JP2001064300A

JP2001064300A - エリスロポエチン誘導体

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Publication number: JP2001064300A
Application number: JP2000201525A
Authority: JP
Inventors: Pascal Sebastian Bailon; セバスチャンバイロンパスカル
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1999-07-02
Filing date: 2000-07-03
Publication date: 2001-03-13
Anticipated expiration: 2020-07-03
Also published as: HU0002553D0; TNSN00147A1; CY2007021I1; NL300289I9; CN1280137A; ITMI20001479A1; ES2289985T3; PL202758B1; TR200001956A2; CZ20002386A3; CY2007021I2; NL300289I1; FR07C0051I2; NO20003372D0; NO20003372L; EP1064951A3; DE60036053D1; LU91363I2; GB0016205D0; PT1064951E

Abstract

(57)【要約】【課題】高いインビボ生体活性を有し、優れた臨床上
の効力が期待できるエリスロポエチン複合体を提供する
ことを課題とする。【解決手段】少なくとも1個の遊離アミノ基を有し、
骨髄細胞において網状赤血球と赤血球の産生を増大させ
るインビボ生体活性を示し、ヒトエリスロポエチンと1
〜6個のグリコシル化部位の付加または少なくとも1個の
グリコシル化部位の転位により修飾されたヒトエリスロ
ポエチン配列を有する該類似体とからなる群より選択さ
れるエリスロポエチン糖蛋白質とポリ（エチレングリコ
ール）との複合体が、未修飾のEPO および従来のPEG-EP
O複合体と比べて、増大した循環血中半減期および血漿
滞留時間、低下したクリアランス、ならびに増大したイ
ンビボ臨床活性を有することを見出した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、エリスロポエチン
誘導体に関する。

【０００２】

【従来の技術】赤血球形成(erythropoiesis)とは、赤血
球(RBC)の産生であり、これは、細胞破壊の相殺を生じ
る。赤血球形成は、適当な組織の酸化に赤血球を十分利
用できるようにする制御された生理的機構である。天然
のヒトエリスロポエチン(hEPO)は腎において生成され、
これは赤血球産生を刺激する液性血漿因子である(Carno
t, PおよびDeflandre, C 、C.R. Acad. Sci.、143:432
(1906)；Erslev, AJ、Blood、8:349(1953)；Reissmann,
KR、Blood、5:372(1950)；Jacobson, LO, Goldwasser,
E, Freid, WおよびPlzak, LF、Nature、179:6331-4(19
57))。天然のEPOは、骨髄における方向づけられた赤血
球系の祖先(committed erythroid progenitor)の分裂お
よび分化を刺激し、かつ赤血球系前駆細胞(erythroid p
recursor)上の受容体に結合することによりその生理活
性を発揮する(Krantz, BS、Blood、77:419(1991))。

【０００３】エリスロポエチンは、組換えDNA技法を用
い生合成的に製造されており(Egrie,JC, Strickland, T
W, Lane, Jら、Immunobiol.、72:213-224(1986))、これ
はチャイニーズハムスター卵巣組織細胞(CHO細胞)中に
挿入されかつ発現されたクローニングされたヒトEPO遺
伝子産物である。hEPOの優勢な完全に処理された形の一
次構造を、配列番号：１に示している。そこには、Cys⁷
-Cys¹⁶¹ およびCys²⁹-Cys³³の間に2個のジスルフィド架
橋がある。EPOポリペプチド鎖の糖部分を除いた分子量
は18,236 Daである。完全なEPO分子においては、分子量
のおよそ40％を、タンパク質のグリコシル化部位におい
てタンパク質をグリコシル化する糖質基が占めている(S
asaki, H, Bothner, B, Dell, AおよびFukuda, M、J. B
iol. Chem.、262:12059(1987))。

【０００４】ヒトのエリスロポエチンは赤血球の形成に
おいて必須であるので、このホルモンは、赤血球産生の
低下または欠損を特徴とする血液疾患の治療において有
用である。臨床的には、EPOは、慢性腎不全患者(CRF)に
おける貧血の治療に使用され(Eschbach, JW, Egri, JC,
Downing, MRら、NEJM、316:73-78(1987)；Eschbach,J
W, Abdulhadi, MH, Browne, JKら、Ann. Intern. Me
d.、111:992(1989)；Egrie, JC, Eschbach, JW, McGuir
e, T, Adamson, JW 、Kidney Intl.、33: 262(1988)；L
im, VS, Degowin, RL, Zavala, Dら、Ann. Intern. Me
d.、110:108-114(1989))、ならびにAIDSおよび化学療法
を受けている癌患者において使用される(Danna, RP, Ru
dnick, SA, Abels, RIの著書、MB, Garnick編、エリス
ロポエチンの臨床応用−内科的展望(Erythropoietin in
Clinical Applications-An International Perspectiv
e)、ニューヨーク:Marcel Dekker；1990年：301-324ペ
ージ)。しかしながら、EPOのような市販のタンパク質療
法の生体利用性は、それらの血漿半減期が短く、プロテ
アーゼによる分解を受けやすいことにより、制限された
ものである。これらの欠点は、これらが最大の臨床上の
効力に到達することを妨げている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
状況に鑑みてなされたものであり、高いインビボ生体活
性を有し、優れた臨床上の効力を示すエリスロポエチン
複合体を提供することを課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を行なった結果、少なくとも1個
の遊離アミノ基を有し、骨髄細胞において網状赤血球お
よび赤血球の産生の増強を引き起こすインビボ生体活性
を示し、かつ、ヒトエリスロポエチンと1から6個のグリ
コシル化部位の付加または少なくとも1個のグリコシル
化部位の転位により修飾されたヒトエリスロポエチン配
列を有するその類似体とからなる群より選択されるエリ
スロポエチン糖タンパク質を含む複合体であって、該糖
タンパク質が、式 -CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR である
「n」ポリ（エチレングリコール）基に共有結合し、各
ポリ（エチレングリコール）基の-CO (すなわちカルボ
ニル)が該アミノ基の1個とアミド結合を形成する複合体
（式中、Rは低級アルキルであり；xは2または3であり；
mは約450〜約900であり；nは1〜3であり；かつ、nおよ
びmは、複合体分子量からエリスロポエチン糖タンパク
質分子量を差し引いたものが20〜100キロダルトンであ
るように選択される）が、未修飾のEPO (すなわち、PEG
が結合していないEPO)および従来のPEG-EPO複合体と比
べて、増大した循環血中半減期および血漿滞留時間、低
下したクリアランス、ならびに増大したインビボ臨床活
性を有することを見出した。この複合体は、EPOと同じ
ように使用することができる。特に、この複合体は、EP
Oが患者の治療に使用されるのと同じ方法で骨髄におい
て方向づけられた赤血球系の先祖の分裂および分化を刺
激することができるため、患者の治療において有用であ
る。本発明の複合体は、より詳しくは、以下のように特
徴付けられるものである。本発明に係る複合体において
は、（１）少なくとも1個の遊離アミノ基を有し、かつ
骨髄細胞において網状赤血球および赤血球の産生の増大
を引き起こすインビボ生体活性を有するエリスロポエチ
ン糖タンパク質を含む結合体であって、ヒトエリスロポ
エチンと、1〜6個のグリコシル化部位の付加または少な
くとも1個のグリコシル化部位の転位によって修飾され
たヒトエリスロポエチン配列を有するその類似体とから
なる群より選択されたものを含む、複合体であって；該
糖タンパク質が、下記式の「n」ポリ（エチレングリコ
ール）基に共有結合し、各ポリ（エチレングリコール）
基の-COが、該アミノ基の1個とアミド結合を形成する複
合体であることを特徴とする：

【式】 -CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR （式中、Rは低級アルキルであり；xは2または3であり；
mは約450〜約900であり；nは1〜3であり；かつ、nおよ
びmは、複合体分子量からエリスロポエチン糖タンパク
質分子量を差し引いたものが20キロダルトンから100キ
ロダルトンであるように選択される）。

【０００７】また、本発明に係る複合体においては、
（２）下記式で表される上記(1)記載の複合体であるこ
とを特徴とする：

【式】 P-[NHCO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR]_n (I) （式中、x、m、nおよびRは上記（1）において定義され
たものであり、かつPは、ポリ（エチレングリコール）
基とアミド結合を形成しているnアミノ基を除いた糖タ
ンパク質残基である）。

