JP4387101B2 - 糖尿病性網膜症の予防または処置のための網膜細胞アポトーシス抑制剤の使用 - Google Patents

Description

【０００１】
糖尿病性網膜症は、最終段階において失明を招くことになる糖尿病の重大な障害のうち毛細管合併症の１つをなす（Ｇｒａｎｇｅ，１９９５；Ｆｒａｎｋ，１９９５；Ａｉｅｌｌｏ ＬＰら，１９９８）。後進国において、認められる失明の第２原因は、ＡＧＥに関連する黄斑変性であり（Ｎａｔｈａｎら，１９９１）、糖尿病患者の失明に至る危険性は、総合的母集団の危険性の２５倍と想定されている（Ｋａｈｎら，１９７４）。現在、上記合併症を予防または治療する薬理学的処置は無く、唯一の処置は、重症例におけるレーザによる網膜光凝固またはガラス体切開である（Ｆｒａｎｋ，１９９５；Ａｉｅｌｌｏ，１９９８）。
【０００２】
糖尿病性網膜症は、いわゆる、“単純な”または初期の段階（網膜症のバックグランド）から、いわゆる“進行する網膜症”の最終段階に至る糖尿病合併症であり、上記の最終段階では、時には網膜剥離を伴う重大な出血および失明を招く脆弱な網膜管が形成される（Ｇｒａｎｇｅ，１９９５；Ｆｒｎｋ，１９９５）。単純な網膜症の場合、毛細血管障害として、微小動脈瘤、個々の小出血、浸出液および静脈拡張が挙げられる（Ｐａｌｍｂｅｒｇ，１９７７，ＥＴＤＲＳ ｒｅｐｏｒｔ ｎｏ．１０，１９９１）。網膜症のこの単純な形は、長期間、臨床的に無症状である。網膜症のこの単純な段階では、死後に採取した糖尿病患者の網膜と同等のＡＧＥの正常な固体の網膜と比較した調査から、網膜毛細血管の細胞的、構造的劣化が認められた。添付の図１に示した如く、網膜の毛細血管は、管のルミナール側の内皮細胞によって被われ、周皮細胞（または壁細胞）は、外部にあり、管の基礎膜内で消失する。
【０００３】
ヒトの網膜およびラットの網膜において、周皮細胞数と内皮細胞数との比は、１：１である（Ｋｕｗａｂａｒａら，１９６３）。この早期段階において観察される変性は、毛細管の基礎膜の肥厚（Ｆｒｉｅｄｅｎｗａｌｄ，１９５０）および周皮細胞の選択的消滅（Ｃｏｇａｎら，１９６１，Ｋｕｗａｂａｒａら，１９６３）であり、その結果、網膜毛細管の周皮細胞数と内皮細胞数との比は、病理学的状態では、０，３：１に低下し、最終段階では、更に、０，１：１に低下する（Ｃｏｇａｎら，１９６１；Ｋｕｗａｂａｒａら，１９６３）。
【０００４】
長期の糖尿病患者の死後に採取したヒトの網膜について実施した研究から、アポトーシスによる周皮細胞の死、ネエクローシスによらない予定の細胞死、観察された突然死は、毒性障害によるということが判明した（Ｍｉｚｕｔａｎｉら，１９９６，Ｌｉら１９９７，Ｐｏｄｅｓｔａら，２０００）。しかしながら、消失を示す１つまたは複数の細胞内表示法は、知られていない。
【０００５】
アポトーシス化周皮細胞の検知は、インシトゥで、全網膜について、アポトーシス化された細胞核のマーキング技術、即ち、ＴＵＮＥＬ法（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＤＰ ｎｉｃｋ−ｅｎｄ ｌａｖｅｌｉｎｇ）によって実施する（Ｍｉｚｕｔａｎｉら，１９９６）。従って、上記データに依拠して、アポトーシスに関連するタンパク質に対する抗体（Ｂａｘと呼ぶ）を使用した場合、アポトーシス化された若干の周皮細胞は着色される（Ｐｏｄｅｓｔａら，２０００）。
【０００６】
他のグループは、糖尿病患者の網膜周皮細胞の精製後、逆トランスクリプターゼによる鎖重合なよる増幅技術によってアポトーシス関連タンパク質、即ち、カスパーゼ３またはＣＰＰ３２（システイン プロテアーゼ タンパク質 ３２ ｋＤａ）のＡＲＮｍの増加率を検知することによって、上記タンパク質の遺伝子発現の増加を示した（Ｌｉら，１９９９）。従って、精製した上記周皮細胞は、細胞酸化防止剤（例えば、グルタチォンペルオキシダーゼ）の防御に関連する他の遺伝子の発現増加を示し、酸化ストレスがアポトーシスによる網膜周皮細胞の消失に関連するということを暗示する（Ｌｉら，１９９９）。
【０００７】
アポトーシスによる周皮細胞の死滅に関する基礎的な細胞機構は、なお、殆ど知られていない。本発明の枠内で実施した研究は、まさに、周皮細胞のアポトーシス化を招く変質鎖を特定して、糖尿病性網膜症の初期段階において認められる周皮細胞の消失プロセスを抑制することを意図した。
【０００８】
Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｔｒｉａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒｏｕｐ（ＤＣＣＴ）（１９９３）またはＵＫ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｄｉａｂａｔｅｓ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ（ＵＫＰＤＳ）（１９９８ａ，ｂ）によって過去に企図された研究において、既に、糖尿病性網膜症の進行における高血糖コントロールの主要な役割が示されている。複数の研究において、グルコースは、病理学的濃度において、網膜毛細管細胞の生物学的機能または持続性を劣化する生化学的変化を誘導できるということが確認された。周皮細胞の増殖に対するインビトロのグルコースの抑制効果は、内皮細胞の増加は改善されない（Ｐｏｒｔａら，１９９４）が、例えば、網膜症時の内皮細胞の選択的消失を説明するものである。更に、グルコースの存在下で培養された周皮細胞および網膜内皮細胞において増進された基礎膜成分（コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン）の合成（Ｌｉら，１９８４，Ｍａｎｄａｒｉｎｏら，１９９３）によって、基礎膜の肥厚が誘起されることになる。
【０００９】
糖尿病においてグルコースによって管劣化が誘起される他の機構は、タンパク質、ＤＮＡまたは脂質の非酵素グリコシレーション−またはグリコシル化−によって生成された進行したグリコシル化生成物またはＡＧＥ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の多量の生成および堆積であり（メイラード反応，１９１２）、これらの生成物は、糖尿病の場合の多数の研究において実証されている（Ｔｈｏｒｎａｌｌｅｙ，１９９９）。更に、糖尿病患者の皮膚において測定されたＡＧＥ量は、管劣化の程度に強く関連する（Ｂｅｉｓｓｗｅｎｇｅｒら，１９９５）。添付の図２に示したグリコシル化またはメイラードの方法には、還元糖とタンパク質との結合が示されている：開示の形の還元糖は、まず、タンパク質（リシン、アルギニン）に含まれる塩基性アミノ酸の遊離アミノ基と反応し、アマドリ生成物にもとづき安定化されたシッフ塩基を生成する。
【００１０】
これらの工程は、可逆であり、基体（タンパク質および糖）の濃度に依存する。アマドリ生成物は、生成されると、一連の改質を受け、部分的分裂、いわゆる、グリコシル化生成物（例えば、カルボキシメチルリシン（ＣＭＬ））の生成およびジカルボニル（例えば、３−デソキシグルコソン）の生成を誘起する。上記ジカルボニルは、極めて反応性であり、タンパク質のアミンと反応し、かくして、長寿命の若干のタンパク質中に分子内ブリッジおよび分子間ブリッジを形成してメイード反応を促進する（Ｔｈｏｒｎａｌｌｅｙ，１９９９）。最近、グルコース以外の他のＡＧＥ合成法が提案されている。
【００１１】
（モノオキシゲナーゼによる）肝臓中のトリオースリン酸の分裂およびアセトンの酸化によって形成されたメチルグリオキサールは、糖尿病の場合に血中濃度が増加する他のジカルボニルであり（ＭｃＬｅｌｌａｎら，１９９４）、インビトロで、ｐＨおよび温度の生理学的条件において、特に、タンパク質のアルギニン残渣を可逆的に改質できる（Ｌｏら，１９９４）。更に、メチルグリオキサールとの反応後に形成されたタンパク質のＡＧＥは、糖尿病の場合に認められた主生成物として記載されている（Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔら，１９９８）。メチルグリオキサールとの反応後の細胞間のタンパク質ＡＧＥの生成は、細胞内の主生成プロセスと考えられ、このＡＧＥは、メイラード反応においてグルコースよりも反応性である（Ｎｉｓｈｉｋａｗａら，２０００，Ｓｈｉｎｏｈａｒａら，１９９８）。
【００１２】
ＡＧＥ前駆体であるアマドリ生成物の堆積（Ｓｃｈａｌｋｗｉｊｋら，１９９９）およびＡＧＥの堆積は、周皮細胞および内皮細胞の基礎膜のレベルにおいて、アンチＡＧＥ抗体にもとづき確認される（Ｓｔｉｔｔら，１９９７）。インビトロで実施された複数の研究において、ＡＧＥが網膜毛細管機能不全に関連するということが提示されている。ＡＧＥは、実際、２つの細胞タイプの増殖を変更し、特に、周皮細胞の増加を抑制する（Ｃｈｉｂｂｅｒら，１９９７；Ｒｕｇｇｉｅｒｏ−Ｌｅｐｅｚら，１９９７，Ｙａｍａｇｉｓｈｉら，１９９５）。細胞外ＡＧＥは、特殊な膜受容体と結合でき、多様な細胞応答を誘起できる。研究において、糖尿病ラットの網膜毛細管に、ＡＧＥにおける受容体およびＡＧＥの共局在が存在することが確認された（Ｓｔｉｔｔら，１９９７，Ｓｏｕｌｉｓら，１９９７）。上記受容体は、複数のタイプの細胞において特定されており、これらから、周皮細胞（Ｃｈｉｂｂｅｒら，１９９７，Ｙａｍａｇｉｓｈｉら，１９９５，Ｓｔｉｔｔら，１９９７，Ｔｈｏｒｎａｌｌｅｙ，１９９８）および各種のタイプの受容体、即ち、ｐ６０，ｐ９０（Ｙａｎｇら，１９９１）、免疫グロブリンスーパファミリーの受容体（Ｎｅｅｐｅｒら，１９９２）、ラクトフェリン錯体の受容体（Ｓｃｈｍｉｄｔら１９９２）およびガレクチン３の受容体（Ｖｌａｓｓａｒａら，１９９５）であるＲＡＧＥ（ＡＧＥ受容体）が分離されている。ＲＡＧＥは、周皮細胞に存在する特性良好な受容体であり（Ｙａｍａｇｉｓｈｉら，１９９５，Ｂｒｅｔｔら，１９９３）、ＡＧＥの固定後、分子内酸化ストレス（Ｙａｎら，１９９４）、転写因子ＮＦ−ｋＢの賦活（Ｙａｎら，１９９４）、臍帯脈管の内皮細胞内のｐ２１ｒａｓおよびＭＡＰ（Ｍｉｔｏｇｅｎ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ）−キナーゼの賦活（Ｌａｎｄｅｒら，１９９７）を誘起する。上記細胞内の転写因子ＮＦ−ｋＢの賦活は、各種の酸化防止剤、例えば、リポ酸（Ｂｉｅｒｈａｕｓら，１９９７）、酸化防止酵素（Ｙａｎら，１９９４）によって抑制できる。トロロックスは、酸化防止剤として、糖尿病ラットの網膜の周皮細胞の消失を抑制し（Ａｎｓａｒｉら，１９９８）、酸化ストレスが内皮細胞の消失に関連することを示す。受容体ＲＡＧＥに対するアンチセンスＲＮＡは、周皮細胞に認められるＡＧＥの増殖防止効果を修正する（Ｙａｍａｇｉｓｈｉら，１９９５）。
【００１３】
糖尿病合併症、特に、網膜症の病因におけるメイラード法およびＡＧＥ堆積の重要性は、特に、遊離アミンによってグルコースまたは反応性ジカルボニルを捕捉してタンパク質との反応を阻止するグリコシル化抑制剤（例えば、アミノグアニジン）の使用にもとづき調査できた。ストレプトゾトシンによって糖尿病を誘発したラットのモデルにおいて、アミノグアニジンは、網膜毛細管内のＡＧＥの堆積および周皮細胞の消失を阻止し、網膜内の無細胞性毛細管の数を８０％減少する（Ｈａｍｍｅｓら，１９９１）。
【００１４】
ＡＧＥが周皮細胞の消失を誘起する機構およびＡＧＥによる周皮細胞のアポトーシス消失モードまたはネクロース消失モードは、現在、なお未解決の問題であり、まさに、本発明の枠内で実施された研究の一部の対象をなす。従って、本発明者は、ＡＧＥがアポトーシスによる周皮細胞の死を誘発したことを示す細胞内の表示法を解明するのに関心を持っている。
【００１５】
上記研究によって、網膜周皮細胞の少なくとも１つのアポトーシス抑制剤の有効量を患者に投与することからなる、糖尿病性網膜症の予防または処置のための新規の方法を考案できた。本発明は、臨床的に確証された網膜症および単なる網膜症の新規の処置手段または予防手段を提供することを特徴とする。単なる網膜症の臨床的兆候は、一般に、眼底の１つまたは２つの微小動脈瘤の出現である。以下では、確証された網膜症および単なる網膜症を糖尿病性網膜症と呼ぶ。
【００１６】
従って、本発明は、糖尿病性網膜症の予防または処置に有効な医薬の調製のための、網膜周皮細胞のアポトーシス抑制剤の使用を目的とする。
【００１７】
本発明の枠内において、メチルグリオキサールによるアルブミンの培養にもとづき生成され２回の継代（１０−１５日）の間に周皮細胞培養媒体（２μＭ）に添加したＡＧＥは、アポトーシスによるその死の刺激を誘発し（基本比率の３倍）、セラミドおよびジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の細胞内堆積（基本比率の２００％）を誘発するとしうことが判った。アポトーシスおよびセラミドおよびＤＡＧの多量な生成は、培養媒体中の酸化防止剤（例えば、非細胞毒性濃度である１０−５０μＭのＮα−アセチルシステイン（ＮＡＣ））の存在下で正常化され、ＡＧＥが細胞中の酸化ストレスを誘起しアポトーシスによるその死に寄与するということを示す。
【００１８】
従って、本発明は、網膜周皮細胞のアポトーシス抑制剤として、酸化防止化合物に関する。このような酸化防止化合物の例として、Ｎα−アセチル−Ｌ−システイン、リポ酸、エブセレン、ゼアキサンチン、コエレンテラミン、これらの誘導体または混合物を挙げることができる。酸化防止化合物は、セラミドおよび／またはＤＡＧの生成を減少するので、特に興味深い。従って、本発明は、更に、セラミドおよび／またはＤＡＧの生成を直接的または間接的に減少できるすべての化合物を意図する。
【００１９】
実際、アポトーシスは、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン以外の酸化防止剤、例えば、リポ酸（７μＭ，１４μＭ）またはエブセレン（５μＭ，１０μＭ）および、特に、ゼアキサンチン（２μＭ）またはコエレンテラミン（２μＭ）（おおよそ５０％の減少）によって緩和されるということが判った。この場合、上記酸化防止剤は、何れも、非細胞毒性濃度で使用される。
【００２０】
更に、ＤＡＧおよびセラミドは、ホスファチジルコリンの特定のホスホリパーゼＣ（ＰＣ−ＰＬＣ）および酸性スフィンゴミエリナーゼの同時の賦活によって生成され、セラミドは、ｎｏｖｏから合成されないと思われるということが判った。
