JP4273967B2 - ジペプチドの製造方法、それに用いるペプチド生成酵素、およびペプチド生成酵素の製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複雑な合成方法を経ることなく、簡便かつ安価にジペプチドを製造する方法に関し、より詳細には、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを製造する方法、当該ジペプチドの製造方法に使用するペプチド生成酵素およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ジペプチドは、医薬品素材、機能性食品等のさまざまな分野で利用されている。例えば、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンは無血清培地の成分として有用であり、Ｌ−グルタミンに比べ安定で、水溶性も高いことから輸液成分に用いられる。
【０００３】
ジペプチドの製造法としては従来から化学合成法が知られているが、その製造法は必ずしも簡便なものではなかった。例えば、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアラニン（以下Ｚ−アラニンと称する）と保護Ｌ−グルタミンを用いる方法（Bull. Chem. Soc. Jpn., 34,739(1961)、Bull. Chem. Soc. Jpn., 35, 1966(1962)）、Ｚ−アラニンと保護Ｌ−グルタミン酸−γ−メチルエステルを用いる方法（Bull. Chem. Soc. Jpn., 37, 200(1964)）、Ｚ−アラニンエステルと無保護グルタミン酸を用いる方法（特開平１−９６１９４号公報）、２−置換−プロピオニルハロイドを原料として、Ｎ−（２−置換）−プロピオニルグルタミン誘導体を中間体として合成する方法（特開平６−２３４７１５号公報）等が知られている。
【０００４】
しかしながら、いずれの方法においても、保護基の導入脱離、もしくは中間体の合成が必要であり、工業的に有利で十分に満足できる製造方法ではなかった。
【０００５】
酵素を用いたジペプチドの代表的製造法としては、Ｎ保護、Ｃ無保護のカルボキシ成分とＮ無保護、Ｃ保護のアミン成分を用いる縮合反応（反応１）、およびＮ保護、Ｃ保護のカルボキシ成分とＮ無保護、Ｃ保護のアミン成分を用いる置換反応（反応２）が知られており、反応１の例としては、Ｚ−アスパラギン酸とフェニルアラニンメチルエステルからのＺ−アスパルチルフェニルアラニンメチルエステルの製造方法（特開昭５３−９２７２９号公報）、（反応２）の例としてはアセチルフェニルアラニンエチルエステルとロイシンアミドからのアセチルフェニルアラニルロイシンアミドの製造方法（Biochemical J., 163, 531(1977)）が挙げられる。Ｎ無保護、Ｃ保護のカルボキシ成分を用いる方法の研究報告例は極めて少なく、Ｎ無保護、Ｃ保護のカルボキシ成分とＮ無保護、Ｃ保護のアミン成分を用いる置換反応（反応３）の例としては特許WO90/01555があり、例えばアルギニンエチルエステルとロイシンアミドからのアルギニルロイシンアミドの製造方法が挙げられる。Ｎ無保護、Ｃ保護のカルボキシ成分とＮ無保護、Ｃ無保護のアミン成分を用いる置換反応（反応４）の例としては、特許EP278787Aがあり、例えばチロシンエチルエステルとアラニンからのチロシルアラニンの製造方法が挙げられる。これらの方法の中で最も安価な製造方法となり得るのは、当然ながら保護基の数が最も少ない反応４の範疇に入る反応である。
【０００６】
しかしながら、反応４の先行例（特許EP278787A）に使用する酵素は、Saccharomyces属に属する酵母あるいはカビ、植物に由来する比較的高価なcarboxypeptidase標品の試薬を用いており、また生産されるジペプチドも比較的疎水度の高いアミノ酸を含むものであった。特許EP278787Aにおいては、細菌およびSaccharomyces属酵母を除く酵母由来の酵素を用いる方法は全く知られておらず、また親水性の高いアラニルグルタミンやアラニルアスパラギンの製造方法については全く知られていなかった。このような背景の下、これらペプチドの工業的安価な製造法の開発が望まれていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、安価に入手可能な出発原料と安価に供給できる酵素源（微生物の培養物、微生物菌体、菌体処理物等）を用いて、工業的に有利かつ簡便な経路でジペプチドを製造する方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的に鑑み鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは安価に培養できる、ある種の細菌、酵母に属する微生物が、安価に入手可能なＬ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕 アクロモバクター属、アシネトバクター属、エアロモナス属、アグロバクテリウム属、アルカリゲネス属、アースロバクター属、ベイジェリンキア属、ブレビバクテリウム属、クラビバクター属、クリセオバクテリウム属、エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、フラボバクテリウム属、クルイヘラ属、ミクロバクテリウム属、ミクロコッカス属、ミコプラナ属、パントテア属、プロピオニバクテリウム属、リストネラ属、リゾビウム属、ロドコッカス属、サルモネラ属、ザルチナ属、セラチア属、ステノトロホモナス属、スタフィロコッカス属、ストレプトマイセス属、ビブリオ属、キサントモナス属、ブレラ属、キャンディダ属、クリプトコッカス属、フィロバシディウム属、ジオトリカム属、パキソレン属、ロドスポリジウム属、ロドトルラ属、サッカロミセス属、スポロブロマイセス属、トレメラ属、トルラスポラ属、トルロプシス属、アセトバクター属、グルコノバクター属、グルコンアセトバクター属、アサイア属、ズッカリバクター属、アクチノマデュラ属、キタサトスポリア属、ミクロモノスポーラ属、ノカルディア属、エルスコフィア属、サッカロスリクス属またはストレプトバーティシリウム属に属し、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、該微生物の菌体処理物、または、該微生物に由来するペプチド生成酵素を用いて、アミノ酸エステルとアミノ酸からジペプチドを製造することを特徴とするジペプチドの製造方法。
〔２〕 アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、該微生物の菌体処理物、または、該微生物に由来するペプチド生成酵素を用いて、アミノ酸エステルとアミノ酸からジペプチドを製造する際に、反応液に金属酵素阻害剤を添加することを特徴とする、上記〔１〕に記載のジペプチドの製造方法。
〔３〕 前記アミノ酸エステルが、Ｌ−アラニンエステルであることを特徴とする、上記〔１〕または〔２〕に記載のジペプチドの製造方法。
〔４〕 前記アミノ酸が、Ｌ−グルタミンであることを特徴とする、上記〔１〕から〔３〕のいずれか１項に記載のジペプチドの製造方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のジペプチドの製造方法は、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、または、該微生物の菌体処理物を用いることを特徴とする。本発明のジペプチドの製造方法における反応は下記反応式により表される。下記化学式に例示されるように、本明細書において「ジペプチド」とは、ペプチド結合を１つ有するペプチドポリマーのことをいう。
【００１１】
【化１】
（Ｒは置換または無置換の炭化水素鎖、Ｒ１はアミノ酸エステルの側鎖、Ｒ２はアミノ酸の側鎖を表す）
【００１２】
アミノ酸エステルは、安価に入手可能な化合物である。アミノ酸エステルと無保護アミノ酸を出発原料として、細菌、酵母を酵素源として水溶液中で反応せしめる本発明の方法は、従来にはない新しいジペプチドの製造方法であり、医薬品素材、機能性食品として有用なジペプチドをより安価に提供することを可能とするものである。
【００１３】
以下、本発明のジペプチドの製造方法を、
〔I〕アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物
〔II〕ジペプチドの製造方法
〔III〕ペプチド合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの単離等
の順に詳細に説明する。
【００１４】
〔I〕アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物
本発明に使用する微生物としては、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物を特に限定なく使用することができる。アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物としては、アクロモバクター属、アシネトバクター属、エアロモナス属、アグロバクテリウム属、アルカリゲネス属、アースロバクター属、ベイジェリンキア属、ブレビバクテリウム属、クラビバクター属、クリセオバクテリウム属、エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、フラボバクテリウム属、クルイヘラ属、ミクロバクテリウム属、ミクロコッカス属、ミコプラナ属、パントテア属、プロピオニバクテリウム属、リストネラ属、リゾビウム属、ロドコッカス属、サルモネラ属、ザルチナ属、セラチア属、ステノトロホモナス属、スタフィロコッカス属、ストレプトマイセス属、ビブリオ属、キサントモナス属、ブレラ属、キャンディダ属、クリプトコッカス属、フィロバシディウム属、ジオトリカム属、パキソレン属、ロドスポリジウム属、ロドトルラ属、サッカロミセス属、スポロブロマイセス属、トレメラ属、トルラスポラ属、またはトルロプシス属、アセトバクター属、グルコノバクター属、グルコンアセトバクター属、アサイア属、ズッカリバクター属、アクチノマデュラ属、キタサトスポリア属、ミクロモノスポーラ属、ノカルディア属、エルスコフィア属、サッカロスリクス属またはストレプトバーティシリウム属に属する微生物を挙げることができるが、具体的には以下のものを例示することができる。
【００１５】
アクロモバクター デルマーベ FERM BP-6988
(Achromobacter delmarvae)
アシネトバクター ジョンソニイ ATCC 9036
(Acinetobacter johnsonii)
エアロモナス サルモニシダ ATCC 14174
(Aeromonas salmonicida)
アグロバクテリウム ツメファシエンス IFO 3058
(Agrobacterium tumefaciens)
アルカリゲネス フェカリス ATCC 8750
(Alcaligenes faecalis)
アースロバクター シトレウス ATCC 11624
(Arthrobacter citreus)
ベイジェリンキア インディカ ATCC 9037
(Beijerinckia indica)
ブレビバクテリウム ローゼウム ATCC 13825
(Brevibacterium roseum)
クラビバクター ミシガネンス ATCC 7429
(Clavibacter michiganense)
クリセオバクテリウム メニンゴセプティカムATCC 13253
(Chryseobacterium meningosepticum)
エシェリヒア コリ ATCC 13071
(Escherichia coli)
エンテロバクター エアロゲネス ATCC 13048
(Enterobacter aerogenes)
エルビニア アミロボーラ IFO 12687
(Erwinia amylovora)
フラボバクテリウム レジノボーラムATCC 12524
(Flavobacterium resinovorum)
クルイヘラ シトロフィラFERM BP-6564
(Kluyvera citrophila)
ミクロバクテリウム インペリアエ ATCC 8365
(Microbacterium imperiale)
ミクロコッカス ルテウス ATCC 11880
(Micrococcus luteus)
ミコプラナ ブラータ ATCC 4278
(Mycoplana bullata)
パントエア アナナティス ATCC 23822
(Pantoea ananatis)
プロピオニバクテリウム シェルマーニ FERM BP-8100
(Propionibacterium shermanii)
リストネラ アングイラーラム ATCC 19264
(Listonella anguillarum)
リゾビウム ラジオバクター ATCC 4720
(Rhizobium radiobacter)
ロドコッカス ロドクラウス ATCC 21198
(Rhodococcus rhodochrous)
サルモネラ チフィムリウム FERM BP-6566
(Salmonella typhimurium)
ザルチナ ルテア FERM BP-6562
(Sarcina lutea)
セラチア グリメシイ ATCC 14460
(Serratia grimesii)
スタフィロコッカス アウレウス ATCC 12600
(Staphylococcus aureus)
ステノトロホモナス マルトフィリアATCC 13270
(Stenotrophomonas maltophilia)
ストレプトマイセス ラベンデュラエ ATCC 11924
(Streptomyces lavendulae)
ビブリオ チロゲネス FERM BP-5848
(Vibrio tyrogenes)
キサントモナス マルトフィリア FERM BP-5568
(Xanthomonas maltophilia)
ブレラ アルバ FERM BP-8099
(Bullera alba)
キャンディダ クルゼイ IFO 0011
(Candida krusei)
クリプトコッカス テレウス IFO 0727
