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JP2019511911A - Ｔｇｆベータ２抗体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、抗トランスフォーミング増殖因子ベータ２（ＴＧＦ−β２）抗体の分野に属する。特に、本発明は、ヒトＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β３アイソフォームより優先的にヒトＴＧＦ−β２アイソフォームに結合するヒトモノクローナル抗体を提供する。

Description

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、ここに参照により完全に組み込まれる配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１７年２月１３日に作製され、ＰＡＴ０５７２０６−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＬ．ＴＸＴと名付けられ、サイズは１６２，０７１バイトである。
本発明は、抗トランスフォーミング増殖因子ベータ２（ＴＧＦ−β２）抗体に関する。特に、本発明は、ヒトＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β３アイソフォームより優先的にヒトＴＧＦ−β２アイソフォームに結合するヒトモノクローナル抗体を提供する。
トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのメンバーは、様々な病的状態、例えば線維形成、瘢痕化、がん（Growth Factors. 2011 Aug;29(4):140-52）、マルファン関連状態（米国特許第８，５９７，６４６号）および表皮水疱症のような特定の状態に関連したサイトカインである。米国特許第５，５７１，７１４号は、悪性腫瘍および転移がんの処置における抗ＴＧＦβ抗体の使用を開示する。抗ＴＧＦβ抗体は多数の疾患の処置で使用されてきた、例えば：肺線維形成（S.N. Giri et al. Thorax 48, 959-966, 1993）；神経性瘢痕化（A. Logan et al. Eur. J. Neurosci. 6, 355-363, 1994）；動脈損傷（Y.G. Wolf, L.M. Rasmussen & E. Ruoslahti J. Clin. Invest. 93, 1172-1178, 1994）；糸球体腎炎（W.A Border et al. Nature 346, 371-374, 1990）；慢性関節リウマチ（Wahl et al J. Exp. Medicine 177, 225-230, 1993）および皮膚の瘢痕化（M. Shah et al. Lancet 339, 213-214 1992；M.Shah et al. J.Cell Science 107, 1137-1157, 1994；M. Shah et al. 108, 985-1002, 1995）。したがって、ＴＧＦ−β活性を標的にすることは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（Curr Pharm Biotechnol. 2011 Dec;12(12):2203-13.）、ＴＧＦ−β受容体キナーゼの小分子阻害剤（例えば、ＴＧＦ−β受容体Ｉ型およびＩＩ型を標的にするＬＹ２１０９７６１（Mol Cancer Ther 2008 7; 829））、それらの天然のリガンドを捕捉する可溶性受容体外部ドメイン、およびモノクローナル抗体（Growth Factors. 2011 Aug;29(4):140-52；国際公開第９７１３８４４号で総論されている）を含む異なるアプローチを使用した研究の活動領域である。
トランスフォーミング増殖因子ベータ２（ＴＧＦ−β２）は、ＴＧＦ−βタンパク質ファミリーの３０を超えるメンバーのうちの１メンバーである。それは、ＴＧＦ−β１／３アイソフォームに緊密に関係している。全てのＴＧＦ−β前駆体タンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド、大きなプロペプチドセグメントおよびＣ末端ポリペプチドからなる。後者は二量体化して、ＴＧＦ−β２と呼ばれる、活性のある成熟したＴＧＦ−β２タンパク質を形成する。成熟したＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３の間の相同性は比較的高い（７１〜７９％）が、プロペプチドセグメントは著しく保存されていない（４３〜５４％の相同性）。さらに、他のＴＧＦ−βファミリータンパク質へのＴＧＦ−β２の相同性はわずか３３％未満であるが、ヒト、カニクイザルおよびマウスを含む様々な種からのＴＧＦ−β２の間で非常に高い相同性が観察される（９５〜１００％）。
最も広く記載されたＴＧＦ−βシグナル伝達経路はＴＧＦ−βＩＩ型受容体、ＡＬＫ５およびＳｍａｄ２／３を介したものであるが、ＡＬＫ−およびＳｍａｄ非依存性経路を含む多くの他の経路が立証されている。大多数の市販されているＴＧＦ−β抗体は、非ヒト種に由来するポリクローナル抗体、またはウエスタンブロット分析で使用するためのＴＧＦ−β１特異的ＭＡＢ２４０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標）による）などのマウスモノクローナル抗体である（J Immunol Methods. 1999 May 27;225(1-2):87-93）。ヒトの臨床試験で使用するための抗体は、ツール抗体と異なる必要条件を満たさなければならない。重大な必要条件は、キメラ、ヒト化、または完全ヒト抗体の使用による潜在的免疫原性の低減である。以下を含む、これらの必要条件を満たす臨床開発途上のいくつかのＴＧＦ−βアイソフォーム抗体がある：
１．ＴＧＦ−βアイソフォーム１、２および３を中和する完全ヒトモノクローナル抗体ＧＣ１００８（フレソリムマブ）、
２．ＴＧＦ−β１を中和する抗体ＬＹ２３８２７７０、
３．ＴＧＦ−β１を中和する抗体ＣＡＴ−１９２（メテリムマブ）、および
４．抗体ＣＡＴ−１５２（レルデリムマブ、６Ｂ１としても知られる）は、ＴＧＦ−β２に高い親和性を、およびＴＧＦ−β３と交差反応性を有する（上の全ては、Growth Factors. 2011 Aug;29(4):140-52で総論されている）。
ＣＡＴ−１５２：ＣＡＴ−１５２は、ＴＧＦ−β２（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムの解離定数０．８９ｎＭ）に親和性を有し、ＴＧＦ−β３（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムの解離定数１０ｎＭ）と９％交差反応性を有するが、ＴＧＦ−β１への検出可能な結合を示さない、完全ヒトＩｇＧ４抗体である（J Immunol Methods. 1999 Jul 30;227(1-2):17-29；Drugs R&D 2002; 3 (2):106-108；国際公開第９７１３８４４号）。ＣＡＴ−１５２は、線維柱帯切除術としても知られる緑内障排液手術の補助的手段として開発された（Drugs R&D 2002; 3 (2):106-108）。しかし、ＣＡＴ−１５２は、フェーズＩＩＩ治験において初回の線維柱帯切除術の後にある特定の緑内障患者で線維形成の進行を予防することができなかった（Ophthalmology. 2007 Oct; 114(10):1822-30）。
ＣＡＴ−１９２：ＴＧＦ−β１特異的組換えヒト抗体ＣＡＴ−１９２は、初期の散在性皮膚全身性硬化症の処置を調査したフェーズＩ／ＩＩ治験において、効力の証拠を示すことができなかった（Arthritis Rheum. 2007 Jan;56(1):323-33）。さらに、その治験でプラセボを受けた患者よりＣＡＴ−１９２を受けた患者でより多くの有害事象が観察された。これらの所見は、活性ＴＧＦ−β１の低下したレベルが、多臓器炎症、表皮のランゲルハンス細胞の欠如および腫瘍の発達と関連することを示す、突然変異体マウスモデルで得られた結果によってさらに裏付けられる（Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Dec 2;105(48)）。
３つの緊密に関連したＴＧＦ−β１／２／３アイソフォームの存在は、有害であるかまたは望ましくない事象と関連する可能性のある他の経路に対するいかなる干渉も回避するために、ヒトでそれらのタンパク質の特異的検出および中和を可能にする化合物の必要性を発生させる。より具体的には、これは、ＴＧＦ−β２を効果的に中和し、ＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β３より優先的なＴＧＦ−β２の結合および中和を示す、アイソフォーム特異的抗ＴＧＦ−β２治療抗体への強力な医学的必要性を発生させる。理想的には、高い結合親和性は効力の増加およびより低い投与必要量と関連し、効能の強化、安全性およびより低い費用に寄与するので、ＴＧＦ−β２抗体の特異性は高い結合親和性と組み合わされる（MAbs. 2012 May-Jun;4(3):341-8）。モノクローナル抗体は、疾患機構における非常にタイトなタンパク質間相互作用を破壊するために、非常に低い（例えば、ピコモルの）解離定数を必要とすることがしばしばある（MAbs. 2012 May-Jun;4(3):341-8）。これは、非常に低いピコモルの解離定数を示すアイソフォーム特異的ＴＧＦ−β２治療抗体への強力な医学的必要性を発生させるが、それも本発明によって解決される。
本開示のある特定の実施形態は、以下の態様で記載される：
１．ヒトＴＧＦ−βアイソフォームＴＧＦ−β２を中和し、ヒトアイソフォームＴＧＦ−β３を中和しない、ヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片。
２．ヒトＴＧＦ−βアイソフォームＴＧＦ−β２を中和し、ヒトアイソフォームＴＧＦ−β３およびＴＧＦ−β１を中和しない、態様１による抗体またはその機能的断片。
３．中和はＳｍａｄ依存性リポーター遺伝子アッセイによって測定される、態様１または２によるヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片。
４．Ｓｍａｄ依存性リポーター遺伝子アッセイによって測定される場合、２５０ｐＭ未満の最大半減抑制濃度（ＩＣ５０）でヒトＴＧＦ−β２を中和し、１００ｎＭを超える最大半減抑制濃度（ＩＣ５０）でヒトＴＧＦ−β１および／またはＴＧＦ−β３を中和する、前記態様のいずれかによる抗体またはその機能的断片。
５．ＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β３に関するその解離定数の少なくとも７０分の１の解離定数で、ヒトアイソフォームＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３より優先的にヒトＴＧＦ−βアイソフォームＴＧＦ−β２に結合し、ヒトＴＧＦ−β２を中和する、ヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片。
６．１ｐＭ以下のＫＤでヒトＴＧＦ−β２に結合する、前記態様のいずれかによる抗体またはその機能的断片。
７．配列番号１、２１、４１、６１、８１、１０１または４、２４、４４、６４、８４、１０４または１２４〜１２９からなる群から選択される配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ＣＤＲ１領域；配列番号２、２２、４２、６２、８２、１０２または５、２５、４５、６５、８５、１０５からなる群から選択される配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ＣＤＲ２領域；配列番号３、２３、４３、６３、８３、１０３または６、２６、４６、６６、８６、１０６からなる群から選択される配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ＣＤＲ３領域；配列番号１１、３１、５１、７１、９１、１１１または１４、３４、５４、７４、９４、１１４からなる群から選択される配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ＣＤＲ１領域；配列番号１２、３２、５２、７２、９２、１１２または１５、３５、５５、７５、９５、１１５からなる群から選択される配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ＣＤＲ２領域；および、配列番号１３、３３、５３、７３、９３、１１３または１６、３６、５６、７６、９６、１１６からなる群から選択される配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ＣＤＲ３領域を含む、態様１〜６のいずれかによる抗体または機能的断片。
８．配列番号７、２７、４７、６７、８７または１０７のうちの少なくとも１つに少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域ポリペプチド配列を含む、態様１〜７のいずれかによる抗体または機能的断片。
９．配列番号１７、３７、５７、７７、９７または１１７のうちの少なくとも１つに少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域ポリペプチド配列を含む、態様１〜８のいずれかによる抗体または機能的断片。
１０．配列番号７、２７、４７、６７、８７または１０７のうちの少なくとも１つに少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域ポリペプチド配列、および配列番号１７、３７、５７、７７、９７または１１７のうちの少なくとも１つに少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域ポリペプチド配列を含む、態様１〜９のいずれかによる抗体または機能的断片。
１１．配列番号１、２１、４１、６１、８１、１０１または４、２４、４４、６４、８４、１０４または１２４〜１２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２、２２、４２、６２、８２、１０２または５、２５、４５、６５、８５、１０５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３、２３、４３、６３、８３、１０３または６、２６、４６、６６、８６、１０６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１１、３１、５１、７１、９１、１１１または１４、３４、５４、７４、９４、１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１２、３２、５２、７２、９２、１１２または１５、３５、５５、７５、９５、１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１３、３３、５３、７３、９３、１１３または１６、３６、５６、７６、９６、１１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、態様１〜１０のいずれかによる抗体またはその機能的断片。
１２．（ａ）配列番号１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号１３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｂ）配列番号２１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号２３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｃ）配列番号４１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号４２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号４３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号５１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号５３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号６１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号６２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号６３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号７１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号７２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号７３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｅ）配列番号８１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号８２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号８３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号９１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号９２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号９３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３；または
（ｆ）配列番号１０１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１０２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１０３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１１１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１１２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号１１３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、態様１〜１１のいずれか１つによるヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体または機能的断片。
１３．配列番号９、２９、４９、６９、８９、１０９からなる群から選択される少なくとも１つの配列に少なくとも９５％の配列同一性を有する完全長重鎖アミノ酸配列を含む、態様１〜１２のいずれかによる抗体または機能的断片。
１４．配列番号１９、３９、５９、７９、９９、１１９からなる群から選択される少なくとも１つの配列に少なくとも９５％の配列同一性を有する完全長軽鎖アミノ酸配列を含む、態様１〜１３のいずれかによる抗体または機能的断片。
１５．配列番号９、２９、４９、６９、８９、１０９からなる群から選択される少なくとも１つの配列に少なくとも９５％の配列同一性を有する完全長重鎖アミノ酸配列、および配列番号１９、３９、５９、７９、９９、１１９からなる群から選択される少なくとも１つの配列に少なくとも９５％の配列同一性を有する完全長軽鎖アミノ酸配列を含む、態様１〜１４のいずれかによる抗体または機能的断片。
１６．（ａ）配列番号７の可変重鎖配列および配列番号１７の可変軽鎖配列；
（ｂ）配列番号２７の可変重鎖配列および配列番号３７の可変軽鎖配列；
（ｃ）配列番号４７の可変重鎖配列および配列番号５７の可変軽鎖配列；
（ｄ）配列番号６７の可変重鎖配列および配列番号７７の可変軽鎖配列；
（ｅ）配列番号８７の可変重鎖配列および配列番号９７の可変軽鎖配列；または
（ｆ）配列番号１０７の可変重鎖配列および配列番号１１７の可変軽鎖配列
を含む、ヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体。
１７．（ａ）配列番号９の重鎖配列および配列番号１９の軽鎖配列；
（ｂ）配列番号２９の重鎖配列および配列番号３９の軽鎖配列；
（ｃ）配列番号４９の重鎖配列および配列番号５９の軽鎖配列；
（ｄ）配列番号６９の重鎖配列および配列番号７９の軽鎖配列；
（ｅ）配列番号８９の重鎖配列および配列番号９９の軽鎖配列；または
（ｆ）配列番号１０９の重鎖配列および配列番号１１９の軽鎖配列
を含む、ヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体。
１８．ＩｇＧ１アイソタイプである、前記態様のいずれかによる抗ＴＧＦ−β２抗体。
１９．Ｆｃ領域の突然変異により変更されたエフェクター機能を有する、前記態様のいずれかによるヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体。
２０．前記態様のいずれかによる抗体または機能的断片をコードする、単離されたポリヌクレオチド配列。
２１．配列番号８、１０、１８、２０、２８、３０、３８、４０、４８、５０、５８、６０、６８、７０、７８、８０、８８、９０、９８、１００、１０８、１１０、１１８または１２０の１つまたは複数を含む、態様２０による単離されたポリヌクレオチド配列。
２２．態様２０または２１による１つまたは複数の単離されたポリヌクレオチド配列を含む、クローニングまたは発現ベクター。
２３．少なくとも１つのＣＤＲ領域をコードする、配列番号８、１０、１８、２０、２８、３０、３８、４０、４８、５０、５８、６０、６８、７０、７８、８０、８８、９０、９８、１００、１０８、１１０、１１８もしくは１２０、またはその断片の１つまたは複数を含む、態様２２によるベクター。
２４．態様２２または２３による１つまたは複数のベクターを含む宿主細胞。
２５．態様１〜１９のいずれか１つの抗体またはその機能的断片の生成のための方法であって、態様２４の宿主細胞を培養することおよび前記抗体または機能的断片を単離することを含む方法。
２６．態様１〜１９のいずれか１つによる抗体またはその機能的断片を含む医薬組成物。
２７．療法において使用するための態様１２、１５、１６、１７または２６のいずれかの抗体またはその機能的断片を含む医薬組成物。
２８．医薬として使用するための態様１２、１５、１６、１７または２６のいずれかの抗体またはその機能的断片を含む医薬組成物。
２９．薬学的に許容される希釈剤または担体をさらに含む、態様２６〜２８による医薬組成物。
３０．１つまたは複数のさらなる活性薬剤をさらに含む、態様２６〜２９による医薬組成物。
３１．デュピュイトラン病の処置で使用するための態様２６〜３０の医薬組成物。
３２．ロイス−ディーツ症候群の処置で使用するための態様２６〜３０の医薬組成物。
３３．マルファン関連状態またはマルファン病の処置で使用するための態様２６〜３０の医薬組成物。
３４．表皮水疱症の処置で使用するための態様２６〜３０の医薬組成物。
３５．線維柱帯切除術の処置で使用するための態様２６〜３０の医薬組成物。
３６．皮膚全身性硬化症の処置で使用するための態様２６〜３０の医薬組成物。
３７．筋骨格疾患または障害の処置で使用するための態様２６〜３０の医薬組成物。
３８．前記筋骨格疾患または障害が、筋萎縮症、例えばミオパシー、例えばミオトニー、先天性ミオパシー、例えばネマリンミオパシー、多重／ミニコアミオパシーおよび管状筋（中心核）ミオパシーによって引き起こされるもの、ミトコンドリアミオパシー、家族性周期性四肢麻痺、炎症性ミオパシー、代謝ミオパシー、例えば、グリコーゲンまたは脂質貯蔵病、皮膚筋炎、多発筋炎、封入体筋肉炎、骨化性筋炎、横紋筋融解およびミオグロビン尿症によって引き起こされるもの；筋ジストロフィー、例えば、デュシェンヌ、ベッカー、筋緊張性、筋膜肩甲上腕部、エメリー−ドライフス、眼球咽頭、肩甲上腕部、四肢肢帯、フクヤマ、先天性筋ジストロフィーまたは遺伝性末梢筋障害；骨粗しょう症；骨折；低い背丈；小人症；長期ベッド療養；随意不活動性；または不随意の不活動性である、態様３７の医薬組成物。
３９．デュピュイトラン病を患っている患者を処置する方法であって、前記患者に態様２６〜３０のいずれか１つによる医薬組成物の有効用量を投与することを含む方法。
４０．マルファン関連状態またはマルファン病を患っている患者を処置する方法であって、前記患者に態様２６〜３０のいずれか１つによる医薬組成物の有効用量を投与することを含む方法。
４１．表皮水疱症を患っている患者を処置する方法であって、前記患者に態様２６〜３０のいずれか１つによる医薬組成物の有効用量を投与することを含む方法。
４２．線維柱帯切除術を受ける患者を処置する方法であって、前記患者に態様２６〜３０のいずれか１つによる医薬組成物の有効用量を投与することを含む方法。
４３．皮膚全身性硬化症を患っている患者を処置する方法であって、前記患者に態様２６〜３０のいずれか１つによる医薬組成物の有効用量を投与することを含む方法。
４４．ロイス−ディーツ症候群を患っている患者を処置する方法であって、前記患者に態様２６〜３０のいずれか１つによる医薬組成物の有効用量を投与することを含む方法。
４５．筋骨格疾患または障害を患っている患者を処置する方法であって、前記患者に態様２６〜３０のいずれか１つによる医薬組成物の有効用量を投与することを含む方法。
４６．前記筋骨格疾患または障害が、筋萎縮症、例えばミオパシー、例えばミオトニー、先天性ミオパシー、例えばネマリンミオパシー、多重／ミニコアミオパシーおよび管状筋（中心核）ミオパシーによって引き起こされるもの、ミトコンドリアミオパシー、家族性周期性四肢麻痺、炎症性ミオパシー、代謝ミオパシー、例えば、グリコーゲンまたは脂質貯蔵病、皮膚筋炎、多発筋炎、封入体筋肉炎、骨化性筋炎、横紋筋融解およびミオグロビン尿症によって引き起こされるもの；筋ジストロフィー、例えば、デュシェンヌ、ベッカー、筋緊張性、筋膜肩甲上腕部、エメリー−ドライフス、眼球咽頭、肩甲上腕部、四肢肢帯、フクヤマ、先天性筋ジストロフィーまたは遺伝性末梢筋障害；骨粗しょう症；骨折；低い背丈；小人症；長期ベッド療養；随意不活動性；または不随意の不活動性である、態様４５による方法。
４７．デュピュイトラン病、マルファン関連状態もしくはマルファン病、表皮水疱症、線維柱帯切除術、ロイス−ディーツ症候群、皮膚全身性硬化症または筋骨格疾患もしくは障害の処置のための医薬の製造における、態様１〜１９のいずれか１つによる抗体もしくは機能的断片、態様２０もしくは２１によるポリヌクレオチド配列、または態様２６〜３０のいずれか１つによる医薬組成物の使用。
４８．前記筋骨格疾患または障害が、筋萎縮症、例えばミオパシー、例えばミオトニー、先天性ミオパシー、例えばネマリンミオパシー、多重／ミニコアミオパシーおよび管状筋（中心核）ミオパシーによって引き起こされるもの、ミトコンドリアミオパシー、家族性周期性四肢麻痺、炎症性ミオパシー、代謝ミオパシー、例えば、グリコーゲンまたは脂質貯蔵病、皮膚筋炎、多発筋炎、封入体筋肉炎、骨化性筋炎、横紋筋融解およびミオグロビン尿症によって引き起こされるもの；ジストロフィー、例えば、デュシェンヌ、ベッカー、筋緊張性、筋膜肩甲上腕部、エメリー−ドライフス、眼球咽頭、肩甲上腕部、四肢肢帯、フクヤマ、先天性筋ジストロフィーまたは遺伝性末梢筋障害；骨粗しょう症；骨折；低い背丈；小人症；長期ベッド療養；随意不活動性；または不随意の不活動性である、態様４７の使用。
４９．態様１７の少なくとも１つの抗体によってＴＧＦβ−２への結合を交差ブロックするかまたは交差ブロックされる、抗体またはその機能的断片。
溶液平衡滴定（ＳＥＴ）方法（Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００（ＭＳＤ））を使用して得られた、ヒト組換えＴＧＦ−β２へのＴＧＦ−β２特異的ＡＢ ＭＯＲ１３４３６結合の濃度−応答曲線を示す図である。ＫＤ親和性測定は、文献に記載されている通りに実施した（Friquet et al., J Immnunol Meth 77, 305-319. 1985）。ＳＥＴ方法の感度および精度を向上させるために、それは古典的ＥＬＩＳＡからＥＣＬに基づくテクノロジーに変えられた（Haenel et al., Anal Biochem 339, 182-184. 2005）。 溶液平衡滴定（ＳＥＴ）方法（Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００（ＭＳＤ））を使用して得られた、ヒト組換えＴＧＦ−β２およびマウス組換えＴＧＦ−β２へのＴＧＦ−β２特異的ＡＢ（Ａ）ＭＯＲ１４７９９、（Ｂ）ＭＯＲ１４８００、（Ｃ）ＭＯＲ１４７９７および（Ｄ）ＭＯＲ１４８０９の濃度−応答曲線を示す図である。Ｋｄ親和性測定は、文献に記載されている通りに実施した（Friquet et al., J Immnunol Meth 77, 305-319. 1985）。ＳＥＴ方法の感度および精度を向上させるために、それは古典的ＥＬＩＳＡからＥＣＬに基づくテクノロジーに変えられた（Haenel et al., Anal Biochem 339, 182-184. 2005）。 ＴＧＦ−β２特異的ＡＢ ＭＯＲ１３４３６の生物学的「中和」活性を示す図である。ＨＥＫ２９３Ｔ／１７ＣＡＧＡ−１２（ＨＥＫ２９３Ｔ−ＲＧＡ）、リン酸化Ｓｍａｄ−２およびＳｍａｄ−３に特異的なルシフェラーゼリポーターアッセイにおける、組換えヒトＴＧＦ−β２、マウスＴＧＦ−β２、ヒトＴＧＦ−β３およびヒトＴＧＦ−β１の効果に対する抗体の濃度−応答曲線を示す図である。組換えＴＧＦ−βは、ＣＡＧＡ−１２リポーターに結合してルシフェラーゼ遺伝子発現を引き起こす、Ｓｍａｄ−２およびＳｍａｄ−３のリン酸化を誘導する。ＭＯＲ１３４３６は、組換えヒトおよびマウスＴＧＦ−β２を中和するが、ヒトＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３を中和しない。ＩｇＧ抗体ＭＯＲ０３２０７は、陰性対照の役目をした。ＭＯＲ０３２０７は、ヒト生得的免疫系の一部である酵素を認識する。 ＴＧＦ−β２特異的ＡＢ ＭＯＲ１４７９９、ＭＯＲ１４８００、ＭＯＲ１４７９７およびＭＯＲ１４８０９の生物学的「中和」活性を示す図である。ＨＥＫ２９３Ｔ／１７ＣＡＧＡ−１２（ＨＥＫ２９３Ｔ−ＲＧＡ）、リン酸化Ｓｍａｄ−２およびＳｍａｄ−３に特異的なルシフェラーゼリポーターアッセイにおける、様々な組換えヒトＴＧＦ−βファミリータンパク質：アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、ＧＤＦ−１１、ミオスタチン、ＴＧＦ−ｂ２およびＴＧＦ−ｂ３の効果に対するＡＢの濃度−応答曲線を示す。組換えＴＧＦ−βは、ＣＡＧＡ−１２リポーターに結合してルシフェラーゼ遺伝子発現を引き起こす、Ｓｍａｄ−２およびＳｍａｄ−３のリン酸化を誘導した。全てのＡＢは組換えヒトＴＧＦ−β２を中和するが、いかなる他のＴＧＦ−βタンパク質ファミリーメンバーも中和しない。ＩｇＧ抗体ＭＯＲ０３２０７（１００ｎＭおよび３３．３ｎＭで評価した）は、陰性対照の役目をした。ＭＯＲ０３２０７は、ヒト生得的免疫系の一部である酵素を認識する。 ＴＧＦ−β２特異的ＡＢ ＭＯＲ１３４３６の生物学的「中和」活性を示す図である。組換えヒトＴＧＦ−β２（●）、マウスＴＧＦ−β２（■）およびヒトＴＧＦ−β３（◆）によるヒト骨格筋細胞（ｓｋＭＣ）分化のＡＢ対抗阻害の濃度−応答曲線を示す。細胞を最高１２０時間分化させ、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）活性、確立された骨格筋細胞分化マーカー、を測定した。全てのＴＧＦ−βはＣＫ活性を阻害し、ＡｂはＴＧＦ−β２に対抗するが、ＴＧＦ−β３応答に対抗しない。 ＴＧＦ−β２特異的ＡＢ（Ａ）ＭＯＲ１４７９９、（Ｂ）ＭＯＲ１４８００、（Ｃ）ＭＯＲ１４７９７および（Ｄ）ＭＯＲ１４８０９の生物学的「中和」活性を示す図である。組換えヒトＴＧＦ−β２（●）、マウスＴＧＦ−β２（■）およびヒトＴＧＦ−β３（◆）によるヒト骨格筋細胞（ｓｋＭＣ）分化のＡＢ対抗阻害の濃度−応答曲線を示す。細胞を最高１２０時間分化させ、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）活性、確立された骨格筋細胞分化マーカー、を測定した。全てのＴＧＦ−βはＣＫ活性を阻害し、ＡｂはＴＧＦ−β２に対抗するが、ＴＧＦ−β３応答に対抗しない。 ＴＧＦ−β２特異的ＡＢ ＭＯＲ１４７９７または汎ＴＧＦ−β抗体１Ｄ１１と７日間培養されたデュピュイトラン患者試料中のコラーゲンＩタンパク質の免疫染色を数量化した棒グラフを示す図である。患者組織をスライスし、Ａｂの存在下で７日間培養し、その後コラーゲンＩのために免疫染色した。 アイソタイプ対照（Ａ／Ｃ）と比較してＴＧＦ−β２特異的ＡＢ ＭＯＲ１４７９７（Ｂ／Ｄ）と７日間培養された２つの異なるデュピュイトラン患者試料中のコラーゲンＩタンパク質の免疫染色を示す図である。患者１からの結果はＡ／Ｂに示し、患者２からのものはＣ／Ｄに示す。患者組織をスライスし、Ａｂの存在下で７日間培養し、その後コラーゲンＩのために免疫染色した。 ＴＧＦ−β２特異的ＡＢ ＭＯＲ１３４３６で処置した片側性尿道閉塞モデル（ＵＵＯ）からのマウス腎臓中のコラーゲンＩタンパク質のｍＲＮＡ発現を数量化した棒グラフを示す図である。偽−またはＵＵＯ手術動物をＡｂで１４日間処置し、腎臓を取り出し、ｍＲＮＡを単離してｑＰＣＲによって分析した。 ＴＧＦβ−２に結合するＭＯＲ１４７９７のエピトープ：（Ａ）ＴＧＦβ−２ダイマーに結合する２つのＭＯＲ１４７９７ Ｆａｂの全体的構造を示す図である。ＭＯＲ１４７９７は面で、ＴＧＦβ−２はリボンで示される。（Ｂ）ＭＯＲ１４７９７まで５Å以内の距離のＴＧＦβ−２ダイマーの残基は、棒で示される。 ＴＧＦβ−２に結合するＭＯＲ１４７９７のパラトープ：ＭＯＲ１４７９７ ＶＨ（Ａ）（それぞれ配列番号６７および６７、登場順）およびＶＬ（Ｂ）（それぞれ配列番号７７および７７、登場順）の配列を掲載した図である。ＣＤＲループ（ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの定義）は、四角で囲まれる。ＴＧＦβ−２ダイマーまで５Å以内の距離のＭＯＲ１４７９７の残基は、灰色で陰影をつけられる。
一般定義
本発明がより容易に理解されるように、特定の用語を先ず定義する。さらなる定義は、詳細な説明全体で示される。
以下を含む：用語「含む（comprising）」は「含む（including）」を意味し、例えば、Ｘを「含む（comprising）」組成物は、Ｘのみからなっていてもよいし、または例えばＸ＋Ｙのように追加のものを含んでいてもよい。
用語「ヒトＴＧＦ−βアイソフォーム」は、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのメンバー、すなわち、ヒトＴＧＦ−βアイソフォームＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３をそれぞれ記載するために使用される。用語「ヒトＴＧＦ−βアイソフォームＴＧＦ−β２」、「ＴＧＦ−β２アイソフォーム」、「ＴＧＦβ２」および「ＴＧＦ−β２」およびＴＧＦベータ２は、本開示全体で同義的に使用される。
本明細書で言及される用語「抗体」は、完全な抗体およびその任意の抗原結合性断片（すなわち、「抗原結合性部分」）またはその単鎖を含む。天然に存在する「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続される少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書でＶＨと略す）および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書でＶＬと略す）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域が間に散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配列される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合性ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１構成要素（Ｃ１ｑ）を含む、宿主の組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
本明細書で用いるように、「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的に含まれない抗体を指す（例えば、抗原結合性部分に特異的に結合する単離された抗体には、ＴＧＦβ−２以外の抗原に特異的に結合する抗体が実質的に含まれない）。
本明細書で用いるように、用語「ＫＤ」は、Ｋｄ対Ｋａの比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）で表される解離定数を指すものとする。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立されている方法を使用して測定することができる。抗体のＫＤを測定する方法は、表面プラズモン共鳴、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）のバイオセンサーシステム、または溶液平衡滴定（ＳＥＴ）である（Friguet B et al. (1985) J. Immunol Methods; 77(2): 305-319、およびHanel C et al. (2005) Anal Biochem; 339(1): 182-184を参照）。用語「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」は、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指すものであり、用語「Ｋｄｉｓ」または「Ｋｄ」は、本明細書で用いるように特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指すものである。
明細書全体で、１０の倍率表記に対して様々な科学的表記が使用される。１０の倍率表記に代わるものとして、科学的Ｅ表記（例えば、１．１Ｅ−１５）が使用される。例えば、０．００００００００１モルは、３．０×１０−９モルとして、または３．０Ｅ−９モルとして表記できる。
本明細書で用いるように、用語「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性細胞傷害」活性は、ヒトＢ細胞消耗活性を指す。ＡＤＣＣ活性は、当技術分野で公知のヒトＢ細胞消耗アッセイによって測定することができる。
本明細書で用いる用語「ヒト抗体」は、フレームワークおよびＣＤＲの両領域がヒト起源の配列に由来する可変領域を有する抗体を含むものである。さらに、抗体が定常領域を含有する場合は、定常領域もそのようなヒト配列、例えばヒト生殖細胞系配列、またはヒト生殖細胞系配列の突然変異版、またはヒトフレームワーク配列分析から導かれるコンセンサスフレームワーク配列を含有する抗体に由来し、これは、例えば、Knappik, et al.（2000. J Mol Biol 296, 57-86）に記載されている。本発明のヒト抗体は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基を含むことができる（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発、またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞突然変異によって導入される突然変異；またはヒト化抗体）。
用語「ヒトモノクローナル抗体」は、フレームワークとＣＤＲ領域の両方がヒト配列に由来する可変領域を有する、単一の結合特異性を提示する抗体を指す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞と融合されている、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、ヒト以外のトランスジェニック動物、例えばトランスジェニックマウスから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマによって生成される。
