PT1570267E - Ensaio para a identificação de células produtoras de anticorpos - Google Patents
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Description
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DESCRIÇÃO
"ENSAIO PARA A IDENTIFICAÇÃO DE CÉLULAS PRODUTORAS DE ANTICORPOS" A presente invenção refere-se genericamente a métodos aperfeiçoados de produção de anticorpos e, mais especificamente, proporciona um ensaio homogéneo para a obtenção de anticorpos. 0 método de anticorpos de linfócitos selecionados (SLAM) para a geração de anticorpos monoclonais ultrapassa as limitações da tecnologia de hibridoma e de bibliotecas de anticorpos expressos de forma bacteriana ao permitir o isolamento, a partir de qualquer espécie, de anticorpos de elevada afinidade gerados durante respostas imunológicas in vivo (Babcook et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sei, 93, 7843-7848) . 0 SLAM permite que um único linfócito que esteja a produzir um anticorpo com uma especificidade ou função desejada seja identificado numa população grande de células linfoides, e que a informação genética que codifica a especificidade do anticorpo seja recuperada desse linfócito. Células produtoras de anticorpos que produzem anticorpos que se ligam a antigénios selecionados são detetadas utilizando um método de ensaio adaptado de placa hemolitica (Jerne e Nordin, 1963, Science, 140, 405) . Neste ensaio, eritrócitos são revestidos com o antigénio selecionado e são incubados com a população de células produtoras de anticorpos e uma fonte de complemento. Células produtoras de anticorpos únicos são identificadas pela formação de placas hemoliticas. Placas de eritrócitos lisados são identificadas utilizando um microscópio invertido, a célula produtora de anticorpos únicos de 2 interesse no centro da placa é removida utilizando técnicas de micromanipulação e os genes de anticorpo da célula são clonados por PCR de transcrição reversa. Outros métodos para a deteção de células produtoras de anticorpos únicos com uma função desejada já foram descritos na Especificação de Patente Internacional WO 92/02551. O documento EP0286405 descreve um método de fase homogénea de seleção de células que produzem um anticorpo anti-idiotípico, que compreende contactar uma população de células produtoras de anticorpos com um anticorpo etiquetado de modo fluorescente, produzido por imunização de um hospedeiro com um antigénio de um patogénio selecionado, e selecionar aquelas células produtoras de anticorpos que se ligam ao antissoro etiquetado.
No ensaio de placa hemolitica descrito acima, os glóbulos vermelhos são tipicamente revestidos com antigénio via um sistema de acoplamento de biotina/estreptavidina que requer que o antigénio seja biotinilado. Em consequência, este método está restrito a antigénios que estão disponíveis numa forma pura e àqueles que podem ser biotinilados sem afetar a apresentação de epítopos. Este método exclui claramente o isolamento de anticorpos contra uma gama larga de antigénios. Por exemplo, muitas proteínas são difíceis de purificar, particularmente proteínas expressas na superfície celular, como proteínas do tipo III. Muitas proteínas alteram a sua conformação e apresentação de epítopos desejáveis por biotinilação, por exemplo, proteínas que contêm grupos lisina no seu sítio ativo.
Também pode ser desejável produzir anticorpos contra antigénios desconhecidos, como proteínas expressas na 3 superfície de células, como células tumorais. É difícil a utilização direta de células tumorais no ensaio de placa, em vez de eritrócitos revestidos com antigénio, dado o requisito de ocorrência de lise celular para ser possível identificar placas contendo células produtoras de anticorpos. A lise celular depende do tipo de células, concentração de antigénio e anticorpo. Glóbulos vermelhos revestidos com o antigénio desejado ligar-se-ão a grandes quantidades de anticorpo disponível e irão facilmente sofrer lise na presença de complemento. Outros tipos de células, como células tumorais, não sofrerão lise tão facilmente, especialmente quando a disponibilidade do antigénio na superfície puder ser muito baixa, e, assim, a ligação de anticorpos será baixa.
