DE60037909T2

DE60037909T2 - Rekonstruktion von organen aus einem dezellularisierten biologischem gerüst

Info

Publication number: DE60037909T2
Application number: DE60037909T
Authority: DE
Inventors: Anthony Weston ATALA
Original assignee: Boston Childrens Hospital
Current assignee: Boston Childrens Hospital
Priority date: 1999-12-29
Filing date: 2000-12-14
Publication date: 2009-01-15
Anticipated expiration: 2020-12-15
Also published as: AU770887B2; EP1246903A1; CA2395698C; AU2099901A; DE60037909D1; CA2395698A1; EP1246903B1; ATE384782T1; JP2003518517A; WO2001048153A1; US6479064B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung liegt auf dem technischen Gebiet der Rekonstruktion von künstlichen Organen durch Perfundieren von kultivierten Zellpopulationen in dezellularisierte Gerüste, die aus gewonnenen Tier- oder Leichenorganen gebildet worden sind. Die Erfindung eignet sich insbesondere zur Konstruktion von künstlichen Nieren für Implantationszwecke.
Der Ausdruck "akutes Nierenversagen" bezieht sich auf die Zerstörung der normalen Nierenfunktion. Dieser klinische Zustand entsteht aufgrund einer Vielzahl von Mechanismen, einschließlich Infektionen, Kreislaufversagen (Schock), Gefäßblockaden, Glomerulonephritis und Behinderung des Urinflusses. Ein akutes Nierenversagen tritt häufig als eine Komplikation bei Bauch- und Gefäßoperationen auf. Von besonderer klinischer Bedeutung sind Fälle von akutem Nierenversagen in Verbindung mit Traumata, Sepsis, postoperativen Komplikationen oder Medikationen, insbesondere Antibiotika.
Postoperative Komplikationen, wie Infektionen, werden durch Verwendung von komplexen Arzneistoffen, wie Antibiotika, überwunden. Ungünstigerweise können diese Arzneistoffe für die Nieren toxisch sein, insbesondere bei älteren Personen. Aufgrund des zunehmenden Alters der Krankenhauspatienten und aufgrund der Fortschritte in bezug auf komplizierte medizinische und chirurgische Techniken ist zu erwarten, dass die Anzahl und Bedeutung der Fälle mit akutem Nierenversagen zunimmt, wenn keine Fortschritte in der Behandlung erzielt werden.
Die Behandlung von akutem Nierenversagen beinhaltet typischerweise eine Dialyse, bei der Abfallprodukte und Chemikalien aus dem Blutsystem entfernt werden. Trotz einiger Fortschritte hat sich seit vielen Jahren die Sterblichkeitsrate in Verbindung mit Nierenkrankheiten kaum geändert. Während eine Dialyse eine Möglichkeit bietet, Abfallprodukte und Chemikalien herauszufiltern, bringt die typische Behandlungsweise für die meisten Patienten erhebliche Unannehmlichkeiten mit sich. Üblicherweise sind mit der Behandlung lange Zeiträume verbunden, in denen der Patient an die Dialyseanlage angeschlossen ist. Das Dialyseverfahren wird mehrmals pro Woche wiederholt. In zahlreichen Fällen treten bei den Patienten Nebenwirkungen auf, wie Muskelkrämpfe und Hochdruck in Verbindung mit der raschen Veränderung der Körperflüssigkeiten des Patienten.
Eine Nierentransplantation stellt eine Alternative zur Dialyse dar. Dies beinhaltet das Ersetzen der Niere des Patienten durch eine gesunde Niere eines Spenders, sofern diese verfügbar ist. Die implantierte Niere erfüllt dann die Funktionen wie die eigene Niere des Patienten, nämlich die Filtration von Blut und die Bildung von Urin. Unglücklicherweise stellt eine Nierenabstoßung ein erhebliches Risiko bei einer Transplantation dar, selbst wenn eine gute Übereinstimmung in bezug auf die Histokompatibilität besteht. Immunosuppressiva, wie Cyclosporin und FK506, werden üblicherweise dem Patienten zur Verhinderung einer Abstoßung verabreicht. Jedoch haben diese Immunosuppressiva ein geringes therapeutisches Fenster zwischen angemessener Immunosuppression und Toxizität. Eine längere Immunosuppression kann die Immunsysteme schwächen, was eine Bedrohung in bezug auf die Entwicklung von Infektionen darstellen kann. In einigen Fällen reicht selbst eine Immunosuppression nicht aus, um eine Nierenabstoßung zu verhindern.
In dem Bestreben, die mit Dialyse und Nierentransplantation verbundenen Probleme zu vermeiden, wurden verschiedene Verfahren beschrieben, bei denen eigene Nierenzellen des Patienten in vitro gezüchtet werden. Beispielsweise beschreibt das US-Patent 5 429 938 (Humes) ein Verfahren zur Rekonstruktion von renalen Tubuli unter Verwendung von gezüchteten Nierenzellen. Die rekonstruierten renalen Tubuli können dann dem Patienten implantiert werden.
Naughton et al. beschreiben ein dreidimensionales Gewebekultursystem, in dem Stromazellen über ein Polymer-Trägersystem geschichtet werden ( US-Patent 5 863 531 ).
Vacanti et al. beschreiben Verfahren zum Züchten von Zellen in einer dreidimensionalen Matrix, die aus einem biologisch abbaubaren Polymeren besteht. Organzellen werden zunächst innerhalb der Matrix gezüchtet und sodann dem Patienten implantiert.
Die vorstehenden Verfahren stützen sich auf die Formung der Trägerstruktur zur gewünschten Konfiguration des Organs. Die korrekte dreidimensionale Konfiguration ist wesentlich dafür, dass das rekonstruierte Organ in vivo einwandfrei funktioniert. Es muss nicht nur die Gestalt zur Körperhöhle passen, sondern die Gestalt schafft auch die nötige Mikroumgebung dafür, dass die kultivierten Zellen wachsen und sich vermehren.
Somit besteht ein Bedürfnis zur Rekonstruktion von künstlichen Organen, die die gleiche dreidimensionale Infrastruktur wie das native Organ aufweisen. Ferner besteht ein Bedürfnis zur Rekonstruktion eines künstlichen Organs zur Verwendung als dauerhaftes Ersatzprodukt für ein Organ.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren zum Rekonstruieren von künstlichen Organen unter Verwendung eines dreidimensionalen Gerüstes, das durch Dezellularisieren einer natürlichen Biostruktur erzeugt worden ist, bereit. Das dreidimensionale Gerüst wird mit einer Population von kultivierten Endothelzellen perfundiert, die an das dreidimensionale Gerüst binden und eine Endothelgewebeschicht bilden. Eine fortgesetzte Züchtung und Differenzierung der Endothelzellen am dreidimensionalen Gerüst führt zur Bildung eines primitiven Gefäßsystems in der Endothelgewebeschicht. Das primitive Gefäßsystem kann sich zu einem reifen Gefäßsystem entwickeln und kann ferner das Wachstum und die Entwicklung von zusätzlichen kultivierten Zellpopulationen unterstützen. Das dreidimensionale Gerüst und die Endothelgewebeschicht mit dem primitiven Gefäßsystem können zum in vitro- und in vivo-Züchten einer Vielzahl von verschiedenen Zellen verwendet werden.
Demzufolge betrifft die Erfindung gemäß einem Aspekt ein Verfahren zum Rekonstruieren eines künstlichen Organkonstrukts, welches umfasst:
Perfundieren einer Population von kultivierten Endothelzellen in das durch Dezellularisieren einer natürlichen Biostruktur gebildete dreidimensionale Gerüst, so dass Endothelzellen an das dreidimensionale Gerüst binden;
Kultivieren der Endothelzellen in dem dreidimensionalen Gerüst, bis die Endothelzellen eine Endothelgewebeschicht bilden, die ein primitives Gefäßsystem umfasst;
Einimpfen mindestens einer weiteren zweiten Population von kultivierten Zellen in das dreidimensionale Gerüst, so dass die zweite Zellpopulation an die Endothelgewebeschicht, die das primitive Gefäßsystem enthält, bindet und in eine neomorphe Organstruktur differenziert.
Während des in vitro-Wachstums kommt es bei den Endothelzellen zur Entwicklung und zur Erzeugung einer Endothelgewebeschicht, die ein primitives Gefäßsystem umfasst, das das dreidimensionale Gerüst einhüllt. Das dreidimensionale Gerüst ist aus einem biologisch verträglichen, nicht-abbaubaren Material zusammengesetzt. Die Endothelgewebeschicht liefert auch ein primitives Gefäßsystem, das zur Entwicklung eines reifen Gefäßsystems befähigt ist, das das Wachstum und die Entwicklung von weiteren kultivierten Zellpopulationen unterstützt. Bei der Züchtung in diesem dreidimensionalen Gerüst kommt es dazu, dass die proliferierenden Zellen reifen und einer einwandfreien Segregation unter Bildung von Geweben, die analog zu in vivo auftretenden Gegenstücken sind, unterliegen.
Die Erfindung beruht teilweise auf dem Befund, dass ein Wachstum von Endothelzellen in dezellularisierten, dreidimensionalen Gerüsten die aktive Proliferation von zusätzlichen Zellpopulationen stützt. Dies kann teilweise auf die vergrößerte Oberfläche des natürlichen, von der Biostruktur abgeleiteten Gerüstes zurückzuführen sein, was eine verlängerte Periode der aktiven Proliferation von Endothelzellen ermöglicht. Die verlängerte Proliferation macht es den Endothelzellen möglich, ein primitives Gefäßsystem zu entwickeln. Das primitive Gefäßsystem unterstützt anschließend das Wachstum und die Entwicklung von zusätzlichen kultivierten Zellpopulationen. Ferner ermöglicht die dreidimensionale Beschaffenheit der dezellularisierten Biostruktur eine räumliche Verteilung, die der Verteilung unter in vivo-Bedingungen entspricht, was die Bildung einer Mikroumgebung gestattet, die zu einer zellulären Reifung und Wanderung führt. Ein optimales Wachstum und Entwicklung von Zellen ergeben sich, wenn die Infrastruktur der Mikroumgebung der Infrastruktur eines natürlichen Organs gleicht. Dies sorgt für die richtigen räumlichen Abstände, die das Auftreten von Zell-Zell-Wechselwirkungen ermöglichen. Das Wachstum von Zellen in Gegenwart dieses Gerüstes kann ferner durch Zugabe von Proteinen, Glycoproteinen, Glycosaminoglycanen und einer zellulären Matrix verstärkt werden.
Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich bei der natürlichen Biostruktur um ein Organ, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Herz, Niere, Leber, Bauchspeicheldrüse, Milz, Blase, Harnleiter und Harnröhre besteht. Gemäß einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der natürlichen Biostruktur um einen Teil eines Organs, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Herz, Niere, Leber, Bauchspeicheldrüse, Milz, Blase, Harnleiter und Harnröhre besteht. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich beim künstlichen Organkonstrukt um ein künstliches Nierenkonstrukt. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform leitet sich das dreidimensionale Gerüst von einer dezellularisierten Säugetierniere ab. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Endothelzellen um humane Endothelzellen. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die zweite Population humane Nierenzellen.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein künstliches Organkonstrukt, das folgendes umfasst: ein dreidimensionales Gerüst, gebildet durch Dezellularisieren einer natürlichen Biostruktur, die mit einer Population von kultivierten Endothelzellen perfundiert worden ist, so dass die Endothelzellen an das dreidimensionale Gerüst unter Bildung einer Endothelgewebeschicht, die ein primitives Gefäßsystem umfasst, bindet, und mindestens eine weitere zweite Population von kultivierten Zellen, so dass die zweite Zellpopulation an die Endothelgewebeschicht, die das primitive Gefäßsystem umfasst, bindet und in eine neomorphe Organstruktur differenziert.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Rekonstruieren einer künstlichen Niere, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
Perfundieren einer Population von kultivierten Endothelzellen in ein dreidimensionales Gerüst, das durch Dezellularisieren einer Säugetierniere gebildet worden ist, so dass die Endothelzellen an das dreidimensionale Gerüst binden;
Kultivieren der Endothelzellen im dreidimensionalen Gerüst, bis die Endothelzellen eine Endothelgewebeschicht, die ein primitives Gefäßsystem umfasst, bilden;
Einimpfen einer Population von kultivierten Nierenzellen in das dreidimensionale Gerüst, so dass die Nierenzellpopulation an die Endothelgewebeschicht, die das primitive Gefäßsystem umfasst, bindet und in Nephronstrukturen differenziert.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Subjekts mit einer Nierenstörung, umfassend:
Implantieren eines dreidimensionalen Gerüstes, gebildet durch Dezellularisieren einer Säugetierniere, die mit einer Population von kultivierten Endothelzellen perfundiert ist, so dass die Endothelzellen an das dreidimensionale Gerüst unter Bildung einer Endothelgewebeschicht, die ein primitives Gefäßsystem umfasst, binden, und einer Population von kultivierten Nierenzellen, so dass die Nierenzellpopulation an die Endothelgewebeschicht, die das primitive Gefäßsystem umfasst, bindet und zu Nephronstrukturen differenziert; und Überwachen des Subjekts in bezug auf eine Modulation der Nierenstörung.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein künstliches Nierenkonstrukt, das folgendes umfasst:
ein dreidimensionales Gerüst, gebildet durch Dezellularisieren einer Säugetierniere, die mit einer Population von kultivierten Endothelzellen perfundiert worden ist, so dass die Endothelzellen an das dreidimensionale Gerüst unter Bildung einer Endothelgewebeschicht, die ein primitives Gefäßsystem umfasst, bindet, und eine Population von kultivierten Nierenzellen, so dass die Nierenzellpopulation an die Endothelgewebeschicht, die das primitive Gefäßsystem umfasst, bindet und zu Nephronstrukturen differenziert.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Screening einer Verbindung, welche Nierenzellen moduliert, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
Bereitstellen eines künstlichen Nierenkonstrukts mit einem dreidimensionalen Gerüst, gebildet durch Dezellularisieren einer Säugetierniere, die mit einer Population von kultivierten Endothelzellen perfundiert worden ist, so dass die Endothelzellen an das dreidimensionale Gerüst unter Bildung einer Endothelgewebeschicht, die ein primitives Gefäßsystem umfasst, binden, und eine Population von gezüchteten Nierenzellen, so dass die Nierenzellpopulation an die Endothelgewebeschicht, die das primitive Gefäßsystem umfasst, bindet und zu Nephronstrukturen differenziert;
Kontaktieren des künstlichen Nierenkonstrukts mit einer Bibliothek von Testverbindungen; und
Selektieren einer interessierenden Verbindung, die Nierenzellen moduliert, aus der Bibliothek von Testverbindungen.
Gemäß einer Ausführungsform ist der Modulator für die Nierenzellen zytotoxisch. Gemäß einer weiteren Ausführungsform wirkt der Modulator auf die Nierenzellen therapeutisch. Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich bei der Verbindung um ein chemisches Mittel oder um ein pharmazeutisches Mittel.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Verarbeiten einer wässrigen Lösung, das folgendes umfasst:
Bereitstellen eines künstlichen Nierenkonstrukts mit einem dreidimensionalen Gerüst, das durch Dezellularisieren einer Säugetierniere, die mit einer Population von kultivierten Endothelzellen, so dass die Endothelzellen an das dreidimensionale Nierengerüst unter Bildung einer Endothelgewebeschicht, die ein primitives Gefäßsystem umfasst, binden, und mit einer Population von kultivierten Nierenzellen perfundiert worden ist, so dass die Nierenzellpopulation an die Endothelgewebeschicht, die das primitive Gefäßsystem umfasst, bindet und in Nephronstrukturen differenziert;
Bereitstellen der wässrigen Lösung an der luminalen Seite des künstlichen Nierenkonstrukts; und
Gewinnen einer verarbeiteten wässrigen Lösung aus der abluminalen Seite des künstlichen Nierenkonstrukts.
Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich bei der wässrigen Lösung um unfiltriertes Blut und bei der verarbeiteten wässrigen Lösung um filtriertes Blut.
Ausführliche Beschreibung
Zum leichteren Verständnis der Erfindung werden zunächst bestimmte Ausdrücke definiert.
Die hier verwendeten Ausdrücke "Bindung" oder "Binden" beziehen sich auf Zellen, die direkt am dreidimensionalen Gerüst haften oder an Zellen, die selbst an anderen Zellen haften.
Die hier verwendeten Ausdrücke "dezellularisiert" oder "Dezellularisierung" beziehen sich auf eine Biostruktur (z. B. ein Organ oder Teil eines Organs), aus der der Zell- und Gewebeinhalt entfernt worden ist, wobei eine intakte, azelluläre Infrastruktur zurückbleibt. Organe, wie die Niere, sind aus verschiedenen spezialisierten Geweben zusammengesetzt. Die spezialisierten Gewebestrukturen eines Organs oder das Parenchym sorgen für die spezifische Funktion, die mit dem Organ verbunden ist. Das stützende faserartige Netzwerk des Organs ist das Stroms. Die meisten Organe weisen ein stromales Gerüst aus unspezialisiertem Bindegewebe auf, das das spezialisierte Gewebe stützt. Beim Vorgang der Dezellularisierung wird das spezialisierte Gewebe entfernt, wobei das komplexe, dreidimensionale Netzwerk des Bindegewebes zurückbleibt. Die Bindegewebe-Infrastruktur ist vorwiegend aus Kollagen zusammengesetzt. Die dezellularisierte Struktur sorgt für ein biokompatibles Substrat, auf das verschiedene Zellpopulationen infundiert werden können. Dezellularisierte Biostrukturen können starr oder halbstarr sein und die Fähigkeit besitzen, ihre Gestalt zu verändern. Zu Beispielen für dezellularisierte Organe, die erfindungsgemäß geeignet sind, gehören (ohne Beschränkung hierauf) Herz, Niere, Leber, Bauchspeicheldrüse, Milz, Blase, Harnleiter und Harnröhre.
Der hier verwendete Ausdruck "dreidimensionales Gerüst" bezieht sich auf die restliche Infrastruktur, die entsteht, wenn eine natürliche Biostruktur, z. B. ein Organ, dezellularisiert wird. Dieses komplexe, dreidimensionale Gerüst liefert das Stützgerüst, das es möglich macht, dass Zellen daran binden und darauf wachsen. Kultivierte Populationen von Zellen können auf dem dreidimensionalen Gerüst gezüchtet werden, das die genauen Zwischenraumabstände bereitstellt, die für die Zell-Zell-Wechselwirkung erforderlich sind. Dadurch ergibt sich ein rekonstruiertes Organ, das dem nativen in vivo-Organ gleicht. Dieses dreidimensionale Gerüst wird mit einer Population von kultivierten Endothelzellen perfundiert, die wachsen und sich entwickeln, wodurch sich eine Endothelgewebeschicht ergibt, die ein primitives Gefäßsystem umfasst, das dazu in der Lage ist, sich zu einem reifen Gefäßsystem zu entwickeln. Die Endothelgewebeschicht und das primitive Gefäßsystem sind ferner dazu befähigt, das Wachstum und die Entwicklung mindestens einer weiteren kultivierten Zellpopulation zu unterstützen.
Der hier verwendete Ausdruck "primitives Gefäßsystem" bezieht sich auf die frühen Stadien der Entwicklung eines Gefäßsystems, das Blutgefäße umfasst, die die Gewebestrukturen mit Blut versorgen.
Der hier verwendete Ausdruck "natürliche Biostruktur" bezieht sich auf eine biologische Anordnung innerhalb eines Subjekts, z. B. auf Organe, einschließlich (ohne Beschränkung hierauf) Herz, Niere, Leber, Bauchspeicheldrüse, Milz, Blase, Harnleiter und Harnröhre. Der Ausdruck "natürliche Biostruktur" soll auch Teile von Biostrukturen umfassen, z. B. Teile von Organen, wie die renale Arterie einer Niere.
Der hier verwendete Ausdruck "neomorphe Organstruktur" bezieht sich auf eine Komponente des Parenchymalgewebes. Die neomorphe Organstruktur entsteht, wenn Zellen, die das Parenchymgewebe bilden, einer Differenzierung in verschiedene Verbände unterliegen. Beispielsweise weist eine natürliche Niere die Medulla- und Cortex-Regionen auf, die entstehen, wenn Nierenzellen unter Bildung von Nephron-Strukturen differenzieren. Die Nephron-Struktur weist die Bowman-Kapsel, das distale Tubuluskonvulut, die Henle-Schleife, das proximale Tubuluskonvulut und Sammelleitungen auf.
Der hier verwendete Ausdruck "Subjekt" ist so zu verstehen, dass er lebende Organismen umfasst, in denen eine Immunantwort herbeigeführt wird. Bevorzugte Subjekte sind Säuger. Zu Beispielen für Subjekte gehören (ohne Beschränkung hierauf), Menschen, Affen, Hunde, Katzen, Mäuse, Ratten, Rinder, Pferde, Schweine, Ziegen und Schafe.
Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren zum Rekonstruieren von künstlichen Organen bereit. Die Rekonstruktion von künstlichen Organen umfasst die Perfusion einer Population von kultivierten Endothelzellen in das Gerüst, das durch Dezellularisieren einer natürlichen Biostruktur gebildet worden ist, so dass Endothelzellen an das dreidimensionale Gerüst binden;
das Kultivieren der Endothelzellen im dreidimensionalen Gerüst, bis die Endothelzellen eine Endothelgewebeschicht bilden, die ein primitives Gefäßsystem umfasst;
das Einimpfen mindestens einer weiteren zweiten Population von kultivierten Zellen in das dreidimensionale Gerüst, so dass die zweite Zellpopulation an die Endothelgewebeschicht, die das primitive Gefäßsystem umfasst, bindet und in eine neomorphe Organstruktur differenziert.
Das künstliche Organ wird rekonstruiert, indem man eine dezellularisierte natürliche Biostruktur als das dreidimensionale Gerüst verwendet, auf das eine kultivierte endotheliale Zellpopulation perfundiert wird. Bei der natürlichen Biostruktur kann es sich um eine beliebige biologische Anordnung handeln, die innerhalb eines Subjekts auftritt, z. B. um ein Organ, wie Herz, Niere, Leber, Bauchspeicheldrüse, Milz, Blase, Harnleiter und Harnröhre, oder um einen Teil des Organs.
