JP2019508367A - ＴＮＦαに結合する抗体分子 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＴＮＦαについて特異性を有する抗体分子、抗体分子の治療使用、及び前記抗体分子を産生する方法に関する。

Description

本開示は、ＴＮＦに特異的な抗体、それを含む製剤、治療法における各々の使用、前記抗体を発現させ随意に製剤化するためのプロセス、抗体をコードするＤＮＡ、及び前記ＤＮＡを含む宿主に関する。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーは、細胞生存及び細胞死を調節する主要な機能を共有するタンパク質のファミリーである。ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーは共通のコアモチーフを共有し、それは逆平行β鎖による２つの逆平行βプリーツシートからなり、「ゼリーロール」β構造を形成する。ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーが共有する別の共通の特色は、ホモ三量体又はヘテロ三量体の複合体を形成することである。特異的なＴＮＦスーパーファミリー受容体へ結合し活性化するのは、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのこれらの三量体形態である。

ＴＮＦαはＴＮＦスーパーファミリーの典型的なメンバーであり、対称的なホモ三量体を形成する。ＴＮＦα産生の調節異常は、際立って医学的に重要な多くの病理学的状態に関与していた。例えば、ＴＮＦαは、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患（クローン病が含まれる）、乾癬、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、疼痛、癲癇、骨粗鬆症、喘息、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）及び多発性硬化症（ＭＳ）に関与していた。

ＴＮＦスーパーファミリーメンバーの公知のアンタゴニストは巨大分子であり、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーがその受容体へ結合することを阻害することによって作用する。かかるアンタゴニストの例としては、抗ＴＮＦα抗体、特にモノクローナル抗体（インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））及びセルトリズマブ・ペゴル（Ｃｉｍｚｉａ（登録商標））等）、又は可溶性ＴＮＦα受容体融合タンパク質（エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））等）が挙げられる。これらは、可溶性ＴＮＦαと受容体ＴＮＦＲ１（炎症に関与する）との相互作用及び膜結合性ＴＮＦαと受容体ＴＮＦＲ２（免疫応答に関与する）との相互作用を両方とも阻害する。

慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者における疾患の重要な駆動力としてＴＮＦａの役割は、十分確立されている。実際、抗ＴＮＦａの抗体は患者ケアを変え、現在抗ＴＮＦａ＋メトトレキサートはＲＡ患者のためのケアの最新のゴールドスタンダードである。

したがって、一態様において、可変領域を有する重鎖又は重鎖断片を含み、前記可変領域が、配列番号：１、配列番号：２及び配列番号：３から独立して選択される１、２又は３つのＣＤＲを含み、例えば、ＣＤＲ Ｈ１が配列番号：１である、ＣＤＲ Ｈ２が配列番号：２である、及び／又はＣＤＲ Ｈ３が配列番号：３である、抗ＴＮＦ抗体又はその結合断片が提供される。

したがって、一実施形態のＣＤＲ Ｈ１は配列番号：１でありＣＤＲ Ｈ２は配列番号：２であるか、又はＣＤＲ Ｈ１は配列番号：１でありＣＤＲ Ｈ３は配列番号：３であるか、又はＣＤＲ Ｈ２は配列番号：２でありＣＤＲ Ｈ３は配列番号：３である。

一実施形態において、本開示に記載の抗体又は結合断片は、可変領域を有する軽鎖又は軽鎖断片を含み、例えば配列番号：４〜１０から独立して選択される１、２又は３つのＣＤＲを含み、特にＣＤＲ Ｌ１は配列番号：４又は５で示される配列を有し、ＣＤＲ Ｌ２は配列番号：６、７、８又は９で示される配列を有し、ＣＤＲ Ｌ３は配列番号：１０で示される配列を有する。

したがって、一実施形態のＣＤＲ Ｌ１は配列番号：４でありＣＤＲ Ｌ２は配列番号：６、７、８若しくは９であるか、ＣＤＲ Ｌ１は配列番号：５でありＣＤＲ Ｌ２は配列番号：６、７、８若しくは９であるか、又はＣＤＲ Ｌ１は配列番号：４若しくは５でありＣＤＲ Ｌ３は配列番号：１０であるか；又はＣＤＲ Ｌ２は配列番号：６、７、８若しくは９であるか又はＣＤＲ Ｌ１は配列番号：１０である。

一実施形態において、本開示に記載の抗体又は結合断片は、配列番号：１〜１０から選択されるＣＤＲ配列を含み、例えば、ＣＤＲ Ｈ１は配列番号：１であり、ＣＤＲ Ｈ２は配列番号：２であり、ＣＤＲ Ｈ３は配列番号：３であり、ＣＤＲ Ｌ１は配列番号：４又は５であり、ＣＤＲ Ｌ２は配列番号：６、７、８又は９であり、ＣＤＲ Ｌ３は配列番号：１０である。

本明細書において明示的に開示される抗体又は結合断片と同じエピトープを結合する、抗体又は結合断片も提供される。

一実施形態において、ヒトＴＮＦへの本明細書において明示的に開示される抗体若しくは結合断片を交差ブロックするか、又は前記抗体によってヒトＴＮＦの結合から交差ブロックされる、抗体又は結合断片が提供される。

本開示は、本明細書において記載されるような抗体又は断片をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ等）へも拡張され、例えばそこでＤＮＡはベクターの中へ取り込まれる。

前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞も提供される。

抗体又は断片を発現する方法は、ポリマー（ＰＥＧ等）へ抗体又は断片をコンジュゲートする方法として本明細書において提供される。

本開示は、前記抗体及び断片を含む医薬組成物にも関する。

一実施形態において、治療有効量の本明細書において記載されるような抗体、断片又は組成物を投与することを含む、治療の方法が提供される。

本開示は、治療における使用、特に免疫障害、自己免疫障害及び／又は炎症性障害、例えば関節炎（炎症性関節炎等、特に関節リウマチ、強直性脊椎炎）の治療における使用のための、本開示に記載の抗体、断片又は組成物へも拡張される。

本開示の抗体及び結合断片に関連する様々な配列を示す。 ＣＡ２１０９マウスＦａｂ（ｆｗｋ１８ ＦＡＢ）ＩｇＧ１（ｆｗｋ１８ ＩｇＧ）についての力価測定曲線を示す。 本開示の抗体及び結合断片に関連する様々な配列アライメントを示す。 本開示の抗体及び結合断片に関連する様々な配列アライメントを示す。

ＴＮＦは、本明細書において用いられる時、サイトカイン腫瘍壊死因子αを指し、そのヒトアミノ酸配列はＰ０１３７５番号下でＵｎｉＰｒｏｔ中にある。

抗体分子は、本明細書において用いられる時、抗体又はその結合断片を指す。

「抗体」という用語は本明細書において使用される時、一般的にはインタクトな（全体の）抗体（すなわち２つの重鎖及び２つの軽鎖のエレメントを含む）に関連する。抗体はさらなる追加の結合ドメインを含むことができ、例えばＷＯ２００７／０２４７１５中に開示されるような分子ＤＶＤ−Ｉｇ、又はＷＯ２０１１／０３０１０７中に記載されるいわゆる（ＦａｂＦｖ）_２Ｆｃのようなものである。したがって、本明細書において用いられる時、抗体には、２価、３価又は４価の完全長抗体が含まれる。

抗体の結合断片には、一本鎖抗体（すなわち完全長の重鎖及び軽鎖）；Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、修飾Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ、単一ドメイン抗体（例えばＶＨ又はＶＬ又は、ＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ、二価、三価又は四価の抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリボディ、トリアボディ、テトラボディ、及び上記のもののうちの任意のエピトープ結合断片が含まれる（例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６−１１３６；Ａｄａｉｒ ａｎｄ Ｌａｗｓｏｎ，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ ２（３），２０９−２１７を参照）。これらの抗体断片を生成及び製造する方法は、当技術分野において周知である（例えばＶｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５−１８１を参照）。Ｆａｂ−Ｆｖフォーマットは最初にＷＯ２００９／０４０５６２中で開示され、そのジスルフィド安定化バージョン（Ｆａｂ−ｄｓＦｖ）は最初にＷＯ２０１０／０３５０１２中で開示された。本発明で使用される他の抗体断片には、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０及びＷＯ２００５／００３１７１中で記載されるＦａｂ断片及びＦａｂ’断片が含まれる。多価の抗体は複数の特異性を含み、例えば二重特異性又は単一特異性であり得る（例えばＷＯ９２／２２５８３及びＷＯ０５／１１３６０５を参照）。後者のかかる１つの例はＷＯ９２／２２５８３中で記載されるようなＴｒｉ−Ｆａｂ（又はＴＦＭ）である。

一実施形態において、Ｆａｂ断片が提供される。

一実施形態において、Ｆａｂ’断片が提供される。

典型的なＦａｂ’分子は重鎖及び軽鎖のペアを含み、そこで、重鎖は可変領域ＶＨ、定常ドメインＣＨ１及び天然又は修飾されたヒンジ領域を含み、軽鎖は可変領域ＶＬ及び定常ドメインＣＬを含む。

一実施形態において、Ｆ（ａｂ’）_２を生成する本開示に記載のＦａｂ’の二量体が提供され、例えば二量体化はヒンジを介するものであり得る。

一実施形態において、抗体又はその結合断片は結合ドメインを含む。結合ドメインは一般的には６つのＣＤＲ（重鎖から３つ及び軽鎖から３つ）を含むだろう。一実施形態において、ＣＤＲはフレームワーク中にあり、一緒に可変領域を形成する。したがって一実施形態において、抗体又は結合断片は、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む、抗原について特異的な結合ドメインを含む。

１つ又は複数の（例えば１、２、３又は４の）アミノ酸の置換、追加及び／又は欠失は、抗体がＴＮＦへ結合する能力の有意な改変なしに、本発明によって提供されるＣＤＲ又は他の配列（例えば可変ドメイン）へ行われ得ることが認識されるだろう。任意のアミノ酸の置換、追加及び／又は欠失の効果は、ＴＮＦの結合／ブロッキングを決定する、例えば本明細書において、特に実施例において記載される方法を使用することによって、当業者によって容易に試験され得る。

１つ又は複数の（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の）アミノ酸置換に加えて、追加及び／又は欠失を、本発明によって提供される抗体又は断片において用いられる重鎖及び／又は軽鎖のフレームワーク領域へ行うことができ、そこで、ＴＮＦへの結合親和性は保持又は増加される。

抗体可変ドメイン中の残基は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．によって考案されたシステムに従って従来通りにナンバリングされる。このシステムは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、１９８７年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、米国（以降「Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．」（前出））中で説明される。このナンバリングシステムは、特別に指示された場合を除いて、本明細書において使用される。

Ｋａｂａｔ残基表記は、必ずしもアミノ酸残基の直線状のナンバリングに直接対応するとは限らない。実際の直線状のアミノ酸配列は、基本的な可変ドメイン構造のフレームワークであるか、相補性決定領域（ＣＤＲ）であるかに関わらず、厳格なＫａｂａｔのナンバリングにおけるものよりも少数のアミノ酸又は追加のアミノ酸を含有し、それは、構造構成要素の短縮又は構造構成要素の中への挿入に対応し得る。残基の正確なＫａｂａｔのナンバリングは、「標準的な」Ｋａｂａｔナンバリング配列との抗体の配列中の残基のアライメントの相同性によって、所与の抗体について決定され得る。

重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従って、残基３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）及び残基９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）に所在する。しかしながら、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１−９１７（１９８７））によれば、ＣＤＲ−Ｈ１に等価なループは残基２６から残基３２へと拡張する。したがって特別の指示のない限り、「ＣＤＲ−Ｈ１」は、本明細書において用いられる時、Ｋａｂａｔのナンバリングシステム及びＣｈｏｔｈｉａの位相幾何学的ループ定義の組み合わせによって記載されるように、残基２６〜３５を指すことが意図される。

軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って、残基２４〜３４（ＣＤＲ−Ｌ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲ−Ｌ２）及び残基８９〜９７（ＣＤＲ−Ｌ３）に所在する。

本開示の抗体及び断片は、ＴＮＦの結合及び／又はシグナリングをブロックする。ブロッキングは、本明細書において用いられる時、受容体の物理的なブロッキング（閉塞等）を指すが、抗体又は断片が例えば立体配座的変化を引き起こすエピトープを結合し、天然リガンドがもはや受容体へ結合しないことを意味する場合も含むだろう。本発明の抗体分子はＴＮＦへ結合し、それによってその標的／受容体へのＴＮＦ結合を減少又は防止する（例えば阻害／中和する）。

本開示で使用される抗体は当技術分野において公知の任意の好適な方法を使用して得ることができる。ＴＮＦポリペプチド／タンパク質（融合タンパク質が含まれる）、ポリペプチドを発現する（組換え又は天然で）細胞（活性化Ｔ細胞等）、を使用して、ＴＮＦを特異的に認識する抗体を産生することができる。ポリペプチドは、「成熟」ポリペプチド又は生物学的に活性のあるその断片若しくは誘導体であり得る。

宿主を免疫付与する使用のためのポリペプチドは、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から当技術分野において周知のプロセスによって調製され得るか、又は天然の生物学的源から回収され得る。本出願において、「ポリペプチド」という用語にはペプチド、ポリペプチド及びタンパク質が含まれる。これらは特別の定めのない限り互換的に使用される。ＴＮＦポリペプチドは、いくつかの事例において、より大きなタンパク質（例えば親和性タグ又は類似のものへ融合された融合タンパク質等）の一部であり得る。

ＴＮＦポリペプチドに対して生成される抗体は、周知のルーチンのプロトコルを使用して、動物の免疫付与が必要な場合に、動物（好ましくは非ヒト動物）へポリペプチドを投与することによって得ることができる（例えばＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（編）、４巻、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、英国、１９８６年を参照）。多くの温血動物（ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダ又はブタ等）が免疫付与され得る。しかしながら、マウス、ウサギ、ブタ及びラットが一般的には好適である。

モノクローナル抗体は、当技術分野において公知の任意の方法（ハイブリドーマ技法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２）及びＥＢＶハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｐｐ７７−９６，Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）等）によっても調製され得る。

本発明で使用される抗体は、例えばＢａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３（１５）：７８４３−７８４８１；ＷＯ９２／０２５５１；ＷＯ２００４／０５１２６８及び国際特許出願第ＷＯ２００４／１０６３７７号によって記載される方法によって特異的抗体の産生のために選択された単一リンパ球から生成された免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡを、クローン化及び発現させることによる、単一リンパ球抗体方法を使用して、生成することもできる。