(Cryptococcus terreus)
フィロバシディウム カプスリゲナム IFO 1119
(Filobacidium capsuligenum)
ジオトリクム アミセリウム ATCC 56046
(Geotrichum amycelium)
パキソレン タンノフィラス IFO 1007
(Pachysolen tannophilus)
ロドスポリジウム ディオボバータム IFO 1829
(Rhodosporidium diobovatum)
ロドトルラ ミヌタ IFO 0879
(Rhodotorula minuta)
サッカロミセス ユニスポーラス IFO 0724
(Saccharomyces unisporus)
スポロボロミセス サルモニカラ− IFO 1038
（Sporoboromyces salmonicolor）
トレメラ フォリアセ IFO 9297
(Tremella foliacea)
トルラスポーラ デルブルッキ IFO 1083
(Torulaspora delbrueckii)
トルロプシス インゲニオーサ FERM BP-8098
(Torulopsis ingeniosa)
グルコンアセトバクター リクエファシエンス IFO12388
（Gluconacetobacter liquefaciens）
アセトバクター オルレアネンシス IFO3223
（Acetobacter orleanensis）
アセトバクター パスツーリアヌス ATCC9325
（Acetobacter pasteurianus）
グルコノバクター オキシダンス ATCC621
（Gluconobacter oxydans）
グルコノバクター オキシダンス IFO3171
（Gluconobacter oxydans）
グルコンアセトバクター ハンゼニイ JCM7643
（Gluconacetobacter hansenii）
アサイア エタノリファシエンス FERM BP-6751
（Asaia ethanolifaciens）
ズッカリバクター フロリコーラ FERM BP-6752
（Zucharibacter floricola）
アクチノマデュラ マデュラエ ATCC 19425
（Actinomadura madurae）
キタサトスポリア グリセオラ IFO 14371
(Katasatosporia griseola)
ミクロモノスポーラ チェルシナ ATCC 53710
(Micromonospora chersina)
ノカルディア グロベルラ ATCC 21602
(Nocardia globerula)
エルスコフィア ツルバータ FERM BP-8122
(Oerskovia turbata)
サッカロスリクス オーストラリエンシス IFO 14444
(Saccharothrix australiensis)
ストレプトバーティシリウム モバラエンシス IFO-13819
(Streptoverticillium mobaraensis)
【００１６】
上記菌株のうち、ATCC番号が記載されているものは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（P.O.Box 1549 Manassas, VA 20110）に寄託されており、各番号を参照して分譲を受けることができる。上記菌株のうち、IFO番号が記載されているものは、財団法人発酵研究所（〒532-8686 大阪市淀川区十三本町2丁目17-85）に寄託されており、各番号を参照して分譲を受けることができる。上記菌株のうち、JCM番号が記載されているものは、理化学研究所（〒351-0106 埼玉県和光市広沢2-1）に寄託されており、各番号を参照して分譲を受けることができる。
【００１７】
上記菌株のうち、FERM番号が記載されているものは、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東１−１−１中央第6）に寄託され、受託番号が付与された微生物である。アクロモバクター デルマーベ FERM BP-6988は、１９９８年１月１６日に原寄託がなされ２０００年１月６日に国際寄託に移管されている。クルイヘラ シトロフィラ FERM BP-6564は、１９８５年４月２３日に原寄託がなされ、１９９８年１１月２日に国際寄託に移管されている。プロピオニバクテリウム シェルマーニ FERM BP-8100は、１９８７年１２月４日に原寄託がされ、２００２年７月１日に国際寄託に移管されている。サルモネラ チフィムリウム FERM BP-6566は、１９８７年７月１１日に原寄託がなされ、１９９８年１１月２日に国際寄託に移管されている。ザルチナ ルテア FERM BP-6562は、１９８４年１月２０日に原寄託がなされ、１９９８年１１月２日に国際寄託に移管されている。ビブリオ チロゲネス FERM BP-5848は、１９８３年４月２５日に原寄託がなされ、１９９７年３月４日に国際寄託に移管されている。キサントモナス マルトフィリア FERM BP-5568は、１９９５年６月１４日に原寄託がなされ、１９９６年６月１４日に国際寄託に移管されている。ブレラ アルバ FERM BP-8099は、１９８４年１２月２４日に原寄託がなされ、２００２年７月１日に国際寄託に移管されている。トルロプシス インゲニオーサ FERM BP-8098は、１９７０年８月２４日に原寄託がなされ、２００２年７月５日に国際寄託に移管されている。アサイア エタノリファシエンス FERM BP-6751（微生物の表示；Bacterium P528 AJ14757）、および、ズッカリバクター フロリコーラ FERM BP-6752（微生物の表示；Bacterium S877 AJ14758）は、１９９８年６月１８日に原寄託がなされ、１９９９年６月１４日に国際寄託に移管されている。エルスコフィア ツルバータ FERM BP-8122は、２００２年７月２２日に国際寄託されている。
【００１８】
これらの微生物としては、野生株または変異株のいずれを用いてもよいし、また、細胞融合もしくは遺伝子操作などの遺伝学的手法により誘導される組み換え株等も用いることができる。
【００１９】
このような微生物の菌体を得るには、当該微生物を適当な培地で培養増殖せしめるとよい。このための培地はその微生物が増殖し得るものであれば特に制限はなく、通常の炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、無機イオン、更に必要に応じ有機栄養源を含む通常の培地でよい。
【００２０】
例えば、炭素源としては上記微生物が利用可能であればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フラクトース、マルトース、アミロース等の糖類、ソルビトール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸類及びこれらの塩類、パラフィンなどの炭水化物類あるいはこれらの混合物などを使用することができる。
【００２１】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機塩のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの有機窒素化合物あるいはこれらの混合物を使用することができる。
他に無機塩類、微量金属塩、ビタミン類等、通常の培地に用いられる栄養源を適宜混合して用いることができる。
【００２２】
培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下にてｐＨ５〜８、温度１５〜４０℃の範囲でｐＨおよび温度を適当に制限しつつ１２〜４８時間程度培養を行えばよい。
【００２３】
〔II〕ジペプチドの製造方法
本発明のジペプチドの製造方法は、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、該微生物の菌体処理物、または、該微生物に由来するペプチド生成酵素を用いて、アミノ酸エステルおよびアミノ酸からジペプチドを製造するものである。
【００２４】
上記微生物の産生するペプチド生成酵素は、アミノ酸エステルとアミノ酸を基質としてジペプチドを生成する活性を有するものである。
【００２５】
上記微生物の産生するペプチド生成酵素をアミノ酸エステルおよびアミノ酸に作用せしめる方法としては、上記微生物を培養しながら、培養液中に直接基質を添加してもよいし、培養終了後の培養液あるいは微生物培養物から遠心分離等により菌体を分離し、これをそのままもしくは洗浄した後、緩衝液に再懸濁したものにアミノ酸エステルとアミノ酸を添加して反応させてもよい。あるいは、ポリアクリルアミドゲル法、カラギーナン法、アルギン酸ゲル法等の公知の方法で固定化した菌体を用いることができる。
【００２６】
また、微生物菌体の処理物として、菌体破砕物、アセトン処理菌体、凍結乾燥菌体を用いてもよい。菌体破砕には超音波破砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕等の方法を用いることができ、また溶菌させる場合には卵白リゾチームや、ペプチターゼ処理、またはこれらを適宜組み合わせた方法が用いられる。
【００２７】
さらに、当該微生物菌体処理物からペプチド生成酵素を回収し、粗酵素液として使用してもよいし、必要に応じて、酵素を精製して用いてもよい。培養物からの精製法としては通常の酵素精製法をもちいることができる。具体的には遠心分離等によって菌体を集め、超音波処理、ガラスビーズ、ダイノミルなどの機械的方法によって菌体を破砕し、細胞片等の固形物を遠心分離によって除き、粗酵素を得て、超遠心分離分画、塩析、有機溶媒沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等を行うことによって上述のペプチド生成酵素が精製される。
【００２８】
なお、「微生物に由来するペプチド生成酵素」とは、当該微生物菌体処理物から上記精製工程を経て得られた酵素のみならず、当該酵素の遺伝子を異種または同種の宿主において発現させることによる、いわゆる遺伝子工学的手法によって生産された酵素をも含む。
【００２９】
すなわち、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する活性を有する画分であれば、酵素と当該酵素含有物全てを使用することが可能である。ここで、「酵素含有物」とは、当該酵素を含有するものであればよく、具体的形態としては、当該酵素を生産する微生物の培養物、当該培養物から分離された微生物菌体、菌体処理物などが含まれる。微生物の培養物とは、微生物を培養して得られる物のことであり、より具体的には、微生物菌体、その微生物の培養に用いた培地および培養された微生物により生成された物質の混合物などのことをいう。また、微生物菌体は洗浄し、洗浄菌体として用いてもよい。また、菌体処理物には、菌体を破砕、溶菌、凍結乾燥したものなどが含まれ、さらに菌体などを処理して回収される粗酵素、さらに精製した精製酵素なども含まれる。精製処理された酵素としては、各種精製法によって得られる部分精製酵素等を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によって固定化した固定化酵素を使用してもよい。また、使用する微生物によっては、培養中に一部、溶菌するものもあるので、この場合には培養液上清も酵素含有物として利用できる。
【００３０】
なお、培養物、培養菌体、洗浄菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物を用いる場合には、ペプチドの生成に関与せずに生成ペプチドを分解する酵素が存在することが多く、この場合には、金属酵素阻害剤、例えばエチレンジアミンン四酢酸(ＥＤＴＡ)のような金属プロテアーゼ阻害剤などを添加するほうが好ましい場合がある。添加量は、０．１ｍＭから１００ｍＭの範囲で、好ましくは１ｍＭから５０ｍＭである。
【００３１】
酵素または酵素含有物の使用量は、目的とする効果を発揮する量（有効量）であればよく、この有効量は当業者であれば簡単な予備実験により容易に求められるが、例えば洗浄菌体を用いる場合は反応液１リットル当たり１〜５００ｇである。
【００３２】
アミノ酸エステルとしては、当該ペプチド生成酵素の基質特異性においてＬ−アミノ酸とジペプチドを生成できるアミノ酸エステルであればいかなるものも使用でき、例えば、Ｌ−アミノ酸のメチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｉｓｏ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、ｉｓｏ−ブチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル等が挙げられる。また、天然型のアミノ酸に対応したＬ−アミノ酸エステルだけでなく、非天然型のアミノ酸もしくはその誘導体に対応するＬ−アミノ酸エステルまたはＤ−アミノ酸エステルも使用可能である。本発明において、アミノ酸エステルとして好ましくは、Ｌ−アラニンエステルを用いることができる。アミノ酸としては、当該ペプチド生成酵素の基質特異性においてアミノ酸エステルとジペプチドを形成するものであれば特に限定なく公知のものを使用できる。例えば、アミノ酸としては、Ｌ−アミノ酸、Ｃ保護Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、Ｃ保護Ｄ−アミノ酸、アミン等が挙げられる。また、アミンとしては、天然型アミンだけでなく、非天然型のアミンもしくはその誘導体などが例示される。また、アミノ酸としては、天然型アミノ酸だけではなく非天然型アミノ酸もしくはその誘導体も例示される。α−アミノ酸の他、アミノ基の結合位置の異なる、β−、γ−、ω−等のアミノ酸なども例示される。本発明においては、アミノ酸として好ましくは、Ｌ−グルタミンを用いることができる。
【００３３】
出発原料であるアミノ酸エステルおよびアミノ酸の濃度は各々１ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは０．０５Ｍ〜２Ｍであるが、アミノ酸エステルに対してアミノ酸を等量以上添加したほうが好ましい場合がある。また、必要ならば、例えば基質が高濃度だと反応を阻害するような場合には、反応中にこれらを阻害しない濃度にして逐次添加する事ができる。