本明細書で用いるように、用語「組換えヒト抗体」は、組換え手段によって調製、発現、作製または単離された全てのヒト抗体、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックもしくはトランスクロモソーム型である動物（例えば、マウス）から単離された抗体、またはそれから調製されるハイブリドーマ、ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えばトランスフェクトーマから単離された抗体、組換え型のコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、およびヒト免疫グロブリン遺伝子配列の全体または一部の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製または単離された抗体を含む。そのような組換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし、ある特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列にトランスジェニックである動物が使用されるときはｉｎ ｖｉｖｏ体細胞突然変異誘発）にかけることができ、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系のＶＨおよびＶＬ配列に由来し、関係があるが、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト抗体生殖細胞系レパートリーの中に本来存在することができない配列である。
本明細書で用いるように、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によって提供される抗体クラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ２）を指す。
本明細書で用いるように、用語「がん」は、組織病理タイプまたは侵襲性の段階にかかわりなく、全てのタイプのがん性の増殖または腫瘍形成過程、転移組織または悪性形質転換細胞、組織もしくは器官を含むものである。がん性障害の例には、固形腫瘍、血液がん、軟組織腫瘍および転移性病変が限定されずに含まれる。固形腫瘍の例には、様々な器官系の悪性腫瘍、例えば肉腫および癌腫（腺癌および扁平上皮細胞癌腫を含む）、例えば肝臓、肺、乳房、リンパ系、胃腸（例えば、結腸）、尿生殖器の管（例えば、腎臓、尿路上皮性細胞）、前立腺および咽頭を侵すものが含まれる。腺癌には、ほとんどの結腸がん、直腸がん、腎細胞腫、肝がん、肺の非小細胞癌、小腸のがんおよび食道のがんなどの悪性腫瘍が含まれる。扁平上皮細胞癌には、例えば、肺、食道、皮膚、頭頸部領域、口腔、肛門および頸部における悪性腫瘍が含まれる。一実施形態では、がんは、メラノーマ、例えば進行期のメラノーマである。前記のがんの転移性病変を、本発明の方法および組成物を使用して処置または予防することもできる。その増殖を本明細書に開示される抗体分子を使用して阻害することができる例示的ながんには、免疫療法に一般的に応答性であるがんが含まれる。処置が好ましいがんの非限定例には、メラノーマ（例えば、転移性悪性メラノーマ）、腎臓がん（例えば、明細胞癌）、前立腺がん（例えば、ホルモン抗療性の前立腺癌）、乳がん、結腸がんおよび肺がん（例えば、非小細胞肺がん）が含まれる。さらに、抗療性および再発性の悪性腫瘍を、本明細書に記載される抗体分子を使用して処置することができる。
処置することができる他のがんの例には、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部または頸部のがん、皮膚または眼内の悪性メラノーマ、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門がん、胃食道、腹部のがん、脂肪肉腫、精巣がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸管癌、膣癌、外陰部癌、メルケル細胞がん、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎腺のがん、軟組織の肉腫、尿道がん、ペニスのがん、慢性または急性白血病、例えば急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、小児期の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、腎臓または尿管のがん、腎盤の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮細胞がん、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって誘発されるものを含む環境誘発がん（例えば、中皮腫）、および前記がんの組合せが含まれる。ある特定の実施形態では、がんは、皮膚がん、例えばメルケル細胞癌またはメラノーマである。一実施形態では、がんはメルケル細胞癌である。他の実施形態では、がんはメラノーマである。他の実施形態では、がんは、乳がん、例えば三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）またはＨＥＲ２陰性乳がんである。他の実施形態では、がんは、腎臓がん、例えば、腎細胞癌（例えば、明細胞腎細胞癌（ＣＣＲＣＣ）または非明細胞腎細胞癌（ｎｃｃＲＣＣ））である。他の実施形態では、がんは、甲状腺がん、例えば未分化甲状腺癌（ＡＴＣ）である。他の実施形態では、がんは、神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）、例えば、非定型的肺カルチノイド腫瘍または膵臓、胃腸（ＧＩ）管もしくは肺におけるＮＥＴである。ある特定の実施形態では、がんは、肺がん、例えば非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）（例えば、扁平上皮ＮＳＣＬＣまたは非扁平上皮ＮＳＣＬＣ）である。
本明細書で用いるように、用語「プログラム死１」または「ＰＤ−１」は、例えば活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、ＴｒｅｇおよびＢ細胞の上で発現されるＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーメンバーに関する。それは、エフェクターＴ細胞のシグナル伝達および機能を負に調節する。ＰＤ−１は腫瘍浸潤性Ｔ細胞の上で誘導され、機能的消耗または機能不全をもたらすことができる（Keir et al. (2008) Annu. Rev. Immunol. 26:677-704；Pardoll et al. (2012) Nat Rev Cancer 12(4):252-64）。ＰＤ−１は、その２つのリガンド、プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）またはプログラム死−リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）のいずれかへの結合の後に、共阻害性シグナルを送達する。ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞、上皮細胞、血管内皮細胞ならびに多くの種類の腫瘍を含む、いくつかの細胞形で発現される。マウスおよびヒト腫瘍でのＰＤ−Ｌ１の高い発現は、様々ながんにおける不良な臨床転帰にリンクされた（Keir et al. (2008) Annu. Rev. Immunol. 26:677-704；Pardoll et al. (2012) Nat Rev Cancer 12(4):252-64）。ＰＤ−Ｌ２は、樹状細胞、マクロファージおよび一部の腫瘍で発現される。ＰＤ−１経路の遮断は、がん免疫療法のために前臨床的および臨床的に検証された。前臨床および臨床研究は、抗ＰＤ−１遮断がエフェクターＴ細胞の活性を回復することができ、強健な抗腫瘍応答をもたらすことを実証した。例えば、ＰＤ−１経路の遮断は、消耗した／機能不全のエフェクターＴ細胞機能（例えば、増殖、ＩＦＮ−γ分泌または細胞溶解機能）を回復することができ、および／またはＴｒｅｇ細胞機能を阻害することができる（Keir et al. (2008) Annu. Rev. Immunol. 26:677-704；Pardoll et al. (2012) Nat Rev Cancer 12(4):252-64）。ＰＤ−１経路の遮断は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２の抗体、その抗原結合性断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドで実行することができる。ＰＤ−１、例えばヒトＰＤ−１のアミノ酸配列は、当技術分野で公知である、例えば、Shinohara T et al. (1994) Genomics 23(3):704-6; Finger LR, et al. Gene (1997) 197(1-2):177-87。
本発明の様々な定義および態様は、以下のサブセクションでさらに詳細に提供／記載される。
発明の詳細な説明
ヒトモノクローナル抗体による異なる機能と関連するいくつかの高度に相同的な標的の１つの特異的中和は、主要な課題のままである。この課題は、他の相同的標的との交差反応性を有害なまたは望ましくない事象と関連付けることができるとき、治療場面でより明白である。相同的アイソフォームＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３の存在のために、ヒトモノクローナル抗体でＴＧＦ−β２を標的にするときにこれらの問題が生じることがある。これらのＴＧＦ−βアイソフォームは、ノックアウトマウスからの実験データによると異なる機能と関連する。さらに、ＴＧＦ−β１の阻害は、有害事象の高いリスクと関連することが知られている。さらに、本明細書では、発明者は、動物モデルにおいてＴＧＦ−β３およびＴＧＦ−β２の同時阻害が弁膜症、心臓弁の重大な障害と関連するとの認識されていない問題を開示する。これは、ＴＧＦ−β２を特異的に中和するが、ＴＧＦ−β３を、またはＴＧＦ−β３およびＴＧＦ−β１を中和しないモノクローナル治療抗体を提供する、これまで未解決の必要性を発生させる。より具体的には、臨床場面で有効になるために、非常に低いピコモルの解離定数を示す中和抗ＴＧＦ−β２抗体の必要性がある。さらに、有害事象と関連する可能性のある他の経路に対する干渉を引き起こしそうにないより低い用量でそれらを投与する必要があるので、高い結合親和性を有する中和抗ＴＧＦ−β２抗体は、強化された効力および安全性と関連する。さらに、モノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体のより低い用量の投与は、より低い費用とも関連する。これらの問題は、本発明によって解決される。
ＴＧＦ−ベータ１／２／３アイソフォームの中和は、Ｓｍａｄ依存性リポーター遺伝子アッセイで測定される。用語「中和抗体」および「アンタゴニスト抗体」は同義的に使用され、Ｓｍａｄ依存性リポーター遺伝子アッセイにおいてＴＧＦβ−１、−２および／または−３誘導シグナル伝達活性を１００ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害する抗体を指すものである。本発明との関連で使用される、「ヒトＴＧＦ−βアイソフォームＴＧＦ−β２を中和し、ヒトアイソフォームＴＧＦ−β３を中和しないヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片」、または「ＴＧＦ−β２を特異的に中和するが、ＴＧＦ−β３またはＴＧＦ−β１（または、ＴＧＦ−β３およびＴＧＦ−β１の両方）を中和しない」というフレーズは、Ｓｍａｄ依存性リポーター遺伝子アッセイによって測定される場合、１５０ｐＭ未満の最大半減抑制濃度（ＩＣ５０）でＴＧＦ−β２を特異的に中和するが、ヒトＴＧＦ−β１および／またはＴＧＦ−β３を中和しないヒトモノクローナル抗体を指す（例えば、ヒトＴＧＦ−β１および／またはＴＧＦ−β３に関して１００ｎＭを超えるＩＣ５０を有する）。その結果として、本開示のヒトＴＧＦ−β２中和抗体は、Ｓｍａｄ依存性リポーター遺伝子アッセイによって測定される場合、例えば１０７ｐＭ未満の最大半減抑制濃度（ＩＣ５０）でヒトＴＧＦ−β２を中和し、１００ｎＭを超える最大半減抑制濃度（ＩＣ５０）でヒトＴＧＦ−β１および／またはＴＧＦ−β３を中和する。一実施形態では、本開示のヒトＴＧＦ−β２中和抗体は、例えば１０７ｐＭ未満の最大半減抑制濃度（ＩＣ５０）でヒトＴＧＦ−β２を中和し、ヒトＴＧＦ−β１および／またはＴＧＦ−β３を中和しないが、その理由は、前記抗体がＳｍａｄ依存性リポーター遺伝子アッセイにおいてこれらのタンパク質に対して事実上検出不能な結合しか示さないからである。
本明細書で用いるように、用語「保存的配列改変」は、そのアミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に有意に影響を及ぼさないか変化させないアミノ酸改変を指すものである。そのような保存的改変には、アミノ酸の置換、付加および欠失が含まれる。部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの当技術分野で公知の標準技術によって、改変を本発明の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で規定されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、無極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝状側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。したがって、本発明の抗体のＣＤＲ領域中の１つまたは複数のアミノ酸残基を同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えることができ、変更された抗体は、本明細書に記載される機能アッセイを使用して保持された機能について試験することができる。
「交差反応する」抗体は、１つを超える抗原に結合する抗体を指し、前記結合は、前記抗原の活性の操作（中和、低減または活性化）をもたらすことができるが、必ずしもそうしなければならないとは限らない。交差反応性は、Ｓｍａｄ依存性リポーター遺伝子アッセイを使用して、および、表面プラズモン共鳴バイオセンサーシステム、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムまたは溶液平衡滴定を使用して測定することができるＫＤを測定することによって、測定することができる。
「ヒトＴＧＦ−βアイソフォームＴＧＦ−β２に結合し、ヒトアイソフォームＴＧＦ−β３もしくはＴＧＦ−β１、またはＴＧＦ−β３およびＴＧＦ−β１に結合（交差反応）しないヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片」は、約１ｐＭ以下のＫＤでＴＧＦ−β２に、および約２×１０−９Ｍ、または約５×１０−９Ｍまたは約１０×１０−９Ｍまたはそれより高いＫＤでＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β３に結合する抗体を指すものでもある。ある特定の実施形態では、ＴＧＦ−β３およびＴＧＦ−β１抗原と交差反応しないそのような抗体は、実際には標準の結合アッセイにおいてこれらのタンパク質に対して事実上検出不能な結合を示す。
様々な種のＴＧＦ−β２への抗体の結合能力を評価する標準のアッセイは、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットおよびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を含め、当技術分野で公知である。適するアッセイは、実施例のセクションにおいて詳細に記載される。抗体の結合親和性は、当技術分野で公知の標準アッセイによって、例えば表面プラズモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム分析）または溶液平衡滴定によって調査することもできる。Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどの表面プラズモン共鳴に基づく技術は、結合親和性の計算を可能にする結合動態を測定することができる。ＴＧＦ−β２の機能特性に及ぼす抗体の効果を評価するアッセイは、実施例のセクションにおいてさらに詳細に記載される。
本発明は、ヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片を提供する。より詳細には、それは、ヒトＴＧＦ−βアイソフォームＴＧＦ−β２（配列番号１２２）（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ６１８１２−ＴＧＦＢ２＿ＨＵＭＡＮ（http://www.uniprot.org/）；ＨＵＧＯ Ｇｅｎｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＨＧＮＣ）に承認された遺伝子記号＝ＴＧＦＢ２；ＨＧＮＣ ＩＤ＝ＨＧＮＣ：１１７６８）を中和し、ヒトアイソフォームＴＧＦ−β３（配列番号１２３）（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ１０６００−ＴＧＦＢ３＿ＨＵＭＡＮ；遺伝子記号ＨＧＮＣ＝ＴＧＦＢ３；ＨＧＮＣ ＩＤ＝ＨＧＮＣ：１１７６９）を中和しないヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片を提供する。特に、本発明は、ヒトＴＧＦ−βアイソフォームＴＧＦ−β２を中和し、ヒトアイソフォームＴＧＦ−β３およびＴＧＦ−β１（配列番号１２１）（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０１１３７−ＴＧＦＢ１＿ＨＵＭＡＮ；遺伝子記号ＨＧＮＣ＝ＴＧＦＢ１；ＨＧＮＣ ＩＤ＝ＨＧＮＣ：１１７６６）を中和しない、ヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片を提供する。抗体またはその機能的断片によるＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３の中和は、実施例のセクションに記載されるＳｍａｄ依存性リポーター遺伝子アッセイによって測定される。好ましくは、本発明によって提供される抗体またはその機能的断片は、Ｓｍａｄ依存性リポーター遺伝子アッセイによって測定される場合、ヒトＴＧＦ−β２を１５０ｐＭ未満、または１０７ｐＭ未満、または１００ｐＭ未満、または９５ｐＭ未満、または８０ｐＭ未満、または３０ｐＭ未満、または２０ｐＭ未満、または１０ｐＭ未満、の最大半減抑制濃度（ＩＣ５０）で中和し、ヒトＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β３（１００ｎＭを超えるＩＣ５０を有する）を中和しない。本開示の別の実施形態では、抗体またはその機能的断片は、Ｓｍａｄ依存性リポーター遺伝子アッセイによって測定される場合、ヒトＴＧＦ−β２を、約１ｐＭから約１５０ｐＭの間、または約１ｐＭから約１０７ｐＭの間、または約１ｐＭから約９５ｐＭの間、または約１ｐＭから約８０ｐＭの間の最大半減抑制濃度（ＩＣ５０）で中和し、ヒトＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β３（１００ｎＭを超えるＩＣ５０を有する）を中和しない。
本発明は、ヒトアイソフォームＴＧＦ−β１および／またはＴＧＦ−β３より優先的にヒトＴＧＦ−βアイソフォームＴＧＦ−β２に結合する、ヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片も提供する。特に、提供されるヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、ヒトＴＧＦ−βアイソフォームＴＧＦ−β２に、ＴＧＦ−β３に関するその解離定数の少なくとも約７０分の１、約１０００分の１、約２０００分の１、約１００００分の１、約２００００分の１、約２０００００分の１、約３０００００分の１、約１００００００分の１または約６００００００分の１の解離定数で結合し、抗体またはその機能的断片はヒトＴＧＦ−β２を中和するがＴＧＦ−β３を中和しない。
一実施形態では、ヒトＴＧＦ−β２に関する提供される抗体の解離定数は、ＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β３に関するその解離定数の約２０００分の１から約１００００００分の１である。別の実施形態では、ヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、ヒトＴＧＦ−βアイソフォームＴＧＦ−β２に、ＴＧＦ−β３に関するその解離定数の少なくとも２０００分の１または少なくとも１００００００分の１の解離定数で結合し、抗体はヒトＴＧＦ−β２を中和するがＴＧＦ−β３を中和しない。抗体の結合親和性は、本明細書に開示される標準アッセイによって、例えば表面プラズモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム分析）または溶液平衡滴定によって調査することもできる。ヒトアイソフォームＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３より優先的にヒトＴＧＦ−β２に結合する、ヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、約１ｐＭ以下、または約１００ｆＭ以下、または約５０ｆＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＴＧＦ−β２に結合する。別の実施形態では、開示される抗体または機能的断片は、１ｐＭ以下または約１ｐＭから約１０ｆＭの解離定数（ＫＤ）でヒトＴＧＦ−βアイソフォームＴＧＦ−β２に結合する。
別の実施形態では、ヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、ヒトＴＧＦ−βアイソフォームＴＧＦ−β３に関するその解離定数の少なくとも７０分の１の解離定数で、ヒトＴＧＦ−βアイソフォームＴＧＦ−β３より優先的にヒトＴＧＦ−βアイソフォームＴＧＦ−β２に結合し、抗体はヒトＴＧＦ−βアイソフォームＴＧＦ−β２を中和するが、ヒトＴＧＦ−βアイソフォームＴＧＦ−β３を中和せず、ヒトＴＧＦ−βアイソフォームＴＧＦ−β２に１ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）で結合する。
好ましい実施形態では、ヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３に関するその解離定数の少なくとも７０分の１の解離定数で、ヒトＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３より優先的にヒトＴＧＦ−β２に結合し、抗体はヒトＴＧＦ−β２を中和するが、ＴＧＦ−β３およびＴＧＦ−β１を中和せず、ヒトＴＧＦ−β２に１ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）で結合する。
抗ＴＧＦ−β２抗体またはその抗原結合性断片は、本明細書に記載されるように、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片またはｓｃＦｖ断片、および／またはＩｇＧアイソタイプであってもよい。
特異性および選択性に関して、先行技術抗体のいずれも本明細書に開示される抗体、特に、抗体ＭＯＲ１４７９９、ＭＯＲ１４８００、ＭＯＲ１４８０９、ＭＯＲ１４７９７、ＭＯＲ１４８０５またはＭＯＲ１４７８７に匹敵しない。本発明の抗体は、実施例に記載される通り、単離され、構造的に特徴付けられたヒト組換え抗体を含む。本発明の単離された抗体のＶＨアミノ酸配列は、配列番号７、２７、４７、６７、８７および１０７にそれぞれ示す。本発明の単離された抗体のＶＬアミノ酸配列は、配列番号１７、３７、５７、７７、９７および１１７にそれぞれ示す。本発明の抗体の好ましい完全長重鎖アミノ酸配列の例は、配列番号９、２９、４９、６９、８９および１０９にそれぞれ示す。本発明の抗体の好ましい完全長軽鎖アミノ酸配列の例は、配列番号１９、３９、５９、７９、９９および１１９にそれぞれ示す。本発明の他の抗体には、アミノ酸の欠失、挿入または置換によって突然変異されているが、上記の配列で表す完全長重鎖アミノ酸配列と少なくとも８０、９０、９５、９７または９９パーセントの同一性をなお有する抗体が含まれる。さらに、可変重鎖ヌクレオチド配列を、配列番号８、２８、４８、６８、８８および１０８にそれぞれ示す。可変軽鎖ヌクレオチド配列は、配列番号１８、３８、５８、７８、９８および１１８にそれぞれ示す。完全長軽鎖ヌクレオチド配列は、配列番号２０、４０、６０、８０、１００および１２０にそれぞれ示す。完全長重鎖ヌクレオチド配列は、配列番号１０、３０、５０、７０、９０および１１０に示す。本発明の他の抗体には、突然変異されているが、上記の配列と少なくとも９０またはそれを超える（すなわち、９１、９２、９３、９４、９５、９７、９９またはそれを超える）パーセントの同一性をなお有する、アミノ酸または核酸が含まれる。一部の実施形態は、上記の配列で表す可変領域と比較した場合、可変領域で１、２、３、４または５個以下のアミノ酸がアミノ酸の欠失、挿入または置換によって突然変異されている突然変異アミノ酸配列を含む。これらの抗体の各々は同じ標的に結合するので、ＶＨ、ＶＬ、完全長軽鎖および完全長重鎖配列（ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列）を「ミックスおよびマッチさせて」、本発明の他の抗ＴＧＦ−β２抗体を作製することができる。そのような「ミックスおよびマッチさせた」抗体のＴＧＦ−β２結合は、上記のおよび実施例の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用して試験することができる。これらの鎖がミックスおよびマッチされるとき、特定のＶＨ／ＶＬ対合からのＶＨ配列は、構造的に類似したＶＨ配列で置き換えられると予想される。同様に、特定の完全長重鎖／完全長軽鎖対合からの完全長重鎖配列は、構造的に類似した完全長重鎖配列で置き換えられると予想される。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対合からのＶＬ配列は、構造的に類似したＶＬ配列で置き換えられると予想される。同様に、特定の完全長重鎖／完全長軽鎖対合からの完全長軽鎖配列は、構造的に類似した完全長軽鎖配列で置き換えられると予想される。したがって、一態様では、本発明は、配列番号７、２７、４７、６７、８７および１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号１７、３７、５７、７７、９７および１１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、単離された組換え抗ＴＧＦ−β２抗体またはその抗原結合性領域を提供する。
本明細書で用いるように、用語「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」は、抗原特異性および結合親和性に寄与する抗体可変領域中のアミノ酸の配列を指す。一般に、各重鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）が、および各軽鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）がある。所与のＣＤＲのアミノ酸配列境界は、Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MDに記載されるもの（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）を含む、いくつかの周知のスキームのいずれかを使用して決定することができる。ＣＤＲ領域を決定する代わりの方法は、Ｃｈｏｔｈｉａ（Chothia et al. 1989, Nature, 342:877-883）によって考案された方法を使用する。Ｃｈｏｔｈｉａの定義は、構造的ループ領域の位置に基づく。ＣＤＲを規定するための他のシステムが存在し、当業者に公知である（例えば、http://www.bioinf.org.uk/abs/を参照）。ＣＤＲは抗原の認識および結合を担い、したがって、抗原結合性領域を含有すると仮定されている。この開示との関連で、ＣＤＲはＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの番号付けシステムを使用して規定されている。Ｋａｂａｔシステムを使用して規定されるＣＤＲは、「ＫａｂａｔのＣＤＲ」と指定される。Ｃｈｏｔｈｉａシステムを使用して規定されるＣＤＲは、「ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ」と指定される。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａのシステムを使用して予測されるＣＤＲは大部分重複するが、必ずしも同一であるとは限らない。したがって、抗体結合性領域は、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａのシステム（「Ｋａｂａｔ／ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ」）によって予測されるＣＤＲアミノ酸配列を併合することによって規定することもできる。抗原に実際に結合する一部のアミノ酸残基はＣＤＲの外部にあり、その結果として、さらなる抗体結合性領域／アミノ酸またはパラトープ領域を規定するために、Ｘ線結晶学およびＸ線回折データを使用することもできることが知られている。
用語「抗体結合性領域」、「抗体結合部位」および「パラトープ領域」は、この文書全体で同義的に使用され、抗体の軽鎖および重鎖両方の特異抗原と相互作用する可変領域の部分を指す。パラトープは、化学的相互作用（例えば、極性、非極性、水素結合／接触または塩橋）の確立によって抗原に結合する、抗体の可変領域に含まれるひと続きのアミノ酸または単独のアミノ酸からなる。ＣＤＲ（例えば、Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａシステムに基づいて予測される）は、抗体のＫａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａパラトープと総称される。この開示との関連で、パラトープは、抗体／抗原の結合／合併に関与する抗体のアミノ酸残基からなり、抗原まで５Å以内の距離にあるアミノ酸が、抗体／抗原結合に関与すると考えられる。パラトープは、Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａにより規定されるＣＤＲアミノ酸、ならびに抗体／抗原の結合／合併に関与する、所与の抗体の可変軽鎖および／または重鎖領域のフレームワーク領域に含まれるアミノ酸を含むことができる。Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａに基づくパラトープ予測の他に、Ｘ線結晶学／Ｘ線回折データを使用して所与の抗体の完全なパラトープを識別することができる。
抗体との関連で使用されるとき、「その機能的断片」というフレーズは、抗原結合性領域（単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片および／またはｓｃＦｖ断片）を含む、完全長抗体のタンパク質断片を指し、ここで、（ｉ）前記断片は、抗原に特異的に結合する能力を保持するか、または、（ｉｉ）別の抗体（配列交換）または抗体様構造への前記機能的断片の移入／融合の後、抗原（例えば、ＴＧＦβ−２の一部）に特異的に結合する能力は保持される。抗体の「機能的断片」の例には、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片であるＦａｂ断片；ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ）２断片；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al., 1989 Nature 341:544-546）；ならびに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え方法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対になって一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423-426；およびHuston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883を参照）としてそれらが作製されることを可能にする合成リンカーによって連結することができる。そのような単鎖抗体も、抗体の「機能的断片」という用語の中に包含されるものである。これらの抗体断片は、当業者に公知である従来の技術を使用して得られ、断片は元の抗体と同様に有用性についてスクリーニングされる。
一態様では、本開示のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、ＫａｂａｔまたはＣｏｔｈｉａによって、またはＫａｂａｔおよびＣｏｔｈｉａによって規定される以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む
（ｉ）配列番号１〜３、１１〜１３、２１〜２３、３１〜３３、４１〜４３、５１〜５３、６１〜６３、７１〜７３、８１〜８３、９１〜９３、１０１〜１０３もしくは１１１〜１１３に列挙されるＫａｂａｔのＣＤＲ、または
（ｉｉ）配列番号４〜６、１４〜１６、２４〜２６、３４〜３６、４４〜４６、５４〜５６、６４〜６６、７４〜７６、８４〜８６、９４〜９６、１０４〜１０６もしくは１１４〜１１６に列挙されるＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ、または、
（ｉｉｉ）配列番号１２４〜１２９に列挙されるＫａｂａｔ／ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ。
本開示のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、配列番号１、２１、４１、６１、８１、１０１または４、２４、４４、６４、８４、１０４または１２４〜１２９からなる群から選択される配列に少なくとも８０％、９０％、９５％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２、２２、４２、６２、８２、１０２または５、２５、４５、６５、８５、１０５からなる群から選択される配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３、２３、４３、６３、８３、１０３または６、２６、４６、６６、８６、１０６からなる群から選択される配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１１、３１、５１、７１、９１、１１１または１４、３４、５４、７４、９４、１１４からなる群から選択される配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１２、３２、５２、７２、９２、１１２または１５、３５、５５、７５、９５、１１５からなる群から選択される配列に少なくとも８０％、９０％、９５％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１３、３３、５３、７３、９３、１１３または１６、３６、５６、７６、９６、１１６からなる群から選択される配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
本開示のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、配列番号７、２７、４７、６７、８７または１０７の少なくとも１つに少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するＶＨポリペプチド配列を含む。
本開示のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、配列番号１７、３７、５７、７７、９７または１１７の少なくとも１つに少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＶＬポリペプチド配列を含む。
本開示のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、配列番号７、２７、４７、６７、８７または１０７の少なくとも１つに少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＶＨポリペプチド配列、および配列番号１７、３７、５７、７７、９７または１１７の少なくとも１つに少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するＶＬポリペプチド配列を含む。
当業者は、２つのＤＮＡまたはタンパク質配列の同一性を評価するために使用することができる方法を知っている。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を測定するために、配列を最適な比較目的のために整列させる（例えば、最適なアラインメントのために第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、非相同配列は比較目的のために無視することができる）。配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の測定は、数学アルゴリズムを使用して達成することができる。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれている、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（(1970) J. Mol. Biol. 48:444-453）アルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５または６のレングスウェイトを使用して測定される。さらに別の好ましい実施形態では、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）中のＧＡＰプログラムを使用して、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよび４０、５０、６０、７０または８０のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５または６のレングスウェイトを使用して測定される。パラメータの特に好ましいセット（特記しない限り使用されると予想されるもの）は、１２のギャップペナルティ、４のギャップ伸長ペナルティおよび５のフレームシフトギャップペナルティによるＢｌｏｓｕｍ６２スコアリングマトリックスである。２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（(1989) CABIOS, 4: 11-17）のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０ウェイトレジデュ表、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを使用して測定することができる。本明細書に記載される核酸およびタンパク質配列は、公開データベースで検索を実行するための「クエリー配列」として使用することができる。そのような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実行することができる。本発明の核酸（配列番号１）分子に相同的なヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索をＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワードレングス＝１２で実行することができる。本発明のタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３で実行することができる。比較目的のためにギャップがあるアラインメントを得るために、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されているようにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照。
