JP4689171B2 - 培養細胞の状態計測方法及び計測装置 - Google Patents

Description

本発明は、培養細胞の状態計測方法及び計測装置に関し、特に、培養容器内で培養された細胞の個体数、形態、分布等を計測する方法及び装置に関するものである。

生体内から採取された細胞を培養して増殖させ、培養された細胞を医療や薬効試験に応用する研究が進められている。

培養された細胞は、特定の数量が必要になる。このため、従来は、培養容器内の細胞を顕微鏡で観察し、細胞数の計測や培養の進み具合の確認を目視によって行っていた。また、顕微鏡による観察画像をＣＣＤカメラ等で取り込み、画像処理を行って細胞数を計測することが試みられている（特許文献１）。
特開２００２−２１４２２８号公報 「光学」３０巻９号（２００１）６０５（３３）〜６１２（４０）頁

上記のような目視による計測及び観察の場合、培養容器全面の計測時間が長くなる、観察者の個人差がある、繰り返し再現性が低い等の問題がある。

また、画像処理による方法の場合は、検出する細胞部分と細胞以外の部分との像コントラストの違いから細胞部分を抽出する。そのため、照明光量分布の変化や観察環境の変化による検出画像のＳ／Ｎの変化に影響される。また、観察倍率を高くする必要があり、培養容器全面を計測する時間が長くなる問題がある。

本発明は従来技術のこのような問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、外乱等に影響されずに再現性良く培養細胞の個体数、形態、分布等の状態を計測できる方法と装置を提供することである。

上記目的を達成する本発明の培養細胞の状態計測装置は、照明光学系と、観察像を干渉によってコントラスト像に変換するユニットを含む観察光学系と、観察像の干渉の際の位相差の符号が反対のコントラスト像を取り込む撮像素子とを有する顕微鏡によって、位相差の符号が反対の２つのコントラスト像からなる画像を取り込み、取り込まれた２つの画像の差演算を行って差演算処理して画像を形成し、得られた差演算処理した画像から、観察範囲内の細胞数、細胞の占有面積、細胞の存在分布、細胞の存在密度、細胞の形態、細胞核の分布、細胞の散乱分布の少なくとも何れか１つを計測する処理ユニットを有し、前記照明光学系の略瞳位置に開口が配置されており、前記観察像を干渉によるコントラスト像に変換するユニットを含む観察光学系が、前記照明光学系の前記開口を通過した光により照明された観察物体の像を合焦位置から近点側及び遠点側のずれた位置各々で前記撮像素子により取り込むように構成された観察光学系からなることを特徴とする装置である。

この場合に、差演算処理した画像の強度分布から、その強度値が０値近傍の部分を抽出して細胞の存在しない部分とし、それ以外の部分を細胞の存在する部分として、細胞の存在する部分と存在しない部分を分離処理する分離ユニットを有することが望ましい。

また、差演算処理した画像の強度分布から、その強度値が０値近傍の部分を抽出して強度値を１つの値に割り当て、それ以外の部分を別の１つの強度値を値に割り当てて２値化する２値化ユニットを有するようにしてもよい。

また、照明光学系と、観察像を干渉によってコントラスト像に変換するユニットを含む観察光学系と、観察像の干渉の際の位相差の符号が反対のコントラスト像を取り込む撮像素子とを有する顕微鏡によって、位相差の符号が反対の２つのコントラスト像からなる画像を取り込み、取り込まれた２つの画像の差演算を行って差演算処理して画像を形成することにより、範囲内の照明光ムラ、対象とする細胞以外の異物の影響を取り除く機能を有するようにしてもよい。

本発明の別の培養細胞の状態計測装置は、照明光学系と、観察像を干渉によってコントラスト像に変換するユニットを含む観察光学系と、観察像の干渉の際の位相差の符号が反対のコントラスト像を取り込む撮像素子とを有する顕微鏡によって、位相差の符号が反対の２つのコントラスト像からなる画像を取り込み、取り込まれた２つの画像の差演算と和演算をそれぞれ行った２つの画像を形成し、差演算処理した画像を和演算処理した画像で割り算し、観察範囲内の細胞の厚み分布及び細胞の位相分布を計測するユニットを有し、前記照明光学系の略瞳位置に開口が配置されており、前記観察像を干渉によるコントラスト像に変換するユニットを含む観察光学系が、前記照明光学系の前記開口を通過した光により照明された観察物体の像を合焦位置から近点側及び遠点側のずれた位置各々で前記撮像素子により取り込むように構成された観察光学系からなることを特徴とする装置である。

