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JP3310291B2 - 骨組織のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成のための生物活性物質テンプレート - Google Patents

骨組織のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成のための生物活性物質テンプレート

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JP3310291B2
JP3310291B2 JP50640094A JP50640094A JP3310291B2 JP 3310291 B2 JP3310291 B2 JP 3310291B2 JP 50640094 A JP50640094 A JP 50640094A JP 50640094 A JP50640094 A JP 50640094A JP 3310291 B2 JP3310291 B2 JP 3310291B2
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ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニア
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、骨及び骨様組織の最適なin vitro形成のた
めの生物活性セラミックテンプレートの合成に関する。
物質表面が骨細胞からin vitro応答を引き出す基本的メ
カニズムが最適化され、それによって骨組織の典型的特
徴を有する細胞外物質の高い生成速度がもたらされる。
発明の背景 物質は、まず、骨の治癒の間の構造的支持体を供給す
るために、又は損傷した又は病んだ骨組織を交換するた
めに用いられる。歴史的に、最も重要な物質選択の規準
は、反応性がないことであった。移植物質は、体内での
反応をほんの僅か起こすに過ぎないものであるべきであ
ると考えられた。とはいえ、どんなに化学的に不活性で
あっても、移植に際して常にある反応が起こることを認
識するのは大切なことである。反応の強さは、移植物質
の表面及び内部特性だけでなく、手術の際の外傷、移植
部位、及び組織−移植片境界面の相対的な動きにも依存
する。この知見は、いわゆる不活性物質の代わりに“生
物活性”物質を用いることを推し進めてきた。生物活性
物質は、有益な組織応答を誘発しなければならはい、具
体的には、その表面で正常組織の形成を引き起こして長
い機能的寿命を促進する境界面を作り出さなければなら
ない。石灰化組織再構築の分野でこの目標は達成された
が、この前進は最終段階のものではなく、より切望され
る目標、つまりin vitro骨組織形成のためのテンプレー
トとして役立ち得る物質の創作のための踏み石に過ぎな
い。これは、生体物質の真の将来、つまり一旦体内に挿
入すると組織と置き換わるというよりもむしろ組織を再
生する物質を創作することの一部分である。
骨始原細胞又は骨芽細胞表現型の細胞での細胞培養研
究が行われてきたが、納得のゆく結果は得られていな
い。これら先行する研究の幾つかは、細胞外物質合成の
最適化自体を求めるものではなかった。幾つかの先行す
る研究は、骨髄抽出物中に存在する骨始原細胞を用い
た。焦点が骨芽細胞表現型発現の確認に置かれているか
他に置かれているかに拘らず、これら結果を用いて、得
られる骨芽細胞表現型活性の現象を１つが外延的なもの
であったか否かを確認することができる。
15％ウシ胎児血清、調製直後のアスコルビン酸、β−
グリセロリン酸ナトリウム、デキサメタソン（DEX）及
び抗生物質を補充したαMEM（最小必須培地）で若い成
体雄ウィスターラットの大腿骨を洗浄することにより、
それから骨髄細胞が得られることは公知である。ダビー
ス（Davies）ら“Early extracellular matrix synthes
is by bone cells,“Bone−Biomterials Workshop",J.
E.Davies Ed.,University of Toronto Press,（Decembe
r 1990）を参照のこと。
２本の大腿骨からの細胞を含有するこの細胞懸濁液の
ある量、例えば、30mlをこの材料支持体上に分配する。
加湿95％空気−５％CO2雰囲気内で、この培養物を最低
２週間維持する。硫黄をも含有する球状付着物の石灰化
基質が形成されることが分かった。この層は、骨組織内
の反転線（reversal line）についての典型、つまりセ
メント質層であったので、その著者達により、その石灰
化層はその培養細胞による骨芽細胞表現型の発現の結果
であることの証拠と考えられた。続いて、いわゆる“フ
ランク（frank）骨形成”があった。従って、基質生成
は、骨誘導細胞をin vitroで分化させることによって中
間期間（17日間）内に始まることができる。しかしなが
ら、多孔質セラミック上では石灰化組織が形成しないと
いうことも報告された。ウチダら，“Growth of bone m
arrow cells on porous ceramics in vitro,"J.Biomed.
