DE10214095C1 - Dedifferenzierte, programmierbare Stammzellen monozytären Ursprungs, sowie deren Herstellung und Verwendung - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft die Herstellung von dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen aus menschlichen Monozyten durch Kultivieren von Monozyten in einem Kulturmedium, welches M-CSF und IL-3 enthält. Die Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Präparate, welche die dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen enthalten sowie die Verwendung dieser Stammzellen zur Herstellung von Zielzellen und Zielgewebe.

Description

Die Erfindung betrifft dedifferenzierte, programmierbare Stamm­ zellen abgeleitet von humanen Monozyten, sowie deren Herstellung und deren Verwendung zur Herstellung von Körperzellen und Geweben. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um autologe humane Stammzellen, d. h. die monozytäre Ur­ sprungszelle stammt von demjenigen Patienten, der mit der aus der Ursprungszelle hervorgegangen Stammzelle bzw. mit den aus dieser Stammzelle hervorgegangenen Körperzellen therapiert werden soll.

Als "Stammzellen" werden solche Zellen bezeichnet, welche (a) die Fähigkeit zur Selbst-Vermehrung und (b) die Fähigkeit zur Als "Stammzellen" werden solche Zellen bezeichnet, welche (a) die Fähigkeit zur Selbst-Vermehrung und (b) die Fähigkeit zur Bildung mindestens eines und vielfach zahlreicher spezialisier­ ter Zelltypen besitzen [vergl. Peter J. Donovan und John Gear­ hart, Nature 414, 92-97, (2001)]. Als "pluripotent" werden Stammzellen bezeichnet, die sich in im wesentlichen alle denk­ baren Zelltypen des menschlichen und tierischen Körpers dif­ ferenzieren können. Derartige Stammzellen sind bisher nur aus embryonalem Gewebe bzw. aus embryonalem Karzinom (testikularen Tumoren) erhältlich (vergl. a. a. O.). Die Verwendung embryonaler Stammzellen wird in der Öffentlichkeit insbesondere in Deutsch­ land umfangreich diskutiert und als außerordentlich problema­ tisch betrachtet. Neben der mit embryonalen Stammzellen verbun­ denen ethischen und rechtlichen Problematik, stößt auch der therapeutische Einsatz derartiger Zellen auf Schwierigkeiten. Naturgemäß stammen embryonale Stammzellen von Spender-Organis­ men, die gegenüber den potentiellen Empfängern von aus diesen Zellen hervorgegangenen differenzierten Zellen oder Gewebe (nachfolgend als Zielzellen oder Zielgewebe bezeichnet), hete­ rolog sind. Es ist somit zu erwarten, daß derartige Zielzellen in den potentiellen Empfängern eine immunologische Sofort­ antwort im Sinne der Abstoßung auslösen werden.

Stammzellen lassen sich auch aus verschiedenen Geweben adulter, d. h. ausdifferenzierter Individuen isolieren. Derartige Stamm­ zellen werden als "multipotente adulte Stammzellen" bezeichnet. Sie spielen im Körper eine Rolle bei der Geweberegeneration und bei der Homöostase. Der wesentliche Unterschied zwischen em­ bryonalen pluripotenten Stammzellen und adulten multipotenten Stammzellen liegt in der Zahl der differenzierten Gewebe, die aus den jeweiligen Zellen gewonnen werden können. Ursache hier­ für ist vermutlich, daß pluripotente Stammzellen aus Samenzel­ len oder aus Zellen hervorgehen, die Samen produzieren können, während adulte multipotente Stammzellen aus dem Körper oder dem Soma adulter Individuen stammen (vergl. a. a. O., Seite 94), die zur Samenproduktion nicht in der Lage sind.

Die eigentliche Problematik bezüglich der Gewinnung und Verwen­ dung adulter Stammzellen beruht jedoch auf dem seltenen Vor­ kommen dieser Zellen. So finden sich im Knochenmark Stammzellen nur im Verhältnis von 1 : 10.000, im peripheren Blut von 1 : 250.000 und in der Leber im Verhältnis von 1 : 100.000. Die Gewinnung derartiger Stammzellen ist somit sehr aufwendig und für den Patienten belastend. Darüber hinaus ist die Generierung großer Zellmengen, wie sie zur klinischen Therapie benötigt werden, mit vertretbarem Aufwand bisher kaum möglich.

Dem steht ein ständig wachsender Bedarf an Möglichkeiten zur Behandlung von zerstörtem Gewebe im Sinne des "tissue en­ gineering" oder als zelluläre Therapie gegenüber, im Rahmen derer Haut-, Muskel-, Herzmuskel-, Leber-, Insel-, Nerven-, Neuronen-, Knochen-, Knorpel-, und Endothelzellen und Fettzel­ len etc. zu ersetzen sind.

Entscheidend ist in diesem Zusammenhang die für die westliche Welt vorauszusehende Entwicklung des Alters- und Krankheits­ profils der Bevölkerung, die für die nächsten 10 Jahre eine drastische Wende auf dem Gesundheits- und Versorgungssektor der westeuropäischen Bevölkerung einschl. USA und Kanada erwarten läßt. Allein für die Bundesrepublik Deutschland läßt die demo­ grafische Entwicklung bis zum Jahre 2015 einen Zuwachs der Bevölkerung in den Altersklasse von 45-64 Jahren um 21% und in der Gruppe der über 65jährigen einen Zuwachs von 26% vermuten. Hieraus wird zwangsläufig eine Wandlung der Patientenstruktur und des behandlungsbedürftigen Krankheitsspektrums resultieren. Vorhersehbarerweise werden Erkrankungen des Herz-Kreislauf- Systems (Hochdruck, Myocardinfarkt), Gefäßerkrankungen durch Arteriosklerose und Stoffwechselerkrankungen, metabolische Erkrankungen wie Diabetes mellitus, Leberstoffwechseler­ krankungen, Nierenfunktionserkrankungen sowie durch al­ tersbedingte Degeneration verursachte Erkrankungen des Knochen- und Knorpelgerüstes und degenerative Erkrankungen des Cerebrums durch neuronale und gliale Zellverluste zunehmen und innovative Behandlungskonzepte erforderlich machen.

Vor diesem Hintergrund erklären sich die immensen nationalen und internationalen Bemühungen an Forschung und Entwicklung beteiligter Fachleute, Stammzellen in die Hand zu bekommen, die sich in ausdifferenzierte gewebetypische Zellen (Leber, Kno­ chen, Knorpel, Muskel, Haut etc.) programmieren lassen.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Stammzellen zur Verfügung zu stellen, deren Generierung keine ethischen und/oder rechtlichen Probleme verursacht, die schnell für den geplanten Therapieeinsatz in den hierfür erforderlichen Mengen und zu vertretbaren Herstellungskosten zur Verfügung stehen, und die beim Einsatz als "zelluläre Therapeutika" keine oder keine nennenswerten Nebenwirkungen im Sinne der zellulären Abstoßung und der Induktion von Tumoren, insbesondere von bös­ artigen Tumoren, in dem jeweiligen Patienten auslösen.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Herstellung von dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen aus menschlichen Monozyten gelöst. Der Be­ griff "Dedifferenzierung" ist dem auf dem einschlägigen Gebiet tätigen Fachmann geläufig, vgl. beispielsweise Weissmann I. L., Cell 100, 157-168, Abb. 4, (2000). Er bedeuted die Rückführung einer bereits spezialisierten (differenzierten) Körperzelle in den Status einer Stammzelle, d. h. einer Zelle, welche ihrer­ seits in eine Vielzahl von Zelltypen überführt (programmiert) werden kann. Überraschenderweise hat es sich gezeigt, daß das erfindungsgemäße Verfahren zur Dedifferenzierung von Monozyten führt. Die auf diese Weise hergestellten Stammzellen lassen sich in zahlreiche verschiedene Zielzellen, bzw. Zielgewebe umwandeln (programmieren), vgl. Beispiele. Die erfindungsge­ mäßen Stammzellen exprimieren neben dem für ausdifferenzierte Monozyten kennzeichnenden Oberflächenantigen CD14 mindestens einen, vorzugsweise zwei oder drei, der typischen Pluri­ potenzmarker CD90, CD117, CD123 und CD135. In besonders bevor­ zugter Weise exprimieren die erfindungsgemäß hergestellten Stammzellen sowohl das Oberflächenantigen CD14 als auch die vier Pluripotenzmarker CD90, CD117, CD123 und CD135, vgl. Bei­ spiel 2, Tabelle 1. Es werden damit erstmals adulte Stammzellen zur Verfügung gestellt, die innerhalb kurzer Zeit zu vorzugs­ weise autologen Geweben reprogrammierbar sind.

Die Generierung der erfindungsgemäßen Stammzellen ist für den Patienten völlig unbedenklich und - bei autologer Anwendung - mit einer Eigenblutspende vergleichbar. Die für die üblichen Therapieoptionen (s. oben) benötigte Menge an Stammzellen (10⁸ bis 10⁹ Zellen) kann innerhalb von 10 bis 14 Tagen nach Blutab­ nahme kostengünstig bereitgestellt werden. Darüber hinaus er­ zeugt das für die Therapie vorgesehene Zellprodukt kein im­ munologisches Problem im Sinne der Zellabstoßung, da vor­ zugsweise Zellen und Empfänger genetisch identisch sind.

Die erfindungsgemäßen Stammzellen erwiesen sich ferner im Tier­ versuch und in Kultur als risikolos bezüglich der Malig­ nomentstehung, ein Ergebnis, welches aufgrund der monozytären Ursprungszelle, von der sich die erfindungsgemäßen Stammzellen ableiten, nicht anders zu erwarten ist.

Die wesentlichen Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von adulten Stammzellen umfassen:

• a) Isolieren von Monozyten aus Human-Blut,
• b) Vermehren der Monozyten in einem geeigneten Kulturmedium, welches den Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (nachfolgend als M-CSF bezeichnet) enthält; und
• c) Kultivieren der Monozyten in Gegenwart von Interleukin 3 (IL-3). Das Vermehren und die Behandlung mit IL-3 können in einer Stufe durchgeführt werden, indem man dem Kultur­ medium sowohl den Wachstumsfaktor als auch IL-3 zusetzt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Zellen ferner in Gegenwart einer Mercaptoverbindung kul­ tiviert. Die Kultivierung kann in einer gesonderten Verfah­ rensstufe erfolgen, die sich an die oben beschriebene Kul­ tivierung anschließt. Sie kann jedoch auch in der gleichen Stufe erfolgen, indem man dem Kulturmedium, vorzugsweise be­ reits zu Beginn der Kultivierung, ferner die Mercaptoverbindung zusetzt.

Im Anschluß an die Kultivierung der Zellen in Gegenwart von M-CSF, sowie in Gegenwart von IL-3 und gegebenenfalls einer Mercaptoverbindung, erfolgt vorzugsweise eine Behandlung mit einem biologisch ver­ träglichen organischen Lösungsmittel.

