JP2532365B2 - 細菌の外来蛋白質の改良された生産のための発現プラスミド - Google Patents
細菌の外来蛋白質の改良された生産のための発現プラスミドInfo
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- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12N9/6481—Pepsins (3.4.23.1; 3.4.23.2; 3.4.23.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K—PEPTIDES
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-
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の利用分野 本発明は細菌において外来蛋白質を発現せしめるため
の組換えDNA技術に関する。より詳しくは、大腸菌（Esc
herichia coli）においてプロキモシン及び哺乳類の成
長ホルモンの有効な直接的発現方法及びそのための手段
に関する。
の組換えDNA技術に関する。より詳しくは、大腸菌（Esc
herichia coli）においてプロキモシン及び哺乳類の成
長ホルモンの有効な直接的発現方法及びそのための手段
に関する。
従来の技術 子牛レンニン（キモシン）、すなわちチーズ製造に使
用するための好適な牛乳凝固プロテアーゼは供給が不足
している。他の牛乳凝固剤、すなわちカビの蛋白分解酵
素が開発研究されてきた。しかし、これらの蛋白分解活
性が大きいのでチーズの収量を低下させ、しばしば苦味
を与える。
用するための好適な牛乳凝固プロテアーゼは供給が不足
している。他の牛乳凝固剤、すなわちカビの蛋白分解酵
素が開発研究されてきた。しかし、これらの蛋白分解活
性が大きいのでチーズの収量を低下させ、しばしば苦味
を与える。
牛乳凝固プロテアーゼの安定且つ充分な供給は経済的
に有利なので何人かの研究者がこの問題に組換えDNA技
術を適用してきた。Beppu et al,J.Biochem.90:901-904
（1981）は大腸菌（E.coli）のプロレンニン（プロキモ
シン）の構造遺伝子のクローニングを報告している。続
く文献として、Beppu et al,J.Biochem.91:1085-1088
（1982）は大腸菌（E.coli）の中でクローンされた子牛
プロレンニンcDNAのヌクレオチド配列を報告している。
lacUV5プロモーターを有する発現プラスミドの構成及び
その大腸菌（E.coli）β−ガラクトシダーゼの短いＮ−
末端ペプチドに結合されたプロキモシンペプチドのほと
んどすべてを含有する融合蛋白質を産生する能力はBepp
u et al.,Gene 19:337-344（1982）によつて記載されて
いる。
に有利なので何人かの研究者がこの問題に組換えDNA技
術を適用してきた。Beppu et al,J.Biochem.90:901-904
（1981）は大腸菌（E.coli）のプロレンニン（プロキモ
シン）の構造遺伝子のクローニングを報告している。続
く文献として、Beppu et al,J.Biochem.91:1085-1088
（1982）は大腸菌（E.coli）の中でクローンされた子牛
プロレンニンcDNAのヌクレオチド配列を報告している。
lacUV5プロモーターを有する発現プラスミドの構成及び
その大腸菌（E.coli）β−ガラクトシダーゼの短いＮ−
末端ペプチドに結合されたプロキモシンペプチドのほと
んどすべてを含有する融合蛋白質を産生する能力はBepp
u et al.,Gene 19:337-344（1982）によつて記載されて
いる。
1983年３月２日に公開されたヨーロツパ特許出願第7
3,029号は子牛プロレンニンDNA含有プラスミド、該プラ
スミドで形質転換された微生物（E.coli）及びそれらに
よるプロレンニンの発現を記載している。
3,029号は子牛プロレンニンDNA含有プラスミド、該プラ
スミドで形質転換された微生物（E.coli）及びそれらに
よるプロレンニンの発現を記載している。
1982年７月28日に公開された英国特許出願第2,091,27
1A号は種々のプロモーター（lac，trp，ura3,等）を使
用して発現させることからなるレンニン、プロレンニン
及びプレプロレンニンを製造する方法及び薬剤を開示し
ている。プレプロレンニンをコードしている開示された
DNA配列の１つには５′−末端に転写プロモーターとリ
ボゾーム結合部位が付加している。プレプロレンニンを
コードしているDNAの開始部位と転写プロモーターとリ
ボゾーム結合部位を有するDNA断片との間の距離は変化
する。
1A号は種々のプロモーター（lac，trp，ura3,等）を使
用して発現させることからなるレンニン、プロレンニン
及びプレプロレンニンを製造する方法及び薬剤を開示し
ている。プレプロレンニンをコードしている開示された
DNA配列の１つには５′−末端に転写プロモーターとリ
ボゾーム結合部位が付加している。プレプロレンニンを
コードしているDNAの開始部位と転写プロモーターとリ
ボゾーム結合部位を有するDNA断片との間の距離は変化
する。
1983年１月６日に公開された英国特許出願第2,100,73
7A号はキモシン、メチオニンキモシン、プロキモシン、
メチオニンプロキモシン、プレプロキモシンを製造する
組換えDNA技術を記載している。大腸菌（E.coli）trpプ
ロモーター−オペレーター断片及び転写ターミネータ
ー、開始コドン、及びリボゾーム結合部位として働くシ
ン−ダルガルノ（Shine-Dalgarno）（SD）配列を有する
ベクターが開示されている。SD配列とATG配列との間隔
の効果についての研究も示されている。
7A号はキモシン、メチオニンキモシン、プロキモシン、
メチオニンプロキモシン、プレプロキモシンを製造する
組換えDNA技術を記載している。大腸菌（E.coli）trpプ
ロモーター−オペレーター断片及び転写ターミネータ
ー、開始コドン、及びリボゾーム結合部位として働くシ
ン−ダルガルノ（Shine-Dalgarno）（SD）配列を有する
ベクターが開示されている。SD配列とATG配列との間隔
の効果についての研究も示されている。
1983年４月20日に公開されたヨーロツパ特許出願第7
7,109号は、プレプロキモシンのための遺伝子及び二重l
acUV5または修飾されたtrp系のような特異的DNA配列か
らなるDNA分子、すなわちプラスミド、及びそれらを使
用して微生物（ラクトバチリ（lactobacilli）、ストレ
プトコツキ（streptococci）、バチルス（bacillus）ま
たは酵母）を形質転換させてその対立形質又は成熟形と
してプレプロキモシンを生成する形質転換体を形成する
ことを記載している。
7,109号は、プレプロキモシンのための遺伝子及び二重l
acUV5または修飾されたtrp系のような特異的DNA配列か
らなるDNA分子、すなわちプラスミド、及びそれらを使
用して微生物（ラクトバチリ（lactobacilli）、ストレ
プトコツキ（streptococci）、バチルス（bacillus）ま
たは酵母）を形質転換させてその対立形質又は成熟形と
してプレプロキモシンを生成する形質転換体を形成する
ことを記載している。
ヨーロツパ特許出願第36,776号（1981年９月30日公
開）は、減衰領域が削除されたtrpプロモーター−オペ
レーターを有する発現ベクター、及びその製造方法を記
載している。このベクターを有する形質転換体はトリプ
トフアンに富んだ培地で生育し得、菌体の生育は、trp
プロモーター−オペレーター系の制御の下で他の挿入物
によつてコード化された外来ペプチドの早熟発現によつ
て阻害されることなく進行する。
開）は、減衰領域が削除されたtrpプロモーター−オペ
レーターを有する発現ベクター、及びその製造方法を記
載している。このベクターを有する形質転換体はトリプ
トフアンに富んだ培地で生育し得、菌体の生育は、trp
プロモーター−オペレーター系の制御の下で他の挿入物
によつてコード化された外来ペプチドの早熟発現によつ
て阻害されることなく進行する。
Emtage et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.80:3671-3675、1
983および日本特願昭58-38,439号（1983年３月９日出
願）はプロキモシンcDNA及び大腸菌（E.coli）trpオペ
ロンを有するハイブリツドプラスミドの構成、及び前記
研究者による報告例より多くプロレンニンを発現させる
ための用法を開示している。さらに上記日本出願の1983
年11月15日付手続補正書によるとSD配列とプロキモシン
の開始コドンとの間隔を変化させることによる効果及び
プロキモシンのＮ−末端アミノ酸を長さの異なるペプチ
ドに換えることによる効果に部分的に言及している。
983および日本特願昭58-38,439号（1983年３月９日出
願）はプロキモシンcDNA及び大腸菌（E.coli）trpオペ
ロンを有するハイブリツドプラスミドの構成、及び前記
研究者による報告例より多くプロレンニンを発現させる
ための用法を開示している。さらに上記日本出願の1983
年11月15日付手続補正書によるとSD配列とプロキモシン
の開始コドンとの間隔を変化させることによる効果及び
プロキモシンのＮ−末端アミノ酸を長さの異なるペプチ
ドに換えることによる効果に部分的に言及している。
Harris et al.Nucleic Acids Research 10:2177-2187
（1982）はプレプロキモシンのためのcDNAコードのクロ
ーニング及びヌクレオチド配列を報告している。Goff e
t al,Gene 27、35〜46（1984）は酵母であるサツカロマ
イセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）に
おける子牛プロキモシンの発現を記載している。プレプ
ロキモシンcDNAの制限エンドヌクレアーゼ開裂地図及び
DNA配列は出版されており〔Beppu et al.,J.Biochem.9
1:1085-1088（1982）〕、本明細書にも参考のため図面
として添付している。
（1982）はプレプロキモシンのためのcDNAコードのクロ
ーニング及びヌクレオチド配列を報告している。Goff e
t al,Gene 27、35〜46（1984）は酵母であるサツカロマ
イセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）に
おける子牛プロキモシンの発現を記載している。プレプ
ロキモシンcDNAの制限エンドヌクレアーゼ開裂地図及び
DNA配列は出版されており〔Beppu et al.,J.Biochem.9
1:1085-1088（1982）〕、本明細書にも参考のため図面
として添付している。
哺乳類の成長ホルモン（ヒト上皮生長因子（h-EGF）
を含む）は動物の代謝を改善する効力があるのでかなり
重要である。それらの一般的な使用は、非常に入手源が
限られているため制限されてきた。上記ホルモンを適当
に供給すれば経済上の利益があるので数人の研究者が組
換えDNA技術をこの問題に適用してきた。
を含む）は動物の代謝を改善する効力があるのでかなり
重要である。それらの一般的な使用は、非常に入手源が
限られているため制限されてきた。上記ホルモンを適当
に供給すれば経済上の利益があるので数人の研究者が組
換えDNA技術をこの問題に適用してきた。
ヒト上皮成長因子（EGF）すなわちウロガストロンは
上皮組織成長の促進剤であるだけでなく胃酸分泌の有効
な阻害剤でもある。EGFの効力全体については主として
充分な材料がないので研究されていなかつた。
上皮組織成長の促進剤であるだけでなく胃酸分泌の有効
な阻害剤でもある。EGFの効力全体については主として
充分な材料がないので研究されていなかつた。
ウロガストロンの構造遺伝子及びそのポリペプチド同
族体の遺伝子の製造、クローニング及び発現のために組
換えDNA技術を使用することは国際特許出願No.83/04030
（1983年11月24日公開）に記載されている。
族体の遺伝子の製造、クローニング及び発現のために組
換えDNA技術を使用することは国際特許出願No.83/04030
（1983年11月24日公開）に記載されている。
ウシ生長ホルモンmRNAに相補性のDNAのクローニン
グ、そのヌクレオチド配列及び該配列から予測される相
当するアミノ酸配列がMillerらのヨーロツパ特許出願第
47,600号（1983年３月17日公開）およびJ.Biochem.25
5、7521-7524（1980）、及びWoychikらのNucleic Acids
Research 10、7197-7210（1982）に報告されている。
英国特許出願第2,073,245A号（1981年10月14日公開）及
びKesketら、Nucleic acids Research ９、19-30（198
1）にはウシ生長ホルモンのクローニング及び大腸菌
（E.coli）HB101の中で融合したベータ−ラクタマーゼ
−ウシ成長ホルモン蛋白質として発現させることを述べ
ている。
グ、そのヌクレオチド配列及び該配列から予測される相
当するアミノ酸配列がMillerらのヨーロツパ特許出願第
47,600号（1983年３月17日公開）およびJ.Biochem.25
5、7521-7524（1980）、及びWoychikらのNucleic Acids
Research 10、7197-7210（1982）に報告されている。
英国特許出願第2,073,245A号（1981年10月14日公開）及
びKesketら、Nucleic acids Research ９、19-30（198
1）にはウシ生長ホルモンのクローニング及び大腸菌
（E.coli）HB101の中で融合したベータ−ラクタマーゼ
−ウシ成長ホルモン蛋白質として発現させることを述べ
ている。
ウシ生長ホルモン遺伝子を発現させる方法、プラスミ
ド及びそれを使用するためのプラスミド宿主がヨーロツ
パ特許出願第67,026号及び第68,646号（各々1982年12月
15日、1983年１月５日に公開）に記載されている。各々
の出願には宿主微生物として大腸菌（E.coli）が開示さ
れている。後者の出願、すなわち米国特許第4,443,539
号（1984年４月17日発行）のヨーロツパ特許出願はサツ
カロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisia
e）を宿主微生物として開示している。
ド及びそれを使用するためのプラスミド宿主がヨーロツ
パ特許出願第67,026号及び第68,646号（各々1982年12月
15日、1983年１月５日に公開）に記載されている。各々
の出願には宿主微生物として大腸菌（E.coli）が開示さ
れている。後者の出願、すなわち米国特許第4,443,539
号（1984年４月17日発行）のヨーロツパ特許出願はサツ
カロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisia
e）を宿主微生物として開示している。
Seeburgら、DNA、２ 37〜45（1983）はウシまたはブ
タ脳下垂体からのポリ(A)mRNAを使用して製造されたcDN
Aの細菌におけるクローニング及び成熟動物（ウシまた
はブタ）の生長ホルモンの有効な細菌での産生を達成す
る発現ベクターの構成を報告している。採用される技術
は、Goeddelら、Nature,281、544-548（1979）において
大腸菌（E.coli）においてヒト成長ホルモンの直接発現
について記載された方法と類似のものである。各々の場
合、使用される細菌の発現ベクターは大腸菌（E.coli）
trpプロモーターの制御下に使用された。ヨーロツパ特
許出願第103,395及び104,920号（1984年３月21日及び４
月４日公開）にはウシ成長ホルモン様ポリペプチド及び
ブタ成長ホルモン様ポリペプチドを各々組換えDNA技術
で生産したことを記載している。
タ脳下垂体からのポリ(A)mRNAを使用して製造されたcDN
Aの細菌におけるクローニング及び成熟動物（ウシまた
はブタ）の生長ホルモンの有効な細菌での産生を達成す
る発現ベクターの構成を報告している。採用される技術
は、Goeddelら、Nature,281、544-548（1979）において
大腸菌（E.coli）においてヒト成長ホルモンの直接発現
について記載された方法と類似のものである。各々の場
合、使用される細菌の発現ベクターは大腸菌（E.coli）
trpプロモーターの制御下に使用された。ヨーロツパ特
許出願第103,395及び104,920号（1984年３月21日及び４
月４日公開）にはウシ成長ホルモン様ポリペプチド及び
ブタ成長ホルモン様ポリペプチドを各々組換えDNA技術
で生産したことを記載している。
ウシ成長ホルモンを酪農用の牛に投与すると乳の量が
増加し、飼料摂取対乳量の比を改善する〔Macklin,J.Da
iry Science 56、575-580（1973）〕。1983年８月３日
に公開されたヨーロツパ特許出願第85,036A号は生合成
された（rDNAによる）ウシ成長ホルモンおよび／または
その断片もウシの乳量を増し、ブタや他の畜産用動物の
肉、毛、卵、毛皮の生産を増加することを開示してい
る。
増加し、飼料摂取対乳量の比を改善する〔Macklin,J.Da
iry Science 56、575-580（1973）〕。1983年８月３日
に公開されたヨーロツパ特許出願第85,036A号は生合成
された（rDNAによる）ウシ成長ホルモンおよび／または
その断片もウシの乳量を増し、ブタや他の畜産用動物の
肉、毛、卵、毛皮の生産を増加することを開示してい
る。
1980年４月16日に公開された英国特許明細書第1,565,
190号は微生物を形質転換できる組換えプラスミドベク
ターであつてそのヌクレオチド配列の中にある動物種の
成長ホルモンをコードしているサブ配列を有するものを
開示している。米国特許第4,237,224号は外来DNAを単細
胞微生物に導入するためのプラスミドベクターを記載し
ている。
190号は微生物を形質転換できる組換えプラスミドベク
ターであつてそのヌクレオチド配列の中にある動物種の
成長ホルモンをコードしているサブ配列を有するものを
開示している。米国特許第4,237,224号は外来DNAを単細
胞微生物に導入するためのプラスミドベクターを記載し
ている。
選択された真核生物のDNA断片のためのHind III挿入
部位を有し、該部位がtrpプロモーターのような細菌の
プロモーターに隣接しており、該DNA断片の転写及び翻
訳が上記プロモーターによつて制御されるプラスミドが
米国特許第4,349,629号に記載されている。
部位を有し、該部位がtrpプロモーターのような細菌の
プロモーターに隣接しており、該DNA断片の転写及び翻
訳が上記プロモーターによつて制御されるプラスミドが
米国特許第4,349,629号に記載されている。
クローン化された遺伝子の発現のレベルは遺伝子複写
の数及び転写と翻訳の効率のような因子の数によつて影
響される。挿入された遺伝子の効率的な転写を行うには
強力なプロモーターを必要とし、効率的な翻訳を行うに
はmRNAの中の適当なリボゾーム結合部位及びrbsと翻訳
開始コドンとの間の適当な間隔を必要とする。プロモー
ターは蛋白質をコードしているDNA（構造遺伝子）のそ
の部分より先に位置する。リボゾーム結合部位（rb
s）、すなわちリボゾーム確認配列は少くとも３〜9bpの
長さのシン−ダルガルノ（Shine-Dalgarno）（SD）配列
として知られる配列からなると信じられている。蛋白質
