JP5170931B2 - Ｐｅｇ修飾エリスロポエチン - Google Patents

Description

［技術分野］
本発明は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で化学修飾した天然型ヒトエリスロポエチンに関し、更に詳細には、動物細胞を宿主として製造した組換えヒトエリスロポエチン（ｒｈＥＰＯ）にＰＥＧの反応性誘導体を反応させることにより得られる、５２位のリジン残基にＰＥＧを結合させたモノＰＥＧ修飾エリスロポエチン、これを含有する組成物及びこれらを有効成分として含有する薬効持続性エリスロポエチン製剤に関する。
［背景技術］
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、主に腎臓で産生され、造血組織の前駆細胞に作用して赤血球への分化・増殖を促進する糖鎖に富んだポリペプチドである。現在、ＥＰＯは、遺伝子組換え技術により、動物細胞を宿主として生産される組換えヒトＥＰＯとして市販されており、腎障害に基づくＥＰＯ産生低下による腎性貧血を始め、各種の貧血症に対する治療薬として主として使用されている。
本発明における「天然型ＥＰＯ」とは、人尿から種々の方法で抽出し、分離精製したもの、及びＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞のような動物細胞を宿主として遺伝子組換え技術により製造されるヒト由来のＥＰＯと同様な糖鎖を有する組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）を意味する外、さらに、これらＥＰＯを構成するアミノ酸の１又は２以上を置換、欠失し、又は１又は２以上のアミノ酸を付加したＥＰＯ改変体を含むものとする。
現在使用されているＥＰＯは静脈内、皮下、筋肉内等の経路により投与される。ＥＰＯの活性は、赤血球の前駆体である網状赤血球の赤血球に占める割合を１つの指標として示すことができる。この網状赤血球割合によって観察される天然型ＥＰＯ活性は、上記のいずれの投与経路でも投与後３〜５日目にピークを示し、以後急速に減少する。したがって、貧血症患者において十分な治療効果を維持するためには１週当り２〜３回の頻度で注射によりＥＰＯを投与することが必要とされ、患者に苦痛を与えるばかりでなく、多忙な医師およびその他の医療従事者の作業量を増加させている。更に、一定期間内の投与回数を減少させることで、医療コストの削減も期待される。
一方、例えば、タンパク質又は糖タンパク上の酸化活性可能な官能基であるポリオール、ラクトール、アミン、カルボン酸又はカルボン酸誘導体との化学反応により、共有結合できるヒドラジド又はオキシルアミン部分を有する水溶性高分子（例えば、ＰＥＧ）により修飾されたタンパク質又は糖タンパクが報告されている（例えば、特開平７−１９６９２５号公報）。この報告によれば、水溶性高分子、例えばＰＥＧは、タンパク質又は糖タンパクを構成するアミノ酸又は糖の種々の遊離基に結合して、１分子のタンパク質に対して６〜３４個のＰＥＧ（分子量２０００〜１２０００）をカップリングさせている。このように多数のＰＥＧを結合させるＰＥＧ修飾タンパク質又は糖タンパクではＰＥＧの結合位置、結合個数を制御することが難しく、均一なＰＥＧ修飾タンパク質又は糖タンパクを得ることは困難である。したがって、この方法によって得られるＰＥＧ修飾タンパク質又は糖タンパクを医薬品として製剤化することは問題がある。
また、スルホネートエステル活性化ポリマー、例えば、スルホネートエステル活性化ＰＥＧが開示され、このスルホネートエステル活性化ポリマーと標的物質、例えばタンパク質又は糖タンパクとを反応させて、ポリマー修飾標的物質を製造する方法も提案されている（特表平９−５０４５１５号公報）。このスルホネートエステル活性化ポリマーと反応する標的物質上の反応基としては第一級又は第二級アミノ基、チオール基及び芳香族ヒドロキシル基が包含される。このように、種々の反応基と反応するスルホネートエステル活性化ポリマーは、カップリングで導入される修飾ポリマーの数、結合位置等の制御は困難であると判断される。また、スルフォネートアミドを形成する可能性も明らかにされており、生成物のヘテロジェニティーは一層、高いものとなる。
更に、分枝鎖ポリマー、例えば分枝ＰＥＧを標的物質であるタンパク質又は糖タンパク等に付加して、標的物質の分枝鎖ポリマー複合体を与えることが報告されている（特表平９−５０４２９９号公報）。この分枝ポリマー修飾標的物質も優れた薬効持続性を有するが、さらに高い持続効果を示すポリマー修飾ＥＰＯの開発が望まれていた。
また、修飾させるＰＥＧの分子量が大きい程、高い持続効果が得られるものと考えられていた。
修飾させるＰＥＧの分子量が大きくなるとインビトロの活性は低下する。ところが、ＰＥＧの分子量が大きくなるとそれに依存してインビボでは血漿中滞留性が目覚ましく向上するために活性が持続化して、ＰＥＧの分子量の増大に依存して高い活性と活性の持続効果が得られる（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ；ＰＳＴＴ Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．８，１９９８，３５２−３５６）と考えられていた。例えば、Ｇ−ＣＳＦミューテインのＰＥＧ修飾複合体では、修飾させたＰＥＧの計算上の分子量がおよそ１０ｋＤａから６０数ｋＤａにおいて、インビボの活性がＰＥＧの分子量に比例して上昇する（ＰＣＴ／ＵＳ００／０１２６４，ＷＯ ００／４４７８５）ことが知られている。
従来のＥＰＯのＰＥＧ修飾複合体では分子量が５ｋＤａ程度の比較的分子量が小さいＰＥＧを多数付けることで薬効の持続化を図っていた。しかし、糖鎖に富むＥＰＯにおいては、糖鎖構造に覆われていないレセプター結合に関与する限られたアミノ酸残基が多数修飾部位として使われてしまうため、インビボ活性の低下が避けられず、薬効の持続化とインビボ活性の低下とのバランスが困難であった。また、前述の如く１０ｋＤａ以上のＰＥＧをアミノ基あるいは糖鎖に修飾した例でもＰＥＧの数の制御の問題で、現実に医薬品化を目指すことが困難であった。
［発明の開示］
そこで糖鎖に富む糖タンパクであるＥＰＯの生理活性を損なうことなく、薬効持続性を高めるために、制御された結合位置、結合分子数でＰＥＧを導入し、極めて高い薬効持続性を有するＰＥＧ修飾ＥＰＯの開発が望まれている。
前に述べたように、修飾させるＰＥＧの分子量とインビボ活性の関係については、一般的にＰＥＧの分子量が大きい程、高い血漿中滞留性が得られ、その結果、高い薬効と薬効持続性が得られると考えられていた。しかし、本発明者は糖鎖を有する天然型（組換え）ＥＰＯのＰＥＧ修飾に関しては、この一般論は当てはまらず、修飾させるＰＥＧが極めて高分子量のものではインビボ活性も低下することを明らかにし、このバランスを得るためには、ＰＥＧの分子量は大きい程良いというものではなく、ある一定の範囲の分子量のＰＥＧが有効であることおよび、特定の結合分子数において極めて優れた薬効持続性効果を有することを見出し、本発明を完成した。
本発明者等は、活性エステルを片末端に有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体、例えば、メトキシＰＥＧ−サクシンイミジル低級脂肪酸エステルを組換えヒトＥＰＯに反応させることにより、ＰＥＧ修飾ＥＰＯを製造した。このＰＥＧ修飾ＥＰＯは、ｒｈＥＰＯ１分子当たり１から３分子の直鎖型ＰＥＧが結合した組成物からなる。モノ−メトキシＰＥＧ−ＥＰＯ（ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ）は、ｒｈＥＰＯの主として５２位のリジン残基のアミノ基に直鎖型ＰＥＧが結合しており、ｒｈＥＰＯ１分子当たり、１分子のＰＥＧが結合している。後に詳しく説明するが、本発明者等はまず、初めに、本発明のＰＥＧ修飾ＥＰＯは、天然型未修飾ＥＰＯに比較して顕著に高い薬効持続性を示すことを確認した。
更に、本発明者等は、ＰＥＧ修飾ＥＰＯの分子量の測定に際し、従来より行われているＴｏＦ−ＭＳによる分子量測定の他に、生体内におけるＰＥＧ修飾ＥＰＯの分子の大きさに関わる挙動を予測するために、実施例２で詳細に述べたように水系溶媒によるゲル濾過カラムクロマトグラフィーにて、球状蛋白質を分子量マーカーとして見掛けの分子量を測定した。その結果、驚くべき事に、糖鎖構造に富む天然型ＥＰＯのＰＥＧ修飾複合体は見掛けの分子量が１００ｋＤａを越え、分子量４０ｋＤａのＰＥＧを用いて修飾したＰＥＧ修飾天然型ＥＰＯにおいては、見掛けの分子量がおよそ８００ｋＤａあるいはそれ以上になることを見いだした。天然型ＥＰＯは糖鎖に富むことで限られた露出蛋白質構造部分がレセプターとの結合に関与することが知られていることと、ここで着目した見掛けの分子量の驚くべき大きさから、我々は、天然型ＥＰＯに対するＰＥＧ修飾においては、むしろ、修飾するＰＥＧの分子量および分子数を制御して、薬効最適化を図る必要があると考えた。