Das erfindungsgemäße Verfahren führt überraschenderweise zur Dedifferenzierung der Monozyten, wobei die aus der Dedifferen­ zierung resultierenden Stammzellen neben dem für ausdifferen­ zierte Monozyten typischen Oberflächenantigen CD14 auch mindes­ tens einen oder mehrere, vorzugsweise sämtliche der Pluri­ potenzmarker CD90, CD117, CD123 und CD135 exprimieren (vergl. Tabelle 1). Die Expression der jeweiligen Marker (Oberflächen­ antigene) kann mittels kommerziell erhältlicher Antikörper mit Spezifität gegenüber den jeweils zu ermittelnden Antigenen mit üblichen Immunnachweisverfahren nachgewiesen werden, vgl. Bei­ spiel 2.

Da die Zellen während des Vermehrungs- und Dedifferenzierungs­ prozesses am Boden des jeweiligen Kulturgefäßes haften, ist es erforderlich, die Zellen nach Abschluß der Dedifferenzierung vom Untergrund zu lösen. Die Ablösung kann mechanisch erfolgen, bevorzugt ist jedoch die enzymatische Ablösung mit beispiels­ weise Trypsin.

Die so erhaltenen, frei im Medium flottierenden dedifferenzier­ ten programmierbaren Stammzellen können entweder direkt dem Re­ programmierungsprozeß zugeführt werden, oder aber für einige Tage im Kulturmedium gehalten werden, wobei in letzterem Falle dem Medium vorzugsweise ein Zytokin oder LIF (leucaemia in­ hibitory factor) zugesetzt wird, um vorzeitigen Verlust der Programmierbarkeit zu vermeiden (vgl. Donovan und Gearhart, a. a. O., Seite 94). Schließlich können die Zellen zum Zwecke der Lagerung ohne Verlust der Programmierbarkeit tiefgefroren wer­ den.

Die erfindungsgemäßen Stammzellen unterscheiden sich von den bisher bekannten pluripotenten Stammzellen embryonalen Ur­ sprungs und von den bekannten adulten Stammzellen aus unter­ schiedlichen Geweben dadurch, daß sie neben den multipotenten Stammzellmarkern CD90, CD117, CD123 und/oder CD135, auch den typischen Differenzierungsmarker CD14 der Monozyten auf ihrer Oberfläche tragen, aus denen sie hervorgegangen sind.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Stamm­ zellen können zu beliebigen Körperzellen reprogrammiert werden. Verfahren zum Reprogrammieren von Stammzellen sind im Stand der Technik bekannt, vergl. beispielsweise Irving L. Weisman, Science 287, 1442-1446 (2000) und Insight Review Articles "Nature 414, 92-131, (2001), sowie das Handbuch "Methods of Tissue Engineering", Herausg. Anthony Atala und Robert P, Lanza, Academic Press, ISBN: 0-12-436636-8; Library of Congress Catalog Card No. 200188747.

Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Stammzellen einfach und zuverlässig in gewünschte Zielzellen, wie beipielsweise Adipozyten (vgl. Bei­ spiel 6), Hepatozyten (vgl. Beispiel 7) und Keratinozyten (vgl. Beispiel 8) differenziert werden, in dem man die Stammzellen in einem Medium wachsen läßt, welches den Überstand des Kulturmediums enthält, in dem die jeweiligen Zielzellen und/oder Fragmente derselben inkubiert wurden. Die­ ser Überstand wird nachfolgend als "Zielzell-konditioniertes Medium" bezeichnet.

Zum Differenzieren (Reprogrammieren) der erfindungsgemäßen Stammzellen, kann demgemäß so vorgegangen werden, daß man

• a) Gewebe zerkleinert, welches die gewünschten Zielzellen ent­ hält oder aus diesen besteht;
• b) die Gewebezellen (Zielzellen) und/oder Fragmente derselben gewinnt;
• c) die Zielzellen und/oder Fragmente derselben in einem geeig­ neten Kulturmedium inkubiert;
• d) den Überstand des Kulturmediums während und nach der Inkuba­ tion als Zielzell-konditioniertes Medium sammelt; und
• e) zum Reprogrammieren/Differenzieren von Stammzellen in die gewünschten Zielzellen oder Zielgewebe die Stammzellen in Gegenwart des Zielzell-konditionierten Mediums wachsen läßt.

Als Kulturmedium können übliche Zellkultur-Medien verwendet werden (vergleiche Beispiele). Vorzugsweise enthalten die Me­ dien Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise den epidermalen Wachstumsfaktor (Epidermal Growth Factor).

Die Inkubation der Zielzellen und/oder Fragmente derselben ("Zellpellet") kann 5 bis 15, vorzugsweise 10 Tage lang erfol­ gen. Vorzugsweise wird der Überstand, d. h. das Zielzell-kon­ ditionierte Medium jeweils nach 2 bis 4 Tagen abgenommen und durch frisches Medium ersetzt. Die so gewonnenen Überstände können getrennt oder vereinigt steril filtriert und bei etwa -20°C gelagert oder direkt zum Programmieren von Stammzellen eingesetzt werden. Wie oben dargelegt, erfolgt die Program­ mierung der Stammzellen in die gewünschten Zielzellen dadurch, daß man Stammzellen in Gegenwart des mit den jeweiligen Ziel­ zellen konditionierten Mediums wachsen läßt (vgl. Beispiele). Vorzugsweise enthält das Wachstumsmedium zusätzlich einen Ziel­ zell-spezifischen Wachstumsfaktor, wie beispielsweise den "He­ patocyte Growth Factor" oder den "Keratinocyte Growth Factor" (vgl. Beispiele).

Die erfindungsgemäßen dedifferenzierten, programmierbaren Stam­ mzellen sind per se als pharmazeutisches Präparat einsetzbar. Stammzellen besitzen die Fähigkeit, sich in vivo durch den di­ rekten Kontakt mit dem Zellverband eines bestimmten Zelltyps spontan in Zellen dieses Typs zu differenzieren. Verfahren zur Gewebeherstellung unter Einsatz von re- oder um-differenzier­ baren Zellen ("tissue engineering") sind im Stand der Technik bekannt. Beispielsweise wurde von Wang, X. et al., "Liver repo­ pulation and correction of metabolic liver disease by trans­ planted adult mouse pancreatic cells" in Am. J. Pathol. 158 (2), 571-579 (2001) gezeigt, daß sogar bestimmte adulte Zellen der Bauchspeicheldrüse der Maus in der Lage sind, sich in FAH defizienten Mäusen zu Hepatozyten umzuwandeln, die den meta­ bolischen Stoffwechseldefekt in diesen Tieren voll kompensieren können. Ein weiteres Beispiel sind die Untersuchungen von La­ gasse et al., "Purified hematopoietic stem cells can differen­ tiate into hepatocytes in vivo", Nature Medicine, 6(11), 1229-­ 1234 (2000). Die Autoren haben gezeigt, daß hämatopoetische Stammzellen aus dem Knochenmark in der Lage waren, sich nach in vivo Transfer in FAH-defiziente Mäuse in Hepatozyten umzuwan­ deln, die dann den metabolischen Defekt kompensieren konnten; siehe auch den Übersichtsartikel von M. Grompe, "Therapeutic Liver Repopulation for the Treatment of Metabolic Liver Disea­ ses" in Hum. Cell, 12: 171-180 (1999).

Bevorzugte Applikationsformen für die erfindungsgemäßen Stamm­ zellen sind Injektion, Infusion oder Implantation. Für die Injektion oder die Infusion können die Zellen in PBS (phosphate buffered sahne) verabreicht werden.

Bevorzugte Beispiele für in diesem Zusammenhang relevante In­ dikationen sind: Leberzirrhose, Pankreasinsuffizienz, akutes oder chronisches Nierenversagen, hormonelle Unterfunktionen, Herzinfarkt, Lungenembolie, Schlaganfall und Hautschäden.

Für die therapeutische Verwendung der aus den erfindungsgemäßen Stammzellen erhältlichen Zielzellen stehen zahlreiche Konzepte zur Verfügung [siehe oben Science 287, 1442-1446 (2000) und "Nature 414, 92-131, (2001)].

So können die Zellen direkt in die zu rekonstituierenden Organe eingebracht werden. Das Einbringen kann über Matrixkonstruk­ tionen erfolgen, die mit entsprechend differenzierten oder differenzierungsfähigen Zellen beschichtet werden. Die Matrix­ konstruktionen sind in der Regel bioabbaubar, so daß sie wäh­ rend des Verwachsens der neu eingebrachten Zellen mit den vor­ handenen Zellen aus dem Körper verschwinden. In Betracht kommen unter diesem Gesichtspunkt beispielsweise zelluläre, vorzugs­ weise autologe Transplantate in Form von Inselzellen, Hepatozy­ ten, Fettzellen, Hautzellen, Muskeln, Herzmuskeln, Nerven, Knochen, endokrinen Zellen etc. zur Restitution beispielsweise nach partieller chirurgischer Resektion eines Organes, zur Reparatur beispielsweise nach einem Trauma oder zur unterstüt­ zenden Anwendung, beispielsweise bei fehlender oder zu geringer Organfunktion.

Die erfindungsgemäßen Stammzellen und die aus ihnen hervorge­ gangenen Zielzellen können ferner zur Beschichtung von Prothe­ sen wie Herzklappen, Gefäßprothesen, Knochen- und Gelenkpro­ thesen etc. dienen, um die Biokompatibilität zu erhöhen.

Die Zellen können auch in künstlichen Konstrukten, wie bei­ spielsweise in Beuteln oder Kammern in den Körper eingebracht werden, um beispielsweise künstliche Inselzellportkammern zur Versorgung mit Insulin zu schaffen. Entsprechend können bei­ spielsweise Adipozyten-gefüllte Polymere zum Brustaufbau nach Operationen und für alle weiteren Indikationen der plastischen und/oder kosmetischen Korrektur zum Einsatz kommen. Weiter können semipermeable Portkammersysteme, bestückt mit endokrinen Zellen verschiedenster Provenienz, in vivo zur Behandlung endo­ kriner, metabolischer oder hämostatischer Erkrankungen zum Ein­ satz kommen. Beispiele für derartige endokrine Zellen sind Thyroxin, Steroide, ADH, Aldosteron, Melatonin, Seratonin, Adrenalin, Noradrenalin, TSH, LH, FSH, Leptin, Cholezystokinin, Gastrin, Insulin, Glucagon, oder Gerinnungsfaktoren produzie­ rende Zellen.

