ２の恒常発現ベクターｏｎａＰ１１００７を制限酵素ＮｏｔＩで消化した後、エレクトロポレーション法によってｏｎａ６５００８株に導入した。カザミノ−Ｕ寒天培地上に塗沫し、３０℃で約２−３日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度カザミノ−Ｕ寒天培地上にて増殖させた後、シャペロンが導入されている形質転換体をコロニーＰＣＲ法によって選抜した。ＯｍＰＤＩ１は、ＧＡＰプロモーター配列内に設計したプライマーＧＡＰｐｆｏｒＳ−Ｆ（５’−ＧＡＴＣＴＣＡＧＧＣＣＧＡＧＴＣＡＡＧＡＣ−３’：配列番号７６）とＯＭＰＤＩ１Ｔ２２Ｉ：５’−ＧＡＴＧＣＡＴＴＴＡＣＡＡＣＴＣＧＴＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣ−３’（配列番号２９）で、ＯｍＥＲＯ１は、ＧＡＰｐｆｏｒＳ−Ｆ（５’−ＧＡＴＣＴＣＡＧＧＣＣＧＡＧＴＣＡＡＧＡＣ−３’：配列番号７６）とＯＭＥＲＯＴ２２Ｉ：５’−ＧＡＴＧＣＡＴＴＴＡＴＡＧＣＴＣＣＡＡＡＣＧＡＴＡＣＡＧ−３’（配列番号４５）で、ＯｍＫａｒ２は、ＰＧＫプロモーター配列内に設計したプライマーＰＧＫｐｆｏｒＳ−Ｆ（５’−ＴＡＡＣＧＣＣＧＣＡＴＡＧＡＡＣＴＡＧＣ−３’：配列番号７７）とプライマーＯＭＫＡＲ−Ｒ：５’−ＧＡＴＧＣＡＴＴＣＡＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＧＡＴＣＣＣＡＧ−３’（配列番号５１）を使用して導入を確認した。得られたＯ．ｍｉｎｕｔａ ＰＭＴ６破壊株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｐｍｔ６）のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）導入株をｏｎａ６９５０８株とした。
（４）Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来シャペロンタンパク質（ＰＤＩ１／ＥＰＯ１／Ｋａｒ２）遺伝子を導入したＰＭＴ５／ＰＭＴ６二重遺伝子破壊株の作製
（４−１）ＰＭＴ６遺伝子破壊株のＰＭＴ５遺伝子の破壊
上記（３）で作製したｏｎａ６５００８株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｐｍｔ６）にＷＯ２００７／１３２９４９に記載のＰＭＴ５遺伝子破壊ベクターＰＭＴ５Ｋ／Ｏ／ｒＵＲＡ３を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化後、エレクトロポレーション法にて導入した。この株のＰＭＴ５遺伝子が破壊されたことを確認するために、ＷＯ２００７／１３２９４９に記載のプライマーで確認した。カザミノ−Ｕ寒天培地上で増殖した形質転換酵母の一部を１０μＬの０．２５％ＳＤＳ溶液に懸濁し、９０μＬの滅菌水を加えた後、遠心分離（２，７００ｘｇ，４℃，５分間）によって菌体を除去した。得られた上清をＤＮＡ溶液とした。プライマーｇＰＭＴ５−５（５’−ＣＧＧＴＧＡＣＧＡＣＴＴＣＧＡＣＴＡＧＴＣＧＡＧ−３’：配列番号１６５）とｇＰＭＴ５−２（５’−ＣＧＧＴＧＣＴＧＴＴＧＧＣＧＴＣＧＴＣＡＴＧＧＧＴＧ−３’：配列番号１６６）を用いて、ＰＣＲ［（９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で２分）×２５サイクル］を行った。導入断片がＰＭＴ５座に組み込まれた株からは、４．９ｋｂの予想増幅断片が検出された。同様に、プライマーｇＰＭＴ５−３（５’−ＧＧＣＧＣＧＴＴＣＣＡＡＴＴＣＣＡＣＴＣＴＧＣＴＧ−３’：配列番号１６７）とｇＰＭＴ５−４（５’−ＣＧＡＣＧＡＧＴＣＣＴＣＴＣＡＣＣＡＧＧＡＧＧＴＴＧ−３’：配列番号１６８）を用いて、ＰＣＲ［（９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で２分）×２５サイクル］を行った。導入断片がＰＭＴ５座に組み込まれた株からは、４．９ｋｂの予想増幅断片が検出された。選抜した株をＯ．ｍｉｎｕｔａ ＹＫ５１株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｐｍｔ６Δｐｍｔ５：：ｒＵＲＡ３）と命名した。
（４−２）Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＰＭＴ５とＰＭＴ６二重破壊株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｐｍｔ５Δｐｍｔ６）のシャペロン導入株の作製
上記（４−１）で作製したＯ．ｍｉｎｕｔａ ＹＫ５１株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｐｍｔ６Δｐｍｔ５：：ｒＵＲＡ３）をＹＰＤＡ培地で培養した後、５−Ｆｌｕｏｒｏｏｒｏｔｉｃ Ａｃｉｄ（５−ＦＯＡ）培地（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ社，Ｆ９００２）に塗沫し、増殖したウラシル要求株を取得した。取得した株をｏｎａ１５７０７株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｐｍｔ５Δｐｍｔ６）とした。次に、実施例４で構築したＯｍＰＤＩ１、ＯｍＥＲＯ１、およびＯｍＫａｒ２の恒常発現ベクターｏｎａＰ１１００７を制限酵素ＮｏｔＩで消化した後、エレクトロポレーション法によってｏｎａ１５７０７株に導入した。カザミノ−Ｕ寒天培地上に塗沫し、３０℃で約２−３日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度カザミノ−Ｕ寒天培地上にて増殖させた後、シャペロンが導入されている形質転換体をコロニーＰＣＲ法によって選抜した。