そこで、更に、分子量５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ及び３０ｋＤａの直鎖ＰＥＧ１分子が天然型ＥＰＯ１分子に結合したモノ−メトキシＰＥＧ−ＥＰＯ（ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ）、分子量５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ及び３０ｋＤａの直鎖ＰＥＧ２分子が天然型ＥＰＯ１分子に結合したジ−メトキシＰＥＧ−ＥＰＯ（ｄｉ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ）並びに、分子量１０ｋＤａ、２０ｋＤａ及び４０ｋＤａの２分枝型ＰＥＧ１分子が天然型ＥＰＯ１分子に結合したモノ−分枝型メトキシＰＥＧ−ＥＰＯ（ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ２−ＥＰＯ）をそれぞれ調製した。後の実施例の中で詳しく述べているように、これら３種のＰＥＧ修飾ＥＰＯの比較では、血漿中滞留性については、モノ−メトキシＰＥＧ−ＥＰＯに比べ、ジ−メトキシＰＥＧ（ｄｉ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ）とモノ−分枝型メトキシＰＥＧ−ＥＰＯ（ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ２−ＥＰＯ）が優れていたのに対して、インビボの赤血球造血効果ではモノ−メトキシＰＥＧ−ＥＰＯの方が優れていることを明らかにして、天然型ＥＰＯに対して最適なＰＥＧ修飾の範囲が存在するとの前述の本発明者等の考えを立証した。
［発明の実施の形態］
本発明のＰＥＧ修飾ＥＰＯを医薬品化する際には、以上の事柄から、例えば、天然型ＥＰＯの主として５２位のリジン残基のアミノ基にＰＥＧが結合しているモノ−メトキシＰＥＧ−ＥＰＯ（ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ）の高度精製物を用いることが望ましいが、例えば、モノ−メトキシＰＥＧ−ＥＰＯ（ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ）を主成分とし、さらに、ジ−メトキシＰＥＧ−ＥＰＯ（ｄｉ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ）等もその生成反応時に副産物としてできる活性関連物質として含めて製剤化することも可能であると考えられる。
本発明によりＰＥＧ修飾されるＥＰＯは、市場で入手可能な動物細胞を宿主として製造される組換えヒトＥＰＯの外、このＥＰＯを構成するアミノ酸の１又は２以上を置換、欠失し、又は１又は２以上のアミノ酸を付加したＥＰＯ改変体を含むものとする。
本発明において、ＰＥＧ修飾に使用されるＰＥＧ誘導体としては、片末端をメトキシ化したものが使用できる。また、ＥＰＯのアミノ基と反応させるためにメトキシ化されていない片末端をサクシンイミジル低級脂肪酸エステル化したＰＥＧ、好ましくは、サクシンイミジル・プロピオン酸エステル化したＰＥＧ又はサクシンイミジル・酪酸エステル化したＰＥＧ（それぞれ、ＳＰＡ−ＰＥＧ又はＳＢＡ−ＰＥＧ）が使用できる。これらＰＥＧ誘導体は、反応のために活性化した末端以外に主鎖にエステル部分を持たないため安定なＰＥＧ修飾複合体を与えることができる。
天然型ＥＰＯが赤血球前駆細胞のＥＰＯレセプターに結合し、細胞を赤血球に分化させるシグナルを伝えるためには、それに必要な蛋白質構造領域が露出している必要がある。ところが、天然型ＥＰＯは、他の組換え蛋白質医薬品と比べても糖鎖含量が極めて高く、僅かな露出蛋白質部分にレセプターへの結合とシグナル伝達に必要な領域が存在している。従って、露出した限られた蛋白質部分に対する修飾、特に高分子化合物による修飾を行うとＥＰＯ活性を低下させて、薬効持続化医薬品の創出という本来の目的を達成できない可能性が危惧される。
本発明では、上述のような特殊な条件下にある天然型ＥＰＯにおいて、ＥＰＯ活性への影響をレセプターへの結合レベルでは多少与えるものの、インビボにおいては天然型ＥＰＯに勝る薬効とその持続性を得るために、修飾するＰＥＧの望ましい分子量と修飾部位を明らかにして発明を完成させた。
ＰＥＧ修飾される可能性があるアミノ酸残基として、天然型ＥＰＯには、いくつかリジン残基が存在するが、特に５２位のリジン残基のアミノ基がＰＥＧで修飾されたＰＥＧ修飾ＥＰＯが好ましい。本発明には、主として５２位のリジン残基のアミノ基がＰＥＧで修飾されたＰＥＧ修飾ＥＰＯ組成物が態様の一つとして含まれる。
この場合のＰＥＧ修飾ＥＰＯ組成物としては、５２位のリジン残基のアミノ基がＰＥＧで修飾されたモノＰＥＧ修飾ＥＰＯを含有し、他の位置のアミノ酸残基が１分子のＰＥＧで修飾されたモノＰＥＧ修飾ＥＰＯ及び／又は天然型ＥＰＯのアミノ酸残基のうち２残基以上がＰＥＧ修飾されたＰＥＧ修飾ＥＰＯを含有するＰＥＧ修飾ＥＰＯ組成物である。この組成物中に含まれるＰＥＧ修飾ＥＰＯは、好ましくは、ＥＰＯ１分子に対し１から３分子、さらに好ましくはＥＰＯ１分子に対し１分子のＰＥＧで修飾されたＰＥＧ修飾ＥＰＯである。
このＰＥＧ修飾ＥＰＯ組成物中の組成としては、５２位のリジン残基のアミノ基がＰＥＧで修飾されたモノＰＥＧ修飾ＥＰＯと、他の位置のアミノ酸残基が１分子のＰＥＧで修飾されたモノＰＥＧ修飾ＥＰＯ及び／又は天然型ＥＰＯのアミノ酸残基のうち２残基以上がＰＥＧ修飾されたＰＥＧ修飾ＥＰＯの組成物が好ましい。
修飾に使用されるＰＥＧの分子量は、得られるＰＥＧ修飾ＥＰＯに要求される薬効持続効果の程度、ＥＰＯ活性の低下の程度等により適宜変更することができるが、ＰＥＧ１分子の分子量は、５〜４０ｋＤａ、好ましくは、１０〜３０ｋＤａ、さらに好ましくは２０〜３０ｋＤａであり、同じ分子量であれば直鎖ＰＥＧが分枝ＰＥＧに比べて好ましい。ＰＥＧ修飾ＥＰＯの水系溶媒中における見掛けの分子量としては、例えば実施例２に記載の条件におけるゲル濾過カラムクロマトグラフィーによる分子量測定で１００〜９００ｋＤａ，好ましくは、１５０〜６５０ｋＤａ、さらに好ましくは４００〜６５０ｋＤａである。
修飾に使用されるＰＥＧの分子形態は好ましくは直鎖型であるが、ＰＥＧ修飾ＥＰＯの見掛けの分子量が前述の範囲となるようなＰＥＧであれば、分枝型あるいは星型等でも使用可能であり、ＰＥＧ修飾されるアミノ酸残基は前述と同様である。
ＰＥＧ修飾ＥＰＯの精製方法は、ＰＥＧ／デキストラン２相分配、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどが挙げられる。
本発明で得られるＰＥＧ修飾ＥＰＯの生理活性、薬効持続性等について、下記の各項目について未修飾の天然型ＥＰＯ、ジ−メトキシＰＥＧ−ＥＰＯ及びモノ−分枝ＰＥＧ−ＥＰＯを含めてベヒクルとの比較試験を行い、本発明のＰＥＧ修飾ＥＰＯが非修飾の天然型ＥＰＯに比べてインビボで薬効およびその持続性において優れていることが確認された。更に、修飾に用いた直鎖ＰＥＧの分子量が２０〜３０ｋＤａで直鎖ＰＥＧ修飾ＥＰＯ全体の見掛けの分子量が４００〜６５０ｋＤａ（実施例２および９参照）であり、主に５２位のリジン残基のアミノ基がＰＥＧ修飾されたモノ−メトキシＰＥＧ−ＥＰＯは、インビボで極めて優れた薬効およびその持続性を有することが確認された。
更に詳細に述べるとラットを使用した未修飾天然型ＥＰＯ、本発明のＰＥＧ修飾ＥＰＯ尾静脈内単回投与後における未修飾天然型ＥＰＯおよびＰＥＧ修飾ＥＰＯの血漿中滞留性を検討したところ、一般に考えられている通り、修飾に用いたＰＥＧの分子量および分子数が多くＰＥＧ修飾ＥＰＯ全体の見掛けの分子量が大きい程、血漿中滞留性が優れていた。
一方、ＰＥＧ修飾ＥＰＯによるＥＰＯ依存性細胞（ＢａＦ／ＥｐｏＲ細胞）に対するインビトロ増殖活性を測定したところ、本発明のＰＥＧ修飾ＥＰＯは未修飾天然型ＥＰＯに比べてインビトロ増殖活性の低下が観察されたものの、活性を失ってはいなかった。即ち、ＰＥＧ修飾によりレセプターとの結合親和性に影響は生じたものの、レセプターと直接結合する部分を完全には遮蔽していないことが予想される。本発明のＰＥＧ修飾ＥＰＯの中でもモノ−メトキシＰＥＧ−ＥＰＯは、他のＰＥＧ修飾ＥＰＯに比較して明らかに高い活性を示した（実施例４参照）。