抗体のためのスクリーニングは、ヒトＴＮＦへの結合を測定するアッセイ及び／又は受容体へのＴＮＦ結合をブロッキングする能力を測定するアッセイを使用して遂行され得る。結合アッセイの例はＥＬＩＳＡである。好適なアンタゴニストアッセイ及びブロッキングアッセイの例は、本明細書の実施例において以下に記載される。

特異的は、本明細書において用いられる時、特異的抗原のみを認識する抗体、又は非特異的抗原への結合に比較して、特異的抗原への有意により高い結合親和性（例えば少なくとも５、６、７、８、９、１０倍高い結合親和性）を有する抗体を指すことが意図される。結合親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ等の技法によって、以下に本明細書において記載されるように測定され得る。

本開示に記載のある特定の抗体のアミノ酸配列及びポリヌクレオチド配列が提供され、本発明の態様を形成する。

したがって一態様において、可変領域を有する重鎖又は重鎖断片を含み、前記可変領域が、配列番号：１、配列番号：２及び配列番号：３から独立して選択される１、２又は３つのＣＤＲを含み、例えば、ＣＤＲ Ｈ１が配列番号：１である、ＣＤＲ Ｈ２が配列番号：２である、及び／又はＣＤＲ Ｈ３が配列番号：３である、抗ＴＮＦ抗体又はその結合断片が提供される。

したがって、一実施形態のＣＤＲ Ｈ１は配列番号：１でありＣＤＲ Ｈ２は配列番号：２であるか、又はＣＤＲ Ｈ１は配列番号：１でありＣＤＲ Ｈ３は配列番号：３であるか、又はＣＤＲ Ｈ２は配列番号：２でありＣＤＲ Ｈ３は配列番号：３である。

一実施形態において、本開示に記載の抗体又は結合断片は、可変領域を有する軽鎖又は軽鎖断片を含み、例えば配列番号：４〜１０から独立して選択される１、２又は３つのＣＤＲを含み、特にＣＤＲ Ｌ１は配列番号：４又は５で示される配列を有し、ＣＤＲ Ｌ２は配列番号：６、７、８又は９で示される配列を有し、ＣＤＲ Ｌ３は配列番号：１０で示される配列を有する。

したがって一実施形態のＣＤＲ Ｌ１は配列番号：４でありＣＤＲ Ｌ２は配列番号：６、７、８若しくは９であるか、ＣＤＲ Ｌ１は配列番号：５でありＣＤＲ Ｌ２は配列番号：６、７、８若しくは９であるか、又はＣＤＲ Ｌ１は配列番号：４若しくは５でありＣＤＲ Ｌ３は配列番号：１０であるか；又はＣＤＲ Ｌ２は配列番号：６、７、８若しくは９であるか又はＣＤＲ Ｌ１は配列番号：１０である。

一実施形態において、本開示に記載の抗体又は結合断片は、配列番号：１〜１０から選択されるＣＤＲ配列を含み、例えば、ＣＤＲ Ｈ１は配列番号：１であり、ＣＤＲ Ｈ２は配列番号：２であり、ＣＤＲ Ｈ３は配列番号：３であり、ＣＤＲ Ｌ１は配列番号：４又は５であり、ＣＤＲ Ｌ２は配列番号：６、７、８又は９であり、ＣＤＲ Ｌ３は配列番号：１０である。

一実施形態において、本発明の抗体は３つの重鎖ＣＤＲを有する重鎖を含み、ＣＤＲＨ１の配列は配列番号：１で示される配列へ少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＨ２の配列は配列番号：２で示される配列へ少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＨ３の配列は配列番号：３で示される配列へ少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する。

一実施形態において、本発明の抗体は３つの軽鎖ＣＤＲを有する軽鎖を含み、ＣＤＲＬ１の配列は配列番号：４又は配列番号：５で示される配列へ少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＬ２の配列は配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８又は配列番号：９で示される配列へ少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＬ３の配列は配列番号：１０で示される配列へ少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する。

一実施形態において、本開示に記載の抗体又は結合断片は完全にヒトであり、例えばファージライブラリー又は類似のものから調製される。

一実施形態において、本開示に記載の抗体又は断片はヒト化される。

ヒト化抗体（それにはＣＤＲグラフトされた抗体が含まれる）は、非ヒト種からの１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する抗体分子である（例えばＵＳ５，５８５，０８９；ＷＯ９１／０９９６７を参照）。むしろ全体のＣＤＲではなくＣＤＲの特異性決定残基のみを移すことが必要であることが認識されるだろう（例えばＫａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６，２５−３４を参照）。ヒト化抗体は、ＣＤＲが由来した非ヒト種に由来する１つ又は複数のフレームワーク残基を随意にさらに含み得る。後者は、多くの場合ドナー残基と称される。

したがって一実施形態において、本明細書において使用される時、「ヒト化抗体分子」という用語は、重鎖及び／又は軽鎖が、アクセプター抗体（例えばヒト抗体）の重鎖及び／又は軽鎖の可変領域フレームワークの中へグラフトされたドナー抗体（例えばマウスモノクローナル抗体等の非ヒト抗体）からの１つ又は複数のＣＤＲ（所望されるならば１つ又は複数の修飾ＣＤＲが含まれる）を含有し、ＣＤＲが由来した非ヒト種に由来する１つ又は複数のフレームワーク残基（ドナー残基）を随意にさらに含む、抗体分子を指す。総説については、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，５３５−５３９，１９９８を参照されたい。一実施形態において、むしろ移されているＣＤＲ全体ではなく、本明細書において上で記載されるＣＤＲのうちの任意の１つからの特異性決定残基のうちの１つ又は複数のみが、ヒト抗体フレームワークへ移される（例えばＫａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６，２５−３４を参照）。一実施形態において、本明細書において上で記載されるＣＤＲのうちの１つ又は複数からの特異性決定残基のみが、ヒト抗体フレームワークへ移される。別の実施形態において、本明細書において上で記載されるＣＤＲの各々からの特異性決定残基のみが、ヒト抗体フレームワークへ移される。

ＣＤＲ又は特異性決定残基がグラフトされる場合に、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／タイプを考慮して、任意の適切なアクセプター可変領域フレームワーク配列を使用することができ、それらには、マウス、霊長動物及びヒトのフレームワーク領域が含まれる。

好適には、本発明に記載のヒト化抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域を含む可変ドメインに加えて、具体的に本明細書において提供されるＣＤＲのうちの１つ又は複数を有する。したがって、可変ドメインがヒトアクセプターフレームワーク領域及び非ヒトドナーＣＤＲを含む、ヒトＴＮＦを結合するブロッキングヒト化抗体が、一実施形態において提供される。

本発明において使用できるヒトフレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ及びＰＯＭである（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、前出）。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭは重鎖のために使用することができ、ＲＥＩは軽鎖のために使用することができ、ＥＵ、ＬＡＹ及びＰＯＭは重鎖及び軽鎖の両方のために使用することができる。或いは、ヒト生殖細胞系列配列を使用することができ、これらはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／で入手可能である。

本発明のヒト化抗体において、アクセプター重鎖及び軽鎖は、必ずしも同じ抗体に由来する必要はなく、所望されるならば、異なる鎖に由来するフレームワーク領域を有する複合鎖を含み得る。

本発明のヒト化抗体の重鎖に好適なかかる１つのフレームワーク領域は、ヒトＶＫ１ ２−１（Ｕ）Ａ２０ ＪＫ２アクセプターフレームワーク又はＶＨ３ １−３ ３−２１ ＪＨ４アクセプターフレームワーク（それぞれ、配列番号：２５及び２６）に由来する。

したがって、一例において、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号：１で示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号：２で示される配列、及びＣＤＲＨ３について配列番号：３で示される配列から選択される１つ又は複数のＣＤＲを含み、重鎖フレームワーク領域が、ヒトアクセプターフレームワークＶＨ３ １−３ ３−２１ ＪＨ４（配列番号：２６）に由来する、ヒト化抗体が提供される。

したがって、一例において、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号：１で示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号：２で示される配列、及びＣＤＲＨ３について配列番号：３で示される配列を含み、重鎖フレームワーク領域が、ヒトアクセプターフレームワークＶＨ３ １−３ ３−２１ ＪＨ４（配列番号：２６）に由来する、ヒト化抗体が提供される。

一例において、抗体の重鎖可変ドメインは、配列番号：１２、１６又は２８（１２又は１６等）で示される配列を含む。

本発明のヒト化抗体の軽鎖に好適なフレームワーク領域は、ヒトアクセプターフレームワークＶＫ１ ２−１（Ｕ）Ａ２０ ＪＫ２（配列番号：２５）に由来する。

したがって、一例において、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号：４又は５で示される配列、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号：６、７、８又は９で示される配列、及びＣＤＲＬ３について配列番号：１０で示される配列を含み、軽鎖フレームワーク領域が、ヒトアクセプターフレームワークＶＫ１ ２−１（Ｕ）Ａ２０ ＪＫ２に由来する、ヒト化抗体が提供される。

一例において、抗体の軽鎖可変ドメインは、配列番号：１１、１５又は２７（１１又は１５等）で示される配列を含む。一例において、抗体の軽鎖可変ドメインは、配列番号：２９で示される配列を含む。

一実施形態において、抗体又は結合断片は、配列番号：１２の重鎖可変領域及び配列番号：１１の軽鎖可変領域配列を含む。

一実施形態において、抗体又は結合断片は、配列番号：１２の重鎖可変領域及び配列番号：２９の軽鎖可変領域配列を含む。

一実施形態において、抗体又は結合断片は、配列番号：１６の重鎖可変領域及び配列番号：１５の軽鎖可変領域配列を含む。

一実施形態において、抗体又は結合断片は、配列番号：２８の重鎖可変領域及び配列番号：２７の軽鎖可変領域配列を含む。

本発明のヒト化抗体において、フレームワーク領域はアクセプター抗体のものと正確に同じ配列を有する必要はない。例えば、稀な残基は、そのアクセプター鎖のクラス又はタイプでより頻繁に起こる残基へ変化させることができる。或いは、アクセプターフレームワーク領域中の選択された残基がドナー抗体中の同じ位置で見出される残基へ対応するように、それらは変化され得る（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２４を参照）。かかる変化は、ドナー抗体の親和性を回復するのに必要な最小限へ抑えられるべきである。変化させることが必要であり得るアクセプターフレームワーク領域中の残基の選択のためのプロトコルは、ＷＯ９１／０９９６７中で説明される。

したがって一実施形態において、重鎖及び／又は軽鎖のフレームワーク中の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の残基は、代替のアミノ酸残基により置き換えられる。

したがって、一例において、重鎖の可変ドメインの位置２４、４８、４９、７１、７３、７８及び９３での残基（Ｋａｂａｔナンバリング）のうちの少なくとも１つが、ドナー残基である、ヒト化抗体が提供され、例えば配列番号：１２又は配列番号：２８で示される配列を参照されたい。

一実施形態において、重鎖可変ドメインの残基２４は代替のアミノ酸（例えばスレオニン）により置き換えられる。

一実施形態において、重鎖可変ドメインの残基４８は代替のアミノ酸（例えばイソロイシン）により置き換えられる。

一実施形態において、重鎖可変ドメインの残基４９は代替のアミノ酸（例えばグリシン）により置き換えられる。

一実施形態において、重鎖可変ドメインの残基７１は代替のアミノ酸（例えばバリン）により置き換えられる。

一実施形態において、重鎖可変ドメインの残基７３は代替のアミノ酸（例えばリジン）により置き換えられる。

一実施形態において、重鎖可変ドメインの残基７８は代替のアミノ酸（例えばアラニン）により置き換えられる。

一実施形態において、重鎖可変ドメインの残基９３は代替のアミノ酸（例えばスレオニン）により置き換えられる。

一実施形態において、本開示に記載のヒト化重鎖可変領域中で、残基４８はイソロイシンであり、残基４９はグリシンであり、７１はバリンであり、７３はリジンであり、７８はアラニンであり、残基９３はスレオニンである。

したがって、一例において、少なくとも重鎖の可変ドメインの位置４８、４９、７１、７３、７８及び９３の各々での残基（Ｋａｂａｔナンバリング）が、ドナー残基である、ヒト化抗体が提供され、例えば配列番号：１２で示される配列を参照されたい。

一例において、少なくとも重鎖の可変ドメインの位置２４、４８、４９、７１、７３、７８及び９３の各々での残基（Ｋａｂａｔナンバリング）が、ドナー残基である、ヒト化抗体が提供され、例えば配列番号：２８で示される配列を参照されたい。

一例において、軽鎖の可変ドメインの位置６５、７１及び８７での残基（Ｋａｂａｔナンバリング）のうちの１つ又は複数が、ドナー残基である、ヒト化抗体が提供され、例えば配列番号：１１又は配列番号：２７で示される配列を参照されたい。

一例において、少なくとも軽鎖の可変ドメインの位置６５、７１、及び８７の各々での残基（Ｋａｂａｔナンバリング）が、ドナー残基である、ヒト化抗体が提供され、例えば配列番号：１１で示される配列を参照されたい。

一実施形態において、軽鎖可変ドメインの残基６５は代替のアミノ酸（例えばスレオニン）により置き換えられる。

一実施形態において、軽鎖可変ドメインの残基７１は代替のアミノ酸（例えばチロシン）により置き換えられる。

一実施形態において、軽鎖可変ドメインの残基８７は代替のアミノ酸（例えばフェニルアラニン）により置き換えられる。

一実施形態において、本開示に記載のヒト化軽鎖可変領域中で、残基６５はスレオニンであり、残基７１はチロシンであり、残基８７はフェニルアラニンである。

一実施形態において、本発明は、重鎖を含み、重鎖の可変ドメインが、本明細書における配列（例えば配列番号：１２、１６又は２８で示される配列）へ少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性又は類似性を有する配列を含む、ヒトＴＮＦを結合する抗体分子を提供する。

一実施形態において、本発明は、軽鎖を含み、軽鎖の可変ドメインが、配列番号：１１、１５又は２７で示される配列へ少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性又は類似性を有する配列を含む、ヒトＴＮＦを結合する抗体分子を提供する。

一実施形態において、本発明は、ヒトＴＮＦを結合する抗体分子を提供し、そこで、抗体は、本明細書で示される配列（例えば配列番号：１２、１５又は２８で示される配列）へ少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％類似又は同一の重鎖可変ドメインを有するが、抗体分子は、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号：１で示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号：２で示される配列、及びＣＤＲ−Ｈ３について配列番号：３で示される配列を有する。

一実施形態において、本発明は、ヒトＴＮＦを結合する抗体分子を提供し、そこで、抗体は、本明細書で示される配列（例えば配列番号：１１、１５又は２７で示される配列）へ少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％類似又は同一の軽鎖可変ドメインを有するが、抗体分子は、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号：４又は５で示される配列、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号：６、７、８又は９で示される配列、及びＣＤＲ−Ｌ３について配列番号：１０で示される配列を有する。

