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JP2948661B2 - ストレプトミセス ｓｐ． Ｐ ６６２１ ＦＥＲＭ Ｐ ２８０４の発酵培養液からクラブラン酸及びその薬剤学的に応用可能な塩を分離する新規な方法 - Google Patents

ストレプトミセス ｓｐ． Ｐ ６６２１ ＦＥＲＭ Ｐ ２８０４の発酵培養液からクラブラン酸及びその薬剤学的に応用可能な塩を分離する新規な方法

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JP2948661B2
JP2948661B2 JP7522554A JP52255495A JP2948661B2 JP 2948661 B2 JP2948661 B2 JP 2948661B2 JP 7522554 A JP7522554 A JP 7522554A JP 52255495 A JP52255495 A JP 52255495A JP 2948661 B2 JP2948661 B2 JP 2948661B2
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clavulanic acid
fermentation broth
separating
streptomyces
microfiltration
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デジディ カプデル
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REKU TOBARINA FUARAMASEUTSUSUKII IN KEMICHINIKU IZUDERUKOBU DEI DEI
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REKU TOBARINA FUARAMASEUTSUSUKII IN KEMICHINIKU IZUDERUKOBU DEI DEI
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
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    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D503/00—Heterocyclic compounds containing 4-oxa-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. oxapenicillins, clavulanic acid derivatives; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulfur-containing hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 （IPC C12P 17/18,C07D 498/04） 本発明は製薬業の分野に関するものであり、ストレプ
トミセス（Streptomyces）sp.P 6621 FERM P 2804の発
酵培養液からグラブラン酸及びその薬剤学的に応用可能
な塩を分離する新規なかつ改良された方法に関するもの
である。
技術上の問題点 クラブラン酸生産菌によって得られる発酵培養液から
の分離によって純粋なクラブラン酸及び例えばクラブラ
ン酸カリウムのような薬剤学的に応用可能な塩を調製す
る新規なかつ改良された方法であって、所望の生産物の
複雑な従来技術による分離法及びクロマトグラフによる
精製を回避するようにした方法に対する必要性は常に存
在している。
従来技術 クラブラン酸は、以下の構造式にて示される（2R,5R,
Z）−３−（２−ヒドロキシエチリデン）−７−オキソ
−４−オキサ−１−アザビシクロ［3,2,0］ヘプタン−
２−カルボン酸の一般名である。
クラブラン酸のアルカリ金属塩及びエステルはある種
のグラム陰性菌並びにある種のグラム陽性菌によって生
産されるベータラクタマーゼの阻害剤としての活性を有
する。
ベータラクタマーゼ阻害作用に加えて、クラブラン酸
及びそのアルカリ金属塩はまた、ペニシリン及びセファ
ロスポリン系のベータラクタム抗生物質と併用すること
によって相乗作用を示す。従って、クラブラン酸及びそ
の塩はベータラクタム抗生物質の非活性化を阻止するた
めのガレヌス製剤（galenic preparation）において使