本開示のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、配列番号１、２１、４１、６１、８１、１０１または４、２４、４４、６４、８４、１０４または１２４〜１２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２、２２、４２、６２、８２、１０２または５、２５、４５、６５、８５、１０５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３、２３、４３、６３、８３、１０３または６、２６、４６、６６、８６、１０６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１１、３１、５１、７１、９１、１１１または１４、３４、５４、７４、９４、１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１２、３２、５２、７２、９２、１１２または１５、３５、５５、７５、９５、１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１３、３３、５３、７３、９３、１１３または１６、３６、５６、７６、９６、１１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
これらの抗体の各々はＴＧＦ−β２に結合することができるので、ＶＨ ＣＤＲ１、２および３の配列、ならびにＶＬ ＣＤＲ１、２および３の配列を「ミックスおよびマッチさせる」ことができる。そのような「ミックスおよびマッチさせた」抗体のＴＧＦ−β２結合は、上記のおよび実施例の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用して試験することができる。ＶＨ ＣＤＲ配列をミックスおよびマッチさせるとき、特定のＶＨ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、構造的に類似したＣＤＲ配列で置き換えると予想される。同様に、ＶＬ ＣＤＲ配列をミックスおよびマッチさせるとき、特定のＶＬ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、構造的に類似したＣＤＲ配列で置き換えると予想される。１つまたは複数のＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ領域の配列を、本発明のモノクローナル抗体について本明細書に示すＣＤＲ配列からの構造的に類似した配列で置換することによって、新規のＶＨおよびＶＬ配列を作製することができることは、当業技術者に容易に明白になる。
本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、（Ａ）配列番号１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号１３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
別の実施形態では、上記の（Ａ）の抗体は、配列番号１２４の重鎖可変領域ＣＤＲ１を含む。
本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、（Ｂ）配列番号４の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号６の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号１６の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
別の実施形態では、上記の（Ｂ）の抗体は、配列番号１２４の重鎖可変領域ＣＤＲ１を含む。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体は、（Ｃ）：配列番号１、２および３のＣＤＲを含む可変重鎖、ならびに配列番号１１、１２および１３のＣＤＲを含む可変軽鎖からなり、前記抗体の可変重鎖および可変軽鎖フレームワーク領域は、配列番号７の可変重鎖（ＶＨ）配列のフレームワーク領域および配列番号１７の可変軽鎖（ＶＬ）配列のフレームワーク領域に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性をそれぞれ有する。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体は、（Ｄ）：配列番号４、５および６のＣＤＲを含む可変重鎖、ならびに配列番号１４、１５および１６のＣＤＲを含む可変軽鎖からなり、前記抗体の可変重鎖および可変軽鎖フレームワーク領域は、配列番号７の可変重鎖（ＶＨ）配列のフレームワーク領域および配列番号１７の可変軽鎖（ＶＬ）配列のフレームワーク領域に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性をそれぞれ有する。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体は、（Ｅ）：配列番号６１、６２および６３のＣＤＲを含む可変重鎖、ならびに配列番号７１、７２および７３のＣＤＲを含む可変軽鎖からなり、前記抗体の可変重鎖および可変軽鎖フレームワーク領域は、配列番号６７の重鎖配列（ＶＨ）のフレームワーク領域および配列番号７７の軽鎖配列（ＶＬ）のフレームワーク領域に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性をそれぞれ有する。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、（Ｆ）配列番号６１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号６２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号６３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号７１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号７２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号７３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、上記の抗体（Ｆ）は、配列番号１２７の重鎖可変領域ＣＤＲ１を含む。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、（Ｆ２）配列番号６１の重鎖可変ドメインＣＤＲ１；配列番号６２の重鎖可変ドメインＣＤＲ２；配列番号６３の重鎖可変ドメインＣＤＲ３；配列番号７１の軽鎖可変ドメインＣＤＲ１；配列番号７２の軽鎖可変ドメインＣＤＲ２；および配列番号７３の軽鎖可変ドメインＣＤＲ３を含み、前記抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインフレームワーク領域は、配列番号６７の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および配列番号７７の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のフレームワーク領域に少なくとも９５％の配列同一性をそれぞれ有する。別の実施形態では、上記の抗体（Ｆ２）は、配列番号１２７の重鎖可変ドメインＣＤＲ１を含む。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、（Ｇ）：（ｉ）配列番号６１、６２および６３のＣＤＲ、ならびに（ｉｉ）１位のアミノ酸Ｑおよび９９位のアミノ酸Ｒを含む重鎖可変ドメイン；ならびに（ｉｉｉ）配列番号７１、７２および７３のＣＤＲ、ならびに（ｉｖ）４９位のアミノ酸Ｆを含む軽鎖可変ドメインを含み、前記抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインフレームワーク領域は、配列番号６７の重鎖可変ドメイン配列（ＶＨ）および配列番号７７の軽鎖可変ドメイン配列（ＶＬ）のフレームワーク領域に少なくとも９５％の配列同一性をそれぞれ有し、（ｉｉ）および（ｉｖ）に指摘されるアミノ酸の位置は、配列番号６７および７７の１位、９９位および４９位にそれぞれ対応する。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、（Ｈ）配列番号６４の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号６５の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号６６の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号７４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号７５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号７６の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、上記の抗体（Ｈ）は、配列番号１２７の重鎖可変領域ＣＤＲ１を含む。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、（Ｈ１）配列番号６４の重鎖可変ドメインＣＤＲ１；配列番号６５の重鎖可変ドメインＣＤＲ２；配列番号６６の重鎖可変ドメインＣＤＲ３；配列番号７４の軽鎖可変ドメインＣＤＲ１；配列番号７５の軽鎖可変ドメインＣＤＲ２；および配列番号７６の軽鎖可変ドメインＣＤＲ３を含み、前記抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインフレームワーク領域は、配列番号６７の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および配列番号７７の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のフレームワーク領域に少なくとも９５％の配列同一性をそれぞれ有する。別の実施形態では、上記の抗体（Ｈ１）は、配列番号１２７の重鎖可変ドメインＣＤＲ１を含む。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、（Ｈ２）：（ｉ）配列番号６４、６５および６６のＣＤＲ、ならびに（ｉｉ）１位のアミノ酸Ｑおよび９９位のアミノ酸Ｒを含む重鎖可変ドメイン；ならびに（ｉｉｉ）配列番号７４、７５および７６のＣＤＲ、ならびに（ｉｖ）４９位のアミノ酸Ｆを含む軽鎖可変ドメインを含み、前記抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインフレームワーク領域は、配列番号６７の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および配列番号７７の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のフレームワーク領域に少なくとも９５％の配列同一性をそれぞれ有し、（ｉｉ）および（ｉｖ）に指摘されるアミノ酸の位置は、配列番号６７および７７の１位、９９位および４９位にそれぞれ対応する。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、（Ｉ）：以下のアミノ酸：（ｉ）１位のＱ、３１位のＴ、３２位のＳ、３４位のＭ、５５位のＷ、５６位のＮ、５８位のＤ、９９位のＲ、１０１位のＦ、１０２位および１０３位のＹ、１０４位のＳ、１０６位のＹおよび１０８位のＤ、を含む重鎖可変ドメイン、ならびに以下のアミノ酸：（ｉｉ）３２位のＹ、４９位のＦ、５３位のＳ、５４位のＬ、５５位のＱ、５６位のＳ、９１位のＴ、９２位のＮおよび９３位のＴ、を含む軽鎖可変ドメインを含み、前記抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインフレームワーク領域は、配列番号６７の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および配列番号７７の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のフレームワーク領域に少なくとも９５％の配列同一性をそれぞれ有し、（ｉ）および（ｉｉ）で指摘するアミノ酸の位置は、配列番号６７の位置１、３１、３２、３４、５５、５６、５８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６および１０８に、ならびに配列番号７７の位置３２、４９、５３、５４、５５、５６、９１、９２および９３にそれぞれ対応する。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、（Ｉ１）：（ｉ）ＴＧＦβ−２ダイマーに結合するとき、前記抗原まで５Å以内の距離にある位置１、３１、３２、３４、５５、５６、５８、９９、１０１〜１０４、１０６および１０８のアミノ酸を含む重鎖可変ドメイン、ならびに（ｉｉ）ＴＧＦβ−２ダイマーに結合するとき、抗原まで５Å以内の距離にある位置３２、４９、５３〜５６および９１〜９３のアミノ酸を含む軽鎖可変ドメインを含み、（ｉ）および（ｉｉ）で指摘するアミノ酸の位置は、配列番号６７の位置１、３１、３２、３４、５５、５６、５８、９９、１０１〜１０４、１０６および１０８に、ならびに配列番号７７の位置３２、４９、５３〜５６、９１、９２および９３にそれぞれ対応する。
別の実施形態では、上記の抗体（Ｉ２）またはその機能的断片は、重鎖可変ドメインの位置１、３１、３２、３４、５５、５６、５８、９９、１０１〜１０４、１０６および１０８に、配列番号６７の重鎖可変ドメインタンパク質の同じ位置にあるそれらと同じアミノ酸を含み、軽鎖可変ドメインの位置３２、４９、５３〜５６および９１〜９３に、配列番号７７の軽鎖可変ドメインタンパク質の同じ位置にあるそれらと同じアミノ酸を含む。
別の実施形態では、上記の抗体（Ｉ３）またはその機能的断片は、重鎖可変ドメインの位置１、３１、３２、３４、５５、５６、５８、９９、１０１〜１０４、１０６および１０８に、配列番号６７の重鎖可変ドメインタンパク質の同じ位置にあるアミノ酸と類似した側鎖を有するアミノ酸を含み、重鎖可変ドメインの位置３２、４９、５３〜５６および９１〜９３に、配列番号７７の重鎖可変ドメインタンパク質の同じ位置にあるアミノ酸と類似した側鎖を有するアミノ酸を含む。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、（Ｉ４）：以下のアミノ酸：ＴＧＦβ−２ダイマーに結合するとき、抗原まで５Å以内の距離にある、１位のＱ、３１位のＴ、３２位のＳ、３４位のＭ、５５位のＷ、５６位のＮ、５８位のＤ、９９位のＲ、１０１位のＦ、１０２位および１０３位のＹ、１０４位のＳ、１０６位のＹおよび１０８位のＤ、を含む重鎖可変ドメイン、ならびに以下のアミノ酸：ＴＧＦβ−２ダイマーに結合するとき、抗原まで５Å以内の距離にある、３２位のＹ、４９位のＦ、５３位のＳ、５４位のＬ、５５位のＱ、５６位のＳ、９１位のＴ、９２位のＮおよび９３位のＴ、を含む軽鎖可変ドメインを含み、前記抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインフレームワーク領域は、配列番号６７の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および配列番号７７の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のフレームワーク領域に少なくとも９５％の配列同一性をそれぞれ有する。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、（Ｊ）配列番号２１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号２３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、上記の抗体（Ｊ）は、配列番号１２５の重鎖可変領域ＣＤＲ１を含む。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体は、（Ｋ）：配列番号２１、２２および２３のＣＤＲを含む可変重鎖、ならびに配列番号３１、３２および３３のＣＤＲを含む可変軽鎖からなり、前記抗体の可変重鎖および可変軽鎖フレームワーク領域は、配列番号２９の重鎖配列（ＶＨ）のフレームワーク領域および配列番号３９の軽鎖配列（ＶＬ）のフレームワーク領域に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性をそれぞれ有する。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、（Ｌ）配列番号２１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号２３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３；および配列番号１３１および１３２のフレームワークパラトープ領域を含む。別の実施形態では、上記の抗体（Ｌ）は、配列番号１２５の重鎖可変領域ＣＤＲ１を含む。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、（Ｍ）配列番号２４の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２５の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号２６の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３６の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、上記の抗体（Ｍ）は、配列番号１２５の重鎖可変領域ＣＤＲ１を含む。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、（Ｎ）配列番号２４の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２５の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号２６の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３６の軽鎖可変領域ＣＤＲ３；および配列番号１３１および１３２のパラトープ領域を含む。別の実施形態では、上記の抗体（Ｎ）は、配列番号１２５の重鎖可変領域ＣＤＲ１を含む。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、（Ｏ）配列番号４１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号４２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号４３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号５１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号５３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、上記の抗体（Ｏ）は、配列番号１２６の重鎖可変領域ＣＤＲ１を含む。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体は、（Ｐ）：配列番号４１、４２および４３のＣＤＲを含む可変重鎖、ならびに配列番号５１、５２および５３のＣＤＲを含む可変軽鎖からなり、前記抗体の可変重鎖および可変軽鎖フレームワーク領域は、配列番号４７の重鎖配列（ＶＨ）のフレームワーク領域および配列番号５７の軽鎖配列（ＶＬ）のフレームワーク領域に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性をそれぞれ有する。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、（Ｑ）配列番号４４の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号４５の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号４６の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号５４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号５６の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、上記の抗体（Ｑ）は、配列番号１２６の重鎖可変領域ＣＤＲ１を含む。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、（Ｒ）配列番号８１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号８２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号８３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号９１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号９２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号９３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、上記の抗体（Ｒ）は、配列番号１２８の重鎖可変領域ＣＤＲ１を含む。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体は、（Ｓ）：配列番号８１、８２および８３のＣＤＲを含む可変重鎖、ならびに配列番号９１、９２および９３のＣＤＲを含む可変軽鎖からなり、前記抗体の可変重鎖および可変軽鎖フレームワーク領域は、配列番号８７の重鎖配列（ＶＨ）のフレームワーク領域および配列番号９７の軽鎖配列（ＶＬ）のフレームワーク領域に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性をそれぞれ有する。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、（Ｔ）配列番号８４の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号８５の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号８６の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号９４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号９５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号９６の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、上記の抗体（Ｔ）は、配列番号１２８の重鎖可変領域ＣＤＲ１を含む。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、（Ｕ）配列番号１０１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１０２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１０３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１１１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１１２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号１１３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、上記の抗体（Ｕ）は、配列番号１２９の重鎖可変領域ＣＤＲ１を含む。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体は、（Ｖ）：配列番号１０１、１０２および１０３のＣＤＲを含む可変重鎖、ならびに配列番号１１１、１１２および１１３のＣＤＲを含む可変軽鎖からなり、前記抗体の可変重鎖および可変軽鎖フレームワーク領域は、配列番号１０７の重鎖配列（ＶＨ）のフレームワーク領域および配列番号１１７の軽鎖配列（ＶＬ）のフレームワーク領域に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性をそれぞれ有する。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、（Ｗ）配列番号１０４の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１０５の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１０６の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１１４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１１５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号１１６の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、上記の抗体（Ｗ）は、配列番号１２９の重鎖可変領域ＣＤＲ１を含む。
別の好ましい実施形態では、上記のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体（Ａ）〜（Ｗ）またはその機能的断片は、ＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β３に関するその解離定数の少なくとも２０００分の１の解離定数で、ヒトＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３より優先的にヒトＴＧＦ−β２に結合し、抗体はヒトＴＧＦ−β２を中和するが、ＴＧＦ−β３を中和せず、ヒトＴＧＦ−β２に１ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）で結合する。別の実施形態では、本開示のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体は、配列番号９、２９、４９、６９、８９および１０９からなる群から選択される少なくとも１つの配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する完全長重鎖アミノ酸配列を含む。
一実施形態では、本開示のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体は、配列番号１９、３９、５９、７９、９９および１１９からなる群から選択される少なくとも１つの配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する完全長軽鎖アミノ酸配列を含む。
一実施形態では、本開示のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体は、配列番号９、２９、４９、６９、８９および１０９からなる群から選択される少なくとも１つの配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する完全長重鎖アミノ酸配列、および、配列番号１９、３９、５９、７９、９９および１１９からなる群から選択される少なくとも１つの配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する完全長軽鎖アミノ酸配列を含む。
一態様では、本発明は、
（ａ）配列番号７の可変重鎖配列および配列番号１７の可変軽鎖配列；（ｂ）配列番号２７の可変重鎖配列および配列番号３７の可変軽鎖配列；（ｃ）配列番号４７の可変重鎖配列および配列番号５７の可変軽鎖配列；（ｄ）配列番号６７の可変重鎖配列および配列番号７７の可変軽鎖配列；（ｅ）配列番号８７の可変重鎖配列および配列番号９７の可変軽鎖配列；または（ｆ）配列番号１０７の可変重鎖配列および配列番号１１７の可変軽鎖配列を含む、ヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片をさらに提供する。
別の実施形態では、ヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、ＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β３に関するその解離定数の少なくとも２０００分の１の解離定数で、ヒトＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３より優先的にヒトＴＧＦ−β２に結合し、抗体はヒトＴＧＦ−β２を中和するが、ＴＧＦ−β３を中和せず、ヒトＴＧＦ−β２に１ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）で結合し、抗体またはその機能的断片は：（ａ）配列番号７の可変重鎖配列および配列番号１７の可変軽鎖配列；（ｂ）配列番号２７の可変重鎖配列および配列番号３７の可変軽鎖配列；（ｃ）配列番号４７の可変重鎖配列および配列番号５７の可変軽鎖配列；（ｄ）配列番号６７の可変重鎖配列および配列番号７７の可変軽鎖配列；（ｅ）配列番号８７の可変重鎖配列および配列番号９７の可変軽鎖配列；または（ｆ）配列番号１０７の可変重鎖配列および配列番号１１７の可変軽鎖配列を含む。
本発明は、
（ａ）配列番号９の重鎖配列および配列番号１９の軽鎖配列；
（ｂ）配列番号２９の重鎖配列および配列番号３９の軽鎖配列；
（ｃ）配列番号４９の重鎖配列および配列番号５９の軽鎖配列；
（ｄ）配列番号６９の重鎖配列および配列番号７９の軽鎖配列；
（ｅ）配列番号８９の重鎖配列および配列番号９９の軽鎖配列；または
（ｆ）配列番号１０９の重鎖配列および配列番号１１９の軽鎖配列
を含む、ヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体を提供する。
ＭＯＲ１４７９９：本明細書でＭＯＲ１４７９９と呼ばれる本開示のモノクローナル抗体は、配列番号９の重鎖配列および配列番号１９の軽鎖配列を含む。ＭＯＲ１４７９９は、配列番号７の可変重鎖配列および配列番号１７の可変軽鎖配列を含む。ＭＯＲ１４７９９は、配列番号１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号１３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、ＭＯＲ１４７９９は、配列番号１２４の重鎖可変領域ＣＤＲ１を含む。ＭＯＲ１４７９９の重鎖および重鎖可変領域は、配列番号１０および８のポリヌクレオチド配列によってそれぞれコードされる。ＭＯＲ１４７９９の軽鎖および軽鎖可変領域は、配列番号２０および１８のポリヌクレオチド配列によってそれぞれコードされる。（ｉ）ｈＴＧＦβ−２に関する抗体ＭＯＲ１４７９９のＫＤ値は１．０８Ｅ−１５Ｍであり、（ｉｉ）ＴＧＦβ−１への検出可能な結合がなく、および（ｉｉｉ）ｈＴＧＦβ−３に関するＫＤ値は１．９９Ｅ−１１Ｍである（表４を参照）。このことから、ＴＧＦβ２に関するＭＯＲ１４７９９のＫＤ値は、ＴＧＦβ３に関するものの１８０００分の１より低いことになる。さらにそのようなアッセイの検出限界近くの極めて低いＫＤ値からもたらされる可能な測定誤差を考慮するために、１００ｆＭ以下のＫＤ値について合意することによって、ＭＯＲ１４７９９のＫＤ値測定のより控え目な解釈を適用するときでさえ、ＴＧＦβ２に関するＭＯＲ１４７９９のＫＤ値は、ＴＧＦβ３に関するもののなお２００分の１である。これらのデータは、先行技術の抗体に対するＭＯＲ１４７９９の意外な優位性を例示するが、その理由は、Thompson et al (J Immunol Methods. 1999 Jul 30;227(1-2):17-29)によって公開されたデータに基づくと、（ｉ）ｈＴＧＦβ−２に関する先行技術抗体ＣＡＴ−１５２のＫＤ値は０．８９ｎＭであり、（ｉｉ）ｈＴＧＦβ−３に関するＫＤ値は１０ｎＭであるからである。このことから、ＴＧＦβ２に関するＣＡＴ−１５２のＫＤ値は、ＴＧＦβ３に関するもののちょうど１１分の１になる。本明細書で提供される実験データに基づいて、ＴＧＦβ２に関するＣＡＴ−１５２のＫＤ値は７．３Ｅ−１１Ｍであり、ｈＴＧＦβ−３に関するＫＤ値は１．１８Ｅ−０９Ｍであり、これは、ＴＧＦβ３に関するもののわずか１６分の１である、ＴＧＦβ２に関するＣＡＴ−１５２のＫＤ値をもたらす。
本明細書で提供される実験データに基づいて、ＴＧＦβ２に関する１Ｄ１１のＫＤ値は１．１７Ｅ−１０Ｍであり、ｈＴＧＦβ−３に関するＫＤ値は２．０Ｅ−１１Ｍであり、これは、ＴＧＦβ３に関するもののわずか１７分の１である、ＴＧＦβ２に関する１Ｄ１１のＫＤ値をもたらす。
ＭＯＲ１４８００：本明細書でＭＯＲ１４８００と呼ばれる本開示のモノクローナル抗体は、配列番号２９の重鎖配列および配列番号３９の軽鎖配列を含む。ＭＯＲ１４８００は、配列番号２７の可変重鎖配列および配列番号３７の可変軽鎖配列を含む。ＭＯＲ１４８００は、配列番号２１の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号２３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、ＭＯＲ１４８００は、配列番号１２５の重鎖可変領域ＣＤＲ１を含む。ＭＯＲ１４８００の重鎖および重鎖可変領域は、配列番号３０および２８のポリヌクレオチド配列によってそれぞれコードされる。ＭＯＲ１４８００の軽鎖および軽鎖可変領域は、配列番号４０および３８のポリヌクレオチド配列によってそれぞれコードされる。（ｉ）ｈＴＧＦβ−２に関する抗体ＭＯＲ１４８００のＫＤ値は４．３４Ｅ−１６Ｍであり、（控え目な推定１００ｆＭ）、（ｉｉ）ＴＧＦβ−１への検出可能な結合がなく、および（ｉｉｉ）ＴＧＦβ−３への検出可能な結合がない（表４）。したがって、抗体ＭＯＲ１４８００は、ＴＧＦβ１ともＴＧＦβ３とも全く反応しない。これらのデータは、先行技術の抗体に対するＭＯＲ１４８００の意外な優位性を例示する。
本開示の別の実施形態では、モノクローナル抗体ＭＯＲ１４８００は、配列番号２１の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号２３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３；ならびに配列番号１３１および１３２のフレームワークパラトープ領域を含む。別の実施形態では、上記の抗体ＭＯＲ１４８００は、配列番号１２５の重鎖可変領域ＣＤＲ１を含む。
ＭＯＲ１４８０９：本明細書でＭＯＲ１４８０９と呼ばれる本開示のモノクローナル抗体は、配列番号４９の重鎖配列および配列番号５９の軽鎖配列を含む。ＭＯＲ１４８０９は、配列番号４７の可変重鎖配列および配列番号５７の可変軽鎖配列を含む。ＭＯＲ１４８０９は、配列番号４１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号４２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号４３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号５１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号５３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗体ＭＯＲ１４８０９は、配列番号１２６の重鎖可変領域ＣＤＲ１を含む。ＭＯＲ１４８０９の重鎖および重鎖可変領域は、配列番号５０および４８のポリヌクレオチド配列によってそれぞれコードされる。ＭＯＲ１４８０９の軽鎖および軽鎖可変領域は、配列番号６０および５８のポリヌクレオチド配列によってそれぞれコードされる。（ｉ）ｈＴＧＦβ−２に関する抗体ＭＯＲ１４８０９のＫＤ値は５．２４Ｅ−１４Ｍであり（控え目な推定１００ｆＭ）、（ｉｉ）ＴＧＦβ−１への検出可能な結合がなく、および（ｉｉｉ）ＴＧＦβ−３への検出可能な結合がない（表４を参照）。したがって、抗体ＭＯＲ１４８０９は、ＴＧＦβ−１ともＴＧＦβ−３とも全く反応しない。これらのデータは、先行技術の抗体に対するＭＯＲ１４８０９の意外な優位性を例示する。
ＭＯＲ１４７９７：本明細書でＭＯＲ１４７９７と呼ばれる本開示のモノクローナル抗体は、配列番号６９の重鎖配列および配列番号７９の軽鎖配列を含む。ＭＯＲ１４７９７は、配列番号６７の可変重鎖配列および配列番号７７の可変軽鎖配列を含む。ＭＯＲ１４７９７は、配列番号６１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号６２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号６３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号７１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号７２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号７３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗体ＭＯＲ１４７９７は、配列番号１２７の重鎖可変領域ＣＤＲ１を含む。ＭＯＲ１４７９７の重鎖および重鎖可変領域は、配列番号７０および６８のポリヌクレオチド配列によってそれぞれコードされる。ＭＯＲ１４７９７の軽鎖および軽鎖可変領域は、配列番号８０および７８のポリヌクレオチド配列によってそれぞれコードされる。（ｉ）ｈＴＧＦβ−２に関する抗体ＭＯＲ１４７９７のＫＤ値は４．４６Ｅ−１５Ｍであり、（ｉｉ）ＴＧＦβ−１への検出可能な結合がなく、および（ｉｉｉ）ｈＴＧＦβ−３に関するＫＤ値は２．７４Ｅ−０８Ｍである（表４）。このことから、ＴＧＦβ−２に関するＭＯＲ１４７９７のＫＤ値は、ＴＧＦβ−３に関するものの６００万分の１であることになる。さらにそのようなアッセイの検出限界近くの極めて低いＫＤ値からもたらされる可能な測定誤差を考慮するために、１００ｆＭ以下のＫＤ値について合意することによって、ＭＯＲ１４７９９のＫＤ値測定のより控え目な解釈を適用するときでさえ、ＴＧＦβ２に関するＭＯＲ１４７９７のＫＤ値は、ＴＧＦβ−３に関するもののなお２７００００分の１と予想される。これらのデータは、先行技術の抗体に対するＭＯＲ１４７９７の意外な優位性を例示する。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号６１、６２および６３のＣＤＲならびに（ｉｉ）１位のアミノ酸Ｑおよび９９位のアミノ酸Ｒを含む重鎖可変ドメイン；ならびに（ｉｉｉ）配列番号７１、７２および７３のＣＤＲならびに（ｉｖ）４９位のアミノ酸Ｆを含む軽鎖可変ドメインを含み、前記抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインフレームワーク領域は、配列番号６７の重鎖可変ドメイン配列（ＶＨ）および配列番号７７の軽鎖可変ドメイン配列（ＶＬ）のフレームワーク領域に少なくとも９８％の配列同一性をそれぞれ有し、（ｉｉ）および（ｉｖ）に指摘されるアミノ酸の位置は、配列番号６７および７７の１位、９９位および４９位にそれぞれ対応する。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号６４、６５および６６のＣＤＲならびに（ｉｉ）１位のアミノ酸Ｑおよび９９位のアミノ酸Ｒを含む重鎖可変ドメイン；ならびに（ｉｉｉ）配列番号７４、７５および７６のＣＤＲならびに（ｉｖ）４９位のアミノ酸Ｆを含む軽鎖可変ドメインを含み、前記抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインフレームワーク領域は、配列番号６７の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および配列番号７７の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のフレームワーク領域に少なくとも９８％の配列同一性をそれぞれ有し、（ｉｉ）および（ｉｖ）に指摘されるアミノ酸の位置は、配列番号６７および７７の１位、９９位および４９位にそれぞれ対応する。
