JP2024045241A - 二重特異性結合タンパク質およびその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】二重特異性結合タンパク質およびその使用方法を提供する。
【解決手段】第１のエピトープに結合する第１の結合ドメイン（ＢＤ１）と、第２のエピトープに結合する第２の結合ドメイン（ＢＤ２）と、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むＦｃ領域とを含むタンパク質であって、Ｆｃ領域は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはＣＨ２およびＣＨ３ドメインの境界面における溶媒曝露ループにＢＤ２を含み、前記タンパク質は、第１および第２のエピトープの各々に結合するために二価である、タンパク質を提供する。本開示は、標的タンパク質に結合する、抗体などの特異性結合タンパク質も提供する。本開示は、対象において免疫応答を誘導する方法、ならびにタンパク質、核酸分子および／または組成物を対象に投与することにより、対象において癌を治療または予防する方法も提供する。
【選択図】図１－１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年５月６日に提出された米国仮特許出願第６２／３３２，７８８号明細書に対する優先権およびその利益を主張し、その開示内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。

配列表
本出願は、電子フォーマットの配列表と一緒に提供されている。この配列表は、２０１７年５月２日に作成され、サイズが２４４ｋｂである「ＩＯＢＳ＿１００＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のファイルとして提供される。配列表の電子フォーマット内の情報は、その全体が参照により本明細書に援用される。

技術分野
本発明は、二重特異性結合タンパク質およびその使用に関する。

癌は、依然として主要な健康上の世界的負担である。癌の治療の進歩にもかかわらず、特に既存の治療薬に対して耐性の進行性疾患または癌を有する患者にとってより有効でありかつ毒性の低い治療法に対する満たされていない必要性が引き続き存在する。

腫瘍制御における免疫系、特にＴ細胞媒介性細胞傷害の役割は、十分に認識されている。Ｔ細胞が疾患の早期および後期段階の両方で癌患者の腫瘍増殖および癌患者の生存を制御するというエビデンスが一層増えている。しかしながら、癌患者において腫瘍特異的Ｔ細胞応答を高め、持続させることは困難である。癌に対する先天性免疫応答を刺激または増強する癌免疫療法薬の継続的な進歩および成功は、こうした治療薬を、非特異的化学療法薬および／または放射線を使用する治療法と比較して魅力的な治療の選択肢にしている。

癌に対する癌免疫（ＩＯ）療法薬としてのそれらの潜在的有用性のために、いくつかの分子標的が同定されている。癌免疫療法の分野におけるそれらの治療薬の可能性について研究されているいくつかの分子標的として、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４またはＣＤ１５２）、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１またはＢ７－Ｈ１またはＣＤ２７４）、プログラム死－１（ＰＤ－１）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４またはＴＮＦＲＳＦ４）ならびにＴ細胞阻害性受容体Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチン－ドメイン含有３（ＴＩＭ３）が挙げられる。これらの標的の一部は、治療に利用することに成功している（たとえば、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４）が、多くの患者は、開発された治療薬に対して不応答性である。また、より高い用量および／または免疫療法薬の併用を含む治療レジメンを検討することもできるが、そうした治療法は、副作用の危険性の増大を伴う恐れがあり、これは、より高い用量および蓄積曝露と共に増大する傾向があり、併用免疫療法と一緒に使用すると相加的になると思われる。いくつかの一般的な副作用として、下垂体炎、甲状腺炎、副腎機能不全、腸炎、皮膚炎、肺臓炎、肝炎、膵炎、運動感覚性ニューロパチー、および関節炎が挙げられる。さらに、免疫療法薬は、典型的に高いコストを伴うため、免疫療法薬の併用を含む治療法は、患者にとって法外な費用となり得る。

従って、ＩＯ治療薬の候補標的を同定し、既存の標的に対する新規の治療薬を開発し、現在使用中の免疫療法薬の欠点（患者応答性の欠如および併用治療に伴う副作用のリスク増大など）を回避する治療戦略を開発することが依然として求められている。標的分子の組み合わせに対して二重特異性を有するＩＯ治療薬（たとえば、結合タンパク質）、特に個別の単一特異性結合タンパク質の組み合わせに対する結合親和性と比較したときに標的分子に対する優れた結合親和性を呈示するものは、治療的有効性について特に望ましい分子のクラスを提供する。

本発明は、２つのエピトープ（たとえば、第１および第２のエピトープ）に結合し、かつ第１および第２のエピトープの各々に結合するために二価である二重特異性分子またはタンパク質を提供する。本発明は、対象において免疫応答を誘導する方法、ならびにタンパク質、核酸分子および／または組成物を対象に投与することにより、対象（たとえば、ヒト対象）において癌を治療または予防する方法も提供する。

一態様では、本発明は、第１のエピトープに結合する第１の結合ドメイン（ＢＤ１）と、第２のエピトープに結合する第２の結合ドメイン（ＢＤ２）と、Ｃ_Ｈ２ドメインおよびＣ_Ｈ３ドメインを有するＦｃ領域とを含むタンパク質であって、Ｆｃ領域は、Ｃ_Ｈ２ドメイン、Ｃ_Ｈ３ドメイン、またはＣ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメインの境界面における溶媒曝露ループにＢＤ２を含み、タンパク質は、第１および第２のエピトープの各々に結合するために二価である、タンパク質を提供する。

別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの態様に従うタンパク質または抗体と、薬学的に許容されるキャリアを含有する組成物を提供する。

別の態様では、本発明は、対象において癌を治療または予防する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるいずれかの態様に従うタンパク質または抗体を対象（たとえば、ヒト対象）に投与するステップを含む。様々な実施形態では、癌は、卵巣癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、膀胱癌、頭部および頚部癌、黒色腫、膵臓癌、腎細胞癌、ならびに肺癌の１つまたは複数である。

別の態様では、本発明は、対象において免疫応答を誘導する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるいずれかの態様に従うタンパク質または抗体を対象（たとえば、ヒト対象）に投与するステップを含む。

別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの態様に従うタンパク質または抗体をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子を提供する。

別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの態様に従う核酸分子を含有するベクターを提供する。

別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの態様に従うベクターを含有する宿主細胞を提供する。

一態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有する第１のペプチドおよび配列番号２のアミノ酸配列を有する第２のペプチドを有するＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４に結合する二重特異性結合タンパク質を提供する。

別の態様では、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列を有する第１のペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列を有する第２のペプチドを有するＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４に結合する二重特異性結合タンパク質を提供する。

別の態様では、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列を有する第１のペプチドおよび配列番号６のアミノ酸配列を有する第２のペプチドを有するＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４に結合する二重特異性結合タンパク質を提供する。

一態様では、本発明は、配列番号９のアミノ酸配列を有する第１の重鎖、配列番号７のアミノ酸配列を有する第１の軽鎖、配列番号１２のアミノ酸配列を有する第２の重鎖、および配列番号４のアミノ酸配列を有する第２の軽鎖を有するＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４に結合する二重特異性結合タンパク質を提供する。

一態様では、本発明は、配列番号１４のアミノ酸配列を有する第１のペプチドおよび配列番号１５のアミノ酸配列を有する第２のペプチドを有するＰＤ－Ｌ１およびＣＴＬＡ－４に結合する二重特異性結合タンパク質を提供する。

別の態様では、本発明は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する第１のペプチドおよび配列番号１７のアミノ酸配列を有する第２のペプチドを有するＰＤ－Ｌ１およびＣＴＬＡ－４に結合する二重特異性結合タンパク質を提供する。

別の態様では、本発明は、配列番号１８のアミノ酸配列を有する第１のペプチドおよび配列番号１９のアミノ酸配列を有する第２のペプチドを有するＰＤ－Ｌ１およびＣＴＬＡ－４に結合する二重特異性結合タンパク質を提供する。

一態様では、本発明は、配列番号２２のアミノ酸配列を有する第１のペプチドおよび配列番号２３のアミノ酸配列を有する第２のペプチドを有するＰＤ－１およびＴＩＭ３に結合する二重特異性結合タンパク質を提供する。

別の態様では、本発明は、配列番号２４または配列番号９１のアミノ酸配列を有する第１のペプチドおよび配列番号２３または配列番号９２のアミノ酸配列を有する第２のペプチドを有するＰＤ－１およびＴＩＭ３に結合する二重特異性結合タンパク質を提供する。

一態様では、本発明は、配列番号９のアミノ酸配列を有する第１の重鎖、配列番号７のアミノ酸配列を有する第１の軽鎖、配列番号２７または配列番号３０のアミノ酸配列を有する第２の重鎖、および配列番号２６または配列番号２８のアミノ酸配列を有する第２の軽鎖を有するＰＤ－１およびＴＩＭ３に結合する二重特異性結合タンパク質を提供する。

一態様では、本発明は、配列番号３４のアミノ酸配列を有する第１のペプチドおよび配列番号３２のアミノ酸配列を有する第２のペプチドを有するＯＸ４０およびＰＤ－Ｌ１に結合する二重特異性結合タンパク質を提供する。

別の態様では、本発明は、配列番号３５のアミノ酸配列を有する第１のペプチドおよび配列番号３２のアミノ酸配列を有する第２のペプチドを有するＯＸ４０およびＰＤ－Ｌ１に結合する二重特異性結合タンパク質を提供する。

別の態様では、本発明は、配列番号３６または配列番号９４のアミノ酸配列を有する第１のペプチドおよび配列番号３２または配列番号９３のアミノ酸配列を有する第２のペプチドを有するＯＸ４０およびＰＤ－Ｌ１に結合する二重特異性結合タンパク質を提供する。

別の態様では、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有する重鎖ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有する軽鎖を有するＴＩＭ３に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、重鎖ＣＤＲ１は、配列番号８８を含み、重鎖ＣＤＲ２は、配列番号８０を含み、重鎖ＣＤＲ３は、配列番号８１を含み、および軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号８２を含み、軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号８３を含み、軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号８４を含む。

他の態様では、本発明は、二重特異性結合タンパク質および薬学的に許容されるキャリアを有する組成物、二重特異性結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子、二重特異性結合タンパク質を投与することにより、対象において癌を治療または予防する方法、および二重特異性結合タンパク質を投与することにより、対象において免疫応答を増強する方法を提供する。

本明細書に記載されるいずれかの態様の様々な実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｃ_Ｈ２ドメイン、Ｃ_Ｈ３ドメイン、またはＣ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメインの境界面におけるアミノ酸配列中の溶媒曝露ループにＢＤ２を含む。

本明細書に記載されるいずれかの態様の様々な実施形態では、溶媒曝露ループは、Ｃ_Ｈ２ドメイン由来のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、溶媒曝露ループは、アミノ酸配列ＩＳＲＴＰ（配列番号３９）を含む。

本明細書に記載されるいずれかの態様の様々な実施形態では、溶媒曝露ループは、Ｃ_Ｈ３ドメイン由来のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、溶媒曝露ループは、アミノ酸配列ＳＮＧを含む。

本明細書に記載されるいずれかの態様の様々な実施形態では、溶媒曝露ループは、Ｃ_Ｈ２ドメインおよびＣ_Ｈ３ドメインの境界面由来のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、溶媒曝露ループは、アミノ酸配列ＡＫＧＱＰ（配列番号４０）を含む、請求項７に記載のタンパク質である。

本明細書に記載されるいずれかの態様の様々な実施形態では、ＢＤ２は、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であるか、またはそれを含む。

本明細書に記載されるいずれかの態様の様々な実施形態では、ＢＤ１は、Ｆａｂドメイン、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、および抗体可変ドメインの１つまたは複数である結合ドメインであるか、またはそれを含む。特定の実施形態では、ＢＤ１は、Ｆａｂドメインを含む。

本明細書に記載されるいずれかの態様の様々な実施形態では、Ｆａｂドメインは、抗体ヒンジ領域を介してＦｃ領域に連結されている。ある実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ由来のＦｃ領域の１つまたは複数であるドメインであるか、またはそれを含む。特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、変異型Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、非グリコシル化、脱グリコシル化、および／もしくは非フコシル化されているか、または低フコシル化を有する。

本明細書に記載されるいずれかの態様の様々な実施形態では、タンパク質は、ＢＤ２とＦｃ領域との間にタンパク質リンカーＬ１をさらに含む。本明細書に記載されるいずれかの態様の様々な実施形態では、タンパク質は、ＢＤ２とＦｃ領域との間に第１のタンパク質リンカーＬ１および第２のタンパク質リンカーＬ２をさらに含む。本明細書に記載されるいずれかの態様の様々な実施形態では、ＢＤ２は、タンパク質リンカーＬ１を介してＦｃ領域と結合される。本明細書に記載されるいずれかの態様の様々な実施形態では、ＢＤ２は、２つのタンパク質リンカーＬ１およびＬ２を介してＦｃ領域と結合される。ある実施形態では、Ｌ１およびＬ２は、（Ｇ_４Ｓ）_２（配列番号４１）、（Ｇ_４Ｓ）_３（配列番号４２）、および（Ｇ_４Ｓ）_４（配列番号４３）から独立に選択される。

本明細書に記載されるいずれかの態様の様々な実施形態では、タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に下記のポリペプチドドメイン：Ｖ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２（Ｎ末端）－ＢＤ２－Ｃ_Ｈ２（Ｃ末端）－Ｃ_Ｈ３を有するキメラ重鎖を含み、およびＢＤ１は、Ｆａｂドメインを含み、Ｖ_Ｈ１は、Ｆａｂドメインの重鎖可変ドメインを含み、およびＣ_Ｈ１は、Ｆａｂの重鎖定常ドメイン１を含む。

本明細書に記載されるいずれかの態様の様々な実施形態では、タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に下記のポリペプチドドメイン：Ｖ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－ＢＤ２－Ｃ_Ｈ３を有するキメラ重鎖を含み、およびＢＤ１は、Ｆａｂドメインを含み、Ｖ_Ｈ１は、Ｆａｂドメインの重鎖可変ドメインを含み、およびＣ_Ｈ１は、Ｆａｂの重鎖定常ドメイン１を含む。

本明細書に記載されるいずれかの態様の様々な実施形態では、タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に下記のポリペプチドドメイン：Ｖ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３（Ｎ末端）－ＢＤ２－Ｃ_Ｈ３（Ｃ末端）を有するキメラ重鎖を含み、およびＢＤ１は、Ｆａｂドメインを含み、Ｖ_Ｈ１は、Ｆａｂドメインの重鎖可変ドメインを含み、およびＣ_Ｈ１は、Ｆａｂの重鎖定常ドメイン１を含む。

本明細書に記載されるいずれかの態様の様々な実施形態では、ＢＤ２は、ｓｃＦｖであるか、またはそれを含む。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_Ｈ２－ポリペプチドリンカー－Ｖ_Ｌ２またはＶ_Ｌ２ポリペプチドリンカー－Ｖ_Ｈ２を含み、Ｖ_Ｈ２は、ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインを含み、およびＶ_Ｌ２は、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインを含む。

本明細書に記載されるいずれかの態様の様々な実施形態では、タンパク質は、ＢＤ２とＦｃ領域との間にタンパク質リンカーＬ１をさらに含む。本明細書に記載されるいずれかの態様の様々な実施形態では、タンパク質は、ＢＤ２とＦｃ領域との間に第１のタンパク質リンカーＬ１および第２のタンパク質リンカーＬ２をさらに含む。

本明細書に記載されるいずれかの態様の様々な実施形態では、ＢＤ２は、リンカー（Ｌ１）を介してＦｃ領域のＣ_Ｈ２ドメイン、Ｃ_Ｈ２ドメイン、またはＣ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメインの境界面に結合される。

本明細書に記載されるいずれかの態様の様々な実施形態では、ＢＤ２は、２つのタンパク質リンカーＬ１およびＬ２を介してＦｃ領域のＣ_Ｈ２ドメイン、Ｃ_Ｈ３ドメイン、またはＣ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメインの境界面に結合される。様々な実施形態では、Ｌ１およびＬ２は、１～２５アミノ酸長を有するタンパク質リンカーから独立に選択される。特定の実施形態では、Ｌ１およびＬ２は、（Ｇ_４Ｓ）_２（配列番号４１）、（Ｇ_４Ｓ）_３（配列番号４２）、および（Ｇ_４Ｓ）_４（配列番号４３）から独立に選択される。

本明細書に記載されるいずれかの態様の様々な実施形態では、第１および第２のエピトープは異なる。本明細書に記載されるいずれかの態様の様々な実施形態では、第１および第２のエピトープは同じである。

本開示の説明において、本開示の特定の態様が図に示されている。しかしながら、本開示は、図に示した態様の正確な配置および手段に限定されるものではない。

本明細書に記載するいくつかの例示的なタンパク質の一般的な概略図を示す。ＣＨ２およびＣＨ３領域は、ＰｙＭＯＬを用いて図１Ａ～１Ｃに示され、球体としての溶媒曝露表面ループ領域を明らかにする。図１Ａは、ＣＨ２領域内のループを描き；図１Ｂは、ＣＨ２－ＣＨ３境界面内のループを描き；図１Ｃは、ＣＨ３領域内のループを描く。例示的なコンストラクトを図１Ｄ～１Ｆに図示するが、これらは、それぞれＦａｂおよびｓｃＦｖドメインとして代表的なＢＤ１およびＢＤ２ドメインを含む。図１Ｄは、ヒンジ領域で結合したＢＤ１と、ＣＨ２領域内の溶媒曝露ループで結合したＢＤ２とを描く。図１Ｅは、ヒンジ領域で結合したＢＤ１と、ＣＨ２－ＣＨ３境界面内の溶媒曝露ループで結合したＢＤ２とを描く。図１Ｆは、ヒンジ領域で結合したＢＤ１と、ＣＨ３領域内の溶媒曝露ループで結合したＢＤ２とを描く。 図１－１の続きである。 本明細書に記載するように、ＣＨ２、ＣＨ２－ＣＨ３境界面、およびＣＨ３における溶媒接触可能ループ配列の拡大図を提供する。ＢＤ２（ｓｃＦｖ）を組み込むコンストラクトの例が図２Ａ～２Ｃの各々に含まれる。図２Ａは、ＣＨ２－ＣＨ３境界面上流のＣＨ２ループ内で同定された代表的なループ配列ＩＳＲＴＰ（配列番号３９）を図示する。図２Ｂは、ＣＨ２－ＣＨ３境界面内の代表的なループ配列ＡＫＧＱＰ（配列番号４０）を図示する。図２Ｃは、ＣＨ２－ＣＨ３境界面下流のＣＨ３領域内の代表的なループ配列ＳＮＧを図示する。 図２－１の続きである。 図２－２の続きである。 ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４を標的とするＢｉＳ２、ＢｉＳ３、およびＢｉＳ５コンストラクトの同時結合を実証する。トレースＡ９は、ＢｉＳ２ ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４を示し、トレースＢ９は、ＢｉＳ３ ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４を示し、トレースＣ９は、ＢｉＳ５ ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４を示す。 ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４遮断のために提案される機構の概略図を示す。 ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４を標的とするＤｕｅｔＭａｂコンストラクトの同時結合を実証するｏｃｔｅｔ結合アッセイの結果を示す。 リポータ遺伝子アッセイにおいてＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４経路を阻害するＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重特異性結合タンパク質を示す。図６Ａは、ＰＤ－１遮断によるＴ細胞活性化を描く。図６Ｂは、ＣＴＬＡ－４遮断によるＴ細胞活性化を描く。図６Ｃは、ＰＤ－１リポータアッセイの結果を示す。図６Ｄは、ＣＴＬＡ－４リポータアッセイの結果を示す。 図６－１の続きである。 ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂおよびＢｉＳ５Ａｂがブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）アッセイにおいて同等の活性を有することを証明するＳＥＢアッセイの結果を示す。 ＳＥＢアッセイにおいて、アイソタイプおよび親ｍＡｂ対照と比較したＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂの活性を示す。 ＳＥＢアッセイにおいて、ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂと比較したＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＢｉＳ５Ａｂの活性を示す。 混合白血球反応アッセイ（ＭＬＲ）において、ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂおよびＢｉＳ５Ａｂが同等の活性を有することを示す。図１０Ａは、アッセイ（ｎ＝４ドナー；２回の独立した実験）の概略図である。 図１０－１の続きである。 ＭＬＲアッセイにおいて、アイソタイプ対照と比較したＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂの活性を示す（ｎ＝２ドナー；１回の実験）。 図１１－１の続きである。 ＭＬＲアッセイにおいて、親ｍＡｂ対照と比較したＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂの活性を示す（ｎ＝２ドナー；１回の実験）。 図１２－１の続きである。 ＭＬＲアッセイにおいて、競合抗体と比較したＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂの活性を示す（ｎ＝２ドナー；１回の実験）。 図１３－１の続きである。 カニクイザルにおける単回用量薬物動態／薬理学（ＰＫ／ＰＤ）試験の試験設計を示す。 ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂがカニクイザルにおいて明確な薬理作用（ＰＤ）を示すことを証明する。 ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂ（ＭＥＤＩ５７５２）およびＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＢｉＳ５Ａｂ（ＭＥＤＩ８５００）を投与されたカニクイザルにおけるＴ細胞依存性抗体応答（ＴＤＡＲ）を示す。 安定したＣＨＯ細胞が多様なレベルのヒトＰＤ－１および／またはＣＴＬＡ－４を発現するＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重特異性分子を試験するためのモデル系を示す。 ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂが同じ細胞の表面上でＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４と同時に結合することを証明する。 過剰ＰＤ－１を発現する細胞上において、ＣＴＬＡ－４の飽和状態で、抗ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４抗体の組み合わせに対して協同的結合が差異を示すか否かを決定するための実験を示す。 ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４親モノクローナル抗体が、非標的受容体に対して測定可能な作用を及ぼすことなく、それらの標的受容体に結合してそれを占有することを証明する。 ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂが、モノクローナル抗体の組み合わせと比較して約２５０倍低い濃度において、過剰ＰＤ－１を発現するＣＨＯ細胞上のＣＴＬＡ－４を飽和させることを証明する。 ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂが、ＣＴＬＡ－４のみを発現する細胞と比較して約５００倍低い濃度において、過剰ＰＤ－１を発現するＣＨＯ細胞上のＣＴＬＡ－４を飽和させることを証明する。 ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂが、優先的に同じ細胞の表面上のＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４とシス結合することを証明する。図２３ＢのＴｒｅｍｅは、ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂである。 図２３－１の続きである。 培養Ｔ細胞に対するＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂおよび親モノクローナル抗体の結合および内在化を示す。ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂは、トレメリムマブの内在化特性を有する。 図２５Ａ：内在化アッセイの概略を示す。図２５Ｂ：ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂが、１０倍の過剰ＰＤ－１を発現する安定したＣＨＯ細胞中のトレメリムマブの内在化特性を帯びていることを証明する。 ＰＤ－Ｌ１およびＣＴＬＡ－４を標的とするＢｉＳ２、ＢｉＳ３、およびＢｉＳ５コンストラクトの同時結合を明らかにする。トレースＡ１１は、ＢｉＳ２ ＰＤ－Ｌ１ ＣＴＬＡ－４を示し、トレースＢ１１は、ＢｉＳ３ ＰＤ－Ｌ１ ＣＴＬＡ－４を示し、トレースＣ１１は、ＢｉＳ５ ＰＤ－Ｌ１ ＣＴＬＡ－４を示す。 ＰＤ－１およびＴＩＭ３（クローン６２、野生型）を標的とするＢｉＳ３コンストラクトの同時結合を明らかにする。 ＰＤ－１およびＴＩＭ３（クローン６２、野生型）を標的とするＤｕｅｔＭａｂコンストラクトの同時結合を明らかにする。 細胞殺傷アッセイにおける単一特異性ＴＩＭ３および二重特異性ＰＤ－１＿ＴＩＭ３ＰＤ－１二重特異性コンストラクトの細胞殺傷活性の概要を提供する。図２８Ａは、１８時間時点の同時培養したウェルの明視野画像を示す。抗ＴＩＭ－３＋抗ＰＤ１またはＴＩＭ－３／ＰＤ－１二重特異性フォーマットの組み合わせは、接着細胞の減少およびＴ細胞のブラスティング）（凝集）の増大により評価される通り腫瘍細胞死を増強し、かつＴ細胞活性化を増大する。図２８Ｂは、黒色腫特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞との１８時間の同時培養後の腫瘍細胞による生体染色剤取り込みの評価を示す。図２８Ｃは、１８時間の同時培養後のＩＦＮγ分泌を示す。二重特異性コンストラクトは、概して、優れた殺傷活性を示し、ＤｕｅｔＭａｂフォーマットが最も堅固な殺傷活性を発揮する。 図２８－１の続きである。 クローン６２の親和性成熟変異体であるＴＩＭ３アーム配列を有するＰＤ－１／ＴＩＭ３ ＤｕｅｔＭａｂコンストラクトの同時結合を明らかにする。 ＢｉＳ３、ＢｉＳ５、およびＤｕｅｔＭａｂなどのＰＤ－１／ＴＩＭ３二重特異性抗体と、ヒトＴＩＭ３またはヒトＰＤ１を過剰発現するＣＨＯ細胞との結合を示す。ＰＤ－１およびＴＩＭ３発現データを差し込み図に示す。 活性化Ｔ細胞クローン（ＤＭＦ４）上でのＴＩＭ３およびＰＤ－１発現データを示す。 ＣＭＶ抗原リコールアッセイからの結果を示し、これは、ＢｉＳ３、ＢｉＳ５、およびＤｕｅｔＭａｂを含むＰＤ－１／ＴＩＭ３二重特異性抗体がアイソタイプ処置と比較して増強された活性を示すことを証明している（３ドナー（１処置当たり／１ドナー当たり１～２回の反復）、１実験）。 ＢｉＳ３、ＢｉＳ５、およびＤｕｅｔＭａｂを含むＰＤ－１／ＴＩＭ３二重特異性抗体が、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて８ｎＭを超える濃度でインターフェロン（ＩＦＮγ）を増強したことを証明する（処置／１ドナーペア／２回の独立した実験のうちの１回当たり２～４回の反復）。 ＢｉＳ３、ＢｉＳ５、およびＤｕｅｔＭａｂを含むＰＤ－１／ＴＩＭ３二重特異性抗体を用いたＰＤ－１リポータアッセイ（二重細胞系）の結果を示す。全ての二重特異性フォーマットが親ＬＯ１１５ＩｇＧ１と同様の活性を示す（１処置当たり３～５回の独立した実験の収集／３回の生物学的反復）。 ＢｉＳ２およびＢｉＳ３ ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子を用いたｏｃｔｅｔアッセイの結果を示す。 ＢｉＳ２およびＢｉＳ３ ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子を用いたＳＥＢアッセイの結果を示す。 図３６－１の続きである。 ＢｉＳ２およびＢｉＳ３ ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子を用いたＰＤ－Ｌ１リポータアッセイの結果を示す。 ＢｉＳ２およびＢｉＳ３ ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子を用いたＣＭＶ Ａｇリコールアッセイの結果を示す。 ＰＤ－Ｌ１およびＯＸ４０を標的とするＯＸ４０（ＳＬＲ）／ＰＤ－Ｌ１ ＢｉＳ５コンストラクトの同時結合を実証するｏｃｔｅｔ結合アッセイの結果を示す。 ＰＤ－Ｌ１およびＯＸ４０を標的とする二重特異性コンストラクトと、ヒトまたはカニクイザルＯＸ４０およびＰＤ－Ｌ１／Ｂ７Ｈ１を発現するＣＨＯ細胞との結合を示す。 図４０－１の続きである。 フローサイトメトリー（ＨｙｐｅｒＣｙｔ）により測定される、ＰＤ－Ｌ１およびＯＸ４０を標的とする二重特異性コンストラクトと、Ｊｕｒｋａｔ ＯＸ４０リポータ細胞、ＮＣＩ Ｈ３５８、ＣＨＯＫ１ Ｂ７Ｈ１（ＰＤ－Ｌ１）／ＯＫＴ３細胞、およびＨＥＫ ＣＤ３２ａ細胞との結合を示す。 ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子を用いたＰＤ－Ｌ１リポータアッセイの結果を示す。 ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子を用いた、ＨＥＫ ＣＤ３２ａ細胞におけるＯＸ４０リポータアッセイの結果を示す。 ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子を用いた、ＣＨＯＫ ＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞におけるＯＸ４０リポータアッセイの結果を示す。 ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子を用いた、腫瘍細胞についてのＰＤ－Ｌ１媒介性ＯＸ４０アゴニズムを示す。 ＯＸ４０／腫瘍細胞アッセイの対照において、ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子を用いたＮＣＩ Ｈ３５８ＰＤ－Ｌ１ ＫＯ細胞にアゴニズムが検出されなかったことを示す結果を示す。 ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子を用いたＳＥＢアッセイの結果を示す。 図４７－１の続きである。 図４８Ａ：ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子を試験するためのＴｒｅｇ抑制アッセイ実験の概略図を示す。図４８Ｂ－Ｃ：二重特異性分子の結合に基づくＴｒｅｇ抑制を示す。 図４８－１の続きである。 ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子を用いたＴｒｅｇ抑制アッセイの結果を示す。 ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子を用いたＴｒｅｇ抑制アッセイの結果を示す。 ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子を試験するための混合白血球反応（ＭＬＲ）アッセイ実験の設計を示す。 ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子を用いたＭＬＲアッセイの結果を示す。 図５２－１の続きである。 ＢｉＳ２およびＢｉＳ５ ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子が、ＰＤ－Ｌ１またはＯＸ４０発現ＣＨＯ細胞に対するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介することを証明する。 ＢｉＳ２およびＢｉＳ５ ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子が、ＰＤ－Ｌ１およびＯＸ４０発現ＣＨＯ細胞に対するＮＫ細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介することを証明する。 ＢｉＳ２およびＢｉＳ５ ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）において、ＰＤ－Ｌ１およびＯＸ４０発現ＣＨＯ細胞に対するＮＫ細胞のＣＤ１０７ａ動員を増大することを証明する。 ＢｉＳ２およびＢｉＳ５ ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子が、活性化同種異系Ｔ細胞に対するＮＫ細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介することを証明する。 ＢｉＳ５ ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）において、活性化同種異系Ｔ細胞に対する２つの異なるドナー由来のＮＫ細胞のＣＤ１０７ａ動員を増大することを証明する。 ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子のＰＫ／ＰＤを比較するための試験設計を示す。 カニクイザルにおけるＰＤ－Ｌ１／ＯＸ４０二重特異性分子の血清濃度－時間プロフィールの比較を示す。 ＰＤ－Ｌ１／ＯＸ４０二重特異性分子による血清中の可溶性ＰＤ－Ｌ１の枯渇を示す。 ＰＤ－Ｌ１／ＯＸ４０二重特異性分子の薬力学的データの概要を提供する。ベースラインは、投与前－５日および０日の平均として定義される。 図６１－１の続きである。 ＰＤ－１／ＯＸ４０ ＢｉＳ２ ＩｇＧ４Ｐモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の概略図を描く。 ＰＤ－１／ＯＸ４０ ＢｉＳ２ ｍＡｂの潜在的作用機構の概略図を描く。 ＰＤ１－ＨｉｓおよびヒトＯＸ４０－Ｆｃに対するＰＤ－１（ＬＯ１１５）／ＯＸ４０ ＢｉＳ２ ｍＡｂの２つの異なるロットの同時結合活性を描く。 図６５Ａ：ＯＸ４０リポータアッセイの概略図を描く。図６５Ｂ：ＰＤ１ ＬＯ１１５ｍＡｂ、ＯＸ４０ ｍＡｂ、対照ｍＡｂおよびＰＤ１（ＬＯ１１５）／ＯＸ４０ ＢｉＳ２ ｍＡｂを用いたＯＸ４０リポータアッセイの結果を示す。 図６６Ａ：ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１リポータアッセイの概略図を描く。図６６Ｂ：ＰＤ１ ＬＯ１１５ｍＡｂ、ＯＸ４０ ｍＡｂ、対照ｍＡｂおよびＰＤ１（ＬＯ１１５）／ＯＸ４０ ＢｉＳ２ ｍＡｂを用いたＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１リポータアッセイの結果を示す。 ＰＤ－１（ＬＯ１１５）／ＯＸ４０二重特異性分子のＢｉＳ２変異体および対照を用いたＳＥＢアッセイの結果を示す。 ＰＤ－１（ＬＯ１１５）／ＯＸ４０二重特異性分子のＢｉＳ２変異体および対照を用いたＣＭＶ抗原リコールアッセイの結果を示す。 ＰＤ－１（ＡＭＰ５１４）／ＯＸ４０二重特異性分子のＢｉＳ２およびＢｉＳ３変異体ならびに対照を用いたＣＭＶ抗原リコールアッセイの結果を示す。 カニクイザルにおける単回ＩＶ用量投与後のＰＤ１（ＬＯ１１５）／ＯＸ４０ ＢｉＳ２ｍＡｂの血清濃度－時間プロフィールを示す。データは、３匹の雄／群の平均±標準偏差を表す。ＬＬＯＱ（５ｎｇ／ｍＬを点線で示す。ＰＫＣ＝薬物動態曲線；ＬＬＯＱ＝定量下限。 カニクイザルにおけるＰＤ－１（ＬＯ１１５）／ＯＸ４０ ＢｉＳ２ｍＡｂの単回ＩＶ投与後のＫｉ６７陽性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋メモリＴ細胞の割合（％）を示す。データは、３匹の雄／群の平均±標準偏差を表す。左側パネルＡは、ＣＤ４＋メモリＴ細胞を示し、右側パネルは、ＣＤ８＋メモリＴ細胞を示す。ＩＶ＝静脈内。 カニクイザル血清中のＰＤ－１／ＯＸ４０定量の代表的な標準曲線を示す。 様々なｐＨ値において、異なるＢｉＳフォーマット（「ＢｉＳ４」）と比較した本明細書に開示の二重特異性結合タンパク質（「ＢｉＳ５」）の例示的なＤＳＣサーモグラムを提供する。図７３Ａは、ＢｉＳ４の熱安定性に対するｐＨ値の作用を示す。図７３Ｂは、ＢｉＳ５の熱安定性に対するｐＨ値の作用を示す。図７３Ｃは、Ｔ_{ｏｎｓｅｔ}、Ｔ_ｍ１、Ｔ_ｍ２、およびＴ_ｍ３を含む、ＢｉＳ４の代表的な曲線当てはめＤＳＣサーモグラムを描く。図７３Ｄは、Ｔ_{ｏｎｓｅｔ}、Ｔ_ｍ１、Ｔ_ｍ２、およびＴ_ｍ３を含む、ＢｉＳ５の代表的な曲線当てはめＤＳＣサーモグラムを描く。図７３Ｅは、ＢｉＳ４およびＢｉＳ５フォーマットについて、Ｔ_{ｏｎｓｅｔ}、Ｔ_ｍ１、Ｔ_ｍ２、およびＴ_ｍ３に対するｐＨの作用を表すプロットを描く。 図７３－１の続きである。 ４０℃で４週間の保存前および保存後のｐＨ７．５でのサンプルのＨＰ－ＳＥＣ分析を描く。図７４Ａは、熱ストレス前および熱ストレス後のＢｉＳ４およびＢｉＳ５のＳＥＣクロマトグラムのプロットを重ねて示し、実線は、ゼロ時点で（ストレスなし）のＢｉＳ４およびＢｉＳ５サンプルに対応し、点線は、４０℃で４週間インキュベートした（ストレスを加えた）ＢｉＳ４およびＢｉＳ５サンプルに対応する。図７４Ｂは、ゼロ日目および４０℃で４週間後に測定した、ＢｉＳ４およびＢｉＳ５の様々な種（モノマー、フラグメント、および凝集体）に対するｐＨ７．５の作用を表す棒グラフを提供する。 図７４－１の続きである。 ＢｉＳ４（三角トレース）およびＢｉＳ５（丸トレース）について、４０℃での加速および短期保存安定性に対するｐＨ７．５の作用を示す動態プロットを提供する。図７５Ａは、４週間にわたってＨＰ－ＳＥＣにより測定した残留モノマーのパーセンテージを示す。図７５Ｂは、４週間にわたってＨＰ－ＳＥＣにより測定したフラグメント化のパーセンテージを示す。図７５Ｃは、４週間にわたってＨＰ－ＳＥＣにより測定した凝集のパーセンテージを示す。表示するデータは、単一バイアル分析からのものである。 ＢｉＳ４（三角）およびＢｉＳ５（丸）のｐＨ－速度プロフィールプロットを描く。図７６Ａは、４０℃でのモノマー喪失の速度に対する様々なｐＨ条件の作用を示す。図７６Ｂは、４０℃でのフラグメント化の速度に対する様々なｐＨ条件の作用を示す。図７６Ｃは、４０℃での凝集の速度に対する様々なｐＨ条件の作用を示す。 ＢｉＳ４およびＢｉＳ５フラグメント化のさらなる分析を描く。図７７Ａは、ｐＨ７．５および４０℃で（時間＝０）いずれの分子も明らかなフラグメント化を呈示しないことを示す。図７７Ｂは、図７７Ａと同じ条件下であるが、４０℃で２週間の保存後、ＢｉＳ４について明らかなフラグメント化が、ＢｉＳ５についてわずかなフラグメント化が観察されることを示す。 図７７－１の続きである。 ｐＨの関数としてのＢｉＳ４およびＢｉＳ５フラグメント化（左側パネル）および凝集（右側パネル）の分析を描く。いずれのフォーマットも低い（５．５）ｐＨでフラグメント化および凝集を低減したが、ＢｉＳ５の方が、いずれのｐＨ値でもフラグメント化および凝集の両方について優れた性能を有する。 コンストラクト（左側パネル）Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ、ならびに（右側パネル）Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨについて本明細書に開示されるいくつかのＢｉＳ５二重特異性結合タンパク質のＤＳＣサーモグラムを描く。コンストラクトＡおよびＥは、ＩＳ－ＲＴＰにｓｃＦｖを含み；ＢおよびＦは、ＡＫ－ＧＱＰにｓｃＦｖを含み；ＣおよびＧは、Ｓ－ＮＧにｓｃＦｖを含み；ＤおよびＨは、ＳＮ－ＧにｓｃＦｖを含む。コンストラクトＡ、Ｂ、ＣおよびＤのｓｃＦｖは、２Ｆ４であり（ＩｇＧは、ＬＣ１０である）、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨのｓｃＦｖは、ＬＣ１０である（ＩｇＧは、２Ｆ４である）。様々なＴ_Ｍ値が下記のドメインに関連する：Ｔ_Ｍ１＝ＣＨ２／ｓｃＦｖ；Ｔ_Ｍ２＝Ｆａｂ；Ｔ_Ｍ３＝ＣＨ３。 本明細書に開示する二重特異性結合タンパク質（コンストラクトＤおよびＨ）とのＦｃＲｎ結合に関する代表的なデータセットを示す。ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン（すなわち、ＩＳＴＲＰループ内）のｓｃＦｖ位置は、ＦｃＲｎ結合活性に作用をもたらし得る。 本明細書に開示する二重特異性結合タンパク質（ＦｃγＲＩＩＩａ－１５８Ｖを含むコンストラクトＥ、Ｇ、およびＨ）とのＦｃγＲ結合に関する代表的なデータセットを示す。差し込み図は、ＦｃγＲＩＩＩａ－１５８Ｖ注射時に再標準化した主要図と同じデータを表す。全てのコンストラクトがＦｃγＲに結合することができたが、ｓｃＦｖドメインの位置に基づく親和性に観察可能な差があった。 インタクトなＩＳＲＴＰループが例示的な二重特異性結合コンストラクト（たとえば、ＡおよびＥ）のＦｃＲｎ結合に重要であることを証明する。Ｎ３ループの導入は、ＩＳＲＴＰループの分断を補償しない（ＢｉＳ５Ｅ＋Ｎ３）。ＩｇＧ１ Ｆｃに挿入されたＮ３ループに導入されたｓｃＦｖにより、ＩｇＧはＦｃＲｎに結合不可能になる。ｘ軸の時間は、秒で測定される。 ＢｉＳ１、ＢｉＳ２、ＢｉＳ３、ＢｉＳ４、およびＢｉＳ５コンストラクト各々の一般的な概略構造フォーマットを描く。「ｋ１」および「ｋ２」の呼称は、実施例３で論じる動態分析で使用されるフラグメント化パターンを示す。 ｐＨの関数としてのＢｉＳ１、ＢｉＳ２、ＢｉＳ３、ＢｉＳ４、およびＢｉＳ５各々のフラグメント化速度を示す。 ｐＨの関数としてのＢｉＳ１、ＢｉＳ２、ＢｉＳ３、ＢｉＳ４、およびＢｉＳ５各々の凝集速度を示す。 ｐＨの関数としてのＢｉＳ１、ＢｉＳ２、ＢｉＳ３、ＢｉＳ４、およびＢｉＳ５各々のモノマー喪失速度を示す。 ＢｉＳ１、ＢｉＳ２、ＢｉＳ３、ＢｉＳ４、およびＢｉＳ５各々についてのフラグメント化パターンおよびＨＰＳＥＣクロマトグラムのピークとの一致の図を描く。 還元条件下でのフラグメント化パターンの代表的な分析を描く。 還元および非還元条件下でのＢｉＳ５の構造配置を描く。 ＳＥＢアッセイフォーマットを描く。

