JP2023036013A - ミトコンドリア機能改善剤、ミトコンドリア生合成促進剤、及びＰＧＣ１α遺伝子発現促進剤 - Google Patents

Abstract

【課題】 本発明は、ミトコンドリアの機能低下に起因する状態を改善する目的で用いられる剤の有効成分として有用な新規の素材を提供することを目的とする。
【解決手段】 フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び／又は前記乳酸菌の抽出物は、ミトコンドリア機能改善剤、ミトコンドリア生合成促進剤、及びＰＧＣ１α遺伝子発現促進剤の有効成分として有用である。
【選択図】 なし

Description

本発明は、ミトコンドリア機能改善剤、ミトコンドリア生合成促進剤、及びＰＧＣ１α遺伝子発現促進剤に関する。

昨今の高齢化社会において、日常的又は継続的な医療又は介護に依存することなく自立した生活ができる期間、つまり健康寿命をいかに長くするかという点に関心が集まっている。このため、健康寿命の延長を目指した老化制御研究が活発に進められている。

老化を誘発する要因として知られているものの例として、ミトコンドリアの機能低下（つまり、細胞内でエネルギーを作り出すミトコンドリアの数及び活動量が加齢と共に低下すること）等が挙げられる。従って、抗老化を防ぐための有効成分として、ミトコンドリアの機能を改善する成分等の創出が望まれる。

例えば、特許文献１には、所定の構造を有するトコフェリルリン酸エステル誘導体及び／又はその塩が、ミトコンドリア機能障害抑制剤の有効成分となることが開示されており、特許文献２には、有効量のウロリチン又はその前駆体と細胞を接触させることでミトコンドリアの機能を向上させることが開示されている。

特開２００７－０５５９２３号公報 国際公開第２０１２／０８８５１９号

本発明は、ミトコンドリアの機能低下に起因する状態を改善する目的で用いられる剤の有効成分として有用な新規の素材を提供することを目的とする。

本発明者は、所定の乳酸菌に、ミトコンドリア機能を改善する作用、ミトコンドリア生合成を促進する作用、及びミトコンドリア生合成遺伝子発現の制御に関与している転写共役因子であるＰＧＣ１α遺伝子発現を促進する作用があり、これにより、ミトコンドリアの機能低下に起因する状態の改善に有効な成分となり得ることを新たに見出した。なお、この所定の乳酸菌は、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）を産生するものであるものの、確認された上記作用による効果が、ＮＭＮのみの寄与に基づくものではなく、意外にも、ＮＭＮを単体で用いた場合に比べてはるかに高いことが判明した。つまり、当該所定の乳酸菌に由来するＮＭＮ以外の成分の存在が、ミトコンドリア機能改善効果、ミトコンドリア生合成促進効果、及びＰＧＣ１α遺伝子発現促進効果に極めて大きく寄与していることが見出された。本発明は、この知見に基づいてさらに検討を重ねることにより完成したものである。

即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び／又は前記乳酸菌の抽出物を含有する、ミトコンドリア機能改善剤又はミトコンドリア生合成促進剤。
項２． 前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株（国際寄託番号ＮＩＴＥＢＰ－０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（国際寄託番号ＮＩＴＥＢＰ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株（国際寄託番号ＮＩＴＥＢＰ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選ばれる、項１に記載のミトコンドリア機能改善剤又はミトコンドリア生合成促進剤。
項３. ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド及びニコチンアミドモノヌクレオチドを含み、前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド１重量部当たりの前記ニコチンアミドモノヌクレオチドの含有比率が０．０２重量部以上である、項１又は２に記載のミトコンドリア機能改善剤又はミトコンドリア生合成促進剤。
項４． 項１～３のいずれかに記載のミトコンドリア機能改善剤又はミトコンドリア生合成促進剤を含む、飲食品、化粧品又は医薬品。
項５． フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び／又は前記乳酸菌の抽出物を含有する、ＰＧＣ１α遺伝子発現促進剤。
項６． 前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株（国際寄託番号ＮＩＴＥＢＰ－０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（国際寄託番号ＮＩＴＥＢＰ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株（国際寄託番号ＮＩＴＥＢＰ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選ばれる、項５に記載のＰＧＣ１α遺伝子発現促進剤。
項７． ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド及びニコチンアミドモノヌクレオチドを含み、前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド１重量部当たりの前記ニコチンアミドモノヌクレオチドの含有比率が０．０２重量部以上である、項５又は６に記載のＰＧＣ１α遺伝子発現促進剤。
項８．項５～７のいずれかに記載のＰＧＣ１α遺伝子発現促進剤を含む、飲食品、化粧品又は医薬品。

本発明によれば、ミトコンドリアの機能低下に起因する状態を改善する目的で用いられる剤の有効成分として有用な新規の素材が提供される。具体的には、本発明によれば、フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、及び／又は前記乳酸菌の培養上清が、ミトコンドリア機能改善剤、ミトコンドリア生合成促進剤、及びＰＧＣ１αの発現量促進剤の有効成分として提供される。

筋肉細胞におけるミトコンドリア生合成に関わる転写共役因子（ＰＧＣ１α）の発現量を示す図である。 筋肉細胞におけるミトコンドリア生合成に関わる転写共役因子（ＰＧＣ１α）の発現量を示す図である。 筋肉細胞におけるミトコンドリア生合成に関わる転写共役因子（ＰＧＣ１α）の発現量を示す図である。 筋肉細胞におけるミトコンドリア生合成に関わる転写共役因子（ＰＧＣ１α）の発現量を示す図である。 皮膚細胞におけるミトコンドリア生合成に関わる転写共役因子（ＰＧＣ１α）の発現量を示す図である。 皮膚細胞におけるミトコンドリア生合成に関わる転写共役因子（ＰＧＣ１α）の発現量を示す図である。 皮膚細胞におけるミトコンドリア生合成に関わる転写共役因子（ＰＧＣ１α）の発現量を示す図である。 皮膚細胞におけるミトコンドリア生合成に関わる転写共役因子（ＰＧＣ１α）の発現量を示す図である。

本発明のミトコンドリア機能改善剤、ミトコンドリア生合成促進剤、及びＰＧＣ１α遺伝子発現促進剤は、フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、及び／又は前記乳酸菌の培養上清を含有することを特徴とする。以下、ミトコンドリア機能改善剤、ミトコンドリア生合成促進剤、及びＰＧＣ１α遺伝子発現促進剤について詳述する。

有効成分
本発明のミトコンドリア機能改善剤、ミトコンドリア生合成促進剤、及びＰＧＣ１α遺伝子発現促進剤の有効成分は、フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び／又は前記乳酸菌の抽出物である。

