JP3211941B2 - ヒト小型肝細胞の取得方法と、この細胞の初代培養および継代培養方法 - Google Patents
ヒト小型肝細胞の取得方法と、この細胞の初代培養および継代培養方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、ヒト小型肝細胞
の取得方法と、この細胞の初代培養および継代培養方法
に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、ヒ
ト肝細胞の発生・分化や分裂増殖過程、あるいはその癌
化メカニズム等に関する細胞生物学的、分子生物学的研
究の材料として、あるいはハイブリッド型人工肝臓等の
医療材料として有用なヒト小型肝細胞を取得する方法
と、このヒト小型肝細胞を大量に得るための培養方法に
関するものである。
の取得方法と、この細胞の初代培養および継代培養方法
に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、ヒ
ト肝細胞の発生・分化や分裂増殖過程、あるいはその癌
化メカニズム等に関する細胞生物学的、分子生物学的研
究の材料として、あるいはハイブリッド型人工肝臓等の
医療材料として有用なヒト小型肝細胞を取得する方法
と、このヒト小型肝細胞を大量に得るための培養方法に
関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】動物個体は、一つの受精卵が
分裂を繰り返し、異なる機能を分担する各種の組織（細
胞集合体）へと分化した多細胞生物である。そして、身
体を構成する各組織の場合には、それぞれの細胞が常に
分裂増殖し、活発は分化機能発現能を有する細胞を次々
と産生することによって個体が維持されている。従っ
て、ヒトをはじめとする動物個体の生物学的実体を理解
し、あるいは発癌のメカニズム等を解明してその治療法
を開発するためには、各組織を構成する細胞を細胞生物
学的、分子生物学的に詳細に分析し、その発生・分化過
程や分裂増殖の機構を明らかにすることが重要であると
考えられる。
分裂を繰り返し、異なる機能を分担する各種の組織（細
胞集合体）へと分化した多細胞生物である。そして、身
体を構成する各組織の場合には、それぞれの細胞が常に
分裂増殖し、活発は分化機能発現能を有する細胞を次々
と産生することによって個体が維持されている。従っ
て、ヒトをはじめとする動物個体の生物学的実体を理解
し、あるいは発癌のメカニズム等を解明してその治療法
を開発するためには、各組織を構成する細胞を細胞生物
学的、分子生物学的に詳細に分析し、その発生・分化過
程や分裂増殖の機構を明らかにすることが重要であると
考えられる。
【０００３】従来より、生体組織の細胞を詳細に分析す
るための手段として、生体外へ取り出した細胞を培養
し、さらには培養細胞を分裂増殖させて継代的に生存さ
せる方法が確立している。ところが、ラットやヒトの肝
細胞については、これまで成熟個体から単離した初代細
胞を継代的に培養することは不可能であるとされてき
た。すなわち、接着依存性の成熟肝細胞は、その継代操
作のために培養基質から剥離する際に大きく損傷し、ま
た培養基質に再接着させることも困難であるなどの理由
から、継代培養系において肝細胞の発生過程や分裂増殖
状態を研究することは不可能であった。
るための手段として、生体外へ取り出した細胞を培養
し、さらには培養細胞を分裂増殖させて継代的に生存さ
せる方法が確立している。ところが、ラットやヒトの肝
細胞については、これまで成熟個体から単離した初代細
胞を継代的に培養することは不可能であるとされてき
た。すなわち、接着依存性の成熟肝細胞は、その継代操
作のために培養基質から剥離する際に大きく損傷し、ま
た培養基質に再接着させることも困難であるなどの理由
から、継代培養系において肝細胞の発生過程や分裂増殖
状態を研究することは不可能であった。
【０００４】この発明の発明者等は、培養培地の成分等
を工夫することによって上記の困難性を克服し、成熟ラ
ットの肝臓から採取した初代細胞を継代培養することに
成功し、その培養方法を既に特許出願している（特願平
６−８９０５６号）。さらにこの発明の発明者等は、従
来その存在が確認されていなかった肝前駆細胞（progen
itor cells）を含むと考えられるクローン性増殖能を有
する肝実質細胞とその取得方法、並びにそれらの細胞を
継代的に培養するための方法を発明し、既に特許出願し
ている（特願平７−２１３６８６号）。特に、この先願
発明における継代培養方法は、成熟哺乳動物の肝臓から
肝細胞を分取し、この肝細胞を低速遠心して重量画分と
軽量画分とに分離し、軽量画分中の小型細胞を牛胎児血
清およびアスコルビン酸類を必須として含有する培地で
初代培養して小型細胞に属する肝実質細胞にコロニーを
形成させ、ＥＤＴＡ溶液またはＥＤＴＡ／トリプシン溶
液によってコロニーの細胞を培地から剥がし、この剥が
した細胞を上記初代培養培地と同様の組成からなる培地
で再培養するか、または、上記初代培養の初期に用いた
培地（コンディションドメディウム）で再培養すること