引き続き本開示をさらに詳細に記載する前に、本開示は、特定の組成物またはプロセスステップに限定されるものではなく、従って異なってもよいことを理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「１つの（ａ）、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、複数の意味を含むことに留意しなければならない。

他に記載がない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は、全て本発明が関連する技術分野の当業者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。たとえば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；およびＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、当業者にとって本発明に使用される多くの用語の一般的な辞書となる。

本明細書においてアミノ酸は、その一般に知られる３文字記号またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）により推奨される１文字記号で示すことがある。ヌクレオチドも、同様に、その一般的に認められた１文字記号で示すことがある。

抗体の可変ドメイン、相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸の番号付けは、他に記載がない限り、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に記載されるＫａｂａｔの定義に従う。この番号付け体系を使用すると、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲもしくはＣＤＲの短縮またはＦＲもしくはＣＤＲへの挿入に対応して、より少ないアミノ酸または追加のアミノ酸を含むことができる。たとえば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後の１個のアミノ酸の挿入（Ｋａｂａｔによれば残基５２ａ）、および重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（たとえば、Ｋａｂａｔによれば残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃなど）を含むことができる。残基のＫａｂａｔの番号付けは個々の抗体に対して、抗体の配列と「標準的な」Ｋａｂａｔ番号が付けられた配列との相同性領域でアライメントを行うことにより決定することができる。フレームワーク残基の最大のアライメントには、Ｆｖ領域に使用される、この番号付け体系の「スペーサー」残基の挿入が必要とされることが多い。さらに、任意の特定のＫａｂａｔ部位番号における個々の特定の残基の種類は、種間の相違または対立遺伝子の相違のため抗体鎖によって異なることもある。

本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリンとも呼ばれ、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの異なるエピトープ結合フラグメントから形成される多重特異性抗体（たとえば、多重特異性抗体、たとえば、その全体を本明細書に援用する国際公開第２００９／０１８３８６号パンフレット、国際出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１２／０４５２２９号明細書）、ＢｉＳＡｂ、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、所望の生物活性を示す抗体フラグメント（たとえば、抗原結合部分）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（たとえば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体など）、イントラボディ、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを包含する。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメント、すなわち、少なくとも１つの抗原結合部位を含む分子を含む。抗体は、抗体またはその一部とのペプチド融合体、たとえばＦｃドメインとの融合タンパク質も含む。免疫グロブリン分子は、どのようなアイソタイプ（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、サブアイソタイプ（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはアロタイプ（たとえば、Ｇｍ、たとえばＧ１ｍ（ｆ、ｚ、ａまたはｘ）、Ｇ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（ｇ、ｂまたはｃ）、Ａｍ、ＥｍおよびＫｍ（１、２または３））であってもよい。抗体は、任意の哺乳動物、以下に限定されるものではないが、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウスなど、または他の動物、たとえばトリ（たとえば、ニワトリ）に由来してもよい。

ＣＴＬＡ－４
細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）は、活性化Ｔ細胞に発現され、ＣＤ２８媒介性Ｔ細胞活性化後にＴ細胞応答を阻止する共阻害剤として作用する。ＣＴＬＡ－４は、ＴＣＲエンゲージメント後、ナイーブおよびメモリＴ細胞の早期活性化の大きさを調節すると共に、抗腫瘍免疫および自己免疫の両方に影響を及ぼす中心的な阻害経路の一部であると考えられる。ＣＴＬＡ－４は、Ｔ細胞にのみ発現され、そのリガンドＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）の発現は、主として、抗原提示細胞、Ｔ細胞、および他の免疫媒介細胞に限定される。ＣＴＬＡ－４シグナル伝達経路を遮断するアンタゴニスト抗ＣＴＬＡ－４抗体は、Ｔ細胞活性化を増強することが報告されている。そのような抗体の１つ、イピリムマブは、転移性黒色腫の治療のために２０１１年にＦＤＡによって承認された。感染症および腫瘍を治療し、養子免疫応答をアップモジュレートするための抗ＣＴＬＡ－４抗体の使用が提案されている（米国特許第６，６８２，７３６号明細書；同第７，１０９，００３号明細書；同第７，１３２，２８１号明細書；同第７，４１１，０５７号明細書；同第７，８２４，６７９号明細書；同第８，１４３，３７９号明細書；同第７，８０７，７９７号明細書；同第８，４９１，８９５号明細書；同第８，８８３，９８４号明細書；ならびに米国特許出願公開第２０１５０１０４４０９号明細書を参照されたい；これらは、その全体が参照により本明細書に援用される）。

ＰＤ－Ｌ１
プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）も、Ｔ細胞活性化の制御に関与する受容体およびリガンドの複合系の一部である。正常組織では、ＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、間葉系幹細胞、骨髄由来肥満細胞、ならびに様々な非造血細胞に発現される。その正常機能は、その２つの受容体：プログラム死１（別称：ＰＤ－１もしくはＣＤ２７９）およびＣＤ８０（別称：Ｂ７－１もしくはＢ７．１）との相互作用により、Ｔ細胞活性化と耐容性との間で平衡を調節することである。ＰＤ－Ｌ１は、腫瘍によっても発現され、多くの部位で作用して、腫瘍が宿主免疫系による検出および排除から逃れることを促進する。ＰＤ－Ｌ１は、多様な癌において高頻度で発現される。いくつかの癌では、ＰＤ－Ｌ１の発現は、低い生存率および予後不良に関連している。ＰＤ－Ｌ１とその受容体との相互反応を阻止する抗体は、ＰＤ－Ｌ１依存性免疫抑制効果を軽減し、抗腫瘍Ｔ細胞の細胞傷害性活性をインビトロで増強することができる。デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｍａｂ）は、ＰＤ－１およびＣＤ８０受容体の両方とＰＤ－Ｌ１との結合を阻止することができる、ヒトＰＤ－Ｌ１に対するヒトモノクローナル抗体である。感染症および腫瘍を治療し、養子免疫応答を増大するための抗ＰＤ－Ｌ１抗体の使用が報告されている（その全体を参照により本明細書に援用する米国特許第８，７７９，１０８号明細書および同第９，４９３，５６５号明細書を参照されたい）。

ＰＤ－１
プログラム死－１（「ＰＤ－１」）は、Ｔ細胞調節物質の延長されたＣＤ２８／ＣＴＬＡ－４ファミリーの約３１ｋＤのＩ型膜タンパク質メンバーである（Ｉｓｈｉｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ ＰＤ－１，Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｍｅｍｂｅｒ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，Ｕｐｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ，”ＥＭＢＯ Ｊ．１１：３８８７－３８９５を参照されたい。

ＰＤ－１は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、および単球に発現される（Ａｇａｔａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＰＤ－１ Ａｎｔｉｇｅｎ ｏｎ ｔｈｅ Ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｔ ａｎｄ Ｂ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，”Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８（５）：７６５－７７２；Ｍａｒｔｉｎ－Ｏｒｏｚｃｏ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（２００７）“Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉ－Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，”Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．１７（４）：２８８－２９８）。ＰＤ－１は、ＰＤＬ－１またはＰＤＬ－２の結合による活性化後に免疫系のダウンレギュレーションの原因となる受容体であり（Ｍａｒｔｉｎ－Ｏｒｏｚｃｏ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（２００７）“Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉ－Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，”Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．１７（４）：２８８－２９８）、細胞死誘導物質として作用する（Ｉｓｈｉｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）“Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰＤ－１，Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，Ｕｐｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ，”ＥＭＢＯ Ｊ．１１：３８８７－３８９５；Ｓｕｂｕｄｈｉ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２００５）“Ｔｈｅ Ｂａｌａｎｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ：Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｖｅｒｓｅ Ｃｏｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｍｅｄ．８３：１９３－２０２）。このプロセスは、多くの腫瘍でＰＤ－Ｌ１の過剰発現を介して利用され、免疫応答の抑制を招く。

ＰＤ－１は、腫瘍学における免疫媒介療法のために十分に検証された標的であり、とりわけ黒色腫および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療の臨床試験から有望な結果をもたらしている。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ－１相互作用の拮抗的阻害は、Ｔ細胞活性化を高め、宿主免疫系による腫瘍細胞の認識および排除を増強する。感染症および腫瘍を治療し、養子免疫応答を増大するための抗ＰＤ－１抗体の使用が提案されている（米国特許第７，５２１，０５１号明細書；同第７，５６３，８６９号明細書；同第７，５９５，０４８号明細書を参照されたい）。

ＯＸ４０
ＯＸ４０（ＣＤ１３４；ＴＮＦＲＳＦ４）は、主として、活性化ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞、調節Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に見出される腫瘍壊死因子受容体である（Ｃｒｏｆｔ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２２９：１７３－９１）。ＯＸ４０は、１つの既知内在性リガンド、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ；ＣＤ１５２；ＴＮＦＳＦ４）を有し、これは、三量体の形態で存在し、ＯＸ４０をクラスター化することができ、それによりＴ細胞内に強力な細胞シグナル伝達事象をもたらす。同上。活性化ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞上でのＯＸ４０によるシグナル伝達は、サイトカイン産生増大、グランザイムおよびペルホリン放出、ならびにエフェクターおよびメモリＴ細胞プールの拡大をもたらす（Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ．３７：５２４－３２）。加えて、Ｔｒｅｇ細胞でのＯＸ４０シグナル伝達は、Ｔｒｅｇの拡大を阻害し、Ｔｒｅｇの誘導を停止すると共にＴｒｅｇ抑制機能を阻止する（Ｖｏｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９１：３６４１－５０；Ｖｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｂｌｏｏｄ．１１０：２５０１－１０）。

免疫組織化学研究および早期フローサイトメトリー分析により、ＯＸ４０が、多様なヒト癌に浸潤するＴ細胞に発現されることが証明された（Ｂａｒｕａｈ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ２１７：６６８－６７５；Ｃｕｒｔｉ ｅｔ ａｌ，２０１３，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７３：７１８９－９８；Ｌａｄａｎｙｉ ｅｔ ａｌ，２００４，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：５２１－３０；Ｐｅｔｔｙ ｅｔ ａｌ，２００２，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ．１８３：５１２－８；Ｒａｍｓｔａｄ ｅｔ ａｌ，２０００，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ．１７９：４００－６；Ｓａｒｆｆ ｅｔ ａｌ，２００８，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ．１９５：６２１－５；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ６２５；Ｖｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ，１９９７，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ．１７４：２５８－６５）。特定の理論に拘束されることは意図しないが、腫瘍浸潤リンパ球でのＯＸ４０発現は、数種のヒト癌におけるより長期の生存と相関しており、これは、ＯＸ４０シグナルが抗腫瘍免疫応答の確立において役割を果たし得ることを示唆している（Ｌａｄａｎｙｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：５２１－３０；Ｐｅｔｔｙ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ．１８３：５１２－８）。

多様な非臨床マウス腫瘍モデルにおいて、抗体およびＯＸ４０リガンド融合タンパク質を含むＯＸ４０のアゴニストの使用が成功しており、有望な結果をもたらしている（Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：５５１４－２１；Ｎｄｈｌｏｖｕ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：２９９１－９；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：２１６０－９）。ＯＸ４０によるＴ細胞の同時刺激は、場合により持続性の抗腫瘍活性を促進し、後の腫瘍攻撃に対して長時間持続する防御をもたらした（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：２１６０－９）。Ｔｒｅｇ細胞阻害およびエフェクターＴ細胞の同時刺激は、ＯＸ４０アゴニストの腫瘍成長阻害に必要であることが明らかにされた（Ｐｉｃｏｎｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２０５：８２５－３９）。ＯＸ４０アゴニスト療法の抗腫瘍効果を増強するために、ワクチン、化学療法、放射線療法、および免疫療法との併用により、多くの戦略および技術が模索されている（Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ．３７：５２４－３２；Ｍｅｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９：９９７－１００８）。感染症および腫瘍を治療し、養子免疫応答をアップモジュレートするための抗ＯＸ４０抗体の使用が提案されている（その全体を参照により本明細書に援用する米国特許出願公開第２０１６０１３７７４０号明細書を参照されたい）。

ＴＩＭ３
Ｔ細胞阻害性受容体Ｔｉｍ－３（Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチン－ドメイン含有３）は、ＩＦＮγ産生ＣＤ４＋ヘルパー１（Ｔｈ１）およびＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性１（Ｔｃ１）Ｔ細胞に発現されることから、抗腫瘍免疫の調節において役割を果たす。これは、当初、特にＴｈ１およびＴｃ１ Ｔ細胞応答の持続時間および大きさを制限するために機能する免疫チェックポイント受容体として作用するＴ細胞阻害性受容体として同定された。さらなる研究により、Ｔｉｍ－３経路がＰＤ－１経路と協同して、癌におけるＣＤ８＋Ｔ細胞中に重度の機能不全表現型の発生を促進し得ることが特定された。これは、特定の癌の調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）でも発現されている。いくつかの癌で免疫抑制されている主要な免疫細胞集団へのＴＩＭ３経路の関与を考慮すれば、これは、癌免疫療法の魅力的な候補となる。Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｃ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．，（２０１４）２：３９３－３９８；およびＦｅｒｒｉｓ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１４）１９３：１５２５－１５３０を参照されたい。

Ａ．二重特異性結合タンパク質
単一の結合ドメインに対する特異性を有する分子に複数の結合部位を付加すると、分子の能力（たとえば、治療能、診断能など）を大きく高めることができる。たとえば、二重特異性抗体は、同じ標的生体分子の２つ以上の領域に結合して、標的の１つのエピトープのみに結合する単特異性ポリペプチドより大きい特異性を与えることができる。あるいは、二重特異性抗体は、複数の標的生体分子、たとえば複合体に存在する標的、または封鎖および／またはクラスター形成が望ましい標的に結合することができる。第３のシナリオでは同じ二重特異性抗体が、その標的分子の局在および／または発現に応じて、いつでも異なる機能を発揮することができる。

本明細書に記載されるのは、新規な結合タンパク質である。これらの新規な結合タンパク質のそうした１つの構造を「ＤｕｅｔＭａｂ」と呼ぶ。ＤｕｅｔＭａｂは、下記の基本構造を有する：修飾重鎖（ここで、修飾重鎖のＣＨ１領域は、非システインアミノ酸へのネイティブシステインの置換、およびシステインアミノ酸へのネイティブ非システインアミノ酸の置換を有する）；対応する修飾軽鎖（ここで、修飾軽鎖のＣＬ領域も、非システインアミノ酸へのネイティブシステインの置換、およびシステインアミノ酸へのネイティブ非システインアミノ酸の置換を有する）；第２の重鎖を有する第２のＦｃ領域；および対応する第２の修飾軽鎖を有するＦｃ領域（ここで、修飾重鎖は、対応する修飾軽鎖に直接連結され、個別の標的結合アーム上において、第２の重鎖は、第２の対応する軽鎖に直接連絡されており、システインアミノ酸へのネイティブ非システインアミノ酸の置換によって得られる修飾重鎖の置換システイン、およびシステインアミノ酸へのネイティブ非システインアミノ酸の置換によって得られる対応する修飾軽鎖の置換システインは、ジスルフィド結合を形成することができる）。ＤｕｅｔＭａｂに関する開示は、たとえば、米国特許第９，５２７，９２７号明細書に見出すことができ、これは、全体として参照により本明細書に援用される。

これらの新規な結合タンパク質の別の例示的な構造は、「ＢｉＳＡｂ」または「ＢｉＳＡｂｓ」と呼ばれる。例示的なＢｉＳＡｂの概略図、ならびに特定のＢｉＳＡｂの具体的な例を本明細書に提供する。さらに一般的には、ＢｉＳＡｂは、２つの結合ユニットを含有するポリペプチドであり、これらの各々がエピトープに結合する（たとえば、結合ユニット１は、第１のエピトープに結合し、結合ユニット２は、第２のエピトープに結合する）。基本的なＢｉＳＡｂは、２つのエピトープの各々に結合するために二価である（たとえば、ポリペプチドは、２つの結合ユニット１（「ＢＤ１」または「ＢＵ１」）と２つの結合ユニット２（「ＢＤ２」または「ＢＵ２」）とを含む）。従って、結合ユニット１および２が異なるエピトープに結合する場合、ＢｉＳＡｂは、従来の二重特異性抗体の多重特異性と、従来の抗体分子の二価性とを有する。結合ユニット１および２が同じエピトープに結合する実施形態では、ＢｉＳＡｂは、通常の抗体の単一特異性を有するが、四価である。結合ユニットに加えて、ＢｉＳＡｂは、リンカーポリペプチドおよびＦｃ部分も含む。本開示は、ＢｉＳＡｂおよびＢｉＳＡｂコアを含むタンパク質などの広範な二重特異性結合タンパク質の組に関し、これらのタンパク質は、免疫応答をモジュレートする分子をターゲティングする。一般に、本明細書に記載の新規な結合タンパク質プラットフォームおよび例示的な二重特異性結合タンパク質（ＢｉＳＡｂ）は、結合ユニット／ドメイン、リンカーポリペプチドおよびＦｃ部分を含む。本開示は、こうしたＢｉＳＡｂをコードする核酸分子、ならびにこうした核酸を含み、こうしたＢｉＳＡｂを生成および使用する方法に用いることができるベクターおよび宿主細胞も提供する。ＢｉＳＡｂ、ＢｉＳＡｂコアを含む結合タンパク質、およびＢｉＳＡｂの様々な部分は、本明細書においてさらに詳細に記載される。

いくつかの態様では、ＢｉＳＡｂは、特異性結合タンパク質（すなわち抗体）に由来する２つの重鎖－軽鎖対を含んでよく、ここで、重鎖および軽鎖は、それぞれ可変領域（たとえば、ＶＬおよびＶＨ）を含み、これらは、一緒に第１結合ユニットを形成し、重鎖は、それぞれ第２の結合ユニット（たとえば、ＦｃまたはＦａｂに結合したｓｃＦｖドメイン）をさらに含む。第１および第２の結合ユニットが異なるエピトープに結合する場合、各重鎖－軽鎖対は、二重特異性であり、エピトープの各々について２つの対が共に二価である。第１および第２の結合ユニットが同じエピトープに結合する場合、各重鎖－軽鎖対は、単一特異性であり、２つの対がそのエピトープについて共に四価である。いくつかの態様において、２つの重鎖－軽鎖対は同一である。いくつかの態様では、２つの重鎖－軽鎖対は同一ではない。

特定の実施形態では、ＢｉＳＡｂのドメインは、既知免疫グロブリンドメインを基材としてもよい。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）などの免疫グロブリン分子は、診断薬および治療薬として広く使用されており、ｍＡｂの結合フラグメントを作製する方法は、当該技術分野で公知である。あらゆる免疫グロブリン分子などのモノクローナル抗体は、重鎖および軽鎖ペプチドサブユニットから構成され、これらは、それぞれ結合特異性（可変ドメイン）およびアイソタイプ（定常ドメイン）を付与する可変および定常ドメインを含む。

本明細書に開示するＢｉＳＡｂは、一般的な抗体と同様の全体的構造を有するが、Ｆａｂドメイン内の位置で結合され、Ｆａｂドメインから離れた位置およびヒンジまたはＦｃ領域内（たとえば、ＣＨ２、ＣＨ３、もしくはＣＨ４領域またはＣＨ２－ＣＨ３境界面などのこうした領域の境界面において）で結合される追加の結合ユニットの存在によって区別可能である。従って、単一のエピトープに結合するために二価である通常の抗体と異なり、ＢｉＳＡｂは、２つのエピトープに結合するために二価である。しかしながら、本明細書に記載するように、ＢｉＳＡｂは、Ｃ１ｑおよびＦｃＲｎと結合する能力ならびにＦｃγ受容体と結合する能力（たとえば、抗体および補体依存性細胞傷害性を媒介する能力を示す）など、通常の抗体の多くの望ましい特性を依然として維持し得る。

本明細書に記載する結合ドメインは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂフラグメントなどのｍＡｂ分子の部分のみを含有する抗原結合フラグメントを含んでもよい。なぜなら、これらのフラグメントは、診断薬または治療薬として有用であることが判明したためである。加えて、可変ドメインにおける特定の残基は、抗体および抗体フラグメントの結合特異性および／または安定性を改善するために改変することもできる。非ヒト抗体の領域を「ヒト化」すると共にｍＡｂの免疫原性を低減するために、抗原結合に直接関与しない他の残基を置換することができる。

ＢｉＳＡｂは、従来の抗体と異なり、たとえば２つの異なるエピトープへの結合に対して二価（または１つのエピトープへの結合に対して四価）であるが、ＢｉＳＡｂの多くの部分は、従来の抗体部分に由来するまたは類似する。本明細書に記載のＢｉＳＡｂには、当該技術分野において公知のどのようなｍＡｂドメインおよび／またはフラグメントを使用してもよい。特に、ＢｉＳＡｂは、Ｆａｂフラグメントおよび／もしくはｓｃＦｖフラグメントまたはこれらの変異体を含んでもよい。例示的かつ非限定的なｓｃＦｖの変異体として、タンデムジ－ｓｃＦｖ、タンデムトリ－ｓｃＦｖ、ダイアボディおよびトリボディまたはトリアボディがあるが、これに限定されるものではない。

本開示は、全般的に、新規な結合タンパク質に関し、ＢｉＳＡｂが実例である。別の例には、ＢｉＳＡｂコアのほか、１つまたは複数の追加の結合ユニットを含む結合タンパク質および／または伸長型ＢｉＳＡｂコアを含む結合タンパク質がある。ＢｉＳＡｂまたはＢｉＳＡｂの特徴を本明細書に記載するときは、そうした記載が本開示の新規な結合タンパク質に全般的に当てはまるものであり、そうした結合タンパク質が２つの結合ユニットまたは３つ以上の結合ユニットを含むかどうかに関係ないことを理解すべきである。従って、ＢｉＳＡｂという用語は、本明細書に記載される結合タンパク質を例示するものであり、文脈上許容される場合、ＢｉＳＡｂに関する任意のそうした言及は、ＢｉＳＡｂコアを含む結合タンパク質を説明するために使用されることがある。

新規なＢｉＳＡｂ構造プラットフォーム
一態様では、本開示は、一般的に図１Ａ～１Ｆの概略図によって示される構造プラットフォームを有するＢｉＳＡｂ結合タンパク質を提供する。これらの図は、例示的であり、従って追加的残基間への挿入も、開示される結合タンパク質の範囲に含まれる。図１Ａ～１Ｃは、ＰｙＭＯＬを用いてモデル化されたＩｇＧ１のＣＨ２－ＣＨ３境界面における抗体のＦｃ領域を描き、本開示のいくつかの例示的なＢｉＳＡｂを示す。３つの表面露出ループがＣＨ２－ＣＨ３境界面またはその付近で同定され、これらは、ＩｇＧまたは第２の結合部分の構造的完全性または安定性を損なうことなく、第２の結合部分（たとえば、ｓｃＦｖ）の挿入に耐えることができる可能性があった。図１Ａは、ＣＨ２－ＣＨ３境界面付近のＣＨ２領域内で同定された１つのそうした代表的ループＩＳＲＴＰ（配列番号３９）の概略図である。図１Ｄも代表的コンストラクトＩＳ－ｓｃＦｖ－ＲＴＰを示し、ここで、ｓｃＦｖは、ＩＳＲＴＰループのＳとＲとの間に挿入されている。図１Ｂは、ＣＨ２－ＣＨ３境界面で同定された代表的ループＡＫＧＱＰ（配列番号４０）の概略図である。図１Ｅは、代表的コンストラクトＡＫ－ｓｃＦｖ－ＧＱＰを示し、ここで、ｓｃＦｖは、ＡＫＧＱＰループのＫとＧとの間に挿入されている。図１Ｃは、ＣＨ２－ＣＨ３境界面下流のＣＨ３領域内で同定された代表的ループＳＮＧの概略図である。図１Ｆも代表的コンストラクトＳ－ｓｃｆｖ－ＮＧを示し、ここで、ｓｃＦｖは、ＳＮＧループのＳとＮとの間に挿入されている。本明細書に記載する実施例は、ＳＮ－ｓｃＦｖ－Ｇのように配向されたコンストラクトの説明を提供するが、この場合、ｓｃＦｖは、ＳＮＧループのＮとＧとの間に挿入されている。

従って、本開示の一態様は、２つの同じ重鎖－軽鎖対を含むＢｉＳＡｂに関し、ここで、各重鎖－軽鎖対は、二重特異性であり、２つの同一の対は、各エピトープについて共に二価である。各重鎖－軽鎖対は、第１のエピトープに結合するＦａｂドメインを含み得る結合ドメイン（ＢＤ）（結合ユニット１）、第２のエピトープに結合する第２の結合ドメイン（ＢＤ２）（またはたとえばｓｃＦｖであってもよい結合ユニット２）、およびＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは、Ｆａｂドメインと結合していてもよい。いくつかの実施形態では、ＢｉＳＡｂのＦｃ領域は、第２のエピトープに結合する第２の結合ドメイン（ＢＤ２）（結合ユニット２；図１Ｄ～１ＦではｓｃＦｖとして描かれる）と結合していてもよい。

いくつかの実施形態では、本開示は、２つのキメラ重鎖を含む一般的なプラットフォーム構造を有するＢｉＳＡｂを提供し、これらは、それぞれ重鎖可変領域（ＶＨ１）、重鎖定常領域（ＣＨ１）、ヒンジまたはポリペプチドリンカー領域、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含むＦｃ領域を含み、ここで、任意選択的に、片側または両側がポリペプチドリンカー（Ｌ１および／またはＬ２）によりフランキングされている第２の結合ドメイン（ＢＤ２）は、（ｉ）ＣＨ２領域、（ｉｉ）ＣＨ２およびＣＨ３領域、または（ｉｉｉ）ＣＨ３領域の順でＦｃ領域内の溶媒曝露ループと結合されている。本開示のこの態様のＢｉＳＡｂも２つの通常の抗体軽鎖を含み、これらは、それぞれ軽鎖可変領域（ＶＬ１）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とを含み、第１の結合ドメイン（ＢＤ１）の一部を形成する。図１Ｄ～１Ｆに示す特定のＢｉＳＡｂの結合ドメイン（ＢＤ２）は、ｓｃＦｖである。

図１Ｄ～１Ｆは、本明細書でＢｉＳＡｂ「コア」と呼ばれることもあるＢｉＳＡｂの有用な概略図を提供する。図１Ｄに示すように、ポリペプチド鎖は、ＶＨ１ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ／リンカー、部分的なＮ末端ＣＨ２ドメイン、任意選択的なリンカー（本明細書ではＬ１または第１のポリペプチドリンカーと呼ばれる）、結合ユニット２（ｓｃＦｖのＶＬ２およびＶＨ２など）、別の任意選択的なリンカー（たとえば、Ｌ２または第２のポリペプチドリンカー）、残りのＣ末端ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを有する重鎖を含む。この重鎖は、代替的な結合タンパク質および／または従来の軽鎖領域を有するＢＤ２を含み得ることから、本明細書でキメラ重鎖と呼ばれる。ＢｉＳＡｂは、２つのこうしたキメラ重鎖を含み、これらは同一でもまたは異なってもよい。結合ユニット１の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）はＶＨ１という点に留意されたい。ある態様では、これは、第１のエピトープに結合するＦａｂの可変重鎖である。同様に、結合ユニット１の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）はＶＬ１という。ある態様では、これは、第１のエピトープに結合するＦａｂの可変軽鎖である。一方、結合ユニット２が第２のエピトープに結合するｓｃＦｖである態様では、結合ユニット２のドメインは、ＶＨ２およびＶＬ２など数字「２」で示す。