Die aus den erfindungsgemäßen Stammzellen hervorgegangenen Zielzellen können darüber hinaus als Zellkulturen außerhalb des Körpers in Bioreaktoren eingesetzt werden, um beispielsweise Entgiftungsreaktionen durchzuführen. Diese Verwendungsform ist insbesondere bei akuten Zuständen relevant, beispielsweise bei akutem Leberversagen als Hepatozyten-Bioreaktor oder als Peri­ tonealzellen enthaltendes Dialysat zur Anwendung bei der Peri­ tonaldialyse niereninsuffizienter Patienten.

Die Herstellung der oben beschriebenen Konstrukte und die Durchführung der entsprechenden Therapieverfahren ist im Stand der Technik bereits vielfach beschrieben, vergleiche beispiels­ weise die Übersichtsartikel Lalan S., Pomerantseva I., Vacanti J. P., "Tissue engineering and its potential impact on surgery", World J. Surg. 2001, 25, 1458-1466; Nassen B. A., Ogawa K., Vacanti J. P., "Tissue engineering: an evolving 21st-century science to provide replacement for reconstruction and trans­ plantation", Surgery 2001; 130, 781-784; Fuchs J. R., Nassen B. A., Vacanti J. P., "Tissue engineering: a 21st century solu­ tion to surgical reconstruction", Ann. Thorac. Surg. 2001; 72, 577-591.

Schließlich wird durch die erfindungsgemäßen pluripotenten Stammzellen ein weites Feld für die transgene Modifikation und Therapie eröffnet. So können die dedifferenzierten, program­ mierbaren Stammzellen gemäß der Erfindung per se oder die von ihnen abgeleiteten Zielzellen mit spezifischen Genkonstrukten transfiziert werden. Auf diese Weise können Gene, die für die Aufrechterhaltung metabolischer Leistungen in bestimmten Or­ ganen, wie beispielsweise Leber oder Niere, erforderlich sind, wiederhergestellt bzw. unterstützt oder neu eingebracht werden. Beispielsweise können Stammzellen oder von diesen abgeleitete Hepatozyten mit dem. FAH-(Fumaryl-Acetoacetat-Hydrolase) Gen transfiziert werden. Im FAH-defizienten Mausmodell genügte die intrasplenische Injektion von 1000 FAH-positiven Spenderhepato­ zyten, um nach 6 bis 8 Wochen die Leber komplett zu repopulari­ sieren und den zur Lebercirrhose führenden metabolischen Defekt voll zu kompensieren (vgl. Grompe M. et al. Nat. Genet. 12, 266 ff, 1996).

Entsprechend kann durch Transfektion der Stammzellen bzw. der jeweiligen aus den Stammzellen durch Programmierung hervorge­ gangenen Zielzellen (beispielsweise hämatopoetische Zellen, Hepatozyten, Ovarzellen, Muskelzellen, Nervenzellen, Neurone, Gliazellen, Korpel- oder Knochenzellen, etc.) mit "Multi-Drug- Resistance-Genen" die erweiterte radikale Chemotherapie bei malignen Erkrankungen durch entsprechende hämatopoietische Rekonstitution ermöglicht werden oder Strahlenresistenz erzeugt werden.

Die Erfindung wird nachfolgend im einzelnen erläutert:
Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren sind Monozyten aus humanem Blut. Vorzugsweise handelt es sich um Monozyten, die aus dem Blut desjenigen Patienten stammen, welcher mit den erfin­ dungsgemäßen Stammzellen oder den aus diesen hergestellten Zielzellen therapiert werden soll.

Zur Gewinnung der Monozyten kann das Blut zunächst nach üb­ licher Behandlung mit einem Antikogakulanz auf bekannte Weise, vorzugsweise durch Zentrifugation, in Plasma sowie in weiße und rote Blutzellen getrennt werden. Nach der Zentrifugation findet sich das Plasma im Überstand; darunter liegt eine Schicht, welche die Gesamtheit der weißen Blutzellen enthält. Diese Schicht wird auch als "Buffy coat" bezeichnet. Darunter befin­ det sich die rote Blutzellen enthaltende Phase (Haematokrit).

Anschließend wird die "Buffy coat" Schicht isoliert und zur Gewinnung der Monozyten beispielsweise durch Zentrifugieren nach bekannten Verfahren aufgetrennt. Gemäß einer bevorzugten Verfahrensvariante wird die "Buffy coat" Schicht auf ein Lym­ phozytenseparationsmedium (Ficoll Hypaque) geschichtet und zentrifugiert (vergl. Beispiel 1). Durch weiteres Zentrifugie­ ren und Spülen wird die Fraktion der Monozyten aus dem Blut gewonnen (vergl. Beispiel 1).

Beipiele für alternative Verfahren zur Gewinnung der Monozyten aus dem Vollblut sind das "Fluorescent-Activating Cell Sorting" (FACS), das "Immunomagnetic Bead Sorting" und "Magnetic Ac­ tivated Cell Sorting" (MACS) oder das sogenannte "Rosetting Verfahren", vgl. Gmelig-Meyling F. et al., "Simplified proce­ dure for the separation of human T and non-T cells", Vox Sang. 33, 5-8 (1977).

Für die Herstellung einer ausreichenden Menge an Stammzellen ist es zunächst erforderlich, die Monozyten zu vermehren. Zu diesem Zweck können bekannte, für Monozyten geeignete Wachs­ tumsmedien verwendet werden, wobei das Medium erfindungsgemäß M-CSF (macrophage-colony-stimulating-factor) enthält. M-CSF (auch als CSF-1 bezeichnet) wird von Monozy­ ten, Fibroblasten und endothelialen Zellen produziert. Die Kon­ zentration von M-CSF in dem Kulturmedium kann von 2 bis 20 µg/l Medium, vorzugsweise 4 bis 6 µg/l und in besonders bevorzugter Weise 5 µg/l betragen.

Anschließend oder gleichzeitig müssen die Zellen in Gegenwart von Interleukin 3 (IL-3) kultiviert werden. Die Konzentration von IL-3 in dem Medium kann von 0,2 bis 1 µg, vorzugsweise 0,3 bis 0,5 µg und in besonders bevorzugter Weise 0,4 µg IL-3/l betragen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Zellen zusätzlich in Gegenwart einer Mercaptoverbindung kultiviert, in der mindestens eine Kohlenwasserstoffgruppe an den Schwefel gebunden ist, wobei die Kohlenwasserstoffgruppe(n) mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen substituiert sein kann (können). Durch die zusätzliche Verwendung einer derarti­ gen Schwefelverbindung kann die Anzahl der durch Dedifferen­ zierung der monozytären Ursprungszellen gewonnenen Stammzellen gesteigert werden, die einen oder mehrere der Stammzellmarker CD90, CD117, CD123 und CD135 exprimieren.

Vorzugsweise ist/sind die funktionelle(n) Gruppe(n) Hydroxyl- und/oder Amingruppen. In besonders bevorzugter Weise ist die Schwefelverbindung 2-Mercaptoethanol. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Schwefelverbindung Di­ methylsulfoxid (DMSO).

Die Menge der verwendeten Schwefelverbindung kann von etwa 4 bis etwa 200 µMol/l bezogen auf den Schwefel betragen. Bevor­ zugt sind etwa 100 µMol/l.

Bei Verwendung von 2-Mercaptoethanol sollte das Kulturmedium etwa 3 µl bis etwa 13 µl, vorzugsweise etwa 7 µl 2-Mercap­ toethanol/l enthalten.

Die Behandlung mit IL-3 und gegebenenfalls mit der Schwefelver­ bindung kann gleichzeitig mit oder im Anschluß an die Vermeh­ rung der Monozyten erfolgen. Vermehrung und Dedifferenzierung sollten zusammengenommen nicht mehr als 10 Tage in Anspruch nehmen, wobei die Behandlung mit IL-3 und gegebenenfalls mit der Schwefelverbindung mindestens 3 und maximal 10 Tage, vorzugsweise 6 Tage lang durchgeführt werden sollte.

Für die gemeinsame Durchführung der Vermehrung und De­ differenzierung, wie in Beispiel 2 beschrieben, werden die Monozyten nach Isolierung in ein Medium überführt, welches sowohl den Wachstumsfaktor, insbesondere M-CSF, als auch das IL-3 sowie vorzugsweise die Schwefelverbindung, insbesondere Mercaptoethanol oder DMSO enthält.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung schließt sich im nächsten Schritt die Zugabe eines biologisch verträglichen organischen Lösungsmittels zu dem die Zellen enthaltenden Medium an, um die Zahl der am Ende des Verfahrens frei im Medium flottierenden Stammzellen zu erhöhen. Die Menge des Lösungsmittels kann 10µ1 bis 1 ml betragen. Vorzugsweise handelt es sich um einen Alkohol mit 1-4 Kohlenstoffatomen, wobei die Zugabe von Ethanol besonders bevorzugt ist. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen mit der Dampfphase des zuvor defininierten biologisch verträg­ lichen organischen Lösungsmittels, vorzugsweise mit Ethanol­ dampf, in Kontakt gebracht (vgl. Beispiel 2). Die Ein­ wirkungszeit des organischen Lösungsmittels, in besonders be­ vorzugter Weise des Ethanoldampfes, sollte 4-12 Stunden, vor­ zugsweise 8-10 Stunden betragen.

Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren in Kultur­ gefäßen durchgeführt, deren Oberfläche zuvor mit foetalem Käl­ berserum (FCS) beschichtet wurde (vergl. Beispiel 2). Alter­ nativ kann auch humanes AB-Serum männlicher Spender verwendet werden. Die Beschichtung mit FCS kann dadurch erfolgen, daß man die Oberfläche der Kulturgefäße vor Ingebrauchnahme mit FCS bedeckt, und nach einer Einwirkungszeit von einigen Stunden, insbesondere 2 bis 12 Stunden, und in besonders bevorzugter Weise 7 Stunden, das nicht an der Oberfläche haftende FCS auf geeignete Weise entfernt.

Aufgrund ihrer adhäsiven Eigenschaften haften die Monozyten und die während des Verfahrensablaufs aus diesen hervorgehenden Stammzellen am Boden des jeweiligen Kulturgefäßes.

Wird eine Behandlung mit organischem Lösungsmittel durchge­ führt, so lösen die Zellen sich bereits in dieser Verfah­ rensstufe in gewissem Umfang vom Boden. Die (weitere) Ablösung kann auf mechanische Weise, beispielsweise mit einem feinen Zellschaber, Spachtel oder einer Pipettenspitze erfolgen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens erfolgt die vollständige Ablösung durch Behandlung mit einem geeigneten Enzym, bespielsweise mit Trypsin (vergl. Beispiel 2). Die Tryp­ sin-Lösung (0,1 bis 0,025 g/l, vorzugsweise 0,05 g/l) kann 2-10 Min. lang bei 35°C bis 39°C, vorzugsweise bei 37°C in Gegenwart von CO₂ auf die Zellen einwirken.