Manz et al. (PNAS, 92_, 1921-1925) divulgam um método para a identificação de células que segregam anticorpos em que o produto segregado é retido na superfície celular das células do rastreio. Passos requeridos incluem a etiquetagem da superfície da célula produtora de anticorpos com anticorpos de captura ou antigénio, aumentar artificialmente a viscosidade do meio para parar a difusão e proceder à nutrição cruzada de produtos segregados entre células, passos de lavagem, identificação de células por procedimentos de triagem de células ativadas de modo fluorescente. A presente invenção aborda estas dificuldades pelo assunto definido nas reivindicações adjuntas. Este ensaio aperfeiçoado tem muitas vantagens relativamente aos métodos descritos acima, permitindo a identificação de anticorpos que se ligam a qualquer antigénio, incluindo antigénios desconhecidos, antigénios da superfície celular e 4 antigénios que não podem ser biotinilados sem alteração da apresentação de epítopos desejáveis. Em resultado, podem agora ser produzidos anticorpos com especificidades de ligação que previamente não podiam ser identificados por ensaios convencionais de placas. Além disso, o ensaio é mais fácil do que o ensaio de placa hemolitica, e células produtoras de anticorpos podem ser identificadas mais rapidamente.
Demonstrámos que é possível obter células produtoras de anticorpos, que produzem anticorpos que se ligam a um antigénio, por incubação de uma população de células produtoras de anticorpos com uma fonte de antigénio na presença de anticorpos etiquetados que se ligam aos anticorpos produzidos pelas células produtoras de anticorpos. Surpreendentemente, é possível distinguir aquelas células produtoras de anticorpos que se ligam a um antigénio relativamente àquelas que não o fazem sem a necessidade de passos de lavagem para remover etiqueta não ligada.
Assim, de acordo com a presente invenção, é proporcionado um ensaio homogéneo in vitro para identificar uma célula produtora de anticorpos que produz um anticorpo que se liga a um antigénio selecionado, que compreende: a) proporcionar uma população de células produtoras de anticorpos; b) incubar, numa lâmina de microscópio, a referida população de células produtoras de anticorpos com um antigénio selecionado conjugado a uma esférula ou acoplado a um eritrócito, ou antigénio expresso na superfície de uma célula, e um anticorpo anti-anticorpo 5 etiquetado, em que o referido anticorpo anti-anticorpo é capaz de distinquir células produtoras de um anticorpo que se liga ao antigénio selecionado daquelas células que não o fazem, e em que o anticorpo anti-anticorpo etiquetado é etiquetado com um conjugado fluorescente; e c) sem necessidade de remover anticorpos anti-anticorpo etiquetados não ligados, identificar uma célula produtora de anticorpos capaz de produzir um anticorpo que se liga ao antigénio selecionado por deteção, utilizando um microscópio, da concentração aumentada de anticorpos anti-anticorpo etiquetados envolvendo a célula. 0 termo "anticorpo", como usado aqui, inclui qualquer molécula de imunoglobulina recombinante ou de ocorrência natural, como um membro da classe IgG, por exemplo, IgGl, e também qualquer fragmento de imunoglobulina de ligação a antigénios, como fragmentos Fv, Fab' e F(ab')2/ e quaisquer derivados destes, como fragmentos Fv de cadeia simples. 0 termo "célula produtora de anticorpos", como usado aqui, significa qualquer célula capaz de segregar um anticorpo, como um linfócito B, uma célula plasmática, um plasmablasto, uma célula B ativada ou célula B de memória. Células produtoras de anticorpos para utilização na invenção podem ser obtidas de um animal que foi imunizado com um antigénio ou então que desenvolveu uma resposta imunológica a um antigénio em resultado de doença. Outras células produtoras de anticorpos para utilização na presente invenção podem incluir qualquer célula transformada, em particular quaisquer células de mamífero que expressam genes de imunoglobulinas ou partes destes. 6