同様に、ポリペプチド鎖は、図１Ｅに示すように、ＶＨ１ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ／リンカー、ＣＨ２ドメイン、任意選択的なリンカー（本明細書ではＬ１または第１のポリペプチドリンカーと呼ばれる）、結合ユニット２（ｓｃＦｖのＶＬ２およびＶＨ２など）、別の任意選択的なリンカー（たとえば、Ｌ２または第２のポリペプチドリンカー）、およびＣＨ３ドメインを有する重鎖を含む。この実施形態では、ＢｉＳＡｂは、ＣＨ２およびＣＨ３領域の境界面における配列でＦｃと結合したｓｃＦｖとして示される第２結合ドメインを含む。

ポリペプチド鎖は、図１Ｆに示すように、ＶＨ１ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ／リンカー、ＣＨ２ドメイン、部分的ＣＨ３ドメイン、任意選択的なリンカー（本明細書ではＬ１または第１のポリペプチドリンカーと呼ばれる）、結合ユニット２（ｓｃＦｖのＶＬ２およびＶＨ２など）、別の任意選択的なリンカー（たとえば、Ｌ２または第２のポリペプチドリンカー）、およびＣＨ３ドメインを有する重鎖を含む。

これらの実施形態では、ＢｉＳＡｂは、典型的に、キメラ重鎖配列における典型的または修飾抗体ヒンジ領域を含む。ヒンジ領域を含むアミノ酸配列の非限定的例として、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号４４）；ＥＰＫＳＣＤＫＴ（配列番号４５）；ＥＰＫＳＣＧＫＴ（配列番号４６）；ＥＰＫＳＣ（配列番号４７）が挙げられる。

本明細書に開示するいくつかのＢｉＳＡｂ分子の特定の構造プラットフォームに関する態様について一般的なフォーマットを記載してきたが、開示されるＢｉＳＡｂの様々な部分および例示的な機能特性を以下にさらに詳細に説明する。他の実施形態では、本開示は、本明細書ならびにその各々を参照により本明細書に援用する他の開示（たとえば、米国特許出願公開第２００９０１５５２７５号明細書および米国特許第９，５８０，５０９号明細書を参照されたい）に簡潔に記載される代替的な構造フォーマットおよび配置を含む他のＢｉＳＡｂ結合タンパク質を考慮しかつ提供する。

１．結合ユニット
本開示のＢｉＳＡｂは、少なくとも２つの結合ユニットまたは結合ドメイン（結合ユニット／ドメイン１および結合ユニット／ドメイン２）を含む。ある態様では各結合ユニットは、同じ標的分子上にある異なるエピトープまたは異なる標的上のエピトープを問わず、異なるエピトープに結合する。ＢｉＳＡｂの結合ユニットは、それぞれ対として存在する（２つの結合ユニット１および２つの結合ユニット２が存在する）ため、ＢｉＳＡｂは各エピトープに対して二価の結合を示す。本明細書の教示から、各結合ユニットが同じエピトープに結合する場合、ＢｉＳＡｂはエピトープに対して四価の結合を示すことが理解されよう。

ある態様では、第１の結合ユニットはＦａｂフラグメント、たとえば通常のモノクローナル抗体のＦａｂフラグメント、または可変軽鎖（ＶＬ１）、定常軽鎖（ＣＬ）、可変重鎖（ＶＨ１）および定常重鎖部分（ＣＨ１）を含む組換え技術によって作製された抗原結合フラグメントである。任意選択的に、Ｆａｂの軽鎖および重鎖は、たとえば、好適な抗体ヒンジ領域などの１つまたは複数のジスルフィド結合を介して相互に連結してもよい。Ｆａｂは、第１のエピトープに結合する。

ある態様では、Ｆａｂは、通常のマウス、ヒト化、またはヒト抗体などの通常のモノクローナル抗体の配列に由来するか、またはそれに基づく。ある態様では、通常のモノクローナル抗体の配列に由来するか、またはそれに基づくＦａｂを含有するＢｉＳＡｂは、通常の抗体の１つまたは複数の機能的活性を保持する（たとえば、機能的活性の少なくとも８０％以上（８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％）を保持する）。たとえば、ある態様では、こうしたＦａｂを含有するＢｉＳＡｂは、通常の抗体の、抗原に対する親和性、阻害活性、免疫系モジュレーション活性、免疫応答の活性化もしくは誘導、および／または細胞（たとえば、癌細胞）殺傷活性の１つまたは複数を保持する。

ある態様では、本開示のＢｉＳＡｂは、結合ユニット２を含み、結合ユニット２は、第２のエピトープに結合する結合ドメインを含む。結合ユニット２（または結合ドメイン２（ＢＤ２））は、任意の好適な戦略を用いてＢｉＳＡｂと結合してもよい。本明細書で使用されるとき、ＢｉＳＡｂと「結合している」（たとえば、いくつかの実施形態ではＦｃ領域内で、他の実施形態ではＦａｂ領域内で）ＢＤ２とは、これらの２つの分子が、標的結合のための配向ならびにＢｉＳＡｂ構造のＦｃ部分またはＦａｂ部分との結合を保持するように、それらの間に相互作用を有することを意味する。こうした相互作用の例として、アミノ酸リンカーを介した共有結合、ＣＨ２、ＣＨ３、もしくはＣＨ２およびＣＨ３の境界面、またはＣＨ４領域におけるＦａｂ領域、ヒンジ領域、もしくはＦｃ領域内のＢＤ２の組換え発現による共有結合、ならびにこうした同じ領域内でのファンデルワールス力および水素結合相互作用などの非共有結合相互作用が挙げられる。本開示の範囲に含まれる結合ドメイン（または「ＢＤ」もしくは「結合ユニット」）の非限定的例として、抗体可変領域、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、一本鎖ダイアボディ、または当該技術分野で公知の他の結合ドメインが挙げられる。結合ドメインは、二重特異性一本鎖ダイアボディ、または２つの異なるエピトープを結合するように設計された一本鎖ダイアボディも含む。一態様では、本開示の多重特異性エピトープ結合ドメインの構築に有用なエピトープ結合ドメインは、あらゆる目的において参照により本明細書に援用する米国特許出願公開第２０１００２９８５４１号明細書および同第２０１３００７９２８０号明細書に例示される。

ある態様では、ＢｉＳＡｂは、ｓｃＦｖを含む結合ドメインを含むことができる。従って、ある態様では、結合ユニット２はｓｃＦｖを含む。ｓｃＦｖは、フレキシブルなポリペプチドリンカーを介して可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に結合した可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を含むポリペプチド鎖を包含することが理解されよう。図１Ｄ～１Ｆは、ＢＤ（ここでは結合ユニット２と表示）が、ＶＬ２およびＶＨ２で示され得る本明細書に記載のドメインを有するｓｃＦｖである、例示的ＢｉＳＡｂの概略図を示す。いくつかの態様では、ＶＨ２とＶＬ２との間のポリペプチドリンカーはプロテアーゼ切断部位を含む。ｓｃＦｖのＶＨドメインおよびＶＬドメインは同じ抗体に由来してもまたは異なる抗体に由来してもよい。いくつかの態様では、ｓｃＦｖのＶＨまたはＶＬは目的の標的に結合する１つまたは複数のＣＤＲを含んでもよく、ＶＨドメインまたはＶＬドメインの残りは、異なる抗体に由来するまたは合成ドメインである。いくつかの態様では、ｓｃＦｖは、抗体、たとえば目的の標的に結合する当該技術分野において公知の抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含む。いくつかの態様では、ｓｃＦｖは、ある抗体の少なくとも２つのＣＤＲを含む。いくつかの態様では、ｓｃＦｖは、ある抗体の少なくとも３つのＣＤＲを含む。いくつかの態様では、ｓｃＦｖは、ある抗体の少なくとも４つのＣＤＲを含む。いくつかの態様では、ｓｃＦｖは、ある抗体の少なくとも５つのＣＤＲを含む。いくつかの態様では、ｓｃＦｖは、ある抗体の少なくとも６つのＣＤＲを含む。

ある態様では、ＢＤは、受容体のリガンド結合ドメインまたはリガンドの受容体結合ドメインを含んでもよい。いくつかの態様では、ＢＤは、上記に記載の通り、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＯＸ４０、およびＴＩＭ３からなる群から選択される標的上の１つまたは複数のエピトープに対する結合親和性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＯＸ４０、およびＴＩＭ３からなる群から選択される標的に対する特異的結合活性を呈示する。本明細書に開示するＢｉＳＡｂは、本明細書に開示する分子標的に対する結合親和性または特異的結合活性を有する結合ドメインのあらゆる組み合わせを含んでもよい。たとえば、本明細書に開示するＢｉＳＡｂは、ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－１；ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－Ｌ１；ＣＴＬＡ－４およびＴＩＭ３；ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１；ＰＤ－Ｌ１およびＯＸ４０；ＰＤ－１およびＴＩＭ３；ＰＤ－Ｌ１およびＴＩＭ３；ならびにＴＩＭ３を含む標的に対する二重特異性結合を可能にする結合ドメインの組み合わせを含んでもよい。特定の標的組み合わせに結合する結合ドメインを含むＢｉＳＡｂは、実施例に例示するが、ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４；ＰＤ－Ｌ１／ＣＴＬＡ－４；ＰＤ－１／ＯＸ４０；ＰＤ－Ｌ１／ＯＸ４０；およびＰＤ－１／ＴＩＭ３の非限定的な組み合わせを含む。

いくつかのさらなる実施形態では、ＢｉＳＡｂは、標的分子の少なくとも一方に対して、ＢｉＳＡｂを生成するのに用いられる親単一特異性結合配列の結合活性よりも大きい結合活性（たとえば、結合親和性および／または結合特異性）を呈示する。類似の実施形態では、ＢｉＳＡｂは、標的分子の両方に対して、ＢｉＳＡｂを生成するのに用いられる親単一特異性結合配列の両方の結合活性よりも大きい結合活性（たとえば、結合親和性および／または結合特異性）を呈示し得る。また別の実施形態では、ＢｉＳＡｂは、標的分子の両方に対して、ＢｉＳＡｂを生成するのに用いられる親単一特異性結合配列の組み合わせの結合活性よりも大きい結合活性（たとえば、結合親和性および／または結合特異性）を呈示し得る。単独または組み合わせのいずれでも、親単一特異性結合配列に対するＢｉＳＡｂの結合特性の増強は、同じ分子をターゲティングする単一特異性治療薬の使用と比較して、たとえ組み合わせて使用した場合でも予想外の利点をもたらす。

いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＯＸ４０、およびＴＩＭ３からなる群から選択される標的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。こうした実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖配列および軽鎖配列、または重鎖および軽鎖配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖配列および軽鎖配列の１部分を含んでもよい。他の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖可変（ＨＣｖ）領域配列および軽鎖可変（ＬＣｖ）領域配列、または重鎖および軽鎖配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含むＨＣｖおよびＬＣｖの１部分を含んでもよい。また別の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖および軽鎖配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、抗体は、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体であってもよい。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってもよい。別の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。

いくつかの実施形態では、前述のような「親」抗体の全部または抗原結合領域を含むドメインを用いて、本明細書に開示する二重特異性結合タンパク質（ＢｉＳＡｂ）を生成することができる。実施例に例示する非限定的な実施形態は、分子標的の組み合わせに対する二重特異性結合を呈示するＢｉＳＡｂを生成するために、どのように抗体配列を同定し、組み合わせることができるかに関する説明を提供する。

いくつかの方法を単独または組み合わせて用いて、ｓｃＦｖ分子を含むＢｉＳＡｂの安定性を高めてもよい。単独または本明細書に記載の１つもしくは複数の他の方法と組み合わせて使用できると考えられる１つの方法は、ｓｃＦｖ部分を安定化させるようにｓｃＦｖドメインを連結するリンカーの長さおよび／または組成を操作することによる。

使用できると考えられる別の方法は、ジスルフィド結合の形成を促進するようにｓｃＦｖのＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインに少なくとも２つのアミノ酸置換（修飾または突然変異ともいう）を導入することである（たとえば、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，ＰＮＡＳ，９０：７５３８－４２；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．６：７８１－８；Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３：５４５１－９；Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ １４：１２３９－４５；Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：８２５－３１；Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＦＥＢＳ Ｌｅｔ．３７７：１３５－９；Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：１３６２－７を参照されたい）。この方法は、単独でもまたは本明細書に記載の他の方法の１つもしくは複数と組み合わせて使用してもよい。

ある態様では、ｓｃＦｖのＶＨドメインおよびＶＬドメインに１つまたは複数の突然変異を導入して、ｓｃＦｖを含むＢｉＳＡｂの発現時にＶＨドメインとＶＬドメインとの間の鎖間ジスルフィド結合の形成を促進することができる。別の態様では、鎖の同じドメインに２つの突然変異を導入する。ある態様では、異なる鎖に２つの突然変異を導入する。ある態様では、複数の相補的な突然変異を導入して、複数のジスルフィド結合の形成または他の安定化相互作用を促進する。ある態様では、システインを導入してジスルフィド結合の形成を促進する。システインに変異させてもよい例示的アミノ酸として、ＶＨ２のアミノ酸４３、４４、４５、４６、４７、１０３、１０４、１０５および１０６、ならびにＶＬ２のアミノ酸４２、４３、４４、４５、４６、９８、９９、１００および１０１が挙げられる。前述の番号付けは、ｓｃＦｖのＶＨ２およびＶＬ２のみに対する（ＢｉＳＡｂの全長配列または本明細書に提供する配列番号のアミノ酸の位置に対するものではない）位置を特定するＫａｂａｔの番号付けに基づく。システイン残基に変異させてもよいアミノ酸位置の例示的組み合わせとして、ＶＨ４４－ＶＬ１００、ＶＨ１０５－ＶＬ４３、ＶＨ１０５－ＶＬ４２、ＶＨ４４－ＶＬ１０１、ＶＨ１０６－ＶＬ４３、ＶＨ１０４－ＶＬ４３、ＶＨ４４－ＶＬ９９、ＶＨ４５－ＶＬ９８、ＶＨ４６－ＶＬ９８、ＶＨ１０３－ＶＬ４３、ＶＨ１０３－ＶＬ４４およびＶＨ１０３－ＶＬ４５が挙げられる。いくつかの態様では、ＶＨのアミノ酸４４およびＶＬのアミノ酸１００をシステインに変異させる。

単独または本明細書に記載の１つもしくは複数の他の方法と組み合わせて使用してもよい別の方法は、ｓｃＦｖの順序を選択することである。ある態様では、ＶＬドメインに対するＶＨドメインの配向を安定性のために最適化する。ある態様では、ｓｃＦｖは、ＶＨ－リンカー－ＶＬの配向である。ある態様では、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨの配向である。本明細書に開示する新規なＢｉＳＡｂフォーマットに関する実施形態において、ｓｃＦｖ内のドメインの配向は、ｓｃＦｖがＢｉＳＡｂのＦｃ部分とどのように結合するかを決定することができる。これは、ポリペプチドリンカーに関連して以下により詳細に記載する。ただし、簡単に説明すると、ＢＤ（たとえば、ｓｃＦｖ）が、任意選択的なポリペプチドリンカー（Ｌ１）および（Ｌ２）によりＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ２およびＣＨ３の境界面と相互に連結されることから、ドメインの順序は、ｓｃＦｖのいずれの部分がＬ１と相互に連結され、ｓｃＦｖのいずれの部分がＬ２と相互に連結されるかを決定する。

単独または他の方法と組み合わせて使用してもよいさらなる方法は、ｓｃＦｖの１つまたは複数の表面残基を変異させて１つまたは複数の安定化突然変異を導入することである。いくつかの態様では、ｓｃＦｖのＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインの一方または両方の１、２、３、４、５、６または６を超える残基を変異させる。ある態様では、ｓｃＦｖのＶＨドメインのみの変更を行う。ある態様では、ｓｃＦｖのＶＬドメインのみの変更を行う。ある態様では、ｓｃＦｖのＶＨドメインおよびＶＬドメインの両方の変更を行う。各ドメインに同じ数の変更を行っても、または各ドメインに異なる数の変更を行ってもよい。ある態様では、１つまたは複数の変更は、未修飾の親ｓｃＦｖに存在する残基の保存的アミノ酸置換である。他の態様では、１つまたは複数の変更は、未修飾の親ｓｃＦｖに存在する残基の非保存的アミノ酸置換である。ｓｃＦｖのＶＨドメインまたはＶＬドメインの一方または両方に複数の置換を行う場合、置換は、それぞれ独立に保存的置換または非保存的置換である。ある態様では、置換は、全て保存的置換である。ある態様では、置換は、全て非保存的である。ある態様では、置換の少なくとも１つは保存的である。ある態様では、少なくとも１つまたは置換は非保存的である。

それ自体でまたは他の方法と組み合わせて使用してもよいさらに別の方法は、ｓｃＦｖのＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインの１つまたは複数の残基を変異させて１つまたは複数のアミノ酸置換を導入して、既知の抗体のＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインのコンセンサス配列の前記特定位置で最も頻度の高い残基にマッチさせることである。ある態様では、ｓｃＦｖのＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインの一方または両方に１、２、３、４、５、６または６を超える位置で置換を導入する。各ドメインに同じ数の変更を行ってもよく、または各ドメインに異なる数の変更を行ってもよい。ある態様では、あるコンセンサス配列にマッチさせる配列の１つまたは複数の変更は、未修飾のＶＨ配列および／またはＶＬ配列に存在する残基の保存的アミノ酸置換である。他の態様では、１つまたは複数の変更は、未修飾のＶＨ配列および／またはＶＬ配列に存在する残基の非保存的アミノ酸置換である。ｓｃＦｖのＶＨドメインまたはＶＬドメインの一方または両方に複数の置換を行う場合、置換は、それぞれ独立に保存的置換または非保存的置換である。ある態様では、置換は、全て保存的置換である。ある態様では、置換は、全て非保存的置換である。ある態様では、置換の少なくとも１つは保存的である。ある態様では、少なくとも１つまたは置換は非保存的である。

ｓｃＦｖ部分の修飾または安定化に有用であると記載された修飾のいずれも、Ｆａｂ部分の修飾に適用できることに留意されたい。たとえば、ＢｉＳＡｂのＦａｂ部分の可変ドメインを修飾して、安定性、抗原結合および同種のものを向上させることができる。さらに、Ｆａｂ部分またはｓｃＦｖ部分を修飾して免疫原性を低下させることもできる。

ある態様では、結合ユニット２（ＢＤ）は、ｓｃＦｖ、たとえばグリシン－セリンリンカーなどのフレキシブルリンカーにより相互に連結された可変軽鎖（ＶＬ２）および可変重鎖（ＶＨ２）を含む通常のモノクローナル抗体に由来するｓｃＦｖである。任意選択的に、ｓｃＦｖの可変軽鎖および可変重鎖は、１つもしくは複数のジスルフィド結合を介してさらに相互に連結されていてもよく、上記のように、１つもしくは複数の突然変異または変更を含んでいてもよい。ｓｃＦｖは、第２のエピトープに結合する。ある態様では、第２のエピトープは、結合ユニット１が結合する第１のエピトープと異なる。他の態様では、第２のエピトープは、結合ユニット１が結合する第１のエピトープと同じである。ある態様では、ｓｃＦｖは、通常のマウス抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体など通常のモノクローナル抗体の配列に由来するまたは基づく。ある態様では、通常のモノクローナル抗体の配列に由来するまたは基づくｓｃＦｖを含むＢｉＳＡｂは、通常の抗体の１つまたは複数の機能活性を保持する（たとえば、機能活性の少なくとも８０％以上（８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％）を保持する）。たとえば、ある態様では、こうしたｓｃＦｖを含むＢｉＳＡｂは、通常の抗体の抗原に対する親和性、阻害活性または細胞殺傷活性の１つまたは複数を保持する。

ある態様では、ＢｉＳＡｂは、結合ユニット１および結合ユニット２の任意の組み合わせを含め、本明細書に記載の結合ユニット１および結合ユニット２のいずれかを含む。たとえば、ある態様では、本開示は、特定の標的に結合する（たとえば、特定の標的上のエピトープに結合する）Ｆａｂ、たとえば特定のアミノ酸配列を含むまたは特定のヌクレオチド配列によりコードされたＦａｂ、および／または特定の標的に結合する（たとえば、特定の標的上のエピトープに結合する）ｓｃＦｖ、たとえば特定のアミノ酸配列を含むまたは特定のヌクレオチド配列によりコードされたｓｃＦｖを含むポリペプチドを提供する。

上に詳述したように、結合ユニット１および結合ユニット２は、リンカーポリペプチド１（Ｌ１、Ｌ２）を介した共有結合によりＢｉＳＡｂと結合させてもよい。一般に、この結合は、相互の連結が重鎖Ｃ_Ｈ２ドメイン、重鎖Ｃ_Ｈ３ドメインを介するものか、または重鎖Ｃ_Ｈ２ドメインおよびＣ_Ｈ３ドメインの境界面におけるものか、またはいくつかの実施形態ではヒンジ領域もしくはＦａｂドメイン内におけるものであるようにＢｉＳＡｂのキメラ重鎖を介する。Ｌ１およびＬ２は、互いに独立に長さおよび配列が異なってもよく、例示的な構造を本明細書に記載する。本開示は、所望の標的に結合する特異的結合ユニットと本明細書に記載の特定のＬ１およびＬ２ポリペプチドリンカーとの任意の組み合わせなど結合ユニットとリンカーポリペプチドとの任意の組み合わせを含むＢｉＳＡｂを意図している。

２．Ｆｃ領域
本明細書で使用する場合、「Ｆｃ領域」は定常領域のフラグメント、アナログ、変異体、ミュータントまたは誘導体を含む、免疫グロブリン、好ましくはヒト免疫グロブリンの定常領域に由来するドメインを包含する。好適な免疫グロブリンとして、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４および他のクラス、たとえばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭが挙げられる。Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域でも、または改変したＦｃ領域でもよい。免疫グロブリンのＦｃ領域は一般に２つの定常ドメイン、Ｃ_Ｈ２ドメインおよびＣ_Ｈ３ドメインを含み、任意選択的にＣ_Ｈ４ドメインを含む。本開示のＢｉＳＡｂは、Ｌ１もしくはＬ２の一方または両方のヒンジ部分と同じクラスのＦｃドメインを含む。

ａ．改変Ｆｃ領域
本開示のＢｉＳＡｂのエフェクター機能および／または半減期を変化させるため、改変Ｆｃ領域（本明細書では「変異Ｆｃ領域」ともいう）を使用してもよい。Ｆｃ領域では、分子の機能特性および／または薬物動態特性を変化させるため、１つまたは複数の改変を行ってもよい。こうした改変の結果、ＩｇＧのＣ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、またはＦｃγＲ結合および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、または抗体依存性貪食作用（ＡＤＣＰ）が低下または増強される。本開示は、機能を増強または減弱するかまたは所望のエフェクター機能を与えることによりエフェクター機能を微調整するための変更を行ったＢｉＳＡｂを包含する。従って、本開示の一態様では、ＢｉＳＡｂは変異Ｆｃ領域（すなわち、下記で考察される改変を行ったＦｃ領域）を含む。本明細書では変異Ｆｃ領域を含むＢｉＳＡｂを「Ｆｃ変異ＢｉＳＡｂ」ともいう。本明細書で使用する場合、「天然の」とは未修飾の親配列を指し、本明細書では天然のＦｃ領域を含むＢｉＳＡｂを「天然のＦｃ ＢｉＳＡｂ」という。Ｆｃ変異ＢｉＳＡｂは、当業者によく知られている多くの方法により作製することができる。非限定的な例として、抗体コード領域の単離（たとえば、ハイブリドーマから）およびＦｃ領域における１つまたは複数の所望の置換の実施が挙げられる。あるいは、ＢｉＳＡｂの抗原結合部分（たとえば、可変領域）を、変異Ｆｃ領域をコードするベクターにサブクローニングしてもよい。一態様では、変異Ｆｃ領域は、天然のＦｃ領域と比較してエフェクター機能を誘導するレベルが同等である。別の態様では、変異Ｆｃ領域は、天然のＦｃと比較してエフェクター機能の誘導が高くなる。別の態様では、変異Ｆｃ領域は、天然のＦｃと比較してエフェクター機能の誘導が低くなる。変異Ｆｃ領域のいくつかの具体的な態様を以下に詳述する。エフェクター機能を測定する方法は、当該技術分野において周知である。

一般に、エフェクター機能は、以下に限定されるものではないが、アミノ酸置換、アミノ酸付加、アミノ酸欠失、およびＦｃアミノ酸の翻訳後修飾（たとえば、グリコシル化）における変更などＦｃ領域の変更により修飾する。下記に記載される方法を用いて、本開示のＢｉＳＡｂのエフェクター機能、ＦｃＲに対するＦｃ領域の結合性の割合（たとえば、親和性および特異性）を微調整して、所望の特性を有するＢｉＳＡｂを得てもよい。

本明細書で使用するＦｃ領域は、第１の定常領域の免疫グロブリンドメインを除く、抗体分子の定常領域を含むポリペプチドを含むことが理解されよう。このためＦｃとは、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧの最後の２つの定常領域の免疫グロブリンドメインと、ＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域の免疫グロブリンドメインと、任意選択的に、これらのドメインのフレキシブルなヒンジのＮ末端の全部または一部とを指す。ＩｇＡおよびＩｇＭの場合、ＦｃはＪ鎖を含んでいてもよい。ＩｇＧの場合、Ｆｃは免疫グロブリンドメインＣガンマ２およびＣガンマ３（Ｃγ２およびＣγ３）、および任意選択的にＣガンマ１（Ｃγ１）とＣガンマ２（Ｃγ２）との間の下方ヒンジ部分を含む。Ｆｃ領域の境界は異なってもよいが、本明細書で使用する場合、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は残基Ａ２３１からそのカルボキシル末端までを含み、番号付けはＫａｂａｔに記載されたＥＵインデックスに従う。Ｆｃとは、単離されたこの領域を指しても、または抗体、抗体フラグメントもしくはＦｃ融合タンパク質に関連してこの領域を指してもよい。多くの異なるＦｃ位置、以下に限定されるものではないが、ＥＵインデックスにより番号付けされたＩｇＧ１の２７０位、２７２位、３１２位、３１５位、３５６位および３５８位で多型が観察されており、従って本配列と従来技術の配列との間に若干の相違が存在してもよい。

一態様では、本開示は、天然のＦｃ ＢｉＳＡｂと比較してＦｃリガンド（たとえば、Ｆｃ受容体、Ｃ１ｑ）に対する結合性が改変されたＦｃ変異ＢｉＳＡｂを包含する。結合性の例として、結合特異性、平衡解離定数（Ｋ_ｄ）、解離速度および結合速度（それぞれｋ_ｏｆｆおよびｋ_ｏｎ）、結合親和性ならびに／またはアビディティーがあるが、これに限定されるものではない。平衡解離定数（Ｋ_ｄ）がｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎと定義されることは、当該技術分野において公知である。ある態様では、低Ｋ_ｄを有するＦｃ変異領域を含むＢｉＳＡｂが、高Ｋ_ｄを有するＢｉＳＡｂより望ましいことがある。しかしながら、場合によりｋ_ｏｎまたはｋ_ｏｆｆの値の方がＫ_ｄの値より重要であることもある。当業者であれば、個々の用途にいずれの速度論的パラメーターが最も重要であるかを判定することができる。たとえば、１つまたは複数のポジティブレギュレーター（たとえば、ＦｃγＲＩＩＩＡ）に対する結合を低下させる、および／または抑制性Ｆｃ受容体（たとえば、ＦｃγＲＩＩＢ）に対する結合を増強する修飾は、ＡＤＣＣ活性を低下させるのに好適であると考えられる。従って、様々な受容体に対する結合親和性の比率（たとえば、平衡解離定数（Ｋ_ｄ）の比率）から、本開示のＦｃ変異ＢｉＳＡｂのＡＤＣＣ活性が増強または低下されるかどうかが示され得る。加えて、Ｃ１ｑに対する結合を低下させる修飾も、ＣＤＣ活性を低下または除去するに好適であると考えられる。

一態様では、１つまたは複数のＦｃ受容体、以下に限定されるものではないが、ＦｃＲｎ、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）（アイソフォームＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＢおよびＦｃγＲＩＣを含む）；ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２、たとえばアイソフォームＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＣ）；およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６、たとえばアイソフォームＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢ）に対する結合親和性が、Ｆｃ変異ＢｉＳＡｂは天然のＦｃ ＢｉＳＡｂと比較して改変される。

ある態様では、Ｆｃ変異ＢｉＳＡｂはＦｃリガンドに対する親和性を高めてある。他の態様では、Ｆｃ変異ＢｉＳＡｂは、天然のＦｃ ＢｉＳＡｂと比較してＦｃリガンドに対する親和性を低下させてある。

特定の態様では、Ｆｃ変異ＢｉＳＡｂはＦｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合を増強させてある。別の特定の態様では、Ｆｃ変異ＢｉＳＡｂはＦｃ受容体ＦｃγＲＩＩＢに対する結合を増強させてある。さらなる特定の態様では、Ｆｃ変異ＢｉＳＡｂはＦｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩＡとＦｃγＲＩＩＢとの両方に対する結合を増強させてある。ある態様では、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合を増強させたＦｃ変異ＢｉＳＡｂは、天然のＦｃ ＢｉＳＡｂと比較してＦｃγＲＩＩＢ受容体に対する結合を同時に高めていない。特定の態様では、Ｆｃ変異ＢｉＳＡｂはＦｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合を低下させてある。さらなる特定の態様では、Ｆｃ変異ＢｉＳＡｂはＦｃ受容体ＦｃγＲＩＩＢに対する結合を低下させてある。別の特定の態様では、Ｆｃ変異ＢｉＳＡｂはＦｃ受容体ＦｃＲｎに対する結合を増強させてある。なお別の特定の態様では、ＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＢに対する親和性が改変されたＦｃ変異ＢｉＳＡｂは、Ｆｃ受容体ＦｃＲｎに対する結合を増強させてある。なお別の特定の態様では、ＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＢに対する親和性が改変されたＦｃ変異ＢｉＳＡｂは、天然のＦｃ ＢｉＳＡｂと比較してＣ１ｑに対する結合を改変してある。

別の態様では、Ｆｃ変異ＢｉＳＡｂは、天然のＦｃ ＢｉＳＡｂと比較してＣ１ｑに対する親和性を増加または低下させる。なお別の特定の態様では、Ｃ１ｑに対する親和性が改変されたＦｃ変異ＢｉＳＡｂは、Ｆｃ受容体ＦｃＲｎに対する結合を増強させてある。なお別の特定の態様では、Ｃ１ｑに対する親和性が改変されたＦｃ変異ＢｉＳＡｂは、天然のＦｃ ＢｉＳＡｂと比較してＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＢに対する結合を改変させてある。

抗体が当該技術分野において抗体エフェクター機能と総称される複数のプロセスにより標的抗原の攻撃および破壊を誘導することができることは認識されている。これらのプロセスの１つは、「抗体依存性細胞性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」と呼ばれ、分泌型Ｉｇが特定の細胞傷害性細胞（たとえば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）上に存在するＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に結合すると、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を有する標的細胞に特異的に結合し、その後、細胞毒で標的細胞を殺傷することができるようになる細胞毒性の形態を指す。標的細胞の表面に対して特異的な高親和性ＩｇＧ抗体は細胞傷害性細胞を「武装」させるものであり、こうした殺傷に必須である。標的細胞の溶解は細胞外で行われ、細胞間の直接的な接触を必要とするが、補体を必要としない。エフェクター機能という用語により包含されるもう１つのプロセスは、補体依存性細胞傷害（以下「ＣＤＣ」という）であり、これは、抗体を介して補体系により標的細胞を破壊する生化学的現象を指す。補体系は、抗体と組み合わさって病原菌および他の外来細胞を破壊する、通常の血漿で見られる複雑なタンパク質の系である。エフェクター機能という用語に包含されるさらに別のプロセスは抗体依存性貪食作用（ＡＤＣＰ）であり、これは、１つまたは複数のエフェクターリガンドを発現する非特異的な細胞傷害性細胞が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後、標的細胞の貪食作用を引き起こす細胞性反応を指す。

Ｆｃ変異ＢｉＳＡｂは、１つまたは複数のＦｃγＲを介したエフェクター細胞の機能に関するインビトロ機能アッセイにより特徴付けられることを意図している。ある態様では、Ｆｃ変異ＢｉＳＡｂは、インビボモデルにおいてインビトロ系アッセイと同様の結合性およびエフェクター細胞機能（本明細書に記載および開示されたものなど）を有する。しかしながら、本開示は、インビトロ系アッセイで所望の表現型を示さないが、インビボでは所望の表現型を示すＦｃ変異ＢｉＳＡｂを除外するものではない。

Ｆｃ領域を含むタンパク質の血清中半減期は、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合親和性を高めることにより延長することができる。「抗体半減期」という用語は、本明細書で使用する場合、投与後の抗体分子の平均生存時間の指標である抗体の薬物動態特性を意味する。抗体半減期は、既知量の免疫グロブリンの５０パーセントを患者の体内（または他の哺乳動物）またはその特定のコンパートメントから除去するのに要する時間を、たとえば血清中で見て（すなわち、血中半減期）または他の組織で見て表すことができる。半減期は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンのクラスによって異なってもよい。一般に、抗体（またはＢｉＳＡｂ）半減期を延長すると、投与されたＢｉＳＡｂの循環血中の平均滞留時間（ＭＲＴ）が長くなる。