ＯｍＰＤＩ１は、ＧＡＰプロモーター配列内に設計したプライマーＧＡＰｐｆｏｒＳ−Ｆ（５’−ＧＡＴＣＴＣＡＧＧＣＣＧＡＧＴＣＡＡＧＡＣ−３’：配列番号７６）とＯＭＰＤＩ１Ｔ２２Ｉ：５’−ＧＡＴＧＣＡＴＴＴＡＣＡＡＣＴＣＧＴＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣ−３’（配列番号２９）で、ＯｍＥＲＯ１は、ＧＡＰｐｆｏｒＳ−Ｆ（５’−ＧＡＴＣＴＣＡＧＧＣＣＧＡＧＴＣＡＡＧＡＣ−３’：配列番号７６）とＯＭＥＲＯＴ２２Ｉ：５’−ＧＡＴＧＣＡＴＴＴＡＴＡＧＣＴＣＣＡＡＡＣＧＡＴＡＣＡＧ−３’（配列番号４５）で、ＯｍＫａｒ２は、ＰＧＫプロモーター配列内に設計したプライマーＰＧＫｐｆｏｒＳ−Ｆ（５’−ＴＡＡＣＧＣＣＧＣＡＴＡＧＡＡＣＴＡＧＣ−３’：配列番号７７）とプライマーＯＭＫＡＲ−Ｒ：５’−ＧＡＴＧＣＡＴＴＣＡＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＧＡＴＣＣＣＡＧ−３’（配列番号５１）を使用して導入を確認した。得られたＯ．ｍｉｎｕｔａ ＰＭＴ５／ＰＭＴ６二重破壊株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｐｍｔ５Δｐｍｔ６）のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）導入株をｏｎａ５６２０７株とした。
（５）Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来シャペロンタンパク質（ＰＤＩ１／ＥＰＯ１／Ｋａｒ２）遺伝子を導入したＰＭＴ遺伝子破壊株を利用した抗体生産酵母株（Ｏ．ｍｉｎｕｔａ）の構築
上記（１）から（４）で構築したＰＭＴ破壊株にシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）を導入した以下の株に、実施例２で構築した抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体遺伝子（ＷＯ２００１／０８３５６０）発現ベクターを上記のエレクトロポレーション法にて導入した。
Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＰＭＴ４破壊株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｐｍｔ４）のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）導入株（ｏｎａ９６７０８株）
Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＰＭＴ５破壊株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｐｍｔ５）のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）導入株（ｏｎａ６９３０８株）
Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＰＭＴ６破壊株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｐｍｔ６）のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）導入株（ｏｎａ６９５０８株）
Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＰＭＴ５／ＰＭＴ６二重破壊株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｐｍｔ５Δｐｍｔ６）のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）導入株（ｏｎａ５６２０７株）
抗体重鎖としては、制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉで消化した１μｇのｏｎａＰ０２７０６を、抗体軽鎖としては、制限酵素ＮｏｔＩで消化した１μｇのｏｎａＰ０３１０６を使用した。エレクトロポレーション後、１００μｇ／ｍＬの濃度でＺｅｏｃｉｎＴＭ（インビトロジェン社，Ｒ２５０−０１）を添加したカザミノ−Ｕ−Ａ寒天培地（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ Ｗ／Ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ６．７ｇ／Ｌ，Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ０．５ｇ／Ｌ，Ｇｌｕｃｏｓｅ ２０ｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン ２０ｍｇ／Ｌ，Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ ２０ｇ／Ｌ）上に塗沫し、３０℃で約２−３日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度、１００μｇ／ｍＬの濃度でＺｅｏｃｉｎＴＭ（インビトロジェン社，Ｒ２５０−０１）を添加したカザミノ−Ｕ−Ａ寒天培地寒天培地上にて増殖させた後、抗体分泌生産株をスクリーニングした。Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＰＭＴ４破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ９８８０８株を、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＰＭＴ５破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ７４１０８株を、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＰＭＴ６破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ７４６０８株を、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＰＭＴ５／ＰＭＴ６二重破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ６７４０８株を選抜した。
Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＰＭＴ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｎｎｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子破壊株にＯ．ｍｉｎｕｔａ由来シャペロンタンパク質（ＰＤＩ１／ＥＰＯ１／Ｋａｒ２）遺伝子を導入した抗体生産酵母株（Ｏ．ｍｉｎｕｔａ）の抗体生産能の確認
実施例２７の（５）で構築したＰＭＴ破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株の抗体分泌生産能を確認した。また、実施例７で明らかとなったＰＭＴ阻害剤の添加による抗体の分泌生産増強効果もあわせて検証した。
抗体生産株は、以下のように培養した。２ｘＹＰ−Ｐ６−ＧＧ培地［２０ｇのＤｉｆｃｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔと４０ｇのＢａｃｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅを９００ｍＬの純水に溶解し、高圧蒸気滅菌した後、別滅菌した１０ｘリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）（１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４，０．１５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，０．３７５Ｎ ＫＯＨ）を１００ｍＬ、別滅菌した５０％グルコース溶液を１０ｍＬ、別滅菌した８０％グリセリンを２５ｍＬ添加して調製した。］を使用し、９６−ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（グライナー社，７８０２７１）に、８００μＬの２ｘＹＰ−Ｐ６−ＧＧ培地を仕込み、爪楊枝で接種した後、ＣＯ２透過性プレートシール（グライナー社，６７６０５１）でプレート上部をシールした。攪拌速度３１０ｒｐｍ、振幅５０ｍｍ、培養温度３０℃で培養し、培養２日目と３日目に、２ｘＹＰ−Ｐ６−ＧＧ培地を１００μＬずつ添加した。ＰＭＴ阻害剤の添加培養は、２ｘＹＰ−Ｐ６−ＧＧ培地［２０ｇのＤｉｆｃｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔと４０ｇのＢａｃｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅを９００ｍＬの純水に溶解し、高圧蒸気滅菌した後、別滅菌した１０ｘリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）（１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４，０．１５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，０．３７５Ｎ ＫＯＨ）を１００ｍＬ、別滅菌した５０％グルコース溶液を１０ｍＬ、別滅菌した８０％グリセリンを２５ｍＬ添加して調製］を使用し、９６−ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（グライナー社，７８０２７１）に、８００μＬの２ｘＹＰ−Ｐ６−ＧＧ培地を仕込み、爪楊枝で接種した後、ＣＯ２透過性プレートシール（グライナー社，６７６０５１）でプレート上部をシールした。ロダニン−３−酢酸誘導体１ｃの添加培養では、攪拌速度３１０ｒｐｍ、振幅５０ｍｍ、培養温度３０℃で２日間培養後、２０μＭの１ｃ含む２ｘＹＰ−Ｐ６−ＧＧ培地を１００μＬ添加し、さらに、３日目に２０μＭの１ｃ含む２ｘＹＰ−Ｐ６−ＧＧ培地を１００μＬ添加した。
抗体の分泌生産は、サンドイッチＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットによって確認した。培養終了液から遠心分離（２，７００ｘｇ，４℃，５分間）によって菌体を除去して培養上清を調製し分泌抗体試料とした。分泌生産された抗体の定量的アッセイは、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によって行った。９６ｗｅｌｌプレートに抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体の抗原であるＴＲＡＩＬレセプタータンパク質を吸着させ、分泌抗体試料を添加し、ペルオキシダーゼ標識ヒトＩｇＧ特異的Ｆｃ抗体（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−Ｌａｂｅｌｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｏ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆｃ）（ＫＰＬ社，０４−１０−２０））とＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ社，５０−６６−０１）を使用して検出した。ウェスタンブロットは、還元条件下、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜にブロッティングし、抗体重鎖と軽鎖の検出は、一次抗体として、それぞれ、Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（γ−ｃｈａｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）（Ｓｉｇｍａ社，Ｉ−３３８２）とＧｏａｔ ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ｋａｐｐａ ｂ＆ｆ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ（Ｂｅｔｈｙｌ社，Ａ−８０−１１５Ａ）を使用した。また、二次抗体としては、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ−ｇｏａｔ ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）（Ｒａｂｂｉｔ）（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，＃６０５−４３１３）を使用した。検出は、ＥＣＬ Ａｄｖａｎｃｅ ウェスタンブロッティング検出キット（ＧＥ社，ＲＰＮ２１３５）を使用した。