Mat.Res.21:1−10（1987）を参照のこと。セメント様線
を堆積する細胞の内在能力に関する先行技術におけるこ
の知見は、ともあれ確かに正しい。この特定の細胞活性
が如何なる組織刺激性生体物質もなく培養物中に存在す
ることを示した上記の細胞培養法は、マニアトプロス
（Maniatopulos）らの“Bone formation in vitro by s
tromal cells obtained from bone marrow of young ad
ult rats,"Cell Tissue Res.254:317−330（1988）から
派生したものである。
多孔質リン酸カルシウムセラミックスの骨膜線維芽細
胞、骨芽細胞、及び軟骨細胞の生育及びホルモン応答へ
の効果が、他の研究者によって開示されている。例え
ば、チェン（Cheng）ら，“Growth of osteoblasts on
porous calcium phosphate ceramic:an in vitro model
for biocompatibility study,"Biomaterials,10,63−6
7（1989）を参照のこと。この文献に報告されているよ
うに、これら細胞の数は、10週間の間に29、23及び17倍
に増加した。骨芽細胞は、タイプＩコラーゲンだけを産
生することによってそれらの表現型発現を保持した。か
つて、チェンは、イヌ軟骨細胞の表現型発現は、多孔質
ヒドロキシアパタイトセラミック顆粒上で培養すると、
13ヶ月まで保持されることを示した。チェン，“In vit
ro cartilage formation on porous hydroxyapatite ce
ramic granules,"In Vitro Cellular ＆ Developmental
Biology,21:6,353−357（1985）を参照のこと。報告に
よれば、細胞外基質の同化は１週間で現れ始めて13週間
にわたって増加し続けた。
また、他の研究者は、種々のリン酸カルシウムセラミ
ックと接触するV79細胞の付着とその後の生育を研究し
て、細胞生育はヒドロキシアパタイトにより顕著に阻害
され、リン酸三カルシウム及びガラスセラミックにより
僅かに阻害されることを見出した。カツフミら，“The
influence of calcium phosphate ceramics and glass
ceramic on cultured cells and their surrounding me
dia,"J.Biomed.Mat.Res.,24:1049−1066（1989）を参照
のこと。小さな生物活性セラミック粉末の食菌作用の条
件下で、骨芽細胞個体群のRNA転写及びタンパク質合成
が刺激された。グレゴイヤ（Gregoire）ら“The influe
nce of calcium phosphate biomaterials on human bon
e cell activities:An in vitro approach."J.Biomed.M
at.Res.24:165−177（1990）を参照のこと。この現象
は、食菌作用性線維芽細胞についても認められた。DNA
内への3H−チミジン取り込み量の増加及びアルカリ性ホ
スファターゼ活性の低下は、おそらく第二カルシウムメ
ッセンジャー経路から生じたのであろうことが示唆され
た。オルリイ（Orly）ら“Effect of synthetic calciu
m phosphate on the 3H−tyhmidine incorporation and
alkaline phosphate activity of human fibroblasts
in culture,"J.Biomed.Mat.Res.23:1433−1440（1989）
を参照のこと。プレオ（Puleo）らによる他の研究“Ost
eoblast responses to orthopaedic implant materials
in vitro,"J.Biomed.Mat.Res.25:711−723（1991）
は、骨芽細胞付着、骨芽細胞増殖及びコラーゲン合成に
関して説得力のない結果を提供している。物質依存的組
織応答パターンに関連する情報を提供している。in vit
roで行われたもう１組の研究は注目に値するものであ
る。多孔質ヒドロキシアパタイト及び骨髄細胞での一連
の実験が、オグシ（Ohgushi）、ゴールドバーグ（Goldb
erg）及びカプラン（Caplan）により開始され、その
後、日本の奈良ではオグシとその仲間により、米国オハ
イオ州のクリーブランドではカプランとその仲間により
別々に続けられた。オグシら，“Heterotopic osteogen
esis in porous ceramics induced by marrow cells,"
J.Ortho.Res.,7:568−578（1989）を参照のこと。これ
ら実験は、異所に移植した骨髄細胞懸濁液の細胞の骨始
原細胞性は、その懸濁液を多孔質ヒドロキシアパタイト
中に注入したときの方が単独で移植したときよりも、よ
り容易に活性化されることを証明している。
最後に、カプランらの米国特許第4,609,501号は、軟
骨生成応答を刺激できる可溶性骨タンパク質に同系線維
芽細胞をin vitroで曝すことを含む骨生育の刺激を開示
している。これら暴された細胞をフィブリンの如き生分
解性キャリヤーと混合するのであるが、これら暴された
細胞を人工器官とインキュベートしてもよいことも示唆
されている。関連するカプランらの特許、つまり米国特
許第4,609,551号は、骨タンパク質を解剖部位に送達す