更に、ラットを使用したインビボ試験による、未修飾天然型ＥＰＯ、本発明のＰＥＧ修飾ＥＰＯの尾静脈内単回投与後における網状赤血球数及びヘモグロビン値の変化を測定したところ、いずれも本発明のＰＥＧ修飾ＥＰＯが優れた効果を示すことが確認された。一般的なＰＥＧ修飾蛋白質と異なり本発明のＰＥＧ修飾ＥＰＯでは、中でも修飾に用いたＰＥＧの分子量が１０〜３０ｋＤａでＰＥＧ修飾ＥＰＯ全体の見掛けの分子量が１５０〜６５０ｋＤａであり、主に５２位のリジン残基のアミノ基がＰＥＧ修飾されたモノ−メトキシＰＥＧ−ＥＰＯは、網状赤血球数及びヘモグロビン値の測定結果から極めて優れた効果を示すことが確認されている（実施例５および１１参照）。
本発明によるＰＥＧ修飾ＥＰＯ、好ましくはモノ−メトキシＰＥＧ−ＥＰＯを用いることにより、エリスロポエチンの投与間隔が従来より延長され、例えば週２から３回投与を週１回に、週１回投与を１０日から２週間間隔にすることが可能になる。従って、患者の通院回数や痛みを伴う注射の回数を減らすことによる肉体的および時間的負担の軽減さらに、医療従事者の負担の軽減による医療コストの削減が可能になる。
投与量は貧血を引き起こす病因や貧血の程度、年齢等および個々の患者のエリスロポエチンに対する反応性によって適宜調節する必要があることから一義的には決められないが、例えば成人に対する静脈内注射では週１回投与の場合、成人１人当り１〜１００マイクログラム、好ましくは５〜５０マイクログラムとなることが予測される。
本発明によるＰＥＧ修飾ＥＰＯは、静脈内注射、点滴静脈内注射、皮下注射、経粘膜投与（例えば経肺、経鼻など）、経皮投与などの投与経路により患者へ投与することができる。
採用する投与方法にあわせて、溶液製剤、凍結乾燥製剤、プレフィルドシリンジ、無痛針あるいは無針型皮下投与製剤、あるいは皮内埋め込み型の徐放製剤（例えばマイクロカプセル、高分子ミセル、高分子を含むゲル化製剤、リポソームなど）などに製剤化することが可能であり、天然型エリスロポエチンよりも安定な製剤を提供することができる。徐放製剤においては、徐放製剤中のエリスロポエチン活性がＰＥＧ修飾により安定化されること、およびＰＥＧ修飾エリスロポエチンが天然型エリスロポエチンよりも血漿中滞留性が極めて長いことから、天然型エリスロポエチン徐放製剤よりも更に有用である。
以下に実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明を限定する意味に解釈してはならない。
［実施例１］ＰＥＧ修飾ＥＰＯの調製（１）
（ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ及びｄｉ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯの調製）
ｒｈＥＰＯ溶液（ｐＨ８．０、１００ｍＭリン酸緩衝液）にＰＥＧの分子量が約２０ｋＤａのｍｅｔｈｏｘｙＰＥＧ−ＳＰＡ（サクシンイミジルプロピオン酸エステル）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社製）（以下、ｍＰＥＧ−ＳＰＡという）を加え、室温下に３０分間攪拌した。１００ｍＭグリシン溶液を１０％容量添加し、室温下にさらに３０分間攪拌して活性エステルの失活を図った。以上の方法で、４回の反応を行った。各反応時のｒｈＥＰＯ溶液濃度と溶液量、添加したｍＰＥＧ−ＳＰＡのｒｈＥＰＯに対するモル比を表１に示した。各反応液についてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−５０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濃縮しつつ、溶媒をｐＨ７．４、２０ｍＭリン酸緩衝液−１５０ｍＭ ＮａＣｌに置換した。

各濃縮液を、表１に示した反応１ではそのまま、反応２以降では２から４回に分けてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ ＨＲ １０／３０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）によるゲル濾過法で精製し、ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ画分とｄｉ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ画分をそれぞれ回収した。反応２以降では、ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ画分とｄｉ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ画分にまたがり、両者が混合して溶出された画分を別途に回収し再度Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ＨＲ １０／３０にて精製してｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ画分とｄｉ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ画分をそれぞれ回収した。一連の精製によって得られたそれぞれの画分を合わせてｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯを３．８ｍｇ、ｄｉ−ＰＥＧ−ＥＰＯを１．６ｍｇ回収した。回収したｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ及びｄｉ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯをそれぞれ孔径０．２２マイクロｍのＭｉｌｅｘフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）にて無菌的に濾過してｄｉ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯを１．６ｍｇ、ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯを３．８ｍｇ得た。これらの試料（約０．７５ｍｇ／ｍＬ、ゲルの試料溝への添加試料量各１マイクロＬ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動をＰａｓｔＧｅｌ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ４−１５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）にて行い、ＰｈａｓｔＧｅｌ Ｂｌｕｅ Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）にて染色した（図１参照、図中のＥＰＯはｒｈＥＰＯの意））。
なお、ｒｈＥＰＯ及びＰＥＧ修飾ＥＰＯの定量値は波長２７９ｎｍの吸光度を測定し、本実施例においてはｒｈＥＰＯ １ｍｇ／ｍＬ溶液の波長２７９ｎｍにおける吸光度を０．９３（生化学データブック記載値）として算出した。なお、他の実施例では２８１ｎｍにおける吸光度を１．３１として算出した。
［実施例２］ＰＥＧ修飾ＥＰＯの分子量測定（１）
（直鎖ＰＥＧ修飾ＥＰＯの分子量測定）
ｒｈＥＰＯ ０．４９ｍｇ／ｍＬ（ｐＨ８．０ １００ｍＭリン酸緩衝液）９６０マイクロＬにＰＥＧの分子量が約２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＳＰＡ ５．３２ｍｇ（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ／ｒｈＥＰＯ＝１０．２（ｍｏｌ／ｍｏｌ））を加え、室温下に１時間穏やかに攪拌した。１Ｍ Ｇｌｙ溶液１００マイクロＬを加えた後、ＰＢＳ ５００マイクロＬを加えて稀釈、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−５０で３９０マイクロＬまで濃縮した。濃縮液を、２本連結したＳｕｐｅｒｏｓｅ６ ＨＲ １０／３０（１．０ｘ３０ｃｍ、ベッド体積２４ｍＬ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に添加して、ＰＢＳにて溶出させて、ｄｉ−及びｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ画分をそれぞれ分取した。
