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JP2019535675A - 新規なハイブリッドａｃｔｒｉｉｂリガンドトラップタンパク質を用いた筋消耗及び骨疾患の治療方法 - Google Patents

新規なハイブリッドａｃｔｒｉｉｂリガンドトラップタンパク質を用いた筋消耗及び骨疾患の治療方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、新規なハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドについて記載する。本開示は、筋消耗、骨疾患、代謝性疾患、線維症、自己免疫／炎症性疾患、心血管疾患、がんまたはがん、慢性腎臓病（ＣＫＤ）、関節炎、食欲不振、肝疾患、臓器または組織移植の拒絶、貧血、疼痛、及び／または老化を治療または予防する方法を、それを必要とする対象において提供する。さらに、本開示は、対象における組織修復または臓器再生のための幹細胞成長を誘導する方法を提供する。前述の方法は、治療上有効量のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップポリペプチドを対象に投与することを含む。本開示はまた、ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。【選択図】図１２

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１０月２０日に出願された米国特許仮出願第６２／４１０，５９５号の優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
筋消耗とは、骨格筋または随意筋、心臓（心筋症）を制御する心筋及び平滑筋を含む、進行性の筋肉量低下及び／または筋肉の進行性衰弱及び変性を意味する。慢性の筋消耗は、進行性の筋肉量低下ならびに筋肉の衰弱及び変性を特徴とする状態（すなわち、長期にわたって持続する）である。筋肉量低下は、筋タンパク質の変性速度が、筋タンパク質の合成速度を上回るときに生じる。
筋消耗は、衰弱させ、生命を脅かす病態であり、例えば、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、筋炎、脱神経性筋萎縮、食欲不振悪質液症候群、がん、関節リウマチ、変形性関節症、インスリン抵抗性／糖尿病、サルコペニア肥満、加齢性サルコペニア、アンドロゲン除去、コルチコステロイドミオパチー、炎症性腸疾患、肝硬変、慢性閉塞性肺疾患、肺線維症、慢性腎疾患、外傷、心筋症、慢性心不全、及びＨＩＶ感染を含む数多くの慢性、神経性、遺伝性、炎症性、線維性、または感染性の病状の発症に関連している。筋消耗を引き起こすと言われている他の条件には、慢性下背部痛、加齢、中枢神経系の損傷、末梢神経損傷、化学的損傷、広範囲熱傷、股関節／膝関節置換、廃用性萎縮、微小重力への曝露、及び長期入院が含まれる。
骨疾患は、骨格系に関連するあらゆる疾病と考えられる。骨疾患は、非常に深刻な場合があり、迅速で効果的な治療を必要とする。骨疾患は、非常に痛みを伴う場合があり、患者の移動性及び自立性を奪う場合がある。疾患によって原因因子は異なるが、多くの骨疾患は、例えば、遺伝的要因、ウイルス感染、化学的異常、骨コラーゲンの欠乏、怪我、骨折、血管の損傷、アルコールの過剰摂取、または特定の薬の長期使用によって引き起こされる。骨疾患の例としては、骨粗鬆症、骨軟化症、骨形成不全症、線維性骨異形成症、進行性骨化性線維異形成症（ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖａ）、コルチコステロイド誘発性骨量減少、骨折、骨転移、及び骨パジェット病が含まれる。
アクチビンＩＩＡ受容体（ＡｃｔＲＩＩＡ）及びアクチビンＩＩＢ受容体（ＡｃｔＲＩＩＢ）は、例えば、アクチビンＡ、ミオスタチン（ＧＤＦ−８とも知られる）、増殖分化因子−１１（ＧＤＦ−１１）、ならびにＢＭＰ−３、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９（ＧＤＦ−２とも知られる）及びＢＭＰ−１０などの様々な他の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む、ＴＧＦ−βファミリーメンバーリガンドのサブセットに対するＩＩ型受容体である。ＡｃｔＲＩＩＡ及びＡｃｔＲＩＩＢは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、及びアクチビンＡＢを含むアクチビンに対するＩＩ型受容体として同定されている。ＡｃｔＲＩＩＢは、ミオスタチンに対する高親和性受容体であり、筋成長の重要な負の調節因子であり、したがって、筋肉量の制御に中心的な役割を果たす。ＡｃｔＲＩＩＡ及び／またはＡｃｔＲＩＩＢへのこれらのリガンドの結合は、細胞分化、アポトーシス、タンパク質の合成及び分解、石灰化、造血、血管新生、ステロイド合成、癒着、遊走、細胞外マトリックス生成、ならびに線維形成を調節することができる。特異的応答は、ＴＧＦ−βリガンド及び受容体の型及びレベル、ならびに細胞の状態及び環境に依存する。ＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達経路は、Ｓｍａｄ２／３転写因子を介して細胞応答を媒介し、ＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達経路の活性化は、筋消耗、骨量減少、線維化、及び炎症を含む、多くの疾患の病因及び進行に関与している。ミオスタチン、アクチビン、及びＧＤＦ１１を含むＴＧＦ−βファミリーのいくつかのメンバーは、ＡｃｔＲＩＩＢへの結合によりＳｍａｄ２／３活性化を媒介する。
従来の研究では、これらのリガンドとＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの薬理学的隔離が、動物モデルにおいて大幅な筋成長及び骨同化作用をもたらすことが示され、正常マウスにおいてミオスタチン中和抗体よりも約３倍高く筋成長することが証明され、ミオスタチン欠損マウスにおいて著しい筋肉増加をさらに刺激する能力が証明されている（Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｒｏｎｔｏｌ Ａ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ Ｍｅｄ Ｓｃｉ．，６８（１０）：１１８１−９２，Ｏｃｔ ２０１３；Ａｒｏｕｎｌｅｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．，４８（９）：８９８−９０４，Ｓｅｐｔ ２０１３）。さらに、筋肉及び骨におけるその顕著な同化作用に加えて、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃはまた、前臨床モデルにおいて重要な抗線維化及び抗炎症効果を有することが示されており、様々なＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ及びＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、数多くの慢性、神経性、遺伝性、炎症性、線維性、または感染性の病状の発症に関連する筋消耗性障害及び／または骨疾患の治療に関して、患者において臨床的に評価されてきた、または現在臨床的に評価されている。例えば、Ａｃｃｅｌｅｒｏｎ ＰｈａｒｍａのＡＣＥ−０１１であるＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合体は、多発性骨髄腫及び骨粗鬆症の溶骨性病変を有する患者において臨床的に評価され（Ｐｈ１、Ｐｈ２ａ）、転移性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する患者における化学療法誘発性貧血（ＣＩＡ）について現在評価中であり（Ｐｈ２／３）（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ）、そして血液透析患者における末期の腎疾患について現在評価中である。Ａｃｃｅｌｅｒｏｎ ＰｈａｒｍａのＡＣＥ−０３１であるＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）における治療的有効性について臨床的に評価されている（Ｐｈ１、Ｐｈ２）（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ）。
残念なことに、効果的に見えながら、骨粗鬆症治療へのＡＣＥ−０１１の臨床的可能性は、安全性の懸念（高赤血球増殖）により阻まれている。一方、ＡＣＥ−０３１は、ミオスタチン抗体、ペプチボディ、プロペプチドなどのミオスタチン選択的阻害剤によって引き起こされるものより、より顕著である著しい筋肉増加を示していたが、ＤＭＤ患者に見られる鼻及び歯茎からの出血における有害事象により阻まれており、このため、ＡＣＥ−０３１には臨床試験の差し止めが課された（Ｓｍｉｔｈ Ｒ．Ｃ．ａｎｄ Ｌｉｎ Ｂ．Ｋ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｐａｌｌｉａｔ Ｃａｒｅ．７（４）：３５２−３６０，２０１３）。その結果として、ＡＣＥ−０３１は、ＤＭＤ患者の筋肉量及び機能を改善する効果の有望な徴候があったにもかかわらず、鼻及び歯茎からの出血の副作用のためにＤＭＤフェーズ２試験で中止された。説得力のある新たな遺伝的証拠によりＢＭＰ９の機能喪失変異がヒトの血管異常及び出血症候群と関連付けられたため、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃが、血管恒常性を維持するのに重要であるＢＭＰ９媒介性Ｓｍａｄ１／３／８シグナル伝達を遮断する可能性があるように思われ、野生型ＡｃｔＲＩＩＢによるＢＭＰ９のこの機能的遮断が、出血副作用の根本原因であると考えられる（Ｗｏｏｄｅｒｃｈａｋ−Ｄｏｎａｈｕｅ ｅｔ．ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．，９３（３）：５３０−５３７，Ｓｅｐ ２０１３）。
したがって、重要な進歩があったが、数多くの慢性、神経性、遺伝性、炎症性、線維性、または感染性の病状の発症に関連する筋消耗及び／または骨疾患を治療するための、非常に有効かつ安全な新規な治療薬の提供が依然として大いに必要とされている。
参照による組み込み
本明細書に開示された全ての参考文献は、あらゆる目的のためにその全体を参照により本明細書に組み込む。
一態様では、本開示は、治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含み、このような投与が、筋肉量の低下及び／または筋機能の喪失を軽減する、対象における筋消耗を治療または予防する方法を提供する。各種実施形態では、前記筋消耗は、筋ジストロフィー（ＤＭＤ、ベッカー型ＭＤ、肢帯型ＭＤ、筋強直性ＭＤ及びＦＳＨＤなど）、筋炎（皮膚筋炎、多発性筋炎、及び封入体筋炎など）、ミオパチー（遺伝性ミオパチー、及びアンドロゲン除去療法、コルチコステロイドまたはスタチンによって誘発されるミオパチーなどの後天性ミオパチーを含む）、運動ニューロン疾患（ルー・ゲーリック病またはＡＬＳなど）、脊髄性筋萎縮症（乳児型進行性脊髄性筋萎縮症、中間型脊髄性筋萎縮症、若年型脊髄性筋萎縮症、及び成人型脊髄性筋萎縮症を含む）、神経筋接合部疾患（重症筋無力症、ランバート・イートン症候群、及びボツリヌス中毒など）、末梢神経疾患（シャルコー・マリー・トゥース病、デジェリン・ソッタス病、及びフリードライヒ運動失調症など）、脊髄損傷、脳卒中、神経変性疾患（パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、及びクロイツフェルト・ヤコブ病を含む）、がん（肺癌、膵臓癌、胃癌、結腸癌、前立腺癌、乳癌、食道癌、頭頸部癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、リンパ腫、及び多発性骨髄腫、皮膚癌、及び血液癌など）、臓器不全（心不全、腎不全、及び肝不全など）、外傷（火傷、またはオートバイ事故など）、廃用（長期安静、入院、及び宇宙飛行など）、感染（ＨＩＶ、ポリオ、及び敗血症など）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び老化（サルコペニア、サルコペニア肥満、及び変形性関節症など）からなる群から選択される疾患と関連する。
別の態様では、本開示は、治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象における骨疾患を治療または予防する方法を提供する。各種実施形態では、前記骨疾患は、骨粗鬆症、腎性骨形成異常症、骨形成不全症、進行性骨化性線維異形成症、コルチコステロイド誘発性骨量減少、アンドロゲン除去療法誘発性骨量減少、股関節骨折、がん誘発性骨量減少、骨転移、パジェット病、くる病、骨軟化症、ペルテス病、及び線維性骨異形成症からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象における代謝異常を治療または予防する方法を提供する。各種実施形態では、前記代謝異常は、メタボリックシンドローム、肥満症、脂質異常症、サルコペニア肥満、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）などの非アルコール性脂肪肝疾患、アルコール性脂肪肝疾患、インスリン抵抗性、糖尿病、ならびに糖尿病性ミオパチー、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、及びヘモクロマトーシスからなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象における線維症を治療または予防する方法を提供する。各種実施形態では、前記線維症は、間質性肺疾患、イディオタイプ肺線維症、嚢胞性線維症、肝線維症、硬変、胆道閉鎖症、心筋梗塞、心臓線維症、腎線維症、骨髄線維症、特発性後腹膜線維症、腎性線維化性皮膚症、炎症性腸疾患またはクローン病、ケロイド、強皮症、後腹膜線維症、及び関節線維症からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象における自己免疫／炎症性疾患を治療または予防する方法を提供する。各種実施形態では、前記疾患は、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性硬化症、糖尿病（１型）、糸球体腎炎、重症筋無力症、乾癬、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、クローン病、潰瘍性大腸炎及び原発性胆汁性肝硬変、関節炎、喘息、及び敗血症を含む自己免疫／炎症性疾患からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象における心血管疾患を治療する方法を提供する。各種実施形態では、前記心血管疾患は、心不全、心臓萎縮、肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）、心筋炎、冠動脈疾患、心筋梗塞、心臓不整脈、心臓弁膜症、心筋症、心膜疾患、大動脈疾患、マルファン症候群、及び心臓移植からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象におけるがんまたはがん転移を治療または予防する方法を提供する。各種実施形態では、前記がんは、膵臓癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、頭頸部癌、横紋筋肉腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、骨髄腫、リンパ腫及び白血病、黒色腫、癌腫、ならびに骨髄異形成症候群からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象における慢性腎臓病（ＣＫＤ）を治療または予防する方法を提供する。各種実施形態では、前記ＣＫＤは、腎不全、間質性線維症、糖尿病性腎症、腎臓透析、腎性骨形成異常症を含むＣＫＤ、及びタンパク質エネルギー障害（ＰＥＷ）からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象における関節炎を治療または予防する方法を提供する。各種実施形態では、前記関節炎は、関節リウマチ、変形性関節症、スティル病、強直性脊椎炎、背部痛、ベーチェット病、滑液包炎、ピロリン酸カルシウム沈着症、手根管症候群、膝蓋軟骨軟化症、慢性疲労症候群、複雑性局所疼痛症候群、クリオピリン関連周期性症候群、変性円板疾患、発育性股関節形成不全、エーラス・ダンロス症候群、家族性地中海熱、線維筋痛症、巨細胞性動脈炎、皮膚筋炎、特発性関節炎、強皮症、川崎病、狼瘡、混合性結合組織病、多発性筋炎、パジェット、リウマチ性疾患、ヘモクロマトーシス、感染性関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、シェーグレン病、脊柱管狭窄症、及び腱炎からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象における食欲不振を治療または予防する方法を提供する。各種実施形態では、前記食欲不振は、神経性食思不振症及び食欲不振悪液質症候群から選択される。
別の態様では、本開示は、治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象における肝疾患を治療または予防する方法を提供する。各種実施形態では、前記肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎、肝線維症または肝硬変、硬変、自己免疫性肝炎、肝細胞癌、肝不全、及び肝移植からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象における臓器または組織の移植方法を提供する。各種実施形態では、前記移植は、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、腸及び胸腺の臓器移植、ならびに筋肉、骨、腱、角膜、皮膚、心臓弁、神経及び血管の組織／細胞移植からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象における貧血を治療または予防する方法を提供する。各種実施形態では、前記貧血は、炎症性貧血、鉄欠乏性貧血、鉄過剰症、サラセミア、溶血性貧血、鎌状赤血球貧血、悪性貧血、ファンコニ貧血、骨髄異形成症候群、再生不良性貧血、がん関連貧血、化学療法誘発性貧血、ならびにＣＫＤ及び腎臓透析に関連する貧血からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象における疼痛を治療する方法を提供する。各種実施形態では、前記疼痛は、神経障害性疼痛、体性痛、内臓痛、炎症性疼痛、がん疼痛、背部痛、及び関節痛からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象における老化を治療する方法を提供する。各種実施形態では、前記老化状態は、高齢者のフレイル、加齢性サルコペニア、及び変形性関節症からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象における組織修復または臓器再生のための幹細胞成長を誘導する方法を提供する。各種実施形態では、前記幹細胞は、筋幹（サテライト）細胞、心臓幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞及び多能性幹細胞からなる群から選択される。
各種実施形態では、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、アミノ酸残基Ｒ３、Ｉ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｓ２０、Ｌ２２、Ｒ２４、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｌ４８、Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｋ５１、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４、Ｆ８４、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８またはＴ１１０の少なくとも１個が別のアミノ酸で置換されている配列番号１のアミノ酸配列を有するハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、ミオスタチン及びアクチビンＡに結合可能であるが、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドと比較してＢＭＰ９に対する結合親和性が減少している。
各種実施形態では、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、または配列番号３７に記載のアミノ酸配列を有するハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、ミオスタチン及びアクチビンＡに結合可能であるが、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドと比較してＢＭＰ９に対する結合親和性が減少している。各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号３〜３７から選択されたアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドであり、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、ミオスタチン及びアクチビンＡに結合可能であるが、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドと比較してＢＭＰ９に対する結合親和性が減少している。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、または配列番号１１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、ミオスタチン及びアクチビンＡに結合可能であるが、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドと比較してＢＭＰ９に対する結合親和性が減少している。各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号５１〜１１７から選択されたアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドであり、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、ミオスタチン及びアクチビンＡに結合可能であるが、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドと比較してＢＭＰ９に対する結合親和性が減少している。
各種実施形態では、本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチド及び少なくとも１つの異種タンパク質を含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップは、ミオスタチン及びアクチビンＡに結合可能であるが、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドと比較してＢＭＰ９に対する結合親和性が減少している。各種実施形態では、前記異種タンパク質は、Ｆｃドメインである。各種実施形態では、前記Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインである。各種実施形態では、前記Ｆｃドメインは、配列番号３８に記載のヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン配列に由来する。各種実施形態では、前記Ｆｃドメインは、配列番号３９に記載のアミノ酸配列を有するＦｃドメインである。各種実施形態では、前記Ｆｃドメインは、配列番号４０に記載のヒトＩｇＧ２重鎖定常ドメイン配列に由来する。各種実施形態では、前記Ｆｃドメインは、配列番号４１に記載のアミノ酸配列を有するＦｃドメインである。各種実施形態では、前記Ｆｃドメインは、配列番号４２に記載のヒトＩｇＧ４重鎖定常ドメイン配列に由来する。各種実施形態では、前記Ｆｃドメインは、配列番号４３に記載のアミノ酸配列を有するＦｃドメインである。
各種実施形態では、前記異種タンパク質は、リンカー及び／またはヒンジリンカーペプチドによって、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドに結合する。前記リンカーまたはヒンジリンカーは、二次構造を比較的含まない５、１０、１５、２０、３０、４０またはそれ以上のアミノ酸の人工配列であり得る。各種実施形態では、前記リンカーは、Ｇ／Ｓ含有量が豊富である（例えば、リンカー中のアミノ酸の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上がＧまたはＳである）。各種実施形態では、前記リンカーは、（ＧＧＧＧＳ（配列番号４４））ｎモチーフ（ｎ＝１〜６）を有する。
各種実施形態では、本開示のハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチド（例えば、配列番号３〜３７または５１〜１１７のいずれか１つ）にヒトＩｇＧ４ Ｆｃ（配列番号４３）を連結するために、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有するリンカーが、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を有するヒンジリンカーと共に使用される。
本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質の２つの例示的な分子構成を示す。 ＡＧ−０００３（配列番号５）のアミノ酸配列を有するハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質と、ＡＧ−０００５（配列番号７）のアミノ酸配列を有するハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質の、ミオスタチン中和能力（左パネル）、アクチビンＡ中和能力（中央パネル）、及びＢＭＰ９中和能力（右パネル）を評価するために使用された細胞ベースアッセイの結果を、ベンチマークとして野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質のもの（ＷＴ）と比較して表す折れ線グラフを示す。 ＡＧ−００１４（配列番号１６）のアミノ酸配列を有するハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質と、ＡＧ−００２７（配列番号２９）のアミノ酸配列を有するハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質の、ミオスタチン（上段左）、アクチビンＡ（上段右）、アクチビンＢ（下段左）、及びＢＭＰ９（下段右）における細胞ベースの中和活性結果を、ベンチマークとして野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質のもの（ＷＴ）と比較して表す折れ線グラフを示す。実施例に記載したように、ミオスタチン、アクチビンＡ、及びアクチビンＢ中和活性を、Ｃ２Ｃ１２−ＣＡＧＡ−ｌｕｃレポーターアッセイを用いることによって調べ、ＢＭＰ９中和活性をＣ２Ｃ１２−ＢＲＥ−ｌｕｃレポーターアッセイを用いて分析した。 週１回、１０ｍｇ／ｋｇの用量でＰＢＳ（ビヒクル）、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（ＷＴ）、ＡＧ−００１４（配列番号１６）、及びＡＧ−００２７（配列番号２９）をそれぞれ皮下注射した９週齢の雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの体重への影響を表す折れ線グラフを示す。０日目、５日目、１２日目及び１８日目に体重を記録した。各群ｎ＝６／８とした。統計分析のためにスチューデントのｔ検定を実施した。＊＊＊：Ｐ＜０．００１ｖｓビヒクル群。 週１回、１０ｍｇ／ｋｇの用量でＰＢＳ（ビヒクル）、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（ＷＴ）、ＡＧ−００１４（配列番号１６）、及びＡＧ−００２７（配列番号２９）をそれぞれ皮下注射した９週齢の雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの筋肉量への影響を表す棒グラフである（各群ｎ＝６／８）。各動物の個々のふくらはぎの筋肉を切開し、最終剖検中に計量した。統計分析は、スチューデントのｔ検定によって実施した。＊＊＊：Ｐ＜０．００１ｖｓビヒクル群。 マウス腹腔のエバンスブルー血管透過性試験画像を示す。外科的に露出させた各群の腹腔の代表的な画像が、図中で分類されているように示される。８週齢の雄ＢａｌｂＣマウスを、週１回、１０ｍｇ／ｋｇの用量で、それぞれＰＢＳ（ビヒクル）、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（ＷＴ）、ＡＧ−００１４（配列番号１６）、及びＡＧ−００２７（配列番号２９）によって処置した。処置の２週間後、２００μｌのエバンスブルー色素（ＰＢＳ中０．５％、ｐＨ７．２）を尾静脈を介して各群の動物（ｎ＝４）に注射した。エバンスブルー色素注射の９０分後、剖検を実施した。 マウス精巣のエバンスブルー血管透過性試験画像を示す。各群の切開した精巣器官の代表的な画像が、図中で分類されているように示される。８週齢の雄ＢａｌｂＣマウスを、週１回、１０ｍｇ／ｋｇで、ＰＢＳ（ビヒクル）、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（ＷＴ）、ＡＧ−００１４（配列番号１６）、及びＡＧ−００２７（配列番号２９）それぞれによって処置した。処置の２週間後、２００μｌのエバンスブルー色素（ＰＢＳ中０．５％、ｐＨ７．２）を尾静脈を介して各群の動物（ｎ＝４）に注射した。エバンスブルー色素注射の９０分後、剖検を実施した。 マウス肺のエバンスブルー血管透過性試験画像を示す。各群の切開した肺組織の代表的な画像が、図中で分類されているように示される。８週齢の雄ＢａｌｂＣマウスを、週１回、１０ｍｇ／ｋｇで、ＰＢＳ（ビヒクル）、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（ＷＴ）、ＡＧ−００１４（配列番号１６）、及びＡＧ−００２７（配列番号２９）それぞれによって処置した。処置の２週間後、２００μｌのエバンスブルー色素（ＰＢＳ中０．５％、ｐＨ７．２）を尾静脈を介して各群の動物（ｎ＝４）に注射した。エバンスブルー色素注射の９０分後、剖検を実施した。 図中で分類されているような異なる処置群における湿肺組織（左パネル）及び精巣組織（右パネル）１ｍｇ当たりの血管外溢出エバンスブルー色素の量を表す棒グラフを示す。８週齢の雄ＢａｌｂＣマウスを、週１回、１０ｍｇ／ｋｇで、ＰＢＳ（ビヒクル）、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質（ＷＴ）、ＡＧ−００１４（配列番号１６）、及びＡＧ−００２７（配列番号２９）それぞれによって処置した。処置の２週間後、２００μｌのエバンスブルー色素（ＰＢＳ中０．５％、ｐＨ７．２）を尾静脈を介して各群の動物（ｎ＝４）に注射した。エバンスブルー色素注射の９０分後、剖検を実施し、精巣及び肺組織を採取した。組織を計量し、次いでホルムアミドを含むバイアルに個別に入れてエバンスブルー色素を抽出した。５５℃で２４時間インキュベーション後、試料を遠心し、各試料の水相の吸光度を分光光度計を用いて６１０ｎｍの波長で測定した。統計分析は、スチューデントのｔ検定を用いることによって実施した。＊：Ｐ＜０．０５。 ＡＧ−００１４（配列番号１６）、ＡＧ−００２３（配列番号２５）、ＡＧ−００２４（配列番号２６）、ＡＧ−００２５（配列番号２７）、ＡＧ−００２７（配列番号２９）、ＡＧ−００２８（配列番号３０）、ＡＧ−００２９（配列番号３１）、及びＡＧ−００３５（配列番号３７）を含む数多くの例示的ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質に関するＢＭＰ９における細胞ベースの中和活性結果を、ベンチマークとして野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質のもの（ＷＴ）と比較して表す折れ線グラフを示す。ＢＭＰ９中和活性をＣ２Ｃ１２−ＢＲＥ−ｌｕｃレポーターアッセイを用いることによって分析した。 野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質のものと比較した、いくつかの例示的なハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質間のミオスタチン中和ＩＣ５０値の差を示す。個々のタンパク質のミオスタチン中和活性をＣ２Ｃ１２−ＣＡＧＡ−ｌｕｃレポーター培養液を用いて調べ、ＩＣ５０値をＰｒｉｓｍソフトウェアを用いることによって算出した。このグラフは、ＡＧ−００１４（配列番号１６）、ＡＧ−００２３（配列番号２５）、ＡＧ−００２４（配列番号２６）、ＡＧ−００２７（配列番号２９）、ＡＧ−００２８（配列番号３０）、及びＡＧ−００２９（配列番号３１）を含む例示的ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質のそれぞれのミオスタチン中和ＩＣ５０値におけるパーセント差を、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃのものと比較して示す。 漸増濃度で野生型（ＷＴ）ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ及び野生型ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃと比較した、２つの例示的なハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質ＡＧ−００１４（配列番号１６）及びＡＧ−００２７（配列番号２９）それぞれのＢＭＰ９結合におけるＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。自動ＥＬＩＳＡ分析をＫｉｎＥｘＡ装置（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて実施した。２０μｇ／ｍｌのＢＭＰ９を、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓによって推奨されている実験手順を用いて、ＮＨＳ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合させた。ＷＴ ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ、ＷＴ ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ、及び各ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質を、図に示すように１００ｐＭ、１ｎＭ、及び１０ｎＭの濃度でＢＭＰ９結合について試験した。野生型及びハイブリッドタンパク質は、ＢＭＰ９被覆ビーズ上に捕捉され、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）によって検出した。ＫｉｎＥｘＡ Ｐｒｏソフトウェア（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、ＢＭＰ９結合シグナルを記録した。 ＰＢＳ（ビヒクル対照）、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（ＷＴ−ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ）、ハイブリッドトラップＡ（ＡＧ−００２７；配列番号２９）またはハイブリッドトラップＢ（ＡＧ−００１４；配列番号１６）によって処置した１２９Ｓ１／ＳｖｌｍＪマウスの後肢足の爪床の肉眼形態の顕微鏡検査を示す。倒立顕微鏡を用いることによって出血の徴候について後肢足の爪床を検査し、デジタルカメラを用いて写真撮影した。 ＯＲＸ Ｃ５７ＢＬ／６マウスの体重におけるハイブリッドトラップ（ＡＧ−００２７；配列番号２９）投与の効果を表す折れ線グラフを示す。データは、正常対照群、ビヒクル処置ＯＲＸ群、及びハイブリッドトラップ処置ＯＲＸ群において縦断的に記録された体重（左パネル）及び体重変化（右パネル）を示す。統計分析は、スチューデントのｔ検定を用いて実施した。＊＊＊：Ｐ＜０．００１ｖｓビヒクル処置ＯＲＸ群。ｎ＝６。 精巣摘出（ＯＲＸ）マウスの後肢筋量及び除脂肪屠体重量におけるハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ（ＡＧ−００２７；配列番号２９）処置の効果を表す棒グラフを示す。正常対照群、ビヒクル処置ＯＲＸ群、及びハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ処置ＯＲＸ群について、腓腹筋、大腿四頭筋、及びヒラメ筋の重量及び除脂肪屠体重量を４２日目の最終剖検中に記録した。腓腹筋、大腿四頭筋、及びヒラメ筋の平均重量に関するデータは、それぞれの後肢筋対をベースとした。統計分析は、スチューデントのｔ検定を用いて実施した。＊＊＊：Ｐ＜０．００１。ｎ＝６。 正常マウス（正常）、ビヒクル処置ＯＲＸマウス（ＯＲＸ＋ビヒクル）、及びハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ（ＡＧ−００２７；配列番号２９）処置ＯＲＸマウス（ＯＲＸ＋ハイブリッドトラップ）の大腿骨遠位部の、骨体積分率（ＢＶ／ＴＶ、％）、骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ、ｍｍ）、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ、ｍｍ−１）、及び骨梁間隔（Ｔｂ．Ｓｐ、ｍｍ）のマイクロＣＴ分析を表す棒グラフを示す。統計分析のためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１。ｎ＝６。 正常マウス（正常）、ビヒクル処置ＯＲＸマウス（ＯＲＸ＋ビヒクル）、及びハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ（ＡＧ−００２７；配列番号２９）処置ＯＲＸマウス（ＯＲＸ＋ハイブリッドトラップ）の第４腰椎の、骨体積分率（ＢＶ／ＴＶ、％）、骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ、ｍｍ）、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ、ｍｍ−１）、及び骨梁間隔（Ｔｂ．Ｓｐ、ｍｍ）のマイクロＣＴ分析を表す棒グラフを示す。統計分析のためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１。ｎ＝６。 糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスの摂食量（Ａ）、水分摂取量（Ｂ）、２４時間尿量（Ｃ）、及び空腹時血糖値（Ｄ）におけるハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ（ＡＧ−００２７；配列番号２９）処置の効果を表す棒グラフを示す。ヘテロ接合型ｄｂ／ｄｂマウス（ｎ＝６）を非糖尿病対照として使用する。摂食量、水分摂取量、２４時間尿量、及び空腹時血糖値を１０週間の処置後に測定する。統計分析は、スチューデントのｔ検定によって実施した。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１。各群ｎ＝６。 雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの体重変化における単回用量のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ（ハイブリッドトラップ）タンパク質の効果を示す。７週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（各群ｎ＝６）を、それぞれ１０ｍｇ／ｋｇでハイブリッドトラップＡ（ＡＧ−００２７；配列番号２９）、ハイブリッドトラップＢ（ＡＧ−００１４；配列番号１６）、及び野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（ＷＴ−ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ）の単回注射によって皮下処置した。対照群にビヒクル（ＰＢＳ）を単回注射した。ＰＢＳ及びハイブリッドトラップ処置マウスの体重（Ａ）及びベースラインからの体重変化（Ｂ）を注射後１４日まで異なる時点で記録した。統計分析は、スチューデントのｔ検定を用いて実施した。＊＊＊：Ｐ＜０．００１；各群ｎ＝６。エラーバーは、標準偏差を示す。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスの後肢筋量及び除脂肪屠体重量におけるハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ（ハイブリッドトラップ）タンパク質の単回注射の効果の直接比較を示す。マウスを、単回用量１０ｍｇ／ｋｇでハイブリッドトラップＡ（ＡＧ−００２７；配列番号２９）、ハイブリッドトラップＢ（ＡＧ−００１４；配列番号１６）、及びＷＴ−ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（ベンチマーク）それぞれによって、またはビヒクル（ＰＢＳ）によって皮下処置した。注射後１４日目に、マウスを最終剖検した。ＰＢＳ処置群、ハイブリッドトラップＡ処置群、及びハイブリッドトラップＢ処置群について、腓腹筋（Ａ）、大腿四頭筋（Ｂ）及びヒラメ筋（Ｃ）を含む後肢筋量、ならびに除脂肪屠体重量（Ｄ）を測定した。統計分析は、スチューデントのｔ検定を用いて実施した。＊＊＊：Ｐ＜０．００１；各群ｎ＝６。エラーバーは、標準偏差を示す。統計分析は、スチューデントのｔ検定を用いて実施した。 雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの体重変化における単回漸増用量のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ（ハイブリッドトラップ）タンパク質の効果を示す。６週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、単回漸増用量のハイブリッドトラップＡ（ＡＧ−００２７；配列番号２９）及びハイブリッドトラップＢ（ＡＧ−００１４（配列番号１６）によって、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇで皮下処置した。対照群は、ビヒクル（ＰＢＳ）によって処置した。ＰＢＳ処置マウス及びハイブリッドトラップ処置マウスにおける体重及びベースラインからの体重変化を注射後８日まで記録した。統計分析は、スチューデントのｔ検定を用いて実施した。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；各群ｎ＝６。エラーバーは、標準偏差を示す。 雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの後肢筋量における単回漸増用量のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ（ハイブリッドトラップ）タンパク質の効果を示す。ハイブリッドトラップＡ（ＡＧ−００２７；配列番号２９）及びハイブリッドトラップＢ（ＡＧ−００１４（配列番号１６）を、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇで皮下処置した。８日目に、マウスを最終剖検のために安楽死させた。ＰＢＳ処置群、ハイブリッドトラップＡ処置群、及びハイブリッドトラップＢ処置群について、腓腹筋（Ａ）及び大腿四頭筋（Ｂ）を含む後肢筋量を剖検手法によって測定した。統計分析は、スチューデントのｔ検定を用いて実施した。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；各群ｎ＝６。エラーバーは、標準偏差を示す。統計分析は、スチューデントのｔ検定を用いて実施した。 雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの摂食量における単回漸増用量のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ（ハイブリッドトラップ）タンパク質の効果を示す。６週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、単回漸増用量のハイブリッドトラップＡ（ＡＧ−００２７；配列番号２９）によって、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇで皮下処置した。データは、ＰＢＳ処置マウス及びハイブリッドトラップ処置マウスにおける８日目に記録された摂食量を示す。統計分析は、スチューデントのｔ検定を用いて実施した。＊＊：Ｐ＜０．０１；各群ｎ＝６。エラーバーは、標準偏差を示す。 デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＭＤＸ）マウスの体重におけるハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ（ハイブリッドトラップ）タンパク質の皮下投与の効果を示す。