用される。商品化された製剤はアモキシシリン三水和物
と併用したより安定なクラブラン酸カリウム塩（酸単独
ではむしろ不安定である）を含んでいる。
クラブラン酸は例えばS.クラブリゲルス（clavuliger
us）NRRL 3585,S.ジュモニネンシス（jumoninensis）NR
RL 5741,S.カツラハマヌス（katsurahamanus）IFO 1371
6及びストレプトミセスsp.P 6621 FERM P 2804のような
各種のストレプトミセス菌を含んだ種々の菌のようなク
ラブラン酸生産菌の発酵によって調製される。
発酵の後に得られる水性の培養液は精製され、水性溶
液を有機溶媒で抽出して有機溶媒中に不純物を含んだク
ラブラン酸の溶液を得る前に、例えばイギリス特許第1,
508,977号に開示されているようなろ過及びクロマトグ
ラフによる精製からなる従来の方法に従って精製及び濃
縮される。
イギリス特許第1,508,977号では、とりわけクラブラ
ン酸の塩は、ろ過された培養液中のクラブラン酸アニオ
ン塩をアニオン性交換樹脂上に吸着させ、それを電解質
で溶出し、生成した溶液を脱塩し、溶媒を除去すること
によって得られると開示されている。この方法は所望の
物質の許容できる生成量を得るために使用されるが、ク
ロマトグラフ法による複雑な精製が必要とされ、樹脂カ
ラムの使用は、大規模な生産操作を制限するような重要
な投資を要する。
イギリス特許第1,543,563号はS.クラブリゲルスNRRL
3585菌を用いた改良された発酵方法を開示しており、媒
体のpH値が6.3〜6.7の範囲に維持されると所望の化合物
の生成量が増大すると述べている。クラブラン酸カリウ
ムのようなクラブラン酸塩はクラブラン酸リチウムから
再び塩にすることによって調製され、それによって所望
のに化合物も精製される。
ヨーロッパ特許出願公開第0026044号はクラブラン酸
の調製における有効な中間体としてクラブラン酸のtert
−ブチルアミン塩の使用を開示している。この塩はベル
ギー特許第862211号によって公知であるが薬剤処方中に
おける一成分としてのみ開示されている。
ヨーロッパ特許第0182522号は、S.クラブリゲルス菌
の発酵によってクラブラン酸を調製する方法を開示して
いる。この方法の重要な改良はその方法の中で連続的あ
るいは断続的に発酵媒地中にグリセロールのような炭素
原を付加することによって達成されており、ここでは炭
素レベルが十分に低い濃度、すなわち0.5％（w/v）以下
かつ２％を越えない濃度、に維持されている点が特に重
要である。炭素原が発酵の際に加えられた場合、クラブ
ラン酸の生成量が増大するという本質的な改良が見られ
るという例が開示されている。160時間後の発酵培養液
中のクラブラン酸の濃度は約1400μg/mlであり、これは
従来の方法に比べて顕著な改良であると述べられてい
る。
更なる改良は、溶液からクラブラン酸をそのリチウム
塩の形にて精製する新規な方法も含まれる。しかしなが
ら、より純度の高いクラブラン酸リチウムを得るには例
えば塩化リチウムのような他のリチウム塩の濃縮液が加
えられている。得られた再結晶されたクラブラン酸リチ
ウムは更に精製され、そして、上述の文献から周知の方
法にてクラブラン酸カリウムのような他の塩に任意に変
換される。
菌糸体、蛋白及び他の固形物は、菌糸体を凝集し、さ
らにろ過を容易にするために、選択された凝集剤で発酵
培養液を可能な前処理をしてから遠心分離あるいはろ過
のような周知の方法を用いて除去される。ろ過された発
酵培養液は更にイオン交換樹脂あるいは蛋白を除去する
ためにアセトンのような溶媒で沈澱させることによって
処理され、沈澱物は遠心分離及びろ過を繰り返すことに
よって分離される。このように発酵培養液に初めから存
在する懸濁液中の菌糸体、蛋白及び他の混在する粒子を
分離することは、時間もかかり、複数の処理工程を必要
とする。
純粋なクラブラン酸及びその塩の調製はもちろん、菌
糸体、蛋白及び他の懸濁した粒子を除去し、そして得ら
れた透明な発酵培養液から分離するというこのような時
間のかかる方法は、ヨーロッパ特許出願公開第0385552
号及びヨーロッパ特許出願公開第0387178号によって開
示された方法によって回避することができる。
方法全体は３工程からなり、すなわち、菌糸体、蛋白
及び他の固形粒子の含まれた発酵培養液の精製、クラブ
ラン酸の安定な中間体の塩を生成するために第１級、第
２級及び第３級アミンのいずれか１つを用いることによ
ってストレプトミセスクラブリゲルスの精製されたろ液