【００２１】
実際、酸性スフィンゴミエリナーゼの抑制剤である１０，１１−ジヒドロ−５−［３−（メチルアミノ）プロピル］−５Ｈ−ジベンズ［ｂ，ｆ］アゼピン（０，１μＭおよび０，３μＭ）（デシプラミンとも呼ばれる）またはＰＣ−ＰＬＣの抑制剤であるトリシクロ［５，２１，０（２，６）］デシ（９［８］キサントゲネート（９，４μＭまたは３０μＭ）（Ｄ６０９とも呼ばれる）は、セラミドの生成を抑制し、しかしながら、Ｄ６０９のみは、同時に、セラミドの生成（９５％）およびＤＡＧ（８０％）を抑制し、従って、ＰＣ−ＰＬＣによるＤＡＧの生成は、セラミドを生成する酸性スフィンゴミエリナーゼの賦活の上流で行われると云える。セラミドのｎｏｖｏ合成の抑制剤であるフモニシンＢ１（０，０１μＭ）は、副次的に、ＡＧＥによって誘導されたアポトーシスのみを抑制し（２０％）、従って、セラミドのこの生成法は、無関係であると云える。この場合、アポトーシスは、１０，１１−ジヒドロ−５−［３−（メチルアミノ）プロピル］−５Ｈ−ジベンズ［ｂ，ｆ］アゼピン（デシプラミン）（０，３μＭ）またはトリシクロ［５，２１，０（２，６）］デシ（９［８］キサントゲネート（Ｄ６０９）（３０μＭ）の存在下で約５０％抑制されるに過ぎず、従って、ＰＣ−ＰＬＣおよび酸性スフィンゴミエリナーゼの並列抑制法は、分子内酸化ストレスにもとづき周皮細胞のアポトーシスを誘起すると云える。
【００２２】
従って、本発明は、特に、糖尿病性網膜症の処置および／または予防に有効な医薬の調製のため下記の使用に関する：
−ＤＡＧの生成抑制剤としてのホスファチジルコリン−ホスホリパーゼＣ（ＰＣ−ＰＬＣ）の抑制剤、
−セラミドの生成抑制剤としての酸性スフィンゴミエリナーゼの抑制剤、
実際、これらの抑制剤は、アポトーシスに対して網膜周皮細胞を保護する能力について注目に値する。
【００２３】
ホスファチジルコリン−ホスホリパーゼＣの抑制剤のうち、特に、Ｄ６０９およびその誘導体を挙げることができる。
【００２４】
酸性スフィンゴミエリナーゼの抑制剤のうち、特に、デシプラミンまたはその誘導体を挙げることができる。
【００２５】
更に、アポトーシスに関連するシステインにおけるプロテアーゼエフェクターの特定のペプチド系抑制剤にもとづき、本発明者は、ＡＧＥなよる周皮細胞のアポトーシスにおけるカスパーゼの介入を調査できた。上記ペプチドは、Ｎ−末端側でベンジルオキシカルボニル基（ｚ）によって且つ細胞に対する透過性を向上するＣ−末端側の（Ｏ−メチル）フルオロメチルケテン基（ｆｍｋ）によって化学的に改質される。ＡＧＥによって誘起される周皮細胞のアポトーシスについてテストしたペプチドを以下に示す：
−トリペプチドｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ、すべてのカスパーゼの抑制剤、
−ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋ、カスパーゼエフェクター、即ち、カスパーゼ３の特定の抑制剤、
−ｚ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋ、カスパーゼエフェクター、即ち、カスパーゼ９の特定の抑制剤、
−ｚ−ＩＥＴＤ−ｆｍｋ、カスパーゼイニシエータ、即ち、カスパーゼ８の特定の抑制剤、
−ｚ−ＶＤＶＡＤ−ｆｍｋおよびｚ−ＡＥＶＤ−ｆｍｋ、それぞれ、カスパーゼイニシエータ２およびカスパーゼイニシエータ１０の抑制剤。
【００２６】
ペプチドｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（パンカスパーゼ抑制剤）、ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋ（カスパーゼ３）、ｚ−ＡＥＶＤ−ｆｍｋ（カスパーゼ１０）およびｚ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋ（カスパーゼ９）は、ＡＧＥによって誘導された４つのすべてのアポトーシスを抑制するが、ペプチドｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋのみは、ＤＡＧおよびセラミドの生成を抑制し、他方、ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋおよびｚ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋは、有効ではない。従って、カスパーゼイニシエータは、ＤＡＧおよびセラミドの生成の上流において生じ、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによって抑制されると云える。更に、２つのカスパーゼエフェクター、即ち、カスパーゼ３およびカスパーゼ９は、アポトーシスの最終段階において生じ、それぞれ、ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋおよびｚ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋによって抑制され、ＤＡＧおよびセラミドの生成後に位置づけられ、これら双方のペプチドによって作用されない。
【００２７】
使用した抑制剤の特殊性にもとづき、生じたカスパーゼイニシエータは、カスパーゼ−８ではなく、ｚ−ＩＥＴＤ−ｆｍｋは、アポトーシスに有効ではないと思われる。これに反して、ｚ−ＡＥＶＤ−ｆｍｋによって抑制されるカスパーゼ１０は、生ずると考えられ、このペプチドは、ＡＧＥによって誘導された周皮細胞のアポトーシスを完全に抑制する。他方、ｚ−ＶＤＶＡＤ−ｆｍｋは、アポトーシスを部分的に抑制し、従って、カスパーゼイニシエータ２自体も生ずると云える。総括して、これらの研究によって、完全に、カスパーゼ２またはカスパーゼ１０は、カスパーゼイニシエータとして、ＡＧＥによって誘導された周皮細胞アポトーシスを誘起するカスパーゼ中に生じ、カスパーゼエフェクター９およびカスパーゼエフェクター３は、上記アポトーシスの最終段階に生ずると思われるということが判明した。
【００２８】
従って、本発明は、特に、糖尿病患者の網膜症の予防および／または処置に有効であってアポトーシスに対して網膜周皮細胞を保護する医薬の調製のためのカスパーゼ抑制剤の使用に関する。
【００２９】
このような抑制剤は、ペプチドタイプであるのが好ましい。Ｎ−末端側でベンジルオキシカルボニル基（ｚ）によって且つ細胞に対する透過性を向上するＣ−末端側の（Ｏ−メチル）フルオロメチルケテン基（ｆｍｋ）によって化学的に改質されたペプチドが有利である。カスパーゼ抑制剤ペプチドの例として、すべてのカスパーゼの抑制剤であるトリペプチドｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋを挙げることができる。
【００３０】
本発明にもとづき、特に、糖尿病性網膜症の予防または処置に有効な医薬の調製のため、好ましくは、カスパーゼ２またはカスパーゼ１０から選択したカスパーゼイニシエータの抑制剤および／または、好ましくは、カスパーゼ３，６，７または９（特に好ましくは、カスパーゼ３または９）から選択したカスパーゼエフェクターの抑制剤の使用を考慮する。
【００３１】
カスパーゼイニシエータ１０の抑制剤の例として、ペプチドｚ−ＡＥＶＤ−ｆｍｋを挙げることができる。カスパーゼイニシエータ２の抑制剤の例として、ペプチドｚ−ＶＤＶＡＤ−ｆｍｋを挙げることができる。カスパーゼエフェクター９の抑制剤の例として、ペプチドｚ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋを挙げることができる。カスパーゼエフェクター３の抑制剤の例として、ペプチドｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋを挙げることができる。
【００３２】
本発明にもとづき、特に、糖尿病性網膜症の予防または処置に有効な医薬の調製のため、好ましくは、以上に挙げた網膜周皮細胞の少なくとも２つのアポトーシス抑制剤の組合せの使用を考慮する。従って、本発明の好ましい実施例にもとづき、下記から選択した少なくとも２の化合物の有効量を患者に同時に投与する：
−酸化防止化合物、
−ホスファチジルコリン−ホスホリパーゼＣ（ＰＣ−ＰＬＣ）の抑制剤、
−酸性スフィンゴミエリナーゼの抑制剤、
−カスパーゼ抑制剤。
【００３３】
網膜周皮細胞の上記のアポトーシス抑制剤の投与は、同時にまたは別個に行うことができる。従って、本発明は、更に、作用剤として網膜周皮細胞の少なくとも１つの上記アポトーシス抑制剤を含む医薬組成物に関する。
【００３４】
従って、本発明は、更に、酸化防止剤、セラミドおよび／またはＤＡＧの生成抑制化合物、酸性スフィンゴミエリナーゼの抑制剤、ホスファチジルコリン−ホスホリパーゼＣの抑制剤、上記の如きカスパーゼの抑制剤またはこれらの少なくとも２の混合物から選択した少なくとも１つの化合物を作用剤として含む組成物に関する。実際、このような組成物は、糖尿病性網膜症の予防または処置に特に有効である。
【００３５】
このような組成物の好ましい例として、上記組成物中で上記の如き少なくとも１つのカスパーゼ抑制剤と組合せた酸化防止剤および／または酸性スフィンゴミエリナーゼの抑制剤および／またはホスファチジルコリン−ホスホリパーゼＣ（ＰＣ−ＰＬＣ）の抑制剤を作用剤として含む組成物を挙げることができる。
【００３６】
本発明に係る組成物は、毎日の投与が可能な作用剤量、即ち、好ましくは、約０，０１〜約２００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、約０，５〜約７０ｍｇ／ｋｇ体重、理想的には、約１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重の適切な処方で、当業者に知られているすべての投与形態、即ち、一般的形態（ｐ．ｏ．）、皮下注形態（ｓ．ｃ．）、腹膜内注入形態（ｉ．ｐ．）または静注形態（ｉ．ｖ．）を取り得るが、量は、上記の数値に限定されるものではなく、毒性が殆どない化合物の場合またはインビボで低活性の化合物の場合、より多量であってよい。経眼以外の投与の場合、上記の如き作用化合物のみを含む組成物中の服用量として投与するため補薬と組合される作用剤量は、変更でき、投与形態に依存する。典型的な調剤は、約５％−９５％（ｗ／ｗ）の作用化合物を含む。調剤が、約２０％−８０％（ｗ／ｗ）の作用化合物を含んでいれば好ましい。
【００３７】
上記の如き少なくとも２つの作用化合物を含む本発明に係る組成物の場合、各化合物は、上記の如き単独治療レジメとして通常投与される量の約１０％−８０％の範囲の量として存在する。患者の状態の改善時、必要であれば、本発明に係る化合物、組成物または組合せの維持量を投与できる。更に、投与量または投与度数は、症状に依存して減少でき、上記症状が所望のレベルに制限された場合、処置を中断すればよい。同様に、若干の患者は、網膜症の何らかな症状の再発まで長期にわたって間欠的処置を必要とする。
【００３８】
一般的投与形態の処方は、極めて多様であり、１つまたは複数の作用剤、補薬、風味修飾剤、緩衝剤、保存剤を含み、当業者に知られており薬学的に許容できる錠剤、カプセル、粉末、溶液であってよい。注入可能な形態は、当業者に知られている生理学的数値（ｐＨ７，０−７，４）の近傍の数値にｐＨを調整する塩組合せを含み、場合によっては更に、作用成分の溶解度を増加する界面活性剤を含む溶媒（好ましくは、水性溶媒）中に、場合によっては、誘電率を減少できる共溶媒中に、１つまたは複数の作用成分を含む。
【００３９】
本発明に係る好ましいすべての投与形態は、局所投与または眼注入からなる。この投与形態によって、一般的形態で投与されたカスパーゼ抑制剤の長期の使用に起因するマイナスの系統的、一般的効果を制限できる。本発明にもとづき眼投与のための医薬組成物は、担体中に溶解したまたは懸濁させた１つまたは複数の作用化合物を含む適切な軟膏（クリーム、ゲルまたは溶液）として処方できる。
【００４０】
従って、例として、目薬を挙げることができる。この場合、薬学的に許容される目薬担体は、等電点の塩化ナトリウム（０，９％，３０８ｍＯｓｍ／Ｌ）であってよく、あるては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、塩化カルシウム、ホウ酸、ホウ酸塩またはホウ酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、ヒドロゲノリン酸ナトリウム・２水加物、ジヒドロゲノリン酸ナトリウム・１２水加物、場合によっては涙の粘度をシュミレートする物質（例えば、ヒプロメロース４０００ｃＰ）を含むソルビトール、デキストラン、保存剤（例えば、エデン酸ナトリウム）、臭化ベンゾドデシニウム、マーキュロチオール酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、パラヒドロキシ安息香酸メチル、メタ重亜硫酸ナトリウム、ホウ酸フェニル水銀を含む等電点塩溶液であってよい。上記化合物は、本発明の非限定的例である。
【００４１】
眼用クリームまたはゲルの場合、各種のポリマー、例えば、カルボメール９８０ＮＦ（４・１０^６Ｄａのポリマー）、ソルビトール、油（例えば、パラフィン）、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルエステルワックス、ワセリン、メチルセルロース、グリースを使用できる。上記化合物には、当業者に知られている他の乳化成分を加えることができる。
【００４２】
本発明に係るこのような組成物は、例えば、長期の望ましくない反応の危険性および局所処置の停止を招くことになる極めて大きい系統的継代を完全に限定するため、０，０１−１０重量％（好ましくは、０，０１−４重量％）の上記抑制剤を含む。本発明に係る典型的投与は、例えば、１回／日〜４回／日、好ましくは、１回または２回／日の粘膜の盲嚢への投与である。
【００４３】