４週齢のＭＤＸマウスを、１０ｍｇ／ｋｇで週１回８週間、ビヒクル（ＰＢＳ）またはハイブリッドトラップＡ（ＡＧ−００２７；配列番号２９）またはハイブリッドトラップＢ（ＡＧ−００１４（配列番号１６）によって皮下処置した。データは、ＰＢＳ処置マウス及びハイブリッドトラップ処置ＭＤＸマウスにおいて縦断的に記録された体重（Ａ）及びベースラインからの体重変化（Ｂ）を示す。統計分析は、スチューデントのｔ検定を用いて実施した。＊＊＊：Ｐ＜０．００１；各群ｎ＝８。エラーバーは、標準偏差を示す。 ＭＤＸマウスの後肢筋量におけるハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ（ハイブリッドトラップ）タンパク質の皮下投与の効果を示す。ＭＤＸマウスを、８週間、１０ｍｇ／ｋｇで週１回、ハイブリッドトラップＡ（ＡＧ−００２７；配列番号２９）及びハイブリッドトラップＢ（ＡＧ−００１４（配列番号１６）によって、またはビヒクル（ＰＢＳ）によって皮下処置した。５６日目に、ＭＤＸマウスを最終剖検のために安楽死させた。ＰＢＳ（ＭＤＸ＋ＰＢＳ）またはハイブリッドトラップＡ（ＭＤＸ＋ハイブリッドトラップＡ）またはハイブリッドトラップＢ（ＭＤＸ＋ハイブリッドトラップＢ）によって処置したＭＤＸマウスにおいて、腓腹筋（Ａ）、大腿四頭筋（Ｂ）及びヒラメ筋（Ｃ）を含む個々の後肢筋量を剖検手法によって測定した。統計分析は、スチューデントのｔ検定を用いて実施した。＊＊＊：Ｐ＜０．００１；各群ｎ＝８。エラーバーは、標準偏差を示す。 ＭＤＸマウスの握力におけるハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ（ハイブリッドトラップ）タンパク質の皮下投与の効果を示す。ＰＢＳ（ＭＤＸ＋ＰＢＳ）またはハイブリッドトラップＡ（ＡＧ−００２７；配列番号２９）（ＭＤＸ＋ハイブリッドトラップＡ）またはハイブリッドトラップＢ（ＭＤＸ＋ハイブリッドトラップＢ）（ＡＧ−００１４（配列番号１６）によって処置したＭＤＸマウスにおいて、ＢＩＯＳＥＢ握力計（ＥＢ−ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いることによって、８週目に握力を分析した。統計分析は、スチューデントのｔ検定を用いて実施した。＊＊＊：Ｐ＜０．００１；各群ｎ＝８。エラーバーは、標準偏差を示す。 ＭＤＸマウスの循環クレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルにおけるハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ（ハイブリッドトラップ）タンパク質の皮下投与の効果を示す。ＭＤＸマウスを、８週間にわたって毎週、１０ｍｇ／ｋｇで、ＰＢＳまたはハイブリッドトラップ（ＡＧ−００２７；配列番号２９）によって皮下処置した。同齢の野生型マウスを正常対照として使用した。同齢の野生型マウス（ＷＴ）、及びＰＢＳによって処置したＭＤＸマウス（ＭＤＸ＋ＰＢＳ）またはハイブリッドトラップによって処置したＭＤＸマウス（ハイブリッドトラップ＋ＰＢＳ）において、血清中ＣＫレベルを測定した。＊：Ｐ＜０．０５。スチューデントのｔ検定。各群ｎ＝８。エラーバーは、標準偏差を示す。 ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ（ハイブリッドトラップ）処置により生じる大腿骨遠位部での骨梁密度変化のマイクロＣＴ分析の結果を示す。ＭＤＸマウスを、８週間にわたって毎週、１０ｍｇ／ｋｇで、ＰＢＳ（ＭＤＸ＋ＰＢＳ）またはハイブリッドトラップ（ＡＧ−００２７；配列番号２９）（ＭＤＸ＋ハイブリッドトラップ）によって皮下処置した。Ａ．ＰＢＳ処置群及びハイブリッドトラップ処置群の大腿骨遠位部の骨体積（ＢＶ／ＴＶ、％）である。統計分析のためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊＊＊：Ｐ＜０．００１。各群ｎ＝８。エラーバーは、標準偏差を示す。Ｂ．ＰＢＳ処置群及びハイブリッドトラップ処置群の大腿骨遠位部の骨梁構造の代表的な画像である。 ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ（ハイブリッドトラップ）処置により生じる腰椎での骨梁密度変化のマイクロＣＴ分析の結果を示す。ＭＤＸマウスを、８週間にわたって毎週、１０ｍｇ／ｋｇで、ＰＢＳ（ＭＤＸ＋ＰＢＳ）またはハイブリッドトラップ（ＡＧ−００２７；配列番号２９）（ＭＤＸ＋ハイブリッドトラップ）によって皮下処置した。Ａ．ＰＢＳ処置群及びハイブリッドトラップ処置群の腰椎の骨体積（ＢＶ／ＴＶ、％）である。統計分析のためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊＊＊：Ｐ＜０．００１。各群ｎ＝８。エラーバーは、標準偏差を示す。Ｂ．ＰＢＳ処置群及びハイブリッドトラップ処置群の腰椎の骨梁構造の代表的な画像である。 野生型マウス及びｏｉｍ／ｏｉｍ（ＩＩＩ型骨形成不全症）マウスの筋肉量におけるハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ（ハイブリッドトラップ）の効果を示す。８週齢の野生型対照マウス及びｏｉｍ／ｏｉｍマウスを、ＰＢＳまたはハイブリッドトラップ（ＡＧ−００２７；配列番号２９）によって６週間処置した。三頭筋（Ａ）及び腓腹筋（Ｂ）の重量を最終剖検中に記録した。統計分析は、スチューデントのｔ検定を用いて実施した。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１。各群ｎ＝９〜１２。エラーバーは、標準偏差を示す。 ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ（ハイブリッドトラップ）処置により生じる野生型マウス及びｏｉｍ／ｏｉｍマウスのＢＭＤ及びＢＭＣの変化の二重エネルギーＸ線吸収測定（ＤＥＸＡ）の結果を示す。８週齢の野生型対照マウス及びｏｉｍ／ｏｉｍマウスを、ＰＢＳまたはハイブリッドトラップ（ＡＧ−００２７；配列番号２９）によって６週間処置した。ＢＭＤ（Ａ）及びＢＭＣ（Ｂ）におけるＤＥＸＡスキャンは、ＰＢＳまたはハイブリッドトラップによる６週間の処置の直前及び直後に実施した。統計分析は、スチューデントのｔ検定を用いて実施した。＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１。各群ｎ＝９〜１２。エラーバーは、標準偏差を示す。 ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ（ハイブリッドトラップ）処置により生じる大腿骨遠位部での骨梁密度変化のマイクロＣＴ分析の結果を示す。８週齢の野生型対照マウス及びｏｉｍ／ｏｉｍマウスを、ＰＢＳまたはハイブリッドトラップ（ＡＧ−００２７；配列番号２９）によって６週間処置した。データは、ＰＢＳ処置野生型マウス及びハイブリッドトラップ処置野生型マウスの大腿骨遠位部の、骨体積分率（ＢＶ／ＴＶ ％）及び骨梁構造の代表的なマイクロＣＴ画像を、ＰＢＳ処置野生型マウス及びハイブリッドトラップ処置野生型マウスはパネルＡにて、ｏｉｍ／ｏｉｍマウスはパネルＢにて示す。統計分析のためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１。エラーバーは、標準偏差を示す。 ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ（ハイブリッドトラップ）処置により生じる腰椎での骨梁密度変化のマイクロＣＴ分析の結果を示す。データは、ＰＢＳまたはハイブリッドトラップ（ＡＧ−００２７；配列番号２９）によって処置した野生型マウス（パネルＡ）及びｏｉｍ／ｏｉｍマウス（パネルＢ）における第５腰椎の、骨体積分率（ＢＶ／ＴＶ ％）及び骨梁構造の代表的なマイクロＣＴ画像を示す。統計分析のためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１。エラーバーは、標準偏差を示す。 ｏｉｍ／ｏｉｍマウスの体長におけるハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ（ハイブリッドトラップ）処置の効果を示す。ＰＢＳまたはハイブリッドトラップ（ＡＧ−００２７；配列番号２９）による６週間の処置後に、ｏｉｍ／ｏｉｍマウス及び同齢の野生型対照マウスの体長を測定した。Ａ．６週間の処置後の野生型マウス及びｏｉｍ／ｏｉｍマウスの体長である。Ｂ．野生型対照からの変化率としてグラフ化した体長である。エラーバーは、標準偏差を示す。 大腿骨遠位部の骨面積（Ａ）、骨周囲長（Ｂ）及び石灰化面／骨表面比（Ｃ）におけるハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ（ハイブリッドトラップ）処置の効果の骨組織形態計測分析の結果を示す。骨組織形態計測分析は、ＰＢＳまたはハイブリッドトラップ（ＡＧ−００２７；配列番号２９）によって６週間処置した後に実施した。 大腿骨遠位部の破骨細胞／骨表面比（Ａ）及び破骨細胞数／骨周囲長比（Ｂ）におけるハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ（ハイブリッドトラップ）処置の効果の骨組織形態計測分析の結果を示す。骨組織形態計測分析は、ＰＢＳまたはハイブリッドトラップ（ＡＧ−００２７；配列番号２９）によって６週間処置した後に実施した。
本開示は、薬学的に許容可能なキャリア中の治療上有効量の本開示の新規な単離ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象におけるミオスタチン関連障害またはアクチビンＡ関連障害を治療する方法を提供する。この新規な単離ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、非筋肉関連サイトカインのシグナル伝達に影響を及ぼすことなく複数の悪液質（萎縮誘導）サイトカインの作用を選択的に遮断するように設計されたマルチサイトカイン拮抗剤として機能する融合タンパク質として遺伝子改変された。各種実施形態では、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、ミオスタチン及びアクチビンＡに結合可能であるが、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドと比較して、ＢＭＰ９に対する結合親和性が減少している（すなわち、ミオスタチン及びアクチビンＡ中和活性を保持するが、ＢＭＰ９中和性が劇的に低い）単離ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含む。本開示は、ミオスタチン及びアクチビンに対して強い中和活性を保持しながら、ＢＭＰ９への結合を著しく減少させる（したがって、ＢＭＰ９中和性が低い）ように改変されたハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップが、現在入手可能なミオスタチン阻害剤よりも安全かつより有効な分子であるミオスタチン阻害剤を提供し得るという発明者の独自の見識に部分的に基づく。具体的には、本発明者らは、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）内のアミノ酸残基を、ＡｃｔＲＩＩＡ ＥＣＤの対応するアミノ酸残基で選択的に置換するように改変したハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、ＢＭＰ９よりもミオスタチン及びアクチビンＡ（筋成長の重要な負の調節因子）を優先的に中和する新規なハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを提供できると想定している。ＢＭＰ９は、数多くの生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たし（例えば、Ｔｉｌｌｅｔ Ｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｇｅｎｅｔ．８；５：４５６，２０１５を参照）、ＢＭＰ９シグナル伝達は、正常な血液の血管系／透過性を維持するのに必須であることが示されている（例えば、Ｄａｖｉｄ Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．２５；１０２（８）：９１４−２２，２００８を参照のこと）。このように、本明細書に記載した新規なハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質によって処置した対象は、ＢＭＰ９に強く結合して中和する既存のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ分子によって処置した対象に見られる鼻及び歯茎からの出血の副作用を回避することができると想定している。これらの新規なハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質によって提供される治療上の利点は、安全であり、重篤な筋肉減少及び悪質液の回復に、そして筋委縮、骨量減少、炎症、及び線維化を伴う広範囲の慢性異化疾患を処置するために有効である次世代の治療薬を提供する。
定義
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書では互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを意味する。各種実施形態では、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、α炭素がペプチド結合を介して連結しているアミノ酸の鎖である。この鎖の一端（アミノ末端）にある末端アミノ酸は、したがって遊離アミノ基を持ち、この鎖の他端（カルボキシ末端）にある末端アミノ酸は、遊離カルボキシル基を持つ。本明細書で使用される場合、用語「アミノ末端」（略して、Ｎ−末端）とは、ペプチドのアミノ末端にあるアミノ酸の遊離αアミノ基を意味するか、またはペプチド内の他の任意の位置にあるアミノ酸のαアミノ基（ペプチド結合に関与する場合のイミノ基）を意味する。同様に、用語「カルボキシ末端」とは、ペプチドのカルボキシ末端の遊離カルボキシル基、または、ペプチド内の他の任意の位置にあるアミノ酸のカルボキシル基を意味する。ペプチドはまた、限定するものではないが、アミド結合ではなくエーテルによって結合したアミノ酸などのペプチド模倣体を含む任意のポリアミノ酸を本質的に含む。
本開示のポリペプチドは、いずれかの方法で、そして何らかの理由で修飾されたポリペプチドを含む。これは、例えば、（１）タンパク質分解に対する感受性を低減する、（２）酸化に対する感受性を低減する、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変える、（４）結合親和性を変える、及び（５）他の物理化学的または機能的特性を付与するまたは改変する、ためである。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）は、天然に存在する配列（例えば、分子間接触を形成するドメイン（複数可）外のポリペプチド部分において）中でなされ得る。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸のポリペプチドを機能的に類似したアミノ酸で置換することを意味する。以下の６つの基は、それぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む。
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、及びスレオニン（Ｔ）
２）アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）
３）アスパラギン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）
４）アルギニン（Ｒ）及びリジン（Ｋ）
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、及びバリン（Ｖ）
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）
「非保存的アミノ酸置換」とは、これらのクラスのうちの１つのメンバーを他のクラスのメンバーで置換することを意味する。このような改変を行う場合、各種実施形態によれば、アミノ酸のハイドロパシー指標が考慮され得る。各アミノ酸には、その疎水性及び電荷特性に基づいてハイドロパシー指標が割り当てられている。それらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）：グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）である。
タンパク質への相互に作用する生物学的機能の付与におけるアミノ酸ハイドロパシー指標の重要性は、本分野で理解されている（例えば、Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３１を参照のこと）。特定のアミノ酸は、類似のハイドロパシー指標またはスコアを持つ他のアミノ酸と置換でき、それでもなお類似した生物学的活性を維持できることが知られている。ハイドロパシー指標に基づいて改変を行う場合、各種実施形態では、ハイドロパシー指標が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。各種実施形態では、ハイドロパシー指標が±１以内であるアミノ酸の置換が含まれ、そして、各種実施形態では、ハイドロパシー指標が±０．５以内であるアミノ酸の置換が含まれる。
本分野ではまた、類似アミノ酸の置換は、親水性に基づいて効果的に行うことができると理解される（特に、その結果作製された生物学的に機能的なタンパク質またはペプチドが本明細書に開示される免疫学的な実施形態で使用されることを意図している場合）。各種実施形態では、その隣接するアミノ酸の親水性によって決定されるタンパク質の最大局所平均親水性は、その免疫原性及び抗原性、すなわちタンパク質の生物学的性質と関係している。
以下の親水性値が、これらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０．＋−．１）；グルタミン酸（＋３．０．＋−．１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（＋０．５．＋−．１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；及びトリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて改変を行う場合、各種実施形態では、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。各種実施形態では、親水性値が±１以内であるアミノ酸の置換が含まれ、そして、各種実施形態では、親水性値が±０．５以内であるアミノ酸の置換が含まれる。
例示的なアミノ酸置換が表１に記載されている。
Figure 2019535675
当業者は、周知の技術を用いて、本明細書に記載のポリペプチドの適切な変異体を決定することができる。各種実施形態では、当業者は、活性に重要であると考えられていない領域を標的とすることによって、活性を損なうことなく改変することができる分子の適切な領域を特定することができる。他の実施形態では、当業者は、類似のポリペプチド間で保存される残基及び分子部分を同定することができる。さらなる実施形態では、生物学的活性または構造に重要であり得る領域でさえも、生物学的活性を損なうことなく、またはポリペプチド構造に悪影響を及ぼすことなく保存的アミノ酸置換の対象となり得る。
加えて、当業者は、活性または構造にとって重要な類似のポリペプチド内の残基を特定する構造・機能研究を調査することができる。このような比較を考慮して、当業者は、類似したポリペプチドにおける活性または構造にとって重要なアミノ酸残基に対応するポリペプチド内のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、このように予測した重要なアミノ酸残基に対する化学的に類似したアミノ酸置換を選択することができる。
当業者はまた、三次元構造及びアミノ酸配列を、類似したポリペプチドのその構造に関連して解析することができる。このような情報を考慮して、当業者は、ポリペプチドのアミノ酸残基のアラインメントを、その三次元構造に関して予測することができる。各種実施形態では、当業者は、ポリペプチドの表面にあると予測されるアミノ酸残基の根本的な変化を起こさないように選択することができ、これは、そのような残基が他の分子との重要な相互作用に関与し得るからである。さらに、当業者は、所望の各アミノ酸残基に単一アミノ酸置換を含む試験変異体を生成してもよい。次いで、この変異体は当業者に既知の活性アッセイを用いてスクリーニングすることができる。このような変異体を使用して、適切な変異体に関する情報を集めることができる。例えば、特定のアミノ酸残基の改変によって活性が損なわれた、所望に反して低下した、または不適切となったことが発見された場合、このような改変を有する変異体を除去することができる。言い換えると、このような定型的な実験から集めた情報に基づいて、当業者は、単独でまたは他の突然変異と組み合わせて、さらなる置換を避けるべきであるアミノ酸を容易に決めることができる。
本明細書で使用される用語「ポリペプチド断片」及び「切断型ポリペプチド」とは、対応する完全長タンパク質と比較して、アミノ末端及び／またはカルボキシ末端が欠失しているポリペプチドを意味する。特定の実施形態では、断片は、例えば、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、または少なくとも１０００アミノ酸長であり得る。特定の実施形態では、断片はまた、例えば、多くとも１０００、多くとも９００、多くとも８００、多くとも７００、多くとも６００、多くとも５００、多くとも４５０、多くとも４００、多くとも３５０、多くとも３００、多くとも２５０、多くとも２００、多くとも１５０、多くとも１００、多くとも５０、多くとも２５、多くとも１０、または多くとも５アミノ酸長であり得る。断片は、さらに、一方または両端に、１つ以上の追加のアミノ酸、例えば、様々な天然に存在するタンパク質（例えば、Ｆｃまたはロイシンジッパードメイン）のアミノ酸配列または人工のアミノ酸配列（例えば、人工リンカー配列）を含んでいてもよい。
本明細書で使用される用語「ポリペプチド変異体」、「ハイブリッドポリペプチド」及び「ポリペプチド突然変異体」とは、別のポリペプチド配列と比較して、１つ以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列に挿入されている、アミノ酸配列から欠失している、及び／またはアミノ酸配列に置換されているアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。特定の実施形態では、挿入、欠失、または置換されたアミノ酸残基の数は、例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、または少なくとも５００アミノ酸長であり得る。本開示のハイブリッドは、融合タンパク質を含む。
ポリペプチドの「誘導体」とは、例えば、ポリエチレングリコール、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）などの別の化学的部分との結合、リン酸化、及びグリコシル化といった化学的に修飾されたポリペプチドである。
用語「％配列同一性」とは、本明細書では、用語「％同一性」と互換的に使用され、配列アラインメントプログラムを用いて整列させた際の、２つ以上のペプチド配列間のアミノ酸配列同一性レベル、または２つ以上のヌクレオチド配列間のヌクレオチド配列同一性レベルを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、８０％同一性は、規定のアルゴリズムによって決定された８０％配列同一性と同じことを意味し、所定の配列が、別の長さの別の配列に対して少なくとも８０％同一であることを意味する。特定の実施形態では、この％同一性は、例えば、所定の配列に対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％またはそれ以上の配列同一性から選択される。特定の実施形態では、この％同一性は、例えば、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、または約９５％〜９９％の範囲にある。
用語「％配列相同性」とは、本明細書では、用語「％相同性」と互換的に使用され、配列アラインメントプログラムを用いて整列させた際の、２つ以上のペプチド配列間のアミノ酸配列相同性レベル、または２つ以上のヌクレオチド配列間のヌクレオチド配列相同性レベルを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、８０％相同性は、規定のアルゴリズムによって決定された８０％配列相同性と同じことを意味し、したがって、所定の配列の相同体は、所定の配列の長さにわたって８０％を超える配列相同性を有する。特定の実施形態では、この％相同性は、例えば、所定の配列に対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％またはそれ以上の配列相同性から選択される。特定の実施形態では、この％相同性は、例えば、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、または約９５％〜９９％の範囲にある。
２つの配列間の同一性の決定に使用できる例示的なコンピュータプログラムには、限定するものではないが、例えば、ＢＡＬＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、及びＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰ、及びＴＢＬＡＳＴＮといった一連のＢＬＡＳＴプログラムがあり、これらはインターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで公的に入手可能である。また、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０（公開されているデフォルト設定、すなわち、パラメータｗ＝４、ｔ＝１７を特に参照のこと）及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２，１９９７も参照のこと。ＧｅｎＢａｎｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ及び他の公共データベースのアミノ酸配列と比較して所定のアミノ酸配列を評価する場合、配列検索は、通常ＢＬＡＳＴＰプログラムを用いて実施する。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＧｅｎＢａｎｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ及び他の公共データベースのアミノ酸配列に対する全てのリーディングフレームで翻訳された核酸配列の検索に好ましい。ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＸのいずれも、１１．０の開始ギャップペナルティ及び１．０の伸長ギャップペナルティのデフォルトパラメータを用いて実行し、ＢＬＯＳＵＭ−６２マトリックスを利用する。同文献参照。
パーセント配列同一性の計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計的分析も実行する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５７８７，１９９３を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって得られる類似性の１つの尺度は、最小和確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率を示す。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸の比較において、その最小和確率が、例えば約０．１未満、約０．０１未満、または約０．００１未満である場合、参照配列に類似していると考えられる。
本明細書で使用される用語「異種」とは、例えば、既存の天然組成物または状態を、別の供給源由来のものと置き換えることによって達成され得る、非天然、または天然に見られるものではない組成物または状態を意味する。同様に、あるタンパク質が天然に発現される生物以外の生物内でのそのタンパク質の発現は、異種発現システム及び異種タンパク質を構成する。
本明細書で使用される用語「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にまたは部分的にコードされた１つ以上のポリペプチドを含み、腫瘍抗原に対する特異性、または病的状態において過剰発現した分子に対する特異性を有するタンパク質を意味する。認識されている免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミュー定常領域遺伝子、ならびに、これらの遺伝子の亜型及び無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖（ＬＣ）は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖（ＨＣ）は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類され、これらは免疫グロブリンのクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥをそれぞれ規定する。典型的な免疫グロブリン（例えば、抗体）構造ユニットは、四量体からなる。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖の対からなり、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を規定する。
本明細書で使用される用語「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定しており、インタクトな抗体のパパイン消化によって生成され得る。前記Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または変異Ｆｃ領域であり得る。前記免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般的に２つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含み、選択的にＣＨ４ドメインを含む。抗体のＦｃ部分は、例えば、サイトカイン誘導、ＡＤＣＣ、貧食作用、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、ならびに抗体及び抗原−抗体複合体の半減期／クリアランス速度（例えば、新生児のＦｃＲ（ＦｃＲｎ）は、エンドソーム内の酸性ｐＨ下でＩｇＧのＦｃ領域に結合してＩｇＧを分解から保護し、これによりＩｇＧの長い血清半減期に寄与する）といったいくつかの重要なエフェクター機能を媒介する。抗体エフェクター機能を変える前記Ｆｃ部分におけるアミノ酸残基の置換は、当技術分野において既知である（例えば、Ｗｉｎｔｅｒらの米国特許第５，６４８，２６０号及び第５，６２４，８２１号を参照のこと）。
「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドユニットからなるポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）及びリボ核酸（「ＲＮＡ」）及び核酸類似体などの天然核酸を含む。核酸類似体には、非天然塩基、天然ホスホジエステル結合以外の他のヌクレオチドとの連結に関与するヌクレオチドを含むもの、またはホスホジエステル結合以外の連結を介して結合した塩基を含むものが含まれる。したがって、ヌクレオチド類似体には、例えば、限定することなく、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、ホスホロアミデート、ボラノホスフェート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）などが含まれる。このようなポリヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成装置を使って合成することができる。用語「核酸」とは、通常、大きなポリヌクレオチドを意味する。用語「オリゴヌクレオチド」とは、一般的に、短いポリヌクレオチドを意味し、一般的に約５０ヌクレオチド以下である。ヌクレオチド配列が、ＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）で表される場合、これは「Ｕ」が「Ｔ」を置換するＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も含むと理解される。
本明細書では、ポリヌクレオチド配列を記載するのに従来の表記法が使用されている：一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端が５’末端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は、５’方向と呼ばれる。５’から３’への新生ＲＮＡ転写産物へのヌクレオチド付加方向は、転写方向と呼ばれる。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は「コード鎖」と呼ばれ；そのＤＮＡから転写されたｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列であり、ＲＮＡ転写産物の５’から５’末端に位置する配列は「上流配列」と呼ばれ；前記ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列であり、コードするＲＮＡ転写産物の３’から３’末端である配列は「下流配列」と呼ばれる。
「相補的」とは、２つのポリヌクレオチドの相互作用表面のトポロジー的適合性または合致を意味する。したがって、２つの分子は相補的であると記載することができ、さらには、接触表面特性が互いに相補的である。第１のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が第２のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド結合パートナ―のヌクレオチド配列に対して実質的に同一である場合、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で第１のポリヌクレオチドが第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズできる場合、第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドに対して相補的である。
「特異的にハイブリダイズ」または「特異的ハイブリダイゼーション」または「選択的にハイブリダイズする」とは、複雑な（例えば、全細胞内の）ＤＮＡまたはＲＮＡ混合物中に配列が存在する場合の、ストリンジェントな条件下における特定の核酸配列への優先的な核酸分子の結合、二重鎖形成、またはハイブリダイズを意味する。用語「ストリンジェントな条件」とは、プローブが、その標的部分配列に優先的にハイブリダイズし、他の配列には、より低い程度でハイブリダイズするまたは全くハイブリダイズしない条件を意味する。サザンハイブリダイゼーション及びノーザンハイブリダイゼーションなどの核酸ハイブリダイゼーション実験の文脈における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、様々な環境パラメータ下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションに関する幅広い指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ，１９９３，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，ｐａｒｔ Ｉ，ｃｈａｐｔｅｒ ２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，３．ｓｕｐ．ｒｄ ｅｄ．，ＮＹ；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹに記載されている。
一般的に、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、規定されたイオン強度及びｐＨでの特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低く選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が、完全に一致したプローブにハイブリダイズする温度（規定のイオン強度及びｐＨ下で）である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブのＴｍと等しくなるように選択される。サザンブロットまたはノーザンブロットにおいてフィルタ上に約１００を超える相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションに対するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、４２℃で１ｍｇのヘパリンを含む５０％のホルマリンであり、そのハイブリダイゼーションは一晩実施される。高ストリンジェントな洗浄条件の一例は、７２℃で約１５分間の０．１５Ｍ ＮａＣｌである。ストリンジェントな洗浄条件の一例は、６５℃で１５分間の０．２×ＳＳＣ洗浄である。ＳＳＣ緩衝液の説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．を参照のこと。高ストリンジェント洗浄の前に低ストリンジェント洗浄を行うことで、バックグラウンドプローブシグナルを除去することができる。例えば、約１００ヌクレオチドを超える二本鎖に対する例示的な中程度のストリンジェンシー洗浄は、４５℃で１５分間の１×ＳＳＣである。例えば、約１００ヌクレオチドを超える二本鎖に対する例示的な低ストリンジェンシー洗浄は、４０℃で１５分間の４〜６×ＳＳＣである。一般的に、個々のハイブリダイゼーションアッセイの無関係なプローブに関して観察されたものの２倍（またはそれ以上）のシグナル対ノイズ比によって、特定のハイブリダイゼーションの検出が示される。
「プライマー」とは、指定のポリヌクレオチド鋳型に特異的にハイブリダイズすることができ、相補的ポリヌクレオチドの合成開始点をもたらすポリヌクレオチドを意味する。このような合成は、ポリヌクレオチドプライマーが、合成が誘導される条件下、すなわちヌクレオチド、相補的ポリヌクレオチド鋳型、及びＤＮＡポリメラーゼなどの重合化のための物質の存在下に置かれる際に生じる。プライマーは通常一本鎖であるが、二本鎖であってもよい。プライマーは、通常デオキシリボ核酸であるが、多種多様な合成プライマー及び天然プライマーが多くの用途において有用である。プライマーは、ハイブリダイズして合成開始部位として機能するように設計された鋳型に相補的であるが、その鋳型の正確な配列を反映する必要はない。このような場合、鋳型に対するプライマーの特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プライマーは、例えば、発色性部分、放射性部分、または蛍光部分によって標識することができ、検出可能な部分として使用される。
「プローブ」とは、ポリヌクレオチドに関連して使用する場合、別のポリヌクレオチドの指定された配列に特異的にハイブリダイズできるポリヌクレオチドを意味する。プローブは、標的相補的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするが、その鋳型の正確な相補的配列を反映する必要はない。このような場合、標的に対するプローブの特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プローブは、例えば、発色性部分、放射性部分、または蛍光部分によって標識することができ、検出可能な部分として使用される。プローブが相補的ポリヌクレオチドの合成開始点をもたらす場合、プローブは、プライマーでもあり得る。
「ベクター」は、それに連結した別の核酸を細胞内に導入するのに使用できるポリヌクレオチドである。あるタイプのベクターは、「プラズミド」であり、これは追加の核酸セグメントがライゲーションすることができる直鎖または環状の二本鎖ＤＮＡ分子を意味する。別のタイプのベクターは、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）であり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノム内に導入することができる。特定のベクターは、導入される宿主細胞内で自己複製することができる（例えば、細菌性複製起点を含む細菌ベクター及びエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムへ組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。「発現ベクター」は、選択したポリヌクレオチドの発現を指示することができるタイプのベクターである。
「調節配列」は、作動可能に連結された核酸の発現（例えば、発現のレベル、タイミング、または位置）に影響を及ぼす核酸である。調節配列は、例えば、調節した核酸に直接影響を及ぼす、または１つ以上の他の分子（例えば、調節配列及び／または核酸に結合したポリペプチド）の作用を介して影響を及ぼすことができる。調節配列の例には、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれる。調節配列のさらなる例は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９０，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．及びＢａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３６０５−０６に記載されている。ヌクレオチド配列は、調節配列がヌクレオチド配列の発現（例えば、発現のレベル、タイミング、または位置）に影響を及ぼす場合、調節配列に「作動可能に連結される」。
「宿主細胞」は、本開示のポリヌクレオチドを発現させるために使用することができる細胞である。宿主細胞は、原核生物、例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉであってよく、または真核生物、例えば、単細胞真核生物（例えば、酵母または他の真菌類）、植物細胞（例えば、タバコまたはトマト植物細胞）、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞、または昆虫細胞）、もしくはハイブリドーマであってもよい。通常、宿主細胞は、ポリペプチドをコードする核酸によって形質転換またはトランスフェクトされ得る培養細胞であり、その核酸はその後宿主細胞中で発現され得る。「組換え宿主細胞」という語句は、発現される核酸によって形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を表すために使用することができる。宿主細胞はまた、核酸を含むが、調整配列が宿主細胞に導入されて核酸と作動可能に連結されない限り、所望のレベルでその核酸を発現しない細胞であり得る。宿主細胞と言う用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫または潜在的子孫もまた意味すると理解される。特定の改変が、例えば、突然変異または環境の影響によって後の世代で発生し得るため、このような子孫は、実際は親細胞と同一ではない場合があるが、それでもなお本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。
用語「単離分子」（この分子は、例えばポリペプチドまたはポリヌクレオチドである）は、その起源または誘導源によって、（１）天然状態で該分子に付随する天然に関連する成分と関連しないか、（２）同じ種由来の他の分子を実質的に含まないか、（３）異なる種由来の細胞によって発現されるか、または（４）天然には存在しない分子である。したがって、化学的に合成されるか、または天然に由来する細胞とは異なる細胞系において発現される分子は、天然に関連する成分から「単離されている」であろう。分子はまた、当技術分野において周知の精製技術を用いた単離によって、天然に関連する成分を実質的に含まないようにされてもよい。分子の純度または均質性は、当技術分野において周知の数多くの手段によって分析することができる。例えば、ポリペプチド試料の純度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用い、そしてゲルを染色して、当技術分野において周知の技術によってポリペプチドを可視化して分析することができる。特定の目的のために、ＨＰＬＣ、または当技術分野において周知の他の精製手段を用いることによって、より高分解能を実現することができる。
タンパク質またはポリペプチドは、試料の少なくとも約６０％〜７５％が単一種のポリペプチドを示す場合、「実質的に純粋」であるか、「実質的に均質」であるか、または「実質的に精製」されている。ポリペプチドまたはタンパク質は、単量体または多量体であり得る。実質的に純粋なポリペプチドまたはタンパク質は、通常、タンパク質試料の約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％Ｗ／Ｗを含み、より一般的には約９５％、好ましくは９９％以上の純度となる。タンパク質の純度または均質性は、当技術分野において周知の数多くの手段によって示され得る。例えば、タンパク質試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動し、続いて当技術分野において周知の染料を用いてゲルを染色して単一ポリペプチドバンドを可視化するなどである。特定の目的のために、ＨＰＬＣ、または当技術分野において周知の他の精製手段を用いることによって、より高分解能を実現することができる。