Num exemplo, as populações de células produtoras de anticorpos para utilização na presente invenção produzem uma gama de anticorpos com diferentes especificidades de ligação. 0 ensaio da presente invenção também pode ser utilizado para identificar células produtoras de anticorpos com altos rendimentos de uma população de células produtoras de anticorpos em que todas produzem o mesmo anticorpo. O termo "alto rendimento", como usado aqui, refere-se a células produtoras de anticorpos que produzem anticorpos com especificidade conhecida mas para as quais seria desejável identificar aquelas células que produzem o anticorpo de modo mais eficiente. A identificação da célula de alto rendimento permitirá que a célula seja isolada e reproduzida de modo clonal. Num exemplo, a célula produtora de anticorpos com altos rendimentos é uma célula de hibridoma. Noutro exemplo, a célula produtora de anticorpos com altos rendimentos é uma célula transformada, em particular uma célula de mamífero que expressa genes de imunoglobulinas, ou partes destes. Exemplos dessas células de mamífero incluem mas não estão limitados a células NSO, CHO, COS e 293. 0 termo "antigénio", como usado aqui, refere-se a qualquer substância, conhecida ou desconhecida, que pode ser reconhecida por um anticorpo, incluindo proteínas, glicoproteínas e hidratos de carbono. Preferivelmente, estes antigénios incluem proteínas biologicamente ativas, como hormonas, citoquinas, e seus recetores da superfície celular, membranas celulares bacterianas ou parasitárias ou respetivos componentes purificados, e antigénios virais. Num exemplo, o antigénio está disponível numa forma pura, 7 obtida por purificação direta da fonte nativa ou por expressão recombinante e purificação do referido antigénio. Preferivelmente, o antigénio purificado é acoplado a eritrócitos ou qualquer outra partícula, como uma esférula, para incorporação no ensaio. Noutro exemplo, o antigénio é tal que é difícil purificar, e esses antigénios incluem mas não estão limitados a proteínas expressas na superfície celular, como recetores, particularmente proteínas do tipo III. Noutro exemplo, a apresentação de epítopos desejáveis no antigénio é alterada por biotinilação, e isto inclui mas não está limitado a proteínas que contêm lisinas nas suas regiões de sítios ativos. Noutro exemplo, o antigénio pode ser expresso na superfície de uma célula, de modo natural ou recombinante. Essas células podem incluir mas não estão limitadas a células de mamífero, células imunomoduladoras, linfócitos, monócitos, polimorfos, células T, células tumorais, células de levedura, células bacterianas, agentes infeciosos, parasitas, células de plantas, células transfetadas, como células NSO, CHO, COS, 293. Num exemplo, os antigénios expressos na superfície das referidas células são antigénios difíceis de purificar, ou antigénios que perdem epítopos desejados por biotinilação, como aqueles antigénios descritos acima.
Noutro exemplo, o antigénio é uma célula ou população de células para as quais seria desejável isolar anticorpos para aquele, como células de mamífero, células imunomoduladoras, linfócitos, monócitos, polimorfos, células T, células tumorais, células de levedura, células bacterianas, agentes infeciosos, parasitas e células de plantas. Numa forma de realização, a célula é uma célula tumoral. 8 0 termo "ensaio homogéneo", como usado aqui, refere-se a um ensaio no qual todos os componentes do ensaio são combinados para identificar células produtoras de anticorpos sem necessidade de remover anticorpos anti-anticorpo etiquetados não ligados. 0 termo "anticorpo anti-anticorpo etiquetado" refere-se a anticorpos etiquetados que se ligam a qualquer região dos anticorpos produzidos pelas células produtoras de anticorpos, independentemente da especificidade de ligação desses anticorpos. Preferivelmente, os referidos anticorpos anti-anticorpo provêm de uma espécie, ao passo que as células produtoras de anticorpos provêm de outra. Preferivelmente, estes anticorpos ligam-se à porção Fc do anticorpo produzido pela célula produtora de anticorpos.