有効成分が乳酸菌の形態である場合、当該有効成分は、菌体成分及び当該乳酸菌に内在する産生物が含まれる。乳酸菌は、生菌及び死菌のいずれであってもよい。また、死菌の場合、菌体が破砕されていてもよい。また、破砕菌の場合、菌体成分の一部が除去されていてもよい。さらに、乳酸菌は、凍結乾燥、棚乾燥、スプレードライ等の手段により乾燥された菌体粉末の形態であってもよい。

有効成分が乳酸菌の培養物である場合、当該有効成分は、乳酸菌とともに、当該乳酸菌の産生物を含む培地成分を含む。なお、当該有効成分に乳酸菌の産生物を含んでいれば、培地成分は、当該乳酸菌の培養に用いた培地成分の一部が除去されていてもよい。また、培養物に含まれる乳酸菌は、生菌及び死菌のいずれであってもよい。また、死菌の場合、菌体が破砕されていてもよい。さらに、破砕菌の場合、菌体成分の一部が除去されていてもよい。

有効成分が乳酸菌の培養上清である場合、培養上清は、当該乳酸菌の産生物を含む培地成分を含む。なお、当該乳酸菌の産生物を含んでいれば、培地成分は、当該乳酸菌の培養に用いた培地成分の一部が除去されていてもよい。

有効成分が乳酸菌の抽出物である場合、当該抽出物は、上記乳酸菌又は乳酸菌の培養物を抽出処理に供して得られる多成分系の組成物である。当該抽出物の調製に用いられる抽出溶媒としては、例えば、水；エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール；１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール；これらの混合液等の極性溶媒が挙げられ、ミトコンドリア機能改善効果、ミトコンドリア生合成促進効果又はＰＧＣ１α遺伝子発現促進効果をより一層効果的に向上させる観点から、好ましくは水が挙げられる。つまり、好ましい形態において、乳酸菌の抽出物は、乳酸菌の水エキスである。また、抽出時の温度条件としては、室温（例えば、５～３５℃、好ましくは２０～３０℃）であることが好ましい。抽出物の具体的な調製方法としては、例えば、記乳酸菌又は乳酸菌の培養物若しくはそれらの粉砕物を抽出溶媒中に含む懸濁液を調製し、当該懸濁液を固液分離することで抽出液（エキス液）を得る方法、又は必要に応じて当該抽出液を乾燥させることで粉末（エキス末）を得る方法が挙げられる。

フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌は、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）を産生する微生物である。また、フルクトバシラス属に属する乳酸菌は、ＮＭＮに加えて、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を産生する微生物であってもよい。

本発明で用いられる有効成分であるフルクトバシラス属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清は、当該乳酸菌が産生したＮＭＮ（又はＮＭＮ及びＮＡＤ）だけでなく、当該乳酸菌が産生した（ＮＭＮ、ＮＡＤ以外の）他の代謝物、及び／又は菌体成分等も含む。本発明による優れたミトコンドリア機能改善効果、ミトコンドリア生合成促進効果及びＰＧＣ１α遺伝子発現促進効果は、これらの成分が相まって奏されるものと考えられる。

また、本発明で用いられる有効成分がＮＭＮ及びＮＡＤを含む場合、その比率としては特に限定されず、ＮＡＤ１重量部当たりのＮＭＮの比率として、例えば０．０２重量部以上、０．０３５重量部以上、０．０４重量部以上、又は０．０５重量部以上が挙げられる。本発明のミトコンドリア機能改善剤、ミトコンドリア生合成促進剤又はＰＧＣ１α遺伝子発現促進剤が外用組成物（好ましくは皮膚外用組成物）である場合及び皮膚ミトコンドリア機能の改善を目的とする用途で用いられる場合、当該比率として、例えば０．０２重量部以上、が挙げられ、ミトコンドリア機能改善効果、ミトコンドリア生合成促進効果又はＰＧＣ１α遺伝子発現促進効果をより一層効果的に向上させる観点から、好ましくは０．０３５重量部以上、より好ましくは０．０４重量部以上、さらに好ましくは０．０５重量部以上が挙げられる。ＮＡＤ１重量部当たりのＮＭＮの比率の上限としては特に限定されないが、例えば５重量部以下が挙げられ、ミトコンドリア機能改善効果、ミトコンドリア生合成促進効果又はＰＧＣ１α遺伝子発現促進効果をより一層効果的に向上させる観点から、好ましくは３重量部以下、より好ましくは２．３重量部以下、さらに好ましくは１．７重量部以下、一層好ましくは１重量部以下、より一層好ましくは０．５重量部以下、特に好ましくは０．１重量部以下、最も好ましくは０．０７重量部以下が挙げられる。

あるいは、ＮＡＤ１モル当たりのＮＭＮの比率として、例えば０．０４モル以上、０．０７モル以上、０．０８モル以上、０．０９モル以上、又は０．１モル以上が挙げられる。本発明のミトコンドリア機能改善剤、ミトコンドリア生合成促進剤又はＰＧＣ１α遺伝子発現促進剤が外用組成物（好ましくは皮膚外用組成物）である場合及び皮膚ミトコンドリア機能の改善を目的とする用途で用いられる場合、ＮＡＤ１モル当たりのＮＭＮの比率として、例えば０．０４モル以上が挙げられ、ミトコンドリア機能改善効果、ミトコンドリア生合成促進効果又はＰＧＣ１α遺伝子発現促進効果をより一層効果的に向上させる観点から、好ましくは０．０７モル以上、より好ましくは０．０８モル以上、さらに好ましくは０．０９モル以上、一層好ましくは０．１モル以上が挙げられる。ＮＡＤ１モル当たりのＮＭＮの比率の上限としては特に限定されないが、例えば１０モル以下が挙げられ、ミトコンドリア機能改善効果、ミトコンドリア生合成促進効果又はＰＧＣ１α遺伝子発現促進効果をより一層効果的に向上させる観点から、好ましくは６モル以下、より好ましくは４．６モル以下、さらに好ましくは３．４モル以下、一層好ましくは２モル以下、より一層好ましくは１モル以下、特に好ましくは０．２モル以下、最も好ましくは０．１４モル以下が挙げられる。

フルクトバシラス属に属する乳酸菌の好ましい例としては、ミトコンドリア機能改善効果、ミトコンドリア生合成促進効果又はＰＧＣ１α遺伝子発現促進効果をより一層効果的に向上させる観点から、フルコトバシラス・ドゥリオニス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ）、フルクトバシラス・トロパエオイル（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ）、及びフルクトバシラス・フルクトサス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）が挙げられ、より好ましくは、フルクトバシラス・トロパエオイル（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ）、及びフルクトバシラス・フルクトサス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）が挙げられる。