本発明の培養細胞の状態計測方法は、照明光学系と、観察像を干渉によってコントラスト像に変換するユニットを含む観察光学系と、観察像の干渉の際の位相差の符号が反対のコントラスト像を取り込む撮像素子とを有する顕微鏡によって、位相差の符号が反対の２つのコントラスト像からなる画像を取り込み、取り込まれた２つの画像の差演算を行って差演算処理して画像を形成し、得られた差演算処理した画像から、観察範囲内の細胞数、細胞の占有面積、細胞の存在分布、細胞の存在密度、細胞の形態、細胞核の分布、細胞の散乱分布の少なくとも何れか１つを計測し、前記照明光学系の略瞳位置に開口が配置されており、前記観察像を干渉によるコントラスト像に変換するユニットを含む観察光学系が、前記照明光学系の前記開口を通過した光により照明された観察物体の像を合焦位置から近点側及び遠点側のずれた各々の位置で前記撮像素子により取り込まれた２つの画像から差画像を形成することを特徴とする方法である。

本発明の培養細胞の状態計測方法は、照明光学系と、観察像を干渉によってコントラスト像に変換するユニットを含む観察光学系と、観察像の干渉の際の位相差の符号が反対のコントラスト像を取り込む撮像素子とを有する顕微鏡によって、位相差の符号が反対の２つのコントラスト像からなる画像を取り込み、取り込まれた２つの画像の差演算と和演算をそれぞれ行った２つの画像を形成し、差演算処理した画像を和演算処理した画像で割り算し、観察範囲内の細胞核の高さ、細胞核の面積、細胞核の扁平率の少なくとも何れか１つを計測し、前記照明光学系の略瞳位置に開口が配置されており、前記観察像を干渉によるコントラスト像に変換するユニットを含む観察光学系が、前記照明光学系の前記開口を通過した光により照明された観察物体の像を合焦位置から近点側及び遠点側のずれた各々の位置で前記撮像素子により取り込まれた２つの画像から差画像を形成することを特徴とする方法である。

以上において、照明光学系の略瞳位置に開口が配置されており、観察像を干渉によるコントラスト像に変換するユニットを含む観察光学系が、照明光学系の前記開口を通過した光により照明された観察物体の像を合焦位置から近点側及び遠点側のずれた位置各々で撮像素子により取り込むように構成された観察光学系からものとしてもよい。

以上の本発明の培養細胞の状態計測方法及び計測装置においては、差演算処理した画像を形成することにより、照明ムラ等の外乱の影響が小さい培養細胞の画像情報を得ることができる。特に、細胞が分布していない部分は影響がほとんどないものとなる。

また、細胞の存在しない部分をまず抽出し、それに基づいて細胞が存在する部分と細胞が存在しない部分の分離を容易に行うことができる。

さらに、細胞が存在する部分と細胞が存在しない部分を分離し２値化することで、細胞の占有面積を計算することができる。さらに、予め細胞の平均面積を求めておくことにより、細胞数を計算することもできる。

また、差演算処理した画像と和演算処理した画像を形成し、その商を計算することで、細胞の高さ分布を計算することが可能である。さらに、特定の抽出範囲を設定し、２値化を行うことにより、細胞の核を抽出することが可能になる。そして、細胞の核に依存した情報を得ることもできるようになる。

本発明の基本は、位相物体としての培養細胞の観察像を干渉によるコントラスト像に変換するときに干渉する光束間の位相差の符号を反転させてコントラストが反転した２つの画像を得ることにより、培養細胞のコントラスト像のコントラストを増強して、培養細胞の個体数、形態、分布等を確実に計測可能にすることである。

位相物体を干渉によるコントラスト像に変換する手法としては、位相差法や微分干渉法（非特許文献１）、本発明者が特願２００３−１５１５０６号、特願２００３−４１４１５８号等で提案したデフォーカス法あるいは波面収差導入法がある。

以下に、主として本発明者が特願２００３−１５１５０６号、特願２００３−４１４１５８号等で提案したデフォーカス法、波面収差導入法に基づいて本発明の培養細胞の状態計測方法及び計測装置を説明する。

まず、デフォーカス法、波面収差導入法について説明する。詳細は特願２００３−４１４１５８号参照。

図１は原理説明図であり、物点、結像光学系入射瞳、射出瞳、結像面を模式的に示した図である。図１に示すように、合焦位置に観察物体を配置すると、観察物点から出た光は実線で示すように球面波状に広がり、結像光学系の入射瞳に入る。入射瞳に入った光は、結像光学系の射出瞳から球面波状の収束光になり、結像面に集光して像を形成する。このとき、結像光学系を透過する各光線の間に光路（位相）差は生じないので、像にボケは生じない。