Die Trypsinaktivität wird sodann auf übliche Weise blockiert und die nun frei flottierenden dedifferenzierten, programmier­ baren Stammzellen können auf übliche Weise beispielsweise durch Zentrifugieren gewonnen werden. Sie stehen nunmehr, entweder suspendiert in einem geeigneten Medium, beispielsweise in RPMI- 1640, für die sofortige Differenzierung in die gewünschten Zielzellen zur Verfügung. Sie können jedoch auch einige Tage lang in dem Medium gehalten werden, wobei dann, wenn die Zellen länger als etwa 48 Stunden als dedifferenzierte, programmier­ bare Stammzellen in Kultur gehalten werden sollen, das Hin­ zufügen von Zytokinen oder LIF-Faktor (Leukemia inhibitory factor), vergl. Nature, 414, 94, (2001 - a. a. O.) bevorzugt ist. In einem derartige Faktoren enthaltenden Medium können die Stammzellen mindestens 10 Tage lang als dedifferenzierte, pro­ grammierbare Stammzellen gehalten werden.

Für die längere Lagerung können die Zellen tiefgefroren werden. Protokolle zum Tiefgefrieren lebender Zellen sind im Stand der Technik bekannt, vgl. Griffith M. et al., Epithelial Cell Cul­ ture, Cornea, in Methods of Tissue Engineering, Atala A. und Lanza RP, Academic Press 2002, Kap. 4, Seiten 131 bis 140. Ein bevorzugtes Suspensionsmedium zum Tiefgefrieren der erfin­ dungsgemäßen Stammzellen ist FCS enthaltendes DMEM, vergl. Beispiel 2.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen weiter erläutert und beschrieben.

Soweit nicht innerhalb der Beispiele definiert, ist die Zusam­ mensetzung der verwendeten Medien und Substanzen, nachfolgend angegeben:

1. Penicillin/Streptomycin-Lösung

10.000 Einheiten Penicillin als Natriumsalz von Penicillin G und 1000 µg Streptomycin als Streptomycinsulfat je ml physiologische Kochsalzlösung (NaCl 0,9%).

2. Trypsin-EDTA

0,5 g Trypsin und 0,2 g EDTA (4 Na)/l

3. Insulin

human, rekombinant hergestellt in E. coli, etwa 28 Ein­ heiten/mg

4. RPMI 1640 (1X, flüssig (11875) Enthält L-Glutamin

RPMI (Roswell Park Memorial Institute) Media 1640 sind ange­ reicherte Formulierungen, mit weitreichender Anwendbarkeit für Säugerzellen.

5. PBS (Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung) vergl. J. Exp. Med. 98,167 (1954)

6. 2-Mercapto-Ethanol

Qualität zur Synthese; Gehalt < 98%, Dichte 1,115 bis 1,116, vergl. z. B. Momo, Jet al., J. Am. Chem. Soc. 73, 4961 (1951).

7. Ficoll-Hypaque

Lymphozyten Separationsmedium (Saccharose/Epichlorhydrin Co­ polymerisat Mg 400.000, -; Dichte 1,077, eingestellt mit Natriumdiatrizoat).

8. Retinsäure

Vitamin A Säure (C₂₀

H₂₈

O₂

), 300 µl in 1.5 ml PBS entsprechend 1 mM. Als Medium zum Programmieren von Neuronen und Gliazel­ len 150 µl auf 10 ml Medium entsprechend 10^-6

M verwenden.

9. DMEM

(Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium (high glucose) vgl. Dulbecco, R. et al., Virology 8, 396 (1959) Smith, J. D. et al., Virology 12, 158 (1960) Tissue Culture Standards Committee, In Vitro 6, 2 (1993)

10. L-Glutamin

flüssig: 29,2 mg/ml

11. Collagenase Typ II

Vergl. Rodbell, M. et al., J. Biol. Chem. 239, 375 (1964).

12. Interleukin-3 (IL-3)

Rekombinantes humanes IL-3 aus E. coli [(Yang Y. C. et al., Cell 47, 10 (1986)]; enthält das 133 Aminosäure-Reste umfas­ sende reife IL-3 und die 134 Aminosäure-Reste umfassende Methionyl-Form im Verhältnis von etwa 1 : 2; berechnete Mol- Masse etwa 17.5 kD; (R Katalog Nr. 203-IL)

13. Antikörper

Die in den Beispielen verwendeten Antikörper gegen die Anti­ gene CD14, CD31, CD90, CD117, CD123, CD135 sind kommerziell erhältlich. Sie wurden aus den folgenden Quellen bezogen:
CD14: DAKO, Monoclonal Mouse Anti-Human CD14, Monocyte, Clone TÜK4, Code No. M 0825, Lot 036 Edition 02.02.01;
CD31: PharMingen International, Monoclonal Mouse Anti-Rat CD31 (PECAM-1), Clone TLD-3A12, Katalog No. 22711D, 0.5 mg;
CD90: Biozol Diagnostica, Serotec, Mouse Anti Human CDw90, Clone No. F15-42-1, MCAP90, Batch No. 0699;
CD117: DAKO, Monoclonal Mouse Anti-Human CD117, c-kit, Clone No. 104D2, Code No. M 7140, Lot 016, Edition 04.05.00;
CD123: Research Diagnostics Inc., Mouse anti-human CD123 antibodies, Clone 9F5, Katalog No. RDI-CD123-9F5;
CD135: Serotec, Mouse Anti Human CD135, MCA1843, Clone No. BV10A4H2.

Beispiel 1 Abtrennen von Monozyten aus Gesamtblut

Zur Vermeidung der Blutgerinnung und zum Füttern der Zellen wurden 450 ml Vollblut in einem 3-Kammerbeutel-Set mit 63 ml einer Stabilisator-Lösung vermischt, die je Liter H₂O 3,27 g Citronensäure, 26,3 g Trinatriumcitrat, 25,5 g Dextrose, und 22,22 g Natriumdihydroxyphosphat enthielt. Der PH-Wert der Lösung betrug 5,6-5,8.

Zur Blutkomponententrennung erfolgte anschließend eine "scharfe Zentrifugation" dieses Gemisches zur Blutkomponententrennung, bei 4000 rpm über 7 min bei 20°C. Hieraus resultierte eine 3- Schichtung der korpuskulären und nicht-korpuskulären Be­ standteile. Durch Einsetzen des Beutelsets in eine dafür vor­ gesehene Preßmaschine wurden dann die Erythrozyten in den un­ teren Beutel, das Plasma in den oberen Beutel gepreßt und der sogenannte Buffy-coat verblieb im mittleren Beutel und enthielt ca. 50 ml Volumen.

Die Menge von 50 ml frisch gewonnenem Buffy-coat wurde nun in jeweils 2 Portionen á 25 ml geteilt und damit jeweils 25 ml Ficoll-Hypaque Separationsmedium überschichtet, welches zuvor in zwei 50 ml Falconröhrchen gefüllt worden war.

Dieser Ansatz wurde 30 Min. lang bei 2500 rpm ungebremst zen­ trifugiert. Im Buffy coat noch vorhandene Erythrozyten und tote Zellen lagen danach unterhalb der Ficoll-Phase während die weißen Blutzellen einschließlich der Monozyten als weiße Inter­ phase auf dem Ficoll separiert sind.

Anschließend wurde die weiße Interphase der Monozyten vorsich­ tig abpipettiert und mit 10 ml Phosphat gepufferter physiologis­ cher Kochsalzlösung (PBS) gemischt.

Danach wurde dieser Ansatz dreimal 10 Min. lang bei 1800 rpm gebremst zentrifugiert, wobei der Überstand nach jeder Zentri­ fugation abpipettiert und mit frischem PBS aufgefüllt wurde.

Das am Boden des Zentrifugationsgefäßes (Falconröhrchen) gesam­ melte Zellpellet enthielt die mononukleäre Zellfraktion, d. h. die Monozyten.

Beispiel 2 Vermehrung und Dedifferenzierung der Monozyten

Die Kultivierung und Vermehrung der Monozyten einerseits und die Dedifferenzierung der Zellen andererseits erfolgte in einem Schritt in Nährmedium der folgenden Zusammensetzung:

Das Nährmedium enthielt ferner 2,5 µg/500 ml M-CSF und 0,2 µg/­ 500 ml Interleukin 3 (IL-3).

Die in Beispiel 1 isolierten Monozyten wurden in 5 Kammern einer 6-Kammer-Rundlochplatte (30 mm Durchmesser pro Loch) in einer Menge von jeweils etwa 10⁵ Zellen je Kammer übertragen und mit jeweils 2 ml des oben angegebenen Nährmediums aufgefüllt. Die 6 Loch-Platte war zuvor mit reinem inaktivierten FCS ge­ füllt und das FCS nach etwa 7 Stunden abgegossen worden, um auf diese Weise eine FCS beschichtete Platte zu erhalten. Die Be­ stimmung der Zellzahl für die exakte Dosierung je Loch erfolgte nach bekannten Verfahren, vergl. Hay R. J., Cell Quantification and Characterisation, in Methods of Tissue Engineering, Acade­ mic Press 2002, Kapitel 4, S. 55-84.

Die 6-Loch-Platte wurde mit dem zugehörigen Deckel abgedeckt und 6 Tage lang in einem Brutschrank bei 37°C gehalten. Die Zellen setzten sich nach 24 Stunden am Boden der Kammern ab. An jedem zweiten Tag wurde der Überstand abpipettiert und die Kammern der 6-Loch-Platte mit jeweils 2 ml frischem Nährmedium wieder aufgefüllt.

Am 6. Tag wurden 2 ml 70%iges Ethanol in die frei gebliebene 6. Kammer der 6-Loch-Platte gefüllt, die Platte wurde wiederum verschlossen und weitere 10 Stunden lang bei 37°C im Brut­ schrank gehalten.

Nachfolgend wurden jeweils 1 ml einer 1 : 10 mit PBS verdünnten Trypsinlösung in jede der Zellen enthaltenden Kammern der Rund­ lochplatte pipettiert. Die geschlossene Rundlochplatte wurde 5 Min. lang bei 37°C unter 5% CO₂ im Brutschrank gehalten.

Die Trypsinaktivität wurde danach durch Zugabe von jeweils 2 ml RPMI 1640 Medium zu den Rundlöchern geblockt. Der gesamte Überstand der jeweiligen Kammern (1 ml Trypsin + 2 ml Medium) wurde abpipettiert, in einem 15 ml Falconröhrchen vereinigt und 10 Min. lang bei 1800 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde nachfolgend verworfen und der Niederschlag mit frischem RPMI 1640 Medium (2 ml/10⁵ Zellen) versetzt.

Diese Zellsuspension konnte direkt zur Differenzierung in ver­ schiedene Zielzellen verwendet werden.

Alternativ wurden die Zellen nach Zentrifugation und Verwerfen des Trypsin enthaltenden Überstandes mit DMSO/FCS als Einfrier­ medium versetzt und in einer Konzentration von 10⁶/ml tief­ gefroren.