一実施形態において、本発明は、ヒトＴＮＦを結合する抗体分子を提供し、そこで、抗体は、本明細書で示される配列（例えば配列番号：１２で示される配列）へ少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％類似又は同一の重鎖可変ドメイン及び本明細書で示される配列（例えば配列番号：１１で示される配列）へ少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％類似又は同一の軽鎖可変ドメインを有するが、抗体分子は、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号：１で示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号：２で示される配列、ＣＤＲ−Ｈ３について配列番号：３で示される配列、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号：４又は５で示される配列、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号：６、７、８又は９で示される配列、及びＣＤＲ−Ｌ３について配列番号：１０で示される配列を有する。

一実施形態において、本発明は、ヒトＴＮＦを結合する抗体分子を提供し、そこで、抗体は、本明細書で示される配列（例えば配列番号：１６で示される配列）へ少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％類似又は同一の重鎖可変ドメイン及び本明細書で示される配列（例えば配列番号：１５で示される配列）へ少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％類似又は同一の軽鎖可変ドメインを有するが、抗体分子は、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号：１で示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号：２で示される配列、ＣＤＲ−Ｈ３について配列番号：３で示される配列、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号：４又は５で示される配列、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号：６、７、８又は９で示される配列、及びＣＤＲ−Ｌ３について配列番号：１０で示される配列を有する。

一実施形態において、本発明は、ヒトＴＮＦを結合する抗体分子を提供し、そこで、抗体は、本明細書で示される配列（例えば配列番号：２８で示される配列）へ少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％類似又は同一の重鎖可変ドメイン及び本明細書で示される配列（例えば配列番号：２７で示される配列）へ少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％類似又は同一の軽鎖可変ドメインを有するが、抗体分子は、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号：１で示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号：２で示される配列、ＣＤＲ−Ｈ３について配列番号：３で示される配列、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号：４又は５で示される配列、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号：６、７、８又は９で示される配列、及びＣＤＲ−Ｌ３について配列番号：１０で示される配列を有する。

「同一性」は、本明細書において使用される時、アライメントさせた配列中の任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で同一であることを指す。「類似性」は、本明細書において使用される時、アライメントさせた配列中の任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で類似のタイプであることを指す。例えば、ロイシンはイソロイシン又はバリンで置換され得る。しばしば互いに置換され得る他のアミノ酸には、
−フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；
−リジン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；
−アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；
−アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；並びに
−システイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）
が含まれるがこれらに限定されない。同一性及び類似性の程度は容易に計算することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、パート１、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４編；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１年、ＮＣＢＩから入手可能なＢＬＡＳＴ（商標）ソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．＆Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２．Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．＆Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．１９９７，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９−６５６））。

本発明の抗体分子は、完全長の重鎖及び軽鎖を有する完全な抗体分子又はその断片を含み、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、修飾Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（例えばＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ、二価、三価又は四価の抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及び上記のものの任意のエピトープ結合断片であり得るがこれらに限定されない（例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６−１１３６；Ａｄａｉｒ ａｎｄ Ｌａｗｓｏｎ，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ ２（３），２０９−２１７を参照）。これらの抗体断片を生成及び製造する方法は、当技術分野において周知である（例えばＶｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５−１８１を参照）。本発明で使用される他の抗体断片には、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０及びＷＯ２００５／００３１７１中で記載されるＦａｂ断片及びＦａｂ’断片が含まれる。多価の抗体は複数の特異性を含み、例えば二重特異性又は単一特異性であり得る（例えばＷＯ９２／２２８５３、ＷＯ０５／１１３６０５、ＷＯ２００９／０４０５６２及びＷＯ２０１０／０３５０１２を参照）。

一例において、本発明は、本明細書において記載される抗ＴＮＦ抗体又はその結合断片のうちの任意の１つを含む、多重特異性抗体を提供する。多重特異性抗体は、２つ以上の抗原の結合が可能な任意の好適な抗体フォーマットを有することができる。多重特異性抗体フォーマットの例は当技術分野において公知であり、例えばダイアボディ、ｓｃダイアボディ、トリアボディ、タンデムｓｃＦｖ、ＦａｂＦｖ、Ｆａｂ’Ｆｖ、ＦａｂｄｓＦｖ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖ、Ｆａｂ−（ｄｓｓｃＦｖ）２、ＦａｂＦｖＦｖ、ＦａｂＦｖＦｃ、ｄｉＦａｂ、ｄｉＦａｂ’、トリボディ、タンデムｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ、ｓｃダイアボディ−Ｆｃ、ｓｃダイアボディ−ＣＨ３、Ｉｇ−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｉｇ、Ｖ−Ｉｇ、Ｉｇ−Ｖ、Ｄｕｏｂｏｄｙ及びＤＶＤ−Ｉｇが挙げられ、それらから選択され得る。一例において、多重特異性抗体はＷＯ２０１５／１９７７７２中で記載されるようなジスルフィド安定化抗体である。

本発明の一態様において、多重特異性抗体分子は二量体として提供され、
ａ）式（Ｉ）のポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｈ１−ＣＨ_１−Ｘ−Ｖ_１と；
ｂ）式（ＩＩ）のポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｌ１−Ｃ_Ｌ−Ｙ−Ｖ_２と
を含むか又はそれらからなり；
式中、
Ｖ_Ｈ１は重鎖可変ドメインを表わし；
ＣＨ_１は、重鎖定常領域（例えばそのドメイン１）のドメインを表わし；
Ｘは結合又はリンカーを表わし；
Ｙは結合又はリンカーを表わし；
Ｖ_１はｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖを表わし；
Ｖ_Ｌ１は軽鎖可変ドメインを表わし；
ＣＬは軽鎖定常領域（Ｃκ等）からドメインを表わし；
Ｖ_２はｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖを表わし、
Ｖ_Ｈ１及びＶ_Ｌ１は一緒に第１の抗原へ特異的な結合ドメインを形成し、Ｖ１及びＶ２は各々、第２の抗原及び第３の抗原をそれぞれ結合し、抗原のうちの少なくとも１つはＴＮＦである。

一例において、抗体分子は配列番号：２１で示される配列を含むｓｃＦｖである。

一例において、抗体分子は、配列番号：１１及び１２、配列番号：１５及び１６で示される配列並びに／又は配列番号：２１で示される配列を含む、１つ又は複数のｓｃＦｖ分子を含む。

一実施形態において、本開示の抗体分子は、例えばそれぞれ軽鎖及び重鎖について、配列番号：１１及び１２において示される可変領域を含む、抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片である。

一実施形態において、本開示の抗体分子は、例えばそれぞれ軽鎖及び重鎖について、配列番号：１５及び１６において示される可変領域を含む、抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片である。

一実施形態において、本開示の抗体分子は、例えばそれぞれ軽鎖及び重鎖について、配列番号：２７及び２８において示される可変領域を含む、抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片である。

本開示のｓｃＦｖ分子及びＦａｂ分子が、本明細書において上で記載されるような任意の好適な多重特異性抗体分子（例えば式Ｉ及びＩＩを有する上記の多重特異性抗体分子）の中へ取り込まれ得ることが認識されるだろう。

一実施形態において、本開示の抗体分子は、例えばそれぞれ軽鎖及び重鎖について、配列番号：１１及び１２において示される可変領域を含む、完全長ＩｇＧ１抗体である。

一実施形態において、本開示の抗体分子は、例えばそれぞれ軽鎖及び重鎖について、配列番号：１５及び１６において示される可変領域を含む、完全長ＩｇＧ１抗体である。

一実施形態において、本開示の抗体分子は、例えばそれぞれ軽鎖及び重鎖について、配列番号：２７及び２８において示される可変領域を含む、完全長ＩｇＧ１抗体である。

一実施形態において、本開示の抗体分子は完全長ＩｇＧ４フォーマットである。一実施形態において、本開示の抗体分子は完全長ＩｇＧ４Ｐフォーマットである。

一実施形態において、本開示の抗体分子は、例えばそれぞれ軽鎖及び重鎖について、配列番号：１１及び１２において示される可変領域を含む、完全長のＩｇＧ４又はＩｇＧ４Ｐ抗体である。

ＩｇＧ４Ｐは、本明細書において用いられる時、アミノ酸２４１がプロリンによって置き換えられた野生型ＩｇＧ４イソタイプの突然変異であり、例えばＡｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９３，３０（１），１０５−１０８中で記載されるような位置２４１でセリンがプロリンへ変化される場合を参照されたい。

一実施形態において、本開示に記載の抗体は、例えばＷＯ２００９／０４０５６２、ＷＯ２０１００３５０１２、ＷＯ２０１１／０３０１０７、ＷＯ２０１１／０６１４９２及びＷＯ２０１１／０８６０９１（すべて参照により本明細書に援用される）中で記載されるような、免疫グロブリン部分（例えばＦａｂ断片又はＦａｂ’断片）及び直接的に又は間接的にそれへ連結される１つ又は２つの単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）を含む、ＴＮＦ結合抗体融合タンパク質として提供される。

一実施形態において、融合タンパク質は、ジスルフィド結合によって随意に連結された、例えば可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）のペアリングとして、２ドメイン抗体を含む。

一実施形態において、融合タンパク質のＦａｂエレメント又はＦａｂ’エレメントは、単一ドメイン抗体（複数可）と同じか又は類似する特異性を有する。一実施形態において、Ｆａｂ又はＦａｂ’は単一ドメイン抗体（複数可）と異なる特異性を有し、それは融合タンパク質が多価であると言うことである。一実施形態において、本発明に記載の多価融合タンパク質はアルブミン結合部位を有し、例えばＶＨ／ＶＬペアはその中でアルブミン結合部位を提供する。

一実施形態において、本開示に記載のＦａｂ又はＦａｂ’は、ＰＥＧ分子又はヒト血清アルブミンへコンジュゲートされる。

本発明の抗体分子の定常領域ドメインは、存在するならば、抗体分子の提案された機能、及び特に要求され得るエフェクター機能を考慮して、選択することができる。例えば、定常領域ドメインは、ヒトのＩｇＡドメイン、ＩｇＤドメイン、ＩｇＥドメイン、ＩｇＧドメイン又はＩｇＭドメインであり得る。特に、ヒトＩｇＧ定常領域ドメイン（特に抗体分子が治療使用について意図され、抗体エフェクター機能が要求される場合に、ＩｇＧ１イソタイプ及びＩｇＧ３イソタイプのもの）が使用され得る。或いは、抗体分子が治療目的について意図され、抗体エフェクター機能が要求されない場合に、ＩｇＧ２イソタイプ及びＩｇＧ４イソタイプが使用され得る。これらの定常領域ドメインの配列バリアントも使用され得ることが認識されるだろう。例えば、Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９３，３０（１），１０５−１０８中で記載されるように位置２４１でセリンがプロリンへ変化したＩｇＧ４分子が使用され得る。抗体が多様な翻訳後修飾を受け得ることも、当業者によって理解されるだろう。これらの修飾のタイプ及び程度は、多くの場合、抗体の発現に使用される宿主細胞株に加えて培養条件に依存する。かかる修飾には、糖鎖付加、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化、及びアスパラギン脱アミド化におけるバリエーションが含まれ得る。頻度の高い修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用に起因するカルボキシ末端の塩基性残基（リジン又はアルギニン等）の喪失である（Ｈａｒｒｉｓ，ＲＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ７０５：１２９−１３４，１９９５中で記載されるような）。したがって、抗体重鎖のＣ末端リジンは存在しなくてもよい。

一実施形態において、抗体重鎖はＣＨ１ドメイン（例えば配列番号：３４において示されるＣＨ１配列）を含み、抗体軽鎖はＣＬドメイン（κ又はλのいずれか、例えば配列番号：３３に示されるＣＬ配列）を含む。

一実施形態において、抗体重鎖は、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン（例えば配列番号：３５において示されるγ１定常領域配列、又は配列番号：３６若しくは配列番号：３７において示されるγ４定常領域配列）を含む完全長定常領域を含み、抗体軽鎖はＣＬドメイン（κ又はλのいずれか、例えば配列番号：３３に示されるＣＬ配列）を含む。

一実施形態において、抗体分子からのＣ末端アミノ酸は、翻訳後修飾の間に切断される。

一実施形態において、抗体分子からのＮ末端アミノ酸は、翻訳後修飾の間に切断される。

本発明によって提供される抗体、特に、
・配列番号：１２の重鎖配列及び配列番号：１１の軽鎖配列、
・配列番号：１６の重鎖配列及び配列番号：１５の軽鎖配列、又は
・配列番号：２８の重鎖配列及び配列番号：２７の軽鎖配列
を含む、抗体又は結合断片が結合する、ヒトＴＮＦの特異的領域又はエピトープも、本発明によって提供される。

ヒトＴＮＦポリペプチドのこの特異的領域又はエピトープは、本発明によって提供される抗体のうちの任意の１つと組み合わせて、当技術分野において公知の任意の好適なエピトープマッピング方法によって同定され得る。かかる方法の例としては、抗体によって認識されるエピトープの配列を含有する、抗体へ特異的に結合できる最も小さな断片との、本発明の抗体への結合について、ＴＮＦに由来する変動長のペプチドをスクリーニングすることが挙げられる。ＴＮＦペプチドは、合成的に又はＴＮＦポリペプチドのタンパク分解によって産生され得る。抗体を結合するペプチドは、例えば質量分光分析によって同定することができる。別の例において、ＮＭＲ分光法又はＸ線結晶学を使用して、本発明の抗体によって結合されたエピトープを同定することができる。Ｘ線結晶学が使用される一例において、エピトープは、抗体の４Å内にあるＴＮＦポリペプチド上のそれらの残基として決定される。一例において、エピトープは、抗体の５Å内にあるＴＮＦポリペプチド上のそれらの残基として決定される。一旦同定されたならば、本発明の抗体を結合するエピトープ断片は、必要ならば、同じエピトープを結合する追加の抗体を得るための免疫原として使用することができる。

一実施形態において、本発明によって提供される、本明細書において上で記載されるエピトープを結合する抗体は、完全にヒトである。一実施形態において、それらはヒト化される。一例において、それらは、ヒトＴＮＦについて１５０ｐＭ以下、典型的には１３０ｐＭ以下の親和性を有する。