を特徴とするものである。
を工夫することによって上記の困難性を克服し、成熟ラ
ットの肝臓から採取した初代細胞を継代培養することに
成功し、その培養方法を既に特許出願している（特願平
６−８９０５６号）。さらにこの発明の発明者等は、従
来その存在が確認されていなかった肝前駆細胞（progen
itor cells）を含むと考えられるクローン性増殖能を有
する肝実質細胞とその取得方法、並びにそれらの細胞を
継代的に培養するための方法を発明し、既に特許出願し
ている（特願平７−２１３６８６号）。特に、この先願
発明における継代培養方法は、成熟哺乳動物の肝臓から
肝細胞を分取し、この肝細胞を低速遠心して重量画分と
軽量画分とに分離し、軽量画分中の小型細胞を牛胎児血
清およびアスコルビン酸類を必須として含有する培地で
初代培養して小型細胞に属する肝実質細胞にコロニーを
形成させ、ＥＤＴＡ溶液またはＥＤＴＡ／トリプシン溶
液によってコロニーの細胞を培地から剥がし、この剥が
した細胞を上記初代培養培地と同様の組成からなる培地
で再培養するか、または、上記初代培養の初期に用いた
培地（コンディションドメディウム）で再培養すること
を特徴とするものである。
【０００５】そして、さらにこの発明の発明者等は、上
記のクローン性増殖能を有する肝実質細胞を、少ない細
胞播種数で培養する方法として、小型肝細胞を上記の初
代培養に用いた培地と３Ｔ３細胞のコンディションドメ
ディウムとの混合培地で培養するか、または小型肝細胞
を３Ｔ３細胞と共培養することを特徴とする方法を開発
し、既に特許出願している（特願平８−１３３９８５
号）。
記のクローン性増殖能を有する肝実質細胞を、少ない細
胞播種数で培養する方法として、小型肝細胞を上記の初
代培養に用いた培地と３Ｔ３細胞のコンディションドメ
ディウムとの混合培地で培養するか、または小型肝細胞
を３Ｔ３細胞と共培養することを特徴とする方法を開発
し、既に特許出願している（特願平８−１３３９８５
号）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】近年、培養肝細胞を組
み込んだ人工肝臓（ハイブリッド型人工肝臓）の開発が
活発に検討されているが、これまでに提案されたハイブ
リッド型人工肝臓には、ブタ等の異種動物から単離した
肝細胞や、癌細胞由来の株化細胞が用いられてきた。し
かしながら、これらの肝細胞をヒトの体内に埋め込んだ
場合には、異種動物細胞の侵入に対する免疫反応や、癌
細胞の活性化による他臓器の発癌といった問題が存在し
た。
み込んだ人工肝臓（ハイブリッド型人工肝臓）の開発が
活発に検討されているが、これまでに提案されたハイブ
リッド型人工肝臓には、ブタ等の異種動物から単離した
肝細胞や、癌細胞由来の株化細胞が用いられてきた。し
かしながら、これらの肝細胞をヒトの体内に埋め込んだ
場合には、異種動物細胞の侵入に対する免疫反応や、癌
細胞の活性化による他臓器の発癌といった問題が存在し
た。
【０００７】このため、ハイブリッド型人工肝臓の用い
る培養肝細胞として、ヒトの正常肝細胞の利用が期待さ
れているが、正常なヒト肝細胞を大量に得ることが困難
であり、またヒト肝細胞を装置に組み込むための培養方
法が確率していないことが、ヒト肝細胞を利用したハイ
ブリッド型人工肝臓の開発の障害の一つとなっていた。
る培養肝細胞として、ヒトの正常肝細胞の利用が期待さ
れているが、正常なヒト肝細胞を大量に得ることが困難
であり、またヒト肝細胞を装置に組み込むための培養方
法が確率していないことが、ヒト肝細胞を利用したハイ
ブリッド型人工肝臓の開発の障害の一つとなっていた。
【０００８】この発明は、以上のとおりの事情に鑑みて
なされたものであって、この発明者等が既に開発したラ
ット肝細胞についての知見を発展させ、少量のヒト正常
肝組織からコロニー形成能を有する小型肝細胞を取得す
る方法と、この細胞を効率良く継代培養する方法を提供
することを目的としている。
なされたものであって、この発明者等が既に開発したラ
ット肝細胞についての知見を発展させ、少量のヒト正常
肝組織からコロニー形成能を有する小型肝細胞を取得す
る方法と、この細胞を効率良く継代培養する方法を提供
することを目的としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】この出願の発明は、上記
の課題を解決するものとして、ヒトの肝臓から分取した
正常肝細胞をディスパーゼ含有コラゲナーゼ溶液で処理
したのち、分散させた肝細胞を低速遠心して重量画分と
軽量画分とに分離し、軽量画分中の小型肝細胞を採取す
ることにより得られたヒト小型肝細胞を、ヒト血清およ
びアスコルビン酸類を必須として含む培地と３Ｔ３細胞
のコンディションドメディウムとの混合培地で培養して
コロニーを形成させることを特徴とするヒト小型肝細胞
の初代培養方法（請求項１）を提供する。
の課題を解決するものとして、ヒトの肝臓から分取した
正常肝細胞をディスパーゼ含有コラゲナーゼ溶液で処理
したのち、分散させた肝細胞を低速遠心して重量画分と
軽量画分とに分離し、軽量画分中の小型肝細胞を採取す