【００３４】
反応温度は３〜７０℃、好ましくは５〜５０℃であり、反応ｐＨはｐＨ２〜１２好ましくはｐＨ３〜１１である。かくして２〜４８時間程度反応を行うことにより、反応混合物中にジペプチドが生成蓄積する。生成されたジペプチドは、定法により回収し、必要に応じて精製することができる。
【００３５】
〔III〕ペプチド合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの単離等
〔III―１〕ＤＮＡの単離
本発明で用いられる微生物は、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有しており、上記の微生物群などから遺伝子工学的な手法を用いて、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成するタンパク質をコードするＤＮＡ単離し、形質転換体を作製することにより、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成するタンパク質（ペプチド合成酵素）を得ることもできる。以下に、例として、微生物からＬ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成するタンパク質をコードするＤＮＡ単離し、形質転換体を作製する方法についての実施形態を説明する。
【００３６】
はじめに、上記の微生物から上記〔II〕の欄で説明したようにして生成酵素を得て、精製されたペプチド生成酵素のアミノ酸配列を決定する。エドマン法（Edman,P., Acta Chem. Scand. 4, 227(1950)）を用いてアミノ酸配列を決定することができる。またApplied Biosystems社製のシークエンサーを用いてアミノ酸配列を決定することができる。精製されたペプチド生成酵素について、Ｎ末端から３０残基のアミノ酸配列を決定し、明らかとなったアミノ酸配列に基づいて、これをコードするＤＮＡの塩基配列を演繹できる。ＤＮＡの塩基配列を演繹するには、ユニバーサルコドンを採用する。
【００３７】
演繹された塩基配列に基づいて、３０塩基対程度のＤＮＡ分子を合成する。該ＤＮＡ分子を合成する方法はTetrahedron Letters, 22, 1859(1981)に開示されている。また、Applied Biosystems社製のシンセサイザーを用いて該ＤＮＡ分子を合成できる。該ＤＮＡ分子は、微生物菌体からペプチド生成酵素をコードするＤＮＡ全長を、染色体遺伝子ライブラリーから単離する際に、プローブとして利用できる。あるいは、ペプチド生成酵素をコードするＤＮＡをＰＣＲ法で増幅する際に、プライマーとして利用できる。ただし、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡは、ペプチド生成酵素をコードするＤＮＡ全長を含んでいないので、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡをプローブとして用いて、ペプチド生成酵素をコードするＤＮＡ全長を微生物の染色体遺伝子ライブラリーから単離する。
【００３８】
ＰＣＲ法の操作については、White, T.J. et al., Trends Genet. 5, 185(1989)等に記載されている。染色体ＤＮＡを調製する方法、さらにＤＮＡ分子をプローブとして用いて、遺伝子ライブラリーから目的とするＤＮＡ分子を単離する方法については、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)等に記載されている。
【００３９】
単離されたペプチド生成酵素をコードするＤＮＡの塩基配列を決定する方法は、A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, Inc.(1985)に記載されている。また、Applied Biosystems社製のＤＮＡシークエンサーを用いて、塩基配列を決定することができる。
【００４０】
本発明で用い得るＤＮＡは、上記のようにして得られるＤＮＡのみではない。ある特定の菌体の染色体ＤＮＡから単離されたペプチド生成酵素をコードするＤＮＡに人工的に変異を加えたＤＮＡであっても、ペプチド生成酵素をコードする場合には、本発明で用い得るＤＮＡである。人工的に変異を加える方法として頻繁に用いられるものとして、Method. in Enzymol.,154(1987)に記載されている部位特異的変異導入法がある。
【００４１】
さらに、上記のようにして染色体ＤＮＡなどから単離されたＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し、ペプチド生成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明で用いることができるＤＮＡである。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、このましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件があげられる。ペプチド生成酵素の活性については既に上記にて説明したとおりである。ただし、相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で元のアミノ酸配列を有するタンパク質の１０％以上、より好ましくは５０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
【００４２】
さらに、単離されたＤＮＡでコードされるタンパク質と実質的に同一のタンパク質も本発明で用いることができる。したがって、単離されたＤＮＡでコードされるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するペプチド生成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明において用いることができる。ここで「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や、ペプチド生成酵素活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１０個である。また、ペプチド生成酵素の活性については、既に説明した通りである。ただし、アミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で元のアミノ酸配列を有するタンパク質の１０％以上、より好ましくは５０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
【００４３】
上記のように、微生物からＤＮＡを単離した場合、本発明では下記のＤＮＡを好適に用いることができる。なお、例として、単離されたＤＮＡの特定された塩基配列を塩基配列ｙとし、当該塩基配列でコードされるアミノ酸配列をアミノ酸配列Ｙという。
【００４４】
（i）塩基配列ｙからなるＤＮＡ。
（ii）塩基配列ｙと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＬ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するペプチド生成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（iii）アミノ酸配列Ｙを有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（iv）アミノ酸配列Ｙにおいて、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するペプチド生成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００４５】
〔III−２〕形質転換体の作製
次に、ペプチド生成酵素活性を有するタンパク質を発現する形質転換体の作製について説明する。組み換えＤＮＡ技術を利用して酵素、生理活性物質等の有用タンパク質を製造する例は数多く知られており、組み換えＤＮＡ技術を用いることで、天然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産できる。
【００４６】
本発明の方法で用いることができる形質転換体としては、例えば下記（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）などのタンパク質を発現することができる形質転換体が好適なものとして挙げられる。
（Ａ）アミノ酸配列Ｙを有するタンパク質。
（Ｂ）アミノ酸配列Ｙにおいて、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するペプチド生成酵素活性を有するタンパク質。
（Ｃ）塩基配列ｙと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＬ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するペプチド生成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡでコードされるタンパク質。
【００４７】
上記（Ａ）〜（Ｃ）のペプチド生成酵素活性を有するタンパク質を発現する形質転換体を作製するためには、上記〔III―１〕の欄に示した（i）〜（iv）のＤＮＡを宿主細胞に導入すればよい。すなわち、（ｉ）、（ii）、（iii）または（iv）のＤＮＡを宿主細胞で発現可能な発現ベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入する。
【００４８】
上記（Ｂ）に示されるような変異は、例えば部位特異的変異法によって、本酵素遺伝子の特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加されるように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理としては、本酵素をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び本酵素をコードするＤＮＡを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法などが挙げられる。
【００４９】
タンパク質を組み換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、該タンパク質を生産する形質転換体内で該タンパク質が会合し、タンパク質の封入体（inclusion body）を形成させる形態も好ましい一実施形態として挙げられる。この発現生産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等である。
【００５０】
このようにして得られるタンパク質封入体は、タンパク質変性剤により可溶化され、主にその変性剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく折り畳まれた生理的に活性なタンパク質に変換される。例えば、ヒトインターロイキン−２の活性再生（特開昭６１−２５７９３１号公報）等多くの例がある。
【００５１】
タンパク質封入体から活性型タンパク質を得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパク質を菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させることにより、その影響を抑えることができる。
【００５２】
目的タンパク質を封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られているタンパク質との融合タンパク質として発現させる方法がある。
【００５３】
さらに、融合タンパク質として発現させた後に、目的のタンパク質を切り出すため、制限プロテアーゼの認識配列を適当な位置に配しておくことも有効である。
【００５４】
タンパク質を組み換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、形質転換される宿主細胞としては、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、動物細胞等を用いることができるが、一般に大腸菌などの腸内細菌、好ましくは大腸菌（エシェリヒア コリ、Escherichia coli）が用いられる。大腸菌などの腸内細菌を用いてタンパクを大量生産する技術について数多くの知見があるためである。以下、形質転換された大腸菌を用いてペプチド生成酵素を製造する方法の一形態を説明する。
【００５５】
ペプチド生成酵素をコードするＤＮＡを発現させるプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ラムダファージのＰＲプロモータ、ＰＬプロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。
【００５６】
ペプチド生成酵素を融合タンパク質封入体として生産させるためには、ペプチド生成酵素遺伝子の上流あるいは下流に、他のタンパク質、好ましくは親水性であるペプチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質遺伝子とする。このような他のタンパク質をコードする遺伝子としては、融合タンパク質の蓄積量を増加させ、変性・再生工程後に融合タンパク質の溶解性を高めるものであればよく、例えば、Ｔ７ｇｅｎｅ １０、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、インターフェロンγ遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。
【００５７】