I. Natürliche Biostrukturen
Die natürliche Biostruktur, z. B. ein Organ, lässt sich von einem Spender der gleichen Spezies als Subjekt erhalten, z. B. eine humane Niere eines Verstorbenen für einen humanen Nierenempfänger. Die natürliche Biostruktur kann auch von einer unterschiedlichen Spezies erhalten werden, wozu (ohne Beschränkung hierauf) Affen, Hunde, Katzen, Mäuse, Ratten, Rinder, Pferde, Schweine, Ziegen und Schafe gehören. Die natürliche Biostruktur kann auch von dem Subjekt erhalten werden, das ein rekonstruiertes Organ benötigt, z. B. kann bei einem Subjekt mit einer funktionsgestörten Niere und einer funktionierenden Niere die funktionsgestörte Niere entfernt und unter Anwendung des nachstehend beschriebenen Verfahrens dezellularisiert werden. Die dezellularisierte Niere des Subjekts kann als dreidimensionales Gerüst zum Rekonstruieren einer künstlichen Niere verwendet werden, wobei man kultivierte Endothelzellen und Nierenzellen, die vom Subjekt isoliert worden sind, verwendet. Die künstliche rekonstruierte Niere kann dem Subjekt für eine weitere Entwicklung reimplantiert werden.
II. Dezellularisierung von Biostrukturen
Biostrukturen, z. B. vollständige Organe oder Teile von Organen, können dezellularisiert werden, indem man den gesamten Zell- und Gewebeanteil aus dem Organ gemäß den Angaben in Beispiel 1 entfernt. Das Dezellularisierungsverfahren umfasst eine Reihe von sequenziellen Extraktionen. Ein Schlüsselmerkmal dieses Extraktionsverfahrens besteht darin, dass eine schroffe Extraktion, die die komplexe Infrastruktur der Biostruktur beeinträchtigen oder zerstören kann, vermieden wird. Die erste Stufe beinhaltet die Entfernung von zellulären Bruchstücken und die Solubilisierung der Zellmembran. Daran schließt sich eine Solubilisierung der nuklearen zytoplasmatischen Komponenten und der nuklearen Komponenten an.
Vorzugsweise wird die Biostruktur, z. B. ein Organ, dezellularisiert, indem man die Zellmembran und das Organ umgebende zelluläre Bruchstücke unter Anwendung milder mechanischer Aufbrechverfahren entfernt. Die milden mechanischen Aufbrechverfahren müssen ausreichen, die zelluläre Membran aufzubrechen. Jedoch sollte das Verfahren der Dezellularisierung eine Schädigung oder Störung der komplexen Infrastruktur der Biostruktur vermeiden. Milde mechanische Aufbrechverfahren umfassen das Abschaben der Oberfläche des Organs, das Bewegen des Organs oder das Rühren des Organs in einem geeigneten Volumen eines Fluids, z. B. in destilliertem Wasser. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das milde mechanische Aufbrechverfahren ein magnetisches Rühren (z. B. unter Verwendung eines magnetischen Rührstabs und einer Magnetrührerplatte) des Organs in einem geeigneten Volumen an destilliertem Wasser, bis die Zellmembran aufgebrochen ist und die zellulären Bruchstücke aus dem Organ entfernt worden sind.
Nachdem die Zellmembran entfernt worden ist, werden die nuklearen und zytoplasmatischen Bestandteile der Biostruktur entfernt. Dies kann durchgeführt werden, indem man die zellulären und nuklearen Komponenten ohne Aufbrechen der Infrastruktur solubilisiert. Zur Solubilisierung der nuklearen Komponenten können nicht-ionische Detergentien oder oberflächenaktive Mittel verwendet werden. Zu Beispielen für nicht-ionische Detergentien oder oberflächenaktive Mittel gehören (ohne Beschränkung hierauf) Produkte der Triton-Reihe der Firma Rohm und Haas, Philadelphia, Pa., wozu Triton X-100, Triton N-101, Triton X-114, Triton X-405, Triton X-705 und Triton DF-16 gehören, die von zahlreichen Vertreibern bezogen werden können; Produkte der Tween-Reihe, wie Monolaurat (Tween 20), Monopalmitat (Tween 40), Monooleat (Tween 80) und Polyoxyethylen-23-laurylether (Brij. 35), Polyoxyethylenether W-1 (Polyox) und dergl., Natriumcholat, Desoxycholate, CHAPS, Saponin, n-Decyl-β-D-glucopyranosid, n-Heptyl-β-D-glucopyranosid, n-Octyl-α-D-glucopyranosid und Nonidet P-40.
Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass sich eine Beschreibung von Verbindungen, die unter die vorstehenden Klassifikationen fallen, und die entsprechenden Lieferanten sich in folgenden Literaturstellen finden: "Chemical Classification, Emulsifiers and Detergents", McCutcheon's Emulsifiers and Detergents, 1986, North American and International Editions, McCutcheon Division, MC Publishing Co., Glen Rock, N. J., USA und Judith Neugebauer, "A Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry", Calbiochem, Hoechst Celanese Corp., 1987. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich beim nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel um ein Produkt der Triton-Reihe, vorzugsweise um Triton X-100.
Die Konzentration des nicht-ionischen Detergens kann je nach dem Typ der der Dezellularisation zu unterziehenden Biostruktur verändert werden. Beispielsweise sollte für empfindliche Gewebe, wie Blutgefäße, die Konzentration des Detergens verringert werden. Bevorzugte Konzentrationsbereiche für nicht-ionische Detergentien können etwa 0,001 bis etwa 2,0% (Gew./Vol.), insbesondere 0,05 bis etwa 1,0% (Gew./Vol.) und ganz besonders etwa 0,1 bis etwa 0,8% (Gew./Vol.) betragen. Ganz besonders bevorzugt ist ein Bereich von etwa 0,001 bis etwa 0,2% (Gew./Vol.) und am meisten bevorzugt ein Bereich von etwa 0,05 bis etwa 0,1% (Gew./Vol.).
Die zytoskelettale Komponente, die dichte zytoplasmatische Filament-Netzwerke, interzelluläre Komplexe und apikale mikrozelluläre Strukturen umfasst, kann unter Verwendung einer alkalischen Lösung, wie Ammoniumhydroxid, solubilisiert werden. Weitere Alkalilösungen, die aus Ammoniumsalzen oder deren Derivaten bestehen, können ebenfalls zur Solubilisierung der zytoskelettalen Komponenten verwendet werden. Zu Beispielen für weitere geeignete Ammoniumlösungen gehören Lösungen von Ammoniumsulfat, Ammoniumacetat und Ammoniumhydroxid. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird Ammoniumhydroxid verwendet.
Die Konzentration der alkalischen Lösungen, z. B. Ammoniumhydroxid, kann je nach dem Typ der zu dezellularisierenden Biostruktur verändert werden. Beispielsweise sollte bei empfindlichen Geweben, wie Blutgefäßen, die Konzentration des Detergens verringert werden. Bevorzugte Konzentrationsbereiche können etwa 0,001 bis etwa 2,0% (Gew./Vol.), insbesondere etwa 0,005 bis etwa 0,1% (Gew./Vol.) und ganz besonders etwa 0,01 bis etwa 0,08% (Gew./Vol.) betragen.
Die dezellularisierte, lyophilisierte Struktur kann bei einer geeigneten Temperatur gelagert werden, bis sie benötigt wird. Vor der Verwendung kann die dezellularisierte Struktur in einem geeigneten isotonischen Puffer oder einem Zellkulturmedium äquilibriert werden. Zu geeigneten Puffern gehören (ohne Beschränkung hierauf) phosphatgepufferte Kochsalzlösungen (PBS), Kochsalzlösung, MOPS, HEPES, ausgewogene Hank-Salzlösung und dergl. Zu geeigneten Zellkulturmedien gehören (ohne Beschränkung hierauf) RPMI 1640, Fisher-Medium, Iscove-Medium, McCoy-Medium, Dulbecco-Medium und dergl.
III. Kultivieren von Zellen
Beim rekonstruierten künstlichen Organ kann es sich um ein allogenes Organ handeln, wobei sich die Zellpopulationen vom eigenen Gewebe des Subjekts ableiten. Beispielsweise können Endothelzellen sich von Haut-, Leber-, Bauchspeicheldrüse-, Arterien-, Venen-, Nabelschnur- oder Plazentageweben des Subjekts ableiten. Nierenzellen können sich auch von einer funktionsgestörten Niere des Subjekts ableiten und in vitro kultiviert werden.
Das rekonstruierte künstliche Organ kann auch xenogen sein, wobei sich die Zellpopulationen von einer Säugetierspezies, die sich von der des Subjekts unterscheiden, ableiten. Beispielsweise können die verschiedenen Zellen von Organen von Säugern, wie Affen, Hunden, Katzen, Mäusen, Ratten, Rindern, Pferden, Schweinen, Ziegen und Schafen, abgeleitet sein.
Derartige Organe lassen sich durch entsprechende Biopsie oder bei der Autopsie erhalten. Organe aus Leichen können zur Bereitstellung einer Quelle für Endothelzellen und Elemente verwendet werden. Bei den isolierten Zellen handelt es sich vorzugsweise um autologe Zellen, die durch Biopsie vom Subjekt erhalten worden sind. Beispielsweise kann es sich um eine Biopsie von Skelettmuskel aus dem Arm, dem Unterarm oder den unteren Extremitäten oder aus glattem Muskel aus dem behandelten Bereich handeln, wobei eine lokale Anästhesie mit einer geringen Menge an subkutan injiziertem Lidocain vorgenommen wird. Anschließend werden die Zellen in Kultur expandiert. Die Biopsieprobe kann unter Verwendung einer Biopsienadel, einer rasch wirkenden Nadel, durch die das Verfahren rasch und einfach gestaltet wird, erhalten werden. Der kleine Biopsiekern von Skelettmuskel oder glatter Muskulatur kann sodann expandiert und kultiviert werden. Zellen von Verwandten oder anderen Spendern der gleichen Spezies können ebenfalls bei geeigneter Immunosuppression verwendet werden.
Verfahren zum Isolieren und Kultivieren von Zellen werden von Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, 2. Auflage, A. R. Liss, Inc., New York, 1987, Kapitel 9, S. 107–126, erörtert. Zellen können unter Anwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren isoliert warden. Beispielsweise kann das Gewebe oder das Organ mechanisch disaggregiert und/oder mit Verdauungsenzymen und/oder chelatbildenden Mitteln, die die Verbindungen zwischen benachbarten Zellen schwächen, behandelt werden, was es ermöglicht, das Gewebe zu einer Suspension von individuellen Zellen ohne ein merkliches Aufbrechen von Zellen zu dispergieren. Eine enzymatische Dissoziation kann durch Zerkleinern des Gewebes und Behandeln des zerkleinerten Gewebes mit einer Reihe von Verdauungsenzymen entweder allein oder in Kombination erreicht werden. Hierzu gehören (ohne Beschränkung hierauf) Trypsin, Chymotrypsin, Collagenase, Elastase und/oder Hyaluronidase, DNase, Pronase und Dispase. Ein mechanisches Aufbrechen kann auch durch eine Anzahl von Verfahren erreicht werden, wozu (ohne Beschränkung hierauf) ein Abschaben der Oberfläche des Organs, die Verwendung von Schleifvorrichtungen, Mischern, Sieben, Homogenisatoren, Druckzellen oder Ultraschallvorrichtungen gehören, um nur einige aufzuführen.