【０００８】また、本発明に係る複合体においては、
（３）Rがメチルである、上記(1)または(2)記載の複合
体であることを特徴とする。

【０００９】また、本発明に係る複合体においては、
（４）mが約650〜約750である、上記(1)〜(3)のいずれ
か一項記載の複合体であることを特徴とする。

【００１０】また、本発明に係る複合体においては、
（５）nが1である、上記(1)〜(4)のいずれか一項記載の
複合体であることを特徴とする。

【００１１】また、本発明に係る複合体においては、
（６）Rがメチルであり；mが約650〜約750であり；か
つ、nが1である、上記(1)〜(5)のいずれか一項記載の複
合体であることを特徴とする。

【００１２】また、本発明に係る複合体においては、
（７）下記式で表される上記（1）〜(6)のいずれか一項
記載の複合体であることを特徴とする：

【式】 [CH₃O(CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂CH₂CO-NH]_n-P （式中、mは650〜750であり、nは1であり、かつPは上記
(1)において定義されたものである）。

【００１３】また、本発明に係る複合体においては、
（８）糖タンパク質が、ヒトエリスロポエチンである、
上記(1)〜(7)のいずれか一項記載の複合体であることを
特徴とする。

【００１４】また、本発明に係る複合体においては、
（９）ヒトエリスロポエチン糖タンパク質が、内因性遺
伝子活性化によって発現される、上記(1)〜(7)のいずれ
か一項記載の複合体であることを特徴とする。

【００１５】また、本発明に係る複合体においては、
（１０）糖タンパク質が、配列番号：1の配列を有す
る、上記(1)〜(9)のいずれか一項記載の複合体であるこ
とを特徴とする。

【００１６】また、本発明に係る複合体においては、
（１１）糖タンパク質が、1〜6個のグリコシル化部位の
付加によって修飾されたヒトエリスロポエチン配列を有
する、上記(1)〜(8)のいずれか一項記載の複合体である
ことを特徴とする。

【００１７】また、本発明に係る複合体においては、
（１２）糖タンパク質が、下記からなる群より選択され
た修飾によって修飾されたヒトエリスロポエチン配列を
有する、上記（1）〜(11)のいずれか一項記載の複合体
であることを特徴とする：

【００１８】また、本発明に係る複合体においては、
（１３）糖タンパク質が、ヒトエリスロポエチン配列、
およびヒトエリスロポエチン配列のカルボキシ末端の第
二配列を含む配列を有し、該第二配列が少なくとも1個
のグリコシル化部位を含む、上記(1)〜(12)のいずれか
一項記載の複合体であることを特徴とする。

【００１９】また、本発明に係る複合体においては、
（１４）第二配列が、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのカ
ルボキシ末端配列に由来する配列を含む、上記(13)記載
の複合体であることを特徴とする。

【００２０】また、本発明に係る複合体においては、
（１５）糖タンパク質が、下記からなる群より選択され
る配列を有する、上記(13)記載の複合体であることを特
徴とする： (a)ヒトエリスロポエチン配列およびヒトエリスロポエ
チン配列のカルボキシ末端における配列番号：3の配
列； (b)Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ で修飾された(a)の配列；および (c)Asn³⁰ Thr³² Val⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ で修飾された(a)の
配列。

【００２１】また、本発明に係る複合体においては、
（１６）糖タンパク質が、少なくとも1個のグリコシル
化部位の転位によって修飾されたヒトエリスロポエチン
の配列を有する、上記(1)〜(7)のいずれか一項記載の複
合体であることを特徴とする。

【００２２】また、本発明に係る複合体においては、
（１７）転位が、ヒトエリスロポエチン中のN結合グリ
コシル化部位の欠失とヒトエリスロポエチン配列の88位
でのN結合グリコシル化部位の付加とを含む、上記(16)
記載の複合体であることを特徴とする。

【００２３】また、本発明に係る複合体においては、
（１８）糖タンパク質が、下記からなる群より選択され
る修飾によって修飾されたヒトエリスロポエチン配列を
有する、上記(17)記載の複合体であることを特徴とす
る：Gln²⁴ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ ；Gln³⁸ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Th
r⁹⁰ ；およびGln⁸³ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ 。

【００２４】また、本発明に係る組成物においては、
（１９）複合体を含有する組成物であって、該複合体の
各々が、少なくとも1個の遊離アミノ基を有し、かつ骨
髄細胞において網状赤血球および赤血球の産生の増大を
引き起こすインビボ生体活性を有する、エリスロポエチ
ン糖タンパク質であって、かつヒトエリスロポエチン
と、1〜6個のグリコシル化部位の付加または少なくとも
1個のグリコシル化部位の転位によって修飾されたヒト
エリスロポエチン配列を有するその類似体とからなる群
より選択されたものを含み；該複合体中の各々の糖タン
パク質が、式 -CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR の「n」ポリ
（エチレングリコール）基に共有結合し、各ポリ（エチ
レングリコール）基の-COが、該アミノ基の1個とアミド
結合を形成し；該複合体の各々において、Rは低級アル
キルであり；xは2または3であり；mは約450〜約900であ
り；nは1〜3であり；nおよびmは、複合体分子量からエ
リスロポエチン糖タンパク質分子量を差し引いたものが
20キロダルトンから100キロダルトンであるように選択
され；n が1である複合体の割合が、少なくとも90％で
ある、組成物であることを特徴とする。

【００２５】また、本発明に係る組成物においては、
（２０）n が1である複合体の割合が、少なくとも90％
である、上記(1)〜(18)のいずれか一項記載の複合体を
含有する組成物であることを特徴とする。

【００２６】また、本発明に係る組成物においては、
（２１）n が1である複合体の割合が、少なくとも92％
である、上記(19)または(20)記載の組成物であることを
特徴とする。

【００２７】また、本発明に係る組成物においては、
（２２）n が1である複合体の割合が、少なくとも96％
である、上記(21)記載の組成物であることを特徴とす
る。

【００２８】また、本発明に係る組成物においては、
（２３）n が1である複合体の割合が、90％〜96％であ
る、上記(19)または(20)記載の組成物であることを特徴
とする。

【００２９】また、本発明に係る組成物においては、
（２４）上記(1)〜(23)のいずれか一項記載の複合体ま
たは組成物および薬学的に許容できる賦形剤を含有す
る、薬学的組成物であることを特徴とする。

【００３０】また、本発明に係る使用においては、（２
５）慢性腎不全患者(CRF)の貧血、AIDSに関連した疾患
の治療または予防、および化学療法を受けている癌患者
の治療のための医薬品の製造を目的とする、上記(1)〜
(23)のいずれか一項記載の複合体または組成物の使用で
あることを特徴とする。

【００３１】また、本発明に係る方法においては、（２
６）上記(1)〜(23)のいずれか一項記載の組成物を患者
に投与する工程を含む、慢性腎不全患者(CRF)の貧血、A
IDSおよび化学療法を受けている癌患者に関連した疾患
の予防的および／または治療的処置の方法であることを
特徴とする。

【００３２】また、本発明に係る方法においては、（２
７）下記式の化合物を、エリスロポエチン糖タンパク質
と縮合する工程を含み、式中R、mおよびxは上記(1)〜
(6)のいずれか一項で定義されたものである、上記(1)〜
(23)のいずれか一項記載の化合物の製造法であることを
特徴とする：

【式】

【００３３】また、本発明に係る化合物においては、
（２８）上記(27)記載の方法により製造された、上記
(1)〜(3)のいずれか一項記載の化合物であることを特徴
とする。

【００３４】また、本発明に係る化合物においては、
（２９）慢性腎不全患者(CRF)の貧血、AIDSおよび化学
療法を受けている癌患者に関連した疾患を治療するため
の、上記(1)〜(23)のいずれか一項記載の化合物である
ことを特徴とする。

【００３５】

【発明の実施の形態】本発明は、エリスロポエチン複合
体を提供し、この複合体は、少なくとも1個の遊離アミ
ノ基を有し、かつ骨髄細胞において網状赤血球および赤
血球の産生の増強を引き起こすインビボ生体活性を有す
る、エリスロポエチン糖タンパク質であって、かつヒト
エリスロポエチンと、1から6個のグリコシル化部位の付
加または少なくとも1個のグリコシル化部位の転位によ
り修飾されたヒトエリスロポエチン配列を有するその類
似体とからなる群より選択されたものを含み；該糖タン
パク質が、式 -CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR である「n」
ポリ（エチレングリコール）基に共有結合し、各ポリ
（エチレングリコール）基の-CO (すなわちカルボニル)
が該アミノ基の1個とアミド結合を形成し；式中、Rは低
級アルキルであり；xは2または3であり；mは約450〜約9
00であり；nは1〜3であり；かつ、nおよびmは、複合体
分子量からエリスロポエチン糖タンパク質分子量を差し
引いたものが20〜100キロダルトンであるように選択さ
れる。