Os anticorpos anti-anticorpo etiquetados são capazes de distinguir células produtoras de anticorpos que se ligam ao antigénio selecionado daquelas células que não o fazem. Etiquetas apropriadas são bem conhecidas na área e podem incluir mas não estão limitadas a etiquetas de quimioluminescência, enzimáticas e fluorescentes. Preferivelmente, a etiqueta é uma etiqueta fluorescente. A etiqueta fluorescente conjugada aos anticorpos anti-anticorpo pode ser qualquer etiqueta fluorescente, incluindo mas não se limitando a Aqua, Texas-Red, FITC, rodamina, derivado da rodamina, fluoresceina, derivado da fluoresceina, Cascade Blue, Cy5 e ficoeritrina. Preferivelmente, o conjugado fluorescente é FITC. Assim, num exemplo particular de um ensaio de acordo com a presente invenção, as células produtoras de anticorpos provêm de coelhos e os anticorpos anti-anticorpo etiquetados são anticorpos de cabra anti-Fc anti-coelho etiquetados de modo fluorescente. 9
No ensaio da presente invenção, as células produtoras de anticorpos que produzem anticorpos que se ligam ao antigénio selecionado são distinguidas daquelas que não o fazem por deteção da concentração aumentada de anticorpos anti-anticorpo etiquetados envolvendo as referidas células. Isto é realizado por visualização dos anticorpos anti-anticorpo etiquetados e, assim, da célula produtora de anticorpos rodeada pelos referidos anticorpos. Isto é efetuado utilizando um microscópio. Preferivelmente, a etiqueta é detetada utilizando um microscópio invertido com uma lâmpada UV de vapor de mercúrio e uma montagem de filtros apropriada para o conjugado utilizado.
Preferivelmente, a montagem de filtros é uma montagem de filtros de fluoresceina. Assim, quando a etiqueta é uma etiqueta fluorescente, as células produtoras de anticorpos que produzem anticorpos que se ligam ao antigénio selecionado são identificadas por um aumento localizado da fluorescência que envolve essas células. A presente invenção também proporciona um método in vitro para a produção de um anticorpo que se liga a um antigénio selecionado, que compreende: a) proporcionar uma população de células produtoras de anticorpos; b) incubar, numa lâmina de microscópio, a referida população de células produtoras de anticorpos com um antigénio selecionado conjugado a uma esférula ou acoplado a um eritrócito, ou antigénio expresso na superfície de uma célula, e um anticorpo anti-anticorpo etiquetado, em que o referido anticorpo anti-anticorpo é capaz de distinguir células produtoras de um anticorpo que se liga ao antigénio selecionado daquelas 10 células que não o fazem, e em que o anticorpo anti-anticorpo etiquetado é etiquetado com um conjugado fluorescente; c) sem necessidade de passos de lavagem, identificar uma célula produtora de anticorpos que produz um anticorpo que se liga ao antigénio selecionado por deteção, utilizando um microscópio, da concentração aumentada de anticorpos anti-anticorpo etiquetados envolvendo a célula; d) isolar a célula produtora de anticorpos identificada; e e) sintetizar, a partir daquela, um anticorpo ou fragmento de anticorpo.
Quando desejado, os passos (d) e (e) podem ser repetidos mais do que uma vez para isolar mais do que uma célula produtora de anticorpos e para sintetizar mais do que um anticorpo. Células produtoras de anticorpos identificadas utilizando o ensaio homogéneo descrito aqui são isoladas diretamente do ensaio utilizando técnicas de micromanipulação bem conhecidas na área.
Anticorpos podem ser sintetizados direta ou indiretamente a partir da célula produtora de anticorpos isolada. A síntese direta pode ser realizada por cultura da célula produtora de anticorpos isolada num meio apropriado. A síntese indireta pode ser realizada por isolamento dos genes que codificam os anticorpos, ou partes destes, e sua expressão numa célula-hospedeiro utilizando métodos bem conhecidos na área. Um vetor contendo o(s) gene(s) do anticorpo é transfetado para uma célula-hospedeiro, e a célula-hospedeiro é cultivada num meio apropriado, de modo que o 11 anticorpo ou fragmento de anticorpo com a especificidade desejada é produzido na célula-hospedeiro.
Descrição pormenorizada do ensaio Células produtoras de anticorpos para utilização na presente invenção podem ser obtidas de qualquer fonte apropriada, incluindo um animal que foi imunizado com um antigénio selecionado ou então que desenvolveu uma resposta imunológica a um antigénio em resultado de doença.
Animais podem ser imunizados com um antigénio selecionado utilizando quaisquer das técnicas bem conhecidas na área adequadas para gerar uma resposta imunológica (ver "Handbook of Experimental Immunology", D. M. Weir (editor), Volume 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, Inglaterra, 1986). Muitos animais de sangue quente, como humanos, coelhos, ratinhos, ratos, ovelhas, vacas ou porcos, podem ser imunizados para se obterem células produtoras de anticorpos. No entanto, são geralmente preferidos ratinhos, coelhos e ratos.
