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WO2010010848A1 - 分子シャペロンを用いた、哺乳動物培養細胞における抗体の産生方法 - Google Patents

分子シャペロンを用いた、哺乳動物培養細胞における抗体の産生方法 Download PDF

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WO2010010848A1
WO2010010848A1 PCT/JP2009/062952 JP2009062952W WO2010010848A1 WO 2010010848 A1 WO2010010848 A1 WO 2010010848A1 JP 2009062952 W JP2009062952 W JP 2009062952W WO 2010010848 A1 WO2010010848 A1 WO 2010010848A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
seq
gene
sequence listing
chop
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2009/062952
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
大祐 西宮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Daiichi Sankyo Co Ltd
Original Assignee
Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Daiichi Sankyo Co Ltd filed Critical Daiichi Sankyo Co Ltd
Publication of WO2010010848A1 publication Critical patent/WO2010010848A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/07—Heat shock proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Definitions

  • the present invention relates to a mammalian transformed cell whose foreign protein secretion ability is enhanced by a molecular chaperone and a transcription factor, and a method for producing the foreign protein using the same.
  • antibody drugs such as antibody drugs and therapeutic proteins are rapidly expanding the market.
  • antibody drugs do not cause harmful immune reactions even when administered to the human body, and are being actively developed due to their high specificity.
  • Post-translational modifications such as protein folding and sugar chain modification are essential for the physiological activity and antigenicity of protein drugs.
  • a secretory protein serving as a proteinaceous drug is transcribed and translated in the nucleus, and when a signal sequence is recognized by SRP (signal recognition particle), it passes through the translocon and enters the endoplasmic reticulum.
  • Secreted proteins are folded in the endoplasmic reticulum by unraveling the higher-order structure when passing through the translocon. Although protein folding is possible spontaneously, various molecular chaperones assist in folding.
  • the formation of the native three-dimensional structure formed in the endoplasmic reticulum is important for secretion, and proteins that are not correctly folded cannot enter the secretion pathway.
  • proteins with higher-order structure accumulate in the endoplasmic reticulum due to various environmental factors in the endoplasmic reticulum, inhibition of synthesis of membrane proteins and secreted proteins, etc., modification disorders such as addition of sugar chains and disulfide bonds, ER stress occurs.
  • Eukaryotic cells exhibit an endoplasmic reticulum stress response called Unfolded Protein Response (UPR) to avoid this critical situation.
  • URP Unfolded Protein Response
  • This stress response system is widely preserved in eukaryotic cells from yeast to mammalian cells, and is an important system that supports protein maturation and plays an essential role in protecting itself from cell death in an emergency. Yes.
  • UPR not only the mechanism that induces and regulates the transcription of molecular chaperones that repair accumulated abnormal proteins, but also ERAD (ER-associated degradation) that degrades and eliminates abnormal proteins to maintain endoplasmic reticulum homeostasis.
  • ERAD ER-associated degradation
  • examples of host cells for producing proteinaceous drugs include microorganisms, yeasts, insects, animal and plant cells, and transgenic animals and plants.
  • Post-translational modifications such as folding and sugar chain modification are indispensable for the physiological activity and antigenicity of protein drugs, so microorganisms that cannot perform complex post-translational modifications and plants with different sugar chain structures are not suitable as bioreactors.
  • Mammalian cells such as CHO cells, which have a sugar chain structure similar to that of humans, can be post-translationally modified, and are in close contact with humans, are now mainstream.
  • ERO1 or PDI1 when producing human serum albumin rich in SS bond, the production amount is improved 15 times. lactis et al. (Applied and Environmental Microbiology 2005 71 (8): 4359-4363). However, even if ERO1 and PDI1 are added at the same time, there is no further improvement, and the production period is only accelerated. In addition, IL-1 ⁇ having no SS bond has no effect.
  • Xbp-1 and ATF4 which play an important role as transcription factors in the secretory pathway and UPR.
  • EPO Epithropoietin
  • ATF4 Activating transcription factor 4
  • AT-III human antithrombin III
  • molecular chaperones are known not only for helping protein folding, but also for loosening aggregated proteins to fold.
  • HSP104 can perform a reaction impossible with other chaperones, such as solubilizing proteins from aggregates in cooperation with HSP70 (Cell 1998 94: 73-82).
  • An antibody molecule forms a disulfide bond between an antibody heavy chain and a light chain or an antibody heavy chain, and forms an intramolecular disulfide bond between the antibody heavy chain and the antibody light chain.
  • light chain tetramer molecules It is difficult to say that sufficient knowledge has been obtained about the types of molecular chaperones applicable to the production system of antibody molecules having such a complicated structure.
  • An object of the present invention is to provide means for producing highly secreted proteins, particularly proteins having a complex structure such as antibodies, in mammalian host cells.
  • the present inventors have co-expressed one or more specific molecular chaperone genes and transcription factors thereof with mammalian proteins to be expressed in mammalian cells.
  • the inventors have found that the secretion productivity of the foreign protein can be improved by making it possible to complete the present invention.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a polynucleotide encoding a protein having promoting activity (C) Poly encoding a protein consisting of a base sequence having 90% or more homology to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 65 or 69 in the sequence listing and having a foreign protein secretion promoting activity nucleotide.
  • the polynucleotide is one or more polynucleotides selected from the group consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, and 23 in the sequence listing.
  • the transformed cell according to (3) The transformed cell according to (4), wherein the polynucleotide is one or two or more polynucleotides selected from the group consisting of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 13, 21, and 23 in the Sequence Listing. .
  • a protein having an amino acid sequence and having a foreign protein secretion promoting activity is one or more proteins selected from the group consisting of amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 22 and 24 in the sequence listing.
  • the transformed cell according to 6 The transformed cell according to (7), wherein the protein is one or two or more proteins selected from the group consisting of the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 14, 22, and 24 in the Sequence Listing.
  • the mammalian-derived cultured cell is any one cell selected from the group consisting of COS-1 cells, 293 cells, and CHO cells (CHO-K1, CHO dhfr-, CHO-S, etc.)
  • (11) The transformed cell according to any one of (1) to (10), into which a polynucleotide encoding a foreign protein is further introduced.
  • (12) The transformed cell according to (11), wherein the foreign protein is a multimeric protein.
  • the transformed cell according to (12), wherein the foreign protein is a heteromultimeric protein.
  • the transformed cell according to (13), wherein the foreign protein is an antibody or a functional fragment thereof.
  • a method for producing a protein wherein the transformed cell according to any one of (11) to (14) is cultured, and a foreign protein is obtained from the culture.
  • a polynucleotide encoding a human mutant CHOP protein comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 65 in the Sequence Listing.
  • a human mutant CHOP protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 66 in the Sequence Listing.
  • a polynucleotide encoding a Chinese hamster mutant CHOP protein comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 69 in the Sequence Listing.
  • a Chinese hamster mutant CHOP protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 70 in the Sequence Listing.
  • a chaperone gene and its transcription factor into a mammalian host cell, it is possible to produce a highly secreted protein having a complex structure such as an antibody in a correctly folded form.
  • a synergistic effect can be obtained with respect to protein high secretion production.
  • the produced protein can be used as a medicine, diagnostic agent or research reagent depending on its activity.
  • variant type CHOP protein The figure which compared the antibody expression enhancement effect which a human mutant CHOP and a Chinese hamster mutant CHOP show, and showed that there was no big difference in an effect by the species (ELISA method). The figure which compared the function of human mutant type and wild type CHOP, and confirmed that mutant type CHOP showed the stronger antibody expression enhancement effect.
  • the term “gene” includes not only DNA but also mRNA, cDNA and RNA thereof.
  • polynucleotide is used in the same meaning as nucleic acid, and includes DNA, RNA, probe, oligonucleotide, and primer.
  • polypeptide and “protein” are used without distinction.
  • the “functional fragment of an antibody” means a partial fragment of an antibody having an activity of binding to an antigen, and includes Fab, F (ab ′) 2, etc. As long as it has binding ability, it is not limited to these molecules.
  • Genes Used in Protein High Secretion Production System include genes encoding a series of molecular chaperones (hereinafter referred to as “chaperones”) that act for protein high secretion production, protein folding, denatured protein degradation and aggregation prevention in the endoplasmic reticulum. And a transcription factor that controls the chaperone gene.
  • one of the genes used for high protein secretion production includes a CHOP gene (CCAAT / enhancer binding protein homologous protein).
  • the CHOP gene is also called Gadd153 (growth arrest and DNA damage inducible gene 153) or DNA Damage-inductive Transscript 3 (DDIT3), and it is induced by genetic stress, cell proliferation E, and / or protein growth arrest P, A / C. / Enhancer binding protein) is also known as a transcription factor.
  • Gadd153 growth arrest and DNA damage inducible gene 153 or DNA Damage-inductive Transscript 3 (DDIT3)
  • DDIT3 DNA Damage-inductive Transscript 3
  • CHOP plays a part in the final signal when ER stress occurs, and when UPR is activated in the PERK pathway, it is said that when CHOP is induced, it activates an apoptotic signal and is involved in UPR. It is suggested that Hereinafter, the transcription factor CHOP gene related to UPR will be described.
  • CHOP is composed of an N-terminal transcription activation domain and a C-terminal bZip DNA binding domain.
  • the origin of the CHOP gene used in the present invention is not particularly limited as long as it is a gene encoding a CHOP protein.
  • a gene encoding human CHOP (GenBank registration number: P35638) (same registration number: NM_004083) is exemplified. be able to.
  • the base sequence of the gene encoding the human CHOP protein is described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and the amino acid sequence encoded thereby is described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • CHOP gene used in the present invention a gene (same registration number: NM_007837) encoding mouse CHOP (GenBank registration number: AAH13718) can also be mentioned.
  • the base sequence of the gene encoding mouse CHOP protein is described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, and the amino acid sequence encoded thereby is described in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • Examples of the CHOP gene used in the present invention include a gene encoding the Chinese hamster CHOP (GenBank registration number: P14607) (same registration number: M29238).
  • the base sequence of the gene encoding the Chinese hamster CHOP protein is described in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing, and the amino acid sequence encoded thereby is described in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing.
  • a Chinese hamster mutant CHOP gene newly cloned according to the present invention can also be used in the present invention.
  • the gene encoding the Chinese hamster mutant CHOP protein is described in SEQ ID NO: 69 in the sequence listing, and the amino acid sequence encoded thereby is described in SEQ ID NO: 70 in the sequence listing.
  • the CHOP used in the present invention may be derived from other biological species.
  • species-derived CHOP genes mammal-derived genes corresponding to the above-mentioned genes derived from humans, mice or Chinese hamsters are preferable.
  • GRP78 is also called immunoglobulin heavy chain-binding protein (BiP) or HSPA5, and is an endoplasmic reticulum (ER) endogenous HSP70 family molecular chaperone. It is a molecule involved in protein folding and assembly in the ER, and is also known as an endoplasmic reticulum stress sensor.
  • the origin of the GRP78 gene used in the present invention is not particularly limited as long as it is a gene encoding GRP78 protein.
  • a gene encoding human GRP78 (GenBank registration number: NP_005338) (same registration number: NM_005347) is mentioned. be able to.
  • the base sequence of the gene encoding the human GRP78 protein is described in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing, and the amino acid sequence encoded thereby is described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing.
  • GRP94 is a molecular chaperone that is localized in the endoplasmic reticulum (ER) and is also known as gp96, a homolog of HSP90.
  • the origin of the GRP94 gene used in the present invention is not particularly limited as long as it is a gene encoding GRP94 protein.
  • a gene encoding human GRP94 (GenBank registration number: P14625) (same registration number: NM_003299) is mentioned. be able to.
  • the base sequence of the gene encoding human GRP94 protein is described in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing, and the amino acid sequence encoded thereby is described in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing.
  • PDIA4 is an enzyme localized in the endoplasmic reticulum (ER) and responsible for reorganization of disulfide (SS) bonds, and is also known as ERp72.
  • the origin of the PDIA4 gene used in the present invention is not particularly limited as long as it is a gene encoding PDIA4 protein.
  • a gene encoding human PDIA4 (GenBank registration number: P13667) (same registration number: NM_004911) is exemplified. be able to.
  • the base sequence of the gene encoding the human PDIA4 protein is described in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing, and the amino acid sequence encoded thereby is described in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing.
  • TPM3 is called Tropomyosin-3, Tropomyosin alpha-3 chain, Tropomyosin gamma, and is a dimer of coiled-coil protein. It is stable to filaments by polymerizing end-to-end along a large groove in actin filaments. And plays a role in regulating the access of other actin-binding proteins.
  • the origin of TPM3 gene used in the present invention is not particularly limited as long as it is a gene encoding TPM3 protein.
  • a gene encoding human TPM3 (GenBank registration number: Q63610) (same registration number: NM_153649) is mentioned. be able to.
  • the base sequence of the gene encoding the human TPM3 protein is described in SEQ ID NO: 13 in the sequence listing, and the amino acid sequence encoded thereby is described in SEQ ID NO: 14 in the sequence listing.
  • HSP90AB1 is a molecular chaperone called HSP90 ⁇ or HSP84 and localized in the cytoplasm.
  • the origin of the HSP90 ⁇ gene used in the present invention is not particularly limited as long as it is a gene encoding HSP90 ⁇ protein.
  • a gene encoding human HSP90AB1 (GENBANK registration number: P08238) (same registration number: NM_007355) is mentioned. be able to.
  • the base sequence of the gene encoding human HSP90AB1 protein is described in SEQ ID NO: 15 in the sequence listing, and the amino acid sequence encoded thereby is described in SEQ ID NO: 16 in the sequence listing.
  • PHB is a highly conserved gene from yeast to human, is localized in the inner mitochondrial membrane, and is thought to be a negative regulator of cell growth. Yeast is thought to have a chaperone-like function that binds to and stabilizes newly synthesized proteins in mitochondria.
  • the PHB gene used in the present invention is not particularly limited as long as it is a gene encoding a PHB protein.
  • a gene encoding human PHB (GenBank registration number: P35232) (same registration number: AK31649) is mentioned. be able to.
  • the base sequence of the gene encoding the human PHB protein is described in SEQ ID NO: 17 in the sequence listing, and the amino acid sequence encoded thereby is described in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing.
  • ATP2A2 also known as Sarco / Endoplasmic Reticulum Calcium (SERCA) -ATPase
  • SERCA Sarco / Endoplasmic Reticulum Calcium
  • the ATP2A2 gene used in the present invention is not particularly limited as long as it is a gene encoding an ATP2A2 protein.
  • a gene encoding human ATP2A2 (GenBank registration number: P166615) (same registration number: NM_170665) is exemplified. be able to.
  • the base sequence of the gene encoding human ATPA2 protein is described in SEQ ID NO: 19 in the sequence listing, and the amino acid sequence encoded thereby is described in SEQ ID NO: 20 in the sequence listing.
  • MCM7 is called DNA replication licensing factor MCM7 or CDC47 homolog, and is one of the highly conserved mini-chromosome maintenance proteins (MCMs) important for the initiation of eukaryotic genome replication.
  • MCMs mini-chromosome maintenance proteins
  • the origin of the MCM7 gene used in the present invention is not particularly limited as long as it is a gene encoding MCM7 protein.
  • a gene encoding human MCM7 (GenBank accession number: P33993) (same registration number: NM_005916) is mentioned. be able to.
  • the base sequence of the gene encoding the human MCM7 protein is described in SEQ ID NO: 21 in the sequence listing, and the amino acid sequence encoded thereby is described in SEQ ID NO: 22 in the sequence listing.
  • EIF4A is called Eukaryotic initiation factor 4A-I, and has an ATP-dependent RNA helicase activity that dissolves RNA secondary structure in order for ribosomal small subunits to bind efficiently to mRNA.
  • the origin of the eIF4A gene used in the present invention is not particularly limited as long as it is a gene encoding the eIF4A protein.
  • a gene encoding human eIF4A (GenBank accession number: P60842) (same registration number: NM_001416) is mentioned. be able to.