【００３６】本発明の複合体は、未修飾のEPOと同じ方
法で使用することができることがわかっている。しかし
本発明の複合体は、増大した循環血中半減期および血漿
滞留時間、低下したクリアランス、ならびに増大したイ
ンビボ臨床活性を有する。これらの改善された特性のた
めに、本発明の複合体は、未修飾EPOを週3回投与する代
わりに、週1回で投与することができる。投与頻度の減
少は患者の服薬遵守の改善をもたらし、これは治療結果
の向上、更には患者の生活の質(QOL)の向上につがるこ
とが期待される。ポリエチレングリコールに連結したEP
Oである従来の複合体と比べて、本発明の複合体の分子
量およびリンカー構造を有する複合体が、改善された効
力、安定性、AUC、循環血中半減期、および良好なコス
トプロフィールを有することはわかっている。

【００３７】本発明の複合体は、EPO投与と同じ方法
で、患者に治療有効量で投与することができる。治療有
効量とは、骨髄細胞において網状赤血球および赤血球の
産生の増大を引き起こすインビボ生体活性に必要な複合
体の量である。複合体の正確な量は、治療される状態の
正確な種類、治療される患者の状態に加え、組成物中の
他の成分のような因子に対する好ましさの問題である。
例として、体重1kgにつき0.01〜10μg、好ましくは体重
1kgにつき0.1〜1μgを、例えば週1回投与することがで
きる。

【００３８】この複合体を含有する薬学的組成物は、赤
血球産生の低下または欠損を特徴とする血液疾患に罹患
したヒト患者に様々な方法で投与される有効強度で製剤
することができる。本複合体の平均治療有効量は変動す
ることができ、かつ特に有資格の医師の推奨および処方
を基にされるべきものである。

【００３９】本発明に従って調製されたエリスロポエチ
ン糖タンパク質生成物は、当該技術分野において公知の
方法により、薬学的に許容できる担体または溶媒と共
に、注射に適した薬学的組成物中に調製することができ
る。例えば適当な組成物は、国際公開公報第97/09996
号、第97/40850号、第98/58660号、および第99/07401号
に開示されている。本発明の製造物の製剤にとってとり
わけ好ましい薬学的に許容できる担体は、ヒト血清アル
ブミン、ヒト血漿タンパク質などである。本発明の化合
物は、例えば132mM塩化ナトリウムのような等張剤を含
有するpH7の10mMナトリウム／カリウムリン酸バッファ
ー中に製剤することができる。任意に、この薬学的組成
物は保存剤を含有することができる。薬学的組成物は、
様々な量のエリスロポエチン、例えば10〜1000μg/ml、
例えば50μgまたは400μgを含むことができる。

【００４０】「エリスロポエチン」または「EPO」の用
語は、(配列番号：1)もしくは(配列番号：2)に記された
アミノ酸配列、またはそれと実質的に相同のアミノ酸配
列を有する糖タンパク質を意味し、それらの生物学的特
性は、赤血球産生の刺激ならびに骨髄における方向づけ
られた赤血球系の先祖の分裂および分化の刺激に関係し
ている。本明細書において使用したように、これらの用
語は、例えば位置指定突然変異により意識的に、もしく
は、突然変異により偶発的に修飾されたこのようなタン
パク質を含む。これらの用語は更に、1〜6個のグリコシ
ル化部位の付加を有する類似体を含み、これは糖タンパ
ク質のカルボキシ末端の端に少なくとも1個の追加のア
ミノ酸を有し、この追加のアミノ酸が少なくとも1個の
グリコシル化部位を有する類似体と、少なくとも1個の
グリコシル化部位の転位を含むアミノ酸配列を有する類
似体とを含む。これらの用語は、天然および組換えによ
り製造されたヒトエリスロポエチンの両方を含む。

【００４１】本発明のエリスロポエチン複合体は、下記
式で表すことができる：

【式】 P-[NHCO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR] _n (I) 式中、x、m、nおよびRは前述のものである。式１におい
て、Pは、本明細書において説明したエリスロポエチン
糖タンパク質の残基(すなわち、アミノ基、または式１
に記されたカルボニルとアミド結合を形成するアミノ基
を除く。）であり、骨髄細胞において網状赤血球および
赤血球の産生の増大を引き起こすインビボ生体活性を有
する。

【００４２】本発明の好ましい態様において、Rはメチ
ルである。好ましくは、mは約650〜約750であり、nは好
ましくは1である。

【００４３】本発明の最も好ましい態様において、Rは
メチルであり、mは約650〜約750であり、nは1であり、
すなわちこの複合体は、下記式で定義される：

【式】 [CH₃O(CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂CH₂CO-NH]_n-P 式中、mは650〜750であり、nは1であり、Pは先に定義さ
れたものである。好ましくはmは平均約680である。

【００４４】先に定義した複合体の糖タンパク質は、ヒ
トエリスロポエチンが好ましい。ヒトエリスロポエチン
および先に定義した類似タンパク質は、内因性遺伝子活
性化によって発現され得る。好ましいヒトエリスロポエ
チン糖タンパク質は、配列番号：１および配列番号：２
のものであり、最も好ましくは配列番号：１のものであ
る。

【００４５】更にPは、ヒトエリスロポエチン残基およ
びグリコシル化部位の付加1〜6個を有するその類似体の
残基からなる群より選択することができる。以下に詳細
に説明するように、EPOの調製および精製は、当該技術
分野において周知である。EPOは、組織のような任意の
一般的供給原料、タンパク質合成、天然または組換え細
胞の細胞培養物などから得られる、好ましくはヒトの、
天然または組換えタンパク質を意味する。EPO活性を有
するいずれかのタンパク質、例えば突然変異タンパク
質、さもなければ修飾されたタンパク質が包含されてい
る。組換えEPOは、組換えDNA技法または内因性遺伝子活
性化により、CHO-、BHK-またはHeLa細胞株における発現
により調製することができる。内因性遺伝子活性化によ
るEPOを含むタンパク質の発現は、当該技術分野におい
て周知であり、例えば米国特許第5,733,761号、第5,64
1,670号、および第5,733,746号、ならびに国際公開公報
第93/09222号、第94/12650号、第95/31560号、第90/113
54号、第91/06667号および第91/09955号に開示されてお
り、それら各々の内容は本明細書に参照として組入れら
れている。エリスロポエチン糖タンパク質生成物の調製
にとって好ましいEPO種は、ヒトEPO種である。より好ま
しいEPO種は、配列番号：１または配列番号：２のアミ
ノ酸配列、より好ましくは配列番号：１のアミノ酸配列
を有するヒトEPOである。

【００４６】ある態様において、Pは、1〜6個のグリコ
シル化部位の付加を有する糖タンパク質類似体の残基で
ある。1個以上のオリゴ糖基による、タンパク質のグリ
コシル化は、ポリペプチド骨格に沿った特定の位置で生
じ、かつタンパク質の安定性、分泌、細胞局在(subcell
ular localization)、生体活性のようなタンパク質の生
理特性に大きく影響を及ぼす。グリコシル化には通常2
種類がある。O-結合オリゴ糖は、セリンまたはトレオニ
ン残基に結合し、かつN-結合オリゴ糖は、アスパラギン
残基に結合する。N-結合およびO-結合オリゴ糖の両方に
おいて認められるある種のオリゴ糖は、N-アセチルノイ
ラミン酸(シアル酸)であり、これは9個以上の炭素原子
を含むアミノ糖ファミリーである。シアル酸は、通常N-
結合およびO-結合オリゴ糖の両方の末端残基であり、こ
れは負電荷を生じるので、糖タンパク質に酸性の特性を
付与する。アミノ酸165個を有するヒトエリスロポエチ
ンは、糖タンパク質の総分子量の約40％を構成している
3個のN-結合オリゴ糖鎖および1個のO-結合オリゴ糖鎖を
含む。N-結合グリコシル化は、24、38および83位に位置
するアスパラギン残基で生じ、O-結合したグリコシル化
は、126位に位置したセリン残基で生じる。これらのオ
リゴ糖鎖は、末端のシアル酸残基によって修飾される。
グリコシル化されたエリスロポエチンからの全てのシア
ル酸残基を酵素的に除去すると、インビボ活性は失われ
るが、インビトロ活性は失なわれず、これはエリスロポ
エチンのシアル化(sialylation)が、肝結合タンパク質
による、その結合およびそれに続くクリアランスを妨げ
るからである。