培養液中において不純物形態にて存在するクラブラン酸
を精製し、それによりクラブラン酸中に混在する不純物
の大部分が分離され、そして最後の工程にてクラブラン
酸の中間体アミン塩（純度85％）が例えばクラブラン酸
カリウムのような所望のアルカリ金属塩に変換される。
第１の工程はヨーロッパ特許出願公開第0385552号に
おいてより詳細に開示されており、ストレプトミセス
クラブリゲルス菌の発酵によって得られる水性の培養液
から、凝集−フロック化の物理化学的な方法によって菌
糸体、蛋白及び他の固体粒子が除去される。この方法に
て得られたフロックは十分に大きくかつ凝集しており、
容易に沈降及び分離がなされ、この分離はローリングふ
るいによってもっとも良好に達成される。その結果透明
な培養液が得られ、逆浸透によって任意に濃縮される。
この方法において、精製された発酵培養液が得られ、
例えば遠心分離、活性炭への吸着、コアジュバンド等と
ともにろ過するような従来の精製法が回避できる。
全ての公知の方法において（開示されたフロック化法
とは異なり）、精製された培養液は所望の物質の最終生
成量において深刻な総量の損失を引き起こすような脱蛋
白化及びイオン交換の種々の方法によって処理される必
要もある。周知の方法と比較して、フロック化法におけ
る総生成量は85〜90％に達する。
ストレプトミセス クラブリゲルスのの発酵培養液か
ら凝集−フロック化を行う開示された方法は、無機電解
質を培養液に添加することによって凝集作用が増大する
ことに基づいており、凝集方法の開始剤として無機凝集
剤を撹拌しながら媒体のpH値を６〜８にて適用し、フロ
ック化が開始されると有機電解質を加え、ローリングふ
るいあるいはろ過を用いて発酵培養液から得られたフロ
ックを任意に分離し、フロック化が水不溶性の溶媒中に
て起こる場合は、相をデカンテーションし、フロックを
分離し、逆浸透あるいは蒸発によって溶液を任意に濃縮
する。
ヨーロッパ特許出願公開第0562583号は、発酵の後に
形成されたクラブラン酸の存在する水性培養液の溶媒抽
出の後、得られた酢酸エチル抽出物から純粋なクラブラ
ン酸あるいはクラブラン酸カリウムのようなクラブラン
酸のアルカリ金属塩を分離及び調製するための有効な中
間体として例えばN,N′−ジイソプロピルエチレンジア
ンモニウムジクラブラネートのような有機ジアミンを有
するクラブラン酸塩の使用を開示している。
技術的な解決手段 本発明の目的は、例えばストレプトミセスsp.P 6621
FERM P 2804のようなクラブラン酸生産菌によって得ら
れる発酵培養液からクラブラン酸を分離する方法を改良
することであり、この方法において、水性の培養液中に
混在する菌糸体、蛋白及び他の懸濁した固形粒子を除去
する時間のかかる従来法が回避され、クラブラン酸カリ
ウムのような高純度の塩が調製される。
本発明による安定な塩とは、例えばナトリウム、カリ
ウム、カルシウム及びマグネシウム塩のような薬剤学的
に適用可能なアルカリ金属及びアルカリ土類金属の塩で
ある。これらの塩のうちではナトリウム及びカリウム
塩、特にカリウム塩が最適である。
本発明は一般にはクラブラン酸生産菌によって得られ
る発酵培養液の精製に有用である。
上述の従来技術から明かなように、周知の方法は時間
のかかる分離法からなっており、ヨーロッパ特許出願公
開第0385552号のみが改良された方法、すなわち完全に
透明な発酵培養液が得られる方法を開示している。しか
しながら、この方法において所望の目的を達成しようと
すれば、例えば無機電解質、凝集剤、有機ポリ電解質の
ような複数の試薬を使用しなければならず、発酵培養液
のフロック化、沈降あるいはろ過は比較的長時間の生成
時間を要し、そのことは所望の生成物の純度に影響を与
えるという欠点を有する。
２頁、第２欄、22〜25行において、発酵培養液の精製
のいくつかの可能性について述べられているが、その方
法はクラブラン酸の生成量の重大な減少を伴うものであ
る。さらに分離及び精製の方法において、例えば限外ろ
過及び逆浸透のような複数の複雑な技術を使用すること
は、これらの方法を使用することが活性炭あるいはイオ
ン樹脂による前ろ過を必要とするので、方法を簡略化す
るものではないと言える。
これらの記述に対して、本発明に従って、菌糸体、蛋
白の大部分（培養液中に存在する量の少なくとも80％）
及び他の懸濁した粒子が取り除かれる精密ろ過が使用さ
れた場合、文献に開示されているような水性発酵培養液
の精製の他の時間のかかる方法と共にヨーロッパ特許出
願公開第0385552号に開示された方法において使用され
るような複数の試薬の使用を避けることを可能にすると