ることにより得られたヒト小型肝細胞を、ヒト血清およ
びアスコルビン酸類を必須として含む培地と３Ｔ３細胞
のコンディションドメディウムとの混合培地で培養して
コロニーを形成させることを特徴とするヒト小型肝細胞
の初代培養方法（請求項１）を提供する。
【００１０】また、この出願の発明は、上記のヒト血清
およびアスコルビン酸類を必須として含む培地がヒト血
清、アスコルビン酸類、上皮細胞成長因子、ニコチンア
ミド類およびＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ培地であるこ
と（請求項２）、および３Ｔ３細胞のコンディションド
メディウムが、牛胎児血清を必須として含むＤＭＥＭ培
地で３Ｔ３細胞を培養した後の培養上清であること（請
求項３）を上記ヒト小型肝細胞の初代培養方法の態様と
して提供する。
およびアスコルビン酸類を必須として含む培地がヒト血
清、アスコルビン酸類、上皮細胞成長因子、ニコチンア
ミド類およびＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ培地であるこ
と（請求項２）、および３Ｔ３細胞のコンディションド
メディウムが、牛胎児血清を必須として含むＤＭＥＭ培
地で３Ｔ３細胞を培養した後の培養上清であること（請
求項３）を上記ヒト小型肝細胞の初代培養方法の態様と
して提供する。
【００１１】さらに、この出願の発明は、以上のいずれ
かの初代培養方法によってコロニーを形成するヒト小型
肝細胞（請求項４）と、コロニー形成能を有する前記ヒ
ト小型肝細胞を、ＥＤＴＡ／トリプシン溶液によって培
地から剥がし、これらの小型肝細胞を、ヒト血清および
アスコルビン酸類を必須として含む培地と３Ｔ３細胞の
コンディションメディドメディウムとの混合培地で培養
することによってコロニーを形成させることを特徴とす
るヒト小型肝細胞の継代培養方法（請求項５）をも提供
する。
かの初代培養方法によってコロニーを形成するヒト小型
肝細胞（請求項４）と、コロニー形成能を有する前記ヒ
ト小型肝細胞を、ＥＤＴＡ／トリプシン溶液によって培
地から剥がし、これらの小型肝細胞を、ヒト血清および
アスコルビン酸類を必須として含む培地と３Ｔ３細胞の
コンディションメディドメディウムとの混合培地で培養
することによってコロニーを形成させることを特徴とす
るヒト小型肝細胞の継代培養方法（請求項５）をも提供
する。
【００１２】この出願の発明は、さらには、ヒト血清お
よびアスコルビン酸類を必須として含む培地が、ヒト血
清、アスコルビン酸類、上皮細胞成長因子、ニコチンア
ミド類およびＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ培地であるこ
と（請求項６）、および３Ｔ３細胞のコンディションド
メディウムが、牛胎児血清を必須として含むＤＭＥＭ培
地で３Ｔ３細胞を培養した後の培養上清であること（請
求項７）を上記継代培養方法の態様として提供する。
よびアスコルビン酸類を必須として含む培地が、ヒト血
清、アスコルビン酸類、上皮細胞成長因子、ニコチンア
ミド類およびＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ培地であるこ
と（請求項６）、および３Ｔ３細胞のコンディションド
メディウムが、牛胎児血清を必須として含むＤＭＥＭ培
地で３Ｔ３細胞を培養した後の培養上清であること（請
求項７）を上記継代培養方法の態様として提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】この発明のヒト小型肝細胞は、た
とえば、外科手術により摘出した肝癌組織から、非腫瘍
部正常組織を一部採取し、これをコラゲナーゼおよびデ
ィスパーゼの混合溶液で処理したのち、分散させた肝細
胞を低速遠心して重量画分と計量画分とに分離し、計量
画分中の小型肝細胞を採取することによって取得するこ
とができる。より具体的には、採取した肝組織を公知の
灌流液により処理したのち、ディスパーゼ (100 〜10,0
00PU/ml)を加えた0.01〜1%コラゲナーゼ溶液により灌流
処理し、さらに0.01〜1%コラゲナーゼ溶液によって肝組
織を消化させる。各溶液の注入時間は、肝組織の状態に
よって異なるため、灌流液による組織の膨化を観察しな
がら、適宜に設定すればよい。ついで、消化した組織を
洗浄液でピペッティングして細胞を分散し、滅菌したガ
ーゼ、メッシュ等によって未消化の組織を除去、濾過し
たのち、低速遠心法（５０Ｇ）による軽量画分を分離
し、この画分に含まれる細胞を採取する。
とえば、外科手術により摘出した肝癌組織から、非腫瘍
部正常組織を一部採取し、これをコラゲナーゼおよびデ
ィスパーゼの混合溶液で処理したのち、分散させた肝細
胞を低速遠心して重量画分と計量画分とに分離し、計量
画分中の小型肝細胞を採取することによって取得するこ
とができる。より具体的には、採取した肝組織を公知の
灌流液により処理したのち、ディスパーゼ (100 〜10,0
00PU/ml)を加えた0.01〜1%コラゲナーゼ溶液により灌流
処理し、さらに0.01〜1%コラゲナーゼ溶液によって肝組