しかし、物点を点線に示す位置に移動させると、物点からの光は入射瞳に球面波状に入射する。入射瞳に入射した光は、射出瞳から移動後の像面に向かう球面波状の光に変わる。移動後の像面で観察すれば、光に光路（位相）差は発生しないが、観察点を移動させずに当初の結像面で観察すると、各光線に光路（位相）差が発生する。

本発明においては、この点を利用して、観察物体を結像光学系の合焦位置からずらした位置に配置することにより、結像光学系を透過する夫々の光線に位相差を発生させている。

また、図１において、結像光学系の光軸上光線と、最大ＮＡ（開口数）光線との位相の差が最も大きくなる。

したがって、観察物体を結像光学系の合焦位置から外れた位置で観察することにより、観察物体を透過した光と回折した光の間に合焦位置からのずれ量（デフォーカス量）に対応した位相差量を発生させることができる。

よって、この位相差量が位相差観察法で用いている位相膜と等価な機能をして、培養細胞等の位相分布に比例した像コントラストを与えることができ、無色透明な培養細胞等を観察することができる。

このとき、結像光学系の結像面に結像する倍率が低い場合の方が、結像光学系を通過する回折光の角度を限定しやすくなり、像のコントラストも良くなる。

位相物体を観察する場合、位相物体の位相分布に比例した像コントラストは、観察物体の位相量と透過光と回折光の間に与える位相差量とに比例する。観察物体で回折される光と透過光の間の角度は、観察物体の形状に依存して変わる。回折光と透過光の間の角度が変わると、同じデフォーカス量でも２つの光束の間に発生する位相差量が異なってくる。そのため、観察する例えば細胞毎にデフォーカス量を変えることにより、より良い像コントラストを得ることができる。

デフォーカスによって生じる各光線の位相差は、観察物体が結像光学系の合焦位置から近点側にずれた場合と遠点側にずれた場合で符号が変わる。そのため、培養細胞等の観察物体を結像光学系の合焦位置から近点側にずらして観察した画像と遠点側にずらして観察した画像は、観察物体の位相分布に相当して夫々得られる画像の像コントラストが反転している。

また、シャーレに付着したゴミ等の光を吸収する物体は、位相物体ではなくなり、デフォーカスによって位相差が与えられても像コントラストに変化は生じない。そのため、近点側にずらして撮像した画像と遠点側にずらして撮像した画像を画像間演算することにより、デフォーカスによって与えられる位相差に影響されない画像成分を分離することができる。特に、２つの画像の各画素毎に差演算を行うことにより、観察物体の位相分布に相当する画像成分の像コントラストは２倍にすることができ、ゴミや異物、照明ムラ等の位相情報を持たない画像成分をなくすことができる。

なお、以上のような位相物体の観察方法は、視野内の位相物体の存在を認識するような用途において、結像光学系の結像倍率が４倍以下の場合に、特に好ましい方法である。

以上のような原理を、以下に若干理論的に説明する。

位相物体：
ａ（Ｕ）＝ｅｘｐ｛−ｉφ（Ｕ）｝ ・・・（１）
の部分的コヒーレント照明における結像Ｉ（ｘ）は、非特許文献１の式（６）で与えられる。その式は以下のようになる。なお、本発明において、式番号は非特許文献１の式番号には対応していない。

・・・（２）
式（２）中、“×" を“○" で囲んだ記号（右辺の第１項）は、コンボリューションである。なお、Ｕ，ｆ_i （ｉ＝１，２），ｘは、それぞれ物体面、瞳面、像面での座標であり、φ（Ｕ）は、観測物体の位相情報である。

ここで、Φ（ｆ）は、φ（Ｕ）のフーリエ変換であり、Ｔ（ｆ₁ ，ｆ₂ ）は、非特許文献１の式（２）で与えられており、部分的コヒーレント結像の空間周波数特性（transmission cross coefficient：ＴＣＣ）と呼ばれており、次式で与えられる。

・・・（３）
ここで、Ｓ（ξ）は照明光学系の瞳の強度分布を表し、Ｐ（ξ）は結像光学系の瞳関数を表す。ξは、瞳内の位置座標である。

無収差光学系のときは、Ｐ（ξ）は瞳の領域を表す関数になり、次式で表せる。

・・・（４）
結像光学系にデフォーカス等の収差Ｗ（ξ）（位相量で表現）が発生した場合には、

・・・（５）
となる。

上記式（２）において、右辺の第１項と第３項は位相φ（Ｕ）に関する高次項であり、第２項が位相分布φ（Ｕ）に比例した像コントラストを与える項である。そこで、上記式（２）の第２項を変形する。

収差Ｗ（ξ）の量が小さく回転対称であり、結像光学系の瞳の領域を表す関数ｐ（ξ）は回転対称であるとすると、

・・・（６）
となる。

式（２）の第２項と式（６）から、位相物体を観察する際に、デフォーカス等の収差を与えて式（６）が０以外の値になるようにすることにより、位相分布が可視化できることが分かる。