コポリマー（メチルセルロース１５ｃＰまたはヒドロキシプロピルセルロース８０−１２０ｃＰ（Ｄｅｓａｉら，１９９８）の２つの層の間に保持され、例えば、上記の如き１つまたは複数の化合物を含み、ポリアクリラートゲル、ブチルシアノアクリラートゲルまたはプルロンゲルＦ１２７（（Ｄｅｓａｉら，１９９８）またはフィプリンまたはコラーゲン（Ｒｕｂｉｎら，１９７３）からなる楕円体形容器から形成され、粘膜の盲嚢に設置され１つまたは複数の化合物の経時的投与を制御するＯｃｕｓｅｒｔタイプの薬品投与システム（Ｆｒｉｅｄｅｒｉｃｈ，１９７４）は、本発明の部分をなす。作用化合物を含む溶液を含浸させ粘膜盲嚢に数分間設置したスポンジ片５×２ｍｍまたは７×４ｍｍ（Ａｌｔｏｍｅｄ^ＴＭ、更に、Ｗｅｃｋ^ＴＭまたはＭｅｒｏｃｅｌ^ＴＭ）は、製品の局所投与のために考慮できる（Ｗｉｌｋｉｎｓら，２０００）。
【００４４】
本発明に係る組成物は、例えば、油またはソーヤレシチン、ゼラチン中のエマルジョンとして処方でき、この場合、上記の如き化合物を、おおよそ１μの液滴（リポソーム）として封入する（Ｖａｎｄｅｒｖｏｏｒｔら，１９９９）。調剤の粘度は、メチルセルロースまたはカルメロースナトリウムの添加によって増大できる（Ｚｕｒｏｗｓｋａ−Ｐｒｙｃｚｋｏｗｓｋａ，１９９９）。化合物は、更に、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキシトリン（例えば、５％溶液）中に封入でき、この場合、濃度は、任意ではあるが、１つまたは複数の作用成分に関して１：１のモル比よりもできる限り低くでき、かくして、その生体利用度、その安定性おおよその溶解度が増大される（Ｆｒｅｅｄｍａｎら，１９９３）。
【００４５】
本発明は、更に、糖尿病性網膜症の処置および／または予防の医薬の調製のための、カスパーゼ、ホスファチジルコリンホスホリパーゼＣ、酸性スフィンゴミエリナーゼをコーディングするシークェンスから選択したポリヌクレオチドシークェンスの一部を付加した、オリゴヌクレオチドアンチセンスの利用に関する。
【００４６】
実際、オリゴヌクレオチドホスホロチオネートアンチセンスは、特殊な遺伝子発現を調整する機会を与え、臨床使用のための大きなポテンシャルの担体である。カスパーゼ２，３，９または１０またはＰＣ−ＰＬＣに対するまたは、更に、酸性スフィンゴミエリナーゼに対する６−２５のヌクレオチド長さの各種サイズの各種のオリゴマーアンチセンスが、合成され、単独でまたは組合せて使用されている。
【００４７】
上記オリゴヌクレオチドアンチセンスは、交差反応を回避し且つ最大限に特有であるよう、上記酵素のＮ−末端またはＣ−末端の近傍のカスパーゼシークエンスで定義される。ＰＣ−ＰＬＣのオリゴヌクレオチドは、活性側に保持されたヒスチジン（例えば、リステリアモノシトゲンのタンパク質のＨ６９およびＨ１１８）の近傍のＣ−末端部分またはＮ−末端部分で定義される（Ｚｕｃｋｅｒｔ ＷＲら，１９９８）。
【００４８】
酸性スフィンゴミエリナーゼのオリゴヌクレオチドは、最大限に特有であり交差反応が避けられるよう、ヒトの酵素のＮ−末端部分またはＣ−末端部分で定義される（Ｓｃｈｕｃｈｍａｎら，１９９１）。
【００４９】
オリゴヌクレオチドは、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）の膜片（Ｋａｒｅｓｈ，１９８７）またはポリウレタン膜片（Ｎｕｙｔｓら，１９９９）上で、ポリオキシエチレン・ポリスペリミン・コポリマーまたはフィブリノーン微小球の存在下で（Ｏｇａｎｅｓｉａｎら，１９９９）の存在下で、１−１０μＭの範囲の濃度において混合され、このパッチは、眼内部に、基底膜のキャビティおよび網膜下方のスペースに、偏平部（角膜・強膜・接合部の側方４−５ｍｍにある２ｍｍのスペース）のマイクロサージェリー技術によって被覆し（Ａｌｇｖｅｒｅら，１９９９）、場合によっては、上記抑制剤の低速の拡散を時間的に制御できるよう、Ｎ−ブチルシアノアクリラート（Ｎｅｘａｃｒｙｌ^ＴＭ）をベースとする接着セメントで適所に保持する（Ｌｅａｈｅｙら，１９９３）。
【００５０】
更に、オリゴヌクレオチドアンチセンスは、そのまま注入できるか、各種の脂肪または油で乳化後、リポソーム内に封入し、次いで、溶融後にＨＶＪ（センダイウイルス）の被膜で被覆し、次いで、偏平部を介して網膜下方のスペースに注入する（Ｈａｎｇａｉら，１９９８）。注入量は、有効であるよう、眼当り１０−２００μｇの範囲にあれば有利である（Ｌｅｅｄｓら，１９９８）。
【００５１】
本発明にもとづき、更に、糖尿病性網膜症の処置および／または予防法においてカスパーゼ２，３，９，１０について遺伝子アンチセンス戦略を利用することを考慮する。実際、上記カスパーゼの遺伝子アンチセンスは、既述の如く偏平部を介して注入後、以下に説明する如く、網膜下方のスペースに注入されたアデノウイルス中に導入される（Ｌａｉら，２０００）。
【００５２】
本発明にもとづき、更に、糖尿病性網膜症の処置および／または予防のための医薬の調製のため、アミノ酸が２つまたは３つから５つまたは６つの環式または線形ペプチド、即ち、カスパーゼの競合抑制剤の利用を考慮する。
【００５３】
例えば、カスパーゼの一般的抑制剤であるＶＡＤ、カスパーゼ３の特有な抑制剤であるＤＥＶＤ、カスパーゼ１０の特有な抑制剤であるＡＥＶＤ、カスパーゼ２の特有な抑制剤であるＶＤＶＡＤまたはカスパーゼ９の特有な抑制剤であるＬＥＨＤなどのペプチドが対象である。これらの線形ペプチドは、Ｎ−末端側でアセチル基またはベンジル基（限定されるものではないが、例えば、ベンジルオキシカルボニル基（ｚまたはＢＯＣ））によって且つＣ−末端側でメチルケトン基（限定されるものではないが、例えば、フルオロメチルケトン基またはクロロメチルケトン基または２，６−ジメチルベンゾイルメチルケトン基または２，６−ジクロロベンゾイルメチルケトン基）によって化学的に保護される。この場合、アミノ酸、即ち、アスパラギン酸（Ｄ）の側鎖は、Ｏ−メチルである。従って、これらのペプチドは、細胞に対する透過性を改善するＫａｐｏｓｉの繊維芽細胞（ＦＧＦ）の増加係数の信号ペプチドの疎水性シークエンスから生ずる１６のアミノ酸のペプチドに結合できる（ＮＨ_２−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ−ＣＯＯＨ）。更に、本発明において、ベンジル基およびフルオロメチルケトン基によって保護されたアスパラギン酸塩誘導体も考慮できる。これらのペプチドは、ｓ．ｃ．，ｉ．ｐ．またはｉ．ｖ．による注入によって投与でき、あるいは、結膜盲嚢に局所投与（好ましくは、ｉ．ｖ．投与）でき、予防処置の枠内において注入頻度の減少のため低速の制御された注入を実現できる処方で投与できる。このような溶液は、現存し、（ａ）ほぼ１−１００μｍの径を有する微小球の形でまたはほぼ０，８ｍｍ−１，５ｍｍのサイズの円筒形インプラント（“ミニ円筒体”と呼ぶ）の形で注入できる、ペプチドおよびその拡散制御剤を含む生体分解可能なポリマー（限定されるものではないが、例えば、ポリ（ＤＬ−ラクチドコグリコリド）（ＰＬＧＡ））の調剤から構成される（Ｚｈｕら，２０００）。更に、本発明の枠内において、ポリマー中への封入時に制酸剤（例えば、Ｍｇ（ＯＨ）_２）の存在下で組込まれるペプチドの安定性を考慮する（Ｚｈｕら，２０００）。
【００５４】
本発明は、更に、糖尿病性網膜症の処置および／または予防のための医薬の調製のため、カスパーゼの競合抑制剤としての２−１０のアミノ酸のペプチドをコーディングする少なくとも１つのポリヌクレオチドシークエンスを含む核酸分子の利用に関する。
【００５５】
実際、本発明にもとづき、更に、ガラス体内および網膜下のレベルにおいてインシトゥで上記のリトルペプチドを局部的且つ連続的に生成することからなる糖尿病性網膜症の処置および／または予防法を考慮する。この場合、このようなアプローチにおいて通常利用されるベクターによる遺伝子治療のプロトコルの枠内において、カスパーゼ抑制剤としての上記のリトルペプチドの遺伝子発現戦略を使用するのが有利である。例えば、ＶＡＤ、ＤＥＶＤ、ＶＤＶＡＤまたはＡＥＶＤのペプチドシークエンスに対応するデソキシリボンヌクレチドオリゴマーは、当業者に周知の自動機によって合成できる。ＡＥＶＤの場合、下記シークエンスを付加した２つのオリゴマー、即ち、コーディングオリゴマーである５´−ＧＡＴＣＣ（ＧまたはＡ）（Ｔ，Ｃ，ＡまたはＧ）（Ｔ，Ｃ，ＡまたはＧ）ＡＴＧＧＣ（Ｔ，Ｃ，ＡまたはＧ）ＧＡ（ＡまたはＧ）ＧＴ（Ｔ，Ｃ，ＡまたはＧ）ＧＡ（ＴまたはＣ）ＴＡＡＧ−３´Ｃおよび非コーディングオリゴマーてせある５´−ＡＡＴＴＣＴＴＡ（ＡまたはＧ）ＴＣ（Ｔ，Ｃ，ＡまたはＧ）ＡＣ（ＴまたはＣ）ＴＣ（Ｔ，Ｃ，ＡまたはＧ）ＧＣＣＡＴ（Ｔ，Ｃ，ＡまたはＧ）（Ｔ，Ｃ，ＡまたはＧ）Ｇ−３´の生成が対象となる。次いで、合成した２つのオリゴマーを、バクテリオファージＴ４のキナーゼによってホスホリル化し、交雑して、ペプチドシークエンスＡＥＶＤに対応するＤＮＡダブル片のシークエンスを形成し、次いで、ｐＡＣタイプの発現ベクターの適切な制限酵素（本例の場合はＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ）の切断サイトを含むポリリンカーにおいて上記シークエンスをクローン化し、次いで、以降の戦略にもとづき所望のリトルペプチドを発現する組換えアデノウイルスを形成できる。ベクターｐＡＣＣＭＶｐＬｐＡは、シトメガロウイルス（ＣＭＶ）の早発構成遺伝子のプロモータ／エンハンサー、ベクターｐＵＣ１８の制限サイトのポリリンカー（ｐＬ）およびベクターｐＡＣ中にリトル抗体−Ｔ（ｔ）およびポリアデニル化信号（ｐＡ）を含むサルウイルスＳＶ４０のゲノムのフラグメントを挿入することによって生成される（Ｇｌｕｚｍａｎら，１９８２）。次いで、シークエンスＡＥＶＤに接する制限サイトに対応する制限酵素（本例の場合はＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ）によって線形化したベクターにシークエンスＡＥＶＤに対応するＤＮＡダブル片を導入する。次いで、従来のバクテリアクローン技術によって、対応するプラスミドを生成し、ポリリンカーの並置シークエンスを利用してブロック共重合によって挿入を実現する。次いで、生じたプラスミドを、リン酸カルシウムによるＤＮＡの共沈によって細胞２９３（アデノウイルスＡｄＥＡにトランスフェクションされたヒトの腎臓の胚細胞）（Ｇｒａｈａｍら，１９７７）中にｐＪＭ１７（ＭｃＧｒｏｒｙら，１９８８）とともにトランスフェクションする。ｐＪＭ１７は、バクテリアプラスミドｐＢＲＸによってアデノウイルスの遺伝子地図の位置３．７ユニットにおいて完全に中断され、従って、アデノウイルスの包含限界を越えたゲノムシークエンスのアデノウイルス５をコーディングする。細胞２９３の組換えプラスミドｐＡＣＣＭＶｐＬｐＡとｐＪＭ１７との間の相同の組換えは、包含可能なサイズのゲノムを生成し、上記ゲノムの早発範囲は、クローン化された仮想遺伝子によって置換され、従って、組換えウイルスの複製は不可能となる。生じたウイルスは、ＡｄＣＭＶ−ＡＥＶＤと呼ばれる。シークェンスＡＥＶＤの第１フランクを利用し且つ得られたＰＣＲ生成物をシークェンシングしてＰＣＲによって、ペプチドＡＥＶＤにおける対応する挿入の存在が確認された。次いで、５−５０×１０^７のプラーク形成ユニット（ｐｆｕ）／ｍｌを含みウシの胎児の血清１０％を加えたＤＭＥＭ中に貯蔵したストックにおいて適切なウイルスプラークを増幅させた。次いで、組換えアデノウイルスを利用し、既述の技術の１つによってカプセルに封入し、網膜下スペース内の偏平部を介して静脈内キャビティに注入し、インシトゥで、アポトーシスによる周皮細胞の損失を阻止できるカスパーゼ抑制剤を連続的に広範囲に生成できる。
【００５６】
本発明は、更に、糖尿病性網膜症を予防または処置できる化合物の特定法に関する。この特定法は、ＡＧＥによって処置した周皮細胞の培養体を被処置化合物と接触させ、上記周皮細胞中のアポトーシスを評価して上記化合物の糖尿病性網膜症の予防能または処置能を求めることを特徴とする。この評価において、上記化合物によっておよび／またはＡＧＥによって処置してない周皮細胞の培養のアポトーシスとの比較を行えば有利である。
【００５７】
被検化合物は、既に考慮した化合物、特に、下記を含むグループから選択する：酸化防止剤、セラミドおよび／またはＤＡＧの生成抑制剤、カスパーゼ抑制剤、カスパーゼ、ホスファチジルコリンホスホリパーゼＣ、酸性スフィンゴミエリナーゼをコーディングするシークェンスから選択したポリヌクレオチドシークェンスの一部を付加した、６−２５のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドアンチセンス、２−１０のアミノ酸のペプチドをコーディングする少なくとも１つのポリヌクレオチドシークェンスを含む核酸、カスパーゼの競合抑制剤。
【００５８】
本発明の他の利点および特徴は、下記に関する説明から明らかであろう：
１）ウシの網膜周皮細胞に対するＡＧＥ−メチルグリオキサールの効果
２）培養時の網膜周皮細胞へのＡＧＥ−メチルグリオキサールによる酸化ストレスの導入
３）ＡＧＥ−メチルグリオキサールに応答する網膜周皮細胞内の活性化セラミドおよびＤＡＧの生成法
４）カスパーゼの影響。
【００５９】
Ａ部：材料および方法
Ｉ−材料
１）試薬
細胞培養のためのすべての製品は、ＳＶＦ（Ｇｉｂｃｏ，フランス）、コラゲナーゼＩＡおよびコラゲナーゼ／ディスパーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｈｅｉｍ，フランス）を除いてＳｉｇｍａ（フランス）から入手した。他のすべての試薬は、“分析用”純度であり、シリカ板（シリカゲル６０Ｇ，メルク）、ＤＡＧキナーゼおよびセラミド（Ｔｅｂｕ，フランス）を除いて、Ｓｉｇｍａ（フランス）から購入した。カラムＰＤ−１０は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（スウェーデン）から入手した。アネキシン−Ｖによるマーキングキットは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｈｅｉｍ（フランス）から入手した。Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、デシプラミン、リポ酸およびエブセレンは、Ｓｉｇｍａ（フランス）から入手した。カスパーゼ抑制剤としてのペプチドは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（フランス）、フモニシンＢ１およびＤ６０９は、Ｂｉｏｍｏｌ（フランス）から入手した。
【００６０】