いうことが見いだされた。
この目的において連続的な精密ろ過のための多段階装
置が使用され、30分以下の滞留時間において菌糸体及び
水性ろ液を分離する方法を実施可能にする。この装置は
複数の（５つの）一連に連結された個々のセグメント
（ろ過ループ）から構成されている。各々のセグメント
は孔径0.05μｍであるセラミックろ過エレメントのチャ
ネルを通過する発酵培養液の所望の通過速度（５〜8m/
s）を許容する循環ポンプをそれぞれ有している。約20
〜40℃の温度（温度は40℃を越えてはならない）にて行
われる精密ろ過方法において、接線方向（tangentiona
l）の速度がそのような方法にて調整されるので、固体
のフラクション中に30,000以上の分子量の分子が保持さ
れる。この方法において、存在する蛋白の約80〜90％を
除去することに成功した。精密ろ過において分離された
菌糸体はまた、得られたろ液中におけるクラブラン酸の
生成量を増大させるために水にて洗浄された。精密ろ過
によって水性の発酵培養液を精製する開示された方法に
よって、クラブラン酸の95％以上が精製された水相に留
まり、それはヨーロッパ特許出願公開第0385552号のフ
ロック化法の結果を上回るものであり、本発明の更なる
改良を示すものである。
精密ろ過の後、ろ液は選択的に限外ろ過方法によって
精製される。この精製の目的は、残存する蛋白不純物の
大部分及びクラブラン酸より大きい分子量を有する他の
付随する不純物を分離することにある。この方法におい
て、不必要な不純物は有効に取り除かれ、これは水不溶
性の有機溶媒との抽出において沈澱し、これによって精
密ろ過による精製後に得られた水性のろ液の着色が本質
的に低減され、所望の生成物の純度が更に高められる。
限外ろ過装置においては約20,000ダルトン（10,000〜
30,000ダルトンの間）の高い分離度を有する高分子膜が
使用される。この方法は連続的に行われ、滞留時間をで
きるだけ短くすることができ、限外ろ過装置が２つ以上
連続的に連結され（それにより不純物及びクラブラン酸
の分離選択性を増大させる）、限外ろ過方法において得
られた保持物（水相）を流す向流とともに純粋な洗浄水
を加えることによって、水相中におけるクラブラン酸の
損失は５％以下に抑えられる。
得られた水性のろ液は、ほぼ室温において逆浸透装置
において最初の量の約1/5にまで濃縮され、不純物を含
んだクラブラン酸の濃縮された水相が得られ、得られた
濃縮物（保持物）は、硫酸のような無機酸を加えること
によって媒体のpHが１〜３に調整された酸性媒体中にお
いてたとえば酢酸エチルのような水不溶性の有機溶媒を
用いて15〜25℃の温度にて直接抽出される（抽出は15℃
以下の温度にても行うことが可能である）。酢酸エチル
の他に、例えば酢酸メチル、メチルイソブチルケトンあ
るいはｎ−ブチルアルコールのような他の水不溶性有機
溶媒が使用され得る。
精密ろ過方法によって菌糸体及び存在する蛋白の大部
分を除去することに成功したことから、上述の文献によ
って開示された周知の方法において適用されているよう
な時間のかかる精製方法を使用することなしに、酢酸エ
チルのような適切な水不溶性有機溶媒を用いて精製され
濃縮された水性の発酵培養液の直接抽出が可能になり、
発酵培養液を精製するための凝集−フロック化法におい
て適用されるような余分な試薬を使用することを回避で
きた。従って、上述の改良に加え、本発明における方法
はまた、発酵培養液精製法の費用の低減をも提供してい
る。不純物を含んだクラブラン酸を水相から有機相に抽
出する工程において、有機溶媒あるいは硫酸との相互作
用によって水相濃縮物中に残存する蛋白の変性を避ける
ために、一連の遠心抽出機において抽出されるのが最適
であり、それらの抽出機の１つ、すなわちセルフエンプ
ティング（self−emptying）遠心分離機において、分離
された蛋白が同時にかつ連続的に除去される。
得られた水不溶性有機溶媒中における不純物を含んだ
クラブラン酸の抽出物中に、クラブラン酸単独より極性
の高いクラブラン酸の種々の分解生成物のような水溶性
の不純物が更に存在しており、この水溶性の不純物は得
られた有機相を水で洗浄することによって除去される。
この方法において、酢酸エチル抽出物のような有機相に
おけるクラブラン酸の精製された抽出物が得られる。
クラブラン酸は有機相から分離され、ヨーロッパ特許
出願公開第0562583号の方法における開示に従って精製
される。本特許出願において記載されたクラブラン酸を
分離する最適な方法はほぼ室温において、クラブラン酸
の酢酸エチル抽出物とN,N′−ジイソプロピルエチレン