半減期を延長すると、患者に投与される薬剤量が減少するほか、投与頻度も低下し得る。ＢｉＳＡｂの血清半減期を延長するには、たとえば米国特許第５，７３９，２７７号明細書に記載されているようなサルベージ受容体結合エピトープをＢｉＳＡｂ（特に抗体フラグメント）に組み込んでもよい。本明細書で使用する場合、「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のインビボでの血清中半減期に関わる、ＩｇＧ分子（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す。あるいは、半減期の延長された本開示のＢｉＳＡｂは、ＦｃとＦｃＲｎ受容体との間の相互作用に関与することが確認されたアミノ酸残基を修飾することにより作製してもよい（たとえば、米国特許第６，８２１，５０５号明細書および同第７，０８３，７８４号明細書を参照されたい）。さらに、本開示のＢｉＳＡｂの半減期は、当該技術分野において広く利用される技術によりＰＥＧまたはアルブミンへのコンジュゲーションによって延長してもよい。

本明細書に記載のようなＦｃ領域中への別の結合ドメインの挿入および／または抗原による後の結合のいずれもＦｃ活性に影響を及ぼし得ることが考慮される。たとえば、結合抗原は、ＦｃｇＲ、Ｃｌｑ、およびＦｃＲｎに対する結合親和性および活性を増大または低減し得る。これは、様々な抗体依存的プロセスをモジュレートするための抗原依存的スイッチを形成し得る。一態様では、抗原結合は、ＦｃＲｎとの相互作用を低減して、自由ＢｉＳＡｂがＦｃＲｎと相互作用して、正常な半減期を有するようにし得るが、ＢｉＳＡｂ－Ａｇ複合体の迅速なクリアランス／細胞内在化を可能にする。さらに、これにより、ＢＤ２－抗原媒介性相互作用が、ＢＤ１と結合した抗原のクリアランスに影響を与えるようにすることができる。別の態様では、ＢｉＳＡｂは、ＢＤ２に直接挿入されたＦｃ領域（Ｆｃ－ＢＤ２）を含むことができる。

一態様では、本開示は、Ｆｃ領域がＫａｂａｔに記載されたＥＵインデックスにより番号付けされた２２１、２２５、２２８、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２５０、２５１、２５２、２５４、２５５、２５６、２５７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７９、２８０、２８４、２９２、２９６、２９７、２９８、２９９、３０５、３０８、３１３、３１６、３１８、３２０、３２２、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３９、３４１、３４３、３７０、３７３、３７８、３９２、４１６、４１９、４２１、４２８、４３３、４３４、４３５、４３６、４４０および４４３からなる群から選択される１つまたは複数の位置に修飾（たとえば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）を含む、Ｆｃ変異体を提供する。任意選択的に、Ｆｃ領域は、当業者に公知の追加および／または代わりの位置に修飾を含んでよい（たとえば、米国特許第５，６２４，８２１号明細書；同第６，２７７，３７５号明細書；同第６，７３７，０５６号明細書；同第７，０８３，７８４号明細書；同第７，３１７，０９１号明細書；同第７，２１７，７９７号明細書；同第７，２７６，５８５号明細書；同第７，３５５，００８号明細書を参照されたい）。さらに、有用なアミノ酸位置および具体的な置換については、米国特許第６，７３７，０５６号明細書の表２および６～１０；米国特許出願公開第２００６／０２４２９８号明細書の図４１に示される表；米国特許出願公開第２００６／２３５２０８号明細書の図５、１２および１５に示される表；米国特許出願公開第２００６／０１７３１７０号明細書の図８、９および１０に示される表および国際公開第０９／０５８４９２号パンフレットの図８～１０、１３および１４に示される表に例示されている。

特定の態様では、本開示は、Ｆｃ領域がＫａｂａｔに記載されたＥＵインデックスにより番号付けされた２２１Ｋ、２２１Ｙ、２２５Ｅ、２２５Ｋ、２２５Ｗ、２２８Ｐ、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｎ、２３４Ｑ、２３４Ｔ、２３４Ｈ、２３４Ｙ、２３４Ｉ、２３４Ｖ、２３４Ｆ、２３５Ａ、２３５Ｄ、２３５Ｒ、２３５Ｗ、２３５Ｐ、２３５Ｓ、２３５Ｎ、２３５Ｑ、２３５Ｔ、２３５Ｈ、２３５Ｙ、２３５Ｉ、２３５Ｖ、２３５Ｅ、２３５Ｆ、２３６Ｅ、２３７Ｌ、２３７Ｍ、２３７Ｐ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２３９Ｎ、２３９Ｑ、２３９Ｆ、２３９Ｔ、２３９Ｈ、２３９Ｙ、２４０Ｉ、２４０Ａ、２４０Ｔ、２４０Ｍ、２４１Ｗ、２４１Ｌ、２４１Ｙ、２４１Ｅ、２４１Ｒ、２４３Ｗ、２４３Ｌ、２４３Ｙ、２４３Ｒ、２４３Ｑ、２４４Ｈ、２４５Ａ、２４７Ｌ、２４７Ｖ、２４７Ｇ、２５０Ｅ、２５０Ｑ、２５１Ｆ、２５２Ｌ、２５２Ｙ、２５４Ｓ、２５４Ｔ、２５５Ｌ、２５６Ｅ、２５６Ｆ、２５６Ｍ、２５７Ｃ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２６２Ｉ、２６２Ａ、２６２Ｔ、２６２Ｅ、２６３Ｉ、２６３Ａ、２６３Ｔ、２６３Ｍ、２６４Ｌ、２６４Ｉ、２６４Ｗ、２６４Ｔ、２６４Ｒ、２６４Ｆ、２６４Ｍ、２６４Ｙ、２６４Ｅ、２６５Ａ、２６５Ｇ、２６５Ｎ、２６５Ｑ、２６５Ｙ、２６５Ｆ、２６５Ｖ、２６５Ｉ、２６５Ｌ、２６５Ｈ、２６５Ｔ、２６６Ｉ、２６６Ａ、２６６Ｔ、２６６Ｍ、２６７Ｑ、２６７Ｌ、２６８Ｅ、２６９Ｈ、２６９Ｙ、２６９Ｆ、２６９Ｒ、２７０Ｅ、２８０Ａ、２８４Ｍ、２９２Ｐ、２９２Ｌ、２９６Ｅ、２９６Ｑ、２９６Ｄ、２９６Ｎ、２９６Ｓ、２９６Ｔ、２９６Ｌ、２９６Ｉ、２９６Ｈ、２９６Ｇ、２９７Ｓ、２９７Ｄ、２９７Ｅ、２９８Ａ、２９８Ｈ、２９８Ｉ、２９８Ｔ、２９８Ｆ、２９９Ｉ、２９９Ｌ、２９９Ａ、２９９Ｓ、２９９Ｖ、２９９Ｈ、２９９Ｆ、２９９Ｅ、３０５Ｉ、３０８Ｆ、３１３Ｆ、３１６Ｄ、３１８Ａ、３１８Ｓ、３２０Ａ、３２０Ｓ、３２２Ａ、３２２Ｓ、３２５Ｑ、３２５Ｌ、３２５Ｉ、３２５Ｄ、３２５Ｅ、３２５Ａ、３２５Ｔ、３２５Ｖ、３２５Ｈ、３２６Ａ、３２６Ｄ、３２６Ｅ、３２６Ｇ、３２６Ｍ、３２６Ｖ、３２７Ｇ、３２７Ｗ、３２７Ｎ、３２７Ｌ、３２８Ｓ、３２８Ｍ、３２８Ｄ、３２８Ｅ、３２８Ｎ、３２８Ｑ、３２８Ｆ、３２８Ｉ、３２８Ｖ、３２８Ｔ、３２８Ｈ、３２８Ａ、３２９Ｆ、３２９Ｈ、３２９Ｑ、３３０Ｋ、３３０Ｇ、３３０Ｔ、３３０Ｃ、３３０Ｌ、３３０Ｙ、３３０Ｖ、３３０Ｉ、３３０Ｆ、３３０Ｒ、３３０Ｈ、３３１Ｇ、３３１Ａ、３３１Ｌ、３３１Ｍ、３３１Ｆ、３３１Ｗ、３３１Ｋ、３３１Ｑ、３３１Ｅ、３３１Ｓ、３３１Ｖ、３３１Ｉ、３３１Ｃ、３３１Ｙ、３３１Ｈ、３３１Ｒ、３３１Ｎ、３３１Ｄ、３３１Ｔ、３３２Ｄ、３３２Ｓ、３３２Ｗ、３３２Ｆ、３３２Ｅ、３３２Ｎ、３３２Ｑ、３３２Ｔ、３３２Ｈ、３３２Ｙ、３３２Ａ、３３３Ａ、３３３Ｄ、３３３Ｇ、３３３Ｑ、３３３Ｓ、３３３Ｖ、３３４Ａ、３３４Ｅ、３３４Ｈ、３３４Ｌ、３３４Ｍ、３３４Ｑ、３３４Ｖ、３３４Ｙ、３３９Ｔ、３７０Ｅ、３７０Ｎ、３７８Ｄ、３９２Ｔ、３９６Ｌ、４１６Ｇ、４１９Ｈ、４２１Ｋ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、４３３Ｋ、４３３Ｌ、４３４Ａ、４２４Ｆ、４３４Ｗ、４３４Ｙ、４３６Ｈ、４４０Ｙおよび４４３Ｗからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含む、Ｆｃ変異体を提供する。任意選択的に、Ｆｃ領域は、当業者に公知の追加および／または代わりのアミノ酸置換、以下に限定されるものではないが、その全てが参照により本明細書に援用される米国特許第６，７３７，０５６号明細書の表２および６～１０；米国特許出願公開第２００６／０２４２９８号明細書の図４１に示される表；米国特許出願公開第２００６／２３５２０８号明細書の図５、１２および１５に示される表；米国特許出願公開第２００６／０１７３１７０号明細書の図８、９および１０に示される表および米国特許出願公開第２００９００４１７７０号明細書の図８、９および１０に示される表に例示されているものを含んでもよい。

特定の態様では、本開示は、Ｆｃ領域がＫａｂａｔに記載されたＥＵインデックスにより番号付けされた２２８、２３４、２３５および３３１からなる群から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの修飾（たとえば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）を含む、Ｆｃ変異ＢｉＳＡｂを提供する。一態様では、修飾は、Ｋａｂａｔに記載されたＥＵインデックスにより番号付けされた２２８Ｐ、２３４Ｆ、２３５Ｅ、２３５Ｆ、２３５Ｙおよび３３１Ｓからなる群から選択される少なくとも１つの置換である。

別の特定の態様では、本開示は、Ｆｃ領域がＩｇＧ４のＦｃ領域であり、Ｋａｂａｔに記載されたＥＵインデックスにより番号付けされた２２８および２３５からなる群から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの修飾を含む、Ｆｃ変異ＢｉＳＡｂを提供する。なお別の特定の態様では、Ｆｃ領域はＩｇＧ４のＦｃ領域であり、非天然のアミノ酸は、Ｋａｂａｔに記載されたＥＵインデックスにより番号付けされた２２８Ｐ、２３５Ｅおよび２３５Ｙからなる群から選択される。

別の特定の態様では、本開示は、Ｆｃ領域がＫａｂａｔに記載されたＥＵインデックスにより番号付けされた２３９、３３０および３３２からなる群から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの非天然のアミノ酸を含む、Ｆｃ変異ＢｉＳＡｂを提供する。一態様では、修飾は、Ｋａｂａｔに記載されたＥＵインデックスにより番号付けされた２３９Ｄ、３３０Ｌ、３３０Ｙおよび３３２Ｅからなる群から選択された少なくとも１つの置換である。本明細書にその全体を援用する米国特許第７，３１７，０９１号明細書を参照されたい。

特定の態様では、本開示は、Ｆｃ領域がＫａｂａｔに記載されたＥＵインデックスにより番号付けされた２５２、２５４および２５６からなる群から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの非天然のアミノ酸を含む、Ｆｃ変異ＢｉＳＡｂを提供する。一態様では、修飾は、Ｋａｂａｔに記載されたＥＵインデックスにより番号付けされた２５２Ｙ、２５４Ｔおよび２５６Ｅからなる群から選択される少なくとも１つの置換である。その全体を本明細書に援用する米国特許第７，０８３，７８４号明細書を参照されたい。

ある態様では、本開示は、Ｆｃ領域がＫａｂａｔに記載されたＥＵインデックスにより番号付けされた４２８位に非天然のアミノ酸を含む、Ｆｃ変異ＢｉＳＡｂを提供する。一態様では、４２８位の修飾は、Ｋａｂａｔに記載されたＥＵインデックスにより番号付けされた４２８Ｔ、４２８Ｌ、４２８Ｆおよび４２８Ｓからなる群から選択される。その全体を本明細書に援用する米国特許第７，６７０，６００号明細書を参照されたい。別の態様では、Ｆｃ変異ＢｉＳＡｂは、Ｋａｂａｔに記載されたＥＵインデックスにより番号付けされた４３４位に非天然のアミノ酸をさらに含んでもよい。一態様では、４３４の修飾は、Ｋａｂａｔに記載されたＥＵインデックスにより番号付けされた４３４Ａ、４３４Ｓおよび４３４Ｆからなる群から選択される。他の態様では、本開示は、Ｆｃ領域がＫａｂａｔに記載されたＥＵインデックスにより番号付けされた４２８位および４３４位に非天然のアミノ酸を含む、Ｆｃ変異ＢｉＳＡｂを提供する。特定の態様では、Ｆｃ領域は４２８Ｌ、４３４Ｓを含む。米国特許第８，０８８，３７６号明細書を参照されたい。

ある態様では、ＩｇＧ抗体により誘発されるエフェクター機能は、タンパク質のＦｃ領域に結合した糖部分に強く依存する（Ｃｌａｕｄｉａ Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９３：８５１－８６１）。従って、Ｆｃ領域にグリコシル化修飾を行ってエフェクター機能を増強または低下させることができる（たとえば、Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ，１９９９，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：１７６－１８０；Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ７４：２８８－２９４；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ，２００２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２６７３３－２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３４６６－３４７３；米国特許第６，６０２，６８４号明細書；同第６，９４６，２９２号明細書；同第７，０６４，１９１号明細書；同第７，２１４，７７５号明細書；同第７，３９３，６８３号明細書；同第７，４２５，４４６号明細書；同第７，５０４，２５６号明細書；ＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ（商標）技術（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）；ＧＬＹＣＯＭＡＢ（商標）グリコシル化工学技術（ＧＬＹＣＡＲＴ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を参照されたい）。従って、一態様では、本開示のＢｉＳＡｂのＦｃ領域はアミノ酸残基の変化したグリコシル化を含む。別の態様では、アミノ酸残基のグリコシル化を変化させた結果、エフェクター機能が低下する。別の態様では、アミノ酸残基のグリコシル化を変化させた結果、エフェクター機能が増強される。特定の態様では、Ｆｃ領域はフコシル化を抑制する。別の態様では、Ｆｃ領域を低フコース化する（たとえば、米国特許出願公開第２００５／０２２６８６７号明細書を参照されたい）。一態様では、エフェクター機能、特にＡＤＣＣを増強したこうしたＢｉＳＡｂを、親細胞により産生されるポリペプチドと比較して１００倍を超えるＡＤＣＣを有する、高度にフコースを除去したポリペプチドを産生するように操作された宿主細胞（たとえば、ＣＨＯ細胞、コウキクサ（Ｌｅｍｎａ ｍｉｎｏｒ））に発現させる（Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８８：９０１－９０８；Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２４：１５９１－７）。

ＩｇＧ分子上のオリゴ糖にシアル酸を付加すると、その抗炎症活性を増強し、その細胞毒性を変化させることができる（Ｋｅｎｅｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，３１３：６７０－６７３；Ｓｃａｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏ．２００７ Ｍａｒ；４４（７）：１５２４－３４）。上記の研究から、シアリル化を増加させたＩｇＧ分子は抗炎症性を有する一方、シアリル化を低下させたＩｇＧ分子は免疫賦活性を増強する（たとえば、ＡＤＣＣ活性を増強する）ことが立証される。従って、ＢｉＳＡｂは、特定の用途に適切なシアリル化プロファイルで修飾してもよい（米国特許出願公開第２００９／０００４１７９号明細書および国際公開第２００７／００５７８６号パンフレット）。

一態様では、本開示のＢｉＳＡｂのＦｃ領域は、天然のＦｃ領域と比較して改変されたシアリル化プロファイルを含む。一態様では、本開示のＢｉＳＡｂのＦｃ領域は、天然のＦｃ領域と比較して増加したシアリル化プロファイルを含む。別の態様では、本開示のＢｉＳＡｂのＦｃ領域は、天然のＦｃ領域と比較して減少したシアリル化プロファイルを含む。

一態様では、本開示のＦｃ変異体は、他の既知のＦｃ変異体、たとえばＧｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：６３７－４０；Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：５６３－５６４；Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４７：２６５７－２６６２；Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ，１９９２，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２９：５３－５９；Ａｌｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５７：１５３７－１５４３；Ｈｕｔｃｈｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９２：１１９８０－１１９８４；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ，１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ．４４：１１１－１１７；Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｆａｓｅｂ Ｊ ９：１１５－１１９；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ，１９９６，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ５４：１０１－１０４；Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ，１９９６，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５７：４９６３－４９６９；Ａｒｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２９：２６１３－２６２４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ，２０００，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：４１７８－４１８４；Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ，２０００，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：１９２５－１９３３；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００：１６－２６；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６：２５７１－２５７５；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：６５９１－６６０４；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８２：５７－６５；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ３０：４８７－４９０）；米国特許第５，６２４，８２１号明細書；同第５，８８５，５７３号明細書；同第５，６７７，４２５号明細書；同第６，１６５，７４５号明細書；同第６，２７７，３７５号明細書；同第５，８６９，０４６号明細書；同第６，１２１，０２２号明細書；同第５，６２４，８２１号明細書；同第５，６４８，２６０号明細書；同第６，５２８，６２４号明細書；同第６，１９４，５５１号明細書；同第６，７３７，０５６号明細書；同第７，１２２，６３７号明細書；同第７，１８３，３８７号明細書；同第７，３３２，５８１号明細書；同第７，３３５，７４２号明細書；同第７，３７１，８２６号明細書；同第６，８２１，５０５号明細書；同第６，１８０，３７７号明細書；同第７，３１７，０９１号明細書；同第７，３５５，００８号明細書に開示されたものと組み合わせてもよい。Ｆｃドメインの他の修飾および／または置換および／または付加および／または欠失も当業者に容易に明らかになるであろう。

天然のＦｃを含むＢｉＳＡｂフォーマットに示されたポリペプチドは、例に示すように、ＦｃＲｎおよびＣ１ｑに結合してＡＤＣＣを媒介する能力を保持している点に留意されたい。このためある態様では、ＢｉＳＡｂは、ＦｃＲｎおよび／またはＣ１ｑおよび／または１つまたは複数のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に結合する能力を保持している。たとえば、ある態様では、ＢｉＳＡｂはＢｉＳＡｂが結合するエピトープの１つに結合する通常の抗体と比較して、ＦｃＲｎおよび／またはＣ１ｑおよび／または１つまたは複数のＦｃγＲに結合する能力を少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％保持する。ある態様では、ＢｉＳＡｂは１つまたは２つの通常の抗体の結合ドメインから作製され、これらの通常の抗体の一方または両方と活性の比較が行われる。

また、改変されたＦｃ領域を使用して重鎖ヘテロ２量体を作製し、２つの異なる重鎖－軽鎖対を含むＢｉＳＡｂを得てもよい。ヘテロ２量体を形成しやすくするには、一対のＦｃ領域間の境界面を操作して、組換え細胞培養から回収されるヘテロ２量体の割合を最大にする。ある態様では、境界面はＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の境界面の１つまたは複数の小さいアミノ酸側鎖を、より大きい側鎖（たとえば、チロシンまたはトリプトファン）で置換することにより「突起」が生じる。大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（たとえば、アラニンまたはトレオニン）で置換することにより、大きい側鎖と同一または類似の大きさの「空洞」が代償として第２の抗体分子の境界面に形成される。これが、ヘテロ２量体の収率をホモ２量体など他の望ましくない最終産物より高めるメカニズムとなる。ＣＨ３の修飾としては、たとえば、一方の重鎖のＹ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａおよび他方の重鎖のＴ３６６Ｗ；一方の重鎖のＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗおよび他方の重鎖のＹ３４９Ｃ／Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａが挙げられる。一方の鎖に突起を、そして他方の鎖に空洞を与える別の修飾については、米国特許第７，１８３，０７６号明細書；米国特許出願公開第２０１４／０３４８８３９号明細書；およびＭｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ １６：６７７－６８１に記載されている。突起－空洞構成を生じ得る修飾のいくつかの非限定的な例を表１ａに示す。ヘテロ２量体を形成するのに使用することができる他の修飾には、静電気的に一致するＦｃ領域が共発現するとヘテロ２量化が起こるように、Ｆｃ２量体の境界面両端の電荷極性を変化させる修飾があるが、これに限定されるものではない。電荷極性を変化させる修飾には、下記表１ｂに示したものがあるが、これに限定されるものではない（さらに国際公開第２００９０１８２１２７号パンフレット；Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，ＪＢＣ ２８５：１９６３７－４６も参照されたい）。さらに、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１０，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２３：１９５－２０２）は、ヒトＩｇＧドメインおよびＩｇＡ ＣＨ３ドメインの誘導体である鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ：ｓｔｒａｎｄ－ｅｘｃｈａｎｇｅｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｄｏｍａｉｎ）ＣＨ３領域を用いたヘテロ２量体のＦｃプラットフォームについて記載している（さらに、国際公開第２００７／１１０２０５号パンフレットも参照されたい）。

当業者は、いくつかの態様では、Ｆｃ融合タンパク質が、Ｆｃ領域を含む分子のホモ２量体性のために２量体を形成し得ることを理解されよう。いくつかの態様では、結合タンパク質（たとえば、ＢｉＳＡｂ）のＦｃ領域に対して、ヘテロ２量体化を促進および／または維持するための突然変異（たとえば、キメラ突然変異、相補的突然変異、ドック・アンド・ロック突然変異、ノブ・イントゥ・ホール突然変異、鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）突然変異などを用いた異なる操作を実施してもよく、たとえば、米国特許第７，１８３，０７６号明細書；Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ １６：６７７－６８１；Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９：６１７－６２１；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２３：１９５－２０２；国際公開第２００７／１１０２０５号パンフレット；国際公開第２００７／１４７９０１号パンフレット；Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＪＢＣ ２８５：１９６３７－４６を参照されたい。これらの全ては、参照により本明細書に援用される）。従って、結合タンパク質を操作して、たとえば、第１の結合タンパク質、結合ドメイン、または第１のＦｃ領域もしくはそのフラグメントと融合したＢｉＳＡｂ、および第２の（すなわち、異なる）結合タンパク質、結合ドメイン、または第２のＦｃ領域もしくはそのフラグメントと融合したＢｉＳＡｂを含むヘテロ２量体を形成することができ、ここで、第１および第２のＦｃ領域、またはそのフラグメントは、ヘテロ２量体化するように操作されている。

３．グリコシル化
グリコシル化によりポリペプチドのエフェクター機能を変化させられるだけでなく、可変領域のグリコシル化修飾により、標的抗原に対する抗体（またはＢｉＳＡｂ）の親和性も変化させることができる。一態様では、本ＢｉＳＡｂの可変領域のグリコシル化パターンを修飾する。たとえば、非グリコシル化ＢｉＳＡｂを作製してもよい（すなわち、ＢｉＳＡｂはグリコシル化を欠損している）。グリコシル化は、たとえば、標的抗原に対するＢｉＳＡｂの親和性を高めるように改変することができる。こうした糖鎖修飾は、たとえば、ＢｉＳＡｂ配列内の１つまたは複数のグリコシル化部位を変化させることにより達成することができる。たとえば、１つまたは複数の可変領域フレームワークのグリコシル化部位を除去し、それによりその部位のグリコシル化を除去する１つまたは複数のアミノ酸置換を行ってもよい。こうした非グリコシル化は、抗原に対するＢｉＳＡｂの親和性を高めることができる。こうしたアプローチについては、米国特許第５，７１４，３５０号明細書および同第６，３５０，８６１号明細書にさらに詳細に記載されている。また、Ｆｃ領域に存在するグリコシル化部位（たとえば、ＩｇＧのアスパラギン２９７）を除去する１つまたは複数のアミノ酸置換を行ってもよい。さらに、非グリコシル化ＢｉＳＡｂは、必要なグリコシル化機構を欠損する細菌細胞を用いて作製してもよい。

４．ポリペプチドリンカー
リンカーは、ＢｉＳＡｂキメラ重鎖のドメイン／領域を近接する分子に連結するのに使用することができる。本明細書に記載のように、ＢｉＳＡｂは、１つ、２つ、またはそれを超えるリンカーポリペプチド（たとえば、Ｌ１およびＬ２）を含むことができる。加えて、ＢｉＳＡｂは、別のリンカー、たとえばｓｃＦｖの可変重鎖および軽鎖を相互に連結するフレキシブルリンカーを含んでもよい。さらに、ＢｉＳＡｂは、別のリンカー、たとえばｓｃＦｖの可変重鎖および軽鎖を相互に連結するフレキシブルリンカーと、他の結合ユニットをＢｉＳＡｂコア構造に連結する他のリンカーとを含んでもよい。

リンカーの例示的かつ非限定的な例として、少なくとも４つの残基を含むポリペプチド鎖がある。こうしたリンカーの一部は、フレキシブルであり、親水性であり、さらにそれ自体の二次構造（リンカー部分またはフレキシブルリンカー部分）をほとんどまたはまったく有さなくてもよい。少なくとも４つのアミノ酸のリンカーは、分子が集合した後、近傍に位置するドメインおよび／または領域を相互に連結するのに使用してもよい。また、より長いまたはより短いリンカーを使用してもよい。このため、リンカーは約１残基、２残基、３残基、４残基、５残基、６残基、７残基、８残基、９残基、１０残基、１１残基、１２残基、１３残基、１４残基、１５残基、１６残基、１７残基、１８残基、１９残基、２０残基、２５残基、３０残基、３５残基、４０残基、４５残基、または約５０残基の長さでもよい。分子の一部を相互に連結するため複数のリンカーを使用する場合、リンカーは同一でもまたは異なっていてもよい（たとえば、長さおよび／またはアミノ酸配列が同一または異なる）。

リンカーは、切断試薬により選択的に切断される少なくとも１つの結合を含む切断可能なリンカーであってもよい。切断可能なリンカーを使用して、リンカー配列の全部または一部を除去しやすくしてもよい。リンカーは、リンカーの内部またはリンカーの少なくとも１つの末端で切断が起こるように、プロテアーゼ切断部位を含むように操作してもよい。たとえば、リンカーの両側の２つの末端各々にトロンビン部位を操作してもよい。また、使用するリンカーの種類に応じて、ＴＣＥＰ、ＴＦＡおよびＤＴＴなど薬により切断を媒介してもよい。リンカーは、切断試薬が切断産物からリンカー由来の残基を全て除去するように設計してもよい。他の例示的かつ非限定的なリンカーとして、インビボ条件下で、たとえば、内在性酵素もしくは他の内在性因子の存在下で、または単に体内に存在する水性液体内もしくは体内の細胞内で結合が選択的に切断され得るプロドラッグリンカーが挙げられる。ＢｉＳＡｂが２つ以上のポリペプチドリンカーを含む場合、リンカーは、それぞれ異なっていてもよく、またはリンカーの少なくとも１つが他と異なっていてもよい。いくつかの態様では、ＢｉＳＡｂは切断可能なリンカーを含む。特定の態様では、ＢｉＳＡｂは、ＶＨ２とＶＬ２との間に切断可能なリンカーを含むｓｃＦｖを含む。

リンカーは所望の構造の形成を容易にする。リンカーは（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）_ｎ残基を含み、溶解性を高めるため、Ｇｌｕ残基またはＬｙｓ残基がある程度全体に分散していてもよい。その代わりにまたはそれに加えて、リンカーはセリン残基をまったく含んでおらず、こうしたリンカーは、リンカーがＯ－結合型グリコシ化を受ける場合に好ましいことがある。いくつかの態様では、たとえば、リンカーの２量体化を使用してＢｉＳＡｂのドメインをドメインが適切に折りたたまれた構造にする場合、リンカーは、システイン残基を含んでもよい。いくつかの態様では、ＢｉＳＡｂは、ポリペプチドのドメインを連結する少なくとも２つのポリペプチドリンカーを含む。他の態様では、ＢｉＳＡｂは少なくとも３つのポリペプチドリンカーを含む。他の態様では、ＢｉＳＡｂは４つ以上のポリペプチドリンカーを含む。

いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーはＦｃ部分の一部を含む。たとえば、いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーはＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体および／またはＩｇＧ４抗体の免疫グロブリンヒンジドメインの一部を含んでもよい。いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３および／またはＩｇＧ４の突然変異免疫グロブリンヒンジドメインの一部を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーは、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体および／またはＩｇＧ４抗体の免疫グロブリンヒンジ領域／ドメインの少なくとも５アミノ酸残基、７アミノ酸残基、８アミノ酸残基または１５アミノ酸残基を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーは、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体および／またはＩｇＧ４抗体の修飾免疫グロブリンヒンジ領域／ドメインの少なくとも５アミノ酸残基、７アミノ酸残基、８アミノ酸残基または１５アミノ酸残基を含む。

ポリペプチドリンカーは、３つのシステインを天然に含むヒンジ領域の全部または一部を含んでもよい。ある態様では、完全なおよび／または天然のヒンジ領域に対してシステイン残基の１つまたは２つのみが残るように、選択されたヒンジ領域を切断するか、または他の方法で改変もしくは置換する。同様に、ある種の他の態様では、ポリペプチドリンカーは、システイン残基の数がアミノ酸の置換または欠失により減少しているヒンジ領域の突然変異部分または他の方法で改変された部分を含んでもよく、たとえば突然変異ヒンジ領域または他の方法で改変されたヒンジ領域は、本明細書に記載するように０、１つまたは２つのシステイン残基を含む。

従って、突然変異ヒンジドメインまたは他の方法で改変されたヒンジドメインは、１つまたは複数のシステイン残基を含む野生型免疫グロブリンヒンジドメインに由来しても、または（それを用いて）構築してもよい。ある態様では、ヒンジ領域の突然変異部分または他の方法で改変された部分はシステイン残基を含まなくても、またはシステイン残基を１つのみ含んでもよく、突然変異ヒンジ領域または他の方法で改変されたヒンジ領域は、それぞれ１つ以上のシステイン残基または２つ以上のシステイン残基を含む、野生型免疫グロブリンヒンジ領域であるか、またはそれに由来している。ヒンジ領域の突然変異部分または他の方法で改変された部分では、野生型免疫グロブリンヒンジ領域のシステイン残基は、好ましくは欠失している、またはジスルフィド結合を形成できないアミノ酸で置換されている。いくつかの態様では、ヒンジ領域の突然変異部分または他の方法で改変された部分は、４つのヒトＩｇＧアイソタイプサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のいずれを含んでもよいヒトＩｇＧ野生型ヒンジ領域であるか、またはそれに由来している。

いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーは、免疫グロブリン軽鎖とジスルフィド結合を形成するシステイン残基（ＥＵ残基２２０）を含むヒンジ領域の一部を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーは、ＥＵ残基Ｃ２２０にアミノ酸置換を含むヒンジ領域の改変された部分を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーは、アミノ酸置換Ｃ２２０Ｖを含む。

いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーは、ヒンジ関連の自発的自己切断を防止するアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーは、ＥＵ位置Ｄ２２１の位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーはアミノ酸置換Ｄ２２１Ｇを含む。いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーはアミノ酸Ｄ２２１を欠損している。

前述したように、いくつかの実施形態は、ｇｌｙ－ｓｅｒリンカーを含むか、またはｇｌｙ－ｓｅｒリンカーからなる１つまたは複数のポリペプチドリンカーを含む。本明細書で使用する場合、「ｇｌｙ－ｓｅｒリンカー」という用語は、グリシン残基およびセリン残基からなるペプチドを指す。例示的ｇｌｙ－ｓｅｒリンカーは、式（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ｎのアミノ酸配列を含み、式中、ｎは、正の整数（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）である。ｇｌｙ－ｓｅｒリンカーのいくつかの好ましい非限定的な例として、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_２（配列番号４１）および（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_４、（配列番号４２）、ならびに（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３（配列番号４３）が挙げられる。なお他の態様では、ポリペプチドリンカーに２つ以上のｇｌｙ－ｓｅｒリンカーを直列に組み込む。いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーは、ヒンジ領域（たとえば、ＩｇＧ１分子、ＩｇＧ２分子、ＩｇＧ３分子またはＩｇＧ４分子に由来する）の少なくとも１部分、および一連のｇｌｙ－ｓｅｒアミノ酸残基（たとえば、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは、２、３、または４である）などのｇｌｙ－ｓｅｒリンカー）を含む。

ある態様では、リンカー（たとえば、Ｌ１および／またはＬ２および／またはＬ３など）は、ヒンジ部分およびリンカー部分、たとえばｇｌｙ－ｓｅｒリンカーを含むリンカー部分の両方を含む。他の態様では、Ｌ１および／またはＬ２は、ヒンジ部分のみ、またはリンカー部分のみ、たとえばｇｌｙ－ｓｅｒリンカーのみを含む。他の態様では、Ｌ１およびＬ２は、ｇｌｙ－ｓｅｒリンカー部分を含む。ある態様では、ＢｉＳＡｂ内のｇｌｙ－ｓｅｒリンカーは同じ長さであるのに対し、他の態様では、ＢｉＳＡｂ（たとえば、Ｌ１およびＬ２）内のｇｌｙ－ｓｅｒリンカー部分は異なる長さである。ＢｉＳＡｂがｓｃＦｖを含む場合、ｓｃＦｖの重鎖および軽鎖は、フレキシブルリンカーによりＢｉＳＡｂ（たとえば、ＢＤ１、Ｆａｂ、Ｆｃなど）に連結されていてもよい。このフレキシブルリンカーは、一般にヒンジ部分を含まず、むしろｇｌｙ－ｓｅｒリンカーまたは他のフレキシブルリンカーである。ｓｃＦｖのドメインを相互に連結するフレキシブルリンカーの長さおよびアミノ酸配列は、容易に選択しかつ最適化することができる（たとえば、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ｎ、（配列番号４８）、式中、ｎは、２、３、または４以上である）。