織を消化させる。各溶液の注入時間は、肝組織の状態に
よって異なるため、灌流液による組織の膨化を観察しな
がら、適宜に設定すればよい。ついで、消化した組織を
洗浄液でピペッティングして細胞を分散し、滅菌したガ
ーゼ、メッシュ等によって未消化の組織を除去、濾過し
たのち、低速遠心法（５０Ｇ）による軽量画分を分離
し、この画分に含まれる細胞を採取する。
【００１４】この方法によって、手術摘出組織等に含ま
れる少量の正常肝組織から、効率よくヒト正常小型肝細
胞を得ることができる。次に、このようにして取得した
ヒト小型肝細胞を、上記の初代培養方法、すなわち培養
培地として、ヒト血清およびアスコルビン酸類（例えば
Ｌ−アスコルビン酸リン酸塩）を必須として含む培地
と、３Ｔ３細胞のコンディションドメディウム（３Ｔ３
ＣＭ）との混合培地を用いる方法により培養する。この
混合培地の使用によって、少数の小型肝細胞からでも効
率よくコロニーを形成させることができる。
れる少量の正常肝組織から、効率よくヒト正常小型肝細
胞を得ることができる。次に、このようにして取得した
ヒト小型肝細胞を、上記の初代培養方法、すなわち培養
培地として、ヒト血清およびアスコルビン酸類（例えば
Ｌ−アスコルビン酸リン酸塩）を必須として含む培地
と、３Ｔ３細胞のコンディションドメディウム（３Ｔ３
ＣＭ）との混合培地を用いる方法により培養する。この
混合培地の使用によって、少数の小型肝細胞からでも効
率よくコロニーを形成させることができる。
【００１５】３Ｔ３細胞は、スイス系マウス胎児から得
られた公知の株細胞、あるいはBalb／Ｃ系マウス由来の
Balb３Ｔ３細胞を用いることができ、そのコンディショ
ンドメディウムは、牛胎児血清を必須として含有するＤ
ＭＥＭ培地で３Ｔ３細胞（５×１０5 cells ／10cm dis
h 程度）を３日間程度培養した後の培養上清として得る
ことができる。そして、このコンディションドメディウ
ムは、上記ＦＢＳおよびアスコルビン酸類を必須として
含む培地と１：９から９：１の割合、より好ましくは、
ほぼ等量の割合で混合して小型肝細胞の培養に用いるこ
とができる。
られた公知の株細胞、あるいはBalb／Ｃ系マウス由来の
Balb３Ｔ３細胞を用いることができ、そのコンディショ
ンドメディウムは、牛胎児血清を必須として含有するＤ
ＭＥＭ培地で３Ｔ３細胞（５×１０5 cells ／10cm dis
h 程度）を３日間程度培養した後の培養上清として得る
ことができる。そして、このコンディションドメディウ
ムは、上記ＦＢＳおよびアスコルビン酸類を必須として
含む培地と１：９から９：１の割合、より好ましくは、
ほぼ等量の割合で混合して小型肝細胞の培養に用いるこ
とができる。
【００１６】また、ヒト血清およびアスコルビン酸類を
必須として含む培地としては、具体的には、ヒト血清、
アスコルビン酸類、上皮細胞成長因子、ニコチンアミド
類およびＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ培地を用いること
ができる。すなわち、ヒト血清およびアスコルビン酸類
によって小型肝細胞のコロニー形成が生じる。また、上
皮細胞成長因子（ＥＧＦ）およびＤＭＳＯは、コロニー
の形成に必須ではないが、コロニーの形成促進作用を有
し、ニコチンアミド類は肝細胞の分化を抑えると考えら
れるため、培養培地に添加する成分として好ましい。さ
らに、低速遠心による軽量画分には、小型肝細胞以外に
も、内皮細胞、クッパー細胞、星細胞、胆管上皮細胞等
が含まれ、小型肝細胞に特殊な環境を提供していると考
えられるが、上記のニコチンアミド類、アスコルビン酸
類およびＤＭＳＯはそれらの非実質細胞の増殖を抑制
し、小型の肝実質細胞を選択的に培養増殖させることを
可能にする。
必須として含む培地としては、具体的には、ヒト血清、
アスコルビン酸類、上皮細胞成長因子、ニコチンアミド
類およびＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ培地を用いること
ができる。すなわち、ヒト血清およびアスコルビン酸類
によって小型肝細胞のコロニー形成が生じる。また、上
皮細胞成長因子（ＥＧＦ）およびＤＭＳＯは、コロニー
の形成に必須ではないが、コロニーの形成促進作用を有
し、ニコチンアミド類は肝細胞の分化を抑えると考えら
れるため、培養培地に添加する成分として好ましい。さ
らに、低速遠心による軽量画分には、小型肝細胞以外に
も、内皮細胞、クッパー細胞、星細胞、胆管上皮細胞等
が含まれ、小型肝細胞に特殊な環境を提供していると考
えられるが、上記のニコチンアミド類、アスコルビン酸
類およびＤＭＳＯはそれらの非実質細胞の増殖を抑制
し、小型の肝実質細胞を選択的に培養増殖させることを
可能にする。
【００１７】これらの成分の培地中への添加量は、例え
ば、ヒト血清は５〜２０％、アスコルビン酸類は0.1 〜
1.0 ｍＭ、ＥＧＦは１〜１００ｎｇ／ｍｌ、ニコチンア
ミド類は１〜２０ｍＭ、そしてＤＭＳＯは0.1 〜２％程
度とすることが出来る。培養は、５％ＣＯ2 条件下で、