ＭＯＲ１４８０５：本明細書でＭＯＲ１４８０５と呼ばれる本開示のモノクローナル抗体は、配列番号８９の重鎖配列および配列番号９９の軽鎖配列を含む。ＭＯＲ１４８０５は、配列番号８７の可変重鎖配列および配列番号９７の可変軽鎖配列を含む。ＭＯＲ１４８０５は、配列番号８１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号８２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号８３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号９１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号９２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号９３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗体ＭＯＲ１４８０５は、配列番号１２８の重鎖可変領域ＣＤＲ１を含む。ＭＯＲ１４８０５の重鎖および重鎖可変領域は、配列番号９０および８８のポリヌクレオチド配列によってそれぞれコードされる。ＭＯＲ１４８０５の軽鎖および軽鎖可変領域は、配列番号１００および９８のポリヌクレオチド配列によってそれぞれコードされる。（ｉ）ｈＴＧＦβ−２に関する抗体ＭＯＲ１４８０５のＫＤ値は９．７０Ｅ−１３Ｍであり、（ｉｉ）ＴＧＦβ−１への検出可能な結合がなく、および（ｉｉｉ）ｈＴＧＦβ−３に関するＫＤ値は７．０５Ｅ−１１Ｍである（表４を参照）。このことから、ＴＧＦβ−２に関するＭＯＲ１４８０５のＫＤ値は、ＴＧＦβ−３に関するものの７３分の１であることになる。これらのデータは、先行技術の抗体に対するＭＯＲ１４８０５の意外な優位性を例示する。
ＭＯＲ１４７８７：本明細書でＭＯＲ１４７８７と呼ばれる本開示のモノクローナル抗体は、配列番号１０９の重鎖配列および配列番号１１９の軽鎖配列を含む。ＭＯＲ１４７８７は、配列番号１０７の可変重鎖配列および配列番号１１７の可変軽鎖配列を含む。ＭＯＲ１４７８７は、配列番号１０１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１０２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１０３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１１１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１１２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号１１３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗体ＭＯＲ１４７８７は、配列番号１２９の重鎖可変領域ＣＤＲ１を含む。ＭＯＲ１４７８７の重鎖および重鎖可変領域は、配列番号１１０および１０８のポリヌクレオチド配列によってそれぞれコードされる。ＭＯＲ１４７８７の軽鎖および軽鎖可変領域は、配列番号１２０および１１８のポリヌクレオチド配列によってそれぞれコードされる。（ｉ）ｈＴＧＦβ−２に関する抗体ＭＯＲ１４７８７のＫＤ値は７．３８Ｅ−１６Ｍであり、（ｉｉ）ＴＧＦβ−１への検出可能な結合がなく、および（ｉｉｉ）ＴＧＦβ−３への検出可能な結合がない（表４を参照）。したがって、抗体ＭＯＲ１４７８７は、ＴＧＦβ−１ともＴＧＦβ−３とも全く反応しない。これらのデータは、先行技術の抗体に対するＭＯＲ１４７８７の意外な優位性を例示する。
高い結合親和性／選択性で抗ＴＧＦ−β２抗体を中和することは、有害事象と関連する可能性のある他の経路に対する干渉をより引き起こしそうにない。本発明の抗体は、ＴＧＦβアイソフォーム１および３に結合および／または中和しない。さらに、本発明の抗体は、同じかまたは関連した代謝経路において活性である他のタンパク質に結合しない。特に、本発明の抗体は、ヒトタンパク質ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−８、アクチビンＡ、アクチビンＢおよびアクチビンＡ／Ｂ（「反標的」）に結合しない。したがって、一実施形態では、本発明は本明細書に開示される抗体ＭＯＲ１４７９９、ＭＯＲ１４８００、ＭＯＲ１４８０９、ＭＯＲ１４７９７、ＭＯＲ１４８０５またはＭＯＲ１４７８７に関し、前記抗体は、１００ｎＭのＩｇＧ抗体まで反標的ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−８、アクチビンＡ、アクチビンＢおよびアクチビンＡ／Ｂを中和しない。
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を有し、これらの配列の１つまたは複数は、本明細書に記載される抗体またはその保存的改変に基づく指定されたアミノ酸配列を有し、抗体は本発明の抗ＴＧＦβ−２抗体の所望の機能特性を保持する。したがって、本発明は、（ａ）配列番号１〜３、１１〜１３、２１〜２３、３１〜３３、４１〜４３、５１〜５３、６１〜６３、７１〜７３、８１〜８３、９１〜９３、１０１〜１０３、１１１〜１１３および１２４〜１２９もしくはその保存的改変からなる群から選択される、またはｂ）配列番号４〜６、１４〜１６、２４〜２６、３４〜３６、４４〜４６、５４〜５６、６４〜６６、７４〜７６、８４〜８６、９４〜９６、１０４〜１０６、１１４〜１１６および１２４〜１２９もしくはその保存的改変からなる群から選択される、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、からなる単離された組換え抗ＴＧＦβ−２抗体またはその機能的断片を提供する。好ましくは、そのような抗体は、以下の機能特性の少なくとも１つを示す：（ｉ）ヒトＴＧＦ−β２を１５０ｐＭ未満、または１０７ｐＭ未満、または１００ｐＭ未満、または８０ｐＭ未満、または３０ｐＭ未満、または２０ｐＭ未満、または１０ｐＭ未満の最大半減抑制濃度（ＩＣ５０）で中和し、およびＳｍａｄ依存性リポーター遺伝子アッセイによって測定される場合、１００ｎＭを超える最大半減抑制濃度（ＩＣ５０）でヒトＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β３を中和する、または（ｉｉ）ヒトＴＧＦ−β２を、約１ｐＭから約１５０ｐＭの間、または約１ｐＭから約１０７ｐＭの間、または約１ｐＭから約８０ｐＭの間の最大半減抑制濃度（ＩＣ５０）で中和し、およびＳｍａｄ依存性リポーター遺伝子アッセイによって測定される場合、１００ｎＭを超える最大半減抑制濃度（ＩＣ５０）でヒトＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β３を中和する。そのような抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であってもよい。
他の実施形態では、哺乳動物細胞での発現のために最適化される本発明の抗体は、完全長重鎖配列および完全長軽鎖配列を有し、これらの配列の１つまたは複数は、本明細書に記載される抗体またはその保存的改変に基づく指定されたアミノ酸配列を有し、抗体は本発明の抗ＴＧＦβ−２抗体の所望の機能特性を保持する。したがって、本発明は、配列番号９、２９、４９、６９、８９および１０９の完全長重鎖配列、ならびに配列番号１９、３９、５９、７９、９９または１１９の完全長軽鎖配列からなる、哺乳動物細胞での発現のために最適化される単離されたモノクローナル抗ＴＧＦβ−２抗体を提供し、ここで、前記配列に保存的改変が導入されている。様々な実施形態では、抗体は、上記の機能特性の一方または両方を提示することができる。そのような抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であってもよい。
本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤアイソタイプであってよく、特に、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４アイソタイプのヒト重鎖定常領域から選択される。本明細書で用いるように、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によって提供される抗体クラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ２）を指す。
本発明のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体または機能的断片は、Ｆｃ領域の突然変異により変更されたエフェクター機能を有することができる。さらなる実施形態では、本発明の抗体はＩｇＧ１アイソタイプであり、Ｆｃ領域の突然変異により変更されたエフェクター機能を有する。一実施形態では、前記変更されたエフェクター機能は、低減された抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性である。一実施形態では、前記変更されたエフェクター機能は、抑制されたＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性である。ＦｃＲγ結合を抑止し、エフェクター機能を減弱するために、２３４位および２３５位のロイシンがアラニンに突然変異されたサイレントＩｇＧ１ＬＡＬＡフォーマットに、抗体を変換することもできる。抗体定常領域を変更する方法は、当技術分野で公知である。変更された機能、例えばエフェクターリガンド、例えば細胞上のＦｃＲ、または補体のＣ１構成成分への親和性の変更を有する抗体は、抗体の定常部分の少なくとも１つのアミノ酸残基を異なる残基で置き換えることによって生成することができる（例えば、欧州特許第３８８１５１号；米国特許第５，６２４，８２１号を参照）。マウスまたは他の種の免疫グロブリンに適用される場合、これらの機能を低下または消失させるだろう、類似の種類の変更が記載されるかもしれない。
本発明の抗ＴＧＦ−β２抗体と同じエピトープに結合する抗体
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される本発明の様々な特異的抗ＴＧＦ−β２抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。したがって、本発明は、配列番号６７の重鎖可変ドメインおよび配列番号７７の軽鎖可変ドメインを含む抗体によって認識されるエピトープに結合する、抗体またはその機能的断片を提供する。したがって、本発明は、抗体ＭＯＲ１４７９７によって認識されるエピトープに結合する抗体またはその機能的断片を提供する。結晶化および構造決定の後、本発明の好ましい抗体の結合性領域がより明らかに規定された。したがって、本発明は、ヒトＴＧＦβ−２タンパク質の鎖Ａのアミノ酸ＬＥＵ３０４、ＡＳＮ３１６、ＰＲＯ３５１、ＴＹＲ３５２、ＬＥＵ３５３、ＴＲＰ３５４、ＳＥＲ３５５、ＳＥＲ３５６、ＧＬＮ３５９、ＡＲＧ３６２、ＶＡＬ３６３、ＬＥＵ３６６、ＴＨＲ３６９およびＩＬＥ３７０ならびにヒトＴＧＦβ−２タンパク質の鎖ＢのＬＹＳ３２７、ＧＬＹ３３１、ＴＲＰ３３２、ＬＹＳ３３３、ＴＲＰ３３４、ＴＹＲ３９２、ＩＬＥ３９４、ＬＹＳ３９９、ＧＬＵ４０１およびＬＥＵ４０３を含むヒトＴＧＦβ−２タンパク質のエピトープに結合する抗体を提供する。
したがって、本発明は、配列番号２７の重鎖可変ドメインおよび配列番号３７の軽鎖可変ドメインを含む抗体によって認識されるエピトープに結合する、抗体またはその機能的断片を提供する。したがって、本発明は、抗体ＭＯＲ１４８００によって認識されるエピトープに結合する抗体またはその機能的断片を提供する。したがって、本発明は、ヒトＴＧＦβ−２タンパク質の鎖Ａのアミノ酸ＧＬＹ２９、ＴＲＰ３０、ＬＹＳ３１、ＴＲＰ３２、ＴＹＲ９０、ＴＹＲ９１、ＩＬＥ９２、ＧＬＵ９９、ＬＥＵ１０１およびＭＥＴ１０４、ならびにヒトＴＧＦβ−２タンパク質の鎖ＢのＡＬＡ１、ＬＥＵ２、ＡＳＰ３、ＡＬＡ５、ＴＹＲ６、ＡＳＮ１０、ＡＳＮ１４、ＰＲＯ４９、ＴＹＲ５０、ＬＥＵ５１、ＴＲＰ５２、ＳＥＲ５３、ＳＥＲ５４、ＡＳＰ５５、ＧＬＮ５７、ＡＲＧ６０、ＶＡＬ６１、ＬＥＵ６４、ＧＬＮ８１、ＬＹＳ１１０を含むヒトＴＧＦβ−２タンパク質のエピトープに結合する抗体を提供する。
工学操作および改変された抗体
本発明の抗体は、改変された抗体を工学的に操作するための出発材料として、本明細書に示すＶＨおよび／またはＶＬ配列の１つまたは複数を有する抗体を使用してさらに調製することができ、この改変された抗体は、出発抗体から変更された特性を有することができる。一方または両方の可変領域（すなわちＶＨおよび／またはＶＬ）の中の、例えば、１つまたは複数のＣＤＲ領域の中および／または１つまたは複数のフレームワーク領域の中の１つまたは複数の残基を改変することによって、抗体を工学的に操作することができる。さらに、または代わりに、例えば抗体のエフェクター機能を変更するために、定常領域の中の残基を改変することによって、抗体を工学的に操作することができる。実行することができる可変領域工学操作の１つのタイプは、抗体結合性領域／パラトープまたはＣＤＲ移植である。パラトープ配列は抗体抗原相互作用の役割を担うので、異なる特性を有する異なる抗体からのフレームワーク配列の上に接がれた特異的な天然に存在する抗体からのＣＤＲ／パラトープ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特異的な天然に存在する抗体の特性を模倣した組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327；Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525；Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033；Ｗｉｎｔｅｒへの米国特許第５，２２５，５３９号、および米国特許第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；Ｑｕｅｅｎらへの第５，６９３，７６２号および第６，１８０，３７０号を参照）。
したがって、本発明の別の実施形態は、（ａ）配列番号１〜３、１１〜１３、２１〜２３、３１〜３３、４１〜４３、５１〜５３、６１〜６３、７１〜７３、８１〜８３、９１〜９３、１０１〜１０３、１１１〜１１３および１２４〜１２９、またはｂ）配列番号４〜６、１４〜１６、２４〜２６、３４〜３６、４４〜４６、５４〜５６、６４〜６６、７４〜７６、８４〜８６、９４〜９６、１０４〜１０６、１１４〜１１６および１２４〜１２９に列挙される配列の群から選択される相補性決定領域配列の混合を含む、単離されたモノクローナル抗ＴＧＦβ−２抗体またはその機能的断片に関する。したがって、そのような抗体は、開示される抗体のＶＨおよびＶＬ ＣＤＲ配列を含有するが、これらの抗体と異なるフレームワーク配列を含有することができる。そのようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは公開された参照から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース（インターネットのwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで利用可能）、ならびにKabat, E. A.ら［上記］；Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. fol. Biol. 227:776-798；およびCox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836で見出すことができる。
本発明の抗体で使用するためのフレームワーク配列の例は、本発明の選択される抗体によって使用されるフレームワーク配列に構造的に類似したもの、例えば、本発明のモノクローナル抗体によって使用されるコンセンサス配列および／またはフレームワーク配列である。ＶＨ ＣＤＲ１、２および３配列、ならびにＶＬ ＣＤＲ１、２および３配列は、そのフレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子に見出されるものと同一の配列を有するフレームワーク領域に移植することができるか、または、生殖系列配列と比較して１つまたは複数の突然変異を含有するフレームワーク領域にＣＤＲ配列を移植することができる。例えば、ある特定の場合には、抗体の抗原結合能力を維持または強化するために、フレームワーク領域の中の残基を突然変異させることが有益であることが見出されている（例えば、米国特許第５，５３０，１０１号；米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許第５，６９３，７６２号および米国特許第６，１８０，３７０号を参照）。別のタイプの可変領域改変は、ＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域の中のアミノ酸残基を突然変異させ、それによって「親和性成熟」として知られる目的の抗体の１つまたは複数の結合特性（例えば、親和性）を改善することである。突然変異を導入するために、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発を実行することができ、抗体結合性または目的の他の機能特性に及ぼす影響は、本明細書に記載され、実施例に提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイで評価することができる。保存的改変（本明細書で議論される）を導入することができる。突然変異は、アミノ酸の置換、付加または欠失であってよい。さらに、一般的にＣＤＲ領域の中の１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ以下の残基が変更される。
代わりのフレームワークまたは足場への抗原結合性ドメインの移植
結果として生じるポリペプチドがＴＧＦβ−２に特異的に結合する少なくとも１つの結合性領域を含む限り、多種多様の抗体／免疫グロブリンフレームワークまたは足場を用いることができる。そのようなフレームワークまたは足場には、ヒト免疫グロブリンの５つの主なイディオタイプまたはその断片（本明細書の他の場所で開示されるものなど）が含まれ、ヒト化態様を好ましくは有する、他の動物種の免疫グロブリンが含まれる。この点に関しては、ラクダ科の動物で同定されたものなどの単一重鎖抗体が特に興味がある。当業者によって、新規のフレームワーク、足場および断片が継続して発見され、開発されている。
ラクダ科の動物の抗体
ラマ種（ラマ・パッコス（Lama paccos）、ラマ・グラマ（Lama glama）およびラマ・ビキューナ（Lama vicugna））などの新世界の種を含むラクダおよびヒトコブラクダ科のメンバー（カメルス・バクトリアヌス（Camelus bactrianus）およびカメルス・ドロマデリウス（Camelus dromaderius））から得た抗体タンパク質が、サイズ、構造的複雑性およびヒト対象への抗原性に関して特徴付けられている。天然に見出されるこの科の哺乳動物からのある特定のＩｇＧ抗体は軽鎖を欠き、したがって、２つの重鎖および２つの軽鎖を有する、他の動物からの抗体の一般的な４つの鎖の四次構造と構造的に異なる（国際公開第９４／０４６７８を参照）。ＶＨＨと同定された小さい単一の可変ドメインであるラクダ科の動物の抗体の領域を遺伝子操作によって得、標的に高い親和性を有する小さいタンパク質を生成し、「ラクダ科の動物のナノボディ」として知られる低分子量抗体誘導タンパク質をもたらすことができる（米国特許第５，７５９，８０８号；Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261；Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788；Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448；Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62；およびLauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520を参照）。ラクダ科の動物の抗体および抗体断片の工学操作ライブラリーは、例えば、Ａｂｌｙｎｘ、Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから市販されている。非ヒト起源の他の抗体と同様に、ラクダ科の動物の抗体のアミノ酸配列を組換えで変更してヒト配列により緊密に類似する配列を得ることができ、すなわち、ナノボディを「ヒト化」することができる。したがって、ヒトに対するラクダ科の動物の抗体の天然の低い抗原性は、さらに低減させることができる。ラクダ科の動物のナノボディは、ヒトＩｇＧ分子のそれの概ね１／１０の分子量を有し、このタンパク質はわずか数ナノメートルの物理的直径を有する。小さいサイズの１つの結果は、より大きな抗体タンパク質に機能的に不可視である抗原性部位に結合するラクダ科の動物のナノボディの能力であり、すなわち、ラクダ科の動物のナノボディは、さもなければ古典的な免疫学的技術を用いると潜在性である抗原を検出する試薬として、および可能性がある治療剤として有益である。したがって、小さいサイズのさらに別の結果は、ラクダ科の動物のナノボディが、標的タンパク質の溝または狭い裂け目の中の特異的部位に結合する結果として阻害することができ、したがって、古典的な抗体のそれより古典的な低分子量薬物の機能により緊密に類似する能力で役目を果たすことができるということである。低分子量およびコンパクトなサイズは、極めて耐熱性で、極端なｐＨおよびタンパク分解に安定であり、抗原性に劣るラクダ科の動物のナノボディをさらにもたらす。別の結果は、ラクダ科の動物のナノボディが循環系から組織に容易に移動し、さらに脳血液関門を通過して、神経組織に影響する障害を処置することができるということである。ナノボディは脳血液関門を越える薬物輸送をさらに促進することができる（米国特許出願公開第２００４／０１６１７３８号を参照）。ヒトへの低い抗原性と組み合わさったこれらの特徴は、大きな治療的潜在能力を示す。さらに、これらの分子は大腸菌（E. coli）などの原核細胞で完全に発現させることができ、バクテリオファージとの融合タンパク質として発現され、機能的である。したがって、本発明の特徴は、例えば国際公開第９４／０４６７８号に記載されるように、本発明のヒト抗体の重鎖または軽鎖のＣＤＲ配列をナノボディまたは単一ドメイン抗体フレームワーク配列に移植することによって得られる、ラクダ科の動物の抗体である。
非抗体足場
公知の非免疫グロブリンフレームワークまたは足場には、アドネクチン（フィブロネクチン）（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、アンキリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｌｔｄ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）およびＡｂｌｙｎｘ ｎｖ（Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ））、リポカリン（アンチカリン）（Ｐｉｅｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ ＡＧ、Ｆｒｅｉｓｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、小モジュール式の免疫医薬（Ｔｒｕｂｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、マキシボディ（Ａｖｉｄｉａ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ））、プロテインＡ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＧ、Ｓｗｅｄｅｎ）およびアフィリン（ガンマ−クリスタリンまたはユビキチン）（Ｓｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ、Ｈａｌｌｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、タンパク質エピトープ模倣体（Ｐｏｌｙｐｈｏｒ Ｌｔｄ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）が限定されずに含まれる。
（ｉ）フィブロネクチン足場
フィブロネクチン足場は、好ましくはフィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン（例えば、フィブロネクチンタイプＩＩＩの第１０モジュール（１０Ｆｎ３ドメイン））に基づく。フィブロネクチンタイプＩＩＩドメインは、それ自身互いに対してパックされてタンパク質のコアを形成し、β鎖を互いと接続して、溶媒に曝露されるループ（ＣＤＲに類似している）をさらに含有している、２つのβシートの間に分配される７つまたは８つのβ鎖を有する。ベータシートサンドイッチの各エッジに少なくとも３つのそのようなループがあり、そこでは、エッジはベータ鎖の方向に直角であるタンパク質の境界である（米国特許第６，８１８，４１８号）。これらのフィブロネクチンをベースとした足場は免疫グロブリンでないが、全体の折重なりは、ラクダおよびラマのＩｇＧでの全体の抗原認識単位を含む最も小さな機能的抗体断片、重鎖の可変領域のそれに緊密に関係する。この構造のため、非免疫グロブリン抗体は、性質および親和性が抗体のそれらに類似する抗原結合特性を模倣する。これらの足場は、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗体の親和性成熟の過程に類似する、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのループランダム化およびシャフリング戦略で使用することができる。これらのフィブロネクチンをベースとした分子は足場として使用することができ、そこでは、標準のクローニング技術を使用して分子のループ領域を本発明のＣＤＲで置き換えることができる。
フレームワークまたはＦｃの工学操作
本発明の工学操作抗体には、例えば抗体の特性を改善するために、ＶＨおよび／またはＶＬの中のフレームワーク残基に改変が加えられたものが含まれる。一般的に、そのようなフレームワーク改変は、抗体の免疫原性を減少させるために加えられる。例えば、１つのアプローチは、１つまたは複数のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系配列に「復帰突然変異」させることである。より具体的には、体細胞突然変異を経た抗体は、その抗体が由来する生殖細胞系配列と異なるフレームワーク残基を含有することができる。抗体のフレームワーク配列を抗体が由来する生殖細胞系配列と比較することによって、そのような残基を同定することができる。それらの生殖細胞系構成にフレームワーク領域配列を戻すために、体細胞突然変異を、例えば部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発によって生殖細胞系配列に「復帰突然変異」させることができる。そのような「復帰突然変異」した抗体も、本発明に包含されるものである。フレームワーク改変の別のタイプは、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって抗体の潜在的な免疫原性を低減するために、フレームワーク領域の中で、または１つもしくは複数のＣＤＲ領域の中でさえも１つまたは複数の残基を突然変異させることを含む。このアプローチは「脱免疫化」とも呼ばれ、米国特許出願公開第２００３／０１５３０４３号にさらに詳細に記載されている。フレームワークまたはＣＤＲ領域に加えられる改変に加えて、またはその代替で、抗体の１つまたは複数の機能的特性、例えば血清中半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存性細胞傷害活性を一般的に変化させるために、本発明の抗体は、Ｆｃ領域中の改変を含むように工学操作することができる。さらに、同じく抗体の１つまたは複数の機能的特性を変化させるために、本発明の抗体は、化学的に改変する（例えば、１つまたは複数の化学部分を抗体に付着することができる）か、またはそのグリコシル化を変化させるように改変することができる。一実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域のシステイン残基の数が変化するように、例えば増加または減少するように改変される。このアプローチは、米国特許第５，６７７，４２５号においてさらに記載される。ＣＨ１のヒンジ領域のシステイン残基の数は、例えば軽鎖および重鎖のアセンブリーを促進するか、または抗体の安定性を増減するために変更される。別の実施形態では、抗体は、その生物学的半減期を増加させるために改変される。様々なアプローチが可能である。例えば、米国特許第６，２７７，３７５号に記載されているように、以下の突然変異の１つまたは複数を導入することができる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。あるいは、生物学的半減期を増加させるために、米国特許第５，８６９，０４６号および米国特許第６，１２１，０２２号に記載の通り、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループからとられるサルベージ受容体結合性エピトープを含有するように、抗体をＣＨ１またはＣＬ領域の中で変化させることができる。さらに他の実施形態では、抗体のエフェクター機能を変化させるために、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えることによって、Ｆｃ領域を変化させる。例えば、抗体がエフェクターリガンドに対して変化した親和性を有するが、親抗体の抗原結合能力を保持するように、１つまたは複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。それに対する親和性が変化させられるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であってもよい。このアプローチは、両方ともＷｉｎｔｅｒらによる、米国特許第５，６２４，８２１号および米国特許第５，６４８，２６０号にさらに詳細に記載される。特に、残基２３４および２３５を突然変異させることができる。特に、これらの突然変異は、アラニンへのものであってよい。したがって、一実施形態では、本発明の抗体は、Ｆｃ領域中のアミノ酸２３４および２３５の一方または両方の突然変異を有する。別の実施形態では、アミノ酸２３４および２３５の一方または両方をアラニンに置換することができる。アラニンへのアミノ酸２３４および２３５の両方の置換は、低下したＡＤＣＣ活性をもたらす。さらに別の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸を改変することによって抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増加させるために、および／またはＦｃγ受容体への抗体の親和性を増加させるために、Ｆｃ領域を改変する。このアプローチは、国際公開第００／４２０７２号においてさらに記載される。さらに、ＦｃγＲｌ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに関するヒトＩｇＧ１の上の結合部位がマッピングされ、向上した結合を有する変異体が記載された（Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604を参照）。さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化が改変される。例えば、無グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、抗体はグリコシル化を欠く）。例えば抗原への抗体の親和性を増加させるために、グリコシル化を変化させることができる。そのような炭水化物改変は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つまたは複数の部位を変化させることによって達成することができる。例えば、１つまたは複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位の消去をもたらし、それによってその部位のグリコシル化を消去する、１つまたは複数のアミノ酸置換を加えることができる。そのような無グリコシル化は、抗原への抗体の親和性を増加させることができる。そのようなアプローチは、Ｃｏらによる米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５０，８６１号にさらに詳細に記載される。さらに、または代わりに、変化したタイプのグリコシル化を有する抗体、例えば低減された量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体、または増加した二分ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体を作製することができる。そのような変化したグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが実証されている。そのような炭水化物改変は、例えば変化したグリコシル化機構を有する宿主細胞で抗体を発現させることによって達成することができる。変化したグリコシル化機構を有する細胞は当技術分野で記載されており、本発明の組換え抗体を発現させ、それによって変化したグリコシル化を有する抗体を生成するための宿主細胞として使用することができる。例えば、Ｈａｎｇらによる欧州特許第１，１７６，１９５号は、そのような細胞系で発現される抗体が低フコシル化を示すように、機能的に破壊された、フコシル転移酵素をコードするＦＵＴ８遺伝子を有する細胞系を記載する。したがって、一実施形態では、本発明の抗体は低フコシル化パターンを示す細胞系、例えばフコシル基転移酵素をコードするＦＵＴ８遺伝子の欠損発現を有する哺乳動物細胞系での組換え発現によって生成される。国際公開第０３／０３５８３５号は、フコースをＡｓｎ（２９７）連結炭水化物に付着させる能力が低下し、その宿主細胞で発現される抗体の低フコシル化をももたらす変異体ＣＨＯ細胞系、Ｌｅｃｌ３細胞を記載する（Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照する）。国際公開第９９／５４３４２号は、工学操作された細胞系で発現される抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらす二分化ＧｌｃＮａｃ構造の増加を示すように、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−Ｎアセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように工学操作された細胞系を記載する（Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180も参照する）。あるいは、本発明の抗体は、哺乳動物様グリコシル化パターンのために操作され、グリコシル化パターンとしてフコースを欠く抗体を生成することが可能である、酵母または糸状菌で生成することができる（例えば、欧州特許第１２９７１７２号明細書を参照）。
本発明の抗体をコードする核酸分子
用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖の形のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびそのポリマーを指す。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸に類似した結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドに類似の方法で代謝される、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。具体的には、変性コドン置換は、１つまたは複数の選択される（または全ての）コドンの第３位が混合基および／またはデオキシイノシン残基で置換される配列を生成することによって達成することができる（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)；およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。本発明の別の態様は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。完全長軽鎖ヌクレオチド配列の例は、配列番号２０、４０、６０、８０、１００または１２０に示す。完全長重鎖ヌクレオチド配列の例は、配列番号１０、３０、５０、７０、９０または１１０に示す。核酸は、完全細胞、細胞溶解物に存在することができるか、または部分的に精製されたか実質的に純粋な形の核酸であってもよい。アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当技術分野で周知である他を含む標準の技術によって、他の細胞構成成分または他の汚染物質、例えば他の細胞性核酸またはタンパク質から精製されるとき、核酸は「単離される」または「実質的に純粋にされる」。F. Ausubel, et al., ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照。本発明の核酸は、例えばＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、イントロン配列を含有しても含有しなくてもよい。一実施形態では、核酸はｃＤＮＡ分子である。核酸は、ファージディスプレイベクターまたは組換えプラスミドベクターなどのベクターに存在してもよい。本発明の核酸は、標準の分子生物学技術を用いて得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、さらに下で記載されるヒト免疫グロブリン遺伝子を運ぶトランスジェニックマウスから調製されるハイブリドーマ）によって発現される抗体については、ハイブリドーマによって作製される抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準のＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術によって得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから（例えば、ファージディスプレイ技術を使用して）得られる抗体については、抗体をコードする核酸は、ライブラリーのメンバーである様々なファージクローンから回収することができる。１つまたは複数の欠失、付加または置換を含む変異核酸配列も、本発明の範囲内に含まれる。一実施形態では、本発明は、配列番号８、１０、１８、２０、２８、３０、３８、４０、４８、５０、５８、６０、６８、７０、７８、８０、８８、９０、９８、１００、１０８、１１０、１１８または１２０の１つまたは複数を含む。遺伝子コードの同義性のために、アミノ酸は、１つより多いコドンによってコードすることができる。したがって、翻訳されるアミノ酸配列が同じままで、ヌクレオチド配列を修正することが可能である。