以上は、式の展開を見やすくするために、１次元変数での展開を行ったが、２次元変数としても同様である。

式（６）を照明光学系の瞳と結像光学系の瞳を用いて模式的に示すと、図２（ａ）、（ｂ）のように表せる。ここで、図２（ａ）は照明光学系の瞳の強度分布（開口形状）Ｓ（ξ）が円形、図２（ｂ）は輪帯状の形状を有していた場合である。図２（ａ）及び（ｂ）は、物体での回折で結像光学系の瞳が移動する形で表している。これを、座標系を入れ換えて照明光学系の瞳Ｓ（ξ）の移動で表すと、照明光学系の瞳形状が輪帯状の場合を例にとると、図３（ａ）と（ｂ）のようになる。図３（ａ）が式（６）のＷ（ξ）について計算する部分（ハッチ部分）であり、図３（ｂ）がＷ（ξ＋ｆ）について計算する部分（ハッチ部分）である。図３（ａ）は物体で回折されない光による結像光学系の瞳における照明光学系の瞳の像に相当し、図３（ｂ）は物体で１次回折された光による結像光学系の瞳における照明光学系の瞳の像にに相当する。

したがって、結像光学系の瞳位置での収差Ｗ（ξ）が回転対称で半径に応じて大きさが変化するものであれば、位相分布の可視化が可能であることになる。

ここで、デフォーカスしたときのＷ（ξ）を考える。焦点ずれによる波面収差は、非特許文献２に示されるように、瞳面内の光線の高さをｈ、レンズの焦点距離をｆ、焦点ずれ量をｚ、瞳の各点の光路長さをΔＬとすると、
ΔＬ＝−ｈ² ｚ／ｆ² ・・・（７）
で与えられる。ｈ／ｆは瞳面上の位置を表した値であり、瞳内の位置座標を表すξに相当する。また、ΔＬは位置ξでの光路長差であることから、波長をλとして、
ΔＬ＝Ｗ（ξ）×λ＝−ξ² ｚ ・・・（８）
で表せる。したがって、
Ｗ（ξ）＝−ξ² ｚ／λ ・・・（９）
で表せる。このデフォーカスによる収差Ｗ（ξ）は回転対称で半径の２乗に比例してマイナス方向に大きくなるので、位相分布に比例した像コントラストを与えることができることになる。

ここで、ｚの座標は一般的に焦点位置に対し、図１の右側を正、左側を負にとる。よって、焦点ずらしを焦点から左側（遠点側）に行う場合と右側（近点側）に行う場合とで、Ｗ（ξ）の符号も変わる。

ここで、収差Ｗ（ξ）として、デフォーカスによるものでなく、瞳面で同様に回転対称で半径に応じて大きさが変化する波面収差を与える光学手段（具体的には、後で説明するような可変形状ミラー（デフォーマブルミラー）等）を用いても可能であることが、以上の検討より明らかである。

以上のようなデフォーカス法を利用してコントラスト反転を含めて培養細胞のコントラスト像を観察・撮像可能な顕微鏡の実施例に基づいて、本発明の培養細胞の状態計測装置の実施例を説明する。

図４は、このようなデフォーカスを利用して培養細胞のコントラスト像が観察・撮像可能な顕微鏡の１実施例の全体の概略図を示す。この実施例の顕微鏡は倒立型顕微鏡１として構成されており、この倒立顕微鏡１は、光源２と、光源２から発せられた光を導くための照明光学系３と、Ｘ−Ｙステージ４０上のシャーレ４の内部底面位置の培養細胞のコントラスト像を形成するための観察光学系５と、シャーレ４の内部底面位置の培養細胞のコントラスト像をを拡大して目視観察するための接眼レンズ６と、シャーレ４の内部底面位置の培養細胞を撮像するための撮像素子７を有するＣＣＤカメラ８とから構成されている。また、ＣＣＤカメラ８には、撮像された画像を記憶し演算処理しその結果を記憶及び出力するパソコン２１とテレビモニター２２とが接続されている。パソコン２１からのＸ−Ｙステージ走査信号は駆動回路を経てＸ−Ｙステージ４０に送られ、また、パソコン２１からのフォーカス信号は駆動回路を経て対物レンズ移動機構４３に送られるように接続されている。

照明光学系３は、光源２側から順に、コレクターレンズ１０、照明光の光軸１１を偏向させるための偏向ミラー１２、光源２からの光を準単色とするための干渉フィルタ１３、及び、コンデンサレンズ１４により構成されている。