フルクトバシラス属に属する乳酸菌のより好ましい例としては、ミトコンドリア機能改善効果、ミトコンドリア生合成促進効果又はＰＧＣ１α遺伝子発現促進効果をより一層効果的に向上させる観点から、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＮＢＲＣ１１３２３９株が挙げられ、更に好ましくは、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株が挙げられる。

フルクトバシラス属に属する乳酸菌のさらに好ましい例としては、ミトコンドリア機能改善効果、ミトコンドリア生合成促進効果又はＰＧＣ１α遺伝子発現促進効果をより一層効果的に向上させる観点から、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株が挙げられ、好ましくはＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株が挙げられ、特に好ましくはＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株が挙げられる。

Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）に、２０２０年１０月２８日付で寄託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７６４として国際寄託されている。

Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）に、２０２０年１０月２８日付で寄託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７６５として国際寄託されている。

Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）に、２０２０年１０月２８日付で寄託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７６６として国際寄託されている。

これらのフルクトバシラス属乳酸菌は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。

フルクトバシラス属乳酸菌の培養物又は培養上清は、上記のフルクトバシラス属乳酸菌
がニコチンアミドモノヌクレオチドを産生する条件で培養することで得ることができる。フルクトバシラス菌乳酸菌の培養に用いられる培地及び培養条件は適宜選択することができる。

培地としては、拡大培養に用いられるもの（前培養培地）、及び生産培養に用いられるもの（本培養培地）が挙げられる。本培養培地は、前培養培地として用いられる培地を基本として、更に添加物を含有させて調製することができる。培地の性状については、好ましくは液体培地であるが、寒天培地であってもよい。培地は、炭素源の他、一般的には窒素源、ミネラル等を含む。

炭素源としては、糖質及び糖質材料が挙げられる。糖質としては、糖類（単糖、二糖、オリゴ糖）、多糖類、及び糖アルコールが挙げられる。糖質としては、乳糖、ショ糖、グルコース、デンプン、キシリトール、デキストロース等が挙げられる。糖質材料は、糖質を含む有機組成物であればよく、例えば、乳及びその加工品（脱脂粉乳、ホエイ、ミルクパウダー、練乳等）、豆乳及びその加工品（豆乳加水分解物等）、穀類、果実、野菜等の食品が挙げられる。乳としては、ウシ、ヤギ、ヒツジ、水牛、ラクダ、ラマ、ロバ、ヤク、ウマ、トナカイ等の任意の哺乳動物に由来するものが挙げられる。なお糖質は、単離されたものであってもよいし、糖質材料に含まれているものであってもよい。例えば、フルクトース（糖質）は、果実（糖質材料）に含まれる形態のものを用いてもよい。これらの炭素源は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。これらの炭素源の中でも、好ましくはグルコースが挙げられる。

培地中の炭素源の濃度については特に限定されず、培地の種類や培養方式等に応じて適宜設定すればよいが、例えば０．５～４ｗ／ｗ％、好ましくは１～３ｗ／ｗ％、より好ましくは１．５～２．５ｗ／ｗ％が挙げられる。

窒素源としては、任意の無機窒素源又は有機窒素源を使用することができる。例えば、酵母エキス（ビール酵母等）、肉エキス、カゼイン等のタンパク質；ペプトン（プロテアーゼペプトン等）等のタンパク質加水分解物、ペプチド等のペプチド類；アンモニウム塩（クエン酸アンモニウム等）、硝酸塩等の含窒素塩等が挙げられる。これらの窒素源は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。

培地中の窒素源の濃度については特に限定されず、培地の種類や培養方式等に応じて適宜設定すればよいが、タンパク質の場合、例えば０．３～４ｗ／ｗ％、好ましくは０．５～３ｗ／ｗ％、より好ましくは１～２ｗ／ｗ％が挙げられ；ペプチド類の場合、例えば０．１～２ｗ／ｗ％、好ましくは０．３～１．８ｗ／ｗ％、より好ましくは０．５～１．５ｗ／ｗ％が挙げられ；含窒素塩の場合、例えば０．０３～１．５ｗ／ｗ％、好ましくは０．０５～１ｗ／ｗ％、より好ましくは０．１～０．５ｗ／ｗ％が挙げられる。

ミネラルとしては、例えば、マンガン（例えば、硫酸マンガン等のマンガン塩）、亜鉛、鉄、ナトリウム（例えば、酢酸ナトリウム等のナトリウム塩）、カリウム（例えば、硫酸水素二カリウム、リン酸水素二カリウム等のカリウム塩）、マグネシウム（例えば、硫酸マグネシウム等のマグネシウム塩）、カルシウム、リン（例えば、リン酸水素二カリウム等のリン酸塩）、硫黄（例えば、硫酸マンガン、硫酸水素カリウム、硫酸マグネシウム等の硫酸塩）、微量元素等が挙げられる。これらのミネラルは、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。これらのミネラルの中でも、好ましくは、マンガン、ナトリウム、マグネシウム、カリウムが挙げられる。

培地中のミネラルの濃度については特に限定されず、培地の種類や培養方式等に応じて適宜設定すればよいが、マンガン塩の場合、例えば０．００１～０．０１ｗ／ｗ％、好ましくは０．００３～０．００８ｗ／ｗ％が挙げられ；ナトリウム塩の場合、例えば０．０５～１．５ｗ／ｗ％、好ましくは０．１～１ｗ／ｗ％が挙げられ；マグネシウム塩の場合、例えば０．００１～０．０２ｗ／ｗ％、好ましくは０．００５～０．０１５ｗ／ｗ％が挙げられ；カリウム塩の場合、例えば０．０５～１ｗ／ｗ％、好ましくは０．１～０．５ｗ／ｗ％が挙げられ；リン酸塩の場合、例えば０．０５～１ｗ／ｗ％、好ましくは０．１～０．５ｗ／ｗ％が挙げられ；硫酸塩の場合、０．００１～０．０４ｗ／ｗ％、好ましくは０．００５～０．０２ｗ／ｗ％が挙げられる。

培地は、上記成分以外に、ビタミン（ビタミンＢ群など）、界面活性剤（非イオン性界面活剤（Ｔｗｅｅｎ等）、陰イオン性界面活性剤（ＳＤＳ等）等）、抗菌剤（トリクロサン等）、抗生物質（モネシン等）等の他の成分を含んでもよい。これらの他の成分は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。これらの他の成分の中でも、好ましくは界面活性剤、より好ましくは非イオン性界面活性剤が挙げられる。