【００４７】本発明の糖タンパク質は、シアル酸結合部
位の数の増大を生じるような、ヒトエリスロポエチンの
アミノ酸配列に1個以上の変更を伴うヒトエリスロポエ
チン類似体を含む。これらの糖タンパク質類似体は、グ
リコシル化に利用できる部位を増大または変更するよう
な、アミノ酸残基の付加、欠失または置換を有する、位
置指定突然変異によって製造することができる。ヒトエ
リスロポエチンにおいて認められるものよりも多いシア
ル酸レベルを有する糖タンパク質類似体は、生体活性に
必要な二次または三次構造を混乱させることのないグリ
コシル化部位の付加によって製造される。本発明の糖タ
ンパク質は、N-結合部位またはO-結合部位に密に近接し
ている1個以上のアミノ酸の置換に通常含まれる、グリ
コシル化部位での糖質の結合レベルが増大した類似体も
含む。本発明の糖タンパク質はまた、エリスロポエチン
のカルボキシ末端の端から伸び、かつ少なくとも1個の
糖質基の付加部位を提供する、1個以上のアミノ酸を有
する類似体も含む。本発明の糖タンパク質は更に、グリ
コシル化部位の少なくとも1個の転位を含むアミノ酸配
列を有する類似体も含む。このようなグリコシル化部位
の転位は、ヒトエリスロポエチンにおける1個以上のグ
リコシル化部位の欠失および1個以上の天然に生じない
グリコシル化部位の付加に関係している。エリスロポエ
チン上の糖質鎖の数が増し、その結果エリスロポエチン
1分子あたりのシアル酸の数が増すと、溶解度の増大、
タンパク質分解に対するより大きい抵抗性、免疫原性の
低下、血清半減期の延長、および生体活性の増大のよう
な有利な特徴を与える。グリコシル化部位の付加を有す
るエリスロポエチン類似体は、Elliotの、1995年3月1日
に公開された欧州特許出願第640 619号により詳細に開
示されている。

【００４８】好ましい態様において、本発明の糖タンパ
ク質は、例えば下記から選択された修飾により修飾され
たヒトエリスロポエチン配列を含むエリスロポエチンで
あるが、これに限定されるものではない、少なくとも1
個のグリコシル化の付加部位を有するアミノ酸配列を含
んでいる：

【００４９】アミノ酸配列の修飾に関して本明細書で使
用した表記法は、上付き数字によって示された対応する
未修飾のタンパク質（例えば配列番号：１または配列番
号：２のhEPO）の位置が、それぞれの上付き数字のすぐ
前のアミノ酸（複数）によって変更されることを意味す
る。

【００５０】糖タンパク質は、更に糖タンパク質のカル
ボキシ末端の端に少なくとも1個のアミノ酸付加を有す
る類似体であることができ、この付加されたアミノ酸
は、少なくとも1個のグリコシル化部位を含み、すなわ
ち先に定義された複合体は、糖タンパク質が、ヒトエリ
スロポエチン配列、およびヒトエリスロポエチン配列の
カルボキシ末端の第二配列を含む配列であって、この第
二配列が少なくとも1個のグリコシル化部位を含有する
ようなものを含む配列を有する化合物を意味する。付加
されたアミノ酸は、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのカル
ボキシ末端の端に由来するペプチド断片を含むことがで
きる。好ましくは、この糖タンパク質は、(a) アミノ酸
配列、Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu
Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pr
o Ile Leu Pro Gln (配列番号：３)を有し、カルボキシ
末端から伸びている、ヒトエリスロポエチン；(b)更にS
er⁸⁷Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPOを含む(a)の類似体；および、(c)
更にAsn³⁰ Thr³² Val⁸⁷ Asn⁸ ⁸ Thr⁹⁰ EPOを含む(a)の類
似体からなる群より選択された類似体である。

【００５１】前記糖タンパク質は、少なくとも1個のグ
リコシル化部位の転位を含むアミノ酸配列を有する類似
体であることもできる。この転位は、ヒトエリスロポエ
チンのN-結合糖質部位の欠損、およびヒトエリスロポエ
チンのアミノ酸配列の88位でのN-結合糖質部位の付加を
含むことができる。好ましくは、この糖タンパク質は、
Gln²⁴ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO；Gln³⁸ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr
⁹⁰ EPO；および、Gln⁸ ³ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPOからな
る群より選択される類似体であることができる。

【００５２】本明細書において使用される「低級アルキ
ル」は、炭素原子を1〜6個含む直鎖または分枝鎖のアル
キル基を意味する。低級アルキル基の例は、メチル、エ
チルおよびイソプロピルを含む。本発明においては、R
はいずれかの低級アルキルである。Rがメチルである複
合体が好ましい。

【００５３】記号「m」は、ポリ（エチレンオキシド）
基の中のエチレンオキシド残基(OCH₂CH₂)の数を示して
いる。エチレンオキシドである1個のPEGサブユニット
は、分子量約44ダルトンを有する。従って、この複合体
の分子量（EPOの分子量を除く)は、数字「m」によって
決まる。本発明の複合体において「m」は、約450から約
900(分子量約20kDaから約40kDaに相当)であり、好まし
くは約650から約750(分子量約30kDaに相当)である。数
字mは、本発明で得られる複合体が、未修飾EPOに匹敵す
る生理活性を有するように選択され、その活性は、未修
飾EPOの対応する活性と同じ、更にはその一部を示すこ
とができる。「約」特定数の分子量とは、通常の分析法
によって決定される数値の理にかなった範囲内であるこ
とを意味する。数字「m」は、エリスロポエチン糖タン
パク質に共有結合した各ポリ（エチレングリコール）基
の分子量が、約20kDaから約40kDaである、好ましくは約
30kDaであるように選択される。

【００５４】本発明の複合体において、数字「n」は、
エリスロポエチンタンパク質の遊離アミノ基（リシンア
ミノ酸のε−アミノ基および／またはアミノ末端のアミ
ノ基を含む) に、アミド結合を介して共有結合したポリ
（エチレングリコール）基の数である。本発明の複合体
は、EPO 1モルにつき1、2または3個のPEG基を有するこ
とができる。「n」は、1〜3の整数であり、好ましくは
「n」は1または2であり、より好ましくは「n」は1であ
る。

【００５５】式Iの化合物は、下記式IIの化合物をエリ
スロポエチン糖タンパク質と縮合することにより、公知
の高分子材料から調製することができる：

【式】

式中、Rおよびmは先に記したものである。式中xが3であ
る式２の化合物は、α−低級アルコキシ、ポリエチレン
グリコール−酪酸スクシンイミジルエステル(低級アル
コキシ-PEG-SBA)である。式中xは2である式２の化合物
は、α−低級アルコキシ、ポリエチレングリコール−プ
ロピイオン酸スクシンイミジルエステル(低級アルコキ
シ-PEG-SPA)である。活性化されたエステルをアミンと
反応し、アミドを生成する従来の方法を使用することが
できる。前述の反応において、例示されたスクシンイミ
ジルエステルは、アミド生成を引き起こす脱離基であ
る。タンパク質との複合体を生成するための式２の化合
物のようなスクシンイミジルエステルの使用は、1997年
9月30日に公開された米国特許第5,672,662号(Harrisら)
に開示されている。

【００５６】ヒトEPOは、9個の遊離アミノ基、アミノ末
端アミノ基と8個のリシン残基のε-アミノ基とを含んで
いる。PEG化(pegylation)試薬を、式２のSBA化合物と組
合わせた場合、pH7.5で、タンパク質：PEGの比が1：3で
あり、かつ20〜25℃の反応温度で、モノ-、ジ-および微
量のトリ-PEG化された種が生成されることがわかった。
PEG化試薬が式２のSPA化合物である場合、タンパク質：
PEGの比が1：2である以外は同様の条件を用いることに
より、主にモノ-PEG化された種が生成された。PEG化EPO
は、混合物として、または陽イオン交換クロマトグラフ
ィーによって分離された異なるPEG化された種として投
与することができる。反応条件（例えば、試薬の比、p
H、温度、タンパク質濃度、反応時間など）を操作する
ことによって、様々なPEG化された種の相対量を変動す
ることができる。