「リンカー」とは、２つの別の分子を、共有結合、またはイオン結合、ファンデルワールス結合、もしくは水素結合で結び付ける分子を意味し、例えば、ある相補配列に５’末端で、別の相補配列に３’末端でハイブリダイズし、これにより２つの非相補配列を結び付ける核酸分子である。「切断可能なリンカー」とは、切断可能なリンカーにより結合された２つの構成要素を分離するために、分解または切り離すことができるリンカーを意味する。切断可能なリンカーは、一般的に酵素、典型的にはペプチダーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼなどによって切断される。切断可能なリンカーはまた、例えば、温度、ｐＨ、塩濃度などの変化といった環境要因によっても切断され得る。
本明細書で使用される用語「標識」または「標識した」とは、抗体における別の分子の組み込みを意味する。一実施形態では、標識は、例えば、放射性標識アミノ酸の組み込み、または標識されたアビジン（例えば、光学的方法または熱量測定法により検出することができる蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出できるビオチニル部分のポリペプチドへの結合といった、検出可能なマーカーである。別の実施形態では、この標識またはマーカーは、治療薬、例えば薬物コンジュゲートまたは毒素であり得る。ポリペプチド及び糖タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野において既知であり、使用することができる。ポリペプチドの標識の例には、限定するものではないが、放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、ガドリニウムキレートなどの磁性剤、百日咳毒素などの毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−ジヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、ならびにこれらの類似体または相同体が含まれる。いくつかの実施形態では、標識は、様々な長さのスペーサーアームによって結合し、立体障害の可能性を低減する。
「薬学的組成物」とは、動物における薬学的用途に適した組成物を意味する。薬学的組成物は、薬理学的に有効量の活性薬剤及び薬学的に許容可能なキャリアを含む。「薬学的に有効量」とは、意図される薬学的結果をもたらすのに効果的な薬剤の量を意味する。「薬学的に許容可能なキャリア」とは、標準的な薬学的キャリア、ビヒクル、緩衝液、及びリン酸緩衝生理食塩水、５％デキストロース水溶液などの賦形剤、及び油／水または水／油エマルジョンなどの乳剤、ならびに様々なタイプの湿潤剤及び／または補助剤のいずれかを意味する。適切な薬学的キャリア及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２１ｓｔ Ｅｄ．２００５，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎに記載されている。「薬学的に許容可能な塩」は、薬学的用途の化合物へと製剤化することができる塩であり、例えば、金属塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど）、及びアンモニアまたは有機アミンの塩を含む。
用語「治療する／処置する」、「治療すること／処置すること」及び「治療／処置」とは、生物学的障害及び／または少なくとも１つの随伴症状を軽減、またはなくす方法を意味する。本明細書で使用される場合、疾患、障害、または状態を「軽減する」とは、その疾患、障害、または状態の症状の重症度及び／または発生頻度を低減することを意味する。さらに、本明細書における「治療／処置」への言及は、治癒的、緩和的、及び予防的治療への言及を含む。
本明細書に記載される開示の態様及び実施形態は、態様及び実施形態「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」及び／または「から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」ことを含むことが理解される。
本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする変動を含む（かつ記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は「Ｘ」の記載を含む。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ｏｒ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上、別段の明確な指示がない限り、複数形の言及を含む。本明細書に記載される開示の態様及び変形形態は、態様及び変形形態「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」及び／または「から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」ことを含むことが理解される。
臨床的適応−治療用途
一態様では、本開示は、薬学的に許容可能なキャリア中の治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象におけるミオスタチン関連障害またはアクチビンＡ関連障害を治療する方法を提供する。重要なことには、本開示の薬学的組成物は、既存のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質ベースの治療薬に関して報告されている安全性の懸念を回避しながら、除脂肪筋肉量を体重における割合として増加させ、体脂肪量を体重における割合として減少させるために使用することができる。
一態様では、本開示は、治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含み、このような投与が、筋肉量の低下及び／または筋機能の喪失を軽減する、対象における筋消耗を治療または予防する方法を提供する。各種実施形態では、前記筋消耗は、筋ジストロフィー（ＤＭＤ、ベッカー型ＭＤ、肢帯型ＭＤ、筋強直性ＭＤ及びＦＳＨＤなど）、筋炎（皮膚筋炎、多発性筋炎、及び封入体筋炎など）、ミオパチー（遺伝性ミオパチー、及びアンドロゲン除去療法、コルチコステロイドまたはスタチンによって誘発されるミオパチーなどの後天性ミオパチーを含む）、運動ニューロン疾患（ルー・ゲーリック病またはＡＬＳなど）、脊髄性筋萎縮症（乳児型進行性脊髄性筋萎縮症、中間型脊髄性筋萎縮症、若年型脊髄性筋萎縮症、及び成人型脊髄性筋萎縮症）、神経筋接合部疾患（重症筋無力症、ランバート・イートン症候群、及びボツリヌス中毒など）、末梢神経疾患（シャルコー・マリー・トゥース病、デジェリン・ソッタス病、及びフリードライヒ運動失調症など）、脊髄損傷、脳卒中、神経変性疾患（パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、及びクロイツフェルト・ヤコブ病を含む）、がん（肺癌、膵臓癌、胃癌、結腸癌、前立腺癌、乳癌、食道癌、頭頸部癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、リンパ腫、及び多発性骨髄腫、皮膚癌、及び血液癌など）、臓器不全（心不全、腎不全、及び肝不全など）、外傷（火傷、またはオートバイ事故など）、廃用（長期安静、入院、及び宇宙飛行など）、感染（ＨＩＶ、ポリオ、及び敗血症など）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び老化（サルコペニア、サルコペニア肥満、及び変形性関節症など）からなる群から選択される疾患と関連する。
別の態様では、本開示は、治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象における骨疾患を治療または予防する方法を提供する。各種実施形態では、前記骨疾患は、骨粗鬆症、腎性骨形成異常症、骨形成不全症、進行性骨化性線維異形成症、コルチコステロイド誘発性骨量減少、アンドロゲン除去療法誘発性骨量減少、股関節骨折、がん誘発性骨量減少、骨転移、パジェット病、くる病、骨軟化症、ペルテス病、及び線維性骨異形成症からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象における代謝異常を治療または予防する方法を提供する。各種実施形態では、前記代謝異常は、メタボリックシンドローム、肥満症、脂質異常症、サルコペニア肥満、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）などの非アルコール性脂肪肝疾患、アルコール性脂肪肝疾患、インスリン抵抗性、糖尿病、ならびに糖尿病性ミオパチー、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、及びヘモクロマトーシスからなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象における線維症を治療または予防する方法を提供する。各種実施形態では、前記線維症は、間質性肺疾患、イディオタイプ肺線維症、嚢胞性線維症、肝線維症、硬変、胆道閉鎖症、心筋梗塞、心臓線維症、腎線維症、骨髄線維症、特発性後腹膜線維症、腎性線維化性皮膚症、炎症性腸疾患またはクローン病、ケロイド、強皮症、後腹膜線維症、及び関節線維症からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象における自己免疫／炎症性疾患を治療または予防する方法を提供する。各種実施形態では、前記疾患は、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性硬化症、糖尿病（１型）、糸球体腎炎、重症筋無力症、乾癬、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、クローン病、潰瘍性大腸炎及び原発性胆汁性肝硬変、関節炎、喘息、及び敗血症を含む自己免疫／炎症性疾患からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象における心血管疾患を治療する方法を提供する。各種実施形態では、前記心血管疾患は、心不全、心臓萎縮、肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）、心筋炎、冠動脈疾患、心筋梗塞、心臓不整脈、心臓弁膜症、心筋症、心膜疾患、大動脈疾患、マルファン症候群、及び心臓移植からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、有効量のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを対象に投与することを含む、対象における心機能障害または心不全を治療する方法を提供する。この調節によって、対象の心機能が少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％改善し得る。心機能の改善は、１）拍出される血液量及び拍出効率に焦点を当てた心臓ポンプ機能と、２）心筋収縮力に焦点を当てた心筋機能とを測定する心エコー検査によって評価することができる。
別の態様では、本開示は、薬学的に許容可能なキャリア中の治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含み、このような投与が、がん細胞の成長及び／または増殖を抑制する、対象におけるがん細胞を治療する方法を提供する。具体的には、本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップは、がんと特徴付けられる疾患の治療に有用である。そのような疾患には、限定するものではないが、乳癌、気道癌、脳腫瘍、生殖器癌、消化管癌、尿路癌、眼癌、肝臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、及びそれらの遠隔転移などの固形腫瘍、リンパ腫、肉腫、多発性骨髄腫、及び白血病が含まれる。乳癌の例には、限定するものではないが、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、非浸潤性乳管癌、及び非浸潤性小葉癌が含まれる。気道癌の例には、限定するものではないが、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌、ならびに気管支腺腫及び胸膜肺芽腫が含まれる。脳腫瘍の例には、限定するものではないが、脳幹部神経膠腫及び視床下部神経膠腫、小脳星状細胞腫及び大脳星状細胞腫、髄芽腫、上衣腫、ならびに神経外胚葉性腫瘍及び松果体部腫瘍が含まれる。男性生殖器の腫瘍には、限定するものではないが、前立腺癌及び精巣癌が含まれる。女性生殖器の腫瘍には、限定するものではないが、子宮内膜癌、子宮頸癌、卵巣癌、膣癌、及び外陰癌、ならびに子宮肉腫が含まれる。消化管の腫瘍には、限定するものではないが、肛門癌、結腸癌、大腸癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、膵臓癌、直腸癌、小腸癌、及び唾液腺癌が含まれる。尿路の腫瘍には、限定するものではないが、膀胱癌、陰茎癌、腎臓癌、腎盂癌、尿管癌、及び尿道癌が含まれる。眼癌には、限定するものではないが、眼内黒色腫及び網膜芽細胞腫が含まれる。肝臓癌の例には、限定するものではないが、肝細胞癌（線維層板状の亜型を含むまたは含まない肝細胞癌）、胆管癌（肝内胆管癌）、及び肝細胞癌・胆管細胞癌の混合型が含まれる。皮膚癌には、限定するものではないが、扁平上皮癌、カポジ肉腫、悪性黒色腫、メルケル細胞皮膚癌、及び非黒色腫皮膚癌が含まれる。頭頸部癌には、限定するものではないが、上咽頭癌、ならびに口唇癌及び口腔癌が含まれる。リンパ腫には、限定するものではないが、エイズ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキン病、及び中枢神経系のリンパ腫が含まれる。肉腫には、限定するものではないが、軟組織の肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、リンパ肉腫、及び横紋筋肉腫が含まれる。白血病には、限定するものではないが、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、及び有毛細胞白血病が含まれる。特定の実施形態では、がんは、アクチビンＡ、ミオスタチン、ＴＧＦ−β、及びＧＤＦ１５などのＴＧＦ−βファミリーメンバーの高い発現を伴うがん、例えば、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、大腸癌、黒色腫白血病、肺癌、前立腺癌、脳腫瘍、膀胱癌、及び頭頸部癌である。
別の態様では、本開示は、薬学的に許容可能なキャリア中の治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含み、このような投与が、筋肉量の低下及び／または筋機能の喪失を軽減、または腎線維症を抑制する、対象における慢性腎臓病（ＣＫＤ）を治療する方法を提供する。具体的には、本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップは、腎不全、間質性線維症、及び腎臓透析を含むＣＫＤ、ならびにＣＫＤに関連するタンパク質エネルギー障害（ＰＥＷ）の治療に有用である。この調節によって、対象のＣＫＤまたはＰＥＷが少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％改善し得る。腎機能の改善は、尿中のタンパク質／クレアチニン比（ＰＣＲ）及び糸球体濾過量（ＧＦＲ）を測定することによって評価することができる。ＰＥＷの改善は、アルブミン及び炎症性サイトカインの血清中レベル、タンパク質の合成及び分解速度、体重、筋肉量、身体活動及び栄養状態の結果を測定することによって評価することができる。
別の態様では、本開示は、薬学的に許容可能なキャリア中の治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象における関節炎を治療する方法を提供する。具体的には、本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップは、関節リウマチ及び変形性関節症から選択される関節炎の治療に有用である。
別の態様では、本開示は、薬学的に許容可能なキャリア中の治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象における食欲不振を治療する方法を提供する。具体的には、本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップは、神経性食思不振症及び食欲不振悪液質症候群から選択される食欲不振の治療に有用である。
別の態様では、本開示は、薬学的に許容可能なキャリア中の治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象における肝疾患を治療する方法を提供する。具体的には、本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップは、非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、アルコール性脂肪肝疾患、肝硬変、肝不全、自己免疫性肝炎、及び肝細胞癌から選択される肝疾患の治療に有用である。
別の態様では、本開示は、薬学的に許容可能なキャリア中の治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象における臓器または組織の移植方法を提供する。具体的には、本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップは、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、腸及び胸腺の臓器移植、または骨、腱、角膜、皮膚、心臓弁、神経及び血管の組織移植から選択される移植の治療に有用である。
別の態様では、本開示は、薬学的に許容可能なキャリア中の治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象における貧血を治療する方法を提供する。各種実施形態では、貧血は、がん関連貧血、化学療法誘発性貧血、慢性腎臓病関連貧血、鉄欠乏性貧血、サラセミア、鎌状赤血球症、再生不良性貧血及び骨髄異形成症候群を含む様々な貧血障害から選択される。
別の態様では、本開示は、治療上有効量の本発明の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象における疼痛を治療する方法を提供する。一実施形態では、前記対象は、ヒト対象である。各種実施形態では、前記疼痛は、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、またはがん疼痛から選択される。
別の態様では、本開示は、薬学的に許容可能なキャリア中の治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象における老化を治療する方法を提供する。各種実施形態では、前記老化状態は、高齢者のフレイル、加齢性サルコペニア、及び変形性関節症からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、薬学的に許容可能なキャリア中の治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含む、対象における組織修復または臓器再生のための幹細胞成長を誘導する方法を提供する。各種実施形態では、前記幹細胞は、筋幹（サテライト）細胞、心臓幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞及び多能性幹細胞からなる群から選択される。
各種実施形態では、本開示は、有効量のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを対象に投与することを含む、対象における筋肉量の低下及び／または筋機能の喪失を抑制する方法を提供する。この調節によって、対象の筋肉量の低下及び／または筋機能の喪失が少なくとも５％、１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％軽減し得る。筋肉量の低下及び筋機能の喪失の抑制は、画像化技術及び体力試験を用いることによって評価することができる。筋肉量を評価する画像化技術の例には、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、及びコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）が含まれる。筋機能試験の例には、握力試験、階段昇段試験、簡易身体能力バッテリー（ＳＰＰＢ）及び６分間歩行、ならびに呼吸筋力の測定に用いられる最大吸気圧（ＭＩＰ）及び最大呼気圧（ＭＥＰ）が含まれる。
「治療上有効量」または「治療上有効な用量」とは、治療される障害の１つ以上の症状をある程度軽減し得る、投与される治療剤の量を意味する。
治療上有効な用量は、まず、細胞培養アッセイからＩＣ５０を決定することによって推定できる。次いで、用量は、細胞培養において決定されたＩＣ５０を含む循環血漿濃度範囲が得られるように、動物モデルにおいて処方することができる。このような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルは、例えば、ＨＰＬＣによって測定できる。正確な成分、投与ルート、及び投与量は、個々の医師によって、対象の状態を考慮して選択することができる。
投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療的または予防的応答）をもたらすように調整することができる。例えば、単回ボーラス投与してもよく、数回に分割した用量（複数回用量または反復用量または維持用量）を経時的に投与してもよく、そして治療状況の緊急性により示されるように、用量を比例的に減少または増加させてもよい。投与の容易さ及び投与量の均一性のために、非経口組成物を投与単位形態に製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される投与単位形態は、処置される哺乳動物対象のための単位用量として適した物理的に別個の単位を意味し；各単位は、必要な薬学的キャリアと共に所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本開示の投与単位形態の仕様は、主に抗体の独自の特性、及び得られる特定の治療効果または予防効果によって決まる。
したがって、当業者は、本明細書に提供される開示に基づいて、用量及び投与レジメンが治療分野で周知の方法にしたがって調整されることを理解するであろう。すなわち、最大耐量を容易に確立することができ、そして対象に検出可能な治療効果をもたらすための各薬剤を投与する時間的要件と同様に、対象に検出可能な治療効果をもたらす有効量もまた決定され得る。したがって、本明細書では特定の用量及び投与レジメンを例示しているが、これらの例は、本開示を実施する際に対象に提供され得る用量及び投与レジメンを決して限定しない。
用量の値は、軽減される状態の種類及び重症度によって変化し得、単回投与または複数回投与を含み得ることが留意される。さらに、任意の特定の対象について、個々の必要性、及び組成物を投与する者または組成物の投与を管理する者の専門的な判断にしたがって、特定の投与レジメンを経時的に調整すべきであり、本明細書に記載される投与量の範囲は、例示にすぎず、特許請求の範囲に記載の組成物の範囲または実施を制限することを意図するものではないと理解される。さらに、本開示の組成物を用いた投与レジメンは、疾患の種類、対象の年齢、体重、性別、医学的状態、症状の重症度、投与経路、及び使用した特定の抗体を含む様々な要因に基づき得る。したがって、投与レジメンは大きく異なり得るが、標準的な方法を用いて日常的に決定することができる。例えば、用量は、毒性作用及び／または検査値などの臨床効果を含み得る、薬物動態学的または薬力学的パラメータに基づいて調整することができる。したがって、本開示は、当業者によって決定される個体内用量漸増を包含する。適切な投与量及び投与レジメンを決定することは、関連技術分野において周知であり、本明細書に開示された教示が提供されれば、当業者によって達成され得ると理解されるであろう。
治療的または予防的有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップの例示的で非限定的な１日の投与量範囲は、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜９０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜８０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜７０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜６０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜４０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜５ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜４ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜３ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜２ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０１０〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．０１０〜４０ｍｇ／ｋｇ、０．０１０〜３０ｍｇ／ｋｇ、０．０１０〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．０１０〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０１０〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０１０〜４ｍｇ／ｋｇ、０．０１０〜３ｍｇ／ｋｇ、０．０１０〜２ｍｇ／ｋｇ、０．０１０〜１ｍｇ／ｋｇ、０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜４０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜５ｍｇ／ｋｇ、０．１〜４ｍｇ／ｋｇ、０．１〜３ｍｇ／ｋｇ、０．１〜２ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１ｍｇ／ｋｇ、１〜５０ｍｇ／ｋｇ、１〜４０ｍｇ／ｋｇ、１〜３０ｍｇ／ｋｇ、１〜２０ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、１〜５ｍｇ／ｋｇ、１〜４ｍｇ／ｋｇ、１〜３ｍｇ／ｋｇ、１〜２ｍｇ／ｋｇ、または１〜１ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。投与量の値は、軽減される状態の種類及び重症度によって変化し得ることが留意される。さらに、任意の特定の対象について、個々の必要性、及び組成物を投与する者または組成物の投与を管理する者の専門的な判断にしたがって、特定の投与レジメンを経時的に調整すべきであり、本明細書に記載される投与量の範囲は、例示にすぎず、特許請求の範囲に記載の組成物の範囲または実施を制限することを意図するものではないと理解される。
各種実施形態では、投与される総用量は、例えば、約１〜１０００μｇ／ｍｌ、約１〜７５０μｇ／ｍｌ、約１〜５００μｇ／ｍｌ、約１〜２５０μｇ／ｍｌ、約１０〜１０００μｇ／ｍｌ、約１０〜７５０μｇ／ｍｌ、約１０〜５００μｇ／ｍｌ、約１０〜２５０μｇ／ｍｌ、約２０〜１０００μｇ／ｍｌ、約２０〜７５０μｇ／ｍｌ、約２０〜５００μｇ／ｍｌ、約２０〜２５０μｇ／ｍｌ、約３０〜１０００μｇ／ｍｌ、約３０〜７５０μｇ／ｍｌ、約３０〜５００μｇ／ｍｌ、約３０〜２５０μｇ／ｍｌの範囲の血漿抗体濃度を達成し得る。
本開示の薬学的組成物の毒性指数及び治療指数は、細胞培養または実験動物での標準的な製薬手順によって決定できる。例えば、ＬＤ５０（母集団の５０％の致死量）及びＥＤ５０（母集団の５０％に治療上有効な用量）を決定することである。毒性用量及び治療上有効な用量との間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比で表すことができる。治療指数が大きい組成物が、一般的に好ましい。
ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ薬学的組成物の投与の投与頻度は、治療、及び治療される特定の疾患の性質に応じて決まる。対象は、毎週または毎月といった一定間隔で、所望の治療結果が得られるまで治療を受けることができる。例示的な投与頻度は、限定するものではないが、連続して週に１回；隔週で週に１回；２週間に１回；３週間に１回；２週間連続して週に１回、次いで月に１回；３週間連続して週に１回、次いで月に１回；月１回；隔月で、３ヶ月に１回；４ヶ月に１回；５ヶ月に１回；もしくは６ヶ月に１回、または年に１回、が含まれる。
併用療法
本明細書で使用される場合、本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ及び１つ以上の他の治療剤について言及する用語「共投与」、「共投与した」、及び「組み合わせて」とは、以下のことを意味することを意図し、以下のことに言及し、以下のことを含む：本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ及び治療剤（複数可）のこのような組み合わせを、このような成分が対象に実質的に同時に該成分を放出する単一の剤形へと共に製剤化されている場合、処置の必要な対象へ同時投与すること；本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ及び治療剤（複数可）のこのような組み合わせを、このような成分が対象によって実質的に同時に摂取されると前記対象に実質的に同時に該成分を放出する個別の剤形へと互いに別々に製剤化されている場合、処置の必要な対象へ実質的に同時に投与すること；本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ及び治療剤（複数可）のこのような組み合わせを、このような成分が各投与の間にかなりの時間間隔を置いて対象によって連続して摂取されると前記対象に実質的に異なる時間に該成分を放出する個別の剤形へと互いに別々に製剤化されている場合、処置の必要な対象へ逐次投与すること；ならびに、本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ及び治療剤（複数可）のこのような組み合わせを、このような成分が制御された方法で前記成分を放出すると対象に同じ及び／または異なる時間に該成分を同時に、連続して、及び／または重なって放出する（各要素は同じまたは異なる経路のいずれかによって投与され得る）単一の剤形へと共に製剤化されている場合、処置の必要な対象へ逐次投与すること。
別の態様では、本開示は、ａ）治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ及びｂ）第２の薬剤の組み合わせの投与を含む、対象における筋消耗疾患を治療する方法に関する。この併用療法は、第２の薬剤単独を用いた処置に対して抵抗性があるか、または不応性である筋消耗疾患に対して特に有効であり得る。各種実施形態では、第２の薬剤は、成長ホルモン、グレリン、ＩＧＦ１、インスリン、プレドニゾン、コルチコステロイド療法、アンドロゲン除去療法、同化ステロイド、アンジオテンシンまたはアンジオテンシン受容体に対する拮抗薬、炎症性サイトカイン、例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１及びそれらの受容体に対する拮抗薬、ならびに、ミオスタチン、アクチビンＡまたは別のＴＧＦ−βファミリーのメンバー及びそれらの受容体に対する他の拮抗薬、ビスホスホネート、ＲＡＮＫＬ阻害剤、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体の作動薬、β２作動薬、ＰＧＣ−１αの活性化剤、プロテアソーム阻害剤、がん治療薬、化学療法剤、細胞療法、幹細胞療法、遺伝子療法、遺伝子標的療法、ならびにアンチセンスオリゴヌクレオチド療法から選択される。
各種実施形態では、併用療法は、ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ及び第２の薬剤組成物を、同じ薬学的組成物または別々の薬学的組成物のいずれかで同時に投与することを含む。各種実施形態では、ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ組成物及び第２の薬剤組成物は逐次投与される、すなわちハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ組成物は第２の薬剤組成物の投与の前または後のいずれかに投与される。
各種実施形態では、ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ組成物及び第２の薬剤組成物の投与は同時であり、すなわちハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ組成物及び第２の薬剤組成物の投与期間が互いに重なる。
各種実施形態では、ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ組成物及び第２の薬剤組成物の投与は同時ではない。例えば、各種実施形態では、ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ組成物の投与は、第２の薬剤組成物が投与される前に終わる。各種実施形態では、第２の薬剤組成物の投与は、ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ組成物が投与される前に終わる。
アクチビン受容体ポリペプチド
本明細書で使用される場合、アクチビンＩＩＢ型受容体（ＡｃｔＲＩＩＢ）という用語は、アクセッション番号ＮＰ＿００１０９７．２（本明細書では配列番号４５）を有するヒトアクチビン受容体、及びその変異体を意味する。用語「野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ」とは、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン、配列番号４５のアミノ酸１〜１３４（シグナル配列を含む）またはアミノ酸１９〜１３４（シグナル配列を含まない）（本明細書では配列番号４６と呼ぶ）を意味する。アクチビンＩＩＡ型受容体（ＡｃｔＲＩＩＩＡ）という用語は、アクセッション番号ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ２７０３７．１（本明細書では配列番号４７）を有するヒトアクチビン受容体、及びその変異体を意味する。用語「野生型ＡｃｔＲＩＩＩＡ−ＥＣＤ」とは、ＡｃｔＲＩＩＩＡの細胞外ドメイン、配列番号４６のアミノ酸１〜１３５（シグナル配列を含む）またはアミノ酸２０〜１３５（シグナル配列を含まない）（本明細書では配列番号４８と呼ぶ）を意味する。
可溶性ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド
本開示の方法は、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ及び野生型ＡｃｔＲＩＩＡ−ＥＣＤに由来する新規なハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを利用する。ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、切断型野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤの１つ以上のアミノ酸を、アミノ酸レベルでの２つの切断型ＡｃｔＲＩＩ−ＥＣＤドメイン間の配列アラインメントに基づいて対応する位置にある切断型野生型ＡｃｔＲＩＩＡ−ＥＣＤのアミノ酸で置換することにより特異的に改変される。１つ以上のアミノ酸置換は、強いミオスタチン中和性及びアクチビンＡ中和性を完全に保持しながら、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドと比較して著しく低いＢＭＰ９中和性を示すハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを提供する目的で特異的に選択される。
各種実施形態では、新規なハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを調製するために使用されるＡｃｔＲＩＩＢの切断型細胞外ドメインは、配列番号１に記載される１１０アミノ酸配列を有する：
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＥＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＥＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＲＦＴＨＬＰＥＡＧＧＰＥＶＴＹＥＰＰＰＴＡＰＴ（配列番号１）。
各種実施形態では、新規なハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを調製するために使用されるＡｃｔＲＩＩＡの切断型細胞外ドメインは、配列番号２に記載される１１０アミノ酸配列を有する：
ＥＴＱＥＣＬＦＦＮＡＮＷＥＫＤＲＴＮＱＴＧＶＥＰＣＹＧＤＫＤＫＲＲＨＣＦＡＴＷＫＮＩＳＧＳＩＥＩＶＫＱＧＣＷＬＤＤＩＮＣＹＤＲＴＤＣＶＥＫＫＤＳＰＥＶＹＦＣＣＣＥＧＮＭＣＮＥＫＦＳＹＦＰＥＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号２）。
各種実施形態では、本開示の方法は、ミオスタチン及びアクチビンＡ中和活性を保持するが、ＢＭＰ９中和性を劇的に減少させた新規なハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含む単離された新規なハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質を利用する。各種実施形態では、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、アミノ酸残基Ｒ３、Ｉ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｓ２０、Ｌ２２、Ｒ２４、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｌ４８、Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｋ５１、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４、Ｆ８４、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８またはＴ１１０の少なくとも１個が別のアミノ酸で置換されている配列番号１のアミノ酸配列を有するハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、ミオスタチン及びアクチビンＡに結合可能であるが、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドと比較してＢＭＰ９に対する結合親和性が減少している。各種実施形態では、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、アミノ酸残基Ｒ３、Ｉ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｓ２０、Ｌ２２、Ｒ２４、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｌ４８、Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｋ５１、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４、Ｆ８４、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８またはＴ１１０の少なくとも２個が別のアミノ酸で置換されている配列番号１のアミノ酸配列を有するハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、ミオスタチン及びアクチビンＡに結合可能であるが、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドと比較してＢＭＰ９に対する結合親和性が減少している。各種実施形態では、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、アミノ酸残基Ｒ３、Ｉ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｓ２０、Ｌ２２、Ｒ２４、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｌ４８、Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｋ５１、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４、Ｆ８４、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８またはＴ１１０の少なくとも３個が別のアミノ酸で置換されている配列番号１のアミノ酸配列を有するハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、ミオスタチン及びアクチビンＡに結合可能であるが、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドと比較してＢＭＰ９に対する結合親和性が減少している。各種実施形態では、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、アミノ酸残基Ｒ３、Ｉ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｓ２０、Ｌ２２、Ｒ２４、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｌ４８、Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｋ５１、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４、Ｆ８４、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８またはＴ１１０の少なくとも４個が別のアミノ酸で置換されている配列番号１のアミノ酸配列を有するハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、ミオスタチン及びアクチビンＡに結合可能であるが、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドと比較してＢＭＰ９に対する結合親和性が減少している。各種実施形態では、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、アミノ酸残基Ｒ３、Ｉ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｓ２０、Ｌ２２、Ｒ２４、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｌ４８、Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｋ５１、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４、Ｆ８４、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８またはＴ１１０の少なくとも５個が別のアミノ酸で置換されている配列番号１のアミノ酸配列を有するハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、ミオスタチン及びアクチビンＡに結合可能であるが、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドと比較してＢＭＰ９に対する結合親和性が減少している。各種実施形態では、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、アミノ酸残基Ｒ３、Ｉ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｓ２０、Ｌ２２、Ｒ２４、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｌ４８、Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｋ５１、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４、Ｆ８４、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８またはＴ１１０の少なくとも６個が別のアミノ酸で置換されている配列番号１のアミノ酸配列を有するハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、ミオスタチン及びアクチビンＡに結合可能であるが、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドと比較してＢＭＰ９に対する結合親和性が減少している。