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られると、例えば可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準の組換えＤＮＡ技術によってこれらのＤＮＡ断片をさらに操作することができる。これらの操作では、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片を、別のＤＮＡ分子、または別のタンパク質、例えば抗体定常領域もしくはフレキシブルリンカーをコードする断片に作動可能に連結される。この文脈で使用するように、用語「作動可能に連結される」は、例えば、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように、またはタンパク質が所望のプロモーターの制御下で発現されるように、２つのＤＮＡ断片が機能的に連結されることを意味するものである。ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子にＶＨをコードするＤＮＡを作動可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で公知であり（例えば、Kabat, E. A., et al.［上記］を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準のＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であってよい。一部の実施形態では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１アイソタイプの中から選択される。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子については、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域だけをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することができる。ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子にＶＬをコードするＤＮＡを作動可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で公知であり（例えば、Kabat, E. A., et al.［上記］を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準のＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域であってよい。ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＬおよびＶＨ領域がフレキシブルリンカーによって連結された、連続した単鎖タンパク質としてＶＨおよびＶＬ配列を発現させることができるように、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片は、フレキシブルリンカーをコードする、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別の断片に作動可能に連結される（例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423-426；Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；McCafferty et al., 1990 Nature 348:552-554を参照）。
本発明のモノクローナル抗体の生成
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体方法論、例えばKohler and Milstein (1975 Nature 256: 495)の標準体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、様々な技術によって生成することができる。モノクローナル抗体を生成するための多くの技術、例えばＢリンパ球のウイルス性または腫瘍形成性の形質転換を用いることができる。ハイブリドーマを調製するための動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ生成は、確立された手順である。融合のための免疫化脾細胞の単離のための免疫化プロトコールおよび技術は、当技術分野で公知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順も公知である。
ヒトモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマの生成
本発明のヒトモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマを生成するために、免疫化されたマウスから脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離して、マウス骨髄腫細胞系などの適当な不死化細胞系に融合することができる。結果として生じるハイブリドーマは、抗原特異的抗体の生成についてスクリーニングすることができる。例えば、免疫化されたマウスからの脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を、５０％ＰＥＧでＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌性マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ １５８０）の数の１／６に融合することができる。平底マイクロタイタープレートに細胞を概ね２×１４５で平板培養し、続いて、２０％胎児クローン血清、１８％「６５３」馴化培地、５％オリゲン（ＩＧＥＮ）、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０：０５５ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン、および１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ；ＨＡＴは、融合の２４時間後に加えられる）を含有する選択培地に２週間インキュベートする。概ね２週後、ＨＡＴがＨＴで置き換えられた培地で細胞を培養することができる。次に、ヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体について個々のウェルをＥＬＩＳＡでスクリーニングすることができる。広範なハイブリドーマ増殖が起こると、通常１０〜１４日後に培地を観察することができる。抗体分泌ハイブリドーマを再び平板培養し、再びスクリーニングし、ヒトＩｇＧに関してなお陽性であるならば、限界希釈によってモノクローナル抗体を少なくとも２回サブクローニングすることができる。次に特徴付けのために組織培養培地で少量の抗体を生成するために、安定したサブクローンをｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することができる。ヒトモノクローナル抗体を精製するために、モノクローナル抗体精製のための２リットルのスピナーフラスコにおいて選択されたハイブリドーマを増殖させることができる。上清を濾過、濃縮してから、プロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で親和性クロマトグラフィーを行うことができる。純度を確認するために、溶出したＩｇＧをゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーによって検査することができる。緩衝溶液をＰＢＳに交換して、１．４３の吸光係数を使用してＯＤ２８０によって濃度を測定することができる。モノクローナル抗体を小分けして、−８０℃で保存することができる。
モノクローナル抗体を生成するトランスフェクトーマの生成
本発明の抗体は、例えば当技術分野で周知である（例えば、Morrison, S. (1985) Science 229:1202）組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション方法の組合せを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマで生成することもできる。例えば、抗体またはその抗体断片を発現させるには、標準の分子生物学技術（例えば、目的の抗体を発現するハイブリドーマを使用するＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング）によって、部分的または完全長の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを得ることができ、遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように、このＤＮＡを発現ベクターに挿入することができる。この関係で、用語「作動可能に連結する」は、ベクターの中の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するそれらの意図された機能を果たすように、抗体遺伝子がベクターの中にライゲーションされることを意味するものである。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用する発現宿主細胞に適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を別々のベクターに挿入することができるか、より一般的には、両方の遺伝子は同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は、標準の方法によって発現ベクターに挿入される（例えば、抗体遺伝子断片の上の相補的制限部位およびベクターのライゲーション、または制限部位が存在しない場合は平滑末端ライゲーション）。本明細書に記載される抗体の軽鎖および重鎖可変領域は、ＶＨセグメントがベクター中のＣＨセグメントに作動可能に連結され、ＶＬセグメントがベクター中のＣＬセグメントに作動可能に連結されるように、所望のアイソタイプの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を既にコードしている発現ベクターにそれらを挿入することによって、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を作製するために使用することができる。さらに、または代わりに、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、抗体鎖遺伝子をベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドであってもよく、または異種シグナルペプチド（すなわち、免疫グロブリン以外のタンパク質からのシグナルペプチド）であってもよい。抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞で抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を運ぶ。用語「調節配列」は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものである。そのような調節配列は、例えば、Goeddel（Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990）に記載されている。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等の因子によって決めることができることは、当業者に理解される。哺乳動物宿主細胞での発現のための調節配列には、哺乳動物細胞での高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルスエレメント、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーが含まれる。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはＰ−グロビンプロモーターなどの、非ウイルス調節配列を使用することができる。さらに、調節エレメントは、ＳＶ４０初期プロモーターからの配列および１型ヒトＴ細胞白血病ウイルスの長い末端反復配列を含有するＳＲａプロモーター系などの、異なる供給源からの配列で構成された（Takebe, Y. et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8:466-472）。抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞でのベクターの複製を調節する配列（例えば、複製開始点）および選択マーカー遺伝子などの、追加の配列を運ぶことができる。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号および第５，１７９，０１７号を参照）。例えば、一般的に、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートなどの薬物への耐性を付与する。選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ−宿主細胞でメトトレキセート選択／増幅で使用するため）およびネオ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）が含まれる。したがって、別の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＣＤＲ領域をコードする、配列番号８、１０、１８、２０、２８、３０、３８、４０、４８、５０、５８、６０、６８、７０、７８、８０、８８、９０、９８、１００、１０８、１１０、１１８もしくは１２０、またはその断片の１つまたは複数を含む、上記のクローニングまたは発現ベクターに関する。軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターが、標準の技術によって宿主細胞にトランスフェクトされる。用語「トランスフェクション」の様々な形態は、原核生物または真核生物の宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入のために一般的に使用される各種の技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含するものである。原核生物または真核生物の宿主細胞で本発明の抗体を発現させることは、理論的に可能である。真核生物の細胞、特に哺乳動物の宿主細胞での抗体の発現が議論されるが、その理由は、そのような真核生物の細胞、特に哺乳動物細胞は、適切に折り畳まれて免疫学的に活性な抗体を組み立て、分泌する可能性が原核細胞より高いからである。原核生物による抗体遺伝子の発現は、活性抗体の高収率生成のために有効でないことが報告されている（Boss, M. A. and Wood, C. R., 1985 Immunology Today 6:12-13）。本発明の組換え抗体を発現させるための哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（ＤＨ ＦＲ選択マーカー、例えばR.J. Kaufman and P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621に記載されているものと一緒に使用された、Urlaub and Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載されているｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が含まれる。一実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ Ｋ１ＰＤ細胞である。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞での使用のために、別の発現システムは、国際公開第８７／０４４６２号、国際公開第８９／０１０３６号および欧州特許第３３８，８４１号に示されるＧＳ遺伝子発現システムである。一実施形態では、本発明の組換え抗体を発現させるための哺乳動物宿主細胞には、ＦＵＴ８遺伝子発現が欠損した哺乳動物細胞系、例えば米国特許第６，９４６，２９２号に記載のものが含まれる。したがって、一態様では、本発明は、上記のまたは本明細書に開示されるベクターの１つまたは複数を含む宿主細胞を提供する。
抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入されるとき、宿主細胞での抗体の発現を可能にするかまたは宿主細胞を増殖させる培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な時間、宿主細胞を培養することによって抗体が生成される。抗体は、標準のタンパク質精製方法を用いて培地から回収することができる。したがって、本発明は、本発明のＴＧＦβ−２抗体またはその機能的断片の生成のための方法であって、上記の宿主細胞を培養すること、および抗体またはその機能的断片を単離することを含む方法を提供する。
医薬組成物
別の態様では、本発明は、本開示のＴＧＦβ−２抗体またはその機能的断片を含有する組成物、例えば医薬組成物を提供する。一実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化される。本発明の医薬組成物は、併用療法で投与すること、すなわち他の薬剤と組み合わせることもできる。例えば、ＴＧＦβ−２抗体またはその機能的断片は、少なくとも１つの筋肉質量／力増強剤、例えばＩＧＦ−１もしくはＩＧＦ−１の変異体、抗ミオスタチン抗体、抗アクチビン抗体、ミオスタチンプロペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢに結合するがそれを活性化しないミオスタチンデコイタンパク質、ＡｃｔＲＩＩＢデコイ受容体、β２アゴニスト、グレリンアゴニスト、ＳＡＲＭ、ＧＨアゴニスト／模倣体またはフォリスタチンと組み合わせることができる。本発明のＴＧＦβ−２抗体またはその機能的断片による処置は、コルチコステロイド、免疫抑制剤、抗サイトカイン剤、抗がん薬；増殖因子、例えばエリスロポイエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦまたは他；糖尿病の処置のために使用される薬物（インスリンおよび経口血糖降下剤を含む）、抗結核薬および抗生物質と組み合わせることができる。組合せは、小分子および生体分子の薬剤を含むことができる。
本発明の医薬組成物は単独の活性薬剤として、または、ＡｃｔＲＩＩＢ抗体、ＡｃｔＲＩＩＡ抗体またはＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢ汎特異的抗体と併用して投与することができる。例えば、本発明の薬物は、国際公開第２０１０１２５００３号に開示されるＡｃｔＲＩＩＢ抗体と併用することができる。用語「薬学的に許容される」は、連邦もしくは州政府の規制機関に承認されたこと、または、動物、より詳細にはヒトでの使用のために米国薬局方もしくは他の公認の薬局方に掲載されていることを意味する。用語「担体」は、治療薬が一緒に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。そのような医薬担体は、無菌の液体、例えば水および油、例えば、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などであってもよい。適する医薬用の賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが含まれる。組成物は、所望により、少量の湿潤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態をとることができる。組成物は、伝統的な結合剤および担体、例えばトリグリセリドで、坐薬として製剤化することができる。経口製剤は、標準の担体、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等を含むことができる。適する医薬担体の例は、E. W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。好ましい実施形態では、組成物は、ルーチンの手順に従ってヒトへの静脈内投与に適合させた医薬組成物として製剤化される。必要な場合、組成物は、可溶化剤および局所麻酔薬、例えばリドカインを、注射部位の疼痛を軽減するために含むこともできる。組成物を注入により投与する場合は、無菌の医薬グレードの水または食塩水を含有する注入ボトルにより注入することができる。組成物を注射により投与する場合は、成分を投与前に混合することができるように、無菌の注射用水または食塩水のアンプルが提供されてもよい。薬学的に許容される担体には、生理的に適合する任意の全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張性および吸収遅延剤などが含まれる。担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮の投与（例えば、注射または注入による）に適するものと予想される。投与経路に従い、活性化合物、すなわち抗体、イムノコンジュゲートまたは二重特異的分子は、化合物を酸の作用および化合物を不活性化するかもしれない他の天然の条件から保護する材料でコーティングしてもよい。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される抗酸化剤を含むこともできる。薬学的に許容される抗酸化剤の例には、以下のものが含まれる：水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；油溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファトコフェロールなど；および金属キレート化剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など。
本発明の医薬組成物で用いることができる、適する水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）および適するそれらの混合物、植物油、例えばオリーブ油、ならびに注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが含まれる。例えばレシチンなどのコーティング材の使用によって、分散液の場合は所望の粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。
これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含有することもできる。微生物の存在の防止は、上記の滅菌手順と様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノールなどの含有の両方によって確実なものにすることができる。組成物中に糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含めることも望ましいであろう。さらに、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの含有によって、注射用の医薬剤形の長期吸収をもたらすことができる。薬学的に許容される担体には、無菌の水性溶液または分散液、および無菌の注射用溶液または分散液の即座の調製のための無菌の粉末が含まれる。薬理学的に活性な物質に関するそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で公知である。いずれかの従来の媒体または薬剤が活性化合物と相容れない場合以外は、本発明の医薬組成物でのその使用が企図される。補助活性化合物を、組成物に組み込むこともできる。治療組成物は、製造および保存の条件下で一般的に無菌および安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度に適する他の注文構造に製剤化することができる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、および適するその混合物を含有する溶媒または分散媒体であってもよい。例えばレシチンなどのコーティング材の使用によって、分散液の場合は所望の粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。多くの場合には、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含めることができる。吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含ませることによって、注射可能な組成物の長期吸収をもたらすことができる。無菌の注射可能な溶液は、必要に応じて上に列挙された薬剤の１つまたは組合せと一緒に、適当な溶媒に必要な量で活性化合物を組み込み、続いて精密濾過滅菌を行うことによって調製することができる。一般に、分散液は、基礎的分散媒体および上に列挙されるものからの必要とされる他の薬剤を含有する無菌のビヒクルに活性化合物を組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合は、調製法は、活性薬剤と前もって濾過滅菌したその溶液からの任意の追加の所望の薬剤の粉末を与える、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。したがって、本発明は、本開示のＴＧＦβ−２抗体またはその機能的断片を含み、薬学的に許容される希釈剤または担体をさらに含む、医薬組成物を提供した。
単一の剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる活性薬剤の量は、処置する対象および特定の投与様式によって異なる。単一の剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる活性薬剤の量は、治療効果を生成する組成物の量に一般的になる。一般的に、薬学的に許容される担体と組み合わせた場合、１００パーセントのうち、この量は、約０．０００１パーセントから約１５パーセントの活性薬剤、約０．０１パーセントから約１０パーセント、または約０．１パーセントから約５パーセントの範囲の活性薬剤である。投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整される。例えば、単一のボーラスを投与することができるか、いくつかの分割用量を経時的に投与することができるか、または治療状況の緊急性によって指示される場合、用量をそれ相応に低減もしくは増加することができる。投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位剤形で非経口組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書で用いられる投薬単位剤形は、処置対象のための単回投薬量として適している物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な薬用担体と共同して所望の治療効果を生むように計算された活性化合物の所定量を含有する。本発明の投薬単位剤形の明細は、活性化合物の特異な特徴および達成すべき特定の治療効果、およびそのような活性化合物を個体の感受性の処置のために配合する技術に固有の限界によって決定づけられ、それに直接的に依存する。本開示のＴＧＦβ−２抗体もしくはその機能的断片または前記ＴＧＦβ−２抗体もしくはその機能的断片を含む組成物の治療的有効量は、宿主の体重あたり約０．００１から１５０ｍｇ／ｋｇ、または０．０１から３０ｍｇ／ｋｇ、より普通には０．１から１０ｍｇ／ｋｇの範囲内にある。当業者は適する有効用量を特定することを知っており、それは投与の経路（例えば、静脈内または皮下）によって異なる。例示的な処置療法は、１日につき１回、毎週１回、２週おきに１回、３週おきに１回、４週おきに１回または１カ月に１回の投与を必要とする。そのような投与は、静脈内または皮下で実行することができる。本開示のＴＧＦβ−２抗体またはその機能的断片のための投薬レジメンは、静脈内投与による０．０１ｍｇ／ｋｇ体重または０．１ｍｇ／ｋｇ体重または０．５ｍｇ／ｋｇ体重または１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重を含む。あるいは、組成物は持続放出製剤であってよく、その場合には、より低い頻度の投与が必要とされる。投薬量および頻度は、患者での抗体の半減期次第で異なる。投与の投薬量および頻度は、処置が予防的であるかまたは治療的であるかによって異なってもよい。予防的適用では、長期間にわたって比較的低い頻度の間隔で比較的低い投薬量が投与される。一部の患者は、残りの存命期間中、処置を受け続ける。治療的適用では、疾患の進行が低減もしくは終了するまで、または疾患の症状の部分的もしくは完全な改善を患者が示すまで、比較的短い間隔の比較的高い投薬量が時には必要とされる。その後、患者に予防的療法を投与することができる。本発明の医薬組成物中の活性薬剤の実際の投薬量レベルは、患者に毒性でなく、特定の患者、組成物および投与様式のために所望の治療応答を達成するのに有効である活性薬剤の量を得るように変更することができる。選択される投薬量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いられる特定の化合物の排泄速度、処置の持続時間、用いられる特定の組成物と併用される他の薬物、化合物および／または材料、処置患者の年齢、性別、体重、状態、健康状態および以前の病歴ならびに医療技術で周知の類似の因子を含む、様々な薬物動態学的因子による。例示的な処置療法は、毎週１回、２週おきに１回、３週おきに１回、４週おきに１回、１カ月に１回、３カ月に１回または３〜６カ月に１回の投与を必要とする。あるいは、抗体は、１年に約１回、または１回だけ投与することができる。そのような投与は、静脈内または皮下で実行することができる。本発明の抗ＴＧＦβ−２抗体のための投薬レジメンは、静脈内投与による０．１ｍｇ／ｋｇ体重または１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重を含むことができ、抗体は以下の例示される投与スケジュールの１つを使用して与えられる：４週おきに６回の投薬、その後３カ月おき；３週おき；３ｍｇ／ｋｇ体重を１回、続いて１ｍｇ／ｋｇ体重を３週おき。本発明の組成物に含まれる本開示のＴＧＦβ−２抗体またはその機能的断片の治療的有効用量の投与は、疾患症状の重症度の低下、疾患無症状期間の頻度および持続時間の増加、または、デュピュイトラン病患者における微細な動作能力を恒久的に阻害する、疾患苦痛による障害もしくは能力障害の予防、すなわち手のひらと指の間の強い線維組織の低減をもたらすことができる。患者は、ポリペプチド有効成分の有効量、すなわち問題の疾患または障害を検出、処置、寛解または予防するのに十分な量を受ける。治療効果は、身体症状の低減を含むこともできる。任意の特定の対象のための治療的タンパク質の最適な有効量および濃度は、患者の年齢、サイズ、健康状態および／または性別、状態の性質および程度、特定の治療的タンパク質の活性、体によるそのクリアランスの速度、さらに治療的タンパク質と組み合わせて投与される任意の可能なさらなる治療薬を含む様々な因子による。所与の状況のために送達される有効量は、ルーチンの実験によって決定することができ、臨床医の判断の範囲内である。投薬は、単回投与スケジュールまたは多回投与スケジュールによるものであってよい。
本発明の組成物は、当技術分野で公知の様々な方法の１つまたは複数を用いて１つまたは複数の投与経路を介して投与することができる。当業者が理解するように、投与の経路および／または様式は、所望の結果によって異なる。本発明の治療的タンパク質のための投与経路には、例えば注射または注入による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路が含まれる。本明細書で用いるように「非経口投与」という語句は、通常注射による、腸内および局所投与以外の投与様式を意味し、限定されずに、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊椎内、硬膜外および胸骨内の注射および注入が含まれる。一実施形態では、組成物を含む抗体は、静脈内投与される。別の実施形態では、抗体は、皮下に投与される。あるいは、本発明の組成物に含まれる本開示のＴＧＦβ−２抗体またはその機能的断片は、非非経口経路、例えば、局所、表皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下または局所によって投与することができる。
活性化合物は、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル送達系を含む制御放出製剤などの、急速な放出から化合物を保護する担体で調製することができる。生分解性、生体適合性のポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用することができる。そのような製剤の調製のための多くの方法は、特許を受けているか、または当業者に周知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照する。治療組成物は、当技術分野で公知の医療器具で投与することができる。例えば、一実施形態では、本発明の治療組成物は、無針皮下注射器具、例えば米国特許第５，３９９，１６３号；５，３８３，８５１号；５，３１２，３３５号；５，０６４，４１３号；４，９４１，８８０号；４，７９０，８２４号；または４，５９６，５５６号に示される器具で投与することができる。本発明において有益な周知のインプラントおよびモジュールの例には、以下のものが含まれる：制御された速度で医薬品を小出しするための植込み型マイクロ注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を介して医薬を投与するための治療器具を示す米国特許第４，４８６，１９４号；正確な注入速度で医薬品を送達するための医薬品注入ポンプを示す米国特許第４，４４７，２３３号；連続的薬物送達のための可変流量植込み型注入機器を示す米国特許第４，４４７，２２４号；マルチチャンバーコンパートメントを有する浸透圧薬物送達系を示す米国特許第４，４３９，１９６号；および、浸透圧薬物送達系を示す米国特許第４，４７５，１９６号。他の多くのそのようなインプラント、送達系およびモジュールが当業者に公知であり、例には、ＭｉｃｒｏＣＨＩＰＳＴＭ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）によって作製されたものが含まれる。
ある特定の実施形態では、本開示のＴＧＦβ−２抗体またはその機能的断片を含む組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏで適切な分布を確実なものにするために製剤化することができる。例えば、脳血液関門（ＢＢＢ）は多くの高親水性化合物を排除する。本発明の治療化合物がＢＢＢを通過することを（所望により）確実なものにするために；それらは、例えば、リポソームに製剤化することができる。リポソームの製造方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；第５，３７４，５４８号；および第５，３９９，３３１号を参照する。リポソームは、特異的細胞または器官に選択的に輸送され、したがって、標的化薬物送達を強化する１つまたは複数の部分を含むことができる（例えば、V.V. Ranade, 1989 J. Clin Pharmacol. 29:685を参照）。例示的な標的化部分には、葉酸またはビオチン（例えば、米国特許第５，４１６，０１６号を参照）；マンノシド（Umezawa et al., 1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）；抗体（P.G. Bloeman et al., 1995 FEBS Lett. 357:140；M. Owais et al., 1995 Antimicrob. Agents Chernother. 39:180）；界面活性剤プロテインＡ受容体（Briscoe et al., 1995 Am. J. Physiol.1233:134）；ｐ１２０（Schreier et al., 1994 J. Biol. Chem. 269:9090）；が含まれるが、K. Keinanen；M.L. Laukkanen, 1994 FEBSLett. 346:123；J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Imrnunomethods 4:273も参照する。
患者群
提案された処置から恩恵を受けることができる患者には、集中治療または長期入院（１週を超える）を必要とする急性または重大な病気から回復している患者；サルコペニアを有する虚弱な高齢患者；重度の外傷、例えば自動車事故、重度のやけど、戦闘負傷および他の外傷性損傷から回復している若年成人；上記のような、悪液質を引き起こすことが知られている慢性疾患を有する患者；ならびに、上記のような筋肉疾患を有する患者が含まれる。筋肉の損耗は、重度または長期にわたるほとんどの病気に一般的な合併症であるので、筋肉消耗からの復帰が、この損耗の根源に関係なく筋肉損耗を経験する患者の機能の回復および復活を速くすることが予期される。さらに、病的状態、例えば、デュピュイトラン病（手のひらと指の間で強い線維組織を形成し、微細な動作能力を恒久的に阻害する、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の過剰な生成によって特徴付けられる、手の良性線維増殖性疾患）線維形成、瘢痕化、がん、特定の状態、例えば、マルファン関連の状態、表皮水疱症、特に栄養障害型表皮水疱症または接合部表皮水疱症、線維柱帯切除術および皮膚の全身性硬化症を有する患者は、提案された処置の恩恵を受けることができる。
さらに、緑内障、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症およびフックスジストロフィーの患者は、提案された処置の恩恵を受けることができる。さらに、過剰増殖性障害、例えば、レダーホース病、ペイロニ病、指関節背結節症、五十肩、手の背の線維腫症、手根管圧迫症候群、結節性筋膜炎、攻撃的な線維腫症、振戦、白蝋病、ムービングフィンガー（手腕振動症候群（ＨＡＶＳ）としても知られる）、足底線維腫症およびギャロッドパッドの患者は、提案された処置の恩恵を受けることができる。線維症は、一般的に炎症または傷害の結果として体の多くの組織で起こることができ、例には以下が含まれる：肺、肝臓、心臓、膝、肩、他の関節。したがって、変性および線維性疾患、例えば、強皮症、肥大性瘢痕化およびケロイド、特発性肺線維症、心臓線維症（線維性心筋炎も）、心房性線維症、心内膜心筋線維症、肝臓線維症（例えば、ＮＡＳＨ）、肺線維症、腎臓線維症（例えば、アルポート症候群）、嚢胞性線維症、全身性硬化症、原発性骨髄線維症、関節線維症、アテローム硬化症および縦隔線維症を有する患者は、提案された処置の恩恵を受けることができる。
本発明の使用および方法
本発明の抗体は、治療的有用性を有する。例えば、これらの分子は、対象に投与することができ、疾患の処置、予防で、および疾患症状の開始を遅延させるために使用することができる。本発明は、療法において使用するための、または医薬としての、本発明のポリペプチド、核酸または医薬組成物を提供する。本発明は、病的障害の処置で使用するための、本発明のポリペプチド、核酸または医薬組成物をさらに提供する。本発明は、病的障害の処置のための医薬の製造における、本発明のポリペプチド、核酸または医薬組成物の使用をさらに提供する。本発明は、病的障害を患っている患者を処置する方法であって、前記患者に本発明のポリペプチド、核酸または医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む方法をさらに提供する。本明細書で用いるように、用語「対象」は、哺乳動物、例えば霊長類、好ましくはより高等な霊長類、例えばヒト（例えば、本明細書に記載される障害を有するまたはその危険がある患者）であってよい。一実施形態では、対象は、ヒト対象、例えば、異常なＴＧＦβ−２機能によって特徴付けられる障害または状態を有するヒト患者である。本発明は、病的障害を患っている患者を処置する方法であって、本開示のＴＧＦβ−２抗体またはその機能的断片の治療的有効量を投与することを含む方法を提供する。したがって、本発明は、病的障害を患っている患者を処置する方法であって、抗体ＭＯＲ１４７９９、ＭＯＲ１４８００、ＭＯＲ１４８０９、ＭＯＲ１４７９７、ＭＯＲ１４８０５またはＭＯＲ１４７８７の治療的有効量を投与することを含む方法を提供する。本発明は、療法において使用するための、本開示のＴＧＦβ−２抗体またはその機能的断片も提供する。したがって、本発明は、療法において使用するための、抗体ＭＯＲ１４７９９、ＭＯＲ１４８００、ＭＯＲ１４８０９、ＭＯＲ１４７９７、ＭＯＲ１４８０５またはＭＯＲ１４７８７を提供する。本明細書で用いるように、「病的障害」には、限定されずに、筋骨格疾患または障害、筋萎縮症、筋ジストロフィー、デュピュイトラン病、サルコペニア、外傷性損傷、悪液質を引き起こすことが知られている慢性疾患（例えば、がん）、病的状態、例えば線維症、マルファン関連の状態、表皮水疱症、特に栄養障害型表皮水疱症または接合部表皮水疱症、線維柱帯切除術、ロイス−ディーツ症候群、皮膚全身性硬化症、過剰増殖性障害、例えば、レダーホース病、ペイロニ病、指関節背結節症、五十肩、手の背の線維腫症、手根管圧迫症候群、結節性筋膜炎、攻撃的な線維腫症、振戦、白蝋病、ムービングフィンガー、足底線維腫症およびギャロッドパッドは提案された治療の恩恵を受けることができる、変性および線維性疾患、例えば、強皮症、肥大性瘢痕化およびケロイド、特発性肺線維症、心臓線維症（線維性心筋炎も）、肝臓線維症（例えば、ＮＡＳＨ）、肺線維症、腎臓線維症（例えば、アルポート）、嚢胞性線維症、全身性硬化症、原発性骨髄線維症、アテローム硬化症、緑内障、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症およびフックスジストロフィーが含まれる。表皮水疱症は表皮水疱症の任意の形態を指すが、特に栄養障害型表皮水疱症および接合部表皮水疱症を指す。