得られたｄｉ−及びｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ画分をそれぞれＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−５０でＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶媒置換しつつ濃縮した後ＴｏＦ−ＭＳにて、ＭａｔｒｉｘにＳｉｎａｐｉｎｉｃ ａｃｉｄ ４．０５ｍｇ／４０５マイクロＬ ５０％ ＭｅＣＮを用い、測定試料／Ｍａｔｒｉｘを５マイクロＬ／５マイクロＬとしてＢＳＡにてＣａｌｉｂｒａｔｉｏｎして分子量を測定した。
一方でゲル濾過法による分子量測定のため、ＴｏＦ−ＭＳ測定に共した試料溶液（３０−３５マイクロＬ）をＰＢＳ ２００マイクロＬで稀釈し、２本連結したＳｕｐｅｒｏｓｅ６ ＨＲ １０／３０（１．０ｘ３０ｃｍ、ベッド体積２４ｍＬ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に添加して、ＰＢＳにて溶出させて、未処理のｒｈＥＰＯ、ｄｉ−及びｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯそれぞれの溶出時間を測定した。ゲル濾過用分子量Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）から▲１▼Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ：ＭＷ６６９０００、Ａｌｄｏｌａｓｅ：１５８０００、Ｃｈｙｍｏｔｒｉｐｓｉｎｏｇｅｎ Ａ：２５０００、▲２▼Ｆｅｒｒｉｔｉｎ：４４００００、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ：４３０００の混合スタンダード溶液を調製し、同条件下にゲル濾過を行った。各標準品の溶出時間から検量線を作成し、ｒｈＥＰＯ、ｄｉ−及びｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯの分子量を求めた。
（分枝型ＰＥＧ修飾ＥＰＯの調製と分子量測定）
ｒｈＥＰＯ ２．２７ｍｇ／ｍＬ（ｐＨ８．０ １００ｍＭリン酸緩衝液）５００マイクロＬにＰＥＧの分子量が約４０ｋＤａ（２０ｋＤａ×２）のｂｒａｎｃｈｅｄ ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ ５．３２ｍｇ（ｂｒａｎｃｈｅｄ ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ／ｒｈＥＰＯ＝２．９９（ｍｏｌ／ｍｏｌ））を加え、室温下に３０分間穏やかに攪拌した。１Ｍ Ｇｌｙ溶液（ｐＨ８．０ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ）５０マイクロＬを加えた後、更に室温下に３０分間攪拌した。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−５０で溶媒をｐＨ８．０ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌに交換し、終容量を７５０マイクロＬに調整した。これをＲｅｓｏｕｒｓｅ Ｑ １ｍＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いたイオン交換クロマトグラフィーにて溶出液Ａ（ｐＨ８．０、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ）に対して溶出液Ｂ（ｐＨ８．０、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ）の０％から５０％グラジエントで溶出された分枝型ＰＥＧ修飾ＥＰＯを含む画分を分取し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−５０で３７５マイクロＬまで濃縮した。これにＰＢＳ ２５マイクロＬを加え、２本連結したＳｕｐｅｒｏｓｅ６ ＨＲ １０／３０（１．０ｘ３０ｃｍ、ベッド体積２４ｍＬ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に添加して、ＰＢＳにて溶出させて、ｄｉ−ｍＰＥＧ２−ＥＰＯ（ｄｉ−分枝型ｍＰＥＧ−ＥＰＯ）およびｔｒｉ−ｍＰＥＧ２−ＥＰＯ（ｔｒｉ−分枝型ｍＰＥＧ−ＥＰＯ）画分ならびにｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ２−ＥＰＯ（ｍｏｎｏ−分枝型ｍＰＥＧ−ＥＰＯ）画分を分取した。得られた２画分をそれぞれＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−５０でＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶媒置換しつつ濃縮した後ＴｏＦ−ＭＳにて、ＭａｔｒｉｘにＳｉｎａｐｉｎｉｃ ａｃｉｄ ４．０５ｍｇ／４０５マイクロＬ５０％ ＭｅＣＮを用い、測定試料／Ｍａｔｒｉｘを５マイクロＬ／５マイクロＬとしてＢＳＡにてＣａｌｉｂｒａｔｉｏｎして分子量を測定した。
一方でゲル濾過クロマトグラフィー法による分子量測定のため、ＴｏＦ−ＭＳ測定に共した試料溶液をＰＢＳ ２００マイクロＬ（ｄｉ−、ｔｒｉ−）あるいは１５０マイクロＬ（ｍｏｎｏ−）で稀釈し、２本連結したＳｕｐｅｒｏｓｅ６ ＨＲ １０／３０（１．０ｘ３０ｃｍ、ベッド体積２４ｍＬ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に添加して、ＰＢＳにて溶出させて、未処理のｒｈＥＰＯ、ｄｉ−及びｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯそれぞれの溶出時間を測定した。ゲル濾過用分子量Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）から▲１▼Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ：ＭＷ６６９０００、Ａｌｄｏｌａｓｅ：１５８０００、Ｃｈｙｍｏｔｒｉｐｓｉｎｏｇｅｎ Ａ：２５０００、▲２▼Ｆｅｒｒｉｔｉｎ：４４００００、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ：４３０００の混合スタンダード溶液を調製し、同条件下にゲル濾過クロマトグラフィーを行った。各標準品の溶出時間から検量線を作成し、ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ２−ＥＰＯ（ｍｏｎｏ−分枝型ｍＰＥＧ−ＥＰＯ）の分子量を求めた。
ｒｈＥＰＯ、ｄｉ−及びｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ及びｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ２−ＥＰＯ、ｍｏｎｏ−分枝型ｍＰＥＧ−ＥＰＯ）の分子量を表２（表中のＥＰＯはｒｈＥＰＯ、Ｌｉｎｅａｒは直鎖型、Ｂｒａｎｃｈｅｄは分枝型の意）に示した。

［実施例３］ＰＥＧ結合部位の同定
実施例１で製造したＰＥＧ修飾ＥＰＯ（ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ）について、ＰＥＧ結合部位を同定した。
ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ（図２ではＰＥＧ（１）−ＥＰＯと表記）及び非修飾ｒｈＥＰＯ（図２ではｉｎｔａｃｔ ＥＰＯと表記）について、エンドプロテアーゼ Ｌｙｓ−Ｃによる消化後、ＲＰ／Ｃ１８カラムによるペプドチドマッピング（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍａｐｐｉｎｇ）を行った。
（実験方法）
サンプルは、ＰＥＧの分子量が約２０ｋＤａのｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ（７８６マイクロｇ／ｍＬ）及びｒｈＥＰＯ（１ｍｇ／ｍＬ）を使用した。
ａ）還元カルボキシメチル化（ＲＣＭ化）、Ｌｙｓ−Ｃ消化
変性溶液は３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）／６Ｍグアニジン塩酸／６ｍＭ ＥＤＴＡを使用。各種ＥＰＯ５０マイクロｇ相当に対し５倍容量の変性溶液を添加、ＤＴＴを１．５マイクロｍｏｌｅ（Ｃｙｓの５０倍量）加え、室温で一晩変性・還元した。モノヨード酢酸を３．１５マイクロｍｏｌｅ（ＤＴＴの２．１倍量）添加、室温・暗所で４５分反応させカルボキシメチル化した後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に対して透析を行った。Ｌｙｓ−Ｃを１マイクロｇ（基質：酵素比＝５０：１）添加して３７℃で一晩消化し、１０％ＴＦＡを１／１０量添加後、ペプチドマッピングを行った。