各種実施形態では、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、アミノ酸残基Ｒ３、Ｉ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｓ２０、Ｌ２２、Ｒ２４、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｌ４８、Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｋ５１、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４、Ｆ８４、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８またはＴ１１０の少なくとも７個が別のアミノ酸で置換されている配列番号１のアミノ酸配列を有するハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、ミオスタチン及びアクチビンＡに結合可能であるが、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドと比較してＢＭＰ９に対する結合親和性が減少している。各種実施形態では、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、アミノ酸残基Ｒ３、Ｉ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｓ２０、Ｌ２２、Ｒ２４、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｌ４８、Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｋ５１、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４、Ｆ８４、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８またはＴ１１０の少なくとも８個が別のアミノ酸で置換されている配列番号１のアミノ酸配列を有するハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、ミオスタチン及びアクチビンＡに結合可能であるが、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドと比較してＢＭＰ９に対する結合親和性が減少している。各種実施形態では、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、アミノ酸残基Ｒ３、Ｉ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｓ２０、Ｌ２２、Ｒ２４、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｌ４８、Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｋ５１、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４、Ｆ８４、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８またはＴ１１０の少なくとも９個が別のアミノ酸で置換されている配列番号１のアミノ酸配列を有するハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、ミオスタチン及びアクチビンＡに結合可能であるが、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドと比較してＢＭＰ９に対する結合親和性が減少している。各種実施形態では、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、アミノ酸残基Ｒ３、Ｉ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｓ２０、Ｌ２２、Ｒ２４、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｌ４８、Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｋ５１、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４、Ｆ８４、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８またはＴ１１０の少なくとも１０個が別のアミノ酸で置換されている配列番号１のアミノ酸配列を有するハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、ミオスタチン及びアクチビンＡに結合可能であるが、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドと比較してＢＭＰ９に対する結合親和性が減少している。各種実施形態では、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、アミノ酸残基Ｒ３、Ｉ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｓ２０、Ｌ２２、Ｒ２４、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｌ４８、Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｋ５１、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４、Ｆ８４、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８またはＴ１１０の少なくとも１５個が別のアミノ酸で置換されている配列番号１のアミノ酸配列を有するハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、ミオスタチン及びアクチビンＡに結合可能であるが、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドと比較してＢＭＰ９に対する結合親和性が減少している。各種実施形態では、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、アミノ酸残基Ｒ３、Ｉ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｓ２０、Ｌ２２、Ｒ２４、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｌ４８、Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｋ５１、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４、Ｆ８４、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８またはＴ１１０の少なくとも２０個が別のアミノ酸で置換されている配列番号１のアミノ酸配列を有するハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、ミオスタチン及びアクチビンＡに結合可能であるが、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドと比較してＢＭＰ９に対する結合親和性が減少している。各種実施形態では、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、アミノ酸残基Ｒ３、Ｉ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｓ２０、Ｌ２２、Ｒ２４、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３
３、Ｌ４８、Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｋ５１、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４、Ｆ８４、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８またはＴ１１０の少なくとも２５個が別のアミノ酸で置換されている配列番号１のアミノ酸配列を有するハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、ミオスタチン及びアクチビンＡに結合可能であるが、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドと比較してＢＭＰ９に対する結合親和性が減少している。各種実施形態では、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、アミノ酸残基Ｒ３、Ｉ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｓ２０、Ｌ２２、Ｒ２４、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｌ４８、Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｋ５１、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４、Ｆ８４、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８またはＴ１１０の少なくとも３０個が別のアミノ酸で置換されている配列番号１のアミノ酸配列を有するハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、ミオスタチン及びアクチビンＡに結合可能であるが、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドと比較してＢＭＰ９に対する結合親和性が減少している。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２及びＱ７４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号３のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２及びＱ７４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号４のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２及びＱ７４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号５のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１及びＮ７２が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号６のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１及びＮ７２が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号７のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２及びＱ７４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号８のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２及びＱ７４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号９のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１及びＮ７２が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｆ５８、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２及びＱ７４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４及びＦ８４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４及びＦ８４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号１３のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｒ３、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｓ２０、Ｌ２２、Ｒ２４、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９及びＬ３３が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｒ３、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｓ２０、Ｌ２２及びＲ２４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９及びＬ３３が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号１６のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｌ１４、Ｅ１５、Ｓ２０、Ｌ２２及びＲ２４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号１７のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｒ３、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｓ２０、Ｌ２２及びＲ２４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｒ３、Ｌ１４、Ｅ１５及びＳ２０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号１９のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｒ３、Ｌ１４及びＥ１５が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号２０のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｌ１４及びＥ１５が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｒ３が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号２２のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｙ３６、Ｓ３８及びＫ５１が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号２３のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３及びＦ５８が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号２４のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ７０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号２５のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｆ５８が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号２６のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｆ５８及びＥ７０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号２７のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２８、Ｑ２９、Ｆ５８及びＥ７０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号２８のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２８、Ｆ５８及びＥ７０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号２９のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２８及びＥ７０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２８が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号３１のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２及びＱ７４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号３２のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｓ２０、Ｌ２２及びＲ２４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号３３のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５及びＫ５１が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号３４のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｑ６４及びＥ６５が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号３５のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｆ８４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号３６のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２８及びＦ５８が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号３７のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｒ３、Ｉ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｌ２２、Ｒ２４、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号５１のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｒ３、Ｉ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｌ２２、Ｒ２４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号５２のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｉ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｌ２２、Ｒ２４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号５３のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｉ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｌ２２、Ｒ２４、Ｅ２６が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号５４のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｉ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｌ２２、Ｒ２４、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号５５のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｉ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｌ２２、Ｒ２４、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｌ４８、Ｋ５１が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号５６のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｉ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｌ２２、Ｒ２４、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｌ４８、Ｋ５１、Ｆ５８が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号５７のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｉ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｌ２２、Ｒ２４、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｌ４８、Ｋ５１、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号５８のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｒ３、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｌ４８、Ｋ５１、Ｆ５８が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号５９のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｌ４８、Ｋ５１、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号６０のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｌ４８、Ｋ５１、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４、Ｆ８４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号６１のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｌ４８、Ｋ５１、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号６２のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｌ４８、Ｋ５１、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号６３のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｌ４８、Ｋ５１、Ｑ６４、Ｅ６５が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号６４のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｌ４８、Ｋ５１が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号６５のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｒ３、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号６６のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｒ３、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４、Ｆ８４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号６７のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｒ３、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｌ４８、Ｋ５１、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４、Ｆ８４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号６８のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｒ３、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｌ４８、Ｋ５１、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号６９のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｉ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｌ２２、Ｒ２４、Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｌ４８、Ｋ５１、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号７０のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｉ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｌ２２、Ｒ２４、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号７１のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｉ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｌ２２、Ｒ２４、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号７２のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｑ６４、Ｅ６５が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号７３のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｋ５１、Ｑ６４、Ｅ６５が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号７４のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｌ４８、Ｑ６４、Ｅ６５が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号７５のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｔ４５、Ｑ６４、Ｅ６５が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号７６のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｔ４５、Ｌ４８、Ｑ６４、Ｅ６５が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号７７のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｔ４５、Ｌ４８、Ｋ５１、Ｑ６４、Ｅ６５が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号７８のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｑ６４、Ｅ６５、Ｆ８４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号７９のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号８０のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号８１のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号８２のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号８３のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号８４のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｋ５１、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号８５のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｌ４８、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号８６のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｔ４５、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号８７のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｔ４５、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号８８のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｌ４８、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号８９のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｋ５１、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号９０のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ａ６８、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号９１のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ａ６８、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号９２のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ７０、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号９３のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ７１、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号９４のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｎ７２、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号９５のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｑ７４、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号９６のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２８、Ｑ２９、Ａ６８、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号９７のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｑ２９、Ｔ６９、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号９８のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２８、Ｅ７０、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号９９のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２８、Ｑ２９、Ｋ５１、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号１００のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ４８、Ｋ５１、Ｔ６９Ｅ、Ｅ７０、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号１０１のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２６、Ｅ２８、Ｔ４５、Ｌ４８、Ｋ５１、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号１０２のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｑ２９、Ｌ４８、Ｅ７０、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号１０３のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２６、Ｅ２８、Ｌ３３、Ｑ７０、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号１０４のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｌ３３、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号１０５のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２６、Ｔ４５、Ｌ４８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号１０６のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｌ３３、Ｔ４５、Ｔ６９、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号１０７のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｌ３３、Ｌ４８、Ｔ６９、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号１０８のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｌ３３、Ｔ４５、Ｌ４８、Ｅ７０、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号１０９のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２８、Ｌ４８、Ｅ７０、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号１１０のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２８、Ｔ４５、Ｅ７０、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号１１１のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２８、Ｅ７０、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号１１２のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｌ４８、Ｅ７０、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号１１３のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ７０、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号１１４のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２８、Ｌ４８、Ｔ７９、Ｅ７０、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８、Ｔ１１０が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号１１５のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｒ３、Ｉ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｓ２０、Ｌ２２、Ｒ２４、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｌ４８、Ｋ５１、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４、Ｆ８４が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号１１６のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｆ５６、Ｅ６８が配列番号２の対応する位置のアミノ酸残基で置換されている配列番号１１７のアミノ酸配列を含む。
異種タンパク質−Ｆｃドメイン
別の態様では、ハイブリッドＡｃｔＲＩＩリガンドトラップは、ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチド、及び直接またはリンカー配列を介して前記ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドに結合して本明細書においてハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップと呼ばれる融合タンパク質を形成する少なくとも１つの異種タンパク質を含む。本明細書で使用される場合、用語「融合タンパク質」とは、組換えＤＮＡ技術を介して結合した異種ポリペプチドを有するタンパク質を意味する。各種実施形態では、前記異種タンパク質は、限定するものではないが、ポリヒスチジンタグ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、蛍光タンパク質、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ヒト血清アルブミン、またはＦｃポリペプチドもしくはＦｃドメインから選択される。各種実施形態では、前記Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧＦｃドメインである。各種実施形態では、前記Ｆｃドメインは、配列番号３８に記載のヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン配列に由来する。各種実施形態では、前記Ｆｃドメインは、配列番号３９に記載のアミノ酸配列を有するＦｃドメインである。各種実施形態では、前記Ｆｃドメインは、配列番号４０に記載のヒトＩｇＧ２重鎖定常ドメイン配列に由来する。各種実施形態では、前記Ｆｃドメインは、配列番号４１に記載のアミノ酸配列を有するＦｃドメインである。各種実施形態では、前記Ｆｃドメインは、配列番号４２に記載のヒトＩｇＧ４重鎖定常ドメイン配列に由来する。各種実施形態では、前記Ｆｃドメインは、配列番号４３に記載のアミノ酸配列を有するＦｃドメインである。
リンカー
前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢハイブリッドトラップは、「リンカー」または「ヒンジリンカー」配列を場合によりさらに含み得る。リンカーは、ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチド、異種タンパク質もしくは他の種類の融合体間、または２つ以上のハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチド間のスペーサーとして主に機能する。各種実施形態では、前記異種タンパク質は、リンカーまたはヒンジリンカーペプチドによって、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドに結合する。前記リンカー及び／またはヒンジリンカーは、二次構造を比較的含まない５、１０、１５、２０、３０、４０またはそれ以上のアミノ酸間の人工配列であり得る。各種実施形態では、前記リンカーは、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、及びリジンから選択されるアミノ酸を含む。各種実施形態では、前記リンカーは、グリシン及びアラニンのような立体障害のないアミノ酸で大部分が構成され、該アミノ酸はポリグリシン（特に（Ｇｌｙ）５、（Ｇｌｙ）８、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ））及びポリアラニンである。各種実施形態では、前記リンカーは、Ｇ／Ｓ含有量が豊富である（例えば、リンカー中のアミノ酸の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上がＧまたはＳである）。各種実施形態では、前記リンカーは、（ＧＧＧＧＳ（配列番号４４））ｎモチーフ（ｎ＝１〜６）を有する。そのようなリンカー及びヒンジリンカーは、当技術分野において詳しく説明されてきた（例えば、そのようなリンカーを教示する目的で参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，４１０，０４３号（Ｓｕｎら）を参照のこと）。各種実施形態では、本開示のハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドにヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（配列番号３９）またはヒトＩｇＧ４ Ｆｃ（配列番号４３）を連結するために、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有するリンカー及び配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を有するヒンジリンカーを使用する。
リンカーはまた、非ペプチドリンカーであってもよい。例えば、−−ＮＨ−−（ＣＨ２）Ｓ−Ｃ（Ｏ）−−（ｓ＝２〜２０）のようなアルキルリンカーを用いることができる。これらのアルキルリンカーは、さらに、低級アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなどといった任意の非立体障害基によって置換されていてもよい。
ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質の分子構成
ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップの異なる要素は、所望の機能性と一致する任意の様式で配置され得ることが理解される。例えば、異種タンパク質はハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドのＣ末端に配置されてもよく、または該ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドが異種ドメインのＣ末端に配置されてもよい。ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩ−ＥＣＤポリペプチドドメイン及び異種ドメインは隣接する必要はなく、追加のドメインまたはアミノ酸配列が、いずれかのドメインのＣ末端もしくはＮ末端、またはドメイン間に含まれ得る（すなわち、本明細書に記載のリンカーを含む）。新規なＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップの例示的な分子構成は、図１に示される。
ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップをコードする合成ＤＮＡカセットの例示的構成は、一般的に、以下の要素を含むと説明することができる：１）ＡｃｔＲＩＩＢの天然シグナルペプチド（例えば、配列番号４９）または分泌タンパク質のプロセシング及び分泌を調節できる任意の代替シグナルペプチド（例えば、代替シグナルペプチドとしてヒト免疫グロブリン軽鎖リーダー配列（配列番号５０）を用いることによって、ＣＨＯ細胞においてハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質の効率的な分泌が達成され得る）のいずれかであり得るＮ末端に配置されたシグナルペプチド（またはリーダー配列）；２）シグナルペプチド配列に融合したハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチド配列（例えば、配列番号３〜３７または５１〜１１７のいずれか１つ）；３）ペプチドリンカー配列（例えば、配列番号４４）及びヒンジリンカー配列（配列番号１１８）、ならびに、４）ペプチド／ヒンジリンカーによってハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチド配列に融合したＦｃドメイン（例えば、配列番号３９、４１または４３）。
本開示の各種実施形態の例には、限定するものではないが、表２に記載のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質が含まれる。
Figure 2019535675

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ポリヌクレオチド
別の態様では、本開示は、本開示のハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。対象核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。このような核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり得る。ＤＮＡには、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、及びこれらの組み合わせが含まれる。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡは、数多くの種に利用可能なゲノムライブラリーから得られる。合成ＤＮＡは、重複するオリゴヌクレオチド断片を化学合成し、続いて該断片のアセンブリによりコード領域及び隣接配列の一部または全てを再構成することから得られる。ＲＮＡは、Ｔ７プロモーター及びＲＮＡポリメラーゼを使用するベクターなどのｍＲＮＡの高レベル合成を指示する原核生物発現ベクターから得ることができる。ｃＤＮＡは、ＡｃｔＲＩＩＢを発現する様々な組織から単離されたｍＲＮＡから調製されたライブラリーから得られる。本開示のＤＮＡ分子は、完全長遺伝子、ならびにポリヌクレオチド及びその断片を含む。前記完全長遺伝子はまた、Ｎ末端シグナル配列をコードする配列を含んでもよい。
そのような核酸は、例えば、新規なハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを作製するための方法において使用され得る。各種実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３〜３７または５１〜１１７に記載のポリペプチド配列のいずれか１つをコードし、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、ミオスタチン及びアクチビンＡに結合可能であるが、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドと比較してＢＭＰ９に対する結合親和性が減少している。各種実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３〜３７または５１〜１１７に記載のポリペプチド配列のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、ミオスタチン及びアクチビンＡに結合可能であるが、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドと比較してＢＭＰ９に対する結合親和性が減少している。各種実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３〜３７または５１〜１１７に記載のポリペプチド配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードし、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、ミオスタチン及びアクチビンＡに結合可能であるが、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドと比較してＢＭＰ９に対する結合親和性が減少している。各種実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３〜３７または５１〜１１７に記載のポリペプチド配列のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、ミオスタチン及びアクチビンＡに結合可能であるが、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドと比較してＢＭＰ９に対する結合親和性が減少している。各種実施形態では、本開示の核酸配列は、単離、組換え、及び／または異種ヌクレオチド配列との融合、またはＤＮＡライブラリー中でのものであり得る。
各種実施形態では、本開示は、ストリンジェントな条件または中程度の条件下で、本明細書に記載のポリヌクレオチドのポリペプチドコード領域とハイブリダイズする核酸分子を提供し、前記コードされたポリヌクレオチドは、配列番号３〜３７または５１〜１１７に記載のアミノ酸配列を含み、前記コードされたポリペプチドは、ミオスタチン及びアクチビンＡに結合可能であるが、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドと比較してＢＭＰ９に対する結合親和性が減少している。当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件が変化し得ることを容易に理解するであろう。例えば、約４５℃で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でハイブリダイゼーションを行い、続いて５０℃で２．０×ＳＳＣで洗浄することができる。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃で約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃で約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまで選択することができる。加えて、洗浄工程における温度は、室温（約２２℃）での低ストリンジェンシー条件から約６５℃での高ストリンジェンシー条件まで上昇させることができる。温度及び塩の両方を変更してもよく、または他の変数を変更する間、温度もしくは塩濃度を一定に保ってもよい。一実施形態では、本開示は、室温において６×ＳＳＣの低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、続いて室温において２×ＳＳＣで洗浄する核酸を提供する。
各種実施形態では、前記単離された核酸分子は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含み、本明細書に記載の少なくとも１つの異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。各種実施形態では、前記核酸分子は、本明細書に記載のリンカーまたはヒンジリンカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
各種実施形態では、本開示の組換え核酸は、発現構築物中の１つ以上の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。調節配列は、当技術分野において認識されており、ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドの発現を指示するように選択される。したがって、調節配列という用語には、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御エレメントが含まれる。例示的な調節配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。典型的には、前記１つ以上の調節ヌクレオチド配列には、限定するものではないが、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を含み得る。当技術分野において既知の構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが、本開示によって企図される。前記プロモーターは、天然プロモーター、または複数のプロモーターのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。発現構築物は、プラスミドなどのエピソーム上の細胞に存在してもよく、または発現構築物は染色体に挿入されてもよい。各種実施形態では、前記発現ベクターは、形質転換宿主細胞の選択を可能にするための選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカー遺伝子は、当技術分野において周知であり、使用される宿主細胞によって異なる。
本開示の別の態様では、対象核酸は、ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドをコードし、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結するヌクレオチド配列を含む発現ベクター中で提供される。用語「発現ベクター」とは、ポリヌクレオチド配列からポリペプチドを発現するためのプラスミド、ファージ、ウイルスまたはベクターを意味する。宿主細胞における発現に適したベクターは容易に入手可能であり、核酸分子は標準的な組換えＤＮＡ技術を用いてベクターに挿入される。このようなベクターは、操作可能に連結された場合にＤＮＡ配列の発現を制御する多種多様な発現制御配列を含むことができ、この発現制御配列は、ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させるためにこれらのベクター中で使用され得る。そのような有用な発現制御配列は、例えば、ＳＶ４０の初期及び後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルス最初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって発現が指示されるＴ７プロモーター、ラムダファージの主要なオペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖系酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、例えばＰｈｏＳ、酵母ａ接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系のポリヘドロンプロモーター及び原核細胞もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られている他の配列、ならびにこれらの種々の組み合わせが含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、及び／または発現させたいタンパク質の種類などの要素に依存し得ることが理解されるべきである。さらに、ベクターのコピー数、そのコピー数及び抗生物質マーカーなどのベクターによりコードされる任意の他のタンパク質の発現を制御する能力もまた考慮されなければならない。ｖＡｃｔＲＩＩＢの発現に適している例示的な発現ベクターは、ｐＤＳＲａ（参照により本明細書に組み込まれるＷＯ９０／１４３６３号に記載されている）及びその派生物であり、ｖＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチド、及び当技術分野において既知の、または以下に説明する任意のさらなる適切なベクターを含む。
本開示の組換え核酸は、クローニングした遺伝子またはその一部を、原核細胞、真核細胞（酵母、鳥類、昆虫類、または哺乳動物）またその両方の発現に適したベクター内にライゲートすることによって生成することができる。組換えＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの生成のための発現媒体には、プラズミド及び他のベクターが含まれる。例えば、適切なベクターには、Ｅ．Ｃｏｌｉなどの原核細胞内に発現する、ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミド、及びｐＵＣ由来プラスミドといった種類のプラズミドが含まれる。
一部の哺乳動物発現ベクターには、バクテリア内のベクターの増殖を促進する原核生物配列と、真核細胞内で発現される１つ以上の真核生物転写ユニットの両方が含まれる。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ及びｐＨｙｇ由来のベクターは、真核細胞のトランスフェクションに適した哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのうちのいくつかは、ｐＢＲ３２２などの細菌プラスミドの配列によって改変され、原核細胞と真核細胞の両方における複製及び薬剤耐性選択を促進する。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン・バール・ウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来、及びｐ２０５）などのウイルスの派生物は、真核細胞のタンパク質の一過性発現に用いることができる。他のウイルス性（レトロウイルス性を含む）発現システムの例は、以下の遺伝子治療送達システムの説明に記載されている。プラズミドの調製及び宿主生物の形質転換に用いられる様々な方法は、当技術分野において周知である。原核細胞及び真核細胞の両方に適切な他の発現システム、ならびに一般的な組換え手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）Ｃｈａｐｔｅｒｓ １６及び１７を参照のこと。場合によっては、バキュロウイルス発現システムの使用によって、組換えポリペプチドを発現させることが望ましい場合がある。このようなバキュロウイルス発現システムの例には、ｐＶＬ由来ベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、及びｐＶＬ９４１など）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（ｐＡｃＵＷ１など）、及びｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（Ｂ−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩなど）が含まれる。
各種実施形態では、ベクターは、Ｐｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）及びｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）などのＣＨＯ細胞中で対象のハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを生成するために設計される。明らかなように、対象の遺伝子構築物を用いて、培養中に増殖した細胞中で対象のハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドの発現を引き起こすことができるが、これは、例えば、精製のために融合タンパク質または変異タンパク質を含むタンパク質を生成するためである。
本開示はまた、１つ以上の対象のハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチド用のアミノ酸配列（例えば、配列番号３〜３７または５１〜１１７）をコードするヌクレオチド配列を含む組換え遺伝子によってトランスフェクトされた宿主細胞に関する。この宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であってよい。例えば、本開示のハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは、Ｅ．Ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現システムを用いて）、酵母、または哺乳動物細胞内で発現することができる。他の適切な宿主細胞は当業者に既知である。
したがって、本開示はさらに、対象のハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを生成する方法に関する。例えば、ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドをコードする発現ベクターによってトランスフェクトされた宿主細胞は、適切な条件下で培養され得、ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドの発現が生じるのを可能にする。ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドが分泌され、細胞とハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含む培地との混合物から単離され得る。あるいは、ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドは細胞質または膜画分に保持され得、細胞は採取され、溶解されて、タンパク質が単離される。細胞培養液は、宿主細胞、培地、及び他の副生成物を含む。細胞培養にとって適切な培地は、当技術分野において周知である。
本開示のポリペプチド及びタンパク質は、当業者には周知であるタンパク質精製技術にしたがって精製することができる。これらの技術は、あるレベルでは、タンパク性及び非タンパク性画分の粗分画を伴う。ペプチドポリペプチドをその他のタンパク質から分離すると、対象のペプチドまたはポリペプチドを、クロマトグラフィー技術及び電気泳動技術を用いてさらに精製して、部分的または完全な精製（または均質に精製）を達成することができる。本明細書で使用される用語「単離したポリペプチド」または「精製したポリペプチド」とは、他の成分から単離可能な組成物を意味することが意図され、前記ポリペプチドは、その天然に得られる状態と比較してある程度精製される。したがって、精製したポリペプチドはまた、天然に生じ得る環境から離れたポリペプチドも意味する。一般的に、「精製した」とは、分画を実施し、様々なその他の成分を取り除いたポリペプチド組成物を意味し、該組成物は、その発現した生物学的活性を実質的に保持している。用語「実質的に精製した」を使用する場合、この表現は、ポリペプチドまたはペプチドが、その組成物の主成分を形成する、例えば、その組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、または約９０％またはそれ以上を構成するペプチドまたはポリペプチド組成物を意味する。
精製での使用に適した様々な技術が当業者に周知である。これらには、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体（免疫沈降）などによる、または熱変性とそれに続く遠心分離による沈殿；アフィニティークロマトグラフィー（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａカラム）、イオン交換、ゲルろ過、逆相、ヒドロキシルアパタイト、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー；等電点電気泳動；ゲル電気泳動、及びこれらの技術の組み合わせが含まれる。当技術分野において一般的に既知であるように、様々な精製工程を実施する順序は変更してもよく、または所定の工程を除外してもよく、それでもなお実質的に精製されたポリペプチドを調製するための適切な方法となると考えられている。
薬学的組成物
別の態様では、本開示は、薬学的に許容可能なキャリアと混合して単離したハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質を含む薬学的組成物を提供する。このような薬学的に許容可能なキャリアは、当業者に周知であり、当業者により理解されるとともに、広範に説明されてきた（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０を参照のこと）。この薬学的に許容可能なキャリアは、例えば、組成物の、ｐＨ、浸透圧モル濃度、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解または放出速度、吸着または浸透速度を変更、維持、または保存する目的で含んでもよい。このような薬学的組成物は、ポリペプチドの物理的状態、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出速度、及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス速度に影響し得る。適切な薬学的に許容可能なキャリアには、限定するものではないが、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンなど）；抗菌剤、抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝剤（ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、他の有機酸など）；増量剤（マンニトールまたはグリシンなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖類；二糖類及び他の糖質（グルコース、マンノース、またはデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）；着色剤；着香剤及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；懸濁化剤；界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などのポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパールなど）；安定性向上剤（スクロースまたはソルビトール）；等張性向上剤（ハロゲン化アルカリ金属（好ましくは、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤及び／または薬学的補助剤が含まれる。
薬学的組成物の主要なビヒクルまたはキャリアは、本質的に水性であっても非水性であってもよい。例えば、適切なビヒクルまたはキャリアは、注射用水、生理食塩水、または人工脳脊髄液であってよく、非経口投与用組成物に一般的な他の物質が場合により添加されている。中性緩衝生理食塩水、または血清アルブミンを混合した生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。他の例示的な薬学的組成物は、ｐＨ約７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ約４．０〜５．５のアセテート緩衝剤を含み、これらはさらに、ソルビトールまたは適切なその代替物を含み得る。本開示の一実施形態では、組成物が、所望の純度を有する選択された組成物を凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で、任意の製剤化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記）と混合することによって、保存用に調製され得る。さらに、治療用組成物は、スクロースなどの適切な賦形剤を用いて凍結乾燥物として製剤化してもよい。最適な薬学的組成物は、例えば、意図する投与経路、送達形式、及び所望の投与量に応じて当業者によって決められる。
非経口投与を意図する場合、前記治療用薬学的組成物は、薬学的に許容可能なビヒクルに所望のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む、発熱性物質非含有の非経口的に許容可能な水溶液の形態であり得る。非経口注射に特に適したビヒクルは、滅菌蒸留水であり、その中でポリペプチドは、適切に保存された滅菌等張液として製剤化される。各種実施形態では、注射可能な投与に適した薬学的製剤は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液などの生理学的適合性のある緩衝剤、または生理学的緩衝生理食塩水中に製剤化され得る。水性懸濁注射液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘度を高める物質を含有してもよい。加えて、前記活性化合物の懸濁液は、適切な油性懸濁注射液として調製してもよい。必要に応じて、この懸濁液はまた、適切な安定化剤、またはその化合物の溶解度を高める物質を含有し得、高濃度溶液の調製を可能にし得る。
各種実施形態では、前記治療用薬学的組成物は、コロイド分散系を用いて、標的化送達用に製剤化してもよい。コロイド分散系には、高分子錯体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質ベースシステムが含まれる。リポソーム製造に有用な脂質の例には、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミンなどのホスファチジル化合物、スフィンゴ脂質、セレブロシド、及びガングリオシドが含まれる。例示的なリン脂質としては、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、及びジステアロイルホスファチジルコリンが含まれる。リポソームの標的化はまた、例えば臓器特異性、細胞特異性、及び細胞小器官特異性に基づいて可能であり、当技術分野において既知である。
各種実施形態では、前記薬学的組成物の経口投与が考えられる。この方法で投与される薬学的組成物は、錠剤及びカプセル剤などの固体剤形の調合において慣用的に使用されるそれらのキャリアを用いてまたは用いずに製剤化することができる。経口投与用の固体剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣剤、散剤、顆粒剤など）では、本開示の１つ以上の治療用化合物は、１つ以上の薬学的に許容可能なキャリア、例えばクエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム、及び／または以下のいずれかと混合され得る：（１）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及び／またはケイ酸などの充填剤または増量剤；（２）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、及び／またはアカシアなどの結合剤；（３）グリセロールなどの保湿剤；（４）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプンまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のシリケート、及び炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；（５）パラフィンなどの溶解遅延剤；（６）第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤；（７）例えば、セチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤；（８）カオリン及びベントナイト粘土などの吸収剤；（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びこれらの混合物などの潤滑剤；ならびに（１０）着色剤。カプセル剤、錠剤及び丸剤の場合、薬学的組成物には緩衝剤もまた含み得る。ラクトースまたは乳糖、及び高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用して、類似の種類の固体組成物を、軟充填ゼラチンカプセル剤及び硬充填ゼラチンカプセル剤の充填剤として用いてもよい。経口投与用の液体剤形には、薬学的に許容可能な乳剤、マイクロエマルジョン剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、及びエリキシル剤が含まれる。活性成分に加えて、前記液体剤形は、当技術分野において一般的に使用される不活性希釈剤、例えば水または他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に綿実、落花生、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシ、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、及びソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を含有してもよい。不活性希釈剤の他に、前記経口組成物には、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味剤、着香剤、着色剤、芳香剤、及び保存剤などの補助剤もまた含むことができる。
各種実施形態では、前記薬学的組成物の、皮膚または粘膜のいずれかへの局所投与が企図される。前記局所製剤は、皮膚または角質層浸透促進剤として有効であることが知られている１つ以上の多種多様な薬剤をさらに含み得る。これらの例は、２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、プロピレングリコール、メチルまたはイソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、及びアゾンである。製剤を外見上許容可能にするために、追加の薬剤をさらに含んでもよい。これらの例は、脂肪、ワックス、油、染料、香料、保存剤、安定剤、及び界面活性剤である。当技術分野において既知のものなどの角質溶解剤もまた含んでもよい。例としては、サリチル酸及びイオウである。局所または経皮投与のための剤形には、散剤、スプレー剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、液剤、貼付剤、及び吸入剤が含まれる。前記活性化合物は、薬学的に許容可能なキャリアと、必要とされ得る任意の保存剤、緩衝剤、または噴射剤と、無菌条件下で混合され得る。軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、及びゲル剤は、本開示の対象の化合物（例えば、ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ）に加えて、動物性及び植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、及び酸化亜鉛、またはこれらの混合物などの賦形剤を含有してもよい。
本明細書での使用が企図されるさらなる薬学的組成物は、持続送達製剤または制御送達製剤にポリペプチドを含む製剤を含む。リポソームキャリア、生体内分解性（ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ）マイクロ粒子または多孔性ビーズ及びデポ注射などの様々な他の持続送達手段または制御送達手段を製剤化するための技術もまた、当業者に既知である。
治療的に使用される薬学的組成物の有効量は、例えば治療状況及び目的に応じて決まる。当業者は、治療のための適切な投与レベルが、送達される分子、ポリペプチドが使用されている兆候、投与経路、ならびに患者のサイズ（体重、体表または臓器の大きさ）及び状態（年齢及び一般的な健康状態）に部分的に応じて変化し得ることを理解するであろう。したがって、臨床医は、最適な治療効果を得るために、投与量を調整し、投与経路を修正してよい。典型的な投与量は、上記の要因に依存し、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ以上までの範囲であってよい。ポリペプチド組成物は、好ましくは、静脈内に注射または投与してもよい。長時間作用性薬学的組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス速度に応じて、３〜４日毎、毎週、または隔週で投与してもよい。投与頻度は、使用される製剤中のポリペプチドの薬物動態学的パラメータに応じて決まる。典型的には、組成物は、所望の効果が得られる投与量に達するまで投与される。したがって、前記組成物は、単回用量として、または複数回用量（同じまたは異なる濃度／投与量で）として経時的に、または持続注入として投与してもよい。適切な投与量のさらなる改良が日常的に行われる。適切な投与量は、適切な用量―反応データを使用することによって確認され得る。
前記薬学的組成物の投与経路は、例えば、経口的、静脈内、腹腔内、脳内（脳実質内）、脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、病巣内経路、髄内、髄腔内、脳室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、経皮的、皮下、または腹腔内注射を介するもの；及び鼻腔内、経腸、局所的、舌下腺、尿道、膣、または直腸の手段、徐放システムによるもの、または埋め込みデバイスによるもの、といった既知の方法と一致する。必要に応じて、前記組成物は、ボーラス注射によって、または連続的に注入することによって、または埋め込みデバイスによって投与してもよい。あるいは、またはこれに加えて、所望の分子を吸収またはカプセル化した、膜、スポンジまたは別の適切な材料を埋め込むことによって、前記組成物を局所的に投与してもよい。埋め込みデバイスを用いる場合は、このデバイスは、適切な組織または臓器へと埋め込まれ得、所望の分子の送達を、拡散、徐放ボーラス、または持続投与によって行ってもよい。
各種実施形態では、本開示は、治療上有効量のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与することを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップが、配列番号１６及び配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含む、対象における筋消耗を治療する方法を提供する。各種実施形態では、前記薬学的組成物のハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドにヒトＩｇＧ４ Ｆｃ（配列番号４３）を連結するために、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有するリンカーが、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を有するヒンジリンカーと共に使用される。
各種実施形態では、本開示は、治療上有効量のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与することを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップが、配列番号１６及び配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含む、対象における骨障害を治療する方法を提供する。各種実施形態では、前記薬学的組成物のハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドにヒトＩｇＧ４ Ｆｃ（配列番号４３）を連結するために、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有するリンカーが、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を有するヒンジリンカーと共に使用される。
各種実施形態では、本開示は、治療上有効量のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与することを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップが、配列番号１６及び配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含む、対象における代謝障害を治療する方法を提供する。各種実施形態では、前記薬学的組成物のハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドにヒトＩｇＧ４ Ｆｃ（配列番号４３）を連結するために、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有するリンカーが、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を有するヒンジリンカーと共に使用される。
各種実施形態では、本開示は、治療上有効量のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与することを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップが、配列番号１６及び配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含む、対象における線維症を治療する方法を提供する。各種実施形態では、前記薬学的組成物のハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドにヒトＩｇＧ４ Ｆｃ（配列番号４３）を連結するために、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有するリンカーが、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を有するヒンジリンカーと共に使用される。
各種実施形態では、本開示は、治療上有効量のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与することを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップが、配列番号１６及び配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含む、対象における自己免疫／炎症性疾患を治療する方法を提供する。各種実施形態では、前記薬学的組成物のハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドにヒトＩｇＧ４ Ｆｃ（配列番号４３）を連結するために、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有するリンカーが、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を有するヒンジリンカーと共に使用される。
各種実施形態では、本開示は、治療上有効量のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与することを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップが、配列番号１６及び配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含む、対象における心血管疾患を治療する方法を提供する。各種実施形態では、前記薬学的組成物のハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドにヒトＩｇＧ４ Ｆｃ（配列番号４３）を連結するために、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有するリンカーが、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を有するヒンジリンカーと共に使用される。
各種実施形態では、本開示は、治療上有効量のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与することを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップが、配列番号１６及び配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含む、対象におけるがん細胞を治療する方法を提供する。各種実施形態では、前記薬学的組成物のハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドにヒトＩｇＧ４ Ｆｃ（配列番号４３）を連結するために、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有するリンカーが、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を有するヒンジリンカーと共に使用される。
各種実施形態では、本開示は、治療上有効量のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与することを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップが、配列番号１６及び配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含む、対象における腎疾患を治療する方法を提供する。各種実施形態では、前記薬学的組成物のハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドにヒトＩｇＧ４ Ｆｃ（配列番号４３）を連結するために、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有するリンカーが、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を有するヒンジリンカーと共に使用される。
各種実施形態では、本開示は、治療上有効量のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与することを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップが、配列番号１６及び配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含む、対象における関節炎を治療する方法を提供する。各種実施形態では、前記薬学的組成物のハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドにヒトＩｇＧ４ Ｆｃ（配列番号４３）を連結するために、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有するリンカーが、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を有するヒンジリンカーと共に使用される。
各種実施形態では、本開示は、治療上有効量のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与することを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップが、配列番号１６及び配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含む、対象における食欲不振を治療する方法を提供する。各種実施形態では、前記薬学的組成物のハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドにヒトＩｇＧ４ Ｆｃ（配列番号４３）を連結するために、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有するリンカーが、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を有するヒンジリンカーと共に使用される。
各種実施形態では、本開示は、治療上有効量のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与することを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップが、配列番号１６及び配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含む、対象における肝疾患を治療する方法を提供する。各種実施形態では、前記薬学的組成物のハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドにヒトＩｇＧ４ Ｆｃ（配列番号４３）を連結するために、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有するリンカーが、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を有するヒンジリンカーと共に使用される。