ジアミンとの反応によって達成され、引き続いて、水性
イソプロパノール溶液中において得られた中間体である
N,N′−ジイソプロピルエチレンジアンモニウムジクラ
ブラネートのカリウム−２−エチルヘキサノエートとの
転換によって室温にてクラブラン酸カリウムが得られ、
高純度にて分離される。
中間体であるN,N′−ジイソプロピルエチレンジアン
モニウムジクラブラネートの調製は、クラブラン酸の酢
酸エチル抽出物のような水不溶性の有機相とN,N′−ジ
イソプロピルエチレンジアミンとの反応において、水が
完全に除去された有機相が使用される方法において最適
に行われることが明らかになった。その理由としてはす
でに存在する少量の水が中間体塩の調製の障害となるか
らであり、すなわち、有機相中に存在する水に分離され
た塩が溶解しピッチ様の副産物が得られ、それが乾燥を
困難にするのである。
水が完全に有機相から除去された場合、有機相あるい
は抽出物の安定性は増大し、なぜならば抽出方法におい
て水溶液中及び酸性pH溶媒中におけるクラブラン酸の安
定性は非常に乏しいことが周知だからである。従ってク
ラブラン酸の酢酸エチル抽出物のような有機相の乾燥
は、高温における中間体塩の安定性が乏しいので、真空
中にて精留カラム（分留の原理）における乾燥が使用さ
れる。酢酸エチルのような有機相と水が最少の沸点を有
する共沸混合物を形成し、従って酢酸エチル抽出物のよ
うな有機相が開示された方法にて完全に乾燥されるのが
この方法の本質的な特徴である。すなわち、酢酸エチル
抽出物のような有機相は常に0.1容量％未満の水分、平
均的には0.03〜0.05容量％の水分を含んでいる。クラブ
ラン酸の酢酸エチル抽出物のような完全に無水の有機相
は、非常に短い滞留時間内で、蒸発によって初めの量の
1/20まで濃縮され、その後N,N′−ジイソプロピルエチ
レンジアミンと反応させる。
引き続いて行われるN,N′−ジイソプロピルエチレン
ジアンモニウムジクラブラネートとカリウム−２−エチ
ルヘキサノエートとの反応によって、ヨーロッパ特許出
願公開第0562583号において開示されたような高純度の
クラブラン酸カリウムが得られ、例において開示されか
つ上述の改良によって述べられた方法にて最適に達成さ
れる。
本発明は以下に示す例によって延べられるがそれのみ
に限定されるものではない。
例１ 不純物を含んだクラブラン酸の酢酸エチル抽出物の濃縮
物の連続的な調製 ストレプトミセスsp.P 6621 FERM P 2804菌の発酵に
よって得られた水性発酵培養液（10,000リットル）が、
媒体のpH値が5.8〜6.2の間に維持されるよう撹拌及び冷
却しながら容器（容量50m3）中の33％硫酸水溶液（５リ
ットル）中に加えられた。その後、培養液は1200リット
ル/hの流速にて精密ろ過装置に加えられた。該ろ過装置
は５つの連続する連結セグメントから構成されている。
各々のセグメントは、孔径0.05μｍのセラミックろ過エ
レメントのチャネルを通過する発酵培養液の通過速度が
8m/sとなるように設定された循環ポンプをそれぞれ備え
ている。温度が40℃を越えないように注意された精密ろ
過方法によって、菌糸体、蛋白の大部分及びその他懸濁
した固体粒子が除去された。
分離された固体は、流速300リットル/hの水で洗浄さ
れ、精密ろ過にて得られたろ液（透過物）は流速1500リ
ットル/hにて連続的に逆浸透装置に加えられ、この装置
において透過物は最初の量の1/5まで濃縮された。
流速300リットル/hにて逆浸透をした後に得られた濃
縮物（保持物）に、媒体のpH値が1.5〜2.0の間に維持さ
れるように33％硫酸水溶液が加えられ（４リットル/
h）、室温条件下、一連の５つの遠心抽出機において向
流にて酸性の保持物を抽出するために900リットル/hの
流速にて酢酸エチルが加えらた。この抽出機における第
２のセルフエンプティング（self−emptying）遠心分離
機において残存する蛋白が同時に除去された。
一連の遠心抽出機から得られた酢酸エチル抽出物は流
速30リットル/hの脱イオン水にて第１の遠心抽出機にお
いて洗浄され、残存する水溶液の不純物が除去された。
900リットル/hの流速を有する酢酸エチル抽出物は、
真空条件下、30℃の温度にて精留カラム中にて乾燥さ
れ、0.03容量％の水分量が達成され、その後抽出物は、
真空条件下30℃の温度にて薄層エバポレータにおいて最
初の量の1/20まで濃縮された。45リットル/hの流速を有
する得られた濃縮された酢酸エチル抽出物（不純物を含
んだクラブラン酸の濃度は50g/リットル）は活性炭（0.