Zu bevorzugten Zelltypen gehören (ohne Beschränkung hierauf), Nierenzellen, Urothelialzellen, mesenchymale Zellen, insbesondere Zellen von glatter Muskulatur oder Skelettmuskeln, Myozyten (Muskelstammzellen), Fibroblasten, Chondrozyten, Adipozyten, Fibromyoblasten und ektodermale Zellen, einschließlich duktile und Hautzellen, Hepatozyten, Inselzellen, im Darm vorliegende Zellen und andere parenchymale Zellen, Nervenzellen, Osteoblasten und andere Zellen, die Knochen oder Knorpel bilden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden humane Endothelzellen isoliert. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden humane Nierenzellen isoliert. Nierenzellen sämtlicher Entwicklungsstadien, wie fötale, neonatale, juvenile bis adulte Zellen, können verwendet werden.
Nachdem das Gewebe zu einer Suspension von individuellen Zellen zerkleinert worden ist, kann die Suspension zu Subpopulationen fraktioniert werden, aus denen die Zellelemente erhalten werden können. Dies kann ebenfalls unter Anwendung üblicher Techniken für die Zellseparation erfolgen, einschließlich (ohne Beschränkung hierauf) Klonierung und Selektion von spezifischen Zelltypen, selektive Zerstörung von unerwünschten Zellen (negative Selektion), Trennung auf der Grundlage der differenziellen Zellagglutinierbarkeit in der Mischpopulation, Einfrier-Auftau-Verfahren, differenzielle Hafteigenschaften der Zellen in der Mischpopulation, Filtration, herkömmliche und zonale Zentrifugation, zentrifugale Elutriation (Gegenstrom-Zentrifugation), Schwerkrafttrennung, Gegenstromverteilung, Elektrophorese und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (vergl. z. B. Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Techniques, 2. Auflage, A. R. Liss, Inc., New York, Kapitel 11 und 12 (1987), S. 137–168). Beispielsweise können Endothelzellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung angereichert werden. Gleichermaßen können auch Nierenzellen angereichert werden.
Eine Zellfraktionierung kann beispielsweise auch wünschenswert sein, wenn der Spender Krankheiten hat, wie Nierenkrebs oder Metastasen anderer Tumoren in der Niere. Eine Nierenzellpopulation kann sortiert werden, um maligne Nierenzellen oder andere Tumorzellen von normalen nicht-krebsartigen Nierenzellen abzutrennen. Die normalen, nicht-krebsartigen Nierenzellen, die durch eine oder mehrere Sortierungstechniken isoliert worden sind, können sodann für die Nierenrekonstruktion verwendet werden.
Isolierte Zellen können in vitro gezüchtet werden, um die Anzahl an Zellen, die für die Infusion in das dreidimensionale Gerüst zur Verfügung stehen, zu erhöhen. Die Verwendung von allogenen Zellen und insbesondere von autologen Zellen wird bevorzugt, um eine Gewebeabstoßung zu verhindern. Wenn es jedoch beim Subjekt nach der Implantation des rekonstruierten künstlichen Organs zu einer immunologischen Reaktion kommt, kann das Subjekt mit immunosuppressiven Mitteln, z. B. Cyclosporin oder FK506, behandelt werden, um die Wahrscheinlichkeit einer Abstoßung zu verringern. Bei bestimmten Ausführungsformen können chimäre Zellen oder Zellen eines transgenen Tieres in das dreidimensionale Gerüst perfundiert werden.
Isolierte Zellen können sodann vor Beschichtung mit dem genetischen Material transfiziert werden. Bei einem geeigneten genetischen Material kann es sich beispielsweise um genetische Sequenzen handeln, die dazu befähigt sind, eine Immunreaktion im Wirt zu verringern oder zu beseitigen. Beispielsweise kann die Expression von Zelloberflächenantigenen, wie der Histokompatibilitäts-Antigene der Klasse I und der Klasse II, unterdrückt werden. Dies ermöglicht es, dass die transplantierten Zellen einer verringerten Gefahr der Abstoßung durch den Wirt unterliegen. Ferner kann eine Transfektion auch für die Genabgabe herangezogen werden. Endotheliale und/oder Nierenzellen können mit spezifischen Genen transfiziert werden, bevor sie in das dreidimensionale Gerüst infundiert werden. Das künstliche rekonstruierte Organ kann genetische Informationen tragen, die für das Langzeitüberleben des Wirts oder des rekonstruierten künstlichen Organs erforderlich sind.
Die auf dem Gerüst gezüchteten endothelialen Zellen können gentechnisch so manipuliert sein, dass sie Genprodukte erzeugen, die für die Transplantation günstig sind, z. B. entzündungshemmende Faktoren, wie anti-GM-CSF, anti-TNF, anti-IL-1 und anti-IL-2. Alternativ können die endothelialen Zellen gentechnisch so manipuliert sein, dass sie die Expression der nativen Genprodukte ausschalten, die eine Entzündung fördern, z. B. GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, oder die Expression von MHC ausschalten, um die Gefahr einer Abstoßung zu vermindern. Ferner können die endothelialen Zellen gentechnisch zur Verwendung bei der Gentherapie manipuliert werden, um den Grad der Genaktivität in einem Patienten einzustellen, um die Ergebnisse der Gewebetransplantation zu unterstützen oder diese zu verbessern.
Verfahren zur gentechnischen Manipulation von Zellen mit retroviralen Vektoren, Polyethylenglycol oder anderen Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, können herangezogen werden. Hierzu gehört die Verwendung von Expressionsvektoren, die Nucleinsäuremoleküle in den Zellen transportieren und exprimieren (vergl. Goeddel, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology, Bd. 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)
Vektor-DNA wird in prokaryontische oder eukaryontische Zellen über herkömmliche Transformations- oder Transfektionstechniken eingeführt. Geeignete Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen finden sich bei Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), und in anderen Laboratoriumshandbüchern.
Zellen, die erfindungsgemäß auf dem dreidimensionalen Gerüst und der endothelialen Gewebeschicht, die ein primitives Gefäßsystem umfasst, gezüchtet worden sind, wachsen in mehrfachen Schichten und bilden eine zelluläre Matrix, die dem in vivo auftretenden physiologischen Zuständen ähnlich ist. Das dreidimensionale Gerüst und die endotheliale Gewebeschicht, die das primitive Gefäßsystem umfasst, können die Proliferation verschiedener Typen von Zellen und die Bildung einer Anzahl von verschiedenen Geweben unterstützen. Zu Beispielen gehören (ohne Beschränkung hierauf) Knochenmark-, Haut-, Leber-, Bauchspeicheldrüse-, Nieren-, Nebennieren- und neurologische Gewebe sowie Gewebe des gastrointestinalen und urogenitalen Trakts und des Kreislaufsystems.
Wenn das künstliche rekonstruierte Organ für in vivo-Transplantationen oder Implantationen verwendet werden soll, kann es bevorzugt sein, die endothelialen Zellen oder parenchymalen Zellen von dem Individuum, das das Transplantat oder Implantat erhalten soll, zu gewinnen. Diese Vorgehensweise kann sich als besonders vorteilhaft in den Fällen erweisen, bei denen eine immunologische Abstoßung des Transplantats und/oder eine Graft-versus-Host-Krankheit wahrscheinlich sind.
Nach der Perfusion auf das dreidimensionale Gerüst kommt es zu einer Vermehrung und Entwicklung der Endothelzellen auf dem Gerüst unter Bildung einer endothelialen Gewebeschicht. Während der in vitro-Züchtung kommt es zu einer Entwicklung und Differenzierung der Endothelzellen unter Erzeugung eines primitiven Gefäßsystems, das dazu in der Lage ist, sich zu einem reifen Gefäßsystem zu entwickeln, und auch dazu befähigt ist, das Wachstum von Parenchymzellen, die in das dreidimensionale Gerüst perfundiert werden, zu unterstützen. Wichtig ist, dass aufgrund der Tatsache, dass das dreidimensionale Gerüst eine Infrastruktur aufweist, die es dem Kulturmedium ermöglicht, die Endothelgewebeschicht und die Parenchymzellen zu erreichen, die verschiedenen Zellpopulationen weiter wachsen, sich teilen und funktionell aktiv bleiben. Die Parenchymzellen unterliegen einer Vermehrung und Differenzierung zu neomorphen Organstrukturen, die eine Morphologie aufweisen, die der analogen in vivo-Struktur ähnlich ist.
Es ist wichtig, in der Kultur die zelluläre Mikroumgebung, die in vivo für das spezielle zu rekonstruierende Organ vorliegt, zu schaffen. Erfindungsgemäß wird ein Verfahren bereitgestellt, bei dem ein dezellularisiertes Organ zur Rekonstruktion eines künstlichen Organs verwendet wird. Unter Verwendung eines dezellularisierten Organs bleibt die komplexe Infrastruktur erhalten, die es den perfundierten, kultivierten Zellpopulationen ermöglicht, an das dreidimensionale Gerüst zu binden. Die Aufrechterhaltung einer Infrastruktur, die ähnlich oder gleich wie bei einem in vivo-Organ ist, schafft die optimale Umgebung für Zell-Zell-Wechselwirkungen und die Entwicklung und Differenzierung von Zellpopulationen. Das Ausmaß, in dem die Endothelzellen und Parenchymzellen vor der in vivo-Verwendung wachsen, kann je nach dem Typ des zu rekonstruierenden Organs variieren.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zum Rekonstruieren eines künstlichen Organs bereitgestellt, wobei man ein dreidimensionales Gerüst mit einer Endothelgewebeschicht, die ein primitives Gefäßsystem umfasst, verwendet. Dieses Gerüst stützt die Reifung, Entwicklung und Differenzierung von zusätzlichen, in vitro-gezüchteten Zellen unter Bildung von Komponenten von erwachsenen Geweben, die zu ihren in vivo-Gegenstücken analog sind. Das dreidimensionale Gerüst ermöglicht optimale Zell-Zell-Wechselwirkungen, wobei es eine natürlichere Bildung von zellulären Phänotypen und einer Gewebemikroumgebung ermöglicht. Das dreidimensionale Gerüst ermöglicht ferner den Endothelzellen, ihr Wachstum in aktiver Weise fortzusetzen, sich zu vermehren und sich unter Bildung eines primitiven Gefäßsystems zu differenzieren. Dieses primitive Gefäßsystem ist zu einer weiteren Entwicklung befähigt und auch dazu befähigt, das Wachstum, die Vermehrung und die Differenzierung von zusätzlichen gezüchteten Zellpopulationen zu unterstützen, beispielsweise von gezüchteten Parenchym-Gewebezellpopulationen, wodurch eine lokalisierte Mikroumgebung geschaffen wird, die für ein in vivo-Gewebe förderlicher ist.
IV. Schaffung des dreidimensionalen Endothelgewebes
Das dreidimensionale Gerüst wird durch den Vorgang der in Abschnitt II beschriebenen Dezellularisierung erzeugt. Das dezellularisierte, dreidimensionale Gerüst behält die Gestalt der dezellularisierten Biostruktur und ermöglicht den kultivierten Zellen, sich daran anzuheften und im oder am Gerüst zu wachsen. Das dezellularisierte dreidimensionale Gerüst kann vor der Perfusion mit kultivierten Endothelzellen beispielsweise mit Kollagen vorbehandelt werden, um die Haftung von Endothelzellen am dreidimensionalen Gerüst zu verstärken.