培地中の他の成分の濃度については特に限定されず、他の成分の種類、培地の種類、培養方式等に応じて適宜設定すればよいが、界面活性剤を含む場合、界面活性剤の濃度として、例えば０．０１～０．５ｗ／ｗ％、好ましくは０．０５～０．３ｗ／ｗ％が挙げられる。

培養条件としては、フルクトバシラス属乳酸菌が生育できる条件下であれば特に限定されない。

培養温度としては、培養対象となるフルクトバシラス属乳酸菌の至適温度であればよく、例えば２６～４０℃、好ましくは２７～３８℃、より好ましくは２８～３６℃、更に好ましくは２９～３４℃が挙げられる。培養時間としては、実際に培養するフルクトバシラス属乳酸菌の種類等に合せて適宜設定すればよく、例えば４～４８時間、好ましくは８～３６時間、より好ましくは１２～２４時間が挙げられる。

培養中の操作については、培養中における培養液の攪拌の要否は問わない。また、具体的な培養手順の例については、上述の培養を一定時間生産培養（本培養）として行い、その前に、少量（例えば体積比で本培養培地の１／６～１／４）の培地で拡大培養を（前培養）行うことができる。前培養の培養条件は、フルクトバシラス属乳酸菌の種類などに合せて適宜設定すればよく、上述の条件を採用することができる。また、本培養においては、前培養で得られた培養物を、ＯＤ６６０が例えば０．０１～０．０４、好ましくは０．０１～０．０３となるように本培養培地に植菌することができる。

これらのフルクトバシラス属乳酸菌の培養物又は培養上清は、上記のフルクトバシラス属乳酸菌の１種を単独で用いて調製したものでもよいし、複数種を組み合わせて用いて調製したものでもよいし、ある１種を単独で用いて調製したものと他の１種を単独で用いて調製したものとの混合物であってもよい。

本発明で用いられるフルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌としては、培養後の乳酸菌をそのまま用いてもよく、培養によって得られた乳酸菌を、回収し、後述する休止菌体反応に付したものを用いてもよい。

培養によって得られたフルクトバシラス属に属する乳酸菌は、そのままミトコンドリア機能改善剤の有効成分として用いてもよいし、あるいはろ紙を用いたろ過、遠心分離、デカンテーション、スクリュープレス、ローラープレス、ロータリードラムスクリーン、ベルトスクリーン、振動スクリーン、多重板振動フィルター、真空脱水、加圧脱水、ベルトプレス、遠心濃縮脱水、多重円板脱水等によって固液分離を行い、培養液から回収した菌体を休止菌体反応に付して得られた菌体をミトコンドリア機能改善剤の有効成分として用いてもよい。

なお、培養で得られたフルクトバシラス属に属する乳酸菌を休止菌体反応に用いる場合、乳酸菌中のニコチンアミドモノヌクレオチド含有量を向上させることができる。

休止菌体反応に用いる液体としては、フルクトバシラス属に属する乳酸菌が効率よく反応できるものであれば、特に制限なく用いることができる。例えば、水、緩衝液、有機溶剤等を用いることができる。

休止菌体反応に用いる液体のｐＨとしては、例えば、４．０～１０．０、好ましくはｐＨ５．０～９．０、より好ましく５．５～７．５が挙げられる。

休止菌体反応に用いる液体が緩衝液である場合、緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ衝液、ＭＥＳ緩衝液等が挙げられる。

緩衝液のより具体的な例としては、ＫＨＣ_８Ｈ_４Ｏ_４－ＮａＯＨ (ｐＨ４．０)、ＣＨ_３ＣＯＯＨ－ＣＨ_３ＣＯＯＮａ（ｐＨ４.０）、ＭＥＳ－ＮａＯＨ (ｐＨ５．０)、ＣＨ_３ＣＯＯＨ－ＣＨ_３ＣＯＯＮａ（ｐＨ５.０）、ＫＨ_２ＰＯ_４－Ｋ_２ＨＰＯ４（ｐＨ６．０）、ＭＥＳ－ＮａＯＨ(ｐＨ６．０)、 ＫＨ_２ＰＯ_４－Ｋ_２ＨＰＯ_４（ｐＨ７．０）、ＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ (ｐＨ７．０) 、ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ(ｐＨ８．０)、Ｈ_３ＢＯ_４－ＮａＯＨ（ｐＨ８.０）、ＣＨＥＳ－ＮａＯＨ(ｐＨ９．０)、Ｈ_３ＢＯ_４－ＮａＯＨ（ｐＨ９.０）、Ｈ_２ＣＯ_３－ＮａＨＣＯ_３（ｐＨ１０.０）、ＣＨＥＳ-ＮａＯＨ(ｐＨ１０．０)等が挙げられ、好ましくはＣＨ_３ＣＯＯＨ－ＣＨ_３ＣＯＯＮａ、ＫＨ_２ＰＯ_４－Ｋ_２ＨＰＯ_４、Ｈ_３ＢＯ_４－ＮａＯＨ、より好ましくはＫＨ_２ＰＯ_４－Ｋ_２ＨＰＯ_４が挙げられる。

休止菌体反応に用いる液体が有機溶剤である場合、有機溶剤としては、例えば、ベンゼン、ベンゾニトリル等の芳香族化合物、アセトン、アセチルアセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、酢酸エチル、酢酸ブチル、酪酸エチル、蟻酸エチル等の脂肪酸エステル類、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジブチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、１，２－プロパンジオール、１，２－ブタンジオール、１，３－ブタンジオール、１，４－ブタンジオール、２，３－ブタンジオール、１，２－ヘキサンジオール、１，６－ヘキサンジオール、１，２－ペンタンジオール、１，５－ペンタンジオール、２－メチル－２，４－ペンタンジオール、３－メチル－１，５－ペンタンジオール等のジオール類、炭素数１～７の直鎖又は分岐アルキルを有するアルコール、シクロヘキサノール、３－メトキシ－３－メチル－１－ブタノール、３－メトキシ－１－ブタノール等のアルコール類等が挙げられる。

休止菌体反応に用いる液体としては、上記の液体の中でも、好ましくは水、緩衝液が挙げられる。

休止菌体反応における反応温度としては、例えば２１～３７℃、好ましくは２４～２８℃が挙げられる。反応時間としては、例えば０．１～２４時間、好ましくは６～１２時間が挙げられる。

休止菌体反応は、フルクトバシラス属に属する乳酸菌を上記の液体に懸濁し、静置、攪拌または振盪することで行うことができる。

また、休止菌体反応は、上記の液体を用いることなく、フルクトバシラス属に属する乳酸菌を含む培養液のｐＨを４．０～１０．０、好ましくはｐＨ５．０～９．０、より好ましくは５．５～７．５の範囲に調整することにより行ってもよい。