３７℃前後の温度で行う。以上の通りの培養によって、
ヒト小型肝細胞を含む肝細胞コロニーが得られる。さら
に、これらのコロニーを形成する細胞に対しては、例え
ば、ペルオキシゾームの有無、肝細胞マーカーへの反応
性、癌化肝細胞マーカーへの反応性、未分化肝細胞マー
カーへの反応性、およびオーバルセルの表面抗原に対す
る抗体への反応性の少なくとも一つを指標としてスクリ
ーニングすることによって、肝細胞としての分化機能発
現を確認することができる。このうち、ペルオキシゾー
ムの有無は、透過型電子顕微鏡観察により確認すること
ができる。肝細胞マーカーとしてはアルブミン、α1 −
アンチトリプシン、トランスフェリン等の抗体を、癌化
または未分化な肝細胞のマーカーとしてはＧＳＴ−Ｐ、
α−フェトプロテインの抗体、γ−ＧＴＰ染色等を、ま
たオーバルセルの表面抗原に対する抗体としては公知の
抗体（ＯＣ２、ＯＣ３）を用いることができる。さら
に、胆管上皮細胞のマーカーや星細胞のマーカー等を用
いることによって、培養中の非実質細胞を同定すること
もできる。
ば、ヒト血清は５〜２０％、アスコルビン酸類は0.1 〜
1.0 ｍＭ、ＥＧＦは１〜１００ｎｇ／ｍｌ、ニコチンア
ミド類は１〜２０ｍＭ、そしてＤＭＳＯは0.1 〜２％程
度とすることが出来る。培養は、５％ＣＯ2 条件下で、
３７℃前後の温度で行う。以上の通りの培養によって、
ヒト小型肝細胞を含む肝細胞コロニーが得られる。さら
に、これらのコロニーを形成する細胞に対しては、例え
ば、ペルオキシゾームの有無、肝細胞マーカーへの反応
性、癌化肝細胞マーカーへの反応性、未分化肝細胞マー
カーへの反応性、およびオーバルセルの表面抗原に対す
る抗体への反応性の少なくとも一つを指標としてスクリ
ーニングすることによって、肝細胞としての分化機能発
現を確認することができる。このうち、ペルオキシゾー
ムの有無は、透過型電子顕微鏡観察により確認すること
ができる。肝細胞マーカーとしてはアルブミン、α1 −
アンチトリプシン、トランスフェリン等の抗体を、癌化
または未分化な肝細胞のマーカーとしてはＧＳＴ−Ｐ、
α−フェトプロテインの抗体、γ−ＧＴＰ染色等を、ま
たオーバルセルの表面抗原に対する抗体としては公知の
抗体（ＯＣ２、ＯＣ３）を用いることができる。さら
に、胆管上皮細胞のマーカーや星細胞のマーカー等を用
いることによって、培養中の非実質細胞を同定すること
もできる。
【００１８】次に、この発明の小型肝細胞の継代培養方
法について説明する。すなわち、この方法は、初代培養
によって得たヒト小型肝細胞のコロニー（初代培養細
胞）をシャーレから剥がし、別のシャーレにおいて再培
養し、増殖させる方法である。コロニーを剥がす際に
は、シャーレから培地を取り除いた後、コロニーにＥＤ
ＴＡ（０.００２〜０.２％）およびトリプシン（０.０
０５〜０.５％）の溶液を添加して約１０分間処理する
ことによって、コロニーを小型肝細胞と非実質細胞とに
分離することができる。
法について説明する。すなわち、この方法は、初代培養
によって得たヒト小型肝細胞のコロニー（初代培養細
胞）をシャーレから剥がし、別のシャーレにおいて再培
養し、増殖させる方法である。コロニーを剥がす際に
は、シャーレから培地を取り除いた後、コロニーにＥＤ
ＴＡ（０.００２〜０.２％）およびトリプシン（０.０
０５〜０.５％）の溶液を添加して約１０分間処理する
ことによって、コロニーを小型肝細胞と非実質細胞とに
分離することができる。
【００１９】そして、このようにして分散させた小型細
胞を、ヒト血清およびアスコルビン酸類を必須として含
む培地と３Ｔ３ＣＭとの混合培地で再培養する。３Ｔ３
ＣＭおよびこれと混合する培地の具体的成分等は、上記
初代培養方法のものと同様とすることができる。以上の
通りのこの発明の各方法は、少量のヒト正常肝組織から
コロニー形成能を有する小型肝細胞を効率よく、しかも
大量に取得することを可能とする。これらの肝細胞は、
ヒト肝細胞の発生・分化や分裂増殖過程、あるいはその
癌化メカニズム等に関する細胞生物学的、分子生物学的
研究の材料としてばかりでなく、ハイブリッド型人工肝
臓等の材料としても有用であり、肝疾患の治療技術の開
発にも新たな展開をもたらすものと期待される。
胞を、ヒト血清およびアスコルビン酸類を必須として含
む培地と３Ｔ３ＣＭとの混合培地で再培養する。３Ｔ３
ＣＭおよびこれと混合する培地の具体的成分等は、上記
初代培養方法のものと同様とすることができる。以上の
通りのこの発明の各方法は、少量のヒト正常肝組織から
コロニー形成能を有する小型肝細胞を効率よく、しかも
大量に取得することを可能とする。これらの肝細胞は、
ヒト肝細胞の発生・分化や分裂増殖過程、あるいはその
癌化メカニズム等に関する細胞生物学的、分子生物学的
研究の材料としてばかりでなく、ハイブリッド型人工肝
臓等の材料としても有用であり、肝疾患の治療技術の開
発にも新たな展開をもたらすものと期待される。
【００２０】以下、実施例を示して、この発明の継代培
養方法をさらに詳細かつ具体的に説明する。もちろん、
この発明は以下の例に限定されるものではない。
養方法をさらに詳細かつ具体的に説明する。もちろん、