糖質コルチコイド、例えばコルチゾール、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロンまたはプレドニゾロンによる処置の結果を含む、筋萎縮症の多くの原因がある。筋萎縮症は、神経外傷による除神経の結果、または変性、代謝性もしくは炎症性神経障害（例えば、ギランバレー症候群、末梢神経障害または環境毒素もしくは薬物への曝露）の結果であってもよい。さらに、筋萎縮症は、ミオパシー、例えばミオトニー；ネマリンミオパシー、多重／ミニコアミオパシーおよび筋細管性（中心核）ミオパシーを含む先天性ミオパシー；ミトコンドリアのミオパシー；家族性周期性四肢麻痺；炎症性ミオパシー；例えばグリコーゲンまたは脂質貯蔵病によって引き起こされる代謝ミオパシー；皮膚筋炎；多発筋炎；封入体筋肉炎；骨化性筋炎；横紋筋融解およびミオグロビン尿症の結果であってよい。ミオパシーは、筋ジストロフィー症候群、例えば、デュシェンヌ、ベッカー、筋緊張性、筋膜肩甲上腕部、エメリー−ドライフス、眼球咽頭、肩甲上腕部、四肢肢帯、フクヤマ、先天性筋ジストロフィーまたは遺伝性末梢筋障害が引き起こすことができる。さらに、筋萎縮症は、成人の運動ニューロン疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症；乳児脊髄筋萎縮、若年性の脊髄筋萎縮、多病巣性伝導体ブロックによる自己免疫性運動神経障害、脳卒中または脊髄損傷による麻痺、外傷による骨格の固定化、長期ベッド療養、随意の不活動性、不随意の不活動性、代謝ストレスまたは栄養不足、がん、ＡＩＤＳ、絶食、甲状腺または副腎または下垂体障害、糖尿病、良性先天性緊張低下、筋中心軸病、肝疾患（線維症、肝硬変などの例）、敗血症、腎不全、うっ血性心不全、加齢、宇宙旅行または無重力環境で費やした時間、の結果であってもよい。本開示の別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、上記の病的障害の処置のために使用することができる。したがって、本発明の医薬組成物は、デュピュイトラン病の処置のために使用することができるか、筋ジストロフィーの処置のために使用することができるか、サルコペニアの処置のために使用することができるか、線維性状態の処置のために使用することができるか、マルファン関連の状態の処置のために使用することができるか、表皮水疱症、特に栄養障害型表皮水疱症または接合部表皮水疱症、ロイス−ディーツ症候群の処置のために使用することができるか、線維柱帯切除術の処置のために使用することができるか、皮膚全身性硬化症の処置のために使用することができる。一実施形態では、本発明は、デュピュイトラン病の処置、または筋ジストロフィーの処置、またはサルコペニアの処置、または線維性状態の処置、またはマルファン関連の状態の処置、または表皮水疱症、特に栄養障害型表皮水疱症もしくは接合部表皮水疱症の処置、または線維柱帯切除術の処置、または皮膚全身性硬化症の処置、またはロイス−ディーツ症候群の処置で使用するための、抗体ＭＯＲ１４７９９、ＭＯＲ１４８００、ＭＯＲ１４８０９、ＭＯＲ１４７９７、ＭＯＲ１４８０５またはＭＯＲ１４７８７を提供する。特定の実施形態では、ＭＯＲ１４７９９、ＭＯＲ１４８００、ＭＯＲ１４８０９、ＭＯＲ１４７９７、ＭＯＲ１４８０５およびＭＯＲ１４７８７からなる群から選択される抗体を含む本発明の医薬組成物は、デュピュイトラン病の処置またはロイス−ディーツ症候群の処置のために使用することができる。本開示の別の特定の実施形態では、ＭＯＲ１４７９９、ＭＯＲ１４８００、ＭＯＲ１４８０９、ＭＯＲ１４７９７、ＭＯＲ１４８０５およびＭＯＲ１４７８７からなる群から選択される抗体を含む本発明の医薬組成物は、筋ジストロフィーの処置のために使用することができる。さらなる状態には、悪液質、慢性関節リウマチと関連した悪液質およびがんと関連した悪液質が含まれる。別の実施形態では、本開示は筋肉障害を処置する方法であって、上記のように本発明の抗体またはその機能的断片の治療的有効量を投与することを含む方法に関する。したがって、本開示は筋肉障害を処置する方法であって、ＭＯＲ１４７９９、ＭＯＲ１４８００、ＭＯＲ１４８０９、ＭＯＲ１４７９７、ＭＯＲ１４８０５およびＭＯＲ１４７８７からなる群から選択される抗体の治療的有効量を投与することを含む方法に関する。筋肉質量を増加させるための開示されるポリペプチドまたはそれらを含む組成物による処置の必要性は、上述の状態の１つから、特に筋萎縮症などの筋骨格疾患または障害の結果として生じることができ、ここで、筋肉障害は、肥満関連のサルコペニア、サルコペニアおよび糖尿病関連の筋萎縮症からなる群から選択される筋萎縮症である。
さらに、本発明は、デュピュイトラン病、マルファン関連の状態またはマルファン病、表皮水疱症、線維柱帯切除術、ロイス−ディーツ症候群、皮膚全身性硬化症または筋骨格疾患または障害の処置のための医薬の製造のための、本発明の抗体またはその機能的断片、特にＭＯＲ１４７９９、ＭＯＲ１４８００、ＭＯＲ１４８０９、ＭＯＲ１４７９７、ＭＯＲ１４８０５およびＭＯＲ１４７８７からなる群から選択される抗体の使用に関する。
ＴＧＦ−βは、例えば、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、増殖および分化因子、アクチビンおよびインヒビンを含む、構造的に関係したサイトカインの大きなファミリーに属する。
正常状態の下で、ＴＧＦ−βはホメオスタシスを維持し、例えば、増殖抑制およびアポトーシスの応答の誘導を介して、上皮、内皮、ニューロンおよび造血細胞系統の増殖を制限する。正規のおよび非正規のシグナル伝達経路が、ＴＧＦ−βに対する細胞性応答に関与する。ＴＧＦ−β／Ｓｍａｄの正規経路の活性化は、ＴＧＦ−βの増殖抑制効果を媒介することができる。非正規のＴＧＦ−β経路は、さらなる細胞内経路、例えば、分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ／プロテインキナーゼＢ、Ｒｈｏ様ＧＴＰアーゼを活性化することができ（Tian et al. Cell Signal. 2011; 23(6):951-62；Blobe et al. N Engl J Med. 2000; 342(18):1350-8）、したがって、上皮−間充織転移（ＥＭＴ）および／または細胞運動性をモジュレートする。
ＴＧＦ−βシグナル伝達経路の変化は、ヒト疾患、例えば、がん、心血管疾患、線維症、生殖障害および創傷治癒と関連する。理論に束縛されることを望むことなく、がんにおけるＴＧＦ−βの役割は、疾患状況（例えば、腫瘍段階および遺伝子の変化）および／または細胞環境に依存すると考えられている。例えば、がんの後期では、ＴＧＦ−βは、がん関連の過程を、例えば、腫瘍増殖を促進する（例えば、ＥＭＴを誘導する）か、抗腫瘍免疫応答をブロックするか、腫瘍関連の線維症を増加させるか、血管新生を強化することによってモジュレートすることができる（Wakefield and Hill Nat Rev Cancer. 2013; 13(5):328-41）。
前臨床証拠は、ＴＧＦ−βが免疫調節において重要な役割を演ずることを示す（Wojtowicz-Praga Invest New Drugs. 2003; 21(1):21-32；Yang et al. Trends Immunol. 2010; 31(6):220-7）。ＴＧＦ−βは、いくつかの機構、例えば、Ｔｈ２免疫表現型の方へのヘルパーＴ平衡のシフト；抗腫瘍Ｔｈ１タイプ応答およびＭ１タイプマクロファージの阻害；細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ＮＫリンパ球および樹状細胞機能の抑制、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ調節細胞の生成；または、免疫抑制サイトカイン（例えば、ＩＬ１０またはＶＥＧＦ）、炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＩＬ６、ＴＮＦαまたはＩＬ１）の分泌によって媒介される腫瘍誘発活性を有するＭ２タイプマクロファージの促進、および遺伝毒性活性を有する反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成を介して、宿主免疫応答を下方制御することができる（Yang et al. Trends Immunol. 2010; 31(6):220-7；Truty and Urrutia Pancreatology. 2007; 7(5-6):423-35；Achyut et al Gastroenterology. 2011; 141(4):1167-78）。
理論に束縛されることを望むことなく、ＰＤ−１免疫療法への抵抗性は、例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達およびＴＧＦ−β依存性の過程、例えば創傷治癒または血管新生に連結された遺伝子を含む、転写サインの存在に関連していると考えられている（Hugo et al. Cell. 2016; 165(1):35-44）。ＴＧＦ−β遮断は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸を阻害する療法の治療ウィンドウを拡張する。ＴＧＦ−β阻害剤は、例えば、腫瘍微小環境、例えば脈管形成、線維形成またはエフェクターＴ細胞の動員に影響する因子をモジュレートすることによって、ＰＤ−１免疫療法の臨床有益性に影響することができる（Yang et al. Trends Immunol. 2010; 31(6):220-7; Wakefield and Hill Nat Rev Cancer. 2013; 13(5):328-41; Truty and Urrutia Pancreatology. 2007; 7(5-6):423-35）。
理論に束縛されることを望むことなく、抗腫瘍免疫サイクルのいくつかのエレメントがＰＤ−１およびＴＧＦ−β受容体の両方を発現し、ＰＤ−１およびＴＧＦ−β受容体はおそらく非冗長細胞性シグナルを増殖させるとも考えられている。例えば、自所性前立腺がんのマウスモデルでは、ＴＧＦＢＲＩＩの優性ネガティブ形の使用、またはＴ細胞でのＴＧＦ−β生成の抑止は、腫瘍増殖を遅延させる（Donkor et al. Immunity. 2011; 35(1):123-34；Diener et al. Lab Invest. 2009; 89(2):142-51）。マウス前立腺トランスジェニック腺癌（ＴＲＡＭＰ）マウスにおける研究は、養子移転Ｔ細胞でのＴＧＦ−βシグナル伝達のブロッキングは、それらの持続性および抗腫瘍活性を増加させることを示した（Chou et al. J Immunol. 2012; 189(8):3936-46）。一部、腫瘍浸潤性リンパ球におけるＰＤ−１の上方制御のために、移転されたＴ細胞の抗腫瘍活性は経時的に減少する可能性があり、本明細書に記載されるようにＰＤ−１およびＴＧＦ−β阻害の組合せを支持する。それらのＰＤ−１の高い発現レベルおよびＴＧＦ−β刺激に対するそれらの応答性を考慮すると、ＰＤ−１またはＴＧＦ−βに対する中和抗体の使用は、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に影響することもでき（Riella et al. Am J Transplant. 2012; 12(10):2575-87）、例えばＴｒｅｇの分化および機能のモジュレーションを強化することによってがんを処置するための、ＰＤ−１およびＴＧＦ−β阻害の組合せを支持する。
理論に束縛されることを望むことなく、腫瘍増殖および転移性進行を促進するために免疫監視を逃避するために、がんはＴＧＦ−βを使用することができると考えられている。例えば、ある特定の進行したがんでは、高レベルのＴＧＦ−βは腫瘍攻撃性および不良な予後と関連し、ＴＧＦ−β経路は、がん細胞運動性、浸潤、ＥＭＴまたは幹細胞表現型のうちの１つまたは複数を促進することができる。がん細胞および白血球集団によって媒介される（例えば、様々な細胞によって発現または分泌される分子、例えばＩＬ−１０またはＴＧＦ−βを介して）免疫調節は、ある特定の患者において単独療法としてのチェックポイント阻害剤への応答を制限することができる。ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ−１）単独療法に応答しないか十分に応答しないがん、例えば、膵臓がんまたは結腸直腸がん（例えば、マイクロサテライト安定結腸直腸がん（ＭＳＳ−ＣＲＣ））を処置するために、チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ−１の阻害剤）によるＴＧＦ−βの組合せ阻害が使用される。他の実施形態では、高レベルのエフェクターＴ細胞浸潤を示すがん、例えば、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、乳がん（例えば、三重陰性乳がん）、肝がん（例えば、肝細胞癌）、前立腺がんまたは腎臓がん（例えば、明細胞腎細胞癌）を処置するために、チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ−１の阻害剤）によるＴＧＦ−βの組合せ阻害が使用される。一実施形態では、本開示は、対象でがんを処置する方法であって、対象にＴＧＦ−β−２抗体とＰＤ−１の阻害剤（例えば、抗ＰＤ−１抗体）の組合せを投与することを含む方法に関する。一実施形態では、本組合せは、本明細書に開示されるＴＧＦ−β−２抗体またはその機能的断片およびＰＤ−１阻害剤（例えば、抗ＰＤ−１抗体）を含む。一実施形態では、本明細書に開示されるＴＧＦ−β−２抗体またはその機能的断片は、０．１ｍｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇの間（例えば、０．３ｍｇ／ｋｇから１２ｍｇ／ｋｇの間、または１ｍｇ／ｋｇから６ｍｇの間、例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ）の用量で、例えば静脈内に、例えば３週おきに１回投与され、配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒトプログラム死−１（ＰＤ−１）タンパク質に結合することが可能な抗体は、５０ｍｇから５００ｍｇの間の用量（例えば、１００ｍｇから４００ｍｇの間、例えば、約１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇまたは４００ｍｇの用量）で、例えば静脈内注入により、例えば３週おきに１回または４週おきに１回投与される。一部の実施形態では、配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒトプログラム死−１（ＰＤ−１）タンパク質に結合することが可能な抗体は、１００ｍｇから３００ｍｇの間の用量（例えば、約１００ｍｇ、２００ｍｇまたは３００ｍｇの用量）で、例えば静脈内注入により、例えば３週おきに１回投与される。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＴＧＦ−β−２抗体またはその機能的断片は、約０．１ｍｇ／ｋｇまたは０．３ｍｇ／ｋｇの用量で、例えば静脈内注入により、例えば３週おきに１回投与され、配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒトプログラム死−１（ＰＤ−１）タンパク質に結合することが可能な抗体は、約１００ｍｇの用量で、例えば静脈内注入により、例えば３週おきに１回投与される。一部の実施形態では、本明細書に開示されるＴＧＦ−β−２抗体またはその機能的断片は、約０．３ｍｇ／ｋｇの用量で、例えば静脈内注入により、例えば３週おきに１回投与され、配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒトプログラム死−１（ＰＤ−１）タンパク質に結合することが可能な抗体は、約１００ｍｇまたは３００ｍｇの用量で、例えば静脈内注入により、例えば３週おきに１回投与される。一部の実施形態では、本明細書に開示されるＴＧＦ−β−２抗体またはその機能的断片は、約１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇの用量で、例えば静脈内注入により、例えば３週おきに１回投与され、配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒトプログラム死−１（ＰＤ−１）タンパク質に結合することが可能な抗体は、約３００ｍｇの用量で、例えば静脈内注入により、例えば３週おきに１回投与される。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＴＧＦ−β−２抗体またはその機能的断片は、０．１ｍｇから０．２ｍｇの間の用量（例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ）で、例えば静脈内注入により、例えば３週おきに１回投与され、配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒトプログラム死−１（ＰＤ−１）タンパク質に結合することが可能な抗体は、５０ｍｇから２００ｍｇの間（例えば、約１００ｍｇ）の用量で、例えば静脈内注入により、例えば３週おきに１回投与される。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＴＧＦ−β−２抗体またはその機能的断片は、０．２ｍｇから０．５ｍｇの間（例えば、約０．３ｍｇ／ｋｇ）の用量で、例えば静脈内注入により、例えば３週おきに１回投与され、配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒトプログラム死−１（ＰＤ−１）タンパク質に結合することが可能な抗体は、５０ｍｇから２００ｍｇの間（例えば、約１００ｍｇ）の用量で、例えば静脈内注入により、例えば３週おきに１回投与される。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＴＧＦ−β−２抗体またはその機能的断片は、０．２ｍｇから０．５ｍｇの間（例えば、約０．３ｍｇ／ｋｇ）の用量で、例えば静脈内注入により、例えば３週おきに１回投与され、配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒトプログラム死−１（ＰＤ−１）タンパク質に結合することが可能な抗体は、２００ｍｇから４００ｍｇの間（例えば、約３００ｍｇ）の用量で、例えば静脈内注入により、例えば３週おきに１回投与される。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＴＧＦ−β−２抗体またはその機能的断片は、０．５ｍｇから２ｍｇの間（例えば、約１ｍｇ／ｋｇ）の用量で、例えば静脈内注入により、例えば３週おきに１回投与され、配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒトプログラム死−１（ＰＤ−１）タンパク質に結合することが可能な抗体は、２００ｍｇから４００ｍｇの間（例えば、約３００ｍｇ）の用量で、例えば静脈内注入により、例えば３週おきに１回投与される。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＴＧＦ−β−２抗体またはその機能的断片は、２ｍｇから５ｍｇの間（例えば、約３ｍｇ／ｋｇ）の用量で、例えば静脈内注入により、例えば３週おきに１回投与され、配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒトプログラム死−１（ＰＤ−１）タンパク質に結合することが可能な抗体は、２００ｍｇから４００ｍｇの間（例えば、約３００ｍｇ）の用量で、例えば静脈内注入により、例えば３週おきに１回投与される。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＴＧＦ−β−２抗体またはその機能的断片は、５ｍｇから１０ｍｇの間（例えば、約６ｍｇ／ｋｇ）の用量で、例えば静脈内注入により、例えば３週おきに１回投与され、配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒトプログラム死−１（ＰＤ−１）タンパク質に結合することが可能な抗体は、２００ｍｇから４００ｍｇの間（例えば、約３００ｍｇ）の用量で、例えば静脈内注入により、例えば３週おきに１回投与される。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＴＧＦ−β−２抗体またはその機能的断片は、１０ｍｇから１５ｍｇの間（例えば、約１２ｍｇ／ｋｇ）の用量で、例えば静脈内注入により、例えば３週おきに１回投与され、配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒトプログラム死−１（ＰＤ−１）タンパク質に結合することが可能な抗体は、２００ｍｇから４００ｍｇの間（例えば、約３００ｍｇ）の用量で、例えば静脈内注入により、例えば３週おきに１回投与される。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＴＧＦ−β−２抗体またはその機能的断片は、１０ｍｇから２０ｍｇの間（例えば、約１５ｍｇ／ｋｇ）の用量で、例えば静脈内注入により、例えば３週おきに１回投与され、配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒトプログラム死−１（ＰＤ−１）タンパク質に結合することが可能な抗体は、２００ｍｇから４００ｍｇの間（例えば、約３００ｍｇ）の用量で、例えば静脈内注入により、例えば３週おきに１回投与される。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＴＧＦ−β−２抗体またはその機能的断片は、ＰＤ−１の阻害剤（例えば、配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒトプログラム死−１（ＰＤ−１）タンパク質に結合することが可能な抗体）が投与される前に投与される。他の実施形態では、本明細書に開示されるＴＧＦ−β−２抗体またはその機能的断片は、ＰＤ−１の阻害剤（例えば、配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒトプログラム死−１（ＰＤ−１）タンパク質に結合することが可能な抗体）が投与される後に投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるＴＧＦ−β−２抗体またはその機能的断片、およびＰＤ−１の阻害剤（例えば、配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒトプログラム死−１（ＰＤ−１）タンパク質に結合することが可能な抗体）は、２つの投与の間に少なくとも３０分（例えば、少なくとも１、１．５または２時間）の中断を入れて別々に投与される。
一実施形態では、膵臓がん、結腸直腸がん（例えば、マイクロサテライト安定結腸直腸がん（ＭＳＳ−ＣＲＣ））、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、乳がん（例えば、三重陰性乳がん）、肝がん（例えば、肝細胞癌）、前立腺がんまたは腎臓がん（例えば、明細胞腎細胞癌）を処置するために、本明細書に開示されるＴＧＦ−β−２抗体またはその機能的断片は、配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒトプログラム死−１（ＰＤ−１）タンパク質に結合することが可能な抗体と併用投与される。
一実施形態では、配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒトプログラム死−１（ＰＤ−１）タンパク質に結合することが可能な抗体と併用投与されるＴＧＦ−β−２抗体またはその機能的断片は、抗体ＭＯＲ１４７９９、ＭＯＲ１４８００、ＭＯＲ１４８０９、ＭＯＲ１４７９７、ＭＯＲ１４８０５またはＭＯＲ１４７８７である。一実施形態では、配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒトプログラム死−１（ＰＤ−１）タンパク質に結合することが可能な抗体と併用投与されるＴＧＦ−β−２抗体またはその機能的断片は、抗体ＭＯＲ１４７９７である。
がんは、例えば、本明細書に記載されるがん、例えば、肺がん（扁平上皮）、肺がん（腺癌）、頭頸部がん、子宮頸がん（扁平上皮）、胃がん、甲状腺がん、皮膚がん、メラノーマ、鼻咽頭がん（例えば、分化したまたは未分化の転移性または局所再発性の上咽頭癌）、腎臓がん、神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）、卵巣がん、卵管がん、結腸直腸がんまたは乳がんであってよい。ある特定の実施形態では、がんは、皮膚がん、例えばメルケル細胞癌またはメラノーマである。一実施形態では、がんはメルケル細胞癌である。他の実施形態では、がんはメラノーマである。他の実施形態では、がんは、乳がん、例えば三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）またはＨＥＲ２陰性乳がんである。他の実施形態では、がんは、腎臓がん、例えば、腎細胞癌（例えば、明細胞腎細胞癌（ＣＣＲＣＣ）または非明細胞腎細胞癌（ｎｃｃＲＣＣ））である。他の実施形態では、がんは、甲状腺がん、例えば未分化甲状腺癌（ＡＴＣ）である。他の実施形態では、がんは、神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）、例えば、非定型的肺カルチノイド腫瘍、または膵臓、胃腸（ＧＩ）管もしくは肺におけるＮＥＴである。ある特定の実施形態では、がんは、肺がん、例えば非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）（例えば、扁平上皮ＮＳＣＬＣまたは非扁平上皮ＮＳＣＬＣ）である。ある特定の実施形態では、がんは卵巣がんである。ある特定の実施形態では、がんは卵管がんである。ある特定の実施形態では、がんは結腸直腸がん（ＣＲＣ）（例えば、高マイクロサテライト不安定性結腸直腸がん（高ＭＳＩ ＣＲＣ）またはマイクロサテライト安定結腸直腸がん（ＭＳＳ ＣＲＣ））である。
別の態様では、対象を処置する、例えば、対象で過剰増殖性状態または障害（例えば、がん）、例えば固形腫瘍、血液がん、軟組織腫瘍または転移性病変を低減または改善する方法が提供される。本方法は、対象に本明細書に開示されるＴＧＦ−β−２抗体／ＰＤ−１阻害剤組合せの１つまたは複数を投与することを含む。
本開示のある特定の実施形態は、以下の態様に記載される：
５０．それを必要とする対象に、
（ａ）配列番号７の可変重鎖配列および配列番号１７の可変軽鎖配列；
（ｂ）配列番号２７の可変重鎖配列および配列番号３７の可変軽鎖配列；
（ｃ）配列番号４７の可変重鎖配列および配列番号５７の可変軽鎖配列；
（ｄ）配列番号６７の可変重鎖配列および配列番号７７の可変軽鎖配列；
（ｅ）配列番号８７の可変重鎖配列および配列番号９７の可変軽鎖配列；または
（ｆ）配列番号１０７の可変重鎖配列および配列番号１１７の可変軽鎖配列を含む、ヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体、
ならびに、がんを処置するのに有効な量のヒトプログラム死−１（ＰＤ−１）タンパク質に結合することが可能な抗体分子を投与することを含み、抗体分子は、配列番号１５３のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１５４のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列および配列番号１５５のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；および、配列番号１６３のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１６４のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列および配列番号１６５のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、がんを処置する方法。
５１．ヒトプログラム死−１（ＰＤ−１）タンパク質に結合することが可能な抗体は、配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、態様５０の方法。
５２．ヒトプログラム死−１（ＰＤ−１）タンパク質に結合することが可能な抗体は、配列番号１６１のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１７１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、態様５０または５１の方法。
５３．ヒトプログラム死−１（ＰＤ−１）タンパク質に結合することが可能な抗体は、配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１４９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、態様５０の方法。
５４．ヒトプログラム死−１（ＰＤ−１）タンパク質に結合することが可能な抗体は、配列番号１６１のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１５１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、態様５０または５３の方法。
例示的なＰＤ−１阻害剤
一実施形態では、ＰＤ−１阻害剤は、抗ＰＤ−１抗体分子である。一実施形態では、ＰＤ−１阻害剤は、参照により完全に組み込まれている、２０１５年７月３０日に公開された「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ ＰＤ−１ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」という表題の米国特許出願公開第２０１５／０２１０７６９号に記載される抗ＰＤ−１抗体分子である。
一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、配列表に示されるアミノ酸配列を含む、または配列表に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、重鎖および軽鎖可変領域からの（例えば、配列表に開示されるＢＡＰ０４９−クローン−ＥまたはＢＡＰ０４９−クローン−Ｂの重鎖および軽鎖可変領域配列からの）少なくとも１、２、３、４、５または６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（または、一括してＣＤＲの全て）を含む。一部の実施形態では、ＣＤＲはＫａｂａｔの定義による（例えば、配列表に示される通りである）。一部の実施形態では、ＣＤＲはＣｈｏｔｈｉａの定義による（例えば、配列表に示される通りである）。一部の実施形態では、ＣＤＲは、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの両方の合わせたＣＤＲ定義による（例えば、配列表に示される通りである）。一実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１のＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの組合せは、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＴＹＷＭＨ（配列番号２０３）を含む。一実施形態では、ＣＤＲの１つまたは複数（または、一括してＣＤＲの全て）は、配列表に示されるアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６またはそれより多くの変化、例えばアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）もしくは欠失を有するか、または配列表に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、配列番号１５３のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１５４のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列および配列番号１５５のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに、配列番号１６３のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１６４のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列および配列番号１６５のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、各々は、配列表に開示されている。
一実施形態では、抗体分子は、配列番号１７３のヌクレオチド配列によってコードされるＶＨＣＤＲ１、配列番号１７４のヌクレオチド配列によってコードされるＶＨＣＤＲ２、および配列番号１７５のヌクレオチド配列によってコードされるＶＨＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに、配列番号１７９のヌクレオチド配列によってコードされるＶＬＣＤＲ１、配列番号１８０のヌクレオチド配列によってコードされるＶＬＣＤＲ２、および配列番号１８１のヌクレオチド配列によってコードされるＶＬＣＤＲ３を含むＶＬを含み、各々は、配列表に開示されている。
一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、配列番号１３９のアミノ酸配列または配列番号１３９に少なくとも８５％、９０％、９５％もしくは９９％もしくはそれより高く同一であるアミノ酸配列を含むＶＨを含む。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、配列番号１６９のアミノ酸配列または配列番号１６９に少なくとも８５％、９０％、９５％もしくは９９％もしくはそれより高く同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、配列番号１４９のアミノ酸配列または配列番号１４９に少なくとも８５％、９０％、９５％もしくは９９％もしくはそれより高く同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１４９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
一実施形態では、抗体分子は、配列番号１４０のヌクレオチド配列または配列番号１４０に少なくとも８５％、９０％、９５％もしくは９９％もしくはそれより高く同一であるヌクレオチド配列によってコードされるＶＨを含む。一実施形態では、抗体分子は、配列番号１７０もしくは１５０のヌクレオチド配列または配列番号１７０もしくは１５０に少なくとも８５％、９０％、９５％もしくは９９％もしくはそれより高く同一であるヌクレオチド配列によってコードされるＶＬを含む。一実施形態では、抗体分子は、配列番号１４０のヌクレオチド配列によってコードされるＶＨおよび配列番号１７０または１５０のヌクレオチド配列によってコードされるＶＬを含む。
一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、配列番号１４１のアミノ酸配列または配列番号１４１に少なくとも８５％、９０％、９５％もしくは９９％もしくはそれより高く同一であるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、配列番号１７１のアミノ酸配列または配列番号１７１に少なくとも８５％、９０％、９５％もしくは９９％もしくはそれより高く同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、配列番号１５１のアミノ酸配列または配列番号１５１に少なくとも８５％、９０％、９５％もしくは９９％もしくはそれより高く同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、配列番号１４１のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１７１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、配列番号１４１のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１５１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
一実施形態では、抗体分子は、配列番号１６２のヌクレオチド配列または配列番号１６２に少なくとも８５％、９０％、９５％もしくは９９％もしくはそれより高く同一であるヌクレオチド配列によってコードされる重鎖を含む。一実施形態では、抗体分子は、配列番号１７２もしくは１５２のヌクレオチド配列または配列番号１７２もしくは１５２に少なくとも８５％、９０％、９５％もしくは９９％もしくはそれより高く同一であるヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖を含む。一実施形態では、抗体分子は、配列番号１４２のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖および配列番号１７２または１５２のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖を含む。
一般的に、特記されない限り、抗ＰＤ−１抗体分子は、例えば本明細書に含まれる配列表に記載される、１つまたは複数のＫａｂａｔ ＣＤＲおよび／またはＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲの任意の組合せを含むことができる。全ての定義の下で、各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて以下の順序で配列される３つのＣＤＲおよび４つのフレームワーク（ＦＲ）を一般的に含む：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
他の例示的なＰＤ−１阻害剤
一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、ニボルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、別名ＭＤＸ−１１０６、ＭＤＸ−１１０６−０４、ＯＮＯ−４５３８、ＢＭＳ−９３６５５８またはＯＰＤＩＶＯ（登録商標）である。ニボルマブ（クローン５Ｃ４）および他の抗ＰＤ−１抗体は、参照により完全に組み込まれる、米国特許第８，００８，４４９号および国際出願２００６／１２１１６８に開示される。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、配列表に開示されるニボルマブのＣＤＲ配列の１つもしくは複数（または、一括してＣＤＲ配列の全て）、重鎖もしくは軽鎖可変領域配列、または重鎖もしくは軽鎖配列を含む。
一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、ペムブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ）、別名ラムブロリズマブ、ＭＫ−３４７５、ＭＫ０３４７５、ＳＣＨ−９００４７５またはＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）である。ペムブロリズマブおよび他の抗ＰＤ−１抗体は、参照により完全に組み込まれる、Hamid, O. et al. (2013) New England Journal of Medicine 369 (2): 134-44、米国特許第８，３５４，５０９号および国際出願２００９／１１４３３５に開示される。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、配列表に開示されるペムブロリズマブのＣＤＲ配列の１つもしくは複数（または、一括してＣＤＲ配列の全て）、重鎖もしくは軽鎖可変領域配列、または重鎖もしくは軽鎖配列を含む。