のアミノ末端メチオニンをコード化しているAUGより３
〜11bp上流から始まり、16S RNAの３′−末端配列に対
して相補性である。１つの遺伝子に対する翻訳開始信号
（AUG）からプロモーターが分離すると産生される蛋白
質の量に影響する（Guaranteら、上記文献、および本明
細書中で引用の文献）。この文献及び1982年６月１日に
発行のPtashneらの米国特許第4,332,892号には、発現に
際して遺伝子の５′−末端からの種々の距離に“移動性
プロモーター”断片を置く効果を記載している。
の数及び転写と翻訳の効率のような因子の数によつて影
響される。挿入された遺伝子の効率的な転写を行うには
強力なプロモーターを必要とし、効率的な翻訳を行うに
はmRNAの中の適当なリボゾーム結合部位及びrbsと翻訳
開始コドンとの間の適当な間隔を必要とする。プロモー
ターは蛋白質をコードしているDNA（構造遺伝子）のそ
の部分より先に位置する。リボゾーム結合部位（rb
s）、すなわちリボゾーム確認配列は少くとも３〜9bpの
長さのシン−ダルガルノ（Shine-Dalgarno）（SD）配列
として知られる配列からなると信じられている。蛋白質
のアミノ末端メチオニンをコード化しているAUGより３
〜11bp上流から始まり、16S RNAの３′−末端配列に対
して相補性である。１つの遺伝子に対する翻訳開始信号
（AUG）からプロモーターが分離すると産生される蛋白
質の量に影響する（Guaranteら、上記文献、および本明
細書中で引用の文献）。この文献及び1982年６月１日に
発行のPtashneらの米国特許第4,332,892号には、発現に
際して遺伝子の５′−末端からの種々の距離に“移動性
プロモーター”断片を置く効果を記載している。
ヌクレオチド配列の明確な変形、特にSD領域と開始コ
ドンの間の変化についての効果に関する他の参考文献は
以下の如くである： Scherer et al.,Nucl.Acids Res.８:3895-3907（198
0）;Shepard et al.,DNA １:125-131（1982）;Windass
et al.,Nucl.Acids Res.10:6639-6657（1982）;De Boer
et al.,DNA ２:231-235（1983）;Tacon et al.,Mole
c.gen.Genet.177、427-438（1980）；およびItoh et a
l.,DNA ３、157-165（1984）。
ドンの間の変化についての効果に関する他の参考文献は
以下の如くである： Scherer et al.,Nucl.Acids Res.８:3895-3907（198
0）;Shepard et al.,DNA １:125-131（1982）;Windass
et al.,Nucl.Acids Res.10:6639-6657（1982）;De Boer
et al.,DNA ２:231-235（1983）;Tacon et al.,Mole
c.gen.Genet.177、427-438（1980）；およびItoh et a
l.,DNA ３、157-165（1984）。
問題を解決するための手段 本発明は、高レベル外来遺伝子発現のために一般的に
有用なプロモーターrbs発現要素；外来蛋白質（原核ま
たは真核）の直接発現のための発現要素を有する発現プ
ラスミドであつて、適当な細菌に導入されれば予期せぬ
程且つ驚く程高レベルの蛋白質を発現し得る組換え微生
物を形成するもの；その構成方法；該プラスミドを含む
組換え大腸菌（Ｅ．coli）形質転換体；および上記外来
蛋白質を産生する組換え微生物の用途に関する。より詳
細には、本発明はプロキモシンのような蛋白質およびウ
シとブタの成長ホルモン及びヒト上皮成長因子のような
哺乳類の成長ホルモンをコード化している外来遺伝子の
大腸菌（E.coli）による高度のレベルの発現、特にその
ために有用な発現プラスミドに関する。上記プラスミド
は、選択できるマーカー；レプリコン、すなわち宿主細
胞における自律的な複写をコントロールする領域からな
るDNA配列；および合成DNAリンカーによつて上記外来蛋
白質cDNA配列（遺伝子）に結合されている大腸菌（E.co
li）trpプロモーターからなり、長さを変化させること
ができる新規なリボゾーム結合領域からなる。本発明の
プラスミドの特徴はATG開始コドンより上流にあるリボ
ゾーム結合領域にヌクレオチド配列５′TAAAAAGGAGAATT
C ATG3′または５′TAAAAAGGGTATCGAGAATTC ATG3′が存
在することである。本発明の一好適発現プラスミドはシ
ン−ダルガルノ配列の直前の蛋白質をコードしている配
列として同じ読み取り枠内に翻訳停止コドン（TAA）を
さらに有意な特徴として有している。
有用なプロモーターrbs発現要素；外来蛋白質（原核ま
たは真核）の直接発現のための発現要素を有する発現プ
ラスミドであつて、適当な細菌に導入されれば予期せぬ
程且つ驚く程高レベルの蛋白質を発現し得る組換え微生
物を形成するもの；その構成方法；該プラスミドを含む
組換え大腸菌（Ｅ．coli）形質転換体；および上記外来
蛋白質を産生する組換え微生物の用途に関する。より詳
細には、本発明はプロキモシンのような蛋白質およびウ
シとブタの成長ホルモン及びヒト上皮成長因子のような
哺乳類の成長ホルモンをコード化している外来遺伝子の
大腸菌（E.coli）による高度のレベルの発現、特にその
ために有用な発現プラスミドに関する。上記プラスミド
は、選択できるマーカー；レプリコン、すなわち宿主細
胞における自律的な複写をコントロールする領域からな
るDNA配列；および合成DNAリンカーによつて上記外来蛋
白質cDNA配列（遺伝子）に結合されている大腸菌（E.co
li）trpプロモーターからなり、長さを変化させること
ができる新規なリボゾーム結合領域からなる。本発明の
プラスミドの特徴はATG開始コドンより上流にあるリボ
ゾーム結合領域にヌクレオチド配列５′TAAAAAGGAGAATT
C ATG3′または５′TAAAAAGGGTATCGAGAATTC ATG3′が存
在することである。本発明の一好適発現プラスミドはシ
ン−ダルガルノ配列の直前の蛋白質をコードしている配
列として同じ読み取り枠内に翻訳停止コドン（TAA）を
さらに有意な特徴として有している。
分子生物学の技術の状態では、充分に開発されたレベ
ルである蛋白質またはポリペプチドを発現すべきハイブ
リツドプラスミドのインビトロでの形成は、上記ポリペ
プチドをコード化しているcDNA配列および該配列の制限
エンドヌクレアーゼ開裂地図の知識から可能である。し
かし、これにもかかわらず、プラスミド内に特定の臨界
的でさえある配置で上記DNA配列を適当に微生物に導入
すると、ポリペプチドを有意且つ予期し得ない程高度に
発現させるであろうということを示唆する根拠は当分野
において何ら存在しない。
ルである蛋白質またはポリペプチドを発現すべきハイブ
リツドプラスミドのインビトロでの形成は、上記ポリペ
プチドをコード化しているcDNA配列および該配列の制限
エンドヌクレアーゼ開裂地図の知識から可能である。し
かし、これにもかかわらず、プラスミド内に特定の臨界
的でさえある配置で上記DNA配列を適当に微生物に導入
すると、ポリペプチドを有意且つ予期し得ない程高度に
発現させるであろうということを示唆する根拠は当分野
において何ら存在しない。
ここに記載の組換え微生物は、以前に報告されている
微生物が産生し、初期に組換えDNA技術によつて経済的
規模で産生したよりも有意に大きな収量で外来蛋白質を
発現する。
微生物が産生し、初期に組換えDNA技術によつて経済的
規模で産生したよりも有意に大きな収量で外来蛋白質を
発現する。
当業者は知つているとおり、組換え微生物は多くの方
法、たとえば形質転換、形質導入、接合、トランスフエ
クシヨンによつて製造によつて製造できる。したがつ
て、“組換え微生物”という用語には、上記いずれの方
法によつて製造されようが外来蛋白質を産生し得る微生
物を含める。別法として、本明細書で使用する組換え微
生物の定義にはその微生物が組換え技術により製造され
た場合外来または外因性配列の外来蛋白質を発現せしめ
ることができる微生物を含める。
法、たとえば形質転換、形質導入、接合、トランスフエ
クシヨンによつて製造によつて製造できる。したがつ
て、“組換え微生物”という用語には、上記いずれの方
法によつて製造されようが外来蛋白質を産生し得る微生
物を含める。別法として、本明細書で使用する組換え微
生物の定義にはその微生物が組換え技術により製造され
た場合外来または外因性配列の外来蛋白質を発現せしめ
ることができる微生物を含める。
本発明のもう１つの目的は、転写プロモーター配列よ
り下流に細菌のプラスミドに挿入した場合大腸菌（E.co
li）において効率のよい発現を行なわせる原核生物また
は真核生物の蛋白質をコード化している遺伝子のリボゾ
ーム結合部位について本明細書で記載したヌクレオチド
配列を得ることである。記載されたリボゾーム結合部位
領域はATG開始コドンのすぐ上流の都合の良いEco R I制
限エンドヌクレアーゼ開裂部位を含み、これによつて、
蛋白質翻訳開始コドンを含むDNA断片を発現ベクターのS
D配列の後に挿入する方法を提供する。換言すれば、こ
こで述べる発現プラスミドの遺伝子は原核生物の蛋白質
か真核生物の蛋白質をコード化している遺伝子ならよ
い。たとえば、ここで記載する、リボゾーム結合部位と
ATG開始コドンとの間のヌクレオチド配列は、プロキモ
シン（プロレンニンン）、ウシ成長ホルモン、ブタ生長
ホルモン、ヒト上皮成長因子（ウロガストロン）のよう
なcDNA配列の高度の発現を可能にする。これらの蛋白
質、すなわちウシおよびブタ成長ホルモン及びヒト上皮
成長因子は一括して哺乳類成長因子と称されている。
り下流に細菌のプラスミドに挿入した場合大腸菌（E.co
li）において効率のよい発現を行なわせる原核生物また
は真核生物の蛋白質をコード化している遺伝子のリボゾ
ーム結合部位について本明細書で記載したヌクレオチド
配列を得ることである。記載されたリボゾーム結合部位
領域はATG開始コドンのすぐ上流の都合の良いEco R I制
限エンドヌクレアーゼ開裂部位を含み、これによつて、
蛋白質翻訳開始コドンを含むDNA断片を発現ベクターのS
D配列の後に挿入する方法を提供する。換言すれば、こ
こで述べる発現プラスミドの遺伝子は原核生物の蛋白質
か真核生物の蛋白質をコード化している遺伝子ならよ
い。たとえば、ここで記載する、リボゾーム結合部位と
ATG開始コドンとの間のヌクレオチド配列は、プロキモ
シン（プロレンニンン）、ウシ成長ホルモン、ブタ生長
ホルモン、ヒト上皮成長因子（ウロガストロン）のよう
なcDNA配列の高度の発現を可能にする。これらの蛋白
質、すなわちウシおよびブタ成長ホルモン及びヒト上皮
成長因子は一括して哺乳類成長因子と称されている。
特定の外来遺伝子を細菌によつて生産するとアミノ末
端にメチオニン残基を有するかあるいは有しないポリペ
プチドを産生できる。したがつて、“プロキモシン”
（プロレンニン）なる用語はメチオニンプロキモシン
（プロレンニン）及びプロキモシン（プロレンニン）を
含むものとする。同じことは本明細書で述べる他のポリ
ペプチドについてもいえる。さらに、“キモシン”（レ
ンニン）というときは、その既知の対立形質（たとえ
ば、Ａ、Ｂ、など）も含めるものとする。
端にメチオニン残基を有するかあるいは有しないポリペ
プチドを産生できる。したがつて、“プロキモシン”
（プロレンニン）なる用語はメチオニンプロキモシン
（プロレンニン）及びプロキモシン（プロレンニン）を
含むものとする。同じことは本明細書で述べる他のポリ
ペプチドについてもいえる。さらに、“キモシン”（レ
ンニン）というときは、その既知の対立形質（たとえ
ば、Ａ、Ｂ、など）も含めるものとする。
本発明は下記例及び添付図面によりさらに詳しく説明
されるが本発明の範囲を限定するものではない。
されるが本発明の範囲を限定するものではない。
第１図はプラスミドpPFZ-R2およびR4（pPFZ-R）の構
成を示すpPFZ-R2およびR4の各々に共通の制限地図を含
む概略図である。図中矢印はtrpプロモーター配列から
プロキモシン（プロレンニン）遺伝子（太い断片として
表わした）へと発現する方向を示している。合成挿入物
は空白の箱状の形で表わした。
成を示すpPFZ-R2およびR4の各々に共通の制限地図を含
む概略図である。図中矢印はtrpプロモーター配列から
プロキモシン（プロレンニン）遺伝子（太い断片として
表わした）へと発現する方向を示している。合成挿入物
は空白の箱状の形で表わした。
第２図はプラスミドptrpLI-R2およびR4の構成のため
の手順を示す概略図である。
の手順を示す概略図である。
第３図はプラスミドptrpLI-R2-R48及びptrpLI-R4-R48
の構成のための手順を示す概略図である。
の構成のための手順を示す概略図である。
第４図はプラスミドpPFZ-R2およびpPFZ-R4の各々につ
いてのプロキモシン（プロレンニン）遺伝子のリボゾー
ム結合部位と開始コドン（ATG）との間のヌクレオチド
配列と間隔を示す概略図である。これは上記プラスミド
がヌクレオチド配列において異なる領域のみを示す。
いてのプロキモシン（プロレンニン）遺伝子のリボゾー
ム結合部位と開始コドン（ATG）との間のヌクレオチド
配列と間隔を示す概略図である。これは上記プラスミド
がヌクレオチド配列において異なる領域のみを示す。
第５−１及び５−２図は、全長のbGH遺伝子及び発現
配列を含むプラスミドの構成のための手順を示す概略図
である。プラスミドpBGH-102はpBR322のアンピシリン耐
性遺伝子にクローンされたbGHcDNA配列（黒く塗つた箱
形）を含む。bGHの新しいアミノ末端をコードしている
合成DNAをbBR322（点線の箱形）のEcoR I部位とHind II
I部位に挿入した。種々のインビトロでの複製を行つて
完全な修飾されたbGH遺伝子を担持するプラスミドpBGH-
212を構成した。プラスミドpBGH-212はEcoR Iによつて
開裂され、trpプロモーター−オペレーター配列の異な
る変化したものを有するDNA断片を挿入した。矢印は配
列解読の５′→３′方向、すなわち転写の方向を示す。
配列を含むプラスミドの構成のための手順を示す概略図
である。プラスミドpBGH-102はpBR322のアンピシリン耐
性遺伝子にクローンされたbGHcDNA配列（黒く塗つた箱
形）を含む。bGHの新しいアミノ末端をコードしている
合成DNAをbBR322（点線の箱形）のEcoR I部位とHind II
I部位に挿入した。種々のインビトロでの複製を行つて
完全な修飾されたbGH遺伝子を担持するプラスミドpBGH-
212を構成した。プラスミドpBGH-212はEcoR Iによつて
開裂され、trpプロモーター−オペレーター配列の異な
る変化したものを有するDNA断片を挿入した。矢印は配
列解読の５′→３′方向、すなわち転写の方向を示す。
第６−１及び６−２図はbGH産生のための細菌の発現
プラスミドの構成を示す概略図である。プラスミドbBGH
-212-Rはtrpプロモーター配列（第５図参照）によつて
成熟bGHを完全に直接発現させる遺伝子を担持してい
る。これらのプラスミドはHind IIIによつて開裂され、
Pvu IIによつて部分的に切断され、２つの約920bpHind
III-Pvu II断片を単離した。bGHのＣ−末端をコードす
る合成DNA断片がpBR322（空白の箱形）のEcoR I部位お
よびHind III部位に挿入された。このサブクローンはPv
u IIおよびBamH Iで開裂され、365bpDNA断片を単離し
た。Hind IIIとBamH Iで開裂後大きいベクター断片（39
95bp）をpBR322から単離した。これら２つのプロモータ
ーbGH遺伝子含有断片（920bp）を別々に合成DNA含有断
片（365bp）およびベクター断片（3995bp）と混合し
た。この混合物をTAリガーゼでつなげて適当な大腸菌
（E.coli）HB101の形質転換に使用された。異なるbGH発
現プラスミドはpBGH-301およびpBGH-375と称される。矢
印はtrpプロモーター配列からの転写の方向及び配列解
読における５′→３′の方向を示している。
プラスミドの構成を示す概略図である。プラスミドbBGH
-212-Rはtrpプロモーター配列（第５図参照）によつて
成熟bGHを完全に直接発現させる遺伝子を担持してい
る。これらのプラスミドはHind IIIによつて開裂され、
Pvu IIによつて部分的に切断され、２つの約920bpHind
III-Pvu II断片を単離した。bGHのＣ−末端をコードす
る合成DNA断片がpBR322（空白の箱形）のEcoR I部位お
よびHind III部位に挿入された。このサブクローンはPv
u IIおよびBamH Iで開裂され、365bpDNA断片を単離し
た。Hind IIIとBamH Iで開裂後大きいベクター断片（39
95bp）をpBR322から単離した。これら２つのプロモータ
ーbGH遺伝子含有断片（920bp）を別々に合成DNA含有断
片（365bp）およびベクター断片（3995bp）と混合し
た。この混合物をTAリガーゼでつなげて適当な大腸菌
（E.coli）HB101の形質転換に使用された。異なるbGH発
現プラスミドはpBGH-301およびpBGH-375と称される。矢
印はtrpプロモーター配列からの転写の方向及び配列解
読における５′→３′の方向を示している。
第７−１および７−２図はpGH遺伝子と発現配列の全
長を有するプラスミドを構成する手順を示す概略図であ
る。プラスミドpGH-24はpBR322のアンピシリン耐性遺伝
子の中にクローンされたpGHcDNA配列（黒く塗つた箱
形）を有する。pGHの新しいアミノ末端をコードしてい
る合成DNAはpBR322（点線の箱形）のEcoR I部位とHind
III部位に挿入された。インビトロで種々の複製を行い
完成した修飾されたpGH遺伝子を担持するプラスミドを
構成した。このプラスミドはEcoR Iによつて開裂され、
いろいろに変化させたtrpプロモーター−オペレーター
配列を含むDNA断片を挿入した。矢印は配列解読の５′
→３′の方向、すなわち転写の方向を示す。
長を有するプラスミドを構成する手順を示す概略図であ
る。プラスミドpGH-24はpBR322のアンピシリン耐性遺伝
子の中にクローンされたpGHcDNA配列（黒く塗つた箱
形）を有する。pGHの新しいアミノ末端をコードしてい
る合成DNAはpBR322（点線の箱形）のEcoR I部位とHind
III部位に挿入された。インビトロで種々の複製を行い
完成した修飾されたpGH遺伝子を担持するプラスミドを
構成した。このプラスミドはEcoR Iによつて開裂され、
いろいろに変化させたtrpプロモーター−オペレーター
配列を含むDNA断片を挿入した。矢印は配列解読の５′
→３′の方向、すなわち転写の方向を示す。
実施例 微生物 本発明において使用されまたは製造された微生物及び
組換え微生物ならびにそれらが入手された寄託機関は下
記のとおりである： 大腸菌（E.coli）C600,CR34としても公知、ATCC23724 大腸菌（E.coli）NRRLB-11371、ATCC33694 大腸菌（E.coli）MM294 ATCC33625 大腸菌（E.coli）W3110 ATCC27325 pPFZ-R2を有する大腸菌（E.coli）HB101 ATCC39544 pPFZ-R4を有する大腸菌（E.coli）HB101 ATCC39543 当業者は知るとおり、上記宿主の代りにいかなる形質
転換可能な大腸菌（E.coli）K-12株も本発明において使
用できる。さらに、プロテアーゼを有しない大腸菌株は
当業者も認めるとおり上記大腸菌株と同等あるいはそれ