  • the base sequence of the gene encoding the human eIF4A protein is described in SEQ ID NO: 23 in the sequence listing, and the amino acid sequence encoded thereby is described in SEQ ID NO: 24 in the sequence listing.
  • P5CS is also called Delta-1-pyroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) and Gamma-glutamyl phosphate reductase (GPR), and belongs to the aldehyde dehydrogenase family, ⁇ -glutamyl phosphatase activity and ⁇ -glutamyl phosphate reductase Directs an ATP- and NADPH-dependent bifunctional mitochondrial enzyme with both activities.
  • the origin of the P5CS gene used in the present invention is not particularly limited as long as it is a gene encoding a P5CS protein.
  • a gene encoding human P5CS (GenBank accession number: P54886) (same registration number: NM_002860) is mentioned. be able to.
  • the base sequence of the gene encoding the human P5CS protein is described in SEQ ID NO: 25 in the sequence listing, and the amino acid sequence encoded thereby is described in SEQ ID NO: 26 in the sequence listing.
  • ILF3 is also called Interleukin enhancer-binding factor 3 (Nucleor factor of activated T-cells 90 kDa (NF-AT-90), and performs transcriptional regulation at the stage of mRNA elongation.
  • the ILF3 gene used in the present invention The origin of the gene is not particularly limited as long as it is a gene encoding ILF3 protein, but includes, for example, a gene encoding human ILF3 (GenBank registration number: Q12906) (same registration number: NM_0121818) Gene encoding human ILF3 protein
  • the nucleotide sequence of is described in SEQ ID NO: 27 in the sequence listing, and the amino acid sequence encoded thereby is described in SEQ ID NO: 28 in the sequence listing.
  • BAP37 also called BAP or Prohibitin-2 (PHB2)
  • PHB2 Prohibitin-2
  • the origin of BAP37 gene used in the present invention is not particularly limited as long as it is a gene encoding BAP37 protein.
  • a gene encoding human BAP37 (GenBank accession number: Q99623) (same registration number: NM_007273) is mentioned. be able to.
  • the base sequence of the gene encoding human BAP37 protein is described in SEQ ID NO: 29 in the sequence listing, and the amino acid sequence encoded thereby is described in SEQ ID NO: 30 in the sequence listing.
  • CALR is a multifunctional protein that functions as a major calcium (Ca2 +) binding protein in the endoplasmic reticulum (ER) lumen. It is also found in the nucleus, indicating that it functions in transcriptional regulation. CALR binds to the synthetic peptide KLGFFFKR, which is nearly identical to the amino acid sequence in the DNA binding region of the nuclear receptor superfamily.
  • the origin of the CALR gene used in the present invention is not particularly limited as long as it encodes a CALR protein.
  • a gene encoding human CALR (GenBank registration number: P27797) (same registration number: NM_004343) is mentioned. be able to.
  • the base sequence of the gene encoding the human CALR protein is described in SEQ ID NO: 31 in the sequence listing, and the amino acid sequence encoded thereby is described in SEQ ID NO: 32 in the sequence listing.
  • the chaperone and transcription factor used in the present invention may be chaperones and transcription factors derived from other species.
  • genes for chaperones and transcription factors derived from other species genes derived from mammals such as mice, rats, and Chinese hamsters corresponding to the above-mentioned genes derived from humans are preferable. Further, chaperones and transcription factors other than the above-mentioned chaperones and transcription factors may be used.
  • the above chaperone genes can be used alone or in combination of two or more.
  • two or more chaperone genes may be derived from the same or different species.
  • genes used in the present invention include human GRP78 gene, human CHOP gene, human GRP94 gene, human PDIA4 gene, human TPM3 gene, human HSP90 ⁇ gene, human PHB gene, human ATP2A2 gene, human MCM7 gene, human eIF4A
  • examples thereof include any one gene selected from the group consisting of a gene, a human P5CS gene, and a human ILF3 gene.
  • genes used in the present invention include human CHOP gene and human GRP78 gene combination, human CHOP gene and human GRP94 gene combination, human CHOP gene and human PDIA4 gene combination, human CHOP gene and human TPM3 gene Combination, combination of human CHOP gene and human HSP90 ⁇ gene, combination of human CHOP gene and human PHB gene, combination of human CHOP gene and human ATP2A2 gene, combination of human CHOP gene and human MCM7 gene, combination of human CHOP gene and human eIF4A gene Selected from the group consisting of a combination, a combination of a human CHOP gene and a human P5CS gene, and a combination of a human CHOP gene and a human ILF3 gene
  • One of the combination or Re can be mentioned.
  • Preferred examples of the combination of genes used in the present invention include a combination of a human CHOP gene and a human GRP94 gene, a combination of a human CHOP gene and a human PDIA4 gene, a combination of a human CHOP gene and a human TPM3 gene, a human CHOP gene and a human Selected from the group consisting of a combination of HSP90 ⁇ gene, a combination of human CHOP gene and human PHB gene, a combination of human CHOP gene and human ATP2A2 gene, a combination of human CHOP gene and human MCM7 gene, and a combination of human CHOP gene and human eIF4A gene Any one of the combinations may be mentioned.
  • More preferable examples of the combination of genes used in the present invention include a combination of a human CHOP gene and a human TPM3 gene, a combination of a human CHOP gene and a human MCM7 gene, and a combination of a human CHOP gene and a human eIF4A gene. Any one selected combination can be mentioned.
  • SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 And a gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, and / or added in any one amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences shown in FIG. Also good.
  • the number of amino acids that may be deleted, substituted and / or added is preferably 1 to several.
  • the number of “several” is not particularly limited, but means, for example, 20 or less, preferably 10 or less, more preferably 7 or less, and even more preferably about 5 or less.
  • the “mutation” here means a mutation artificially introduced mainly by a known mutant protein production method, but may be a similar naturally occurring mutation.
  • the gene used in the present invention consists of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 and 32. It may be a gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more homology with any one amino acid sequence selected from the group and having a foreign protein secretion promoting activity.
  • the 80% or higher homology is preferably 85% or higher, more preferably 90% or higher, and most preferably 95% or higher.
  • Protein homology search can be performed, for example, using a program such as FASTA or BLAST for the DNA Database of Japan (DNA Database of JAPAN (DDBJ)).
  • “foreign protein secretion-promoting activity” is based on the protein folding action (disulfide bond formation, etc.) of the molecular chaperone in the endoplasmic reticulum, the refolding action of the denatured protein to the normal protein, and the action of inhibiting the aggregation of the denatured protein. This refers to the activity of highly secreting a correctly folded foreign protein in the host cell.
  • “having foreign protein secretion promoting activity” means that the above activity is represented by SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30. And the activity of a protein having any one amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences described in (32) and (32).
  • the chaperone gene used in the present invention consists of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, and 31. It may be a gene that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to any one polynucleotide selected from the group and encodes a protein having a foreign protein secretion promoting activity .
  • stringent conditions refer to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • nucleic acids with high homology that is, base sequences described in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, and 31.
  • a nucleic acid complementary strand consisting of a base sequence having a homology of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more is hybridized with any one base sequence selected from An example is a condition in which a complementary strand of a nucleic acid composed of a soybean and a base sequence having a lower homology is not hybridized.
  • the sodium salt concentration is 15 to 750 mM, preferably 50 to 750 mM, more preferably 300 to 750 mM
  • the temperature is 25 to 70 ° C., preferably 50 to 70 ° C., more preferably 55 to 65 ° C.
  • formamide The condition is that the concentration is 0 to 50%, preferably 20 to 50%, more preferably 35 to 45%.
  • the conditions for washing the filter after hybridization are usually that the sodium salt concentration is 15 to 600 mM, preferably 50 to 600 mM, more preferably 300 to 600 mM, and the temperature is 50 to 70 ° C., preferably The temperature is 55 to 70 ° C, more preferably 60 to 65 ° C.
  • the amino acid mutation (deletion, substitution, and / or addition) can be introduced by a technique known in the art such as the Kunkel method or the Gapped duplex method, or a method analogous thereto, for example, site-specific.
  • Mutation introduction kits using the mutagenesis method for example, Mutant-K (manufactured by Takara Bio Inc.) or Mutant-G (manufactured by Takara Bio Inc.), LA PCR in vitro Mutagenesis series kit manufactured by Takara Bio Inc., etc.
  • Mutant-K manufactured by Takara Bio Inc.
  • Mutant-G manufactured by Takara Bio Inc.
  • the above-mentioned gene used for protein high-secretion production and the gene encoding a foreign protein that is the target of high-secretory expression described below are prepared by preparing mRNA and using reverse transcriptase. It can be obtained by a general method for synthesizing cDNA. As a general method, for example, a cDNA library derived from a cell or tissue expressing the target gene is isolated by screening using a DNA probe synthesized based on the gene fragment. can do. Preparation of mRNA can be performed by a method usually used in the art.
  • the above cells or tissues are treated with a guanidinin reagent, a phenol reagent or the like to obtain total RNA, and then, by an affinity column method using an oligo (dT) cellulose column or poly U-sepharose using Sepharose 2B as a carrier.
  • poly (A) + RNA (mRNA) is obtained by a batch method.
  • poly (A +) RNA may be further fractionated by sucrose density gradient centrifugation or the like.
  • single-stranded cDNA was synthesized using oligo dT primer and reverse transcriptase, and double-stranded using DNA synthase I, DNA ligase, RNase H, etc.
  • cDNA library can be prepared using a plasmid vector. Thereafter, a strain (positive clone) having the target DNA may be selected from the cDNA library.
  • Genomic DNA can be extracted by, for example, the method of Cryer et al. (Methods in Cell Biology, 12, 39-44 (1975)) and P.I. It can be carried out according to the method of Philippsen et al. (Methods Enzymol., 194, 169-182 (1991)).
  • a yeast protoplast is prepared, and from the protoplast, a generally known DNA extraction method, an alcohol precipitation method after removing cell residues under high salt concentration, a phenol or chloroform extraction A conventional method such as an alcohol precipitation method may be used.
  • the target gene can also be obtained, for example, by the PCR method (PCR Technology. Henry A. Errich, Attackton press (1989)).
  • PCR method PCR Technology. Henry A. Errich, Attackton press (1989)
  • 20 to 30-mer synthetic single-stranded DNA is used as a primer
  • genomic DNA is used as a template.
  • the amplified gene is used after confirming the base sequence.
  • a gene library is prepared by a conventional method, (b) a desired clone is selected from the prepared gene library, and the clone is amplified.
  • the gene library is a fragment obtained by partially digesting chromosomal DNA obtained from a cell line of an organism as a collection source by a conventional method with an appropriate restriction enzyme and ligating the obtained fragment to an appropriate vector.
  • a plasmid known as a vector for preparing a commonly known gene library can be used, and a phage vector or a cosmid can also be widely used.
  • a host for transformation or transduction a host corresponding to the type of the vector may be used.
  • Selection of clones retaining the target gene fragment is carried out by colony hybridization method, plaque hybridization method or the like using a labeled probe containing a sequence specific to the target gene from the above gene library.
  • the target gene can also be chemically synthesized.
  • a method of producing two pairs of complementary oligonucleotides and annealing them, a method of ligating several annealed DNAs with DNA ligase, or producing several partially complementary oligonucleotides by PCR Genes can be synthesized by, for example, filling a gap.
  • Determination of the DNA sequence of a gene can be performed by a conventional method, for example, the dideoxy method (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463-5467 (1977)). Furthermore, the determination of the DNA base sequence can be easily performed by using a commercially available sequence kit or the like.
  • the vector of the present invention is a vector containing one of the above chaperone genes, a vector containing one or more of the above chaperone genes, or a combination of two or more of the above chaperone genes.
  • a vector comprising is provided.
  • a chaperone gene in a host cell it may be transformed using a vector containing each gene alone, or may be transformed using a single vector containing a plurality of genes.
  • the expression vector may contain a gene encoding a foreign protein.
  • an expression vector containing a gene encoding a foreign protein may be prepared separately, and when prepared separately, each vector is cotransfected (co-introduced) into a host cell.
  • the gene encoding the foreign protein is not particularly limited, but various enzyme genes such as ⁇ -amylase gene and ⁇ -galactosidase gene, particularly pharmaceuticals such as erythropoietin (EPO) and granulocyte colony stimulating factor (G-CSF).
  • EPO erythropoietin
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • Glycosyltransferase genes necessary for the production of the above useful glycoproteins various interferon genes such as interferon ⁇ and interferon ⁇ , which are physiologically active physiologically active proteins, various interleukin genes such as IL1 and IL2, erythropoietin (EPO) Examples include genes, various cytokine genes such as granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) gene, growth factor genes, antibody genes and the like. These genes may be obtained by any technique.
  • the present invention is particularly effective for proteins with high hydrophobicity and proteins that are difficult to produce secretively, such as forming a complex. Therefore, the foreign protein includes a multimeric protein such as an antibody or a functional product thereof. Heteromultimers that are fragments are included.
  • humanized anti-DR5 antibody (mouse anti-human DR5 antibody TRA-8 (Nature Med. 2001, 7 (8), 954-60) is a humanized antibody, (Hereinafter referred to as hTRA-8) was selected.
  • hTRA-8 human anti-human DR5 antibody
  • the foreign protein to be subjected to high secretion production using the present invention is not limited to hTRA-8.
  • the foreign protein that can be used for testing the effect of the present invention is not limited to hTRA-8.
  • An expression vector may be constructed as a protein expression unit by appropriately adding an expression control region to a chaperone gene and a gene encoding a foreign protein.
  • the protein expression unit has at least a promoter region, the gene, and a transcription terminator region (poly A addition signal) in the direction of the transcription reading frame.
  • the promoter that can be used here may be a constitutive expression promoter or an inducible expression promoter.
  • constitutive expression promoters include various natural promoters such as SV40 early promoter, adenovirus E1A promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, EF-1 ⁇ (human elongation factor-1) promoter, HSP70 promoter, MT promoter, RSV promoter, UBC promoter, actin promoter, SR ⁇ promoter which is an artificial (fusion) promoter, CAG promoter and the like.
  • the poly A addition sequence may be any sequence that has an activity of causing transcription termination with respect to transcription from the promoter, and may be of the same or different gene as the promoter gene.
  • the protein to be produced is denatured and does not cause aggregation, or a promoter that can achieve an expression level that does not exceed the capacity of the secreted protein is appropriately selected, or adjustments such as weakening the activity are made.
  • a promoter that can achieve an expression level that does not exceed the capacity of the secreted protein is appropriately selected, or adjustments such as weakening the activity are made.
  • multimeric proteins molecules that form heteromultimers are susceptible to the above-mentioned effects.
  • molecules such as antibodies are heterotetramers in which two heavy chains and two light chains are associated with each other. The expression level is an important factor for achieving this.
  • the expression vector of the present invention can contain a selection marker for selecting a transformant.
  • a selection marker for selecting a transformant for example, by using drug resistance markers that confer resistance to drugs such as cerulenin, aureobasidin, zeocin, canavanine, cycloheximide, hygromycin, blasticidin, tetracycline, kanamycin, ampicillin, tetracycline, neomycin, etc. It is possible to select converters.
  • a transformant can be selected by using as a marker a gene that imparts solvent resistance to ethanol and the like, osmotic pressure resistance to glycerol and salts, resistance to metal ions such as copper, and the like.
  • the transformed cell of the present invention is the above-mentioned 1. Of the gene of 2.
  • the host cell to be transformed is a eukaryotic cell, preferably a mammalian cell, more preferably a human, mouse or rat, hamster, monkey or bovine cell.
  • the present invention aims to obtain a host cell reinforced with an endoplasmic reticulum (ER) essential for secretion, it can be applied to other mammalian cells or yeast.
  • ER endoplasmic reticulum
  • any method can be used for introducing an expression vector into a host cell as long as the transgene is stably present in the host and can be appropriately expressed.
  • calcium phosphate method Ito et al., (1984) Agric. Biol. Chem., 48, 341
  • electroporation method Becker, DM et al. (1990) Methods. Enzymol., 194, 182-187
  • spheroplast method Creggh et al., Mol. Cell. Biol., 5, 3376 (1985)
  • lithium acetate method Itoh, H. (1983) J. Bacteriol. 153, 163) -168
  • Lipo Ekushon method or the like can be mentioned.