【００５７】ヒトエリスロポエチン(EPO)は、赤血球の
形成を刺激するヒト糖タンパク質である。その調製およ
び治療適応は、詳細に、例えば米国特許第5,547,933号
および第5,621,080号、欧州特許第EP-B 0 148 605号、H
uang, S.L.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2708-2712(1
984)、欧州特許第EP-B 0 205 564号、第EP-B 0 209 539
号および第EP-B 0 411 678号、更にはLai, P.H.ら、J.
Biol. Chem. 261:3116-3121(1986)、およびSasaki, H.
ら、J. Biol. Chem.262: 12059-12076(1987)に開示され
ている。治療の用途のためのエリスロポエチンは、組換
え法により製造することができる(欧州特許第EP-B 0 14
8 605号、第EP-B 0 209 539号およびEgrie, J.C.、Stri
ckland, T.W.、Lane, J. ら、Immunobiol.72:213-224(1
986))に開示されている。

【００５８】血清を含まない培地におけるエリスロポエ
チンの発現および調製の方法は、例えば1996年11月14日
に公開されたBurgの国際公開公報第96/35718号、および
1992年6月12日に公開されたKochの欧州特許出願第513 7
38号に開示されている。前述の公表物に加えて、EPO 遺
伝子を含む組換えCHO細胞の血清非含有発酵を実行する
ことができることがわかっている。このような方法は、
例えば、欧州特許公開第EP-A 0 513 738号、第EP-A 0 2
67 678号、および一般的な形でKawamoto, T.ら、Analyt
ical Biochem.130:445-453(1983) 、欧州特許公開第EP-
A 0 248 656号、Kowar, J.およびFranek, F.、Methods
in Enzymology 421:277-292(1986)、Bavister, B.、Exp
cology 271:45-51(1981)、欧州特許公開第EP-A 0 481 7
91号、第EP-A 0 307 247号、第EP-A 0 343 635号、国際
公開公報第88/00967号に開示されている。

【００５９】欧州特許公開第EP-A 0 267 678号におい
て、透析後の血清非含有培養中に生成されたEPOの精製
について、S-セファロース上でのイオン交換クロマトグ
ラフィー、C8カラム上での分取逆相HPLCおよびゲルろ過
クロマトグラフィーが開示されている。この組合せにお
いて、ゲルろ過クロマトグラフィー工程は、S-セファロ
ース・ファストフロー上でのイオン交換クロマトグラフ
ィーに置き換えることができる。更に、イオン交換クロ
マトグラフィーの前に、ブルー・トリスアクリル(Blue
Trisacryl)カラム上での色素クロマトグラフィーを行う
ことができることが提唱されている。

【００６０】組換えEPOの精製工程は、Nobuo, I. ら、
J. Biochem.107:352-359(1990)に記されている。しかし
この方法においては、EPOは、精製工程の前に、Tween
（登録商標）20、フェニルメチルスルホニルフルオリ
ド、エチルマレイミド、ペプスタチンA、硫酸銅および
オキサミド酸の溶液によって処理される。Burgの1996年
11月14日に公開された国際公開公報第96/35718号を含む
公開は、血清非含有発酵法によるエリスロポエチン(EPO
sf)の調製法を開示している。

【００６１】本発明のEPOまたはEPO複合体の比活性は、
当該技術分野において公知の様々なアッセイ法により測
定することができる。本発明の精製されたEPOタンパク
質の生体活性は、ヒト患者への注射によるEPOタンパク
質の投与によって、対象の非注射群または対照群と比べ
て、骨髄細胞における網状赤血球および赤血球の産生を
増大を引き起こすようなものである。本発明において得
られかつ精製されたEPOタンパク質、またはそれらの断
片の生体活性は、Annableらの方法（Bull. Wld.Hlth. O
rg.、47:99-112 (1972)およびPharm. Europa Spec. Iss
ue Erythropoetin BRP Bio、1997(2)）に従う方法で試
験することができる。EPOタンパク質の活性を測定する
ための別の生物学的アッセイである、正赤血球性貧血(n
ormocythaemic)マウスアッセイ法については、実施例４
に示した。

【００６２】本発明は、前述の複合体で構成された組成
物を提供する。少なくとも90％のモノ-PEG複合体、すな
わちnが1であるものを含有する組成物は、実施例５に示
したように調製することができる。通常エリスロポエチ
ン糖タンパク質のモノ-PEG複合体が望ましく、その理由
はこれらが、ジ-PEG複合体よりもより高い活性を有する
傾向があるからである。モノ-PEG複合体の割合、更には
モノ-およびジ-PEG種の比は、溶離ピークの周囲の比較
的広い画分をプールし、組成物中のモノ-PEGの割合を小
さくするか、もしくは、比較的狭い画分をプールし、モ
ノ-PEGの割合を増加することによって制御することがで
きる。約90％のモノ-PEG複合体が、収量および活性の釣
り合いが良い。例えば少なくとも92％のまたは少なくと
も96％の複合体がモノ-PEG種(nが1である)であるような
組成物が望ましいことが多い。本発明の態様において、
nが1である複合体の割合は、90％から96％である。

【００６３】本発明は更に、前述の複合体または組成物
および薬学的に許容できる賦形剤を含有する対応する薬
学的組成物に関連している。

【００６４】本発明の複合体および組成物は、特に慢性
腎不全患者(CRF)の貧血、AIDSに関連した疾患の治療ま
たは予防、および化学療法を受けている癌の治療のため
の医薬品の調製において有用である。

【００６５】本発明の別の態様は、前述の組成物を患者
に投与する工程を含む、慢性腎不全患者(CRF)の貧血、A
IDSおよび化学療法を受けている癌患者の予防的および
／または治療的処置の方法に関する。

【００６６】更に、本発明は、下記式２の化合物（R、m
およびxは先に記したもの）とエリスロポエチン糖タン
パク質との縮合を含み、前述のような化合物を調製する
方法に関する：

【００６７】

【式】

【００６８】本発明は更に、慢性腎不全患者(CRF)の貧
血、AIDSおよび化学療法を受けている癌患者に関連した
疾患の治療のための前述の化合物にも関する。

【００６９】本発明は、本明細書に記された発明を例証
するが、限定するものではなく、下記の実施例を参照す
ることにより、より良く理解されると思われる。

【００７０】

【実施例】実施例１：ヒトEPOの発酵および精製 a) 接種材料の調製および発酵 EPO-産生CHO細胞株(欧州特許第EP 411 678号(Genetics
Institute)において開示されたATCC CRL8695を使用する
ことができる)を起源とする、Working Cell Bankの1種
のウイルスを、液体窒素貯蔵タンクの気相から採取し
た。細胞を、ガラス製の回転フラスコに移し、かつ加湿
したC0₂培養装置中の炭酸水素−緩衝した(hydrogen car
bonate-buffered)培地において培養した。接種材料の調
製および発酵のために使用した代表的な血清非含有培地
は、1992年6月12日に公表されたKochの欧州特許出願第5
13 738号または1996年11月14日に公表されたBurgの国際
公開公報第96/35718号に開示されており、例えば、培地
DMEM/F12 (例えば、JRHバイオサイエンス／ハゼルトン
・バイオロジックス社(JRH Biosciences/Hazleton Biol
ogics)、デンバー、米国、注文番号57-736)、および更
に炭酸水素ナトリウム、L+グルタミン、D+グルコース、
組換えインスリン、亜セレン酸ナトリウム、ジアミノブ
タン、ヒドロコルチゾン、硫酸鉄(II)、アスパラギン、
アスパラギン酸、セリンおよび哺乳動物細胞の安定剤、
例えばポリビニルアルコール、メチルセルロース、ポリ
デキストラン、ポリエチレングリコール、プルロッニク
F68、血漿増量剤ポリゲリン(HEMACCEL（登録商標）)ま
たはポリビニルピロリドン(国際公開公報第96/35718号)
を含む。

【００７１】この培養物を、微生物の混入の有無につい
て顕微鏡でチェックし、細胞密度を決定した。これらの
試験は各分離(splitting)工程で行った。

【００７２】最初の増殖期間の後、細胞培養物を、新鮮
な培地で出発時の細胞密度に希釈し、別の増殖サイクル
を施した。この手順を、培養容量がガラス製回転フラス
コ1個につきおよそ2Ｌになるまで繰り返した。およそ12
倍になった後、この培養物1〜5Lを利用し、その後10Lの
接種発酵槽への接種材料として使用した。

【００７３】3〜5日後、10Lの発酵槽中の培養物を、100
L接種発酵槽のための接種材料として用いることができ
た。

【００７４】更に3〜5日間培養し、100Lの発酵槽中の培
養物を、1000Lの生成発酵槽のための接種材料として使
用した。

【００７５】b) 回収および細胞分離バッチ再供給(refeed)法を用い、すなわち、望ましい細
胞密度に到達した時点で培養物の約80%を回収した。残
りの培養物に新鮮な培地を再び満たし、かつ次の回収ま
で培養した。1回の製造の試行は、最大10の連続する回
収からなり：これは、9回の部分回収および最終発酵時
の1回の全回収であった。回収は、3〜4日毎に行った。