医薬溶液の調製：
アクロディスク殺菌フィルタ０，２μｍ（Ｇｅｌｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ）によって溶液を殺菌した。
【００６１】
Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの１μＭの母液は、必要な際に調製した：１６３，２ｍｇを１ｍｌのＤＭＥＭに溶解し、溶液を無菌濾過した。
【００６２】
エタノール中のコエレンテラミンの１，２ｍＭの母液は、必要な際に調製し、２μＭの最終濃度で細胞に加えた。
【００６３】
ゼアキサンチンは、濃度１，２ｍＭで無菌ＤＭＳＯに溶解し、２μＭの濃度で細胞に加えた。
【００６４】
エブセレンの１０ｍＭストック溶液は、１ｍｌのエタノールに溶解した２，７４ｇの製品から調製し、次いで、溶液を分割し、−２０℃に保管した。
【００６５】
デシプラミンの１００ｍＭの母液は、必要な際に調製した：３０，３ｍｇを１ｍｌの蒸留水に溶解し、次いで、溶液を無菌濾過した。
【００６６】
フモニシンＢ１の１ｍＭ母液は、１３７８μｌの蒸留水に溶解した１ｍｇから調製し、次いで、溶液を殺菌、分割し、−１８０℃で凍結し、−２０℃に保管した。
【００６７】
Ｄ６０９の９，４ｍＭの母液は、必要な際に調製した：１ｍｇのＤ６０９を４００μｌの蒸留水に溶解し、次いで、溶液を無菌濾過した。
【００６８】
ペプチドｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ，ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋ，ｚ−ＡＥＶＤ−ｆｍｋ，ｚ−ＶＤＶＡＤ−ｆｍｋ，ｚ−ＩＥＴＤ−ｆｍｋおよびｚ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋの３０ｍＭのストック溶液は、それぞれ７０，５０，５４，４５，５１，４２μｌの無菌ＤＭＳＯに溶解した１ｍｇの無菌製品から調製した。各抑制剤の溶液を適切な容積に分割し、次いで、−２０℃に凍結させた。
【００６９】
２）装置
９６ピットｉＥＭＳ Ｒｅａｄｅｒ ＭＦ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）のプレート読取にもとづき分光分析を行った。蛍光計（タイプＬＳ ５０Ｂ）は、パーキン・エルマーの製品である。音波処理装置（モデルＢ１５）は、ブランソンの製品である。アポトーシスの検知は、フィルタＺｅｉｓｓ ＩＶ，ｎｏ．９を使用して蛍光顕微鏡Ａｘｉｏｐｌａｎ（カール・ツァイス）によって実施した（励起：４５０−４９０ｎｍ；放射＞５２０ｎｍ）。
【００７０】
ＩＩ−方法
１）ウシの網膜毛細管細胞の培養（Ｌｅｃｏｍｔｅら，１９９６）
新しく採取したウシの眼を屠殺場からガラス上に移し、直ちに、眼以外の組織を除去し、緩衝液ＰＢＳ内に置いた。次いで、すべての操作は、層流乾燥機の下で無菌状態で行った。培養すべき細胞の各ボックスについて、２つの眼が必要である。眼を、７０％エタノールに短時間浸漬し、次いで、（Ｃａ^２＋もＭｇ^２＋も含まない）媒体ＨＢＳＳ中で洗浄した。角膜の後ろの５ｍｍにおいてカットし、結晶体を含む後眼房および眼球に含まれるガラス体を除去した。ニューロン網膜を眼球から剥がし、視神経のレベルにおいてカットし、４℃の緩衝液ＨＢＳＳ中に置いた。この緩衝液は、ｐＨ７，４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ，１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含みＣａ^２＋もＭｇ^２＋も含まないＨＢＳＳから調製した。１０ｍｉｎの酸化処理（９５％Ｏ_２；５％ＣＯ_２）後、最終濃度が０，５％となるまで、２２％ＢＳＡを加えた。次いで、数滴のＮａＯＨによってｐＨを７，４に調整した（フェノールレッド指示薬の変色によって確認）。着色した汚染細胞を除去し、２つのロット毎に網膜をガラス上の１０ｍｌの緩衝液ＨＢＳＳ中に置いた。網膜をハサミでカットし（約２ｍｍの断片）、均一化（Ｄｏｕｎｃｅ １５ｍｌ，ビストンＡ）した後、遠心分離（３００ｇ，５ｍｉｎ，４℃）した。
【００７１】
周皮細胞（ＢＲＰ）の培養：
培養すべき各ボックス（径６ｃｍ）について、ウシの２つの網膜を使用した。２つの網膜の各ロットを、既述の如く、４℃において緩衝液ＨＢＳＳ１０ｍｌ中で処理し、均一化した。均一化物を遠心分離し（３００ｇ，５ｍｉｎ，４℃）、残渣をコラゲナーゼ／ディスパーゼ酵素溶液５ｍｌ中に懸濁させた。次いで、ｐＨ７，４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ，１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含みＣａ^２＋もＭｇ^２＋も含まない媒体ＨＢＳＳ中で調製した上記のコラゲナーゼ／ディスパーゼ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を、１０ｍｉｎ酸化し、ＴＬＣＫ（１４７ｎｇ／ｍｌ）およびＤＮａｓｅ（２００Ｕ／ｍｌ）を加えてｐＨを７，４に調整した。３７℃において２０ｍｉｎにわたって消化を行い、細胞残渣を共培養体中に再懸濁させた。次いで、サスペンジョンを、７０μｍメッシュのナイロンフィルタで無菌濾過した。フィルタ上に含まれた毛細管断片を緩衝液ＨＢＳＳ中に捕集し（フィルタを２回洗浄）、遠心分離し（３００ｇ，５ｍｉｎ，４℃）、同一の緩衝液で１回洗浄した。遠心分離後（３００ｇ，５ｍｉｎ，４℃）、毛細管断片を、１０％ＳＶＦ，２ｍＭグルタミンおよび抗生物質を含む３ｍｌのＤＭＥＭ中に再懸濁させた。ＤＭＥＭ２ｍｌにフィブロネクチン１００μｇを溶解した溶液を塗布（４μｇ／ｃｍ^２）したペトリボックス（径６ｃｍ）内で培養した（Ｓｕ＆Ｇｉｌｌｉｅｓ，１９９２）。３７℃において３時間、毛細管を接合させた後、媒体およびマトリックスに接着してない残渣を除去し、培養媒体３ｍｌを加えた。この媒体は、ウシの胎児の１０％血清（ＳＶＦ），ヘパリン８０μｇ／ｍｌ、グルタミンおよび抗生物質を含むＤＭＥＭから構成した。ＣＯ_２５％を含む加湿空気雰囲気下で、培養器内に３７℃に細胞を保持した。２４時間後、培養媒体を更新し、次いで、合流まで４８時間毎に更新した。
【００７２】
融合後、培養媒体を除去し、位相差顕微鏡で観察して細胞が丸くなるまで（約５ｍｉｎ），０，５％トリブシンおよび０，２％ＥＤＴＡを含む溶液によって細胞をトリブシン処理した。次いで、血清を含む培養媒体２ｍｌでトリブシンを不活性化し、細胞を回収し、遠心分離した（１８０ｇ，３ｍｉｎ，４℃）。比１：３で継代培養した細胞を、フィブロネクチンを被覆して同一媒体中で培養した３つのボックス（径６ｃｍ）において培養した。
【００７３】
２）先進グリコシル化生成物（ＡＧＥ）の存在下における周皮細胞の培養
同一ロットの細胞（同一の１次培養のＢＲＰ）についてＡＧＥの効果を調べた。融合時、１次培養のＢＲＰをトリブシン処理した。３７℃における３時間の融合後、媒体およびマトリックスに接着してない残渣を除去し、培養媒体（ＢＲＰのための１０％ＳＶＦ）を加えた。ＡＧＥの効果のテストのため、濃度が２０μＭになるまでＡＧＥ溶液（またはそのコントロール）を培養媒体に加えた。作用剤による１回または２回の継代の間、ＢＲＰについてそれぞれ７日間および１５日間、細胞を追跡した。
【００７４】
ＡＧＥの調製：
ＢＳＡ７，２ｍｇ／ｍｌおよびメチルグリオキサール１００ｍＭを３７℃において５０日間培養して、“ＡＧＥ−メチルグリオキサール”を調製した（Ｗｅｓｔｗｏｏｄら，１９５５）。同一の条件−但し、メチルグリオキサールは使用せず−においてアルブミンを培養してＢＳＡ−コントロールを得た。グリコシル化タンパク質は、その蛍光（３７０−４４０ｎｍ），培養時に内皮細胞への固定、単核食細胞および精製ＲＡＧＥを特徴とする（Ｙａｎら，１９９４）。
【００７５】
カラムＰＤ−１０において各標本を脱塩処理した（標本２，５ｍｌを濾過し、ＤＭＥＭ３，５ｍｌ中に回収した）。
【００７６】
３）ニトロセルロース膜上のブラックアミドの着色によるタンパク質の検量
Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ＆Ｗｅｉｓｓｍａｎ（１９７３）の方法にもとづき、タンパク質を検量した。ＳＤＳ１％を含む緩衝液トリス−ＨＣｌ（１Ｍ，ｐＨ７，５）３０μｌの添加前に、タンパク質を含む検量試料にＰＢＳを加えて２７０μｌとし、次いで、６０％トリクロロ酢酸６０μｌを加えた。上記溶液を“渦流流動”させ、室温に２ｍｉｎ放置して、タンパク質を沈殿させ、それぞれ、６％ＴＣＡで濡らした０，４５μｍニトロセルロースフィルタ上で所定の目印のレベルにおいて濾過した。ＢＳＡ０−２７μｇの標準スケールを並行して作成した。次いで、０，１％ブラックアミド溶液（メタノール：酢酸：水、４５：１０：４５、ｖ／ｖ／ｖの溶液として、ｗ／ｖ）中に浸漬した。次いで、フィルタを水浴中で洗浄し、次いで、タンパク質沈析レベルを除いて膜が完全に白色となるまで、脱色溶液（メタノール：酢酸：水、９０：２：８、ｖ／ｖ／ｖ）中で洗浄した。フィルタを洗浄し、沈析物を剥がし、タンパク質に固定された色素を、１ｍｌの溶離溶液（エタノール：水：ＮａＯＨ：ＥＤＴＡ、１００：１００：０，１：１，９、ｖ／ｖ／ｗ／ｗ）（一定の“渦流状態”で約１０ｍｉｎ）によって溶離した。上記溶液３００μｌ（９６ピット・プレート）について６２０ｎｍにおいて読取を行い、論理バイオリスにもとづき定量を行った。
【００７７】
４）ＡＧＥの存在下で培養した周皮細胞におけるアポトーシスの免疫細胞化学的評価
アポトーシス化細胞のアネキシンＶによる検知技術およびネクローシス化細胞のヨウ化プロビジウムによる検知技術を利用して、２μＭのＡＧＥ−メチルグリオキサールまたはそのコントロールによって、２回の継代中に培養された周皮細胞について、アポトーシスを検知、定量した。
【００７８】
アネキシンＶの着色：
プラズマ膜の外皮上のホスファチジルセリン（ＰＳ）の存在は、アポトーシス化細胞の特徴をなすものであり、フルオレセインでマーキングしたアネキシン−Ｖによって検知できる。このタンパク質は、実際、ＰＳについて極めて強い親和性を有する。同じくアネキシン−Ｖを固定する場合によるネクローシス化細胞とアポトーシス化細胞とを区別するため、ＤＮＡの挿入着色剤、即ち、臭化エチジウムと類似のヨウ化プロビジウムの存在下で、上記着色を実施した。このマーキングのため、周皮細胞は、予融合（融合の７５％）させなければならず、従って、ＡＧＥ−メチルグリオキサールまたはＢＳＡ−コントロールによって約１２日間のみ培養した。
【００７９】
ＢＲＰ（径３，５ｃｍのボックス）をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、フルオレセインでマーキングしたアネキシン−Ｖ溶液１０μｌおよびヨウ化プロビジウム溶液１０μｌ（何れも検量ケースから供給）を含む緩衝液ＨＥＰＥＳ５００μｌで暗室中で１０ｍｉｎ培養した。アポトーシス化細胞およびネクローシス化細胞は、アネキシン−Ｖを固定し、従って、蛍光顕微鏡下で緑色を呈するが、ネクローシス化細胞の核のみは、ヨウ化プロビジウムによって赤色に着色された。１０種類の領域、即ち、合計３００−８００の細胞について、ネクローシス化細胞の％およびアポトーシス化細胞の％を求めた。
【００８０】
５）セラミドおよびジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の検量
２μＭのＡＧＥ−メチルグリオキサールまたはそのコントロールによって、２回の継代中に培養された周皮細胞について、Ｐｒｅｉｓｓら（１９８６）の方法にもとづき、セラミドおよびジアシルグリセロールを測定した。この方法は、添付の図３に示した方式にもとづき、γ−リン上で、^３２ＰでマーキングしたＡＴＰの存在下でＥｃｈｅｒｉｓｃｈｉａｃｏｌｉから精製したジアシルグリセロールキナーゼ（ＤＡＧ−キナーゼ）によるセラミドおよびＤＡＧのホスホリル化にもとづく。
【００８１】
周皮細胞（径６ｃｍの２つまたは３つのボックス）を精製し、ガラス上の０，５ｍｌの水中で“ｒｕｂｂｅｒ ｐｏｌｉｃｅｍａｎ”で掻きとって回収した。ボックスは、更に、０，５μＣｉ／ｍｌになるよう［９，１０−^３Ｈ］−トリアシルグリセロール溶液１０μｌを加えた０，５ｍｌ（細胞サスペンジョン１ｍｌの容積）で洗浄した。
【００８２】
５．１）全脂質の抽出
次いで、ＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒ（１９５９）の方法によって全脂質を抽出した。この細胞サスペンジョンに、エタノール溶液としてのＢＨＴ（５ｍＭ）８０μｌを含むクロロホルム：メタノール・混合物（２：１，ｖ／ｖ）３，７５ｍｌを加えた。次いで、溶液を３０ｓｅｃ“渦流流動”させ、最短３０ｍｉｎ静止し、次いで、相分離のため、ＮａＣｌ（０，９％）１，２５ｍｌおよびクロロホルム１，２５ｍｌを加えた。遠心分離後（７００ｇ，５ｍｉｎ），下部有機相を採取し、クロロホルム１，５ｍｌによって２回、水相の抽出を反復した。次いで、脂質抽出物を捕集し、窒素流下でクロロホルムを気化させた。水相において、ブラックアミドの着色にもとづき全タンパク質を検量でき、有機相をエッペンドルフ管に回収し、次いで、窒素下で気化させた。
【００８３】
５．２）ＤＡＧキナーゼのホスホリル化
トリチウムでマーキングした同量のトリアシルグリセロールを含むセラミド（２５−２５００ｎｇ）およびＤＡＧ（２５−２５０００ｎｇ）の標準スケールを並行して作成した。次いで、洗剤溶液（ｎ−オクチルグルコピラノシド７，５％，カルジオリピン５ｍＭおよびＤＥＴＡＰＣ１ｍＭ）２０μｌに，１ｍｉｎの“音波処理”によって、脂質を溶解し、次いで、室温において１５ｍｉｎ培養した。反応緩衝液（イミダゾール１００ｍＭ，ＮａＣｌ１００ｍＭ，ＭｇＣｌ_２２５ｍＭ，ＥＧＴＡ２ｍＭ，ｐＨ６，６），ＤＴＴ１０ｍＭおよび非マーキングＡＴＰ１０ｍＭを含む溶液で１／１０に希釈した［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰ（５ｍＣｉ／ｍｌ）１０μｌを含むＤＡＧ−キナーゼ（４，８６ｍＵ）２０μｌ，イミダゾール１００ｍＭおよびＤＥＴＡＰＡＣ（ｐＨ６，６）１ｍＭを添加して、反応を開始させた。室温において１時間、反応を継続し、次いで、クロロホルム：メタノール：１Ｎ塩酸・混合物（１００：１００：１，ｖ／ｖ／ｖ）１ｍｌ，ＨＥＰＥＳ１０ｍＭ，ＮａＣｌ１，３５ｍｌ，ＣａＣｌ_２１，５ｍＭ，ＭｇＣｌ_２０，５ｍＭおよびグルコース５，６ｍＭを含む緩衝液（ｐＨ７，４）１７０μｌおよび１００ｍＭのＥＤＴＡ３０μｌによって反応を停止させた。次いで、混合物を“渦流流動”させ、室温に１５ｍｉｎ放置し、次いで、室温において遠心分離（１００００ｇ，５ｍｉｎ）した。