観察光学系５は、観察物体のシャーレ４側から順に、シャーレ４の内部底面位置の培養細胞のコントラスト像を形成するための対物レンズ１５、第１のリレーレンズ１６、対物レンズ１５からの光を偏向するための偏向ミラー１７、第１のリレーレンズ１６と共に対物レンズ１５による像を結像面に結像させるための第２のリレーレンズ１８により構成されている。

また、第２のリレーレンズ１８と結像面１９との間には、培養細胞のコントラスト像をを接眼レンズ６による目視観察とＣＣＤカメラ８による観察が同じ又は任意に切り換えることができるように、ハーフミラーである切り換えミラー２０が配置されている。

また、光源２からの光が投射されるコンデンサーレンズ１４の瞳位置２５には、円形開口や輪帯開口からなる部分開口を有する開口ユニット２８が、着脱自在に配置されている。また、開口ユニット２８の部分開口以外は、遮光性の遮光板から形成されている。

この実施例はこのように構成されているので、光源２からの照明光は、コンデンサーレンズ１４の瞳位置に投射される。そして、この照明光は、コンデンサーレンズ１４によってケーラー照明としてシャーレ４の内部底面位置の培養細胞を照明する。照明光は培養細胞を透過して対物レンズ１５に入射する。対物レンズ１５に入射した光は、対物レンズ１５と第１のリレーレンズ１６及び第２のリレーレンズ１８により結像面１９に培養細胞の像を形成する。結像面１９に形成された培養細胞のコントラスト像は、接眼レンズ６に入射すると共に、切り換えミラー２０により、ＣＣＤカメラ８の撮像素子７の撮像面上に結像する。したがって、合焦位置で観察物体の培養細胞の通常の顕微鏡観察ができる。

この実施例では、対物レンズ１５の光軸方向の位置を、パソコン２１からのフォーカス信号により対物レンズ移動機構４３を介して対物レンズ１５を通常の観察の合焦位置とされている位置から観察物体に対し前後何れかに微小量だけ移動させてデフォーカスさせる。デフォーカスを与えると、開口ユニット２８の部分開口を通った照明光は、観察物体の培養細胞で回折した光とそれを透過した光が、対物レンズ１５の瞳３０内の異なる部分を通過する（図３参照）。透過光束と回折光束の間には、回折角とデフォーカスに基づく波面の変化量に対応した位相差が生じる。この位相差は、位相差顕微鏡の位相膜と同様の作用をし、観察物体の培養細胞の位相分布に比例した像強度分布を結像面１９上に形成する。

対物レンズ１５を前後に移動させる移動量は、形成される像にボケが生じない範囲であることが必要であり、観察に使用する光源２の波長を使用する対物レンズ１５のＮＡの２乗で割った値以下であることが望ましい。

ここで、前記したように 対物レンズ１５のデフォーカスによって生じる各光線の位相差は、観察物体が対物レンズ１５の合焦位置から近点側にずれた場合と遠点側にずれた場合で符号が変わる。そのため、観察物体の培養細胞を対物レンズ１５の合焦位置から近点側にずらして撮像素子７によりパソコン２１に取り込んだ画像と遠点側にずらして撮像素子７によりパソコン２１に取り込んだ画像は、観察物体の位相分布に相当して夫々得られる画像の像コントラストは相互に反転している。その様子を図５（ａ）、（ｂ）に示す。図５（ａ）、（ｂ）各々において、左側に上記のように対物レンズ１５のデフォーカスによって得られる培養細胞のコントラスト像を、右側に左側の破線で示す走査線位置での像強度を表す階調を模式的に示した図を示してあり、図５（ａ）は遠点側に、図５（ｂ）は近点側にそれぞれ略同じ移動量デフォーカスしたときの様子を示す。細胞がない背景領域は何れも略一定の階調ｎを示しており、図５（ａ）に示すように、近点側（遠点側）にデフォーカスすると、細胞及び核の部分は背景に対して若干明るくコントラストがつき、逆に図５（ｂ）に示すように、遠点側（近点側）にデフォーカスすると、細胞及び核の部分は背景に対して若干暗くコントラストがつく。

したがって、このように、デフォーカスの方向が変わることにより位相差の符号が相互に反対となり、得られた培養細胞のコントラスト像のコントラストが相互に反転した２枚の画像（図５（ａ）、（ｂ））の対応する個々の画素の値の差を取って新たな画素とする差演算をパソコン２１内で行わせると、図５（ｃ）の左側に示すような画像となり、観察範囲内の照明光の強度変化や異物等による光強度変化は相殺されて０になり、一方、培養細胞のような位相分布は位相差の符号の反転により像のコントラストが反転するので、このような位相差の符号が反対の２つのコントラスト像からなる画像の差演算を行うことにより、図５（ｃ）の右側に示すように、像のコントラストが２倍になる（ただし、デフォーカス量が近点側と遠点側で同じ場合）。