  • a foreign protein is produced by transforming the transformed cell described in the above item “3.” with the gene encoding the foreign protein expressed in the expression "2.”
  • the transformed cells introduced using can be cultured by a known method, collected from the culture, and purified.
  • the “foreign protein” means that the transformed cell described in the above item “3.” is not produced at all or is produced in a small amount, and it is difficult to prepare a large amount from the transformed cell itself. It means protein.
  • the “culture” means not only the culture supernatant but also cultured cells or cell disruptions.
  • a foreign protein that can be produced using the transformed cell described in the item “3.” not only a monomer protein but also a multimeric protein can be selected. When producing a heteromultimeric protein composed of a plurality of different subunits, it is necessary to introduce a plurality of genes encoding these subunits into the transformed cells described in the item “3.” There is.
  • the method of culturing the transformed cell in the medium can be performed according to a usual method used for culturing the host cell.
  • the transformed cell When the transformed cell is a mammalian cell, it is cultured under conditions of 37 ° C., 5% or 8% CO 2 , and the culture time is about 24 to 1000 hours. It can be carried out by batch culture, fed-batch culture or continuous culture.
  • Confirmation of the expression product of the foreign protein gene from the above culture can be performed by SDS-PAGE, Western analysis, ELISA, or the like.
  • ordinary protein isolation and purification methods may be used.
  • the target protein is produced intracellularly after culturing, the target protein is collected by disrupting the cells with an ultrasonic disrupter, a French press, a Manton Gaurin homogenizer, a dynomill or the like.
  • the culture solution is used as it is, or the cells are removed by centrifugation or the like.
  • the target protein is collected by extraction with an organic solvent, etc., and if necessary, various chromatography (hydrophobic chromatography, reverse phase chromatography, affinity chromatography, ion exchange chromatography, etc.), gel filtration using a molecular sieve May be isolated and purified using a method such as electrophoresis, electrophoresis using polyacrylamide gel or the like alone or in combination.
  • various chromatography hydrophobic chromatography, reverse phase chromatography, affinity chromatography, ion exchange chromatography, etc.
  • gel filtration using a molecular sieve May be isolated and purified using a method such as electrophoresis, electrophoresis using polyacrylamide gel or the like alone or in combination.
  • the above culture method and purification method are examples, and are not limited to these.
  • the amino acid sequence of the purified gene product can be confirmed by known amino acid analysis, for example, automatic amino acid sequencing by Edman degradation.
  • the heteromultimeric protein produced using the production method described in the item “4.” examples include antibody proteins.
  • the antibody protein is a tetrameric protein composed of two molecules of a heavy chain polypeptide and two molecules of a light chain polypeptide. Therefore, in order to obtain an antibody protein in a form that maintains the antigen-binding ability, it is necessary to introduce both the heavy chain and light chain genes into the transformed cells described in the item “3.”. In this case, the heavy and light chain genes may be present on the same expression vector or may be present on different expression vectors.
  • the antibody gene used for antibody production has a specific nucleotide sequence as long as the combination of the heavy and light chain polypeptides transcribed and translated from the antibody gene retains the activity of binding to any antigen protein. It is not limited to an antibody gene having
  • antibody functional fragment means a partial fragment of an antibody having an activity of binding to an antigen, and includes Fab, F (ab ′) 2, etc., but has the ability to bind to an antigen. As long as it is not limited to these molecules. Genes encoding these functional fragments can be obtained by genetically modifying the gene encoding the full-length antibody protein molecule.
  • Plasmids, restriction enzymes, DNA modifying enzymes and the like used in the examples of the present invention are commercially available and can be used in accordance with conventional methods. Also well known to those skilled in the art are the procedures used for DNA cloning, nucleotide sequence determination, host cell transformation, transformation cell culture, enzyme collection from the resulting culture, purification, etc. It can be known from the literature.
  • pcDNA3.1 (-) (Invitrogen) was treated with restriction enzymes XbaI and HindIII, the target fragment was separated by 1% agarose electrophoresis, cut out from the gel, purified, and this DNA fragment was used as a vector along with the above-mentioned ligation. Reaction and transformation were performed. Ligation reaction was performed using In-fusion 2.0 Dry-Down PCR Cloning Kit (Clontech). In the transformation, first, the frozen competent cell JM109 was thawed, 10 ⁇ l of the solution after the above ligation reaction was added to the solution, and the mixture was allowed to stand on ice for 30 minutes. Then, heat shock was performed at 42 ° C. for 45 seconds and ice-cooled for 5 minutes.
  • the target plasmid was obtained from the colonies cultured on the LB plate by the alkali method.
  • the pcDNA3.1 ( ⁇ ) hTRA-8 light chain expression vector was constructed by determining the base sequence of the hTRA-8 light chain in the plasmid obtained by the alkaline method.
  • This DNA fragment and pcDNA3.1 (-) are treated with restriction enzymes XhoI and HindIII, followed by separation and purification of the target fragment by agarose gel electrophoresis, ligation reaction, transformation, and culture of the plate. Acquired.
  • the Ligation reaction was performed according to the protocol using a LigaFast TM Rapid DNA Ligation System (Promega).
  • the pcDNA3.1 ( ⁇ ) hTRA-8 heavy chain expression vector was constructed by determining the base sequence of the hTRA-8 heavy chain in the plasmid obtained by the alkaline method.
  • hTRA-8 is given the general name of tigatuzumab, and the amino acid sequences of the heavy chain and the light chain are known.
  • hTRA-8 by synthesizing the hTRA-8 gene according to conventional methods based on these known sequence information and cloning the obtained gene into an appropriate expression vector. is there. It is also possible to test the effect of the present invention using a synthesized hTRA-8 gene.
  • chaperone and transcription factor expression vector (2-1) Cloning of human-derived chaperone and transcription factor Reverse transcription reaction using RNA extracted from 293 cells using RNeasy Kit (Qiagen) as template and ReveTraAce (TOYOBO) To synthesize cDNA. Using the synthesized cDNA as a template, DNA encoding each protein was amplified with the primers shown in (2-2), and the target fragment was separated by agarose gel electrophoresis and the DNA fragment was purified. Each DNA fragment was cloned into pcDNA3.1 Directional TOPO. A clone containing the target gene was selected by determining the nucleotide sequence of the target gene in the cloned plasmid.
  • FIG. 3 shows a comparison of base sequences of human wild-type CHOP and human mutant CHOP
  • FIG. 4 shows a comparison of amino acid sequences.
  • Example 1-3 1-3
  • human constructed in Example 2 Each of the derived protein expression vectors was introduced into a cell, the antibody was transiently expressed, and an ELISA method was performed to measure the amount of the antibody secreted into the culture medium.
  • an empty vector in which no chaperone gene was inserted was added to an antibody expression vector, and the amount of DNA was adjusted to introduce the gene into the cell.
  • the host cell was COS-1, and Lipofectamine 2000 was used as the gene introduction reagent.
  • COS-1 was an ⁇ -MEM medium containing 10% FCS and cultured under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2.
  • ELISA was performed by the following method. To a 96-well plate coated with 50 ng / well of anti-kappa Light Chain, 100 ⁇ l of the decellularized culture supernatant was added and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. Next, after removing the sample (culture supernatant) and washing each well with 200 ⁇ l of PBS-Tween (0.05%), 100 ⁇ l of HRP-labeled anti-human IgG (Fc) was added to the well. It left still at 1 degreeC for 1 hour.
  • Host cells are COS-1, 293F cells, CHO-S, CHO-K1, and gene introduction reagents are Lipofectamine 2000 (Invitrogen) for COS-1 and CHO-K1, and MAX reagents (Invitrogen) for 293F cells and CHO-S. )
  • COS-1 is ⁇ -MEM medium containing 10% FCS
  • CHO-S is Free style CHO medium
  • CHO-K1 is F-12 medium containing 10% FCS
  • 293 cells at 37 ° C under 5% CO2.
  • was cultured in a free style 293 medium under conditions of 37 ° C. and 8% CO 2 and after 48 hours of transfection, the culture solution was collected and subjected to ELISA.
  • the ELISA operation was performed by the method described in Example 3.
  • Antibody expression enhancement effect by a combination of CHOP and chaperone or CHOP and transcription factor A gene is introduced into a cell in the same manner as in Example 3 by combining a mutant CHOP expression vector and another protein (chaperone or transcription factor) expression vector and culturing. The amount of antibody secreted into the liquid was measured by ELISA. The ELISA operation was performed by the method described in Example 3.
  • CHO-S was cultured in a free style CHO medium under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2. Six days after gene introduction, the culture supernatant was collected, and the culture solution was purified using a protein A column. Apoptosis activity measurement and antigen binding activity measurement were performed using the purified protein solution.
  • Apoptosis activity was measured by the following method. Serial dilution (200 ng) of purified hTRA-8 and sample (hTRA-8 expressed and purified in CHO-S) with Goat Affinity Purified Antibodies to Human IgG Fc solution adjusted to 1 ⁇ g / ml using RPMI 1640 with 10% serum / Ml, 20 ng / ml, 2 ng / ml, 0.2 ng / ml) and added to the assay plate at 50 ⁇ l / well. This plate was seeded with 50 ⁇ l of Jurkat cells adjusted to 1 ⁇ 10 3 cells / ml and incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 for 72 hours.
  • the amount of ATP in each well was measured with CellTiter-Glo TM Luminescent Cell Viability Assay (Promega) to produce cell viability.
  • Jurkat was cultured using RPMI 1640 containing 10% serum under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2. The results are shown in FIG.
  • the apoptotic activity of the expressed antibody was consistent with or without CHOP.
  • the antibody obtained by co-introducing the antibody expression vector and the mutant CHOP expression vector had the same apoptotic activity as the antibody obtained separately by introducing only the antibody expression vector into the cell ( Data not shown).
  • the antigen binding activity measurement by competitive ELISA was performed by the following method.
  • HDR5-His (6 ⁇ His fused to human DR5 C-end) was diluted with a coating buffer (SDT) adjusted to a 1-fold concentration, added to the immuno plate at 50 ⁇ L / well, and left at 4 ° C. overnight or 37 ° C. And left for 2 hours.
  • the plate was washed with 200 ⁇ l of PBS-Tween (0.05%), 150 ⁇ l of PBS containing 1% BSA was added, and the plate was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour.
  • Biotin-labeled hTRA-8 was serially diluted with PBS-Tween (0.05%) containing 1% BSA (10-fold dilution in order from 200 ⁇ g / ml), and a sample (hTRA-8 expressed and purified with CHO-S) In the same manner, 25 ⁇ l / well was added to each of the plates from which 1% BSA-containing PBS was removed, and the plate was allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours or at 4 ° C. overnight.
  • the antigen binding activities of the expressed antibodies were the same regardless of the presence or absence of CHOP, and the antigen binding activity measurement was the same.
  • the antibody obtained by co-introducing the antibody expression vector and the mutant CHOP expression vector had the same antigen-binding activity as the antibody obtained separately by introducing only the antibody expression vector into the cell. (Data not shown). This suggests that CHOP enhances only the expression level without affecting the function of the foreign gene (antibody).
  • Chinese hamster mutant CHOP and human mutant CHOP showed a high antibody expression enhancing effect.
  • Chinese hamster mutant CHOP and human mutant CHOP have 87% homology in the base sequence and 88% homology in the amino acid sequence. That is, it was confirmed that the CHOP gene having 85% or more homology with the human CHOP gene has an antibody expression enhancing effect regardless of the species.
  • DNA encoding human wild-type CHOP was amplified, the target fragment was separated by agarose gel electrophoresis, and the DNA fragment was purified. Furthermore, PCR (94 ° C. for 15 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 68 ° C. for 30 seconds ⁇ 30 cycles) was performed using the purified DNA as a template and the hCHOP amplification primer described in Example 2.
  • DNA encoding human wild-type CHOP was amplified, the target fragment was separated by agarose gel electrophoresis, and the DNA fragment was purified, and each DNA fragment was cloned into pcDNA3.1 Directional TOPO.
  • a clone containing the target gene was selected by determining the nucleotide sequence of the target gene in the cloned plasmid.
  • the human mutant CHOP expression vector and the human wild-type CHOP expression vector were each introduced into COS-1 cells together with the antibody expression vector, and the amount of antibody secreted into the culture medium was determined by ELISA. It was measured.
  • an empty vector into which the CHOP gene was not inserted was added to the antibody expression vector, and the amount of DNA was adjusted to introduce the gene into the cells.
  • the ELISA operation was performed by the method described in Example 3. The results are shown in FIG.
  • Human mutant-type CHOP and human wild-type CHOP showed an antibody expression enhancing effect, but mutant-type CHOP showed a higher effect.
  • Human mutant CHOP and human wild-type CHOP have 99% homology in the nucleotide sequence and 97% homology in the amino acid sequence, but the place where the mutation is located is in the transcriptional activation domain, and the mutation enhances the expression of the antibody. The possibility that it became high was suggested.
  • Mammalian host cells into which a polynucleotide encoding the molecular chaperone protein of the present invention has been introduced can be used as a high-secretory production system for medical proteins or antibodies.