これらの遺伝子とペプチド生成酵素をコードする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか、あるいは適当な配列の合成ＤＮＡを利用すればよい。
【００５８】
また、生産量を増大させるためには、融合タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネーターを連結することが好ましい場合がある。このターミネータとしては、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータ等が挙げられる。
【００５９】
ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。より具体的には、ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８等を用いることができる。他にもファージＤＮＡ、トランスポゾンＤＮＡのベクターも利用できる。
【００６０】
また、形質転換体を選別するために、該ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている（ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）ほか）。
【００６１】
プロモータ、ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子、ターミネータの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを連結して組み換えＤＮＡを得る。
【００６２】
該組み換えＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質が発現生産される。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用することができるが、例えばエシェリヒア コリ ＪＭ１０９株が好ましい。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法はMolecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)等に記載されている。
【００６３】
融合タンパク質として発現させた場合、血液凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、ペプチド生成酵素内に存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用いてペプチド生成酵素を切り出せるようにしてもよい。
【００６４】
生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。
【００６５】
ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質を回収するには、以下の方法などがある。ペプチド生成酵素あるいはその融合タンパク質が菌体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法によりペプチド生成酵素あるいはその融合タンパク質を精製して用いることも可能である。この場合、ペプチド生成酵素あるいは融合タンパク質の抗体を利用した精製法も利用できる。
【００６６】
タンパク質封入体が形成される場合には、変性剤でこれを可溶化する。菌体タンパク質とともに可溶化してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入体を取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入体を菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよい。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封入体を回収する。タンパク質封入体を可溶化させる変性剤としては、グアニジン塩酸（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜８）や尿素（例えば８Ｍ）などが挙げられる。
【００６７】
これらの変性剤を透析等により除くと、活性を有するタンパク質として再生される。透析に用いる透析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液などを用いればよく、濃度としては２０ｍＭ〜０．５Ｍ、ｐＨとしては５〜８が挙げられる。
【００６８】
再生工程時のタンパク質濃度は、５００μｇ／ｍｌ程度以下に抑えるのが好ましい。再生したペプチド生成酵素が自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は５℃以下であることが好ましい。また、変性剤除去の方法として、この透析法のほか、希釈法、限外濾過法などがあり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。
【００６９】
なお、遺伝子工学的な手法については、例えばMolecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)などの文献に記載された手法に準拠して実施することができる。
【００７０】
【実施例】
以下、実施例をあげて、さらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例におけるＬ−アラニン、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの定量は高速液体クロマトグラフィーを用いる方法（カラム：ＧＬサイエンス社製 ＩｎｅｒｔｓｉＬ ＯＤＳ−２、溶離液：リン酸水溶液（ｐＨ２．２、５．０ｍＭ １−オクタンスルホン酸ナトリウム溶液／メタノール＝１００／１５、流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出２１０ｎｍ）により行った。
【００７１】
（実施例１） Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成する微生物
細菌、放線菌の培養には、１Ｌ中にグルコース ５ｇ、硫酸アンモニウム ５ｇ、リン酸一カリウム １ｇ、リン酸二カリウム ３ｇ、硫酸マグネシウム ０．５ｇ、酵母エキス １０ｇ、ペプトン １０ｇを含む培地（ｐＨ７．０）５０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注し、１１５℃で１５分殺菌したものを用いた。これに１Ｌ中にグルコース ５ｇ、酵母エキス １０ｇ、ペプトン １０ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを含む斜面寒天培地（寒天 ２０g/L、ｐＨ７．０）にて３０℃、２４時間培養した表１（ａ）および表１（ｂ）に示す微生物を１白金耳接種し、３０℃、１２０往復／分、で１７時間振とう培養を行った。培養後菌体を遠心分離し、湿菌体として１００ｇ/Ｌになるように１０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）にて懸濁した。酵母の培養には、１Ｌ中にグルコース ５ｇ、硫酸アンモニウム ５ｇ、リン酸一カリウム １ｇ、リン酸二カリウム ３ｇ、硫酸マグネシウム ０．５ｇ、酵母エキス ５ｇ、マルツエキス ５ｇ、ペプトン １０ｇを含む培地（ｐＨ６．０）５０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注し、１１５℃で１５分殺菌したものを用いた。これに１Ｌ中にグルコース ５ｇ、酵母エキス ５ｇ、マルツエキス ５ｇ、ペプトン １０ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを含む斜面寒天培地（寒天 ２０g/L、ｐＨ６．０）にて３０℃、２４時間培養した下表に示す酵母を１白金耳接種し、２５℃、１２０往復／分、で１７時間振とう培養を行った。培養終了後、これらの培養液から菌体を遠心分離し、湿菌体として１００ｇ/Ｌになるように１０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）にて懸濁した。酢酸菌の培養には、１Ｌ中にグルコース５ｇ、硫酸アンモニウム ５ｇ、リン酸一カリウム １ｇ、リン酸二カリウム ３ｇ、硫酸マグネシウム ０．５ｇ（別殺菌）、酵母エキス ５ｇ、ペプトン ５ｇを含む培地（ｐＨ７．０）５０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注し、１２０℃で２０分殺菌したものを用いた。これに１Ｌ中にグルコース ５ｇ、酵母エキス １０ｇ、ペプトン１０ｇを含む斜面寒天培地（寒天 ２０g/L、ｐＨ７．０）にて３０℃、２４時間培養した表１（ｃ）に示す微生物を１白金耳接種し、３０℃、１２０往復／分、で２４時間振とう培養を行った。この培養液１ｍｌを上記培地（５０ｍｌ/５００ｍＬ坂口フラスコ）に添加し、３０℃、２４時間培養した。培養後菌体を遠心分離し、湿菌体として１００ｇ/Ｌになるように１０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）にて懸濁した。これらの微生物の菌体懸濁液０．１ｍＬに、ＥＤＴＡ１０ｍＭ、Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩２００ｍＭ、及びＬ−グルタミン４００ｍＭを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）０．１ｍＬをそれぞれ添加し、全量を０．２ｍＬとした後、２５℃にて２時間反応をおこなった。このときのＬ―アラニル−Ｌ−グルタミン（Ala-Gln）の生成量（ｍＭ）を表１（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に示す。
【００７２】
【表１】
【００７３】
【表２】
【００７４】
【表３】
【００７５】
【発明の効果】
本発明のジペプチドの製造方法により、複雑な合成方法を経ることなく、安価に入手可能なアミノ酸エステルとアミノ酸を用いてジペプチドを製造することができ、医薬品素材、機能性食品等として有用なジペプチドの製造コストダウンが可能となる。また、本発明のジペプチドの製造方法によれば、様々な種類のアミノ酸エステルおよびアミノ酸を原料として、種々のタイプのジペプチドを生成することができる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、複雑な合成方法を経ることなく、簡便かつ安価にジペプチドを製造する方法に関し、より詳細には、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを製造する方法、当該ジペプチドの製造方法に使用するペプチド生成酵素およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ジペプチドは、医薬品素材、機能性食品等のさまざまな分野で利用されている。例えば、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンは無血清培地の成分として有用であり、Ｌ−グルタミンに比べ安定で、水溶性も高いことから輸液成分に用いられる。
【０００３】
ジペプチドの製造法としては従来から化学合成法が知られているが、その製造法は必ずしも簡便なものではなかった。例えば、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアラニン（以下Ｚ−アラニンと称する）と保護Ｌ−グルタミンを用いる方法（Bull. Chem. Soc. Jpn., 34,739(1961)、Bull. Chem. Soc. Jpn., 35, 1966(1962)）、Ｚ−アラニンと保護Ｌ−グルタミン酸−γ−メチルエステルを用いる方法（Bull. Chem. Soc. Jpn., 37, 200(1964)）、Ｚ−アラニンエステルと無保護グルタミン酸を用いる方法（特開平１−９６１９４号公報）、２−置換−プロピオニルハロイドを原料として、Ｎ−（２−置換）−プロピオニルグルタミン誘導体を中間体として合成する方法（特開平６−２３４７１５号公報）等が知られている。
【０００４】
しかしながら、いずれの方法においても、保護基の導入脱離、もしくは中間体の合成が必要であり、工業的に有利で十分に満足できる製造方法ではなかった。
【０００５】
酵素を用いたジペプチドの代表的製造法としては、Ｎ保護、Ｃ無保護のカルボキシ成分とＮ無保護、Ｃ保護のアミン成分を用いる縮合反応（反応１）、およびＮ保護、Ｃ保護のカルボキシ成分とＮ無保護、Ｃ保護のアミン成分を用いる置換反応（反応２）が知られており、反応１の例としては、Ｚ−アスパラギン酸とフェニルアラニンメチルエステルからのＺ−アスパルチルフェニルアラニンメチルエステルの製造方法（特開昭５３−９２７２９号公報）、（反応２）の例としてはアセチルフェニルアラニンエチルエステルとロイシンアミドからのアセチルフェニルアラニルロイシンアミドの製造方法（Biochemical J., 163, 531(1977)）が挙げられる。Ｎ無保護、Ｃ保護のカルボキシ成分を用いる方法の研究報告例は極めて少なく、Ｎ無保護、Ｃ保護のカルボキシ成分とＮ無保護、Ｃ保護のアミン成分を用いる置換反応（反応３）の例としては特許WO90/01555があり、例えばアルギニンエチルエステルとロイシンアミドからのアルギニルロイシンアミドの製造方法が挙げられる。Ｎ無保護、Ｃ保護のカルボキシ成分とＮ無保護、Ｃ無保護のアミン成分を用いる置換反応（反応４）の例としては、特許EP278787Aがあり、例えばチロシンエチルエステルとアラニンからのチロシルアラニンの製造方法が挙げられる。これらの方法の中で最も安価な製造方法となり得るのは、当然ながら保護基の数が最も少ない反応４の範疇に入る反応である。
【０００６】