【００８４】
（下部）有機相を採取し、窒素下で気化させた。次いで、エーテル：メタノール・混合物（９：１，ｖ／ｖ）３００ｍｌによって回収し、シリカ板上に被覆した。移動溶媒としてのクロロホルム：メタノール：酢酸・混合物（６５：１５：５，ｖ／ｖ／ｖ）を使用して、ホスファチジン酸およびトリアシルグリセロールからセラミド−１−ホスフェートを分離した。
【００８５】
オートラジオグラフィーフィルム上にシリカ板を露光させて（３０ｍｉｎ，−８０℃）、^３２Ｐでマーキングした各種脂質を観察した。セラミド−１−ホスフェートおよびホスファチジン酸に対応する斑点および移動フロントの１ｃｍ前の３つの斑点（トリアシルグリセロールに対応）を黒鉛筆でマーキングし、掻き取った。シリカを計数容器に回収し、メタノール２００μｌ，蒸留水２００μｌおよびシンチレーション液（Ｐｉｃｏｆｌｕｏｒ）で２時間、濡らし、次いで、シンチレーション液８ｍｌを追加した。次いで、各容器において、^３２Ｐまたは^３Ｈから放射された放射線を計数した。更に、［９，１０^−３Ｈ］−トリアシルグリセロール母液から放射された放射線を計数し、かくして、各試料の反応率を計算できた。次いで、各試料中に存在するセラミド量およびジアシルグリセロール量を、収率を考慮して標準スケールから外挿によって求め、タンパク質全量と対比させた。
【００８６】
Ｂ部：結果
Ｉ−ウシの網膜周皮細胞に対するＡＧＥ−メチルグリオキサールの効果
先行のインビトロ実験において、網膜周皮細胞の増殖に対するＡＧＥ−グルコースの毒性効果が確認されている（Ｒｕｇｇｉｅｒｏ−Ｌｏｐｅｚら，１９９７）。
【００８７】
網膜周皮細胞に対するＡＧＥ−メチルグリオキサールの効果に対する研究は、特に興味深い。実際、メチルグリオキサールは、糖尿病において極めて重要であると考えられる。糖尿病の場合、ジカルボニルの血中濃度は、著しく増加する（ＭｃＬｅｌｌａｎら，１９９４）。更に、メチルグリオキサールから誘導される先進グリコシル化生成物は、糖尿病の如き慢性疾患中に、大きな化学的変質を示すということが発表されている（Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔら，１９９８）。
【００８８】
糖尿病の慢性状況をシミュレートするため、ＡＧＥ−メチルグリオキサールの存在下で２回の継代の間（約１５日間）、ＢＲＰを培養した。研究の目的は、第１に、ＡＧＥ−メチルグリオキサールが周皮細胞のアポトーシスを誘導するか否かを調べ且つこの現象がセラミドおよびＤＡＧの著しい生成に関連するか否かを調べることにある。
【００８９】
１）ＡＧＥ−メチルグリオキサールに応答する周皮細胞のアポトーシス
２μＭのＡＧＥ−メチルグリオキサールまたはそのコントロールによって２回の継代の間に培養したＢＲＰにおいて、アネキシン−Ｖおよびヨウ化プロビジウムのマーキングによって、アポトーシスを検知、定量した（材料および方法の項参照）。この技術によって、プラズマ膜の内皮から外皮へのホスファチジルセリンのトランスロケーション、即ち、アポトーシスの早発相を特徴づける生化学的現象が確認される。フルオレセインでマーキングしたアネキシン−Ｖは、アポトーシス化細胞およびネクローシス化細胞を緑色に着色するが、ネクローシス化細胞のみは、プラズマ膜の完全性を失い、ヨウ化プロビジウムを透過し、その結果、細胞核が赤色に着色される。図４に、ウシの網膜周皮細胞のアポトーシスに対するＡＧＥ−メチルグリオキサールの効果を示した。２μＭのＡＧＥ−メチルグリオキサールまたはＢＳＡ−コントロールの存在下で２回の継代の間（約１５日間）、細胞を培養した。結果を、全細胞集団中のアポトーシス化細胞の％として示した。
【００９０】
アポトーシス化細胞の割合は、２μＭのＡＧＥ−メチルグリオキサールで培養した全周皮細胞の８，９±１，１％（平均値±ＳＥＭ，ｎ＝１０，ｐ＜０，０５）であり、他方、
２μＭのＢＳＡ−コントロールで培養した細胞の場合、２，９±０，３４％に過ぎなかった。即ち、ＡＧＥ−メチルグリオキサールは、周皮細胞中のアポトーシス率を平均して約３倍増大する。ネクローシス化細胞は、全く認められなかった。
【００９１】
２）周皮細胞中のセラミドおよびＤＡＧの生成
セラミドおよびＤＡＧがアポトーシスを誘起する形質導入信号に関連するか否かを知るために、２μＭのＡＧＥ−メチルグリオキサールまたはそのコントロールによって２回の継代の間（約１５日間）培養した周皮細胞について、これら２つの化合物を検量した。使用した検量技術は、放射性ＡＴＲ（^３２Ｐ）の存在下でＤＡＧ−キナーゼによるセラミドおよびＤＡＧのホスホリル化に依拠する（材料および方法の項参照）。図５に、ウシの網膜周皮細胞中のセラミドおよびＤＡＧの生成に対するＡＧＥ−メチルグリオキサールの効果を示した。結果は、ＢＳＡコントロールによって培養したコントロール細胞の変化（単位：％）として示した。
【００９２】
ＢＲＰにおいて、ＡＧＥ−メチルグリオキサールに応答して、セラミドの生成の刺激＋８５±１２％（平均値±ＳＥＭ，ｎ＝１０，ｐ＜０，０５）が確認され、ＤＡＧの生成の刺激（＋９４±９％）が確認された。
【００９３】
３）結論
２μＭのＡＧＥ−メチルグリオキサールによって約１５日間培養した細胞をアネキシン−Ｖおよびヨウ化プロビジウムでマーキングしたことによって、ＢＲＰのアポトーシス化率が平均して３倍増大することを検知できた。かくして、ＡＧＥ−メチルグリオキサールは、培養時に周皮細胞のアポトーシスを長期にわたって誘導すると云える。アポトーシスによる網膜周皮細胞の消失は、インビトロではグルコースの急激な変動に応答すると報告されており（Ｌｉら，１９９６），ビボ外では糖尿病患者および糖尿病ラットの網膜に認められると報告されている（Ｍｉｚｕｔａｎｉら１９９６；Ｌｉら，１９９７）。更に、高濃度のグルコースで長期にわたって培養した後にグルコースを急速に還元した周皮細胞の場合（Ｌｉら，１９９８）および死後に採取した糖尿病患者の網膜周皮細胞の場合（Ｐｏｄｅｓｔａら，２０００）、アポトーシス調整遺伝子（タンパク質ＢａｘのｍＲＮＡ）の発現の劣化が確認された。
【００９４】
他方、ＡＧＥ（ＡＧＥ−グルコースおよびＡＧＥ−メチルグリオキサール）による網膜周皮細胞のアポトーシスの導入は、全く認められなかった。
【００９５】
本発明の枠内で実施した研究において、ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導された周皮細胞のアポトーシスはセラミドおよびＤＡＧの生成の刺激に関連し、更に、これらの２つの化合物がアポトーシス信号の形質導入に関連するということを確認できた。以降の研究において、ＡＧＥ−メチルグリオキサールに応答して周皮細胞のアポトーシスに関する標示法を示した。
【００９６】
ＩＩ−培養時の網膜周皮細胞へのＡＧＥ−メチルグリオキサールによる酸化ストレスの導入
先行の研究において、ＡＧＥ−グルコース（２０μＭ）に応答する、ウシの網膜周皮細胞の酸化防止能の劣化を確認できた。カタラーゼおよびＣｕ／ＺｎＳＯＤの活性の増大およびチオール量の減少が、ＡＧＥ−グルコースで慢性的に培養された周皮細胞に観察され、従って、細胞の補償応答が遊離基の著しい生成に、従って、酸化ストレスに直面すると云える（Ｐａｇｅｔら，１９９８）。更に、脂質の過酸化のマーキングの減少、ＴＢＡＲＳおよびイソプロスタンが、酸化防止防御の刺激の反映として認められた（Ｐａｇｅｔら１９９８）。
【００９７】
アポトーシスに関する標示法における酸化ストレスの影響を検証するため、周皮細胞の誘導アポトーシスおよびＡＧＥ−メチルグリオキサールに応答するセラミドおよびＤＡＧの刺激生成に対する各種の酸化防止剤の効果を検討した。
【００９８】
１）テストした各種の酸化防止剤
テストした酸化防止剤は、その分子構造およびその作用態様にもとづき、３つのグループに分類される。第１グループは、プロトン供給能を有するチオール官能基を有する水溶性化合物からなる。この場合、Ｎα−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）およびリポ酸が対象である。これら２つの作用物質は、細胞のシトプラズマのレドックス・バランスの保護効果を有する。テストした第２のタイプの酸化防止剤は、エブセレン、即ち、セレニウム原子を含む合成分子である。この化合物は、依存するグルタチオン−ペルオキシダーゼセレニウム（Ｓｅ−ＧＰｘ）の活性をシミュレートする特殊性を有する。従って、この化合物は、脂質過酸化に対して膜の保護を誘導する。第３グループは、遊離基に対する高い反応性を有し、従って、脂質過酸化に対して膜を顕著に保護する共役二重結合に富んだ脂溶性化合物からなる。ゼアキサンチンおよびコエレンテラミンが対象である。
【００９９】
２）Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの効果
図６に、ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導されるＢＲＰのアポトーシスに対するＮα−アセチル−Ｌ−システインの効果を示した（アネキシン−Ｖ，材料および方法の項参照）。２μＭのＡＧＥ−メチルグリオキサールまたはＢＳＡ−コントロール）および１０μＭ−５０μＭのＮ−アセチル−Ｌ−システインの存在下で２回の継代の間（１２−１５日間）周皮細胞を培養した。誘導されたアポトーシスの抑制度（単位：％）として示した結果は、別個の５つの実験の平均値である。
【０１００】
２つの被検濃度において、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインは、ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導されるアポトーシスに対して周皮細胞を保護する。
【０１０１】
更に、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの存在下で培養したＢＲＰについて、セラミドおよびＤＡＧを検量した（図７参照）。材料および方法の項に記載した如く、セラミドおよびＤＡＧを検量した。セラミドおよびＤＡＧの刺激生成の抑制度（単位：％）として示した結果は、別個の２つの実験の平均値である。培養媒体にＮ−アセチル−Ｌ−システイン１０μＭを添加した場合、ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導されたセラミドおよびＤＡＧの生成が、完全に抑制された（−１００％）。これに反して、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン５０μＭによって細胞を処理した場合、この過剰生成は、部分的にのみ抑制された（セラミドの過剰生成の−６０％，ＤＡＧの過剰生成の−７０％）。この部分的効果は、極めて高い濃度で使用した酸化防止剤の前酸化効果で説明されると云える。
【０１０２】
１０μＭのＮ−アセチル−Ｌ−システインの存在下で培養した周皮細胞の誘導アポトーシスの完全な抑制は、セラミドおよびＤＡＧの過剰生成の並行した完全な抑制に関連し、従って、ＡＧＥ−メチルグリオキサールは、セラミドおよびＤＡＧの生成および周皮細胞のアポトーシスの上流において酸化ストレスを誘導すると云える。
【０１０３】
３）ＡＧＥ−メチルグリオキサールに応答する周皮細胞のアポトーシスに対する各種の酸化防止剤の効果
各種の酸化防止剤のテストにおいて、ＡＧＥ−メチルグリオキサールに応答する周皮細胞の消失に対するＮα−アセチル−Ｌ−システインの促進効果が確認された。図８に、ＡＧＥ−メチルグリオキサールに応答する周皮細胞のアポトーシスに対する各種の酸化防止剤の効果を示した。誘導されたアポトーシスの抑制度（単位：％）として示した結果は、別個の３つの実験の平均値である。但し、コエレンテラミンの結果（別個の２つの実験）は含まれてない。
【０１０４】
濃度７μＭおよび１４μＭのリポ酸を培養媒体に添加した場合、ＡＧＥによって誘導された周皮細胞のアポトーシスが、それぞれ、８８％および７５％抑制される（アネキシン−Ｖ，材料および方法の項参照）。５μＭおよび１０μＭのエブセレンで細胞を培養した場合、ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導されたアポトーシスが、それぞれ、９４％および８８％だけ抑制された。これに反して、２μＭのコエレンテラミンおよび２μＭのゼアキサンチンによって周皮細胞を処理した場合、誘導されたアポトーシスの抑制度は、部分的に過ぎず、即ち、それぞれ、６０％および５０％に過ぎない。２つの脂溶性酸化防止剤の中程度の効果は、これらの２つの薬剤がより高い濃度ではテストできないことによって説明される。ＡＧＥ−メチルグリオキサールに応答する周皮細胞のアポトーシスにおいて、担体（ＤＭＳＯ）の効果が観察された。
【０１０５】
各種酸化防止剤で周皮細胞を培養した場合、アポトーシスに対して細胞を保護できる。この結果から、ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導される周皮細胞のアポトーシスの標示法における酸化ストレスの導入が確認される。
【０１０６】
ＩＩＩ−ＡＧＥ−メチルグリオキサールに応答する網膜周皮細胞における活性セラミドおよびＤＡＧの生成法
更に、本発明の枠内で実施した研究において、ＡＧＥ−メチルグリオキサールに培養された周皮細胞における活性セラミドおよびＤＡＧの代謝法を定めた。
【０１０７】
特に、セラミドの可能な各種の生成法が対象である。他方、セラミドは、ｎｏｖｏの生合成法によって得ることができる。２つの中間代謝物、即ち、スフィンゴシンおよびスフィンガニンをスフィンガニンアシルトランスフェラーゼによってアセチル化してセラミドを形成した。
【０１０８】
セラミドは、更に、酵素加水分解生成物であってよい。セラミドは、一方では、スフィンゴミエリンの“プール”から得られ、他方では、グリコスフィンゴ脂質の“プール”から得られる（１つまたは複数のグリカン鎖に結合されたセラミド）（Ｍａｔｈｉａｓら，１９９８；Ｏｋａｓａｋｉら，１９９８）。