他の成分
本発明のミトコンドリア機能改善剤、ミトコンドリア生合成促進剤、及びＰＧＣ１α遺伝子発現促進剤は、上記の有効成分以外に、必要に応じて、他の薬理成分を含有していてもよい。このような薬理成分としては、例えば、抗炎症剤、抗酸化剤、殺菌剤、清涼化剤、ビタミン類、ムコ多糖類等が挙げられる。

また、本発明のミトコンドリア機能改善剤、ミトコンドリア生合成促進剤、及びＰＧＣ１α遺伝子発現促進剤は、所望の製剤形態にするために、必要に応じて、基剤や添加剤が含まれていてもよい。このような基剤や添加剤については、薬学的に許容されることを限度として特に制限されないが、例えば、水、低級アルコール（エタノール、イソプロパノール等）、多価アルコール（グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール等）等の水性基剤；天然由来油、鉱物油、エステル油、脂肪酸アルキルエステル、脂肪酸、脂肪酸エステル、高級アルコール等の油性基剤；界面活性剤；清涼化剤、防腐剤、着香剤、着色剤、粘稠剤、ｐＨ調整剤、湿潤剤、安定化剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、キレート剤、粘着剤、緩衝剤、溶解補助剤、可溶化剤、保存剤等の添加剤が挙げられる。

性状及び形態
本発明のミトコンドリア機能改善剤、ミトコンドリア生合成促進剤、及びＰＧＣ１α遺伝子発現促進剤の性状については、特に制限されず、液状、固形状、半固形状（クリーム状、ゲル状、軟膏状、ペースト状）等のいずれであってもよい。また、本発明のミトコンドリア機能改善剤、ミトコンドリア生合成促進剤、及びＰＧＣ１α遺伝子発現促進剤は、水性製剤、油性製剤等の非乳化製剤であってもよく、また水中油型乳化製剤、油中水型乳化製剤等の乳化製剤であってもよい。

また、本発明のミトコンドリア機能改善剤、ミトコンドリア生合成促進剤、及びＰＧＣ１α遺伝子発現促進剤は、内用組成物又は外用組成物（好ましくは皮膚外用組成物）の形態で用いることができる。

具体的には、本発明のミトコンドリア機能改善剤、ミトコンドリア生合成促進剤、及びＰＧＣ１α遺伝子発現促進剤は、飲食品、化粧品、医薬品（内服薬又は外用薬）の形態で用いることができる。

飲食品としては特に限定されないが、例えば、発酵乳（ドリンクヨーグルト等）、乳酸菌飲料、乳飲料（コーヒー牛乳、フルーツ牛乳等）、茶系飲料（緑茶、紅茶及び烏龍茶等）、果物・野菜系飲料（オレンジ、りんご、ぶどう等の果汁、トマト、ニンジン等の野菜汁を含む飲料）、アルコール性飲料（ビール、発泡酒、ワイン等）、炭酸飲料、清涼飲料、水ベースの飲料等の飲料；及び発酵乳（セットタイプヨーグルト、ソフトヨーグルト等）、菓子、インスタント食品、調味料等の加工食品等の食品が挙げられる。

また、飲食品としては、機能性食品も挙げられる。機能性食品は、生体に対して一定の機能性を有する食品を意味し、例えば、特定保健用食品（条件付きトクホ［特定保健用食品］を含む）及び栄養機能食品等の保健機能食品、機能性表示食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント（例えば、錠剤、被覆錠、糖衣錠、カプセル及び液剤等の各種剤形のもの）及び美容食品（例えばダイエット食品）等が挙げられる。更に、機能性食品は、病者用食品、妊産婦・授乳婦用粉乳、乳児用調製粉乳、高齢者用食品、介護用食品等の特別用途食品であってもよい。

化粧品としては、化粧水、乳液、クリーム、エッセンス、ゲル、パック、シートマスク、リップクリーム等の基礎化粧料；洗顔料、メイク落とし（クレンジング剤を含む）、角質除去剤、ボディーシャンプーなどの皮膚洗浄料；サンスクリーン剤、ボディー用ジェル、ボディー用マッサージ剤、抑汗剤、防臭剤、除毛剤、入浴剤等のボディーケア化粧料；ファンデーション、おしろい、口紅、頬紅、アイシャドー、アイライナー、マスカラ、眉墨等のメークアップ化粧料；マネキュア、ネイルリムーバー等の爪用化粧料；ヘアスタイリング剤、シャンプー、コンディショナー、リンス、育毛剤等の毛髪化粧料；液体歯磨、練歯磨、洗口液、マウススプレー等の口腔用化粧料等が挙げられる。

医薬品としては、内服薬又は外用薬（医薬部外品を含む）が挙げられる。内服薬の剤形としては、錠剤、被覆錠、糖衣錠、カプセル及び液剤等が挙げられ、外用薬の剤型としては、液剤（ローション剤、スプレー剤、エアゾール剤、及び乳液剤を含む）、フォーム剤、軟膏剤、クリーム剤、ジェル剤、貼付剤等が挙げられる。

ミトコンドリア機能改善剤、ミトコンドリア生合成促進剤、又はＰＧＣ１α遺伝子発現促進剤を含む飲食品、化粧品又は医薬品の適用対象としては、好ましくは哺乳動物が挙げられ、例えば、ヒト、チンパンジー、ゴリラ等の霊長類；イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ロバ等のペット又は家畜；マウス、ラット、ハムスター、サル等の実験動物が挙げられる。

用途
本発明のミトコンドリア機能改善剤は、ミトコンドリア機能の改善を目的とした用途（つまり、ミトコンドリアの機能低下に起因する状態の改善を目的とした用途）に用いられる。標的となるミトコンドリアとしては特に限定されないが、好ましくは皮膚ミトコンドリア及び筋肉ミトコンドリアが挙げられ、より好ましくは皮膚ミトコンドリアが挙げられる。ミトコンドリア機能の改善を目的とした具体的な用途としては、皮膚ミトコンドリア機能の改善を目的とするものとして、例えば、皮膚のシワ形成の抑制又は改善等の用途が挙げられ；筋肉ミトコンドリア機能の改善を目的とするものとして、例えば、運動能力低下改善、筋力低下抑制等の用途が挙げられ；その他の例として、代謝機能の改善、寿命延長、老化防止、神経系異常回復、認知機能改善等の用途が挙げられる。