より良好な結果をもたらす。
組換え微生物ならびにそれらが入手された寄託機関は下
記のとおりである： 大腸菌（E.coli）C600,CR34としても公知、ATCC23724 大腸菌（E.coli）NRRLB-11371、ATCC33694 大腸菌（E.coli）MM294 ATCC33625 大腸菌（E.coli）W3110 ATCC27325 pPFZ-R2を有する大腸菌（E.coli）HB101 ATCC39544 pPFZ-R4を有する大腸菌（E.coli）HB101 ATCC39543 当業者は知るとおり、上記宿主の代りにいかなる形質
転換可能な大腸菌（E.coli）K-12株も本発明において使
用できる。さらに、プロテアーゼを有しない大腸菌株は
当業者も認めるとおり上記大腸菌株と同等あるいはそれ
より良好な結果をもたらす。
上記組換え微生物ATCC39543及び39544は1983年12月14
日にブダペスト条約の下でアメリカ合衆国メリーランド
州ロツクビルのアメリカン・タイプ・カルチヤー・コレ
クシヨン、すなわち寄託を永久的に維持し特許出願が特
許になつたら一般公衆に分譲する公認の寄託機関に寄託
された。これらの菌株には上記受託番号が与えられた。
これらの寄託物は本願が37CER114および35USC122の下に
適格性ありと合衆国特許商標庁の長官によつて決定され
るものとして係属している間本願の相当する出願または
その関連出願が出願された国の外国特許法により入手で
きる。寄託された微生物の公衆への分譲に対するすべて
の制限は特許の許可と同時に不可逆的に取り除かれる。
日にブダペスト条約の下でアメリカ合衆国メリーランド
州ロツクビルのアメリカン・タイプ・カルチヤー・コレ
クシヨン、すなわち寄託を永久的に維持し特許出願が特
許になつたら一般公衆に分譲する公認の寄託機関に寄託
された。これらの菌株には上記受託番号が与えられた。
これらの寄託物は本願が37CER114および35USC122の下に
適格性ありと合衆国特許商標庁の長官によつて決定され
るものとして係属している間本願の相当する出願または
その関連出願が出願された国の外国特許法により入手で
きる。寄託された微生物の公衆への分譲に対するすべて
の制限は特許の許可と同時に不可逆的に取り除かれる。
RNAの製造及びcDNAのクローニング 地方の畜殺場から動物の脳下垂体を得、そこから総RN
AをUllrichら、Science 196、1313-1319（1977）の方法
により単離した。ポリアデニル化RNAをオリゴ（dT）セ
ルロース上のクロマトグラフイーにより総RNAから得
た。二本鎖cDNAをこのRNAから製造し、cDNAのサイズフ
ラクシヨンをプラスミドpBR322を使用して大腸菌（E.co
li）中で標準的方法及び従来のホモポリマー方法でクロ
ーン化した。（Miller,W.,et al.1980、J.Biochem.,25
5、7521、Goeddel et al.,1979;Nature 281、544-548;S
eeburg et al.,1983、DNA２、37-45） プラスミドを有する、cDNAで形質転換されたコロニー
をニトロセルロースフイルター上にレプリカ平板法によ
り移植した。形質転換体コロニーを有するフイルターを
GrunsteinおよびHognessの方法（1975、Proc.Natl.Aca
d.Sci.72、3961-3965）によつてハイブリダイゼーシヨ
ンのために処理した。公開されたcDNA配列から誘導され
た配列を有する放射性同位元素標識合成オリゴヌクレオ
チドをプローブとして使用してクローン化cDNAを検出し
た。ハイブリツド化しているコロニーを5mlLB中で生育
させ、製造されたプラスミドDNAおよびクローン化され
た配列は制限エンドヌクレアーゼによる開裂に続いてDN
A断片のゲル中での電気泳動によつて特性をしらべた。
AをUllrichら、Science 196、1313-1319（1977）の方法
により単離した。ポリアデニル化RNAをオリゴ（dT）セ
ルロース上のクロマトグラフイーにより総RNAから得
た。二本鎖cDNAをこのRNAから製造し、cDNAのサイズフ
ラクシヨンをプラスミドpBR322を使用して大腸菌（E.co
li）中で標準的方法及び従来のホモポリマー方法でクロ
ーン化した。（Miller,W.,et al.1980、J.Biochem.,25
5、7521、Goeddel et al.,1979;Nature 281、544-548;S
eeburg et al.,1983、DNA２、37-45） プラスミドを有する、cDNAで形質転換されたコロニー
をニトロセルロースフイルター上にレプリカ平板法によ
り移植した。形質転換体コロニーを有するフイルターを
GrunsteinおよびHognessの方法（1975、Proc.Natl.Aca
d.Sci.72、3961-3965）によつてハイブリダイゼーシヨ
ンのために処理した。公開されたcDNA配列から誘導され
た配列を有する放射性同位元素標識合成オリゴヌクレオ
チドをプローブとして使用してクローン化cDNAを検出し
た。ハイブリツド化しているコロニーを5mlLB中で生育
させ、製造されたプラスミドDNAおよびクローン化され
た配列は制限エンドヌクレアーゼによる開裂に続いてDN
A断片のゲル中での電気泳動によつて特性をしらべた。
出発プラスミド プラスミドpCR101はNishimoriら、Gene,19:337-344
（1982）によつて記載されている。このプラスミドはプ
ロキモシンの全長cDNA、すなわちアンピシリン耐性のた
めの遺伝子を有し、5678bpからなる。このプラスミドは
Hind IIIの開裂部位といくつかのBamH I部位を有する。
（1982）によつて記載されている。このプラスミドはプ
ロキモシンの全長cDNA、すなわちアンピシリン耐性のた
めの遺伝子を有し、5678bpからなる。このプラスミドは
Hind IIIの開裂部位といくつかのBamH I部位を有する。
プラスミドptrpLIはEdmanら、Nature 291;503-506（1
981）に記載され、プラスミドpBR322はBolivarら、Gene
２:95-113（1977）によつて報告されている。
981）に記載され、プラスミドpBR322はBolivarら、Gene
２:95-113（1977）によつて報告されている。
材料 制限エンドヌクレアーゼ（Asu I、BamH I、EcoR I、H
ind III、Cla I、Hinf I、Kpn I、Pst I、Pvu II、Rsa
I、Sa1 I）、T4リガーゼ、およびDNAポリメラーゼＩ
（大きい断片）をニユーイングランド・バイオラブズ
（New England Biolabs）から購入し、T4ポリヌクレオ
チドキナーゼはPLバイオケミカルズ（Biochemicals）よ
り得、細菌のアルカリ性ホスフアターゼはベセスダ・リ
サーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Laborato
ries）（BRL）より入手、子牛小腸アルカリ性ホスフア
ターゼはベーリンガー・コープ（Boehringer Corp）よ
り入手した。すべての酵素は上記製造元が推める条件下
に使用した。放射性化学物質はニユーイングランド・ヌ
クレアー（New England Nuclear）（NEN）から購入し
た。蛋白質分子量の標準物はBRLより入手し、精製され
た子牛キモシンはシグマ・ケミカル・カンパニー（Sigm
a Chemical Company）より入手し、精製bGHはマイルス
（Miles）より入手した。
ind III、Cla I、Hinf I、Kpn I、Pst I、Pvu II、Rsa
I、Sa1 I）、T4リガーゼ、およびDNAポリメラーゼＩ
（大きい断片）をニユーイングランド・バイオラブズ
（New England Biolabs）から購入し、T4ポリヌクレオ
チドキナーゼはPLバイオケミカルズ（Biochemicals）よ
り得、細菌のアルカリ性ホスフアターゼはベセスダ・リ
サーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Laborato
ries）（BRL）より入手、子牛小腸アルカリ性ホスフア
ターゼはベーリンガー・コープ（Boehringer Corp）よ
り入手した。すべての酵素は上記製造元が推める条件下
に使用した。放射性化学物質はニユーイングランド・ヌ
クレアー（New England Nuclear）（NEN）から購入し
た。蛋白質分子量の標準物はBRLより入手し、精製され
た子牛キモシンはシグマ・ケミカル・カンパニー（Sigm
a Chemical Company）より入手し、精製bGHはマイルス
（Miles）より入手した。
細菌はアンピシリン（25μg/ml）またはテトラサイク
リン（10μg/ml）を含有するＬブロス（Broth）中また
はＬ寒天プレート上（Miller,J.Experiments in Molecu
lar Genetics,Cold Spring Harbor Labratory,New Yor
k,p433、1972）で37℃で常法どおり生育させた。大規模
にプラスミドを製造するためには、対数期の培養物をク
ロラムフエニコール（170μg/ml）の添加によつて増大
させた〔Clewell and Helsinki,J.Bacteriol.110:1135
（1972）〕。
リン（10μg/ml）を含有するＬブロス（Broth）中また
はＬ寒天プレート上（Miller,J.Experiments in Molecu
lar Genetics,Cold Spring Harbor Labratory,New Yor
k,p433、1972）で37℃で常法どおり生育させた。大規模
にプラスミドを製造するためには、対数期の培養物をク
ロラムフエニコール（170μg/ml）の添加によつて増大
させた〔Clewell and Helsinki,J.Bacteriol.110:1135
（1972）〕。
プラスミドpBGH-7は、Pst I部位にクローンさせたbGH
の全長cDNAを含むpBR-322からなり、Miller,W.ら、J.Bi
ochem.255、7521（1980）によつて記載されたようにし
て製造された。クローン化されたcDNAは31bpの５′未翻
訳配列、全プレホルモン構造配列（651bp）、全３′未
翻訳領域（104bp）、短いポリ（Ａ）、およびdC-dG尾部
を有する約830pbの長さである。プラスミドpGH-24はそ
のPst I部位にクローン化された全長cDNAを含むpBR322
からなり、Seeburgら、DNA2、37-45（1983）によつて記
載された方法と類似の方法で製造された。pGH-24プラス
ミドDNAはデニス・ペレイラ（Dennis Pereira）によつ
て構成され提供された。プラスミドpBR-322はすでにBol
ivarら、Gene ２、95-113（1977）によつて報告されて
いる。
の全長cDNAを含むpBR-322からなり、Miller,W.ら、J.Bi
ochem.255、7521（1980）によつて記載されたようにし
て製造された。クローン化されたcDNAは31bpの５′未翻
訳配列、全プレホルモン構造配列（651bp）、全３′未
翻訳領域（104bp）、短いポリ（Ａ）、およびdC-dG尾部
を有する約830pbの長さである。プラスミドpGH-24はそ
のPst I部位にクローン化された全長cDNAを含むpBR322
からなり、Seeburgら、DNA2、37-45（1983）によつて記
載された方法と類似の方法で製造された。pGH-24プラス
ミドDNAはデニス・ペレイラ（Dennis Pereira）によつ
て構成され提供された。プラスミドpBR-322はすでにBol
ivarら、Gene ２、95-113（1977）によつて報告されて
いる。
オリゴヌクレオチド類の合成 合成オリゴヌクレオチド５′.AGAATTCATGG.3′(I)お
よび５′.CCATGAATTCT.3′(II)をホスフアイト法〔Caru
thers,J.Am.Chem.Soc.103、1385（1981）〕によつて化
学合成し、6M尿素−20％ポリアクリルアミドゲルから精
製した。
よび５′.CCATGAATTCT.3′(II)をホスフアイト法〔Caru
thers,J.Am.Chem.Soc.103、1385（1981）〕によつて化
学合成し、6M尿素−20％ポリアクリルアミドゲルから精
製した。
18-bpおよび22bp一本鎖オリゴマーを本明細書記載の
方法で合成し、本明細書記載の方法で40-merアダプター
に形質転換した。二本鎖40-merは一本鎖18−および22-m
erを公知方法によりアニーリングし、結合（ligate）す
ることによつて生成した。
方法で合成し、本明細書記載の方法で40-merアダプター
に形質転換した。二本鎖40-merは一本鎖18−および22-m
erを公知方法によりアニーリングし、結合（ligate）す
ることによつて生成した。
pGH′およびbGHのために使用されたジゴヌクレオチド
はCaruthersら、Tetrahedron Lett.24、245（1983）の
ホスホラミダイト法により合成され、断片は11〜16塩基
の長さの一本鎖オリゴマーから合成した。
はCaruthersら、Tetrahedron Lett.24、245（1983）の
ホスホラミダイト法により合成され、断片は11〜16塩基
の長さの一本鎖オリゴマーから合成した。
分子クローニング反応 大腸菌（E.coli）DNAポリメラーゼＩのクレナウ（Kle
now）断片を使用して二本鎖DNAの隠れた３′末端の空白
を満たす反応は本質的にManiatisら、Molewlar Clonin
g,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laborator
y p.113（1982）の方法に依つた。ATPのガンマホスフエ
ートをT4ポリヌクレオチドキナーゼによつて合成リンカ
ーDNAの５′−OH末端へ転移させることは上記Maniatis
の文献に示されている。約20μｇの二本鎖リンカーDNA
を、70mMトリス（pH7.6）、10mM MgCl2、5mMジチオスレ
イトール（DTT）、20μCi〔ガンマー32P〕ATP（5000Ci
ミリモル-1;NEN）を含有する20μｌの反応混合物中でホ
スホリル化し、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（10単位）
を加えて、反応を37℃で15分間行い、１μｌの10mM ATP
および10単位のT4キナーゼを加え、反応をさらに30分間
37℃で行なつた。キナーゼ処理したリンカーは−20℃で
貯蔵した。
now）断片を使用して二本鎖DNAの隠れた３′末端の空白
を満たす反応は本質的にManiatisら、Molewlar Clonin
g,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laborator
y p.113（1982）の方法に依つた。ATPのガンマホスフエ
ートをT4ポリヌクレオチドキナーゼによつて合成リンカ
ーDNAの５′−OH末端へ転移させることは上記Maniatis
の文献に示されている。約20μｇの二本鎖リンカーDNA
を、70mMトリス（pH7.6）、10mM MgCl2、5mMジチオスレ
イトール（DTT）、20μCi〔ガンマー32P〕ATP（5000Ci
ミリモル-1;NEN）を含有する20μｌの反応混合物中でホ
スホリル化し、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（10単位）
を加えて、反応を37℃で15分間行い、１μｌの10mM ATP
および10単位のT4キナーゼを加え、反応をさらに30分間
37℃で行なつた。キナーゼ処理したリンカーは−20℃で
貯蔵した。
必要ならば、末端の５′ホスフエートを細菌のアルカ
リ性ホスフアターゼ（BAP）あるいは子牛腸アルカリ性
ホスフアターゼ（CIP）のいずれかにより処理してDNAか
ら除去した。〔Chaconasら、Methods Enzymol.65:75（1
980）〕。簡単に言えば、CIPによる処理においては、プ
ラスミドDNAは適当な制限酵素によつて切断を完了させ
エタノール中に沈殿させた。DNAのペレツトをCIP反応緩
衝液（0.1Mグリシン、1mM MgCl2、0.1mM ZnCl2、pH10.
4）中に最終濃度１μg/10μｌ緩衝液で再懸濁した。試
料を65℃に10分間加熱し、氷上で５分間冷却した。子牛
腸アルカリ性ホスフアターゼを最終濃度0.5単位/DNA1μ
ｇとなるまで加えた。この混合物を37℃で30分間インキ
ユベートし、続いてフエノール−クロロホルムにより抽
出し、DNA断片をエタノールで沈殿させた。これらのDNA
ペレツトを蒸留水に再懸濁し、最終濃度100μg/mlとし
た。
リ性ホスフアターゼ（BAP）あるいは子牛腸アルカリ性
ホスフアターゼ（CIP）のいずれかにより処理してDNAか
ら除去した。〔Chaconasら、Methods Enzymol.65:75（1
980）〕。簡単に言えば、CIPによる処理においては、プ
ラスミドDNAは適当な制限酵素によつて切断を完了させ
エタノール中に沈殿させた。DNAのペレツトをCIP反応緩
衝液（0.1Mグリシン、1mM MgCl2、0.1mM ZnCl2、pH10.
4）中に最終濃度１μg/10μｌ緩衝液で再懸濁した。試
料を65℃に10分間加熱し、氷上で５分間冷却した。子牛
腸アルカリ性ホスフアターゼを最終濃度0.5単位/DNA1μ
ｇとなるまで加えた。この混合物を37℃で30分間インキ
ユベートし、続いてフエノール−クロロホルムにより抽
出し、DNA断片をエタノールで沈殿させた。これらのDNA
ペレツトを蒸留水に再懸濁し、最終濃度100μg/mlとし
た。
BAP処理の場合は、プラスミドDNAを選択した制限エン
ドヌクレアーゼで開裂し、エタノール中で沈殿させた。
DNAペレツトを緩衝液（50mM NaCl、10mM MgCl2、10mMト
リス、10mM DTT）中に再懸濁した（最終濃度１μg/10μ
ｌの緩衝液）。この反応混合物を65℃に10分間加熱し氷
上で反応停止した。細菌のアルカリ性ホスフアターゼを
最終濃度50単位/DNA1μｇまで添加した。この反応混合
物を65℃で２時間インキユベートしフエノール−クロロ
ホルムで抽出し、DNA断片をエタノール中に沈殿させ
た。
ドヌクレアーゼで開裂し、エタノール中で沈殿させた。
DNAペレツトを緩衝液（50mM NaCl、10mM MgCl2、10mMト
リス、10mM DTT）中に再懸濁した（最終濃度１μg/10μ
ｌの緩衝液）。この反応混合物を65℃に10分間加熱し氷
上で反応停止した。細菌のアルカリ性ホスフアターゼを
最終濃度50単位/DNA1μｇまで添加した。この反応混合
物を65℃で２時間インキユベートしフエノール−クロロ
ホルムで抽出し、DNA断片をエタノール中に沈殿させ
た。
細胞の発現プラスミドの構成は種々のプラスミドから
のDNA断片を結合する操作からなる。すべての段階は添
付図面に示されている。一般に、DNA断片はゲルから単
離後精製され、20〜50μｌの66mMトリス−HCl（pH7.
6）、5mM MgCl2、1mM ATP、20mM DTTおよび１μｌのT4
リガーゼ（400単位）中で他の断片またはプラスミドDNA
に結合した。大腸菌（E.coli）の能力細胞を標準的方法
〔Mandelら、J.Mol.Biol.53、1543（1970）〕で調製
し、上記配位結合混合物の半分で形質転換した。
のDNA断片を結合する操作からなる。すべての段階は添
付図面に示されている。一般に、DNA断片はゲルから単
離後精製され、20〜50μｌの66mMトリス−HCl（pH7.