本発明に記載の抗体分子の結合を交差ブロックする抗体、特に
配列番号：１２で示される重鎖配列及び配列番号：１１で示される軽鎖配列、
配列番号：１６で示される重鎖配列及び配列番号：１５で示される軽鎖配列、又は
配列番号：２８で示される重鎖配列及び配列番号：２７で示される軽鎖配列
を含む抗体は、ＴＮＦ活性のブロッキングにおいて同様に有用であり得る。したがって、本発明は、本明細書において上で記載される抗体分子のうちの任意の１つのヒトＴＮＦへの結合を交差ブロックする、及び／又はそれらの抗体のうちの任意の１つによってヒトＴＮＦの結合から交差ブロックされる、抗ＴＮＦ抗体分子も提供する。一実施形態において、かかる抗体は、本明細書において上で記載される抗体と同じエピトープへ結合する。別の実施形態において、交差ブロッキング中和抗体は、本明細書において上で記載される抗体によって結合されるエピトープと接する及び／又はオーバーラップするエピトープへ結合する。

交差ブロッキング抗体は、当技術分野における任意の好適な方法を使用して、例えば競合ＥＬＩＳＡ又はＢＩＡｃｏｒｅアッセイの使用によって、同定することができ、そこで、交差ブロッキング抗体のヒトＴＮＦへの結合は、本発明の抗体の結合を防止するか、又は、その逆も成立する。かかる交差ブロッキングアッセイは、単離された天然若しくは組換えのＴＮＦ又は好適な融合タンパク質／ポリペプチドを使用することができる。一例において、結合及び交差ブロッキングは組換えヒトＴＮＦを使用して測定される。

一実施形態において、本発明によって提供される交差ブロッキング抗体は、
配列番号：１２で示される重鎖配列及び配列番号：１１で示される軽鎖配列、
配列番号：１６で示される重鎖配列及び配列番号：１５で示される軽鎖配列、又は
配列番号：２８で示される重鎖配列及び配列番号：２７で示される軽鎖配列
を含む抗体の結合を、８０％を超える、例えば８５％を超える（９０％を超える等、特に９５％を超える）阻害で阻害する。

一実施形態において、本発明によって提供される交差ブロッキング抗体は、完全にヒトである。一実施形態において、本発明によって提供される交差ブロッキング抗体は、ヒト化される。一実施形態において、本発明によって提供される交差ブロッキング抗体は、ヒトＴＮＦについて、１５０ｐＭ以下、１３０ｐＭ以下又は１００ｐＭ以下の親和性を有する。一実施形態において、本発明によって提供される交差ブロッキング抗体は、ヒトＴＮＦについて、５０ｐＭ以下の親和性を有する。親和性は、本明細書において記載される方法を使用して以下で測定され得る。

生物学的分子（抗体又は断片等）は酸性及び／又は塩基性の官能基を含有し、それによって分子に正味の正又は負の電荷を与える。全体の「観察される」電荷の量は、実体の絶対的なアミノ酸配列、三次元構造中の荷電基の局部的な環境、及び分子の環境条件に依存するだろう。等電点（ｐＩ）は、特定の分子又は溶媒のその接触可能表面が正味の電荷を保有しないｐＨである。一実施例において、本発明のＴＮＦ抗体及び断片は、適切な等電点を有するように操作され得る。これは、多くの着実な特性、特に好適な溶解度及び／又は安定性プロファイル及び／又は改善された精製特徴を備えた抗体及び／又は断片を導き得る。

したがって一態様において、本発明は、もともと同定された抗体の等電点と異なる等電点を有するように操作されたヒト化ＴＮＦ抗体を提供する。抗体は、例えばアミノ酸残基を置き換えること（酸性アミノ酸残基を１つ又は複数の塩基性アミノ酸残基により置き換えること等）によって操作され得る。或いは、塩基性アミノ酸残基が導入され得るか、又は酸性アミノ酸残基が除去され得る。或いは、分子が許容できないほど高いｐＩ値を有するならば、ｐＩを低下させるために酸性残基が必要に応じて導入され得る。ｐＩを操作する場合に抗体又は断片の所望される活性の保持を注意しなければならないことが重要である。したがって一実施形態において、操作された抗体又は断片は、「非修飾」抗体又は断片と同じか又は実質的に同じ活性を有する。

プログラム（＊＊ＥｘＰＡＳＹ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌ及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｕｔ−ａｒｌｅｓ．ｕｐ．ｕｎｉｖ−ｍｒｓ．ｆｒ／ｗ３ｂｂ／ｄ＿ａｂｉｍ／ｃｏｍｐｏ−ｐ．ｈｔｍｌ等）を使用して、抗体又は断片の等電点を予測することができる。或いは又は追加で、ｐＩは、任意の好適な標準的な実験室技法を使用して測定され得る。

本発明の抗体分子は、特にナノモーラー範囲の高結合親和性を好適に有する。親和性は、単離された天然若しくは組換えのＴＮＦ又は好適な融合タンパク質／ポリペプチドを使用して、実施例中で本明細書において記載されるように、当技術分野において公知の任意の好適な方法（ＢＩＡｃｏｒｅが含まれる）を使用して測定され得る。一例において、親和性は組換えヒトＴＮＦを使用して測定される。

好適には、本発明の抗体分子は、単離されたヒトＴＮＦについて約１ｎＭ以下の結合親和性を有する。一実施形態において、本発明の抗体分子は、約５００ｐＭ以下の結合親和性を有する（すなわちより高い親和性）。一実施形態において、本発明の抗体分子は、約２５０ｐＭ以下の結合親和性を有する。一実施形態において、本発明の抗体分子は、約２５０ｐＭ以下の結合親和性を有する。一実施形態において、本発明の抗体分子は、約２５０ｐＭ以下の結合親和性を有する。一実施形態において、本発明は、約１００ｐＭ以下の結合親和性を備えた抗ＴＮＦの抗体を提供する。一実施形態において、本発明は、約１００ｐＭ以下の結合親和性を備えたヒト化抗ＴＮＦ抗体を提供する。一実施形態において、本発明は、５０ｐＭ以下の結合親和性による抗ＴＮＦの抗体を提供する。

本発明の抗体又は結合断片の親和性に加えて、結合剤（抗体等）が結合を阻害する程度は、従来の技法（例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．ＫＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０−６７２（１９４９））によって記載されるもの）を使用して、又はＢＩＡｃｏｒｅ等のシステムを使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、当業者によって決定することができる。表面プラズモン共鳴のために、標的分子は、固相上で固定化され、フローセルに沿って動く移動相中のリガンドへ曝露される。固定化された標的へのリガンド結合が起こるならば、局部的な屈折率変化は、ＳＰＲ角度の変化を導き、それは反射光の強度の変化の検出によってリアルタイムでモニタリングすることができる。ＳＰＲシグナルの変化率を分析して、結合反応の会合相及び解離相についての見かけの速度定数をもたらすことができる。これらの値の比は見かけの平衡定数（親和性）を与える（例えばＷｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２５６０−６５（１９９３）を参照）。

本発明によって提供される抗体の親和性は、当技術分野において公知の任意の好適な方法を使用して改変され得ることが認識されるだろう。したがって、本発明は、ＴＮＦについて改善された親和性を有する本発明の抗体分子のバリアントにも関する。かかるバリアントは多くの親和性成熟プロトコルによって得ることができ、それらには、ＣＤＲの突然変異（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４，３９２−４０３，１９９５）、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，７７９−７８３，１９９２）、Ｅ．ｃｏｌｉの突然変異誘発株の使用（Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０，３５９−３６８，１９９６）、ＤＮＡシャフリング（Ｐａｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８，７２４−７３３，１９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６，７７−８８，１９９６）、及びセクシャルＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，２８８−２９１，１９９８が含まれる。Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．（前出）は、親和性成熟のこれらの方法について議論する。

一実施形態において、本発明の抗体分子はヒトＴＮＦ活性をブロックする。抗体がＴＮＦをブロックする能力を決定するのに好適なアッセイは、当技術分野において公知である。

所望されるならば、本発明で使用される抗体は、１つ又は複数のエフェクター分子（複数可）へコンジュゲートされ得る。エフェクター分子は、本発明の抗体へ付加することができる、単一エフェクター分子又は単一部分を形成するように連結される２つ以上のかかる分子を含み得ることが認識されるだろう。エフェクター分子へ連結された抗体断片を得ることが所望される場合に、これは、抗体断片が直接的に又はカップリング剤経由でエフェクター分子へ連結される、標準的な化学的手順又は組換えＤＮＡ手順によって調製され得る。かかるエフェクター分子の抗体へのコンジュゲートのための技法は、当技術分野において周知である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、第２版、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．編、１９８７年、ｐｐ．６２３−５３；Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８３，６７−１２３を参照）。特定の化学的手順には、例えばＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６及びＷＯ０３／０３１５８１中で記載されるものが含まれる。或いは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合に、リンケージは、例えばＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ０３９２７４５中で記載されるような組換ＤＮＡ手順を使用して達成され得る。

エフェクター分子という用語には、本明細書において使用される時、例えば抗新生物剤、薬物、毒素、生物学的に活性のあるタンパク質（例えば酵素）、他の抗体又は抗体断片、合成又は天然に存在するポリマー、核酸及びその断片（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びその断片）、放射性核種（特に放射性ヨウ化物、放射性同位体）、キレートされた金属、ナノ粒子、並びにレポーター基（蛍光化合物、又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法によって検出され得る化合物等）が含まれる。

エフェクター分子の例としては細胞毒素又は細胞毒性剤が挙げられ、細胞へ有害な（例えば死滅させる）任意の薬剤が含まれ得る。例としては、コンブレスタチン、ドラスチン、エポチロン、スタウロスポリン、メイタンシノイド、スポンジスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアステリン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｔｈｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシン並びにその類似体又はホモログが挙げられる。

エフェクター分子には、抗代謝物質（例えばメトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ及びシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアミシン又はデュオカルマイシン）、及び抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチン及びビンブラスチン）も含まれるがこれらに限定されない。

他のエフェクター分子には、キレートされた放射性核種（^１１１Ｉｎ及び^９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス^２１３、カリホルニウム^２５２、イリディアム^１９２及びタングステン^１８８／レニウム^１８８等）；又は薬物（アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害物質、タキソイド及びスラミン等であるがこれらに限定されない）が含まれ得る。他のエフェクター分子には、タンパク質、ペプチド及び酵素が含まれる。対象となる酵素には、タンパク分解酵素、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが含まれるがこれらに限定されない。対象となるタンパク質、ポリペプチド及びペプチドには、免疫グロブリン、毒素（アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素又はジフテリア毒素等）、タンパク質（インスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経増殖因子、血小板由来増殖因子又は組織プラスミノーゲン活性化因子等）、血栓症の薬剤又は抗血管新生剤（例えばアンジオスタチン又はエンドスタチン）、又は生物学的応答修飾因子（リンホカイン、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）又は他の増殖因子及び免疫グロブリン等）が、含まれるがこれらに限定されない。

他のエフェクター分子には、例えば診断において有用な検出可能な物質が含まれ得る。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性核種、陽電子放出金属（陽電子放射断層撮影法における使用のための）、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。診断薬として使用される抗体へコンジュゲートされ得る金属イオンについては、一般的には米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。好適な酵素には、ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ；好適な補欠分子族には、ストレプトアビジン、アビジン及びビオチンが含まれ；好適な蛍光材料には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセン、塩化ダンシル及びフィコエリトリンが含まれ；好適な発光材料にはルミノールが含まれ；好適な生物発光材料には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが含まれ；好適な放射性核種には、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１１１Ｉｎ及び^９９Ｔｃが含まれる。

別の例において、エフェクター分子は、インビボの抗体の半減期を増加させる、及び／又は抗体の免疫原性を低減する、及び／又は上皮バリアーを横切って免疫系への抗体の送達を促進することができる。このタイプの好適なエフェクター分子の例としては、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質又はアルブミン結合化合物（ＷＯ０５／１１７９８４中で記載されるもの等）が挙げられる。

エフェクター分子がポリマーである場合に、それは、一般に、合成又は天然に存在するポリマー（例えば随意に置換される直鎖又は分岐鎖のポリアルキレン、ポリアルケニレン又はポリオキシアルキレンのポリマー）又は分岐多糖若しくは非分岐多糖（例えばホモ多糖又はヘテロ多糖）であり得る。

上述の合成ポリマー上に存在し得る具体的な随意の置換基には、１つ又は複数のヒドロキシ基、メチル基又はメトキシ基が含まれる。

合成ポリマーの具体的な例としては、随意に置換される直鎖又は分岐鎖のポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）又はその誘導体、特に随意に置換されるポリ（エチレングリコール）（メトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体等）が挙げられる。

具体的な天然に存在するポリマーには、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はその誘導体が含まれる。

一実施形態において、ポリマーは、アルブミン又はその断片（ヒト血清アルブミン又はその断片等）である。

「誘導体」は、本明細書において使用される時、反応性誘導体、例えばチオール選択的反応基（マレイミド及び同種のもの等）が含まれることが意図される。反応基は、直接的に又はリンカーセグメントを介してポリマーへ連結され得る。いくつかの事例において、かかる基の残基が抗体断片とポリマーとの間の連結基として産物の一部を形成するであろうことが認識されるだろう。

ポリマーのサイズは所望に応じて変動し得るが、一般的には５００Ｄａ〜５００００Ｄａ、例えば５０００〜４００００Ｄａ（２００００〜４００００Ｄａ等）の平均分子量範囲中であるだろう。ポリマーサイズは、産物の意図された使用（例えばある特定の組織（腫瘍等）へ局在させる能力又は循環半減期を延長させる能力）に基づいて、特に選択され得る（総説については、Ｃｈａｐｍａｎ，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，５３１−５４５を参照）。したがって、例えば、産物が、例えば腫瘍の治療における使用のために血中循環を離れ組織を透過することが意図される場合に、例えば約５０００Ｄａの分子量を備えた小さな分子量のポリマーを使用することは有利であり得る。産物が血中循環中にとどまる適用については、例えば２００００Ｄａ〜４００００Ｄａの範囲中の分子量を有するより高分子量のポリマーを使用することは有利であり得る。

好適なポリマーには、ポリアルキレンポリマー（ポリ（エチレングリコール）等、又は特にメトキシポリ（エチレングリコール）若しくはその誘導体、及び特に約１５０００Ｄａ〜約４００００Ｄａの範囲中の分子量を備えたもの）が含まれる。

一例において、本発明で使用される抗体はポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分へ付加される。特定の一例において、抗体は抗体断片であり、ＰＥＧ分子は、抗体断片中に所在する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基（例えば任意の遊離アミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基又はカルボキシル基）を介して付加され得る。かかるアミノ酸は、抗体断片中で天然に存在し得るか、又は組換ＤＮＡ方法を使用して断片の中へ操作され得る（例えばＵＳ５，２１９，９９６；ＵＳ５，６６７，４２５；ＷＯ９８／２５９７１、ＷＯ２００８／０３８０２４を参照）。一例において、本発明の抗体分子は修飾Ｆａｂ断片であり、そこで、修飾は、エフェクター分子の付加を可能にする１つ又は複数のアミノ酸をその重鎖のＣ末端へ追加することである。好適には、追加のアミノ酸は、エフェクター分子が付加され得る１つ又は複数のシステイン残基を含有する、修飾ヒンジ領域を形成する。複数の部位を使用して、２つ以上のＰＥＧ分子を付加することができる。