この発明は以下の例に限定されるものではない。
【００２１】
実施例１：ヒト肝細胞の取得 ヒトの手術摘出肝組織から非腫瘍部正常組織を一部採取
し、３７℃に加温した0.5mM ethylene glycol-bis (2-a
minoethylene ether) tetraacetic acidを含むHanks 液
を約１０分間、肝切離面の脈管断端から挿入したシリン
ジを介して気泡が入らないように注入したのち、1,000U
P/mlディスパーゼを加えた0.05% コラゲナーゼ溶液（３
７℃）を同シリンジから３分間注入し、さらに0.05% コ
ラゲナーゼ溶液（３７℃）を単独で１５分間注入して肝
組織を消化した。
し、３７℃に加温した0.5mM ethylene glycol-bis (2-a
minoethylene ether) tetraacetic acidを含むHanks 液
を約１０分間、肝切離面の脈管断端から挿入したシリン
ジを介して気泡が入らないように注入したのち、1,000U
P/mlディスパーゼを加えた0.05% コラゲナーゼ溶液（３
７℃）を同シリンジから３分間注入し、さらに0.05% コ
ラゲナーゼ溶液（３７℃）を単独で１５分間注入して肝
組織を消化した。
【００２２】次いで、消化した組織は、メスで肝皮膜を
切開し、１０％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）に0.4U/ml
のDNase を添加した洗浄液でピペッティングして肝細胞
を分散させのち、滅菌したガーゼで未消化の組織片を除
去し、さらに70μm のナイロンメッシュで濾過した。得
られた濾過液を低速遠心（５０ Ｇ：１分間×３回）
し、成熟肝細胞を多く含む実質画分の沈殿を除き、計量
画分を含む遠心上清を得た。この非実質細胞画分をさら
に低速遠心（１５０ Ｇ：５分間×３回）し、非実質細
胞を含むヒト小型肝細胞を取得した。 実施例２：小型肝細胞の初代培養 ３Ｔ３細胞 (５×１０5 cells/10cm dish)を１０％牛胎
児血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤ
ＭＥＭ培地中で、３７℃、５％Ｃｏ2 条件下で培養し
た。そして、この培養に用いた培地の培養上清をコノデ
ィションドメディウム（３Ｔ３ＣＭ）とした。
切開し、１０％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）に0.4U/ml
のDNase を添加した洗浄液でピペッティングして肝細胞
を分散させのち、滅菌したガーゼで未消化の組織片を除
去し、さらに70μm のナイロンメッシュで濾過した。得
られた濾過液を低速遠心（５０ Ｇ：１分間×３回）
し、成熟肝細胞を多く含む実質画分の沈殿を除き、計量
画分を含む遠心上清を得た。この非実質細胞画分をさら
に低速遠心（１５０ Ｇ：５分間×３回）し、非実質細
胞を含むヒト小型肝細胞を取得した。 実施例２：小型肝細胞の初代培養 ３Ｔ３細胞 (５×１０5 cells/10cm dish)を１０％牛胎
児血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤ
ＭＥＭ培地中で、３７℃、５％Ｃｏ2 条件下で培養し
た。そして、この培養に用いた培地の培養上清をコノデ
ィションドメディウム（３Ｔ３ＣＭ）とした。
【００２３】実施例１で得たヒト小型肝細胞を、３．５
ｃｍ径の培養皿に９×１０5 個ずつ播き、ＤＭＥＭ培地
（10% ヒト血清, 44mM NaHCO3, 20mM HEPES, 0.5mg/lイ
ンシュリン，10-7M デキサメタゾン，30mg/lＬ−プロリ
ン，ペニシリンおよびストレプトマイシン含有）と３Ｔ
３ＣＭとを等量混合した培地（５０％３Ｔ３ＣＭ）で、
３７℃、５％ＣＯ2 条件下で２〜３時間培養した。次い
で、培養培地を、上記混合培地に 10mM ニコチンアミ
ド、10ng/ml ＥＧＦおよび0.2mM Ｌ−アスコルビン酸リ
ン酸塩を加えたＤＭＥＭ培地に交換し、さらに４日目か
らは１％ＤＭＳＯを培地に加え、３５日間培養を続け、
形成されたコロニー数を計測した。また、対照として、
３Ｔ３ＣＭを含まないＤＭＥＭ培地で培養した場合のコ
ロニー数も計測した。
ｃｍ径の培養皿に９×１０5 個ずつ播き、ＤＭＥＭ培地
（10% ヒト血清, 44mM NaHCO3, 20mM HEPES, 0.5mg/lイ
ンシュリン，10-7M デキサメタゾン，30mg/lＬ−プロリ
ン，ペニシリンおよびストレプトマイシン含有）と３Ｔ
３ＣＭとを等量混合した培地（５０％３Ｔ３ＣＭ）で、
３７℃、５％ＣＯ2 条件下で２〜３時間培養した。次い
で、培養培地を、上記混合培地に 10mM ニコチンアミ
ド、10ng/ml ＥＧＦおよび0.2mM Ｌ−アスコルビン酸リ
ン酸塩を加えたＤＭＥＭ培地に交換し、さらに４日目か
らは１％ＤＭＳＯを培地に加え、３５日間培養を続け、
形成されたコロニー数を計測した。また、対照として、
３Ｔ３ＣＭを含まないＤＭＥＭ培地で培養した場合のコ
ロニー数も計測した。
【００２４】結果は図１（Ａ）（Ｂ）に示したとおりで