6）、5mM MgCl2、1mM ATP、20mM DTTおよび１μｌのT4
リガーゼ（400単位）中で他の断片またはプラスミドDNA
に結合した。大腸菌（E.coli）の能力細胞を標準的方法
〔Mandelら、J.Mol.Biol.53、1543（1970）〕で調製
し、上記配位結合混合物の半分で形質転換した。
DNA配列決定 DNA配列は化学的減成方法〔Maxam A and Gilbert,W.M
ethods Enzymol.65:499-560（1980）〕により末端標識D
NA断片を使用することによつて決定した。各リボゾーム
結合部位領域は各々独立して二本鎖の両方に数回配列さ
れていた。
ethods Enzymol.65:499-560（1980）〕により末端標識D
NA断片を使用することによつて決定した。各リボゾーム
結合部位領域は各々独立して二本鎖の両方に数回配列さ
れていた。
プラスミドDNAの製造 プラスミドDNAの大規模な製造は先行文献に記載のア
ルカリ性−SDS法〔Birnboimら、Nucleic Acid Res.7:15
13（1979）〕、続いてエチジウムブロミド−CsCl浮遊密
度遠心分離あるいは分画をバイオゲル（Biogel）A-50
（バイオラド（Bio Rad製）カラムを使用してEl-Gewely
ら、Anal,Biochem.102:423-428（1980）の方法により行
つた。小標品としてのDNAをアルカリ性SDS法（Birnboim
ら上記文献）の迅速にできる変法によつて調製した。
ルカリ性−SDS法〔Birnboimら、Nucleic Acid Res.7:15
13（1979）〕、続いてエチジウムブロミド−CsCl浮遊密
度遠心分離あるいは分画をバイオゲル（Biogel）A-50
（バイオラド（Bio Rad製）カラムを使用してEl-Gewely
ら、Anal,Biochem.102:423-428（1980）の方法により行
つた。小標品としてのDNAをアルカリ性SDS法（Birnboim
ら上記文献）の迅速にできる変法によつて調製した。
ゲル電気泳動 アガロース平板ゲル0.7〜１％をManiatisら、上記文
献p150〜164の条件下に使用した。ゲルを15分間１μg/m
lのエチジウムブロミドで染色し、ポラロイドフイルム
（タイプ57、ASA3000）をコダツク・ラツテン（Kodak W
ratten）フイルタとともに使用して266nmの紫外線の照
明で写真をとつた。
献p150〜164の条件下に使用した。ゲルを15分間１μg/m
lのエチジウムブロミドで染色し、ポラロイドフイルム
（タイプ57、ASA3000）をコダツク・ラツテン（Kodak W
ratten）フイルタとともに使用して266nmの紫外線の照
明で写真をとつた。
５〜12.5％のアクリルアミドゲル（20×15×0.15cm）
を使用してManiatisら、Biochemistry 14:3787-3794（1
975）の方法により小さな（1.5kb未満）制限断片を同定
した。アガロースゲルと同様にゲルを染色し、写真をと
つた。
を使用してManiatisら、Biochemistry 14:3787-3794（1
975）の方法により小さな（1.5kb未満）制限断片を同定
した。アガロースゲルと同様にゲルを染色し、写真をと
つた。
DNA断片を、ゲル切片から0.1XTBE18.9mMトリス−ホウ
酸塩、8.9mMホウ酸、0.2mM EDTA）を含有する透析バツ
グ中で電気的に溶出することによつて精製した。
酸塩、8.9mMホウ酸、0.2mM EDTA）を含有する透析バツ
グ中で電気的に溶出することによつて精製した。
大腸菌（E.coli）中に生成した外来蛋白質の同定 pBR322または発現プラスミド（pPFZ-R2またはpPFZ-R
4）を含有する細菌培養物を４μg/mlチアミン、25μg/m
lアンピシリンおよび100μg/mlトリプトフアンを含有す
るLBブロスまたはM9CA培地（Maniatisら、上記文献）中
で一晩生育させた。これらの培養物をM9CA培地中に1:25
に希釈し（Maniatisらの上記文献、トリプトフアンなし
でtrpプロモーターの完全導入を行なわせる）、またはM
9CA培地＋100μ/mlのトリプトフアンに1:25に希釈し（t
rpプロモーターの導入を阻害し）、あるいはLB培地（ネ
ガチブコントロールとして）に1:25に希釈し、振とうフ
ラスコ中で細胞密度A560＝1.0となるまで生育させた。
全細胞蛋白質抽出のために、200μｌ培養物に等しい細
胞ペレツトを２％ドデシル硫酸ナトリウム、１％β−メ
ルカプトエタノール中で溶解させ、蛋白質を10容量部の
冷アセトン中に沈殿させた。沈殿させた蛋白質をSDS試
料緩衝液中に再溶解し、アリコツトを10％または12.5％
SDS−ポリアクリルアミドゲル〔Laemmli,Nature 227:68
0-685（1970）〕上で電気泳動にかけた。標識された蛋
白質の製造のためには発現培養物の1mlアリコツトから
の細胞ペレツトを1mlのM9CA添加培地（M9CA塩、0.2％グ
ルコース、４μg/mlチアミン、20μg/ml標準アミノ酸
（メチオニンとトリプトフアンを除く））＋25μg/mlア
ンピシリンおよび75Ci35Sメチオニン（NEN;970Ci/ミリ
モル）中に懸濁した。１時間37℃でインキユベートした
後、細胞をペレツト化し、200μｌの10mMトリス（pH8.
0）、1mM NaEDTAに再懸濁し、氷上に10分間置き、最終
濃度としてリゾチームを1mg/mlまで、NP40を0.2％ま
で、NaClを0.35Mまで添加した。溶解物を10mM MgCl2に
調節し、氷上で30分間50μg/mlのDNA分解酵素（DNase）
Ｉ（シグマ（Sigma）製）とインキユベートした。不溶
物を緩やかな遠心分離で除き、このペレツトフラクシヨ
ンをSDS試料緩衝液中に溶解した。上清試料をウサギ抗
プロレンニン抗体（Beppu,Gene 19、337-344）およびブ
ドウ球菌吸着剤（Pansorbin,Cal Biochem）でKessler,
J.Immunology 117:1482-1490の方法により免疫沈殿させ
た。試料をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（Laemm
liの上記文献）し、−75℃でコダツク（Kodak）XAR-2フ
イルムとコルネツクス（Cornex）ライトニングプラス
（Lightnig Plus）強化スクリーンで螢光写真法を行う
前に強化した（エンライトニング（Enlightning:NE
N））。
4）を含有する細菌培養物を４μg/mlチアミン、25μg/m
lアンピシリンおよび100μg/mlトリプトフアンを含有す
るLBブロスまたはM9CA培地（Maniatisら、上記文献）中
で一晩生育させた。これらの培養物をM9CA培地中に1:25
に希釈し（Maniatisらの上記文献、トリプトフアンなし
でtrpプロモーターの完全導入を行なわせる）、またはM
9CA培地＋100μ/mlのトリプトフアンに1:25に希釈し（t
rpプロモーターの導入を阻害し）、あるいはLB培地（ネ
ガチブコントロールとして）に1:25に希釈し、振とうフ
ラスコ中で細胞密度A560＝1.0となるまで生育させた。
全細胞蛋白質抽出のために、200μｌ培養物に等しい細
胞ペレツトを２％ドデシル硫酸ナトリウム、１％β−メ
ルカプトエタノール中で溶解させ、蛋白質を10容量部の
冷アセトン中に沈殿させた。沈殿させた蛋白質をSDS試
料緩衝液中に再溶解し、アリコツトを10％または12.5％
SDS−ポリアクリルアミドゲル〔Laemmli,Nature 227:68
0-685（1970）〕上で電気泳動にかけた。標識された蛋
白質の製造のためには発現培養物の1mlアリコツトから
の細胞ペレツトを1mlのM9CA添加培地（M9CA塩、0.2％グ
ルコース、４μg/mlチアミン、20μg/ml標準アミノ酸
（メチオニンとトリプトフアンを除く））＋25μg/mlア
ンピシリンおよび75Ci35Sメチオニン（NEN;970Ci/ミリ
モル）中に懸濁した。１時間37℃でインキユベートした
後、細胞をペレツト化し、200μｌの10mMトリス（pH8.
0）、1mM NaEDTAに再懸濁し、氷上に10分間置き、最終
濃度としてリゾチームを1mg/mlまで、NP40を0.2％ま
で、NaClを0.35Mまで添加した。溶解物を10mM MgCl2に
調節し、氷上で30分間50μg/mlのDNA分解酵素（DNase）
Ｉ（シグマ（Sigma）製）とインキユベートした。不溶
物を緩やかな遠心分離で除き、このペレツトフラクシヨ
ンをSDS試料緩衝液中に溶解した。上清試料をウサギ抗
プロレンニン抗体（Beppu,Gene 19、337-344）およびブ
ドウ球菌吸着剤（Pansorbin,Cal Biochem）でKessler,
J.Immunology 117:1482-1490の方法により免疫沈殿させ
た。試料をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（Laemm
liの上記文献）し、−75℃でコダツク（Kodak）XAR-2フ
イルムとコルネツクス（Cornex）ライトニングプラス
（Lightnig Plus）強化スクリーンで螢光写真法を行う
前に強化した（エンライトニング（Enlightning:NE
N））。
発現レベルの定量化 発現培養物によつて産生された外来蛋白質の量の測定
は細菌培養物からの全蛋白質抽出物を含有する蛋白質ゲ
ルをデンシトメーターによつて走査することにより測定
した。総細胞蛋白質抽出物のSDS−ポリアクリルアミド
ゲルの個々のレーンをベツクマン（Beckman）DU-8Bデン
シトメーターを使用して分析した。乾燥したコーマシー
青染色SDS−ポリアクリルアミドゲルを各レーンにおい
て走査して外来蛋白質帯における総細胞蛋白質のパーセ
ントを測定した。対照培養物（pBR322ベクター含有）か
らの総細胞蛋白質の走査図を使用して組換生成物のサイ
ズに一致するゲルの領域における生来の蛋白質含量を測
定した。対照培養物中の見かけ上のバツクグラウンドピ
ークを補正後、発現レベルの総細胞蛋白質のパーセント
として測定した。蛋白質ゲルは579nmで走査した。
は細菌培養物からの全蛋白質抽出物を含有する蛋白質ゲ
ルをデンシトメーターによつて走査することにより測定
した。総細胞蛋白質抽出物のSDS−ポリアクリルアミド
ゲルの個々のレーンをベツクマン（Beckman）DU-8Bデン
シトメーターを使用して分析した。乾燥したコーマシー
青染色SDS−ポリアクリルアミドゲルを各レーンにおい
て走査して外来蛋白質帯における総細胞蛋白質のパーセ
ントを測定した。対照培養物（pBR322ベクター含有）か
らの総細胞蛋白質の走査図を使用して組換生成物のサイ
ズに一致するゲルの領域における生来の蛋白質含量を測
定した。対照培養物中の見かけ上のバツクグラウンドピ
ークを補正後、発現レベルの総細胞蛋白質のパーセント
として測定した。蛋白質ゲルは579nmで走査した。
結果 ptrpLI-R2およびptrpLI-R4の構成 プラスミドptrpLIはHind III-Cla I断片（360bp以
下）上に大腸菌（E.coli）trpプロモーター−オペレー
ターの一部およびtrpLのシン−ダルガルノ（SD）配列を
含んでいるpBR322誘導体である。〔Edmanら、Nature 29
1:503-506（1981）〕したがつて、このベクターはtrp調
節領域に隣接して特有のCla Iクローニング部位を有す
る発現プラスミドである。挿入されるDNAは、その配列
内に、ptrpLIに挿入された場合trpLリボゾーム結合部位
配列に対して適当に間隔を空けられるであろう遺伝子コ
ード配列の前にATG翻訳開始コドンを含まなければなら
ない。この発現ベクターは適当な合成DNAリンカーを第
２図に図示されたようにCla I部位に挿入することによ
つて修飾された。
下）上に大腸菌（E.coli）trpプロモーター−オペレー
ターの一部およびtrpLのシン−ダルガルノ（SD）配列を
含んでいるpBR322誘導体である。〔Edmanら、Nature 29
1:503-506（1981）〕したがつて、このベクターはtrp調
節領域に隣接して特有のCla Iクローニング部位を有す
る発現プラスミドである。挿入されるDNAは、その配列
内に、ptrpLIに挿入された場合trpLリボゾーム結合部位
配列に対して適当に間隔を空けられるであろう遺伝子コ
ード配列の前にATG翻訳開始コドンを含まなければなら
ない。この発現ベクターは適当な合成DNAリンカーを第
２図に図示されたようにCla I部位に挿入することによ
つて修飾された。
特異的二本鎖合成DNAリンカーを使用してptrpLIのCal
I制限部位の周囲のヌクレオチド含量を変えた。約10μ
ｇのptrpLI DNAを16単位の制限エンドヌクレアーゼCla
Iで90分間37℃で切断した。Cla Iによる開裂によつて生
じた接着末端を50mMトリス−HCl（pH7.2）、10mM MgS
O4、0.1mMジチオスレイトール、0.2mM dGTP、0.2mM dCT
Pを含有する100μｌの反応混合物中で鈍化した。DNAポ
リメラーゼ（30単位）のクレナウ断片を加え、反応を20
℃で45分間行なわせた。フエノールとクロロホルムで抽
出後、示されたホスホリル化されたデオキシオリゴヌク
レオチドリンカー（60pモル以下）（５′AGAATTCATGG
3′）（３′TCTTAAGTACC5′）を１μｇ以下（0.6pモル
以下）の挿入ベクター断片といつしよにしてエタノール
で沈殿させた。これらの断片を４℃で18時間30μｌの66
mMトリス−HCl（pH7.6）、50mM MgCl2、1mM ATP、20mM
ジチオスレイトールおよび800単位のTADNAリガーゼ中で
結合させた。この混合物を90分間３単位のEcoR Iで90分
間切断した。EcoR Iで開裂したプラスミドDNAを４℃で
４時間100μｌの66mMトリス−HCl（pH7.6）、5mM MgC
l2、1mM ATP、20mM DTT、および400単位のT4DNAリガー
ゼの中で再び結合させた。大腸菌（E.coli）菌株HB101
の能力細胞を20μｌの上記結合混合物で形質転換した。
〔Mandel et al.J.Mol.Biol.53:154（1970）〕プラスミ
ドDNAを上記形質転換体のうちの12のものから調製し、E
coR IとHind IIIで切断した。これらのプラスミドのう
ち10のものが所望の360-bp以下のEcoR I-Hind III断片
を含有していた。DNA配列を分析したところ、これらの
プラスミドのうち１つ（ptrpLI-R4）は合成リンカーの
所望の配向およびtrpプロモーターと合成DNAとの間の接
合部に所望の配列を有していた。
I制限部位の周囲のヌクレオチド含量を変えた。約10μ
ｇのptrpLI DNAを16単位の制限エンドヌクレアーゼCla
Iで90分間37℃で切断した。Cla Iによる開裂によつて生
じた接着末端を50mMトリス−HCl（pH7.2）、10mM MgS
O4、0.1mMジチオスレイトール、0.2mM dGTP、0.2mM dCT
Pを含有する100μｌの反応混合物中で鈍化した。DNAポ
リメラーゼ（30単位）のクレナウ断片を加え、反応を20
℃で45分間行なわせた。フエノールとクロロホルムで抽
出後、示されたホスホリル化されたデオキシオリゴヌク
レオチドリンカー（60pモル以下）（５′AGAATTCATGG
3′）（３′TCTTAAGTACC5′）を１μｇ以下（0.6pモル
以下）の挿入ベクター断片といつしよにしてエタノール
で沈殿させた。これらの断片を４℃で18時間30μｌの66
mMトリス−HCl（pH7.6）、50mM MgCl2、1mM ATP、20mM
ジチオスレイトールおよび800単位のTADNAリガーゼ中で
結合させた。この混合物を90分間３単位のEcoR Iで90分
間切断した。EcoR Iで開裂したプラスミドDNAを４℃で
４時間100μｌの66mMトリス−HCl（pH7.6）、5mM MgC
l2、1mM ATP、20mM DTT、および400単位のT4DNAリガー
ゼの中で再び結合させた。大腸菌（E.coli）菌株HB101
の能力細胞を20μｌの上記結合混合物で形質転換した。
〔Mandel et al.J.Mol.Biol.53:154（1970）〕プラスミ
ドDNAを上記形質転換体のうちの12のものから調製し、E
coR IとHind IIIで切断した。これらのプラスミドのう
ち10のものが所望の360-bp以下のEcoR I-Hind III断片
を含有していた。DNA配列を分析したところ、これらの
プラスミドのうち１つ（ptrpLI-R4）は合成リンカーの
所望の配向およびtrpプロモーターと合成DNAとの間の接
合部に所望の配列を有していた。
種々の形質転換体からのプラスミドDNAのDNA配列を分
析している間に、上記プラスミドのうちの１つ（ptrpLI
-R2）がリボゾーム結合部位の領域においても6bp削除さ
れていることが発見された。この削除は、リンカー配列
がすべて存在するのでDNAポリメラーゼＩのクレナウ断
片の３′→５′エキソヌクレアーゼ活性から生じたもの
とされている。この誘導体はptrpLI-R4に含まれている
生来のtrpSD配列に比較して変化したリボゾーム結合部
位を有する。
析している間に、上記プラスミドのうちの１つ（ptrpLI
-R2）がリボゾーム結合部位の領域においても6bp削除さ
れていることが発見された。この削除は、リンカー配列
がすべて存在するのでDNAポリメラーゼＩのクレナウ断
片の３′→５′エキソヌクレアーゼ活性から生じたもの
とされている。この誘導体はptrpLI-R4に含まれている
生来のtrpSD配列に比較して変化したリボゾーム結合部
位を有する。
合成プロレンニンアダプターのクローニング プロレンニンのアミノ末端を修飾するのに使用される
合成二本鎖DNAの配列は下記のとおりである。
合成二本鎖DNAの配列は下記のとおりである。
この断片は２本の一本鎖オリゴマー（18-bpと22-bpの長
さ）から組み立てられた。この合成DNAは蛋白質合成の
ための人工的なATG開始コドン及びプロレンニン配列〔N
ishimoriら、J.Biochem.91:1085-1088（1982）〕の最終
のいくつかのコドンをBamH I部位の周囲に変化して繰り
返された形でコードしている。この合成DNAは、すでにD
NAポリメラーゼＩのクレナウ断片で処理して接着末端に
挿入されているpBR322のEcoR I制限部位にサブクローン
された。サブクローンは放射性同位元素で標識された22
-merをプローブとして使用する組換え微生物のその場で
のコロニーハイブリダイゼーシヨンによつて同定され
た。〔Grunstein,Mand Hogness,D.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.72:3961（1975）〕。プラスミドDNAは20個のハイブリ
ダイゼーシヨン陽性コロニーから調製され、BamH Iまた
はEcoR Iで開裂されて所望のプラスミドを含有するサブ
クローンを同定した。組換え微生物＃17からの約100μ
ｇのプラスミドDNAをEcoR Iで開裂して40bp断片を12.5
％ポリアクリルアミドゲル上で単離した。精製された40
bpEcoR I断片を、すでにEcoR Iで開裂し子牛腸アルカリ
性ホスフアターゼで処理して脱ホスホリル化してある２
発現プラスミド誘導体（ptrpLI-R2およびptrpLI-R4）の
EcoR I部位に挿入した。各結合物のいくつかの組換え微
生物からのプラスミドDNAを調製し、BamH I制限エンド
ヌクレアーゼで切断した。trp発現配列より下流に挿入
された40bpプロレンニンアダプターを有するプラスミド
を約700bp離れた２つのBamH I部位の存在により同定し
た。この構成は第３図に示されている。これらの発現プ
ラスミドはptrpLI-R2-B48およびptrpLI-R4-B48と称され
た。
さ）から組み立てられた。この合成DNAは蛋白質合成の
ための人工的なATG開始コドン及びプロレンニン配列〔N
ishimoriら、J.Biochem.91:1085-1088（1982）〕の最終
のいくつかのコドンをBamH I部位の周囲に変化して繰り
返された形でコードしている。この合成DNAは、すでにD
NAポリメラーゼＩのクレナウ断片で処理して接着末端に