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Abstract

哺乳動物宿主細胞において、蛋白質、特に抗体などの構造の複雑な蛋白質を高分泌生産させる手段を提供すること。 本発明によって、１種または２種以上の分子シャペロン蛋白質遺伝子を有する形質転換細胞、および該形質転換細胞を用いて外来蛋白質を高分泌させる方法が提供される。

Description

分子シャペロンを用いた、哺乳動物培養細胞における抗体の産生方法
　本発明は、分子シャペロンおよび転写因子によって外来蛋白質分泌能が増強された、哺乳動物形質転換細胞およびこれを用いた該外来蛋白質の製造方法に関する。
　遺伝子組換え技術の発展によって、抗体医薬や治療用蛋白質といった蛋白質性医薬品が急速にその市場を拡大している。中でも、抗体医薬は人体に投与しても有害な免疫反応を引き起こさず、その特異性の高さから開発が盛んに進められている。
　蛋白質性医薬の生理活性や抗原性には、蛋白質のフォールディングや糖鎖修飾といった翻訳後修飾が必須である。蛋白質性医薬となる分泌蛋白質は、核内で転写、翻訳され、ＳＲＰ（ｓｉｇｎａｌ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｐａｒｔｉｃｌｅ）にシグナル配列が認識されると、トランスロコンを通過して小胞体に入る。分泌蛋白質は、トランスロコンの通過時に高次構造がほどけて小胞体内でフォールディングされる。蛋白質のフォールディングは自発的に可能であるが、様々な分子シャペロンがフォールディングを助けている。
　小胞体内で形成されるネイティブな立体構造の形成は分泌に重要であり、正しくフォールディングされなかった蛋白質は分泌経路に乗ることができなくなる。小胞体内の種々の環境要因やよる膜蛋白質や分泌蛋白質等の合成阻害、糖鎖やジスルフィド結合の付加等の修飾障害などにより、高次構造の異常な蛋白質が小胞体内に蓄積すると、「小胞体ストレス」が生じる。真核細胞はこの危機的状況を回避するために、Ｕｎｆｏｌｄｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅ（ＵＰＲ）と呼ばれる小胞体ストレス応答を示す。このストレス応答系は酵母から哺乳動物細胞まで真核細胞に広く保存されており、蛋白質の成熟を支える重要なシステムであるとともに、非常時に細胞死から身を守るのにも不可欠な役割を担っている。ＵＰＲには、蓄積した異常蛋白質を修復する分子シャペロンの転写誘導・翻訳調節を行う機構だけでなく、異常蛋白質を分解、排除して小胞体内の恒常性を維持するＥＲＡＤ（ＥＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）という機構も存在している。これらの応答系には分子シャペロンやその転写因子を含む多くの蛋白質が関与していることが明らかにされつつある。
　一方、蛋白質性医薬を生産させる宿主細胞としては、微生物や酵母、昆虫、動植物細胞、トランスジェニック動植物等を挙げることができる。蛋白質性医薬の生理活性や抗原性には、フォールディングや糖鎖修飾といった翻訳後修飾が必須であるため、複雑な翻訳後修飾が行えない微生物や糖鎖構造の異なる植物はバイオリアクターとして不適である。ヒトと類似した糖鎖構造を有し、翻訳後修飾が可能、さらには安全性の面を考慮し、ヒトと近縁生物であるＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞が現在の主流となっている。
　哺乳動物細胞を宿主とする場合、微生物等と比較して、増殖速度の低さ、生産性の低さ、高価なコスト等の問題を抱えている。また、蛋白質性医薬品を臨床に利用するためには大量の投与が必要となるため、世界的にもその生産能力の不足が問題となっている。そこで、哺乳動物細胞を用いた外来遺伝子の生産性を向上させるため、これまでに、転写や翻訳、選択マーカー（薬剤）、遺伝子増幅などの遺伝子工学的手法や培養工学的手法など多くのアプローチが試行錯誤されてきたが、一律に発現を上げる系は未だ存在していないのが現状である。
　近年、分泌蛋白質の正しいフォールディングに必須である分子シャペロンを利用することで、分泌蛋白質の生産量を上げるという試みが為され始めている。
　例えば、Ｓ－Ｓ結合がリッチなヒト血清アルブミンを生産する際に、ＥＲＯ１またはＰＤＩ１を導入すると、生産量が１５倍に向上することがＫ．ｌａｃｔｉｓらに報告されている（Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　２００５　７１（８）：　４３５９－４３６３）。しかし、ＥＲＯ１とＰＤＩ１を同時に入れてもそれ以上の向上はなく、生産される時期が早くなるだけである。また、Ｓ－Ｓ結合を有さないＩＬ－１βには効果がない。
　酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を生産する際に、Ｒａｔ　ＰＤＩとＢｉＰを共発現させることによって分泌生産量が８倍に増大したことが報告されている（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１９９８　１６：７７３－７７７）。筆者らによると、ＢｉＰは凝集を防ぎ、ＰＤＩはシャペロン活性ではなく、イソメラーゼ活性によって分泌生産量が増大したと結論づけている。
　Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｒｉｓにおいて、単鎖抗体断片（ＳｃＦｖ）を生産するに際し、Ｂｉｐを共発現すると分泌生産量が３倍に向上したが、ＰＤＩまたはＰＤＩとＢｉＰの併用では、効果は認められなかったことが報告されている（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２００７　７４（２）：　３８１－３８９）。さらに、ＣＨＯ細胞においてＰＤＩレベルの増加によるＩＬ－１５とｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｆｃ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＮＦＲ－Ｆｃ）の分泌に対する効果を調べたところ、ＰＤＩの過剰発現によってＴＮＦＲ－Ｆｃ（ジスルフィド結合がリッチな蛋白質）は細胞内に保持されるが、ＩＬ－１５は細胞内に保持されなかったことが報告されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　２０００　１６：７３６－７４３）。これは、ＣＨＯ細胞ではＰＤＩの過剰発現はかえって分泌生産量が減少してしまうことを示唆している。
　分泌経路やＵＰＲにおいて転写因子として重要な働きをするＸｂｐ－１やＡＴＦ４を用いることで、分泌蛋白質の生産性を向上させるという試みも行われている。ＣＨＯ細胞を用いた一過的な発現において、Ｘｂｐ－１はＥＰＯ（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）の発現を２．５倍上昇させることが報告されているが、抗体を外来遺伝子とする場合は顕著な発現量上昇効果は認められなかった（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　２００８　　９９（１）：１５５－６４）。また、Ｘｂｐ－１と同様に、ＵＰＲの一端を担うＡＴＦ４（Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　４）をＡＴ－ＩＩＩ（ｈｕｍａｎ　ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ　ＩＩＩ）生産ＣＨＯ細胞で強発現させると、２倍強の発現上昇効果があると報告されているが、抗体での実績はなく、その発現レベルも低いものであった。（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　２００８　１００（２）：３１７－３２４）。
　また、分子シャペロンには、蛋白質のフォールディングを助けるものだけなく、凝集した蛋白質をフォールディングするためにほぐすものも知られている。例えば、ＨＳＰ１０４は、ＨＳＰ７０と協同して凝集体から蛋白質を可溶化するという、他のシャペロンでは不可能な反応を行うことができる（Ｃｅｌｌ　１９９８　９４：７３－８２）。
　以上のように、蛋白質のフォールディングを助ける分子シャペロン群を抗体などの外来遺伝子と共発現させることによって目的蛋白質の生産性を向上させる試みが行われているが、宿主細胞や分子シャペロンの種類、またそれらの組み合わせによってその効果が一律に得られるものではない。
　抗体分子は、抗体重鎖と軽鎖または抗体重鎖間でジスルフィド結合が形成されるとともに抗体重鎖、抗体軽鎖の分子内ジスルフィド結合を形成することによって、正しい立体構造の会合体（重鎖と軽鎖の４量体分子）が形成される。このような複雑な構造を持つ抗体分子の産生系に適用可能な分子シャペロンの種類については、十分な知見が得られているとは言い難い。
　以上のような背景の下、哺乳動物細胞等の宿主細胞において、シャペロンおよびその関連因子を適切に組み合わせることによって、蛋白質、特に抗体を高分泌生産させる方法が求められていた。
　本発明の課題は、哺乳動物宿主細胞において、蛋白質、特に抗体などの構造の複雑な蛋白質を高分泌生産させる手段を提供することにある。
課題を解決する手段
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、哺乳動物細胞において特定の１種または２種以上の分子シャペロン遺伝子およびその転写因子を、発現対象となる外来蛋白質と共発現させることによって、該外来蛋白質の分泌生産性を向上させることが可能であることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）下記の（ａ）乃至（ｃ）からなる群から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞：
（ａ）配列表の配列番号１、３、５、６５または６９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列表の配列番号１、３、５、６５または６９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ外来蛋白質分泌促進活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列表の配列番号１、３、５、６５または６９に示す塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ外来蛋白質分泌促進活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（２）下記の（ｄ）乃至（ｆ）からなる群から選択されるいずれかの一つの分子シャペロン蛋白質をコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞：
（ｄ）配列表の配列番号２、４、６、６６または７０に示すアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｅ）配列表の配列番号２、４、６、６６または７０に示すアミノ酸配列からなる蛋白質に対して９０％以上の相同性を有し、かつ外来蛋白質分泌促進活性を有する蛋白質；
（ｆ）配列表の配列番号２、４、６、６６または７０に示すアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ外来蛋白質分泌促進活性を有する蛋白質。
（３）下記の（ｉ）乃至（ｉｉｉ）からなる群から選択される一つまたは二つ以上のポリヌクレオチドが導入された（１）または（２）に記載の形質転換細胞：
（ｉ）配列表の配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列表の配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ外来蛋白質分泌促進活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列表の配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７に示す塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ外来蛋白質分泌促進活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（４）ポリヌクレオチドが、配列表の配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１及び２３に記載の塩基配列からなる群から選択される一つまたは二つ以上のポリヌクレオチドである、（３）に記載の形質転換細胞。
（５）ポリヌクレオチドが、配列表の配列番号１３、２１及び２３に記載の塩基配列からなる群から選択される一つまたは二つ以上のポリヌクレオチドである、（４）に記載の形質転換細胞。
（６）下記の（ｉｖ）乃至（ｖｉ）からなる群から選択される一つまたは二つ以上の蛋白質をコードするポリヌクレオチドが導入された、（１）または（２）に記載の形質転換細胞：
（ｉｖ）配列表の配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８に示すアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｖ）配列表の配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８に示すアミノ酸配列からなる蛋白質に対して９０％以上の相同性を有し、かつ外来蛋白質分泌促進活性を有する蛋白質；
（ｖｉ）配列表の配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８示すアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ外来蛋白質分泌促進活性を有する蛋白質。
（７）蛋白質が、配列表の配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４に記載のアミノ酸配列からなる群から選択される一つまたは二つ以上の蛋白質である、（６）に記載の形質転換細胞。
（８）蛋白質が、配列表の配列番号１４、２２及び２４に記載のアミノ酸配列からなる群から選択される一つまたは二つ以上の蛋白質である、（７）に記載の形質転換細胞。
（９）細胞が哺乳動物由来の培養細胞である、（１）乃至（８）のいずれか一つに記載の形質転換細胞。
（１０）哺乳動物由来の培養細胞が、ＣＯＳ－１細胞、２９３細胞、およびＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ　ｄｈｆｒ－、ＣＨＯ－Ｓ等）からなる群から選択されるいずれか一つの細胞である、（９）に記載の形質転換細胞。
（１１）外来蛋白質をコードするポリヌクレオチドをさらに導入した、（１）乃至（１０）のいずれか一つに記載の形質転換細胞。
（１２）外来蛋白質が多量体蛋白質である、（１１）に記載の形質転換細胞。
（１３）外来蛋白質がヘテロ多量体蛋白質である、（１２）に記載の形質転換細胞。
（１４）外来蛋白質が抗体またはその機能性断片である、（１３）に記載の形質転換細胞。
（１５）（１１）乃至（１４）のいずれか一つに記載の形質転換細胞を培養し、培養物から外来蛋白質を取得することを特徴とする、蛋白質の製造方法。
（１６）配列表の配列番号６５に記載の塩基配列からなるヒト変異型ＣＨＯＰ蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（１７）配列表の配列番号６６に記載のアミノ酸配列からなるヒト変異型ＣＨＯＰ蛋白質。
（１８）配列表の配列番号６９に記載の塩基配列からなるチャイニーズハムスター変異型ＣＨＯＰ蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（１９）配列表の配列番号７０記載のアミノ酸配列からなるチャイニーズハムスター変異型ＣＨＯＰ蛋白質。
　本発明によれば、哺乳動物宿主細胞へのシャペロン遺伝子およびその転写因子の導入によって、抗体等の構造の複雑な蛋白質を正しくフォールディングされた形態で高分泌生産することが可能となる。また、複数の分子シャペロンを組み合わせることにより、蛋白質高分泌生産に関して相乗的な効果を得ることができる。生産された蛋白質は、その活性に応じて、医薬、診断薬または研究用試薬として使用することができる。
抗体発現（ｈＴＲＡ－８　重鎖、軽鎖共発現）ベクターの概略図。 シャペロン等発現ベクターの概略図。 ヒト野生型ＣＨＯＰ遺伝子とヒト変異型ＣＨＯＰ遺伝子の塩基配列を比較した図。 ヒト野生型ＣＨＯＰ蛋白質とヒト変異型ＣＨＯＰ蛋白質のアミノ酸配列を比較した図。 ＥＬＩＳＡ法により、各因子の抗体発現亢進効果を確認した図。 ＣＨＯＰがＣＯＳ－１、ＣＨＯ系細胞、２９３Ｆにおいて普遍的に抗体発現亢進効果を示すことをＥＬＩＳＡ法により確認した図。 各因子（ＧＲＰ７８，ＧＲＰ９４，ＰＤＩＡ４，ＴＰＭ３，ＭＣＭ７，ｅＩＦ４Ａ，Ｐ５ＣＳ，ＩＬＦ３）をＣＨＯＰと共に発現させることで、より高い抗体発現亢進効果を生むことをＥＬＩＳＡ法により確認した図。 各因子（ＨＳＰ９０β、ＰＨＢ，ＡＴＰ２Ａ２）をＣＨＯＰと共に発現させることで、より高い抗体発現亢進効果を生むことをＥＬＩＳＡ法により確認した図。 ＣＨＯＰの発現がｈＴＲＡ－８のアポトーシス誘導活性に影響しないことを示した図。 ＣＨＯＰの発現がｈＴＲＡ－８の抗原結合に影響しないことを示した図。 チャイニーズハムスターの野生型ＣＨＯＰ遺伝子と変異型ＣＨＯＰ遺伝子の塩基配列を比較した図。 チャイニーズハムスターの野生型ＣＨＯＰ蛋白質と変異型ＣＨＯＰ蛋白質とのアミノ酸配列を比較した図。 ヒト変異型ＣＨＯＰとチャイニーズハムスター変異型ＣＨＯＰの示す抗体発現亢進効果を比較し、種によって効果に大差のないことを示した図（ＥＬＩＳＡ法）。 ヒトの変異型と野生型のＣＨＯＰの機能を比較し、変異型ＣＨＯＰがより強い抗体発現亢進効果を示すことを確認した図。
　本明細書中において、「遺伝子」という語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびそのＲＮＡも含まれるものとする。
　本明細書中において、「ポリヌクレオチド」という語は核酸と同じ意味で用いており、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、およびプライマーも含まれている。
　本明細中においては、「ポリペプチド」と「蛋白質」は区別せずに用いている。
　本明細書中においては、「抗体の機能性断片」とは、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片を意味しており、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等を含むが、抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない
　１．蛋白質高分泌生産系に用いる遺伝子
　本発明においては、蛋白質高分泌生産に、小胞体において蛋白質のフォールディング、変性蛋白質の分解や凝集阻止などに働く一連の分子シャペロン群をコードする遺伝子（以下、「シャペロン遺伝子」という。）およびシャペロン遺伝子を制御する転写因子を用いる。
　本発明において、蛋白質高分泌生産に用いる遺伝子の１つとしては、ＣＨＯＰ遺伝子（ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を挙げることができる。ＣＨＯＰ遺伝子はＧａｄｄ１５３（ｇｒｏｗｔｈ　ａｒｒｅｓｔ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ｄａｍａｇｅ　ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｇｅｎｅ　１５３）またはＤＮＡ　Ｄａｍａｇｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　３（ＤＤＩＴ３）ともよばれ、ｇｅｎｏｔｏｘｉｃなストレスや細胞の増殖停止シグナルによって誘導される蛋白質で、また、Ｃ／ＥＢＰ（ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）のメンバーとして同定されたことでも知られている転写因子である。ＣＨＯＰはＥＲ　ｓｔｒｅｓｓが起きたときの最終シグナルの一端を担っており、ＵＰＲがＰＥＲＫ経路で活性化されたとき、ＣＨＯＰが誘導されるとアポトーシスシグナルを活性化すると言われており、ＵＰＲに関与していることが示唆される。以下、ＵＰＲに関わる転写因子ＣＨＯＰ遺伝子について述べる。