【００７６】決定した回収容量を、冷却容器に移した。
細胞を、遠心またはろ過により除去し、かつ廃棄した。
遠心工程のEPO含有上清を、インラインでろ過し、かつ
第二の冷却容器に収集した。各回収物を、精製時に個別
に処理した。

【００７７】EPO-タンパク質の精製の代表的方法は、19
96年11月14日に公表されたBurgの国際公開公報第96/357
18号に開示されている。この精製法を、以下に説明す
る。

【００７８】a) ブルーセファロースクロマトグラフィ
ーブルーセファロース（ファルマシア社）は、表面にシバ
クロンブルー色素が共有結合したセファロースビーズか
らなる。EPOは、ほとんどの非タンパク質性混入物、い
くつかのタンパク質性不純物およびPVAよりも、ブルー
セファロースに強力に結合するので、EPOはこの工程で
濃縮することができる。ブルーセファロースカラムの溶
離は、塩濃度に加えpHを上昇することで行った。

【００７９】カラムにブルーセファロース80〜100Lを充
填し、NaOHで再生し、かつ平衡バッファー(塩化ナトリ
ウム／塩化カルシウムおよび酢酸ナトリウム)で平衡化
した。酸性化され、かつろ過した発酵槽上清を負荷し
た。負荷が完了した後、カラムをまずより高い塩化ナト
リウム濃度を有する平衡バッファーに類似のバッファー
で洗浄し、引き続きTris-ベースバッファーで洗浄し
た。生成物を、Tris-ベースバッファーで溶離し、主要
な溶離プロフィールに従って単一の画分中に回収した。

【００８０】b) ブチルトヨパールクロマトグラフィーブチルトヨパール(Butyl Toyopearl)650 C (TOSOハス
社) は、脂肪族ブチル残基が共有結合したポリスチレン
を主成分にしたマトリックスである。EPOは、このゲル
にほとんどの不純物およびPVAよりもより強力に結合す
るので、これはイソプロパノールを含有するバッファー
で溶離しなければならない。

【００８１】カラムに、ブチルトヨパール650 Cの30〜4
0Lを充填し、 NaOHで再生し、Tris-ベースバッファーで
洗浄し、かつイソプロパノールを含有するTris-ベース
バッファーで平衡化した。

【００８２】ブルーセファロース溶離液を、カラム平衡
化バッファー中のイソプロパノール濃度に調節し、カラ
ムに負荷した。その後、このカラムを、イソプロパノー
ルの濃度を漸増しながら平衡バッファーで洗浄した。生
成物を、溶離バッファー（高イソプロパノール含量のTr
is-ベースバッファー）で溶離し、主要な溶離プロフィ
ールに従って単一の画分中に回収した。

【００８３】c)ヒドロキシアパタイトウルトロゲルクロ
マトグラフィーヒドロキシアパタイトウルトロゲル(バイオスペラ社)
は、力学的特性を向上するためにアガロースマトリック
スに組込まれたヒドロキシアパタイトからなる。EPO
は、ヒドロキシアパタイトに対する親和性が低く、その
結果タンパク質不純物よりもより低いリン酸濃度で溶離
することができる。

【００８４】このカラムにヒドロキシアパタイトウルト
ロゲル30〜40Lを充填し、リン酸カリウム／塩化カルシ
ウムバッファーおよびNaOHで再生し、その後Tris-ベー
スバッファーで再生した。その後、少量のイソプロパノ
ールおよび塩化ナトリウムを含有するTris-ベースバッ
ファーで平衡化した。

【００８５】ブチルトヨパノールクロマトグラフィーの
EPO含有溶離液を、カラムに負荷した。引き続き、カラ
ムを平衡バッファーで洗浄し、イソプロパノールおよび
塩化ナトリウムを含まないTris-ベースバッファーで洗
浄した。生成物を、低濃度のリン酸カリウムを含有する
Tris-ベースバッファーで溶離し、主要な溶離プロフィ
ールに従って単一の画分中に収集した。

【００８６】d)Vydac C4上での逆相HPLC RP-HPLC材料Vydac C4 (Vydac社)は、シリカゲル粒子か
らなり、その表面にC4-アルキル鎖を保持している。タ
ンパク質性不純物からのEPOの分離は、疎水性相互作用
の強度の様々な差を基にしている。溶離は、希釈したト
リフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配を用いて行っ
た。

【００８７】分取HPLCは、ステンレス鋼製のカラム(2.8
〜3.2LのVydac C4シリカゲルを充填した)を用いて行っ
た。ヒドロキシアパタイトウルトロゲルの溶離液を、ト
リフルオロ酢酸を添加することにより酸性とし、Vydac
C4カラムに負荷した。洗浄および溶離のために、希釈し
たトリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配を用いた。
画分を回収し、かつリン酸バッファーで迅速に中和し
た。IPC限界内の EPO画分をプールした。

【００８８】e) DEAEセファロースクロマトグラフィー DEAEセファロース(ファルマシア社)物質は、セファロー
スビーズの表面に共有結合したジメチルアミノエチル(D
EAE)基からなる。EPOのDEAE基への結合は、イオン相互
作用により媒介される。アセトニトリルおよびトリフル
オロ酢酸は、保持されずに、カラムを通過した。これら
の物質を洗浄除去した後、微量の不純物を、カラムを低
pHの酢酸バッファーで洗浄することによって除去した。
その後、カラムを中性リン酸バッファーで洗浄し、かつ
イオン強度を増大したバッファーでEPOを溶離した。

【００８９】カラムにDEAEセファロース・ファストフロ
ーを充填した。カラム容量を、EPO負荷が、3〜10mg EPO
/mlゲルの範囲に確実に納まるように調節した。カラム
を水および平衡バッファー(リン酸ナトリウム／リン酸
カリウム)で洗浄した。HPLC溶離液のプールした画分を
負荷し、カラムを平衡バッファーで洗浄した。その後、
カラムを洗浄バッファー(酢酸ナトリウムバッファー)で
洗浄し、その後平衡バッファーで洗浄した。引き続き、
EPOを、溶離バッファー(塩化ナトリウム、リン酸ナトリ
ウム／リン酸カリウム)でカラムから溶離し、かつ主要
な溶離プロフィールに従って単一の画分中に回収した。

【００９０】DEAEセファロースカラムの溶離液は、特定
の伝導度に調節した。得られる医薬物質は、テフロン
（登録商標）瓶中に滅菌ろ過し、-70℃で保管した。

【００９１】実施例２：mPEG-SBAによるEPOのPEG化実施例１の血清を使用しない方法によって精製されたEP
O(EPOsf)は、分析法により調べたところ均質であり、か
つ8種の異性体からなる典型的アイソフォームパターン
を示していた。これは、正赤血球性貧血マウスアッセイ
法で調べたところ、生体比活性190,000IU/mgを有してい
た。使用したPEG化試薬は、メトキシ-PEG-SBAであり、
これは式２の化合物（式中、Rはメチル；xは3；およびm
は650〜750である(平均約680、これは平均分子量約30kD
aに相当)。）である。

【００９２】PEG化反応 EPOsf 100mg (10.3mg/ml EPOsfストック9.71ml、5.48μ
mol)に、30kDaのメトキシ-PEG-SBA 506mg (16.5μmol)
(シェアウォーター・ポリマー社(ShearwaterPolymers,
Inc.)、ハンツビル、アラバマから入手) を含有する0.1
Mリン酸カリウムバッファー（pH7.5）を10ml添加し、室
温(20〜23℃)で2時間混合した。最終のタンパク質濃度
は5mg/mlであり、かつタンパク質：PEG試薬の比は1：3
であった。2時間後、氷酢酸を使ってpH4.5に調節するこ
とにより反応を停止し、精製に使用するまで-20℃で貯
蔵した。