挿入されているpBR322のEcoR I制限部位にサブクローン
された。サブクローンは放射性同位元素で標識された22
-merをプローブとして使用する組換え微生物のその場で
のコロニーハイブリダイゼーシヨンによつて同定され
た。〔Grunstein,Mand Hogness,D.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.72:3961（1975）〕。プラスミドDNAは20個のハイブリ
ダイゼーシヨン陽性コロニーから調製され、BamH Iまた
はEcoR Iで開裂されて所望のプラスミドを含有するサブ
クローンを同定した。組換え微生物＃17からの約100μ
ｇのプラスミドDNAをEcoR Iで開裂して40bp断片を12.5
％ポリアクリルアミドゲル上で単離した。精製された40
bpEcoR I断片を、すでにEcoR Iで開裂し子牛腸アルカリ
性ホスフアターゼで処理して脱ホスホリル化してある２
発現プラスミド誘導体（ptrpLI-R2およびptrpLI-R4）の
EcoR I部位に挿入した。各結合物のいくつかの組換え微
生物からのプラスミドDNAを調製し、BamH I制限エンド
ヌクレアーゼで切断した。trp発現配列より下流に挿入
された40bpプロレンニンアダプターを有するプラスミド
を約700bp離れた２つのBamH I部位の存在により同定し
た。この構成は第３図に示されている。これらの発現プ
ラスミドはptrpLI-R2-B48およびptrpLI-R4-B48と称され
た。
これらの組換え微生物は、trpプロモーター−オペレ
ーター配列、リボゾーム結合部位、人工ATG開始コド
ン、及びプロレンニンの最初の５つのアミノ酸残基をコ
ードしている化学的に得られた配列を含む約370bpのHin
d III-BamH I DNA断片のための源として使用した。プロ
モーターより下流のヌクレオチド配列は、上述のプラス
ミドベクターptrpLIのCla I制限部位に異なる化学合成
されたデオキシオリゴヌクレオチドリンカーがすでに挿
入されていたのでリボゾーム結合部位の領域が異なつて
いる。リボゾーム結合部位（rbs）配列と、プロレンニ
ン遺伝子のATGおよび、他の蛋白質についてはコードし
ている遺伝子との間のヌクレオチドの内容および間隔を
DNA配列分析により下記の如く各発現の構成について示
した： 各リボゾーム結合部位の変化を使用してプロレンニン
発現プラスミドをつくつて、rbsヌクレオチド配列の内
容及び間隔が蛋白質発現レベルに対して有している可能
性ある効果を後でしらべた。
ーター配列、リボゾーム結合部位、人工ATG開始コド
ン、及びプロレンニンの最初の５つのアミノ酸残基をコ
ードしている化学的に得られた配列を含む約370bpのHin
d III-BamH I DNA断片のための源として使用した。プロ
モーターより下流のヌクレオチド配列は、上述のプラス
ミドベクターptrpLIのCla I制限部位に異なる化学合成
されたデオキシオリゴヌクレオチドリンカーがすでに挿
入されていたのでリボゾーム結合部位の領域が異なつて
いる。リボゾーム結合部位（rbs）配列と、プロレンニ
ン遺伝子のATGおよび、他の蛋白質についてはコードし
ている遺伝子との間のヌクレオチドの内容および間隔を
DNA配列分析により下記の如く各発現の構成について示
した： 各リボゾーム結合部位の変化を使用してプロレンニン
発現プラスミドをつくつて、rbsヌクレオチド配列の内
容及び間隔が蛋白質発現レベルに対して有している可能
性ある効果を後でしらべた。
プロレンニン発現プラスミドの構成 プロレンニン発現プラスミドを構成するために使用さ
れる実験段階は第１図に示されている。第一に、プラス
ミドレプリコン、アンピシリン耐性マーカー、及び所望
のプロレンニンをコードしている配列（アミノ酸コドン
83から停止コドン（TGA）まで）を含む4772bpベクター
断片を、30μｇのpCR101プラスミドDNAをHind IIIおよ
びKpn I制限エンドヌクレアーゼで切断することにより
製造した。この制限反応物を１％アガロースゲル上で電
気泳動にかけ、両方のDNA断片を電気溶出によりゲル切
片から単離した。プロレンニンcDNA配列のアミノ末端部
分を含む906-bp Hind III-Kpn I断片をさらにBamH Iで
切断し５％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけ
た。235-bp BamH I-Kpn I断片（アミノ酸コドン６ない
し83をコードしている）をゲルの切片から電気溶出し
た。
れる実験段階は第１図に示されている。第一に、プラス
ミドレプリコン、アンピシリン耐性マーカー、及び所望
のプロレンニンをコードしている配列（アミノ酸コドン
83から停止コドン（TGA）まで）を含む4772bpベクター
断片を、30μｇのpCR101プラスミドDNAをHind IIIおよ
びKpn I制限エンドヌクレアーゼで切断することにより
製造した。この制限反応物を１％アガロースゲル上で電
気泳動にかけ、両方のDNA断片を電気溶出によりゲル切
片から単離した。プロレンニンcDNA配列のアミノ末端部
分を含む906-bp Hind III-Kpn I断片をさらにBamH Iで
切断し５％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけ
た。235-bp BamH I-Kpn I断片（アミノ酸コドン６ない
し83をコードしている）をゲルの切片から電気溶出し
た。
異なるptrpLI-R-B48誘導体からの発現配列を含むHind
III-BamH I DNA断片をpCR101から２つの制限断片（477
2bpおよび235bp）と約等モル比で別々に混合した。この
混合物をT4DNAリガーゼの添加により結合させ、各結合
混合物の１部をHB101能力細胞に導入するのに使用し
た。細胞をアンピシリン（25μg/ml）を含有するLB寒天
プレート上で細胞を選択した各場合についてコロニーが
得られた。上述のコロニーからいくつかの薬物耐性コロ
ニーを5mlのLB培養物に採取して、プラスミドDNAを制限
酵素によつて分析した。各場合について、ほとんどの組
換え微生物はtrpプロモーター−rbs配列に隣接して組換
えられた完全なプロレンニン遺伝子を含んでいることが
わかつた。
III-BamH I DNA断片をpCR101から２つの制限断片（477
2bpおよび235bp）と約等モル比で別々に混合した。この
混合物をT4DNAリガーゼの添加により結合させ、各結合
混合物の１部をHB101能力細胞に導入するのに使用し
た。細胞をアンピシリン（25μg/ml）を含有するLB寒天
プレート上で細胞を選択した各場合についてコロニーが
得られた。上述のコロニーからいくつかの薬物耐性コロ
ニーを5mlのLB培養物に採取して、プラスミドDNAを制限
酵素によつて分析した。各場合について、ほとんどの組
換え微生物はtrpプロモーター−rbs配列に隣接して組換
えられた完全なプロレンニン遺伝子を含んでいることが
わかつた。
これらの発現プラスミドを制限エンドヌクレアーゼで
分析することにより、プロレンニンの直接的発現に適合
した全プロレンニンコード化配列を含んでいることがわ
かつた。上記プロレンニン遺伝子、インビトロ接合領域
およびtrpプロモーター−オペレーターのほとんどをMax
amおよびGilbertの上記文献の化学的減成方法によつてD
NA配列を分析したところ、上記人工の開始コドンおよび
プロキモシンをコードしている配列が大腸菌（E.coli）
trpプロモーター−オペレーターの直後に位置し、ヌク
レオチドレベルで２つの発現プラスミドの別々の特性を
確立する役割をしていることが確認された。ここで構成
されたこれらの２つのプロレンニンプラスミドはpPFZ-R
2およびpPFZ-R4と称される。さらに、発現プラスミドpP
FZ-R2およびpPFZ-R4においては、trpリーダーペプチド
の大腸菌リボゾーム結合部位の各々５および11ヌクレオ
チド後にATG開始コドンが存在している。
分析することにより、プロレンニンの直接的発現に適合
した全プロレンニンコード化配列を含んでいることがわ
かつた。上記プロレンニン遺伝子、インビトロ接合領域
およびtrpプロモーター−オペレーターのほとんどをMax
amおよびGilbertの上記文献の化学的減成方法によつてD
NA配列を分析したところ、上記人工の開始コドンおよび
プロキモシンをコードしている配列が大腸菌（E.coli）
trpプロモーター−オペレーターの直後に位置し、ヌク
レオチドレベルで２つの発現プラスミドの別々の特性を
確立する役割をしていることが確認された。ここで構成
されたこれらの２つのプロレンニンプラスミドはpPFZ-R
2およびpPFZ-R4と称される。さらに、発現プラスミドpP
FZ-R2およびpPFZ-R4においては、trpリーダーペプチド
の大腸菌リボゾーム結合部位の各々５および11ヌクレオ
チド後にATG開始コドンが存在している。
これらの発現プラスミドのDNA配列を翻訳すると366個
のアミノ酸で構成されたプロレンニン蛋白質を予測す
る。そのようなポリペプチドの測定された分子量は約4
1,000である。発現プラスミドを有する大腸菌をトリプ
トフアンを欠く最小限の培地中で生育させると、これら
の細胞はSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動におい
て成熟キモシン（約36,000ダルトン）よりわずかに大き
いところに位置する蛋白質を産生する〔Laemmli,U.K.Na
ture 227:680（1970）〕。そのような蛋白質は同一条件
下に生育させたベクタープラスミドpBR322を含む大腸菌
によつては産生されない。トリプトフアン（100μg/m
l）を欠くM9CA培地中で生育された同一の発現組換え体
によつてはプロレンニン蛋白質はほとんど産生されず、
このことは推定されるプロキモシン蛋白質の大腸菌によ
る産生は意図されたようにtrpプロモーター−オペレー
ターの制御下にあることを示す。
のアミノ酸で構成されたプロレンニン蛋白質を予測す
る。そのようなポリペプチドの測定された分子量は約4
1,000である。発現プラスミドを有する大腸菌をトリプ
トフアンを欠く最小限の培地中で生育させると、これら
の細胞はSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動におい
て成熟キモシン（約36,000ダルトン）よりわずかに大き
いところに位置する蛋白質を産生する〔Laemmli,U.K.Na
ture 227:680（1970）〕。そのような蛋白質は同一条件
下に生育させたベクタープラスミドpBR322を含む大腸菌
によつては産生されない。トリプトフアン（100μg/m
l）を欠くM9CA培地中で生育された同一の発現組換え体
によつてはプロレンニン蛋白質はほとんど産生されず、
このことは推定されるプロキモシン蛋白質の大腸菌によ
る産生は意図されたようにtrpプロモーター−オペレー
ターの制御下にあることを示す。
発現培養物によるプロレンニン合成の評価 プロレンニン発現プラスミドpPFZ-R2およびpPFZ-R4を
有する大腸菌形質転換体はtrpプロモーターの誘導のた
めにトリプトフアンを欠くM9CA培地中で生育させた。細
胞を振とうフラスコ中で550nmにおける光学密度1.0とな
るまで生育させた。これらの培養物からの細胞ペレツト
を２％SDS、１％ベータ−メルカプトエタノール中で分
解させて、蛋白質をアセトンで沈殿させた。沈殿した蛋
白質をSDS試料緩衝液中で再溶解し、アリコツトを10％S
DS−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させた〔Laem
mli,Nature 227:680（1970）〕。プロレンニンレベルは
コーマシー青で染色したゲルを579nmでデンシトメータ
ーによつてゲルを走査することによつて測定した。
有する大腸菌形質転換体はtrpプロモーターの誘導のた
めにトリプトフアンを欠くM9CA培地中で生育させた。細
胞を振とうフラスコ中で550nmにおける光学密度1.0とな
るまで生育させた。これらの培養物からの細胞ペレツト
を２％SDS、１％ベータ−メルカプトエタノール中で分
解させて、蛋白質をアセトンで沈殿させた。沈殿した蛋
白質をSDS試料緩衝液中で再溶解し、アリコツトを10％S
DS−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させた〔Laem
mli,Nature 227:680（1970）〕。プロレンニンレベルは
コーマシー青で染色したゲルを579nmでデンシトメータ
ーによつてゲルを走査することによつて測定した。
プロキモシン発現プラスミドを含む大腸菌の菌体中に
屈折性の包摂物体が存在することが位相差顕微鏡によつ
て観察された。プラスミドベクターpBR322を含む対照菌
体を同一の条件下に生育せしめても何らそのような屈折
性包摂物体は現われない。同様の観察はインシユリンや
チモシンのような外来遺伝子の産物を産生する遺伝子操
作された微生物に関して報告されている〔Carrier et a
l.,Trends in BioTechnology 1:109（1983）〕。屈折性
物体は発現された外来蛋白質がたまつたものであると考
えられる。
屈折性の包摂物体が存在することが位相差顕微鏡によつ
て観察された。プラスミドベクターpBR322を含む対照菌
体を同一の条件下に生育せしめても何らそのような屈折
性包摂物体は現われない。同様の観察はインシユリンや
チモシンのような外来遺伝子の産物を産生する遺伝子操
作された微生物に関して報告されている〔Carrier et a
l.,Trends in BioTechnology 1:109（1983）〕。屈折性
物体は発現された外来蛋白質がたまつたものであると考
えられる。
屈折性包摂物の存在は高レベルでプロレンニンが産生
されたことと直接相関関係があるものと見られる。
されたことと直接相関関係があるものと見られる。
上記の細菌によつて合成されたプロキモシンはプロレ
ンニン抗体と特異的に反応する。
ンニン抗体と特異的に反応する。
同一の振とうフラスコでの生育条件下に、プラスミド
pPFZ-R2およびpPFZ-R4を有する大腸菌（E.coli）HB101
の組換体の生育を評価したところ、プラスミドpPFZ-R2
はプロレンニンを10〜15％のレベル範囲で再現性を以つ
て産生し、pPFZ-R4はプロレンニンを５〜７％のレベル
範囲で産生した： ヌクレオチドの組成に関してこれら２つのプロレンニ
ン発現構造物（pPFZ-R2およびpPFZ-R4）の間の相違点は
プロレンニン遺伝子のリボゾーム結合部位と開始コドン
の周囲の配列のみである。異なるプラスミドを含有する
培養物の間にはプロレンニン発現のレベルに有意の差も
ある。プロレンニン発現において観察される相違は、リ
ボゾーム結合部位の周囲の一次DNA配列の差異に起因す
るといえる。ShineおよびDalgarnoによつて最初に注目
されたように（1974、PNAS71:1342-1342）、16Sリボゾ
ームRNAの３′−末端配列に対して相補性の開始コドン
より約10ヌクレオチド上流を中心とするプリンに富んだ
配列がある。ほとんどの証拠は大腸菌のリボゾームによ
る蛋白質合成開始部位の選択におけるrRNA塩基対形成に
対するmRNAの役割を証明している。多くの細菌およびフ
アージのmRNAからのリボゾーム結合部位の配列がしらべ
られ、合致するシン−ダルガルノ配列はTAAGGAGGTであ
ることがわかつた。これらの３つのパラメーターはシン
−ダルガルノ相互作用:1）相補性の長さ;2）シン−ダル
ガルノ配列と開始コドンとの間の距離；および３）シン
−ダルガルノ配列が二次構造によつて遮へいされる程度
に影響を与える。
pPFZ-R2およびpPFZ-R4を有する大腸菌（E.coli）HB101
の組換体の生育を評価したところ、プラスミドpPFZ-R2
はプロレンニンを10〜15％のレベル範囲で再現性を以つ
て産生し、pPFZ-R4はプロレンニンを５〜７％のレベル
範囲で産生した： ヌクレオチドの組成に関してこれら２つのプロレンニ
ン発現構造物（pPFZ-R2およびpPFZ-R4）の間の相違点は
プロレンニン遺伝子のリボゾーム結合部位と開始コドン
の周囲の配列のみである。異なるプラスミドを含有する
培養物の間にはプロレンニン発現のレベルに有意の差も
ある。プロレンニン発現において観察される相違は、リ
ボゾーム結合部位の周囲の一次DNA配列の差異に起因す
るといえる。ShineおよびDalgarnoによつて最初に注目
されたように（1974、PNAS71:1342-1342）、16Sリボゾ
ームRNAの３′−末端配列に対して相補性の開始コドン
より約10ヌクレオチド上流を中心とするプリンに富んだ
配列がある。ほとんどの証拠は大腸菌のリボゾームによ
る蛋白質合成開始部位の選択におけるrRNA塩基対形成に
対するmRNAの役割を証明している。多くの細菌およびフ
アージのmRNAからのリボゾーム結合部位の配列がしらべ
られ、合致するシン−ダルガルノ配列はTAAGGAGGTであ
ることがわかつた。これらの３つのパラメーターはシン
−ダルガルノ相互作用:1）相補性の長さ;2）シン−ダル
ガルノ配列と開始コドンとの間の距離；および３）シン
−ダルガルノ配列が二次構造によつて遮へいされる程度
に影響を与える。
上記２つの発現プラスミドの各々のSD配列の周囲の部
分をしらべるとpPFZ-R2における相補性の長さは６つの
隣接するヌクレオチドであり、他は３つの隣接するヌク
レオチドを有するのみであることがわかる： 又、リボゾーム結合部位と開始コドンとの間の間隔はpP
FZ-R2において５つのヌクレオチドであり、これは７つ
のヌクレオチドが介在する天然のtrpL遺伝子開始領域の
間隔に非常に近似している。一方pPFZ-R4はリボゾーム
結合部位と開始コドンとの間に11個のヌクレオチドを有
している。pPFZ-R2に見られる効果的にリボゾーム結合
部位のもう１つの重要な特徴は、シン−ダルガルノ配列
の直前のプロレンニンコード化配列と同じ読み取り枠に
おける翻訳停止コドン（TAA）である。pPFZ-R2DNA配列
のこれらすべての特徴はその高度に効果的なプロレンニ
ン発現においてある役割を演じている。
分をしらべるとpPFZ-R2における相補性の長さは６つの
隣接するヌクレオチドであり、他は３つの隣接するヌク
レオチドを有するのみであることがわかる： 又、リボゾーム結合部位と開始コドンとの間の間隔はpP
FZ-R2において５つのヌクレオチドであり、これは７つ
のヌクレオチドが介在する天然のtrpL遺伝子開始領域の
間隔に非常に近似している。一方pPFZ-R4はリボゾーム
結合部位と開始コドンとの間に11個のヌクレオチドを有
している。pPFZ-R2に見られる効果的にリボゾーム結合
部位のもう１つの重要な特徴は、シン−ダルガルノ配列
の直前のプロレンニンコード化配列と同じ読み取り枠に
おける翻訳停止コドン（TAA）である。pPFZ-R2DNA配列
のこれらすべての特徴はその高度に効果的なプロレンニ
ン発現においてある役割を演じている。
もちろん遺伝学的コードが退化すると、上記配列によ
つてコードされた蛋白質のアミノ酸配列を変えることな
しに特定のヌクレオチド配列の組成をある程度変化させ
る。このようにして、２つ以上の異なる塩基配列（同意
義のコドン）を、それによつて特定化されるアミノ酸の
同一性を変化させることなく特定のヌクレオチド配列に
おいて置換することができる。さらに、コドンを除去
し、あるいは１つ以上のコドンを退化しているコドン以
外のコドンで置換して構造的に修飾されたポリペプチド
であるが修飾されていないDNA分子によつて生成される
ポリペプチドと実質的に同じ有用性または活性を有する
ものを産生することは可能である。たとえ上記DNA分子
の相異が上記遺伝学的コードの退化に無関係だとして
も、上記ポリペプチドを生産する２つのDNA分子として
見た場合、上記２つのポリペプチド類は機能的に均等で
ある。
つてコードされた蛋白質のアミノ酸配列を変えることな
しに特定のヌクレオチド配列の組成をある程度変化させ
る。このようにして、２つ以上の異なる塩基配列（同意
義のコドン）を、それによつて特定化されるアミノ酸の
同一性を変化させることなく特定のヌクレオチド配列に
おいて置換することができる。さらに、コドンを除去
し、あるいは１つ以上のコドンを退化しているコドン以