Endothelzellen werden in das Gerüst perfundiert, indem man Nadeln verwendet, die an lokalisierten Positionen im dreidimensionalen Gerüst platziert werden. Diese Endothelzellen können sich von Organen, wie Haut, Leber und Bauchspeicheldrüse, die durch Biopsie (sofern zutreffend) oder bei einer Autopsie erhältlich sind, ableiten. Endothelzellen können auch aus einem beliebigen Organ einer Leiche erhalten werden. Die Endothelzellen können durch in vitro-Kultivieren bis zur erwünschten Zelldichte expandiert werden, bevor die Infusion in das dreidimensionale Gerüst vorgenommen wird.
Endothelzellen lassen sich leicht isolieren, indem man ein entsprechendes Organ oder Gewebe, das als Quelle für die Zellen dienen soll, disaggregiert. Dies kann unter Anwendung von dem Fachmann geläufigen Techniken erfolgen. Beispielsweise kann das Gewebe oder Organ mechanisch disaggregiert werden und/oder mit Verdauungsenzymen behandelt werden und/oder mit chelatbildenden Mitteln behandelt werden, die die Verbindungen zwischen benachbarten Zellen lockern, was es ermöglicht, das Gewebe zu einer Suspension von individuellen Zellen zu dispergieren, ohne dass es zu einer nennenswerten Zerstörung von Zellen kommt. Eine enzymatische Dissoziation kann erreicht werden, indem man das Gewebe zerkleinert und das zerkleinerte Gewebe mit einem aus einer Anzahl aus Verdauungsenzymen ausgewählten Enzym entweder allein oder in Kombination behandelt. Zu diesen Enzymen gehören (ohne Beschränkung hierauf) Trypsin, Chymotrypsin, Collagenase, Elastase und/oder Hyaluronidase, DNase, Pronase und Dispase. Ein mechanisches Aufbrechen kann auch durch eine Anzahl von Verfahren erreicht werden, wozu (ohne Beschränkung hierauf) die Verwendung von Schleifvorrichtungen, Mischvorrichtungen, Sieben, Homogenisatoren, Druckzellen oder Ultraschallvorrichtungen gehören, um nur einige aufzuzählen (vergl. z. B. Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, 2. Auflage, A. R. Liss, Inc., New York, Kapitel 9 (1987), S. 107–126).
Nach Zerlegen des Gewebes zu einer Suspension von individuellen Zellen kann die Suspension zu Unterpopulationen fraktioniert werden, aus denen sich die Endothelzellen erhalten lassen. Dies kann auch durch übliche Techniken zur Zellseparation erfolgen, wozu (ohne Beschränkung hierauf) das Klonieren und die Auswahl von spezifischen Zelltypen, die selektive Zerstörung von unerwünschten Zellen (negative Selektion), die Trennung auf der Grundlage der differenziellen Zellagglutinierbarkeit in der gemischten Population, Einfrier-Auftau-Verfahren, die Ausnutzung von differenziellen Hafteigenschaften der Zellen in der gemischten Population, die Filtration, eine herkömmliche und zonale Zentrifugation, die zentrifugale Elutriation (Gegenstrom-Zentrifugation), die Schwerkrafttrennung, die Gegenstromverteilung, die Elektrophorese und die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung gehören (vergl. z. B. Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, 2. Auflage, A. R. Liss, Inc., New York, Kapitel 11 und 12 (1987), S. 137–168).
Das Wachstum von Zellen im dreidimensionalen Gerüst kann verstärkt werden, indem man das dreidimensionale Gerüst mit Proteinen (z. B. Collagenen, elastischen Fasern, retikulären Fasern), Glycoproteinen, Glycosaminoglycanen (z. B. Heparansulfat, Chondroitin-4-sulfat, Chondroitin-6-sulfat, Dermatansulfat, Keratinsulfat und dergl.), einer zellulären Matrix und/oder anderen Materialien versetzt oder beschichtet.
Nach Perfusion der Endothelzellen sollte das dreidimensionale Gerüst in einem geeigneten Nährmedium inkubiert werden. Für die Verwendung eignen sich zahlreiche handelsübliche Medien, wie RPMI 1640, Fisher-Medium, Iscove-Medium, McCoy-Medium, Dulbecco-Medium und dergl. Das Kulturmedium soll periodisch ausgetauscht werden, um verbrauchtes Medium zu entfernen, eine Depopulation von freigesetzten Zellen vorzunehmen und frisches Medium zuzusetzen. Es ist wichtig, die Endothelzellen bis zu einem Stadium zu züchten, bei dem eine Endothelgewebeschicht, die ein primitives Gefäßsystem umfasst, sich entwickelt hat, bevor eine Perfusion der Endothelgewebeschicht mit den Parenchymzellen vorgenommen wird.
V. Perfusion von Parenchymzellen auf ein dreidimensionales endotheliales Gerüst
Nachdem die dreidimensionale Endothelgewebeschicht den geeigneten Wachstumsgrad erreicht hat und ein primitives Gefäßsystem entwickelt hat, können zusätzliche Populationen von kultivierten Zellen, wie Parenchymzellen auf die Endothelgewebeschicht perfundiert werden. Parenchymzellen, die auf das Endothelgewebe perfundiert worden sind, können inkubiert werden, um den Zellen die Haftung an der Endothelgewebeschicht zu ermöglichen. Die Parenchymzellen können in vitro in Kulturmedium kultiviert werden, um den Zellen das Wachstum und die Entwicklung zu ermöglichen, bis die Zellen in Bezug auf Morphologie und Struktur den Zellen des nativen Gewebes ähnlich geworden sind. Das Wachstum von Parenchymzellen auf der Endothelgewebeschicht führt zur Differenzierung von Parenchymzellen in geeignete neomorphe Organstrukturen.
Alternativ kann nach der Perfusion der dreidimensionalen Parenchymzellen das Gerüst in vivo implantiert werden, ohne dass in vitro die Parenchymzellen kultiviert werden. Die für die Perfusion gewählten Parenchymzellen hängen vom zu rekonstruierenden Organ ab. Beispielsweise beinhaltet die Rekonstruktion einer Niere die Infusion von kultivierten Endothelzellen in das dezellularisierte, dreidimensionale Nierengerüst, das kultiviert wird, bis sich eine Entwicklung zu einer Endothelgewebeschicht, die ein primitives Gefäßsystem umfasst, ergeben hat. Das Endothelgewebe kann sodann mit kultivierten Nierenzellen perfundiert werden und in vitro kultiviert werden, bis die Nierenzellen mit ihrer Differenzierung unter Bildung von Nephronstrukturen beginnen.
Die Parenchymzellen können aus Zellsuspensionen erhalten werden, die durch Disaggregation des erwünschten Gewebes unter Anwendung von Standardtechniken, wie sie vorstehend beschrieben wurden, erhalten worden sind. Die Zellen können sodann in vitro bis zur gewünschten Dichte kultiviert werden. Nach Erreichen der gewünschten Dichte können die kultivierten Zellen zur Perfusion des dreidimensionalen Gerüstes mit der Endothelgewebeschicht verwendet werden. Die Zellen unterliegen auf der Endothelgewebeschicht einer Vermehrung, Reifung und Differenzierung. Die Wahl der Parenchymzellen hängt von dem zu rekonstruierenden Organ ab. Beispielsweise werden bei Rekonstruktion einer künstlichen Niere das dreidimensionale Nierengerüst und die Endothelgewebeschicht mit kultivierten Nierenzellen perfundiert. Bei der Rekonstruktion einer künstlichen Leber werden das dreidimensionale Lebergerüst und die Endothelgewebeschicht mit kultivierten Hepatozyten perfundiert. Bei der Rekonstruktion einer künstlichen Bauchspeicheldrüse werden das dreidimensionale Bauchspeicheldrüsengerüst und die Endothelgewebeschicht mit kultivierten pankreatischen, endokrinen Zellen perfundiert. Bezüglich eines Überblicks über Verfahren, die zur Bildung von Parenchymzellen aus verschiedenen Geweben verwendet werden können, wird verwiesen auf Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique, 2. Auflg., A. R. Liss, Inc., New York, (1987), Kapitel 20, S. 257–288. Zellen werden kultiviert, bis sie unter Bildung von neomorphen Organstrukturen, deren Morphologie Ähnlichkeit mit dem nativen in vivo-Gewebe hat, differenzieren.
Wachstumsfaktoren und regulatorische Faktoren können dem Medium zugesetzt werden, um die Vermehrung und Zellreifung und die Differenzierung in den Kulturen zu verstärken oder zu modulieren. Das Wachstum und die Aktivität von Zellen in der Kultur kann durch verschiedene Wachstumsfaktoren beeinflusst werden, z. B. durch Insulin, Wachstumshormon, Somatomedine, kolonienstimulierende Faktoren, Erythropoietin, epidermaler Wachstumsfaktor, hepatischer erythropoietischer Faktor (Hepatopoietin) und Leberzellen-Wachstumsfaktor. Zu weiteren Faktoren, die die Vermehrung und/oder Differenzierung regulieren, gehören, Prostaglandine, Interleukine und in der Natur auftretende Chalone.
VI. Verwendung der rekonstruierten künstlichen Organe
Die erfindungsgemäßen rekonstruierten künstlichen Organe können für eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten eingesetzt werden. Die rekonstruierten künstlichen Organe können z. B. einem Subjekt implantiert werden. Erfindungsgemäße Implantate können als Ersatz oder als Ergänzung von vorhandenem Gewebe verwendet werden. Beispielsweise kann ein Subjekt, das an einer Nierenstörung leidet, behandelt werden, indem man die funktionsgestörte Niere des Subjekts durch eine künstliche rekonstruierte Niere ersetzt. Das Subjekt kann nach der Implantation der künstlichen Niere in Bezug auf die Besserung der Nierenstörung überwacht werden.
Die rekonstruierten künstlichen Organe können in vitro verwendet werden, um ein Screening auf eine Vielzahl von Verbindungen in Bezug auf Wirksamkeit und Zytotoxizität von pharmazeutischen Mitteln, chemischen Mitteln, Wachstums- und Regulationsfaktoren vorzunehmen. Die Kulturen können in vitro gehalten werden und der zu testenden Verbindung ausgesetzt werden. Die Aktivität einer zytotoxischen Verbindung kann aufgrund ihrer Fähigkeit zur Schädigung oder Abtötung von Zellen in Kultur gemessen werden. Dies kann leicht durch vitale Färbetechniken vorgenommen werden. Der Einfluss von Wachstums/Regulationsfaktoren kann durch Analyse des zellulären Gehalts der Matrix bestimmt werden, z. B. aufgrund der gesamten Zellzahl und der differenziellen Zellzahlen. Dies kann unter Anwendung üblicher zytologischer und/oder histologischer Techniken erfolgen, unter Einschluss der Anwendung immunozytochemischer Techniken unter Verwendung von Antikörpern, die typspezifische zelluläre Antigene definieren. Der Einfluss verschiedener Arzneistoffe auf normale Zellen, die in den rekonstruierten künstlichen Organen kultiviert werden, kann bestimmt werden.
Die rekonstruierten künstlichen Organe können in vitro verwendet werden, um wässrige Lösungen zu filtrieren. Beispielsweise kann eine rekonstruierte künstliche Niere zur Filtration von Blut verwendet werden. Die Verwendung der rekonstruierten Niere liefert ein System mit morphologischen Merkmalen, die den in vivo-Nierenprodukten ähnlich sind. Dieses System kann sich für die Hämodialyse eignen und kann daher bei der Entfernung von gelösten Bestandteilen im Blut von mittlerem Molekulargewicht, die durch übliche Hämodialysesysteme nicht entfernt werden können, wirksam sein. Das System kann sich auch zur Hämofiltration zur Entfernung von Wasser und niedermolekularen gelösten Bestandteilen aus Blut eignen. Die künstliche Niere kann in vitro gehalten werden und dem Blut ausgesetzt werden, das in die luminale Seite der künstlichen Niere infundiert werden kann. Die bearbeitete wässrige Lösung kann auf der abluminalen Seite der künstlichen Niere gesammelt werden. Die Wirksamkeit der Filtration kann durch Messung des Gehalts an Ionen oder an Stoffwechselabfallprodukten des filtrierten und des unfiltrierten Bluts bestimmt werden.