図２３に示すように、コントロール（ｏｎａ０２３０６株）が約０．６ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産量を示すのに対して、シャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ４８７０７株）が約８．２ｍｇ／Ｌ、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＰＭＴ４破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ９８８０８株）が約０．４ｍｇ／Ｌ、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＰＭＴ５破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ７４１０８株）が約３．８ｍｇ／Ｌ、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＰＭＴ６破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ７４６０８株）が約８ｍｇ／Ｌ、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＰＭＴ５／ＰＭＴ６二重破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ６７４０８株）が約８．３ｍｇ／Ｌの抗体分泌生産量を示した。ＰＭＴ４遺伝子破壊株を除き、ＰＭＴ遺伝子の単独または二重破壊株でもシャペロンの発現を強化した効果があり、コントロールと比較して、約５から１４倍に抗体分泌生産能が向上した。
さらに、ＰＭＴ阻害剤ロダニンを培養へ添加することによって、図２３に示すように全ての生産株で約２０倍から約３３倍に抗体分泌生産量が向上した。しかしながら、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＰＭＴ５破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ７４１０８株）とＯ．ｍｉｎｕｔａ ＰＭＴ６破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ７４６０８株）では、シャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ４８７０７株）の抗体分泌生産量の約７５％に抗体分泌生産量が減少した。また、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＰＭＴ５／ＰＭＴ６二重破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ６７４０８株）では、シャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ４８７０７株）の抗体分泌生産量約６０％に抗体分泌生産量が減少した。
前述のように約０．４ｍｇ／Ｌと低い生産量を示したＯ．ｍｉｎｕｔａ ＰＭＴ４破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ９８８０８株）は、図２４と図２５に示すように、ＰＭＴ４遺伝子の破壊によって、増殖、分裂に異常が生じていた。Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＰＭＴ４破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ９８８０８株）に関しては、ＰＭＴ活性阻害剤ロダニン−３−酢酸誘導体１ｃの添加濃度を検討した。９６−ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（グライナー社，７８０２７１）に８００μＬの２ｘＹＰ−Ｐ６−ＧＧ培地を仕込んで培養を行い、培養２日目と３日目に、ロダニン−３−酢酸誘導体１ｃを１．２５、２．５、５、１０、２０、４０μＭになるように２ｘＹＰ−Ｐ６−ＧＧ培地で調製した培地を、それぞれ１００μＬずつ添加した（終濃度０．２５、０．５、１、２、４、８μＭ）。その結果、図２６に示すように、終濃度０．２５μＭの１ｃ含む２ｘＹＰ−Ｐ６−ＧＧ培地を添加した場合に、生産量が約１３％向上した。Ｏ．ｍｉｎｕｔａ ＰＭＴ４破壊株の（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ９８８０８株）のＰＭＴ活性阻害剤ロダニン−３−酢酸誘導体１ｃの添加濃度は、他の１６分の１の濃度と決定した。
ＰＭＴ遺伝子破壊株にＯ．ｍｉｎｕｔａ由来シャペロンタンパク質（ＰＤＩ１／ＥＰＯ１／Ｋａｒ２）遺伝子を導入した抗体生産酵母株（Ｏ．ｍｉｎｕｔａ）が産生した抗体の精製