好適には、ＰＥＧ分子は、抗体断片中に所在する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合で連結される。修飾抗体断片へ付加される各々ポリマー分子は、断片中に所在するシステイン残基の硫黄原子へ共有結合で連結され得る。共有結合は、一般的にはジスルフィド結合又は特に硫黄−炭素結合であるだろう。そこでは、チオール基は付加点として使用される。適切に活性化されたエフェクター分子、例えばチオール選択的誘導体（マレイミド及びシステイン誘導体等）が使用され得る。活性化されたポリマーは、ポリマーで修飾された抗体断片の調製における出発材料として上で記載されるように使用され得る。活性化されたポリマーは、チオール反応基（α−ハローカルボン酸又はエステル、例えばヨードアセトアミド、イミド等、例えばマレイミド、ビニルスルホン、ジスルフィド）を含有する任意のポリマーであり得る。かかる出発材料は、商業的に得られ得るか（例えばＮｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ、米国から）、又は従来の化学的手順を使用して、商業的に入手可能な出発材料から調製され得る。特定のＰＥＧ分子には、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ；Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ及びＳｕｎＢｉｏから入手可能）及びＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）が含まれる。

一実施形態において、抗体は、ＰＥＧ化した（すなわち例えばＥＰ０９４８５４４又はＥＰ１０９００３７中で開示された方法に従って、ＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））をそれへ共有結合で付加した）修飾されたＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片又はｄｉＦａｂである［「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、１９９２年、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ（編）、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、１９９７年、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ、及び「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、１９９８年、Ｍ．Ａｓｌａｍ ａｎｄ Ａ．Ｄｅｎｔ、Ｇｒｏｖｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｃｈａｐｍａｎ，Ａ．２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２００２，５４：５３１−５４５も参照］。一例において、ＰＥＧはヒンジ領域中のシステインへ付加される。一実施例において、ＰＥＧ修飾Ｆａｂ断片は、修飾ヒンジ領域中の単一チオール基へ共有結合で連結されたマレイミド基を有する。リジン残基はマレイミド基へ共有結合で連結され、リジン残基上のアミン基の各々へ、およそ２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーが付加され得る。したがって、Ｆａｂ断片へ付加されたＰＥＧの分子量の合計はおよそ４０，０００Ｄａであろう。

特定のＰＥＧ分子には、Ｎ，Ｎ’−ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）ＭＷ２０，０００）修飾リジンの２−［３−（Ｎ−マレイミド）プロピオンアミド］エチルアミドが含まれ、ＰＥＧ２ＭＡＬ４０Ｋ（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）としても公知である。

ＰＥＧリンカーの代替のソースにはＮＯＦが含まれ、これらは、ｎがおよそ４５０である、ＧＬ２−４００ＭＡ３（式中、以下の構造中のｍは５である）及びＧＬ２−４００ＭＡ（式中、ｍは２である）

を供給する。

すなわち、各々のＰＥＧは約２０，０００Ｄａである。

したがって一実施形態において、ＰＥＧは、２，３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−｛［３−（６−マレイミド−１−オキソヘキシル）アミノ］プロピルオキシ｝ヘキサン（２アーム分岐ＰＥＧ、−（ＣＨ_２）_３ＮＨＣＯ（ＣＨ_２）_５−ＭＡＬ、分子量４０，０００、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２−４００ＭＡ３として公知）である。

以下のタイプのさらなる代替のＰＥＧエフェクター分子：

は、Ｄｒ Ｒｅｄｄｙ、ＮＯＦ及びＪｅｎｋｅｍから入手可能である。

一実施形態において、鎖中のアミノ酸２３２、例えば重鎖のアミノ酸２３２（連続的なナンバリングによる）で、又はそのまわりで、システインアミノ酸残基を介して付加される、ＰＥＧ化される抗体（例えば本明細書において記載されるＰＥＧによる）が提供される。

一実施形態において、本開示は、１つ又は複数のＰＥＧポリマー、例えば１つ又は２つのポリマー（４０ｋＤａポリマー（複数可）等）を含むＦａｂ’ＰＥＧ分子を提供する。

本開示に記載のＦａｂ’−ＰＥＧ分子は、Ｆｃ断片に非依存的な半減期を有するという点で特に有利であり得る。一例において、本発明は、治療有効量の抗ＴＮＦ抗体又はその結合断片を投与することを含む、ヒトＴＮＦのブロックによって回復される疾患を治療する方法を提供し、そこで、抗体又はその結合断片はＴＮＦへのＦｃ結合に非依存的な半減期を有する。

一実施形態において、ポリマー（ＰＥＧ分子、デンプン分子又はアルブミン分子等）へコンジュゲートされたＦａｂ’が提供される。

一実施形態において、ポリマー（ＰＥＧ分子、デンプン分子又はアルブミン分子等）へコンジュゲートされたｓｃＦｖが提供される。

一実施形態において、抗体又は断片は、例えば半減期を増加させるためにデンプン分子へコンジュゲートされる。ＵＳ８，０１７，７３９中に記載されるようなタンパク質へデンプンをコンジュゲートする方法が、参照として本明細書に援用される。

本発明は、本発明の抗体分子の重鎖（複数可）及び／又は軽鎖（複数可）をコードする、単離されたＤＮＡ配列も提供する。好適には、ＤＮＡ配列は、本発明の抗体分子の重鎖又は軽鎖をコードする。本発明のＤＮＡ配列は、合成ＤＮＡ（例えば化学的プロセシングによって産生された）、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はその任意の組み合わせを含み得る。

本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列は当業者に周知の方法によって得ることができる。例えば、抗体の重鎖及び軽鎖の一部又はすべてについてのＤＮＡ配列コーディングは、決定されたＤＮＡ配列から又は対応するアミノ酸配列に基づいて、所望に応じて合成され得る。

アクセプターフレームワーク配列についてのＤＮＡコーディングは当業者に広く入手可能であり、それらの公知のアミノ酸配列に基づいて容易に合成され得る。

分子生物学の標準的な技法を使用して、本発明の抗体分子についてのＤＮＡ配列コーディングを調製することができる。所望されるＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成技法を使用して、完全に又は部分的に合成され得る。部位特異的突然変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の技法は必要に応じて使用され得る。

好適なＤＮＡ配列の例は本明細書において提供される。

２１０９ ｇＬ１８軽鎖可変領域をコードする好適なＤＮＡ配列の例は、配列番号：１３及び配列番号：１７において提供される。

２１０９ ｇＨ２重鎖可変領域をコードする好適なＤＮＡ配列の例は、配列番号：１４及び配列番号：１８において提供される。

したがって一例において、本発明は、配列番号：１３、１７、１４又は１８（１３及び１４又は１７及び１８等）で示される配列を含む本発明の抗体のＦａｂ断片又はＦａｂ’断片の重鎖をコードする、単離されたＤＮＡ配列を提供する。

一例において、本発明は、重鎖をコードするＤＮＡが配列番号：１３又は１７で示される配列を含み、軽鎖をコードするＤＮＡが配列番号：１４又は１８で示される配列を含む、本発明のＩｇＧ４（Ｐ）抗体の重鎖及び軽鎖をコードする、単離されたＤＮＡ配列を提供する。

一例において、本発明は、重鎖をコードするＤＮＡが配列番号：１３又は１７で示される配列を含み、軽鎖をコードするＤＮＡが配列番号：１４又は１８で示される配列を含む、本発明のＩｇＧ１抗体の重鎖及び軽鎖をコードする、単離されたＤＮＡ配列を提供する。

一例において、本発明は、重鎖をコードするＤＮＡが配列番号：１３又は１７で示される配列を含み、軽鎖をコードするＤＮＡが配列番号：１４又は１８で示される配列を含む、本発明のＦａｂ−ｄｓＦｖ抗体の重鎖及び軽鎖をコードする、単離されたＤＮＡ配列を提供する。

本発明は、本発明の１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニングベクター又は発現ベクターにも関する。したがって、本発明の抗体をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニングベクター又は発現ベクターが提供される。好適には、クローニングベクター又は発現ベクターは、本発明の抗体分子の軽鎖及び重鎖をそれぞれコードする２つのＤＮＡ配列並びに好適なシグナル配列を含む。一例において、ベクターは重鎖と軽鎖との間の遺伝子間配列を含む（ＷＯ０３／０４８２０８を参照）。

ベクターを構築できる一般的方法、トランスフェクション方法及び培養方法は、当業者に周知である。この点において、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１９９９年、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、及びＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇによって製作されたＭａｎｉａｔｉｓ Ｍａｎｕａｌが参照される。

本発明の抗体をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む１つ又は複数のクローニングベクター又は発現ベクターを含む、宿主細胞も提供される。したがって、本発明は、
ｉ）前記抗体の重鎖をコードするＤＮＡ配列と、
ｉｉ）前記抗体の軽鎖をコードするＤＮＡ配列と
を含み、
それらのＤＮＡ配列が１つ又は複数のクローニングベクター又は発現ベクター中で提供される、
本発明に記載の抗体の発現のための宿主細胞も提供する。

任意の好適な宿主細胞／ベクター系が、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列の発現のために使用され得る。細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ）及び他の微生物性システムが使用され得るか（特に抗体断片の発現のため）又は真核生物（例えば哺乳動物）宿主細胞発現系も使用され得る（特に完全長抗体の発現のため）。好適な哺乳類宿主細胞には、ＣＨＯ細胞、骨髄腫細胞又はハイブリドーマ細胞が含まれる。

本発明で使用される好適なタイプのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）にはＣＨＯ細胞及びＣＨＯ−Ｋ１細胞が含まれ、これらには、ＤＨＦＲ選択可能マーカーと共に使用され得るｄｈｆｒ− ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞及びＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞等）又はグルタミン合成酵素選択可能マーカーと共に使用され得るＣＨＯＫ１−ＳＶ細胞が含まれる。抗体の発現における他の細胞タイプの使用は、リンパ球細胞株（例えばＮＳＯミエローマ細胞及びＳＰ２細胞）、ＣＯＳ細胞を含む。

本発明は、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからのタンパク質の発現を導くのに好適な条件下で本発明のベクター（複数可）を含有する宿主細胞を培養すること、及び抗体分子を単離することを含む、本発明に記載の抗体分子の産生のためのプロセスも提供する。

抗体分子は重鎖ポリペプチド又は軽鎖ポリペプチドのみを含むことができ、その場合には、重鎖ポリペプチド又は軽鎖ポリペプチドのコーディング配列のみが宿主細胞のトランスフェクションに使用されることが必要である。重鎖及び軽鎖の両方を含む産物の産生のために、細胞株は、２つのベクター（軽鎖ポリペプチドをコードする第１のベクター及び重鎖ポリペプチドをコードする第２のベクター）によりトランスフェクションされ得る。或いは、単一ベクターを使用することができ、ベクターは軽鎖ポリペプチド及び重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む。

本開示に記載の抗体及び断片は宿主細胞から良好なレベルで発現される。したがって、抗体及び／又は断片の特性は商業的な加工の助けになる。

したがって、宿主細胞を培養し、抗体又はその断片を発現させ、抗体又はその断片を単離し、随意にそれらを精製して単離された抗体又は断片を提供するプロセスが提供される。一実施形態において、プロセスは、単離された抗体又は断片へエフェクター分子をコンジュゲートする（例えば特に本明細書において記載されるようなＰＥＧポリマーへコンジュゲートする）ステップをさらに含む。

一実施形態において、不純物がカラム上に保持され、抗体が溶出されるように、非結合モードにおいて陰イオン交換クロマトグラフィーを遂行するステップを含む、抗体（特に本発明に記載の抗体又は断片）を精製するプロセスが提供される。

したがってクロマトグラフステップ（複数可）は、１つ又は複数の洗浄ステップを必要に応じて含み得る。

精製プロセスは、１つ又は複数の濾過ステップ（ダイアフィルトレーションステップ等）も含み得る。

したがって一実施形態において、実質的に精製された形態で、特にエンドトキシン及び／又は宿主細胞のタンパク質又はＤＮＡが無いか又は実質的に無い、精製された抗ＴＮＦ抗体又は断片（例えばヒト化抗体又は断片、特に本発明に記載の抗体又は断片）が提供される。

上で使用されるような、精製された形態は、少なくとも９０％の純度（９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％ｗ／ｗ以上の純粋等）を指すことが意図される。

エンドトキシンが実質的にないは、一般的には、抗体産物１ｍｇあたり１ＥＵ以下（産物１ｍｇあたり０．５ＥＵ又は０．１ＥＵ等）のエンドトキシン含有量を指すことが意図される。

宿主細胞のタンパク質又はＤＮＡが実質的にないは、一般的には、抗体産物１ｍｇあたり４００μｇ以下（１ｍｇあたり１００μｇ以下等、特に必要に応じて１ｍｇあたり２０μｇ）の宿主細胞のタンパク質及び／又はＤＮＡ含量を指すことが意図される。

本発明の抗体分子は、診断において（例えばＴＮＦが関与する疾患状況のインビボの診断及び画像化において）も使用され得る。

本発明の抗体は病理学的状態の治療及び／又は予防において有用なので、本発明は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体のうちの１つ又は複数と組み合わせた本発明の抗体分子を含む、医薬組成物又は診断用組成物も提供する。したがって、医薬品の製造のための本発明の抗体分子の使用が提供される。組成物は、薬学的に許容される担体を正常に含むであろう滅菌された医薬組成物の一部として通常供給されるだろう。本発明の医薬組成物は加えて薬学的に許容される賦形剤を含み得る。

本発明は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体のうちの１つ又は複数と一緒に本発明の抗体分子を添加及び混合することを含む、医薬組成物又は診断組成物の調製のためのプロセスも提供する。

抗体分子は、医薬組成物又は診断組成物中の唯一の活性成分であり得るか、又は他の抗体成分若しくは非抗体成分（ステロイド又は他の薬物分子等、特にその半減期がＴＮＦ結合に非依存的な薬物分子）が含まれる、他の活性成分が付随し得る。