このように差演算によって得られた画像の細胞以外の部分の階調（強度値）は０になる。したがって、差演算を行った画像（図５（ｃ）の左側）からパソコン２１内で階調０近傍の部分を抽出して細胞の存在しない部分とし、そのようにして求めた細胞の存在しない部分を同様にパソコン２１内で観察範囲から除いて、残った部分を細胞の存在する部分とするようにすることが望ましい。すなわち、差演算した画像の強度が略０になる部分は、位相が略０であって細胞が存在しない部分を表している。これに対して、差演算した画像の強度が略０以外の部分は、位相分布に対応した部分であるが、照明光の強度ムラや容器の蓋についた結露の影響等によって強度ムラが含まれ位相分布を必ずしも正確に反映していない。そのため、細胞が存在する部分を直接抽出するより、細胞が存在しない部分を抜き出して観察範囲から除外することにより、細胞が存在する部分を換算する方が、外乱の影響が小さくて望ましい。

また、差演算を行った画像（図５（ｃ）の左側）に、図５（ｃ）の右側に一点鎖線で示すように、強度０近傍に２値化の敷居値を設けて、それ以下の領域の画素に０の強度を割り当て、敷居値以上の画素に１の強度を割り当てて図５（ｄ）に示すような２値化画像を形成することができる。この２値化画像は、細胞の存在分布を表すことになる。

この２値化画像の画像データを画素毎に足し算し、その足し算した値を観察範囲内の総画素数で割り算すると、細胞の観察範囲内での存在密度が算出される。また、足し算した値に実際の物体面（シャーレ４の内部底面）上での１画素の面積を掛けることにより、観察範囲内での細胞が存在する総面積が計算でき、その総面積を１つの細胞の平均的な面積で割り算することにより、観察範囲内での細胞の存在個数が計算できる。

あるいは、細胞が存在する画素数を画像の総画素数で割り算することにより、観察範囲内での細胞の平均密度、細胞の占有率を求めることができる。また、予め細胞１個が占有する平均画素数を求めておくことにより、細胞が存在する画素数を細胞１個の平均画素数で割ることにより、観察範囲内に存在する細胞の個数を求めることができる。

また、２値化とは別に、パソコン２１に取り込まれた２つの画像（図５（ａ）の左側の画像と図５（ｂ）の左側の画像）の差演算に加えて和演算を行う。

上記のように、差演算によって得られた画像から観察物体（培養細胞）の位相分布に相当する画像情報が得られる。しかし、照明ムラ等の影響は含まれたままで位相分布を必ずしも正確に表しているとは言い難い。そこで、コントラストが相互に反転した２枚の画像（図５（ａ）、（ｂ））の対応する個々の画素の値の和を取って新たな画素とする和演算をパソコン２１内で行わせると、細胞が存在する部分は反転分布のため位相分布が相殺され、観察範囲内の照明ムラ等の強度分布の情報が得られることになる。この和演算によって得られた画像で差演算によって得られた画像を割り算することにより、照明ムラ等の影響を小さくすることができ、位相分布に比例した画像情報が得られる。

シャーレ４内では同じ細胞を培養していることから、細胞は略同じ屈折率を持つと考えることができ、得られた位相分布は細胞の高さ情報に相当すると言える。したがって、このようにして得られた画像（差演算によって得られた画像を和演算によって得られた画像で割り算して得られた画像）の強度（階調）分布から培養細胞の高さ分布計測することができる。

さらに、培養する細胞によっては、核の部分とそれ以外の部分で厚みが異なり、核の部分が盛り上がっている細胞がある（図５（ｃ）の右側の図のＮ）。上記の差演算によって得られた画像を和演算によって得られた画像で割り算して得られた画像において、敷居値を特定の値（核のない部分の高さに相当する値より大きく、核のある部分の高さに相当する値より小さい値）以下の部分を０、それ以外を１とする２値化画像処置をすることで、細胞の核の部分を抽出した画像が得られる。この２値化画像から各細胞の核の面積を求めることができる。

また、上記の核の分布を表した２値化画像と前の位相分布を表す画像（差演算によって得られた画像を和演算によって得られた画像で割り算して得られた画像）の掛け算を行うことで、核の部分の高さ分布が計算できる。各細胞の核の面積と高さ情報から核の扁平率を求めることもできる。