実施例２８のように、Ｏ．ｍｉｎｕｔａのＰＭＴ遺伝子を破壊することは、抗体の分泌生産能をやや低下させ、また、Ｏ．ｍｉｎｕｔａの形態に大きな影響を与えることが見出された。これは、Ｏ．ｍｉｎｕｔａのＰＭＴ活性の抑制によるＯ型糖鎖の付加抑制が、Ｏ．ｍｉｎｕｔａの生理機能に大きな影響を与えていることを強く示唆する。そこで、これらの生産株によって産生した抗体の生物活性（細胞障害活性）を評価することによって、ＰＭＴ変異とシャペロンタンパク質（ＰＤＩ１／ＥＰＯ１／Ｋａｒ２）の恒常発現、さらにＰＭＴ活性阻害剤ロダニン−３−酢酸誘導体１ｃを添加する組合せの最適条件を見出すことが可能になると考えられる。
（１）ＰＭＴ遺伝子破壊株にＯ．ｍｉｎｕｔａ由来シャペロンタンパク質（ＰＤＩ１／ＥＰＯ１／Ｋａｒ２）遺伝子を導入した抗体生産酵母株（Ｏ．ｍｉｎｕｔａ）の培養
コントロール株（シャペロン非導入抗体遺伝子導入株）として、ｏｎａ０２３０６株を、シャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株として、ｏｎａ４８７０７株を、ＰＭＴ４破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ９８８０８株を、ＰＭＴ５破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ７４１０８株を、ＰＭＴ６破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ７４６０８株を、ＰＭＴ５／ＰＭＴ６二重破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株としてｏｎａ６７４０８株を選抜し培養した。
種培養として、カザミノ−Ｕ−Ａ培地（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ Ｗ／Ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ６．７ｇ／Ｌ，Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ０．５ｇ／Ｌ，Ｇｌｕｃｏｓｅ ２０ｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン ２０ｍｇ／Ｌ）に５０μｇ／ｍＬの濃度でＺｅｏｃｉｎＴＭ（インビトロジェン社，Ｒ２５０−０１）を添加したカザミノ−Ｕ−Ａ培地を２０ｍＬ仕込んだ１００ｍＬ容三角フラスコを、攪拌速度２１０ｒｐｍ、振幅７５ｍｍ、培養温度３０℃で２日間培養した。次に、４００ｍＬの２ｘＹＰ−Ｐ６−ＧＧ培地［２０ｇのＤｉｆｃｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔと４０ｇのＢａｃｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅを９００ｍＬの純水に溶解し、高圧蒸気滅菌した後、別滅菌した１０ｘリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）（１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４，０．１５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，０．３７５Ｎ ＫＯＨ）を１００ｍＬ、別滅菌した５０％グルコース溶液を１０ｍＬ、別滅菌した８０％グリセリンを２５ｍＬ添加して調製］を仕込んだ２Ｌ容三角フラスコに、種培養液を２０−３０ｍＬ接種し、攪拌速度２１０ｒｐｍ、振幅７５ｍｍ、培養温度３０℃で培養した。ＯＤ６００が１０を超えてから、ＰＭＴ活性阻害剤ロダニン−３−酢酸誘導体１ｃ（原液濃度４０ｍＭ）をＯＤ６００＝１につき０．２μＭになるように添加した。ただし、ＰＭＴ４破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ９８８０８株）のみ、０．０１２５μＭになるように添加した。
（２）Ｏ．ｍｉｎｕｔａ産生抗体の精製
培養終了液から遠心分離（１３，０００ｘｇ，４℃，３０分間）によって菌体を除去して培養上清を分泌抗体試料とした。ＰＡＬＬ ＦＩＬＴＲＯＮ ＣＥＮＴＲＩＭＡＴＥＴＭ（１０Ｋ ＯＭＥＧＡ ＣＥＮＴＲＩＭＡＴＥ ＭＥＤＩＵＭ ＳＣＲＥＥＮ）（ＰＡＬＬ社）を用いて濃縮した後、ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥ社）を用いて精製した。始めに、リン酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｏｈａｔｅ，３００ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｒｏｌｉｄｅ，ｐＨ７．２）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ社，１１−００３４−９４）に、濃縮した抗体試料を吸着させた後、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ ＩｇＧ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ社，２１００９）を用いて溶出した。溶出画分に、直ちに１／１０量の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９）を加えて中和した後、等量のリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｏｈａｔｅ，１５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｒｏｌｉｄｅ，ｐＨ７．２）を加えた。次に、リン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｏｈａｔｅ，１５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｒｏｌｉｄｅ，ｐＨ７．