一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子はピジリズマブ（ＣｕｒｅＴｅｃｈ）であり、ＣＴ−０１１としても知られる。ピジリズマブおよび他の抗ＰＤ−１抗体は、参照により完全に組み込まれる、Rosenblatt, J. et al. (2011) J Immunotherapy 34(5): 409-18、米国特許第７，６９５，７１５号、米国特許第７，３３２，５８２号および米国特許第８，６８６，１１９号に開示される。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、配列表に開示されるピジリズマブのＣＤＲ配列の１つもしくは複数（または、一括してＣＤＲ配列の全て）、重鎖もしくは軽鎖可変領域配列、または重鎖もしくは軽鎖配列を含む。
一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子はＭＥＤＩ０６８０（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）であり、ＡＭＰ−５１４としても知られる。ＭＥＤＩ０６８０および他の抗ＰＤ−１抗体は、参照により完全に組み込まれる、米国特許第９，２０５，１４８号および国際出願２０１２／１４５４９３に開示される。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、ＭＥＤＩ０６８０のＣＤＲ配列の１つもしくは複数（または、一括してＣＤＲ配列の全て）、重鎖もしくは軽鎖可変領域配列、または重鎖もしくは軽鎖配列を含む。
一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、ＲＥＧＮ２８１０（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）である。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、ＲＥＧＮ２８１０のＣＤＲ配列の１つもしくは複数（または、一括してＣＤＲ配列の全て）、重鎖もしくは軽鎖可変領域配列、または重鎖もしくは軽鎖配列を含む。
一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、ＰＦ−０６８０１５９１（Ｐｆｉｚｅｒ）である。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、ＰＦ−０６８０１５９１のＣＤＲ配列の１つもしくは複数（または、一括してＣＤＲ配列の全て）、重鎖もしくは軽鎖可変領域配列、または重鎖もしくは軽鎖配列を含む。
一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、ＢＧＢ−Ａ３１７またはＢＧＢ−１０８（Ｂｅｉｇｅｎｅ）である。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、ＢＧＢ−Ａ３１７またはＢＧＢ−１０８のＣＤＲ配列の１つもしくは複数（または、一括してＣＤＲ配列の全て）、重鎖もしくは軽鎖可変領域配列、または重鎖もしくは軽鎖配列を含む。
一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子はＩＮＣＳＨＲ１２１０（Ｉｎｃｙｔｅ）であり、別名、ＩＮＣＳＨＲ０１２１０またはＳＨＲ−１２１０である。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、ＩＮＣＳＨＲ１２１０のＣＤＲ配列の１つもしくは複数（または、一括してＣＤＲ配列の全て）、重鎖もしくは軽鎖可変領域配列、または重鎖もしくは軽鎖配列を含む。
一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、ＴＳＲ−０４２（Ｔｅｓａｒｏ）であり、ＡＮＢ０１１としても知られる。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、ＴＳＲ−０４２のＣＤＲ配列の１つもしくは複数（または、一括してＣＤＲ配列の全て）、重鎖もしくは軽鎖可変領域配列、または重鎖もしくは軽鎖配列を含む。
さらなる公知の抗ＰＤ−１抗体には、例えば、参照により完全に組み込まれる、国際出願２０１５／１１２８００、国際出願２０１６／０９２４１９、国際出願２０１５／０８５８４７、国際出願２０１４／１７９６６４、国際出願２０１４／１９４３０２、国際出願２０１４／２０９８０４、国際出願２０１５／２００１１９、米国特許第８，７３５，５５３号、米国特許第７，４８８，８０２号、米国特許第８，９２７，６９７号、米国特許第８，９９３，７３１号および米国特許第９，１０２，７２７号に記載されるものが含まれる。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、本明細書に記載される抗ＰＤ−１抗体の１つと同じ、ＰＤ−１上のエピトープとの結合で競合し、および／またはそれに結合する抗体である。一実施形態では、ＰＤ−１阻害剤は、例えば、参照により完全に組み込まれる米国特許第８，９０７，０５３号に記載されるように、ＰＤ−１シグナル伝達経路を阻害するペプチドである。一実施形態では、ＰＤ−１阻害剤は、イムノアドヘシンである（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合したＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２の細胞外またはＰＤ−１結合性部分を含むイムノアドヘシン）。一実施形態では、ＰＤ−１阻害剤は、ＡＭＰ−２２４（Ｂ７−ＤＣＩｇ（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）、例えば、参照により完全に組み込まれる国際出願２０１０／０２７８２７および国際出願２０１１／０６６３４２に開示されるもの）である。
上述により、本発明はさらに他の態様で以下を規定する：
本発明の抗体が別の活性薬剤と併用投与される場合、共投与される組合せ化合物の投薬量は、用いられる共薬物のタイプ、用いられる特定薬物、処置される状態などによって当然ながら異なる。本発明のヒト抗体を含む組成物および使用説明書からなるキットも、本発明の範囲内である。キットは、少なくとも１つのさらなる試薬、または本発明の１つまたは複数のさらなる抗体をさらに含有することができる。キットは、キットの内容物の使用目的を示す表示を一般的に含む。用語表示は、キットの上にまたはそれと一緒に提供される、さもなければキットに付随する任意の書面、または記録資料を含む。キットは、患者が抗ＴＧＦβ−２抗体処置に応答する群に属するかどうかについて診断するためのツールをさらに含むことができる。そのようなキットは、凍結乾燥形の本発明の抗体、希釈剤および使用説明書を含むことができる。本発明を完全に記載したが、本発明は以下の実施例および請求項によってさらに説明され、それらは例示的であり、さらに制限するものではない。
本発明を実行するための様式
ＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）パニング
ファージミドライブラリーは、ＨｕＣＡＬ（登録商標）概念（Knappik et al., J Mol Biol 296, 57-86. 2000）に基づき、ファージ表面でＦａｂを提示するためにＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（商標）技術を用いる（国際公開第０１／０５９５０号）。
ＴＧＦ−β２に対するビーズベースのパニング
ビーズベースのパニングの前に、抗原をカルボキシビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２７０カルボン酸、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に固定化しなければならなかった。ファージプールにつき、１×１０７個の抗原コートビーズを、等量のＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／５％ミルク粉末でブロックした。並行して、各パニングのために、ＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ファージ−抗体を、等量のＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／５％ミルク粉末／５％ＢＳＡでブロックした。ビーズ結合性ファージの除去のために、各々０．５〜１．０×１０７個のＢＳＡコートビーズを使用して、ブロックされたファージ粒子の前吸着を２回実行した。次に、ブロックされた抗原コートビーズを前吸着およびブロックされたファージ粒子に加え、ローテータの上でＲＴ（室温）において１〜２時間インキュベートした。抗原コートビーズに結合したファージ粒子を、磁気分離器で採集した。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０およびＰＢＳを使用したいくつかの洗浄ステップによって、非特異的に結合したファージを洗い落とし、特異的に結合したファージは、ＤＤＴを使用して抗原コートビーズから溶出させた。ＤＴＴ溶出液は次に大腸菌（E. coli）ＴＧ１に移し、ファージ感染のために３７℃の水浴で４５分間インキュベートした。細菌ペレットを２ｘＹＴ培地に再懸濁させ、ＬＢ／Ｃａｍ寒天プレートの上で平板培養し、ｏ／ｎでインキュベートした。コロニーをプレートから削り取り、ファージ奪還、選択されたクローンのポリクローナル増幅およびファージ生成のために使用した。精製されたファージで、次の回のパニングを開始した。第２および第３回のビーズベースのパニングは、よりストリンジェントな洗浄条件が適用されたこと以外は、１回目のプロトコールに従って実行した。
ＴＧＦ−β２に対する溶液パニング
溶液パニングの必要条件は、抗原のビオチン化およびビオチン化抗原の保持された活性の確認であった。溶液パニングの間、Ｆａｂ提示ファージおよびビオチン化抗原は、ファージによる抗原のアクセス性を促進した溶液にインキュベートした。
ストレプトアビジン結合磁気ビーズによる溶液パニングプロトコール
ファージプールにつき、４ｍｇのストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１×Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ中でブロックした。並行して、各パニングのために、ＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ファージ−抗体を、Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０でブロックした。その後、ストレプトアビジンまたはビーズ結合性ファージの除去のために、各々ストレプトアビジンビーズを使用して、ブロックされたファージ粒子の前吸着を２回実行した。次に、１００ｎＭのビオチン化抗原ＴＧＦ−β２を前吸着およびブロックされたファージ粒子に加え、ローテータの上で室温において１〜２時間インキュベートした。ファージ−抗原複合体は２ｍｇのブロックされたストレプトアビジンビーズを使用して捕捉し、ストレプトアビジンビーズに結合したファージ粒子は磁気分離器で採取した。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０およびＰＢＳを使用したいくつかの洗浄ステップによって、非特異的に結合したファージを洗い落とした。特異的に結合したファージは、ＤＤＴを使用してストレプトアビジンビーズから溶出させた。ＤＴＴ溶出液は次に大腸菌（E. coli）ＴＧ１に移し、ＴＧ１およびＤＴＴ溶出液の混合液をファージ感染のためにインキュベートした。細菌ペレットを２ｘＹＴ培地に再懸濁させ、ＬＢ／Ｃａｍ寒天プレートの上で平板培養し、ｏ／ｎでインキュベートした。コロニーをプレートから削り取り、ファージ奪還、選択されたクローンのポリクローナル増幅およびファージ生成のために使用した。精製されたファージで、次の回のパニングを開始した。第２および第３回の溶液パニングは、低減された抗原の量およびよりストリンジェントな洗浄条件以外は、１回目のプロトコールに従って実行した。
ＲａｐＭＡＴ（登録商標）パニング
増加した親和性を有する特異的抗体を得るために、ＲａｐＭＡＴ（登録商標）パニングを実行した（Prassler et al., Immunotherapy 1, 571-583. 2009）。この目的のために、２回のビーズベースのまたは溶液パニングを上記の抗原ＴＧＦ−β２で実行した。
ａ）ＬＣＤＲ３ ＲａｐＭＡＴ（登録商標）のために：第２回のパニングの後、ファージ由来のｐＭＯＲＰＨ３０（登録商標）ベクターＤＮＡのＦａｂコード断片を酵素的に消化し、ＴＲＩＭ（商標）ＬＣＤＲ３成熟カセットを酵素的ライゲーション（Virnekas et al., 1994）によって挿入し、ＬＣＤＲ３を多様化した。
ｂ）ＨＣＤＲ２ ＲａｐＭＡＴ（登録商標）のために：第２回のパニングの後、ファージ由来のｐＭＯＲＰＨ（登録商標）３０ベクターＤＮＡのＦａｂコード断片を酵素的に消化し、ＴＲＩＭ（商標）ＨＣＤＲ２成熟カセット（Virnekas et al., Nucleic Acids Res 22, 5600-5607. 1994）を酵素的ライゲーションによって挿入し、ＨＣＤＲ２を多様化した。
ライゲーション混合物は、大腸菌（E. coli）ＴＯＰ１０Ｆ’細胞でエレクトロポレーションさせ、＞５×１０６個の独立したコロニーを与えた。生成されたライブラリーを増幅し、第３回および第４回の溶液パニングのために５ｎＭおよび０．５ｎＭの抗原濃度をそれぞれ使用して、増加したストリンジェンシーによるさらなる２回のパニングに付した。
選択されたＦａｂ断片のサブクローニングおよびスクリーニングスケールの発現
可溶性Ｆａｂの迅速な発現を促進するために、選択されたＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ファージのＦａｂコード挿入断片を、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）３０ディスプレイベクターからｐＭＯＲＰＨ（登録商標）ｘ１１発現ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）ｘ１１＿Ｆａｂ＿ＦＨにサブクローニングした。大腸菌（E. coli）ＴＧ１−Ｆ’の形質転換の後、ＨｕＣＡＬ（登録商標）−Ｆａｂ断片を含有するペリプラズム抽出物の単一クローン発現および調製を、以前に記載される通りに実行した（Rauchenberger et al., J Biol Chem 278, 38194-38205. 2003）。
マスタープレートの生成
２ｘＹＴ−ＣＧ（３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（Ｃａｍ）；０．１％グルコース）培地を予充填した無菌の３８４ウェルマイクロタイタープレートのウェルに、クロラムフェニコール耐性単独クローンを選んで入れ、３７℃でｏ／ｎで増殖させた。翌朝、グリセロールを含有する無菌の２ｘＹＴ培地を、マスタープレートの各ウェルに加え、プレートをアルミ箔で密封し、−８０℃で保存した。以下の２つの章は、それぞれ３８４および９６ウェルフォーマットにおけるＦａｂ発現大腸菌（E. coli）からの溶菌液の調製を記載する。これらの発現プレートは、スクリーニングアプローチのために後に使用される。
ＥＬＩＳＡおよびＦＭＡＴスクリーニングのためのＦａｂ含有細菌溶菌液の調製
各ｏ／ｎ培養の５μｌを、ウェルにつき４０μｌの２ｘＹＴ−ＣＧ培地（３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（Ｃａｍ）；０．１％グルコース）を予充填した無菌の３８４ウェルマイクロタイタープレートに移した。培養がわずかに濁るまで、プレートを３７℃でインキュベートし、ＣａｍおよびＩＰＴＧを含有する２ｘＹＴ培地を各ウェルに加えた。一晩のインキュベーションの後、ＢＥＬ緩衝液（２．５ｍｇ／ｍｌリゾチーム、４ｍＭ ＥＤＴＡ、１０Ｕ／μｌベンゾナーゼ）を加え、プレートを１時間インキュベートした。
ｐＳＭＡＤ３ ＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）アッセイのためのＦａｂ含有細菌溶菌液の調製
各ｏ／ｎ培養の５μｌを、ウェルにつき１００μｌの２ｘＹＴ−ＣＧ培地（３４μｇ／ｍｌのＣａｍ；０．１％グルコース）を予充填した無菌の９６ウェルマイクロタイタープレートに移した。培養がわずかに濁るまで、プレートを２２℃でインキュベートし、ＣＡＭおよびＩＰＴＧを含有する２ｘＹＴ培地を各ウェルに加えた。翌朝、遠心分離によって細菌を遠沈させ、上清を破棄し、ＢＥＬ緩衝液（２．５ｍｇ／ｍｌリゾチーム、完全（ｗ／ｏ ＥＤＴＡ；Ｒｏｃｈｅ）、２０Ｕ／ｍｌベンゾナーゼ）を各ウェルに加えた。プレートを２ハンド（hand）間インキュベートし、ＢＥＬ−溶菌液（ＢＥＬ緩衝液を使用して生成した溶菌液）を遠心分離して細菌細胞デブリを遠沈させた。Ｆａｂ含有上清は、スクリーニング目的（例えば、ｐＳＭＡＤ３ ＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）アッセイ）のために使用した。
Ｆａｂ含有生細菌溶菌液のスクリーニング
ＥＬＩＳＡスクリーニング
ＥＬＩＳＡスクリーニングを使用して、標的抗原ヒトＴＧＦ−β２タンパク質への結合に関するパニングアウトプットから単一のＦａｂクローンが同定される。上記のＦａｂ含有粗大腸菌（E. coli）溶菌液を使用して、Ｆａｂを試験する。
直接コート抗原でのＥＬＩＳＡスクリーニング
このアプローチは、ＳＥＴの前に一部のＲａｐＭＡＴ（登録商標）パニングのスクリーニングのために使用された。Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）３８４ウェルプレートを、ＰＢＳにそれぞれ５μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌの濃度のマウスＴＧＦ−β２でコーティングした。ＰＢＳ中の５％スキムミルクによるプレートのブロッキングの後、Ｆａｂ含有大腸菌（E. coli）溶菌液を加えた。Ａｔｔｏｐｈｏｓ蛍光基質（Ｒｏｃｈｅ、＃１１６８１９８２００１）を使用して、アルカリ性ホスファターゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、＃１０９−０５５−０９７）（１：５０００に希釈）にコンジュゲートしたＦ（ａｂ）２特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧによって、Ｆａｂの結合性を検出した。５３５ｎｍの蛍光発光を、４３０ｎｍでの励起で記録した。
ビオチン化抗原のＥＬＩＳＡスクリーニング（Ｆａｂ捕捉ＥＬＩＳＡ）
ヒトＴＧＦ−β２およびマウスＴＧＦ−β２に対する抗ＴＧＦ−β２ Ｆａｂ抗体の特異性ならびにラットＴＧＦ−β３、ヒトＴＧＦ−β１への交差反応性をＥＬＩＳＡのセッティングで評価した。
これのために、特記されない限り、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）３８４ウェルプレートを、ＰＢＳに１：１０００で希釈したＦｄ断片特異的ヒツジ抗ヒトＩｇＧ（結合部位、＃ＰＣ０７５）でコーティングした。ＰＢＳ中の５％スキムミルクパウダーによるブロッキングの後、Ｆａｂ含有大腸菌（E. coli）溶菌液を加えた。その後、捕捉されたＨｕＣＡＬ（登録商標）Ｆａｂ断片をビオチン化抗原に結合させた。ビオチン化抗原の以下の濃度をスクリーニングのために使用した：
・標準のパニングのＦａｂ捕捉ＥＬＩＳＡベースのスクリーニングのための１μｇ／ｍｌのビオチン化ヒトＴＧＦ−β２／ビオチン化トランスフェリン（無関係なビオチン化タンパク質でのカウンタースクリーニングのため）；
・ＳＥＴの前の一部のＲａｐＭＡＴ（登録商標）パニングのＦａｂ捕捉ＥＬＩＳＡベースのスクリーニングのための０．０１μｇ／ｍｌのビオチン化ヒトＴＧＦ−β２；
抗ＴＧＦ−β２ Ｆａｂ抗体結合ビオチン化抗原は、アルカリ性ホスファターゼ（ホスファターゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｚｙｍｅｄ）、＃４３−４３２２））にコンジュゲートしたストレプトアビジンとのインキュベーションと、続くＡｔｔｏＰｈｏｓ蛍光基質（Ｒｏｃｈｅ、＃１１６８１９８２００１）の添加によって検出した。５３５ｎｍの蛍光発光を、４３０ｎｍでの励起で記録した。
ＦＭＡＴスクリーニング
ＦＭＡＴ（蛍光定量的微量アッセイテクノロジー）スクリーニングを使用して、ビーズに固定化された標的抗原への結合に関するパニングアウトプットから単一のＦａｂクローンを同定する（上記のように、カルボキシビーズの上に抗原またはＢＳＡが固定化された）。Ｆａｂ含有粗大腸菌（E. coli）溶菌液（上記のように調製された）を使用して、Ｆａｂを試験する。
Ｆａｂ含有溶菌液およびビーズを、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／３％ＢＳＡでブロックした。ブロックされた溶菌液、ブロックされたビーズおよびＣｙ（商標）５コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃１０９−１７６−０９７）を、ＦＭＡＴプレートに移した。プレートは、暗所において室温で約３時間の間インキュベートした。８２００細胞検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者の説明書に従って使用して、ＦＭＡＴ読取りをとった。
ＳＥＴスクリーニング
親和性のランク付けは、原則として上記の通りに実行した。（Haenel et al., Anal Biochem 339, 182-184 2005）に記載される原理に基づく溶液平衡滴定による成熟結合剤のランク付けのために、一定量の希釈されたＢＥＬ抽出物（ＢＥＬ緩衝液：２．５ｍｇ／ｍｌリゾチーム、４ｍＭ ＥＤＴＡ、１０Ｕ／μｌベンゾナーゼを使用して生成された溶菌液）を、抗原の異なる濃度で一晩平衡させた。
次に、以前に抗原でコーティングしたＭＳＤプレートに混合物を移し、インキュベーションおよび洗浄の後に、適するＭＳＤ−スルホ−タグ標識検出抗体を加えた。その後、Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ６０００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用したＥＣＬ検出を介して、未結合のＦａｂの濃度を数量化した。親和性を推定し、こうして成熟によって最も向上したクローンを同定するために、対応するフィットモデル（下を参照）を適用して、ＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ）ソフトウェアを使用して結果を処理した。
ＨｕＣＡＬ（登録商標）Ｆａｂ断片の発現および精製
大腸菌（E. coli）におけるＨｉｓタグ付きＨｕＣＡＬ（登録商標）Ｆａｂ断片の微発現および微精製
０．１％グルコース、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび０．１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト−ピラノシド）を加えた２５ｍｌの２ｘＹＴ培地を使用して、大腸菌（E. coli）ＴＧ１ Ｆ’細胞におけるｐＭＯＲＰＨ（登録商標）ｘ１１＿Ｆａｂ＿ＦＨによってコードされるＦａｂ断片の発現を、５０ｍｌファルコンにおいて実行した。培養は、３０℃で１８時間振盪させた。細胞を収集し、リゾチームおよびバグバスタータンパク質抽出試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の組合せを使用して破壊した。Ｈｉｓ６タグ付きＦａｂ断片（配列番号２０４として開示される「Ｈｉｓ６」）を、ＩＭＡＣ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって単離した。Ｄ−Ｔｕｂｅ９６（商標）透析器（ＭＷＣＯ ６〜８ｋＤａ、Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、１×ダルベッコのＰＢＳ（ｐＨ７．２）への緩衝液交換を実行した。紫外分光光度法によって、タンパク質濃度を測定した。代表として選択された試料の純度を、変性、還元性１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
大腸菌（E. coli）におけるＨｉｓタグ付きＨｕＣＡＬ（登録商標）Ｆａｂ断片の発現および精製
０．１％グルコースおよび３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを加えた５００ｍｌの２ｘＹＴ培地を使用して、大腸菌（E. coli）ＴＧ１ Ｆ’細胞におけるｐＭＯＲＰＨ（登録商標）ｘ１１＿Ｆａｂ＿ＦＨによってコードされるＦａｂ断片の発現を、振盪フラスコ培養において実行した。ＯＤ６００が０．５の値に到達するまで、培養を３０℃で振盪した。０．７５ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を加え、さらに３０℃で２０時間の培養によってＦａｂ発現を誘導した。細胞を収集し、リゾチームを使用して破壊した。Ｈｉｓ６タグ付きＦａｂ断片（配列番号２０４として開示される「Ｈｉｓ６」）を、ＩＭＡＣ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって単離し、イミダゾールを使用して溶出した。ＰＤ１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、１×ダルベッコのＰＢＳ（ｐＨ７．２）への緩衝液交換を実行した。試料を滅菌濾過した（０．２μｍ）。紫外分光光度法によって、タンパク質濃度を測定した。試料の純度は、変性、還元性１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。較正標準によるサイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）によって、Ｆａｂ調製物の均一性を自然状態で測定した。
機能的バイオアッセイ
リポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）
ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞系の培養
１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ペニシリン（５０ＩＥ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭ（ダルベッコの改変イーグル培地）で、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞を維持した。細胞を３７℃および５％ＣＯ２のインキュベーター内で増殖させ、３〜４日おきに継代培養した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）を使用して細胞を切り離し、新鮮培地を含有する新しいフラスコに次に移した。ＣＡＧＡ−１２ ｌｕｃで安定してトランスフェクトさせたＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞を、親のＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞のために上に記載の通りに培養したが、細胞増殖培地には、ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンに加えて４ｍＭのＬ−グルタミンおよび３μｇ／ｍｌのブラストサイジンを加えた。
ＴＧＦ−βタンパク質誘導ルシフェラーゼリポーター遺伝子アッセイ
ＴＧＦ−β２誘導シグナル伝達および他のＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３、ミオスタチン、アクチビンおよびＧＤＦ−１１に対する特異性を阻害する抗ＴＧＦ−β２抗体の能力を測定するために、安定したリポーター細胞系ＨＥＫ２９３Ｔ／１７ ＣＡＧＡ−１２ ｌｕｃを使用したリポーター遺伝子アッセイを実行した。ＣＡＧＡ−１２ルシフェラーゼリポーター構築物は、最小限のプロモーターの下流のルシフェラーゼ遺伝子ならびにリン酸化Ｓｍａｄ−２およびＳｍａｄ−３に特異的である複数のＣＡＧＡボックスを有する。精製された組換えＴＧＦ−β２（さらに、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β１、ミオスタチン、ＧＤＦ−１１およびアクチビン）の追加は、Ｓｍａｄ−２およびＳｍａｄ−３のリン酸化を、したがってＣＡＧＡ−１２リポーターへの結合性を誘導し、ルシフェラーゼ遺伝子発現につながる。ＨＥＫ２９３Ｔ／１７ ＣＡＧＡ−１２ ｌｕｃ細胞の９０％の集密度で、ａｃｃｕｔａｓｅを使用して細胞を切り離し、細胞数２．５×１０５／ｍｌの濃度までアッセイ培地（２％ＦＢＳおよび２ｍＭ Ｌグルタミンを加えたＤＭＥＭ）で希釈した。その後、ウェルにつき１００μｌの細胞を白色平底９６ウェルプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、＃３５３２９６）に播種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、所望の濃度のＴＧＦ−β２抗体（ＦａｂまたはＩｇＧ）およびＴＧＦ−βタンパク質をＰＢＳ中で混合した。混合物中の抗原の最終濃度は、このアッセイにおけるそれらのそれぞれの約ＥＣ８０濃度に対応し、以下の通りである：ＴＧＦ−β１／２／３タンパク質−１２ｐＭ（活性ダイマー）、アクチビンＡ、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１−１ｎＭ（活性ダイマー）およびアクチビンΒ、アクチビンＡＢ−１００ｐＭ（活性ダイマー）。抗原および抗体は、室温で３０分の間インキュベートした。アッセイ培地を細胞から除去し、播種した細胞に混合物を加えた。一晩のインキュベーションの後、アッセイ培地を除去し、７０μｌのＰＢＳを（ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２と一緒に）各ウェルに加えた。室温に適応させた後、５０μｌの新たに調製したＢｒｉｔｅＬｉｔｅ Ｐｌｕｓ試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃６０１６７６１）を各ウェルに加えた。５分間のインキュベーション時間の後、発光を照度計（ＧｅｎｉｏｓＰｒｏ、Ｔｅｃａｎ）で読み取った。それぞれの抗体の完全滴定の後、プリズムソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して最大半減抑制濃度（ＩＣ５０値）を計算した。
受容体／リガンド相互作用Ｅｌｉｓａ
阻害性ＦａｂがヒトＴＧＦ−βＲＩＩＩ／ＦｃのＴＧＦ−β２結合部位をブロックすることにより作用するかどうかについて評価するために、ＴＧＦ−β受容体−ＴＧＦ−β相互作用ＥＬＩＳＡを実行した。
ＴＧＦ−β２−ＴＧＦ−βＲＩＩＩ相互作用アッセイ
これのために、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）３８４ウェルプレートを、２μｇ／ｍｌ（約２２ｎＭ）のＴＧＦ−βＲＩＩＩ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＬＦ１３０９０５１）により、４℃で一晩コーティングした。１．２５μｇ／ｍｌ（約１００ｎＭ）のビオチン化ヒトＴＧＦ−β２を、異なるＦａｂ／ＩｇＧ濃度と３０分間インキュベートし、次にＣｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒでブロックしたコーティングされたウェルに加えた。結合したビオチン化ヒトＴＧＦ−β２は、アルカリ性ホスファターゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｚｙｍｅｄ）、＃４３−４３２２）にコンジュゲートしたストレプトアビジンとのインキュベーションと、続くＡｔｔｏＰｈｏｓ蛍光基質（Ｒｏｃｈｅ、＃１１６８１９８２００１）の添加によって検出した。５３５ｎｍの蛍光発光を、４３０ｎｍでの励起で記録した。
ｐＳＭＡＤ３ ＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）アッセイ
この機能性スクリーニングのために、特製のＦａｂ含有細菌溶菌液（ＢＥＬ緩衝液）を使用して、ホスホＳＭＡＤ３（Ｓｅｒ４２３／４２５）キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ＃ＴＧＲＳＭ３Ｓ１０Ｋ）およびＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）ＩｇＧ（ＰｒｏｔｅｉｎＡ）検出キット（＃６７６０６１７Ｃ）のためのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）ＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）によりＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＴＧＦ−β誘導Ｓｍａｄ３リン酸化を測定した。ＢＥＬ溶菌液（ＢＥＬ緩衝液を使用することにより生成した溶菌液）のＴＧＦ−β２／３の中和能力を測定するために、各ウェルにつきリポーター細胞系ＨＥＫ２９３Ｔ（ＣＡＧＡ−１２ルシフェラーゼ）からの８，０００個の細胞を、アッセイ培地（２％ＦＢＳおよび２ｍＭ Ｌ−グルタミンを追加したＤＭＥＭ）中のコラーゲンコートｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ（商標）に播種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩培養した。その翌日、０．３ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β２または３をそれぞれ加えた、２５μｌのＢＥＬ溶菌液および７５μｌの無血清アッセイ培地を含有するマスタープレートを調製した。ペーパータオルの上でプレートを払い落とし、タブをつけること（tabbing）によって、アッセイ培地を細胞から除去した。次に、マスタープレートから１５μｌをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に移し、３７℃および５％ＣＯ２で１時間刺激した。培地を除去し、４μｌの１×溶解緩衝液を各ウェルに加えた。分析まで、プレートを−８０℃で保存した。分析のために、５μｌの「アクセプタービーズミックス」を２時間加え、その後２μｌの「ドナービーズミックス」を追加し、さらに２時間の間インキュベートした。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎセッティングを使用して、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎプレートリーダーでプレートを読み取った。
骨格筋細胞分化アッセイ（クレアチンキナーゼ（ＣＫ）アッセイ）
２０％ＦＣＳ（ＰＡＡ）を加えた骨格筋基礎培地（ｓｋＢＭ；Ｌｏｎｚａ）からなる増殖培地（ＧＭ）を使用して、９６ウェルプレートでヒト骨格筋細胞（ＨｓＫＭＣ；Ｌｏｎｚａ）を培養した（７５００個の細胞／ウェル）。ｓｋＢＭからなる無血清分化培地（ＤＭ）に変更することによって、播種の２４〜４８時間後に分化が開始された。分化の開始時に０．３ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β２およびそれぞれのＩｇＧ１を７つの異なる濃度（最高３μｇ／ｍｌ）で加え、細胞を最高１２０時間管状筋細胞に分化させることによって、ＨｕＳＫＭＣｓ分化に及ぼす効果を評価した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次にリポーター溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解し、測定まで−８０℃で保存した。ＣＫ活性は、ＣＫ（ＩＦＣＣ）試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）を使用して測定した。ＣＫ試薬は、製造業者の指示に従って調製した。室温（ＲＴ）への調整のために、測定の少なくとも９０分前にアッセイプレートを−８０℃のフリーザーから取り出した。７５μｌのＣＫ試薬を各ウェルに加えた後に（プレート設計を参照）、アッセイプレートをＥＬＩＳＡリーダーに直ちに移し、１分間の読取り間隔で吸光度を３４０ｎｍで２０分間読み取った。ＣＫ活性を計算するために、ウサギの筋肉からのＣＫ（＃１０１２７５６６００１；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、リポーター溶解緩衝液で標準曲線（０．０２〜４０μｇ／ｍｌ）を新たに作成した。
タンパク含有量は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）試薬（＃ＢＣＡ−１；シグマ）を使用して測定した。ＢＣＡ試薬は、製造業者の指示に従って調製した。２００μｌのＢＣＡ試薬を各ウェルに加えた後に、アッセイプレートを３７℃で３０分間インキュベートし、次に吸光度を５６２ｎｍで読み取った。タンパク含有量を計算するために、タンパク質標準曲線（リポーター溶解緩衝液に０．２５〜１ｍｇ／ｍｌ）を作成した。ＣＫ活性は、以下の通りに計算した（Florini et al. 1989も参照する）。記録した２１時点の各々での吸光度の値を平均して、プロットした。これらのプロットの線形部分から、線形回帰（ＳｉｇｍａＰｌｏｔソフトウェアを使用する）によって最大勾配を測定し、ＣＫ標準曲線の助けを借りてＣＫ活性（ｍＵｎｉｔ）に変換した。値は対応するタンパク含有量で次に正規化し、ＣＫ活性はｍＵｎｉｔ／ｍｇタンパク質または対照の百分率（ＣＫ活性）で表した。可能ならば、ＥＣ５０値（最大半減効果を引き起こす濃度）およびＥｍａｘ（最大効果）を与えるＳ字曲線のあてはめ（ＸＬｆｉｔソフトウェアを使用する）によって、濃度−応答データを評価した。
親和性測定
表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用した親和性測定
直接抗原固定化のために、標準のＥＤＣ−ＮＨＳアミンカップリング化学を使用した。ＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を、１０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ４．５中の適当な共鳴単位（ＲＵ）のヒト−またはマウス−ＴＧＦβ−２／Ｆｃ（抗原の活性による）でコーティングした。参照フローセルのために、ＨＳＡのそれぞれの量を使用した。５μｌの１０ｍＭグリシン／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ１．５で、再生を実行した。あるいは、抗原を直接的に固定化せずに、抗ヒトＦｃ抗体で改変した（Ｆｃ捕捉キット、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ／Ｂｉａｃｏｒｅ）ＣＭ５チップの上に捕捉した。参照フローセルの上では、捕捉抗体は固定化されたが、抗原は捕捉されなかった。再生は、５μＬの３Ｍ ＭｇＣｌ２の２回の注射を使用して達成された。動態測定は、Ｆａｂ試料の段階希釈列を使用して、ダルベッコのＰＢＳにおいて２０μｌ／分の流量で実行した。Ｆａｂ濃度は、１５．６から５００ｎＭの範囲内だった。各濃度の注射時間は、１分であった。解離時間は、少なくとも２分（または、測定された親和性によってそれより長く）に設定した。二重参照のために、ランニングバッファーのブランク注射を使用した。ＢＩＡ評価ソフトウェア３．２（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、全てのセンサーグラムを全般的にあてはめた。
溶液平衡滴定（ＳＥＴ）方法（Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００（ＭＳＤ）を使用した選択された抗ヒトＴＧＦ−β２ ＦａｂおよびＩｇＧの親和性測定