【０１０９】
更に、ＤＡＧの生成法にも、２つのタイプがある。ＤＡＧは、ｎｏｖｏの生合成法の賦活からまたは酵素加水分解から得られる。ＤＡＧは、特殊なホスホリパーゼの作用によって、ホスファチジルイノシトールビスホスフェートの“プール”からまたはホスファチジルコリンの“プール”から遊離させることができる。
【０１１０】
薬理学的アプローチにもとづき、上記の２つの中間代謝物の生成法を検討した。各種の酵素抑制剤の存在下で細胞を培養し、一方では，誘導されたアポトーシスに対する、他方では，ＡＧＥ−メチルグリオキサールに応答するセラミドおよびＤＡＧの刺激生成に対する、上記抑制剤の効果を分析した。
【０１１１】
１）周皮細胞における活性セラミドの生成法
ａ）スフィンガニンアシルトランスフェラーゼの影響
ｎｏｖｏの生合成法がＡＧＥ−メチルグリオキサールに応答して賦活されるか否かを検証するため、周皮細胞のアポトーシスに対するスフィンガニンアシルトランスフェラーゼの特殊な抑制剤、即ち、フモニシンＢ１の効果をテストした（Ｗａｎｇら，１９９１）。
【０１１２】
図９に、ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導された周皮細胞アポトーシスに対する効果を示した。誘導されたアポトーシスの抑制度（単位：％）として示した結果は、別個の２つの実験の平均値である。培養媒体に０，０１μＭのフモニシンＢ１を添加した場合、ＡＧＥ−メチルグリオキサール（またはＢＳＡ−コントロール）の存在下で２回の継代の間（約１５日間）培養した周皮細胞アポトーシスの抑制度は２２％に過ぎなかった（アネキシン−Ｖ，材料および方法の項参照）。更に、０，１μＭのフモニシンＢ１をテストした。この濃度において、フモニシンＢ１は、プロアポプトチックである。なぜならば、フモニシンＢ１は、ＢＳＡ−コントロールで培養された細胞のアポトーシスの基本割合に影響を与えるからである（結果は示されていない）。
【０１１３】
フモニシンＢ１は、誘導されたアポトーシスに対して周皮細胞を保護しない。従って、セラミドのｎｏｖｏ合成は、ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導された網膜周皮細胞のアポトーシスに関連しない。
【０１１４】
ｂ）酸性スフィンゴミエリナーゼの影響
スフィンゴミエリナーゼの作用下でスフィンゴミエリンの“プール”からセラミドを形成できる。各種スフィンゴミエリナーゼの活性は、その分子間位置および最適なｐＨに依存する。酸性、中性および塩基性スフィンゴミエリナーゼが対象となる。
【０１１５】
細胞の誘導アポトーシスに対するおよびＡＧＥ−メチルグリオキサールで培養された周皮細胞におけるセラミドおよびＤＡＧの刺激生成に対する、上記酵素の特殊抑制剤、即ち、デシプラミン（１０，１１−ジヒドロ−５−［３−（メチルアミノ）プロピル］−５Ｈ−ジベンズ［ｂ，ｆ］アゼピン）（Ａｎｄｒｉｅｕら，１９９４；Ｊａｆｆｒｅｚｏｕら，１９９５）の効果を分析して、酸性スフィンゴミエリナーゼの影響を検証した。
【０１１６】
図１０に、ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導された周皮細胞アポトーシスに対するデシプラミンの効果を示した。誘導されたアポトーシスの抑制度（単位：％）として示した結果は、０，１μＭのデシプラミンについて７つの別個の実験の平均値および０，３μＭのデシプラミンについて別個の６つの実験の平均値である。ＡＧＥ−メチルグリオキサールの存在下で０，１μＭのデシプラミンおよび０，３μＭのデシプラミンで２回の継代の間（約１５日間）の周皮細胞の培養によって，ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導されたアポトーシスを部分的に３５％だけ抑制できた（図１０）。更に、培養媒体に、１μＭのデシプラミンを添加した。しかしながら、上記条件において、細胞コントロールのアポトーシスの基本率が影響された（結果は示されてない）。
【０１１７】
図１１に、ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導されたＢＲＰにおけるセラミドおよびＤＡＧの刺激生成に対するデシプラミンの効果を示した。セラミドおよびＤＡＧは、材料および方法の項に記載の如く検量した。セラミドおよびＤＡＧの刺激生成の抑制度（単位：％）として示した結果は、０，１μＭのデシプラミンについて４つの別個の実験の平均値および０，３μＭのデシプラミンについて別個の２つの実験の平均値である。２回の継代中に培養媒体に添加した０，１μＭのデシプラミンは、ＡＧＥ−メチルグリオキサールに応答して周皮細胞に生成されるセラミドの７８％を抑制するが、ＤＡＧの過剰生成を１７％抑制するに過ぎなかった。セラミドの刺激生成に対する０，３μＭのデシプラミンの抑制効果は、配量に依存すると思われる。なぜならば、テストした薬剤は、形成されたセラミドの９５％の抑制を誘導するからである。ＤＡＧの過剰生成は、１３％抑制されるに過ぎない。培養媒体に１μＭのデシプラミンを添加した場合、ＢＳＡ−コントロールで培養した細胞のセラミドおよびＤＡＧの基本率が影響された（結果は示されてない）。
【０１１８】
ｃ）結論
０，３μＭのデシプラミンで周皮細胞を処理した場合、生成セラミドは完全に抑制されるが、ＤＡＧの過剰生成は影響されない。２μＭのＡＧＥ−メチルグリオキサールで培養した周皮細胞中のセラミドの観察された増加は、酸性スフィンゴミエリナーゼの賦活に大きく関連する。この酵素は、ホスファチジルコリンの特殊なホスホリパーゼＣ（ＰＣ−ＰＬＣ）に結合されることになる（Ｓｃｈｕｔｚｅら，１９９２；Ｇｅｎｅｓｔｉｅｒら，１９９８）。従って、２μＭのＡＧＥ−メチルグリオキサールで培養した周皮細胞において、ホスファチジルコリンのプールに対するＰＣ−ＰＬＣの作用によって、セラミド生成を誘導する酸性スフィンゴミエリナーゼを連続的に賦活するＤＡＧが遊離される。デシプラミンで細胞を培養した場合、酸性スフィンゴミエリナーゼが抑制された。従って、セラミド生成が減少されたが、酵素ターゲットの上流に生成されたＤＡＧは影響されなかった。
【０１１９】
図１２に、本発明の基礎において考慮された周皮細胞中のセラミドおよびＤＡＧの生成法を示した。
【０１２０】
セラミドの過剰生成は、完全に抑制されるが、デシプラミンは、ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導されたアポトーシスに対して周皮細胞を部分的に保護するに過ぎない。
【０１２１】
２）周皮細胞中で賦活されるＤＡＧ生成法
ａ）ホスファチジルコリンホスホリバーゼＣ
一方では、セラミドおよびＤＡＧの生成法について提案した仮説を確認するため、他方では、ＤＡＧが残存アポトーシスに関連するか否かを検証するため、誘導されたアポトーシスに対する（図１３）およびＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導されたセラミドおよびＤＡＧの生成に対する（図１４）ホスファチジルコリンホスホリバーゼＣ，Ｄ６０９（トリシクロ［５．２１．０（２．６）］デシル−９［８］キサントゲネート）（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｄｅｃｋｅｒら，１９８８；Ｍｕｌｌｅｒ−Ｄｅｃｋｅｒ，１９８９）の抑制効果を分析した。
【０１２２】
図１３に、２回の継代後にＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導された周皮細胞のアポトーシスに対するＤ６０９の効果を示した（アネキシン−Ｖ，材料および方法）。誘導されたアポトーシスの抑制度（単位：％）として示した結果は、９，４μＭのＤ６０９について７つの別個の実験の平均値および３０μＭのＤ６０９およびデシプラミン／Ｄ６０９組合せについて別個の６つの実験の平均値である。培養媒体に９，４μＭおよび３０μＭのＤ６０９を添加した場合、それぞれ、ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導された周皮細胞アポトーシスを４０％および４７％抑制できた。本発明者は、更に、２つの酵素ターゲットに同時に作用する光学系において０，１μＭデシプラミン／９，４μＭＤ６０９組合せをテストした。２つの作用物質の組合せで細胞を処理した場合、Ｄ６０９と等価の効果が誘導された。即ち、周皮細胞アポトーシスの抑制度は、５１％であった。
【０１２３】
図１４に、ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導されたＢＲＰ中のセラミドおよびＤＡＧの刺激生成に対するＤ６０９の効果を示した（材料および方法の項参照）。セラミドおよびＤＡＧの刺激生成の抑制度（単位：％）として示した結果は、９，４μＭのＤ６０９について４つの別個の実験の平均値および３０μＭのＤ６０９およびデシプラミン／Ｄ６０９組合せについて別個の２つの実験の平均値である。９，４μＭのＤ６０９の存在下で細胞を培養した場合、セラミドおよびＤＡＧの生成の抑制度は、ほぼ完全であり、即ち、それぞれ、９５％および８０％であった。濃度３０μＭのＤ６０９は、セラミドの生成を完全に抑制でき、生成したＤＡＧの６５％抑制できた。２つの作用物質の組合せによって細胞を処理した場合、３０μＭのＤ６０９と等価の効果が誘導された。即ち、セラミドの過剰生成は、完全に抑制され、ＡＧＥ−メチルグリオキサール下で生成されたＤＡＧの７０％が、抑制された。
【０１２４】
ｂ）結論
Ｄ６０９によって、更に詳細に云えば、９，４μＭの濃度のＤ６０９によって周皮細胞を培養した場合、セラミドおよびＤＡＧの刺激生成が、同時に抑制された。従って、この結果から、ＤＡＧの生成は、スフィンゴミエリナーゼに結合されたホスファチジルコリンホスホリパーゼＣの賦活に大きく関連し、従って、以上で考慮したセラミドおよびＤＡＧの生成法が有効であることが結論づけられる。
【０１２５】
しかしながら、セラミドおよびＤＡＧの完全な抑制にも拘わらず、細胞は、ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導されたアポトーシスに対して部分的に保護されるに過ぎず、従って、セラミドおよびＤＡＧの生成と並列で周皮細胞アポトーシスに関連する第２の標示法の存在が考えられる。
【０１２６】
図１５に、周皮細胞アポトーシスの標示法を示した。
【０１２７】
ＡＧＥ−メチルグリオキサールは、恐らく、ＡＧＥの特殊な受容体を介して、周皮細胞アポトーシスに関連する信号の２つの形質導入経路の交差点にある云える酸化ストレスを誘導する。実際、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインで細胞を処理すれば、セラミドおよびＤＡＧの刺激生成が、完全に阻止され、ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導される周皮細胞アポトーシスが、完全に抑制される。
【０１２８】
さて、最近の研究において、セラミドおよびＤＡＧの上流にあり且つ、更に、２つの標示経路の交差点にも存在し得る酵素ターゲットが定義された。
【０１２９】
ＩＶ−カスパーゼ、即ち、アポトーシスの特殊なプロテアーゼの影響
最近の研究において、著名なＩＣＥ（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ）グループの一連のプロテアーゼ、即ち、カスパーゼ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ Ａｓｐａｒｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ）が、アポトーシス信号の形質導入においてキーとしていの役割を果たすということが確認された。比較基準に依存して、上記プロテアーゼの各種の分類が提案されている：
−アポトーシス標示法におけるその影響時間にもとづき、上記酵素は、２つのグループに分類される：アポトーシスの開始段階時に賦活されるカスパーゼイニシエータ（カスパーゼ２，８，１０）および細胞の生化学的、形態的損傷によって特徴づけられるアポトーシス実施段階に関連するカスパーゼイニシエータによって連続的に賦活されるカスパーゼエフェクター（カスパーゼ３，６，７，９）（Ｎｕｎｅｚら，１９９８；Ｓｔｅｎｎｉｃｋｅら，１９９８；Ａｌｎｅｍｒｉ，１９９９）。
−他方、基体の特殊性にもとづき、カスパーゼは、３つのサブグループに分類される；カスパーゼ１，４，５からなるグループＩ（炎症性応答に関連する酵素），カスパーゼ２，３，７からなるグループＩＩおよびカスパーゼ６，８，９，１０からなるグループＩＩＩ。グループＩＩのプロテアーゼは、タンパク分解面（ＸＤＸＸＤ）のサイトの第１位置および第４位置にアスパラギン酸塩残基を必要とするが、グループＩＩＩのプロテアーゼは、第４アミノ酸残基をより十分に許容するとともに、好ましくは、脂肪族アミノ酸について優先性を有する（ＸＥ［Ｉ／Ｔ／Ｈ／Ｖ］Ｄ）（Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙら，１９９７；Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｌｖｏら，１９９８）。
−更に、カスパーゼの系統分類分析において、３つの亜族を定義できた：ＩＣＥ類似のプロテアーゼ（プロテアーゼ１のグループ）は、カスパーゼ１，４，５，１１を包含し、ＩｃｈＩＩ類似のプロテアーゼ（カスパーゼ２のグループ）は、カスパーゼ２，９を包含し、ＣＰＰ（ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ）３２類似のプロテアーゼ（カスパーゼ３のグループ）は、カスパーゼ３，６，７，８，１０を包含する（Ａｌｎｅｍｒｉら，１９９６；Ｄｕａｎら，１９９６ａ，１９９６ｂ）。
【０１３０】
カスパーゼを、特に、インビトロおよびインビボにおいて、末端基ＮＨ_２およびＣＯＯＨを阻止し各基体の分裂サイトを擬態する化学的基によって細胞透過性化された合成ペプチド（一般にテトラペプチド）によって培養した。
【０１３１】
カスパーゼイニシエータおよび／またはカスパーゼエフェクターがＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導される周皮細胞アポトーシスに関連するか否かを検証するため、各種の合成ペプチド抑制剤をテストした。