２）で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎＬ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｐｉｅｒｃｅ社，＃８９９２９）に、ＨｉＴｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ溶出画分を吸着させ、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ ＩｇＧ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ社，２１００９）を用いて溶出した。溶出したＰｒｏｔｅｉｎＬ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ精製画分は、リン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｏｈａｔｅ，１５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｒｏｌｉｄｅ，ｐＨ７．２）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３０ ＧＬ（ＧＥ社，１７−５１７５−０１）を用いてゲルろ過することによって、各種Ｏ．ｍｉｎｕｔａ産生抗体を精製した。精製抗体は、ＰＲＯＴＥＩＮ ＫＷ４０３−４Ｆ（４．６ｉ．ｄ．ｘ３００ｍｍ）（昭和電工社，Ｆ６９８９２０２）によって、ＳＥＣ（Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）−ＨＰＬＣによって分析した。移動相として、リン酸ナトリウム緩衝液（３０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｏｈａｔｅ，３００ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｒｏｌｉｄｅ，ｐＨ６．７）を使用した。精製抗体のＳＥＣ−ＨＰＬＣ溶出パターンを図２７に示した。コントロール株（シャペロン非導入抗体遺伝子導入株）であるｏｎａ０２３０６株とＰＭＴ４破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ９８８０８株）では、クロマトグラムがブロードになっているのに対して、シャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ４８７０７株）、ＰＭＴ５破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ７４１０８株）、ＰＭＴ６破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ７４６０８株）、ＰＭＴ５／ＰＭＴ６二重破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ６７４０８株）では、クロマトグラムがシャープになっているのが確認された。
また、還元／非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ウェスタンブロット解析を行った結果、図２８に示すように、非還元条件下では、コントロール株（シャペロン非導入抗体遺伝子導入株）であるｏｎａ０２３０６株とＰＭＴ４破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ９８８０８株）では、抗体重鎖と軽鎖のヘテロ４量体の検出が不鮮明であるのに対し、シャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ４８７０７株）、ＰＭＴ５破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ７４１０８株）、ＰＭＴ６破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ７４６０８株）、ＰＭＴ５／ＰＭＴ６二重破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ６７４０８株）では、抗体重鎖と軽鎖のヘテロ４量体が鮮明に検出された。シャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）の発現を強化することによって、会合体である抗体重鎖と軽鎖のヘテロ４量体の形成が促進されることが明らかとなった。
（３）Ｏ．ｍｉｎｕｔａ産生抗体の細胞障害活性
（３−１）精製抗体のタンパク量の測定
精製抗体のタンパク量は、ウシ血清アルブミンをスタンダードとしてＤＣプロテインアッセイキットＩＩ（バイオラッド社，５００−０１１２ＪＡ）によって測定した。
（３−２）精製抗体の細胞障害活性の測定
抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体の細胞障害活性は以下のように二次抗体を使用したクロスリンク法によって測定した。対照として動物細胞によって生産した抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体を使用した。二次抗体には、Ｇｏａｔ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社，＃５５０７１）を使用した。二次抗体を細胞培養用培地（１０％血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社，１１８７５））で１ｍｇ／ｍｌの濃度に調製し、この調製した二次抗体を含む細胞培養培地を使用して、２０００ｎｇ／ｍＬの濃度になるように検体を調製した。さらに、調製した検体の希釈系列を作製（２００，２０，２，０．２ｎｇ／ｍｌ；１０倍希釈）し、５０μＬ／ｗｅｌｌでＣｏｒｎｉｎｇ ９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ｃｏｓｔａｒ社，＃３５９８）に分注した。検体を添加したプレートにＪｕｒｋａｔ細胞懸濁液（１ｘ１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで播種した。