　ＣＨＯＰは、Ｎ末端側の転写活性化ドメインとＣ末端側のｂＺｉｐ　ＤＮＡ結合ドメインから構成される。本発明において使用されるＣＨＯＰ遺伝子は、ＣＨＯＰ蛋白質をコードする遺伝子であれば特に由来は制限されないが、例えば、ヒトＣＨＯＰ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｐ３５６３８）をコードする遺伝子（同登録番号：ＮＭ＿００４０８３）を挙げることができる。ヒトＣＨＯＰ蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号１に記載され、これにコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に記載されている。また、本発明によって新たにクローニングされたヒト２９３Ｆ細胞由来のヒト変異型ＣＨＯＰ遺伝子を使用することも出来る。このヒト変異型ＣＨＯＰ蛋白質をコードする遺伝子は、配列表の配列番号６５に記載され、これにコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号６６に記載されている。
　本発明において使用されるＣＨＯＰ遺伝子としては、マウスＣＨＯＰ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＡＨ１３７１８）をコードする遺伝子（同登録番号：ＮＭ＿００７８３７）を挙げることもできる。マウスＣＨＯＰ蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号３に記載され、これにコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号４に記載されている。
　本発明において使用されるＣＨＯＰ遺伝子としては、チャイニーズハムスターＣＨＯＰ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｐ１４６０７）をコードする遺伝子（同登録番号：Ｍ２９２３８）を挙げることもできる。チャイニーズハムスターＣＨＯＰ蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号５に記載され、これにコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号６に記載されている。また、本発明によって新たにクローニングされたチャイニーズハムスター変異型ＣＨＯＰ遺伝子も本発明において使用することができる。このチャイニーズハムスター変異型ＣＨＯＰ蛋白質をコードする遺伝子は、配列表の配列番号６９に記載され、これにコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号７０に記載されている。
　本発明に使用されるＣＨＯＰは、他の生物種由来であってもよい。他の生物種由来ＣＨＯＰ遺伝子としては、上記のヒト、マウスまたはチャイニーズハムスター由来の各遺伝子に対応する哺乳動物由来の遺伝子が好ましい。
　次に、本発明において、単独あるいはＣＨＯＰと併用して蛋白質高分泌生産に用いるシャペロンまたは転写因子について述べる。ＧＲＰ７８は、ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢｉＰ）やＨＳＰＡ５とも呼ばれ、小胞体（ＥＲ）内在性のＨＳＰ７０ファミリーの分子シャペロンである。ＥＲ内で、蛋白質のｆｏｌｄｉｎｇやａｓｓｅｍｂｌｙに関わる分子であり、また、小胞体ストレスセンサーとしても知られている。本発明において使用されるＧＲＰ７８遺伝子は、ＧＲＰ７８蛋白質をコードする遺伝子であれば特に由来は制限されないが、例えば、ヒトＧＲＰ７８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＰ＿００５３３８）をコードする遺伝子（同登録番号：ＮＭ＿００５３４７）を挙げることができる。ヒトＧＲＰ７８蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号７に記載され、これにコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号８に記載されている。
　ＧＲＰ９４は、小胞体（ＥＲ）に局在し、ＨＳＰ９０のホモログでｇｐ９６としても知られている分子シャペロンである。本発明において使用されるＧＲＰ９４遺伝子は、ＧＲＰ９４蛋白質をコードする遺伝子であれば特に由来は制限されないが、例えば、ヒトＧＲＰ９４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｐ１４６２５）をコードする遺伝子（同登録番号：ＮＭ＿００３２９９）を挙げることができる。ヒトＧＲＰ９４蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号９に記載され、これにコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号１０に記載されている。
　ＰＤＩＡ４は、小胞体（ＥＲ）に局在し、ジスルフィド（Ｓ－Ｓ）結合の再構成を担う酵素で、ＥＲｐ７２としても知られている。本発明において使用されるＰＤＩＡ４遺伝子は、ＰＤＩＡ４蛋白質をコードする遺伝子であれば特に由来は制限されないが、例えば、ヒトＰＤＩＡ４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｐ１３６６７）をコードする遺伝子（同登録番号：ＮＭ＿００４９１１）を挙げることができる。ヒトＰＤＩＡ４蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号１１に記載され、これにコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号１２に記載されている。
　ＴＰＭ３は、Ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ－３やＴｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ　ａｌｐｈａ－３　ｃｈａｉｎ、Ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ　ｇａｍｍａとよばれ、コイルドコイル蛋白質の二量体で、アクチンフィラメントにおいて大きい溝に沿って端と端を接して重合することで、フィラメントに安定性をもたらし、他のアクチン結合蛋白質の接近を調節する役割を担っている。本発明において使用されるＴＰＭ３遺伝子は、ＴＰＭ３蛋白質をコードする遺伝子であれば特に由来は制限されないが、例えば、ヒトＴＰＭ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｑ６３６１０）をコードする遺伝子（同登録番号：ＮＭ＿１５３６４９）を挙げることができる。ヒトＴＰＭ３蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号１３に記載され、これにコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４に記載されている。
　ＨＳＰ９０ＡＢ１は、ＨＳＰ９０βやＨＳＰ８４と呼ばれ、細胞質に局在する分子シャペロンである。本発明において使用されるＨＳＰ９０β遺伝子は、ＨＳＰ９０β蛋白質をコードする遺伝子であれば特に由来は制限されないが、例えば、ヒトＨＳＰ９０ＡＢ１（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号：Ｐ０８２３８）をコードする遺伝子（同登録番号：ＮＭ＿００７３５５）を挙げることができる。ヒトＨＳＰ９０ＡＢ１蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号１５に記載され、これにコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号１６に記載されている。
　ＰＨＢは、酵母からヒトまで高度に保存された遺伝子で、ミトコンドリア内膜に局在し、細胞増殖の負の調節因子であると考えられている。また、酵母では、ミトコンドリアで新規に合成された蛋白質と結合し、その安定化を果たすシャペロン様機能を有すると考えられる。本発明において使用されるＰＨＢ遺伝子は、ＰＨＢ蛋白質をコードする遺伝子であれば特に由来は制限されないが、例えば、ヒトＰＨＢ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｐ３５２３２）をコードする遺伝子（同登録番号：ＡＫ３１２６４９）を挙げることができる。ヒトＰＨＢ蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号１７に記載され、これにコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号１８に記載されている。
　ＡＴＰ２Ａ２は、Ｓａｒｃｏ／Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ　Ｃａｌｃｉｕｍ（ＳＥＲＣＡ）－ＡＴＰａｓｅとしても知られており、細胞質から小胞体内腔へのカルシウム輸送に共役したＡＴＰ加水分解を触媒する、小胞体に位置する細胞内ポンプである。本発明において使用されるＡＴＰ２Ａ２遺伝子は、ＡＴＰ２Ａ２蛋白質をコードする遺伝子であれば特に由来は制限されないが、例えば、ヒトＡＴＰ２Ａ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｐ１６６１５）をコードする遺伝子（同登録番号：ＮＭ＿１７０６６５）を挙げることができる。ヒトＡＴＰＡ２蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号１９に記載され、これにコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号２０に記載されている。
　ＭＣＭ７は、ＤＮＡ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｌｉｃｅｎｓｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　ＭＣＭ７やＣＤＣ４７　ｈｏｍｏｌｏｇと呼ばれ、真核生物ゲノム複製の開始に重要な高度に保存されたミニ染色体維持蛋白質（ＭＣＭ）の１つである。本発明において使用されるＭＣＭ７遺伝子は、ＭＣＭ７蛋白質をコードする遺伝子であれば特に由来は制限されないが、例えば、ヒトＭＣＭ７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｐ３３９９３）をコードする遺伝子（同登録番号：ＮＭ＿００５９１６）を挙げることができる。ヒトＭＣＭ７蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号２１に記載され、これにコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号２２に記載されている。
　ｅＩＦ４Ａは、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　４Ａ－Ｉとよばれ、リボソーム小サブユニットがｍＲＮＡに効率的に結合するために、ＲＮＡ二次構造を解くＡＴＰ依存ＲＮＡヘリカーゼ活性を有している。本発明において使用されるｅＩＦ４Ａ遺伝子は、ｅＩＦ４Ａ蛋白質をコードする遺伝子であれば特に由来は制限されないが、例えば、ヒトｅＩＦ４Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｐ６０８４２）をコードする遺伝子（同登録番号：ＮＭ＿００１４１６）を挙げることができる。ヒトｅＩＦ４Ａ蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号２３に記載され、これにコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号２４に記載されている。
　Ｐ５ＣＳは、Ｄｅｌｔａ－１－ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ－５－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ　（Ｐ５ＣＳ）やＧａｍｍａ－ｇｌｕｔａｍｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＧＰＲ）とも呼ばれ、アルデヒド脱水素酵素ファミリーに属し、γグルタミルリン酸化酵素活性とγグルタミルリン酸還元酵素活性の両方をもつ、ＡＴＰおよびＮＡＤＰＨ依存性の二機能ミトコンドリア酵素を指令する。本発明において使用されるＰ５ＣＳ遺伝子は、Ｐ５ＣＳ蛋白質をコードする遺伝子であれば特に由来は制限されないが、例えば、ヒトＰ５ＣＳ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｐ５４８８６）をコードする遺伝子（同登録番号：ＮＭ＿００２８６０）を挙げることができる。ヒトＰ５ＣＳ蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号２５に記載され、これにコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号２６に記載されている。
　ＩＬＦ３は、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　ｅｎｈａｎｃｅｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　３　（Ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ　ｏｆ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｔ－ｃｅｌｌｓ　９０　ｋＤａ（ＮＦ－ＡＴ－９０）とも呼ばれ、ｍＲＮＡ伸張の段階での転写調節を行う。本発明において使用されるＩＬＦ３遺伝子は、ＩＬＦ３蛋白質をコードする遺伝子であれば特に由来は制限されないが、例えば、ヒトＩＬＦ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｑ１２９０６）をコードする遺伝子（同登録番号：ＮＭ＿０１２２１８）が挙げられる。ヒトＩＬＦ３蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号２７に記載され、これにコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号２８に記載されている。
　ＢＡＰ３７は、ＢＡＰやＰｒｏｈｉｂｉｔｉｎ－２（ＰＨＢ２）とも呼ばれ、酵母からヒトまで高度に保存された遺伝子で、ＰＨＢと複合体を形成し、ミトコンドリア内膜に局在すると考えられる。また、ミトコンドリアの形態調節に関与することも報告されている。本発明において使用されるＢＡＰ３７遺伝子は、ＢＡＰ３７蛋白質をコードする遺伝子であれば特に由来は制限されないが、例えば、ヒトＢＡＰ３７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｑ９９６２３）をコードする遺伝子（同登録番号：ＮＭ＿００７２７３）を挙げることができる。ヒトＢＡＰ３７蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号２９に記載され、これにコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号３０に記載されている。
　ＣＡＬＲは、小胞体（ＥＲ）内腔における主要なカルシウム（Ｃａ２＋）結合蛋白質として機能する多機能蛋白質である。また核でも見られ、転写調節において機能することを示している。ＣＡＬＲは合成ペプチドＫＬＧＦＦＫＲに結合するが、これは核内受容体スーパーファミリーのＤＮＡ結合領域中のアミノ酸配列とほぼ同一である。本発明において使用されるＣＡＬＲ遺伝子は、ＣＡＬＲ蛋白質をコードする遺伝子であれば特に由来は制限されないが、例えば、ヒトＣＡＬＲ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｐ２７７９７）をコードする遺伝子（同登録番号：ＮＭ＿００４３４３）を挙げることができる。ヒトＣＡＬＲ蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号３１に記載され、これにコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号３２に記載されている。
　本発明に使用されるシャペロンおよび転写因子は、他の生物種由来のシャペロンおよび転写因子であってもよい。他の生物種由来のシャペロンおよび転写因子の遺伝子としては、上記のヒト由来の各遺伝子に対応するマウス、ラット、チャイニーズハムスター等の哺乳動物由来の各遺伝子が好ましい。また、上記の各シャペロンおよび転写因子以外のシャペロンおよび転写因子であってもよい。
　本発明においては、上記シャペロン遺伝子を１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。上記シャペロン遺伝子を２種以上組み合わせて用いる場合には、同じ生物種由来のものであっても異なる生物種由来のものであってもよい。
　本発明において使用される遺伝子の好ましい例として、ヒトＧＲＰ７８遺伝子、ヒトＣＨＯＰ遺伝子、ヒトＧＲＰ９４遺伝子、ヒトＰＤＩＡ４遺伝子、ヒトＴＰＭ３遺伝子、ヒトＨＳＰ９０β遺伝子、ヒトＰＨＢ遺伝子、ヒトＡＴＰ２Ａ２遺伝子、ヒトＭＣＭ７遺伝子、ヒトｅＩＦ４Ａ遺伝子、ヒトＰ５ＣＳ遺伝子、及びヒトＩＬＦ３遺伝子からなる群から選択されるいずれか一つの遺伝子を挙げることができる。
　本発明において使用される遺伝子の組合せとしては、ヒトＣＨＯＰ遺伝子とヒトＧＲＰ７８遺伝子の組み合わせ、ヒトＣＨＯＰ遺伝子とヒトＧＲＰ９４遺伝子の組み合わせ、ヒトＣＨＯＰ遺伝子とヒトＰＤＩＡ４遺伝子の組み合わせ、ヒトＣＨＯＰ遺伝子とヒトＴＰＭ３遺伝子の組み合わせ、ヒトＣＨＯＰ遺伝子とヒトＨＳＰ９０β遺伝子の組み合わせ、ヒトＣＨＯＰ遺伝子とヒトＰＨＢ遺伝子の組み合わせ、ヒトＣＨＯＰ遺伝子とヒトＡＴＰ２Ａ２遺伝子の組み合わせ、ヒトＣＨＯＰ遺伝子とヒトＭＣＭ７遺伝子の組み合わせ、ヒトＣＨＯＰ遺伝子とヒトｅＩＦ４Ａ遺伝子の組み合わせ、ヒトＣＨＯＰ遺伝子とヒトＰ５ＣＳ遺伝子の組み合わせ、及びヒトＣＨＯＰ遺伝子とヒトＩＬＦ３遺伝子の組み合わせ、からなる群から選択されるいずれか一つの組み合わせを挙げることができる。
　本発明において使用される遺伝子の組合せの好ましい例としては、ヒトＣＨＯＰ遺伝子とヒトＧＲＰ９４遺伝子の組み合わせ、ヒトＣＨＯＰ遺伝子とヒトＰＤＩＡ４遺伝子の組み合わせ、ヒトＣＨＯＰ遺伝子とヒトＴＰＭ３遺伝子の組み合わせ、ヒトＣＨＯＰ遺伝子とヒトＨＳＰ９０β遺伝子の組み合わせ、ヒトＣＨＯＰ遺伝子とヒトＰＨＢ遺伝子の組み合わせ、ヒトＣＨＯＰ遺伝子とヒトＡＴＰ２Ａ２遺伝子の組み合わせ、ヒトＣＨＯＰ遺伝子とヒトＭＣＭ７遺伝子の組み合わせ、及びヒトＣＨＯＰ遺伝子とヒトｅＩＦ４Ａ遺伝子の組み合わせからなる群から選択されるいずれか一つの組み合わせを挙げることができる。
　本発明において使用される遺伝子の組合せのさらに好ましい例としては、ヒトＣＨＯＰ遺伝子とヒトＴＰＭ３遺伝子の組み合わせ、ヒトＣＨＯＰ遺伝子とヒトＭＣＭ７遺伝子の組み合わせ、及びヒトＣＨＯＰ遺伝子とヒトｅＩＦ４Ａ遺伝子の組み合わせからなる群から選択されるいずれか一つの組み合わせを挙げることができる。
　本発明において使用される遺伝子は、外来蛋白質分泌促進活性を保持する限り、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０及び３２に示すアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子であってもよい。ここで、欠失、置換、および／または付加されてもよいアミノ酸の数としては、好ましくは、１個から数個である。「数個」の数は特には限定されないが、例えば２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下程度を意味する。また、ここにいう「変異」は、主には公知の変異蛋白質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異であってもよい。