医薬組成物は、好適には治療有効量の本発明の抗体を含む。「治療有効量」という用語は、本明細書において使用される時、標的の疾患若しくは病態を治療、寛解若しくは予防すること、又は検出可能な治療効果若しくは予防効果を示すことに必要な治療剤の量を指す。任意の抗体について、治療有効量は、細胞培養アッセイ又は動物モデルのいずれかにおいて（通常齧歯動物、ウサギ、イヌ、ブタ又は霊長動物において）、最初に推測することができる。動物モデルを使用して、適切な濃度範囲及び投与経路も決定することができる。次いでかかる情報を使用して、ヒトにおける投与のための有用な用量及び経路を決定することができる。

ヒト被験体のための正確な治療有効量は、疾患状態の重症度、被験体の全体的な健康、被験体の年齢、体重及び性別、食餌、投与の時間及び頻度、薬物の組み合わせ（複数可）、反応感度、並びに療法への寛容／応答に依存するだろう。この量はルーチンの実験によって決定することができ、臨床医の判断内である。一般的に、治療有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ等）であるだろう。

医薬組成物は、好都合には、１用量あたり本発明の活性のある薬剤の所定量を含有する単位用量形態で提示され得る。

治療用量の本開示に記載の抗体はインビボで明らかな毒性効果を示さない。

組成物は、患者へ個別に投与され得るか、又は他の薬剤、薬物若しくはホルモンと組み合わせて（例えば同時に、連続して、又は分離して）投与され得る。

薬剤は、本明細書において用いられる時、投与された場合に生理的影響を有する実体を指す。

薬物は、本明細書において用いられる時、治療用量で適切な生理的影響を有する化学的実体を指す。

一実施形態において、本開示に記載の抗体又は断片は、免疫抑制療法（ステロイド等、特にプレドニゾン）と共に用いられる。

一実施形態において、本開示に記載の抗体又は断片は、リツキシマブ又は他のＢ細胞療法と共に用いられる。

一実施形態において、本開示に記載の抗体又は断片は、任意のＢ細胞修飾剤若しくはＴ細胞修飾剤又は免疫修飾物質と共に用いられる。例としてはメトトレキサート、ミクロフェニオレート（ｍｉｃｒｏｐｈｅｎｙｏｌａｔｅ）及びアザチオプリンが挙げられる。

本発明の抗体分子が投与される用量は、治療される病態の性質、存在する炎症の程度、及び抗体分子が予防的に使用されているか又は既存の病態を治療するかに依存する。

投薬頻度は、抗体の半減期、標的媒介性体内動態、効果の継続期間、及び抗薬物抗体の存在に依存するだろう。抗体が短い半減期（数時間）若しくは限定的な活性を有するならば、及び／又は小体積の薬物（例えば皮下注射のために）を送達することが所望されるならば、１日あたり１回又はそれ以上の頻度で頻繁に投薬することが必要であり得る。或いは、抗体が長い半減期を有するか、長い継続時間の活性を有するか、又は大きな体積（点滴によって等）で投薬することができるならば、投薬は、１日あたり１回、又は数日、数週間若しくは数か月毎で、頻繁でなくてもよい。一実施形態において、用量間で十分な時間をとって、抗薬物抗体レベルの低下を可能にする。

半減期は、本明細書において用いられる時、例えば血清／血漿中での循環における分子の継続期間を指すことが意図される。

薬力学は、本明細書において用いられる時、本開示に記載の分子の生物学的作用のプロファイル及び特に継続時間を指す。

薬学的に許容される担体それ自体は、組成物を投与される個体へ有害な抗体の産生を誘導せず毒性であるべきでない。好適な担体は、大きくゆっくり代謝されるマクロ分子（タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー及び不活性ウイルス粒子等）であり得る。

薬学的に許容される塩、例えば鉱酸塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩等）、又は有機酸塩（酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩及び安息香酸塩等）が使用され得る。

治療組成物中の薬学的に許容される担体は、加えて液体（水、食塩水、グリセロール及びエタノール等）を含有し得る。加えて、補助物質（湿潤剤若しくは乳化剤又はｐＨ緩衝物質等）は、かかる組成物中に存在し得る。かかる担体は、医薬組成物を、患者による摂取のために、錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ、スラリ及び懸濁物として製剤化することができる。

投与に好適な形態には、例えば注射又は点滴による（例えばボーラス注射又は連続点滴による）非経口投与に好適な形態が含まれる。産物が注射又は点滴のためのものである場合に、それは、油性又は水性のベヒクル中で懸濁物、溶液又はエマルションの形態をとり、製剤化剤（懸濁化剤、防腐剤、安定化剤及び／又は分散剤等）を含有し得る。或いは、抗体分子は、適切な滅菌された液体による使用前の再構成のために、乾燥形態であり得る。

一旦製剤化されたならば、本発明の組成物は被験体へ直接投与することができる。治療される被験体は動物であり得る。しかしながら、１つ又は複数の実施形態において、組成物はヒト被験体への投与に適合する。

好適には、本開示に記載の製剤において、最終的な製剤のｐＨは抗体又は断片の等電点の値に類似せず、例えば、タンパク質のｐＩが８〜９又はそれ以上の範囲であるならば、製剤のｐＨは７が適切であり得る。理論に拘束されることを望むものではないが、これは改善された安定性（例えば抗体又は断片が溶液のままである）を持った最終的な製剤を結局提供し得ると考えられる。

一例において、医薬製剤は、４．０〜７．０の範囲中のｐＨで、本開示に記載の１〜２００ｍｇ／ｍＬの抗体分子、１〜１００ｍＭのバッファー、０．００１〜１％の界面活性剤、ａ）１０〜５００ｍＭの安定化物質、ｂ）１０〜５００ｍＭの安定化物質及び５〜５００ｍＭの等張化剤、又はｃ）５〜５００ｍＭの等張化剤を含む。

本発明の医薬組成物は任意の数の経路によって投与することができ、それらには、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、動脈内経路、髄内経路、髄腔内経路、脳室内経路、経真皮経路、経皮経路（例えばＷＯ９８／２０７３４を参照）、皮下経路、腹腔内経路、鼻腔内経路、腸経由経路、局所経路、舌下経路、膣内経路又は直腸経路が含まれるがこれらに限定されない。ハイポスプレーを使用して本発明の医薬組成物を投与することもできる。典型的には、治療組成物は、液体溶液又は懸濁物のいずれかとして、注射可能物として調製され得る。注射の前の液体ベヒクル中の溶液又は懸濁物に好適な固体の形態も調製され得る。

組成物の直接的な送達は、一般的には皮下、腹腔内、静脈内若しくは筋肉内への注射によって達成されるか、又は組織の間質腔へ送達されるだろう。組成物は病巣の中へも投与することができる。投薬治療は、単一用量スケジュール又は複数用量スケジュールであり得る。

組成物中の活性成分が抗体分子であるだろうことが認識されるだろう。それゆえ、それは胃腸管中での分解に感受性があるだろう。したがって、組成物が胃腸管を使用する経路によって投与される予定ならば、組成物は、抗体を分解から保護するが一旦胃腸管から吸収されると抗体を放出する薬剤を含有する必要があるだろう。

薬学的に許容される担体の詳細な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．、１９９１年）中で利用可能である。

一実施形態において、製剤は局所投与（吸入が含まれる）のための製剤として提供される。

好適な吸入可能な調製物には、吸入可能な粉末、噴射気体を含有する定量式エアロゾル、又は噴射気体がない吸入可能な溶液が含まれる。活性のある物質を含有する本開示に記載の吸入可能な粉末は、上記の活性のある物質のみ、又は生理学的に許容される賦形剤と上記の活性のある物質の混合物からなり得る。

これらの吸入可能な粉末には、単糖（例えばグルコース又はアラビノース）、二糖（例えばラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ糖及び多糖（例えばデキストラン）、ポリアルコール（例えばソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）、又はこれら互いの混合物が含まれ得る。好適には単糖又は二糖が使用され、ラクトース又はグルコース、特にそれらの水和物の形態が使用されるが排他的ではない。

肺における沈着のための粒子は、１０ミクロン（１〜９ミクロン等、例えば１〜５μｍ）よりも小さい粒子サイズを要求する。活性成分（抗体又は断片等）の粒子サイズが、主に重要である。

吸入可能なエアロゾルの調製に使用できる噴射気体は当技術分野において公知である。好適な噴射気体は、炭化水素（ｎ−プロパン、ｎ−ブタン又はイソブタン等）及びハロ炭化水素（メタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン又はシクロブタンの塩素化誘導体及び／又はフッ素化誘導体等）の中で選択される。上記の噴射気体は、単独で又はその混合物において使用され得る。

特に好適な噴射気体は、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ及びＴＧ２２７の中で選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上記のハロゲン化炭化水素のうちの、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）並びにその混合物は特に好適である。

噴射気体含有吸入可能なエアロゾルは、他の成分（共溶媒、安定化物質、界面活性剤（サーファクタント）、抗酸化物質、滑沢物質及びｐＨの調整のための手段等）も含有し得る。これらの成分はすべて当技術分野において公知である。

本発明に記載の噴射気体含有吸入可能なエアロゾルは、活性のある物質を重量で５％まで含有し得る。本発明に記載のエアロゾルは、例えば、活性成分を重量で０．００２〜５％、重量で０．０１〜３％、重量で０．０１５〜２％、重量で０．１〜２％、重量で０．５〜２％又は重量で０．５〜１％含有する。

或いは、肺への局所投与は、例えばデバイス（ネブライザー等、例えばコンプレッサーへ接続されたネブライザー（例えばＰａｒｉ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｖａ．によって製造されたＰａｒｉ Ｍａｓｔｅｒ（登録商標）コンプレッサーへ接続されたＰａｒｉ ＬＣ−Ｊｅｔ Ｐｌｕｓ（登録商標）ネブライザー））を用いる、液体溶液又は懸濁物製剤の投与によるものでもあり得る。

本発明の抗体は、溶媒中に分散させて（例えば溶液又は懸濁物の形態で）送達され得る。それは適切な生理溶液（例えば食塩水又は他の薬理学的に許容される溶媒若しくはバッファー溶液）中で懸濁され得る。当技術分野において公知のバッファー溶液の例は、約４．０〜５．０のｐＨを達成するように、１ｍｌの水あたり、０．０５ｍｇ〜０．１５ｍｇのエデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇ〜９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５ｍｇ〜０．２５ｍｇのポリソルベート、０．２５ｍｇ〜０．３０ｍｇの無水クエン酸、及び０．４５ｍｇ〜０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムを含有し得る。懸濁物は例えば凍結乾燥抗体を用いることができる。

治療用の懸濁物又は溶液製剤は１つ又は複数の賦形剤も含有することができる。賦形剤は当技術分野において周知であり、それらには、バッファー（例えばクエン酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー及び重炭酸バッファー）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール及びグリセロールが含まれる。溶液又は懸濁物は、リポソーム又は生物分解性マイクロスフェア中でカプセル化され得る。製剤は、一般的には滅菌された製造プロセスを用いて、実質的に滅菌された形態で提供されるだろう。

これには、製剤化のために使用される緩衝された溶媒／溶液の濾過による産生及び滅菌、滅菌された緩衝溶媒溶液中での抗体の無菌的な懸濁、並びに当業者が精通する方法による滅菌されたレセプタクルの中への製剤の分配が含まれ得る。

本開示に記載の噴霧可能な製剤は、例えば箔エンベロープ中でパックされた単一用量単位（例えばシールしたプラスチック容器又はバイアル）として提供され得る。各々のバイアルは、ある体積（例えば２ｍＬ）の単位用量の溶媒／溶液バッファーを含有する。

本明細書において開示される抗体は、噴霧化経由の送達に好適であり得る。

本発明の抗体が遺伝子療法の使用によって投与され得ることも意図される。これを達成するために、抗体鎖がＤＮＡ配列から発現され、インシトゥーでアセンブルされるように、適切なＤＮＡ構成要素の制御下での抗体分子の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ配列は、患者の中へ導入される。

ＴＮＦαはＴＮＦスーパーファミリーの典型的なメンバーである。ＴＮＦαは免疫調節及び炎症応答を媒介する多機能サイトカインである。インビボで、ＴＮＦαは、細菌、寄生生物及びウイルスの感染にも関与することが公知である。特に、ＴＮＦαは、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（クローン病が含まれる）、乾癬、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、疼痛、癲癇、骨粗鬆症、喘息、敗血症、発熱、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）及び多発性硬化症（ＭＳ）並びに癌における役割を有することが公知である。ＴＮＦαは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、虚血性脳卒中、免疫複合体糸球体腎炎、狼瘡性腎炎（ＬＮ）、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連糸球体腎炎、微小変化型疾患、糖尿病性腎症（ＤＮ）、急性腎臓損傷（ＡＫＩ）、閉塞性尿路疾患、腎臓の同種異系移植片拒絶、シスプラチン誘導性ＡＫＩ及び閉塞性尿路疾患における役割を有することも公知である。

したがって、本発明の抗体又は組成物を使用して（直接的に又は間接的に）、他のＴＮＦαアンタゴニストによって治療、予防又は寛解され得る任意の病態を、治療、予防又は寛解することができる。

本発明の抗体及び組成物は、したがって様々なヒトの病気の治療及び／又は予防において有益である。これらには、自己免疫障害及び炎症性障害；神経学的障害及び神経変性障害；疼痛及び侵害受容性障害；並びに心臓血管障害が含まれる。

炎症性障害及び自己免疫障害には、全身性自己免疫障害、自己免疫性内分泌障害、及び器官特異的自己免疫障害が含まれる。全身性自己免疫障害には、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、乾癬、血管炎、多発性筋炎、硬皮症、多発性硬化症、強直性脊椎炎、関節リウマチ、及びシェーグレン症候群が含まれる。自己免疫性内分泌障害には甲状腺炎が含まれる。器官特異的自己免疫障害には、アジソン病、溶血性貧血又は悪性貧血、糸球体腎炎（グッドパスチャー症候群が含まれる）、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病、インスリン依存性糖尿病、小児糖尿病、ぶどう膜炎、炎症性大腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎が含まれる）、天疱瘡、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、自己免疫性肺炎、自己免疫性心臓炎、重症筋無力症、自然不妊、骨粗鬆症、喘息、及び筋ジストロフィー症（デュシェンヌ型筋ジストロフィーが含まれる）が含まれる。

神経学的障害及び神経変性障害には、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、脳卒中、筋萎縮性側索硬化症、脊髄損傷、頭部外傷、発作及び癲癇が含まれる。