あり、３Ｔ３ＣＭを含まないＤＭＥＭ培地で培養した場
合（図１：Ａ）び比べ、５０％３Ｔ３ＣＭ培地で培養し
た場合（図１：Ｂ）にには、より多くのコロニーが形成
されることが観察された。 実施例３：小型肝細胞の継代培養 実施例２の小型肝細胞を含む肝細胞コロニーが形成され
たシャーレから培地を取り除き、コロニーを０.０２％
ＥＤＴＡおよび０.０５％トリプシンで処理し、コロニ
ーの小型肝細胞と非実質細胞とを溶液中に分散させた。
こ細胞分散液をピペッティングし、コロニー周囲の非実
質細胞と、小型肝細胞の各々の分散液を得た。次いで、
上記の３Ｔ３ＣＭとＤＭＡＥＭ培地との混合培地（５０
％３Ｔ３ＣＭ）で再培養した。
あり、３Ｔ３ＣＭを含まないＤＭＥＭ培地で培養した場
合（図１：Ａ）び比べ、５０％３Ｔ３ＣＭ培地で培養し
た場合（図１：Ｂ）にには、より多くのコロニーが形成
されることが観察された。 実施例３：小型肝細胞の継代培養 実施例２の小型肝細胞を含む肝細胞コロニーが形成され
たシャーレから培地を取り除き、コロニーを０.０２％
ＥＤＴＡおよび０.０５％トリプシンで処理し、コロニ
ーの小型肝細胞と非実質細胞とを溶液中に分散させた。
こ細胞分散液をピペッティングし、コロニー周囲の非実
質細胞と、小型肝細胞の各々の分散液を得た。次いで、
上記の３Ｔ３ＣＭとＤＭＡＥＭ培地との混合培地（５０
％３Ｔ３ＣＭ）で再培養した。
【００２５】その結果、多数の細胞によって構成された
コロニーが形成されることが確認された。
コロニーが形成されることが確認された。
【００２６】
【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明によ
って、少量のヒト正常肝組織からコロニー生計能を有す
る小型肝細胞を効率よく、しかも大量に取得することを
可能となる。これらの肝細胞は、ヒト肝細胞の発生・分
化や分裂増殖過程、あるいはその癌化メカニズム等に関
する細胞生物学的、分子生物学的研究の材料としてばか
りでなく、ハイブリッド型人工肝臓等の材料としても有
用であり、肝疾患の治療技術の開発にも新たな展開をも
たらすものと期待される。
って、少量のヒト正常肝組織からコロニー生計能を有す
る小型肝細胞を効率よく、しかも大量に取得することを
可能となる。これらの肝細胞は、ヒト肝細胞の発生・分
化や分裂増殖過程、あるいはその癌化メカニズム等に関
する細胞生物学的、分子生物学的研究の材料としてばか
りでなく、ハイブリッド型人工肝臓等の材料としても有
用であり、肝疾患の治療技術の開発にも新たな展開をも
たらすものと期待される。
【図１】Ａは、３Ｔ３ＣＭを含まないＤＭＥＭ培地で培
養したヒト小型肝細胞のコロニー数を示したヒストグラ
ムであり、Ｂは５０％３Ｔ３ＣＭ培地で培養したヒト小
型肝細胞のコロニー数を示したヒストグラムである。
養したヒト小型肝細胞のコロニー数を示したヒストグラ
ムであり、Ｂは５０％３Ｔ３ＣＭ培地で培養したヒト小
型肝細胞のコロニー数を示したヒストグラムである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平４−158786（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−112092（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 5/06 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)
Claims (7)
- 【請求項１】 ヒトの肝臓から分取した正常肝細胞をデ
ィスパーゼ含有コラゲナーゼ溶液で処理したのち、分散
させた肝細胞を低速遠心して重量画分と軽量画分とに分
離し、軽量画分中の小型肝細胞を採取することにより得
られたヒト小型肝細胞を、ヒト血清およびアスコルビン
酸類を必須として含む培地と３Ｔ３細胞のコンディショ
ンドメディウムとの混合培地で培養してコロニーを形成
させることを特徴とするヒト小型肝細胞の初代培養方
法。 - 【請求項２】 ヒト血清およびアスコルビン酸類を必須
として含む培地がヒト血清、アスコルビン酸類、上皮細
胞成長因子、ニコチンアミド類およびＤＭＳＯを含有す
るＤＭＥＭ培地である請求項１のヒト小型肝細胞の初代
培養方法。 - 【請求項３】 ３Ｔ３細胞のコンディションドメディウ
ムが、牛胎児血清を必須として含むＤＭＥＭ培地で３Ｔ
３細胞を培養した後の培養上清である請求項１または２
のいずれかの小型肝細胞の初代培養方法。 - 【請求項４】 請求項１ないし３のいずれかの初代培養
方法によってコロニーを形成するヒト小型肝細胞。 - 【請求項５】 コロニーを形成した請求項４のヒト小型
肝細胞を、ＥＤＴＡ／トリプシン溶液によって培地から
剥がし、これらの小型肝細胞を、ヒト血清およびアスコ
ルビン酸類を必須として含む培地と３Ｔ３細胞のコンデ
ィションメディドメディウムとの混合培地で培養するこ
とによってコロニーを形成させることを特徴とするヒト
小型肝細胞の継代培養方法。 - 【請求項６】 ヒト血清およびアスコルビン酸類を必須