ＡＴＰ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＴＭ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社，＃Ｇ７５７１））を用いて、培養７２時間後に代謝活性のある細胞に由来するＡＴＰを定量し、未処理群の細胞生存率を１００％として各処理群の生存細胞数を算出した。この結果、図２９に示すように、ＩＣ５０は、動物細胞産生抗ＴＲＡＩＬ抗体で７ｎｇ／ｍＬであるのに対して、コントロール株（シャペロン非導入抗体遺伝子導入株）であるｏｎａ０２３０６株産生抗体で７７．３ｎｇ／ｍＬ、シャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株であるｏｎａ４８７０７株産生抗体で２８．５ｎｇ／ｍＬ、ＰＭＴ５破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株であるｏｎａ７４１０８株産生抗体で２６．６ｎｇ／ｍＬ、ＰＭＴ６破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株であるｏｎａ７４６０８株で１６．８ｎｇ／ｍＬ、ＰＭＴ５／ＰＭＴ６二重破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株であるｏｎａ６７４０８株産生抗体で２１．８ｎｇ／ｍｌであった。また、図３０に示すように、ＩＣ５０は、動物細胞産生抗ＴＲＡＩＬ抗体で６．７ｎｇ／ｍＬであるのに対して、シャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株であるｏｎａ４８７０７株産生抗体で２５．３ｎｇ／ｍＬ、ＰＭＴ６破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株であるｏｎａ７４６０８株で２１．６ｎｇ／ｍＬであるのに対し、ＰＭＴ４破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株であるｏｎａ９８８０８株産生抗体では、２８．２ｎｇ／ｍＬであった。
コントロール株（シャペロン非導入抗体遺伝子導入株）であるｏｎａ０２３０６株の産生抗体は、動物細胞産生抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体の１／１１の細胞障害活性しか有していなかったが、シャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ４８７０７株）産生抗体は、動物細胞産生抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体の１／４．１倍、コントロール株の２．７倍の細胞障害活性を示した。一方、ＰＭＴ破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株では、全てのＰＭＴ破壊株でコントロール以上の細胞障害活性を示したが、ＰＭＴ６破壊株のシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）恒常発現抗体遺伝子導入株（ｏｎａ７４６０８株）産生抗体が、最も高い細胞障害活性を示し、動物細胞産生抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体の１／２．４倍、コントロール株の４．６倍の細胞障害活性を示した。この結果より、Ｏ．ｍｉｎｕｔａのＰＭＴ６遺伝子破壊株にシャペロン（ＯｍＰＤＩ１／ＯｍＥＲＯ１／ＯｍＫａｒ２）を導入し、ＰＭＴ阻害剤であるロダニン−３−酢酸誘導体１ｃを添加した条件下で生産された抗体が、最も抗体の生物活性が高いことが明らかとなった。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。
本発明によれば、宿主細胞へのシャペロン遺伝子の導入によって、通常のタンパク質のみならず、抗体などの構造が複雑なタンパク質をも正しくフォールディングされた形態で宿主細胞内において高分泌生産することが可能となる。また、シャペロン遺伝子の導入と、酵母に特有のＯ型糖鎖付加の抑制を組合せることにより、タンパク質高分泌生産に関して相乗的な効果を得ることができる。
［配列表］

Claims (27)

  1. 下記の(a)または(b)のシャペロン遺伝子を導入した形質転換宿主細胞。
    (a) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNAを含む遺伝子
    (b) 配列番号１に示す塩基配列に対して95％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ外来タンパク質分泌促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
  2. 下記の(d)または(e)のシャペロンタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換宿主細胞。
    (d) 配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
    (e) 配列番号２に示すアミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ外来タンパク質分泌促進活性を有するタンパク質
  3. 下記の(g)または(h)のシャペロン遺伝子の１種または２種以上の組合せをさらに導入した請求項１または２に記載の形質転換宿主細胞。
    (g) S.cerevisiae由来のPDI1, MPD1, SCJ1, ERO1, FKB2, JEM1, LHS1, MPD2, ERJ5, 若しくはEUG1をコードする遺伝子
    (h) ヒト由来のPDI, ERO1-Lα, ERO1-Lβ, 若しくはGRP78をコードする遺伝子
  4. 下記の（i)〜(vi)のシャペロン遺伝子の１種または２種以上の組合せからなる群から選択される遺伝子をさらに導入した請求項１または２に記載の形質転換宿主細胞。