心臓血管障害には、血栓症、心臓肥大、高血圧症、心臓の不規則収縮（例えば心不全の間）、及び性的障害（勃起障害及び女性の性機能不全が含まれる）が含まれる。

特に、本発明の組成物の抗体を使用して、炎症性障害、ＣＮＳ障害、免疫障害及び自己免疫疾患、疼痛、骨粗鬆症、発熱及び移植臓器拒絶を治療又は予防することができる。好ましい実施形態において、本発明の抗体又は組成物を使用して、関節リウマチ、炎症性大腸疾患（クローン病が含まれる）、乾癬、アルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、喘息、敗血症、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、喘息、鼻炎、癌及び骨粗鬆症を治療又は予防することができる。別の好ましい実施形態において、本発明の抗体又は組成物を使用して、関節リウマチ（ＲＡ）、非特異的炎症性関節炎、浸食性の骨疾患、軟骨炎、軟骨変性及び／又は破壊、若年性炎症性関節炎、スティル病（若年性及び／又は成人発症）、若年性特発性関節炎、若年性特発性関節炎（少関節型及び多関節型）、炎症性大腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎、非定型的大腸炎、回腸嚢炎が含まれる）、乾癬、乾癬性関節症、強直性脊椎炎、シェーグレン病、アルツハイマー病（ＡＤ）、ベーチェット病、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、虚血性脳卒中、疼痛、癲癇、骨粗鬆症、オステオペニア、慢性疾患の貧血、悪液質、糖尿病、脂質異常症、メタボリック症候群、喘息、慢性閉塞性気道（又は肺）疾患、敗血症、発熱、呼吸窮迫症候群、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、免疫複合体糸球体腎炎、狼瘡性腎炎（ＬＮ）、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連糸球体腎炎、微小変化型疾患、糖尿病性腎症（ＤＮ）、急性腎臓損傷（ＡＫＩ）、閉塞性尿路疾患、腎臓同種異系移植片拒絶、シスプラチン誘導性ＡＫＩ及び閉塞性尿路疾患、眼疾患（糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、末熟児網膜症、加齢黄斑変性症、黄斑浮腫、増殖性網膜症及び／又は非増殖性網膜症、角膜血管形成（新生血管形成が含まれる）、網膜静脈閉塞症、ぶどう膜炎の様々な形態、及び角膜炎が含まれる）、甲状腺炎、線維化障害（肝線維症の様々な形態、肺線維症の様々な形態、全身性硬化症、硬皮症が含まれる）、癌及び癌関連合併症（骨格合併症、悪液質及び貧血が含まれる）を治療又は予防することができる。

本開示に記載の抗体及び断片は治療又は予防において用いられ得る。

本発明は、治療有効用量の本明細書において記載される抗ＴＮＦ抗体又はその結合断片を個体へ投与するステップを含む、個体における所望されない抗体の濃度を低減する方法も提供する。

本発明は、本明細書において記載される病理学的障害（自己免疫疾患等）の治療及び／又は予防のための医薬品の製造における本発明に記載の抗体分子の使用をさらに提供する。

一実施形態において、本開示は、レポーター分子へ例えばコンジュゲートして、診断のための試薬としての抗体又はその断片の使用を含む。したがって、標識された本開示に記載の抗体又は断片が提供される。一態様において、本開示に記載の抗体又は断片を含むカラムが提供される。

本明細書の文脈において、含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、包含すること（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味することが意図される。

技術的に適切である場合に、本発明の実施形態は組み合わせられ得る。

実施形態は、ある特定の特徴／エレメントを含むとして本明細書において記載される。本開示は、前記特徴／エレメントからなるか又は本質的になる分離した実施形態へも拡張される。

技術的な参照文献（特許及び出願等）は参照により本明細書に援用される。

本発明は、付随の図を参照する以下の実施例において、例示の目的のみで、さらに記載される。

例１：中和抗ヒトＴＮＦ−α可変領域の単離：
以下の免疫付与は、Ｂ細胞培養及び抗体スクリーニングのための材料を生成するために遂行された。

５匹のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに、小分子ベンズイミダゾール化合物（化合物１）と前複合体化したヒトＴＮＦ−αを３回の注射で免疫付与した（ＷＯ２０１３／１８６２２９及びＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０７４５２７中で記載されるように）。血清を生成し、ＥＬＩＳＡにおいてヒトＴＮＦ−αへの結合について試験した。力価は１００，０００の希釈を超えて測定可能であり、したがってＢ細胞培養について許容されると判断された。

Ｂ細胞培養は、Ｚｕｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８５）及びＬｉｇｈｔｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（２０１３）によって記載されるものに類似する方法を使用して調製した。簡潔には、Ｂ細胞を含有する脾細胞を、１０％のＦＣＳ（ＰＡＡ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ｌｔｄ）、２％のＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％のＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、０．１％のβ−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、２〜５％の活性化脾細胞培養上清及びガンマ線照射マウス胸腺腫細胞（５×１０^４／ウェル）を補足した２００μ／ウェルのＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）により、バーコード付きの９６ウェルの組織培養プレート中で、１ウェルあたりおよそ５０００細胞の密度で、５％のＣＯ_２の雰囲気中で、３７℃で７日目間培養した。７０００万を上回るのＢ細胞をこのプロジェクトの間にスクリーニングした。

Ｂ細胞培養液上清中のヒトＴＮＦ特異的抗体の存在を、標的抗原源としてビオチン化ヒトＴＮＦによりコーティングされた１０ミクロンのスーパーアビジンポリマービーズ（Ｂａｎｇｓ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、均一蛍光ベースの結合アッセイを使用して決定した。１０ｕｌの上清を、Ｍａｔｒｉｘ Ｐｌａｔｅｍａｔｅ液体ハンドラーを使用して、バーコードを付きの９６ウェルの組織培養プレートから、５０００のコーティングビーズを含有するバーコード付きの３８４ウェルの黒色壁のアッセイプレートの中へ移した。ヤギ抗ラット又はマウスのＩｇＧ Ｆｃγ特異的Ｃｙ−５コンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）により、結合を明らかにした 。プレートはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ８２００細胞検出システム上で読み取った。

或いは、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して陽性ウェルを同定した。３８４ウェルＥＬＩＳＡプレートを２ｕｇ／ｍｌのＴＮＦによりコーティングした後に、１０ｕｌのＢ細胞培養液上清をブロックされたプレートへ添加した。１時間のインキュベーションに後続して、プレートを洗浄し、ヤギ抗ラットＦｃ特異的ＨＲＰコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）により結合を明らかにした。

一次スクリーニングに後続して、陽性上清を、Ａｖｉｓｏ Ｏｎｙｘヒットピッキングロボットを使用して９６ウェルのバーコード付きのマスタープレートの上へ統合し、細胞培養プレート中のＢ細胞を−８０Ｃで凍結した。高親和性の抗体を含有するウェルを同定するために、次いでマスタープレートをＢｉａｃｏｒｅアッセイにおいてスクリーニングした。

ＴＮＦαの生物学的活性を中和できる抗体を同定するために、マスタープレート中のＢ細胞培養液上清を使用して、細胞ベースのＴＮＦαレポーターアッセイを遂行した。アッセイは、ＮＦκＢ経路を介して作動する多くの刺激（ヒトＴＮＦαが含まれる）に応答してアルカリホスファターゼを分泌するように操作されたＨＥＫ−２９３−ＣＤ４０−ＢＬＵＥ細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を利用した。抗体含有上清を、１：２．５の単一希釈でこのアッセイにおいて直接的に使用した。高親和性のブロッキング抗体（Ｂｉａｃｏｒｅにおいて１００ｐＭ未満及びレポーターアッセイにおい＞９０％阻害を示す）を含有するウェルを、さらなる進行のために選択した。

選択した対象となるウェルからの抗体可変領域遺伝子の回収を可能にするために、デコンボリューションステップを遂行して、Ｂ細胞の不均一集団を含有する与えられたウェル中での抗原特異的Ｂ細胞の同定を可能にしなければならなかった。これは蛍光焦点方法を使用して達成した。簡潔には、陽性ウェルからの免疫グロブリン分泌Ｂ細胞を、ビオチン化ヒトＴＮＦによりコーティングしたストレプトアビジンビーズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、及びヤギ抗ラットＦｃγ断片特異的ＦＩＴＣコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）の１：１２００の最終的な希釈物と混合した。３７℃で１時間の静的インキュベーション後に、そのＢ細胞を囲む蛍光ハロの存在に起因して、抗原特異的Ｂ細胞を同定することができた。次いでＯｌｙｍｐｕｓ顕微鏡を使用して同定したこれらの個別のＢ細胞を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆマイクロマニピュレーターにより取り、ＰＣＲチューブの中へ堆積させた。

２１０２、２１０１、２１０９及び２１１１として既知の４つの異なる抗体についての抗体可変領域遺伝子を、重鎖及び軽鎖の可変領域特異的プライマーを使用する逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲによって単一細胞から回収した。２ラウンドＰＣＲを、３’末端及び５’末端で制限部位を取り込むネステッド２°ＰＣＲによりＡｖｉｓｏ Ｏｎｙｘ液体ハンドリングロボット上で遂行し、マウスγ１ ＩｇＧ又はＦａｂ（ＶＨ）又はマウスκ（ＶＬ）哺乳類発現ベクターの中へのラット可変領域のクローニングを可能にした。重鎖コンストラクト及び軽鎖コンストラクトをＦｅｃｔｉｎ ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＨＥＫ−２９３細胞の中へコトランスフェクションし、組換え抗体を１ｍｌの体積で４８ウェルプレート中で発現させた。５〜７日の発現後に、上清を採取し、抗体にさらなるスクリーニングを行った。

組換えラット／マウスキメラＩｇＧ及びＦａｂ分子を、ＥＣ_５０値の計算を可能にする濃度の数で、ＨＥＫ−２９３−ＣＤ４０−ＢＬＵＥレポーターアッセイにおいてスクリーニングし、最大パーセンテージ阻害を決定した。一価の場合に抗体が活性があることを保証するために、Ｆａｂ断片を試験した。ＩｇＧをＢｉａｃｏｒｅ実験においても分析して、ヒトＴＮＦについての結合親和性を決定した。Ｂｉａｃｏｒｅ実験のアッセイフォーマットは、固定化された抗マウスＩｇＧ−ＦｃによるマウスＩｇＧの捕捉、その後の捕捉された表面上のヒトＴＮＦの力価測定であった。ＢＩＡ（Ｂｉａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して遂行した。Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）_２断片ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、約５０００反応単位（ＲＵ）のレベルへ、アミンカップリング化学経由でＣＭ５センサーチップ上に固定化した。ＨＢＳ−ＥＰバッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のサーファクタントＰ２０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を、１０μＬ／分の最小流速で、ランニングバッファーとして使用した。１０μＬの０．５μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧの注入を、固定化された抗マウスＩｇＧ−Ｆｃによる捕捉のために使用した。ヒトＴＮＦを、２０ｎＭで３０μＬ／分の流速で、捕捉されたマウスＩｇＧの上に２回注入した。１０μＬ／分の流速で、４０ｍＭのＨＣｌの２×１０μＬの注入とその間の５ｍＭのＮａＯＨの５μＬの注入によって、表面を再生した。バックグラウンドサブトラクション結合曲線を、標準的な手順に従ってＴ２００ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン１．０）を使用して分析した。

中和はＨＥＫ−２９３−ＣＤ４０−ＢＬＵＥレポーターアッセイ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用して決定した。ＥＣ_５０及び％中和を示す。Ｂｉａｃｏｒｅ分析を遂行して結合動態を決定した。オンレート（ｋａ）、オフレート（ｋｄ）及び親和定数（ＫＤ）を示す。

図２は、ＣＡ２１０９ラット／マウスのＦａｂ（ｆｗｋ１８ ＦＡＢ）ＩｇＧ１（ｆｗｋ１８ ＩｇＧ）についての力価測定曲線を示す。上で記載されるようにＨＥＫ−２９３−ＣＤ４０−ＢＬＵＥレポーターアッセイ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用して、データを決定した。

上で記載されるように単離されたすべての４つの抗体（２１０１、２１０９、２１１１及び２１０２）を、表４ａ中で以下で示されるように、ヒトＴＮＦ（ｈＴＮＦ）及びカニクイザルＴＮＦ（ｃＴＮＦ）に対するカニクイザルＴＮＦ及びヒトＴＮＦの交差反応性について、ラット／ヒトキメラＦａｂとしてスクリーニングした。

Ｂｉａｃｏｒｅ実験のアッセイフォーマットは、固定化された抗ヒトＦ（ａｂ’）によるラット／ヒトキメラＦａｂの捕捉、その後の捕捉された表面上のヒト又はカニクイザルＴＮＦの力価測定であった。ＢＩＡ（Ｂｉａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して遂行した。Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）_２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆ（ａｂ’）２断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、約５０００反応単位（ＲＵ）のレベルへ、アミンカップリング化学経由でＣＭ５センサーチップ上に固定化した。ＨＢＳ−ＥＰバッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のサーファクタントＰ２０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を、１０μＬ／分の最小流速で、ランニングバッファーとして使用した。１０μＬの０．５μｇ／ｍＬのラット／ヒトキメラの注入を、固定化されたヒトＩｇＧ−Ｆ（ａｂ’）２による捕捉のために使用した。ヒトＴＮＦ又はカニクイザルＴＮＦを、３０μＬ／分の流速で（それぞれ５ｎＭ又は３．１２５ｎＭで）、捕捉されたラット／ヒトキメラＦａｂの上に注入した。１０μＬ／分の流速で、５０ｍＭのＨＣｌの２×１０μＬの注入とその間の５ｍＭのＮａＯＨの５μＬの注入によって、表面を再生した。バックグラウンドサブトラクション結合曲線を、標準的な手順に従ってＴ２００ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン１．０）を使用して分析した。

抗体２１０２は、カニクイザルＴＮＦについてはるかに低い親和性を有することが見出された。この抗体はヒト化の間にも親和性を失い、したがってもはやこれ以上進められなかった。

この研究に基づいて、ＣＡ２１０９を、カニクイザル／ヒト交差反応性（表４ａ）、高親和性（表４）、及び強力な中和活性（図２及び表４）に起因して、最有力候補として選択した。この抗体をこれらの特性に基づいてヒト化のために選択した。

類似の親和性及び中和特性を有する他の２つの抗体を、ＣＡ２１０９と平行してヒト化のために選択し、これらは２１０１及び２１１１であった。しかしながら、２１０１はヒト化に際してＴＮＦについての親和性を保持せず、したがってこの抗体はもはやこれ以上進行められなかった。抗体２１０９及び抗体２１１１は成功してヒト化され、次いでｓｃＦｖフォーマットに変換し、Ｌ９２９ ＴＮＦ阻害アッセイ（下で記載されるアッセイ）においてスクリーニングして中和活性を確認した（表５）。