ｂ）ペプチドマッピング
カラムはＶｙｄａｃ Ｃ１８（２１８ＴＰ５２、２．１ｍｍ ｘ ２５０ｍｍ）、ＬＣはＳＭＡＲＴ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を使用。流速は１００マイクロＬ／分、検出は２２０、２８０ｎｍ。溶媒とグラジエントは以下の通りである。
・Ａ：０．１％ ＴＦＡ
・Ｂ：９０％ ＭｅＣＮ／０．１％ ＴＦＡ
５％Ｂ／１５分、５−１００％Ｂ／８５分、１００％Ｂ／１０分、
得られたクロマトパターンを図２に示す。
ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ（図２ではＰＥＧ（１）−ＥＰＯと表記）と非修飾ｒｈＥＰＯ（図２ではｉｎｔａｃｔ ＥＰＯと表記）を比較すると、Ｌ４がほぼ消失し、Ｌ３（図２のＬ３＆Ｌ６ピーク）が明らかに減少している。このことからＬ３とＬ４の境目のＬｙｓ５２がＰＥＧ修飾されている可能性が高いと考えられる。またＬ５とＬ４の間に新たなピークが出現しており、これがＰＥＧ修飾ペプチドと考えられる。またＬ４は完全には消失していないこととわずかにＬ１が減少していることから、Ｌ１のＮ末端（Ａｌａ１）がＰＥＧ修飾されている分子種も存在すると考えられる。クロマトパターンから、全体の７０〜８０％がＬｙｓ５２でＰＥＧ修飾されたものと考えられる。
［実施例４］ＰＥＧ修飾ＥＰＯのＥＰＯ依存性細胞に対する
細胞増殖活性の測定（１）
ＥＰＯ依存的に増殖するＢａＦ／ＥｐｏＲ細胞（Ｂｌｏｏｄ、９０、１８６７−、１９９７、ＰＮＡＳ、９３、９４７１−、１９９６）を、２％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩで４回再懸濁と遠心分離を繰り返して洗浄した後に１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩにて１ｘ１０^６細胞／１０ｍＬになるように懸濁し、９６穴プレートに１穴当たり５０マイクロＬずつ添加した。一方、測定試料については、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩを希釈液に用いてＥＰＯ並びに実施例１及び２で製造したｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ、ｄｉ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ、ｍｏｎｏ−分枝型ｍＰＥＧ−ＥＰＯの希釈列をそれぞれ調製して、１穴当たり５０マイクロＬの試料液をｎ＝３であらかじめＢａＦ／ＥｐｏＲ細胞を添加した９６穴プレートに添加して混合し、３７℃、５％ＣＯ_２加湿下で２４時間培養した。各穴に、１穴当たり１０マイクロＬのＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＦ（ナカライテスク社製）を添加して４５０ｎｍと６２０ｎｍの波長で吸光度を測定して０時間の測定値とした。さらに室温で６時間静置して４５０ｎｍと６２０ｎｍの波長で吸光度を測定した結果をグラフ化した（図３参照、図中のｍｏｎｏはｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ、ｄｉはｄｉ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ、ｂｒａｎｃｈｅｄはｍｏｎｏ−分枝型ｍＰＥＧ−ＥＰＯ、ＥｐｏはｒｈＥＰＯの意）。得られた結果について、用量−反応性について直線性がみられる３点を直線回帰し、ＥＤ５０値と９５％信頼区間をＳＡＳを用いて求め、表３（表中のｂｒａｎｃｈｅｄ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯは、ｍｏｎｏ−分枝型ｍＰＥＧ−ＥＰＯを意味する）にまとめた。

［実施例５］ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ、ｄｉ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ及び
ｒｈＥＰＯの薬効持続性の測定
被検物質として、実施例１で製造したｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ（７８６マイクロｇ／ｍＬ：ｒｈＥＰＯ１分子にｍＰＥＧ１分子結合）及びｄｉ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ（６４０マイクロｇ／ｍＬ：ｒｈＥＰＯ１分子にｍＰＥＧ２分子結合）を用いた。これらはいずれもｒｈＥＰＯのアミノ基に片末端活性エステル型ｍＰＥＧ（分子量約２０ｋＤａ）を結合することによりＰＥＧ修飾し、ゲル濾過クロマトグラフィーにて精製したものであった。
投与液溶媒としては、０．０５％ラット血清アルブミン、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水にＰＥＧ修飾ＥＰＯ又はｒｈＥＰＯを１２．５マイクロｇ／ｍＬに希釈した。投与溶媒のみ（ベヒクル）の投与を陰性対照とした。投与液の調製は投与初日に行った。本実施例では、ＳＩｃ：ＳＤ系雄性ラット（日本エスエルシー株式会社）を７週齢にて実験に供した。被検物質投与日に赤血球数が各群ほぼ同じになるよう１群４匹ずつ４群に割り付けた。
ベヒクル投与群、ｒｈＥＰＯ投与群、ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ投与群及びｄｉ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ投与群の４群を設定し、１群４匹とした。投与は２ｍＬ／ｋｇの容量（試料濃度２５マイクロｇ／ｋｇ）で単回尾静脈内投与した。
投与初日、投与後２、４、７、１０、１４、１７、２１、２５、２９、３２、３５、３９日に無麻酔下でラットを保定器に保定し、尾静脈に注射針を刺し、傷口より流出する血液を採取して試料とした。各試料について、網状赤血球数及びヘモグロビン値について測定した。ヘモグロビン値はマイクロセルカウンター（Ｓｙｓｍｅｘ Ｆ−８００、東亜医用電子株式会社製）で測定した。
各測定時点におけるヘモグロビン値及び網状赤血球数について、ベヒクル投与群とｒｈＥＰＯ投与群、ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ投与群及びｄｉ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ投与群の平均値の差の有意性をダンネット（Ｄｕｎｎｅｔｔ）の多重比較法により検定した。有意水準は両側５％とした。
測定の結果は、図４（末梢網状血球数の変化）、図５（ヘモグロビン値）に示した。また、造血促進効果の持続期間については、表４に要約した。

網状赤血球数は、いずれの投与群も投与後２日にベヒクル投与群に比べて有意に増加した。その後、ｒｈＥＰＯ投与群では投与後４日で最大値に達し、投与後７日にはベヒクル投与群より低値にまで低下した。それに対して、ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ投与群では投与後１０日まで、ｄｉ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ投与群では投与後７日までベヒクル投与群に比べて有意に高い値を示した。
ヘモグロビン値は、ｒｈＥＰＯ投与群で投与後４日に最大値に達し、投与後７日にはベヒクル投与群とほぼ同程度の値にまで低下した。それに対して、ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ投与群では投与後１４日に、ｄｉ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ投与群では投与後１０日に最大値に達し、ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ投与群では投与後２５日まで、ｄｉ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ投与群では投与後２１日までベヒクル投与群に比べて有意に高い値を示した。ベヒクル投与群に比べて有意に高値を示した期間は、ｒｈＥＰＯ投与群では投与後４日の１日間であったのに対して、ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ投与群では投与後４〜２５日の２２日間、ｄｉ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ投与群では投与後４〜２１日の１８日間であった（表４）。