Die erfindungsgemäßen rekonstruierten künstlichen Organe können als Träger zur Einführung von Genen und Genprodukten in vivo verwendet werden, um die Ergebnisse der Transplantation zu unterstützen oder zu verbessern, und/oder sie können in der Gentherapie eingesetzt werden. Beispielsweise können die kultivierten Endothelzellen gentechnisch so manipuliert werden, dass sie Genprodukte exprimieren. Die Zellen können gentechnisch so manipuliert werden, dass sie Genprodukte vorübergehend und/oder unter induzierbarer Kontrolle oder als ein chimäres Fusionsprotein, das mit den Endothelzellen verankert ist, exprimieren, z. B. ein chimäres Molekül, das aus einer intrazellulären und/oder Transmembrandomäne eines Rezeptors oder rezeptorartigen Moleküls zusammengesetzt ist und mit dem Genprodukt als extrazellulärer Domäne fusioniert ist. Bei einer weiteren Ausführungsform können die Endothelzellen gentechnisch so manipuliert werden, dass sie ein Gen exprimieren, das beim Patienten fehlt oder das eine therapeutische Wirkung ausübt. Die Gene von Interesse, die durch genetische Techniken in die Endothelzellen oder Parenchymzellen eingeführt worden sind, müssen im Zusammenhang mit der zu behandelnden Krankheit stehen. Beispielsweise können für eine Nierenstörung die Endothelzellen oder kultivierten Nierenzellen gentechnisch so manipuliert werden, dass sie Genprodukte exprimieren, die zu einer Besserung der Nierenstörung führen.
Die Endothel- oder Parenchymzellen können gentechnisch manipuliert werden, indem man ein rekombinantes DNA-Konstrukt mit einem Gehalt an dem Gen von Interesse, das zur Transformation oder Transfektion von Endothel- oder Parenchymzellen verwendet wird, einsetzt. Das dreidimensionale Gerüst und die ein primitives Gefäßsystem umfassende Endothelgewebeschicht, die das aktive Genprodukt exprimiert, können einem Individuum, das einen Mangel an diesem Produkt aufweist, implantiert werden. Beispielsweise können Gene, die Symptome verschiedener Typen von Gefäßkrankheiten, Krankheiten des urogenitalen Trakts, Hernie-Krankheiten, gastrointestinalen Krankheiten oder Nierenkrankheiten verhindern oder bessern, unter diesen Krankheitsbedingungen unterexprimiert oder herunterreguliert werden. Der Grad der Genaktivität kann erhöht werden, indem man entweder die Konzentration des vorhandenen Genprodukts steigert oder die Konzentration des aktiven Genprodukts, das im dreidimensionalen Gerüst und Endothelgewebe vorhanden ist, steigert. Die dreidimensionale Kultur, die das aktive Zielgenprodukt exprimiert, kann sodann dem Patienten, der einen Mangel an diesem Produkt aufweist, implantiert werden.
Die dreidimensionalen Kulturen, die derartige, gentechnisch manipulierte Endothel- oder Parenchymzellen enthalten, werden sodann dem Subjekt implantiert, um eine Besserung der Symptome der Krankheit zu ermöglichen. Die Genexpression kann unter der Kontrolle eines nicht-induzierbaren (d. h. konstitutiven) oder induzierbaren Promotors stehen. Der Grad der Genexpression und der Typ des regulierten Gens können je nach den Behandlungsmodalitäten, die bei einem individuellen Patienten eingehalten werden, gesteuert werden.
Unter den Umfang der Erfindung fallen auch Zusammensetzungen und Verfahren zum Rekonstruieren von künstlichen Organen, die eine Population von kultivierten Zellen umfassen. Alternativ können die rekonstruierten künstlichen Konstrukte mehrfache Schichten von kultivierten Zellpopulationen umfassen. Zu Organen, die rekonstruiert werden können, gehören (ohne Beschränkung hierauf) Herz, Niere, Leber, Bauchspeicheldrüse, Milz, Blase, Harnleiter und Harnröhre.
Durch Aufnahme und Aufrechterhaltung der Parenchymgewebe im dreidimensionalen Gerüst und in der Endothelgewebeschicht, die das primitive Gefäßsystem umfasst, können die Parenchymgewebe zu neomorphen Organstrukturen differenzieren, die spezielle Struktur- und Funktionseigenschaften aufweisen, die für eine einwandfreie physiologische in vivo-Funktionsweise erforderlich sind. Die rekonstruierten künstlichen Organe simulieren die entsprechende biologische in vivo-Struktur und können als Ersatz für das geschädigte oder erkrankte in vivo-Organ dienen.
Beispiele
Beispiel 1: Herstellung einer dezellularisierten Niere
Das folgende Verfahren beschreibt den Vorgang der Entfernung des gesamten zellulären Inhalts eines Organs oder Gewebes ohne Zerstörung der komplexen dreidimensionalen Infrastruktur des Organs oder Gewebes. Eine Niere wurde auf chirurgischem Wege einer schwarzen C7-Maus unter Anwendung üblicher Techniken zur Gewebeentfernung entfernt. Die Niere wurde in einen Kolben gebracht, der ein geeignetes Volumen an destilliertem Wasser enthielt, um die isolierte Niere zu bedecken. Eine magnetische Rührplatte und ein Magnetrührer wurden dazu verwendet, die isolierte Niere in destilliertem Wasser bei einer geeigneten Drehzahl 24 bis 48 Stunden bei 4°C zu rotieren. Durch dieses Verfahren werden Zellbruchstücke und Zellmembranen, die die isolierte Niere umgeben, entfernt.
Nach diesem ersten Entfernungsschritt wurde das destillierte Wasser durch eine 0,05%ige Ammoniumhydroxidlösung mit einem Gehalt an 0,5% Triton X-100 ersetzt. Die Niere wurde 72 Stunden bei 4°C unter Verwendung einer magnetischen Rührplatte und eines Magnetrührers rotiert. Diese alkalische Lösung bewirkte eine Solubilisierung der nuklearen und zytoplasmatischen Komponenten der isolierten Niere. Das Detergens Triton X-100 wurde zur Entfernung der nuklearen Komponenten der Niere verwendet, während die Ammoniumhydroxidlösung zur Lysis der Zellmembran und der zytoplasmatischen Proteine der isolierten Niere verwendet wurde.
Die isolierte Niere wurde sodann 24 bis 48 Stunden bei 4°C mit destilliertem Wasser unter Verwendung einer magnetischen Rührplatte und eines Magnetrührers gewaschen. Nach diesem Waschschritt wurde die Entfernung von zellulären Komponenten aus dem Isolat durch histologische Analyse eines kleinen Nierenstückes bestätigt. Gegebenenfalls wurde die isolierte Niere erneut mit der Ammoniumhydroxidlösung mit einem Gehalt an Triton X-100 behandelt, bis der gesamte zelluläre Inhalt der isolierten Niere entfernt war. Nach Entfernung der solubilisierten Komponenten entstand ein kollagenöses, dreidimensionales Gerüst in Gestalt der isolierten Niere.
Diese dezellularisierte Niere wurde mit 1 × Phosphatpufferlösung (PBS) äquilibriert, wobei die dezellularisierte Niere über Nacht bei 4°C unter Verwendung einer Magnetrührplatte und eines Magnetrührers rotiert wurde. Nach der Äquilibration wurde die dezellularisierte Niere über Nacht unter Vakuum lyophilisiert. Die lyophilisierte Niere wurde 72 Stunden unter Verwendung von Ethylenoxidgas sterilisiert. Nach der Sterilisation wurde die dezellularisierte Niere entweder sofort verwendet oder bei 4°C oder bei Raumtemperatur aufbewahrt, bis sie benötigt wurde. Gelagerte Organe wurden in Gewebekulturmedium über Nacht bei 4°C äquilibriert, bevor sie mit gezüchteten Zellen beimpft wurden.
Beispiel 2: Isolierung von Nierenzellen
Kleine Nieren, z. B. von schwarzen C7-Mäusen mit einem Alter von 1 Woche, wurden entkapselt, zerschnitten, zerkleinert und in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, Sigma, St. Louis, MO) mit einem Gehalt an 15 mM Hepes, pH-Wert 7,4, 0,5 μg/ml Insulin, 1,0 mg/ml Collagenase und 0,5 mg/ml Dispase, einer neutralen Protease aus Bacillus polymyxa (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), suspendiert.
Große Nieren, z. B. Schweinenieren, wurden arteriell 10 Minuten bei 37°C mit calciumfreiem Eagle-Minimalessentialmedium während einer 3-stündigen Extraktion perfundiert. Die Nieren wurden sodann mit 0,5 mg/ml Collagenase (Typ IV, Sigma, St. Louis, MO) im gleichen Puffer, der mit 1,5 mM MgCl₂ und 1,5 mM CaCl₂ ergänzt war, perfundiert. Anschließend wurden die Nieren entkapselt, zerschnitten, zerkleinert und in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, Sigma, St. Louis, MO) mit einem Gehalt an 15 mM Hepes, pH-Wert 7,4 und 0,5 μg/ml Insulin, 1,0 mg/ml Collagenase und 0,5 mg/ml Dispase, einer neutralen Protease aus Bacillus polymyxa (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), suspendiert.
Die Nierenzellsuspension (entweder aus großen oder kleinen Nieren) wurde 30 Minuten bei 37°C in einem Wasserbad mäßig bewegt. Die Zellen und Fragmente wurden durch 5-minütige Zentrifugation mit 50 g gewonnen. Die Pellets wurden in DMEM mit einem Gehalt an 10% fötalem Kälberserum (Biowhittaker, Walkersville, Maryland) resuspendiert, um die Proteolyse zu stoppen. Die trübe Lösung wurde durch ein steriles Nylon-Sieb mit 80 mesh geleitet, um große Fragmente zu beseitigen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen und 2-mal mit calciumfreiem Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium gewaschen.
Beispiel 3: In vitro-Züchtung von Nierenzellen
(i) Isolierung von Rattenschwanz-Kollagen
Sehnen wurden aus Rattenschwänzen gezogen und in 0,12 M Essigsäure in entionisiertem Wasser in 50 ml fassenden Röhrchen 16 Stunden über Nacht bei 4°C aufbewahrt.
Dialysebeutel wurden vorbehandelt, um eine gleichmäßige Porengröße und die Entfernung von Schwermetallen zu gewährleisten. Kurz zusammengefasst, der Dialysebeutel wurde in eine Lösung von 2% Natriumbicarbonat und 0,05% EDTA getaucht und 10 Minuten einer Siedebehandlung unterzogen. Mehrfache Spülungen mit destilliertem Wasser wurden durchgeführt, um das Natriumbicarbonat und die 0,05% EDTA zu entfernen.