様々な結合ユニットおよびドメイン（たとえば、結合ドメイン／ユニット（たとえば、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ）、または結合ドメイン／ユニットをＦｃ（たとえば、Ｌ１およびＬ２を介してｓｃＦｖ）に相互に連結するのに使用するポリペプチドリンカーとは無関係に、ＢｉＳＡｂは、任意選択的に、追加のポリペプチドリンカーを含んでもよい。そうした追加のポリペプチドリンカーの長さおよび配列は独立に選択される。たとえば、ＢｉＳＡｂは、ｓｃＦｖの可変重鎖および軽鎖を相互に連結するフレキシブルなポリペプチドリンカーをさらに含んでもよい。このフレキシブルなポリペプチドリンカーは、ｇｌｙ－ｓｅｒリンカーを含んでもよい。一般に、このリンカーは、ヒンジ部分を含まない。

ここで、ＢＤ２にフランキングするリンカーの長さの変化がＢＤ２抗原結合部位の配向および残りのＢｉＳＡｂ分子に対する間隔に影響を及ぼし得ることが考慮される。たとえば、短いＮ末端リンカーと長いＣ末端リンカーとは、結合部位が一方向に配座される配向を生成し得るが、長いＮ末端リンカーと短いＣ末端リンカーとは、反対の配座配向に影響を及ぼし得る。従って、リンカーの長さは、ＢＤ２抗原結合部位を配向するためにモジュレートすることができ、ＢＤ１とＢＤ２との間および／またはＢＤ２と、Ｆｃもしくは他のドメイン内の抗体分子に結合する他の実体との間の立体作用の生成または回避に重要な影響をもたらし得る。

５．ＢｉＳＡｂの特定の構造
前述したように、本開示の一態様は、２つの重鎖－軽鎖対を含むＢｉＳＡｂ構造配置（プラットフォーム）に関する（図１Ａ～１Ｆに示す）。この態様のいくつかの実施形態では、ＢｉＳＡｂキメラ重鎖のポリペプチド配列は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）を含むポリペプチド配列、抗体重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）を含むポリペプチド配列、Ｆｃドメインの一部、第１のポリペプチドリンカー（Ｌ１）を含むポリペプチド配列、結合ドメイン（ＢＤ２）を含むポリペプチド配列、第２のポリペプチドリンカー（Ｌ２）を含むポリペプチド配列、および残りのＦｃドメインを含むポリペプチド配列を含んでもよい。いくつかの態様では、Ｆｃドメインは、Ｃ_Ｈ２ドメインおよびＣ_Ｈ３ドメインを含む。このため、ある実施形態は、Ｎ末端からＣ末端に下記の配向：ＶＨ１－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２（Ｎ末端）－Ｌ１－ＢＤ２－Ｌ２－Ｃ_Ｈ２（Ｃ末端）－Ｃ_Ｈ３；ＶＨ１－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｌ１－ＢＤ２－Ｌ２－Ｃ_Ｈ３；およびＶＨ１－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３（Ｎ末端）－Ｌ１－ＢＤ２－Ｌ２－Ｃ_Ｈ３（Ｃ末端）でポリペプチド配列を含んでもよいＢｉＳＡｂキメラ重鎖を提供する。ＢｉＳＡｂ軽鎖のポリペプチド配列は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）および軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含んでもよい。従って、ＢｉＳＡｂ軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端に下記の配向：ＶＬ１－ＣＬでポリペプチド配列を含んでもよい。ＶＨ１、ＶＬ１、およびＣＬは、第１のエピトープに結合する「結合ユニット１」（ＢＤ１）の部分を示すために使用される点に留意されたい。ＢＤ２は、第２のエピトープに結合する「結合ユニット２」の部分を示すために使用される。

結合ドメインがｓｃＦｖである態様では、ＢｉＳＡｂキメラ重鎖は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）を含むポリペプチド配列、抗体重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）を含むポリペプチド配列、第１のポリペプチドリンカー（Ｌ１）を含むポリペプチド配列、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）を含むポリペプチド配列、フレキシブルリンカーを含むポリペプチド配列、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）を含むポリペプチド配列、第２のポリペプチドリンカー（Ｌ２）を含むポリペプチド配列、および抗体Ｆｃドメインを含むポリペプチド配列を含んでもよい。このため、ＢＤ２としてｓｃＦｖを含むＢｉＳＡｂのキメラ重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に以下の配向：ＶＨ１－ＣＨ１－ＣＨ２（Ｎ末端）－Ｌ１－ＶＬ２－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ２－ＣＨ２（Ｃ末端）－ＣＨ３；ＶＨ１－ＣＨ１－ＣＨ２－Ｌ１－ＶＬ２－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ２－ＣＨ３；ＶＨ１－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｎ末端）－Ｌ１－ＶＬ２－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ２－ＣＨ３（Ｃ末端）；ＶＨ１－ＣＨ１－ＣＨ２（Ｎ末端）－Ｌ１－ＶＨ２－Ｌ３－ＶＬ２－Ｌ２－ＣＨ２（Ｃ末端）－ＣＨ３；ＶＨ１－ＣＨ１－ＣＨ２－Ｌ１－ＶＨ２－Ｌ３－ＶＬ２－Ｌ２－ＣＨ３；およびＶＨ１－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｎ末端）－Ｌ１－ＶＨ２－Ｌ３－ＶＬ２－Ｌ２－ＣＨ３（Ｃ末端）でポリペプチド配列を含んでもよい。

キメラ重鎖は、アミノ酸配列（たとえば、各ポリペプチドドメインのアミノ酸配列）を含むポリペプチド鎖である。キメラ重鎖は、アミノ酸配列（たとえば、各ポリペプチドドメインのアミノ酸配列）を含むポリペプチド鎖である。ＶＨ１、ＶＬ１およびＣＬは結合ユニット１の一部を示すのに使用され、ＶＨ１およびＶＬ１はその第１のエピトープに結合する部分を示す点に留意されたい。ＶＨ２およびＶＬ２は、第２のエピトープに結合する結合ユニット２の一部を示すのに使用される。ある態様では、追加のｓｃＦｖ結合ドメインが、ＢｉＳＡｂコアを構成するポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に存在する（ここで、ＢｉＳＡｂは、結合ユニット（ＢＤ）３および／または４および／または５をさらに含む）を参照されたい。ある態様では、２つ以上のｓｃＦｖ結合ドメインがＢｉＳＡｂコア内に存在する。追加のｓｃＦｖは、それぞれＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５で示す抗体重鎖可変領域、およびＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５で示す対応する抗体軽鎖可変領域を含む。

６．標識、コンジュゲートおよび部分
ある特徴では、薬剤および他の分子は、部位特異的なコンジュゲーションによりＢｉＳＡｂを標的としてもよい。たとえば、ＢｉＳＡｂは、コンジュゲーション反応のための遊離チオール基が得られるシステイン操作ドメイン（結合ユニットおよび／またはＦｃドメインに導入されたシステインを含む）を含んでもよい。ある態様では、特異的なコンジュゲーション部位を含むようにＢｉＳＡｂを操作してもよい。いくつかの態様では、本開示は、Ｆｃ領域が、ＥＵインデックスにより番号付けされた２３９位、２８２位、２８９位、２９７位、３１２位、３２４位、３３０位、３３５位，３３７位、３３９位、３５６位、３５９位、３６１位、３８３位、３８４位、３９８位、４００位、４４０位、４２２位および４４２位の１つまたは複数にアミノ酸置換を含むＦｃ変異ＢｉＳＡｂを提供する。いくつかの態様では、Ｆｃ領域は、以下の群：ａ）２８９位および４４０位；ｂ）３３０位および４４０位；ｃ）３３９位および４４０位；ｄ）３５９位および４４０位；ｅ）２８９位および３５９位；ｆ）３３０位および３５９位；ｇ）３３９位および３５９位；ｈ）２８９位および３３９位；ｉ）３３０位および３３９位；ｊ）２８９位および３３０位；ｋ）３３９位および４４２位；ｌ）２８９位、３３９位および４４２位；ｍ）２８９位、３３０位および３３９位；ｎ）３３０位、３３９位および４４２位；ならびにｏ）２８９位、３３０位および４４２位の群の１つまたは複数に置換を含む。他の態様では、本開示は、ＦａｂアームのＣＨ１ドメインが、ＥＵインデックスにより番号付けされた１３１位、１３２位、１３４位、１３５位、１３６位および１３９位の１つまたは複数に置換を含むＢｉＳＡｂを提供する。一態様では、置換は、システイン、リジン、チロシン、ヒスチジン、セレノシステインおよびセレノメチオニンから選択されるアミノ酸の置換を含む。特定の態様では、置換はシステインである。安定なシステイン操作抗体を作製するための方法は、その内容全体を本明細書に援用する米国特許第７，８５５，２７５号明細書、米国特許出願公開第２０１１００３３３７８号明細書および米国特許出願公開第２０１２０２１３７０５号明細書に記載されている。

７．例示的な標的
本明細書に記載される様々なＤｕｅｔＭａｂおよびＢｉＳＡｂプラットフォームに関する態様および実施形態は、いずれかの所望の１つまたは複数の標的と結合するように作製することもできるが、本明細書に開示するＢｉＳＡｂは、特定の標的分子対を標的とするのが好ましい（たとえば、結合ユニット１は、標的の一方に結合し、結合ユニット２は、他方の標的に結合する）。前述した通りかつ以下の例示的な実施例で例証するように、本明細書に開示する抗体、ＤｕｅｔＭａｂおよびＢｉＳＡｂは、レシピエント対象、または培養中の免疫細胞における免疫応答をモジュレートする分子を標的とする。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＯＸ４０、およびＴＩＭ３からなる群から選択される標的に対する特異性結合活性を呈示する。ＤｕｅｔＭａｂおよびＢｉＳＡｂは、様々な順序および配向で異なる結合ドメインの組み合わせを含むことができ、これらのドメインは、本明細書に開示する標的に対する結合親和性を有するか、またはそれらと特異的に結合する。たとえば、本明細書に開示するＤｕｅｔＭａｂおよびＢｉＳＡｂは、ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－１；ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－Ｌ１；ならびにＣＴＬＡ－４；ＣＴＬＡ－４およびＴＩＭ３；ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１；ＰＤ－Ｌ１およびＯＸ４０；ＰＤ－１およびＴＩＭ３；ＰＤ－Ｌ１およびＴＩＭ３などの標的に対する二重特異性結合を可能にする結合ドメインの組み合わせを含んでもよい。特定の標的組み合わせに結合する結合ドメインを含むＤｕｅｔＭａｂおよびＢｉＳＡｂは、実施例に例示され、ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４；ＰＤ－Ｌ１／ＣＴＬＡ－４；ＰＤ－１／ＴＩＭ３；およびＰＤ－Ｌ１／ＯＸ４０の非限定的な組み合わせを含む。ある実施形態では、ＢｉＳＡｂは、ＢｉＳＡｂを作製するために使用される個別の単一特異性結合タンパク質の組み合わせの結合特性と比較して増強された結合特性を有する。

ある態様では、本開示のＤｕｅｔＭａｂまたはＢｉＳＡｂは同じ標的上の２つの異なるエピトープに結合する（たとえば、結合ユニット１は標的上の第１のエピトープに結合し、結合ユニット２は同じ標的上の第２のエピトープに結合する）。

いくつかの態様では、本開示のＤｕｅｔＭａｂまたはＢｉＳＡｂが多量体であることにより、標識または療法剤が特定の細胞型または分子の標的を標的とすることができる。たとえば、ＤｕｅｔＭａｂまたはＢｉＳＡｂの１つの機能ドメインが細胞表面の標的に結合し、同時に同じＤｕｅｔＭａｂまたはＢｉＳＡｂの別の機能ドメインが検出に有用なハプテンまたは標識剤に結合することができる。同様に、１つの機能ドメインが細胞標的に結合し、同時に第２の機能ドメインがトキシンに結合することができる。両方の結合反応が単一の分子により媒介されるため、トキシンが細胞傷害機能に影響を及ぼす細胞標的の近傍にトキシンを配置することができる。

Ｂ．ＢｉＳＡｂをコードする核酸分子
本開示は、ＢｉＳＡｂをコードする核酸分子を提供する。本開示の一態様は、本開示のＢｉＳＡｂのいずれかをコードする核酸分子を提供する。核酸分子は、本明細書に開示するＢｉＳＡｂ分子のいずれか、ならびに本明細書に開示する個別の結合ドメインのいずれか（たとえば、ｓｃＦｖ）の重鎖および／または軽鎖をコードし得る。当業者であれば、当該技術分野において周知であるように、特定の生物についての核酸コドン縮退ならびにコドン頻度を考慮して、そうしたポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列が変動し得ることを認識されよう。

Ｃ．ＢｉＳＡｂを作製するためのベクターおよび宿主細胞ならびに後の精製
本開示は、ＢｉＳＡｂを作製するための方法に関する。ある態様では、本明細書に開示するＢｉＳＡｂの全部または一部をコードする組換え核酸分子を発現コンストラクトの１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結してもよい。ＢｉＳＡｂの軽鎖およびキメラ重鎖をコードする核酸配列は、任意の配向（たとえば、軽鎖が重鎖の前またはその逆）で同じ発現ベクターにクローニングしてもよく、または２つの異なるベクターにクローニングしてもよい。１つのベクターを用いて発現を行う場合、２つのコーディング遺伝子は、それ自体の遺伝子エレメント（たとえば、プロモーター、ＲＢＳ、リーダー、停止、ポリＡなど）を有していてもよく、または１セットの遺伝子エレメントでクローニングしてもよいが、シストロンエレメントに連結する。調節ヌクレオチド配列は一般に、発現に使用される宿主細胞に適切なものとする。種々の宿主細胞に適切な発現ベクターおよび好適な調節配列の多くの種類が当該技術分野において公知である。典型的には、前記１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列として、プロモーター配列、リーダー配列またはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始配列および終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を挙げることができるが、これに限定されるものではない。本開示は、当該技術分野において公知の構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを意図している。プロモーターは、天然プロモーターでも、または２つ以上のプロモーターのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターでもよい。発現コンストラクトは細胞のエピソーム、たとえばプラスミド上に存在してもよく、または発現コンストラクトを染色体に挿入してもよい。

ある態様では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択可能なマーカー遺伝子は当該技術分野において周知であり、使用する宿主細胞によって異なる。ある態様では、本開示は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結された発現ベクターに関する。調節配列は当該技術分野で知られており、コードされたポリペプチドの発現を誘導するように選択される。従って、調節配列という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントを含む。例示的かつ非限定的な調節配列については、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載される。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現が望まれるタンパク質の種類のような要因によって異なることがあることを理解すべきである。さらに、特定のベクターのコピー数、コピー数を制御する能力、およびベクターによりコードされた他の任意のタンパク質、たとえば抗生物質マーカーの発現も考慮すべきである。

本開示は、本開示のＢｉＳＡｂを作製する方法にさらに関する。たとえば、ＢｉＳＡｂをコードする１つまたは２つ以上の発現ベクター（たとえば、キメラ重鎖および軽鎖をコードする単一のベクター、またはキメラ重鎖をコードするベクターと軽鎖をコードするベクターとの２つのベクター）をトランスフェクトした宿主細胞を適切な条件下で培養してポリペプチドの発現が起こるようにしてもよい。ＢｉＳＡｂを分泌させ、ポリペプチドを含む細胞と培地との混合物から単離してもよい。あるいは、ＢｉＳＡｂを細胞質または膜画分に保持し、細胞を採取、溶解してタンパク質を単離してもよい。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養に好適な培地は当該技術分野において周知である。タンパク質を精製するには、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動およびイムノアフィニティ精製などの当該技術分野において公知の技術を用いてＢｉＳＡｂを細胞培養基、宿主細胞または両方から単離してもよい。ある態様では、ＢｉＳＡｂは、その精製を容易にするドメインを含む融合タンパク質として作製する。

クローン化遺伝子またはその一部を、原核細胞、真核細胞（酵母、トリ、昆虫または哺乳動物）または両方の発現に好適なベクターにライゲートして組換え核酸を作製してもよい。組換えポリペプチドを産生する発現媒体には、プラスミドおよび他のベクターがある。たとえば、好適なベクターとして、原核細胞、たとえばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現用の下記の種類のプラスミド：ｐＢＲ３２２由来のプラスミド、ｐＥＭＢＬ由来のプラスミド、ｐＥＸ由来のプラスミド、ｐＢＴａｃ由来のプラスミドおよびｐＵＣ由来のプラスミドが挙げられる。ある態様では、哺乳動物発現ベクターは、細菌においてベクターを伝播しやすくする原核生物配列および真核細胞に発現する１つまたは複数の真核生物転写ユニットの両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ由来、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ由来、ｐＲｃ／ＣＭＶ由来、ｐＳＶ２ｇｐｔ由来、ｐＳＶ２ｎｅｏ由来、ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ由来、ｐＴｋ２由来、ｐＲＳＶｎｅｏ由来、ｐＭＳＧ由来、ｐＳＶＴ７由来、ｐｋｏ－ｎｅｏ由来およびｐＨｙｇ由来のベクターは、真核細胞のトランスフェクションに好適な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターの一部は、細菌プラスミド、たとえばｐＢＲ３２２由来の配列で修飾して、原核生物細胞および真核細胞の両方において複製および薬剤耐性選択を行いやすくする。あるいは、真核細胞におけるタンパク質の一過性発現には、ウイルス、たとえばウシパピローマウイルス（ＢＰＶ－１）またはエプスタインバーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）の誘導体を使用してもよい。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換に使用される様々な方法は、当該技術分野において知られている。原核細胞および真核細胞の両方に好適な他の発現系のほか、一般的な組換え手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）Ｃｈａｐｔｅｒｓ １６ ａｎｄ １７を参照されたい。場合により、組換えポリペプチドを、バキュロウイルス発現系の使用により発現させると望ましい場合がある。そうしたバキュロウイルス発現系の例として、ｐＶＬ由来のベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１など）、ｐＡｃＵＷ由来のベクター（ｐＡｃＵＷ１など）、およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来のベクター（β－ｇａｌを含むｐＢｌｕｅＢａｃ ＩＩＩ）が挙げられる。

分子が産生されたら、タンパク質、免疫グロブリン分子または他の多量体分子を精製するための当該技術分野において公知の任意の方法により、たとえばクロマトグラフィー（たとえば、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー（特に特異的な抗原タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇに対する親和性による）、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質の精製ための他の任意の多量体分子技術を用いて分子を精製してもよい。さらに、本明細書に開示の分子は、精製を促進するために日常的に使用される異種ポリペプチド配列（たとえば、アフィニティタグ）と融合させてもよい。

ＢｉＳＡｂをどのように作製および精製するかにかかわらず、ＢｉＳＡｂの機能的結合活性を確認するために、結合アッセイ、たとえば二重ＥＬＩＳＡアッセイを（精製前および／または後に）行ってもよい。こうした結合アッセイは、一般に、当該技術分野において周知である。

Ｄ．医薬製剤
ある態様では、本開示は、医薬組成物を提供する。こうした医薬組成物は、ＢｉＳＡｂをコードする核酸分子を含む組成物であってもよい。また、こうした医薬組成物は、ＤｕｅｔＭａｂ、ＢｉＳＡｂ、ＤｕｅｔＭａｂの組み合わせ、またはＢｉＳＡｂの組み合わせと、薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物であってもよい。ある態様では、本開示の医薬組成物は、薬物として使用される。

Ｅ．使用
本明細書に述べるように、ＤｕｅｔＭａｂおよびＢｉＳＡｂを用いて、癌および細胞増殖性疾患または障害に関連する標的に結合させることができ、これらの疾患または障害は、たとえば、免疫抑制活性を阻害し、および／または標的分子に関連する免疫応答を誘導することにより、免疫療法に応答性となり得る。たとえば、異常シグナル伝達および／または阻害された免疫応答は、望ましくない細胞増殖および癌に寄与し得る。従って、本明細書に開示するＤｕｅｔＭａｂ、ＢｉＳＡｂおよび抗体は、癌を標的とする、阻害された、低減したまたは不十分な免疫応答に関連する望ましくない細胞増殖および／または癌を治療するために用いることができる。特に、腫瘍および／または腫瘍の体積の腫瘍成長曲線は、たとえば、癌に罹患したヒト患者などの対象における免疫応答を誘導および／または刺激するＢｉＳＡｂのＤｕｅｔＭａｂの投与によって低下し得る。

このように、本開示は、それを必要とする対象への本明細書に開示する結合タンパク質の投与を含む様々な方法にも関する。一態様では、本開示は、癌を有するかまたは発症するリスクがある対象において免疫応答を誘導する方法に関し、これは、本明細書に開示する結合タンパク質を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、対象において癌に対する免疫応答を活性化する。いくつかの実施形態では、本方法は、対象において癌に対する免疫応答を増強する。いくつかの実施形態では、本方法は、対象において阻害された免疫応答経路を活性化し、この活性化が、対象における癌を標的とする免疫応答を増大する。いくつかの実施形態では、本方法は、対象における癌を標的とする免疫応答経路を増強する。

別の態様では、本開示は、それを必要とする対象の癌を処置する方法に関し、これは、本明細書に開示する結合タンパク質を対象に投与することを含む。一実施形態では、癌を処置する方法は、対象の癌の成長を停止させるかまたは緩徐にすることを含む。一実施形態では、癌を処置する方法は、対象における癌の他の部位への転移を停止させるかまたは緩徐にすることを含む。一実施形態では、癌を処置する方法は、対象において癌細胞を殺傷することを含む。一実施形態では、癌を処置する方法は、対象において癌細胞の増殖および／または広がりを停止させることを含む。

前述の態様の様々な実施形態において、本方法は、腫瘍疾患および／または癌疾患のために患者を処置することに関する。複数の実施形態では、癌は、対象において誘導された免疫応答に対して感受性である癌の群から選択される。いくつかの実施形態では、癌は、卵巣癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、膀胱癌、頭部および頚部癌、黒色腫、膵臓癌、腎細胞癌、または肺癌の１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、癌は、消化管または胃腸癌（たとえば、肛門癌；胆管癌；肝臓外胆管癌；虫垂癌；カルチノイド腫瘍、結腸癌；小児大腸癌を含む大腸癌；小児食道癌を含む食道癌；膀胱癌；小児胃癌を含む胃（胃）癌；成人（原発性）肝細胞癌および小児肝細胞癌を含む肝細胞癌（たとえば、肝細胞癌腫）；小児膵臓癌を含む膵臓癌；肉腫、横紋筋肉腫；膵島細胞癌；直腸癌；および小腸癌）；肺癌（たとえば、小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）；頭部および頚部癌（たとえば、口唇および口腔癌；小児口腔癌を含む口腔癌；下咽頭癌；小児咽頭癌を含む咽頭癌；原発不明転移性扁平上皮性頸部癌；口腔癌；鼻腔および副鼻腔癌；小児鼻咽頭癌を含む鼻咽頭癌；口腔咽頭癌；副甲状腺癌；咽頭癌；小児唾液腺癌を含む唾液腺癌；咽喉癌；および甲状腺癌）；卵巣癌および乳癌から選択される。

前述の方法において、対象に投与される結合タンパク質の量は、対象において免疫応答を誘導し、免疫応答を増大し、癌の成長を停止させるかもしくは緩徐にし、癌の転移を停止させるかもしくは緩徐にし、癌細胞を殺傷し、かつ／または癌細胞の増殖および／もしくは広がりを停止させるかもしくは緩徐にする上で有効である。

前述の方法の実施形態において、結合タンパク質は、本明細書に開示するＤｕｅｔｍａｂおよびＢｉＳＡｂを含む。前述の方法のいくつかの実施形態では、結合タンパク質は、本明細書に開示するように、抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。

本明細書で使用されるとき、「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物、特に哺乳動物を含むことが意図される。対象の例として、障害、たとえば癌などの本明細書に記載する障害を有するヒト患者、または正常な患者を有するヒト患者が挙げられる。「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、たとえば非哺乳動物（たとえば、ニワトリ、両生類、爬虫類など）ならびに非ヒト霊長類、家畜および／または農業用動物（たとえば、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタなど）および齧歯動物（たとえば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）などの哺乳動物を含む。特定の実施形態では、対象は、ヒト患者である。

「処置」または「処置する」は、治療処置および予防または予防的措置の両方を指す。処置が必要な対象は、すでに障害を有する者および障害を有する傾向がある者または障害を予防すべきである者を含む。処置を必要とする疾患または対象について使用するとき、この用語は、従って、疾患の進行を停止または緩徐にすること、疾患の寛解、症状の予防、疾患および／もしくは症状の重症度の軽減、または未処置の対象と比較して疾患の長さの短縮を含むが、これらに限定されない。複数の実施形態では、治療方法は、治療しようとする特定の疾患の１つまたは複数の臨床的適応を緩和することができる。

以下に記載する実施例は、上に記載した本開示の特定の態様および実施形態を示すために付与されるものであり、記載の範囲または添付の特許請求される主題を限定するものとして解釈すべきではない。

材料および方法
免疫応答モジュレーションアッセイ
本明細書に記載される免疫療法薬分子のいくつかにより誘導された潜在的免疫応答を評価するために、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原リコールアッセイを使用した。アッセイのための試薬は、以下を含む：
－ ＣＭＶ反応性凍結末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）；
－ ＡＩＭ Ｖ（登録商標）Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｃａｔ♯１２０５５－０９１）；
－ リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｃａｔ♯２００１２－０４３）；
－ ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ（登録商標）、ＣＭＶｐｐ６５ペプチドプール、（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，ｃａｔ♯１３０－０９３－４３８，５０μｇ／ｍｌ）；
－ オボアルブミン、（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ＃７７１２０，１ｍｇ／ｍｌ）；
－ Ｃｏａｔａｒ、９６ウェルプレート非ＴＣ処理（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ｃａｔ＃３７８８）；および
－ 免疫療法薬分子。

一般的アッセイプロトコル：
アッセイを実施する前日、凍結ＰＢＭＣを温かいＡＩＭ Ｖ培地中で解凍した。Ｃｏａｔｅｒ丸形ウェルプレート内で細胞を２回洗浄した。細胞の濃度を１×１０^６細胞／ｍＬに調節した。

細胞のアリコート（１００μＬ）を個々のウェルに分配し、プレートの外側の行列を空のまま残した。細胞を一晩静置した。

翌日、２×ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ ＣＭＶペプチドプール（０．１μｇ／ｍｌ～０．０５μｇ／ｍｌ最終）および２×免疫療法薬分子を含有する１００μＬのＡＩＭＶ培地をウェルに添加した。

７２時間後、各ウェルからの２５μＬの上清を、予め遮断および洗浄したＭＳＤプレート（抗ヒトＩＦＮγ）に移した。標準溶液を添加した後、プレートを室温で２時間インキュベートした。インキュベーション時間後、ＭＳＤプレートを３回洗浄した。洗浄後、２５μＬのＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ検出抗体を添加し、室温で１時間反応させた。プレートを再度洗浄し、１５０μＬの２×ＭＳＤ読み取り緩衝液を添加した後、読み取りを行った。

ブドウ球菌（Ｓｔａｈｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシンＡ／Ｂ（ＳＥＡ／ＳＥＢ）アッセイプロトコル
ＩＬ－２免疫応答に対するＤｕｅｔＭａｂまたはＢｉＳＡｂの作用を決定するために、ＳＥＢまたはＳＥＡアッセイプロトコルのいずれかで使用する試薬は、以下を含む：
－ 白血球錐体（ＮＨＳＢＴコードＮＣ２４；Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌから）；
－ ５０ｍｌＦａｌｃｏｎチューブ（ＢＤ３５２０７０）；
－ Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ １７－１４４０－０２）；
－ 抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３；１ｍｇ／ｍｌ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；ｃａｔ ｎｏ：１６－００３７－８５）；
－ 塩化アンモニウム溶液（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ０７８５０）；
－ －２０℃で保存される、１ｍｇ／ｍｌのブドウ球菌（Ｓｔａｈｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ；Ｓｉｇｍａ，Ｓ－９３９９）またはブドウ球菌（Ｓｔａｈｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ；Ｓｉｇｍａ，Ｓ－４８８１）ストック溶液：
－ 培地（全てＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから）：１０％ｖ／ｖ熱不活性化ＦＣＳ（９０００５Ｍ）および１００Ｕ／ｍＬペニシリン＋１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシン（１５１４０－１２２）を補充したｇｌｕｔａｍａｘ（６１８７０）を含むＲＰＭＩ１６４０；
－ Ｖ字底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＢｉｏＯｎｅ６５１２０１）；
－ ９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ７１０７）。

ＩＬ－２ＤＥＬＦＩＡ ＥＬＩＳＡのための試薬は、以下を含む：
－ ＦＬＵＯＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ ４３７９５８）；
－ ユウロピウム標識ストレプトアビジン、ＳＡ－ＥＵ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ １２４４－３６０）；
－ ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）アッセイ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ，＃４００２－００１０）；
－ ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）強化溶液（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ ４００１－００１０）；使用前はＲＴ；
－ アッセイ希釈剤：０．１％ＢＳＡで補充し、滅菌濾過したＤＥＬＦＩＡ洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２～７．４）；
－ 粉乳（Ｍａｒｖｅｌ；Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｆｏｏｄｓ）：
－ サンプル希釈剤（ＰＲＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（前述と同様））；
－ ＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ １４１９０２３５）；
－ ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（登録商標）（ＰＢＳ中の０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０）；
－ ヒトＩＬ－２ＥＬＩＳＡキット（Ｄｕｏｓｅｔ ＤＹ２０２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）；
－ 自動プレートローダ付きＢｉｏｔｅｋプレートウォッシャー（ＥＬ４０６）。

一般的アッセイプロトコル
密度勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてヒト血液白血球錐体（ＮＨＳ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｓｅｒｖｉｃｅ ｃｏｄｅ ＮＣ２４）からＰＢＭＣを単離し、続いて赤血球を塩化アンモニウム溶液（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に溶解させた。抗ヒトＣＤ３（ＰＢＳ中０．５ｕｇ／ｍｌのクローンＯＫＴ３；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を平底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ７１０７）内で３７℃において２時間コーティングした。次に、培地（１０％ｖ／ｖ熱不活性化ウシ血清および１００Ｕ／１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシン／ペニシリン（それぞれ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で補充したＲＰＭＩ１６４０－Ｇｌｕｔａｍａｘ）中のＰＢＭＣに１ウェル当たり０．２×１０^６細胞を添加した。０．００８８～０．１ｕｇ／ｍｌの範囲内のブドウ球菌エンテロトキシン（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）ＡまたはＢ（ＳＥＢ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の添加によりＰＢＭＣをさらに刺激した後、候補ＤｕｅｔＭａｂまたはＢｉＳＡｂを最終試験濃度まで添加した。３７℃および５％ＣＯ_２での３日の培養後、上清を細胞から取り出し、市販のＥＬＩＳＡを用いて、製造者の指示（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｕｏｓｅｔ ｐｒｏｄｕｃｔ ｃｏｄｅ ＤＹ２０２）に従い、ＩＬ－２分泌を決定した。図９０を参照されたい。

混合白血球反応（ＭＬＲ）アッセイプロトコル（新鮮な血液）
さらに、本明細書に開示するＤｕｅｔＭａｂおよびＢｉＳＡｂに応答するＴ細胞機能のインビトロ相関を得るために、ＭＬＲ細胞アッセイも使用した。新鮮な血液サンプルからＭＬＲアッセイを実施するのに使用される試薬は、以下を含む：
－ ８ｍＬ ＣＰＴヘパリンチューブ；
－ ＡＩＭ－Ｖ Ｍｅｄｉｕｍ（無血清）Ｇｉｂｃｏ ＃１２０５５－０９１、添加剤なし；
－ ５０ｍｌコニカルチューブ；
－ ２ｍｌ凍結保存容器；
－ ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ ＃Ａ１０４９２－０１）；
－ ９６ウェル組織培養物処理丸底プレートＢＤｆａｌｃｏｎ ＃３０７７；
－ 陽性対照としてのＰＨＡ（Ｒｏｃｈｅ）１ｍｇ／ｍｌ（１０ｕｇ／ｍＬ最終濃度）。

一般的アッセイプロトコル
ＣＴＰヘパリンチューブに導入した血液サンプルからＰＢＭＣを調製した。２５℃において、ブレーキを用いず２７００ｒｐｍで２０分間チューブを遠心分離した。血清の上層を吸引した。残りの物質をピペットで穏やかに採取し、ＣＰＴチューブプラグ上方にある全てを回収し、５０ｍｌのコニカルチューブに導入した。細胞にＡＩＭ－Ｖ培地を添加して、細胞を洗浄した（ブレーキをオンにして、１５００ｒｐｍ、２５℃で５分を３回）。残った赤血球は、全て赤血球溶解緩衝液（たとえば、約３ｍｌの緩衝液で約５分）を用いて溶解させた。残った細胞をＡＩＭ－Ｖ培地（ブレーキをオンにして、１５００ｒｐｍ、２５℃で５分）で２回洗浄した。必要に応じて、ペレットを単一チューブ内で固め、ＡＩＭ－Ｖ培地中に再懸濁させて、細胞カウントを実施した。

ＭＬＲアッセイを実施するために、９６ウェルプレートにおいて、１ドナー当たり５０ｕｌ（計４００，０００／１００ｕｌ）のＡＩＭ－Ｖ培地中、２００，０００細胞／ドナー／ウェルで細胞を平板培養した。候補分子を１ウェル当たり（４×）５０ｕｌで添加し、無血清ＡＩＭ－Ｖ培地で希釈した。７２時間後、プレートをイメージングし、３０ｕｌの上清をヒトＴＨ１／ＴＨ２（ＭＳＤ）サイトカインアッセイのために取り出した。

ヒトＴＨ１／ＴＨ２ＭＳＤ１０－ｐｌｅｘプロトコル
このアッセイを用いて、本明細書に開示するＤｕｅｔＭａｂおよびＢｉＳＡｂの投与に応答して培養上清中に存在するサイトカインの量を決定した。このアッセイを実施するために、２００ｍｇの遮断剤Ｂを１プレート当たり２０ｍｌのＰＢＳ中に溶解させることにより、遮断剤を調製した。溶解させた１５０ｕｌの遮断剤を各ウェルに添加した。プレートを密封してから、室温で２時間または４℃で一晩振盪した。ウェルをＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄した。凍結した較正物質ブレンド１０ｕｌを１ｍｌの希釈剤で希釈することにより、較正物質を調製し、これをさらに連続的に４倍希釈した。ウェルを分離するために、２５ｕｌの較正物質（標準）および２５ｕｌのサンプルを添加した。ウェルを振盪しながら、室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した。