【００９３】精製 1. 複合体混合物：およそ28mlのSP-SEPHAROSE FF (スル
ホ−プロピル陽イオン交換樹脂)を、AMICONガラスカラ
ム(2.2 x 7.5 cm)に充填し、かつ20mM酢酸バッファー、
pH4.5、流量150ml/時で平衡化した。タンパク質30mgを
含有する反応混合液6 mlを、平衡バッファーで5倍希釈
し、カラムに載せた。吸着されない物質を、該バッファ
ーで流出し、吸着されたPEG複合体の混合物を、平衡バ
ッファーを溶媒とする0.175 M NaClでカラムから溶離し
た。依然カラムに留まっている未修飾のEPOsfは、750mM
NaClで溶離した。カラムは、出発バッファーで再度平
衡化した。試料を、SDS-PAGEで分析し、それらのPEG化
程度を決定した。0.175M NaCl溶離液は、モノ-に加え、
ジ-および微量のトリ-PEG化された種を含む一方で、750
mM NaCl溶離液は未修飾のEPOsfを含むことがわかった。

【００９４】2. ジ-PEGおよびモノ-PEG-EPOsf：先の工
程のカラムから溶離した精製複合体の混合物を、該バッ
ファーで4倍希釈し、カラムに再度載せ、前述のように
洗浄した。ジ-PEG-EPOsfおよびモノ-PEG-EPOsfを、それ
ぞれ、0.1M NaClおよび0.175M NaClを用いてカラムから
個別に溶離した。溶離は、更に750mM NaClで行い、残留
している未修飾のEPOsfを全て溶離した。

【００９５】あるいは、反応混合物を5倍量の酢酸バッ
ファーで希釈し、SP-セファロースカラムに載せた(〜0.
5mgタンパク質／ゲル)。カラムを洗浄し、かつ吸着した
モノ-PEG-EPOsf、ジ-PEG-EPOsfおよび未修飾のEPOsf
を、先の段に記したように溶離した。

【００９６】結果 PEG-EPOsfは、数平均分子量30kDaを有する直鎖のPEG分
子の化学的に複合することによって合成した。PEG-EPOs
fは、EPOsfの1級アミノ基と30kDa PEG-酪酸のスクシン
イミジルエステル誘導体の間で、アミド結合を生じる反
応によって生成した。

【００９７】結果を表１にまとめた。SDS-PAGE 分析に
よると、精製した複合体混合物は、モノ-およびジ-PEG-
EPOsfで構成され、かつ未修飾のEPOsf混合物は含まなか
った。複合体混合物は、23.4mgまたは出発材料の78％に
相当していた。陽イオン交換クロマトグラフィーによる
モノ-およびジ-PEG-EPOsf の分離は、複合体混合物中の
モノ-PEG対ジ-PEGの比がほぼ1：1であることを示した。
反応が完了した後、モノ：ジ：未修飾の個々の成分の比
は、40：38：20(%)であった。全体の収量はほぼ定量的
であった。

【００９８】

【表１】 EPOsf PEG化における結果のまとめ

【００９９】実施例３：mPEG-SPAによるEPOのPEG化実施例２において使用した様々なEPOsfのアリコート
を、30kDa メトキシ-PEG-SPA (シェアウォーター・ポリ
マー社、ハンツビル、アラバマ)と反応させた。反応
は、タンパク質：試薬の比1：2で行い、実施例２の精製
法を行った。主にモノ-PEG化された種が生成した。

【０１００】実施例４：正赤血球性貧血マウスアッセイ
法によって測定したPEG化されたEPOのin-vivo活性正赤血球性貧血マウスのバイオアッセイ法は当該技術分
野において(Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoieti
n BRP Bio 1997(2))、およびPh. Eur. BRP.のエリスロ
ポエチン専門書の方法として公知である。試料を、BSA-
PBSに希釈した。7〜15週齢の通常の健常マウスに、実施
例２または３のPEG化されないEPOまたはトリ-、ジ-もし
くはモノ-PEG化EPOを含有するEPO-画分0.2 mlを皮下(s.
c.)投与した。6日間にわたって、尾静脈の穿刺により採
血し、0.15μmolアクリジンオレンジ染色液1ml中に、血
液1μLが存在するように希釈した。染色時間は3〜10分
とした。フローサイトメーターにおいて赤色蛍光のヒス
トグラムを分析することにより、微量蛍光定量法的に網
状赤血球のカウントを行った。網状赤血球のカウント
は、絶対数(absolute figures) (分析した血球30,000個
あたり)で示した。提示したデータに関して、各群は、
マウス5匹／日からなり、これらのマウスは1回のみ採血
した。

【０１０１】別の実験において、未修飾のEPO(EPO 25n
g)、実施例２のPEG(SBA)-EPO混合物(複合体10ng)、実施
例２のモノ-およびジ-PEG化EPO(複合体10ng)、実施例３
のPEG(SPA)-EPO(複合体10ng)およびバッファー溶液の単
回用量を、マウスに投与した。結果を表２に示した。こ
の結果は、未修飾EPOの25ng用量と比較し、マウス当た
り同じ用量(10ng)を使用した場合に、網状赤血球量の顕
著な増加および最大網状赤血球カウントのシフトによっ
て示されるように、PEG化されたEPO種が優れた活性を持
ち、半減期が延長されることを示した。

【０１０２】

【表２】

【０１０３】実施例５：優勢なモノ-PEG-EPOの調製 PEG化反応 100mMリン酸カリウムバッファー（pH7.5）中のEPOsf 10
0mg(5.48μmol)の出発物質を実施例１に従って調製し、
1mM HCl 3mlに溶解した30kDa PEG-SBA試薬329mg(10.96
μmol)を添加した。十分量の100mMリン酸カリウムバッ
ファー（pH7.5）を添加し、反応混合液の容量を20mlと
した。最終のタンパク質濃度は5mg/mlであり、かつタン
パク質：PEG試薬の比は1：2であった。この反応混合液
を周囲温度(20〜22℃)で2時間混合した。2時間後、氷酢
酸をpH4.5になるまで添加し反応を停止し、精製に使用
するまで-20℃で凍結保存した。

【０１０４】精製先の工程の反応混合液を、10mM酢酸ナトリウム（pH4.
5）で1：5に希釈し、4.2x 19cm カラムに充填した300ml
のSP-セファロースFF（スルホプロピル陽イオン交換樹
脂）に載せた。カラムは、あらかじめ同じバッファーで
平衡化した。カラムの溶離液を、Gilson UV モニターを
使い、280nmでモニタリングし、Kipp andZonen記録計で
記録した。カラムを、300mlまたは1床容量の平衡バッフ
ァーで洗浄し、過剰な試薬、反応副産物およびオリゴマ
ーPEG-EPOを除去した。引き続き、100mM NaCl 2床容量
で洗浄し、ジ-PEG-EPOを除去した。その後モノ-PEG-EPO
を200mM NaClで溶離した。モノ-PEG-EPOの溶離時には、
タンパク質の最初のピーク50mlを廃棄し、モノ-PEG-EPO
を150ml画分として回収した。カラムに残留している未
修飾EPOsfは、750mM NaClで溶離した。全ての溶離バッ
ファーは、平衡バッファーを溶媒として調製した。全て
の溶離した試料は、SDS-PAGE、および高速サイズ排除ク
ロマトグラフィー(SEC)により分析した。150ml 画分か
ら得たモノ-PEG-EPOプールには、未修飾EPOsfは検出さ
れず、これを次に〜4.5〜7.5mg/mlに濃縮し、かつ貯蔵
バッファー、10mMリン酸カリウム、100mM NaCl（pH7.
5）に対しダイアフィルトレーションした。濃縮／ダイ
アフィルトレーションは、50 kDaでカットするミリポア
社のPellicon XL Biomax 50膜を装着したミリポア社のL
abscale（登録商標）TFFシステムを用い、周囲温度で行
った。濃縮したモノ-PEG-EPOを滅菌ろ過し、-20℃で凍
結保存した。

【０１０５】EPOsf のおよそ75％がPEG化された。精製
後の総収率は、モノ-PEG-EPOが〜30％で、未修飾のEPOs
f は検出されず、かつジ-PEG-EPOは約25％であった。残
りのタンパク質は、オリゴマーおよびPEG化されないEPO
sfが占めた。150ml画分から得たモノ-PEG-EPOのプール
は、モノ-PEG-EPOがおよそ90％であり、ジ-PEG-EPOがお
よそ10％であった。