外のコドンで置換して構造的に修飾されたポリペプチド
であるが修飾されていないDNA分子によつて生成される
ポリペプチドと実質的に同じ有用性または活性を有する
ものを産生することは可能である。たとえ上記DNA分子
の相異が上記遺伝学的コードの退化に無関係だとして
も、上記ポリペプチドを生産する２つのDNA分子として
見た場合、上記２つのポリペプチド類は機能的に均等で
ある。
＃４アミノ酸、すなわちスレオニンのコドンはACCの
代りにACTである。遺伝学的コードの過剰によつて、こ
のコードはこの位置のアミノ酸を変化しない。この工程
では、上記ホルモンのＮ−末端部分をコードしている部
分が合成的につくられているハイブリツド遺伝子の構成
物を使用するので、合成DNAによつてプロレンニンのそ
の部分のための新しいコード化配列の設計を行うことが
できる。プロレンニンのアミノ酸配列は実際には遺伝学
的コードの退化によつて維持されるので、これらの種類
の配列の変化は無意味であつて、この遺伝子は天然で生
産されるものと均等のポリペプチド（Ｎ末端metを除
く）を生成する。
代りにACTである。遺伝学的コードの過剰によつて、こ
のコードはこの位置のアミノ酸を変化しない。この工程
では、上記ホルモンのＮ−末端部分をコードしている部
分が合成的につくられているハイブリツド遺伝子の構成
物を使用するので、合成DNAによつてプロレンニンのそ
の部分のための新しいコード化配列の設計を行うことが
できる。プロレンニンのアミノ酸配列は実際には遺伝学
的コードの退化によつて維持されるので、これらの種類
の配列の変化は無意味であつて、この遺伝子は天然で生
産されるものと均等のポリペプチド（Ｎ末端metを除
く）を生成する。
本発明の細菌（E.coli）形質転換体によつて発現され
たメチオニンプロレンニンの単離、そのレニンへの転化
および該レニンの牛乳凝固活性は英国特許出願2,100,73
7AおよびEmtageら、Proc.Natl.Acad.Sci.80:3671-3675
（1983）に記載の方法によつて示された。
たメチオニンプロレンニンの単離、そのレニンへの転化
および該レニンの牛乳凝固活性は英国特許出願2,100,73
7AおよびEmtageら、Proc.Natl.Acad.Sci.80:3671-3675
（1983）に記載の方法によつて示された。
大腸菌trpプロモーター−オペレーター断片ATG開始コ
ドン、R2またはR4からなるリボゾーム結合部位、および
ウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモンまたはヒト上皮成
長因子をコード化しているcDNA遺伝子配列を有するプラ
スミドも構成され、大腸菌に導入されると、上述の各外
来蛋白質を高度に効率よく発現する。ATG開始コドン迄
のベクター、プロモーターおよびリボゾーム結合部位の
ヌクレオチド配列は本質的にプロレンニン発現プラスミ
ドについて上述したものと同一である。これらの種々の
構成物により産生される外来蛋白質の発現レベルはSDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、続いてデン
シトメーターで走査することによつて測定された。これ
らの培養物によつて得られた発現の相対的レベルはプロ
レンニンの発現について観察されるものと類似してい
た。すなわち、リボゾーム結合部位のR2翻訳を含む動物
の成長ホルモン発現プラスミドの発現レベルはR4翻訳の
発現レベルの約４〜５倍である。最終的には、大腸菌細
胞における発現レベルは全細胞蛋白質の約25〜30％であ
つた。
ドン、R2またはR4からなるリボゾーム結合部位、および
ウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモンまたはヒト上皮成
長因子をコード化しているcDNA遺伝子配列を有するプラ
スミドも構成され、大腸菌に導入されると、上述の各外
来蛋白質を高度に効率よく発現する。ATG開始コドン迄
のベクター、プロモーターおよびリボゾーム結合部位の
ヌクレオチド配列は本質的にプロレンニン発現プラスミ
ドについて上述したものと同一である。これらの種々の
構成物により産生される外来蛋白質の発現レベルはSDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、続いてデン
シトメーターで走査することによつて測定された。これ
らの培養物によつて得られた発現の相対的レベルはプロ
レンニンの発現について観察されるものと類似してい
た。すなわち、リボゾーム結合部位のR2翻訳を含む動物
の成長ホルモン発現プラスミドの発現レベルはR4翻訳の
発現レベルの約４〜５倍である。最終的には、大腸菌細
胞における発現レベルは全細胞蛋白質の約25〜30％であ
つた。
bGHおよびpGH遺伝子の発現を達成させるのに使用され
る方法は動物の成長ホルモンの発現についてP.Seeburg
ら（1983、DNA2137-45）によつて報告されている方法と
本質的に同じてある。この方法によりクローンされた合
成DNAとクローンされたcDNA配列からなる混成遺伝子の
構成を確認した。この構成設計により、成熟ホルモンの
最初のアミノ酸についての翻訳開始コドンを導入するこ
とにより信号配列のないbGHおよびpGHを大腸菌において
直接発現させることができた。合成DNAの使用によつてb
GHおよびpGH遺伝子のアミノ末端領域のための新しいコ
ード化配列を設計することもできた。成長ホルモン遺伝
子の合成領域によつてコード化されているアミノ酸配列
は実際には遺伝学的コードの過剰によつて維持された。
る方法は動物の成長ホルモンの発現についてP.Seeburg
ら（1983、DNA2137-45）によつて報告されている方法と
本質的に同じてある。この方法によりクローンされた合
成DNAとクローンされたcDNA配列からなる混成遺伝子の
構成を確認した。この構成設計により、成熟ホルモンの
最初のアミノ酸についての翻訳開始コドンを導入するこ
とにより信号配列のないbGHおよびpGHを大腸菌において
直接発現させることができた。合成DNAの使用によつてb
GHおよびpGH遺伝子のアミノ末端領域のための新しいコ
ード化配列を設計することもできた。成長ホルモン遺伝
子の合成領域によつてコード化されているアミノ酸配列
は実際には遺伝学的コードの過剰によつて維持された。
bGHcDNAを有するプラスミドをMillerら、J.Biochem.7
521（1980）によつて報告されたようにして得られpBGH-
102と称された。これはMillerらのプラスミドBP348と均
等である。bGHmRNAのヌクレオチド配列とその相当する
アミノ酸配列（該ヌクレオチド配列により予測される）
はすでに公開されている（Miller,Wら、上記文献）。ト
リプトフアンプロモーター−オペレーターおよびリボゾ
ーム結合部位配列を有する制限断片をptrpL1-R2および
−R4から得た。成長ホルモン遺伝子のアミノおよびカル
ボキシ末端を修飾するのに使用される合成二本鎖DNAの
配列はSeeburgら（1983、DNA２;37-45）による報告から
取り出した。ホスホラミダイト化学（Caruthersら）を
使用して上述の如くオリゴヌクレオチドを合成し、断片
を一本鎖オリゴマー（11〜16塩基）から組立てた。Ｎ−
末端合成DNAは蛋白質合成のための人工ATG開始コドンお
よびbGHの最初の23個のアミノ酸のコドンをコード化し
ている。pBR322DNAへの挿入を促進するために、この合
成断片は、制限エンドヌクレアーゼEcoR IとHind IIIに
よつて生じた接着末端に連続的に一致する５′末端上に
４塩基一本鎖接着末端をも有していた。所望の配位結合
生成物を５％ポリアクリルアミドゲルから約80bpの帯状
物として単離した。次いで精製されたDNAを、すでに制
限エンドヌクレアーゼEcoR IおよびHind IIIで切断され
たpBR322DNAと配位結合して大腸菌能力細胞の中に形質
転換した。クローンされた合成DNAを化学減成方法（Max
amおよびGilbert,1980、Methods Enzymol 65;499）を使
用してDNA配列を分析して修飾されたbGH配列の完全な配
列を確認した。
521（1980）によつて報告されたようにして得られpBGH-
102と称された。これはMillerらのプラスミドBP348と均
等である。bGHmRNAのヌクレオチド配列とその相当する
アミノ酸配列（該ヌクレオチド配列により予測される）
はすでに公開されている（Miller,Wら、上記文献）。ト
リプトフアンプロモーター−オペレーターおよびリボゾ
ーム結合部位配列を有する制限断片をptrpL1-R2および
−R4から得た。成長ホルモン遺伝子のアミノおよびカル
ボキシ末端を修飾するのに使用される合成二本鎖DNAの
配列はSeeburgら（1983、DNA２;37-45）による報告から
取り出した。ホスホラミダイト化学（Caruthersら）を
使用して上述の如くオリゴヌクレオチドを合成し、断片
を一本鎖オリゴマー（11〜16塩基）から組立てた。Ｎ−
末端合成DNAは蛋白質合成のための人工ATG開始コドンお
よびbGHの最初の23個のアミノ酸のコドンをコード化し
ている。pBR322DNAへの挿入を促進するために、この合
成断片は、制限エンドヌクレアーゼEcoR IとHind IIIに
よつて生じた接着末端に連続的に一致する５′末端上に
４塩基一本鎖接着末端をも有していた。所望の配位結合
生成物を５％ポリアクリルアミドゲルから約80bpの帯状
物として単離した。次いで精製されたDNAを、すでに制
限エンドヌクレアーゼEcoR IおよびHind IIIで切断され
たpBR322DNAと配位結合して大腸菌能力細胞の中に形質
転換した。クローンされた合成DNAを化学減成方法（Max
amおよびGilbert,1980、Methods Enzymol 65;499）を使
用してDNA配列を分析して修飾されたbGH配列の完全な配
列を確認した。
Seeburgらによつて記載されたプラスミドに類似の発
現ベクターをbGHとpGHの両者について構成して、リボゾ
ーム結合部位を変えた場合のプロレンニン以外の哺乳類
の遺伝子の発現を比較した。bGH発現プラスミドを構成
するのに使用される実験工程は第５図と第６図に示し
た。
現ベクターをbGHとpGHの両者について構成して、リボゾ
ーム結合部位を変えた場合のプロレンニン以外の哺乳類
の遺伝子の発現を比較した。bGH発現プラスミドを構成
するのに使用される実験工程は第５図と第６図に示し
た。
まず、cDNAクローンpBGH-102からの領域、すなわちア
ミノ酸23〜86をコード化している配列を５％ポリアクリ
ルアミドゲル上で単離し、ATG開始コドンとbGHの最初の
22個のアミノ酸のための配列をコード化しているpBR322
サブクローンが単離されたクローン化合成75bp EcoR I-
Pvu II断片に配位結合した。この配位結合混合物を制限
エンドヌクレアーゼEcoR IおよびPst Iで開裂し、270bp
断片を５％ポリアクリルアミドゲルから単離し、適当に
開裂されたpBR322DNAに挿入した。これらの２つの部位
を使用して、修飾されたbGH遺伝子配列のEcoR I-Pst I
DNA断片をpBR322プラスミドに挿入して挿入の単一の配
向のみを可能にした。この結合において得られた形質転
換体から得られたプラスミドDNAをEcoR IとPst Iで開裂
して270bp bGH遺伝子断片のベクターへの挿入を証明し
た。次に、bGHアミノ酸91〜191のコード化配列（および
bGHcDNAの３′未翻訳領域）を有するbBGH-102からの440
bp Pst I DNA断片をこのプラスミドDNAのPst I部位に挿
入して全長bGH遺伝子の再構成を完了した。このPst I断
片はbGH遺伝子の残部に対して２つの可能な方向で挿入
された。制限地図によると、挿入物を所望の方向に挿入
すると約490bp Pvu II断片（上記bGH遺伝子に対して完
全に内部）を生成するが、挿入する方向が悪いと350bp
Pvu II DNA断片となる。制限エンドヌクレアーゼPvu II
でテトラサイクリン耐性形質転換体からのプラスミドDN
Aを開裂後両方の方向の多重単離物を同定した。この方
法で同定されたプラスミドの１つはpBGH-212と称され、
この全長bGH遺伝子をさらに制限エンドヌクレアーゼで
開裂して制限地図を作成しDNA配列をしらべることによ
つて分析して該プラスミドの構成を正確なものにした。
ミノ酸23〜86をコード化している配列を５％ポリアクリ
ルアミドゲル上で単離し、ATG開始コドンとbGHの最初の
22個のアミノ酸のための配列をコード化しているpBR322
サブクローンが単離されたクローン化合成75bp EcoR I-
Pvu II断片に配位結合した。この配位結合混合物を制限
エンドヌクレアーゼEcoR IおよびPst Iで開裂し、270bp
断片を５％ポリアクリルアミドゲルから単離し、適当に
開裂されたpBR322DNAに挿入した。これらの２つの部位
を使用して、修飾されたbGH遺伝子配列のEcoR I-Pst I
DNA断片をpBR322プラスミドに挿入して挿入の単一の配
向のみを可能にした。この結合において得られた形質転
換体から得られたプラスミドDNAをEcoR IとPst Iで開裂
して270bp bGH遺伝子断片のベクターへの挿入を証明し
た。次に、bGHアミノ酸91〜191のコード化配列（および
bGHcDNAの３′未翻訳領域）を有するbBGH-102からの440
bp Pst I DNA断片をこのプラスミドDNAのPst I部位に挿
入して全長bGH遺伝子の再構成を完了した。このPst I断
片はbGH遺伝子の残部に対して２つの可能な方向で挿入
された。制限地図によると、挿入物を所望の方向に挿入
すると約490bp Pvu II断片（上記bGH遺伝子に対して完
全に内部）を生成するが、挿入する方向が悪いと350bp
Pvu II DNA断片となる。制限エンドヌクレアーゼPvu II
でテトラサイクリン耐性形質転換体からのプラスミドDN
Aを開裂後両方の方向の多重単離物を同定した。この方
法で同定されたプラスミドの１つはpBGH-212と称され、
この全長bGH遺伝子をさらに制限エンドヌクレアーゼで
開裂して制限地図を作成しDNA配列をしらべることによ
つて分析して該プラスミドの構成を正確なものにした。
bGH発現プラスミドを組立てるための次の段階は、大
腸菌trpプロモーターとリボゾーム結合部位配列を有す
るEcoR I DNA断片の挿入である。全長bGHクローン、pBG
H212を制限エンドヌクレアーゼEcoR Iで開裂し、細菌の
アルカリ性ホスフアターゼで処理して、２つの異なる約
390bpのEcoR I断片（bGHの細菌による発現に要する配列
を有する）と結合させた。２つの異なる配位結合を行つ
て、遺伝子開始領域のヌクレオチド配列がわずかに異な
るtrpプロモーター−rbs断片をpBGH-212に挿入した。菌
株HB101の能力細胞を各配位結合反応混合物で形質転換
した。各形質転換物からいくつかのテトラサイクリン耐
性コロニーをとり出し、単離されたプラスミドDNAを制
限エンドヌクレアーゼによる切断によつて分析した。tr
pプロモーター−rbs含有断片を、該プロモーターからの
転写の方向に対して可能な２つの方向でpBGH-212DNAに
挿入できた。プロモーター−rbs挿入物の方向をbGH遺伝
子の転写を生じる方向にすると60bp Hind III DNA断片
を生成し、望ましくない方向にすると400bp断片を生成
する。各結合混合物からの倍数の組換え微生物を、直接
の発現に必要とされる配置でtrpプロモーター−rbs配列
に隣接する完全なbGH遺伝子を担持するプラスミドで同
定した。
腸菌trpプロモーターとリボゾーム結合部位配列を有す
るEcoR I DNA断片の挿入である。全長bGHクローン、pBG
H212を制限エンドヌクレアーゼEcoR Iで開裂し、細菌の
アルカリ性ホスフアターゼで処理して、２つの異なる約
390bpのEcoR I断片（bGHの細菌による発現に要する配列
を有する）と結合させた。２つの異なる配位結合を行つ
て、遺伝子開始領域のヌクレオチド配列がわずかに異な
るtrpプロモーター−rbs断片をpBGH-212に挿入した。菌
株HB101の能力細胞を各配位結合反応混合物で形質転換
した。各形質転換物からいくつかのテトラサイクリン耐
性コロニーをとり出し、単離されたプラスミドDNAを制
限エンドヌクレアーゼによる切断によつて分析した。tr
pプロモーター−rbs含有断片を、該プロモーターからの
転写の方向に対して可能な２つの方向でpBGH-212DNAに
挿入できた。プロモーター−rbs挿入物の方向をbGH遺伝
子の転写を生じる方向にすると60bp Hind III DNA断片
を生成し、望ましくない方向にすると400bp断片を生成
する。各結合混合物からの倍数の組換え微生物を、直接
の発現に必要とされる配置でtrpプロモーター−rbs配列
に隣接する完全なbGH遺伝子を担持するプラスミドで同
定した。
発現プラスミドの構成は、プラスミドpBGH-212-R2お
よびpBGH-212-R4からの約920bp Hind III-Pru II（パー
シヤル）DNA断片を単離することによつて開始された。
このDNA断片はtrpプロモーター−rbs配列およびbGHコー
ド化配列のほとんど全体（最後の４個のアミノ酸残基お
よび停止コドン以外のすべて）を含む。ホルモン全体を
発現するために、bGHのＣ末端をコード化している合成D
NAの断片をpBR-322にクローンした。この20bp DNA断片
を２つの独立したオリゴマーとして合成し、アニール化
して二本鎖断片を形成し、制限エンドヌクレアーゼEcoR
IおよびHind IIIで切断されたpBR322DNAに挿入した。
このサブクローンを制限エンドヌクレアーゼPvu IIおよ
びBamH Iで切断後、356bp Pvu II-BamH I DNA断片をゲ
ルで単離し、電気溶出により精製した。最終的な発現プ
ラスミドは、クローンされた合成Ｃ末端を有する断片
（365bp）を第６図に示すとおりに、各々、trpプロモー
ター−rbs-bGHDNA断片（920bp）とPBR322誘導ベクター
断片（3995bp）と結合することによつて組み立てられ
た。全長bGH発現プラスミドをPvu IIによる制限エンド
ヌクレアーゼ開裂によつて同定された。これらのbGH発
現プラスミドはさらに制限酵素開裂地図のもつと正確な
決定により特徴付けられた。DNAの配列をしらべること
によりこれらの発現プラスミドをさらにしらべることに
より、上記修飾されたbGH遺伝子配列を証明し、pBGH-30
1とpBGH-375と称される２つの異なるベクターが別個の
ものであることを確証した。
よびpBGH-212-R4からの約920bp Hind III-Pru II（パー
シヤル）DNA断片を単離することによつて開始された。
このDNA断片はtrpプロモーター−rbs配列およびbGHコー
ド化配列のほとんど全体（最後の４個のアミノ酸残基お
よび停止コドン以外のすべて）を含む。ホルモン全体を
発現するために、bGHのＣ末端をコード化している合成D
NAの断片をpBR-322にクローンした。この20bp DNA断片
を２つの独立したオリゴマーとして合成し、アニール化
して二本鎖断片を形成し、制限エンドヌクレアーゼEcoR
IおよびHind IIIで切断されたpBR322DNAに挿入した。
このサブクローンを制限エンドヌクレアーゼPvu IIおよ
びBamH Iで切断後、356bp Pvu II-BamH I DNA断片をゲ
ルで単離し、電気溶出により精製した。最終的な発現プ
ラスミドは、クローンされた合成Ｃ末端を有する断片
（365bp）を第６図に示すとおりに、各々、trpプロモー
ター−rbs-bGHDNA断片（920bp）とPBR322誘導ベクター
断片（3995bp）と結合することによつて組み立てられ
た。全長bGH発現プラスミドをPvu IIによる制限エンド
ヌクレアーゼ開裂によつて同定された。これらのbGH発
現プラスミドはさらに制限酵素開裂地図のもつと正確な
決定により特徴付けられた。DNAの配列をしらべること
によりこれらの発現プラスミドをさらにしらべることに
より、上記修飾されたbGH遺伝子配列を証明し、pBGH-30
1とpBGH-375と称される２つの異なるベクターが別個の
ものであることを確証した。