検出抗体を調製し、必要濃度まで希釈した後、各ウェルに添加した。振盪しながら室温で２時間のインキュベーション後、ウェルをＰＢＳＴで（３回）洗浄した。ＭＳＤ装置で読み取る前に読み取り緩衝液を各ウェルに添加した。

腫瘍特異的殺傷アッセイプロトコル
ヒトｇｐ１００_{２０９－２１７}ペプチドに対する反応性を有するヒトＣＤ８＋Ｔ細胞株（ＪＲ６Ｃ１２）は、Ｄｒ．Ｓｔｅｖｅｎ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ），Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から好意的に提供された。ＪＲ６Ｃ１２細胞を、ＣＦＳＥ（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）標識ヒト黒色腫細胞株（Ｍｅｌ６２４）と一緒に１：１比（２０，０００ＪＲ６Ｃ１２＋２０，０００Ｍｅｌ６２４）で９６ウェル平底プレートにおいて３７℃で１８時間同時培養した。同時培養の０時点で候補分子を６９ｎＭの濃度で添加した。１８時間後、明視野顕微鏡によりウェルを視覚化した。ＭＳＤ分析のために上清を収集し、接着細胞をトリプシン処理してから、ＰＢＳで（２×）洗浄した後、生体染色（Ｚｏｍｂｉｅ ＵＶ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｋｉｔ，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に付した。ＣＦＳＥ標識細胞の生体染色剤の取り込みをＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ）でのフローサイトメトリーにより評価した。

実施例１．結合ドメイン結合のための候補Ｆｃ位置の決定
オープンソースソフトウェアＰｙＭＯＬ分子視覚化システムを用いて、結合ドメイン結合のための候補領域、たとえば露出表面ループを見出すために、ＣＨ２およびＣＨ３領域において、ならびにＣＨ２－ＣＨ３境界面またはその付近で抗体構造を調べた。こうした領域は、ＩｇＧまたは第２の結合ドメイン自体の構造完全性もしくは安定性を損なうことなく、第２の結合ドメイン（たとえば、ｓｃＦｖ）の挿入に適合しているであろう。この分析から３つの領域が見出された（図１Ａ～１Ｃに球体として表される）。図１Ｄ、１Ｅ、および１Ｆは、結合ドメインの実施形態を描き、それぞれ図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃで見出されたループの各々における第２の結合ドメイン（例示の目的のためにｓｃＦｖを有する）の結合を示す。

図２Ａは、ＣＨ２－ＣＨ３境界面付近のＣＨ２領域において見出され、配列ＩＳＲＴＰ（配列番号３９）を含む見出された代表的ループの１つのアミノ酸配列のさらに詳細な概略図を提供する。結合ドメインをこのアミノ酸配列内に挿入して、任意の数の代表的コンストラクト、たとえば実施例に例示するような挿入ｓｃＦｖドメイン（たとえば、Ｉ－ｓｃＦｖ－ＳＲＴＰ、ＩＳ－ｓｃＦｖ－ＲＴＰ、ＩＳＲ－ｓｃＦｖ－ＴＰ、またはＩＳＲＴ－ｓｃＦｖ－Ｐ、ｓｃＦｖ－ＩＳＲＴＰ、およびＩＳＲＴＰ－ｓｃＦｖを作製してもよく、ここで、「－ｓｃＦｖ－」は、結合ドメインが結合され得るネイティブループ配列における地点を明らかにする。図２Ｂは、ＣＨ２－ＣＨ３境界面で見出され、アミノ酸配列ＡＫＧＱＰ（配列番号４０）を含むループを表す同様の概略図である。ここに記載される代表的なコンストラクトは、本明細書に記載する通りこのループ配列に付着した結合ドメイン（たとえば、ｓｃＦｖドメイン）を含んでよく、こうしたものとして、Ａ－ｓｃＦｖ－ＫＧＱＰ、ＡＫ－ｓｃＦｖ－ＧＱＰ、ＡＫＧ－ｓｃＦｖ－ＱＰ、ＡＫＧＱ－ｓｃＦｖ－Ｐ、ｓｃＦｖ－ＡＫＧＱ、ＡＫＧＱ－ｓｃＦｖが挙げられ、ここで、「－ｓｃＦｖ－」は、結合ドメインが結合され得るネイティブループ配列における地点を明らかにする。図２Ｃは、ＣＨ３領域内のＣＨ２－ＣＨ３境界面の下流で見出され、アミノ酸配列ＳＮＧを含む代表的なループの概略図を提供する。このループ配列の代表的なコンストラクトは、上の他の２つのループ領域についての例示的な実施形態に関して論じられ、ｓｃＦｖ－ＳＮＧ、Ｓ－ｓｃＦｖ－ＮＧ、ＳＮ－ｓｃＦｖ－Ｇ、およびＳＮＧ－ｓｃＦｖを含む。

実施例２．一連の親抗体ならびに結合ユニットの組み合わせを含む二重特異性結合タンパク質の作製および特性決定
一連のモノクローナル抗体を作製し、特性決定した。これらの「親」抗体に由来する抗原結合配列（たとえば、ＣＤＲ、ＨＣｖ、ＬＣｖ、ＨＣ、ＬＣ）の組み合わせを用いて一連の二重特異性結合タンパク質を作製したところ、これらは、組み合わせた標的抗原に対して二重特異性結合活性を有することが判明した。二重特異性結合タンパク質は、本明細書に開示する特定の構造プラットフォームモチーフ（すなわち「ＢｉＳ５」）を有するように設計された。

親抗体配列を以下の表に記載する。

実施例２（ａ）ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重特異性結合タンパク質
特定の理論に拘束されるわけではないが、ＰＤ－１とＣＴＬＡ－４遮断の組み合わせには強固な臨床上および前臨床上の理論的根拠がある。従って、ＰＤ－１とＣＴＬＡ－４との組み合わせの危険度／受益度比を最大にすることが望ましいであろう（図４）。

表２で上に同定された親配列を用いて、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４に結合する以下の二重特異性結合タンパク質を作製した。ＢｉＳ２、ＢｉＳ３、およびＢｉＳ５として識別されるタンパク質は、以下に同定される配列を用いて作製し、後述するＯｃｔｅｔ結合アッセイを用いて同時抗原結合活性について評価した。

Ｏｃｔｅｔ結合アッセイ（ＢｉＳ２、ＢｉＳ３、およびＢｉＳ５）
本明細書に開示する二重特異性結合分子の結合を評価するために、Ｎｉ－ＮＴＡバイオセンサーチップを備えるＯｃｔｅｔ ＱＫおよび１０×キネティクス緩衝液を使用した（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）。この特定のシリーズの二重特異性結合タンパク質の場合、Ｈｉｓタグ付きＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ、ｈｉｓ－タグ付きＰＤ－１－ＦｃおよびＣＴＬＡ－４－Ｆｃ（ヒト組換えタンパク質）をＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。全ての結合アッセイは２５℃で実施した。

分析前にサンプルプレートを１０００ｒｍｐで攪拌した。Ｎｉ－ＮＴＡバイオセンサーチップを事前に１×キネティック緩衝液で５分間湿潤させた。１×キネティック緩衝液は、ベースライン決定のためのランニング緩衝液および抗原および二重特異性抗体の希釈緩衝液としての役割も果たした。Ｎｉ－ＮＴＡバイオセンサーチップを、抗原捕捉のために１００ｎＭ ｈｉｓ－タグ付きＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ（以下の（ｂ）を参照されたい）またはｈｉｓ－タグ付きＰＤ－１－Ｆｃ中に約１分間浸漬した。抗原をコーティングしたバイオセンサーチップを各々１０μｇ／ｍｌの二重特異性抗体中に約５分間浸漬した後、１００ｎＭ ＣＴＬＡ－４－Ｆｃ抗原を含有するウェルのカラム内に２分間移した。結合の結果を図３に示す。

表２で上に同定された親配列を用いて、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４に結合するＤｕｅｔＭａｂフォーマットの二重特異性結合タンパク質を作製した。ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂを以下の表４に示す配列を用いて作製し、ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＢｉＳ５との比較を含め、後述するように評価した。

Ｏｃｔｅｔ結合アッセイ（ＤｕｅｔＭａｂ）
２つの個別の抗原に対する同時結合試験をＯｃｔｅｔ分析によって実施した。ビオチン化ヒトＰＤ－１をストレプトアビジンセンサーにロードした後、まずＤｕｅｔＭａｂ ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４、次に可溶性ＣＴＬＡ－４抗原との連続的相互作用を行った。ストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いてＰＢＳ ｐＨ７．２、３ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０（アッセイ緩衝液）中５μｇ／ｍＬのビオチン化ヒトＰＤ－１を捕捉した。洗浄ステップ後、ロードしたバイオセンサーを、まず１３３ｎＭのＤｕｅｔＭａｂ ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重特異性抗体を担持するサンプルウェルと、次に２００ｎＭのヒトＣＴＬＡ－４抗原を担持するウェルとの連続的な会合および解離相互作用に付した。結合の結果を図５に示す。

ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂ二重特異性抗体の固有の動態もＢｉａＣｏｒｅにより評価した。ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００計器（ＢＩＡｃｏｒｅ）を用いて結合実験を実施した。抗体を捕捉するためにマウス抗ｈｕＩｇＧ－Ｆａｂを２０００ＲＵの標的応答までＣＭ５チップに固定化した。約１００応答単位の捕捉抗体を達成するために、１００ｎＭのＤｕｅｔＭａｂまたはｍＡｂを２０μＬ／分で５分間流した。次に、５０μｌ／分の流量で５分間抗原を連続的に注射した。動態パラメーター（ｋ_ｏｎおよびｋ_ｏｆｆ）ならびに解離定数（ＫＤ）を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェアを用いて非線形フィットから計算した。結合結果を表５に示す。

リポータ遺伝子アッセイ
リポータ遺伝子アッセイからの結果は、ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重特異性結合タンパク質がＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４経路を阻害したことを示す（図６Ａ～Ｄ）。ＢｉＳ５結合タンパク質は、親と比較してＰＤ－１力価を維持したが、抗ＣＴＬＡ－４ ＩｇＧと比較して力価が約３倍低下した。ＤｕｅｔＭａｂ抗体は、ＰＤ－１力価の約９倍の低下およびＣＴＬＡ－４について約１６倍の低下を示した（ＩｇＧ４Ｐと比較して）。当該技術分野において、ＣＴＬＡ－４ターゲティングは低いが、機能的活性（たとえば、ＳＥＢアッセイに示す通り）を維持する分子が求められる。このように、ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重特異性結合タンパク質は、患者に安全性の利益をもたらす可能性を有する。

ブドウ球菌エンテロトキシン（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）Ｂ（ＳＥＢ）アッセイ
ＳＥＢアッセイからの結果は、ＤｕｅｔＭａｂとＢｉＳ５ＡｂがＳＥＢ一次免疫細胞アッセイにおいて同等の活性を有することを明らかにし（図７）、ＤｕｅｔＭａｂは、ＤｕｍｍｙＤｕｅｔ対照アームと比較して高い活性を示した（図８Ａ）。ＤｕｅｔＭａｂは、親分子の組み合わせとほぼ同等の活性、またＬＯ１１５またはＣＴＬＡ－４抗体ＭＥＤＩ１１２３（トレメリムマブ）と比較して高い活性を示した（図８Ｂ）。最後に、ＢｉＳ５およびＤｕｅｔＭａｂは、新規のアイソタイプ対照の組み合わせと比較して高い活性を示した（図９Ａ～Ｂ）。データは、２つの独立した実験を通して４ドナーから取得し、これらの具体的なアッセイには、ＩＦＮγの使用が必要であった。

混合白血球反応（ＭＬＲ）アッセイ
ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重特異性分子を試験するためにＭＬＲアッセイを実施した。ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂおよびＢｉＳ５Ａｂは、混合白血球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて同等の活性を有した（図１０Ａ～Ｃ）。ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂは、ＤｕｍｍｙＤｕｅｔ／アイソタイプ対照アームの組み合わせと比較して高い活性を有した（図１１Ａ～Ｄ）。ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂは、親抗体対照の組み合わせと比較してほぼ同等の活性を有した（図１２Ａ～Ｄ）。最後に、ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂは、競合ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４組み合わせと比較してほぼ同等の活性を有し、抗ＰＤ－１単独（たとえば、ペムブロリズマブおよびニボルマブ）よりも高い活性を有した（図１３Ａ～Ｄ）。

薬物動態および薬力学的（ＰＫ／ＰＤ）試験
カニクイザルにおいて単回用量薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）を調べるために試験を実施した。試験設計を図１４に示す。ＤｕｅｔＭａｂは、カニクイザルにおいて明瞭な薬力学（ＰＤ）を示し、両方の分子について堅固なＰＤ応答が観察された（図１５Ａ～Ｂ）。このように、インビボ環境でのＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重特異性結合タンパク質の生存能を確認する。

Ｔ細胞依存性抗体応答（ＴＤＡＲ）
表示量（０．５、５、５０ｍｇ／ｋｇ）のＤｕｅｔＭａｂまたはＢｉＳ５二重特異性分子をカニクイザルに静脈内（伏在静脈または橈側皮静脈）投与した。スカシガイ（Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン（ＫＬＨ）タンパク質を滅菌条件下において適切な量の滅菌注射液で再構成した。低用量ＫＬＨ溶液を各動物の背中に２回（１日目および２９日目）皮下投与した。さらなる分析のために血液サンプルを全ての動物から採取した。ＫＬＨ特異的ＩｇＭおよびＩｇＧ抗体力価の評価を実施した。ＥＬＩＳＡを用いてサル血清中の抗ＫＬＨ抗体を検出した。

ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂ（図１６Ａ）およびＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＢｉＳ５Ａｂを投与したカニクイザルにＴ細胞依存性抗体応答（ＴＤＡＲ）が認められた（図１６Ｂ）。

様々なレベルのヒトＰＤ－１および／またはＣＴＬＡ－４を発現するＣＨＯ細胞
ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重特異性分子を試験するために、様々なレベルのヒトＰＤ－１および／またはＣＴＬＡ－４を発現する安定したＣＨＯ細胞を用いてモデル系を作製した（図１７）。蛍光標識可溶性ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４タンパク質を用いて、細胞結合ＤｕｅｔＭａｂ上の自由抗原結合アームをフローサイトメトリーにより検出した。このアッセイの結果は、ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂが同じ細胞の表面上のＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４に同時に結合することを明らかにする（図１８Ａ～Ｃ）。

ＣＴＬＡ－４は、クラスリン被覆ピット中に絶えず取り込まれ、任意の時点で細胞表面に発現される受容体の小さい画分となるに過ぎない。細胞表面ＣＴＬＡ－４の再利用は迅速であり、表面ＣＴＬＡ－４の８０％未満が５分以内に内在化される。従って、過剰ＰＤ－１を発現する細胞上でＣＴＬＡ－４が飽和した状態において、抗ＰＤ－１および抗ＣＴＬＡ－４抗体の組み合わせに対して協同的結合がＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂを識別するか否かを調べるために実験を行った（図１９Ａ～Ｃ）。標的抗ＰＤ－１および抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂを用いて各標的抗原の受容体占有を独立に決定した。

親モノクローナル抗体は、非標的受容体には測定可能な作用を及ぼすことなく、それらの標的受容体に結合してそれを占有することが判明した（図２０Ａ～Ｄ）。ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂは、モノクローナル抗体の組み合わせと比較して約２５０倍低い濃度で過剰ＰＤ－１を発現するＣＨＯ細胞上でＣＴＬＡ－４を飽和させた（図２１Ａ～Ｄ）。ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂは、ＣＴＬＡ－４のみを発現する細胞と比較して約５００倍低い濃度で過剰ＰＤ－１を発現するＣＨＯ細胞上でＣＴＬＡ－４を飽和させた（図２２Ａ～Ｆ）。予め混合した全ＣＨＯ集団内でのダブレット形成の定量により決定されるように、ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂは、同じ細胞の表面上のＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４と優先的にシス結合した（図２３Ａ～Ｂ）。しかし、ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂは、単一発現細胞とトランス結合することもできる。ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂは、親抗ＣＴＬＡ－４抗体、トレメリムマブの内在化特性を帯びた（図２４Ａ～Ｄ）。特定の理論に拘束されるわけではないが、この分子が示す作用は、ＰＤ－１のダウンレギュレーションを誘導する可能性がある。ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂの内在化特性は、１０倍過剰のＰＤ－１を発現する安定なＣＨＯ細胞にも認められた（図２５Ｂ）。

実施例２（ｂ）ＰＤ－Ｌ１／ＣＴＬＡ－４二重特異性結合タンパク質
表２で上に同定された親配列を用いて、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４に結合する下記の二重特異性結合タンパク質を作製した。ＢｉＳ２、ＢｉＳ３、およびＢｉＳ５として識別されるタンパク質は、以下の表６に示す配列を用いて作製し、以下に同定された配列を、セクション２（ａ）で前述したようにＯｃｔｅｔ結合アッセイを用いて同時抗原結合活性について評価した（図２６）。

実施例２（ｃ）ＰＤ－１／ＴＩＭ３二重特異性結合タンパク質
表２で上に同定された親配列を用いて、ＰＤ－１およびＴＩＭ３に結合する下記の二重特異性結合タンパク質（表７）を作製した。ＢｉＳ３、ＢｉＳ５、およびＤｕｅｔＭａｂとして識別されるタンパク質は、以下で同定される配列を用いて作製し、Ｏｃｔｅｔ分析により、同時結合試験について評価した。手短には、ＰＢＳ ｐＨ７．２、３ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（アッセイ緩衝液）中２μｇ／ｍｌのストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いてビオチン化ヒトＴＩＭ３－ＩｇＶドメインを捕捉した。洗浄ステップ後、ロードしたバイオセンサーを、まず２００ｎＭの二重特異性抗体を担持するサンプルウェル、次に２００ｎＭのＰＤ－１抗原を担持するウェルとの連続的な結合および解離相互作用に付した。ビオチン化ヒトＴＩＭ３－ＩｇＶドメインをストレプトアビジンセンサーにロードした後、まず二重特異性分子、次にＰＤ－１抗原との連続的な相互作用に付した。結合結果を図２７Ａ～２７Ｂに示す。

腫瘍特異的殺傷活性アッセイ
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇクローン黒色腫殺傷アッセイ
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ Ｃｌｏｎｅ：ＪＲ６Ｃ１２および黒色腫細胞株：Ｍｅ１３２４を用いて、ＴＩＭ３／ＰＤ－１二重特異性結合分子および親ＴＩＭ３抗体の一般的な細胞殺傷活性を試験した。

一般的なアッセイプロトコル
ＪＲ６Ｃ１２は、エフェクターとして機能し、黒色腫患者から拡大され、かつｇｐ１００－黒色腫抗原に対して特異的なヒトＣＤ８＋Ｔ細胞株である。治療能力を評価するために、Ｍｅｌ６２４腫瘍細胞を蛍光標識してから、エフェクター（ＪＲ６Ｃ１２）ならびにＴＩＭ３およびまたはＰＤ－１に結合する候補抗体と一緒に添加した。細胞を１６時間同時培養した。図２８Ａに示す複数のパネルは、抗ＰＤ１と組み合わせて、またはＰＤ－１／ＴＩＭ３二重特異性分子（表７に記載の通り）としてのいずれかでＴＩＭ３ ６２を添加すると、Ｔ細胞活性化および腫瘍殺傷を増強することを視覚的に示す図を提供する。

さらに、図２８Ｂ～２８Ｃに示すように、ＰＤ－１／ＴＩＭ３二重特異性分子は、（ｂ）腫瘍細胞生体染色剤取り込みおよび（ｃ）ＩＦＮγ分泌により評価されるように、抗ＴＩＭ３、抗ＰＤ－１またはアイソタイプ対照単剤療法と比較して最大の腫瘍殺傷効力を示す。

クローン６２に加えて、表２で上に同定された親配列を用いて、ＤｕｅｔＭａｂフォーマットの、ＰＤ－１およびＴＩＭ３に結合する別の二重特異性結合タンパク質を作製した。ＰＤ－１／ＴＩＭ３ ＤｕｅｔＭａｂは、以下の表８に示す配列を用いて作製した。ＴＩＭ３アームの配列は、クローン６２の親和性成熟変異体であるＯ１３－１から取得し、抗ＰＤ－１アームの配列は、ＬＯ１１５から取得したが、これは、前述したＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４ ＤｕｅｔＭａｂ二重特異性抗体に使用したＰＤ－１アームと同一である。ＰＤ－１（ＬＯ１１５）／ＴＩＭ３（Ｏ１３－１）二重特異性抗体は、ＰＤ－１／ＴＩＭ ＢｉＳ３およびＢｉＳ５との比較を含め、以下に論じるように評価した。

Ｏｃｔｅｔ結合アッセイ（ＤｕｅｔＭａｂ、ＴＩＭ３アーム親和性成熟変異体）
２つの個別の抗原、ＰＤ－１およびＴＩＭ３に対する同時結合試験をＯｃｔｅｔアッセイにより実施した。ビオチン化ヒトＴＩＭ３をストレプトアビジンセンサーにロードした後、まずＰＤ－１／ＴＩＭ３ ＤｕｅｔＭａｂ、次に可溶性ＰＤ－１抗原と連続的に相互作用させた。ＰＢＳ ｐＨ７．２、３ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（アッセイ緩衝液）中５μｇ／ｍｌのストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いてビオチン化ヒトＴＩＭ３を捕捉した。洗浄ステップ後、ロードしたバイオセンサーを、まずクローン６２ ＴＩＭ抗体の親和性成熟変異体であるＴＩＭ３アーム（Ｏ１３－１）を有する、２００ｎＭでロードされたＤｕｅｔＭａｂ ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重特異性抗体を担持するサンプルウェル、次に２００ｎＭのヒトＰＤ－１抗原を担持するウェルとの連続的な会合および解離相互作用に付した。結合結果を図２９に示す。

ＢｉａＣｏｒｅにより、ＰＤ－１／ＴＩＭ３ ＤｕｅｔＭａｂ二重特異性抗体の固有の動態も評価した。ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００計器（ＢＩＡｃｏｒｅ）を用いて結合実験を実施した。抗体を捕捉するためにマウス抗ｈｕＩｇＧ－Ｆａｂを２０００ＲＵの標的応答までＣＭ５チップ上に固定化した。１００ｎＭのＤｕｅｔＭａｂまたはｍＡｂを２０μＬ／分で５分間流すことにより、捕捉抗体の約１００応答単位を達成した。次に、５０μＬ／分の流量で５分間抗原を順次注射した。動態パラメーター（ｋ_ｏｎおよびｋ_ｏｆｆ）ならびに解離定数（ＫＤ）を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェアを用いて非線形フィットから計算した。結合結果を表９に示す。

ＢｉＳ３、ＢｉＳ５、およびＤｕｅｔＭａｂを含むＰＤ－１／ＴＩＭ３二重特異性抗体は、ヒトＴＩＭ３またはヒトＰＤ－１を過剰発現するＣＨＯ細胞に結合し（図３０および表２５）、ＰＤ－１およびＴＩＭ３発現（ＤＭＦ４）を図３１に示す。

ＣＭＶ Ａｇリコールアッセイ
ＢｉＳ３、ＢｉＳ５、およびＤｕｅｔＭａｂを含むＰＤ－１／ＴＩＭ３二重特異性抗体は、アイソタイプ処置と比較してＣＭＶ抗原リコールアッセイにおいてＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を増大した（図３２Ａ～Ｃ）。

混合白血球反応（ＭＬＲ）アッセイ
ＢｉＳ３、ＢｉＳ５、およびＤｕｅｔＭａｂを含むＰＤ－１／ＴＩＭ３二重特異性抗体は、混合白血球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、単剤および併用療法を超える活性でインターフェロン（ＩＦＮγ）分泌を増大した（図３３Ａ～Ｄ）。ＢｉＳ３、ＢｉＳ５、およびＤｕｅｔＭａｂを含むＰＤ－１／ＴＩＭ３二重特異性抗体は、主にＰＤ－１を発現する（８７％ＰＤ－１単一陽性）ｊｕｒｋａｔ ＮＦκＢリポータ系列において親ＬＯ１１５ ＩｇＧ１と同様の活性を示した（図３４Ａ～Ｃ）。

要約すると、３つの二重特異性フォーマット（ＤｕｅｔＭａｂ、ＢｉＳ３、およびＢｉＳ５）をＰＤ－１／ＴＩＭ３のために作製した。二重特異性フォーマットは、全て抗ＰＤ－１と同等であるか、またはより優れたインビトロ機能性を示し、これは、これらの分子が既存の癌免疫戦略に対して優れた利点をもたらし得ることを示唆している。

実施例２（ｄ）ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性結合タンパク質
表２で上に同定された親配列を用いて、ＰＤ－１およびＯＸ４０に結合する下記の二重特異性結合タンパク質を作製した。ＢｉＳ２、ＢｉＳ３、およびＢｉＳ５として識別されるタンパク質は、以下の表１０に示す配列を用いて作製し、後述するＯｃｔｅｔ結合アッセイを用いて同時結合試験について評価した。

Ｏｃｔｅｔ結合アッセイ
本明細書に開示する二重特異性結合分子の結合を評価するために、Ｎｉ－ＮＴＡバイオセンサーチップを備えるＯｃｔｅｔ ＱＫおよび１０×キネティクス緩衝液を使用した（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）。この特定のシリーズの二重特異性結合タンパク質の場合、Ｈｉｓタグ付きＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ、ｈｉｓ－タグ付きＰＤ－１－ＦｃおよびｈＯＸ４０－Ｆｃ（ヒト組換えタンパク質）をＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。全ての結合アッセイは２５℃で実施した。

分析前にサンプルプレートを１０００ｒｍｐで攪拌した。Ｎｉ－ＮＴＡバイオセンサーチップを１×キネティック緩衝液で５分間予め湿潤させた。１×キネティック緩衝液は、ベースライン決定のためのランニング緩衝液ならびに抗原および二重特異性抗体の希釈緩衝液としての役割も果たした。Ｎｉ－ＮＴＡバイオセンサーチップを、抗原捕捉のために１００ｎＭ ｈｉｓ－タグ付きＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ（以下の（ｂ）を参照されたい）またはｈｉｓ－タグ付きＰＤ－１－Ｆｃ中に約１分間浸漬した。抗原をコーティングしたバイオセンサーチップを各々１０μｇ／ｍｌの二重特異性抗体中に約５分間浸漬した後、１００ｎＭ ｈＯＸ４０－Ｆｃ抗原を含有するウェルのカラム内に２分間移した。結合結果は、ＢｉＳ２／ＢｉＳ３ ＯＸ４０Ａｂ／ＰＤ－Ｌ１分子がＰＤ－Ｌ１－ＨｉｓおよびｈＯＸ４０－Ｆｃの両方に結合すること、ならびにＢｉＳ２ ＯＸ４０Ａｂ／ＰＤ－Ｌ１が、ＢｉＳ３ ＯＸ４０Ａｂ／ＰＤ－Ｌ１よりも高い親和性で結合することを示している。ＢｉＳ２ ＯＸ４０Ａｂ／ＰＤ－１を対照として使用した（図３５）。

ブドウ球菌エンテロトキシン（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）Ｂ（ＳＥＢ）アッセイ
前述したプロトコルを用いたＳＥＢアッセイは、ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子がＢｉＳ２およびＢｉＳ３フォーマットの両方で活性であることを示した（図３６Ａ～Ｂ）。

ＰＤ－Ｌ１リポータアッセイ
材料：
－ 細胞株および培養条件：
－ ヒトＰＤ－１ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴルシフェラーゼクローン２受容体
－ ＰＤ－Ｌ１発現ＣＨＯ ｓｃＦｖ ＯＫＴ３（ＵＢＣ）（全細胞は、加湿組織培養インキュベータ内の１０％ＦＢＳおよび１×ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ抗体含有ＲＰＭＩ１６４０培地（ＲＰＭＩ完全培地）中に３７℃で維持した）。
－ ＲＰＭＩ－１６４０、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｃａｔ♯Ａ１０４９１０１
－ 熱不活性化新生ウシ血清（ＦＢＳ）、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｃａｔ♯２６０１００７４
－ 完全ＲＰＭＩ培地：１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０
－ １００×ペニシリン／ストレプトマイシン、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｃａｔ♯１５１４０－１２２
－ ９６ウェルＴＣ処理平底培養プレート、Ｃｏｓｔａｒ３９０３、ＶＷＲ ｃａｔ♯２９４４４－０１０
－ ＳｔｅａｄｙＧｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ，ｃａｔ＃Ｅ２５１０
－ 試験抗体
－ ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ

方法
ＰＤ－１阻害の中和についての２細胞生体活性アッセイのために、ＰＤ－Ｌ１発現ＣＨＯ ｓｃＦｖ ＯＫＴ３細胞をトリプシン処理し、温かいＲＰＭＩ完全培地で中和した後、５０ｍＬのコニカルチューブ内に収集した。細胞をＲＴにおいて５分間３８０ｇでペレット化してから、新鮮なＲＰＭＩ完全培地中に懸濁させた後、Ｖｉ細胞カウンター上でカウントした。ＣＨＯ ｓｃＦｖ ＯＫＴ３細胞を発現するＰＤ－Ｌ１を０．４ｅ６／ｍＬに調節し、１ウェル当たり２５μＬ（１０，０００細胞）をプレートレイアウトに示すように平板培養した。細胞をプレートに３時間付着させた。その後、試験試薬（２×最終濃度）を含有する５０μＬのＲＰＭＩを等分してＣＨＯ細胞上に添加し、さらに１時間インキュベートした。このインキュベーションにより、ＣＨＯ細胞表面上のＰＤ－Ｌ１に結合する時間を試験試薬に与える。１時間後、ＰＤ－１発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴルシフェラーゼリポータ細胞を５０ｍＬのコニカルチューブ内に収集し、ＲＴにおいて５分間３８０ｇでペレット化し、新鮮で温かいＲＰＭＩ完全培地に再懸濁させた。細胞を１．２ｅ６／ｍＬに調節し、ＰＤ－Ｌ１発現ＣＨＯ ｓｃＦｖ ＯＫＴ３細胞および試験品目を含むウェル中に２５μＬ（３０，０００）の細胞を平板培養した。

ＰＤ－１ Ｊｕｒｋａｔリポータ細胞活性化のために細胞および試験試薬を１８時間さらにインキュベートした。その後、ＳｔｅａｄｙＧｌｏルシフェラーゼ試薬を調製し、１００μＬを等分して各ウェルに添加した。ＲＴで穏やかに１５分間振盪（２００ｒｐｍオービタルシェーカ）することによって完全な溶解を達成した。溶解後、ＵＳ９６発光プロトコルを用い、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒでルシフェラーゼ活性を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、ログ［試験試薬］に対してルシフェラーゼＲＬＵをプロットし、非線形回帰分析、Ｓ字状用量応答曲線の４－パラメーターフィットを用いてＰＤ－Ｌ１拮抗のＥＣ_５０値を決定した。

結果：
１００ｎＭ（ＰＤ－Ｌ１）を出発点とする５点用量滴定を用いて、ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１ ＢｉＳ２／３をＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１親およびＮＩＰ２２８（Ｇ４Ｐ）対照に対して試験した。ＯＸ４０－ＰＤ－Ｌ１ ＢｉｓＡｂは、いずれも活性であり、ＰＤ－Ｌ１（４７３６）親よりも強いアゴニズムを有することが明らかにされた（図３７）。ＢｉＳ２およびＢｉＳ３フォーマットは同様に機能した。

ＣＭＶ Ａｇリコールアッセイ
ＣＭＶ Ａｇリコールアッセイ（前述したプロトコルを用いる）において、ＢｉＳ２およびＢｉＳ３分子は、組み合わせと比較して同等の活性を示した（図３８）。

前述した結合および免疫応答アッセイの全ては、本明細書に開示する二重特異性結合分子が両方の標的分子に対して特異的な結合を呈示し、いくつかの事例では個々の単一特異性親結合分子（抗体）の組み合わせよりも高い活性を呈示し、従って免疫応答を誘導または増強することができるという例証的データを提供する。さらに、癌細胞株に対して細胞殺傷活性を有することも示される。このように、データは、これらの分子および二重特異性プラットフォーム構造が癌免疫療法薬の優れた候補となることを明らかにしている。

Ｏｃｔｅｔ結合アッセイ（ＯＸ４０（ＳＬＲ）／ＰＤ－Ｌ１ ＢｉＳ５）
本明細書に開示する二重特異性結合分子の結合を評価するために、Ｎｉ－ＮＴＡバイオセンサーチップを備えるＯｃｔｅｔ ＱＫおよび１０×キネティクス緩衝液を使用した（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）。この特定のシリーズの二重特異性結合タンパク質の場合、Ｈｉｓタグ付きＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ、ｈｉｓ－タグ付きＰＤ－１－ＦｃおよびｈＯＸ４０－Ｆｃ（ヒト組換えタンパク質）をＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。全ての結合アッセイは２５℃で実施した。結合結果は、ＢｉＳ５ ＯＸ４０Ａｂ／ＰＤ－Ｌ１分子がＰＤ－Ｌ１－ＨｉｓおよびｈＯＸ４０－Ｆｃの両方に結合することを明らかにしている（図３９）。

ＰＤ－Ｌ１／ＯＸ４０ ＢｉＳ５は、ヒトまたはカニクイザルＯＸ４０およびＰＤ－Ｌ１／Ｂ７Ｈ１を発現するＣＨＯ細胞に結合した（図４０Ａ～Ｆ）。ＰＤ－Ｌ１／ＯＸ４０ ＢｉＳ５コンストラクトの結合は、フローサイトメトリー（ＨｙｐｅｒＣｙｔ）によっても測定した（図４２）。ＯＸ４０ ＩｇＧ４ＰおよびＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子は、Ｊｕｒｋａｔ ＯＸ４０受容体細胞に結合した。ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧおよびＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子は、ＮＣＩ Ｈ３５８およびＣＨＯＫ１ Ｂ７Ｈ１（ＰＤ－Ｌ１）／ＯＫＴ３細胞に結合した。ＩｇＧおよび二重特異性分子は、全てＨＥＫ ＣＤ３２ａ細胞に結合した。