しかしながら、反応４の先行例（特許EP278787A）に使用する酵素は、Saccharomyces属に属する酵母あるいはカビ、植物に由来する比較的高価なcarboxypeptidase標品の試薬を用いており、また生産されるジペプチドも比較的疎水度の高いアミノ酸を含むものであった。特許EP278787Aにおいては、細菌およびSaccharomyces属酵母を除く酵母由来の酵素を用いる方法は全く知られておらず、また親水性の高いアラニルグルタミンやアラニルアスパラギンの製造方法については全く知られていなかった。このような背景の下、これらペプチドの工業的安価な製造法の開発が望まれていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、安価に入手可能な出発原料と安価に供給できる酵素源（微生物の培養物、微生物菌体、菌体処理物等）を用いて、工業的に有利かつ簡便な経路でジペプチドを製造する方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的に鑑み鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは安価に培養できる、ある種の細菌、酵母に属する微生物が、安価に入手可能なＬ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕 アクロモバクター属、アシネトバクター属、エアロモナス属、アグロバクテリウム属、アルカリゲネス属、アースロバクター属、ベイジェリンキア属、ブレビバクテリウム属、クラビバクター属、クリセオバクテリウム属、エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、フラボバクテリウム属、クルイヘラ属、ミクロバクテリウム属、ミクロコッカス属、ミコプラナ属、パントテア属、プロピオニバクテリウム属、リストネラ属、リゾビウム属、ロドコッカス属、サルモネラ属、ザルチナ属、セラチア属、ステノトロホモナス属、スタフィロコッカス属、ストレプトマイセス属、ビブリオ属、キサントモナス属、ブレラ属、キャンディダ属、クリプトコッカス属、フィロバシディウム属、ジオトリカム属、パキソレン属、ロドスポリジウム属、ロドトルラ属、サッカロミセス属、スポロブロマイセス属、トレメラ属、トルラスポラ属、トルロプシス属、アセトバクター属、グルコノバクター属、グルコンアセトバクター属、アサイア属、ズッカリバクター属、アクチノマデュラ属、キタサトスポリア属、ミクロモノスポーラ属、ノカルディア属、エルスコフィア属、サッカロスリクス属またはストレプトバーティシリウム属に属し、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、該微生物の菌体処理物、または、該微生物に由来するペプチド生成酵素を用いて、アミノ酸エステルとアミノ酸からジペプチドを製造することを特徴とするジペプチドの製造方法。
〔２〕 アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、該微生物の菌体処理物、または、該微生物に由来するペプチド生成酵素を用いて、アミノ酸エステルとアミノ酸からジペプチドを製造する際に、反応液に金属酵素阻害剤を添加することを特徴とする、上記〔１〕に記載のジペプチドの製造方法。
〔３〕 前記アミノ酸エステルが、Ｌ−アラニンエステルであることを特徴とする、上記〔１〕または〔２〕に記載のジペプチドの製造方法。
〔４〕 前記アミノ酸が、Ｌ−グルタミンであることを特徴とする、上記〔１〕から〔３〕のいずれか１項に記載のジペプチドの製造方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のジペプチドの製造方法は、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、または、該微生物の菌体処理物を用いることを特徴とする。本発明のジペプチドの製造方法における反応は下記反応式により表される。下記化学式に例示されるように、本明細書において「ジペプチド」とは、ペプチド結合を１つ有するペプチドポリマーのことをいう。
【００１１】
【化１】
【００１２】
アミノ酸エステルは、安価に入手可能な化合物である。アミノ酸エステルと無保護アミノ酸を出発原料として、細菌、酵母を酵素源として水溶液中で反応せしめる本発明の方法は、従来にはない新しいジペプチドの製造方法であり、医薬品素材、機能性食品として有用なジペプチドをより安価に提供することを可能とするものである。
【００１３】
以下、本発明のジペプチドの製造方法を、
〔I〕アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物
〔II〕ジペプチドの製造方法
〔III〕ペプチド合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの単離等
の順に詳細に説明する。
【００１４】
〔I〕アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物
本発明に使用する微生物としては、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物を特に限定なく使用することができる。アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物としては、アクロモバクター属、アシネトバクター属、エアロモナス属、アグロバクテリウム属、アルカリゲネス属、アースロバクター属、ベイジェリンキア属、ブレビバクテリウム属、クラビバクター属、クリセオバクテリウム属、エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、フラボバクテリウム属、クルイヘラ属、ミクロバクテリウム属、ミクロコッカス属、ミコプラナ属、パントテア属、プロピオニバクテリウム属、リストネラ属、リゾビウム属、ロドコッカス属、サルモネラ属、ザルチナ属、セラチア属、ステノトロホモナス属、スタフィロコッカス属、ストレプトマイセス属、ビブリオ属、キサントモナス属、ブレラ属、キャンディダ属、クリプトコッカス属、フィロバシディウム属、ジオトリカム属、パキソレン属、ロドスポリジウム属、ロドトルラ属、サッカロミセス属、スポロブロマイセス属、トレメラ属、トルラスポラ属、またはトルロプシス属、アセトバクター属、グルコノバクター属、グルコンアセトバクター属、アサイア属、ズッカリバクター属、アクチノマデュラ属、キタサトスポリア属、ミクロモノスポーラ属、ノカルディア属、エルスコフィア属、サッカロスリクス属またはストレプトバーティシリウム属に属する微生物を挙げることができるが、具体的には以下のものを例示することができる。
【００１５】
アクロモバクター デルマーベ FERM BP-6988
(Achromobacter delmarvae)
アシネトバクター ジョンソニイ ATCC 9036
(Acinetobacter johnsonii)
エアロモナス サルモニシダ ATCC 14174
(Aeromonas salmonicida)
アグロバクテリウム ツメファシエンス IFO 3058
(Agrobacterium tumefaciens)
アルカリゲネス フェカリス ATCC 8750
(Alcaligenes faecalis)
アースロバクター シトレウス ATCC 11624
(Arthrobacter citreus)
ベイジェリンキア インディカ ATCC 9037
(Beijerinckia indica)
ブレビバクテリウム ローゼウム ATCC 13825
(Brevibacterium roseum)
クラビバクター ミシガネンス ATCC 7429
(Clavibacter michiganense)
クリセオバクテリウム メニンゴセプティカムATCC 13253
(Chryseobacterium meningosepticum)
エシェリヒア コリ ATCC 13071
(Escherichia coli)
エンテロバクター エアロゲネス ATCC 13048
(Enterobacter aerogenes)
エルビニア アミロボーラ IFO 12687
(Erwinia amylovora)
フラボバクテリウム レジノボーラムATCC 12524
(Flavobacterium resinovorum)
クルイヘラ シトロフィラFERM BP-6564
(Kluyvera citrophila)
ミクロバクテリウム インペリアエ ATCC 8365
(Microbacterium imperiale)
ミクロコッカス ルテウス ATCC 11880
(Micrococcus luteus)
ミコプラナ ブラータ ATCC 4278
(Mycoplana bullata)
パントエア アナナティス ATCC 23822
(Pantoea ananatis)
プロピオニバクテリウム シェルマーニ FERM BP-8100
(Propionibacterium shermanii)
リストネラ アングイラーラム ATCC 19264
(Listonella anguillarum)
リゾビウム ラジオバクター ATCC 4720
(Rhizobium radiobacter)
ロドコッカス ロドクラウス ATCC 21198
(Rhodococcus rhodochrous)
サルモネラ チフィムリウム FERM BP-6566
(Salmonella typhimurium)
ザルチナ ルテア FERM BP-6562
(Sarcina lutea)
セラチア グリメシイ ATCC 14460
(Serratia grimesii)
スタフィロコッカス アウレウス ATCC 12600
(Staphylococcus aureus)
ステノトロホモナス マルトフィリアATCC 13270
(Stenotrophomonas maltophilia)
ストレプトマイセス ラベンデュラエ ATCC 11924
(Streptomyces lavendulae)
ビブリオ チロゲネス FERM BP-5848
(Vibrio tyrogenes)
キサントモナス マルトフィリア FERM BP-5568
(Xanthomonas maltophilia)
ブレラ アルバ FERM BP-8099
(Bullera alba)
キャンディダ クルゼイ IFO 0011
(Candida krusei)
クリプトコッカス テレウス IFO 0727
(Cryptococcus terreus)
フィロバシディウム カプスリゲナム IFO 1119
(Filobacidium capsuligenum)
ジオトリクム アミセリウム ATCC 56046
(Geotrichum amycelium)
パキソレン タンノフィラス IFO 1007
(Pachysolen tannophilus)
ロドスポリジウム ディオボバータム IFO 1829
(Rhodosporidium diobovatum)
ロドトルラ ミヌタ IFO 0879
(Rhodotorula minuta)
サッカロミセス ユニスポーラス IFO 0724
(Saccharomyces unisporus)
スポロボロミセス サルモニカラ− IFO 1038
（Sporoboromyces salmonicolor）
トレメラ フォリアセ IFO 9297
(Tremella foliacea)
トルラスポーラ デルブルッキ IFO 1083
(Torulaspora delbrueckii)
トルロプシス インゲニオーサ FERM BP-8098
(Torulopsis ingeniosa)
グルコンアセトバクター リクエファシエンス IFO12388
（Gluconacetobacter liquefaciens）
アセトバクター オルレアネンシス IFO3223
（Acetobacter orleanensis）
アセトバクター パスツーリアヌス ATCC9325
（Acetobacter pasteurianus）
グルコノバクター オキシダンス ATCC621
（Gluconobacter oxydans）
グルコノバクター オキシダンス IFO3171
（Gluconobacter oxydans）
グルコンアセトバクター ハンゼニイ JCM7643
（Gluconacetobacter hansenii）
アサイア エタノリファシエンス FERM BP-6751
（Asaia ethanolifaciens）
ズッカリバクター フロリコーラ FERM BP-6752
（Zucharibacter floricola）
アクチノマデュラ マデュラエ ATCC 19425
（Actinomadura madurae）
キタサトスポリア グリセオラ IFO 14371
(Katasatosporia griseola)
ミクロモノスポーラ チェルシナ ATCC 53710
(Micromonospora chersina)
ノカルディア グロベルラ ATCC 21602
(Nocardia globerula)
エルスコフィア ツルバータ FERM BP-8122
(Oerskovia turbata)
サッカロスリクス オーストラリエンシス IFO 14444
(Saccharothrix australiensis)
ストレプトバーティシリウム モバラエンシス IFO-13819
(Streptoverticillium mobaraensis)
【００１６】
上記菌株のうち、ATCC番号が記載されているものは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（P.O.Box 1549 Manassas, VA 20110）に寄託されており、各番号を参照して分譲を受けることができる。上記菌株のうち、IFO番号が記載されているものは、財団法人発酵研究所（〒532-8686 大阪市淀川区十三本町2丁目17-85）に寄託されており、各番号を参照して分譲を受けることができる。上記菌株のうち、JCM番号が記載されているものは、理化学研究所（〒351-0106 埼玉県和光市広沢2-1）に寄託されており、各番号を参照して分譲を受けることができる。
【００１７】