Die 0,12 M Essigsäurelösung mit den Rattensehnen wurde in die behandelten Dialysebeutel gebracht und 2 oder 3 Tage dialysiert, um die Essigsäure zu entfernen. Die Dialyselösung wurde alle 3 bis 4 Stunden ausgetauscht.
(ii) Beschichtung von Gewebekulturplatten
Die Kulturkolben (75 cm²) wurden mit einer Lösung mit einem Gehalt an etwa 30 μg/ml Kollagen (Vitrogen- oder Rattenschwanz-Kollagen), etwa 10 μg/ml humanem Fibronectin (Sigma, St. Louis, MO) und etwa 10 μg/ml Rinderserumalbumin (Sigma, St. Louis, MO) in einem Gesamtvolumen von etwa 2 ml des ergänzten Mediums unter 3-stündiger Inkubation bei 37°C beschichtet.
(iii) Zellkultur
Verdaute, suspendierte, renale Einzelzellen wurden auf eine modifizierte Kollagenmatrix in einer Konzentration von etwa 1 × 10⁶ Zellen/ml ausgestrichen und in DMEM, das mit etwa 10% fötalem Kälberserum, etwa 5 μg/ml Rinderinsulin, etwa 10 μg/ml Transferrin, etwa 10 μg/ml Natriumselenit, etwa 0,5 μM Hydrocortison, etwa 10 ng/ml Prostaglandin E₂, etwa 100 Einheiten/ml Penicillin G und etwa 100 μg/ml Streptomycin (Sigma, St. Louis, MO) ergänzt war, in einem 5%-CO₂-Inkubator bei etwa 37°C gezüchtet.
Konfluente Monolayers wurden einer Subkultur unterzogen, indem sie mit etwa 0,05% Trypsin, etwa 0,53 mM EDTA (Gibco BRL, Grand Island, NY) in calciumionenfreier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (etwa 1,51 mM KH₂PO₄, etwa 155,17 mM NaCl, etwa 2,8 mM Na₂HPO₄·7H₂O) behandelt wurden. Die Zellen können jederzeit nach der ersten Passage durch Suspension in etwa 10% DMSO in Kulturmedium gezüchtet werden, um sie einzufrieren und in flüssigem Medium zu lagern.
(iv) Behandlung von dezellularisierten Nieren mit Kollagen
Die dezellularisierte Nierenstruktur wurde mit einer Lösung mit einem Gehalt an etwa 30 μg/ml Kollagen (Vitrogen- oder Rattenschwanz-Kollagen), etwa 10 μg/ml humanem Fibronectin (Sigma, St. Louis, MO) und etwa 10 μg/ml Rinderserumalbumin (Sigma, St. Louis, MO) in ergänztem Medium perfundiert. Die mit Kollagen perfundierte dezellularisierte Nierenstruktur wurde 30 Minuten zusammen mit 1 ml konzentriertem Ammoniumhydroxid (etwa 28% bis etwa 30% NH₄OH, Sigma, St. Louis, MO) in einen Inkubator gebracht, um den pH-Wert zu erhöhen und die Gelbildung des Kollagens zu fördern. Nach der Behandlung mit Ammoniumhydroxid wurde die dezellularisierte Nierenstruktur gründlich mit isotonem Medium gewaschen, um den pH-Wert der dezellularisierten Nierenstruktur vor der Verwendung zu neutralisieren.
Beispiel 4: In vitro-Züchtung von Endothelzellen
Endothelzellen wurden aus einer präparierten Vene isoliert. Eine perivenöse Heparin/Papaverin-Lösung (3 mg Papaverin-HCl, verdünnt in 25 ml ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS) mit einem Gehalt an 100 Einheiten Heparin (Endkonzentration, 4 U/ml)) wurde zur Verbesserung der Konservierung der Endothelzellen verwendet. Eine proximale Seidenschlinge wurde um die Vene gelegt und befestigt. Eine kleine Venotomie wurde proximal zur Schlinge vorgenommen und die Spitze einer Venenkanüle wurde eingeführt und mit einer zweiten Schlinge befestigt. Eine kleine Venotomie wurde oberhalb der proximalen Schlinge vorgenommen und die Vene wurde vorsichtig mit Medium 199/Heparinlösung im Medium 199 (M-199), ergänzt mit 20% fötalem Kälberserum, ECGF (100 μg/ml), L-Glutamin, Heparin (Sigma, 17,5 U/ml) und Antibiotikum-Antimycotikum) gespült, um Blut und Blutgerinnsel zu entfernen. Etwa 1 ml einer Collagenase-Lösung (0,2% Worthington-Typ I-Collagenase, gelöst in 98 ml M-199, 1 ml FBS, 1 ml PSF, 15 bis 30 Minuten bei 37°C und steril filtriert) wurde dazu verwendet, die präparierte Vene zu durchspülen. Die Collagenase-Lösung wurde ferner dazu verwendet, die Vene aufzuweiten. Die aufgeweitete Vene wurde in ein 50 ml fassendes Röhrchen mit einem Gehalt an ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS) gebracht. Das Röhrchen mit der mit Collagenase aufgeweiteten Vene wurde 12 Minuten bei 37°C inkubiert, um die innere Auskleidung der Vene zu verdauen. Nach dem Verdau wurde der Inhalt der Vene, der Endothelzellen enthält, in ein steriles, 15 ml fassendes Röhrchen gebracht. Die Endothelzellsuspension wurde 10 Minuten mit 125 × g zentrifugiert. Sodann wurden die Endothelzellen mit 2 ml Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium mit einem Gehalt an 10% FBS und Penicillin/Streptomycin (DMEM/10% FBS) resuspendiert und auf eine Platte mit 24 Vertiefungen, die mit 1% Difco-Gelatine beschichtet war, ausgestrichen. Die Endothelzellen wurden über Nacht bei 37°C inkubiert.
Nach der Inkubation über Nacht wurden die Zellen mit HBSS gespült und in 1 ml frisches DMEM/10% FBS gebracht. Das Medium wurde 3-mal wöchentlich ausgetauscht. Nachdem die Kulturen den konfluenten Zustand erreicht hatten (etwa 3–7 Tage) wurden die konfluenten Monolayers durch Behandlung mit 0,05% Trypsin, 0,53 mM EDTA, 3–5 Minuten einer Subkultur unterzogen, bis die Zellen dispergiert waren. Die dispergierten Zellen wurden auf mit 0,1% Difco-Gelatine beschichtete Kulturplatten in einem Aufteilverhältnis von 1:4–1:6 ausgestrichen. Die Endothelzellen wurden expandiert, bis ausreichende Zellmengen zur Verfügung standen. Die Zellen wurden für die Überimpfung trypsiniert, gewonnen, gewaschen und gezählt.
Beispiel 5: Rekonstruktion einer künstlichen Niere
Eine Niere wurde auf chirurgischem Wege entfernt und gemäß Beispiel 1 dezellularisiert. Die dezellularisierte Nierenstruktur wurde als ein Gerüst zur Rekonstruktion einer künstlichen Niere verwendet. Endothelzellen wurden in vitro gemäß den Angaben in Beispiel 4 kultiviert und expandiert. Die Endothelzellensuspension wurde vorsichtig unter Verwendung von Nadeln, die in die dezellularisierte Nierenstruktur eingeführt worden waren, perfundiert. Die dezellularisierte Nierenstruktur wurde mit etwa 10 × 10⁶ Zellen pro cm³ perfundiert und bei 37°C unter 5% CO₂ inkubiert, bis die Zellen an der Matrix hafteten und wuchsen. Die Struktur wurde etwa 3 Tage bei 37°C unter 5% CO₂ inkubiert, bis eine Schicht von Endothelzellen mit einem primitiven Gefäßsystem entstanden war. Das Medium wurde häufig ausgetauscht, beispielsweise etwa täglich, etwa alle 2 Tage oder etwa alle 3 Tage.
Nierenzellen wurden gemäß den Angaben in Beispiel 3 zehn Tage in vitro kultiviert und expandiert. Die Zellen wurden durch Trypsinverdau unter Verwendung von 0,05% Trypsin, etwa 0,53 mM EDTA (Gibco BRL, Grand Island, NY) in calciumionenfreier, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (etwa 1,51 mM KH₂PO₄, etwa 155,17 mM NaCl, etwa 2,8 mM Na₂HPO₄·7H₂O) geerntet. Nach 10-minütigem Verdau bei 37°C wurden die Zellen in DMEM-Medium in einer Konzentration von etwa 5 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. Die Nierenzellsuspension wurde anschließend vorsichtig über die Endothelzellschicht unter Verwendung von Nadeln, die in die dezellularisierte Struktur eingeführt worden waren, perfundiert. Die dezellularisierte Nierenstruktur, die mit etwa 10 × 10⁶ Zellen/cm³ perfundiert war, wurde bei 37°C unter 5% CO₂ inkubiert, bis die Zellen hafteten und wuchsen. Die Struktur wurde etwa 3 Tage bis etwa 10 Tage bei 37°C unter 5% CO₂ inkubiert, bis die Nierenzellen begannen, sich zu Nieren-Tubulizellen zu differenzieren.
Eine künstliche Niere kann auch unter Verwendung eines Bioreaktorsystems rekonstruiert werden. Einzelne, suspendierte Nierenzellen wurden auf eine dezellularisierte Nierenmatrix überimpft.
Man ließ die Zellen 2 Stunden bei 37°C an der Matrixwand haften. Nach beendeter Inkubation wurde langsam Medium in den Kolben gegeben, um die gesamte Matrix zu bedecken, wobei darauf geachtet wurde, dass die Zellen innerhalb der Matrix nicht gestört wurden. Das Medium wurde täglich oder häufiger ausgetauscht, und zwar in Abhängigkeit von der Milchsäurekonzentration. Am 4. Tag nach der ursprünglichen Beimpfung wurde das Zellmatrixsystem in ein zirkulierendes Bioreaktorsystem gebracht. Der Infusionsschlauch wurde mit der Nieren-Hauptarterie verbunden und der Rückleitungsschlauch wurde mit der Nieren-Hauptvene verbunden. Zusätzliche einzelne Nierenzellen wurden durch die Nieren-Hauptarterien-Matrix überimpft. Nach Infusion der zusätzlichen Zellen wurde der Bioreaktor 2 Stunden abgestellt, um den Zellen die Haftung an der Matrix zu ermöglichen. Die Infusion mit dem Medium wurde bei einer niedrigen Infusionsgeschwindigkeit begonnen, um ein Aufbrechen von Zellen zu vermeiden. Die Zellen ließ man 3 oder 4 Tage fest an der Matrix haften.
Nachdem die Nierenzellen in die dezellularisierte Niere überimpft worden waren, wurden glatte Muskelzellen überimpft. Die äußere Nieren-Hauptarterie und -vene wurden direkt auf der Oberfläche der Gefäße beimpft. Die internen Gefäßstrukturen wurden durch die Nieren-Hauptarterie unter Anwendung von dem Fachmann geläufigen Infusionstechniken beimpft. Nach Infusion der glatten Muskelzellen wurde der Kreislauf durch den Bioreaktor 2 Stunden unterbrochen, um ein Anhaften der glatten Muskelzellen zu ermöglichen. Nach 2 Stunden wurde das Medium langsam durch das zirkulierende Bioreaktorsystem mit geringer Geschwindigkeit infundiert, um eine Bewegung der anhaftenden glatten Muskelzellen zu verhindern. Die glatten Muskelzellen brauchten mindestens 2 Tage, um sich an der Gefäßmatrix zu organisieren.