ＰＤ－Ｌ１およびＯＸ４０受容体アッセイ
ＰＤ－Ｌ１受容体アッセイ（前述したプロトコルを用いる）において、ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖ含有二重特異性分子および陽性対照ＩｇＧは、全て活性を示した（図４２Ａ～Ｂ）。単一アームＯＸ４０対照およびアイソタイプ対照は、このアッセイでは活性を示さなかった。ＥＣ_５０およびヒルスロープは、抗ＰＤ－Ｌ１親対照ならびにＰＤ－Ｌ１ Ｂｉｓ２、Ｂｉｓ３およびＢｉｓ５コンストラクトについての以前のアッセイで得られた値と一致している。

ＨＥＫ ＣＤ３２ａ細胞を用いるＯＸ４０リポータ遺伝子アッセイにおいて、二重特異性コンストラクトは、互いに同等の活性を有し、Ｆｃ媒介性アゴニズムが観察された（図４３Ａ～Ｂ）。ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１ Ｂｉｓ５ Ｎ４３４Ａ ＩｇＧ１は、ＯＸ４０ ＩｇＧ４ＰおよびＭＥＤＩ０５６２（ＯＸ４０ ＩｇＧ１）と同等のＥＣ_５０活性を有した。

発現細胞に対してＣＨＯＫ１ ＰＤ－Ｌ１を用いるＯＸ４０リポータ遺伝子アッセイにおいて、ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子は、同等のアゴニズムを示す（図４４Ａ～Ｂ）。ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１ Ｂｉｓ５ Ｎ４３４Ａ ＩｇＧ１は、試験したＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１ Ｂｉｓ５二重特異性Ｍａｂの他のＦｃ変異体と同等のＥＣ_５０活性を有した。ＯＸ４０ ＩｇＧまたはＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧによるアゴニズムは検出されなかった。このように、ＰＤ－Ｌ１媒介性ＯＸ４０アゴニズムが実証された。

ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子を用いて腫瘍細胞とのＰＤ－Ｌ１媒介性ＯＸ４０アゴニズムが検出された（図４５Ａ～Ｂ）。ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子は、このアッセイで等しいアゴニズム－正規曲線を示した。ＯＸ４０ ＩｇＧによるアゴニズムは観察されなかったことから、ＯＸ４０ ＩｇＧとＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧとの組み合わせに対して、二重特異性分子を使用する有益性を証明している。ＮＣＩ Ｈ３５８ ＰＤ－Ｌ１ ＫＯ細胞によりアゴニズムは検出されなかった（図４６Ａ～Ｄ）が、これは、細胞で認められたＮＣＩ Ｈ３５８アゴニズムがＰＤ－Ｌ１特異的であることを示している。

ブドウ球菌エンテロトキシン（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）Ｂ（ＳＥＢ）アッセイ
ＳＥＢアッセイでは、ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子は、ＯＸ４０およびＰＤ－Ｌ１に対する個別の抗体の組み合わせよりも高い活性を有した（図４７Ａ～Ｄ）。特に、Ｇ４Ｐコンストラクトは、Ｇ１コンストラクトよりも高い活性を有した。野生型、ＹＴＥ含有変異体、およびＮ４３４Ａ変異体は、同等の活性を有した。

Ｔｒｅｇ抑制アッセイ
Ｔｒｅｇ抑制アッセイを実施してＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子を試験した（図４Ａ～Ｄ）。ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子は、ＰＤ－Ｌ１の存在下でのみ、ＣＤ４＋Ｔ_ｅｆｆ上で活性であった（図４９および５０）。特定の理論に拘束されるわけではないが、これは、トランスでのＯＸ４０の架橋を示すものであった。ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子は、Ｔ_ｒｅｇ阻害作用を抑制したが、これは、プレート固定化ＰＤ－Ｌ１への結合により架橋された場合に限られた。

混合白血球反応（ＭＬＲ）アッセイ
ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子を試験するために、ＭＬＲアッセイを実施した（図５１Ａ～Ｂ）。ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子は、ＯＸ４０およびＰＤ－Ｌ１に対する個別の抗体の組み合わせよりも高い活性を有した（図５２Ａ～Ｅ）。

抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ
ＡＤＣＣアッセイを実施してＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子を試験した。新しく単離したＮＫ細胞をエフェクター細胞として、またＣＨＯＫ１ ＰＤ－Ｌ１ Ｂ７Ｈ１およびＣＨＯＫ１ ＯＸ４０過剰発現細胞をそれぞれ標的細胞として２０：１のエフェクター：標的分子（Ｅ：Ｔ）比で用いるＡＤＣＣアッセイである。５時間後の標識標的細胞からのユウロピウムの放出を用いて標的細胞溶解を分析した。ＡＤＣＣアッセイでは、ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１ ＢｉＳ２およびＢｉＳ５は、ＰＤ－Ｌ１またはＯＸ４０発現ＣＨＯ細胞に対するＡＤＣＣを媒介した（図５３Ａ～Ｂおよび５４）。

新しく単離したＮＫ細胞をエフェクター細胞として、ならびにＰＤ－Ｌ１およびＯＸ４０過剰発現ＣＨＯ Ｋ１をそれぞれ標的細胞として１０：１のＥ：Ｔ比で用いてＣＤ１０７ａ動員アッセイを実施した。ＮＫ細胞の細胞表面に対するＣＤ１０７ａ動員は、４時間後にフローサイトメトリーにより分析した。ＢｉＳ２およびＢｉＳ５ ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイにおいて、ＰＤ－Ｌ１およびＯＸ４０発現ＣＨＯ細胞に対するＮＫ細胞のＣＤ１０７ａ動員を増大した（図５５）。ＢｉＳ２およびＢｉＳ５ ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子は、ＯＸ４０およびＰＤ－Ｌ１をアップレギュレーションした活性化同種異系Ｔ細胞に対するＮＫ細胞のＣＤ１０７ａ動員を増大した（図５６）。ＢｉＳ５ ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１は、活性化同種異系Ｔ細胞に対する２つの異なるドナーからＮＫ細胞のＣＤ１０７ａ動員を増大した（図５７Ａ～Ｂ）。

薬物動態および薬力学的（ＰＫ／ＰＤ）試験
ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子のＰＫ／ＰＤを比較するために試験を設計した（図５８）。ＰＤ－Ｌ１／ＯＸ４０二重特異性分子の血清濃度－時間プロフィールをカニクイザルにおいて比較した（図５９および表１１）。Ｂｉｓ５ ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ１ Ｎ４３４Ａ分子の平均Ｔ_１／２は、ＷＴＢｉｓ５分子のそれよりも高く；クリアランス速度は、ＷＴＢｉｓ５分子と比較してＢｉｓ５ ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ１ Ｎ４３４Ａ分子の方が低かった。いずれの分子も血清中の可溶性ＰＤ－Ｌ１を同様に低減し、Ｋｉ６７＋全メモリＣＤ４＋Ｔ細胞、全メモリＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の割合（％）に有意な増加を誘発した。

ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性分子は、アッセイＬＬＯＱより低く血清可溶性ＰＤ－Ｌ１濃度を低減した（図６０）。Ｎ４３４Ａ突然変異は、Ｂｉｓ５ ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１－Ｇ１の薬物動態を向上させた。特に、ＣＬは、ほぼ半分に低減し；対応してＴ１／２およびＡＵＣｉｎｆに２倍の増加が見られ；また、ＣｍａｘおよびＶｓｓは影響されなかった。これは、モノクローナル抗体のＰＫに対してこれまでに報告されているこの突然変異の作用と一致した。従って、Ｂｉｓ５ ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１－Ｇ１ ＩＯ ＢｉｓＡｂのｍＡｂ様ＰＫに向けた進歩が達成された。Ｂｉｓ５ ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１－Ｇ１ ＢｉｓＡｂの血清濃度は、２週間の時点で定量下限未満（ＢＬＯＱ）であったが、これは、ＡＤＡに関連していると考えられる。

ＰＤ－Ｌ１ ＯＸ４０ Ｂｉｓ５群を対照（抗ＰｃｒＶ－Ｐｓｌ対照）Ａｂ群と比較して実質的かつ統計的に有意な増加が全メモリＣＤ４、全メモリＣＤ８、およびＮＫ細胞増殖（Ｋｉ６７＋細胞のパーセンテージ）に認められた（図６１Ａ～Ｆ）。有意な差への傾向が全メモリＣＤ４、全メモリＣＤ８、およびＮＫ細胞増殖（Ｋｉ６７＋）におけるＰＤ－１ ＬＯ１１５とＰＤ－Ｌ１ ＯＸ４０ Ｂｉｓ５群との間に認められた。ＰＤ－Ｌ１ ＯＸ４０ Ｂｉｓ５ Ｎ４３４Ａ（半減期延長）バージョンとＧ１バージョンとの間で増殖に統計学に有意な差はなかった。ＰＤ－Ｌ１ ＯＸ４０ Ｂｉｓ５ Ｎ４３４ＡおよびＩｇＧ１バージョンは、生物学的に活性の二重特異性分子である。

実施例２（ｅ）．ＯＸ４０／ＰＤ－１二重特異性結合タンパク質
表２で上に同定された親配列を用いて、ＰＤ－１およびＯＸ４０に結合する下記の二重特異性結合タンパク質を作製した。ＢｉＳ２およびＢｉＳ３として識別されるタンパク質は、以下の表２４に示す配列を用いて作製し、後述するＯｃｔｅｔ結合アッセイを用いた同時抗原結合試験について評価した。

ＰＤ－１／ＯＸ４０ ＢｉＳ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ヒトおよびカニクイザルＰＤ－１ならびにヒトおよびカニクイザルＯＸ４０に同時に結合するように操作された二重特異性抗体（図６２；ＰＤ－１結合タンパク質は灰色で、ＯＸ４０結合タンパク質は薄い灰色で示す）である。特定の理論に拘束されるわけではないが、提示される作用機構は、ＯＸ４０およびＰＤ－１の両方にシス結合した後のＴ細胞に対する二重シグナル伝達作用、Ｔ細胞同時刺激表面受容体ＯＸ４０のアゴニズム、ならびに免疫抑制性ＰＤ－１の遮断を示唆している（図６３）。

Ｏｃｔｅｔ結合アッセイ
ＰＤ１－ＨｉｓおよびヒトＯＸ４０－Ｆｃに対するＰＤ－１（ＬＯ１１５）／ＯＸ４０ ＢｉＳ２ ｍＡｂの異なる２つのロットについての同時に結合活性を示す（図６４）。

ＯＸ４０リポータアッセイ
ＰＤ－１（ＬＯ１１５）／ＯＸ４０ ＢｉＳ２ ｍＡｂは、他のＯＸ４０アゴニストと同等の活性を示した（図６５Ａ～Ｂ）。タンパク質を４℃で保存し、直ちに使用して、３回凍結／解凍し、４℃で７日間保存した後、４０℃で７日間保存した。ｍＡｂの濃度に対する相対発光量として活性を記録した。０日目、４℃のＰＤ１（ＬＯ１１５）／ＯＸ４０ ＢｉＳ２ ｍＡｂのＥＣ_５０は約２ｎＭであった。

ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１リポータアッセイ
ＰＤ－１（ＬＯ１１５）／ＯＸ４０ ＢｉＳ２ ｍＡｂは、他のＰＤ－１アゴニストと同等の活性を示した（図６６Ａ～Ｂ）。タンパク質を４℃で保存し、直ちに使用して、３回凍結／解凍し、４℃で７日間保存した後、４０℃で７日間保存した。ｍＡｂの濃度に対する相対発光量として活性を記録した。０日目、４℃のＰＤ１（ＬＯ１１５）／ＯＸ４０ ＢｉＳ２ ｍＡｂについてＥＣ_５０は約１ｎＭであった。２組の一次ヒトインビトロ効力アッセイを実施した；抗原リコールＴ細胞アッセイおよびブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）を用いたＴ細胞同時刺激。

ブドウ球菌エンテロトキシン（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）Ｂ（ＳＥＢ）アッセイ
ＳＥＢアッセイにおいて、ＰＤ－１（ＬＯ１１５）／ＯＸ４０ ＢｉＳ２ ｍＡｂは、培養３日後に細胞の上清中に検出されたＩＬ－２のレベル増加を誘導した（図６７）。従って、ＰＤ－１／ＯＸ４０ ＢｉＳ２ ｍＡｂは、そのヒト標的抗原に同時に結合することができ、かつＴ細胞をインビトロで同時刺激することができる。

抗原リコールアッセイでは、ＰＤ－１／ＯＸ４０ ＢｉＳ２ ｍＡｂは、親ｍＡｂおよび親ｍＡｂの組み合わせと比較してインターフェロン（ＩＦＮ）γのレベル増大を駆動した（図６８および６９）。

ＣＭＶ Ａｇリコールアッセイ
ＣＭＶ Ａｇリコールアッセイ（前述のプロトコルを用いる）の結果、ＢｉＳ２およびＢｉＳ３分子は、組み合わせと比較して等しい活性を示さなかった（図７０）。データは、ＰＤ－１／ＯＸ４０ ＢｉＳ２ ＩｇＧ４Ｐ ｍＡｂがインビトロおよびインビボで活性であることを示している。ＰＤ－１／ＯＸ４０ ＢｉＳ２と構造が異なるＰＤ－１／ＯＸ４０ ＢｉＳ３は、検出可能な程度に活性ではなかった。従って、ＰＤ－１／ＯＸ４０ ＢｉＳ３（活性ではない）は、ＢｉＳ２（活性）と異なる。

薬物動態および薬力学的（ＰＫ／ＰＤ）試験
カニクイザルは、ＰＤ－１／ＯＸ４０ ＢｉＳ２ ｍＡｂの機能的活性を試験するための薬理学的に適切な非臨床的な種であると考えられた。ＰＤ－１／ＯＸ４０ ＢｉＳ２ ｍＡｂの薬物動態（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）をカニクイザルの非ＧＬＰ（Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）試験で評価した。０．１ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇの用量範囲にわたって単回静脈内（ＩＶ）投与後のカニクイザル（ｎ＝３；雄）において、ＰＤ－１（ＬＯ１１５）／ＯＸ４０ ＢｉＳ２ ｍＡｂ ＰＫおよびＰＤ（Ｋｉ６７陽性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋全メモリＴ細胞の％）を評価した。投与前、投与から１日、８日、１１日および１５日後にＰＢＭＣを採取し、凍結保存および解凍した後、フローサイトメトリーにより分析した。要約すると、ＰＤ－１（ＬＯ１１５）／ＯＸ４０ ＢｉＳ２ ｍＡｂは、０．６～１．７日の短い半減期と共にほぼ線形のＰＫを示した（図７０；表１２）。

平均ピーク濃度（Ｃ_ｍａｘ）は、０．１ｍｇ／ｋｇで２．０μｇ／ｍＬから３０ｍｇ／ｋｇで６０７μｇ／ｍＬまで用量にほぼ比例して増加した。ＡＵＣ∞は、０．１ｍｇ／ｋｇで１．７μｇ・日／ｍＬから３０ｍｇ／ｋｇで５７７μｇ・日／ｍＬまで用量にほぼ比例して増加した。平均血清クリアランスは、４１．８ｍＬ／日／ｋｇ～６０．２ｍＬ／日／ｋｇの範囲であった。定常状態分布容積は、４３．２ｍＬ／ｋｇ～８５．６ｍＬ／ｋｇの範囲であった。ＰＤ結果（図７１）は、ＣＤ４＋全メモリＴ細胞増殖（Ｋｉ６７）の用量依存的増大、およびＣＤ８＋全メモリＴ細胞増殖（Ｋｉ６７）の増大を示した。カニクイザル血清中のＰＤ－１／ＯＸ４０の定量について代表的な標準曲線を示す（図７２）。

実施例３．ＢｉＳＡｂコンストラクトの物理的および化学的安定性
他の二重特異性結合タンパク質構造戦略およびプラットフォームと比較して、本明細書に記載するＢｉＳＡｂコンストラクトの物理的および化学的安定性を評価するために一連の実験を実施した。特に、以下に述べる一連の安定性試験により、ＢｉＳＡｂの安定性に対する様々なｐＨ範囲の作用（たとえば、加水分解、フラグメント化、凝集、熱安定性）を明らかにすると共に分析した。様々なＢｉＳＡｂフォーマットの異なる例示的実施形態について、データが示すように、本明細書に開示するＢｉＳＡｂ（以下の試験では「ＢｉＳ５」として識別され、表１３に示すようにＤ／Ｈフォーマットである）は、他の全てのＢｉＳＡｂ構造モチーフと比較して予想外で驚くべき物理的および化学的安定性を示した。

実施例３．１
本明細書に開示されるＢｉＳフォーマット（「ＢｉＳ５」）と、ヒンジ領域（たとえば、ＦｃおよびＦａｂ領域間）で連結された２つの結合ドメイン（ｓｃＦｖドメイン）を含み、「ＢｉＳ４」として識別される別のＢｉＳフォーマットとの比較をさらに実施した。ＢｉＳ４およびＢｉＳ５タンパク質をチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）に発現させ、常用のクロマトグラフィー法によって精製した。上に注記したように、これらの２つのフォーマットは、同様のＦａｂおよびｓｃＦｖ配列を有し、それらの主な違いは、ｓｃＦｖドメインの位置である（本明細書に述べるように、ＢｉＳ４について、ｓｃＦｖは、ヒンジ領域内に位置し；この特定のＢｉＳ５について、ｓｃＦｖは、Ｃ_Ｈ３ドメイン内のＳＮＧループ中に存在する）。精製したＢｉＳ分子をＰＢＳ緩衝液中に添加し、１．５４Ｍ^－１ｃｍ^－１の消散係数を用い、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ－１０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅ）を用いてタンパク質濃度を決定した。

ｐＨスクリーンおよび短期安定性試験
ｐＨスクリーン試験のために、ＢｉＳ４およびＢｉＳ５抗体を約１２ｍｇ／ｍＬまで濃縮して、６つの異なるｐＨ条件、２０ｍＭコハク酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、ヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌ（ｐＨ５．５、６．０、および６．５）、ならびにリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０および７．５）（全て、２４０ｍＭスクロースを含有する）に対して透析した。Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ透析カセット（１０ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を用いて透析を実施した。透析の完了後、０．０２％のポリソルベート８０を加え、タンパク質の最終濃度を約１０ｍｇ／ｍＬに調節した。予め消毒したクリーンベンチ内の０．２２μｍフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いてＢｉＳ４およびＢｉＳ５製剤を滅菌した。１ミリリットルのアリコートを３ｍＬのホウケイ酸ガラスＩ型バイアル中に分配した（Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｅｘｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）。サンプルを４０℃で保存し、ゼロ時点ならびに１、２、３、および４週間の保存後、ＳＥＣにより分析した。

示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
温度調節オートサンプラー（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）に接続したＶＰ－Ｃａｐｉｌａｒｙ ＤＳＣを用いて、ゼロ時間サンプルについて示差走査熱量測定サーモグラムを取得した。サーモグラムを取得するために、２０℃～１００℃の温度範囲にわたって９０℃／時の走査速度と共に１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を使用した。５．０～７．５の範囲の異なるｐＨ条件でＢｉＳ４およびＢｉＳ５のサーモグラムからバッファーを差し引いた後、ベースライン補正した。Ｏｒｉｇｉｎ ７ ＳＲ４ソフトウェアパッケージ用のＤＳＣプラグインを用いてデータ解析を実施した。３つの遷移を有する多状態モデルに実験結果を当てはめて、融解温度（Ｔ_ｍ）値を計算した。第１の温度遷移の熱容量（Ｃ_ｐ）値が５００ｃａｌ ｍｏｌ^－１℃^－１に達した点を開始温度（Ｔ_{ｏｎｓｅｔ}）とみなした。

高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ－ＳＥＣ）
サイズに基づいてモノマーから凝集体およびフラグメント種を分離するために、７．８×３０ｃｍ^２、５μｍ、２５０Å、Ｔｏｓｈｏ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌ（ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）で２００～４００ｎｍ ＵＶ吸収スペクトルを記録することができる光ダイオードアレイ検出器および対応するガードカラムを備えるＡｇｉｌｅｎｔ高性能液体クロマトグラフィーシステムを用いて安定性サンプルを分析した。種を分離するために、０．１Ｍ無水リン酸水素二ナトリウム、０．１Ｍ硫酸ナトリウム、０．０１％アジ化ナトリウムを含有する移動相、ｐＨ６．８および１ｍＬ／分の流量を使用した。注射されるタンパク質の量は、約２５０μｇであった。２８０ｎｍの吸収スペクトルを用いてＢｉＳ４およびＢｉＳ５の分離をモニターした。可溶性凝集体（多量体および２量体）、モノマー、およびフラグメントのピーク面積を定量した。次に、これらの種の各々のパーセンテージを計算し、インキュベーション時間に対してプロットすることにより、動態プロットを作成した。各動態プロットの傾きを計算することにより、毎月のモノマー喪失、フラグメント化および凝集の速度についてのｐＨプロフィール曲線を作成した。

ＢｉＳ４およびＢｉＳ５の熱安定性
キャピラリー型ＤＳＣを用いて取得し、６つの異なるｐＨ条件で作成したサーモグラムの解析から、ＢｉＳ４およびＢｉＳ５の熱安定性に対するｐＨの作用を評価した。図７４Ａおよび７４Ｂは、それぞれｐＨ５．０～７．５までのＢｉＳ４およびＢｉＳ５のＤＳＣサーモグラムを重ねて示す。図７３に示すように、各サーモグラムは、遷移温度Ｔ_ｍ１、Ｔ_ｍ２、およびＴ_ｍ３による３つの熱変性事象を示す。第１の遷移（Ｔ_ｍ１）は、Ｃ_Ｈ２およびｓｃＦｖドメインの同時変性と関連すると考えられ、第２（Ｔ_ｍ２）および第３（Ｔ_ｍ３）遷移は、Ｃ_Ｈ３およびＦ_ａｂドメインの変性と関連する。いずれのフォーマットについても、最大６．５までのｐＨの増加と共に、Ｔ_{ｏｎｓｅｔ}、Ｔ_ｍ１、Ｔ_ｍ２、およびＴ_ｍ３の増加が観察された（図７３Ａ、７３Ｂ、７３Ｅおよび以下の表１４）。ＢｉＳ４およびＢｉＳ５について、全てのｐＨ条件でＴ_{ｏｎｓｅｔ}、Ｔ_ｍ２、およびＴ_ｍ３に差は認められなかった（図７３Ｅおよび表１５）が、これは、ヒンジ領域またはＣ_Ｈ３ドメインいずれかにおけるｓｃＦｖの存在がＣ_Ｈ３およびＦ_ａｂの熱安定性に影響を与えないことを示すものである。興味深いことに、全てのｐＨ条件でＴ_ｍ１のわずかな増加がＢｉＳ５について観察され、これは、ｓｃＦｖがＣ_Ｈ３ドメイン内に位置する場合、ｓｃＦｖ、Ｃ_Ｈ２のいずれかまたはその両方の熱安定性の増加を示している。

ＢｉＳ４およびＢｉＳ５の物理的および化学的安定性
異なるｐＨ値（５．０～７．５）でＢｉＳ４およびＢｉＳ５フォーマットの物理的および化学的安定性を４０℃で最大４週間評価した。「ゼロ時間」でのＨＰ－ＳＥＣクロマトグラムを用いて、他の時点のＨＰ－ＳＥＣクロマトグラムの総面積、モノマー、凝集体、およびフラグメント含量を比較した。４週間と比較した、ｐＨ７．５ゼロ時間でのＢｉＳ４およびＢｉＳ５の代表的なクロマトグラムを図７４Ａに示す。全てのサンプルは、主として、低レベルの可溶性凝集体を含み、かつフラグメントを含むまたは含まないモノマーを含有する。ゼロ時間（実線）でサンプルの大部分はモノマーであり、若干の濃度差によると思われる２つのサンプル間のピーク高さのわずかな違い以外に顕著な違いはない（図７４Ａ）。点線は、４０℃で４週間の保存後に同じｐＨ条件で両方のフォーマットのＨＰ－ＳＥＣクロマトグラムを重ねて示す。加速した温度ストレス条件下でいずれのフォーマットもさらなるピーク、早期溶離ピーク（多量体種）、モノマーの減少、およびフラグメントレベルの増加を示す（図７４Ａ）。フラグメント化によるモノマーの喪失は、ＢｉＳ５と比較してＢｉＳ４でより顕著であったが、これは、ＢｉＳ５の方が化学的に安定していることを示す。それらの構造、考えられるフラグメント化部位、および保持時間に基づき、小さいフラグメントピーク（ＲＴ約１０．８分）がＦａｂであり、大きいフラグメントピーク（ＲＴ約９．８分）およびショルダーピーク（ＲＴ約８．７分）が、それぞれｓｃＦｖを含むＦａｂ、ならびにＦａｂ、ｓｃＦｖ、およびＦｃを含むその対応する高分子量フラグメント（ＨＭＷＦ）であると推測される。

ＢｉＳ４およびＢｉＳ５の物理的および化学的安定性に対するｓｃＦｖの位置の影響をさらによく評価するために、各々の種の総面積の割合（％）をｐＨ７．５、４０℃でゼロ時間および４週間について棒グラフにプロットした（図７４Ｂ）。図７４Ｂに示すように、ゼロ時間では、ＢｉＳ４およびＢｉＳ５のモノマー純度は類似している。最大４週間４０℃でインキュベートしたサンプルは、形成されたフラグメントの種類および程度に有意な差を示した。ＢｉＳ４の場合、１１．８％、７．２％および３．５％のショルダーピーク（ＲＴ約８．７分）、大きいフラグメント（ＲＴ約９．８分）および小さいフラグメント（ＲＴ約１０．８分）がそれぞれ形成された（図７４Ｂ）。驚くべきことに、ＢｉＳ５サンプルは、恐らくｓｃＦｖがドメインの両側からＦｃにテザリングしたために、わずか１．４％の小さいフラグメント（ＲＴ約１０．８分）のみを示した。

図７５Ａ～７５Ｃは、ｐＨ７．５サンプルについて４０℃でインキュベートしたＢｉＳ４およびＢｉＳ５の凝集、フラグメント化およびモノマー喪失の速度論を示す。ＢｉＳ４サンプルは、ＢｉＳ５に比べて速いモノマーの喪失速度を示した（図７５Ａ）。ｐＨ７．５でのＢｉＳ４およびＢｉＳ５のモノマーの喪失速度は、それぞれ毎月２７．４％および毎月４．５％であった（図７５Ａ）。ＢｉＳ４の場合、モノマー喪失の大部分は、毎月２３．９％であったフラグメント化に起因し、これより程度は低いが、３．５％／月であった凝集によるものであった（図７５Ｂおよび７５Ｃ）。興味深いことに、ＢｉＳ５の場合、凝集は、フラグメント化速度（１．７％／月）と比較してやや高い速度（２．８％／月）であると思われる（図７５Ｂ～７５Ｃ）。

ＢｉＳ４およびＢｉＳ５フォーマットの物理的および化学的安定性、毎月のモノマー喪失、フラグメント化および凝集速度に対するｐＨの作用のさらなる分析を、６つのｐＨ条件に対して上記の値をプロットすることにより実施した（図７６Ａ～７６Ｃ）。ｐＨ５．０～７．５の範囲の６つのｐＨ条件の全てを通して、モノマー喪失速度は、ＢｉＳ４よりもＢｉＳ５フォーマットの方が低く（図７６Ａ）、これは、本明細書に開示するＢｉＳ５フォーマットが他の二重特異性タンパク質フォーマットよりも予想外に優れた物理的および化学的安定性を有することを示唆している。ＢｉＳ４の場合、モノマー分解の大部分は、さらに低いｐＨ条件でのフラグメント化によるものであった（図７６Ｂ）。ＢｉＳ５は、試験した全てのｐＨ条件において、Ｂｉｓ４よりも低いフラグメント化速度を示した。驚くべきことに、ＢｉＳ５のフラグメント化速度は、広いｐＨ範囲にわたって平坦であり、Ｂｉｓ４よりも低いと思われる。いずれかの特定の理論に拘束されるわけではないが、ＢｉＳ５で観察された比較的低いフラグメント化速度は、それをＦｃに連結するｓｃＦｖのいずれかの末端のＧ_４Ｓリンカーに起因し得る。Ｆｃと連結させるＧ_４Ｓリンカーの一方でのフラグメント化は、他方のＧ_４Ｓリンカーを介してＦｃに依然として連結している可能性があるため、ｓｃＦｖを放出しないであろう。ＢｉＳ４およびＢｉＳ５において、凝集速度は、試験した全てのｐＨ条件を通して類似していると思われ（図７６Ｃ）、これは、ｓｃＦｖの位置が凝集動態に最小限の影響をもたらし、これは、キャピラリー型ＤＳＣを用いて測定された通り、全てのｐＨ条件で２つのフォーマット間のＴ_{ｏｎｓｅｔ}に変化が認められなかったことによっても支持される（図７３Ｅおよび前述の表１４）。ｐＨ７．５および４０℃（時間＝０）では、分子のいずれも明らかなフラグメント化を示さなかった（図７７Ａ）が、４０℃で２週間の保存後の同じ条件下ではＢｉＳ４について明らかなフラグメント化が観察され、ＢｉＳ５についてわずかなフラグメント化が認められる（図７７Ｂ）。ＢｉＳ４およびＢｉＳ５のいずれも、低い（５．５）ｐＨではフラグメント化および凝集が低下したが、ＢｉＳ５は、いずれのｐＨ値でもフラグメント化および凝集の両方で優れた性能を有する（図７８）。この実験のシリーズは、本明細書に開示するＢｉＳ５がＢｉＳ４よりも優れた化学的安定性を有し、ＢｉＳ４と同様の物理的安定性を有することを実証している。

実施例３．２
本明細書に開示され、コンストラクトＡ～Ｈとして識別される二重特異性結合タンパク質の様々な実施形態の物理的および化学的安定性を評価するためにさらなる試験を実施した（たとえば、上の表１３および関連実施例）。以下に記載するように、ＤＳＣ、加速保存安定性、ならびにＦｃＲｎおよびＦｃｇＲ結合アッセイを用いてこれらのコンストラクトを分析した。

示差走査熱量測定分析
このデータセットのためのＤＳＣ実験は、Ｍｉｃｒｏｃａｌ ＶＰ－ＤＳＣ走査マイクロ熱量計（Ｍｉｃｒｏｃａｌ）を用いて実施した。ＤＳＣに使用する溶液およびサンプルは、全て０．２２μｍフィルタを用いて濾過し、熱量計にロードする前に脱気した。ＤＳＣ試験に使用する抗体は、分析ＳＥＣにより決定して＞９８％モノマーであった。ＤＳＣ分析前に全てのサンプルを２５ｍＭヒスチジン－ＨＣｌ（ｐＨ６．０）中で十分に透析した（少なくとも３回の緩衝液交換）。この透析からの緩衝液を次のＤＳＣ実験のための標準緩衝液として用いた。サンプル測定前にベースライン測定値（緩衝液対緩衝液）をサンプル測定値から差し引いた。透析したサンプル（濃度１ｍｇ／ｍｌ）をサンプルウェルに添加し、ＤＳＣ測定を１℃／分の走査速度で実施した。Ｍｉｃｒｏｃａｌから提供されたＯｒｉｇｉｎ（商標）ＤＳＣソフトウェアを用いてデータ解析およびデコンボリューションを実施した。非二状態モデルを用いてデコンボリューション解析を実施し、１００反復サイクルを用いて最良適合を取得した。Ｔ_{ｏｎｓｅｔ}は、サーモグラムが非ゼロの傾きを有することが明らかとなる定性温度として定義され、Ｔ_ｍは、組における分子の半分が変性される温度として定義され、これは、サーモグラムでの各ピーク最大値に対応する温度値として計算される。

異なるコンストラクトの結果を図７９に示す。一般に、ｓｃＦｖとして２Ｆ４を含むコンストラクトＡ、Ｃ、Ｄは、ｓｃＦｖとしてＬＣ１０を含むコンストラクトＥ、Ｇ、Ｈと比較すると低いＴ_Ｍ１を有する。特定の理論に拘束されるわけではないが、ＴＭ１値の差は、２Ｆ４可変ドメインに対して、ＬＣ１０ ｓｃＦｖドメインの本質的に優れた熱安定性に起因すると考えられる。これらのデータは、ｓｃＦｖとして２Ｆ４を有するコンストラクトＡ～Ｄが、ｓｃＦｖとしてＬＣ１０を有するコンストラクトＥ～Ｈよりも熱安定性が低いであろうことを示唆している。

加速保存安定性分析
コンストラクトの濃度を１ｍｇ／ｍＬに正規化した。１ｍＬの各二重特異性コンストラクトまたはＩｇＧ対照を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに等分して導入した。サンプルを静的インキュベータにおいて４５℃で２週間インキュベートした。３、７、および１４日時点でサンプルを分析し、安定性について評価した。各時点で外観検査を実施してあらゆる混濁または沈殿の増大を記録した。０．２ｕｍスピンカラムを用いてサンプルを濾過し、１２０ｕｌのサンプルを等分してＨＰＬＣに導入し、バイアルの底に気泡がないことを確認した。次に、泳動用緩衝液として０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１Ｍ硫酸ナトリウム（ｐＨ６．８）を含むＴＳＫ－ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷ_ＸＬ（３００×７．８ｍｍ）Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅカラムを用いて、凝集および分解についてチェックするためにＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣ－ＳＥＣでサンプルを試験した。６０μＬのサンプルを注射し、１ｍＬ／分の流量で流した。モノマー保持時間（分）、総ピーク面積、％モノマー、％凝集体、％フラグメント、％モノマー喪失を取得し、解析的ＳＥＣ分析に使用した。結果を表１５にまとめる。