ＫＤ測定のために、抗体タンパク質のモノマー分画を使用した（少なくとも９０％のモノマー含有量、Ｆａｂのためには分析的ＳＥＣ；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって、またはＩｇＧのためにはＴｏｓｏｈ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によってそれぞれ分析した）。溶液での親和性測定は、基本的には文献に記載されている通りに実施した（Friquet et al., J Immnunol Meth 77, 305-319. 1985）。ＳＥＴ方法の感度および精度を向上させるために、それは古典的ＥＬＩＳＡからＥＣＬに基づくテクノロジーに変えられた（Haenel et al., Anal Biochem 339, 182-184. 2005）。１ｍｇ／ｍｌのヤギ抗ヒト（Ｆａｂ）２断片特異的抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）を、製造業者の指示に従ってＭＳＤ−Ｓｕｌｆｏ−ＴＡＧ（商標）ＮＨＳ−エステル（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）で標識した。ポリプロピレンマイクロタイタープレートおよびアッセイ緩衝液として０．５％ＢＳＡおよび０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ ｐＨ７．４で実験を実行した。予想されるＫＤより少なくとも１０倍高い濃度から出発して、非標識の抗原を２ｎ系列で希釈した。Ｂｍａｘ値を測定するために、抗原なしのウェルを使用し、バックグラウンドを測定するために、アッセイ緩衝剤だけを含むウェルを使用した。適当な量の結合剤（予想されるＫＤに類似のまたはそれ未満の抗体濃度、６０μｌの最終量）の添加の後、混合物を室温で一晩インキュベートした。ＭＳＤプレートを、抗原（１ウェルにつき３０μｌ）でコーティングした。０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳでプレートを洗浄した後に、平衡させた試料をそれらのプレートに移し（１ウェルにつき３０μｌ）、２０分の間インキュベートした。洗浄の後、１ウェルにつき３０μｌのＭＳＤ−Ｓｉｌｆｏ−Ｔａｇ標識検出抗体（抗ヒト（Ｆａｂ）２、最終希釈は一般的に１：２，０００）をＭＳＤプレートに加え、エッペンドルフ振盪機（７００ｒｐｍ）の上において室温で３０分間インキュベートした。ＭＳＤプレートを洗浄して、界面活性剤と一緒に３０μｌ／ウェルのＭＳＤ Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔを加えた後、Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用して電気化学発光シグナルを検出した。
カスタマイズしたフィッティングモデルを適用して、ＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ）ソフトウェアでデータを評価した。Ｆａｂ分子のＫＤ測定のために、以下のフィットモデルを使用した（（Abraham et al., J Mol Recognit. 9, 456-461.1996）によって改変された、（Haenel et al., Anal Biochem 339, 182-184.2005）による）：
［Ｆａｂ］ｔ：適用された全体のＦａｂ濃度
ｘ：適用された全体の可溶性抗原濃度（結合部位）
Ｂｍａｘ：抗原なしのＦａｂの最大シグナル
ＫＤ：親和性
Ｆａｂの親和性測定
抗ＴＧＦ−β２ ＦａｂのＫＤ測定は、基本的に以下の通りに実行した：全ての希釈溶液のために、ヒトＴＧＦ−β２を４ｍＭのＨＣｌで１００μｇ／ｍＬまで前希釈した。コーティングのために、抗原をＰＢＳで０．０５μｇ／ｍｌ（ＴＧＦ−β２）までさらに希釈し、標準のＭＳＤプレートの上で４℃においてｏ／ｎでコーティングした。その後、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡにより、ＭＳＤプレートを室温で１時間ブロックした。
ＴＧＦ−β１／３および反標的への結合
ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３および反標的（ミオスタチン、ＧＤＦ−１１、アクチビンＡ、アクチビンＢおよびアクチビンＡＢ）への結合のＳＥＴをベースとした分析のために、特異抗原、それぞれヒトＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β３を記載の通りコーティングした。試験するタンパク質を滴定のために使用し、２ｎ系列で希釈した。出発濃度は、それぞれ、ＴＧＦ−β１の場合２μＭ、ＴＧＦ−β３の場合０．０５μｇ／ｍｌ、または全ての反標的の場合１００ｎＭであった。
エピトープビニング
ＰＢＳに希釈した２．５μｇ／ｍｌのＴＧＦ−β２特異的Ｆａｂにより、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）３８４ウェルプレートを４℃で一晩コーティングした。ビオチン化ＴＧＦ−β２タンパク質を０．１μｇ／ｍｌ（約８ｎＭ）の定常ＴＧＦ−β２濃度の溶液中のＦａｂと室温で１時間インキュベートし、Ｆａｂの滴定はＴＧＦ−β２タンパク質と比較して１２．５モル過剰のＦａｂ（５μｇ／ｍｌ（１００ｎＭ））から開始された。Ｆａｂ−ＴＧＦ−β２複合体を、ＢＳＡで３０分間ブロックされたＦａｂをコートしたウェルに次に加えた。結合したビオチン化ＴＧＦ−β２は、アルカリ性ホスファターゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｚｙｍｅｄ）、＃４３−４３２２）にコンジュゲートしたストレプトアビジンとのインキュベーションと、続くＡｔｔｏＰｈｏｓ蛍光基質（Ｒｏｃｈｅ、＃１１６８１９８２００１）の添加によって検出した。５３５ｎｍの蛍光発光を、４３０ｎｍでの励起で記録した。
ＩｇＧへの変換
完全長ＩｇＧを発現させるために、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメイン断片を、Ｆａｂ発現ベクターからヒトＩｇＧ１ｆ＿ＬＡＬＡのためのｐＭｏｒｐｈ（登録商標）４＿ｈＩｇ１ｆ＿ＬＡＬＡ＿カッパまたはｐＭｏｒｐｈ（登録商標）４＿ｈＩｇ１ｆ＿ＬＡＬＡ＿ラムダベクターにサブクローニングした。
ＨｕＣＡＬ（登録商標）免疫グロブリンの生成
ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）４ベクター系を使用したヒトＩｇＧの一過性の試験的発現および精製。ＩｇＧの重鎖および軽鎖の両方をコードするｐＭＯＲＰＨ（登録商標）４発現ベクターＤＮＡにより、真核生物のＨＫＢ１１細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションから３日または７日目に細胞培養上清を収集し、標準のプロテインＡ親和性クロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳＵＲＥ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に付した。特記されない限り、１×ダルベッコのＰＢＳ（ｐＨ７．２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）への緩衝液交換を実行し、試料を濾過滅菌（０．２μｍの孔径）した。ＩｇＧの純度は、Ｌａｂｃｈｉｐシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡまたはＡｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）を使用した変性、還元性および非還元性条件の下で、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。タンパク質濃度を紫外分光光度法によって測定し、自然状態のＩｇＧ調製物を分析するためにＨＰ−ＳＥＣを実行した。
パニング、抗体の同定および特徴付け
抗体変異体タンパク質の供与源として市販されているファージディスプレイライブラリー、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ ＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ライブラリーを使用して、高い結合親和性を有するクローンの選択によって、抗原ＴＧＦ−β２タンパク質の生物学的活性を中和する治療的抗体を生成した。ＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ファージミドライブラリーは、ＨｕＣＡＬ（登録商標）概念（Knappik et al., J Mol Biol 296, 57-86, 2000）に基づき、ファージ表面でＦａｂを提示するためにＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（登録商標）テクノロジーを用いる（国際公開第０１／０５９５０号）。
５つのパニング戦略、３つはビーズベースのものおよび２つは溶液パニング、を実行した。第２回の標準パニングのアウトプットを使用して、ＲａｐＭＡＴ（登録商標）パニングを実行した。高度に多様なＨｕＣＡＬ（登録商標）抗体を選択する確率を高くするために、ライブラリープールを主に別個に保った。高親和性抗体を生成する確率を高くするために、標準パニングの２回目のアウトプットを使用してＲａｐＭＡＴ（登録商標）を実行した。Ｈ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を、別々に多様化した。標準パニングのアウトプットを、ヒトＴＧＦ−β２への結合についてスクリーニングした。スクリーニング方法は、パニング戦略に基づいて選択した：ビーズパニングはＦＭＡＴアプローチを使用してスクリーニングし、溶液パニングはＦａｂ捕捉ＥＬＩＳＡアプローチを使用してスクリーニングした。ＴＧＦ−β１に対するカウンタースクリーニングは、ＦＭＡＴを使用して実行した。ｒｈ ＴＧＦ−β２に対するパニングのために、ｐＳｍａｄ３ ＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）をベースとしたスクリーニングを実行した。ＳＥＴアプローチを使用して、主に最もアフィンなヒットについてＲａｐＭＡＴ（登録商標）パニングアウトプットをスクリーニングした。標準対ＲａｐＭＡＴ（登録商標）パニングの一部として、ｒｈ ＴＧＦ−β２に対するパニングのために、ｐＳｍａｄ３ ＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）をベースとしたスクリーニングを実行した。これらの方法を使用して、ｈＴＧＦ−β２の阻害を分析した。ｈＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３陰性クローンを選択する、ストリンジェントなＥＬＩＳＡスクリーニングを適用した。さらに、高アフィン（ＴＧＦ−β１へのＫＤ＜２５ｎＭ）ＴＧＦ−β１結合体を排除するために、ＳＥＴスクリーニングはＴＧＦ−β１に対するカウンタースクリーニングを含んだ。標準パニングの一次スクリーニングにおいて同定された一次ヒットのうち、ｐＳｍａｄ３ ＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）をベースとしたスクリーニングで同定された２７個のモノクローナルＴＧＦ−β２阻害抗体が固定された。その後、１０／２７個の特異な強固になったクローンを試験的スケールで発現させ、精製した。これらの精製されたＦａｂタンパク質も、その後ＲＧＡで分析した。ＲａｐＭＡＴ（登録商標）パニングの一次スクリーニングで同定された一次ヒットは、Ｆａｂ−ＦＨフォーマットで微量発現させ、微量精製し、その後、ＲＧＡでｈＴＧＦ−β２、ｍＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３およびＴＧＦ−β１の阻害について分析した。ｐＳｍａｄ３ ＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）スクリーニングアプローチにおいて同定されたｍＴＧＦ−β２阻害性ヒットと合わせて、３８個の特異な固定された抗体は、次にＦａｂ−ＦＨフォーマットにより試験的スケールで発現させ、ＲＧＡで分析もした。ＥＬＩＳＡおよび配列決定における異なるＴＧＦ−βアイソフォームへの結合の分析を含んだ固定ステップのために、最も有力な二次ヒットを選択した。全てのパニングおよびスクリーニング戦略から、合計で１９０個の特異なＦａｂを固定することができた。１９０個の特異な固定された抗体の配列分析は、以下を示した：
− ９０個のＨＣＤＲ３ファミリー；
− ８９個のカッパおよび１０１個のラムダ抗体。
１９０個の固定されたＦａｂを大腸菌（E. coli）で発現させ、精製した。１６９／１９０個の発現させたＦａｂは品質管理に合格し、ヒトＴＧＦ−β２、マウスＴＧＦ−β２、ヒトＴＧＦ−β３およびヒトＴＧＦ−β１の阻害についてＲＧＡにおいて特徴付けられた。この特徴付けの結果に基づいて、最も見込みがある１１６個の抗体を、ＲａｐＣＬＯＮＥ（登録商標）を介したｈＩｇＧ１ｆ＿ＬＡＬＡフォーマットへの変換のために選択した。
選択−発展性評価（ｓ−ＤＡＳ）を含むＩｇＧ特徴付け
１１６個のＩｇＧを真核生物のＨＫＢ１１細胞で発現させ、精製した。９０／１１６個の発現させたＩｇＧは品質管理に合格し、ヒトＴＧＦ−β２、マウスＴＧＦ−β２、ヒトＴＧＦ−β３およびヒトＴＧＦ−β１の阻害についてＲＧＡにおいて特徴付けられた。高い割合の抗体が、凝集傾向のために高いか中等度の発展性リスクを有することが見出された。延長されたｓ−ＤＡＳ分析の中で、疎水性分析も実行した。結果は、高い割合の、非常に疎水性の抗体を明らかにした。高い疎水性は、抗体の凝集傾向と相関することが見出された。低い発展性リスクを有すると明記された抗体と比較して高いか中等度の発展性リスクを有すると明記された抗体の間で、より高い割合の高／中等度の疎水性を有する抗体が見出された。
候補の特徴付け（生殖系列化およびＰＴＭ除去の前）
ｓ−ＤＡＳに合格した５６個の抗体は、ＲＧＡにおいて親和性および効力を示した。ＲＧＡおよびＣＫアッセイおよび延長されたｓ−ＤＡＳデータ（ｓ−ＤＡＳ＋疎水性評価）における活性に基づく。ｉｎ ｖｉｖｏ特徴付けおよびＰＴＭ除去／生殖系列化のために、６つの抗ＴＧＦ−β２抗体を選択した。これらの６つの選択された抗体（ＭＯＲ１２７７３、ＭＯＲ１３４３６、ＭＯＲ１３４３８、ＭＯＲ１２４１３、ＭＯＲ１３４１６、ＭＯＲ１３４２６）を、下に要約される様々なアッセイで特徴付けた。
親和性測定
抗体抗原相互作用のＫＤ値は、上記の原理および条件に従ってＳＥＴを使用して測定した。ＴＧＦ−β２特異的Ａｂ ＭＯＲ１３４３６、および選択されたＴＧＦ−β２抗体に関するＫＤ値は、表１に要約する。このプロジェクトのＫＤ成功基準は、ヒトＴＧＦ−β２については２００ｐＭ未満に設定した。全ての選択されたＴＧＦ−β２特異的抗体候補は、この基準を満たした。ＴＧＦ−β２特異的は、好ましくは５倍の緩い基準でマウスＴＧＦ−β２に結合すると予想される。６つの選択されたＴＧＦ−β２特異的抗体のうちの４つは、この基準を満たした。
反標的への交差反応性
ＴＧＦ−β１および５つの反標的（ミオスタチン、ＧＤＦ−１１、アクチビンＡ、アクチビンＢおよびアクチビンＡＢ）への最終抗体の結合（ＰＴＭ除去および生殖系列化の前）を、上記の原理および条件に従ってＳＥＴを使用して分析した。全ての選択されたＴＧＦ−β２特異的Ａｂは、成功基準を満たした。
ＲＧＡにおける活性
最終抗体の活性（ＰＴＭ除去および生殖系列化の前）を、上記の条件を使用したＲＧＡにおいてｈＴＧＦ−β２、ｍＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３およびＴＧＦ−β１の阻害について分析した。ＭＯＲ１３４３６に関するＲＧＡ活性データの一つの例を、図３に示す。このプロジェクトのＲＧＡ成功基準のＩＣ５０は、ヒトＴＧＦ−β２については２００ｐＭ未満に設定した。全ての選択されたＴＧＦ−β２特異的抗体候補は、この基準を満たした。
ＣＫアッセイにおける活性
最終抗体の活性（ＰＴＭ除去および生殖系列化の前）を、上記の条件を使用したＣＫアッセイで分析した。ＣＫアッセイデータはＲＧＡデータとよく相関したが、ＣＫアッセイで一般的により低い効力であった。このプロジェクトのＣＫアッセイ成功基準のＩＣ５０は、ヒトＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３抗体のそれぞれについて１０００ｐＭ未満に設定した。ＭＯＲ１３４３６の濃度−応答曲線の例を、図５に提供する。
受容体−リガンド相互作用アッセイ
ＴＧＦ−β２−ＴＧＦβＲＩＩＩ結合を阻害する最終抗体の能力（ＰＴＭ除去および生殖系列化の前）を、上記の条件を使用した受容体−リガンド相互作用アッセイで分析した。
最終候補の生殖系列化／工学操作
ＰＴＭ除去および生殖系列化の後に、合計で２３個の誘導体をｐＭ４＿ｈＩｇＧ１ｆ＿ＬＡＬＡ＿カッパまたはｐＭ４＿ｈＩｇＧ１ｆ＿ＬＡＬＡ＿ラムダにおいて生成した。表は、ＰＴＭ除去および生殖系列化の後の抗体誘導体の概要を提供する。
ＲＧＡにおける活性
最終抗体の活性（ＰＴＭ除去および生殖系列化の後）を、上記の条件を使用したＲＧＡにおいてｈＴＧＦ−β２、ｍＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３およびＴＧＦ−β１の阻害について分析した。データは、表４に要約する。
ＣＫアッセイにおける活性
最終抗体の活性（ＰＴＭ除去および生殖系列化の後）を、上記の条件を使用したＣＫアッセイで分析した。ＣＫアッセイデータは、表４に要約する。
反標的への交差反応性（ＲＧＡ）
ＴＧＦ−β３および５つの反標的（ミオスタチン、ＧＤＦ−１１、アクチビンＡ、アクチビンＢおよびアクチビンＡＢ）への最終抗体の交差反応性（ＰＴＭ除去および生殖系列化の後）を、上記の条件を使用したＲＧＡで分析し、図４に示す。
要約すると、ＴＧＦ−β３および５つの反標的の濃度依存性阻害は、試験した抗体のいずれについても検出できなかった。最終抗体は、ＴＧＦ−β１の阻害についても試験した。抗体のいずれも、１００ｎＭ ＩｇＧまでＴＧＦ−β１の濃度依存性阻害を示さなかった。
統計分析
結果は、平均＋／−ＳＥＭで表す。統計分析は、一元配置分散分析法に従って、ダネットの多重比較検定を使用して実行した。確率値が＜０．０５であったとき、処置（抗ＴＧＦ−β２抗体ＭＯＲ１４７９７、ＭＯＲ１４７９９、ＭＯＲ１４８００、ＭＯＲ１４８０５、ＭＯＲ１４８０９およびＭＯＲ１４７８７を対照抗体との差について試験した）および差は有意であると考えた：＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、ＮＳ：ＩｇＧ対照に対して有意性なし。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）によって実行した。０日目の体重を引き算することによって体重を計算し、筋肉重は０日目の体重（初期体重）によって正規化した。
デュピュイトラン病を患っている患者からの組織における抗ＴＧＦ−β２抗体のｅｘ ｖｉｖｏ試験
免疫組織化学およびｍＲＮＡによって線維症マーカーを測定する、その抗線維症活性を測定するためのデュピュイトランの拘縮疾患の最近記載された三次元ｅｘ ｖｉｖｏ培養システム（Karkampouna et al. 2014, Molecular Therapy - Nucleic Acids, (2014) 3, e142）で、ＴＧＦ−β２特異的Ａｂ ＭＯＲ１４７９７を試験し、汎ＴＧＦ−βＡｂ １Ｄ１１と比較した。結果は、図７および８に示す。ｅｘ ｖｉｖｏモデルは、Karkampouna et al. 2014に記載されている通りに実行した。患者組織をスライスし、３μｇ／ｍｌの抗体の存在下で７日間、ニトロセルラー膜の上で培養した。７日目に、組織スライスをｍＲＮＡ単離のために収集したか、または免疫組織化学分析のために使用されるならば、低温包埋のために固定し、処理した。
免疫組織化学のために、５μｍの切片を切り出し、コラーゲン１およびα−平滑筋アクチンに対する抗体で染色した。核色素ＤＡＰＩを使用して、核を評価した。標識された検体の共焦点顕微鏡で切片につき３つの画像を取得し、画像化分析によって数量化した。ＲＮＡ分析のために、全ＲＮＡを単離し、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を実行した。結果は、ハウスキーピング遺伝子の発現に正規化したｍＲＮＡ発現で表す。３人の異なる患者からの培養で、３μｇ／ｍｌのＭＯＲ１４７９７は、免疫組織化学によって測定したとき線維症マーカーコラーゲン１およびα−平滑筋アクチン（ＳＭＡ；図７を参照）を効果的に低減した。ＭＯＲ１４７９７は、汎ＴＧＦ−βＡＢ １Ｄ１１より効果的だった。２人のさらなる患者からの培養で、線維症マーカーコラーゲン１およびα−平滑筋アクチンの用量依存的（０．０３〜３μｇ／ｍｌ）低減が示された。ＴＧＦ−β２特異的Ａｂ ＭＯＲ１４７９７のコラーゲン１免疫染色阻害の例を、図８に示す。ＭＯＲ１４７９７は、ｍＲＮＡレベルの様々な線維症マーカーの発現も低減した。
片側性尿管閉塞（ＵＵＯ）マウス腎臓線維症モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ試験
ｍＲＮＡによって線維症マーカーを測定する、その抗線維症活性を測定するための、片側性尿管閉塞（ＵＵＯ）マウス腎臓線維症モデルにおけるＴＧＦ−β２特異的Ａｂ ＭＯＲ１３４３６。結果を、図９に示す。ｅｘ ｖｉｖｏモデルは、Kitamoto et al. 2009（J Pharmacol Sci, 111, 285-292）に記載されている通りに実行した。簡潔には、左尿管の完全なライゲーションによってＵＵＯを実行し、５ｍｇ／ｋｇのＴＧＦ−β２特異的ＡＢ ＭＯＲ１４３４６で１４日間処置した。ｍＲＮＡ単離のために、腎臓を回収した。ＲＮＡ分析のために、全ＲＮＡを単離し、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を実行した。結果は、ハウスキーピング遺伝子の発現に正規化したｍＲＮＡ発現で表す。
ヒトＴＧＦβ−２／ＭＯＲ１４７９７ Ｆａｂ複合体のＸ線結晶構造
ＭＯＲ１４７９７のＦａｂ断片（配列番号６９（部分配列）および７９、表５）に結合したヒトＴＧＦβ−２（残基３０３〜４１４、配列番号１２２）の結晶構造を測定した。下で詳述されるように、複合体の個々の構成成分は、別個の発現系を使用して生成され、精製された複合体を生成するために組み合わせた。ＭＯＲ１４７９７ Ｆａｂに結合したＴＧＦβ−２に関する回折データを生成するために、Ｘ線結晶学を次に用い、抗原結合部位を解明した。
タンパク質生成
ＩｇＧのパパイン切断からのＦａｂ生成：ＭＯＲ１４７９７ Ｆａｂは、固定化されたパパイン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）による完全長ＭＯＲ１４７９７ ＩｇＧの切断によって生成された。２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ中の２０ｍｇ／ｍｌのＭＯＲ１４７９７ ＩｇＧを、８０：１の重量比で固定化されたパパインと混合し、混合物は、３７℃で一晩、回転プラットホームの上でインキュベートした。次に、重力流動カラムを使用して、ＦａｂおよびＦｃ断片を固定化されたパパインから分離した。次に、あらゆるＦｃ断片を除去するために、収集したフロースルーをＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳＵＲＥカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に加えた。Ｆａｂ含有フロースルーを次に濃縮し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡させたＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に加えた。ピーク分画はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析にかけ、組み合わせた分画はＴＧＦβ−２と複合体を形成するために次に使用した。
ＴＧＦβ−２−ＭＯＲ１４７９７ Ｆａｂ複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ再構成：１：１０（ｖ／ｖ）の１Ｍクエン酸三ナトリウム（ｐＨ３．５）を加えることによって、１ｍｇ／ｍｌの濃度のＦａｂを酸性化した。次に、精製されたＴＧＦβ−２を、１：１．５のモル比（濃度はＯＤ Ａ２８０によって測定した）でＭＯＲ１４７９７ Ｆａｂと混合した。複合体を１：５（ｖ／ｖ）の１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で中和し、次に濃縮し、その後２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡させたＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に加えた。ピーク分画はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析にかけ、選択された分画を結晶化試験のために組み合わせた。
結晶化および構造決定
ＴＧＦβ−２−ＭＯＲ１４７９７複合体を２０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、その後、結晶化スクリーニングを実施する前に２０，０００×ｇで１０分間遠心分離した。シッティングドロップ蒸気拡散セットアップを使用して、結晶を２０℃で成長させた。ＴＧＦβ−２−ＭＯＲ１４７９７複合体の０．１μｌを、０．１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）および７０％（ｖ／ｖ）のＭＰＤを含有するレザバー溶液の０．１μｌと混合し、液滴を、４５μｌのレザバー溶液に対して平衡させた。液体窒素の中で結晶を直接的に瞬間冷却し、光線１７−ＩＤでの回折データの収集のために、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ（Ａｒｇｏｎｎｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳＡ）に送った。データセットは、ａｕｔｏＰＲＯＣ（バージョン１．１．６、Ｇｌｏｂａｌ Ｐｈａｓｉｎｇ Ｌｔｄ．）を使用して、格子サイズａ＝７７．２Å、ｂ＝１２２．１Å、ｃ＝１３０．１Å、α＝９０°、β＝９０°およびγ＝９０°の空間群Ｐ２１２１２１において２．４Åの解像度まで処理した。複合体の構造はＰｈａｓｅｒ（バージョン２．５．５、McCoy et al., J. Appl. Cryst. 40, 658-674, 2007）を使用して分子交換によって解決し、最終モデルはＣＯＯＴ（バージョン０．８．７、Emsley et al., Acta Cryst. D66, 486-501, 2010）において構築され、Ｐｈｅｎｉｘ（バージョン１．１１．１、Afonine et al., Acta Cryst. D66, 213-221, 2010）を使用して精密化された。ＲｗｏｒｋおよびＲｆｒｅｅ値は、それぞれ１７．５％および２３．０％である。結合の長さおよび角度のＲＭＳＤ値は、０．００８Åおよび１．０５４°であった。
エピトープは、ＭＯＲ１４７９７ Ｆａｂの任意の原子から５Å以内の原子を含有するＴＧＦβ−２の残基と規定され、ＰｙＭＯＬ（バージョン１．８、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ．）を使用して同定され、表６に掲載される。非対称単位（結晶中の最小の特異な単位）中に２コピーのＴＧＦβ−２／ＭＯＲ１４７９７ Ｆａｂ複合体があり、両方のコピーに共通する抗体接触残基だけがエピトープ残基として掲載される。
ＴＧＦβ−２に結合するＭＯＲ１４７９７のエピトープおよびパラトープ
ＴＧＦβ−２に結合するＭＯＲ１４７９７のエピトープおよびパラトープを同定するために、ＴＧＦβ−２−ＭＯＲ１４７９７ Ｆａｂ複合体の結晶構造を使用した。表６に詳述されるように、ＭＯＲ１４７９７ Ｆａｂと相互作用するＴＧＦβ−２の表面は、いくつかの非連続配列によって形成される。これらの残基は、ＭＯＲ１４７９７ Ｆａｂによって認識される三次元立体配置エピトープを形成する（図１）。表６に詳述されるように、ＴＧＦβ−２と相互作用するＭＯＲ１４７９７の表面は、いくつかの非連続配列によって形成される。これらの残基は、ＴＧＦβ−２に結合するＭＯＲ１４７９７の三次元パラトープを形成する（図１１）。
ＴＧＦβ−２に結合するＭＯＲ１４８００のエピトープ

Claims (28)

  1. ヒトＴＧＦ−βアイソフォームＴＧＦ−β２を中和し、ヒトアイソフォームＴＧＦ−β３を中和しない、ヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片。
  2. ヒトＴＧＦ−βアイソフォームＴＧＦ−β２を中和し、ヒトアイソフォームＴＧＦ−β３およびＴＧＦ−β１を中和しない、請求項１に記載の抗体またはその機能的断片。
  3. 中和が、Ｓｍａｄ依存性リポーター遺伝子アッセイによって測定される、請求項１または２に記載のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片。
  4. Ｓｍａｄ依存性リポーター遺伝子アッセイによって測定される場合、２５０ｐＭ未満の最大半減抑制濃度（ＩＣ５０）でヒトＴＧＦ−β２を中和し、１００ｎＭを超える最大半減抑制濃度（ＩＣ５０）でヒトＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β３を中和する、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片。
  5. ＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β３に関するその解離定数の少なくとも７０倍小さい解離定数で、ヒトアイソフォームＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３より優先的にヒトＴＧＦ−βアイソフォームＴＧＦ−β２に結合する、ヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体またはその機能的断片であって、前記抗体がヒトＴＧＦ−β２を中和する、前記抗体またはその機能的断片。
  6. １ｐＭ以下のＫＤでヒトＴＧＦ−β２に結合する、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片。
  7. 配列番号７、２７、４７、６７、８７または１０７のうちの少なくとも１つに少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨポリペプチド配列、および配列番号１７、３７、５７、７７、９７または１１７のうちの少なくとも１つに少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬポリペプチド配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片。
  8. 配列番号１、２１、４１、６１、８１、１０１または４、２４、４４、６４、８４、１０４または１２４〜１２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２、２２、４２、６２、８２、１０２または５、２５、４５、６５、８５、１０５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３、２３、４３、６３、８３、１０３または６、２６、４６、６６、８６、１０６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１１、３１、５１、７１、９１、１１１または１４、３４、５４、７４、９４、１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１２、３２、５２、７２、９２、１１２または１５、３５、５５、７５、９５、１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１３、３３、５３、７３、９３、１１３または１６、３６、５６、７６、９６、１１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片。
  9. （ａ）配列番号１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号１３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
    （ｂ）配列番号２１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号２３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
    （ｃ）配列番号４１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号４２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号４３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号５１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号５３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
    （ｄ）配列番号６１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号６２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号６３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号７１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号７２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号７３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
    （ｅ）配列番号８１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号８２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号８３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号９１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号９２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号９３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３；または
    （ｆ）配列番号１０１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１０２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１０３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１１１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１１２の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号１１３の軽鎖可変領域ＣＤＲ３
    を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体または機能的断片。
  10. 配列番号９、２９、４９、６９、８９、１０９からなる群から選択される少なくとも１つの配列に少なくとも９５％の配列同一性を有する完全長重鎖アミノ酸配列、および配列番号１９、３９、５９、７９、９９、１１９からなる群から選択される少なくとも１つの配列に少なくとも９５％の配列同一性を有する完全長軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片。
  11. （ａ）配列番号７の可変重鎖配列および配列番号１７の可変軽鎖配列；
    （ｂ）配列番号２７の可変重鎖配列および配列番号３７の可変軽鎖配列；
    （ｃ）配列番号４７の可変重鎖配列および配列番号５７の可変軽鎖配列；
    （ｄ）配列番号６７の可変重鎖配列および配列番号７７の可変軽鎖配列；
    （ｅ）配列番号８７の可変重鎖配列および配列番号９７の可変軽鎖配列；または
    （ｆ）配列番号１０７の可変重鎖配列および配列番号１１７の可変軽鎖配列
    を含む、ヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体。
  12. （ａ）配列番号９の重鎖配列および配列番号１９の軽鎖配列；
    （ｂ）配列番号２９の重鎖配列および配列番号３９の軽鎖配列；
    （ｃ）配列番号４９の重鎖配列および配列番号５９の軽鎖配列；
    （ｄ）配列番号６９の重鎖配列および配列番号７９の軽鎖配列；
    （ｅ）配列番号８９の重鎖配列および配列番号９９の軽鎖配列；または
    （ｆ）配列番号１０９の重鎖配列および配列番号１１９の軽鎖配列
    を含む、ヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体。
  13. ＩｇＧ１アイソタイプのものである、前記請求項のいずれか一項に記載の抗ＴＧＦ−β２抗体。
  14. Ｆｃ領域の突然変異により変更されたエフェクター機能を有する、前記請求項のいずれか一項に記載のヒトモノクローナル抗ＴＧＦ−β２抗体。
  15. 前記請求項のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片をコードする、単離されたポリヌクレオチド配列。
  16. 配列番号８、１０、１８、２０、２８、３０、３８、４０、４８、５０、５８、６０、６８、７０、７８、８０、８８、９０、９８、１００、１０８、１１０、１１８または１２０の１つまたは複数を含む、請求項１５に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
  17. 請求項１５または１６に記載の１つまたは複数の単離されたポリヌクレオチド配列を含む、クローニングまたは発現ベクター。
  18. 少なくとも１つのＣＤＲ領域をコードする、配列番号８、１０、１８、２０、２８、３０、３８、４０、４８、５０、５８、６０、６８、７０、７８、８０、８８、９０、９８、１００、１０８、１１０、１１８もしくは１２０、またはその断片の１つまたは複数を含む、請求項１７に記載のベクター。
  19. 請求項１７または１８に記載の１つまたは複数のベクターを含む宿主細胞。
  20. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片の生成のための方法であって、請求項２４の宿主細胞を培養し、前記抗体または機能的断片を単離することを含む方法。
  21. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片を含む医薬組成物。
  22. 療法において、または医薬として使用するための、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片を含む医薬組成物。
  23. 薬学的に許容される希釈剤または担体をさらに含む、請求項２１または２２に記載の医薬組成物。
  24. １つまたは複数のさらなる活性薬剤をさらに含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  25. デュピュイトラン病、マルファン関連の状態またはマルファン病、表皮水疱症、線維柱帯切除術、ロイス−ディーツ症候群、皮膚全身性硬化症および筋骨格疾患または障害からなる群から選択される疾患または病的状態の処置に使用するための、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  26. デュピュイトラン病、マルファン関連の状態またはマルファン病、表皮水疱症、線維柱帯切除術、ロイス−ディーツ症候群、皮膚全身性硬化症および筋骨格疾患または障害からなる群から選択される疾患または病的状態を患っている患者を処置する方法であって、前記患者に請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の医薬組成物の有効用量を投与することを含む方法。
  27. デュピュイトラン病、マルファン関連の状態またはマルファン病、表皮水疱症、線維柱帯切除術、ロイス−ディーツ症候群、皮膚全身性硬化症または筋骨格疾患または障害の処置のための医薬の製造における、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体もしくは機能的断片、請求項１５もしくは請求項１６に記載のポリヌクレオチド配列または請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
  28. 請求項１２の少なくとも１つの抗体によってＴＧＦβ−２への結合を交差ブロックするかまたは交差ブロックされる、抗体またはその機能的断片。
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