Das Einfriermedium enthielt 95% FCS und 5% DMSO. Jeweils etwa 10⁶ Zellen wurden in 1 ml des Mediums aufgenommen und in folgen­ den Stufen abgekühlt:
30 Min. auf Eis;
2 Stunden bei -20°C im vorgekühlten Styroporkasten;
24 Stunden bei -80°C in Styropor;
Lagerung in Röhrchen in Flüssigstickstoff (N₂) bei -180°C.

Zur immunhistochemischen Phenotypisierung der nach obigem Ver­ fahren generierten Zellpopulation dedifferenzierter pro­ grammierbarer Stammzellen monozytären Ursprungs wurden jeweils 10⁵ Zellen abgenommen und als Cytospin-Präparat auf Ob­ jektträgern zur weiteren histochemischen Anfärbung fixiert. (Ref. Watson, P. A slide centrifuge; an apparatus for con­ centrating cells in suspension on a microscope slide. J Lab Clin Med. 68: 494-501. 1966). Hiernach konnten die Zellen durch die von Cordell JL, et al., (Literatur s. u.) beschriebene Technik nit APAAP-Rot-Komplex gefärbt werden. Die Verdünnung des zugesetzten Primärantikörpers erfolgte, soweit nicht ande­ res angegeben, in der Verdünnung 1 : 100 mit PBS, wobei jeweils 200 µl dieser Antikörperkonzentration eingesetzt wurde. Als Primärantikörper wurden monoklonale Antikörper gegen die in Tabelle 1 gelisteten Zellantigenepitope eingesetzt. Abb. 6 zeigt gefärbte Cytospinpräparate und den entsprechenden Nach­ weis der Stammzellmarker CD90, CD117, CD123 und CD135.

Literatur zur Färbetechnik

Cordell J. L. et al., Immunoenzymatic labeling of monoclonal antibodies using immune complexes of alkaline phosphatase and monoclonal anti-alkaline phosphatase (APAAP complexes). J. Histochem. Cytochem. 32, 219-229 (1984)

Literatur zu den Markern

CD14
Ferrero E., Goyert S. M.;
"Nucleotide sequence of the gene encodinig the monocyte differentiation antigen, CD14";
Nucleic Acids Res. 16: 4173-4173 (1988).
CD31
Newman P. J., Berndt M. C., Gorski J., White J. C. II, Lyman S., Paddock C., Muller W. A.; "PECAM-1(CD31) cloning and relation to adhesion molecules of the immunoglobulin gene superfamily";
Science 247; 1219-1222 (1990).
CD90
Seki T., Spurr N., Obata F., Goyert S., Goodfellow P., Silver J.;
"The human thy-1 gene: structure and chromosomal location"; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6657-6661 (1985).
CD117
Yarden Y., Kuang W.-J., Yang-Feng T., Coussels L., Munemitsu S., Dull T. J., Chen E., Schlessinger J., Francke U., Ullrich A.;
"Human proto-oncogene c-kit: a new cell surface receptor tyrosine kinase for an unidentified ligand.";
EMBO J. 6: 3341-3351 (1987).
CD123
Kitamura T., Sato N., Arai K., Miyajima A.;
"Expression cloning of the human IL-3 receptor cDNA reveals a shared beta subunit for the human IL-3 and GM-CSF receptors."; Cell 66: 165-1174 (1991).
CD135
Small D., Levenstein M., Kim E., Carow C., Amn S. Rockwell P., Witte L., Burrow C., Ratajazak M. Z., Gewirtz A. M., Civin C. I.;
"STK-1, the human honolog of Flk-2/Flt-3, is selectively expressed in CD34+ human bone marrow cells and is involved in the proliferation of early progenitor/stem cells.;
Proc. Natl. Acad. Sci USA, 91: 459-463 (1994).

Tabelle 1

Antigenexpression der erfindungsgemäßen Stammzellen

Die angegebene Graduierung entspricht der ermittelten Antigen­ positivität, die sich ab Tag 4 bis Tag 9 nach Kultivierung der Monozyten in den entsprechend spezifizierten Medien zeigt und erfolgte durch mikroskopischen Vergleich der jeweiligen Cyto­ spin-Färbungen mit der negativen Kontrolle (beobachtete Färbung ohne Primärantikörper).
+ deutliche Farbreaktion der Zellen mit dem Primärantikör­ per;
++ starke Farbreaktion der Zellen mit dem Primärantikörper.

Es wurden nur Cytospinpräparate evaluiert, die mehr als 70% vitale Zellen mit typischer Stammzellmorphologie (s. Abb. 6) aufwiesen.

Beispiel 3 Herstellung von Neuronen und Gliazellen aus adulten Stammzellen

Die Herstellung von Neuronen und Gliazellen erfolgte in Petri­ schalen mit einem Durchmesser von 100 mm. Zur Vorbereitung der Petrischalen wurden in jede Schale 5 ml reines inaktiviertes foetales Kälberserum (FCS) gefüllt, so daß der Boden bedeckt war. Nach 7 Std. wurde der nicht an dem Boden der Petrischale haftende Anteil des FCS abpipettiert. Etwa 10⁶ der gemäß Beispiel 2 hergestellten Zellen wurden in eine der vorbereite­ ten Petrischalen gegeben und es wurden 10 ml Nährmedium der folgenden Zusammensetzung hinzugefügt:

Das Nährmedium enthielt ferner Retinsäure in einer Menge von 1 × 100^-6 M/500 ml.

Die Reprogrammierung/Differenzierung der eingesetzten Stammzel­ len in Neurone und Gliazellen erfolgte innerhalb von 10 Tagen, wobei das Medium im Abstand von etwa 3 Tagen gewechselt wurde. Die Zellen waren nach diesem Zeitraum zum größten Teil adhärent am Boden der Kammer und konnten analog, wie zuvor für die Stammzellen beschrieben, durch kurzzeitige Trypsinierung vom Plattenboden gelöst werden.

Beispiel 4 Nachweis von neuronalen Vorläuferzellen, Neuronen und Gliazellen

Zur späteren immunohistochemischen Charakterisierung der durch die dedifferenzierten programmierbaren Stammzellen induzierten Zielzellen wurden die aus Monozyten generierten Stammzellen (10⁵ Zellen/Deckelglas) auf Deckelgläschen (20 mm × 20 mm), die auf den Boden der 6-Rund-Lochplatten (30 mm Durchmesser pro Kammer) plaziert wurden, aufgetragen und mit dem Nährmedium (2 ml) pro Lochplatte kultiviert. Nach Ausdifferenzierung der jeweiligen Zielzellen wurden diese wie folgt fixiert: Nach Abnahme des Nährmediums (Überstand) erfolgte die Fixierung der gezüchteten Zielzellen durch Zugabe von 2 ml Methanol, welches 10 Minuten lang einwirkte. Danach erfolgte das Abpipettieren des Ethanols und die Lochplatten wurden zweimalig mit PBS (jeweils 2 ml) gewaschen. Hiernach konnten die Zellen durch die von Cordell, J. L. et al. Immunoenzymatic labeling monoclonal antibodies using immune complexes of alkaline phosphatase and monoclonal anti-alkaline phosphatase (APAAP complexes). J. Histochem. Cytochem. 32, 219-229 (1994) beschriebene Technik mit APAAP- Rot-Komplex gefärbt werden. Die Verdünnung des zugesetzten Primärantikörpers erfolgte, soweit nicht anderes spezifiziert, in der Verdünnung 1 : 100 mit PBS, wobei jeweils 200 µl dieser Antikörperkonzentration in jedes der 6 Rundlöcher pipettiert wurde.

Neuronale Vorläuferzellen wurden durch Färbung der Zellen mit dem Antikörper gegen das 5100 Antigen nachgewiesen, vgl. mitt­ leres Bild der Abb. 1 (x200).

Neurone wurden durch spezifische Expression von Synaptophysin MAP2 (microtubular associates protein 2) oder Neurofillament 68 mit den entsprechenden spezifischen Antikörpern (Primärantikör­ per 1 : 300 mit PBS verdünnt) nachgewiesen, rechtes Bild der Abb. 1, x200.

Gliazellen, wie zum Beispiel Astrozyten, wurden durch Detektion von GFAP (glial fibrillary associated protein) (Primärantikör­ per 1 : 200 mit PBS verdünnt) nachgewiesen, linkes Bild der Abb. 1, x200.

Die Trennung von Neuronen und Gliazellen erfolgte durch spezi­ fische Antikörper gegen MAP2 (Neurone) oder GFAP (Gliazellen), mittels MACS (Magnetic Activated Cell Sorting) nach dem Verfah­ ren, wie es beispielsweise in Carmiol S, Cell Isolation and Selection in Methos of Tissue Engineering, Academic Press 2002, Kapitel 2, Seiten 19-35 beschrieben ist.

Die mittels Anfärbung sichtbar gemachten Zelltypen sind in Abb. 1 gezeigt.

Beispiel 5 Herstellung von Endothelzellen aus dedifferenzierten program­ mierbaren adulten Stammzellen monozytären Ursprungs

Zur Züchtung von Endothelzellen wurde als Matrix Matrigel® (Beckton und Dickinson, Heidelberg, DE) verwendet. Dabei han­ delt es sich um eine Matrix aus Fibronektin, Laminin und den Collagenen I und IV.

Die gefrorene Matrix wurde über einen Zeitraum von 12 Stunden bei 4°C im Kühlschrank langsam aufgetaut. Dabei änderte sich die Zustandsform, d. h. die ursprünglich feste Matrix wurde schwammig/flüssig. Sie wurde in diesem Zustand in eine 48-Loch- Platte (10 mm Durchmesser je Kammer) in solcher Weise aufgetra­ gen, daß der Boden der jeweiligen Kammern bedeckt war.

Nach dem Auftragen wurde die Platte 30 Min. lang bei Raum­ temperatur gehalten, bis sich das Gel auf dem Boden als ad­ härente Schicht verfestigt hatte.

Anschließend wurden etwa 1 × 10² Zellen je Kammer mit Zusatz des Nährmediums (wie in Beispiel 2 beschrieben) auf Matrigel® inku­ biert.

Nach 4-5 Tagen zeigten sich die ersten tubulären Zellstränge, die sich nach 6-8 Tagen in dreidimensionale Zellnetzwerke ent­ wickelten. Auf den Zellen konnten die Endothelmarker CD31, und Faktor VIII mit den jeweils spezifischen Primärantikörpern (200 µl, jeweils 1 : 100 mit PBS verdünnt) nachgewiesen werden.

In einem alternativen Verfahren wurde die verflüssigte Matrix auf eine Gefäßprothese aufgetragen und diese anschließend mit den dedifferenzierten programmierbaren adulten Stammzellen gemäß Beispiel 2 beschichtet. Nach etwa 6 Tagen war ein Endot­ helrasen zu erkennen, der die Prothese zirkulär ausgekleidete.