［実施例６］ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ、ｍｏｎｏ−分枝型ｍＰＥＧ−ＥＰＯ
及びｒｈＥＰＯの薬効持続性の測定
以下の点を除き、実施例５と同様の比較実験を行った。活性エステルを有する分子量約４０ｋＤａの（ｍｅｔｈｏｘｙＰＥＧ２００００）_２誘導体（ｍＰＥＧ）_２−サクシンイミジル・プロピオン酸エステルとｒｈＥＰＯのアミノ基を反応させることにより作製したｍｏｎｏ−分枝型ＰＥＧ−ＥＰＯ（ｂｒ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ：分枝型ＰＥＧが１分子結合）と活性エステルを有する分子量約２０ｋＤａのｍＰＥＧ誘導体（ｍＰＥＧ−サクシンイミジル・プロピオン酸エステルとｒｈＥＰＯのアミノ基とを反応させることにより作製した直鎖型ｍｏｎｏ−ＰＥＧ−ＥＰＯ（ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ：直鎖型ＰＥＧが１分子結合）をラットに５及び１マイクロｇ／ｋｇの投与量で尾静脈内単回投与した時の赤血球造血に対する効果を比較検討した。被検物質投与日にヘモグロビン値が各群ほぼ同じになるように１群５匹ずつ群分けした。
被検物質は、投与初日、投与後２、４、７、１０、１４、２１、２８、３５日に無麻酔下でラットを保定器に保定し、尾静脈に注射針を刺し、傷口より流出する血液を採取した。
測定の結果は、図６（末梢網状赤血球数の変化）、図７（ヘモグロビン値）に示した。また、造血促進効果の持続期間については、表５に要約した。なお、図６、図７及び表５で表記されているｂｒ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯはｍｏｎｏ−分枝型ｍＰＥＧ−ＥＰＯを指す。

網状赤血球数は、いずれの投与群も投与後２日にベヒクル投与群に比べて有意に増加し、投与後４日に最大値となった。網状赤血球数の最大値を比較すると、ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ ５マイクロｇ／ｋｇ投与群が最も大きな値となっており、ｍｏｎｏ−分枝型ｍＰＥＧ−ＥＰＯ ５マイクロｇ／ｋｇ投与群と、ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ １マイクロｇ／ｋｇ投与群が同程度、ｍｏｎｏ−分枝型ｍＰＥＧ−ＥＰＯ １マイクロｇ／ｋｇ投与群が、最も小さな値となっていた。網状赤血球数が、ベヒクル投与群に比べて有意に高い値を示していた期間は、ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ投与群及びｍｏｎｏ−分枝型ｍＰＥＧ−ＥＰＯ投与群共に、５マイクロｇ／ｋｇ投与群では投与後２〜７日の６日間、１マイクロｇ／ｋｇ投与群では投与後２〜４日の３日間であった（図６）。
ヘモグロビン値は、ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ ５マイクロｇ／ｋｇ投与群で投与後７日に最大値に達し、ベヒクル投与群に対して有意な増加が認められた期間は、投与後２〜１４日の１３日間であった。ｍｏｎｏ−分枝型ｍＰＥＧ−ＥＰＯ ５マイクロｇ／ｋｇ投与群とｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ １マイクロｇ／ｋｇ投与群は、投与後４日に最大値を示し、ベヒクル投与群に対して有意な増加が認められた期間は、それぞれ、投与後４〜１４日の１１日間と投与後７〜１４日の８日間であった。これに対して、ｍｏｎｏ−分枝型ｍＰＥＧ−ＥＰＯ １マイクロｇ／ｋｇ投与群は、実験期間を通じてベヒクル群との有意な差は認められなかった。（図７、表５）。
［実施例７］ｒｈＥＰＯ及びＰＥＧ修飾ＥＰＯの薬効における用量依存性及び
ＰＥＧ修飾ＥＰＯの薬効持続性
実施例１で製造したｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯの２５マイクロｇ／ｋｇ以下の用量における薬効を確認するとともに、その効果をｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯの尾静脈内単回投与と、非修飾ＥＰＯの尾静脈内連続投与とを比較検討する。
（ＰＥＧ修飾ＥＰＯの薬効における用量依存性）
ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯを２５マイクロｇ／ｋｇ、５マイクロｇ／ｋｇ、１マイクロｇ／ｋｇ、０．２マイクロｇ／ｋｇの用量で８週齢の雄性ラット（各群５匹）に尾静脈内単回投与した時の造血効果の経時変化と用量依存性を検討した。
ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯを２５マイクロｇ／ｋｇ、５マイクロｇ／ｋｇ、１マイクロｇ／ｋｇ、０．２マイクロｇ／ｋｇの用量でラットに尾静脈内単回投与した時のヘモグロビン値の変化を図８（図中ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯをＰＥＧ（１）−ＥＰＯと表記）に示した。投与後２８日までの観察では、ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯのヘモグロビン最大値及び薬効持続期間は２５マイクロｇ／ｋｇ投与群と５マイクロｇ／ｋｇ投与群がほぼ同程度と考えられ、１マイクロｇ／ｋｇ投与群、０．２マイクロｇ／ｋｇ投与群では投与量に依存してヘモグロビン最大値及び薬効持続期間が短縮しているものと考えられた。
（ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ尾静脈内単回投与とｒｈＥＰＯ尾静脈内５日間連続投与との薬効の比較）
ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ尾静脈内単回投与とｒｈＥＰＯ尾静脈内５日間連続投与との薬効を比較した。結果を図９（図中ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯをＰＥＧ（１）−ＥＰＯと表記）に示した。ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ ５マイクロｇ／ｋｇ単回投与とＥＰＯ １マイクロｇ／ｋｇ ５日間連続投与（総投与量として５マイクロｇ／ｋｇとなる）とを比較すると、ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ ５マイクロｇ／ｋｇ単回投与群の方がヘモグロビン値の最大値が高く、効果もより持続した。また、ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ １マイクロｇ／ｋｇ単回投与とＥＰＯ ０．２マイクロｇ／ｋｇ５日間連続投与（総投与量として１マイクロｇ／ｋｇとなる）とを比較した場合では、両投与群のヘモグロビン値はほぼ同様の変化を示した。このことから、ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯはｒｈＥＰＯに比べて投与頻度を減らせることが強く示唆された。
［実施例８］ＰＥＧ修飾ＥＰＯの調製（２）
（ｍＰＥＧ５Ｋ−ＥＰＯの調製）
ＥＰＯ２．２７ｍｇ／ｍＬ（ｐＨ８．０ １００ｍＭリン酸緩衝液）１．３ｍＬをｍＰＥＧ５Ｋ−ＳＰＡ３．３８ｍｇ（ＰＥＧ／ＥＰＯ＝４．０９（ｍｏｌ／ｍｏｌ））に加えて溶解させ、室温下に３０分間穏やかに攪拌した。１Ｍ Ｇｌｙ水溶液１３０マイクロＬを加えた後、更に室温下に３０分間攪拌して反応を停止させた。これにＰＢＳ５５０マイクロＬを加えて稀釈し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−５０で３２５マイクロＬまで濃縮した。さらにＰＢＳ１５０マイクロＬを加えた後、２本連結したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ ＨＲ １０／３０によるゲル濾過法で精製し、ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＥＰＯ、ｄｉ−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＥＰＯおよびそれらの混合物を主に含むと考えられた画分として３画分を分取した。それぞれをＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−５０で濃縮した後、同様の条件下に再度ゲル濾過に供し、それぞれからｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＥＰＯおよびｄｉ−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＥＰＯ画分を分取、混合し、ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＥＰＯ ２１０マイクロｇおよびｄｉ−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＥＰＯ２１８マイクロｇを得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより反応生成物と分取試料の分子量の対応を確認した。
（ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＥＰＯ，ｍＰＥＧ１５Ｋ−ＥＰＯ，ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＥＰＯ，ｂｒ−ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＥＰＯ，およびｂｒ−ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＥＰＯの調製）
以下に手順を示すが、反応条件（▲１▼〜▲４▼）の詳細は表６にまとめた。
ＥＰＯ溶液（ｐＨ８．０ １００ｍＭリン酸緩衝液）（濃度▲１▼、溶液量▲２▼）をｍＰＥＧ−ＳＰＡ（直鎖型）あるいはｂｒ−ｍＰＥＧ−ＮＨＳ（分枝型）（溶液量▲３▼）（ＰＥＧ／ＥＰＯ比▲４▼（ｍｏｌ／ｍｏｌ））に加えて溶解させ、室温下に３０分間穏やかに攪拌した。反応に供したＥＰＯ溶液の１／１０量の１Ｍ Ｇｌｙ水溶液を加えた後、更に室温下に３０分間攪拌して反応を停止させた。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−５０を用いて溶媒をｐＨ８．０ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓに置換し、ＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑ１ｍＬを用いたイオン交換クロマトグラフィーにて実施例２と同様の溶出液Ｂの０から１００％グラジエントで溶出されたＰＥＧ修飾ＥＰＯおよびＥＰＯを含む画分をそれぞれ分取し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−５０を用いてＰＢＳに溶媒置換した。各溶液は、ｍＰＥＧ５Ｋ−ＥＰＯの調製に記した条件と同様にゲル濾過に供した。但し、ｍＰＥＧ１５Ｋ−ＥＰＯ、ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＥＰＯ、およびｂｒ−ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＥＰＯの調製においてはカラムを２本連結したＳｕｐｅｒｏｓｅ６ＨＲ １０／３０（１．０ｃｍφ×３０ｃｍ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に代えて行った。それぞれｍＰＥＧまたはｂｒ−ｍＰＥＧが１あるいは２分子ＥＰＯに導入されたと思われる分画を分取、濃縮した。異なるＰＥＧ導入量のｍＰＥＧ−ＥＰＯｓ混合溶出画分は再度濃縮した後にゲル濾過に供し、ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯおよびｄｉ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯを分取した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより反応生成物と分取試料の分子量の対応を確認した。得られた試料の収率は表７の通りであった。

［実施例９］ＰＥＧ修飾ＥＰＯの分子量測定（２）
実施例８（ＰＥＧ修飾ＥＰＯの調製）と同様の方法で得た各種ＰＥＧ修飾ＥＰＯ溶液の溶媒をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−５０を利用してＱ水に置換、濃縮した。実施例２記載の条件と同様にＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ−ＭＳの測定を行った。また、ＴｏＦ−ＭＳ測定に供した試料残渣をＰＢＳで稀釈し、実施例２記載の条件と同様にゲル濾過を行なった。実施例８のｍＰＥＧ１０Ｋ−とｍＰＥＧ１５Ｋ−と同条件下にゲル濾過カラムクロマトグラフィー（ＧＰＣ）に供してその溶出時間を求めた。
但し、ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＥＰＯについては濃縮液を２分し、一方をＴｏＦ−ＭＳ測定、他方をＧＰＣに供した。また、ｂｒ−ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＥＰＯｓおよびｂｒ−ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＥＰＯｓについてはＧＰＣで溶出時間を求めた画分を回収、Ｑ水に溶媒置換してＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ−ＭＳ測定に供した。結果を表８に示した。

［実施例１０］ＰＥＧ修飾ＥＰＯのＥＰＯ依存性細胞に対する細胞増殖活性
の測定（２）
ＥＰＯ依存的に増殖するＢａＦ／ＥｐｏＲ細胞（Ｂｌｏｏｄ、９０、１８６７−、１９９７、ＰＮＡＳ、９３、９４７１−、１９９６）を、１％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩで２回再懸濁と遠心分離を繰り返して洗浄した後に１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩにて１ｘ１０^５細胞／２０ｍＬになるように懸濁し、９６穴プレートに１穴当たり５０マイクロＬずつ添加した。一方、測定試料については、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩを希釈液に用いてＥＰＯ及びｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯの希釈列をそれぞれ調製して、１穴当たり５０マイクロＬの試料液をｎ＝３であらかじめＢａＦ／ＥｐｏＲ細胞を添加した９６穴プレートに添加して混合し、３７℃、５％ＣＯ_２加湿下で２４時間培養した。各穴に、１穴当たり１０マイクロＬのＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＦ（ナカライテスク社製）を添加して４５０ｎｍと６２０ｎｍの波長で吸光度を測定して０時間の測定値とした。さらに室温で５時間静置して４５０ｎｍと６２０ｎｍの波長で吸光度を測定した結果をグラフ化した（図１０および１１参照、図中のｍｏｎｏはｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ、ＥｐｏはｒｈＥＰＯの意）。得られた結果について、用量−反応性について活性値５０％を挟む２点を基に直線回帰し、ＥＤ５０値を求め、表９および１０にまとめた。

［実施例１１］各種分子量のｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯの薬効持続性の測定
投与液溶媒としては、０．０５％ラット血清アルブミン、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水にＰＥＧ修飾ＥＰＯ又はｒｈＥＰＯを２．５マイクロｇ／ｍＬに希釈した。投与溶媒のみ（ベヒクル）の投与を陰性対照とした。投与液の調製は投与初日に行った。本実施例では、Ｓｌｃ：ＳＤ系雄性ラット（日本エスエルシー株式会社）を７〜８週齢にて実験に供した。被検物質投与日に赤血球数が各群ほぼ同じになるよう１群５匹ずつ７群に割り付けた。
ベヒクル投与群、ｒｈＥＰＯ投与群、ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＥＰＯ投与群、ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＥＰＯ投与群、ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ１５Ｋ−ＥＰＯ投与群、ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＥＰＯ投与群、ｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＥＰＯ投与群の７群を設定し、１群５匹とした。投与は２ｍＬ／ｋｇの容量（試料濃度５マイクロｇ／ｋｇ）で単回尾静脈内投与した。