【０１３２】
プロテアーゼの特殊な抑制剤としての３つのペプチドをテストした：
−カスパーゼ２イニシエータの特殊な抑制ペプチドｚ−ＶＤＶＡＤ−ｆｍｋ，
−カスパーゼ８イニシエータの特殊な抑制ペプチドｚ−ＩＥＴＤ−ｆｍｋ，
−カスパーゼ９イニシエータの特殊な抑制ペプチドｚ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋ。
【０１３３】
本発明者は、更に、カスパーゼに対する特殊性または酵素のアクセス性および抑制剤の分子間濃度に依存する制限された特殊性を有していない他の改質ペプチドの効果を分析した：
−カスパーゼイニシエータおよびカスパーゼエフェクターを含み、カスパーゼの大きいスペクトルを抑制する抑制剤ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｌｖｏら，１９９８）；
−基本的にカスパーゼ３エフェクターに作用し（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら，１９９５）且つ特定的ではないがカスパーゼ６，７，８，１０に作用する（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ−Ａｌｎｅｍｒｉら，１９９５）ＣＰＰ３２類似プロテアーゼの抑制効果を有するペプチドｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋ；
−カスパーゼ１０イニシエータの抑制剤であり、特定的ではないがカスパーゼ８，９を抑制するペプチドｚ−ＡＥＶＤ−ｆｍｋ。
【０１３４】
２）誘導された周皮細胞アポトーシスに対するカスパーゼ抑制ペプチドの効果
図１６に、ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導された周皮細胞アポトーシスに対するカスパーゼ抑制ペプチドの効果を示した。ＡＧＥ−メチルグリオキサール（またはＢＳＡ−コントロール）およびペプチド抑制剤ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ，ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋ，ｚ−ＩＥＴＤ−ｆｍｋ，ｚ−ＡＥＶＤ−ｆｍｋ，ｚ−ＶＤＶＡＤ−ｆｍｋ，ｚ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋ（５０μＭ）の存在下で、２回の継代の間（約１５日間）、細胞を培養した。アポトーシスを検知し、材料および方法の項に記載のアネキシンＶによるマーキングによって検量した。誘導されたアポトーシスの抑制度（単位：％）として示した結果は、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋおよびｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋについて６つの別個の実験の平均値、ｚ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋについて別個の４つの実験の平均値およびｚ−ＶＤＶＡＤ−ｆｍｋ，ｚ−ＡＥＶＤ−ｆｍｋおよびｚ−ＩＥＴＤ−ｆｍｋについて別個の３つの実験の平均値である。
【０１３５】
培養媒体に５０μＭのｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ，ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋ，ｚ−ＡＥＶＤ−ｆｍｋおよびｚ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋを添加した場合、ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導された周皮細胞アポトーシスをほぼ完全に抑制できた。ペプチドｚ−ＩＥＴＤ−ｆｍｋは、アポトーシスに対して細胞を保護しないが、ペプチドｚ−ＶＤＶＡＤ−ｆｍｋは、ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導されたアポトーシスを部分的に抑制する（図１６）。
【０１３６】
３）網膜周皮細胞中のセラミドおよびＤＡＧの刺激生成に対するカスパーゼ抑制ペプチドの効果
図１７に、ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導されたＢＲＰ中のセラミドおよびＤＡＧの刺激生成に対するカスパーゼ抑制ペプチドｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋおよびｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋ（５０μＭ）の効果を示した。材料および方法の項に記載の如く、セラミドおよびＤＡＧを検量した。２つの別個の実験の刺激生成の抑制度（単位：％）として結果を示した。
【０１３７】
セラミドおよびＤＡＧに対するペプチド抑制剤の効果は、多様である：２つの中間代謝物の刺激生成は、５０μＭのｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋまたはｚ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋで処理した周皮細胞には認められないが、ペプチドｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋは、セラミドおよびＤＡＧの過剰生成を、それぞれ、７５％および１００％抑制する。
【０１３８】
４）ＡＧＥによって誘起された網膜周皮細胞アポトーシスにおけるカスパーゼ１０の影響
ａ）材料
カスパーゼ１０に対する１次抗体、その各抑制ペプチド、プラスのコントロールとして利用されるカスパーゼ１０およびウサギの２次抗体は、Ｂｉｏｍｏｌ（フランス）から供給を受けた。オートラジオグラフィー用フィルムおよび現像薬ＥＣＬは、Ａｍｅｒｓｈａｍ（フランス）から購入した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲル（調合ゲル トリス−ＨＣｌ １２％）、イムノインプリント用ニトロセルロース膜（０，４５μＭの気孔率）、ヤギの２次抗体および分子量マーカ（タンパク質精密標準，広範囲）は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（フランス）から入手した。
【０１３９】
タンパク質の電気泳動および電子移動のため、Ｂｉｏ−Ｒａｄの系Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩおよびＭｉｎｉ−Ｔｒａｎｓ Ｂｌｏｔを使用した。
【０１４０】
ｂ）イムノブロット
−試料調製
以下の使用に記載の如く３μＭのＡＧＥ−メチルグリオキサールの存在下で１５日間培養した周皮細胞（径６ｃｍの２〜３のボックス）をガラスベット上に置き、冷ＤＦＢＳで３回洗浄し、次いで、５００μｌの冷回収緩衝液（４，４μＭペブスタチン，６μＭのロイペプチン、０，６ｍＭのＰＭＳＦおよび１０ｍＭのＥＤＴＡを含む０，１ＭトリスＨＣｌ，ｐＨ８）中にゴム製ポリスマンによって掻き落とした。細胞質材料のロスを制限するため、緩衝液Ｌａｅｍｍｌｉ ５ｘ（５％ＳＤＳ，１２，５％グリセロール，１２，５％β−メルカプトエタノールおよび１％ブロモフェノールブルーを含む０，１５ＭトリスＨＣｌ，ｐＨ６，８）１００μｌを加えてペトリボックス中で細胞サスペンジョンを直接に可溶化した。溶液を粘稠化するＤＮＡ球を、針３０Ｇ_１／２を備えた注射器内で往復運動エネルギによって機械的に破砕した。次いで、タンパク質試料を、１００℃に３ｍｉｎ加熱した後、ポリアクリルアミドゲル上に置いた。
【０１４１】
−変性条件におけるポリアクリルアミドゲル上の電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）：
Ｌａｅｍｍｌｉ技術（Ｌａｅｍｍｌｉ Ｕ．Ｋ，１９７０）にもとづき、還元条件（β−メルカプトエタノール）および変性条件（ＳＤＳ）において電気泳動を実施した。
【０１４２】
周皮細胞の溶解物質のアリクォート（２０μｇ）を、４％アクリルアミドの濃縮ゲルおよび１２％アクリルアミドの分離ゲルから構成したポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄの調合ゲル トリスＨＣｌ）上に塗布した。タンパク質の電気泳動は、移動緩衝液（２５ｍＭトリス，０，１９Ｍグリシン，０，１％ＳＤＳ）中で、（移動フロントをマーキングする）ブロモフェノールブルーがゲル底に達するまで、１００Ｖ（濃縮ゲル）において実施し、次いで、２００Ｖ（分離ゲル）において実施した。更に、タンパク質の移動の検定のため、分子量マーカ（２５０，１５０，１００，７５，５０，３７，２５，１５，１０ｋＤａ）を設けた。
【０１４３】
次いで、タンパク質の電子移動のため、ゲルを使用し、クーマシーブルーで着色した。
【０１４４】
−ニトロセルロース上のタンパク質の電子移動：
電気泳動の終了時、膜、Ｗａｔｔｍａｎペーパシートおよび発泡スポンジ（Ｓｃｏｔｃｈ Ｂｒｉｔｅ，３Ｍ）を、冷移送緩衝液（２５ｍＭトリス（ｐＨ８，３），１９２ｍＭグリシン，２０％メタノール（ｖ／ｖ）中で１０ｍｉｎの間、平衡させた。セミ浸漬法でサンドイッチを作製した。即ち、膜およびゲルを重ね合わせ、ペーパおよびスポンジの両側で枠で囲んだ。槽内に設置したユニットを移送緩衝液中に浸漬し、４℃において磁気的に撹拌しながら、１００Ｖにおいて４５ｍｉｎ、タンパク質をゲルからニトロセルロース膜（陽極）へ向かって電気泳動によって移送した。
【０１４５】
−移送されたタンパク質の免疫検知
我々の研究で使用した抗原材料は、ウシから得た。ウシの材料に対する１次抗体を使用せず、異なる種（ヒト、ハツカネズミおよびラット）と交差する免疫反応性を有するポリクロナール抗体を選択した。
【０１４６】
・使用した緩衝液：
−緩衝液ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ）：１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８，０），１５０μＭＮａＣｌ
−緩衝液ＴＴＢＳ：ＴＢＳ中に０，０５％トゥイーン２０
−抗体希釈緩衝液：ＴＴＢＳ中に１％ＢＳＡ
−膜飽和緩衝液：ＴＴＢＳ中に１０％乳汁
【０１４７】
・タンパク質の呈示：
抗原反応
タンパク質の電気泳動および移送後に、タンパク質の移動トラックのマーキングのため、ニトロセルロース膜をポンソーレッドで着色し、次いで、脱色した。膜の特定されない結合サイトを、緩やかに撹拌しながら室温において６０ｍｉｎ（または４℃において一晩）適切な飽和緩衝液中で培養してブロックした。膜を、緩衝液ＴＴＢＳ中で３回（１５ｍｉｎ，５ｍｉｎ，５ｍｉｎ）洗浄し、次いで、希釈緩衝液で希釈した、ヒトのカスパーゼ１０に対する１次抗体（１／２０００）で２時間培養した。ＴＴＢＳ中で第２の洗浄シリースを実施した後、セイヨウワサビのベルオキシダーゼと結合したウサギの２次抗体（１／６０００）によって第２の培養（１，５時間）を実施した。膜をＴＴＢＳ中で新たに洗浄し、次いで、ＥＣＬによる呈示の前に、ＴＢＳ中で５ｍｉｎ濯いだ。
【０１４８】
ＥＣＬによる呈示
膜を、吸取紙上で迅速に乾燥し、ＥＣＬキットの化学ルミエセンス検知溶液で１ｍｉｎ培養し、次いで、ペーパフィルムＳａｒａｎに包んだ。次いで、上記膜を、オートラジオグラフィーフィルムに８ｍｉｎ露光し、フィルムを現像した。
【０１４９】
ｃ）結果
これらの結果は、カスパーゼ抑制ペプチドのみを使用した先行の結果と一致した。図１９に示した本結果において、特定の抗体による直接的分析から、前駆体（カスパーゼ１０ｂまたは１０ｄ）から賦活されたカスパーゼ１０の大きいサブユニット（２５ｋＤａ）がＡＧＥで培養した周皮細胞中に存在することが示され、従って、ＡＧＥによって誘導された網膜周皮細胞アポトーシスの場合、カスパーゼ１０が良好に賦活されると云える。
【０１５０】
５）結論
アポトーシス信号の形質導入経路におけるカスパーゼの賦活から、周皮細胞アポトーシスに対するペプチドｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（スペクトルの大きいカスパーゼ抑制剤）の保護効果が確認される。上記ペプチド抑制剤で培養した周皮細胞の場合、ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導されるセラミドおよびＤＡＧの生成は阻止され、従って、セラミドおよびＤＡＧの生成を制御するカスパーゼイニシエータ（カスパーゼ２，８，１０）の影響が認められる。
【０１５１】
第１に、我々は、カスパーゼ８イニシエータがＡＧＥ−メチルグリオキサールに応答して賦活される酵素であるか否かを検証した。特定の抑制剤ｚ−ＩＥＴＤ−ｆｍｋで細胞を培養した場合、アポトーシスは阻止されない。従って、カスパーゼ８は、周皮細胞アポトーシスに関連しないと思われる。
【０１５２】
カスパーゼ２イニシエータがアポトーシスに関係する信号の形質導入に関与するか否かを定めるため、我々は、上記カスパーゼに特定なペプチド抑制剤ｚ−ＶＤＶＡＤ−ｆｍｋの存在下で周皮細胞を培養した。ペプチドｚ−ＶＤＶＡＤ−ｆｍｋは、ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導されたアポトーシスを部分的に抑制し、従って、カスパーゼ２イニシエータは周皮細胞アポトーシスに関連する云える。
【０１５３】
更に、我々は、カスパーゼ１０イニシエータの抑制剤、カスパーゼ-８イニシエータおよびカスパーゼ９エフェクターの少なくとも特定の抑制剤として示されたペプチドｚ−ＡＥＶＤ−ｆｍｋの効果を分析した。周皮細胞アポトーシスに対する上記ペプチドの保護効果から、カスパーゼ１０および／またはカスパーゼ９の賦活が考えられ、カスパーゼ８の影響は、アポトーシスに対するｚ−ＩＥＴＤ−ｆｍｋの効果の欠如にもとづき除外される。従って、カスパーゼ９に特定の抑制剤としてのペプチドｚ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋは、周皮細胞アポトーシスに対する保護効果を有するが、ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導されるセラミドまたはＤＡＧの過剰生成には作用しない。この結果から、ｚ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋによって阻止されたカスパーゼ９はＤＡＧおよびセラミドの生成の下流に介入すると考えられる。