Nach der Organisation der glatten Muskelzellen wurden vaskuläre Endothelzellen auf die luminale Oberfläche von Blutgefäßen durch die Nieren-Hauptarterie überimpft. Der Kreislauf im Bioreaktor wurde 2 Stunden unterbrochen, um den Zellen ein Absetzen und ein Anhaften an der luminalen Gefäßwand zu ermöglichen. Sodann wurde das Kulturmedium durch das zirkulierende Bioreaktorsystem mit niedriger Geschwindigkeit infundiert, um eine Bewegung der Zellen zu vermeiden. Die Zellen brauchten mindestens 2 Tage, um sich an der Gefäßmatrix zu organisieren.
Urothelialzellen und glatte Muskelzellen, die das Sammelsystem bilden, wurden unter Anwendung einer Rückwärtsimpftechnik überimpft.
Einzelne suspendierte Urothelialzellen wurden durch den Harnleiter überimpft und glatte Muskelzellen wurden von der Serosaseite aus überimpft. Das Medium wurde in regelmäßigen Abständen während des Züchtungsvorgangs ausgetauscht und es sollte die gesamte Zellmatrix bedecken. Das künstliche Nierenkonstrukt ist für die Implantation bereit, wenn das infundierte Medium aufhört, aus dem Bioreaktor zu entweichen.
Beispiel 6: Implantation der rekonstruierten Niere in einen Empfänger
Die rekonstruierte Niere, die ein primitives Gefäßsystem und Nierenzellen, die zu Nieren-Tubulizellen differenziert waren, umfasste, wurde einer athymischen Maus implantiert. Athymische Mäuse sind im Handel erhältlich, beispielsweise von Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME. Die Tiere wurden auf die in vivo-Funktion der rekonstruierten Niere durch Beobachtung des Urinausstoßes überwacht. Die rekonstruierte Niere zeigte ein anhaltendes Wachstum und Vermehrung der Nierenzellen nach der in vivo-Implantation. Die Tiere wurden etwa 2, etwa 4 und etwa 8 Wochen nach der Implantation getötet. Die rekonstruierte Niere wurde gewonnen und analysiert.
Die gewonnenen Proben wurden grob und histologisch mit Hämatoxylin und Eosin untersucht. Immunohistochemische Färbungen auf Osteopontin, Fibronectin und alkalische Phosphatase wurden durchgeführt, um die Zelltypen und deren in vivo-Architektur zu bestimmen. Humaner, monoklonaler Fibronectin-Antikörper (Sigma, St. Louis, MO) wurde gegen die Fibronectin-Matrix verwendet. Mit Rhodamin konjugierter Ziegen-anti-Maus-Antikörper (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) wurde als sekundärer Antikörper verwendet. Eine immunozytochemische Färbung auf Osteopontin wurde mit einem polyklonalen Antikörper durchgeführt. Antikörper wurden in Weißen Neuseeland-Kaninchen unter Anwendung üblicher Verfahren erzeugt (Harlow und Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988) und in einem Verdünnungsverhältnis von 1:5000 verwendet. Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper, konjugiert mit FITC, (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) wurde als sekundärer Antikörper verwendet. Eine immunohistochemische Färbung auf alkalische Phosphatase unter Verwendung von Nitroblautetrazolium und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (Sigma, St. Louis, MO) wurde durchgeführt. Aus der Nierenprothese gewonnenes Filtrat zeigte eine strohgelbe Farbe. Eine Analyse des Filtrats auf die Harnsäurekonzentration wurde unter Verwendung eines Harnsäure-Nachweiskits (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO) durchgeführt.
Das Fluid in der rekonstruierten Niere wurde gewonnen. Eine histologische Untersuchung der implantierten rekonstruierten Niere ergab eine ausgedehnte Gefäßbildung, Bildung von Glomeruli und von hochgradig organisierten, tubuliartigen Strukturen mit einer analogen Morphologie wie bei einer nativen Niere. Die Nierenzellen in der rekonstruierten Niere blieben nach der Implantation lebensfähig, was durch ihre Fähigkeit zur Bindung an den fluoreszierenden Marker DIL festgestellt wurde. Eine immunozytochemische Färbung mit anti-Osteopontin-Antikörper, der vorwiegend durch die proximalen und distalen Tubulizellen sezerniert wird, färbte die tubulären Schnitte positiv. Eine immunohistochemische Färbung auf alkalische Phosphatase färbte die proximalen tubuliartigen Strukturen positiv. Die gelbe Flüssigkeit, die aus der neu gebildeten Niereneinheit gesammelt wurde, enthielt 66 mg/dl Harnsäure, verglichen mit 2 mg/dl im Plasma, was darauf schließen lässt, dass diese Tubuli zu einer unidirektionalen Ausscheidung und Konzentration von Harnsäure befähigt sind.

Claims

Verfahren zum Rekonstruieren eines künstlichen Organkonstrukts, welches umfaßt: Dezellularisieren einer natürlichen Biostruktur durch Entfernen des gesamten Zell- und Gewebeinhalts, wobei ein dreidimensionales Gerüst aus Bindegewebe hergestellt wird; Perfundieren einer ersten Population von isolierten und kultivierten Endothelzellen in das durch Dezellularisieren einer natürlichen Biostruktur gebildete dreidimensionale Gerüst, so daß die Endothelzellen an das dreidimensionale Gerüst binden; Kultivieren der Endothelzellen in dem Gerüst, bis die Endothelzellen eine Endothelgewebeschicht bilden, die ein Gefäßsystem umfaßt; und Einimpfen mindestens einer zweiten Population der kultivierten Zellen, die sich von der Population der kultivierten Endothelzellen unterscheidet, in das dreidimensionale Gerüst, so daß die zweite Zellpopulation an die Endothelgewebeschicht, die das Gefäßsystem enthält, bindet und in eine neomorphe Organstruktur differenziert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das künstliche Organkonstrukt ein künstliches Nierenkonstrukt ist, wobei das Verfahren umfaßt: Verwenden einer dezellularisierten Sängerniere, worin der Zellinhalt entfernt worden ist, wobei ein dreidimensionales Gerüst aus Bindegewebe gebildet wird; Perfundieren einer Population von isolierten und kultivierten Endothelzellen in das durch Dezellularisieren einer Säugerniere gebildete dreidimensionale Gerüst, so daß die Endothelzellen an das dreidimensionale Gerüst binden; Kultivieren der Endothelzellen in dem dreidimensionalen Gerüst, bis die Endothelzellen eine Endothelgewebeschicht produzieren, die ein Gefäßsystem enthält; und Einimpfen einer Population von kultivierten Nierenzellen in das dreidimensionale Gerüst, so daß die Nierenzellpopulation an die Endothelgewebeschicht bindet, welche das primitive Gefäßsystem enthält, und in Nephronstrukturen differenziert.
Künstliches Organkonstrukt, das ein dreidimensionales Gerüst aus Bindegewebe, gebildet durch Dezellularisieren einer natürlichen Biostruktur unter Entfernung des Zellinhalts, welches mit einer ersten Population von isolierten und kultivierten Endothelzellen perfundiert worden ist, so daß die Endothelzellen an das dreidimensionale Gerüst unter Bildung einer Endothelgewebeschicht, die ein Gefäßsystem enthält, binden, und mindestens eine zweite Population von kultivierten Zellen umfaßt, die sich von der Population der kultivierten Endothelzellen unterscheidet, so daß die zweite Zellpopulation an die Endothelgewebeschicht, die ein Gefäßsystem enthält, bindet und in eine neomorphe Organstruktur differenziert.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 oder das künstliche Organ nach Anspruch 3, wobei die Kombination der natürlichen Biostruktur und der zweiten Zellpopulation ausgewählt ist aus Kombinationen, die aus Herz oder einem Teil davon und Herzzellen, Niere oder einem Teil davon und Nierenzellen, Leber oder einem Teil davon und Leberzellen, Bauchspeicheldrüse oder einen Teil davon und Bauchspeicheldrüsenzellen, Milz oder einem Teil davon und Milzzellen, Blase oder einem Teil davon und Blasenzellen und Harnleiter und Harnröhre oder einem Teil davon und Harnleiterzellen und Harnröhrenzellen besteht.
Künstliches Organ nach Anspruch 3, wobei das künstliche Organkonstrukt ein künstliches Nierenkonstrukt ist, das ein dreidimensionales Gerüst aus Bindegewebe, gebildet durch Dezellularisieren einer Sängerniere unter Entfernung des Zellinhalts, umfasst, welches mit einer Population aus isolierten und kultivierten Endothelzellen, so daß die Endothelzellen an das dreidimensionale Gerüst unter Bildung einer Endothelgewebeschicht, die ein Gefäßsystem umfaßt, binden, und mit einer Population von kultivierten Nierenzellen perfundiert worden ist, so daß die Nierenzellpopulation an die Endothelgewebeschicht, die das Gefäßsystem enthält, bindet und in Nephronstrukturen differenziert.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 oder künstliches Organ nach Anspruch 3 oder 5, wobei die Endothelzellen menschliche Endothelzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 2 oder künstliches Organ nach Anspruch 5, wobei die Nierenzellen menschliche Nierenzellen sind.
Verfahren zum Screenen einer Verbindung, welche Nierenzellen moduliert, wobei das Verfahren umfaßt: Bereitstellen eines künstlichen Nierenkonstrukts mit einem dreidimensionalen Gerüst aus Bindegewebe, gebildet durch Dezellularisieren einer Sängerniere unter Entfernung des Zellinhalts, welches mit einer Population von isolierten und kultivierten Endothelzellen, so daß die Endothelzellen an das dreidimensionale Gerüst unter Bildung einer Endothelgewebeschicht, die ein Gefäßsystem enthält, binden, und mit einer Population aus kultivierten Nierenzellen perfundiert worden ist, so daß die Nierenzellpopulation an die das primitive Gefäßsystem umfassende Endothelgewebeschicht bindet und in Nephronstrukturen differenziert; Kontaktieren des künstlichen Nierenkonstrukts mit einer Bibliothek von Testverbindungen; und Selektieren einer interessierenden Verbindung, die Nierenzellen moduliert, aus der Bibliothek von Testverbindungen.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Modulator cytotoxisch oder therapeutisch gegenüber Nierenzellen ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Verbindung ein chemisches oder pharmazeutisches Mittel ist.
Verfahren zum Verarbeiten einer wäßrigen Lösung, welches umfaßt: Bereitstellen eines künstlichen Nierenkonstrukts mit einem dreidimensionalen Gerüst aus Bindegewebe, gebildet durch Dezellularisieren einer Sängerniere unter Entfernung des Zellinhalts, welches mit einer Population von isolierten und kultivierten Endothelzellen, so daß die Endothelzellen an das dreidimensionale Nierengerüst unter Bildung einer Endothelgewebeschicht, die ein Gefäßsystem enthält, binden, und mit einer Population von kultivierten Nierenzellen perfundiert worden ist, so daß die Nierenzellpopulation an die das Gefäßsystem enthaltende Endothelgewebeschicht bindet und in Nephronstrukturen differenziert; Bereitstellen der wäßrigen Lösung an der luminalen Seite des künstlichen Nierenkonstrukts; und Gewinnen einer verarbeiteten wäßrigen Lösung von der abluminalen Seite des künstlichen Nierenkonstrukts.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die wäßrige Lösung nicht-filtriertes Blut ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die verarbeitete wäßrige Lösung filtriertes Blut ist.