投与初日、投与後２、４、５、７、１０、１５、２１、２９、３５日に無麻酔下でラットを保定器に保定し、尾静脈に注射針を刺し、傷口より流出する血液を採取して試料とした。各試料について、網状赤血球数及びヘモグロビン値について測定した。ヘモグロビン値はマイクロセルカウンター（Ｓｙｓｍｅｘ Ｆ−８００、東亜医用電子株式会社製）で測定した。
さらに、網状赤血球数の増加量と増加期間を反映した薬効評価の指標として、投与後１５日までの網状赤血球数のＡＵＣ（Ｒｅｔｉ−ＡＵＣ）を台形法により算出した。
測定の結果は、図１２（末梢網状赤血球数の変化）、図１３（ヘモグロビン値）、図１４（網状赤血球数のＡＵＣ）に示した。
［産業上の利用可能性］
糖鎖に富む糖タンパクである天然型ＥＰＯの生理活性を損なうことなく、薬効持続性を高めるために、制御された結合位置、結合分子数でＰＥＧを導入して製造された、極めて高い薬効持続性を有するＰＥＧ修飾ＥＰＯが開発された。このＰＥＧ修飾ＥＰＯは、天然型ＥＰＯ本来の造血作用を損なうことなく、高い薬効持続性を有するので、例えば、患者への投与回数を著しく減らすことができ、患者の投与時の苦痛の軽減が達成でき、また通院回数を減らすことで病気の患者の通院にかかる肉体的、時間的負担の軽減が達成でき、更に、極めて多忙で労働条件の厳しい医療従事者すなわち医師や看護婦、薬剤師等の作業とそれにかかる時間の軽減が達成でき、総じて医療コストの削減が達成できる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明方法でＰＥＧ修飾したＥＰＯ（モノ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ）及びジ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ、非修飾ＥＰＯ等のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示した図である。
図２は、本発明のモノ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯをエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃで消化した後、溶液クロマトグラフィーによりマッピングしたクロマトパターンである。
図３は、本発明のモノ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯを含む、ＰＥＧ修飾ＥＰＯのＥＰＯ依存性細胞に対する増殖活性を示すグラフである。
図４は、本発明のモノ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯを含む、ＰＥＧ修飾ＥＰＯ投与による末梢網状赤血球数の変化を示すグラフである。
図５は、本発明のモノ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯを含む、ＰＥＧ修飾ＥＰＯ投与によるヘモグロビン値の変化を示すグラフである。
図６は、本発明のモノ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ及びモノ−分枝型ｍＰＥＧ−ＥＰＯを含む、ＰＥＧ修飾ＥＰＯ投与による末梢網状赤血球数の変化を示すグラフである。
図７は、本発明のモノ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ及びモノ−分枝型ｍＰＥＧ−ＥＰＯを含む、ＰＥＧ修飾ＥＰＯ投与によるヘモグロビン値の変化を示すグラフである。
図８は、本発明のモノ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ（ＰＥＧ（１）−ＥＰＯ）のヘモグロビン値における用量依存性を示すグラフである。
図９は、本発明のモノ−ｍＰＥＧ−ＥＰＯ（ＰＥＧ（１）−ＥＰＯ）単回投与とＥＰＯ ５日間連続投与との比較を示すグラフである。
図１０は、本発明のモノ−ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＥＰＯ、モノ−ｍＰＥＧ１５Ｋ−ＥＰＯ、モノ−ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＥＰＯを含む、ＰＥＧ修飾ＥＰＯのＥＰＯ依存性細胞に対する増殖活性を示すグラフである。
図１１は、本発明のモノ−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＥＰＯ、モノ−ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＥＰＯ、モノ−ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＥＰＯを含む、ＰＥＧ修飾ＥＰＯのＥＰＯ依存性細胞に対する増殖活性を示すグラフである。
図１２は、本発明のモノ−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＥＰＯ、モノ−ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＥＰＯ、モノ−ｍＰＥＧ１５Ｋ−ＥＰＯ、モノ−ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＥＰＯ、モノ−ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＥＰＯを含む、ＰＥＧ修飾ＥＰＯ投与による末梢網状赤血球数の変化を示すグラフである。
図１３は、本発明のモノ−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＥＰＯ、モノ−ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＥＰＯ、モノ−ｍＰＥＧ１５Ｋ−ＥＰＯ、モノ−ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＥＰＯ、モノ−ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＥＰＯを含む、ＰＥＧ修飾ＥＰＯ投与によるヘモグロビン値の変化を示すグラフである。
図１４は、本発明のモノ−ｍＰＥＧ５Ｋ−ＥＰＯ、モノ−ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＥＰＯ、モノ−ｍＰＥＧ１５Ｋ−ＥＰＯ、モノ−ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＥＰＯ、モノ−ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＥＰＯを含む、ＰＥＧ修飾ＥＰＯ投与による末梢網状赤血球数のＡＵＣを示すグラフである。

Claims (4)

1. 天然型ヒトエリスロポエチン（天然型ＥＰＯ）の５２位のリジン残基が分子量２０〜３０ｋＤａの直鎖型ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で化学修飾された、単離されたモノＰＥＧ修飾ＥＰＯであって、モノＰＥＧ修飾ＥＰＯ１分子のゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより測定した水系溶媒中における見掛けの分子量が４００〜６５０ｋＤａである、前記モノＰＥＧ修飾ＥＰＯ。
2. 天然型ヒトエリスロポエチン（天然型ＥＰＯ）の修飾に用いるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の分子量が２０ｋＤａである請求項１に記載のモノＰＥＧ修飾ＥＰＯであって、モノＰＥＧ修飾ＥＰＯ１分子のゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより測定した水系溶媒中における見掛けの分子量が４００ｋＤａである、前記モノＰＥＧ修飾ＥＰＯ。
3. 請求項１又は２に記載のモノＰＥＧ修飾ＥＰＯを有効成分として含有する薬効持続性エリスロポエチン製剤。
4. ＰＥＧがＰＥＧのサクシンイミジルエステル誘導体である、請求項１又は２に記載のモノＰＥＧ修飾ＥＰＯ。

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