本発明のミトコンドリア生合成促進剤は、ミトコンドリア生合成の促進を目的とした用途（ひいては、ミトコンドリアの機能低下に起因する状態の改善を目的とした用途）で用いられる。標的となるミトコンドリアとしては特に限定されないが、好ましくは皮膚ミトコンドリア及び筋肉ミトコンドリアが挙げられ、より好ましくは皮膚ミトコンドリアが挙げられる。ミトコンドリア生合成の促進を目的とした具体的な用途としては、皮膚ミトコンドリア生合成の促進を目的とするものとして、例えば、皮膚のシワ形成の抑制又は改善等の用途が挙げられ；筋肉ミトコンドリア生合成の促進を目的とするものとして、例えば、運動能力低下改善、筋力低下抑制等の用途が挙げられ；その他の例として、代謝機能の改善、寿命延長、老化防止、神経系異常回復、認知機能改善等の用途が挙げられる。

本発明のＰＧＣ１α遺伝子発現促進剤は、ＰＧＣ１α遺伝子発現の促進を目的とした用途で用いられる。ＰＧＣ１α遺伝子発現の促進を目的とした具体的な用途としては特に限定されないが、ミトコンドリア生合成の促進（ひいては、ミトコンドリアの機能低下に起因する状態の改善）、マイオカイン産生の促進等の用途が挙げられる。ＰＧＣ１α遺伝子発現の標的となる組織については特に限定されないが、好ましくは皮膚及び筋肉が挙げられ、より好ましくは皮膚が挙げられる。ＰＧＣ１α遺伝子発現の促進を目的としたさらに具体的な用途としては、皮膚のＰＧＣ１α遺伝子発現の促進を目的とするものとして、例えば、皮膚のシワ形成の抑制又は改善等の用途が挙げられ；筋肉のＰＧＣ１α遺伝子発現の促進を目的とするものとして、例えば、運動能力低下改善、筋力低下抑制等の用途が挙げられる。

用量
本発明のミトコンドリア機能改善剤、ミトコンドリア生合成促進剤及びＰＧＣ１α遺伝子発現促進剤が内用される場合、有効成分量が、例えば、０．０１～２００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．１～２０ｍｇ／ｋｇ／日となる量で、１日に１～５回、内用することができる。

本発明のミトコンドリア機能改善剤、ミトコンドリア生合成促進剤及びＰＧＣ１α遺伝子発現促進剤が外用される場合、有効成分量が、例えば、１回当たりの塗布量で０．０００１～０．２ｍｇ／ｃｍ^２、好ましくは０．００１～０．０２ｍｇ／ｃｍ^２となる量で、１日に１～５回外用することができる。

以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

試験例１
（１）フルクトバシラス属乳酸菌の粉末（サンプルＡ）の調製
Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株を、Ｄｉｆｃｏ社製のＭＲＳ培地（前培養培地）３０ｍｌに植菌し、３０℃で２４時間、静置で拡大培養した。得られた培養液をＯＤ６６０が０.０２となるように、ＭＲＳ培地（本培養培地）１Ｌに植菌し、３０℃で１２時間、ｐＨ６．０～７．０で攪拌培養した。
得られた培養液を遠心分離に供して菌体を回収した。回収した菌体を１Ｌの０.８５ｗ／ｗ％ＫＣｌ水溶液で洗浄した。洗浄した菌体を再度遠心分離に供し、菌体を回収した。回収した菌体を殺菌後、凍結乾燥を行い、乳酸菌粉末（サンプルＡ）を得た。後述するＨＰＬＣ条件にて分析し、回収した菌体中のニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド生産量を測定した。測定の結果、サンプルＡのＮＡＤ１重量部当たりのＮＭＮの重量比率は０．０５５重量部であった。サンプルＡを実施例１、２に用いた。

（２）フルクトバシラス属乳酸菌の粉末（サンプルＢ）の調製
Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株を、Ｄｉｆｃｏ社製のＭＲＳ培地（前培養培地）３０ｍｌに植菌し、３０℃で２４時間、静置で拡大培養した。得られた培養液をＯＤ６６０が０.０２となるように、ＭＲＳ培地（本培養培地）１Ｌに植菌し、３０℃で１２時間、ｐＨ６．０～７．０で攪拌培養した。
得られた培養液を遠心分離に供して菌体を回収した。回収した菌体を１Ｌの０.８５ｗ／ｗ％ＫＣｌ水溶液で洗浄した。洗浄した菌体を再度遠心分離に供し、菌体を回収した。
回収した菌体を２００ｍｌのイオン交換水に懸濁し、ｐＨ６．０～７．０で２５℃で８時間攪拌し、休止菌体反応を実施した。休止菌体反応終了後、遠心分離に供して菌体を回収した。回収した菌体を１Ｌの０.８５ｗ／ｗ％ＫＣｌ水溶液で洗浄した。洗浄した菌体を再度遠心分離に供し、菌体を回収した。回収した菌体を殺菌後、凍結乾燥を行い、乳酸菌粉末（サンプルＢ）を得た。後述するＨＰＬＣ条件にて分析し、回収した菌体中のニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド生産量（を測定した。測定の結果、サンプルＢのＮＡＤ１重量部当たりのＮＭＮの重量比率は１．５５重量部であった。サンプルＢを実施例３、４に用いた。

（ＭＲＳ培地組成）
２ｗ／ｗ％ グルコース
１ｗ／ｗ％ プロテアーゼペプトン
１ｗ／ｗ％ 牛肉エキス
０．５ｗ／ｗ％ 酵母エキス
０．２ｗ／ｗ％ クエン酸アンモニウム
０．１ｗ／ｗ％ Ｔｗｅｅｎ８０
０．５ｗ／ｗ％ 酢酸ナトリウム
０．０１ｗ／ｗ％ 硫酸マグネシウム
０．００５ｗ／ｗ％ 硫酸マンガン
０．２ｗ／ｗ％ リン酸水素二カリウム

（ＨＰＬＣ分析条件）ＮＭＮの測定方法
カラム：ＤａｉｓｏＰａｋ ＳＰ－１００－５－ＯＤＳ－Ｐ（４.６×１５０ｍｍ）×２本
カラム温度：２５℃
溶離液 ：７５ｍＭ リン酸アンモニウム水溶液（ｐＨ６.０）
流速 ：０.６ｍｌ/ｍｉｎ
検出器 ：ＵＶ検出器（２６０ｎｍ）
検出時間 ：１４．５分

（ＨＰＬＣ分析条件）ＮＡＤの測定方法
カラム：ＤＡＩＳＯＰＡＫ ＳＰ－１００－５－ＯＤＳ－Ｐ（４．６×２５０ｍｍ)×２本
カラム温度:２５℃
溶離液 ：７５ｍＭ リン酸アンモニウム水溶液(ｐＨ６．０):メタノール=９５：５(ｗ：ｗ)
流速 ：０．７ｍＬ/ｍｉｎ
検出器 ：ＵＶ検出器(２６０ｎｍ)
検出時間 ：３３分