る技術を開示しており、やはりカプランらへの米国特許
第4,608,199号は、適する骨タンパク質を得る方法を開
示している。
本発明は、支持物質に焦点を合わせており、その支持
体として用いられる物質を修飾するとin vitroでの組織
形成の量と速度において大きな差異が生じることを示す
ものである。従って、本発明の目的は、生命過程、具体
的には骨組織形成がその上で盛んになる理想的なテンプ
レートとして役立つセラミック物質を合成することであ
る。
発明の要旨 これら及びその他の目的は、有意に結晶化させること
なしに多孔質ガラスを合成し、そして細胞付着が増進さ
れ広範な細胞外基質（ECM）形成が起こることができる
ようにそのガラス表面をコンディショニングすることに
より満たされる。一旦この多孔質ガラス上に接種する
と、細胞を死滅させない境界内の溶液中のpH変動値をも
たらすための生物活性反応のコントロール法も開示す
る。
一般に、本発明は、組織培養培地中に入れたときに骨
細胞付着及び活性を高めるよう表面処理されている結
果、細胞を接種したときに骨組織がin vitroで生成す
る、生物活性物質を開示する。好ましくは、この生物活
性物質は、pHを最も好ましくは7.6未満にコントロール
するように処理されたガラスを含む。好ましい態様にお
いては、この生物活性物質は、本質的にSiO2;CaO;Na2O;
及びP2O5からなる非晶質ガラスであって次の好ましい組
成を有する:45重量％SiO2;24.5重量％CaO;24.5重量％Na
2O;及び６重量％P2O5。また、他の好ましい態様におい
ては、本発明の生物活性物質はセラミックを含む。しか
しながら、ガラス型又はセラミック型のいずれでも、こ
の物質は好ましくは多孔質であり、その多孔度は約20〜
30％であって気孔サイズの範囲は約75〜200μｍであ
る。
従って、本発明は、本質的にSiO2、Na2O、CaO及びP2O
5からなる混合物を溶融し、次いで溶融した混合物を冷
却してガラスフリットを作る工程を含む多孔質ガラス支
持体を作る方法を開示する。好ましくは約40〜70μｍの
粒子サイズを有するガラス粉末をこのガラスフリットか
ら作る。次いで、この粉末から発泡プロセスによって多
孔質ガラス支持体を作る。本発明の重要な側面は、生成
する多孔質ガラスが、実質的に非晶質性を示すことであ
る。結晶質性は場合によっては許容できるが、その主要
な欠点は表面の不均一な腐蝕速度、引いては反応層の空
間的変動である。更に、その腐蝕反応がかなり遅く、そ
れによって長いコンディショニング及びインキュベーシ
ョン時間が必要である。別に、この多孔質ガラス支持体
は、ガラス粉末とポリビニルアルコールの如きバインダ
ーとのスラリーを作ってそのスラリーを型に流し込み、
そのスラリーを乾燥及び焼結することによって作ること
ができる。最後に、この多孔質ガラス支持体は、最初
に、ガラスが形成されるように冷却することによって形
成することができる。このガラスを１を超える結晶相を
有するガラスセラミックに転換してから優先的に溶解さ
せると多孔質物質になる。この優先的溶解は、例えば、
酸又は塩基の如き溶媒を添加することによって行うこと
ができる。
従って、本発明は、多孔質の、好ましくは非晶質の生
物活性ガラスを作ることを開示する。とはいえ、あらゆ
る既知の生物活性ガラス又はセラミックも適当に転換し
て骨組織のin vitro合成用テンプレートにすることがで
きることが見越される。接種時間は多分かなり相違する
であろう。ここに開示したガラス物質は、ディスク状、
スリーブ状、棒状又は他のあらゆる形状の支持体又はテ
ンプレートに成形することができる。また、ここで作ら
れたガラスは、粒子の形状で供給することもできる。
本発明のガラスを用いて生物活性及び骨形成性を高め
るには、このガラスを処理して、その表面に細胞が付着
できるようにしかつ細胞を接種する前のpHをコントロー
ルしなければならない。従って、本発明は、上記のガラ
ス物質からなる多孔質生物活性テンプレートを供給し、
このテンプレートを緩衝溶液中に浸し、そしてそのテン
プレートを組織培養培地中に浸して、この表面上に細胞
を接種したときに骨細胞活性を有意に高める表面にする
工程を含む骨組織を形成する方法も開示する。最終的
に、このテンプレートに細胞を接種してその上に骨組織
を形成させる。最も好ましくは、緩衝溶液は約6.8のpH
で緩衝され、組織培養培地は約7.6を超えないpHを有す
る。テンプレート上に接種される細胞は、骨始原細胞を
供給するあらゆる試料、骨髄細胞試料、骨芽細胞表現型
潜在性又は骨芽細胞表現型の細胞から選ぶことができ
る。接種は、線維芽細胞及び軟骨細胞で始めることもで
きる。
図面の簡単な説明 図１は、本発明に従って作られた支持体の断面図の顕
微鏡写真であって、骨様シート状物の形成を示す。
図２は、本発明に従って作られた生物活性ガラスの表
面の顕微鏡写真であって、コラーゲンフィブリルによっ
て繋がれた球状の付着成長物を示す。
発明の詳細な説明 in vivo骨生育の分野では、ガラスはリン酸カルシウ
ムセラミックがもたらす以上の有益な効果をもたらすこ
とが知られている。例えば、シェパーズ（Schepers）ら
“Bioactive glass particulate material as a filler
for bone lesions,"J.Oral Rehabilitation,8,435−45
2（1991）を参照のこと。しかしながら、in vivoでのこ
の効果はin vitroでは再現されていない。本発明は、新
規な物理的形態のガラスに加えてin vitroで効果的であ