Die durch Färbung mit entsprechenden Endothel-spezifischen Antikörpern (s. o.) sichtbar gemachten Endothelzellen sind in Abb. 2 gezeigt. Im mittleren Bild sind die Zellen nach 5 Tagen Inkubation auf Matrigel® dargestellt. Erste tubuläre Stränge verbinden einzelne Zellaggregate. Die dunkelbraun markierten Zellen exprimieren CD31-Antigen (x200 mit Gelbfilter). Nach 8 Tagen kommt es zunehmend zur Bildung von dreidimensionalen Netzwerkstrukturen (anti-CD31-Antigen-Färbung, x200 mit Gelb­ filter). Nach 12 Tagen bilden die neu-differenzierten CD31⁺- Zellen, die auf Matrigel® gezüchtet wurden, eine Gefäßähnliche dreidimensionale Röhre mit mehrschichtigen Wandstrukturen aus, die bereits morphologisch an ein Gefäß erinnert. Man erkennt, daß nunmehr nahezu alle Zellen das CD31-Antigen exprimieren (CD31-Färbung, x400, Blaufilter), rechte Abbildung.

Beispiel 6 Herstellung von Fettzellen (Adipozyten) A

Für die Programmierung/Differenzierung der adulten Stammzel­ len gemäß Beispiel 2 in Fettzellen wurde zunächst ein kon­ ditioniertes Medium generiert. Hierzu wurden 20 g eines autologen Fettgewebes, d. h. von Fettgewebe der gleichen Spenderperson, aus deren Blut auch die Monozyten stammten, wie folgt aufgearbeitet:
Zunächst wurde das Fettgewebe in einer Petrischale zerklei­ nert und die zerkleinerten Gewebebrocken wurden durch ein Sieb (Durchmesser der Löcher 100 µm) passiert.

Die so erhaltene Suspension wurde anschließend in eine Pe­ trischale mit einem Durchmesser von 100 mm überführt und 10 ml DMEM-Medium mit einem Gehalt an 30 mg Collagenase Typ II hinzugefügt. Zur Einwirkung der Collagenase auf die Fettzel­ len wurde der Ansatz etwa 60 Min. lang bei Raumtemperatur (22°C ± 2°C) stehen gelassen.

Anschließend wurde das Gemisch in 50 ml Falconröhrchen über­ führt und die Röhrchen wurden 10 Min. lang bei 1800 rpm zentrifugiert.

Nach Zentrifugation wurde der Überstand verworfen und das aus Adipozyten und Vorläuferzellen bestehende Zellpellet in 8 ml eines Mediums der folgenden Zusammensetzung aufgenommen und in Petrischalen (Durchmesser 100 mm) 10 Tage lang bei 37°C im Brutschrank inkubiert:

Die Insulinlösung enthielt 18 mg Insulin (Sigmal-0259) ge­ löst in 2 ml Essigwasser (bestehend aus 40 ml H₂O und 0,4 ml Eisessig). Die Lösung wird mit Essigwasser im Verhältnis 1 : 10 verdünnt.

Während der 10 Tage dauernden Inkubation bildete sich das Fettzell-konditionierte Medium, FCCM als Überstand. Der Überstand wurde nach jeweils 2 bis 4 Tagen durch frisches Nährmedium ersetzt. Das jeweils beim Mediumwechsel gewonne FCCM wurde steril filtriert und bei -20°C gelagert. An­ schließend wurden 10 ml des oben beschriebenen FCCM mit etwa 10⁶ Stammzellen gemäß Beispiel 2 in eine Petrischale (Durch­ messer 100 mm) gegeben. Die ersten Fettvakuolen enthaltenden Vorläuferzellen wurden nach 4 Tagen sichtbar (Abb. 3A). Nach 6 Tagen erschienen vereinzelte, mit Sudan-Rot anfärbbare Adipozyten (Abb. 3B und C). Nach 10 Tagen kam es zur typi­ schen Aggregation und Clusterbildung dieser Zellen, die in diesem Stadium bereits makroskopisch als Fettgewebe erken­ nbar wurden (Abb. 3D).

Die durch Anfärben sichtbar gemachten Fettzellen in den Abb. 3A-3D unterscheiden sich damit ganz wesentlich von den Kontrollen 3E und 3F: Abb. 3E zeigt die monozytären Ursprungszellen, die im Nährmedium (wie in Beispiel 2 an­ gegeben) für 6 Tage gezüchtet wurden, jedoch ohne Zusatz von IL-3 und 2-Mercaptoethanol zu dem Nährmedium. Hiernach er­ folgte die Zugabe des FCCM. Diese Zellen waren nicht in der Lage, in Fettzellen zu differenzieren. Abbildung F. zeigt Zellen, die 6 Tage lang mit komplettem Medium (gemäß Beispiel 2) kultiviert wurden, und die dann, statt mit FCCM mit Nährme­ dium (gemäß Beispiel 2) für weitere 6 Tage behandelt wurden. Das FCCM enthält also Komponenten, die als Signalgeber für die Differenzierung in Fettzellen benötigt werden.

Das Färben der Zellen mit Sudan-Rot erfolgte nach der von Patrick Jr., C. W. et al., Epithelial Cell Culture: Breast, in Methods of Tissue Engineering, Academic Press 2002, Kapi­ tel 4, S. 141-149. 3A, B, C und D gezeigt.

B

Zusätzlich zur Phänotypisierung der Fettzellen durch Färbung mit Sudan-Rot erfolgte eine molekularbiologische Cha­ rakterisierung der Fettzellen auf mRNA-Ebene, um zu überprü­ fen, ob das genetische Programm der Fettzelle nach entspre­ chender Programmierung mit dem eingesetzten Fettzell-kon­ ditionierenden Medium eine entsprechende Alteration erfährt und typische, für Fettzellen beschriebene messenger-Ribonuk­ leinsäure (mRNA)-Transkripte in den aus programmierbaren Monozyten programmierten Fetzellen nachweisbar sind. Zwei für den Fettzellstoffwechsel typische mRNA-Seguenzen wurden mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus isolierten RNA- Proben von dedifferenzierten programmierbaren Stammzellen monozytären Ursprungs und, in einem parallelen Versuchsan­ satz, aus den programmierten Fettzellen amplifiziert, näm­ lich "peroxisome proliferative activated receptor gamma" (PPARG) mRNA, (Ref. Tontonoz, P., et al. Stimulation of adi­ pogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor. Cell 79, 1147-1156, 1994), Genbank Zugangscodenummer; NM_005037) und "leptin (obesity homolog, mouse)" mRNA, (Rf. Zhang Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature 372, 425-432, 1994), Genbank, Zugangscodenummer: NM_000320).

Die hierfür notwendige RNA-Isolierung, die reverse Trans­ kriptionsmethodik und die Bedingungen der PCR-Amplifikation der gewünschten mRNA-Sequenzen wurden wie im Stand der Tech­ nik detailliert beschrieben, durchgeführt, s. hierzu, Un­ gefroren H., et al., "Human pancreatic adenocarcinomas ex­ press Fas und Fas ligand yet are resistant to Fas-mediated apoptosis", Cancer Res. 58, 1741-1749 (1998).

Zu diesem Zweck wurden die jeweiligen zur PCR-Amplifikation hergestellten Primer so ausgewählt, daß der forward and reverse Primer an mRNA Sequenzen binden, deren homologe Bereiche im chromosomalen Gen in zwei verschiedenen Exons liegen und durch ein großes Intron voneinander getrennt sind. Hierdurch konnte sichergestellt werden, daß das erhal­ tene Amplifikationsfragment von der in der Zelle enthaltenen mRNA und nicht von der in der chromosomalen DNA vorhandenen Sequenz stammt. Im Einzelnen wurde für PPAR-γ und für Leptin folgende Primersequenzen ausgewählt:

PPAR-γ: forward-primer; 265-288 (korespondierende Gensequenz in Exon 1), reverse-primer: 487-465 (korrespondierende Gese­ quenz in Exon 2), damit ergibt sich ein Amplifikationsfrag­ ment von 487 - 265 bp = 223 bp, s. Abb. 3G. Wie ferner aus Abb. 3G ersichtlich, sind Spuren an transkribierter PPAR-γ- spezifischer mRNA bereits in der programmierbaren Stammzelle und in der Tumorzellinie HL-60 (einer humanen promyeloischen Leukäme-Zelllinie) nachweisbar, allerdings mit signifikant geringerer Signalbande als in der Fettzelle selbst. Dagegen läßt sich das Fettzell-spezifische Protein Leptin nur in den aus der programmierbaren Stammzellen abgeleiteten Fettzellen auf mRNA-Ebene durch reverse-Transkriptase-PCR nachweisen.

Die zur Kontrolle eingesetzten programmierbaren Stammzellen (progr. Stammzelle) und die humanen Tumorzelllinien HL-60, Panc-1 und WI-38 transkribieren kein Leptin. Als Negativ­ kontrollen wurden alle Ansätze ohne Zusatz der reversen Transkriptase (Fettzelle/-RT) und H₂O-Proben simultan mit­ bestimmt. Durch Nachweis des GAPDH-housekeeping Gens in den Positivkontrollen ist sichergestellt, daß die jeweiligen PCR-Amplifizierungsschritte in den Einzelansätzen ordnungs­ gemäß durchgeführt wurden.

Beispiel 7 Herstellung von Leberzellen (Hepatozyten) A

Für die Programmierung der dedifferenzierten programmier­ baren Stammzellen monozytären Ursprungs gemäß Beispiel 2 in Leberzellen wurde zunächst ein konditioniertes Medium gene­ riert. Hierzu wurden 40 g humanes Lebergewebe wie folgt aufgearbeitet.

Zunächst wurde das Lebergewebe mehrmals in PBS gespült, um es weitestgehend von Erythrozyten zu befreien. Anschließend wurde das Gewebe in einer Petrischale zerkleinert und mit einer Dissoziationslösung etwa 45 Min. lang bei Raum­ temperatur inkubiert. Die Dissoiationslösung bestand aus 40 ml PBS (Phosphate buffered sahne), 10 ml einer 1 : 10 mit PBS verdünnten Trypsinlösung und 30 mg Collagenase Typ II (Rod­ bel M., et al. J. Biol Chem 239; 375, 1964). Nach 45minütiger Inkubation wurden die Gewebebrocken durch ein Sieb (s. Bei­ spiel 6) passiert.

Anschließend wurde das Gemisch in 50 ml Falconröhrchen über­ führt, bis auf 50 ml mit PBS aufgefüllt und 10 Min. lang bei 1800 rpm zentrifugiert.