Ｌ９２９細胞株は、ＴＮＦ−αの細胞毒性効果へ感受性のあるマウス線維肉腫細胞株である。ＴＮＦは、ＴＮＦ受容体（それはヒト、カニクイザル又はマウスのＴＮＦ−αに結合する）経由で刺激して、アポトーシスを誘導する。細胞を、アクチノマイシンＤ（それはＴＮＦ−αによる死への感受性を増加させる）により共処理する。アクチノマイシンＤ／ＴＮＦ−α及び各々の抗ＴＮＦ抗体による処理に後続するＬ９２９細胞の生存率を、ルシフェラーゼ反応（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）経由のＡＴＰレベル（それは生存率の減少と共に減少する）を検出することによって決定した。

１時間の前インキュベーションに後続して、３８４ウェル平底プレート中の３０μｌの最終的な体積で、各々の抗体又は対照化合物の存在下において、２．３５μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤ及び１００ｐｇ／ｍｌのヒトＴＮＦαにより、Ｌ９２９細胞を処理した。３７℃の５％のＣＯ２で２４時間後に、細胞生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｔｄ）によって測定した。

表５中で示されるように、抗体２１１１は、重−軽（ＨＬ）又は軽−重（ＬＨ）の方向性のいずれかにおいても、ｓｃＦｖとして（ヒト化Ｆａｂと比較して）、このアッセイで活性を保持しなかった。抗体２１０９のみが、ヒト化ｓｃＦｖとして、カニクイザル−ヒト交差反応性、高親和性及び中和能力及び耐熱性を保持した。抗体ＣＡ２１０９のヒト化を以下でより詳細に記載する。

例２：抗ＴＮＦ−α抗体ＣＡ２１０９のヒト化
抗体ＣＡ２１０９を、ヒト生殖細胞系列フレームワークの上へ相補性決定領域（ＣＤＲ）をグラフトすることによってヒト化した。ヒト生殖細胞系列（アクセプター）フレームワークを備えたラット抗体（ドナー）配列のアライメントを、デザインされたヒト化配列と一緒に図３及び４中で示す。

選択された軽鎖生殖細胞系列アクセプター配列は、ヒトＶＫ１ ２−１（Ｕ）Ａ２０ Ｖ領域プラスＪＫ２ Ｊ領域であった（Ｖ ＢＡＳＥ、ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）。選択された重鎖生殖細胞系列アクセプター配列は、ヒトＶＨ３ １−３ ３−２１ Ｖ領域プラスＪＨ４ Ｊ領域であった（Ｖ ＢＡＳＥ、ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）。ドナーからアクセプター配列へグラフトされたＣＤＲはＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．１９８７）によって定義された通りであり、組み合わせのＣｈｏｔｈｉａ／Ｋａｂａｔ定義を使用した場合のＣＤＲ−Ｈ１は例外である。

最初のＶ領域配列をコードする遺伝子を、Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ ＧｍｂＨによる自動合成アプローチによってデザイン及び構築し、それを修飾して、オリゴヌクレオチド依存性突然変異誘発によってグラフトされたバージョンのｇＬ１、ｇＬ１８、ｇＨ１及びｇＨ２を生成した。ｇＬ１８遺伝子配列を、ＵＣＢ Ｃｅｌｌｔｅｃｈヒト軽鎖発現ベクターｐＭｈＣＫデルタ（それはヒトＣ−κ定常領域（Ｋｍ３アロタイプ）をコードするＤＮＡを含有する）の中へサブクローン化した。ｇＨ２配列を、ＵＣＢ Ｃｅｌｌｔｅｃｈ発現ベクターｐＭｈｇ１Ｆａｂ（それはヒト重鎖γ−１ ＣＨ１定常領域をコードするＤＮＡを含有する）の中へサブクローン化した。

完全な活性を保持し高耐熱性を維持するために、ヒト化重鎖の位置４８（イソロイシン）、４９（グリシン）、７１（バリン）、７３（リジン）、７８（アラニン）及び９３（スレオニン）でのドナー残基（Ｋａｂａｔナンバリング）を保持した。同様に、ヒト化軽鎖（Ｋａｂａｔナンバリング）の位置６５（スレオニン）、７１（チロシン）及び８７（フェニルアラニン）でのドナー残基を保持した。加えて、軽鎖中の３つの脱アミド化部位を、位置３１、５０及び５２でのアスパラギン残基をそれぞれセリン、アスパラギン酸及びセリンへ突然変異させることによって、除去した。最終的な選択された可変グラフト配列のｇＬ１８及びｇＨ２を、図１、３及び４（配列番号：１１及び１２）中で示す。

例１において上で記載されるように、抗体２１０９のみが、ヒト化ｓｃＦｖとして、カニクイザル−ヒト交差反応性、高親和性及び中和能力及び耐熱性を保持した。複数の抗体フォーマット（ＩｇＧ、Ｆａｂ及びｓｃＦｖが含まれる）において同等に活性のある抗体２１０９の能力により、抗体２１０９は有用で多用性のある抗体であり、それは単一特異性抗体として単独で使用され得るか、又は多重特異性抗体フォーマットの中へ取り込まれ得る。

配列番号：１＜２２３＞抗体２１０９のＣＤＲ配列 − ＣＤＲＨ１
配列番号：２＜２２３＞抗体２１０９のＣＤＲ配列 − ＣＤＲＨ２
配列番号：３＜２２３＞抗体２１０９のＣＤＲ配列 − ＣＤＲＨ３
配列番号：４＜２２３＞抗体２１０９のＣＤＲ配列 − ＣＤＲＬ１
配列番号：５＜２２３＞抗体２１０９のＣＤＲ配列 − ＣＤＲＬ１
配列番号：６＜２２３＞抗体２１０９のＣＤＲ配列 − ＣＤＲＬ２
配列番号：７＜２２３＞抗体２１０９のＣＤＲ配列 − ＣＤＲＬ２
配列番号：８＜２２３＞抗体２１０９のＣＤＲ配列 − ＣＤＲＬ２
配列番号：９＜２２３＞抗体２１０９のＣＤＲ配列 − ＣＤＲＬ２
配列番号：１０＜２２３＞抗体２１０９のＣＤＲ配列 − ＣＤＲＬ３
配列番号：１１＜２２３＞抗体２１０９ ｇＬ１８の軽鎖可変領域
配列番号：１２＜２２３＞抗体２１０９ ｇＨ２の重鎖可変領域
配列番号：１３＜２２３＞抗体２１０９ ｇＬ１８の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ
配列番号：１４＜２２３＞抗体２１０９ ｇＨ２の重鎖可変領域をコードするＤＮＡ
配列番号：１５＜２２３＞抗体２１０９ ｇＬ１８の軽鎖可変領域
配列番号：１６＜２２３＞抗体２１０９ ｇＨ２の重鎖可変領域
配列番号：１７＜２２３＞抗体２１０９ ｇＬ１８の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ
配列番号：１８＜２２３＞抗体２１０９ ｇＨ２の重鎖可変領域をコードするＤＮＡ
配列番号：１９＜２２３＞抗体２１０９ ｇＨ２ｇＬ１８のｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）
配列番号：２０＜２２３＞抗体２１０９ ｇＨ２ｇＬ１８のｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）をコードするＤＮＡ
配列番号：２１＜２２３＞抗体２１０９ ｇＨ２ｇＬ１８のｄｓｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）
配列番号：２２＜２２３＞抗体２１０９ ｇＨ２ｇＬ１８のｄｓｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）をコードするＤＮＡ
配列番号：２３＜２２３＞ラット抗体２１０９の軽鎖可変領域
配列番号：２４＜２２３＞ラット抗体２１０９の重鎖可変領域
配列番号：２５＜２２３＞ヒトＶＫ１ ２−１（Ｕ）Ａ２０ ＪＫ２アクセプターフレームワーク
配列番号：２６＜２２３＞ヒトＶＨ３ １−３ ３−２１ ＪＨ４アクセプターフレームワーク
配列番号：２７＜２２３＞抗体２１０９ ｇＬ１の軽鎖可変領域
配列番号：２８＜２２３＞抗体２１０９ ｇＨ１の重鎖可変領域
配列番号：２９＜２２３＞抗体２１０９ ｇＬ１８の軽鎖可変領域
配列番号：３０＜２２３＞マウス重鎖ｇ１定常領域
配列番号：３１＜２２３＞マウス重鎖ｇ１ Ｆａｂヒンジ無し定常領域
配列番号：３２＜２２３＞マウス軽鎖定常領域
配列番号：３３＜２２３＞軽鎖定常領域
配列番号：３４＜２２３＞重鎖γ１ Ｆａｂ ＣＨ１ヒンジ無し定常領域
配列番号：３５＜２２３＞重鎖γ１完全長定常領域
配列番号：３６＜２２３＞重鎖γ４完全長定常領域
配列番号：３７＜２２３＞重鎖γ４Ｐ完全長定常領域

Claims (36)

1. 可変領域を有する重鎖又は重鎖断片を含み、前記可変領域が３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲ Ｈ１が配列番号：１で示される配列を有し、ＣＤＲ Ｈ２が配列番号：２で示される配列を有し、ＣＤＲ Ｈ３が配列番号：３で示される配列を有する、抗ＴＮＦ抗体又はその結合断片。
2. 前記抗体又は結合断片が、３つのＣＤＲを含む可変領域を有する軽鎖又はその断片をさらに含み、ＣＤＲ Ｌ１が配列番号：４又は５で示される配列を有し、ＣＤＲ Ｌ２が配列番号：６、７、８又は９で示される配列を有し、ＣＤＲ Ｌ３が配列番号：１０で示される配列を有する、請求項１に記載の抗ＴＮＦ抗体又はその結合断片。
3. 前記ＣＤＲ Ｌ１が配列番号：４で示される配列を有する、請求項２に記載の抗ＴＮＦ抗体又はその結合断片。
4. 前記ＣＤＲ Ｌ１が配列番号：５で示される配列を有する、請求項２に記載の抗ＴＮＦ抗体又はその結合断片。
5. ＣＤＲ Ｌ２が配列番号：６で示される配列を有する、請求項２〜４のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦ抗体又はその結合断片。
6. ＣＤＲ Ｌ２が配列番号：７で示される配列を有する、請求項２〜４のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦ抗体又はその結合断片。
7. ＣＤＲ Ｌ２が配列番号：８で示される配列を有する、請求項２〜４のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦ抗体又はその結合断片。
8. ＣＤＲ Ｌ２が配列番号：９で示される配列を有する、請求項２〜４のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦ抗体又はその結合断片。
9. 配列番号：１２、１６又は２８で示される配列を含む重鎖を有する、請求項１又は請求項２に記載の抗ＴＮＦ抗体又はその結合断片。
10. 配列番号：１１、１５又は２７で示される配列を含む軽鎖を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦ抗体又はその結合断片。
11. 配列番号：１２で示される配列を含む重鎖及び配列番号：１１で示される配列を含む軽鎖を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦ抗体又はその結合断片。
12. 配列番号：１６で示される配列を含む重鎖及び配列番号：１５で示される配列を含む軽鎖を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦ抗体又はその結合断片。
13. 配列番号：２８で示される配列を含む重鎖及び配列番号：２７で示される配列を含む軽鎖を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦ抗体又はその結合断片。
14. 前記抗体がヒト化される、請求項１又は請求項２のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦ抗体又はその結合断片。
15. 前記抗体又は結合断片が、ｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ−Ｆｖ、又はＦａｂ−ｄｓＦｖ断片である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦ抗体又はその結合断片。
16. 前記抗体又は結合断片が、例えばデンプン、アルブミン及びポリエチレングリコールから選択されるポリマーへコンジュゲートされる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦ抗体又はその結合断片。
17. 前記ポリマーが、例えば５〜５０ｋＤａの範囲中の分子量を備えたＰＥＧである、請求項１６に記載の抗ＴＮＦの抗体又はその結合断片。
18. 前記抗体が完全長抗体である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦ抗体。
19. 前記完全長抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４及びＩｇＧ４Ｐからなる群から選択される、請求項１８に記載の抗ＴＮＦ抗体。
20. 請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の抗体と同じヒトＴＮＦのエピトープへ結合する、抗ＴＮＦ抗体又はその結合断片。
21. 請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の抗体のヒトＴＮＦへの結合を交差ブロックするか、又は請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の抗体によってヒトＴＮＦの結合から交差ブロックされる、抗ＴＮＦ抗体又はその結合断片。
22. ヒト化された、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦ抗体又はその結合断片。
23. １５０ｐＭ以上の親和性のヒトＴＮＦについての結合親和性を有する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦ抗体又はその結合断片。
24. 請求項１〜１５のいずれか一項又は請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦ抗体又はその結合断片を含む、多重特異性抗体。
25. 請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗体の重鎖（複数可）及び／又は軽鎖（複数可）をコードする、単離されたＤＮＡ配列。
26. 請求項２５に記載の１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む、クローニング又は発現ベクター。
27. 前記ベクターが、（ｉ）配列番号：１７、１８及び／又は２２で示される配列を含む、請求項２６に記載のベクター。
28. 請求項２６又は請求項２７に記載の１つ又は複数のクローニング又は発現ベクターを含む、宿主細胞。
29. 請求項２８に記載の宿主細胞を培養すること及び抗体を単離することを含む、ヒトＴＮＦについての結合特異性を有する抗体の産生のためのプロセス。
30. 薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体のうちの１つ又は複数と組み合わせて、請求項１〜２４のいずれか一項に定義される抗ＴＮＦ抗体又はその結合断片を含む、医薬組成物。
31. 他の活性成分を含む、請求項３０に記載の医薬組成物。
32. 治療法における使用のための、請求項１〜２４のいずれか一項に定義される抗体若しくはその結合断片、又は請求項３０若しくは３１に定義される組成物。
33. 自己免疫障害及び炎症性障害；神経学的障害及び神経変性障害；疼痛及び侵害受容性障害；並びに心臓血管障害のうちの１つ又は複数の治療における使用のための、請求項１〜２４のいずれか一項に定義される抗体若しくはその結合断片、又は請求項３０若しくは３１に定義される組成物。
34. 関節リウマチ、クローン病、乾癬、全身性紅斑性狼瘡、アルツハイマー病、パーキンソン病及び癲癇のうちの１つ又は複数の治療における使用のための、請求項１〜２４のいずれか一項に定義される抗体若しくはその結合断片、又は請求項３０若しくは３１のいずれか一項に定義される組成物。
35. 治療有効量の、請求項１〜２４のいずれか一項に定義される抗体若しくはその結合断片、又は請求項３０若しくは請求項３１に定義される組成物を投与することを含む、患者を治療する方法。
36. 前記治療が、自己免疫障害及び炎症性障害；神経学的障害及び神経変性障害；疼痛及び侵害受容性障害；並びに心臓血管障害のうちの１つ又は複数のためのものである、請求項３５に記載の方法。