さらに、干渉の際の位相差の符号が反対の２つのコントラスト像（図５（ａ）の左側の画像と図５（ｂ）の左側の画像）を取り込む際に、同時に、コンデンサーレンズ１４の瞳位置２５に、デフォーカス法用の部分開口を有する開口ユニット２８の代わりに、暗視野照明用の輪帯開口を有する別の開口ユニットを挿入して暗視野照明して同じ培養細胞の暗視野画像を取り込んでおく。この暗視野画像と上記の核の分布を表した２値化画像の掛け算を行うことで、核の部分の暗視野画像を得ることができ、核の散乱分布を計算することができるようになる。

ところで、以上の説明では、位相物体である培養細胞の観察像であってその結像における干渉の際の位相差の符号が相互に反対である２枚のコントラスト像を得る手段としては、デフォーカス法に基づいて説明してきたが、波面収差導入法によってもよい。そのためには、図４において、コンデンサーレンズ１４の瞳位置２５に、部分開口を有する開口ユニット２８を配置すると共に、対物レンズ１５の瞳面３０に、その瞳の径に応じて大きさが変化する波面を導入する。そのためには、例えば対物レンズ１５の瞳面３０と共役な位置の偏向ミラー１７の面形状を変形させる。その変形を同じ形状で符号が反対になるようにすることにより、上記のような位相差の符号が相互に反対の２枚のコントラスト像が得られる。

あるいは、位相差顕微鏡に原理によってもよい。そのためには、図４において、コンデンサーレンズ１４の瞳位置２５に、部分開口を有する開口ユニット２８の代わりに、輪帯開口を有する別の開口ユニットを挿入し、その輪帯開口の像が結像する対物レンズ１５の瞳面３０に、その輪帯開口の像に対応する輪帯状の位相膜３１を配置する。その位相膜３１の位相差の符号を相互に反対の４分の１波長にすることにより、上記のような位相差の符号が相互に反対の２枚のコントラスト像が得られる。

あるいは、微分干渉顕微鏡に原理によってもよい。そのためには、図４において、コンデンサーレンズ１４の瞳位置２５に、開口ユニット２８の代わりに、ノマルスキープリズムやウォラストンプリズムの直交する偏光間にシャーを与える第１プリズムを挿入し、その第１プリズムと共役な対物レンズ１５の瞳面３０に、そのシャーを戻すノマルスキープリズムやウォラストンプリズムからなる第２ププリズムを配置し、第１プリズムの入射側にポーラライザーを、第２プリズムの射出側にアナライザーを配置する。そして、２つの偏光成分間のリターデーション量を反転させるて２枚の画像を撮影することにより、上記のような位相差の符号が相互に反対の２枚のコントラスト像が得られる。

以上、本発明の培養細胞の状態計測方法及び計測装置をその原理と実施例に基づいて説明してきたが、本発明はこれら実施例に限定されず種々の変形が可能である。

本発明で用いるの２枚のコントラスト像を得るデフォーカス法の原理説明図である。 部分的コヒーレント結像の空間周波数特性を説明するための図である。 照明光学系の瞳形状が輪帯状の場合に物体で回折されない光による結像光学系の瞳における照明光学系の瞳の像（ａ）と物体で１次回折された光による結像光学系の瞳における照明光学系の瞳の像（ｂ）を示す図である。 デフォーカスを利用して培養細胞のコントラスト像が観察・撮像可能な顕微鏡の１実施例の全体の概略図である。 本発明の培養細胞の状態計測方法を説明するための図である。

符号の説明

１…倒立型顕微鏡
２…光源
３…照明光学系
４…シャーレ
５…観察光学系
６…接眼レンズ
７…撮像素子
８…ＣＣＤカメラ
１０…コレクターレンズ
１１…光軸
１２…偏向ミラー
１３…干渉フィルタ
１４…コンデンサレンズ
１５…対物レンズ
１６…第１のリレーレンズ
１７…偏向ミラー
１８…第２のリレーレンズ
１９…結像面
２０…切り換えミラー
２１…パソコン
２２…テレビモニター
２５…コンデンサーレンズの瞳位置
２８…部分開口を有する開口ユニット
３０…対物レンズの瞳
３１…位相膜
４０…Ｘ−Ｙステージ
４３…対物レンズ移動機構

Claims (7)