（３）ミトコンドリア機能改善試験及び結果
Ｃ２Ｃ１２細胞を１．０×１０^４Ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう９６－ＷＥＬＬ μClear fluorescence black plate (Greiner-Bio One, Tokyo, Japan)に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で２４時間培養した。その後、水中に表１に示す成分を添加し、２４時間培養した。その後、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２及びＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭで染色し、ミトコンドリア数をＩＮ ＣＥＬＬ Ａｎａｌｙｚｅｒ２２００にて解析した。比較例１（水のみを添加したコントロール）におけるミトコンドリア数を１００とした場合の各実施例及び各比較例によるミトコンドリアの相対数を導出した。ミトコンドリア相対数が１００を超えていると、ミトコンドリアの生合成が促進されている、つまり、ミトコンドリア機能が改善していると評価できる。結果を表１に示す。

さらに、比較例１及び４、並びに実施例３及び４について、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭで染色されたミトコンドリアの面積について、ＩＮ ＣＥＬＬ Ａｎａｌｙｚｅｒ２２００にて解析した。比較例１（水のみを添加したコントロール）におけるミトコンドリア面積を１００とした場合の各実施例及び比較例によるミトコンドリアの相対面積を導出した。ミトコンドリア相対面積が１００を超えている場合も、ミトコンドリアの生合成が促進されている、つまり、ミトコンドリア機能が改善していると評価できる。結果を表２に示す。

表１に示すように、試薬としてのＮＡＤ及びＮＭＮは、比較例２及び比較例４で用いた程度の量ではミトコンドリア機能を改善できなかったが、実施例１～４に示す通り、フルクトバシラス属乳酸菌粉末は、ＮＡＤ及びＮＭＮの含有量が比較例２又は比較例３よりはるかに少なくても、ミトコンドリア機能を顕著に改善することが確認できた。表２に示される結果も、表１に示される傾向を良く反映している。また、表１の比較例３及び比較例５に示すように、試薬としてのＮＡＤ及びＮＭＮでは、比較例２及び比較例４で用いた場合の１０倍量に増量しても実質的なミトコンドリア機能改善効果を奏しなかった。これらの事実から、フルクトバシラス属乳酸菌粉末によるミトコンドリア機能改善効果は驚異的であるといえる。

試験例２
（１）フルクトバシラス属乳酸菌の抽出液（サンプルａ）の調製
試験例１で調製した乾燥乳酸菌(サンプルＡ)２０ｇを乳鉢で細かくすりつぶし、滅菌水１Ｌに懸濁し、懸濁液を調製した。懸濁液を室温（約２５℃）で１時間撹拌し、遠心分離（１２,０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ）後、上清を０.２μｍのフィルターでろ過し、乳酸菌抽出液（サンプルａ）を得た。前述するＨＰＬＣ条件にて分析し、得られたサンプルａ中のニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）生産量を測定した。測定の結果、サンプルａのＮＡＤ１重量部当たりのＮＭＮの重量比率は０．０５２７重量部であった。サンプルａを実施例５、９に用いた。

（２）他のフルクトバシラス属乳酸菌の抽出液（サンプルｃ、ｄ、ｅ）の調製
乳酸菌として、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株、又はＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株を用いた以外は、試験例１の「（１）フルクトバシラス属乳酸菌の粉末（サンプルＡ）の調製」と同じ方法で、各乳酸菌の粉末を調製した。得られた各乳酸菌の粉末を用い、本試験例の「（１）フルクトバシラス属乳酸菌の抽出液（サンプルａ）の調製」と同様にして抽出液を調製し得た。具体的には、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株の粉末からその抽出液（サンプルｃ）を調製し、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株の粉末からその抽出液（サンプルｄ）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株の粉末からその抽出液（サンプルｅ）を得た。試験例１の「（ＨＰＬＣ分析条件）ＮＭＮの測定方法」及び「（ＨＰＬＣ分析条件）ＮＡＤの測定方法」の方法を用い、サンプルｃ、ｄ、ｅ中のニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）生産量を測定した。測定の結果、サンプルｃ中のＮＡＤ１重量部当たりのＮＭＮの重量比率は０．０２０２重量部であった。サンプルｄ中のＮＡＤ１重量部当たりのＮＭＮの重量比率は０．０２５０重量部であった。サンプルｅ中のＮＡＤ１重量部当たりのＮＭＮの重量比率は０．０４２１重量部であった。サンプルｃを実施例６、１０に用い、サンプルｄを実施例７、１１に用い、サンプルｅを実施例８、１２に用いた。

（３）マウス筋芽細胞におけるミトコンドリア生合成の遺伝子発現に関わる転写共役因子ＰＧＣ１αの発現量の測定及び結果（実施例５～８）
マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２（ＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ、ＲＣＢ０９８７）を６ウェルプレートに播種し、１０重量％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ（富士フイルム和光純薬）培地にて、３７℃、５体積％ＣＯ_２条件下で培養した。サブコンフルエントな状態になったところで、２体積％ウマ血清を含むＤＭＥＭ培地に交換し、６日間培養した。

サンプルａ、ｃ～ｄそれぞれを終濃度が１重量％となるよう添加した２体積％ウマ血清を含むＤＭＥＭ培地に置き換えて、３７℃、５体積％ＣＯ_２条件下で２４時間培養した。また、コントロールとして、サンプルａ、ｃ～ｄを添加しないことを除いて同様の操作を行った。得られた培養物について、総ＲＮＡの抽出を行った。

総ＲＮＡの抽出は、Ｃ２Ｃ１２細胞をＰＢＳで洗浄後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて抽出した。総ＲＮＡの定量はＱｕｂｉｔ ＲＮＡ ＨＳアッセイキット（インビトジェン社）を用いて行った。抽出したＲＮＡをＲｅｖｅｒＴｒａ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡社）を用いて逆転写し、１本鎖ｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型にＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＮｅｘｔＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡社）で蛍光色素ＣｙｂｅｒＧｒｅｅｎを用いたリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は９５℃、３０秒の初期変性ののち、９５℃、５秒・６０℃、３０秒の増幅反応を４０回繰り返した。遺伝子発現量は、一定量のＰＣＲ産物が得られるまでのサイクル数から相対値を算出した。リアルタイムＰＣＲはＰＧＣ１α遺伝子の他に内部標準としてＧＡＰＤＨ遺伝子についても行い、ＰＧＣ１αの相対発現量をＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素）の相対発現量で補正することによって評価を行った。