各種実施形態では、本開示は、治療上有効量のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与することを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップが、配列番号１６及び配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含む、対象における組織修復または臓器再生のための幹細胞成長を誘導する方法を提供する。各種実施形態では、前記薬学的組成物のハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドにヒトＩｇＧ４ Ｆｃ（配列番号４３）を連結するために、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有するリンカーが、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を有するヒンジリンカーと共に使用される。
各種実施形態では、本開示は、治療上有効量のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与することを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップが、配列番号１６及び配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含む、対象における貧血を治療する方法を提供する。各種実施形態では、前記薬学的組成物のハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドにヒトＩｇＧ４ Ｆｃ（配列番号４３）を連結するために、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有するリンカーが、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を有するヒンジリンカーと共に使用される。
各種実施形態では、本開示は、治療上有効量のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与することを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップが、配列番号１６及び配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含む、対象における疼痛を治療する方法を提供する。各種実施形態では、前記薬学的組成物のハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドにヒトＩｇＧ４ Ｆｃ（配列番号４３）を連結するために、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有するリンカーが、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を有するヒンジリンカーと共に使用される。
各種実施形態では、本開示は、治療上有効量のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与することを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップが、配列番号１６及び配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含む、対象における老化を治療する方法を提供する。各種実施形態では、前記薬学的組成物のハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドにヒトＩｇＧ４ Ｆｃ（配列番号４３）を連結するために、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有するリンカーが、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を有するヒンジリンカーと共に使用される。
以下の実施例は、本開示をより完全に説明するために提供されるが、その範囲を限定するものとしては解釈されない。
実施例１
本開示のポリペプチドは、当業者に周知である組換えＤＮＡ技術にしたがって調製することができる。この例では、ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドの調製について概して説明される。
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン内の選択的位置にある複数のアミノ酸残基を、アミノ酸レベルでの配列アラインメントに基づいて対応する位置にあるヒトＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインに由来するアミノ酸残基で置換することにより、様々なハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを設計した。部位特異的突然変異導入を用いることによってハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドをコードするＤＮＡ発現カセットを作製し、その後５’末端にヒト免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチドをコードするｃＤＮＡ断片、そしてペプチドリンカーをコードするＤＮＡ断片、続いて３’末端にヒトＦｃをインフレームで配置することにより、Ｆｃ融合タンパク質構築物へと改変させた。
実施例２
この例では、図１に示すように構成されたハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質の調製について概して説明される。
様々なハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質をコードする合成ＤＮＡカセット（それぞれシグナルペプチドリーダー配列（配列番号４９または５０）、実施例１のハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチド（または野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ配列）、ペプチドリンカー配列（配列番号４４）、ヒンジリンカー配列（配列番号１１８）及びＦｃドメイン配列（配列番号３９または４１または４３）を含む）が、Ｆｒｅｅｄｏｍ ｐＣＨＯ１．０及びｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）へとクローニングされる。
安定したトランスフェクションのために、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、様々なハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質をコードするｐＣＨＯ１．０発現ベクターを、ＣＨＯ−Ｓ細胞にそれぞれトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を、３〜７週間、３７℃で振とうＣＯ２インキュベーター中で、ピューロマイシン及びメトトレキサート（ＭＴＸ）選択を含む無血清ＣＤ ＦｏｒｔｉＣＨＯ培地において増殖させた。細胞が３０Ｍピューロマイシン及び５００ｎＭメトトレキサートを含有する９０％生存率を超えるまで、安定なプールを作製した。製造元が推奨するプロトコール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にしたがって、希釈クローニングにより安定なクローンを作製した。一過性トランスフェクションのために、ＥｘｐｒｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３トランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、様々なハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質をコードするｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミドを、Ｅｘｐｉ２９３細胞にそれぞれトランスフェクトした。
トランスフェクション後、安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｓ細胞を、３７℃でＣＯ２振とうインキュベーター中で、グルコースを添加した完全無血清ＣＤ ＦｏｒｔｉＣＨＯ培地において１４日間まで増殖させた。馴化培地をタンパク質精製のために回収した。一過性トランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３細胞を、３７℃でＣＯ２振とうインキュベーター中で、Ｅｘｐｉ２９３発現培地において７日間まで培養し、培地をタンパク質精製のために回収した。
精製のために、ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質を含有する馴化培地を、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いることによってＨｉｔｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ高性能カラムによって精製した。ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質を、酢酸緩衝液（ｐＨ３．６）で溶出し、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した後、緩衝液を交換した。タンパク質濃度は、分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いることによって測定した。
実施例３
この例では、７つのハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質のミオスタチン結合活性及びＢＭＰ９結合活性を評価する。
様々なハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質のミオスタチン結合活性及びＢＭＰ９結合活性は、Ｏｃｔｅｃｔ Ｒｅｄ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いてまず分析した。精製タンパク質または馴化培地は、最大負荷量でＡＨＣバイオセンサに個別に負荷した。ベースライン洗浄段階の後、会合工程とそれに続く解離工程のために、前記センサを１０ｎＭのミオスタチンまたはＢＭＰ９にそれぞれさらした。全ての実験は１，０００ｒｐｍで振とうしながら実施した。結合活性は、ＦｏｒｔｅＢｉｏのソフトウェアを用いて分析し、ＫＤはＫｄ／Ｋａ比を用いて算出した。
結果
ミオスタチン及びＢＭＰ９に対する結合活性について、ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質を野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質と比較して調べた。結果は、ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質が、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質と比較して、ＢＭＰ９に対する結合親和性が著しく低いことを示す。いくつかのハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ−Ｆｃタンパク質のものよりもＢＭＰ９結合親和性を１００倍以上弱く劇的に減少させたが、その一方で、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ−Ｆｃタンパク質のものと類似した強いミオスタチン結合親和性を保持していた。Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ分析により得られた予備結合データの要約を表３に示す。
Figure 2019535675
ＡＧ−００１４及びＡＧ−００２７を結合平衡除外アッセイ（ｋｉｎｅｔｉｃ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）（ＫｉｎＥｘＡ）（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）によって分析した。２０〜３０μｇ／ｍｌのミオスタチン、アクチビンＡまたはＢＭＰ−９を、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓによって推奨されている実験手順を用いて、ＮＨＳ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に別々に結合させた。各ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質の濃度は、リガンドを２．５倍の段階希釈で調整して一定に保った。溶液を室温において２４時間までインキュベートすることによって平衡に達するようにし、続いてＫｉｎＥｘＡ３０００装置（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）上で、リガンド被覆Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを予め充填したフローセルに通過させた。ビーズ上に捕捉された遊離ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）によって検出した。リガンド結合親和性値（ＫＤ）は、ＫｉｎＥｘＡ Ｐｒｏソフトウェア（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて算出した。
結果
ＫｉｎＥｘＡ分析により得られた予備結合データの要約を表４に示す。データは、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃと同様に、２つの例示的なハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質が一桁台のｐＭ範囲でミオスタチン及びアクチビンＡの両方に対して高い親和性を有することを示す。しかしながら、２つのハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、一桁台のｐＭ範囲でＢＭＰ９に対して強い結合親和性を示す野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃとは対照的に、ＢＭＰ９に対して検出可能な結合を示さない。
Figure 2019535675
実施例４
この例では、ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質のミオスタチン／アクチビンＡ遮断活性及びＢＭＰ９遮断活性をそれぞれ定量するために使用されたミオスタチン／アクチビンＡシグナル伝達アッセイ及びＢＭＰ９シグナル伝達アッセイについて説明される。
ミオスタチン／アクチビンＡシグナル伝達を評価するために、１２回反復のＣＡＧＡ配列を有するレポーター構築物（Ｄｅｎｎｌｅｒ ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯ １７：３０９１−３１００，１９９８）をｐＧＬ３−ｌｕｃレポーターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）へとクローニングした。改変されたｐＧＬ３−ＣＡＧＡ１２−ｌｕｃベクターをＣ２Ｃ１２細胞に安定的にトランスフェクトし、ミオスタチンまたはアクチビンＡによって媒介されるＳｍａｄ３／４シグナル伝達を感知することができるルシフェラーゼレポーター細胞株Ｃ２Ｃ１２−ＣＡＧＡ−ｌｕｃを作製した。ミオスタチン及びアクチビンＡ中和活性を測定するために、４ｎＭの組換えミオスタチンまたはアクチビンＡを、漸増濃度の様々なハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質及び野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（対照として）と共に室温において１時間プレインキュベートした。続いて、反応混合物をＣ２Ｃ１２−ＣＡＧＡ−ｌｕｃ細胞培養液に添加した。３７℃でＣＯ２インキュベーター中で５時間インキュベーション後、Ｃ２Ｃ１２−ＣＡＧＡ−ｌｕｃレポーター培養液のルシフェラーゼ活性を、ＬｕｍｉｎｏＳｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いることによって測定した。
Ｓｍａｄ１／５／８シグナル伝達を感知するＢＭＰ応答エレメント（ＢＲＥ）を含有するルシフェラーゼレポーターによって安定的にトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞においてＢＭＰ９シグナル伝達を試験した（Ｋｏｒｃｈｙｎｓｋｉ ｅｔ．ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４８８３−４８９１，２００２）。具体的には、２つの反復ＢＭＰ応答エレメント（Ｂｒｉｔｅｒ ｅｔ ａｔ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１２）を合成し、ｐＧＬ３−ｌｕｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）へとクローニングした。次いで、ｐＧＬ３−２ＸＢＲＥ−ｌｕｃベクターをＣ２Ｃ１２細胞へと安定的にトランスフェクトした。安定的にトランスフェクトされたレポーター細胞株Ｃ２Ｃ１２−ＢＲＥ−ｌｕｃを使用して、ＢＭＰ９媒介性Ｓｍａｄ１／５／８シグナル伝達を定量した。ＢＭＰ中和活性を測定するためには、４ｎＭのＢＭＰ９を、漸増濃度の様々なハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質及び野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（対照として）と共に室温において１時間プレインキュベートした。反応混合物をＣ２Ｃ１２−ＢＲＥ−ｌｕｃ細胞培養液に添加した。３７℃でＣＯ２インキュベーター中で５時間インキュベーション後、Ｃ２Ｃ１２−ＢＲＥ−ｌｕｃレポーター培養液のルシフェラーゼ活性を、Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いることによって測定した。
結果
結果は、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質と比較して、２つの例示的なハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質が、強いミオスタチン及びアクチビンＡ中和活性を保持していたが、著しく低いＢＭＰ９中和活性を有することを明らかにした（図２参照）。図２では、２つの例示的なハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質、ＡＧ−０００３（配列番号５）及びＡＧ−０００５（配列番号７）の、ミオスタチン、アクチビンＡ、及びＢＭＰ９に対する細胞ベースの中和活性が、野生型対照ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質のものと比較して示される。
実施例５
この実施例では、実施例４に記載されたミオスタチン／アクチビンＡシグナル伝達アッセイ及びＢＭＰ９シグナル伝達アッセイを使用して、以下のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質：ＡＧ−０００３（配列番号５）、ＡＧ−００１４（配列番号１６）、ＡＧ−００２３（配列番号２５）、ＡＧ−００２４（配列番号２６）、ＡＧ−００２５（配列番号２７）、ＡＧ−００２７（配列番号２９）、ＡＧ−００２８（配列番号３０）、ＡＧ−００２９（配列番号３１）、及びＡＧ−００３５（配列番号３７）のミオスタチン／アクチビンＡ遮断活性及びＢＭＰ９遮断活性をそれぞれ定量した。
結果
結果は、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質と比較して、これらのハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質のいくつかが、強いミオスタチン及びアクチビンＡ中和活性を保持していたが、著しく低いＢＭＰ９中和活性を有することを明らかにした。図３では、ミオスタチン、アクチビンＡ、及びＢＭＰ９に対する細胞ベースの中和活性が、２つの例示的なハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質、ＡＧ−００１４及びＡＧ−００２７について、野生型対照ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質のものと比較して示される。
表５及び表６にて示すように、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（ＷＴ ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ）と比較して、様々な例示的なハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、細胞ベースのＳｍａｄ２／３ ＣＡＧＡ−ｌｕｃレポーターアッセイではミオスタチン、アクチビンＡ、及びアクチビンＢに対する強い中和活性を保持しながら、細胞ベースのＳｍａｄ１／５／８ ＢＲＥ−ｌｕｃレポーターアッセイではＢＭＰ９中和活性を劇的に減少させた。表５は、ＷＴ ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃのものと比較した、ＡＧ−００１４及びＡＧ−００２７のミオスタチン、アクチビンＡ、アクチビンＢ及びＢＭＰ９それぞれに対する細胞ベースの中和性のＩＣ５０値を示す。表６は、ＷＴ ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃのものと比較した、いくつかの例示的なハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質のＢＭＰ９及びミオスタチン中和活性を概説する。ＷＴ ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃと比較して、ハイブリッドタンパク質ＡＧ−０００３、ＡＧ−０００４、ＡＧ−０００５、ＡＧ−００１４、ＡＧ−００２３、ＡＧ−００２４、ＡＧ−００２５、ＡＧ−００２７及びＡＧ−００２８は、ＢＭＰ９中和活性を劇的に減少させるか、または実質的にＢＭＰ９中和活性を示さなかった（図１０もまた参照）；ＡＧ−０００３、ＡＧ−０００５、ＡＧ−００１４及びＡＧ−００２７は、完全なミオスタチン中和活性を保持したが、一方でＡＧ−０００４、ＡＧ−００２３、ＡＧ−００２４、ＡＧ−００２５及びＡＧ−００２８は、ミオスタチン中和活性の喪失を示した（図１１もまた参照）。概して、これらの結果は、ＢＭＰ９媒介性Ｓｍａｄ１／５／８シグナル伝達への影響を最小限で、または全く伴わずに、ミオスタチン／アクチビン媒介性Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達を優先的に遮断する様々なハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質の能力を証明する。
Figure 2019535675

Figure 2019535675

Figure 2019535675
実施例６
この実施例では、週１回、１０ｍｇ／ｋｇの用量でＰＢＳ（ビヒクル）、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ、ＡＧ−００１４（配列番号１６）及びＡＧ−００２７（配列番号２９）をそれぞれ皮下注射した９週齢の雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの体重及び筋量への影響を評価した。０日目、５日目、１２日目及び１８日目に体重を記録した。各群ｎ＝６／８とした。体重変化の値は、０日目のベースラインからの体重増加率として算出した。各動物の個々のふくらはぎの筋肉を切開し、最終剖検中に計量した。値は、ビヒクル群のものと比較して、各処置群における平均ふくらはぎ筋量の増加率として表される。図４及び図５及び表７に示すように、２つの例示的なハイブリッドリガンドトラップタンパク質のそれぞれの投与は、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃと同様に、マウスの体重を著しく増加させることができる。
Figure 2019535675
図５及び表８に示すように、２つの例示的なハイブリッドリガンドトラップタンパク質、ＡＧ−００１４及びＡＧ−００２７それぞれの投与は、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃと同様に、マウスの筋量を著しく増加させることができる。
Figure 2019535675
実施例７
この実施例では、週１回、１０ｍｇ／ｋｇの用量で、ＰＢＳ（ビヒクル）、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ、ＡＧ−００１４（配列番号１６）及びＡＧ−００２７（配列番号２９）それぞれによって処置した８週齢の雄ＢａｌｂＣマウスのマウス腹腔、マウス精巣、及びマウス肺組織のエバンスブルーの浸透率における影響を評価した。処置の２週間後、２００μｌのエバンスブルー色素（ＰＢＳ中０．５％、ｐＨ７．２）を尾静脈を介して各群の動物（ｎ＝４）に注射した。エバンスブルー色素注射の９０分後、剖検を実施した。外科的に露出させた各群の腹腔、切開した精巣器官、及び切開した肺組織の代表的な画像は、それぞれ図６〜図８中に分類されているように示される。青色は血管の漏出を示す。精巣及び肺組織を計量し、次いでホルムアミドを含むバイアルに個別に入れてエバンスブルー色素を抽出した。５５℃で２４時間インキュベーション後、試料を遠心した。各試料の水相の吸光度を分光光度計を用いて６１０ｎｍの波長で測定した。異なる処置群における湿肺組織（左パネル）及び精巣組織（右パネル）１ｍｇ当たりの血管外溢出エバンスブルー色素の量を図９に示す。
重要なことに、図６〜９に示すように、２つの例示的なハイブリッドリガンドトラップタンパク質の投与が、処置動物において評価した全ての組織において、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質と比較して血管漏出のレベルを著しく減少させる。
実施例８
野生型ＡｃｔＲＩＩＢ ＥＣＤ−Ｆｃ及び野生型ＡｃｔＲＩＩＡ ＥＣＤ−Ｆｃの両方と比較して、異なる濃度でのハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質のＢＭＰ９結合の特性をさらに調べるために自動ＥＬＩＳＡ分析を実施した。図１２に示すように、データは、２つの例示的なハイブリッドタンパク質、ＡＧ−００１４及びＡＧ−００２７それぞれが、ＷＴ ＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃまたはＷＴ ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃのいずれかと比較して、ＢＭＰ９結合を大幅に減少させたことを明らかにする。これらのデータは、ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質が、ＷＴ ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ及びＷＴ ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃとは異なるＢＭＰ９結合において顕著な選択性を有することを示す。
実施例９
この実施例では、ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質ＡＧ−００１４（配列番号１６）及びＡＧ−００２７（配列番号２９）及びベンチマーク野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃとの間の差を、雌１２９Ｓ１／ＳｖｌｍＪマウスの血管完全性及び爪床出血へのそれらの潜在的影響に特に関連して評価した。
２４匹の若齢成熟雌１２９Ｓ１／ＳｖｌｍＪマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を４つの実験群（各群ｎ＝６）に分け、続いて、以下の表９に示すような投与レジメンを使用して、ビヒクル（ＰＢＳ）によって処置するか、または反復して高用量の野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（ＷＴ）、ＡＧ−００２７及びＡＧ−００１４それぞれによって処置した。
Figure 2019535675
４週間の処置後、各動物を透明底容器に入れ、倒立顕微鏡を用いて足の爪床の出血の徴候を調べた。
図１３に示すように、肉眼形態の顕微鏡検査は、反復して高用量の野生型ＡｃｔＲＩＩ−Ｆｃ（ＷＴ−ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ）によって処置した６匹の１２９Ｓ１／ＳｖｌｍＪマウスのそれぞれにおいて、ほぼ全ての足の爪床が明らかな出血の徴候を有することを明らかにした（図１３、２番目のパネル）。対照的に、反復して高用量の２つのハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質のいずれかによって処置した１２９Ｓ１／ＳｖｌｍＪマウスでは、足の爪床出血の徴候が観察されなかった。ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ処置マウスにおける足の爪床の形態は、ビヒクル処置対照動物のものと同様であるように思われる。これらの知見は、ベンチマーク化合物の野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃが爪床において血管系を破壊し出血を引き起こしたのに対して、ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、血管恒常性を妨げず、爪床において正常な血管完全性を維持したことを示唆している。
まとめると、本実施例の結果は、３０ｍｇ／ｋｇで週２回、４週間、反復して皮下投与された高用量のＷＴ−ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃにより、１２９Ｓ１／ＳｖｌｍＪ雌マウスの足の爪床及びブルンナー腺において明らかな出血の徴候がもたらされることを証明する。対照的に、ＡＧ−００２７またはＡＧ−００１４による４週間の反復した高用量処置は、１２９Ｓ１／ＳｖｌｍＪ雌マウスの爪床において出血の徴候を引き起こさなかった。したがって、ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ分子は、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃのように血管完全性に悪影響を及ぼさなかった。これらの知見は、ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップ分子がｉｎ ｖｉｖｏ選択性に関して野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃと劇的に異なり、血管系を破壊する野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃと違い、ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、血管恒常性を妨げることなく、正常な血管系の完全性を維持することを証明する。そのため、優れたｉｎ ｖｉｖｏ選択性及びｉｎ ｖｉｖｏ有効性と共に（以下の実施例を参照）、ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃまたはいかなる類似の前世代の分子よりも安全性及び有効性において明らかに異なる治療上の利点を提供する。
実施例１０
この実施例では、精巣摘出Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、筋量及び骨密度増強におけるＡＧ−００２７（配列番号２９）のｉｎ ｖｉｖｏ有効性、ならびにアンドロゲン除去誘発性筋消耗及び骨量減少を回復させるＡＧ−００２７の能力を評価した。
６匹の正常対照マウス及び１２匹の精巣摘出（ＯＲＸ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を含む１０週齢の１８匹の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、以下の表１０に示される投与レジメンを用いて、ビヒクル（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）またはＡＧ−００２７のいずれかを皮下注射した。
Figure 2019535675
６週間の処置期間を通して、縦断的に体重を週２回記録した。４２日目、マウスをＣＯ２による窒息により安楽死させた。除脂肪屠体、心臓、及び個々の後肢筋（腓腹筋、大腿四頭筋及びヒラメ筋）を含む組織、ならびに大腿骨及び腰椎を各動物から切除した。除脂肪屠体、心臓、及び個々の後肢筋の対（左右両方）を、直示天秤を使用して計量し、その値を記録した。各動物の大腿骨遠位部及び第４腰椎を含む骨組織を、マイクロＣＴイメージングシステムを使用して高解像度マイクロコンピュータ断層撮影法（マイクロＣＴ）によって分析した。大腿骨遠位部及び第４腰椎の骨体積（ＢＶ／ＴＶ、％）、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ、ｍｍ−１）、骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ、ｍｍ）及び骨梁間隔（Ｔｂ．Ｓｐ、ｍｍ）を各群の６つの大腿骨及び腰椎骨試料の連続したマイクロＣＴスキャンに基づいて算出した。
図１４に示すように、体重データ（左パネル）は、ＯＲＸ Ｃ５７ＢＬ／６マウスが正常対照Ｃ５７ＢＬ／６マウスと比較して体重が著しく低いことを示す。１週間の処置中に、ＡＧ−００２７はＯＲＸマウスにおける体重減少の完全な回復をもたらし（左パネル）、ＡＧ−００２７投与により、ビヒクル処置ＯＲＸマウス及び正常対照マウスの両方と比較して迅速で持続的かつ統計的に有意な体重増加がもたらされた（右パネル参照）。
図１５は、個々の後肢筋量と除脂肪屠体重量の変化を示す。データは、ビヒクル処置ＯＲＸ群では、正常対照群と比較して、後肢筋量において９％〜１３％有意に減少し、除脂肪屠体重量において１４％近く減少したことを示す。対照的に、ＡＧ−００２７処置ＯＲＸ群は、ビヒクル処置ＯＲＸ群と比較して、後肢筋量では２２％〜４７％、除脂肪屠体重量では３７％近くの著しい増加を示し、さらに、正常対照群と比較して、後肢筋量では１１％〜２８％、除脂肪屠体重量では１８％の有意な増加を示した。顕著なことには、ＡＧ−００２７は、ＯＲＸマウスの筋萎縮を完全に回復させただけでなく、処置ＯＲＸマウスにおいて、正常対照群でのレベルを超える大幅な筋肉増加も引き起こした。ビヒクル処置ＯＲＸ群では、速筋（すなわち、腓腹筋及び大腿四頭筋）及び遅筋（すなわち、ヒラメ筋）筋肉の両方が有意に減少し、ＡＧ−００２７処置は、ＯＲＸマウスのこれらの両方の筋肉タイプの減少を効果的に回復させた（図１５参照）。これらの知見は、ＡＧ−００２７が筋成長に対して強力なｉｎ ｖｉｖｏ有効性を有し、筋萎縮を回復させる能力が非常に高いことを証明する。
図１６及び図１７はまた、正常対照マウス、ビヒクル処置ＯＲＸマウス、及びＡＧ−００２７処置ＯＲＸマウスにおける大腿骨遠位部（図１６）及び第４腰椎（図１７）の骨密度のマイクロＣＴ分析の結果を示す。図１８に示すように、ＯＲＸマウスは、正常対照マウスと比較して、大腿骨遠位部の骨体積分率（ＢＶ／ＴＶ、％）及び骨梁数（Ｔｂ．Ｎ、ｍｍ−１）では８６％を超える統計的に有意な減少、及び骨梁間隔（Ｔｂ．Ｓｐ、ｍｍ）では１４４％の顕著な増加と共に、大腿骨遠位部では骨量の顕著な減少を示した。しかしながら、ＡＧ−００２７によるＯＲＸマウスの処置は、骨体積分率（ＢＶ／ＴＶ、％）を７２６％、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ、ｍｍ−１）を６６７％劇的に増加させ、骨梁間隔（Ｔｂ．Ｓｐ、ｍｍ）を５１％減少させた。これにより、アンドロゲン除去に起因するＯＲＸマウスの大腿骨遠位部骨密度の減少を完全に回復する。さらに、マイクロＣＴデータによって示されるように、ＡＧ−００２７処置は、ＯＲＸマウスの大腿骨遠位部の骨梁幅を、正常マウスに見られる正常対照レベルを１１％超えるまで有意に増加させた。図１７に示すように、精巣摘出により誘発されるアンドロゲン除去は、ＯＲＸマウスの腰椎の骨量の著しい減少をもたらすが、これはＡＧ−００２７処置により完全に回復した（図１７参照）。具体的には、ビヒクル処置ＯＲＸマウスは、正常対照マウスと比較して、第４腰椎の骨体積分率（ＢＶ／ＴＶ、％）及び骨梁数（Ｔｂ．Ｎ、ｍｍ−１）では約５０％の統計的に有意な減少を示し、さらに、（Ｔｂ．Ｓｐ、ｍｍ）では３３％の統計的に有意な減少を示した。しかしながら、ＡＧ−００２７によるＯＲＸマウスの処置は、腰椎の骨体積分率を１４８％、腰椎の骨梁数を１１０％劇的に増加させ、腰椎の骨梁間隔（Ｔｂ．Ｓｐ、ｍｍ）を２３％減少させた。これにより、アンドロゲン除去に起因するＯＲＸマウスの腰椎の骨密度の著しい減少を完全に改善する。さらに、ＡＧ−００２７処置は、ＯＲＸマウスの腰椎の骨梁幅を、正常マウスに見られる正常対照値を１９％超えるまで有意に増加させた。これらのデータは、ＡＧ−００２７がｉｎ ｖｉｖｏで強力な骨同化作用を有し、ＡＧ−００２７処置が骨量減少を回復させるのに非常に有効であることを実証する。
要約すると、ＯＲＸマウスに関するこの実施例のデータは、ＡＧ−００２７の皮下投与により体重、筋量及び骨量の劇的な増加がもたらされ、アンドロゲン除去による深刻な筋萎縮及び骨量減少が完全に回復されたことを示す。筋肉及び骨同化作用に対する顕著なｉｎ ｖｉｖｏ有効性は、次世代治療薬として、ＡＧ−００２７が様々な筋肉及び骨障害を治療するための強力な治療可能性を提供することを実証する。
実施例１１
糖尿病は、世界的に蔓延しつつある主要な公衆衛生問題である。運動による筋肉量及び機能の向上は、インスリン感受性を改善し、糖尿病状態を改善することができることが示されている。前述の実施例のデータにより、ＡＧ−００２７（配列番号２９）のようなハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップがミオスタチン／アクチビン−Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達経路に選択的に拮抗することによって、筋成長及び筋肉再生を大幅に増強できることが明確に立証される。この実施例では、グルコース代謝に及ぼす筋成長の影響を、ＡＧ−００２７またはビヒクルのいずれかによって処置した糖尿病マウスを用いて試験する。
ホモ接合型ｄｂ／ｄｂ糖尿病マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）は、３０ｍｇ／ｋｇまで用量を増加させたＡＧ−００２７によって、またはビヒクル（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）によって、１０または１２週間処置する。ヘテロ接合型ｄｂ／ｄｂマウスは、非糖尿病対照として使用する（各群ｎ＝６）。摂食量、水分摂取量、２４時間尿量、空腹時血糖値、及び体重の変化を調査する。研究の最後には、マウスをＣＯ２により安楽死させた。血液試料を採取し、市販のアッセイキットを用いて血清中インスリン値、ＨｂＡ１ｃ値、アディポネクチン値を測定する。腹部脂肪、筋肉量及び褐色脂肪量を含む体組成は、剖検分析によって測定される。肝組織は、Ｈ＆Ｅ染色及びオイルレッドＯ染色によって組織学的に検査する。
図１８は、糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスの摂食量、水分摂取量、２４時間尿量、及び空腹時血糖値におけるＡＧ−００２７処置の効果を示す。ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質ＡＧ−００２７の皮下投与によって、糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスの摂食量、水分摂取量、２４時間尿量、及び空腹時血糖値を劇的に正常化した。したがって、このデータは、ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質による処置が、摂食量及び水分摂取量を効果的に減少させ、血糖値を下げ、２４時間尿量を減少させることが見出されるため、ｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスにおけるミオスタチン／アクチビン−Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達の薬理学的遮断は代謝機能不全を改善できることを示す。前記処置はまた、ｄｂ／ｄｂマウスの脂肪肝を改善した。したがって、ＡＧ−００２７のようなハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢトラップタンパク質は、糖尿病、糖尿病性腎症、メタボリックシンドローム、肥満、及び脂肪肝を含む代謝性疾患を治療するための治療可能性を提供するように思われる。
実施例１２
この実施例では、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて、体重増加及び筋成長におけるＡＧ−００１４（配列番号１６）及びＡＧ−００２７（配列番号２９）のｉｎ ｖｉｖｏ有効性が、ベンチマークとして野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（ＷＴ−ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ）と比較して評価される。
７週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（各群ｎ＝６）を、１０ｍｇ／ｋｇで、それぞれハイブリッドトラップＡ（ＡＧ−００２７；配列番号２９）、ハイブリッドトラップＢ（ＡＧ−００１４；配列番号１６）、及び野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（ＷＴ−ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ）の単回注射によって、またはビヒクル（ＰＢＳ）の単回注射によって皮下処置した。単回注射後１４日までに記録された体重によって、ＷＴ−ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃと比較して、ＡＧ−００２７及びＡＧ−００１４処置が同等に大幅な体重増加を誘発したことが示された（図１９）。１４日目に最終剖検分析を実施し、データは、ＡＧ−００１４及びＡＧ−００２７による処置により、腓腹筋、大腿四頭筋、及びヒラメ筋を含む調査した３つの個々の後肢筋量において、ベンチマークのＷＴ−ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃと同じレベルで有意な増加がもたらされたことを実証した（図２０）。これらのデータは、ＡＧ−００１４及びＡＧ−００２７のようなハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質が、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃと比較して、筋成長に対して完全なｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示すことができることを実証している。
実施例１３
この実施例では、体重増加及び骨格筋成長の増強におけるＡＧ−００１４（配列番号１６）及びＡＧ−００２７（配列番号２９）の用量依存性ｉｎ ｖｉｖｏ有効性を、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて評価する。
６週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、単回漸増用量のハイブリッドトラップＡ（ＡＧ−００２７；配列番号２９）及びハイブリッドトラップＢ（ＡＧ−００１４（配列番号１６））それぞれによって、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇで皮下処置した。ＰＢＳ処置マウス及びハイブリッドトラップ処置マウスにおける体重及びベースラインからの体重変化を注射後８日まで記録した。体重データは、ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質ＡＧ−００１４及びＡＧ−００２７が、用量依存的に体重増加を刺激することができることを実証する（図２１）。後肢筋量の最終剖検分析はさらに、ＡＧ−００１４またはＡＧ−００２７による処置により用量依存的に腓腹筋重量（Ａ）及び大腿四頭筋重量（Ｂ）において、統計的に有意な増加がもたらされたことを実証する。これらのデータは、ＡＧ−００１４及びＡＧ−００２７のようなハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質が、用量依存的に筋成長を刺激することができることを示す。
実施例１４
筋ジストロフィーは、進行性の衰弱及び筋肉量の低下及び骨の脆弱化を引き起こす非常に衰弱性の疾患群である。前述の実施例のデータにより、ＡＧ−００１４（配列番号１６）及びＡＧ−００２７（配列番号２９）のようなハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質がミオスタチン／アクチビン−Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達経路を選択的に拮抗させることによって、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの疾患モデルであるＭＤＸマウスの筋成長、筋肉再生及び骨形成を大幅に増強できることが明確に立証される。この実施例では、筋ジストロフィーを治療するためのＡＧ−００１４及びＡＧ−００２７の治療可能性を評価する。