　また、本発明において使用される遺伝子は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０及び３２に示すアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ外来蛋白質分泌促進活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であってもよい。上記８０％以上の相同性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性をいう。蛋白質のホモロジー検索は、例えば、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＮＡ　Ｄａｔａｂａｎｋ　ｏｆ　ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）等を対象に、ＦＡＳＴＡやＢＬＡＳＴなどのプログラムを用いて行うことができる。
　ここで、「外来蛋白質分泌促進活性」とは、小胞体における分子シャペロンの蛋白質のフォールディング作用（ジスルフィド結合形成など）、変性蛋白質の正常型蛋白質へのリフォールディング作用、変性蛋白質の凝集抑制作用に基づき、正確にフォールディングされた外来蛋白質を宿主細胞内において高分泌させる活性をいう。
　また、「外来蛋白質分泌促進活性を有する」とは、上記の活性が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０及び３２に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有する蛋白質が有する活性と実質的に同等であることをいう。
　本発明に使用されるシャペロン遺伝子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９及び３１に記載の塩基配列からなる群から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ外来蛋白質分泌促進活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であってもよい。
　ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸、すなわち配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９及び３１に記載されている塩基配列からなる群から選択されるいずれか一つの塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましく９５％以上の相同性を有する塩基配列からなる核酸の相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い塩基配列からなる核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件を挙げることができる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５～７５０ｍＭ、好ましくは５０～７５０ｍＭ、より好ましくは３００～７５０ｍＭ、温度が２５～７０℃、好ましくは５０～７０℃、より好ましくは５５～６５℃、ホルムアミド濃度が０～５０％、好ましくは２０～５０％、より好ましくは３５～４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が１５～６００ｍＭ、好ましくは５０～６００ｍＭ、より好ましくは３００～６００ｍＭ、温度が５０～７０℃、好ましくは５５～７０℃、より好ましくは６０～６５℃である。
　当業者であれば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１０　Ｓｋｙｌｉｎｅ　Ｄｒｉｖｅ　Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，　ＮＹ　（１９８９））等を参照することにより、こうしたホモログ遺伝子を容易に取得することができる。また、上記の塩基配列の相同性は、同様に、ＦＡＳＴＡ検索やＢＬＡＳＴ検索により決定することができる。
　上記アミノ酸の変異（欠失、置換、および／または付加）の導入は、Ｋｕｎｋｅｌ法若しくはＧａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法等の当該技術分野で公知の手法、またはこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ－Ｋ（タカラバイオ社製）若しくはＭｕｔａｎｔ－Ｇ（タカラバイオ社製）、タカラバイオ社のＬＡ　ＰＣＲ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　シリーズキットなどが利用できる。
　本発明において、蛋白質高分泌生産に用いる上記遺伝子や後記の高分泌発現の対象となる外来蛋白質をコードする遺伝子（以下、これらを「目的遺伝子」という）は、ｍＲＮＡを調製し、逆転写酵素でｃＤＮＡを合成する一般的な方法により取得することができる。上記の一般的な手法としては、例えば、目的遺伝子が発現している細胞や組織に由来するｃＤＮＡライブラリーを、当該遺伝子断片をもとにして合成したＤＮＡプローブを用いてスクリーニングすることにより単離することができる。ｍＲＮＡの調製は、当該技術分野において通常用いられる手法により行うことができる。例えば、上記細胞または組織を、グアニジニン試薬、フェノール試薬等で処理して全ＲＮＡを得、その後、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムやセファロース２Ｂを担体とするポリＵ－セファロース等を用いたアフィニティーカラム法により、あるいはバッチ法によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得る。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ（Ａ＋）ＲＮＡをさらに分画してもよい。次いで、得られたｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマーおよび逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成し、該一本鎖ｃＤＮＡからＤＮＡ合成酵素Ｉ、ＤＮＡリガーゼおよびＲＮａｓｅＨ等を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成する。合成した二本鎖ｃＤＮＡをＴ４ＤＮＡ合成酵素によって平滑化後、アダプター（例えば、ＥｃｏＲＩアダプター）の連結、リン酸化等を経て、λｇｔ１１等のλファージに組み込んでｉｎ　ｖｉｖｏパッケージングすることによってｃＤＮＡライブラリーを作製する。また、λファージ以外にもプラスミドベクターを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製することもできる。その後、ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを有する株（ポジティブクローン）を選択すればよい。
　また目的遺伝子をゲノムＤＮＡから単離する場合、あるいは、プロモーター、ターミネーター領域を含む断片の単離は、一般的手法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９），Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１９４（１９９１））に従い、採取源となる生物の細胞株よりゲノムＤＮＡを抽出し、目的遺伝子を選別することにより行う。ゲノムＤＮＡの抽出は、例えば、Ｃｒｙｅｒ　らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　１２，　３９－４４（１９７５））およびＰ．　Ｐｈｉｌｉｐｐｓｅｎらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１９４，　１６９－１８２（１９９１））に従って行うことができる。例えば、採取源が酵母の場合は、酵母のプロトプラストを調製して、当該プロトプラストから、通常公知のＤＮＡ抽出法、高塩濃度下での細胞残さ除去後のアルコール沈殿法、フェノールやクロロホルム抽出後のアルコール沈殿法等の常法を用いて行えばよい。
　目的遺伝子の取得は、例えばＰＣＲ法（ＰＣＲ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｈｅｎｒｙ　Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，Ａｔｏｃｋｔｏｎ　ｐｒｅｓｓ（１９８９））によって行うこともできる。ＰＣＲ法を用いた目的遺伝子の増幅には、プライマーとして２０～３０ｍｅｒの合成１本鎖ＤＮＡを、鋳型としてゲノムＤＮＡを用いる。増幅された遺伝子は塩基配列を確認した後、用いる。
　一方、配列未知の目的遺伝子を含む断片の取得は、（ａ）常法により遺伝子ライブラリーを作製し、（ｂ）作製された遺伝子ライブラリーから所望のクローンを選択し、当該クローンを増幅する、ことによって行うことができる。遺伝子ライブラリーは、採取源となる生物の細胞株から常法により得た染色体ＤＮＡを適当な制限酵素によって部分消化して断片化し、得られた断片を適当なベクターに連結し、該ベクターを適当な宿主に導入することによって調製することができる。また、細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ここからｃＤＮＡを合成後、適当なベクターに連結し、該ベクターを適当な宿主に導入することによっても調製することができる。この際用いられるベクターとしては、通常公知の遺伝子ライブラリー調製用ベクターとして知られるプラスミドを用いることができ、またファージベクターまたはコスミド等も広く用いることができる。形質転換または形質導入を行う宿主は、上記ベクターの種類に応じたものを用いればよい。
　目的遺伝子断片を保持したクローンの選択は、上記遺伝子ライブラリーから、目的遺伝子に特有の配列を含む標識プローブを用いるコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法等によって行う。
　また目的遺伝子を化学的に全合成することもできる。例えば相補的な２対のオリゴヌクレオチドを作製しこれらをアニールさせる方法や、数本のアニールされたＤＮＡをＤＮＡリガーゼにより連結する方法、または一部相補的な数本のオリゴヌクレオチドを作製しＰＣＲによりギャップを埋める方法等により、遺伝子を合成することができる。
　遺伝子のＤＮＡ配列の決定等は通常の方法、例えばジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　７４，　５４６３－５４６７（１９７７））等により行うことができる。更に上記ＤＮＡ塩基配列の決定は、市販のシークエンスキット等を用いることによっても容易に行い得る。
　２．発現ベクター
　本発明のベクターは、上記のシャペロン遺伝子の１種を含むベクター、あるいは、上記のシャペロン遺伝子の１種を２個以上のコピー数含むベクター、または上記のシャペロン遺伝子の２種以上の組み合わせを含むベクターが提供される。シャペロン遺伝子を宿主細胞内で発現させるために、各遺伝子を単独で含むベクターをそれぞれ用いて形質転換してもよく、また、複数の遺伝子を含む一つのベクターを用いて形質転換してもよい。また、同発現ベクターに外来蛋白質をコードする遺伝子を含んでいてもよい。あるいは、外来蛋白質をコードする遺伝子を含む発現ベクターを別に調製してもよく、別に調製した場合は、各ベクターを宿主細胞にコトランスフェクト（共導入）する。
　外来蛋白質をコードする遺伝子としては、特に限定はされないが、α－アミラーゼ遺伝子、α－ガラクトシダーゼ遺伝子等の各種酵素遺伝子、特に、エリスロポエチン（ＥＰＯ）や顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）などの医薬上有用な糖蛋白質の生産に必要な糖転移酵素遺伝子、また医薬上有用な生理活性蛋白質であるインターフェロンα、インターフェロンγ等の各種インターフェロン遺伝子、ＩＬ１、ＩＬ２等の各種インターロイキン遺伝子、エリスロポエチン（ＥＰＯ）遺伝子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）遺伝子等の各種サイトカイン遺伝子、成長因子遺伝子、抗体遺伝子等を挙げることができる。これらの遺伝子はいかなる手法によって得られるものでもよい。
　本発明は特に疎水性の高い蛋白質、複合体を形成するような分泌生産が困難な蛋白質に対して有効であり、よって、上記の外来蛋白質には、多量体蛋白質、例えば、抗体またはその機能的断片であるヘテロ多量体が含まれる。
　本発明の効果を試験するモデル抗体として、ヒト化抗ＤＲ５抗体（マウス抗ヒトＤＲ５抗体であるＴＲＡ－８（Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．　２００１，　７（８），　９５４－６０）をヒト化した抗体であり、以下ｈＴＲＡ－８とする。）が選択された。しかし、本発明を使用して高分泌生産を行う対象となる外来蛋白質はｈＴＲＡ－８に限定されない。また、本発明の効果を試験するために使用可能な外来蛋白質もｈＴＲＡ－８に限定されない。
　シャペロン遺伝子および外来蛋白質をコードする遺伝子は、発現制御領域を適宜付加して蛋白質発現ユニットとして発現ベクターを構築してもよい。蛋白質発現ユニットは、転写の読み枠の方向に、少なくともプロモーター領域、上記遺伝子、転写ターミネーター領域（ポリＡ付加シグナル）を有するものである。ここで使用し得るプロモーターとしては、構成発現プロモーターであっても、誘導発現プロモーターであってもよい。構成発現プロモーターとしては、例えば、種々の天然のプロモーターであるＳＶ４０　ｅａｒｌｙ　プロモーター、アデノウイルスＥ１Ａプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＥＦ－１α（ヒト延長因子－１）プロモーター、ＨＳＰ７０プロモーター、ＭＴプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター、アクチンプロモーター、人工（融合）プロモーターであるＳＲαプロモーター、ＣＡＧプロモーターなどを挙げることができる。また、ポリＡ付加配列は、プロモーターからの転写に対して転写終結を起こす活性を有する配列であればよく、プロモーターの遺伝子と同じまたは異なる遺伝子のものであってもよい。
　外来蛋白質を高分泌生産させるためには強力なプロモーターを用いることが必要であるが、高活性なプロモーターを用いてフォールディングされにくい蛋白質や、分泌されにくい蛋白質の生産を試みた場合、かえって分泌不全が起こることがある。これは、蛋白質の生産が、翻訳が行われるリボソーム、フォールディング・分泌が行われる小胞体のキャパシティを越えることにより、過剰に生産されたタンパクが細胞内で変性し、蓄積、ユビキチン化され、プロテオソームにて分解するような状況になるためである。従って、生成する蛋白質が変性しアグリゲーションを起こさない、または生産された蛋白質が分泌能のキャパシティを越えない程度の発現量を達成できるプロモーターを適宜採択するか、あるいは活性を弱めるなどの調整を行って使用することが好ましい。多量体蛋白質の中でも、ヘテロ多量体を形成する分子は上記の影響を受けやすく、特に抗体のような分子は重鎖、軽鎖が２分子ずつ会合したヘテロ４量体であるため、適切に会合させるためには発現量は重要な因子である。
　また、本発明の発現ベクターには、形質転換体を選抜するための選択マーカーを含めることができる。例えば、セルレニン、オーレオバシジン、ゼオシン、カナバニン、シクロヘキシミド、ハイグロマイシン、ブラストシジン、テトラサイクリン、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシンなどの薬剤に対して耐性を付与する薬剤耐性マーカーなどを使用することで、形質転換体の選抜を行うことが可能である。また、エタノール等に対する溶剤耐性や、グリセロールや塩等に対する浸透圧耐性、銅等の金属イオン耐性等を付与する遺伝子をマーカーにすることで、形質転換体の選抜を行うことも可能である。
　３．形質転換細胞
　本発明の形質転換細胞は、前記１．の遺伝子を、前記２．の発現ベクターを用いて導入した形質転換細胞である。形質転換させる宿主細胞としては、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、さらに好ましくはヒト、マウスまたはラット、ハムスター、サル、ウシ由来の細胞である。さらに、本発明は分泌に必須である小胞体（ＥＲ）を補強した宿主細胞を得ることを目的としているため、その他の哺乳動物細胞、または酵母にも適用可能である。
　本発明において、宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、導入遺伝子が宿主内にて安定に存在し、かつ適宜発現させることができる方法であればいかなる方法でもよく、一般的に用いられている方法、例えば、リン酸カルシウム法（Ｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　（１９８４）　Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，３４１）、エレクトロポレーション法（Ｂｅｃｋｅｒ，　Ｄ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９０）　Ｍｅｔｈｏｄｓ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１９４，１８２－１８７）、スフェロプラスト法（Ｃｒｅｇｇｈ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５，３３７６（１９８５））、酢酸リチウム法（Ｉｔｏｈ，　Ｈ．　（１９８３）　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１５３，　１６３－１６８）、リポフェクション法等を挙げることができる。
　４．外来蛋白質の製造方法
　本発明における外来蛋白質の製造は、上記「３．」の項目に記載の形質転換細胞に対して、外来蛋白質をコードする遺伝子を、前記「２．」項目に記載の発現ベクターを用いて導入した形質転換細胞を公知の方法により培養し、その培養物から採取し、精製することにより行うことができる。「外来蛋白質」とは、上記「３．」の項目に記載の形質転換細胞が全く産生しないか、あるいは産生していたとしても少量であり、該形質転換細胞自体からは大量調製が困難である蛋白質のことをいう。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞、または細胞の破砕物のいずれをも意味するものである。なお、「３．」の項目に記載の形質転換細胞を用いて産生することのできる外来蛋白質としては、単量体蛋白質のみならず多量体蛋白質を選択することも可能である。異なる複数のサブユニットから構成されるヘテロ多量体蛋白質の生産を行う場合、これらのサブユニットをコードしている複数の遺伝子を、それぞれ「３．」の項目に記載の形質転換細胞に導入する必要がある。
　形質転換細胞を培地に培養する方法は、その宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　形質転換細胞が哺乳動物細胞の場合は３７℃、５％または８％ＣＯ２条件下で培養し、培養時間は２４～１０００時間程度であり、培養は静置、振とう、攪拌、通気下の回分培養や流加培養または連続培養などにより実施することができる。
　上記の培養物（培養液）から外来蛋白質遺伝子の発現産物の確認は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウエスタン解析、ＥＬＩＳＡ等により行うことができる。生産された蛋白質を単離精製するためには、通常の蛋白質の単離、精製法を用いればよい。培養後、目的蛋白質が細胞内に生産される場合には、細胞を超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により破砕することにより、目的蛋白質を採取する。また、目的蛋白質が細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により細胞を除去する。その後、有機溶媒による抽出等により目的蛋白質を採取し、必要に応じて各種クロマトグラフィー（疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー等）、分子篩を用いたゲルろ過法、ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法などの手法を単独あるいは組み合わせて用いて単離精製すればよい。