る新規な表面処理を開示するものである。
支持体の多孔度は必須ではないが、細胞との潜在的な
接触比表面積が大きくなることからみて有利である。こ
の支持体を介して組織を生育させると、再移植に必要と
される組織の速やかな形成がもたらされ、そしてこの人
工物質はより速やかに分解する。従って、本発明の１側
面は、生物活性なガラス多孔質体を作る方法を提供す
る。先行技術で提案された方法は結晶化ガラスを作るも
のであることが認識されるであろう、そしてその結晶化
は生物活性反応を妨害するので避けられなければならな
い。言い換えれば、リン酸カルシウム表面、おそらく骨
のミネタル相に非常に類似している炭酸化カルシウム欠
如ヒドロキシアパタイトをもたらす溶解及びイオン交換
反応が、ガラス中に存在する結晶で相当に遅くなるので
ある。その制限下では、この必要な富カルシウム−リン
酸層が非常にゆっくり形成されるので、細胞付着反応に
とって最小限か又は全く取るに足らないものになり得
る。細胞付着が行われないと、細胞機能は妨害されない
までも制限されると仮定できる。従って、分泌機能、速
ち、細胞外基質形成又は骨組織様合成に具体的に焦点を
合わせた場合、それは、極めて大きく低下し、引いては
真の利用は行われない。本発明は細胞生物学に依拠しな
いとうことにまず留意すべきである。骨芽細胞表現型の
細胞に格上げ調節される潜在性を有する多くの細胞を用
いることができる。
A.ガラス調製 計画通りの組成である45％（重量％）SiO2、24.5％Na
2O、24.5％CaO及び６％P2O5を有する生物活性ガラス
が、最も好ましい態様に該当し、化学的に純粋な試薬グ
レードのNa2CO3、CaCO3、Ca10（OH）２（PO4）６及びSi
O2から調製される。しかしながら、本発明の物質を作る
にはこれら構成成分の次の範囲が有用である:40〜60％S
iO2;5〜30％Na2O;10〜35％CaO及び０〜12％P2O5。一定
比率の量にした試薬を混合してルツボ中で約1350℃で溶
融する。溶融物含有ルツボを必要な回数、最も好ましく
は少なくとも３回渦巻かせることによってこの溶融物を
確実に均質にする。次いで、この溶融物を脱イオン水中
に注ぎ入れる。次いで、この方法によって得られたガラ
スフリットを乾燥して多孔質ガラスの合成に用いる。多
孔質ガラスを合成するには、このガラスフリットを粉砕
して約40〜70μｍの範囲の粒子サイズを有する粉末に磨
砕する。この粉末を発泡剤として用いられる２〜３％の
CaCO3と混合する。この混合物を約50MPa及び460℃で約
２時間真空下で熱圧プレスする。得られる気孔サイズ範
囲は、約70〜200μｍである。もっと大きな気孔サイズ
範囲、例えば、約200〜500μｍは、もっと大きな粒子サ
イズのCaCO3粉末を用いるか、又は発泡剤としてNaHCO3
を用いることにより得られる。平均の多孔度及び気孔サ
イズは、それぞれ重量測定及び体積測定によって測定さ
れる。本発明に従って調製された多孔質生体ガラスのＸ
線回折は、発泡プロセス後の結晶化の兆候のない完全な
ガラス化を示す。
本発明に従うガラスの合成を最適化するために、幾つ
かの発泡剤（Na2CO3、NaHCO3、NH4H2PO4及び大理石）を
異なる濃度（１％、２％、３％、６％及び10％）で用
い、そして幾つかの焼結及び発泡処理（450、580、475
及び550℃）を異なる時間（１、２、３及び５時間）で
用いた。２段階熱処理（450℃で１時間；次いで475℃、
550℃又は580℃のいずれかで１時間）も用いた。異なる
粒子サイズ、例えば、約110μｍ及び約70〜40μｍのガ
ラス粉末を用い、かける圧力も変動値として採用して約
100、70及び40MPaを試した。測定可能な程度にガラス結
晶化反応を開始しなった発泡剤及び処理条件が好まし
い。如何なる結晶化も、ガラスをより腐蝕抵抗性にする
か又は不均一な腐蝕をもたらす。これは、この有益な表
面反応層の形成に逆に影響するので避けられなければな
らない。
最良の結果は、グラファイト製ダイで約50MPaの圧力
でプレスした約2.3％CaCO3での約40〜70μｍの粒子サイ
ズのガラス粉末を混合することによって得られた。次い
で、このプレスした混合物を約460℃に約２時間真空で
加熱する。高圧、例えば、約100MPa及び約580℃での熱
処理を用いると、非多孔質ガラスセラミック物質ができ
るので、これら変動値についてはこれら値は好ましくな
い。更に、低圧、例えば、約40MPaを用いると、取り扱
いができない崩れやすい物質が生成することが分かっ
た。長時間の熱処理は、特に発泡剤の存在下ではガラス
の結晶化を開始するであろうから、最も短い熱処理時間
が最も好ましい態様である。
本発明で多孔質ガラス、ガラスセラミック、又はセラ
ミックを作るのに有用な別の方法は次の通りである。
（１）発泡と焼結 バインダー（例えば、ポリビニルアルコール）で水性
セラミックスラリーを作り、次いでそのスラリーを発泡
剤（例えば、H2O2又はCaCO3）と混合してその混合物を
型に流し込み、それを乾燥させ、次いでそれを高温で焼
結することにより、有用な物質を作ることができる。こ
の方法は、ガラス表面の性質を変化させて生物活性を制
限してしまうので、あまり好ましくない。
（２）セラミック化と浸出 ガラスを１を超える結晶相に結晶化させ、次いで得ら
れたガラスセラミックを、好ましくは１相を溶解して他
の相を残す酸又は塩基で処理することにより、多孔質物
質を作る。しかしながら、このセラミック化と浸出法
は、富リン酸カルシウム相の浸出がこのガラスの生物活
性を低下させることになるので、あまり好ましくない態
様に該当する。