上記菌株のうち、FERM番号が記載されているものは、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東１−１−１中央第6）に寄託され、受託番号が付与された微生物である。アクロモバクター デルマーベ FERM BP-6988は、１９９８年１月１６日に原寄託がなされ２０００年１月６日に国際寄託に移管されている。クルイヘラ シトロフィラ FERM BP-6564は、１９８５年４月２３日に原寄託がなされ、１９９８年１１月２日に国際寄託に移管されている。プロピオニバクテリウム シェルマーニ FERM BP-8100は、１９８７年１２月４日に原寄託がされ、２００２年７月１日に国際寄託に移管されている。サルモネラ チフィムリウム FERM BP-6566は、１９８７年７月１１日に原寄託がなされ、１９９８年１１月２日に国際寄託に移管されている。ザルチナ ルテア FERM BP-6562は、１９８４年１月２０日に原寄託がなされ、１９９８年１１月２日に国際寄託に移管されている。ビブリオ チロゲネス FERM BP-5848は、１９８３年４月２５日に原寄託がなされ、１９９７年３月４日に国際寄託に移管されている。キサントモナス マルトフィリア FERM BP-5568は、１９９５年６月１４日に原寄託がなされ、１９９６年６月１４日に国際寄託に移管されている。ブレラ アルバ FERM BP-8099は、１９８４年１２月２４日に原寄託がなされ、２００２年７月１日に国際寄託に移管されている。トルロプシス インゲニオーサ FERM BP-8098は、１９７０年８月２４日に原寄託がなされ、２００２年７月５日に国際寄託に移管されている。アサイア エタノリファシエンス FERM BP-6751（微生物の表示；Bacterium P528 AJ14757）、および、ズッカリバクター フロリコーラ FERM BP-6752（微生物の表示；Bacterium S877 AJ14758）は、１９９８年６月１８日に原寄託がなされ、１９９９年６月１４日に国際寄託に移管されている。エルスコフィア ツルバータ FERM BP-8122は、２００２年７月２２日に国際寄託されている。
【００１８】
これらの微生物としては、野生株または変異株のいずれを用いてもよいし、また、細胞融合もしくは遺伝子操作などの遺伝学的手法により誘導される組み換え株等も用いることができる。
【００１９】
このような微生物の菌体を得るには、当該微生物を適当な培地で培養増殖せしめるとよい。このための培地はその微生物が増殖し得るものであれば特に制限はなく、通常の炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、無機イオン、更に必要に応じ有機栄養源を含む通常の培地でよい。
【００２０】
例えば、炭素源としては上記微生物が利用可能であればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フラクトース、マルトース、アミロース等の糖類、ソルビトール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸類及びこれらの塩類、パラフィンなどの炭水化物類あるいはこれらの混合物などを使用することができる。
【００２１】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機塩のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの有機窒素化合物あるいはこれらの混合物を使用することができる。
他に無機塩類、微量金属塩、ビタミン類等、通常の培地に用いられる栄養源を適宜混合して用いることができる。
【００２２】
培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下にてｐＨ５〜８、温度１５〜４０℃の範囲でｐＨおよび温度を適当に制限しつつ１２〜４８時間程度培養を行えばよい。
【００２３】
〔II〕ジペプチドの製造方法
本発明のジペプチドの製造方法は、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、該微生物の菌体処理物、または、該微生物に由来するペプチド生成酵素を用いて、アミノ酸エステルおよびアミノ酸からジペプチドを製造するものである。
【００２４】
上記微生物の産生するペプチド生成酵素は、アミノ酸エステルとアミノ酸を基質としてジペプチドを生成する活性を有するものである。
【００２５】
上記微生物の産生するペプチド生成酵素をアミノ酸エステルおよびアミノ酸に作用せしめる方法としては、上記微生物を培養しながら、培養液中に直接基質を添加してもよいし、培養終了後の培養液あるいは微生物培養物から遠心分離等により菌体を分離し、これをそのままもしくは洗浄した後、緩衝液に再懸濁したものにアミノ酸エステルとアミノ酸を添加して反応させてもよい。あるいは、ポリアクリルアミドゲル法、カラギーナン法、アルギン酸ゲル法等の公知の方法で固定化した菌体を用いることができる。
【００２６】
また、微生物菌体の処理物として、菌体破砕物、アセトン処理菌体、凍結乾燥菌体を用いてもよい。菌体破砕には超音波破砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕等の方法を用いることができ、また溶菌させる場合には卵白リゾチームや、ペプチターゼ処理、またはこれらを適宜組み合わせた方法が用いられる。
【００２７】
さらに、当該微生物菌体処理物からペプチド生成酵素を回収し、粗酵素液として使用してもよいし、必要に応じて、酵素を精製して用いてもよい。培養物からの精製法としては通常の酵素精製法をもちいることができる。具体的には遠心分離等によって菌体を集め、超音波処理、ガラスビーズ、ダイノミルなどの機械的方法によって菌体を破砕し、細胞片等の固形物を遠心分離によって除き、粗酵素を得て、超遠心分離分画、塩析、有機溶媒沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等を行うことによって上述のペプチド生成酵素が精製される。
【００２８】
なお、「微生物に由来するペプチド生成酵素」とは、当該微生物菌体処理物から上記精製工程を経て得られた酵素のみならず、当該酵素の遺伝子を異種または同種の宿主において発現させることによる、いわゆる遺伝子工学的手法によって生産された酵素をも含む。
【００２９】
すなわち、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する活性を有する画分であれば、酵素と当該酵素含有物全てを使用することが可能である。ここで、「酵素含有物」とは、当該酵素を含有するものであればよく、具体的形態としては、当該酵素を生産する微生物の培養物、当該培養物から分離された微生物菌体、菌体処理物などが含まれる。微生物の培養物とは、微生物を培養して得られる物のことであり、より具体的には、微生物菌体、その微生物の培養に用いた培地および培養された微生物により生成された物質の混合物などのことをいう。また、微生物菌体は洗浄し、洗浄菌体として用いてもよい。また、菌体処理物には、菌体を破砕、溶菌、凍結乾燥したものなどが含まれ、さらに菌体などを処理して回収される粗酵素、さらに精製した精製酵素なども含まれる。精製処理された酵素としては、各種精製法によって得られる部分精製酵素等を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によって固定化した固定化酵素を使用してもよい。また、使用する微生物によっては、培養中に一部、溶菌するものもあるので、この場合には培養液上清も酵素含有物として利用できる。
【００３０】
なお、培養物、培養菌体、洗浄菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物を用いる場合には、ペプチドの生成に関与せずに生成ペプチドを分解する酵素が存在することが多く、この場合には、金属酵素阻害剤、例えばエチレンジアミンン四酢酸(ＥＤＴＡ)のような金属プロテアーゼ阻害剤などを添加するほうが好ましい場合がある。添加量は、０．１ｍＭから１００ｍＭの範囲で、好ましくは１ｍＭから５０ｍＭである。
【００３１】
酵素または酵素含有物の使用量は、目的とする効果を発揮する量（有効量）であればよく、この有効量は当業者であれば簡単な予備実験により容易に求められるが、例えば洗浄菌体を用いる場合は反応液１リットル当たり１〜５００ｇである。
【００３２】
アミノ酸エステルとしては、当該ペプチド生成酵素の基質特異性においてＬ−アミノ酸とジペプチドを生成できるアミノ酸エステルであればいかなるものも使用でき、例えば、Ｌ−アミノ酸のメチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｉｓｏ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、ｉｓｏ−ブチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル等が挙げられる。また、天然型のアミノ酸に対応したＬ−アミノ酸エステルだけでなく、非天然型のアミノ酸もしくはその誘導体に対応するＬ−アミノ酸エステルまたはＤ−アミノ酸エステルも使用可能である。本発明において、アミノ酸エステルとして好ましくは、Ｌ−アラニンエステルを用いることができる。アミノ酸としては、当該ペプチド生成酵素の基質特異性においてアミノ酸エステルとジペプチドを形成するものであれば特に限定なく公知のものを使用できる。例えば、アミノ酸としては、Ｌ−アミノ酸、Ｃ保護Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、Ｃ保護Ｄ−アミノ酸、アミン等が挙げられる。また、アミンとしては、天然型アミンだけでなく、非天然型のアミンもしくはその誘導体などが例示される。また、アミノ酸としては、天然型アミノ酸だけではなく非天然型アミノ酸もしくはその誘導体も例示される。α−アミノ酸の他、アミノ基の結合位置の異なる、β−、γ−、ω−等のアミノ酸なども例示される。本発明においては、アミノ酸として好ましくは、Ｌ−グルタミンを用いることができる。
【００３３】
出発原料であるアミノ酸エステルおよびアミノ酸の濃度は各々１ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは０．０５Ｍ〜２Ｍであるが、アミノ酸エステルに対してアミノ酸を等量以上添加したほうが好ましい場合がある。また、必要ならば、例えば基質が高濃度だと反応を阻害するような場合には、反応中にこれらを阻害しない濃度にして逐次添加する事ができる。
【００３４】
反応温度は３〜７０℃、好ましくは５〜５０℃であり、反応ｐＨはｐＨ２〜１２好ましくはｐＨ３〜１１である。かくして２〜４８時間程度反応を行うことにより、反応混合物中にジペプチドが生成蓄積する。生成されたジペプチドは、定法により回収し、必要に応じて精製することができる。
【００３５】
〔III〕ペプチド合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの単離等
〔III―１〕ＤＮＡの単離
本発明で用いられる微生物は、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有しており、上記の微生物群などから遺伝子工学的な手法を用いて、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成するタンパク質をコードするＤＮＡ単離し、形質転換体を作製することにより、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成するタンパク質（ペプチド合成酵素）を得ることもできる。以下に、例として、微生物からＬ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成するタンパク質をコードするＤＮＡ単離し、形質転換体を作製する方法についての実施形態を説明する。
【００３６】
はじめに、上記の微生物から上記〔II〕の欄で説明したようにして生成酵素を得て、精製されたペプチド生成酵素のアミノ酸配列を決定する。エドマン法（Edman,P., Acta Chem. Scand. 4, 227(1950)）を用いてアミノ酸配列を決定することができる。またApplied Biosystems社製のシークエンサーを用いてアミノ酸配列を決定することができる。精製されたペプチド生成酵素について、Ｎ末端から３０残基のアミノ酸配列を決定し、明らかとなったアミノ酸配列に基づいて、これをコードするＤＮＡの塩基配列を演繹できる。ＤＮＡの塩基配列を演繹するには、ユニバーサルコドンを採用する。
【００３７】
演繹された塩基配列に基づいて、３０塩基対程度のＤＮＡ分子を合成する。該ＤＮＡ分子を合成する方法はTetrahedron Letters, 22, 1859(1981)に開示されている。また、Applied Biosystems社製のシンセサイザーを用いて該ＤＮＡ分子を合成できる。該ＤＮＡ分子は、微生物菌体からペプチド生成酵素をコードするＤＮＡ全長を、染色体遺伝子ライブラリーから単離する際に、プローブとして利用できる。あるいは、ペプチド生成酵素をコードするＤＮＡをＰＣＲ法で増幅する際に、プライマーとして利用できる。ただし、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡは、ペプチド生成酵素をコードするＤＮＡ全長を含んでいないので、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡをプローブとして用いて、ペプチド生成酵素をコードするＤＮＡ全長を微生物の染色体遺伝子ライブラリーから単離する。
【００３８】
ＰＣＲ法の操作については、White, T.J. et al., Trends Genet. 5, 185(1989)等に記載されている。染色体ＤＮＡを調製する方法、さらにＤＮＡ分子をプローブとして用いて、遺伝子ライブラリーから目的とするＤＮＡ分子を単離する方法については、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)等に記載されている。
【００３９】