本明細書に記載するように、前述のコンストラクトにおけるｓｃＦｖドメインの位置は次の通りである（「－」は、ｓｃＦｖを示す）：ＡおよびＥは、ＩＳ－ＲＴＰであり；ＢおよびＦは、ＡＫ－ＧＱＰであり；ＣおよびＧは、Ｓ－ＮＧであり；ＤおよびＨは、ＳＮ－Ｇである。様々なＴ_Ｍ値は、下記ドメインと関連している：Ｔ_Ｍ１＝ＣＨ２／ｓｃＦｖ；Ｔ_Ｍ２＝Ｆａｂ；Ｔ_Ｍ３＝ＣＨ３。データは、ＩＳＲＴＰ（Ａ）およびＳＮＧ（Ｃ）ループに挿入された２Ｆ４ ｓｃＦｖを有するコンストラクトＡおよびＣが、同じ位置に挿入されたＬＣ１０ ｓｃｆｖを有するコンストラクトＥおよびＧよりも凝集しやすいことを示す傾向がある。この観測は、ｓｃＦｖドメインの配列アイデンティティおよび挙動が二重特異性結合タンパク質コンストラクトの安定性に作用をもたらし得ることを示唆している。さらに、以上のことから、２Ｆ４ ｓｃＦｖを含有するコンストラクトＤは、ＡおよびＣと同様の低い安定性を有することを予測することができるが、ＳＮＧループに２Ｆ４ ｓｃＦｖを挿入すると、分子を安定化し、凝集体を形成する傾向を低減するようである。総合的に考えると、この加速安定性試験は、Ｆｃ領域内のｓｃＦｖ配列および位置がＢｉＳＡｂコンストラクトの安定性においてかなり重要な役割を果たし得ることを示している。

ＦｃＲｎおよびＦｃγＲ結合分析
ＢＩＡｃｏｒｅ３０００計器（ＢＩＡｃｏｒｅ）を用いて結合実験を実施した。抗体を捕捉するために１０００ＲＵ ＩｓｄＨ（Ｆａｂ）抗原をＣＭ５チップに固定化した。１００ｎＭのＢｉＳＡｂコンストラクトまたはｍＡｂ対照を２０μＬ／分で５分間流すことにより、抗体を捕捉した。５ｕＭ ｈｕＦｃＲｎまたはＦｃγＲＩ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩａ－１５８ＶまたはＩＩＩＡ１５８Ｆを５μＬ／分で２０分間流した。ｐＨ６．０のＰＢＳ＋５ｕＭ ＥＤＴＡ中でＦｃＲｎ結合を実施すると共に、ｐＨ７．４のＰＢＳ＋５ｕＭ ＥＤＴＡ中でもＦｃＲｎ結合を実施した。

コンストラクトＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＧおよびＨをＦｃＲｎ結合について評価した。二重特異性コンストラクトＥおよびＨの各々について、ならびにＦｃＲｎに対する２Ｆ４ ＩｇＧ結合について代表的なデータを図８０に示す。ＣＨ２－ＣＨ３境界面の下流にｓｃＦｖを有するコンストラクトは、ＦｃＲｎ結合を保持することがわかる（たとえば、ＤおよびＨコンストラクト）。ＣＨ２－ＣＨ３境界面の上流のＩＳＲＴＰループ内に位置するｓｃＦｖを有するコンストラクトは、検出可能なＦｃＲｎ結合を除去すると思われる（たとえば、ＡおよびＥコンストラクト）。ＩＳＲＴＰループは、ＦｃＲｎ結合に重要であることがわかっているＦｃ（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）における既知の半減期延長ＹＴＥ突然変異の領域内にある。

コンストラクトＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、およびＨをＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ－１５８Ｆ、およびＦｃγＲＩＩＩａ－１５８Ｖとの結合について試験した。ＦｃγＲＩＩＩａ－１５８Ｖに対するコンストラクトＥ、Ｇ、およびＨの結合について代表的なデータを図８１に示す。試験した全てのコンストラクトは、ＦｃγＲとの結合を保持したが、親和性が異なっていた（図８１、差し込み図）。表１６は、ＦｃγＲに対する様々なコンストラクトの観察された結合傾向を示す。

ＣＨ２－ＣＨ３境界面の下流のＳＮＧループに挿入されたｓｃＦｖを有する他のコンストラクト（Ｃ、Ｄ、Ｇ、およびＨ）と比較して、ＣＨ２－ＣＨ３境界面の上流のＩＳＲＴＰループ内に挿入されたｓｃＦｖを有するコンストラクト（ＡおよびＥ）とのＦｃγＲ結合に認められる違いは、一貫して低いＦｃγＲ結合を示す。

コンストラクトＡおよびＥのＦｃＲｎ結合を改善または回復することができるか否かを評価する試みは、Ｆｃ領域への半減期延長ループ（Ｎ３）を導入することによって実施した。図８２は、代表的なデータを示し、Ｅコンストラクトについて、ＢｉＳ５Ａｂ ＥまたはＮ３ループが導入されたコンストラクトＥ（ＢｉＳ５Ａｂ Ｅ＋Ｎ３）のいずれもＦｃＲｎと結合することができなかったことを示す。さらに、Ｎ３ループにＬＣ１０ ｓｃＦｖを挿入し（Ｎ３ ｓｃＦｖ）、ＩＳＲＴＰループをインタクトに維持しても、ＦｃＲｎ結合は、検出可能レベル未満に低下した。これらのデータは、少なくともＥコンストラクトの場合、そうでなければ本明細書に開示するコンストラクトの各々について、ＩＳＲＴＰループおよびＮ３ループ（存在する場合）のいずれも、ＦｃＲｎ結合を保持するためにインタクトかつ非修飾に維持する必要があることを示している。

実施例３．３
ＢｉＳ４と、本明細書に開示する二重特異性結合コンストラクト（ＢｉＳ５）との比較以外に、他の３つのＢｉＳ構造モチーフプラットフォームを評価するために試験を実施し、ＢｉＳ１、ＢｉＳ２、およびＢｉＳ３として識別された（図８３を参照されたい）。図８３を参照して理解されるように、これらのプラットフォームは、１つの結合ドメイン（ｓｃＦｖドメインとして示す）の位置に関して変化する。５つのモチーフのうち、ＢｉＳ４およびＢｉＳ５のみが、大きいタンパク質との結合点として２つのリンカー部分を含み、それ以外（ＢｉＳ１、ＢｉＳ２、およびＢｉＳ３）は、単一のリンカーにより結合される。

手短には、上の実施例３．１および３．２で述べた技術を用いて各コンストラクトの代表的な分子を安定性について分析した。各コンストラクトのサンプルをｐＨ５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、および７．５の緩衝液に添加し、２ヵ月の期間にわたって４０℃で保存した。次に、ＨＰ－ＳＥＣを用いてサンプルをフラグメント化速度（図８４）、凝集速度（図８５）、およびモノマー喪失速度（図８６）について分析した。これらの条件下において、分析から、本明細書に開示する二重特異性結合タンパク質フォーマット（「ＢｉＳ５」；および表１３で上に示すＤ／Ｈフォーマット）が全てのｐＨ条件で他の全てのフォーマットより優れた物理的および化学的安定性を有することがわかった。

また、ＳＥＣデータを用いて、ＢｉＳ分子の対応するフラグメントに様々なピークをマッピングした（図８７）。マッピングは、フラグメント化が分子のヒンジおよびリンカー領域で起こること、フラグメントの大きさ、理論上のフラグメント化、ならびに予想されるフラグメント種が、他のフォーマットで観察されるフラグメント種に関してどのように調整されるかなどの推定に基づいて行った。各フォーマットにおいて低分子量フラグメント（ＬＭＷＦ）間では良好な分解があるものの、全てのフォーマットにおいてモノマーと高分子量フラグメント（ＨＭＷＦ）との間の分解は乏しいかまたは皆無である。表１７の情報に基づき、ＨＰ－ＳＥＣ技術は、モノクローナル抗体よりもはるかにＢｉＳフォーマットのフラグメント化を過小評価すると結論付けた。代替的な分析を以下に述べるように開発した。

（ｉ）分解中、小さいフラグメントが検出されたら、対応する大きいフラグメントも存在するはずであり；（ｉｉ）安定性試験の期間中、二次フラグメント化（フラグメントのフラグメント）は有意に起こらず；かつ（ｉｉｉ）フラグメント化は、リンカー領域および／またはヒンジ領域で起こるという推定に基づくモル消散係数を用いて、ＨＭＷＦのフラグメント化速度を計算するために代替的な分析を開発した。下記の関係に基づいてフラグメント化速度を決定した。

さらに、ジスルフィド結合がフラグメント化および安定性に影響をもたらしたか否かを決定するために、還元条件下のコンストラクトを用いてフラグメント化速度の分析を実施した。このアッセイの代表的なデータを（図８６）に示す。還元条件下において、より高いフラグメント化速度は、ＢｉＳ１を除いて全てのＢｉＳフォーマットで観測可能であった（表１９）。還元条件下でのより高いフラグメント化速度は、ＢｉＳ５コンストラクト中のｓｃＦｖ部分がＣＨ３領域にテザリングされていることを裏付けると結論付けられた（図８９）。

上に開示した安定化ジスルフィド結合の特徴をさらに調べた。結果を以下の表２３および２４に示す。２つの異なる特異性に対応する二重特異性抗体を、ｓｃＦｖに安定化ジスルフィド結合を含むまたは含まないＢｉＳ４およびＢｉＳ５（ｓｃＦｖはＳＮ－Ｇループに挿入されている）フォーマットで作製した。加速安定性試験により、安定化ジスルフィド結合を含まないＢｉＳ４コンストラクトは、安定化ＶＬ－ＶＨジスルフィド結合の導入により阻止される分解による実質的なモノマー喪失を有することがわかった。これらの結果は、ＢｉＳ５コンストラクトのｓｃＦｖ中の安定化ジスルフィド結合の除去がその安定性に有意な作用をもたらさなかったことを示している。

上の全データに基づき、本明細書に開示する二重特異性結合タンパク質フォーマットが、試験した全てのフォーマットの中で最も安定していると思われる。さらに、ＢｉＳＡｂ５は、試験した低ｐＨ値（たとえば、５．０、５．５、および６．０）において、フラグメント化および凝集の両方を最小にするという点から最も安定していることがわかる。このように、本明細書に開示するＢｉｓＡｂの予想外の驚くべき安定特性により、二重特異性結合分子の作製に使用されている他の構造プラットフォームおよびフォーマットに対してさらなる利点がもたらされる。

参照による援用
本明細書に言及した刊行物および特許の全ては、各個別の刊行物または特許を参照により援用するために具体的に個々に示しているかのように、参照によりその全体が本明細書に援用される。

本開示の具体的な態様について考察してきたが、上記の記載は例示であり、限定するものではない。本明細書および下記の特許請求の範囲を検討すれば、本開示の多くの変更形態が当業者に明らかになるであろう。本開示の全範囲は、特許請求の範囲をその均等物の全範囲と共に、および本明細書をその変更形態と共に参照して決定されるべきである。
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）第１のエピトープに結合する第１の結合ドメイン（ＢＤ１）と、
第２のエピトープに結合する第２の結合ドメイン（ＢＤ２）と、
Ｃ_H２およびＣ_H３ドメインを含むＦｃ領域と
を含むタンパク質であって、
前記Ｆｃ領域は、前記Ｃ_H２ドメイン、前記Ｃ_H３ドメイン、または前記Ｃ_H２およびＣ_H３ドメインの境界面における溶媒曝露ループにＢＤ２を含み、
前記タンパク質は、前記第１および第２のエピトープの各々に結合するために二価である、タンパク質。
（２）前記Ｆｃ領域は、前記Ｃ_H２ドメイン、前記Ｃ_H３ドメイン、または前記Ｃ_H２およびＣ_H３ドメインの前記境界面においてアミノ酸配列における溶媒曝露ループにＢＤ２を含む、（１）に記載のタンパク質。
（３）前記溶媒曝露ループは、前記Ｃ_H２ドメイン由来のアミノ酸配列を含む、（２）に記載のタンパク質。
（４）前記溶媒曝露ループは、アミノ酸配列ＩＳＲＴＰ（配列番号３９）を含む、（３）に記載のタンパク質。
（５）前記溶媒曝露ループは、前記Ｃ_H３ドメイン由来のアミノ酸配列を含む、（２）に記載のタンパク質。
（６）前記溶媒曝露ループは、アミノ酸配列ＳＮＧを含む、（５）に記載のタンパク質。（７）前記溶媒曝露ループは、前記Ｃ_H２ドメインおよび前記Ｃ_H３ドメインの前記境界面由来のアミノ酸配列を含む、（２）に記載のタンパク質。
（８）前記溶媒曝露ループは、アミノ酸配列ＡＫＧＱＰ（配列番号４０）を含む、（７）に記載のタンパク質。
（９）ＢＤ２は、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、（１）～（８）のいずれか一に記載のタンパク質。
（１０）ＢＤ１は、Ｆａｂドメイン、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、および抗体可変ドメインからなる群から選択される結合ドメインを含む、（１）～（８）のいずれか一に記載のタンパク質。
（１１）ＢＤ１は、Ｆａｂドメインを含む、（１）～（８）のいずれか一に記載のタンパク質。
（１２）前記Ｆａｂドメインは、抗体ヒンジ領域を介して前記Ｆｃ領域に連結されている、（１１）に記載のタンパク質。
（１３）前記Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＤ由来のＦｃ領域からなる群から選択されるドメインを含む、（１）～（８）のいずれか一に記載のタンパク質。
（１４）前記Ｆｃ領域は、変異型Ｆｃ領域を含む、（１３）に記載のタンパク質。
（１５）前記Ｆｃ領域は、非グリコシル化されている、（１３）に記載のタンパク質。
（１６）前記Ｆｃ領域は、脱グリコシル化されている、（１３）に記載のタンパク質。
（１７）前記Ｆｃ領域は、低フコシル化を有するか、または非フコシル化されている、（１３）に記載のタンパク質。
（１８）ＢＤ２と前記Ｆｃ領域との間にタンパク質リンカーＬ１をさらに含む、（１）～（８）のいずれか一に記載のタンパク質。
（１９）ＢＤ２と前記Ｆｃ領域との間に第１のタンパク質リンカーＬ１および第２のタンパク質リンカーＬ２をさらに含む、（１）～（８）のいずれか一に記載のタンパク質。
（２０）ＢＤ２は、タンパク質リンカーＬ１を介して前記Ｆｃ領域と結合される、（１）～（８）のいずれか一に記載のタンパク質。
（２１）ＢＤ２は、２つのタンパク質リンカーＬ１およびＬ２を介して前記Ｆｃ領域と結合される、（１）～（８）のいずれか一に記載のタンパク質。
（２２）Ｌ１およびＬ２は、（Ｇ₄Ｓ）₂（配列番号４１）、（Ｇ₄Ｓ）₃（配列番号４２）、および（Ｇ₄Ｓ）₄（配列番号４３）から独立に選択される、（１８）～（２１）のいずれか一に記載のタンパク質。
（２３）Ｎ末端からＣ末端に以下のポリペプチドドメイン：
Ｖ_H１－Ｃ_H１－Ｃ_H２（Ｎ末端）－ＢＤ２－Ｃ_H２（Ｃ末端）－Ｃ_H３
を含むキメラ重鎖を含み、および
ＢＤ１は、Ｆａｂドメインを含み、
Ｖ_H１は、前記Ｆａｂドメインの重鎖可変ドメインを含み、およびＣ_H１は、前記Ｆａｂの重鎖定常ドメイン１を含む、（１）に記載のタンパク質。
（２４）Ｎ末端からＣ末端に以下のポリペプチドドメイン：
Ｖ_H１－Ｃ_H１－Ｃ_H２－ＢＤ２－Ｃ_H３
を含むキメラ重鎖を含み、および
ＢＤ１は、Ｆａｂドメインを含み、
Ｖ_H１は、前記Ｆａｂドメインの重鎖可変ドメインを含み、およびＣ_H１は、前記Ｆａｂの重鎖定常ドメイン１を含む、（１）に記載のタンパク質。
（２５）Ｎ末端からＣ末端に以下のポリペプチドドメイン：
Ｖ_H１－Ｃ_H１－Ｃ_H２－Ｃ_H３（Ｎ末端）－ＢＤ２－Ｃ_H３（Ｃ末端）
を含むキメラ重鎖を含み、および
ＢＤ１は、Ｆａｂドメインを含み、
Ｖ_H１は、前記Ｆａｂドメインの重鎖可変ドメインを含み、Ｃ_H１は、前記Ｆａｂの重鎖定常ドメイン１を含む、（１）に記載のタンパク質。
（２６）ＢＤ２は、ｓｃＦｖを含む、（２３）～（２５）のいずれか一に記載のタンパク質。
（２７）前記ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に、
Ｖ_H２－ポリペプチドリンカー－Ｖ_L２またはＶ_L２－ポリペプチドリンカー－Ｖ_H２を含み、
Ｖ_H２は、前記ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインを含み、およびＶ_L２は、前記ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインを含む、（２６）に記載のタンパク質。
（２８）ＢＤ２と前記Ｆｃ領域との間にタンパク質リンカーＬ１をさらに含む、（２３）～（２７）のいずれか一に記載のタンパク質。
（２９）ＢＤ２と前記Ｆｃ領域との間に第１のタンパク質リンカーＬ１および第２のタンパク質リンカーＬ２をさらに含む、（２３）～（２７）のいずれか一に記載のタンパク質。
（３０）ＢＤ２は、リンカー（Ｌ１）を介して前記Ｆｃ領域の前記Ｃ_H２ドメイン、前記Ｃ_H２ドメイン、または前記Ｃ_H２およびＣ_H３ドメインの前記境界面に結合される、（２３）～（２５）のいずれか一に記載のタンパク質。
（３１）ＢＤ２は、２つのタンパク質リンカーＬ１およびＬ２を介して前記Ｆｃ領域の前記Ｃ_H２ドメイン、前記Ｃ_H２ドメイン、または前記Ｃ_H２およびＣ_H３ドメインの前記境界面に結合される、（２３）～（２５）のいずれか一に記載のタンパク質。
（３２）Ｌ１およびＬ２は、１～２５アミノ酸長を有するタンパク質リンカーから独立に選択される、（２８）～（３１）のいずれか一に記載のタンパク質。
（３３）Ｌ１およびＬ２は、（Ｇ₄Ｓ）₂（配列番号４１）、（Ｇ₄Ｓ）₃（配列番号４２）、および（Ｇ₄Ｓ）₄（配列番号４３）から独立に選択される、（２８）～（３１）のいずれか一に記載のタンパク質。
（３４）前記第１および第２のエピトープは異なる、（１）～（３３）のいずれか一に記載のタンパク質。
（３５）前記第１および第２のエピトープは同じである、（１）～（３４）のいずれか一に記載のタンパク質。
（３６）配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のペプチドおよび配列番号２のアミノ酸配列を含む第２のペプチドを含むＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４に結合する二重特異性結合タンパク質。
（３７）配列番号３のアミノ酸配列を含む第１のペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列を含む第２のペプチドを含むＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４に結合する二重特異性結合タンパク質。
（３８）配列番号５のアミノ酸配列を含む第１のペプチドおよび配列番号６のアミノ酸配列を含む第２のペプチドを含むＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４に結合する二重特異性結合タンパク質。
（３９）配列番号９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号７のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、および配列番号４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含むＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４に結合する二重特異性結合タンパク質。
（４０）配列番号１４のアミノ酸配列を含む第１のペプチドおよび配列番号１５のアミノ酸配列を含む第２のペプチドを含むＰＤ－Ｌ１およびＣＴＬＡ－４に結合する二重特異性結合タンパク質。
（４１）配列番号１６のアミノ酸配列を含む第１のペプチドおよび配列番号１７のアミノ酸配列を含む第２のペプチドを含むＰＤ－Ｌ１およびＣＴＬＡ－４に結合する二重特異性結合タンパク質。
（４２）配列番号１８のアミノ酸配列を含む第１のペプチドおよび配列番号１９のアミノ酸配列を含む第２のペプチドを含むＰＤ－Ｌ１およびＣＴＬＡ－４に結合する二重特異性結合タンパク質。
（４３）配列番号２２または配列番号８９のアミノ酸配列を含む第１のペプチドおよび配列番号２３または配列番号９０のアミノ酸配列を含む第２のペプチドを含むＰＤ－１およびＴＩＭ３に結合する二重特異性結合タンパク質。
（４４）配列番号２４または配列番号９１のアミノ酸配列を含む第１のペプチドおよび配列番号２３または配列番号９２のアミノ酸配列を含む第２のペプチドを含むＰＤ－１およびＴＩＭ３に結合する二重特異性結合タンパク質。
（４５）配列番号９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号７のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２７または配列番号３０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、および配列番号２６または配列番号２８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含むＰＤ－１およびＴＩＭ３に結合する二重特異性結合タンパク質。
（４６）配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１のペプチドおよび配列番号３２のアミノ酸配列を含む第２のペプチドを含むＯＸ４０およびＰＤ－Ｌ１に結合する二重特異性結合タンパク質。
（４７）配列番号３５のアミノ酸配列を含む第１のペプチドおよび配列番号３２のアミノ酸配列を含む第２のペプチドを含むＯＸ４０およびＰＤ－Ｌ１に結合する二重特異性結合タンパク質。
（４８）配列番号３６または配列番号９４のアミノ酸配列を含む第１のペプチドおよび配列番号３２または配列番号９３のアミノ酸配列を含む第２のペプチドを含むＯＸ４０およびＰＤ－Ｌ１に結合する二重特異性結合タンパク質。
（４９）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む重鎖ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む軽鎖を含むＴＩＭ３に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記重鎖ＣＤＲ１は、配列番号７９を含み、前記重鎖ＣＤＲ２は、配列番号８０を含み、前記重鎖ＣＤＲ３は、配列番号８１を含み、および前記軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号８２を含み、前記軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号８３を含み、前記軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号８４を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
（５０）重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号８５を含み、および前記軽鎖可変領域は、配列番号８６を含む、（４９）に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（５１）前記重鎖は、配列番号８７を含み、および前記軽鎖は、配列番号８８を含む、（４９）に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（５２）（１）～（５１）のいずれか一に記載のタンパク質または抗体と、薬学的に許容されるキャリアとを含む組成物。
（５３）（１）～（５１）のいずれか一に記載のタンパク質または抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
（５４）（５３）に記載の核酸分子を含むベクター。
（５５）（５４）に記載のベクターを含む宿主細胞。
（５６）対象において癌を治療または予防する方法であって、（１）～（５１）のいずれか一に記載のタンパク質または抗体を前記対象に投与するステップを含む方法。
（５７）前記癌は、卵巣癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、膀胱癌、頭部および頚部癌、黒色腫、膵臓癌、腎細胞癌、ならびに肺癌の１つまたは複数である、（５６）に記載の方法。
（５８）対象において免疫応答を増強する方法であって、（１）～（５１）のいずれか一に記載のタンパク質または抗体を前記対象に投与するステップを含む方法。

［配列表］

Claims (58)

1. 第１のエピトープに結合する第１の結合ドメイン（ＢＤ１）と、
   第２のエピトープに結合する第２の結合ドメイン（ＢＤ２）と、
   Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメインを含むＦｃ領域と
   を含むタンパク質であって、
   前記Ｆｃ領域は、前記Ｃ_Ｈ２ドメイン、前記Ｃ_Ｈ３ドメイン、または前記Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメインの境界面における溶媒曝露ループにＢＤ２を含み、
   前記タンパク質は、前記第１および第２のエピトープの各々に結合するために二価である、タンパク質。
2. 前記Ｆｃ領域は、前記Ｃ_Ｈ２ドメイン、前記Ｃ_Ｈ３ドメイン、または前記Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメインの前記境界面においてアミノ酸配列における溶媒曝露ループにＢＤ２を含む、請求項１に記載のタンパク質。
3. 前記溶媒曝露ループは、前記Ｃ_Ｈ２ドメイン由来のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のタンパク質。
4. 前記溶媒曝露ループは、アミノ酸配列ＩＳＲＴＰ（配列番号３９）を含む、請求項３に記載のタンパク質。
5. 前記溶媒曝露ループは、前記Ｃ_Ｈ３ドメイン由来のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のタンパク質。
6. 前記溶媒曝露ループは、アミノ酸配列ＳＮＧを含む、請求項５に記載のタンパク質。
7. 前記溶媒曝露ループは、前記Ｃ_Ｈ２ドメインおよび前記Ｃ_Ｈ３ドメインの前記境界面由来のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のタンパク質。
8. 前記溶媒曝露ループは、アミノ酸配列ＡＫＧＱＰ（配列番号４０）を含む、請求項７に記載のタンパク質。
9. ＢＤ２は、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のタンパク質。
10. ＢＤ１は、Ｆａｂドメイン、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、および抗体可変ドメインからなる群から選択される結合ドメインを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のタンパク質。
11. ＢＤ１は、Ｆａｂドメインを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のタンパク質。
12. 前記Ｆａｂドメインは、抗体ヒンジ領域を介して前記Ｆｃ領域に連結されている、請求項１１に記載のタンパク質。
13. 前記Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＤ由来のＦｃ領域からなる群から選択されるドメインを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のタンパク質。
14. 前記Ｆｃ領域は、変異型Ｆｃ領域を含む、請求項１３に記載のタンパク質。
15. 前記Ｆｃ領域は、非グリコシル化されている、請求項１３に記載のタンパク質。
16. 前記Ｆｃ領域は、脱グリコシル化されている、請求項１３に記載のタンパク質。
17. 前記Ｆｃ領域は、低フコシル化を有するか、または非フコシル化されている、請求項１３に記載のタンパク質。
18. ＢＤ２と前記Ｆｃ領域との間にタンパク質リンカーＬ１をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のタンパク質。
19. ＢＤ２と前記Ｆｃ領域との間に第１のタンパク質リンカーＬ１および第２のタンパク質リンカーＬ２をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のタンパク質。
20. ＢＤ２は、タンパク質リンカーＬ１を介して前記Ｆｃ領域と結合される、請求項１～８のいずれか一項に記載のタンパク質。
21. ＢＤ２は、２つのタンパク質リンカーＬ１およびＬ２を介して前記Ｆｃ領域と結合される、請求項１～８のいずれか一項に記載のタンパク質。
22. Ｌ１およびＬ２は、（Ｇ_４Ｓ）_２（配列番号４１）、（Ｇ_４Ｓ）_３（配列番号４２）、および（Ｇ_４Ｓ）_４（配列番号４３）から独立に選択される、請求項１８～２１のいずれか一項に記載のタンパク質。
23. Ｎ末端からＣ末端に以下のポリペプチドドメイン：
    Ｖ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２（Ｎ末端）－ＢＤ２－Ｃ_Ｈ２（Ｃ末端）－Ｃ_Ｈ３
    を含むキメラ重鎖を含み、および
    ＢＤ１は、Ｆａｂドメインを含み、
    Ｖ_Ｈ１は、前記Ｆａｂドメインの重鎖可変ドメインを含み、およびＣ_Ｈ１は、前記Ｆａｂの重鎖定常ドメイン１を含む、請求項１に記載のタンパク質。
24. Ｎ末端からＣ末端に以下のポリペプチドドメイン：
    Ｖ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－ＢＤ２－Ｃ_Ｈ３
    を含むキメラ重鎖を含み、および
    ＢＤ１は、Ｆａｂドメインを含み、
    Ｖ_Ｈ１は、前記Ｆａｂドメインの重鎖可変ドメインを含み、およびＣ_Ｈ１は、前記Ｆａｂの重鎖定常ドメイン１を含む、請求項１に記載のタンパク質。
25. Ｎ末端からＣ末端に以下のポリペプチドドメイン：
    Ｖ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３（Ｎ末端）－ＢＤ２－Ｃ_Ｈ３（Ｃ末端）
    を含むキメラ重鎖を含み、および
    ＢＤ１は、Ｆａｂドメインを含み、
    Ｖ_Ｈ１は、前記Ｆａｂドメインの重鎖可変ドメインを含み、Ｃ_Ｈ１は、前記Ｆａｂの重鎖定常ドメイン１を含む、請求項１に記載のタンパク質。
26. ＢＤ２は、ｓｃＦｖを含む、請求項２３～２５のいずれか一項に記載のタンパク質。
27. 前記ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に、
    Ｖ_Ｈ２－ポリペプチドリンカー－Ｖ_Ｌ２またはＶ_Ｌ２－ポリペプチドリンカー－Ｖ_Ｈ２を含み、
    Ｖ_Ｈ２は、前記ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインを含み、およびＶ_Ｌ２は、前記ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインを含む、請求項２６に記載のタンパク質。
28. ＢＤ２と前記Ｆｃ領域との間にタンパク質リンカーＬ１をさらに含む、請求項２３～２７のいずれか一項に記載のタンパク質。
29. ＢＤ２と前記Ｆｃ領域との間に第１のタンパク質リンカーＬ１および第２のタンパク質リンカーＬ２をさらに含む、請求項２３～２７のいずれか一項に記載のタンパク質。
30. ＢＤ２は、リンカー（Ｌ１）を介して前記Ｆｃ領域の前記Ｃ_Ｈ２ドメイン、前記Ｃ_Ｈ２ドメイン、または前記Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメインの前記境界面に結合される、請求項２３～２５のいずれか一項に記載のタンパク質。
31. ＢＤ２は、２つのタンパク質リンカーＬ１およびＬ２を介して前記Ｆｃ領域の前記Ｃ_Ｈ２ドメイン、前記Ｃ_Ｈ２ドメイン、または前記Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメインの前記境界面に結合される、請求項２３～２５のいずれか一項に記載のタンパク質。
32. Ｌ１およびＬ２は、１～２５アミノ酸長を有するタンパク質リンカーから独立に選択される、請求項２８～３１のいずれか一項に記載のタンパク質。
33. Ｌ１およびＬ２は、（Ｇ_４Ｓ）_２（配列番号４１）、（Ｇ_４Ｓ）_３（配列番号４２）、および（Ｇ_４Ｓ）_４（配列番号４３）から独立に選択される、請求項２８～３１のいずれか一項に記載のタンパク質。
34. 前記第１および第２のエピトープは異なる、請求項１～３３のいずれか一項に記載のタンパク質。
35. 前記第１および第２のエピトープは同じである、請求項１～３４のいずれか一項に記載のタンパク質。
36. 配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のペプチドおよび配列番号２のアミノ酸配列を含む第２のペプチドを含むＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４に結合する二重特異性結合タンパク質。
37. 配列番号３のアミノ酸配列を含む第１のペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列を含む第２のペプチドを含むＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４に結合する二重特異性結合タンパク質。
38. 配列番号５のアミノ酸配列を含む第１のペプチドおよび配列番号６のアミノ酸配列を含む第２のペプチドを含むＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４に結合する二重特異性結合タンパク質。
39. 配列番号９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号７のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、および配列番号４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含むＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４に結合する二重特異性結合タンパク質。
40. 配列番号１４のアミノ酸配列を含む第１のペプチドおよび配列番号１５のアミノ酸配列を含む第２のペプチドを含むＰＤ－Ｌ１およびＣＴＬＡ－４に結合する二重特異性結合タンパク質。
41. 配列番号１６のアミノ酸配列を含む第１のペプチドおよび配列番号１７のアミノ酸配列を含む第２のペプチドを含むＰＤ－Ｌ１およびＣＴＬＡ－４に結合する二重特異性結合タンパク質。
42. 配列番号１８のアミノ酸配列を含む第１のペプチドおよび配列番号１９のアミノ酸配列を含む第２のペプチドを含むＰＤ－Ｌ１およびＣＴＬＡ－４に結合する二重特異性結合タンパク質。
43. 配列番号２２または配列番号８９のアミノ酸配列を含む第１のペプチドおよび配列番号２３または配列番号９０のアミノ酸配列を含む第２のペプチドを含むＰＤ－１およびＴＩＭ３に結合する二重特異性結合タンパク質。
44. 配列番号２４または配列番号９１のアミノ酸配列を含む第１のペプチドおよび配列番号２３または配列番号９２のアミノ酸配列を含む第２のペプチドを含むＰＤ－１およびＴＩＭ３に結合する二重特異性結合タンパク質。
45. 配列番号９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号７のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号２７または配列番号３０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、および配列番号２６または配列番号２８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含むＰＤ－１およびＴＩＭ３に結合する二重特異性結合タンパク質。
46. 配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１のペプチドおよび配列番号３２のアミノ酸配列を含む第２のペプチドを含むＯＸ４０およびＰＤ－Ｌ１に結合する二重特異性結合タンパク質。
47. 配列番号３５のアミノ酸配列を含む第１のペプチドおよび配列番号３２のアミノ酸配列を含む第２のペプチドを含むＯＸ４０およびＰＤ－Ｌ１に結合する二重特異性結合タンパク質。
48. 配列番号３６または配列番号９４のアミノ酸配列を含む第１のペプチドおよび配列番号３２または配列番号９３のアミノ酸配列を含む第２のペプチドを含むＯＸ４０およびＰＤ－Ｌ１に結合する二重特異性結合タンパク質。
49. ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む重鎖ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む軽鎖を含むＴＩＭ３に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記重鎖ＣＤＲ１は、配列番号７９を含み、前記重鎖ＣＤＲ２は、配列番号８０を含み、前記重鎖ＣＤＲ３は、配列番号８１を含み、および前記軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号８２を含み、前記軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号８３を含み、前記軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号８４を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
50. 重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号８５を含み、および前記軽鎖可変領域は、配列番号８６を含む、請求項４９に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
51. 前記重鎖は、配列番号８７を含み、および前記軽鎖は、配列番号８８を含む、請求項４９に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
52. 請求項１～５１のいずれか一項に記載のタンパク質または抗体と、薬学的に許容されるキャリアとを含む組成物。
53. 請求項１～５１のいずれか一項に記載のタンパク質または抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
54. 請求項５３に記載の核酸分子を含むベクター。
55. 請求項５４に記載のベクターを含む宿主細胞。
56. 対象において癌を治療または予防する方法であって、請求項１～５１のいずれか一項に記載のタンパク質または抗体を前記対象に投与するステップを含む方法。
57. 前記癌は、卵巣癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、膀胱癌、頭部および頚部癌、黒色腫、膵臓癌、腎細胞癌、ならびに肺癌の１つまたは複数である、請求項５６に記載の方法。
58. 対象において免疫応答を増強する方法であって、請求項１～５１のいずれか一項に記載のタンパク質または抗体を前記対象に投与するステップを含む方法。

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