（３）ゾルゲル法 当該技術分野で周知のように、セラミック又はガラス
ゲルの熱処理サイクルをコントロールすると、その物質
の気孔と気孔−気孔間がコントロールされて多孔質セラ
ミックを得ることができる。しかしながら、この方法に
より調製される生物活性ガラスの気孔サイズと多孔度パ
ーセントのコントロールは、上記の発泡と焼結法より
も、所期の範囲にあるものを得るのが非常に難しい。
B.ガラス表面のコンディショニング及びpH変動値のコン
トロール 本発明のもう１つの重要な側面は、ガラス表面のコン
ディショニングと同時に溶液のpHコントロールをするこ
とである。かかるコンディショニングは、次の２つの理
由から必須である：（１）細胞をコンディショニングし
ていないガラスに添加すると、起こるガラス腐蝕反応
が、そのガラス表面及び溶液の主容積部分のpH値を、細
胞を死滅させる値にしてしまう；及び（２）有利な細胞
付着及び細胞外基質堆積ができるように用意された表面
を作らなければならない。ガラスの最良のコンディショ
ニング法を説明する前に、まず行った幾つかの実験を時
系列で説明する。
上記の技術に従って作ったガラスディスクを、間質液
中に見られるのと類似の濃度でイオンを含有するトリス
緩衝溶液中に浸漬し、ロータリーテーブル上で37℃（pH
6.84）で48時間震盪した。この溶液の容量は１リッター
であった。ガラス浸漬時間の間、pH値の変化は認められ
なかった。電子分散式Ｘ線回折（EDXA）により、富リン
酸カルシウム層がこの生物活性ガラス上に形成されてい
ることが明らかになった。
他の実験では、このガラスディスクを修飾トリス緩衝
溶液中で20時間処理するか又はトリス緩衝溶液中で20時
間処理した後に典型的組織培養培地（TCM）、即ち、Ｅ
−MEM（イーグル最小必須培地＋10％NBS＋2mM Ｌ−グ
ルタミン）中で48時間処理（処理TB2−Ｅ−MEM）し、次
いで細胞を接種した。４つ又は５つのディスクを浸漬し
た。この溶液は37℃に維持した。際立った相違が、ガラ
スディスクに付着した細胞の数及び細胞外基質物質の分
泌に認められた。これら異なる処理を施した２つのガラ
スに付着した細胞の数を比較したところ、トリス緩衝液
単独で処理したガラスディスクにより多くの細胞が接着
していた。両方の組のサンプルには、コラーゲンフィブ
リルと石灰化小節が見られたが、如何なる骨様組織形成
も見られなかった。TB2−Ｅ−MEMに従って処理したガラ
スディスクに付着した細胞は、細胞間により多くのコラ
ーゲンフィブリルを生成した。細胞付着は好ましい態様
に該当するので、続く実験では、修飾トリス溶液中での
浸漬が好ましいと仮定した。この次の実験の組では、修
飾トリス中で20時間処理した後にこれらディスク上に細
胞を接種すると、細胞を死滅させる可能性のあるpH変化
が起こるか否かという問題を扱った。これら実験におい
て、ディスクを修飾トリス中で20時間処理した後に、細
胞の接種及びインキュベーションに用いるのと同じ組織
培養培地中にディスクを浸漬して、pH変化を測定した。
これをまず、組織培養培地容量のガラス重量に対する１
種類の比率について行った。かくして、ガラスディスク
をトリス緩衝液中で37℃で20時間処理した後、Ｅ−MEM
中で37℃で浸漬した。溶液容量のガラス重量に対する比
率は、約19ml/gであった。このガラスの腐蝕生成物は、
TCM溶液のpHを24時間後に7.6から7.9に、そして48時間
後には7.6から8.0に上昇させることが分かった。このpH
の上昇は、細胞をかかる溶液中に接種した際に逆作用を
もたらし得る、即ち、細胞が死滅するであろう。
次の一続きの実験では、ガラス重量に対して異なる比
率のTCM容量を用いた。すぐ前の実験の結果に基づい
て、トリス中への浸漬時間も20時間から48時間に延ばし
た。これは、細胞が存在する場合でのガラスからTCM内
への続く溶解を最小限にしようとしたものであった。前
のように、修飾トリス緩衝溶液中で48時間、次いでTCM
中で３日間の２段階浸漬を行った。TCMの開始pHは7.6で
あった。TCMのpHを24、48及び72時間後に測定した。次
いで、このTCMをTCM＋3mMβ−グリセロール・ホスフェ
ートと置き換え、pHをやはり24時間毎に３日間測定し
た。TCMのpH値を変化させなかった最小のTCM容量／ガラ
ス重量比は90ml/gであったが、ガラス表面とTCMの主容
積部分の間には依然としてpH勾配があり得る。更に、気
孔内部のTCMのpH値は、ペトリ皿内の溶液の主容積部分
のTCMの１点よりもかなり高いかも知れない。我々は、
主容積部分TCMのpHが、例えば、TCM容量のガラス重量に
対する比率が低いために、約7.85に上昇したときは、予
めコンディショニングしたガラスディスク上に接種され
た細胞の活性が大きく阻害されることを見出した。これ
ら培養物の走査電子顕微鏡（SEM）分析により、細胞プ
ロセスが非常に制限されていること、及びサンプルをフ
ァーストレッド染色で染色した際に見られる淡桃色から
してアルカリ性ホスファターゼ活性が最小であることが
分かった。
これら結果に基づいて、組織培養培地中に強い生物学
的緩衝液を添加するもう１つの実験を行った。20mM He
pesを添加した。気孔内部のpH値を安定化するためにこ
の緩衝液を添加した。かくして、一組の全条件は次の通
りである：修飾トリス内での48時間の浸漬、20mM hepe
sを補充したＥ−MEM中での浸漬、及びTCM容量のガラス
重量に対する比率、90ml/g。また、この第２浸漬は、接
種の条件に該当する。かくして、ガラスの気孔内及び表
面におけるpHが、細胞をそのガラス上に接種する間、7.