単離されたペプチド生成酵素をコードするＤＮＡの塩基配列を決定する方法は、A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, Inc.(1985)に記載されている。また、Applied Biosystems社製のＤＮＡシークエンサーを用いて、塩基配列を決定することができる。
【００４０】
本発明で用い得るＤＮＡは、上記のようにして得られるＤＮＡのみではない。ある特定の菌体の染色体ＤＮＡから単離されたペプチド生成酵素をコードするＤＮＡに人工的に変異を加えたＤＮＡであっても、ペプチド生成酵素をコードする場合には、本発明で用い得るＤＮＡである。人工的に変異を加える方法として頻繁に用いられるものとして、Method. in Enzymol.,154(1987)に記載されている部位特異的変異導入法がある。
【００４１】
さらに、上記のようにして染色体ＤＮＡなどから単離されたＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し、ペプチド生成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明で用いることができるＤＮＡである。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、このましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件があげられる。ペプチド生成酵素の活性については既に上記にて説明したとおりである。ただし、相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で元のアミノ酸配列を有するタンパク質の１０％以上、より好ましくは５０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
【００４２】
さらに、単離されたＤＮＡでコードされるタンパク質と実質的に同一のタンパク質も本発明で用いることができる。したがって、単離されたＤＮＡでコードされるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するペプチド生成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明において用いることができる。ここで「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や、ペプチド生成酵素活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１０個である。また、ペプチド生成酵素の活性については、既に説明した通りである。ただし、アミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で元のアミノ酸配列を有するタンパク質の１０％以上、より好ましくは５０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
【００４３】
上記のように、微生物からＤＮＡを単離した場合、本発明では下記のＤＮＡを好適に用いることができる。なお、例として、単離されたＤＮＡの特定された塩基配列を塩基配列ｙとし、当該塩基配列でコードされるアミノ酸配列をアミノ酸配列Ｙという。
【００４４】
（i）塩基配列ｙからなるＤＮＡ。
（ii）塩基配列ｙと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＬ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するペプチド生成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（iii）アミノ酸配列Ｙを有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（iv）アミノ酸配列Ｙにおいて、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するペプチド生成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００４５】
〔III−２〕形質転換体の作製
次に、ペプチド生成酵素活性を有するタンパク質を発現する形質転換体の作製について説明する。組み換えＤＮＡ技術を利用して酵素、生理活性物質等の有用タンパク質を製造する例は数多く知られており、組み換えＤＮＡ技術を用いることで、天然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産できる。
【００４６】
本発明の方法で用いることができる形質転換体としては、例えば下記（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）などのタンパク質を発現することができる形質転換体が好適なものとして挙げられる。
（Ａ）アミノ酸配列Ｙを有するタンパク質。
（Ｂ）アミノ酸配列Ｙにおいて、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するペプチド生成酵素活性を有するタンパク質。
（Ｃ）塩基配列ｙと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＬ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するペプチド生成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡでコードされるタンパク質。
【００４７】
上記（Ａ）〜（Ｃ）のペプチド生成酵素活性を有するタンパク質を発現する形質転換体を作製するためには、上記〔III―１〕の欄に示した（i）〜（iv）のＤＮＡを宿主細胞に導入すればよい。すなわち、（ｉ）、（ii）、（iii）または（iv）のＤＮＡを宿主細胞で発現可能な発現ベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入する。
【００４８】
上記（Ｂ）に示されるような変異は、例えば部位特異的変異法によって、本酵素遺伝子の特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加されるように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理としては、本酵素をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び本酵素をコードするＤＮＡを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法などが挙げられる。
【００４９】
タンパク質を組み換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、該タンパク質を生産する形質転換体内で該タンパク質が会合し、タンパク質の封入体（inclusion body）を形成させる形態も好ましい一実施形態として挙げられる。この発現生産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等である。
【００５０】
このようにして得られるタンパク質封入体は、タンパク質変性剤により可溶化され、主にその変性剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく折り畳まれた生理的に活性なタンパク質に変換される。例えば、ヒトインターロイキン−２の活性再生（特開昭６１−２５７９３１号公報）等多くの例がある。
【００５１】
タンパク質封入体から活性型タンパク質を得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパク質を菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させることにより、その影響を抑えることができる。
【００５２】
目的タンパク質を封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られているタンパク質との融合タンパク質として発現させる方法がある。
【００５３】
さらに、融合タンパク質として発現させた後に、目的のタンパク質を切り出すため、制限プロテアーゼの認識配列を適当な位置に配しておくことも有効である。
【００５４】
タンパク質を組み換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、形質転換される宿主細胞としては、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、動物細胞等を用いることができるが、一般に大腸菌などの腸内細菌、好ましくは大腸菌（エシェリヒア コリ、Escherichia coli）が用いられる。大腸菌などの腸内細菌を用いてタンパクを大量生産する技術について数多くの知見があるためである。以下、形質転換された大腸菌を用いてペプチド生成酵素を製造する方法の一形態を説明する。
【００５５】
ペプチド生成酵素をコードするＤＮＡを発現させるプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ラムダファージのＰＲプロモータ、ＰＬプロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。
【００５６】
ペプチド生成酵素を融合タンパク質封入体として生産させるためには、ペプチド生成酵素遺伝子の上流あるいは下流に、他のタンパク質、好ましくは親水性であるペプチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質遺伝子とする。このような他のタンパク質をコードする遺伝子としては、融合タンパク質の蓄積量を増加させ、変性・再生工程後に融合タンパク質の溶解性を高めるものであればよく、例えば、Ｔ７ｇｅｎｅ １０、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、インターフェロンγ遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。
【００５７】
これらの遺伝子とペプチド生成酵素をコードする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか、あるいは適当な配列の合成ＤＮＡを利用すればよい。
【００５８】
また、生産量を増大させるためには、融合タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネーターを連結することが好ましい場合がある。このターミネータとしては、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータ等が挙げられる。
【００５９】
ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。より具体的には、ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８等を用いることができる。他にもファージＤＮＡ、トランスポゾンＤＮＡのベクターも利用できる。
【００６０】
また、形質転換体を選別するために、該ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている（ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）ほか）。
【００６１】
プロモータ、ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子、ターミネータの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを連結して組み換えＤＮＡを得る。
【００６２】
該組み換えＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質が発現生産される。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用することができるが、例えばエシェリヒア コリ ＪＭ１０９株が好ましい。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法はMolecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)等に記載されている。
【００６３】
融合タンパク質として発現させた場合、血液凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、ペプチド生成酵素内に存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用いてペプチド生成酵素を切り出せるようにしてもよい。
【００６４】
生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。
【００６５】
ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質を回収するには、以下の方法などがある。ペプチド生成酵素あるいはその融合タンパク質が菌体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法によりペプチド生成酵素あるいはその融合タンパク質を精製して用いることも可能である。この場合、ペプチド生成酵素あるいは融合タンパク質の抗体を利用した精製法も利用できる。
【００６６】