Nach Zentrifugation wurde der Überstand verworfen und das die Leberzellen enthaltende Zellpellet wurde erneut mit 50 ml PBS gewaschen und zentrifugiert. Der so entstandene Über­ stand wurde wiederum verworfen und das Zellpellet in 25 ml eines Mediums der folgenden Zusammensetzung aufgenommen und in Zellkulturflaschen (250 ml Volumen) 10 Tage lang bei 37°C im Brutschrank inkubiert:

Leberzell-Wachstumsmedium

Das Nährmedium enthielt zusätzlich 5 µg (10 ng/ml Epidermal growth factor (Pascall, I. C., et al., 1994, J. Mol. Endocinol. 12, 313). Die Zusammensetzung der Insulinlösung wurde in Bsp. 6 beschrieben.

Während der 10 Tage dauernden Inkubation bildete sich das Leberzell-konditionierte Medium, LCCM als Überstand. Der Überstand wurde nach jeweils 2 bis 4 Tagen durch frisches Nährmedium ersetzt. Das jeweils beim Mediumwechsel gewonnene LCCM wurde steril filtriert (Filter mit 0,2 µm Porengröße) und bei -20°C gelagert.

1 × 10⁶ dedifferenzierte Stammzellen wurden dann mit 10 ml eines Mediums der folgenden Zusammensetzung in einer Petri­ schale (Ø 100 mm) oder einer Kulturflasche kultiviert.

Leberzell-Differenzierungs-Medium

"Hepytocyte growth factor" [Kobayashi, Y. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 220, 7, (1996)] wurde in der Kon­ zentration 40 ng/ml eingesetzt. Nach einigen Tagen konnten morphologische Veränderungen zu flachen, polygonalen mono- oder diploiden Zellen beobachtet werden (Abb. 4A). Nach 10-12 Tagen konnten aus dedifferenzierten Stammzellen entstandene Hepatozyten durch einen immunhistochemischen Nachweis des leberspezifischen Antigens "Alpha-Fetoprotein" identifiziert werden (Jacobsen et al., Am. J. Surg. Pathol. 1981; 5: 257-66), wie auf den Abb. 4B und 4C gezeigt.

B

Zusätzlich zur Phänotypisierung der Hepatozyten durch immun­ histochemischen Nachweis des Alpha-Foetoproteins erfolgte eine molekularbiologische Charakterisierung der Hepatozyten auf mRNA-Ebene um zu überprüfen, ob das genetische Programm der Stammzellen nach entsprechender Programmierung mit dem eingesetzten Leberzell-konditionierenten Medium eine ent­ sprechende Alteration erfährt und als typisch für Leberzel­ len beschriebene messenger-Ribonukleinsäure (mRNA) in den aus den erfindungsgemäßen Stammzellen hervorgegangenen He­ patozyten nachweisbar sind. Zu diesem Zweck wurde das Vor­ handensein von fünf verschiedenen, für Hepatozyten typischen mRNA-Sequenzen mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in isolierten RNA-Proben aus dedifferenzierten programmierbaren Stammzellen monozytären Ursprungs und, in einem parallelen Versuchsansatz, aus den durch Programmieren der Stammzellen erhaltenen Leberzellen untersucht. Im einzelnen handelte es sich um "Homos sapiens albumin mRNA", [Ref. Lawn, R. M. et al. The sequence of human serum albumin cDNA and its expression in E. coli. Nucleic Acids Res.. 9,6103-6114, (1981)], Genbank Zugangscodenummer: NM-000477; "alpha-fetoprotein mRNA" [Ref. Morinaga T, et al. Primary structures of human alpha-feto­ protein and its mRNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.80, 4604-­ 4608, (1983)], Genbank Zugangscodenummer: V01514; "Human carbamyl phosphate synthetase I mRNA" [Ref. Haraguchi, Y., et al., Cloning and sequence of a cDNA encoding human carb­ amyl phosphate synthetase I: molecular analysis of hyper­ ammonemia, Gene 107, 335-340 (1991)], Genbank Zugangscode­ nummer D90282, "Homo sapiens coagulation factor II" (Throm­ bin, F2) mRNA [Ref. Degen, S. J. et al. Characterization of the complementary deoxyribonucleic acid and gene coding for human prothrombin, Biochemistry 22, 2087-2097, (1983)], Gen­ bank Zugangscodenummer NM-000506; "Homo sapiens coagulation factor VII" (serum prothrombin conversion accelerator, F7) mRNA [Ref. NCBI Annotation Project. Direct Submission, 06- Feb-2002, National Center for Biotechnology Information, NIH, Bethesda, MD 20894, USA] Genbank Zugangscodenummer XM- 027508.

Die hierfür notwendige RNA-Isolierung, die reverse Trans­ kriptionsmethodik und die Bedingungen der PCR-Amplifikation der gewünschten mRNA-Sequenzen wurden wie im Stand der Tech­ nik detailliert beschrieben durchgeführt, siehe hierzu Un­ gefroren H. et al. "Human pancreatic adenocarcinomas express Fas and Fas ligand yet are resistant to Fas-mediated apop­ tosis", Cancer Res. 58, 1741-1749 (1998).

Die jeweiligen Primer zur PCR-Amplifikation wurden so aus­ gewählt, daß der "forward" und "reverse" Primer an mRNA-Se­ quenzen binden, deren homologe Bereiche im chromosomalen Gen in zwei verschiedenen Exons liegen und durch ein großes Intron voneinander getrennt sind. Auf diese Weise konnte sichergestellt werden, daß das erhaltene Amplifikationsfrag­ ment von der in der Zelle enthaltenen mRNA und nicht von der in der chromosomalen DNA vorhandenen Sequenz stammt.

Es wurden die nachfolgend angegebenen Primersequenzen ausge­ wählt; die Ergebnisse der jeweiligen PCR Analysen sind in Abb. 4D wiedergegeben. Die erfindungsgemäßen dedif­ ferenzierten, programmierbaren Stammzellen sind dort als "progr. Stammzelle" und die durch Programmieren von diesen abgeleiteten Hepatozyten als "progr. Hepatozyt" bezeichnet.

• - Alpha-Foetoprotein: forward-primer: 1458-1478 (korres­ pondierende Gensequenz in Exon 1), reverse-primer: 1758-1735 (korrespondierende Gensequenz in Exon 2), damit ergibt sich ein Amplifikationsfragment von 1758-1458 bp = 391 bp, siehe Abb. 4D.
  Wie Abb. 4 zeigt, läßt sich die programmierbare Stam­ mzelle (progr. Stammzelle), in der selbst keine spezifischen mRNA-Transkripte für Alpha-Fötoprotein nachweisbar sind, in einen Hepatozyten programmieren (progr. Hepatozyt), der die­ ses mRNA-Transkript enthält (positive Bande mit dem Moleku­ largewicht von 301 bp). Hieraus erklärt sich auch die immun­ histochemische Nachweisbarkeit des Alpha-Fötoproteins, wie auf den Abb. 4B und 4C gezeigt. Die Positiv-Kontrol­ len, namentlich humanes Lebergewebe und die Lebertumorzel­ linie HepG2 transkribieren ebenfalls Alphafötoprotein-spezi­ fische mRNA, wie die Banden von 301 bp bestätigen.
• - Albumin: "forward-primer": 1450-1473 (korrespondierende Gen­ sequenz in Exon 1), "reverse-primer": 1868-1844 (korres­ pondierende Gensequenz in Exon 2), damit ergab sich ein Amplifikationsfragment von 1868 - 1450 bp = 419 bp. siehe Abb. 4D.
  Abb. 4D zeigt Spuren an transkribierter Albumin-spezi­ fischer mRNA bereits in der programmierbaren Stammzelle, während die durch Programmieren der Stammzellen erhaltenen Hepatozyten, sowie die positiv-Kontrollen, nämlich normales Lebergewebe und die Tumorzellinie HepG2 starke Banden expri­ mieren.
• - Carbamyolphosphatase Synthetase I: forward-primer 3135-3157 (korrespondierende Gensequenz in Exon 1), reverse-primer: 4635-4613 (korrespondierende Gensequenz in Exon 2), damit ergibt sich ein Amplifikationsfragment von 4635 - 3135 = 1500 bp, siehe Abb. 4D.
  Die Carbamoylphosphat Synthetase I stellt ein für den Hepa­ tozyten spezifisches Enzym dar, welches eine wichtige Rolle bei der Metabolisierung von Harnstoff im sogenannten Harn­ stoffzyklus übernimmt. Diese Entgiftungsfunktion wird durch funktionsfähige Hepatozyten gewährleistet. Wie Abb. 4D belegt, lassen sich sowohl in den aus programmierbaren Stammzellen generierten Hepatozyten als auch in den Posi­ tiv-Kontrollen (aus humanem Lebergewebe und die HepG2 Tumor­ zellinie) die spezifischen mRNA-Banden (1500 bp) für Car­ bamoylphosphat Synthetase I nachweisen. Die etwas schwächere Expression der mRNA Bande für die programmierten Hepatozyten (progr. Hepatozyt) erklärt sich durch das fehlende Substrat­ angebot in der Kulturschale.
• - Gerinnungssfaktor II: forward-primer 1458-1481 (korrespon­ dierende Gensequenz in Exon 1), reverse-primer: 1901-1877 (korrespondierende Gensequenz in Exon 2), damit ergibt sich ein Amplifikationsfragment von 1901 - 1458 = 444 bp, siehe Abb. 4D.
  Dieses ebenfalls Hepatozyten-spezifische Protein läßt sich lediglich in dem programmierten Hepatozyten (progr. Hepato­ zyt) und in der Positiv-Kontrolle aus humanem Lebergewebe auf mRNA-Ebene durch Bandenexpression bei 444 bp nachweisen, wogegen die programmierbare Stammzelle (progr. Stammzelle) diese Bande nicht zeigt, d. h. das Gen wird dort nicht transkribiert, wie in Abb. 4D gezeigt.
• - Gerinnungsfaktor VII: forward-primer 725-747 (korres­ pondierende Gensequenz in Exon 1), reverse-primer: 1289-1268 (korrespondierende Gensequenz in Exon 2), damit ergibt sich ein Amplifikationsfragment von 1289 - 725 = 565 bp, siehe Abb. 4D.
  Ebenso wie der Gerinnungsfaktor II wird auch dieses Protein lediglich in programmierten Hepatozyten (progr. Hepatozyt) und in der Positivkontrolle (humanes Lebergewebe) transkri­ biert (siehe Banden bei 656 bp), wenn auch schwächer als der Gerinnungsfaktor II. Weder die programmierbare Stammzelle noch die Negativkontrolle (H₂O) zeigen diese spezifische mRNA-Bande.
• - Glyzerinaldehyd-dehydrogenase: Dieses auch als "house­ keeping gene" bezeichnete Gen läßt sich in jeder eukaryotis­ chen Zelle nachweisen und dient als Kontrolle einer in allen Proben ordnungsgemäß durchgeführten PCR-Amplifikation, die parallel mitbestimmt wird und durch Zugabe einer definierten Menge an RNA aus den jeweiligen Zellproben zustande kommt.
• - Als Negativkontrollen wurde in allen Ansätzen H₂O-Proben simultan mitbestimmt. Da H₂O keine RNA enthält, wird auch nichts amplifiziert und die Bande bleibt aus (dient damit als Gegenkontrolle).