【０１０６】

【発明の効果】本発明により、少なくとも1個の遊離ア
ミノ基を有し、かつ骨髄細胞において網状赤血球および
赤血球の産生の増大を引き起こすインビボ生体活性を有
するエリスロポエチン糖タンパク質であって、かつヒト
エリスロポエチン、および1〜6個のグリコシル化部位の
付加または少なくとも1個のグリコシル部位の転位によ
り修飾されたヒトエリスロポエチン配列を有するその類
似体からなる群より選択されたものを含む、エリスロポ
エチンのポリエチレングリコールとの複合体であり；該
糖タンパク質が、式 -CO-(CH₂)_x(OCH₂CH₂)_m-OR の「n」
ポリ（エチレングリコール）基に共有結合し、各ポリ
（エチレングリコール）基のカルボニルが該アミノ基の
1個とアミド結合を形成し；式中、R は低級アルキルで
あり；xは2または3であり；mは約450〜約900であり；n
は1〜3であり；ならびに、nおよびmは、複合体分子量か
らエリスロポエチン糖タンパク質分子量を差し引いたも
のが20キロダルトンから100キロダルトンになるように
選択されるものである複合体が提供された。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> F.Hoffmann-La Roche AG <120> Erythropoietin Conjugates <130> RC-A0011 <150> US 60/142,254 <151> 1999-07-02 <150> US 60/150,225 <151> 1999-08-23 <150> US 60/151,548 <151> 1999-08-31 <150> US 60/166,151 <151> 1999-11-17 <160> 3 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp 165 <210> 2 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 3 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg 1 5 10 15 Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln 20 25

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 1/107 Ｃ０７Ｋ 1/107 14/59 14/59 19/00 19/00 Ａ６１Ｋ 37/24 (31)優先権主張番号６０／１６６１５１ (32)優先日平成11年11月17日(1999．11．17) (33)優先権主張国米国（ＵＳ）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも1個の遊離アミノ基を有し、
かつ骨髄細胞において網状赤血球および赤血球の産生の
増大を引き起こすインビボ生体活性を有するエリスロポ
エチン糖タンパク質であって、かつ、ヒトエリスロポエ
チンと、1〜6個のグリコシル化部位の付加または少なく
とも1個のグリコシル化部位の転位によって修飾された
ヒトエリスロポエチン配列を有するその類似体とからな
る群より選択されたものを含む、複合体であって；該糖
タンパク質が、下記式の「n」ポリ（エチレングリコー
ル）基に共有結合し、各ポリ（エチレングリコール）基
の-COが、該アミノ基の1個とアミド結合を形成する複合
体：【式】 -CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR 式中、Rは低級アルキルであり；xは2または3であり；m
は約450〜約900であり；nは1〜3であり；かつ、nおよび
mは、複合体分子量からエリスロポエチン糖タンパク質
分子量を差し引いたものが20キロダルトンから100キロ
ダルトンであるように選択される。
【請求項２】下記式で表される請求項１記載の複合
体：【式】 P-[NHCO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR]_n (I) 式中、x、m、nおよびRは請求項１において定義されたも
のであり、かつPは、ポリ（エチレングリコール）基と
アミド結合を形成しているnアミノ基を除いた糖タンパ
ク質残基である。
【請求項３】 Rがメチルである、請求項１または２記
載の複合体。
【請求項４】 mが約650〜約750である、請求項１〜３
のいずれか一項記載の複合体。
【請求項５】 nが1である、請求項１〜４のいずれか一
項記載の複合体。
【請求項６】 Rがメチルであり；mが約650〜約750であ
り；かつ、nが1である、請求項１〜５のいずれか一項記
載の複合体。
【請求項７】下記式で表される請求項１〜６のいずれ
か一項記載の複合体：【式】 [CH₃O(CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂CH₂CO-NH]_n-P 式中、mは650〜750であり、nは1であり、かつPは請求項
１において定義されたものである。
【請求項８】糖タンパク質が、ヒトエリスロポエチン
である、請求項１〜７のいずれか一項記載の複合体。
【請求項９】ヒトエリスロポエチン糖タンパク質が、
内因性遺伝子活性化によって発現される、請求項１〜７
のいずれか一項記載の複合体。
【請求項１０】糖タンパク質が、配列番号：1の配列
を有する、請求項１〜９のいずれか一項記載の複合体。
【請求項１１】糖タンパク質が、1〜6個のグリコシル
化部位の付加によって修飾されたヒトエリスロポエチン
配列を有する、請求項１〜８のいずれか一項記載の複合
体。
【請求項１２】糖タンパク質が、下記からなる群より
選択された修飾によって修飾されたヒトエリスロポエチ
ン配列を有する、請求項１〜11のいずれか一項記載の複
合体：
【請求項１３】糖タンパク質が、ヒトエリスロポエチ
ン配列、およびヒトエリスロポエチン配列のカルボキシ
末端の第二配列を含む配列を有し、該第二配列が少なく
とも1個のグリコシル化部位を含む、請求項１〜12のい
ずれか一項記載の複合体。
【請求項１４】第二配列が、ヒト絨毛性性腺刺激ホル
モンのカルボキシ末端配列に由来する配列を含む、請求
項13記載の複合体。
【請求項１５】糖タンパク質が、下記からなる群より
選択される配列を有する、請求項13記載の複合体： (a)ヒトエリスロポエチン配列およびヒトエリスロポエ
チン配列のカルボキシ末端における配列番号：3の配
列； (b)Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ で修飾された(a)の配列；および (c)Asn³⁰ Thr³² Val⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ で修飾された(a)の
配列。
【請求項１６】糖タンパク質が、少なくとも1個のグ
リコシル化部位の転位によって修飾されたヒトエリスロ
ポエチンの配列を有する、請求項１〜７のいずれか一項
記載の複合体。
【請求項１７】転位が、ヒトエリスロポエチン中のN
結合グリコシル化部位の欠失とヒトエリスロポエチン配
列の88位でのN結合グリコシル化部位の付加とを含む、
請求項16記載の複合体。
【請求項１８】糖タンパク質が、下記からなる群より
選択される修飾によって修飾されたヒトエリスロポエチ
ン配列を有する、請求項17記載の複合体：Gln²⁴ Ser⁸⁷
Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ ；Gln³⁸ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ ；およびGln
⁸³ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ 。
【請求項１９】複合体を含有する組成物であって、該
複合体の各々が、少なくとも1個の遊離アミノ基を有
し、かつ骨髄細胞において網状赤血球および赤血球の産
生の増大を引き起こすインビボ生体活性を有する、エリ
スロポエチン糖タンパク質であって、かつヒトエリスロ
ポエチンと、1〜6個のグリコシル化部位の付加または少
なくとも1個のグリコシル化部位の転位によって修飾さ
れたヒトエリスロポエチン配列を有するその類似体とか
らなる群より選択されたものを含み；該複合体中の各々
の糖タンパク質が、式 -CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR の
「n」ポリ（エチレングリコール）基に共有結合し、各
ポリ（エチレングリコール）基の-COが、該アミノ基の1
個とアミド結合を形成し；該複合体の各々において、R
は低級アルキルであり；xは2または3であり；mは約450
〜約900であり；nは1〜3であり；nおよびmは、複合体分
子量からエリスロポエチン糖タンパク質分子量を差し引
いたものが20キロダルトンから100キロダルトンである
ように選択され；nが1である複合体の割合が、少なくと
も90％である、組成物。
【請求項２０】 n が1である複合体の割合が、少なく
とも90％である、請求項１〜18のいずれか一項記載の複
合体を含有する組成物。
【請求項２１】 n が1である複合体の割合が、少なく
とも92％である、請求項19または20記載の組成物。
【請求項２２】 n が1である複合体の割合が、少なく
とも96％である、請求項21記載の組成物。
【請求項２３】 n が1である複合体の割合が、90％〜9
6％である、請求項19または20記載の組成物。
【請求項２４】請求項1〜23のいずれか一項記載の複
合体または組成物および薬学的に許容できる賦形剤を含
有する、薬学的組成物。
【請求項２５】慢性腎不全患者(CRF)の貧血、AIDSに
関連した疾患の治療または予防、および化学療法を受け
ている癌患者の治療のための医薬品の製造を目的とす
る、請求項1〜23のいずれか一項記載の複合体または組
成物の使用。
【請求項２６】請求項1〜23のいずれか一項記載の組
成物を患者に投与する工程を含む、慢性腎不全患者(CR
F)の貧血、AIDSおよび化学療法を受けている癌患者に関
連した疾患の予防的および／または治療的処置の方法。
【請求項２７】下記式の化合物を、エリスロポエチン
糖タンパク質と縮合する工程を含み、式中R、mおよびx
は請求項1〜6のいずれか一項で定義されたものである、
請求項1〜23のいずれか一項記載の化合物の製造法。【式】
【請求項２８】請求項27記載の方法により製造され
た、請求項１〜３のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２９】慢性腎不全患者(CRF)の貧血、AIDSお
よび化学療法を受けている癌患者に関連した疾患を治療
するための、請求項1〜23のいずれか一項記載の化合
物。