として含む培地が、ヒト血清、アスコルビン酸類、上皮
細胞成長因子、ニコチンアミド類およびＤＭＳＯを含有
するＤＭＥＭ培地である請求項５のヒト小型肝細胞の継
代培養方法。 - 【請求項７】 ３Ｔ３細胞のコンディションドメディウ
ムが、牛胎児血清を必須として含むＤＭＥＭ培地で３Ｔ
３細胞を培養した後の培養上清である請求項５または６
のいずれかのヒト小型肝細胞の継代培養方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34889896A JP3211941B2 (ja) | 1996-12-26 | 1996-12-26 | ヒト小型肝細胞の取得方法と、この細胞の初代培養および継代培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34889896A JP3211941B2 (ja) | 1996-12-26 | 1996-12-26 | ヒト小型肝細胞の取得方法と、この細胞の初代培養および継代培養方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10179148A JPH10179148A (ja) | 1998-07-07 |
| JP3211941B2 true JP3211941B2 (ja) | 2001-09-25 |
Family
ID=18400135
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34889896A Expired - Lifetime JP3211941B2 (ja) | 1996-12-26 | 1996-12-26 | ヒト小型肝細胞の取得方法と、この細胞の初代培養および継代培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3211941B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021038892A1 (ja) | 2019-08-26 | 2021-03-04 | 株式会社フェニックスバイオ | ヒト脂肪肝モデル細胞 |
| WO2022181660A1 (ja) | 2021-02-26 | 2022-09-01 | 株式会社フェニックスバイオ | スクリーニング方法に使用するためのヒト脂肪肝モデル細胞 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE414143T1 (de) * | 1999-01-19 | 2008-11-15 | Univ North Carolina | Menschliche leber-vorläuferzellen |
| WO2001087059A1 (fr) * | 2000-05-19 | 2001-11-22 | Japan Science And Technology Corporation | Animal chimerique |
| AU2001288072A1 (en) * | 2000-09-22 | 2002-04-02 | Hokkaido Technology Licensing Office Co., Ltd. | Culture liquor for normal human matured liver cells |
| JP2004344078A (ja) * | 2003-05-22 | 2004-12-09 | Japan Science & Technology Agency | インスリン産生細胞とその作製方法 |
| CN101802174B (zh) | 2007-09-11 | 2013-06-05 | 北海道公立大学法人札幌医科大学 | 细胞增殖方法以及用于组织修复及再生的药物 |
| JP5883265B2 (ja) | 2011-10-13 | 2016-03-09 | 株式会社フェニックスバイオ | ヒト肝細胞を担持するキメラ非ヒト動物 |
| JP6704617B2 (ja) * | 2016-01-29 | 2020-06-03 | 北海道公立大学法人 札幌医科大学 | 小型肝細胞の継代培養方法 |
-
1996
- 1996-12-26 JP JP34889896A patent/JP3211941B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021038892A1 (ja) | 2019-08-26 | 2021-03-04 | 株式会社フェニックスバイオ | ヒト脂肪肝モデル細胞 |
| WO2022181660A1 (ja) | 2021-02-26 | 2022-09-01 | 株式会社フェニックスバイオ | スクリーニング方法に使用するためのヒト脂肪肝モデル細胞 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH10179148A (ja) | 1998-07-07 |
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