　上記の培養法、精製法は一例であって、これらに限定されるものではない。なお、精製された遺伝子産物が有するアミノ酸配列の確認は、公知のアミノ酸分析、例えばエドマン分解法による自動アミノ酸配列決定法等により行うことができる。
　５．抗体蛋白質の製造方法
　前記「４．」の項目に記載の製造方法を用いて製造されるヘテロ多量体蛋白質としては抗体蛋白質を挙げることができる。抗体蛋白質は、２分子の重鎖ポリペプチドおよび２分子の軽鎖ポリペプチドからなる４量体蛋白質である。従って、抗原結合能を維持した形態で抗体蛋白質を取得するためには、前記「３．」の項目に記載の形質転換細胞に、重鎖および軽鎖の遺伝子の双方を導入する必要がある。この場合に、重鎖および軽鎖の遺伝子は、同じ発現ベクター上に存在しても良く、あるいは異なる発現ベクター上に存在していても良い。
　抗体製造に用いる抗体遺伝子としては、該抗体遺伝子より転写・翻訳される重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの組合せが、任意の抗原蛋白質と結合する活性を保持している限り、特定の塩基配列を持つ抗体遺伝子に限定されない。
　また、抗体遺伝子としては、必ずしも抗体の全長分子をコードしている必要はなく、抗体の機能性断片をコードしている遺伝子を用いることができる。「抗体の機能性断片」とは、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片を意味しており、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等を含むが、抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない。これらの機能性断片をコードする遺伝子は、抗体蛋白質の全長分子をコードする遺伝子を遺伝子工学的に改変することによって取得することができる。
　以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし、これらの実施例は本発明の技術的範囲をなんら限定するものではない。本発明の実施例で用いるプラスミド，制限酵素，ＤＮＡ修飾酵素等は市販のものであり、常法に従って使用することができる。また、ＤＮＡのクローニング，塩基配列の決定，宿主細胞の形質転換，形質転換細胞の培養，得られる培養物からの酵素の採取，精製等に用いた操作についても当業者によく知られているものであるか、文献により知ることのできるものである。
　外来遺伝子発現ベクターの構築
　（１－１）　ｐｃＤＮＡ３．１（－）　ｈＴＲＡ－８　軽鎖発現ベクターの構築
　モデル抗体としてヒト化抗ＤＲ５抗体ｈＴＲＡ－８を使用するために、ＤＧＶ　ｈＴＲＡ－８（ＤＧＶ　（ＬＯＮＺＡ社）にｈＴＲＡ－８を組込んだもの）プラスミドを鋳型とし、下記プライマーを用いてＰＣＲ法（９４℃　１５秒、５５℃　３０秒、６８℃　６０秒×３０ｃｙｃｌｅ）により、ｈＴＲＡ－８　軽鎖を増幅した。
５’－ＡＡＡＣＧＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＴＡＧＴＴＣＴＣＡＧＡＧＡＴＧ－３’（配列番号３３）
５’－ＧＴＴＴＡＡＡＣＴＴＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧＧＣＴＴＴＴＡＣＴＡＡＣＡＣＴＣ－３’（配列番号３４）
次に、１％アガロース電気泳動により目的である約７００ｂｐの断片を分離後、ゲルから切り出し、Ｍａｇ　Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ　－ＰＣＲ＆Ｇｅｌ　Ｃｌｅａｎ　ｕｐ－（ＴＯＹＯＢＯ）により精製し、このＤＮＡ断片をインサートとした。ｐｃＤＮＡ３．１（－）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を制限酵素ＸｂａＩ，　ＨｉｎｄＩＩＩで処理後、１％アガロース電気泳動により目的断片を分離後、ゲルから切り出し、精製し、このＤＮＡ断片をベクターとして、先述のインサートと共にＬｉｇａｔｉｏｎ反応、ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎを行った。Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応は、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ　２．０　Ｄｒｙ－Ｄｏｗｎ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて行った　。Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎは、まず、凍結しているコンピテントセルＪＭ１０９を融解し、その溶液に、上記のＬｉｇａｔｉｏｎ反応後の溶液１０μｌ加え氷上で３０分静置した。その後、ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋを４２℃で４５秒行い、５分氷冷した。この菌体懸濁液に１ｍｌのＬＢ培地を加え、３７℃で１時間振とうさせ、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリン入りのＬＢプレートに播き、３７℃で１４時間培養した。その後、アルカリ法によりＬＢプレート上に培養したコロニーから目的プラスミドが得られた。最後に、アルカリ法にて得られたプラスミド中のｈＴＲＡ－８　軽鎖の塩基配列を決定することで、ｐｃＤＮＡ３．１（－）ｈＴＲＡ－８　軽鎖発現ベクターを構築した。
　（１－２）　ｐｃＤＮＡ３．１（－）ｈＴＲＡ－８　重鎖発現ベクターの構築
　ＤＧＶ　ｈＴＲＡ－８プラスミドを鋳型とし、下記プライマーを用いてＰＣＲ法（９４℃　１５秒、５５℃　３０秒、６８℃　１５０秒×３０ｃｙｃｌｅ）により、ｈＴＲＡ－８　重鎖を増幅した。
５’－ＡＣＣＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＧＡＣＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧ－３’（配列番号３５）
５’－ＡＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＡＧＣＧＧＧＧＣＴＴＧＣＣ－３’（配列番号３６）
次に、（１）と同様に、アガロースゲル電気泳動による目的断片の分離、精製を行った。このＤＮＡ断片とｐｃＤＮＡ３．１（－）を制限酵素ＸｈｏＩ，　ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、その後、アガロースゲル電気泳動による目的断片の分離、精製、Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応、ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、プレートの培養を行い、アルカリ法により目的プラスミドを取得した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応は、ＬｉｇａＦａｓｔTM　Ｒａｐｉｄ　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、プロトコールに準じて行った。最後に、アルカリ法にて得られたプラスミド中のｈＴＲＡ－８　重鎖の塩基配列を決定することで、ｐｃＤＮＡ３．１（－）　ｈＴＲＡ－８　重鎖発現ベクターを構築した。
　（１－３）　ｐｃＤＮＡ３．１（－）を骨格としたｈＴＲＡ－８　軽鎖、重鎖共発現ベクターの構築
　（１－１）で構築したプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（－）　ｈＴＲＡ－８　軽鎖発現ベクターを鋳型とし、下記プライマーを用いてＰＣＲ法（９４℃　１５秒、５５℃　３０秒、６８℃　１２０秒×３０ｃｙｃｌｅ）により、ベクター上のＣＭＶプロモーター、ｈＴＲＡ－８　軽鎖、ｐｏｌｙＡを含むユニットを増幅した。次に、（１－１）と同様に、アガロースゲル電気泳動による目的断片の分離、精製を行った。このＤＮＡ断片と制限酵素ＢｇｌＩＩで消化された（１－２）で構築されたｐｃＤＮＡ３．１（－）　ｈＴＲＡ－８　重鎖発現ベクターとをＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ　２．０　Ｄｒｙ－Ｄｏｗｎ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ＫｉｔによりＬｉｇａｔｉｏｎ反応を行い、ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、プレートの培養、アルカリ法により目的プラスミドを取得した。最後に、アルカリ法にて得られたプラスミド中の目的ユニットを決定することで、ｐｃＤＮＡ３．１（－）を骨格としたｈＴＲＡ－８　軽鎖、重鎖共発現ベクターを構築した。なお、ｈＴＲＡ－８には、一般名としてチガツズマブ（Ｔｉｇａｔｕｚｕｍａｂ）が付与されており、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は公知である。当業者は、これらの公知の配列情報に基づいてｈＴＲＡ－８の遺伝子を常法に従って合成し、得られた遺伝子を適当な発現ベクターにクローニングすることによって、ｈＴＲＡ－８を取得することが可能である。また、合成されたｈＴＲＡ－８遺伝子を使用して本発明の効果を試験することも可能である。
　シャペロンおよび転写因子発現ベクターの構築
　（２－１）　ヒト由来のシャペロンおよび転写因子のクローニング
　ＲＮｅａｓｙ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて２９３細胞から抽出したＲＮＡを鋳型とし、ＲｅｖｅＴｒａＡｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡを鋳型として（２－２）で示したプライマーにより各蛋白質をコードするＤＮＡを増幅し、アガロースゲル電気泳動による目的断片の分離、ＤＮＡ断片の精製を行った。各ＤＮＡ断片はｐｃＤＮＡ３．１　Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ＴＯＰＯにクローニングした。クローニングされたプラスミド中の目的遺伝子の塩基配列を決定することで、目的遺伝子を含むクローンを選抜した。
　（２－２）　シャペロンおよび転写因子の取得時に使用したプライマー
　ＣＨＯＰ遺伝子：
５’－ＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＴＧＡＧＴＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＣ－３’（配列番号３７）
５’－ＴＣＡＴＧＣＴＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＴＣ－３’（配列番号３８）
　ＧＲＰ７８遺伝子：
５’－ＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＴＣＴＣＣＣＴＧＧＴＧＧ－３’（配列番号３９）
５’－ＣＴＡＣＡＡＣＴＣＡＴＣＴＴＴＴＴＣＴＧＣＴＧＴＡＴＣＣ－３’（配列番号４０）
　ＧＲＰ９４遺伝子：
５’－ＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧＧＣＣＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣ－３’（配列番号４１）
５’－ＴＴＡＣＡＡＴＴＣＡＴＣＴＴＴＴＴＣＡＧＣＴＧＴＡＧＡＴＴＣＣＴＴＴＧ－３’（配列番号４２）
　ＰＤＩＡ４遺伝子：
５’－ＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧＣＣＣＣＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＣ－３’（配列番号４３）
５’－ＴＣＡＡＡＧＣＴＣＴＴＣＣＴＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＣＡＧ－３’（配列番号４４）
　ＴＰＭ３遺伝子：
５’－ＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＧＡＧ－３’（配列番号４５）
５’－ＣＴＡＣＡＴＣＴＣＡＴＴＣＡＧＧＴＣＡＡＧＣＡＧＧＧＴＣＴＧ－３’（配列番号４６）
　ＨＳＰ９０β遺伝子：
５’－ＣＡＣＣＡＴＧＣＣＴＧＡＧＧＡＡＧＴＧＣＡＣＣＡＴＧＧ－３’（配列番号４７）
５’－ＣＴＡＡＴＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＣＡＴＧＣＧＡＧＡＣＧ－３’（配列番号４８）
　ＰＨＢ遺伝子：
５’－ＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＣＡＡＡＧＴＧＴＴＴＧＡＧＴＣＣ－３’（配列番号４９）
５’－ＴＣＡＣＴＧＧＧＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧ－３’（配列番号５０）
　ＡＴＰ２Ａ２遺伝子：
５’－ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＣＧＣＧＣＡＣＡＣＣＡＡＧＡＣ－３’（配列番号５１）
５’－ＴＣＡＡＧＡＣＣＡＧＡＡＣＡＴＡＴＣＧＣＴＡＡＡＧＴＴＡＧＴＧＴＣＴ－３’（配列番号５２）
　ＭＣＭ７遺伝子：
５’－ＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＧＣＧＣＴＡＧＡＧ－３’（配列番号５３）
５’－ＴＣＡＧＡＣＡＡＡＡＧＴＧＡＴＣＣＧＴＧＴＣＣＧＧ－３’（配列番号５４）
　ｅＩＦ４Ａ遺伝子：
５’－ＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＣＧＡＧＣＣＡＧＧＡＴＴＣＣＣＧ－３’（配列番号５５）
５’－ＴＣＡＧＡＴＧＡＧＧＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＴＧＡＧＧＧ－３’（配列番号５６）
　Ｐ５ＣＳ遺伝子：
５’－ＣＡＣＣＡＴＧＴＴＧＡＧＴＣＡＡＧＴＴＴＡＣＣＧＣＴＧＴＧＧＧ－３’（配列番号５７）
５’－ＴＣＡＧＴＴＧＧＴＧＴＴＴＣＴＣＴＧＡＧＧＡＡＴＡＧＧＧＡＧ－３’（配列番号５８）
　ＩＬＦ３遺伝子：
５’－ＣＡＣＣＡＴＧＣＧＴＣＣＡＡＴＧＣＧＡＡＴＴＴＴＴＧＴＧ－３’（配列番号５９）
５’－ＴＴＡＴＣＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＴＧＧＴＣＴＧＣ－３’（配列番号６０）
　ＢＡＰ３７遺伝子：
５’－ＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＡＡＣＴＴＧＡＡＧＧＡＣＴＴＧＧ－３’（配列番号６１）
５’－ＴＣＡＴＴＴＣＴＴＡＣＣＣＴＴＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＴＣＡＣ－３’（配列番号６２）
　ＣＡＬＲ遺伝子：
５’－ＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴＡＴＣＣＧＴＧＣＣＧＣＴＧ－３’（配列番号６３）
５’－ＣＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＴＴＧＧＣＣＴＧＧＣ－３’（配列番号６４）
　ヒトＣＨＯＰ遺伝子については、データベースに登録された野生型ＣＨＯＰ遺伝子と比較して、塩基配列レベルで９９％、アミノ酸配列レベルで９７％の相同性を示す変異型遺伝子が取得された。このヒト変異型ＣＨＯＰ遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号６５に記載され、これにコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号６６に記載されている。ヒト野生型ＣＨＯＰとヒト変異型ＣＨＯＰの塩基配列の比較を図３に、アミノ酸配列の比較を図４に示した。
　シャペロンおよび転写因子の抗体発現亢進に対する効果
　シャペロンおよび転写因子の抗体発現亢進に対する効果を確認するため、実施例1の（１－３）で構築された抗体発現ベクターと実施例２で構築されたヒト由来の各蛋白質発現ベクターを細胞に遺伝子導入し、一過的に抗体を発現させ、培養液中に分泌された抗体の量を測るためにＥＬＩＳＡ法を行った。コントロール実験としては、抗体発現ベクターにシャペロン遺伝子を挿入していない空ベクターを加え、ＤＮＡ量をそろえて細胞に遺伝子導入した。宿主細胞はＣＯＳ－１とし、遺伝子導入試薬はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００を用いた。ＣＯＳ－１は１０％ＦＣＳ入りα－ＭＥＭ培地で、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養を行い、ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　４８時間後に培養液を回収し、ＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡは、以下の方法で行った。ａｎｔｉ－ｋａｐｐａ　Ｌｉｇｈｔ　Ｃｈａｉｎを５０ｎｇ／ｗｅｌｌでコーティングした９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに、除細胞した培養上清１００μｌを添加し、３７℃で１時間静置した。次に、サンプル（培養上清）を除き、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）２００μｌで各ｗｅｌｌを洗った後、ＨＲＰ標識されたａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｆｃ）１００μｌをｗｅｌｌに添加し、さらに３７℃で１時間静置した。その後、ＨＲＰ標識されたａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｆｃ）を除き、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で各ｗｅｌｌを洗った後、ＰＯＤ基質Ａ．Ｂ．Ｔ．Ｓ．キット（ｎａｃａｌａｉ）を用いて発色させ、測定波長４０５ｎｍの吸光度を測定した。ａｎｔｉ－ｋａｐｐａ　Ｌｉｇｈｔ　Ｃｈａｉｎ、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｆｃ）およびサンプルの希釈にはＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）を用いた。段階希釈（１２ｎｇ、６ｎｇ、３ｎｇ、１．５ｎｇ、０．７５ｎｇ、０．３７５ｎｇ、０．１８７５ｎｇ）したｈｕｍａｎ　ＩｇＧをスタンダードに、サンプル濃度を産出した。
　結果を図５に示した。変異型ＣＨＯＰ、ＧＰＲ７８、ＧＲＰ９４、ＰＤＩＡ４、ＴＰＭ３、ＨＳＰ９０β、ＰＨＢ、ＡＴＰ２Ａ２、ＭＣＭ７、ｅＩＦ４Ａ、Ｐ５ＣＳ、ＩＬＦ３を抗体と共に発現させることで、２～３倍の抗体発現量亢進効果が確認された。ＢＡＰ３７およびＣＡＬＲについては、抗体発現量亢進効果が観察されなかった。
　各細胞（２９３、ＣＯＳ－１、ＣＨＯ系の細胞）におけるＣＨＯＰの抗体発現亢進効果