6に安定化される場合は、豊富な細胞プロセスが可能と
なり、培養後たった１週間で骨様組織が広範に形成され
た。
これらガラスディスクを乾燥し、そして最も好ましく
は細胞を接種する前にエチレンオキシドにより滅菌す
る。
富リン酸カルシウム反応層の形成である浸漬処理の効
果は公知である。ヘンチ（Hench）ら“Bonding mechani
sms at the interface of ceramic prosthetic materia
ls,"J.Biomed.Mater.Res.Symp.,2:117−141（1972）を
参照のこと。この反応層は、不十分に結晶化した不完全
なカルシウム・ヒドロキシアパタイト構造に徐々に成熟
する。キム（Kim）ら“Early stages of calcium phosp
hate layer formation in bioglass,"J.Non−Cryst.Sol
ids,113:195−202（1989）を参照のこと。しかしなが
ら、本発明の浸漬処理は、上で参照したヘンチらにより
用いられた方法とは基本的なやり方において異なってい
る。この先行技術の意図するものは、ガラス表面におけ
る幾つかのイオン交換、溶解、濃縮、沈降及び変換反応
の速度論を確立することであった。これらの理由から、
間質骨液の如何なる典型的成分も含有しないトリス緩衝
溶液が用いられた。対照的に、本発明は、骨のミネラル
相に似ているガラス表面であって、生物学的分子を含有
する溶液に接触させるとすぐに生体分子を吸収するガラ
ス表面を達成する。これは、次の２つの方法のいずれか
によって達成することができる:i）修飾トリス緩衝液へ
の浸漬の後であって接種の前に、骨組織中に正常に存在
する生物学的分子を含有するTCM又は他のあらゆる適当
な溶液にそのディスクを浸漬するか；又はii）生物学的
分子を含有する細胞懸濁液中にディスクを浸漬する。細
胞接着の前に、これら生物学的分子は、連続的に生長す
るガラス表面反応層に取り込まれてゆく。その結果、こ
の生長するリン酸カルシウム層が有機分子で被覆されそ
れとよく混合されることになる。
C. in vitroで合成された骨組織の特徴付け 上記の修飾トリス緩衝液で前処理した後、10mm径ディ
スクを60mm径ペトリ皿又は他の適当な容器に入れ、TCM
で濡らし、そして1.2×106細胞/mlを含有する懸濁液か
らの約１×106個の新生子ラット頭蓋冠骨芽細胞を接触
する。ここで用いた細胞懸濁液は、0.2％コラゲナーゼ
を用いる酵素消化法によって得た。細胞を付着させるた
めに、それらペトリ皿をTCMで満たす前に約１時間イン
キュベーター内に保持した。２日後、そのTCMを3mMβ−
グリセロール・ホスフェートを補充したTCMと交換し
た。この交換を日に４回繰り返した。これらペトリ皿を
日に７個を費やした。カルシウム、リン及び硫黄につい
ての走査電子顕微鏡（SEM）、エネルギー分散性Ｘ線マ
イクロアナリシス（EDXA）を用いることによる形態学的
分析、溶液中のアルカリ性ホスファターゼ濃度の定性的
及び定量的測定、及びDNA、コラゲナーゼＩ及びオステ
オカルシン合成により、形成された組織の特性が明らか
になる。
図１に見られるように、これら多孔質試験片には、細
胞及びそれらが同化した細胞外基質が完全に侵入してい
ることが分かった。図１は、１週間のインキュベーショ
ン後の多孔質生物活性ガラスの断面の走査電子顕微鏡写
真（×100）を示す。骨様シート状物が、この多孔質ガ
ラスサンプルの全厚みにわたって形成された。図２は、
生物活性ガラス表面の別の走査電子顕微鏡写真（×350
0）を示す。この写真は、本発明のパラメーターがまだ
最適化されていない時に作られた。それは、広範な骨組
織形成の前の幾つかの事象を示しており、ガラス表面に
直接接触している球状の付着成長物が見える。コラーゲ
ンフィブリルがこれら球状小節を繋いでいる。この石灰
化セメント質様層は、まだ骨様シート状物によって覆わ
れていないのでこのようにまだ見えるのである。
アルカリ性ホスファターゼ活性の定性的評価により、
最高の活性が生物活性ガラスディスク上の細胞で存在
し；そのガラスディスクを取り囲むペトリ皿の底部には
弱い活性しか存在しないことが明らかとなっている。
アルカリ性ホスファターゼ活性の定量的測定は、ペト
リ皿当たりの平均を表すものである。ローリイ（Lowr
y）ら“The quantitative histochemistry of the brai
n:II.Enzyme measurements,"J.Biol.Chem.,207:19−37
（1954）に記載された放出ｐ−ニトロフェノール（PN
P）定量法を用いて、0.62nmol PNP/分／μｇタンパク質
の速度が見出された。μgDNAに関しては、骨芽細胞表現
型発現についての典型的な値（2.01μg/ml）が示され
た。これら種々のサンプルの広範な形態学的観察は、次
の仮説的な連続事象を示唆している：第１段階で石灰化
型の、径が１〜２μｍの小さな球のフォーカスがガラス
表面上に現れる、続いて、コラーゲンフィブリルが生成
してこれら石灰化小節に付着する。
コラゲナーゼＩ合成が確認されたことに留意すべきで
ある。その上から、石灰化物質及び絡み合ったフィブリ
ルの両方の合成が連続し、それによって束の形成が徐々
に起こり、最終的に骨様物質のシート状物に合着する。
これらシート状物の表面は滑らかであり石灰化球がない
ことに留意することが重要である。かかる結果は、これ
ら石灰化球がコラーゲンフィブリルを橋架けするのに役
立ち、それによってこの連続的な骨様シート状物ができ
るという理論と一致するので興味深い。ガラス表面上の
これら小節の最初の同化なしには、細胞はコラーゲンフ
ィブリルを生成しないことももう１つの興味深い結果で
ある。オステオカルシン放射性免疫検定法（ヤギ抗ラッ