1. 照明光学系と、
   観察像を干渉によってコントラスト像に変換するユニットを含む観察光学系と、
   観察像の干渉の際の位相差の符号が反対のコントラスト像を取り込む撮像素子と
   を有する顕微鏡によって、
   位相差の符号が反対の２つのコントラスト像からなる画像を取り込み、
   取り込まれた２つの画像の差演算を行って差演算処理して画像を形成し、
   得られた差演算処理した画像から、観察範囲内の細胞数、細胞の占有面積、細胞の存在分布、細胞の存在密度、細胞の形態、細胞核の分布、細胞の散乱分布の少なくとも何れか１つを計測する処理ユニットを有し、
   前記照明光学系の略瞳位置に開口が配置されており、
   前記観察像を干渉によるコントラスト像に変換するユニットを含む観察光学系が、前記照明光学系の前記開口を通過した光により照明された観察物体の像を合焦位置から近点側及び遠点側のずれた位置各々で前記撮像素子により取り込むように構成された観察光学系からなる
   ことを特徴とする培養細胞の状態計測装置。
2. 差演算処理した画像の強度分布から、その強度値が０値近傍の部分を抽出して細胞の存在しない部分とし、それ以外の部分を細胞の存在する部分として、細胞の存在する部分と存在しない部分を分離処理する分離ユニットを有する
   ことを特徴とする請求項１記載の培養細胞の状態計測装置。
3. 差演算処理した画像の強度分布から、その強度値が０値近傍の部分を抽出して強度値を１つの値に割り当て、それ以外の部分を別の１つの強度値を値に割り当てて２値化する２値化ユニットを有する
   ことを特徴とする請求項１記載の培養細胞の状態計測装置。
4. 照明光学系と、
   観察像を干渉によってコントラスト像に変換するユニットを含む観察光学系と、
   観察像の干渉の際の位相差の符号が反対のコントラスト像を取り込む撮像素子と
   を有する顕微鏡によって、
   位相差の符号が反対の２つのコントラスト像からなる画像を取り込み、
   取り込まれた２つの画像の差演算を行って差演算処理して画像を形成することにより、範囲内の照明光ムラ、対象とする細胞以外の異物の影響を取り除く機能を有する
   ことを特徴とする請求項１記載の培養細胞の状態計測装置。
5. 照明光学系と、
   観察像を干渉によってコントラスト像に変換するユニットを含む観察光学系と、
   観察像の干渉の際の位相差の符号が反対のコントラスト像を取り込む撮像素子と
   を有する顕微鏡によって、
   位相差の符号が反対の２つのコントラスト像からなる画像を取り込み、
   取り込まれた２つの画像の差演算と和演算をそれぞれ行った２つの画像を形成し、
   差演算処理した画像を和演算処理した画像で割り算し、
   観察範囲内の細胞の厚み分布及び細胞の位相分布を計測するユニットを有し、
   前記照明光学系の略瞳位置に開口が配置されており、
   前記観察像を干渉によるコントラスト像に変換するユニットを含む観察光学系が、前記照明光学系の前記開口を通過した光により照明された観察物体の像を合焦位置から近点側及び遠点側のずれた位置各々で前記撮像素子により取り込むように構成された観察光学系からなる
   ことを特徴とする培養細胞の状態計測装置。
6. 照明光学系と、
   観察像を干渉によってコントラスト像に変換するユニットを含む観察光学系と、
   観察像の干渉の際の位相差の符号が反対のコントラスト像を取り込む撮像素子と
   を有する顕微鏡によって、
   位相差の符号が反対の２つのコントラスト像からなる画像を取り込み、
   取り込まれた２つの画像の差演算を行って差演算処理して画像を形成し、
   得られた差演算処理した画像から、観察範囲内の細胞数、細胞の占有面積、細胞の存在分布、細胞の存在密度、細胞の形態、細胞核の分布、細胞の散乱分布の少なくとも何れか１つを計測し、
   前記照明光学系の略瞳位置に開口が配置されており、前記観察像を干渉によるコントラスト像に変換するユニットを含む観察光学系が、前記照明光学系の前記開口を通過した光により照明された観察物体の像を合焦位置から近点側及び遠点側のずれた各々の位置で前記撮像素子により取り込まれた２つの画像から差画像を形成する
   ことを特徴とする培養細胞の状態計測方法。
7. 照明光学系と、
   観察像を干渉によってコントラスト像に変換するユニットを含む観察光学系と、
   観察像の干渉の際の位相差の符号が反対のコントラスト像を取り込む撮像素子と
   を有する顕微鏡によって、
   位相差の符号が反対の２つのコントラスト像からなる画像を取り込み、
   取り込まれた２つの画像の差演算と和演算をそれぞれ行った２つの画像を形成し、
   差演算処理した画像を和演算処理した画像で割り算し、
   観察範囲内の細胞核の高さ、細胞核の面積、細胞核の扁平率の少なくとも何れか１つを計測し、
   前記照明光学系の略瞳位置に開口が配置されており、前記観察像を干渉によるコントラスト像に変換するユニットを含む観察光学系が、前記照明光学系の前記開口を通過した光により照明された観察物体の像を合焦位置から近点側及び遠点側のずれた各々の位置で前記撮像素子により取り込まれた２つの画像から差画像を形成する
   ことを特徴とする培養細胞の状態計測方法。

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