Podem encontrar-se números elevados de células produtoras de anticorpos no baço e nodos linfáticos do animal imunizado e, depois de ter sido gerada uma resposta imunológica e de o animal ter sido sacrificado, o baço e nodos linfáticos são removidos. Prepara-se uma suspensão de uma única célula de células produtoras de anticorpos utilizando técnicas bem conhecidas na área. Células produtoras de anticorpos também podem ser obtidas de um animal que tenha gerado as células durante uma doença. Por exemplo, células produtoras de anticorpos de um ser humano com uma doença de causa desconhecida, como cancro, podem ser obtidas e utilizadas para auxiliar a identificação de 12 anticorpos que exercem um efeito no processo da doença, ou que podem conduzir à identificação de um agente ou componente do corpo que esteja envolvido na causa da doença. De modo semelhante, células produtoras de anticorpos podem ser obtidas de sujeitos com doença de causa conhecida, como malária ou SIDA. Estas células produtoras de anticorpos podem ser derivadas do sangue ou nodos linfáticos, bem como de outros tecidos doentes ou normais. Células produtoras de anticorpos também podem ser obtidas por técnicas de cultura, como imunização in vitro. Exemplos desses métodos são descritos por C. R. Reading em Methods in Enzymology 121: 18-33 (J. J. Langone, Η. H. van Vunakis (editores), Academic Press Inc., N. Y.). Células produtoras de anticorpos também podem ser obtidas de culturas de fusão monoclonal ou oligoclonal muito precoces produzidas por tecnologia de hibridoma convencional. A população de células produtoras de anticorpos pode ser enriquecida para utilização no ensaio por métodos baseados na dimensão ou densidade das células produtoras de anticorpos relativamente a outras células. Um exemplo da utilização de Percoll para separar células de acordo com a densidade é descrito por van Mourik e W. P. Zeizlmaker em Methods in Enzymology 121: 174-182 (J. J. Langone, Η. H. van Vunakis (editores), Academic Press Inc., N.Y.). Também podem ser utilizados gradientes de densidade variável de soluções de albumina do soro bovino para separar células de acordo com a densidade. (Ver N. Moav e T. N. Harris, J. Immunol. 105, 1512, 1970; ver também Raid, D. J. em "Selected Methods in Cellular Immunology", B. Misheli e S. Shiigi (editores), W. H.Freeman and Co., San Francisco, 13 1987.) Preferivelmente, a separação é realizada por centrifugação com Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Uppsula, Suécia) . A fração que está mais enriquecida em células produtoras de anticorpos desejados pode ser determinada num procedimento preliminar utilizando ensaios baseados em ELISA para selecionar populações que podem conter anticorpos com a especificidade de ligação desejada. Em alternativa ou adicionalmente, a fração mais enriquecida no anticorpo desejado pode ser determinada por um ensaio funcional.
No ensaio, a população de células produtoras de anticorpos suspeitas de produzir anticorpos com a especificidade de ligação desejada é suspensa num meio apropriado antes da incorporação no ensaio. Um meio apropriado para o ensaio será tal que proporciona pelo menos os requisitos mínimos para manutenção de curta duração da integridade celular e estruturas celulares, como um tampão isotónico. Preferivelmente, este meio é meio de células imunológicas compreendendo meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) + 10% soro fetal de bovino; 50μΜ 2-p-mercaptoetanol; 2 mM glutamina; 20 mM Hepes; e lx Penicilina e Estreptomicina.
Nessas condições, as células produtoras de anticorpos produzem e segregam anticorpos. Células produtoras de anticorpos são diluídas no meio para uma densidade que permite seleção de uma célula produtora de anticorpos individual ou um pequeno número de células produtoras de anticorpos. Se não for claro que célula é responsável pela atividade indicada pelo ensaio, ou para confirmar a atividade, a(s) célula (s) selecionada (s) pode (m) ser 14 testada(s) de novo quanto à sua capacidade para produzir anticorpos com a especificidade de ligação desejada. 0 antigénio para utilização no ensaio pode ser, como descrito acima, qualquer substância para a qual pode ser produzido um anticorpo, incluindo proteínas, glicoproteínas, hidratos de carbono e células completas, como células tumorais ou células transfetadas que expressam o antigénio na superfície. Num exemplo, o antigénio é conhecido, está disponível em forma pura e está revestido na superfície de eritrócitos ou outras partículas, como esférulas, para incorporação no ensaio. Alguns métodos de revestimento de partículas com antigénios são conhecidos dos profissionais. Estes incluem cloreto crómico ou carbodiimida solúvel em água. Numa forma de realização emprega-se um sistema de acoplamento de biotina/ estreptavidina para acoplar antigénios a eritrócitos, cujos métodos estão descritos em pormenor em WO92/02551.