45kg）を加えることによって脱色され、混合物を30分撹
拌した後、活性炭が酢酸エチル抽出物の濃縮物の懸濁液
から１バールの窒素圧にて圧力フィルタにてろ去され、
不純物を含んだクラブラン酸を含む酢酸エチル抽出物の
乾燥濃縮物（45リットル）を得た。
例２ N,N′−ジイソプロピルエチレンジアンモニウムジクラ
ブラネートの調製 例１の連続的な方法において得られた酢酸エチル抽出
物の乾燥濃縮物（45リットル）（クラブラン酸含量は50
g/リットルである）中に、25℃の温度にて５分間強く撹
拌しながら、N,N′−ジイソプロピルエチレンジアミン
（1.4リットル）が加えられた。得られた懸濁液はろ過
されて取り除かれ、得られた結晶は再びアセトン（45リ
ットル）中に懸濁され、10℃以下の温度にて懸濁液を撹
拌及び冷却しながら、所望の物質の結晶を分離し、結晶
はろ去され、アセトンにて洗浄され、真空条件下、30℃
の温度にて乾燥された。N,N′−ジイソプロピルエチレ
ンジアンモニウムジクラブラネート（3.3kg、クラブラ
ン酸の含量60％）の結晶が得られた。
例３ クラブラン酸カリウムの調製 例２から得られたN,N′−ジイソプロピルエチレンジ
アンモニウムジクラブラネート（3.3kg）がイソプロパ
ノール／水混合液（82.5リットル，水が1.5％）中に溶
解され、得られた溶液に活性炭（1.5kg）及びカリウム
−２−エチルヘキサノエート（0.5リットル,2M）が室温
にて30分間撹拌しながら加えられた。その後、活性炭及
び得られた沈澱がろ去された。得られたろ液にカリウム
−２−エチルヘキサノエート（2M）のイソプロパノール
溶液（６リットル）が室温にて20分間撹拌しながら加え
られた。得られた懸濁液は０〜５℃の温度にて冷却しな
がら更に２時間撹拌され、分離された結晶をろ去し、イ
ソプロパノール及びアセトンにて洗浄され、真空条件
下、30℃の温度にて乾燥された。クラブラン酸カリウム
（2kg,USPグレード、HPLC法にて決定されたクラブラン
酸含量80.6％）が得られた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 17/00 - 17/18 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】水性発酵培養液からクラブラン酸を分離す
    る方法であって、菌糸体、蛋白の大部分及び他の懸濁し
    た固体粒子が精密ろ過によって除去される方法。
  2. 【請求項２】請求項１に記載の方法において、前記固体
    粒子が孔径0.05μｍを有するフィルターエレメントを介
    した連続的な精密ろ過によって除去される方法。
  3. 【請求項３】請求項１又は２に記載の方法において、水
    性発酵培養液のろ過が精密ろ過工程及びそれに続く限外
    ろ過工程を含む方法。
  4. 【請求項４】請求項３に記載の方法において、限外ろ過
    が10,000〜30,000ダルトンの分離度を有する半透膜を用
    いて連続的に行われる方法。
  5. 【請求項５】請求項３又は４に記載の方法において、水
    不溶性溶媒にて抽出する前に逆浸透によって水を除去す
    る工程を含む方法。
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