　ＣＨＯＰを始めとするシャペロンおよび転写因子の抗体発現亢進効果の普遍性を確認するため、実施例１の（１－３）で構築された抗体発現ベクターと実施例２で構築された変異型ＣＨＯＰ発現ベクターを細胞に遺伝子導入し、一過的に抗体を発現させ、培養液中に分泌された抗体の量を測るためにＥＬＩＳＡ法を行った。コントロール実験としては、抗体発現ベクターにＣＨＯＰ遺伝子を挿入していない空ベクターを加え、ＤＮＡ量をそろえて細胞に遺伝子導入した。宿主細胞はＣＯＳ－１、２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１とし、遺伝子導入試薬はＣＯＳ－１およびＣＨＯ－Ｋ１にはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２９３Ｆ細胞およびＣＨＯ－ＳにはＭＡＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。ＣＯＳ－１は１０％ＦＣＳ入りα－ＭＥＭ培地、ＣＨＯ－ＳはＦｒｅｅ　ｓｔｙｌｅ　ＣＨＯ培地、ＣＨＯ－Ｋ１は１０％ＦＣＳ入りＦ－１２培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で、２９３細胞はＦｒｅｅ　ｓｔｙｌｅ　２９３培地を用いて３７℃、８％ＣＯ２条件下で培養を行い、ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　４８時間後に培養液を回収し、ＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡ操作は、実施例３に記載した方法で行った。
　結果を図６に示した。ヒト変異型ＣＨＯＰは、ＣＯＳ－１、２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１において抗体発現亢進効果が認められ、これらの細胞で普遍的な抗体発現亢進効果が確認された。
　ＣＨＯＰとシャペロンまたはＣＨＯＰと転写因子の組み合わせによる抗体発現亢進効果
　変異型ＣＨＯＰ発現ベクターと他の蛋白質（シャペロンまたは転写因子）発現ベクターを組み合わせて、実施例３と同様に、細胞に遺伝子導入し、培養液中に分泌された抗体量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。ＥＬＩＳＡ操作は、実施例３に記載した方法で行った。
　結果を図７および図８に示した。抗体遺伝子と各遺伝子（シャペロンまたは転写因子）を発現させたときに比べて、変異型ＣＨＯＰと各遺伝子を組み合わせたほうが、どの因子も抗体発現に高い倍率で亢進効果を示していた。変異型ＣＨＯＰと各遺伝子を組み合わせることで、ＧＰＲ７８、ＧＲＰ９４、ＰＤＩＡ４、ＴＰＭ３、ＨＳＰ９０β、ＰＨＢ、ＡＴＰ２Ａ２、ＭＣＭ７、ｅＩＦ４Ａ、Ｐ５ＣＳ、ＩＬＦ３は単独のときに比べて顕著に高い割合で抗体発現亢進効果を示し、コントロールの５倍以上の抗体発現亢進効果が確認された。複数回の実験を繰り返して確認したところ、変異型ＣＨＯＰを、ＧＲＰ９４、ＰＤＩＡ４、ＴＰＭ３、ＨＳＰ９０β、ＰＨＢ、ＡＴＰ２Ａ２、ＭＣＭ７またはｅＩＦ４Ａと組み合わせた場合に比較的強い抗体発現亢進効果が確認された。ＴＰＭ３、ＭＣＭ７またはｅＩＦ４Ａと組み合わせた場合に、さらに強い抗体発現亢進効果が確認された。ＢＡＰ３７およびＣＡＬＲについては、変異型ＣＨＯＰと組み合わせても抗体発現量亢進効果が観察されなかった。
　品質確認
　シャペロンの発現が目的蛋白質（抗体）の品質に影響するかを確認するため、変異型ＣＨＯＰ発現ベクターと抗体発現ベクターをＣＨＯ－Ｓ細胞に遺伝子導入した。コントロール実験としては、抗体発現ベクターにＣＨＯＰ遺伝子を挿入していない空ベクターを加え、ＤＮＡ量をそろえて細胞に遺伝子導入した。ＣＨＯ－Ｓの培養はＦｒｅｅ　ｓｔｙｌｅ　ＣＨＯ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で行い、遺伝子導入６日後に培養上清を回収し、培養液をｐｒｏｔｅｉｎ　Ａカラムによる精製を行った。精製後の蛋白質溶液を用いて、アポトーシス活性測定および抗原結合活性測定を行った。
　アポトーシス活性測定は以下の方法で行った。１０％血清入りＲＰＭＩ１６４０を用い、１μｇ／ｍｌに調整したＧｏａｔ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｏ　Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　Ｆｃ溶液で、精製したｈＴＲＡ－８およびサンプル（ＣＨＯ－Ｓで発現、精製したｈＴＲＡ－８）を段階希釈（２００ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、０．２ｎｇ／ｍｌ）し、５０μｌ／ｗｅｌｌでａｓｓａｙ　ｐｌａｔｅに添加した。このｐｌａｔｅに、１×１０＾３　ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整したＪｕｒｋａｔ細胞を５０μｌ播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で７２時間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で各ｗｅｌｌのＡＴＰ量を測定し、細胞生存率を産出した。尚、Ｊｕｒｋａｔの培養は、１０％血清入りＲＰＭＩ１６４０を用い、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養を行った。結果を図９に示した。アポトーシス活性測定の結果、ＣＨＯＰの有無に関わらず、発現した抗体のアポトーシス活性は一致した。なお、上記の抗体発現ベクターと変異型ＣＨＯＰ発現ベクターを共導入して得られた抗体は、抗体発現ベクターのみを細胞に導入して別途得られた抗体と同等のアポトーシス活性を保持していた（データ示さず）。
　競合ＥＬＩＳＡによる抗原結合活性測定は以下の方法で行った。１倍濃度に調整したＣｏａｔｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（ＳＤＴ）でｈＤＲ５－Ｈｉｓ（ヒトＤＲ５　Ｃ末に６×Ｈｉｓを融合）を希釈し、Ｉｍｍｕｎｏ　ｐｌａｔｅに５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で一晩静置または３７℃で２時間静置した。次に、ｐｌａｔｅをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）　２００μｌで洗い、１％ＢＳＡ入りＰＢＳを１５０μｌ添加し、３７℃で１時間静置した。Ｂｉｏｔｉｎ標識ｈＴＲＡ－８を１％ＢＳＡ入りＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で段階希釈（２００μｇ／ｍｌから順に１０倍希釈）し、また、サンプル（ＣＨＯ－Ｓで発現、精製したｈＴＲＡ－８）も同様に段階希釈し、１％ＢＳＡ入りＰＢＳを除去したｐｌａｔｅにそれぞれ２５μｌ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で２時間または４℃で一晩静置した。その後、サンプルを除去し、各ｗｅｌｌをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）　２００μｌで洗い、１％ＢＳＡ入りＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で５０００倍希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ５０μｌ／ｗｅｌｌを添加し、３７℃で１時間静置した。Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰを除去し、各ｗｅｌｌをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）　２００μｌで洗い、ペルオキシダーゼ用発色キット（ＳＵＭＩＬＯＮ）で発色させ、測定波長４９０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図１０に示した。抗原結合活性測定の結果、ＣＨＯＰの有無に関わらず、発現した抗体の抗原結合活性は一致し、抗原結合活性測定も同等の結果であった。なお、上記の抗体発現ベクターと変異型ＣＨＯＰ発現ベクターを共導入して得られた抗体は、抗体発現ベクターのみを細胞に導入して別途得られた抗体と同等の抗原結合活性を保持していた（データ示さず）。このことから、ＣＨＯＰは外来遺伝子（抗体）の機能に影響することなく、発現量だけを亢進させることが示唆された。
　ヒト変異型ＣＨＯＰとチャイニーズハムスター変異型ＣＨＯＰの示す抗体発現亢進効果の比較
　（７－１）　ＣＨＯ細胞由来チャイニーズハムスターＣＨＯＰのクローニング
　ＲＮｅａｓｙ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＣＨＯ細胞から抽出したＲＮＡを鋳型とし、ＲｅｖｅＴｒａＡｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡを鋳型として（７－２）で示したプライマーにより各蛋白質をコードするＤＮＡを増幅し、アガロースゲル電気泳動による目的断片の分離、ＤＮＡ断片の精製を行った。各ＤＮＡ断片はｐｃＤＮＡ３．１　Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ＴＯＰＯにクローニングした。クローニングされたプラスミド中の目的遺伝子の塩基配列を決定することで、目的遺伝子を含むクローンを選抜した。
　（７－２）　シャペロンおよび転写因子の取得時に使用したプライマー
ＣＨＯＰ遺伝子：
５’－ＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＴＧＡＧＴＣＣＣＴＧＣＣＡＴＴＣＡＣＣ－３’（配列番号６７）
５’－ＴＣＡＴＡＣＴＴＧＴＴＧＣＡＧＡＴＴＴＡＣＡＴＧＣＧＧ－３’（配列番号６８）
　データベースに登録されたチャイニーズハムスター野生型ＣＨＯＰ遺伝子と比較して、塩基配列レベルで９４％、アミノ酸配列レベルで９１％の相同性を示すチャイニーズハムスター変異型ＣＨＯＰ遺伝子が取得された。この変異型ＣＨＯＰ遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号６９に記載され、これにコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番７０に記載されている。チャイニーズハムスターの野生型ＣＨＯＰと変異型ＣＨＯＰの塩基配列の比較を図１１に、アミノ酸配列の比較を図１２に示した。
　（７－３）　ヒト変異型ＣＨＯＰおよびチャイニーズハムスター変異型ＣＨＯＰの示す抗体発現亢進効果の比較
　実施例３と同様に、チャイニーズハムスター変異型ＣＨＯＰ発現ベクターおよびヒト変異型ＣＨＯＰ発現ベクターを、それぞれ抗体発現ベクターと共にＣＯＳ－１細胞に遺伝子導入し、培養液中に分泌された抗体量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。コントロール実験としては、抗体発現ベクターにＣＨＯＰ遺伝子を挿入していない空ベクターを加え、ＤＮＡ量をそろえて細胞に遺伝子導入した。ＥＬＩＳＡ操作は、実施例３に記載した方法で行った。結果を図１３に示した。
　ＣＨＯＰの種によらず、チャイニーズハムスター変異型ＣＨＯＰおよびヒト変異型ＣＨＯＰには高い抗体発現亢進効果が認められた。チャイニーズハムスター変異型ＣＨＯＰとヒト変異型ＣＨＯＰでは塩基配列で８７％相同性があり、アミノ酸配列では８８％の相同性がある。つまり、ヒトＣＨＯＰ遺伝子と８５％以上の相同性があるＣＨＯＰ遺伝子は、種に関係なく、抗体発現亢進効果があることが認められた。
　ヒトの変異型ＣＨＯＰと野生型ＣＨＯＰのの示す抗体発現亢進効果の比較
　ヒト野生型ＣＨＯＰをクローニングするため、実施例２で取得したヒト変異型ＣＨＯＰ遺伝子を鋳型にし、下記プライマーを用いたＰＣＲ（９５℃　１５秒、５０℃　３０秒、７２℃　３０秒×３０ｃｙｃｌｅｓ）により、変異箇所を野生型に戻した。
５’－ＧＡＣＴＡＧＴＡＴＧＧＣＡＧＣＴＧＡＧＴＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＧＧＡＣＡＣＴＧＴＣＡＧＣ－３’（配列番号７１）
５’－ＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＧＣＴＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＴＣ－３’（配列番号７２）
　ヒト野生型ＣＨＯＰをコードするＤＮＡを増幅し、アガロースゲル電気泳動による目的断片の分離、ＤＮＡ断片の精製を行った。さらに、精製したＤＮＡを鋳型にし、実施例２に記載したｈＣＨＯＰ増幅プライマーを用いて、ＰＣＲ（９４℃　１５秒、５５℃　３０秒、６８℃　３０秒×３０ｃｙｃｌｅ）を行った。ヒト野生型ＣＨＯＰをコードするＤＮＡを増幅し、アガロースゲル電気泳動による目的断片の分離、ＤＮＡ断片の精製を行い、各ＤＮＡ断片はｐｃＤＮＡ３．１　Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ＴＯＰＯにクローニングした。クローニングされたプラスミド中の目的遺伝子の塩基配列を決定することで、目的遺伝子を含むクローンを選抜した。
　実施例３と同様に、ヒト変異型ＣＨＯＰ発現ベクター、ヒト野生型ＣＨＯＰ発現ベクター、それぞれを抗体発現ベクターと共にＣＯＳ－１細胞に遺伝子導入し、培養液中に分泌された抗体量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。コントロール実験としては、抗体発現ベクターにＣＨＯＰ遺伝子を挿入していない空ベクターを加え、ＤＮＡ量をそろえて細胞に遺伝子導入した。ＥＬＩＳＡ操作は、実施例３に記載した方法で行った。結果を図１４に示した。
　ヒト変異型ＣＨＯＰおよびヒト野生型ＣＨＯＰは共に抗体発現亢進効果を示していたが、変異型ＣＨＯＰのほうが高い効果を示した。ヒト変異型ＣＨＯＰとヒト野生型ＣＨＯＰでは塩基配列で９９％相同性、アミノ酸配列で９７％相同性があるが、変異の入った場所は転写活性化ドメイン内にあり、変異により抗体発現亢進効果が高くなった可能性が示唆された。
　本発明の分子シャペロン蛋白質をコードするポリヌクレオチドが導入された哺乳動物宿主細胞は、医療用蛋白質又は抗体の高分泌生産系として使用することが可能である。
 

Claims (19)

  1. 　下記の（ａ）乃至（ｃ）からなる群から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞：
    （ａ）配列表の配列番号１、３、５、６５または６９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    （ｂ）配列表の配列番号１、３、５、６５または６９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ外来蛋白質分泌促進活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｃ）配列表の配列番号１、３、５、６５または６９に示す塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ外来蛋白質分泌促進活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
  2. 　下記の（ｄ）乃至（ｆ）からなる群から選択されるいずれかの一つの分子シャペロン蛋白質をコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞：
    （ｄ）配列表の配列番号２、４、６、６６または７０に示すアミノ酸配列からなる蛋白質；
    （ｅ）配列表の配列番号２、４、６、６６または７０に示すアミノ酸配列からなる蛋白質に対して９０％以上の相同性を有し、かつ外来蛋白質分泌促進活性を有する蛋白質；
    （ｆ）配列表の配列番号２、４、６、６６または７０に示すアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ外来蛋白質分泌促進活性を有する蛋白質。
  3. 　下記の（ｉ）乃至（ｉｉｉ）からなる群から選択される一つまたは二つ以上のポリヌクレオチドが導入された請求項１または２に記載の形質転換細胞：
    （ｉ）配列表の配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）配列表の配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ外来蛋白質分泌促進活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｉｉｉ）配列表の配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７に示す塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ外来蛋白質分泌促進活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
  4. 　ポリヌクレオチドが、配列表の配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１及び２３に記載の塩基配列からなる群から選択される一つまたは二つ以上のポリヌクレオチドである、請求項３に記載の形質転換細胞。
  5. 　ポリヌクレオチドが、配列表の配列番号１３、２１及び２３に記載の塩基配列からなる群から選択される一つまたは二つ以上のポリヌクレオチドである、請求項４に記載の形質転換細胞。
  6. 　下記の（ｉｖ）乃至（ｖｉ）からなる群から選択される一つまたは二つ以上の蛋白質をコードするポリヌクレオチドが導入された、請求項１または２に記載の形質転換細胞：
    （ｉｖ）配列表の配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８に示すアミノ酸配列からなる蛋白質；
    （ｖ）配列表の配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８に示すアミノ酸配列からなる蛋白質に対して９０％以上の相同性を有し、かつ外来蛋白質分泌促進活性を有する蛋白質；
    （ｖｉ）配列表の配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８示すアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ外来蛋白質分泌促進活性を有する蛋白質。
  7. 　蛋白質が、配列表の配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４に記載のアミノ酸配列からなる群から選択される一つまたは二つ以上の蛋白質である、請求項６に記載の形質転換細胞。
  8. 　蛋白質が、配列表の配列番号１４、２２及び２４に記載のアミノ酸配列からなる群から選択される一つまたは二つ以上の蛋白質である、請求項７に記載の形質転換細胞。
  9. 　細胞が哺乳動物由来の培養細胞である、請求項１乃至８のいずれか一つに記載の形質転換細胞。
  10. 　哺乳動物由来の培養細胞が、ＣＯＳ－１細胞、２９３細胞、およびＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ　ｄｈｆｒ－、ＣＨＯ－Ｓ等）からなる群から選択されるいずれか一つの細胞である、請求項９に記載の形質転換細胞。
  11. 　外来蛋白質をコードするポリヌクレオチドをさらに導入した、請求項１乃至１０のいずれか一つに記載の形質転換細胞。
  12. 　外来蛋白質が多量体蛋白質である、請求項１１に記載の形質転換細胞。
  13. 　外来蛋白質がヘテロ多量体蛋白質である、請求項１２に記載の形質転換細胞。
  14. 　外来蛋白質が抗体またはその機能性断片である、請求項１３に記載の形質転換細胞。
  15. 　請求項１１乃至１４のいずれか一つに記載の形質転換細胞を培養し、培養物から外来蛋白質を取得することを特徴とする、蛋白質の製造方法。
  16. 　配列表の配列番号６５に記載の塩基配列からなるヒト変異型ＣＨＯＰ蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
  17. 　配列表の配列番号６６に記載のアミノ酸配列からなるヒト変異型ＣＨＯＰ蛋白質。
  18. 　配列表の配列番号６９に記載の塩基配列からなるチャイニーズハムスター変異型ＣＨＯＰ蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
  19. 　配列表の配列番号７０記載のアミノ酸配列からなるチャイニーズハムスター変異型ＣＨＯＰ蛋白質。
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