これらの発現プラスミドのDNA配列を翻訳することに
より191個のアミノ酸残渣のホルモンポリペプチドを予
測できる。そのような蛋白質の測定された分子量は約2
2,000である。bGH発現プラスミドpBGH-301とpBGH-375を
有する細胞をtrpプロモーターで司令される発現を誘導
するのに公知の条件下に生育させると、細胞は、総蛋白
抽出物をSDS−ポリアクリルアミドゲル（Laemmli,U.197
0,Nature277,680）上でしらべたところ精製されたbGH蛋
白（マイルス（Miles）より得た）のサイズに似た蛋白
質を生産した。この帯状物は同一条件下に生育させたベ
クタープラスミドpBR322を有する細胞からの蛋白質抽出
物中で可視ではなかつた。bGHレベルを579nmにおけるデ
ンシトメーターゲル走査によりしらべた。rbsのR2を変
えた発現プラスミド（pBGH-301）を含む培養物は総細胞
蛋白質の約20〜25％のレベルでbGHを生成した。一方、r
brのR4が変化したpBGA-375発現プラスミドを有する細胞
は総細胞蛋白質の約５〜７％のレベルでbGHを生成し
た。
より191個のアミノ酸残渣のホルモンポリペプチドを予
測できる。そのような蛋白質の測定された分子量は約2
2,000である。bGH発現プラスミドpBGH-301とpBGH-375を
有する細胞をtrpプロモーターで司令される発現を誘導
するのに公知の条件下に生育させると、細胞は、総蛋白
抽出物をSDS−ポリアクリルアミドゲル（Laemmli,U.197
0,Nature277,680）上でしらべたところ精製されたbGH蛋
白（マイルス（Miles）より得た）のサイズに似た蛋白
質を生産した。この帯状物は同一条件下に生育させたベ
クタープラスミドpBR322を有する細胞からの蛋白質抽出
物中で可視ではなかつた。bGHレベルを579nmにおけるデ
ンシトメーターゲル走査によりしらべた。rbsのR2を変
えた発現プラスミド（pBGH-301）を含む培養物は総細胞
蛋白質の約20〜25％のレベルでbGHを生成した。一方、r
brのR4が変化したpBGA-375発現プラスミドを有する細胞
は総細胞蛋白質の約５〜７％のレベルでbGHを生成し
た。
pGH発現の場合、bGH発現に使用されるものと類似の方
法が使用された。pGH遺伝子のアミノ末端を修飾するの
に使用される二本鎖DNAの配列は本質的にSeeburgらの上
記文献に記載のとおりである。pGH発現プラスミドを構
成するのに使用される実験の工程は第７図のとおりであ
る。まず、CDNAクローン（pGH24）からの領域をpGH遺伝
子の合成領域で置換した。pGHのアミノ酸残基22と23を
コードしている領域はPvu II部位を欠いているので、pG
Hハイブリツド遺伝子の合成５′部分を上記クローンさ
れたcDNAから誘導されたコード化配列にAsu I部位（pGH
-24のアミノ酸コドン16および17で生じる）において結
合した。Asu I部位もpGHのアミノ末端をコードしている
合成DNAの同じ位置に挿入した。クローンされたcDNAに
さらにAsu I部位が存在することにより、このpGH遺伝子
は３つの異なるDNA断片から再構成された。
法が使用された。pGH遺伝子のアミノ末端を修飾するの
に使用される二本鎖DNAの配列は本質的にSeeburgらの上
記文献に記載のとおりである。pGH発現プラスミドを構
成するのに使用される実験の工程は第７図のとおりであ
る。まず、CDNAクローン（pGH24）からの領域をpGH遺伝
子の合成領域で置換した。pGHのアミノ酸残基22と23を
コードしている領域はPvu II部位を欠いているので、pG
Hハイブリツド遺伝子の合成５′部分を上記クローンさ
れたcDNAから誘導されたコード化配列にAsu I部位（pGH
-24のアミノ酸コドン16および17で生じる）において結
合した。Asu I部位もpGHのアミノ末端をコードしている
合成DNAの同じ位置に挿入した。クローンされたcDNAに
さらにAsu I部位が存在することにより、このpGH遺伝子
は３つの異なるDNA断片から再構成された。
pGH-24から単離された635bp Pst I-Pvu II断片はRsa
Iによつて切断され、得られた200bp Pst I-Rsa I断片を
さらにAsn Iで開裂した。修飾された遺伝子はクローン
された合成EcoR I-Asu I53bp断片、75bp Asu I-Rsa I断
片および480bp Rsa I-Pvu II断片をいつしよに結合する
ことにより構成した。この結合の生成物をEcoR Iおよび
Rvu IIで切断し、570bpの大きさのDNA断片を５％ポリア
クリルアミドゲルから単離した。この断片をbGH発現プ
ラスミドpBGH-375からのEcoR I-Pvu II（パーシヤル）
ベクター断片と結合して大腸菌菌株MM294（ATCC33625）
の能力細胞内に形質転換し、アンピシリンを含有するプ
レート上で選択された。このプレー発現プラスミド（91
0bp EcoR I-BamH I断片の存在によつて同定された）は
全長pGH遺伝子を有する。というのは、pGHおよびbGH蛋
白質は同じＣ末端アミノ酸配列を有するからである。
Iによつて切断され、得られた200bp Pst I-Rsa I断片を
さらにAsn Iで開裂した。修飾された遺伝子はクローン
された合成EcoR I-Asu I53bp断片、75bp Asu I-Rsa I断
片および480bp Rsa I-Pvu II断片をいつしよに結合する
ことにより構成した。この結合の生成物をEcoR Iおよび
Rvu IIで切断し、570bpの大きさのDNA断片を５％ポリア
クリルアミドゲルから単離した。この断片をbGH発現プ
ラスミドpBGH-375からのEcoR I-Pvu II（パーシヤル）
ベクター断片と結合して大腸菌菌株MM294（ATCC33625）
の能力細胞内に形質転換し、アンピシリンを含有するプ
レート上で選択された。このプレー発現プラスミド（91
0bp EcoR I-BamH I断片の存在によつて同定された）は
全長pGH遺伝子を有する。というのは、pGHおよびbGH蛋
白質は同じＣ末端アミノ酸配列を有するからである。
pGH発現プラスミドの構成における次の工程は、大腸
菌trpオペロンプロモーター配列と修飾されたリボゾー
ム結合部位を有する約390bp EcoR I DNA断片の挿入であ
る。全長pGHプラスミドを制限エンドヌクレアーゼEcoR
Iで開裂し、pGHの細菌による発現に必要な配列を有する
EcoR I断片の別個のもの（separate version）と結合し
た。発現断片をリボゾーム結合部位の周囲の領域がわず
かに異なるヌクレオチド配列とともに使用することによ
り２つの異なる結合反応物をつくつた。菌株C600の能力
細胞を各結合反応物で形質転換した。プラスミドDNAを
各形質転換体からいくつかの薬剤耐性コロニーから単離
し、制限エンドヌクレアーゼによつて切断して分析し
た。trpプロモーターを含む断片をtrpプロモーターから
の転写方向に対して可能な２つの方向でプレ発現プラス
ミド中に挿入できた。上記pGH遺伝子の転写を生じるプ
ロモーター挿入断片を所望の方向に挿入すると920bp Hi
nd III DNA断片を産生し、一方望ましくない方向にする
と600bpDNA断片を生成する。各結合反応物からの多重単
離物を直接発現に必要とされる配置にあるtrpプロモー
ターとrbs配列に隣接する完全なpGH遺伝子を有するプラ
スミドで同定した。さらに、これらの発現構成物の特性
は他の制限エンドヌクレアーゼによる制限地図をつくる
ことによりしらべられた。これらのpGH発現プラスミド
の特徴をDNA配列をしらべることによつてしらべてヌク
レオチドのレベルでそれらが別個のものであることを確
証した。これら２つのpGH発現プラスミドはpGH-101とpG
H-107と称された。
菌trpオペロンプロモーター配列と修飾されたリボゾー
ム結合部位を有する約390bp EcoR I DNA断片の挿入であ
る。全長pGHプラスミドを制限エンドヌクレアーゼEcoR
Iで開裂し、pGHの細菌による発現に必要な配列を有する
EcoR I断片の別個のもの（separate version）と結合し
た。発現断片をリボゾーム結合部位の周囲の領域がわず
かに異なるヌクレオチド配列とともに使用することによ
り２つの異なる結合反応物をつくつた。菌株C600の能力
細胞を各結合反応物で形質転換した。プラスミドDNAを
各形質転換体からいくつかの薬剤耐性コロニーから単離
し、制限エンドヌクレアーゼによつて切断して分析し
た。trpプロモーターを含む断片をtrpプロモーターから
の転写方向に対して可能な２つの方向でプレ発現プラス
ミド中に挿入できた。上記pGH遺伝子の転写を生じるプ
ロモーター挿入断片を所望の方向に挿入すると920bp Hi
nd III DNA断片を産生し、一方望ましくない方向にする
と600bpDNA断片を生成する。各結合反応物からの多重単
離物を直接発現に必要とされる配置にあるtrpプロモー
ターとrbs配列に隣接する完全なpGH遺伝子を有するプラ
スミドで同定した。さらに、これらの発現構成物の特性
は他の制限エンドヌクレアーゼによる制限地図をつくる
ことによりしらべられた。これらのpGH発現プラスミド
の特徴をDNA配列をしらべることによつてしらべてヌク
レオチドのレベルでそれらが別個のものであることを確
証した。これら２つのpGH発現プラスミドはpGH-101とpG
H-107と称された。
これらのpGH発現プラスミドのDNA配列を翻訳すれば19
1個のアミノ酸のホルモンポリペプチドを予測し得る。
そのような蛋白質の測定された分子量は約22,000とな
る。プラスミドpGH-101またはpGH-107からなる組換え微
生物をtrpプロモーターが司令する発現を誘導させるに
公知の条件下で生育させると、これらの細胞は約22,000
ダルトンのサイズの蛋白質を生成した。この帯状物は同
一の条件下に生育されたベクタープラスミドpBR322を有
する細胞からつくられた蛋白質抽出物からは得られなか
つた。pGH産生のレベルはSDS−ポリアクリルアミドゲル
の個々のレーンをデンシトメーターで走査することによ
つて決定された。いくつかの大腸菌蛋白質は22,000ダル
トンの大きさにあてはまり対照細胞抽出物中の総蛋白質
の約２〜５％を占める。これらの生来の蛋白質の割合を
補正すると、上記発現培養物の蛋白質抽出物中に見られ
るpGH帯状物はpGH-101とpGH-107の各々について総細胞
蛋白質の約５％および15％である。トリプトフアン（10
0μg/ml）の存在下に生育させた培養物中のpGHレベルを
定量するとpGH発現のレベルが低下した。この事実は、p
GH蛋白質の大腸菌内での産生が意図されたtrpプロモー
ター−オペレーターの制御下で本当に行なわれているこ
とを意味する。pGHの場合の発現レベルの相違は同じリ
ボゾーム結合部位配列を使用してプロレンニンとbGHを
発現させるときに見られる相違と類似していた。
1個のアミノ酸のホルモンポリペプチドを予測し得る。
そのような蛋白質の測定された分子量は約22,000とな
る。プラスミドpGH-101またはpGH-107からなる組換え微
生物をtrpプロモーターが司令する発現を誘導させるに
公知の条件下で生育させると、これらの細胞は約22,000
ダルトンのサイズの蛋白質を生成した。この帯状物は同
一の条件下に生育されたベクタープラスミドpBR322を有
する細胞からつくられた蛋白質抽出物からは得られなか
つた。pGH産生のレベルはSDS−ポリアクリルアミドゲル
の個々のレーンをデンシトメーターで走査することによ
つて決定された。いくつかの大腸菌蛋白質は22,000ダル
トンの大きさにあてはまり対照細胞抽出物中の総蛋白質
の約２〜５％を占める。これらの生来の蛋白質の割合を
補正すると、上記発現培養物の蛋白質抽出物中に見られ
るpGH帯状物はpGH-101とpGH-107の各々について総細胞
蛋白質の約５％および15％である。トリプトフアン（10
0μg/ml）の存在下に生育させた培養物中のpGHレベルを
定量するとpGH発現のレベルが低下した。この事実は、p
GH蛋白質の大腸菌内での産生が意図されたtrpプロモー
ター−オペレーターの制御下で本当に行なわれているこ
とを意味する。pGHの場合の発現レベルの相違は同じリ
ボゾーム結合部位配列を使用してプロレンニンとbGHを
発現させるときに見られる相違と類似していた。
“R2"trpプロモーター−rbsを使用した外来遺伝子の
効率的発現のもう１つの例は、合成DNA配列からのヒト
ウロガストロンすなわちヒト上皮成長因子（hEGF）の産
生である。hEGFの効率的な細菌による生産を達成するの
に工夫された計画においては成熟hEGFのコード化配列を
含むDNA断片を化学的に合成した。この方法によつて、
成熟EGFポリペプチドの最初のアミノ酸残基をコードし
ているコドンの前に蛋白質合成のためのATG開始コドン
を導入することによつてこの成熟ホルモンの直接発現が
可能となつた。この合成遺伝子は15個のオリゴヌクレオ
チドからなり、長さは12〜45個の塩基である。３つの別
個の結合を行い、結合中間生成物をポリアクリルアミド
ゲル上で単離した。精製された結合中間生成物を次いで
hEGF遺伝子の最終的組立として配位結合した。hEGF遺伝
子をプラスミドpBR322DNAに挿入するのを促進するた
め、合成hEGF遺伝子がその末端にEcoR IおよびHind III
制限エンドヌクレアーゼ接着末端を有するようにした。
hEGF合成DNAをEcoR IおよびHind III開裂したpBR322DNA
と結合させ、このプラスミドの合成的に誘導された領域
をDNA配列により分析（MaxamおよびGilbertの上記文
献）して正確なものとした。
効率的発現のもう１つの例は、合成DNA配列からのヒト
ウロガストロンすなわちヒト上皮成長因子（hEGF）の産
生である。hEGFの効率的な細菌による生産を達成するの
に工夫された計画においては成熟hEGFのコード化配列を
含むDNA断片を化学的に合成した。この方法によつて、
成熟EGFポリペプチドの最初のアミノ酸残基をコードし
ているコドンの前に蛋白質合成のためのATG開始コドン
を導入することによつてこの成熟ホルモンの直接発現が
可能となつた。この合成遺伝子は15個のオリゴヌクレオ
チドからなり、長さは12〜45個の塩基である。３つの別
個の結合を行い、結合中間生成物をポリアクリルアミド
ゲル上で単離した。精製された結合中間生成物を次いで
hEGF遺伝子の最終的組立として配位結合した。hEGF遺伝
子をプラスミドpBR322DNAに挿入するのを促進するた
め、合成hEGF遺伝子がその末端にEcoR IおよびHind III
制限エンドヌクレアーゼ接着末端を有するようにした。
hEGF合成DNAをEcoR IおよびHind III開裂したpBR322DNA
と結合させ、このプラスミドの合成的に誘導された領域
をDNA配列により分析（MaxamおよびGilbertの上記文
献）して正確なものとした。
大腸菌のhEGFの発現のためのベクターは、プロレンニ
ン、bGHおよびpGHの高レベルの発現に使用されたことの
あるtrpプロモーター−rbs断片を使用して構成された。
EGF発現プラスミドの構成はpBR322-EGFサブクローンを
制限エンドヌクレアーゼEcoR Iで開裂し、続いて細菌の
アルカリ性ホスフアターゼで脱ホスホリル化することに
より開始された。これらの発現プラスミドはtrpプロモ
ーター−rbs配列を有するEcoR I断片を使用して構成さ
れた。リボゾーム結合部位の周囲の領域のヌクレオチド
配列がわずかに異なるtrpプロモーター−rps断片を使用
して２つの異なる結合を行なつた。大腸菌菌株HB101の
能力細胞を各結合反応物で形質転換した。各形質転換物
から得られたいくつかの薬物耐性コロニーをとり出して
単離したプラスミドDNAを制限エンドヌクレアーゼによ
つて開裂して分析した。trpプロモーター−rbsを有する
断片をプロモーターからの転写の方向に対して可能な２
つの方向でEGFサブクローンの中に挿入できた。合成EGF
遺伝子の発現を生じるプロモーター挿入断片の方向を望
ましい方向にすると510bpのHind III DAN断片を生成す
るが、望ましくない方向にすると200bpのHind III DNA
断片を生成する。各結合反応物からの多重単離物は、直
接発現に必要な配置で細菌のプロモーター−rbs配列に
隣接してEGF遺伝子を有するプラスミドで同定された。
ン、bGHおよびpGHの高レベルの発現に使用されたことの
あるtrpプロモーター−rbs断片を使用して構成された。
EGF発現プラスミドの構成はpBR322-EGFサブクローンを
制限エンドヌクレアーゼEcoR Iで開裂し、続いて細菌の
アルカリ性ホスフアターゼで脱ホスホリル化することに
より開始された。これらの発現プラスミドはtrpプロモ
ーター−rbs配列を有するEcoR I断片を使用して構成さ
れた。リボゾーム結合部位の周囲の領域のヌクレオチド
配列がわずかに異なるtrpプロモーター−rps断片を使用
して２つの異なる結合を行なつた。大腸菌菌株HB101の
能力細胞を各結合反応物で形質転換した。各形質転換物
から得られたいくつかの薬物耐性コロニーをとり出して
単離したプラスミドDNAを制限エンドヌクレアーゼによ
つて開裂して分析した。trpプロモーター−rbsを有する
断片をプロモーターからの転写の方向に対して可能な２
つの方向でEGFサブクローンの中に挿入できた。合成EGF
遺伝子の発現を生じるプロモーター挿入断片の方向を望
ましい方向にすると510bpのHind III DAN断片を生成す
るが、望ましくない方向にすると200bpのHind III DNA
断片を生成する。各結合反応物からの多重単離物は、直
接発現に必要な配置で細菌のプロモーター−rbs配列に
隣接してEGF遺伝子を有するプラスミドで同定された。
発現プラスミドのDNA配列を分析することによりEGFコ
ード化配列が上述の如く大腸菌trpプロモーター−rbsの
直後にあることが確認された。pEGF-R2およびpEGF-R4と
称されるEGF発現プラスミドにおいてはATG開始コドンは
リボゾーム結合部位配列の各々５および11個のヌクレオ
チドの後に存在する。
ード化配列が上述の如く大腸菌trpプロモーター−rbsの
直後にあることが確認された。pEGF-R2およびpEGF-R4と
称されるEGF発現プラスミドにおいてはATG開始コドンは
リボゾーム結合部位配列の各々５および11個のヌクレオ
チドの後に存在する。
EGF発現プラスミドのDNA配列の翻訳をすると、鎖内に
３つのジスルフイド結合を形成すると考えられる６つの
システイン残基を有する54個のアミノ酸ポリペプチドを
予測できる。そのようなホルモンの測定された分子量は
約6,353となろう。lonと称される大腸菌の変異菌株（Go
ttesmanら,J.Bacteriol.148,265,1981）はコネチカツト
州ニユーヘブンのエール大学の大腸菌（E.coli）遺伝子
ストツク・センターから菌株No.ECGSC-6436として入手
し得、EGF発現プラスミドで形質転換され、trpプロモー
ターによつて司令された発現を誘導するのに公知の条件
下で生育される。野性型細胞に存するいくつかのプロテ
アーゼの１つを欠くこの変異菌株を使用して細菌によつ
て生成したhEGFの蛋白質分解を最小限にした。
３つのジスルフイド結合を形成すると考えられる６つの
システイン残基を有する54個のアミノ酸ポリペプチドを
予測できる。そのようなホルモンの測定された分子量は
約6,353となろう。lonと称される大腸菌の変異菌株（Go
ttesmanら,J.Bacteriol.148,265,1981）はコネチカツト
州ニユーヘブンのエール大学の大腸菌（E.coli）遺伝子
ストツク・センターから菌株No.ECGSC-6436として入手
し得、EGF発現プラスミドで形質転換され、trpプロモー
ターによつて司令された発現を誘導するのに公知の条件
下で生育される。野性型細胞に存するいくつかのプロテ
アーゼの１つを欠くこの変異菌株を使用して細菌によつ
て生成したhEGFの蛋白質分解を最小限にした。
これらの発現培養物の総蛋白抽出物を15％SDS−ポリ
アクリルアミドゲル上でしらべてEGF産生のレベルを決
定しようとした。低分子量のポリペプチド（市販のもの
から得られた精製マウス−EGFを含む）は比較的分割し
ないが、対照の抽出物に比べて発現培養物からの抽出物