タンパク質封入体が形成される場合には、変性剤でこれを可溶化する。菌体タンパク質とともに可溶化してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入体を取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入体を菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよい。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封入体を回収する。タンパク質封入体を可溶化させる変性剤としては、グアニジン塩酸（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜８）や尿素（例えば８Ｍ）などが挙げられる。
【００６７】
これらの変性剤を透析等により除くと、活性を有するタンパク質として再生される。透析に用いる透析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液などを用いればよく、濃度としては２０ｍＭ〜０．５Ｍ、ｐＨとしては５〜８が挙げられる。
【００６８】
再生工程時のタンパク質濃度は、５００μｇ／ｍｌ程度以下に抑えるのが好ましい。再生したペプチド生成酵素が自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は５℃以下であることが好ましい。また、変性剤除去の方法として、この透析法のほか、希釈法、限外濾過法などがあり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。
【００６９】
なお、遺伝子工学的な手法については、例えばMolecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)などの文献に記載された手法に準拠して実施することができる。
【００７０】
【実施例】
以下、実施例をあげて、さらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例におけるＬ−アラニン、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの定量は高速液体クロマトグラフィーを用いる方法（カラム：ＧＬサイエンス社製 ＩｎｅｒｔｓｉＬ ＯＤＳ−２、溶離液：リン酸水溶液（ｐＨ２．２、５．０ｍＭ １−オクタンスルホン酸ナトリウム溶液／メタノール＝１００／１５、流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出２１０ｎｍ）により行った。
【００７１】
（実施例１） Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成する微生物
細菌、放線菌の培養には、１Ｌ中にグルコース ５ｇ、硫酸アンモニウム ５ｇ、リン酸一カリウム １ｇ、リン酸二カリウム ３ｇ、硫酸マグネシウム ０．５ｇ、酵母エキス １０ｇ、ペプトン １０ｇを含む培地（ｐＨ７．０）５０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注し、１１５℃で１５分殺菌したものを用いた。これに１Ｌ中にグルコース ５ｇ、酵母エキス １０ｇ、ペプトン １０ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを含む斜面寒天培地（寒天 ２０g/L、ｐＨ７．０）にて３０℃、２４時間培養した表１（ａ）および表１（ｂ）に示す微生物を１白金耳接種し、３０℃、１２０往復／分、で１７時間振とう培養を行った。培養後菌体を遠心分離し、湿菌体として１００ｇ/Ｌになるように１０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）にて懸濁した。酵母の培養には、１Ｌ中にグルコース ５ｇ、硫酸アンモニウム ５ｇ、リン酸一カリウム １ｇ、リン酸二カリウム ３ｇ、硫酸マグネシウム ０．５ｇ、酵母エキス ５ｇ、マルツエキス ５ｇ、ペプトン １０ｇを含む培地（ｐＨ６．０）５０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注し、１１５℃で１５分殺菌したものを用いた。これに１Ｌ中にグルコース ５ｇ、酵母エキス ５ｇ、マルツエキス ５ｇ、ペプトン １０ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを含む斜面寒天培地（寒天 ２０g/L、ｐＨ６．０）にて３０℃、２４時間培養した下表に示す酵母を１白金耳接種し、２５℃、１２０往復／分、で１７時間振とう培養を行った。培養終了後、これらの培養液から菌体を遠心分離し、湿菌体として１００ｇ/Ｌになるように１０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）にて懸濁した。酢酸菌の培養には、１Ｌ中にグルコース５ｇ、硫酸アンモニウム ５ｇ、リン酸一カリウム １ｇ、リン酸二カリウム ３ｇ、硫酸マグネシウム ０．５ｇ（別殺菌）、酵母エキス ５ｇ、ペプトン ５ｇを含む培地（ｐＨ７．０）５０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注し、１２０℃で２０分殺菌したものを用いた。これに１Ｌ中にグルコース ５ｇ、酵母エキス １０ｇ、ペプトン１０ｇを含む斜面寒天培地（寒天 ２０g/L、ｐＨ７．０）にて３０℃、２４時間培養した表１（ｃ）に示す微生物を１白金耳接種し、３０℃、１２０往復／分、で２４時間振とう培養を行った。この培養液１ｍｌを上記培地（５０ｍｌ/５００ｍＬ坂口フラスコ）に添加し、３０℃、２４時間培養した。培養後菌体を遠心分離し、湿菌体として１００ｇ/Ｌになるように１０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）にて懸濁した。これらの微生物の菌体懸濁液０．１ｍＬに、ＥＤＴＡ１０ｍＭ、Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩２００ｍＭ、及びＬ−グルタミン４００ｍＭを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）０．１ｍＬをそれぞれ添加し、全量を０．２ｍＬとした後、２５℃にて２時間反応をおこなった。このときのＬ―アラニル−Ｌ−グルタミン（Ala-Gln）の生成量（ｍＭ）を表１（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に示す。
【００７２】
【表１】
【表２】
【表３】
【発明の効果】
本発明のジペプチドの製造方法により、複雑な合成方法を経ることなく、安価に入手可能なアミノ酸エステルとアミノ酸を用いてジペプチドを製造することができ、医薬品素材、機能性食品等として有用なジペプチドの製造コストダウンが可能となる。また、本発明のジペプチドの製造方法によれば、様々な種類のアミノ酸エステルおよびアミノ酸を原料として、種々のタイプのジペプチドを生成することができる。
Claims (5)
- アクロモバクター デルマーベ（ Achromobacter delmarvae ）、
アシネトバクター ジョンソニイ（ Acinetobacter johnsonii ）、
エアロモナス サルモニシダ（ Aeromonas salmonicida ）、
アグロバクテリウム ツメファシエンス（ Agrobacterium tumefaciens ）、
アルカリゲネス フェカリス（ Alcaligenes faecalis ）、
アースロバクター シトレウス（ Arthrobacter citreus ）、
ベイジェリンキア インディカ（ Beijerinckia indica ）、
ブレビバクテリウム ローゼウム（ Brevibacterium roseum ）、
クラビバクター ミシガネンス（ Clavibacter michiganense ）、
クリセオバクテリウム メニンゴセプティカム（ Chryseobacterium meningosepticum ）、
エシェリヒア コリ（ Escherichia coli ）、
エンテロバクター エアロゲネス（ Enterobacter aerogenes ）、
エルビニア アミロボーラ（ Erwinia amylovora ）、
フラボバクテリウム レジノボーラム（ Flavobacterium resinovorum ）、
クルイヘラ シトロフィラ（ Kluyvera citrophila ）、
ミクロバクテリウム インペリアエ（ Microbacterium imperiale ）、
ミクロコッカス ルテウス（ Micrococcus luteus ）、
ミコプラナ ブラータ（ Mycoplana bullata ）、
パントエア アナナティス（ Pantoea ananatis ）、
プロピオニバクテリウム シェルマーニ（ Propionibacterium shermanii ）、
リストネラ アングイラーラム（ Listonella anguillarum ）、
リゾビウム ラジオバクター（ Rhizobium radiobacter ）、
ロドコッカス ロドクラウス（ Rhodococcus rhodochrous ）、
サルモネラ チフィムリウム（ Salmonella typhimurium ）、
ザルチナ ルテア（ Sarcina lutea ）、
セラチア グリメシイ（ Serratia grimesii ）、
スタフィロコッカス アウレウス（ Staphylococcus aureus ）、
ステノトロホモナス マルトフィリア（ Stenotrophomonas maltophilia ）、
ストレプトマイセス ラベンデュラエ（ Streptomyces lavendulae ）、
ビブリオ チロゲネス（ Vibrio tyrogenes ）、
キサントモナス マルトフィリア（ Xanthomonas maltophilia ）、
ブレラ アルバ（ Bullera alba ）、
キャンディダ クルゼイ（ Candida krusei ）、
クリプトコッカス テレウス（ Cryptococcus terreus ）、
フィロバシディウム カプスリゲナム（ Filobacidium capsuligenum ）、
ジオトリクム アミセリウム（ Geotrichum amycelium ）、
パキソレン タンノフィラス（ Pachysolen tannophilus ）、
ロドスポリジウム ディオボバータム（ Rhodosporidium diobovatum ）、
ロドトルラ ミヌタ（ Rhodotorula minuta) 、
スポロボロミセス サルモニカラー（ Sporoboromyces salmonicolor ）、
トレメラ フォリアセ（ Tremella foliacea ）、
トルラスポーラ デルブルッキ（ Torulaspora delbrueckii ）、
トルロプシス インゲニオーサ（ Torulopsis ingeniosa ）、
グルコンアセトバクター リクエファシエンス（ Gluconacetobacter liquefaciens ）、
アセトバクター オルレアネンシス（ Acetobacter orleanensis ）、
アセトバクター パスツーリアヌス（ Acetobacter pasteurianus ）、
グルコノバクター オキシダンス（ Gluconobacter oxydans ）、
グルコノバクター オキシダンス（ Gluconobacter oxydans ）、
グルコンアセトバクター ハンゼニイ（ Gluconacetobacter hansenii ）、
アサイア エタノリファシエンス（ Asaia ethanolifaciens ）、
ズッカリバクター フロリコーラ（ Zucharibacter floricola ）、
アクチノマデュラ マデュラエ（ Actinomadura madurae ）、
キタサトスポリア グリセオラ（ Katasatosporia griseola ）、
ミクロモノスポーラ チェルシナ（ Micromonospora chersina ）、
ノカルディア グロベルラ（ Nocardia globerula ）、
エルスコフィア ツルバータ（ Oerskovia turbata ）、
サッカロスリクス オーストラリエンシス (Saccharothrix australiensis) 、または、
ストレプトバーティシリウム モバラエンシス（ Streptoverticillium mobaraensis ）
のいずれかの種に属し、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物、該微生物の培養物、または該微生物の菌体処理物を含む水溶液中で、アミノ酸エステルと、アミノ基およびカルボキシル基が無保護のアミノ酸とを酵素反応させて、前記アミノ酸エステルのエステル部位と前記アミノ酸のアミノ基とがペプチド結合して形成されるジペプチドを製造することを特徴とするジペプチドの製造方法。 - 前記アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物、該微生物の培養物、または該微生物の菌体処理物を含む水溶液中で、前記アミノ酸エステルと前記アミノ酸からジペプチドを製造する際に、前記水溶液に金属酵素阻害剤を添加することを特徴とする、請求の範囲第１項に記載のジペプチドの製造方法。
- 前記アミノ酸エステルが、Ｌ−アラニンエステルであることを特徴とする、請求範囲第１項または第２項に記載のジペプチドの製造方法。
- 前記アミノ酸が、Ｌ−グルタミンであることを特徴とする、請求範囲第１項から第３項のいずれかに記載のジペプチドの製造方法。
- サッカロミセス ユニスポーラス（ Saccharomyces unisporus ）に属し、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物、該微生物の培養物、または該微生物の菌体処理物を含む水溶液中で、Ｌ−アラニンエステルと、アミノ基およびカルボキシル基が無保護のＬ−グルタミンとを反応させて、前記Ｌ−アラニンエステルのエステル部位と前記Ｌ−グルタミンのアミノ基とがペプチド結合して形成されるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを製造することを特徴とするジペプチドの製造方法。
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