トオステオカルシン、ロバ抗ヤギ第２抗体及びＩ−125
ラットオステオカルシンを使用）により、かなりの濃度
（約8ng/ml）のオステオカルシンが示された。オステオ
カルシンは、ガラスと骨芽細胞を含有するペトリ皿上で
だけ検出された。骨芽細胞はあるがガラスディスクがな
いコントロールペトリ皿は、検出できる濃度のオステオ
カルシンを示さなかった。
同化物質の石灰化は、カルシウム及びリンが過飽和し
た溶液からの沈殿の物理化学的現象の結果ではなく、こ
れは本質的にガラス溶解の結果であった。ガラスはある
が細胞を接種しないコントロール実験、又は多孔質生物
活性ガラスのない細胞培養実験は、測定できるほどの石
灰化をもたらさなかった。
ここに開示したin vitro合成テンプレートの適用は、
生物活性ガラスの顆粒の利点及び欠点を解析することに
よって説明することができる。シェパーズら“Bioactiv
e glass particulate material as a filler for bone
lesions,"J.Oral Rehabilitation,8,435−452（1991）
を参照のこと。顆粒形のガラスを用いる大きな利点の１
つは、それらが現時点で臨床的用途にすぐに使えるが、
in vitro合成テンプレートはそうでない点である。両者
はガラスを主成分とする製品であるので、顆粒が市場に
受入れられれば、テンプレートの将来の導入に大いなる
助けとなり得る。
ここに開示したテンプレートを多孔質の粒子形態に作
ることができることは留意するだけの価値がある。手術
では異なる多くの型がないことに遭遇するが、このこと
が、これらテンプレートをそれを満たすのに用れるよう
にする。しかしながら、そうすることは、これらテンプ
レートのこの有意義な特質の１つ、即ち、それらが大き
な硬質構造体として利用できるという特質をなおざりに
することになる。これは、骨損傷が重度のものでありか
つ手術後の構造体に必要な高度を与えるために修復及び
再構築が固体ブロックで試みられなければならないよう
な外傷又は病的異常のいずれの状況においても非常に重
要な事柄である。そのような状況では、ペーストを形成
する顆粒や粒子では限界がある。というのは、それらは
送り込んだ部位から絞り出され得るからである。
本発明に従って作られるテンプレート上のin vitro合
成骨組織形成体の第２に主要な利点は、それらを別の理
由で限られた生育能力しか有しない部位に移植できるこ
とである。本発明の方法に従ってテンプレート上に接種
された細胞は移植前に活性化されている。この観察は莫
大な展望を開く。西洋人は絶えず高齢化しており、この
高齢層に骨粗鬆症が広がっている。骨形成よりも骨吸収
の方が大きいことを特徴とする骨粗鬆症は、年齢が55歳
を越える世代の50％以上の人々が患う。それは、脊椎を
徐々に圧縮して典型的なものは背中を丸くする。骨粗鬆
症は、かなりの罹患率であり重要な二次的死亡率でさえ
ある股関節骨折の高パーセンテージの原因でもある。要
するに、ここに開示したin vitro生育骨組織を有する接
種されたガラス表面は、骨折の高い危険性及び骨組織形
成能力の低下又は消失さえも示す身体の全領域に挿入す
ることができる。多孔質で生物活性な本発明のガラスの
網状構造物を、脊椎の椎骨又は股関節骨の頸部における
多孔質骨網状構造に似せて作ることができる。
ここに開示した合成支持体上に接種される細胞は、最
も好ましくはその患者からの細胞である。実験では、骨
芽細胞、即ち、骨組織物質を分泌する細胞を用いた。し
かしながら、当業者に周知なように、骨芽細胞は、骨芽
細胞系列の細胞の最終段階の細胞に過ぎない。骨芽細胞
の前駆体細胞である細胞を用いることも可能であり、そ
れらは典型的には骨髄中に存在する。簡単な抽出、その
後の適当な分離及びコンディショニングにより、接種で
きる細胞が得られる。これら細胞の家族間授受は、治療
を受ける患者の老化がもう限られた細胞活性しか持って
いない時点まで進行した場合、又は細胞生検材料を得る
ことができないような臨床的状況の場合に計画される。
ここに開示した多孔質生物活性ガラステンプレートの
第３の重要な利点は、それらをすぐに骨が必要である部
位に移植できることである。一旦テンプレートに接種す
ると、１週間後にはもう骨組織がin vitroで広範に形成
されることになる。
要するに、これら本テンプレートは、上記のシェパー
ズの文献で議論された非多孔質顆粒と完全に置き換わる
ものではなく、むしろそれらは、これら顆粒がどちらか
と言えば制限されたやり方で以前に用いられた適用症を
広げることになろう。更に、それらは、上で示唆した骨
粗鬆症における治療法の如き全く新規な治療法を生み出
すであろう。
当業者は、これら多孔質テンプレートも一次関節代用
物に用いられるようになることを認識するであろう。多
孔質被覆人工器官は、本発明に従って作られた多孔質テ
ンプレート物質のスリーブにより周囲を取り巻かれるで
あろう。約１〜２週間後に、それは患者に挿入されるで
あろう。その時点で、自生の大腿骨中への非常に速いそ
の装置の組み込みが起こるであろう。
本発明を応用することができる他の新規で有用な分野
は、患者への薬品又は生物学的分子の送達である。この
支持体に薬品又は生物学的分子を加えることによって、
骨代用に加えて他の治療的効果を得ることができる。
本発明の一定の態様及び適用を詳細に記載してきた
が、上記明細書を参照すれば、当業者は、本発明がその
ように限定されないことを認識するであろう。本発明の
精神から逸脱することなく、多くの変更、修飾及び他の
適用症への応用がすぐに明らかになるであろう。この理
由から、本発明の真の範囲を確実にするために、添付の
請求の範囲が参照されるべきである。