【０１５４】
従って、カスパーゼ２，９，１０は、網膜周皮細胞のアポトーシス信号の形質導入に関与すると考えられる。
【０１５５】
周皮細胞アポトーシスに対するペプチドｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋの保護効果から、提案の２つの代謝経路は、ＣＰＰ３２類似のプロテアーゼのグループの同一のカスパーゼへ向かって収斂すると考えられる。このペプチド抑制剤で周皮細胞を処理した場合、ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導されるセラミドおよびＤＡＧの過剰生成は影響されない。従って、この結果から、ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋによって阻止された１つまたは複数のカスパーゼは、セラミドおよびＤＡＧの下流に介入すると結論づけられる。他方、ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋの存在下で観察されるアポトーシス抑制は、カスパーゼ２，８，１０の抑制とは無関係と考えられる。なぜならば、セラミドおよびＤＡＧの生成レベルは影響されないからである。更に、カスパーゼ９の特定のｚ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋによるアポトーシスの抑制は，カスパーゼイニシエータの抑制とは無関係と思われる。なぜならば、ＤＡＧおよびセラミドのレベルは影響されないからである。従って、我々は、２つの代謝経路は、２つのカスパーゼエフェクター、即ち、カスパーゼ９およびカスパーゼ３へ向かって十分に収斂し、ＣＰＰ３２類似のプロテアーゼのカスパーゼ６，７はアポトーシス出現段階に介入すると結論づけた。
【０１５６】
図１８に、周皮細胞アポトーシスの標示法を示した。ＡＧＥ−メチルグリオキサールは、カスパーゼイニシエータ（カスパーゼ２または１０）を賦活すると思われる酸化ストレスを誘導する。このカスパーゼの賦活によって、第１に、ホスファチジルコリンホスホリパーゼＣを意味する酵素カスケードが賦活され、次いで、酸性スフィンゴミエリナーゼが賦活され、次いで、ＣＰＰ３２類似のプロテアーゼのカスパーゼエフェクターが賦活される。上記カスパーゼ９および３は２つの代謝経路の交差点にあることを確認できた。他方、２つの経路がカスパーゼイニシエータの下流で分散するか否かまたは酸化ストレスがこれら２つの経路の交差点にあるか否かは、結論づけ得ない。
【０１５７】
さて、本発明の枠内で実施した上記研究によって、カスパーゼイニシエータ（多分、カスパーゼ１０）がＡＧＥによって誘導される周皮細胞アポトーシスに関連する生化学的事象のカスケードに関連するということが、明確に確認される。この関連性は、各種カスパーゼの特定のペプチド系抑制剤を利用する純粋に薬理学的アプローチによって支持される。図１９から明らかな如く、ウシの網膜周皮細胞にＡＧＥを作用させた場合、カスパーゼ１０が十分に賦活される。実際、カスパーゼ１０の活性の分裂形態（大きいサブユニット，２５ｋＤａ）をその前駆体（カスパーゼ１０ｂ（ＦＡＤＤ類似インタロイキン−１−転換酵素−２，ＦＬＩＣＥ−２）または１０ｄ，６０ｋＤａ）から識別する特定の抗体によるニトロセルロース上の免疫検知によって、ＡＧＥで処理された細胞中に賦活されたカスパーゼの大きいサブユニット（２５ｋＤａ）を検知できた。尤も、前駆体（カスパーゼ１０ｂまたは１０ｄ）の量は２つの条件において類似であるが（図１参照）、ＢＳＡコントロールで処理した細胞の場合には、このようなサブユニットは存在しない（図１９参照）。
【図面の簡単な説明】
【図１】 網膜毛細管の略図である。
【図２】 メイラード法を示す図面である。
【図３】 ^３２ＰによるセラミドおよびＤＡＧのマーキングを示す図面である。
【図４】 ウシの網膜周皮細胞のアポトーシスに対するＡＧＥ−メチルグリオキサールの効果を示す図面である。
【図５】 ウシの網膜周皮細胞中のセラミドおよびＤＡＧの生成に対するＡＧＥ−メチルグリオキサールの効果を示す図面である。
【図６】 ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導されたＢＲＰアポトーシスに対するＮα−アセチル−Ｌ−システインの効果を示す図面である。
【図７】 ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導されたＢＲＰ中のセラミドおよびＤＡＧの生成に対するＮα−アセチル−Ｌ−システインの効果を示す図面である。
【図８】 ＡＧＥ−メチルグリオキサールに応答する周皮細胞アポトーシスに対する各種酸化剤の効果を示す図面である。
【図９】 ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導された周皮細胞アポトーシスに対するフモニシンＢ１の効果を示す図面である。
【図１０】 ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導された周皮細胞アポトーシスに対するデシプラミンの効果を示す図面である。
【図１１】 ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導されたＢＲＰ中のセラミドおよびＤＡＧの刺激生成に対するデシプラミンの効果を示す図面である。
【図１２】 本発明にもとづき考慮したＤＡＧ中のセラミドおよびＤＡＧの生成推移を示す図面である。
【図１３】 ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導された周皮細胞アポトーシスに対するＤ６０９の効果を示す図面である。
【図１４】 ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導されたＢＲＰ中のセラミドおよびＤＡＧの刺激生成に対するＤ６０９の効果を示す図面である。
【図１５】 本発明にもとづき考慮した周皮細胞アポトーシスの標示法を示す図面である。
【図１６】 ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導された周皮細胞アポトーシスに対するカスパーゼ抑制ペプチドの効果を示す図面である。
【図１７】 ＡＧＥ−メチルグリオキサールによって誘導されたＢＲＰ中のセラミドおよびＤＡＧの刺激生成に対するカスパーゼ抑制ペプチドｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ，ｚ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋおよびｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋ（５０μＭ）の効果を示す図面である。
【図１８】 本発明にもとづき考慮した周皮細胞アポトーシスの標示法を示す図面である。
【図１９】 ＡＧＥによって処理したまたは処理してない周皮細胞の分解生成物におけるヒトのカスパーゼ１０に対する抗体によるウエスタンブロット法を示す図面である。
【参考文献】

Claims (18)

1. 糖尿病性網膜症の予防または処置に有効な医薬の調製のための、網膜細胞アポトーシス抑制剤の使用であって、該網膜細胞アポトーシス抑制剤が、トリペプチドｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋであるカスパーゼの抑制剤であることを特徴とする前記の使用。
2. 糖尿病性網膜症の予防または処置に有効な医薬の調製のための、網膜細胞アポトーシス抑制剤の使用であって、該網膜細胞アポトーシス抑制剤が、ペプチドｚ−ＡＥＶＤ−ｆｍｋであるカスパーゼの抑制剤であることを特徴とする前記の使用。
3. 糖尿病性網膜症の予防または処置に有効な医薬の調製のための、網膜細胞アポトーシス抑制剤の使用であって、該網膜細胞アポトーシス抑制剤が、ペプチドｚ−ＶＤＶＡＤ−ｆｍｋであるカスパーゼの抑制剤であることを特徴とする前記の使用。
4. 糖尿病性網膜症の予防または処置に有効な医薬の調製のための、網膜細胞アポトーシス抑制剤の使用であって、該網膜細胞アポトーシス抑制剤が、ペプチドｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋであるカスパーゼの抑制剤であることを特徴とする前記の使用。
5. 糖尿病性網膜症の予防または処置に有効な医薬の調製のための、網膜細胞アポトーシス抑制剤の使用であって、該網膜細胞アポトーシス抑制剤が、ペプチドｚ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋであるカスパーゼの抑制剤であることを特徴とする前記の使用。
6. 糖尿病性網膜症の予防または処置に有効な医薬の調製のための、網膜細胞アポトーシス抑制剤の使用であって該網膜細胞アポトーシス抑制剤が請求項１〜５に記載した２種以上の網膜細胞アポトーシス抑制剤の組合せであることを特徴とする前記の使用。
7. 糖尿病性網膜症の予防または処置に有効な医薬の調製のための、網膜細胞アポトーシス抑制剤の使用であって、該網膜細胞アポトーシス抑制剤が２種以上の網膜細胞アポトーシス抑制剤の組合せであり、その少なくとも１種が、下記化合物、
   −エブセレン、ゼアキサンチン、コエレンテラミン、これらの誘導体または混合物から選択される酸化防止化合物、
   −トリシクロ［５，２１，０（２，６）］デシル−（９［８］キサントゲナート（Ｄ６０９）またはその誘導体の１種であるホスファチジルコリンホスホリパーゼＣの抑制剤、または
   −１０，１１−ジヒドロ−５−［３−（メチルアミノ）プロピル］−５Ｈ−ジベンズ［ｂ，ｆ］アゼピン（デシピラミン）またはその誘導体の１種である酸性スフィンゴミエリナーゼの抑制剤から選択され、
   他の少なくとも１種が、−トリペプチドｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ、ペプチドｚ−ＡＥＶＤ−ｆｍｋ、ペプチドｚ−ＶＤＶＡＤ−ｆｍｋ、ペプチドｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋまたはペプチドｚ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋから選択されるカスパーゼの抑制剤であることを特徴とする前記の使用。
8. 作用剤として請求項１〜５に記載の少なくとも１種の網膜細胞アポトーシス抑制剤を含む医薬組成物。
9. 作用剤として、
   −トリペプチドｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ、ペプチドｚ−ＡＥＶＤ−ｆｍｋ、ペプチドｚ−ＶＤＶＡＤ−ｆｍｋ、ペプチドｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋまたはペプチドｚ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋから選択される少なくとも１種のカスパーゼの抑制剤と組合わせた、
   −エブセレン、ゼアキサンチン、コエレンテラミン、これらの誘導体または混合物から選択された酸化防止化合物、および／または、
   −トリシクロ［５，２１，０（２，６）］デシル−（９［８］キサントゲナート（Ｄ６０９）またはその誘導体の１種であるホスファチジルコリンホスホリパーゼＣの抑制剤、および／または、
   −１０，１１−ジヒドロ−５−［３−（メチルアミノ）プロピル］−５Ｈ−ジベンズ［ｂ，ｆ］アゼピン（デシピラミン）またはその誘導体の１種である酸性スフィンゴミエリナーゼの抑制剤、
   を含むことを特徴とする請求項８に記載の医薬組成物。
10. １種または複数の作用剤の配合にもとづき、０．０１−２００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の毎日の投与が可能であることを特徴とする請求項８または９に記載の医薬組成物。
11. ０．５−７５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の毎日の投与が可能であることを特徴とする請求項８または９に記載の医薬組成物。
12. １−５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の毎日の投与が可能であることを特徴とする請求項８または９に記載の医薬組成物。
13. ５％−９５％（ｗ／ｗ）の１種または複数の作用剤を含むことを特徴とする請求項８〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
14. ２０％−８０％（ｗ／ｗ）の１種または複数の作用剤を含むことを特徴とする請求項８〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
15. 局所投与の形または眼注入の形であることを特徴とする請求項８または９に記載の医薬組成物。
16. ０．０１−１０重量％の範囲の作用剤を含むことを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
17. ０．０１−４重量％の範囲の作用剤を含むことを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
18. 糖尿病性網膜症を予防または処置できる化合物の特定法において、ＡＧＥによって処置した周皮細胞の培養体を被検化合物と接触させ、上記周皮細胞中のアポトーシスを評価して上記化合物の糖尿病性網膜症の予防能または処置能を求める方法であって、
    カスパーゼの抑制剤から被検化合物を選択することを特徴とする上記方法。

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