にはEGF分子量範囲の蛋白質がもつと多いようである。S
DS−ポリアクリルアミドゲルの個々のレーンをデンシト
メーターで走査した。大きさが10,000ダルトン未満の細
胞蛋白質は対照抽出物においては総細胞蛋白質の約１％
を占めている。これらの生来の蛋白質の割合を補正する
と、発現培養蛋白抽出物中の推定EGFレベルは総細胞蛋
白質の約３〜５％に相当する。
アクリルアミドゲル上でしらべてEGF産生のレベルを決
定しようとした。低分子量のポリペプチド（市販のもの
から得られた精製マウス−EGFを含む）は比較的分割し
ないが、対照の抽出物に比べて発現培養物からの抽出物
にはEGF分子量範囲の蛋白質がもつと多いようである。S
DS−ポリアクリルアミドゲルの個々のレーンをデンシト
メーターで走査した。大きさが10,000ダルトン未満の細
胞蛋白質は対照抽出物においては総細胞蛋白質の約１％
を占めている。これらの生来の蛋白質の割合を補正する
と、発現培養蛋白抽出物中の推定EGFレベルは総細胞蛋
白質の約３〜５％に相当する。
第１図はプラスミドpPEZ-R2およびR4（pPFZ-R）の構成
を示すpPFZ-R2およびR4の各々に共通の制限地図を含む
概略図である。図中矢印はtrpプロモーター配列からプ
ロキモシン（プロレンニン）遺伝子（太い断片として表
わした）へと発現する方向を示している。合成挿入物は
空白の箱状の形で表わした。 第２図は、プラスミドptrpLI-R2およびR4の構成のため
の手順を示す概略図である。 第３図はプラスミドptrpLI-R2-B48及びptrpLI-R4-B48の
構成のための手順を示す概略図である。 第４図はプラスミドpPFZ-R2およびpPFZ-R4の各々につい
てのプロキモシン（プロレンニン）遺伝子のリボゾーム
の結合部位と開始コドン（ATG）との間のヌクレオチド
配列と間隔を示す概略図である。 第５−１および５−２図は、全長のbGH遺伝子及び発現
配列を含むプラスミドの構成のための手順を示す概略図
である。プラスミドpBGH-102はpBR322のアンピシリン耐
性遺伝子にクローンされたbGHcDNA配列（黒く塗つた箱
形）を含む。bGHの新しいアミノ末端をコードしている
合成DNAをpBR322（点線の箱形）のEcoR I部位とHind II
I部位に挿入した。矢印は配列解読の５′→３′方向、
すなわち転写の方向を示す。 第６−１および６−２図はbGH産生のための細菌の発現
プラスミドの構成を示す概略図である。プラスミドpBGH
-212-Rはtrpプロモーター配列（第５図参照）によつて
成熟bGHを完全に直接発現させる遺伝子を担持してい
る。これらのプラスミドはHind IIIによつて開裂され、
Pvu IIによつて部分的に切断され、２つの約920bp Hind
III-Pvu II断片を単離した。bGHのＣ−末端をコードす
る合成DNA断片がpBR322（空白の箱形）のEcoR I部位お
よびHind III部位に挿入れた。矢印はtrpプロモーター
配列からの転写の方向及び配列解読における５′→３′
の方向を示している。 第７−１および７−２図はpGH遺伝子と発現配列の全長
を有するプラスミドを構成する手順を示す概略図であ
る。プラスミドpGH-24はpBR322のアンピシリン耐性遺伝
子の中にクローンされたpGHcDNA配列（黒く塗つた箱
形）を有する。pGHの新しいアミノ末端をコードしてい
る合成DNAはpBR322（点線の箱形）のEcoR I部位とHind
III部位に挿入された。矢印は配列解読の５′→３′の
方向、すなわち転写の方向を示す。
を示すpPFZ-R2およびR4の各々に共通の制限地図を含む
概略図である。図中矢印はtrpプロモーター配列からプ
ロキモシン（プロレンニン）遺伝子（太い断片として表
わした）へと発現する方向を示している。合成挿入物は
空白の箱状の形で表わした。 第２図は、プラスミドptrpLI-R2およびR4の構成のため
の手順を示す概略図である。 第３図はプラスミドptrpLI-R2-B48及びptrpLI-R4-B48の
構成のための手順を示す概略図である。 第４図はプラスミドpPFZ-R2およびpPFZ-R4の各々につい
てのプロキモシン（プロレンニン）遺伝子のリボゾーム
の結合部位と開始コドン（ATG）との間のヌクレオチド
配列と間隔を示す概略図である。 第５−１および５−２図は、全長のbGH遺伝子及び発現
配列を含むプラスミドの構成のための手順を示す概略図
である。プラスミドpBGH-102はpBR322のアンピシリン耐
性遺伝子にクローンされたbGHcDNA配列（黒く塗つた箱
形）を含む。bGHの新しいアミノ末端をコードしている
合成DNAをpBR322（点線の箱形）のEcoR I部位とHind II
I部位に挿入した。矢印は配列解読の５′→３′方向、
すなわち転写の方向を示す。 第６−１および６−２図はbGH産生のための細菌の発現
プラスミドの構成を示す概略図である。プラスミドpBGH
-212-Rはtrpプロモーター配列（第５図参照）によつて
成熟bGHを完全に直接発現させる遺伝子を担持してい
る。これらのプラスミドはHind IIIによつて開裂され、
Pvu IIによつて部分的に切断され、２つの約920bp Hind
III-Pvu II断片を単離した。bGHのＣ−末端をコードす
る合成DNA断片がpBR322（空白の箱形）のEcoR I部位お
よびHind III部位に挿入れた。矢印はtrpプロモーター
配列からの転写の方向及び配列解読における５′→３′
の方向を示している。 第７−１および７−２図はpGH遺伝子と発現配列の全長
を有するプラスミドを構成する手順を示す概略図であ
る。プラスミドpGH-24はpBR322のアンピシリン耐性遺伝
子の中にクローンされたpGHcDNA配列（黒く塗つた箱
形）を有する。pGHの新しいアミノ末端をコードしてい
る合成DNAはpBR322（点線の箱形）のEcoR I部位とHind
III部位に挿入された。矢印は配列解読の５′→３′の
方向、すなわち転写の方向を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭56−166200（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−63390（ＪＰ，Ａ) 実開 昭58−9687（ＪＰ，Ｕ) 実開 昭58−189197（ＪＰ，Ｕ)
Claims (17)
- 【請求項１】ヌクレオチド配列TAAAAAGGAGAATTC ATG
（ここでATGは翻訳開始コドンである）またはTAAAAAGGG
TATCGAGAATTC ATG（ここでATGは翻訳開始コドンであ
る）を含む大腸菌（E.coli）の発現プラスミド。 - 【請求項２】レプリコン、選択できるマーカー、および
外来蛋白質をコードしている遺伝子に合成リンカーによ
って結合している大腸菌（E.coli）trpプロモーターか
らなり、発現されるべき遺伝子のリボゾーム結合部位に
TAAAAAGGAGAATTC ATGまたはTAAAAAGGGTATCGAGAATTC ATG
であるヌクレオチド配列を有する特許請求の範囲第１項
のプラスミド。 - 【請求項３】発現されるべき遺伝子のリボゾーム結合部
位とATG開始コドンとの間に5bpの間隔があり、該5bpは
ヌクレオチド配列−AATTC−である特許請求の範囲第２
項記載の発現プラスミド。 - 【請求項４】発現されるべき遺伝子のリボゾーム結合部
位とATG開始コドンとの間に11bpの間隔があり、該11bp
はヌクレオチド配列−ATCGAGAATTC−である特許請求の
範囲第２項記載の発現プラスミド。 - 【請求項５】外来蛋白質をコードしている遺伝子がプロ
レンニン遺伝子または哺乳類成長ホルモン遺伝子である
特許請求の範囲第３または第４項の細菌の発現プラスミ
ド。 - 【請求項６】哺乳類成長ホルモン遺伝子がウシ成長ホル
モン遺伝子、ブタ成長ホルモン遺伝子またはヒト上皮成
長因子遺伝子である特許請求の範囲第４項の細菌の発現
プラスミド。 - 【請求項７】大腸菌（E.coli）において外来蛋白質を産
生するための発現プラスミドであって、 （ｉ）大腸菌（E.coli）trpプロモーター； （ii）要素（iv）の翻訳のためのリボゾーム結合部位を
コード化しているヌクレオチド； （iii）要素（iv）の翻訳のための翻訳開始信号をコー
ド化しているヌクレオチド； （iv）上記外来蛋白質のアミノ酸配列をコード化してい
る構造遺伝子； からなり、 （ｖ）リボゾーム結合部位と翻訳開始信号との間のヌク
レオチド配列が（ａ）AATTCまたは（ｂ）ATCGAGAATTCで
あるプラスミド。 - 【請求項８】外来蛋白質DNA配列の構造遺伝子と同じ読
み取り枠に翻訳停止コドンを有し、該コドンはシン−ダ
ルガルノ（Shine-Dalgarno）配列の前にある特許請求の
範囲第７項の発現プラスミド。 - 【請求項９】合致するシン−ダルガルノ配列TAAGGA-GGT
と相補性を有する６個の連続ヌクレオチドからなる特許
請求の範囲第７または８項の発現プラスミド。 - 【請求項１０】第１図および第４図における制限エンド
ヌクレアーゼ地図によって示されるプラスミドpPFZ-R2
およびpPFZ-R4である特許請求の範囲第５項の発現プラ
スミド。 - 【請求項１１】プラスミドptrpL I-R2である特許請求の
範囲第３項の発現プラスミド。 - 【請求項１２】プラスミドpBGH-301である特許請求の範
囲第６項の発現プラスミド。 - 【請求項１３】プラスミドpGH-107である特許請求の範
囲第６項の発現プラスミド。 - 【請求項１４】プラスミドEGF-R2である特許請求の範囲
第６項の発現プラスミド。 - 【請求項１５】ヌクレオチド配列TAAAAAGGAGAATTC ATG
（ここでATGは翻訳開始コドンである）またはTAAAAAGGG
TATCGAGAATTC ATG（ここでATGは翻訳開始コドンであ
る）を含む大腸菌（E.coli）の発現プラスミドを有する
大腸菌（E.coli）。 - 【請求項１６】pPFZ-R2を有しATCC39544の識別特性を有
する大腸菌（E.coli）HB101である特許請求の範囲第15
項の大腸菌。 - 【請求項１７】pPFZ-R4を有するATCC39543の識別特性を
有する大腸菌（E.coli）HB101である特許請求の範囲第1
5項の大腸菌。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US56496283A | 1983-12-23 | 1983-12-23 | |
| US564962 | 1983-12-23 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1166479A Division JPH0630612B2 (ja) | 1983-12-23 | 1989-06-28 | 蛋白質の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60227682A JPS60227682A (ja) | 1985-11-12 |
| JP2532365B2 true JP2532365B2 (ja) | 1996-09-11 |
Family
ID=24256628
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59272726A Expired - Lifetime JP2532365B2 (ja) | 1983-12-23 | 1984-12-24 | 細菌の外来蛋白質の改良された生産のための発現プラスミド |
| JP1166479A Expired - Lifetime JPH0630612B2 (ja) | 1983-12-23 | 1989-06-28 | 蛋白質の製造方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1166479A Expired - Lifetime JPH0630612B2 (ja) | 1983-12-23 | 1989-06-28 | 蛋白質の製造方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0147178B1 (ja) |
| JP (2) | JP2532365B2 (ja) |
| AT (1) | ATE66251T1 (ja) |
| BR (1) | BR8406680A (ja) |
| CA (1) | CA1340867C (ja) |
| DE (1) | DE3484926D1 (ja) |
| DK (1) | DK173028B1 (ja) |
| IE (1) | IE57651B1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US4743679A (en) * | 1986-02-24 | 1988-05-10 | Creative Biomolecules, Inc. | Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof |
| GB8701848D0 (en) * | 1987-01-28 | 1987-03-04 | Celltech Ltd | Polypeptides |
| US5222978A (en) | 1987-08-26 | 1993-06-29 | United States Surgical Corporation | Packaged synthetic absorbable surgical elements |
| US5366081A (en) | 1987-08-26 | 1994-11-22 | United States Surgical Corporation | Packaged synthetic absorbable surgical elements |
| US5472702A (en) * | 1987-08-26 | 1995-12-05 | United States Surgical Corporation | Sterilization of growth factors |
| DE68915841T2 (de) * | 1988-03-30 | 1995-02-02 | Hitachi Chemical Co Ltd | Verfahren zur Herstellung von Epidermal-Wachstumsfaktor durch genetische Transformation. |
| US5359831A (en) | 1989-08-01 | 1994-11-01 | United States Surgical Corporation | Molded suture retainer |
| CA2059245C (en) * | 1991-02-08 | 2004-07-06 | Michael P. Chesterfield | Method and apparatus for calendering and coating/filling sutures |
| JP3550440B2 (ja) * | 1995-04-13 | 2004-08-04 | イーストマン・コダックジャパン株式会社 | オートホワイトバランス調整装置 |
| US5904716A (en) * | 1995-04-26 | 1999-05-18 | Gendler; El | Method for reconstituting cartilage tissue using demineralized bone and product thereof |
| US20090192554A1 (en) | 2008-01-29 | 2009-07-30 | Confluent Surgical, Inc. | Bioabsorbable block copolymer |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1200773A (en) * | 1980-02-29 | 1986-02-18 | William J. Rutter | Expression linkers |
| IE52755B1 (en) * | 1980-08-26 | 1988-02-17 | Univ California | Bovine pre-growth and growth hormone |
| DK489481A (da) * | 1980-11-10 | 1982-05-11 | Searle & Co | Plasmidvektor og frmgangsmaade til fremstilling deraf |
| DE3175357D1 (en) * | 1980-12-12 | 1986-10-23 | Unilever Nv | Dna sequences encoding various allelic forms of mature thaumatin, recombinant plasmids comprising said dna's and a process for their preparation, bacterial cultures comprising said recombinant plasmids, and method for producing mature thaumatin |
| JPS589687A (ja) * | 1981-06-17 | 1983-01-20 | セルテク リミテッド | ポリペプチドの生産方法 |
| IE53517B1 (en) * | 1981-06-17 | 1988-12-07 | Celltech Ltd | Process for the production of a polypeptide |
| NZ201918A (en) * | 1981-09-18 | 1987-04-30 | Genentech Inc | N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone |
| BR8205954A (pt) * | 1981-10-14 | 1983-09-13 | Unilever Nv | Sequencia de dna,plasmidio recombinante,cultura bacteriana e microorganismos |
| JPS58189197A (ja) * | 1982-03-24 | 1983-11-04 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規ｄｎａおよびその用途 |
| IL68100A0 (en) * | 1982-03-24 | 1983-06-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Novel dna and use thereof |
| WO1983004030A1 (en) * | 1982-05-06 | 1983-11-24 | Applied Molecular Genetics, Inc. | The manufacture and expression of genes for urogastrone and polypeptide analogs thereof |
| US4582800A (en) * | 1982-07-12 | 1986-04-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Novel vectors and method for controlling interferon expression |
| EP0121569B1 (en) * | 1982-10-08 | 1990-08-22 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Novel vector |
| IE56372B1 (en) * | 1982-12-22 | 1991-07-03 | Genentech Inc | Microbially produced rennet methods for its production and plasmids used for its production |
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