ＰＧＣ１αを増幅するためのプライマーとして、センス：５’－ ＧＡＡＴＣＡＡＧＣＣＡＣＴＡＣＡＧＡＣＡＣＣＧ－３’（配列番号１）、アンチセンス：５’－ＣＡＴＣＣＣＴＣＴＴＧＡＧＣＣＴＴＴＣＧＴＧ－３’（配列番号２）を、ＧＡＰＤＨを増幅するためのプライマーとして、５’－ ＣＡＴＣＡＣＴＧＣＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＣＴＧ－３’（配列番号３）、アンチセンス：５’－ＡＴＧＣＣＡＧＴＧＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＡＧ－３’（配列番号４）を使用した。

遺伝子発現量の測定は、リアルタイムＰＣＲ法により行った。ＰＧＣ１α遺伝子発現量を、内部標準であるＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素）遺伝子発現量に対する割合として求めた。コントロールにおけるＰＧＣ１α遺伝子発現量を１とした場合の各乳酸菌抽出液添加によるＰＧＣ１α遺伝子発現の相対量を算出した。結果を図１～図４に示す。

図１～４に示す通り、フルクトバシラス属乳酸菌抽出液は、乳酸菌抽出液無添加に比べて、マウス筋芽細胞において、ミトコンドリア生合成の遺伝子発現に関わる転写共役因子ＰＧＣ１α遺伝子発現量を顕著に増加させることが確認できた。

（４）ヒト表皮角化細胞におけるミトコンドリア生合成の遺伝子発現に関わる転写共役因子ＰＧＣ１αの発現量の測定及び結果（実施例９～１２）
ヒト表皮角化細胞ＰＳＶＫ１（ＪＣＲＢ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ、ＪＣＲＢ１０９３ 細胞樹立者：Yasumoto,S）を６ウェルプレートに５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種し、３７℃、５体積％ＣＯ_２の条件下で一晩培養した。培地は、ＫＭＧ－Ｇｏｌｄ基本培地（ロンザ）培地に添加剤（KGM-Gold Single Quots（ロンザ））を添加した培地にて、３７℃、５体積％ＣＯ_２条件下で２４時間培養した。

培養後、培地をＫＭＧ－Ｇｏｌｄ基本培地に交換し３７℃、５体積％ＣＯ_２の条件下で２４時間培養した。その後、サンプルａ、ｃ～ｄそれぞれを終濃度が１重量％となるよう添加したＫＭＧ－Ｇｏｌｄ基本培地に交換し、３７℃、５体積％ＣＯ_２の条件下で３時間培養した。また、コントロールとして、サンプルａ、ｃ～ｄを添加しないことを除いて同様の操作を行った。得られた培養物について、総ＲＮＡの抽出を行った。

総ＲＮＡの抽出はＰＳＶＫ１細胞をＰＢＳで洗浄後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて抽出した。総ＲＮＡの定量はＱｕｂｉｔ ＲＮＡ ＨＳアッセイキット（インビトジェン社）を用いて行った。抽出したＲＮＡをＲｅｖｅｒＴｒａ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡社）を用いて逆転写し、１本鎖ｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型にＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＮｅｘｔＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡社）で蛍光色素ＣｙｂｅｒＧｒｅｅｎを用いたリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は９５℃、３０秒の初期変性ののち、９５℃、５秒・６０℃、３０秒の増幅反応を４０回繰り返した。遺伝子発現量は、一定量のＰＣＲ産物が得られるまでのサイクル数から相対値を算出した。リアルタイムＰＣＲはＰＧＣ１α遺伝子の他に内部標準としてＧＡＰＤＨ遺伝子についても行い、ＰＧＣ１αの相対発現量をＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素）の相対発現量で補正することによって評価を行った。

ＰＧＣ１αを増幅するためのプライマーとして、センス：５’－ ＣＣＡＡＡＧＧＡＴＧＣＧＣＴＣＴＣＧＴＴＣＡ－３’（配列番号５）、アンチセンス：５’－ＣＧＧＴＧＴＣＴＧＴＡＧＴＧＧＣＴＴＧＡＣＴ－３’（配列番号６）を、ＧＡＰＤＨを増幅するためのプライマーとして、５’－ ＧＴＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＴＣＡＡＣＡＧＣＧ－３’（配列番号７）、アンチセンス：５’－ＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＡＡ－３’（配列番号８）を使用した。

遺伝子発現量の測定は、リアルタイムＰＣＲ法により行った。ＰＧＣ１α遺伝子発現量を、内部標準であるＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素）遺伝子発現量に対する割合として求めた。コントロールにおけるＰＧＣ１α遺伝子発現量を１とした場合の乳酸菌抽出液添加によるＰＧＣ１α遺伝子発現の相対量を算出した。結果を図５～図８に示す。

図５～８に示す通り、フルクトバシラス属乳酸菌抽出液は、乳酸菌抽出液無添加に比べて、ヒト表皮角化細胞においてミトコンドリア生合成の遺伝子発現に関わる転写共役因子ＰＧＣ１α遺伝子発現量を顕著に増加させることが確認できた。

Claims (8)

1. フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び／又は前記乳酸菌の抽出物を含有する、ミトコンドリア機能改善剤又はミトコンドリア生合成促進剤。
2. 前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株（国際寄託番号ＮＩＴＥＢＰ－０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（国際寄託番号ＮＩＴＥＢＰ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株（国際寄託番号ＮＩＴＥＢＰ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選ばれる、請求項１に記載のミトコンドリア機能改善剤又はミトコンドリア生合成促進剤。
3. ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド及びニコチンアミドモノヌクレオチドを含み、前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド１重量部当たりの前記ニコチンアミドモノヌクレオチドの含有比率が０．０２重量部以上である、請求項１に記載のミトコンドリア機能改善剤又はミトコンドリア生合成促進剤。
4. 請求項１に記載のミトコンドリア機能改善剤又はミトコンドリア生合成促進剤を含む、飲食品、化粧品又は医薬品。
5. フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び／又は前記乳酸菌の抽出物を含有する、ＰＧＣ１α遺伝子発現促進剤。
6. 前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株（国際寄託番号ＮＩＴＥＢＰ－０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（国際寄託番号ＮＩＴＥＢＰ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株（国際寄託番号ＮＩＴＥＢＰ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選ばれる、請求項５に記載のＰＧＣ１α遺伝子発現促進剤。
7. ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド及びニコチンアミドモノヌクレオチドを含み、前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド１重量部当たりの前記ニコチンアミドモノヌクレオチドの含有比率が０．０２重量部以上である、請求項５に記載のＰＧＣ１α遺伝子発現促進剤。
8. 請求項５に記載のＰＧＣ１α遺伝子発現促進剤を含む、飲食品、化粧品又は医薬品。

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