Beispiel 8 Herstellung von Hautzellen (Keratinozyten)

Für die Programmierung der dedifferenzierten programmierbaren Stammzellen monozytären Ursprungs gemäß Beispiel 2 in Hautzel­ len wurde zunächst ein konditioniertes Medium generiert. Hierzu wurde 1-2 cm² humane Vollhaut wie folgt aufgearbeitet.

Das Hautmaterial wurde zunächst unter sterilen Bedingungen von der Subcutis befreit. Das Gewebe wurde nun insgesamt 10x mit PBS in einem sterilen Behälter durch kräftiges Schütteln gewas­ chen. Nach der 2. Waschung wurde das Gewebe nochmals von demar­ kierten Bindegewebsresten befreit.

Danach wurde das Hautmaterial in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 60 mm gegeben, dort mit 3 ml einer 1 : 10 mit PBS verdünnten Trypsinlösung versetzt und in kleine Stücke (etwa 0,5 bis 1 mm³) geschnitten. Danach wurden dem Gemisch erneut 3 ml der 1 : 100 mit PBS verdünnten Trypsinlösung zugesetzt und die Mischung wurde bei 37°C 60 Minuten lang unter intermittierendem Schütteln inkubiert.

Danach ließ man die größeren Partikel sedimentieren und der die Keratinozyten enthaltende Überstand wurde abgegossen und bei 800 rpm 5 min. lang zentrifugiert. Der nun entstandene Über­ stand wurde abpipettiert und das Zellpellet in 3 ml eines Mediums der folgenden Zusammensetzung aufgenommen und in Petri­ schalen (ø 100 mm) 15 Tage lang im Brutschrank bei 37°C inku­ biert.

Keratinocyten-Wachstums-Medium

Das Nährmedium enthielt 5 µg "Epidermal growth factor" (genaue Spezifizierung, s. Beispiel 7) und 5 mg Hydrocortison (Ref. Merck Index: 12, 4828).

Während der 15 Tage dauernden Inkubation bildet sich das Kera­ tinozytenzell-konditionierte Medium KCCM als Überstand. Der Überstand wurde nach jeweils 2-4 Tagen durch frisches Nährme­ dium ersetzt. Das jeweils beim Mediumwechsel gewonnene KCCM wurde steril filtriert und bei -20°C gelagert.

1 × 10⁶ dedifferenzierte Stammzellen wurden dann mit 10 ml eines Mediums der folgenden Zusammensetzung in einer Petrischale 100 mm) oder einer Kulturflasche kultiviert.

Keratinocyten-Differenzierungs-Medium

Keratinocyte growth factor wurde in einer Konzentration von 25 ng/ml eingesetzt, wie beschrieben von Finch et al., 1996, Gas­ troenterology 110: 441.

Nach einigen Tagen konnte eine morphologische Veränderung der Zellen beobachtet werden. Nach 6 Tagen ließen sich die kera­ tinozyten-spezifischen Antigene, Cytokeratin 5 und 6, die beide von dem verwendeten Primärantikörper gebunden werden, (Exp. Cell. Res. 1986, 162: 114) nachweisen (Abb. 5A). Nach 10 Tagen erfolgte bereits in Kultur eine Zelladhärenz der deutlich grö­ ßeren Einzelzellen, die einen sichtbaren Zellgewebeverband kon­ fluierender Zellen erkennen ließen (Abb. 5B).

Beispiel 9 In vivo Anwendung dedifferenzierter programmierter Stammzellen monozytären Ursprungs

Zur Abklärung, inwieweit die programmierbaren Stammzellen in vivo nach Injektion über die Pfortader in die Leber eines gene­ tisch-identischen Empfängertieres durch die im Leberorgan vor­ handenen Signalgeber eine spezifische Differenzierung erfahren, wurden Leberorgane weiblicher LEW-Ratten zunächst mit Retrorsin behandelt, um die in der Leber vorhandenen Hepatozyten (Leber­ parenchymzellen) in ihrer Prolieferationsaktivität zu hemmen [Ref. Lacone E. et al. "Long-term, near-total liver replacement by transplantation of isolated hepatocytes in rats treated with retrorsine, Am J Path 153, 319-329, (1998)].

Zu diesem Zweck erhielten die LEW-Ratten 30 mg des Pyrro­ lizidin-Alkaloids Retrorsin, intraperitoneal zweimalig, inner­ halb von 14 Tagen gespritzt. Anschließend erfolgte eine 80% Resektion der so vorbehandelten Lebern gefolgt von der Gabe von 5 × 10⁵ der programmierbaren Stammzellen in 1 ml PBS in die Pfortader der verbliebenen Restleber. Die Stammzellen waren wie in Beispiel 2 beschrieben aus Monozyten männlicher LEW-Ratten gewonnen worden. 5 Tage nach Gabe der Stammzellen erfolgte eine Stanzbiopsie der Leber zur histologischen Beurteilung der Leber und zum Nachweis der aus den Stammzellen differenzierten Zell­ typen mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) mit Y- Chromosom spezifischen Sonden, wie ausführlich in Hoebee B., de Stoppelaar JM, et al. Isolation of rat chromosome-specific paint probes by bivariate flow sorting followed by degenerate oligonucleotide primed-PCR. Cytogenet Cell Genet 66: 277-282 (1994) beschrieben.

Abb. 7A zeigt die aus den männlichen LEW-Stammzellen ab­ geleiteten Y-Chromosom-positiven (rote Punkte im Zellkern) Heptozyten am 5. Tage nach intraportaler Injektion in Retror­ sin-vorbehandelte 80%-resezierte Leberorgane weiblicher Empfän­ gertiere. Die selektive Entnahme der gleichen Leber am Tag 25 nach Stammzellinjektion zeigt die Differenzierung der Stammzel­ len in Hepatozyten, Endothelzellen und Gallengangsepithelien. Zu diesem Zeitpunkt hat die Lebergröße bereits wieder Nor­ malgröße erreicht und < 90% der Zellen weisen ein Y-Chromosom auf. Hieraus kann gefolgert werden, daß die injizierten syn­ genen programmierbaren Stammzellen monozytären Ursprungs in der Lage sind, in vivo eine komplette Wiederherstellung des Leber­ organs mit normaler metabolischer Funktion zu bewerkstelligen. Abb. 7C zeigt hierzu die Überlebenskurven nach Kaplan- Meier (n = 4 pro Gruppe), Stammzell-behandelter versus unbehandel­ ter Empfängerratten nach Retrorsingabe und 80% Leberresektion.

Die Funktionsparameter Bilirubin und Ammoniak (NH₃) belegen die volle metabolische Funktion der langzeit überlebenden Stamm­ zell-behandelten Tiere (Abb. 7D und 7E).

Claims (24)

1. Verfahren zur Herstellung von dedifferenzierten, pro­ grammierbaren Stammzellen humanen monozytären Ursprungs, dadurch gekennzeichnet, daß man

• a) Monozyten aus Human-Blut isoliert;
• b) die Monozyten in einem geeigneten Kulturmedium ver­ mehrt, welches den zellulären Wachstumsfaktor M-CSF enthält;
• c) die Monozyten gleichzeitig mit oder im Anschluß an Stufe b) in einem IL-3 enthaltenden Kulturmedium kul­ tiviert; und
• d) die in Stufe c) gebildeten humanen adulten dedifferen­ zierten, programmierbaren Stammzellen gewinnt, indem man die Zellen von dem Kulturmedium abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Kulturmedium in Stufe c) ferner eine Mercaptoverbindung zusetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mercaptoverbindung verwendet, in der mindestens eine Kohlenwasserstoffgruppe an den Schwefel gebunden ist, wobei die Kohlenwasserstoffgruppe(n) mit einer oder mehreren wei­ teren funktionellen Gruppen substituiert sein kann (kön­ nen).

4. Verfahren nach den Ansprüchen 2 oder 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Mercaptoverbindung 2-Mercaptoethanol oder Dimethylsulfoxid ist.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeich­ net, daß man die Zellen im Anschluß an Stufe c) und vor Stufe d) mit einem biologisch verträglichen organischen Lö­ sungsmittel in Kontakt bringt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das biologisch verträgliche organische Lösungsmittel ein Alko­ hol mit 1-4 Kohlenstoffatomen ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkohol Ethanol ist.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 5 bis 7, dadurch gekennzeich­ net, daß man die Zellen mit der Dampfphase des biologisch verträglichen organischen Lösungsmittels in Kontakt bringt.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen im Anschluß an Stufe e) in einem geeig­ neten Zellkulturmedium suspendiert.

10. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium RPMI oder DMEM ist.

11. Verfahren nach den Ansprüchen 9 oder 10, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Medium ein Zytokin oder LIF enthält.

12. Verfahren nach den Ansprüchen 9 bis 11, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man die Zellen in einem flüssigen Medium suspendiert und anschließend tiefgefriert.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium ein Zellkulturmedium ist.

14. Dedifferenzierte, programmierbare Stammzellen humanen mono­ zytären Ursprungs.

15. Stammzellen nach Anspruch 14, erhältlich nach dem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 13.

16. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend die de­ differenzierten, programmierbaren Stammzellen nach den Ansprüchen 14 oder 15.

17. Verwendung der dedifferenzierten, programmierbaren Stamm­ zellen nach den Ansprüchen 14 oder 15, zur Herstellung von Zielzellen und Zielgewebe.

18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man

• a) die gewünschten Zielzellen enthaltendes Gewebe zer­ kleinert;
• b) die Zielzellen und/oder Fragmente derselben aus dem zerkleinerten Gewebe gewinnt;
• c) die Zielzellen und/oder Fragmente derselben in einem geeigneten Kulturmedium inkubiert;
• d) den Überstand des Kulturmediums während und nach der Inkubation als Zielzell-konditioniertes Medium sam­ melt; und
• e) zum Reprogrammieren/Differenzieren der Stammzellen in die gewünschten Zielzellen die Stammzellen in Gegen­ wart des Zielzell-konditionierten Mediums wachsen läßt.

19. Verwendung nach den Ansprüchen 17 oder 18 zur Herstellung von Adipocyten.

20. Verwendung nach den Ansprüchen 17 oder 18 zur Herstellung von Neuronen und Gliazellen.

21. Verwendung nach den Ansprüchen 17 oder 18 zur Herstellung von Endothelzellen.

22. Verwendung nach den Ansprüchen 17 oder 18 zur Herstellung von Keratinocyten.

23. Verwendung nach den Ansprüchen 17 oder 18 zur Herstellung von Hepatozyten.

24. Verwendung nach den Ansprüchen 17 oder 18 zur Herstellung von Inselzellen.