    (i) O.minuta由来のERO1をコードする遺伝子
    (ii) ヒト由来のERO1をコードする遺伝子
    (iii) O.minuta由来のKar2をコードする遺伝子
    (iv) O.minuta由来のERO1をコードする遺伝子とKar2をコードする遺伝子
    (v) ヒト由来のERO1-Lβをコードする遺伝子とGRP78をコードする遺伝子
    (vi) O.minuta由来のERO1をコードする遺伝子とヒト由来のGRP78をコードする遺伝子
  5. 宿主細胞が真核細胞である、請求項１から４のいずれかに記載の形質転換宿主細胞。
  6. 真核細胞が酵母である、請求項５に記載の形質転換宿主細胞。
  7. 酵母がメタノール資化性酵母である、請求項６に記載の形質転換宿主細胞。
  8. メタノール資化性酵母がOgataea minutaである、請求項７に記載の形質転換宿主細胞。
  9. 酵母がSaccharomyces cerevisiaeである、請求項６に記載の形質転換宿主細胞。
  10. 外来タンパク質をコードする遺伝子を導入した、請求項１から９のいずれかに記載の形質転換宿主細胞。
  11. 外来タンパク質が多量体タンパク質である、請求項１０に記載の形質転換宿主細胞。
  12. 多量体タンパク質がヘテロ多量体である、請求項１１に記載の形質転換宿主細胞。
  13. ヘテロ多量体が抗体またはその機能的断片である、請求項１２に記載の形質転換宿主細胞。
  14. 外来タンパク質が糖転移酵素である、請求項１０に記載の形質転換宿主細胞。
  15. 請求項１０から１４のいずれかに記載の形質転換宿主細胞を培地に培養し、培養物から目的タンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
  16. 培養をProtein O-mannosyltransferase (PMT)活性を抑制する条件下で行うことを特徴とする、請求項１５に記載のタンパク質の製造方法。
  17. Protein O-mannosyltransferase (PMT)活性の抑制が、培地にPMT活性阻害剤を添加することにより行われる、請求項１６に記載のタンパク質の製造方法。
  18. PMT活性阻害剤が、5-[[3,4-(1- phenylmethoxy)phenyl]methylene]-4-oxo-2-thioxo-3-thiazolidineacetic acidである、請求項１７に記載のタンパク質の製造方法。
  19. Protein O-mannosyltransferase (PMT)活性の抑制が、PMT遺伝子の破壊により行われる、請求項１６に記載のタンパク質の製造方法。
  20. Protein O-mannosyltransferase (PMT)活性の抑制が、PMT遺伝子を破壊し、かつ、培地にPMT活性阻害剤を添加することにより行われる、請求項１６に記載のタンパク質の製造方法。
  21. PMT活性阻害剤が、5-[[3,4-(1- phenylmethoxy)phenyl]methylene]-4-oxo-2-thioxo-3-thiazolidineacetic acidである、請求項２０に記載のタンパク質の製造方法。
  22. PMT遺伝子の破壊が、PMT5遺伝子またはPMT6遺伝子の単独破壊、PMT5遺伝子とPMT6遺伝子の二重破壊である、請求項１９〜２１のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
  23. 下記の(a)または(b)のOgataea minuta由来のシャペロン遺伝子。
    (a) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNAを含む遺伝子
    (b) 配列番号１に示す塩基配列に対して95％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ外来タンパク質分泌促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
  24. 下記の(d)または(e)のシャペロンタンパク質をコードする遺伝子。
    (d) 配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
    (e) 配列番号２に示すアミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ外来タンパク質分泌促進活性を有するタンパク質
  25. 請求項２３または２４に記載の遺伝子を含む発現ベクター。
  26. 下記の(a-1)または(b-1)のシャペロン遺伝子の１種または２種以上の組合せをさらに導入した請求項１に記載の形質転換宿主細胞。
    (a-1) 配列番号３、５、７、９、１１、または１３に示す塩基配列からなるDNAを含む遺伝子
    (b-1) 配列番号３、５、７、９、１１、または１３に示す塩基配列に対して95％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ外来タンパク質分泌促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
  27. 下記の(d-1)または(e-1)のシャペロンタンパク質をコードする遺伝子の１種または２種以上の組合せをさらに導入した請求項２に記載の形質転換宿主細胞。
    (d-1) 配列番号４、６、８、１０、１２、または１４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
    (e-1) 配列番号４、６、８、１０、１２、または１４に示すアミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ外来タンパク質分泌促進活性を有するタンパク質
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