フロントページの続き (72)発明者 エル−ガンナム，アーメッド アメリカ合衆国ペンシルバニア州19104, フィラデルフィア，ボルティモア・アベ ニュー 4013 211 (72)発明者 シャピーロ，アーヴィング アメリカ合衆国ペンシルバニア州19146, フィラデルフィア，サウス・トゥエンテ ィシックスス・ストリート 426 (56)参考文献 Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｖｏｌ. ８，ｐ．275−284（1987) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄ ｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓ ｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．24（1990），ｐ. 721−734 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12M 3/00 - 3/06 C12N 5/00 - 5/08 A61L 27/00 C03B 19/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (20)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】組織培養培地にイオンを浸出することがで
    きる表面を有する支持体を含む、骨芽細胞表現型を発現
    することができる細胞のin vitro接種のための生物活性
    物質であって、前記表面が、骨組織において通常に生じ
    る間質液および生物学的分子の典型的なイオンを含む水
    性溶液中への浸漬により、接種前に処理されており、そ
    して前記支持体がSiO2;CaO;Na2O;及びP2O5からなる、生
    物活性物質。
  2. 【請求項２】ガラスを含む、請求項１記載の生物活性物
    質。
  3. 【請求項３】次の組成:40〜50重量％SiO2;20〜30重量％
    CaO;5〜30重量％Na2O;及び０〜12重量％P2O5を有する、
    請求項１記載の生物活性物質。
  4. 【請求項４】該物質が多孔質であり、約10〜80％の多孔
    度と800μｍ未満の気孔サイズを示す、請求項１記載の
    生物活性物質。
  5. 【請求項５】骨形成が生じる支持体、及び骨芽細胞表現
    型を発現することができる細胞を接種することによりin
    vitroで該支持体上に形成された骨組織を含む移植可能
    な骨代用物であって、前記支持体が、SiO2;CaO;Na2O;及
    びP2O5からなり、且つ骨組織において通常に生じる間質
    液および生物学的分子の典型的なイオンを含む水性溶液
    中への浸漬により接種前に処理されている表面を有す
    る、移植可能な骨組織代用物。
  6. 【請求項６】支持体が多孔質の生物活性セラミックを含
    む、請求項５記載の移植可能な骨代用物。
  7. 【請求項７】支持体がシートの形状にある、請求項６記
    載の移植可能な骨代用物。
  8. 【請求項８】支持体が顆粒の形状にある、請求項６記載
    の骨代用物。
  9. 【請求項９】請求項５〜８いずれか１項記載の移植可能
    な骨代用物に用いるための多孔質ガラス支持体を形成す
    る方法であって、 SiO2;CaO;Na2O;及びP2O5から本質的になる混合物を熔融
    し； 熔融した混合物を冷却してガラスフリットを作り； 該ガラスフリットからガラス粉末を作り；そして 該ガラス粉末から多孔質ガラス支持体を作る ことを含み、それにより、生成する多孔質ガラスが実質
    的に結晶性を示さない方法。
  10. 【請求項１０】浸漬が修飾トリスバッファーからなる第
    １水性溶液および組織培養培地からなる第２水性溶液中
    である、請求項１記載の生物活性物質。
  11. 【請求項１１】修飾トリスバッファーへの浸漬が少なく
    とも約20時間である、請求項10記載の生物活性物質。
  12. 【請求項１２】支持体が少なくとも上記人工装具の一部
    を含む、請求項５記載の移植可能な骨組織代用物。
  13. 【請求項１３】浸漬が修飾トリスバッファーからなる第
    １水性溶液および組織培養培地からなる第２水性溶液中
    である、請求項５記載の移植可能な骨組織代用物。
  14. 【請求項１４】修飾トリスバッファーへの浸漬が少なく
    とも約20時間である、請求項５記載の移植可能な骨組織
    代用物。
  15. 【請求項１５】SiO2;CaO;Na2O;及びP2O5から本質的にな
    るガラスまたはセラミックを含み、約10〜約80％の多孔
    度と800μｍ未満の気孔サイズを示し、そして実質的に
    結晶性を示さない、多孔質生物活性支持体。
  16. 【請求項１６】約20〜約30％の多孔度である、請求項15
    記載の支持体。
  17. 【請求項１７】約75〜約200μｍの気孔サイズである、
    請求項15記載の支持体。
  18. 【請求項１８】ガラスが、次の組成:45重量％SiO2;24.5
    重量％CaO;24.5重量％Na2O;及び６重量％P2O5を有す
    る、請求項15記載の支持体。
  19. 【請求項１９】次の組成:40〜60重量％SiO2;10〜35重量
    ％CaO;5〜30重量％Na2O;及び０〜12重量％P2O5を有する
    ガラスまたはセラミックを含み、そして約10〜約80％の
    多孔度と800μｍ未満の気孔サイズを示す、多孔質生物
    活性支持体。
  20. 【請求項２０】請求項９記載の方法により製造される多
    孔質生物活性支持体。
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