４週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ−Ｄｍｄｍｄｘ／Ｊ（ｍｄｘ）及び同年齢のＣ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ野生型マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入する。ｍｄｘマウスをそれらの体重にしたがって体重均衡群に分け、続いて、週１回１２週間、１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＧ−００２７（ｎ＝８）または無菌ＰＢＳ注射（ｎ＝８）を皮下投与することによって処置した。同齢のＣ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎマウス（ｎ＝６）を未処置の野生型対照として使用する。マウスを週２回縦断的に計量し、研究の開始時（１週目）及び終了時（１２週目）に体組成を測定する。前肢の握力は、ＢＩＯＳＥＢの握力計（Ｂｉｏｓｅｂ）を用いて、動物を水平グリッド上に置き、マウスがその前肢を用いることによって実験者から身を引き離すことができるようにすることによって、毎週評価する。研究の最後には、動物はＣＯ２を用いて安楽死させ、除脂肪屠体、大腿四頭筋、腓腹筋、ヒラメ筋、及び横隔膜筋を含む個々の組織を採取し、計量する。心臓穿刺により全ての実験マウスから血清試料を採取し、Ｐｏｉｎｔｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃクレアチンキナーゼテストキット（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてクレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルを定量する。データは、ハイブリッドトラップタンパク質（ＡＧ−００２７及びＡＧ−００１４）が、ＭＤＸマウスにおいて体重増加、筋肉量、及び握力を効果的に増強したことを示す（図２４及び２５）。図２４に示すように、ハイブリッドトラップタンパク質（ＡＧ−００２７及びＡＧ−００１４）の皮下投与は、統計的に有意にＭＤＸマウスの体重の持続的増加をもたらした。この処置により、ＭＤＸマウスの後肢筋（腓腹筋、ヒラメ筋、及び大腿四頭筋）の重量において、ビヒクル処置対照より１８％〜３６％の顕著かつ統計的に有意な増加がもたらされた（図２５参照）。加えて、この処置により、ＭＤＸマウスの握力が４７〜５６％有意に増加した。この処置により、ｍｄｘマウスの血清中ＣＫレベルの劇的かつ統計的に有意な減少がもたらされ（図２７参照）、この処置が筋肉修復を改善し、筋肉損傷を低減させたことを示す。さらに、マイクロＣＴ分析は、処置により、ＭＤＸマウスの大腿骨遠位部で１６８％、腰椎で４８％骨梁体積が増加したことを明らかにした（図２８及び２９参照）。したがって、ＡＧ−００１４及びＡＧ−００２７のようなハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、ＭＤＸマウスにおいて、筋成長を促進し、筋力を向上し、筋修復を改善し、そして骨密度を増強することができる。総合すれば、これらのデータは、ＡＧ−００１４及びＡＧ−００２７のようなハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを含むがこれに限定されない筋ジストロフィーと闘う治療可能性を有することを示す。
実施例１５
アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ及びアクチビンＡＢ）は、多くの炎症性疾患状態では上方制御されている。循環中の上昇したアクチビンは炎症において重要な役割を果たす。この実施例では、ＡＧ−００２７（配列番号２９）の抗炎症効果は、内毒素血症のマウスモデルを用いて調査し、ＡＧ−００２７の炎症誘発性サイトカインの誘導及びリポ多糖（ＬＰＳ）によって誘導される死亡率を低減させる能力が測定される。
血清中炎症誘発性サイトカインレベルを調べるために、４週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を無作為に３つの群（ｎ＝８）に分け、ビヒクル（ＰＢＳ ｐＨ７．４）またはＡＧ−００２７処置を実施した。ベースライン対照として、無処置の第１群のマウスをＣＯ２で屠殺し、基礎血清中サイトカインレベルを分析する。第２群及び第３群は、ＬＰＳ免疫感作の１時間前にＡＧ−００２７（２０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルを１回皮下注射される。次いで、１時間後にＬＰＳ（４００μｇ／ｋｇ）を腹腔内注射する。ＬＰＳ注射の９０分後、全ての動物をＣＯ２で安楽死させ、血液試料を採取し、アクチビンＡ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１７を含む炎症誘発性サイトカインの血清中レベルをＬｕｍｉｎｅｘアッセイによって測定する。ＬＰＳ誘導性内毒素血症に対するハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップの防御効果を評価するために、４０匹の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスを、対照群及びＡＧ−００２７処置群に無作為に割り付けた（ｎ＝２０）。ＬＰＳ免疫感作の１時間前、一方の群にはＡＧ−００２７（２０ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射し、もう一方にはビヒクルを皮下注射する。処置の１時間後、両群にＬＰＳ（３０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を注射し、マウスの生存率をＬＰＳ投与直後から開始してＬＰＳ注射後７日まで毎日２回モニターする。データは、アクチビンの薬理学的隔離が炎症誘発性サイトカインのＬＰＳ媒介性誘導を軽減させることができ、リポ多糖誘導性内毒素血症のマウスにおける死亡率を低減できることを示す。したがって、ＡＧ−００２７のようなハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、炎症性疾患を治療するための治療可能性を有する。
実施例１６
線維症は、肺、腎臓、心臓、肝臓、骨髄、消化管、皮膚、及び骨格筋を含む様々な臓器に影響を及ぼす深刻で進行性の病状であり、臓器不全を引き起こす可能性がある。アクチビン−Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達経路の活性化は、線維症の病因に関与している。この実施例では、ＡＧ−００２７（配列番号２９）の治療可能性を、線維症治療の可能性を研究するために広く使用されている疾患モデルであるブレオマイシン誘発肺線維症を有するマウスにおける線維症に対抗するその能力について、調査した。
３Ｕ／ｋｇの用量でのブレオマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の気管内点滴注入により６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）において肺線維症が誘発される。次いで、マウスの半数を、ブレオマイシン点滴注入の１日後、そして５、９、及び１２日目に再び１０ｍｇ／ｋｇでＡＧ−００２７によって処置し、同じ日に、マウスの残りの半数をビヒクル（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）によって処置する（ｎ＝８）。正常な対照として、同齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝６）をビヒクルによって処置する。１４日目に、マウスを安楽死させる。血液試料及び肺組織を採取し、線維症スコアの組織学的検査ならびにヒドロキシプロリンレベル及びコラーゲン含有量の測定によって線維症の重症度を定量する。データは、アクチビンの作用の遮断がブレオマイシン誘発線維症を効果的に軽減できることを示唆している。したがって、ＡＧ−００２７のようなハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、線維性疾患を治療するための治療可能性を提供するように思われる。
実施例１７
骨形成不全症（ＯＩ）は、脆弱骨、頻回骨折、及び廃用性筋萎縮を特徴とする非常に衰弱性の遺伝性疾患である。Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達経路の活性化は、病因及びＯＩの進行に重要な役割を果たす可能性があることが示されている。この実施例では、骨形成不全症における骨量減少及び廃用性筋萎縮の治療におけるＡＧ−００２７（配列番号２９）の有効性を評価する。
ＯＩの前臨床疾患モデルであるホモ接合型Ｂ６Ｃ３Ｆｅ ａ／ａ Ｃｏｌ１ａ２ｏｉｍ／Ｊマウスを調べる。具体的には、８週齢の雄ホモ接合型のＢ６Ｃ３Ｆｅ ａ／ａ Ｃｏｌ１ａ２ｏｉｍ／Ｊ ｏｉｍ／ｏｉｍマウス（ＯＩマウス）及び同齢の野生型同腹仔正常対照マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）から入手する。ＯＩマウスは、体重、及び二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）によって測定された骨量の無作為化に基づいて２つの群に分ける。２４匹のホモ接合型Ｃｏｌ１ａ２ｏｉｍマウス（各群ｎ＝１２）をＡＧ−００２７（１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）またはビヒクル（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）によって週１回６週間処置する。対照として、２０匹の野生型同腹仔対照マウス（各群ｎ＝１０）をＡＧ−００２７（１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）またはビヒクルによって週１回６週間処置する。体重は、６週間にわたって毎週縦断的に測定する。骨量を評価するために、ホモ接合型ＯＩマウス及び野生型同腹仔対照マウスに麻酔をかけ、ＤＥＸＡスキャン（Ｌｕｎａｒ ＰＩＸＩｍｕｓ）にかけて、実験の開始時及び終了直前に骨塩密度及び骨塩量を測定する。研究の最後には、動物をＣＯ２を用いて安楽死させ、三頭筋、大腿四頭筋、及び腓腹筋を採取し、計量する。心臓穿刺により全ての実験マウスから血液試料を採取し、骨形成マーカーであるプロコラーゲン１型Ｎ末端プロペプチド（Ｐ１ＮＰ）、骨型アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）、及びオステオカルシン（ＯＣ）、ならびに１型コラーゲンＣ−テロペプチド（ＣＴＸ−１）のような骨吸収マーカーを含む骨代謝マーカーの分析のために血清を採取する。大腿骨及び第４腰椎を採取し、マイクロトモグラフィーイメージングシステム（μＣＴ、Ｓｋｙｓｃａｎ、Ｋｏｎｔｉｃｈ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて骨体積を評価する。データは、ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質の皮下投与が、ＯＩマウス（ｏｉｍ／ｏｉｍマウス）における筋成長及び骨形成の両方を劇的に増強し得ることを実証する。ＡＧ−００２７（配列番号２９）による処置は、ＯＩマウスの三頭筋では３４％、腓腹筋では５１％、骨格筋量を有意に増加させた（図３０参照）。さらに、ＤＥＸＡスキャンによって明らかにされるように、この処置により、ＢＭＤとＢＭＣがそれぞれ１４．６％と３６％、劇的に増加した（図３１参照）。さらに、マイクロＣＴ分析によって示されるように、この処置により、ＯＩマウス（ｏｉｍ／ｏｉｍマウス）の大腿骨遠位部で２５１％、腰椎で９８％、骨梁体積が増加した（図３２及び３３参照）。顕著なことには、筋肉量及び骨量の改善と共に、この処置により、ＯＩマウスの体長が改善することによって低体長が正常化されたようにも思われる（図３４）。したがって、ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップＡＧ−００２７によるミオスタチン／アクチビン−Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達の薬理学的阻害は、ＯＩマウスにおける骨量減少及び廃用性筋萎縮の回復、ならびに低体長の改善に非常に有効であることが見出された。したがって、ＡＧ−００２７のようなハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、ＯＩを治療するための治療可能性を保持している。
本開示の教示全体は、本明細書に記載の新規なハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質が複数の萎縮誘導サイトカインに強力に結合し、中和することを実証する。そして、重要なことに、ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は筋肉に対する選択性を劇的に改善した、すなわち、筋萎縮誘導性サイトカインの作用を強力に遮断する一方で、該ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は非筋肉関連サイトカインのシグナル伝達をインタクトなままにし、これにより非筋肉細胞の正常な生理学的機能を維持する。上述したように、ＢＭＰは、数多くの生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たし、ＢＭＰ９シグナル伝達は、正常な血液の血管系／透過性を維持するのに必須であることが示されている。ＢＭＰ９シグナル伝達を控え、ミオスタチン及びアクチビンシグナル伝達を優先的に拮抗させることによって、本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、ＢＭＰ−９を強力に中和する既存の可溶性ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質よりもより有効かつ安全な治療を提供する（すなわち、複数の萎縮誘導性サイトカインを並行して選択的に標的化し、非筋肉関連サイトカインのシグナル伝達の妨害を回避することによって）。これらのハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質は、優れた筋成長効果と改善された安全性プロファイルを備えた臨床候補のクラスを代表し、これにより、数多くの慢性、神経性、遺伝性、炎症性、線維性、または感染性の病状の発症に関連する筋消耗及び／または骨障害と闘うための最高クラスの治療になる可能性が提供される。
本明細書に開示され請求される全ての物品及び方法は、本開示に照らして過度の実験をすることなく、製造及び実行することができる。本開示の物品及び方法は好ましい実施形態に関して説明されているが、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、物品及び方法に変形が適用され得ることが当業者には明らかであろう。既存のものであろうと後に開発されるものであろうと、当業者に明らかなそのような変形及び均等物は全て、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本開示の趣旨及び範囲内にあるとみなされる。本明細書で言及されている全ての特許、特許出願、及び刊行物は、本開示が関連する当業者のレベルを示している。全ての特許、特許出願、及び刊行物は、個々の刊行物がいずれかの及びあらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されるのと同程度に、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に例示的に記載された開示は、本明細書に具体的に開示されていない要素（複数可）がなくても適切に実施することができる。したがって、本開示は好ましい実施形態及び任意選択の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示された概念の修正及び変形が当業者によって行われてもよく、そのような修正及び変形は、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲内であると見なされることを理解されたい。
配列表
添付の配列表に列挙された核酸及びアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に規定されるように、ヌクレオチド塩基の場合、標準的な文字略語を用いて、アミノ酸の場合、３文字コードを用いて示される。
配列番号１は、切断型野生型ヒトＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号２は、切断型野生型ヒトＡｃｔＲＩＩＡ−ＥＣＤポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号３〜３７は、様々なハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号３８は、ヒト免疫グロブリンγ−１（ＩｇＧ１）重鎖定常領域のアミノ酸配列である。
配列番号３９は、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインのアミノ酸配列である。
配列番号４０は、ヒト免疫グロブリンγ−２重鎖定常領域のアミノ酸配列である。
配列番号４１は、ＩｇＧ２ Ｆｃドメインのアミノ酸配列である。
配列番号４２は、ヒト免疫グロブリンγ−４重鎖定常領域のアミノ酸配列である。
配列番号４３は、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインのアミノ酸配列である。
配列番号４４は、ペプチドリンカーのアミノ酸配列である。
配列番号４５は、ヒトＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの完全長アミノ酸配列である。
配列番号４６は、野生型ヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインのアミノ酸配列である（配列番号４５の１９〜１３４）。
配列番号４７は、ヒトＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの完全長アミノ酸配列である。
配列番号４８は、野生型ヒトＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインのアミノ酸配列である（配列番号４７の２０〜１３５）。
配列番号４９は、ＡｃｔＲＩＩＢ天然シグナルペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号５０は、免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号５１〜１１７は、様々なハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１１８は、ペプチドリンカーのアミノ酸配列である。
配列表
切断型野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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切断型野生型ＡｃｔＲＩＩＡ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−０００１）
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−０００２）
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−０００３）
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−０００４）
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−０００５）
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−０００６）
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−０００７）
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−０００８）
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−０００９）
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−００１０）
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−００１１）
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−００１２）
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−００１３）
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−００１４）
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−００１５）
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−００１６）
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−００１７）
ＥＴＱＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＫＤＲＴＮＱＴＧＬＥＲＣＥＧＥＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＥＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＲＦＴＨＬＰＥＡＧＧＰＥＶＴＹＥＰＰＰＴＡＰＴ（配列番号１９）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−００１８）
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−００１９）
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＫＤＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＥＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＥＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＲＦＴＨＬＰＥＡＧＧＰＥＶＴＹＥＰＰＰＴＡＰＴ（配列番号２１）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−００２０）
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−００２１）
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−００２２）
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＹＧＤＫＤＫＲＲＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＩＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＥＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＲＦＴＨＬＰＥＡＧＧＰＥＶＴＹＥＰＰＰＴＡＰＴ（配列番号２４）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−００２３）
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−００２４）
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−００２５）
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＥＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＩＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＫＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＲＦＴＨＬＰＥＡＧＧＰＥＶＴＹＥＰＰＰＴＡＰＴ（配列番号２７）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−００２６）
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＤＫＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＩＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＫＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＲＦＴＨＬＰＥＡＧＧＰＥＶＴＹＥＰＰＰＴＡＰＴ（配列番号２８）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−００２７）
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＤＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＩＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＫＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＲＦＴＨＬＰＥＡＧＧＰＥＶＴＹＥＰＰＰＴＡＰＴ（配列番号２９）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−００２８）
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＤＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＫＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＲＦＴＨＬＰＥＡＧＧＰＥＶＴＹＥＰＰＰＴＡＰＴ（配列番号３０）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−００２９）
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−００３０）
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−００３１）
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−００３２）
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−００３３）
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＥＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＴＤＣＶＡＴＥＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＲＦＴＨＬＰＥＡＧＧＰＥＶＴＹＥＰＰＰＴＡＰＴ（配列番号３５）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−００３４）
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＥＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＥＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＭＣＮＥＲＦＴＨＬＰＥＡＧＧＰＥＶＴＹＥＰＰＰＴＡＰＴ（配列番号３６）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ（ＡＧ−００３５）
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＤＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＩＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＥＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＲＦＴＨＬＰＥＡＧＧＰＥＶＴＹＥＰＰＰＴＡＰＴ（配列番号３７）
ヒト免疫グロブリンγ−１重鎖定常領域
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３８）
ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン
ＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３９）
ヒト免疫グロブリンγ−２重鎖定常領域
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ＩｇＧ２ Ｆｃドメイン
ＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４１）
ヒト免疫グロブリンγ−４重鎖定常領域
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥ ＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号４２）
ＩｇＧ４ Ｆｃドメイン
ＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号４３）
ペプチドリンカー配列
ＧＧＧＧＳ（配列番号４４）
ヒトＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの完全長アミノ酸配列
ＭＴＡＰＷＶＡＬＡＬＬＷＧＳＬＣＡＧＳＧＲＧＥＡＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＥＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＥＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＲＦＴＨＬＰＥＡＧＧＰＥＶＴＹＥＰＰＰＴＡＰＴＬＬＴＶＬＡＹＳＬＬＰＩＧＧＬＳＬＩＶＬＬＡＦＷＭＹＲＨＲＫＰＰＹＧＨＶＤＩＨＥＤＰＧＰＰＰＰＳＰＬＶＧＬＫＰＬＱＬＬＥＩＫＡＲＧＲＦＧＣＶＷＫＡＱＬＭＮＤＦＶＡＶＫＩＦＰＬＱＤＫＱＳＷＱＳＥＲＥＩＦＳＴＰＧＭＫＨＥＮＬＬＱＦＩＡＡＥＫＲＧＳＮＬＥＶＥＬＷＬＩＴＡＦＨＤＫＧＳＬＴＤＹＬＫＧＮＩＩＴＷＮＥＬＣＨＶＡＥＴＭＳＲＧＬＳＹＬＨＥＤＶＰＷＣＲＧＥＧＨＫＰＳＩＡＨＲＤＦＫＳＫＮＶＬＬＫＳＤＬＴＡＶＬＡＤＦＧＬＡＶＲＦＥＰＧＫＰＰＧＤＴＨＧＱＶＧＴＲＲＹＭＡＰＥＶＬＥＧＡＩＮＦＱＲＤＡＦＬＲＩＤＭＹＡＭＧＬＶＬＷＥＬＶＳＲＣＫＡＡＤＧＰＶＤＥＹＭＬＰＦＥＥＥＩＧＱＨＰＳＬＥＥＬＱＥＶＶＶＨＫＫＭＲＰＴＩＫＤＨＷＬＫＨＰＧＬＡＱＬＣＶＴＩＥＥＣＷＤＨＤＡＥＡＲＬＳＡＧＣＶＥＥＲＶＳＬＩＲＲＳＶＮＧＴＴＳＤＣＬＶＳＬＶＴＳＶＴＮＶＤＬＰＰＫＥＳＳＩ（配列番号４５）
野生型ヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号４５の１９〜１３４）
ＳＧＲＧＥＡＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＥＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＥＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＲＦＴＨＬＰＥＡＧＧＰＥＶＴＹＥＰＰＰＴＡＰＴ（配列番号４６）
ヒトＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの完全長アミノ酸配列
ＭＧＡＡＴＫＬＡＦＡＶＦＬＩＳＣＳＳＧＡＩＬＧＲＳＥＴＱＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＫＤＫＴＮＲＳＧＩＥＰＣＹＧＤＫＤＫＲＲＨＣＦＡＴＷＫＮＩＳＧＳＩＥＩＶＫＱＧＣＷＬＤＤＩＮＣＹＤＲＮＤＣＩＥＫＫＤＳＰＥＶＦＦＣＣＣＥＧＮＭＣＮＥＲＦＦＹＦＰＥＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰＬＦＮＴＬＬＹＳＬＶＰＩＭＧＩＡＶＩＶＬＦＳＦＷＭＹＲＨＨＫＬＡＹＰＰＶＬＶＰＴＱＤＰＧＰＰＰＰＳＰＬＭＧＬＫＰＬＱＬＬＥＩＫＡＲＧＲＦＧＣＶＷＫＡＱＬＬＮＥＹＶＡＶＫＩＦＰＩＱＤＫＱＳＷＱＮＥＹＥＩＹＳＬＰＧＭＫＨＤＮＩＬＱＦＩＧＡＥＫＲＧＴＳＩＤＶＤＬＷＬＩＴＡＦＨＥＫＧＳＬＴＤＦＬＫＡＮＶＶＳＷＮＥＬＣＨＩＡＱＴＭＡＲＧＬＡＹＬＨＥＤＩＰＧＬＫＤＧＨＫＰＡＩＳＨＲＤＩＫＳＫＮＶＬＬＫＮＮＬＴＡＣＩＡＤＦＧＬＡＬＫＦＥＡＧＫＳＡＧＤＴＨＧＱＶＧＴＲＲＹＭＡＰＥＶＬＥＧＡＩＮＦＱＲＤＡＦＬＲＩＤＭＹＡＭＧＬＶＬＷＥＬＡＳＲＣＴＡＳＤＧＰＶＤＥＹＭＬＰＦＥＥＥＩＧＱＨＰＳＬＥＤＭＱＥＶＶＶＨＫＫＫＲＰＶＬＲＥＣＷＱＫＨＳＧＭＡＭＬＣＥＴＩＥＥＣＷＤＨＤＡＥＡＲＬＳＡＧＣＶＥＥＲＩＩＱＭＱＫＬＴＮＩＩＴＴＥＤＩＶＴＶＶＴＭＶＴＮＶＤＦＰＰＫＥＳＳＬ（配列番号４７）
野生型ヒトＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメイン（配列番号４７の２０〜１３５）
ＡＩＬＧＲＳＥＴＱＥＣＬＦＦＮＡＮＷＥＫＤＲＴＮＱＴＧＶＥＰＣＹＧＤＫＤＫＲＲＨＣＦＡＴＷＫＮＩＳＧＳＩＥＩＶＫＱＧＣＷＬＤＤＩＮＣＹＤＲＴＤＣＶＥＫＫＤＳＰＥＶＹＦＣＣＣＥＧＮＭＣＮＥＫＦＳＹＦＰＥＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号４８）
ＡｃｔＲＩＩＢ天然シグナルペプチド：
ＭＴＡＰＷＶＡＬＡＬＬＷＧＳＬＣＡＧ（配列番号４９）
免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチド：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ（配列番号５０）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＱＥＣＬＦＦＮＡＮＷＥＫＤＲＴＮＱＳＧＶＥＰＣＥＧＥＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＥＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＲＦＴＨＬＰＥＡＧＧＰＥＶＴＹＥＰＰＰＴＡＰＴ（配列番号５２）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＱＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＹＧＤＫＤＫＲＲＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＩＮＣＹＤＲＴＤＣＶＥＫＫＤＳＰＥＶＹＦＣＣＣＥＧＮＭＣＮＥＲＦＴＨＬＰＥＡＧＧＰＥＶＴＹＥＰＰＰＴＡＰＴ（配列番号６７）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＱＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＹＧＤＫＤＫＲＲＨＣＦＡＴＷＫＮＩＳＧＳＩＥＩＶＫＱＧＣＷＬＤＤＩＮＣＹＤＲＴＤＣＶＥＫＫＤＳＰＥＶＹＦＣＣＣＥＧＮＭＣＮＥＲＦＴＨＬＰＥＡＧＧＰＥＶＴＹＥＰＰＰＴＡＰＴ（配列番号６８）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＹＧＤＫＤＫＲＲＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＳＩＥＩＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＴＤＣＶＡＴＥＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＲＦＴＨＬＰＥＡＧＧＰＥＶＴＹＥＰＰＰＴＡＰＴ（配列番号７７）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＹＧＤＫＤＫＲＲＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＳＩＥＩＶＫＱＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＴＤＣＶＡＴＥＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＲＦＴＨＬＰＥＡＧＧＰＥＶＴＹＥＰＰＰＴＡＰＴ（配列番号７８）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＥＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＳＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＥＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＫＦＳＹＦＰＱＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号８８）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＥＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＩＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＥＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＫＦＳＹＦＰＱＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号８９）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
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ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＥＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＥＴＥＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＫＦＳＹＦＰＱＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号９１）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＥＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＫＥＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＫＦＳＹＦＰＱＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号９２）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＥＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＫＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＫＦＳＹＦＰＱＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号９３）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＥＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＥＤＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＫＦＳＹＦＰＱＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号９４）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＥＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＥＥＳＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＫＦＳＹＦＰＱＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号９５）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＥＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＥＥＮＰＥＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＫＦＳＹＦＰＱＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号９６）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＤＫＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＥＴＥＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＫＦＳＹＦＰＱＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号９７）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＥＫＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＫＥＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＫＦＳＹＦＰＱＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号９８）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＤＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＫＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＫＦＳＹＦＰＱＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号９９）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＤＫＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＱＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＫＫＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＫＦＳＹＦＰＱＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号１００）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＤＫＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＩＶＫＱＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＥＫＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＫＦＳＹＦＰＱＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号１０１）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＹＧＤＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＳＩＥＩＶＫＱＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＫＫＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＫＦＳＹＦＰＱＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号１０２）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＥＫＤＫＲＲＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＩＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＫＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＫＦＳＹＦＰＱＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号１０３）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＹＧＤＱＤＫＲＲＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＥＥＮＰＥＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＫＦＳＹＦＰＱＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号１０４）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＥＱＤＫＲＲＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＥＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＫＦＳＹＦＰＱＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号１０５）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＹＧＥＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＳＩＥＩＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＴＤＣＶＡＴＥＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＫＦＳＹＦＰＱＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号１０６）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＥＱＤＫＲＲＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＳＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＫＥＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＫＦＳＹＦＰＱＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号１０７）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＥＱＤＫＲＲＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＩＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＫＥＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＫＦＳＹＦＰＱＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号１０８）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＥＱＤＫＲＲＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＳＩＥＩＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＫＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＫＦＳＹＦＰＱＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号１０９）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＤＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＩＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＫＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＫＦＳＹＦＰＱＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号１１０）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＤＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＳＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＫＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＫＦＳＹＦＰＱＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号１１１）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＤＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＫＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＫＦＳＹＦＰＱＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号１１２）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＥＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＩＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＫＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＫＦＳＹＦＰＱＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号１１３）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＥＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＫＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＫＦＳＹＦＰＱＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号１１４）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＥＧＤＱＤＫＲＬＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＩＶＫＫＧＣＷＬＤＤＦＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＫＫＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＫＦＳＹＦＰＱＭＥＶＴＱＰＴＳＮＰＶＴＰＫＰＰ（配列番号１１５）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＱＥＣＬＦＦＮＡＮＷＥＫＤＲＴＮＱＴＧＶＥＰＣＹＧＤＫＤＫＲＲＨＣＦＡＴＷＫＮＩＳＧＳＩＥＩＶＫＱＧＣＷＬＤＤＩＮＣＹＤＲＴＤＣＶＥＫＫＤＳＰＥＶＹＦＣＣＣＥＧＮＭＣＮＥＲＦＴＨＬＰＥＡＧＧＰＥＶＴＹＥＰＰＰＴＡＰＴ（配列番号１１６）
ハイブリッドｈｕ−ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤ
ＥＴＲＥＣＩＹＹＮＡＮＷＥＬＥＲＴＮＱＳＧＬＥＲＣＹＧＤＫＤＫＲＲＨＣＹＡＳＷＲＮＳＳＧＴＩＥＬＶＫＫＧＣＷＬＤＤＩＮＣＹＤＲＱＥＣＶＡＴＫＥＮＰＱＶＹＦＣＣＣＥＧＮＦＣＮＥＲＦＴＨＬＰＥＡＧＧＰＥＶＴＹＥＰＰＰＴＡＰＴ（配列番号１１７）
ペプチドリンカー配列
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号１１８）

Claims (39)

  1. 治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含み、このような投与が、筋肉量の低下及び／または筋機能の喪失を軽減する、対象における筋消耗を治療または予防する方法。
  2. 前記筋消耗が、筋ジストロフィー（ＤＭＤ、ベッカー型ＭＤ、肢帯型ＭＤ、筋強直性ＭＤ及びＦＳＨＤなど）、筋炎、ミオパチー（遺伝性ミオパチー及び後天性ミオパチーを含む）、運動ニューロン疾患（ルー・ゲーリック病またはＡＬＳなど）、及び神経変性疾患（パーキンソン病、ハンチントン病及びアルツハイマー病など）からなる群から選択される疾患と関連する、請求項１に記載の方法。
  3. 治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含み、このような投与が、筋肉量の低下及び／または筋機能の喪失を軽減する、対象における骨疾患を治療または予防する方法。
  4. 前記骨疾患が、骨粗鬆症、骨軟化症、骨形成不全症、進行性骨化性線維異形成症、コルチコステロイド誘発性骨量減少、骨折、及び骨転移からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
  5. 治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含み、このような投与が、筋肉量の低下及び／または筋機能の喪失を軽減する、対象における代謝異常を治療または予防する方法。
  6. 前記代謝異常が、肥満症、脂質異常症、サルコペニア肥満、非アルコール性脂肪性肝炎などの非アルコール性脂肪肝疾患、アルコール性脂肪肝疾患、インスリン抵抗性、糖尿病、及びメタボリックシンドローム、ならびに糖尿病性ミオパチー、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、及びヘモクロマトーシスからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
  7. 治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含み、このような投与が、筋肉量の低下及び／または筋機能の喪失を軽減する、対象における線維症を治療または予防する方法。
  8. 前記線維症が、間質性肺疾患、イディオタイプ肺線維症、嚢胞性線維症、肝線維症、硬変、心臓線維症、腎線維症、骨髄線維症、特発性後腹膜線維症、腎性線維化性皮膚症、炎症性腸疾患、ケロイド、強皮症、及び関節線維症からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
  9. 治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含み、このような投与が、筋肉量の低下及び／または筋機能の喪失を軽減する、対象における自己免疫／炎症性疾患を治療または予防する方法。
  10. 前記疾患が、多発性硬化症、全身性硬化症、糖尿病（１型）、糸球体腎炎、重症筋無力症、乾癬、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び原発性胆汁性肝硬変などの自己免疫疾患からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
  11. 治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含み、このような投与が、筋肉量の低下及び／または筋機能の喪失を軽減する、対象における心血管疾患の治療方法。
  12. 前記心血管疾患が、心不全、心臓萎縮、高血圧、心筋炎、冠動脈疾患、心筋梗塞、心臓不整脈、心臓弁膜症、心筋症、心膜疾患、大動脈疾患、及びマルファン症候群からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
  13. 治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含み、このような投与が、筋肉量の低下及び／または筋機能の喪失を軽減する、対象におけるがんまたはがん転移を治療または予防する方法。
  14. 前記がんが、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、大腸癌、黒色腫、白血病、骨髄異形成症候群、肺癌、前立腺癌、脳腫瘍、膀胱癌、頭頸部癌、及び横紋筋肉腫からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
  15. 治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含み、このような投与が、筋肉量の低下及び／または筋機能の喪失を軽減する、対象における慢性腎臓病（ＣＫＤ）を治療または予防する方法。
  16. 前記ＣＫＤが、腎不全、間質性線維症、及び腎臓透析を含むＣＫＤ、ならびにＣＫＤに関連するタンパク質エネルギー障害（ＰＥＷ）からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
  17. 治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含み、このような投与が、筋肉量の低下及び／または筋機能の喪失を軽減する、対象における関節炎を治療または予防する方法。
  18. 前記関節炎が、関節リウマチ及び変形性関節症からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
  19. 治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含み、このような投与が、筋肉量の低下及び／または筋機能の喪失を軽減する、対象における食欲不振を治療または予防する方法。
  20. 前記食欲不振が、神経性食思不振症及び食欲不振悪液質症候群から選択される、請求項１９に記載の方法。
  21. 治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含み、このような投与が、筋肉量の低下及び／または筋機能の喪失を軽減する、対象における肝疾患を治療または予防する方法。
  22. 前記肝疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎、肝線維症または肝硬変、肝不全、自己免疫性肝炎、及び肝細胞癌からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
  23. 治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含み、このような投与が、筋肉量の低下及び／または筋機能の喪失を軽減する、対象における臓器または組織の移植方法。
  24. 前記移植が、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、腸及び胸腺の臓器移植、ならびに骨、腱、角膜、皮膚、心臓弁、神経及び血管の組織移植からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
  25. 治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含み、このような投与が、筋肉量の低下及び／または筋機能の喪失を軽減する、対象における貧血を治療または予防する方法。
  26. 前記貧血が、鉄欠乏性貧血、鉄過剰症、サラセミア、溶血性貧血、鎌状赤血球貧血、悪性貧血、ファンコニ貧血、及び再生不良性貧血（がん関連貧血及び化学療法誘発性貧血など）からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
  27. 治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含み、このような投与が、筋肉量の低下及び／または筋機能の喪失を軽減する、対象における疼痛の治療方法。
  28. 前記疼痛が、神経障害性疼痛、体性痛、内臓痛、炎症性疼痛、がん疼痛、背部痛、及び関節痛からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
  29. 治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含み、このような投与が、筋肉量の低下及び／または筋機能の喪失を軽減する、対象における老化の治療方法。
  30. 前記老化状態が、高齢者のフレイル、加齢性サルコペニア、及び変形性関節症からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
  31. 治療上有効量の本開示のハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップを薬学的に許容可能なキャリアと混合して対象に投与すること（単剤療法としてまたは併用療法レジメンとして）を含み、このような投与が、筋肉量の低下及び／または筋機能の喪失を軽減する、対象における組織修復または臓器再生のための幹細胞成長を誘導する方法。
  32. 前記幹細胞が、筋幹（サテライト）細胞、心臓幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞及び多能性幹細胞からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質が、アミノ酸残基Ｒ３、Ｉ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｓ２０、Ｌ２２、Ｒ２４、Ｅ２６、Ｅ２８、Ｑ２９、Ｌ３３、Ｌ４８、Ｙ３６、Ｓ３８、Ｒ４０、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｋ５１、Ｆ５８、Ｑ６４、Ｅ６５、Ａ６８、Ｔ６９、Ｅ７０、Ｅ７１、Ｎ７２、Ｑ７４、Ｆ８４、Ｒ８８、Ｔ９０、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｅ９４、Ａ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｐ９８、Ｅ９９、Ｖ１００、Ｙ１０２、Ｅ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１０６、Ｔ１０７、Ａ１０８またはＴ１１０の少なくとも１個が別のアミノ酸で置換されている配列番号１のアミノ酸配列を有するハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含み、前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドが、ミオスタチン及びアクチビンＡに結合可能であるが、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドと比較してＢＭＰ９に対する結合親和性が減少している、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、及び配列番号１１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップタンパク質が、前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドに連結した配列番号３９、配列番号４１、及び配列番号４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するヒトＦｃドメインを含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記ヒトＦｃドメインを前記ハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドに連結するために、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有するリンカーが、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を有するヒンジリンカーと共に使用される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップが、配列番号３９、配列番号４１及び配列番号４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するヒトＦｃドメインに結合した配列番号１６及び配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップが、配列番号４３のアミノ酸配列を有するヒトＦｃドメインに結合した配列番号１６のアミノ酸配列を有するハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記ハイブリッドＡｃｔＲＩＩＢリガンドトラップが、配列番号４３のアミノ酸配列を有するヒトＦｃドメインに結合した配列番号２９のアミノ酸配列を有するハイブリッド可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ＥＣＤポリペプチドを含む、請求項３７に記載の方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023518260A (ja) * 2020-03-20 2023-04-28 ケロス セラピューティクス インコーポレイテッド アクチビン受容体ｉｉ型キメラ及びその使用方法

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6810702B2 (ja) 2015-04-06 2021-01-06 アクセルロン ファーマ インコーポレイテッド シングルアームｉ型およびｉｉ型受容体融合タンパク質およびその使用
MA41919A (fr) 2015-04-06 2018-02-13 Acceleron Pharma Inc Hétéromultimères alk4:actriib et leurs utilisations
CN114736307A (zh) 2015-04-06 2022-07-12 阿塞勒隆制药公司 TGF-β超家族I型和II型受体异多聚体及其用途
US11267865B2 (en) 2016-10-05 2022-03-08 Acceleron Pharma Inc. Variant ActRIIB proteins and uses thereof
WO2018067879A1 (en) 2016-10-05 2018-04-12 Acceleron Pharma Inc. Alk4:actriib heteromultimers and uses thereof
JOP20190085A1 (ar) 2016-10-20 2019-04-17 Biogen Ma Inc طرق علاج الضمور العضلي ومرض العظام باستخدام بروتينات احتجاز مركب ترابطي actriib هجين حديثة
US11013785B2 (en) 2016-11-10 2021-05-25 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type IIA variants and methods of use thereof
EP4428147A3 (en) 2017-11-09 2024-10-30 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type iia variants and methods of use thereof
AU2019206634B2 (en) 2018-01-12 2024-06-27 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type IIB variants and methods of use thereof
CA3098679A1 (en) 2018-05-09 2019-11-14 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type iia variants and methods of use thereof
BR112022015387A2 (pt) * 2020-02-03 2022-10-11 Acceleron Pharma Inc Proteínas actriib variantes e usos das mesmas
EP4121088A4 (en) * 2020-03-20 2024-07-03 Keros Therapeutics, Inc. Methods of using activin receptor type iib variants
WO2021189006A1 (en) * 2020-03-20 2021-09-23 Keros Therapeutics, Inc. Methods of using activin receptor type iia variants
KR20230003502A (ko) * 2020-04-13 2023-01-06 셀진 코포레이션 Actriib 리간드 트랩 및 페드라티닙을 사용한 빈혈 치료 방법
WO2022150590A1 (en) * 2021-01-08 2022-07-14 Acceleron Pharma Inc. Compositions and methods for treating pulmonary hypertension
EP4653010A1 (en) * 2024-05-14 2025-11-26 35Pharma Inc. Activin receptor type iib traps for use in improving body composition

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008507288A (ja) * 2004-07-23 2008-03-13 アクセルロン ファーマ インコーポレーテッド ＡｃｔＲＩＩ受容体ポリペプチド、方法、および組成物
US20110038831A1 (en) * 2008-08-14 2011-02-17 Acceleron Pharma Inc. Combined use of gdf traps and erythropoietin receptor activators to increase red blood cell levels
US20110070233A1 (en) * 2009-09-09 2011-03-24 Acceleron Pharma Inc. Actriib antagonists and dosing and uses thereof
JP2013510090A (ja) * 2009-11-03 2013-03-21 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド 脂肪肝疾患を処置するための方法
JP6959487B2 (ja) * 2015-04-22 2021-11-02 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． 筋消耗疾患治療用の新規なハイブリッドａｃｔｒｉｉｂリガンド捕集タンパク質

Family Cites Families (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
WO1990014363A1 (en) 1989-05-19 1990-11-29 Amgen Inc. Metalloproteinase inhibitor
US5885794A (en) 1991-05-10 1999-03-23 The Salk Institute For Biological Studies Recombinant production of vertebrate activin receptor polypeptides and identification of receptor DNAs in the activin/TGF-β superfamily
US6891082B2 (en) 1997-08-01 2005-05-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor
US6656475B1 (en) 1997-08-01 2003-12-02 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor receptors, agonists and antagonists thereof, and methods of using same
CA2359242C (en) 1999-01-21 2009-12-08 Metamorphix, Inc. Growth differentiation factor inhibitors and uses therefor
JP4487376B2 (ja) 2000-03-31 2010-06-23 味の素株式会社 腎疾患治療剤
BR0207854A (pt) 2001-03-07 2004-08-24 Merck Patent Gmbh Tecnologia de expressão para proteìnas contendo uma porção de anticorpo de isotipo hìbrido
AU2012204098B2 (en) 2001-04-24 2014-05-15 The Johns Hopkins University Use of follistatin to increase muscle mass
US7737260B2 (en) 2003-11-13 2010-06-15 Hanmi Pharm. Co., Ltd Protein complex using an immunoglobulin fragment and method for the preparation thereof
US20040223966A1 (en) 2002-10-25 2004-11-11 Wolfman Neil M. ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor
JP5110877B2 (ja) 2003-06-02 2012-12-26 ワイス・エルエルシー 神経筋障害を処置するための、コルチコステロイドと組み合わせたミオスタチン（ｇｄｆ８）インヒビターの使用
AU2015200950B2 (en) 2004-07-23 2017-04-27 Acceleron Pharma Inc. ActRII receptor polypeptides, methods and compositions
JP2008509927A (ja) 2004-08-12 2008-04-03 ワイス Ｇｄｆ−８阻害剤を使用する、糖尿病、肥満、および心臓血管疾患のための併用療法
US8067562B2 (en) 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
US9844528B2 (en) 2006-08-24 2017-12-19 University Of Tennessee Research Foundation SARMs and method of use thereof
US20100028332A1 (en) 2006-12-18 2010-02-04 Acceleron Pharma Inc. Antagonists of actriib and uses for increasing red blood cell levels
ME02335B (me) 2006-12-18 2013-04-30 Acceleron Pharma Inc Activin-actrii antagonisti i upotreba za liječenje anemije
TW201803890A (zh) 2007-02-02 2018-02-01 艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
US8501678B2 (en) * 2007-03-06 2013-08-06 Atara Biotherapeutics, Inc. Variant activin receptor polypeptides and uses thereof
TW201718635A (zh) * 2007-03-06 2017-06-01 安美基公司 變異之活動素受體多肽及其用途
EP2207562B1 (en) 2007-09-18 2017-05-31 Acceleron Pharma, Inc. Activin-actriia antagonists and uses for decreasing or inhibiting fsh secretion
PE20091163A1 (es) 2007-11-01 2009-08-09 Wyeth Corp Anticuerpos para gdf8
KR20220002710A (ko) 2008-06-26 2022-01-06 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈-ａｃｔｒｉｉａ 길항물질을 투약하는 방법 및 치료된 환자의 모니터링
EP2318028B1 (en) 2008-06-26 2020-02-19 Acceleron Pharma Inc. Antagonists of soluble activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
PL3494986T3 (pl) 2008-08-14 2020-11-16 Acceleron Pharma Inc. Pułapki GDF
CN102245634B (zh) 2008-11-26 2014-10-08 安姆根有限公司 激活素iib受体多肽的变异体及其用途
CA2749544A1 (en) 2009-01-13 2010-07-22 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin
CA2758290C (en) 2009-04-27 2018-04-10 Novartis Ag Antagonistic activin receptor iib (actriib) antibodies for increasing muscle growth
JP5912078B2 (ja) 2009-06-08 2016-04-27 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド 熱発生性脂肪細胞を増加させるための方法
JP2012529294A (ja) 2009-06-12 2012-11-22 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド 切断型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質
KR20200124322A (ko) 2009-08-13 2020-11-02 악셀레론 파마 인코포레이티드 적혈구 수준을 증가시키기 위한 ｇｄｆ 트랩과 에리트로포이에틴 수용체 활성인자의 병용
CA2781152A1 (en) 2009-11-17 2011-05-26 Acceleron Pharma Inc. Actriib proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy
US20110268736A1 (en) 2010-04-30 2011-11-03 Children's Medical Center Corporation Method for treating congenital myopathy
WO2012027065A2 (en) 2010-08-27 2012-03-01 Celgene Corporation Combination therapy for treatment of disease
BR122019023174B1 (pt) 2011-10-17 2021-02-23 Acceleron Pharma, Inc Uso de um polipeptídeo para a fabricação de um medicamento paratratar anemia associada à esplenomegalia
US8765385B2 (en) 2011-10-27 2014-07-01 Ravindra Kumar Method of detection of neutralizing anti-actriib antibodies
AU2012339722B2 (en) 2011-11-14 2017-09-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for increasing muscle mass and muscle strength by specifically antagonizing GDF8 and/or Activin A
GR1007832B (el) * 2011-11-21 2013-02-14 Ιδρυμα Ιατροβιολογικων Ερευνων Ακαδημιας Αθηνων, Αδρανοποιητες της ακτιβινης και χρηση τους για την θεραπεια ασθενειων που σχετιζονται με παρεκκλινουσα ενεργοποιηση της "αμυντικης αποκρισης του ξενιστη"
KR20140108562A (ko) 2011-12-19 2014-09-11 암젠 인코퍼레이티드 변이체 액티빈 수용체 폴리펩티드 단독 또는 화학 치료법과의 결합, 및 그들의 용도
US9809636B2 (en) 2012-04-06 2017-11-07 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing red blood cell levels comprising administering BMP9
ES2753811T3 (es) 2012-10-24 2020-04-14 Celgene Corp Biomarcador para uso en el tratamiento de anemia
NZ707477A (en) 2012-11-02 2019-09-27 Celgene Corp Activin-actrii antagonists and uses for treating bone and other disorders
US20140220033A1 (en) 2013-02-01 2014-08-07 Santa Maria Biotherapeutics, Inc. Administration of an Anti-Activin-A Compound to a Subject
KR20150136061A (ko) 2013-02-01 2015-12-04 산타 마리아 바이오테라퓨틱스, 인코포레이티드 대상에 항-액티빈-a 화합물의 투여
US20160046690A1 (en) 2014-03-21 2016-02-18 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating ineffective erythropoiesis
WO2015161220A1 (en) 2014-04-18 2015-10-22 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating sickle-cell disease
MX2016016281A (es) 2014-06-13 2017-03-31 Santa Maria Biotherapeutics Inc Polipeptidos receptores formulados y metodos relacionados.
TN2016000553A1 (en) 2014-06-13 2018-04-04 Acceleron Pharma Inc Methods and compositions for treating ulcers
US20160075772A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva
EP4233889A3 (en) 2014-12-03 2023-10-11 Celgene Corporation Activin-actrii antagonists and uses for treating myelodysplastic syndrome
MA41919A (fr) * 2015-04-06 2018-02-13 Acceleron Pharma Inc Hétéromultimères alk4:actriib et leurs utilisations
CN114736307A (zh) 2015-04-06 2022-07-12 阿塞勒隆制药公司 TGF-β超家族I型和II型受体异多聚体及其用途
ES3028883T3 (en) 2015-08-31 2025-06-20 Nat Res Council Canada Tgf-beta-receptor ectodomain fusion molecules and uses thereof
US11123430B2 (en) 2015-11-04 2021-09-21 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating ineffective erythropoiesis
WO2017091706A1 (en) 2015-11-23 2017-06-01 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating eye disorders
US11185569B2 (en) * 2016-05-04 2021-11-30 University Of Cincinnati ActRIIB:Fc to treat infertility in females
NZ789269A (en) 2016-06-13 2026-01-30 Scholar Rock Inc Use of myostatin inhibitors and combination therapies
US11267865B2 (en) * 2016-10-05 2022-03-08 Acceleron Pharma Inc. Variant ActRIIB proteins and uses thereof
JOP20190085A1 (ar) 2016-10-20 2019-04-17 Biogen Ma Inc طرق علاج الضمور العضلي ومرض العظام باستخدام بروتينات احتجاز مركب ترابطي actriib هجين حديثة
AU2019206634B2 (en) * 2018-01-12 2024-06-27 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type IIB variants and methods of use thereof

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008507288A (ja) * 2004-07-23 2008-03-13 アクセルロン ファーマ インコーポレーテッド ＡｃｔＲＩＩ受容体ポリペプチド、方法、および組成物
US20100267133A1 (en) * 2004-07-23 2010-10-21 Acceleron Pharma Inc. Acrtiib-fc polynucleotides, polypeptides, and compositions
US20110038831A1 (en) * 2008-08-14 2011-02-17 Acceleron Pharma Inc. Combined use of gdf traps and erythropoietin receptor activators to increase red blood cell levels
US20110070233A1 (en) * 2009-09-09 2011-03-24 Acceleron Pharma Inc. Actriib antagonists and dosing and uses thereof
JP2013510090A (ja) * 2009-11-03 2013-03-21 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド 脂肪肝疾患を処置するための方法
JP6959487B2 (ja) * 2015-04-22 2021-11-02 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． 筋消耗疾患治療用の新規なハイブリッドａｃｔｒｉｉｂリガンド捕集タンパク質
JP2022000027A (ja) * 2015-04-22 2022-01-04 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドBiogen MA Inc. 筋消耗疾患治療用の新規なハイブリッドａｃｔｒｉｉｂリガンド捕集タンパク質

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CELL, vol. 142, JPN6021044178, 2010, pages 531 - 543, ISSN: 0004635084 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023518260A (ja) * 2020-03-20 2023-04-28 ケロス セラピューティクス インコーポレイテッド アクチビン受容体ｉｉ型キメラ及びその使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20220332791A1 (en) 2022-10-20
IL266032A (en) 2019-06-30
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KR20190071758A (ko) 2019-06-24
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