Noutro exemplo, o antigénio é acoplado a esférulas comercialmente disponíveis (por exemplo, as que podem ser obtidas da New England Biolabs). 0 antigénio pode ser conjugado a esférulas utilizando alguns métodos diferentes, preferivelmente via conjugação direta a esférulas ativadas ou via esférulas acopladas a biotina estreptavidina. Preferivelmente, estas esférulas são magnéticas, por facilidade de manipulação.
Noutro exemplo, particularmente quando o antigénio perde epítopos desejáveis por biotinilação, o antigénio é acoplado à superfície de uma partícula via um anticorpo policlonal que se liga ao antigénio. Para preparar o conjugado antigénio-anticorpo policlonal-partícuia, o 15 anticorpo policlonal é primeiramente conjugado à superfície de uma partícula, como uma esférula, utilizando qualquer método adequado, tal como via esférulas acopladas a biotina estreptavidina. 0 conjugado anticorpo policlonal-partícuia é então incubado com um excesso de antigénio, para permitir a ligação do anticorpo policlonal ao antigénio. 0 conjugado antigénio-anticorpo policlonal-partícula é então separado de antigénio não ligado, por exemplo, por centrifugação, e é incorporado no ensaio. 0 anticorpo policlonal para utilização no conjugado pode ser produzido utilizando qualquer método adequado conhecido na área, utilizando o antigénio desejado como imunogénio, em qualquer espécie adequada. 0 anticorpo policlonal pode ser uma IgG completa ou um respetivo fragmento, como um fragmento Fab', F(ab')2 ou Fab. Os fragmentos podem ser produzidos utilizando qualquer método conhecido na área, por exemplo, por digestão com pepsina ou papaína. É importante que o anticorpo policlonal utilizado no conjugado não seja reconhecido pelo anticorpo anti-anticorpo etiquetado utilizado no ensaio para detetar os anticorpos produzidos pelas células produtoras de anticorpos. Por exemplo, quando as células produtoras de anticorpos provierem de coelho, o anticorpo anti-anticorpo etiquetado pode ser um anticorpo anti-Fc anti-coelho, e o anticorpo policlonal utilizado no conjugado deve ser um anticorpo de uma espécie diferente de coelho, por exemplo, cabra, ou então, se o anticorpo provier de coelho, deve ser um fragmento sem a região Fc, por exemplo, um fragmento Fab', F(ab')2 ou Fab.
Noutro exemplo, particularmente quando o antigénio for difícil de purificar ou perder epítopos desejados por biotinilação, o antigénio é expresso na superfície de uma célula. Essas células podem ser as que expressam 16 naturalmente o antigénio na sua superfície, ou uma célula transfetada que expressa o antigénio na sua superfície. Essas células podem incluir mas não estão limitadas a células de mamífero, células imunomoduladoras, linfócitos, monócitos, polimorfos, células T, células tumorais, células de levedura, células bacterianas, agentes infeciosos, parasitas, células de plantas, células transfetadas, como células NSO, CHO, COS, 293. A transfeção de células tais como células NSO, CHO, COS e 293 pode ser efetuada por qualquer método conhecido na área, incluindo eletroporação e nucleofeção.
Num outro exemplo, a fonte do antigénio é qualquer célula que seria desejável para isolar anticorpos para aquele. Essas células podem incluir mas não estão limitadas a células de mamífero, células imunomoduladoras, linfócitos, monócitos, polimorfos, células T, células tumorais, células de levedura, células bacterianas, agentes infeciosos, parasitas e células de plantas.
As células produtoras de anticorpos e o antigénio são incorporados no ensaio a uma concentração apropriada, que pode ser determinada empiricamente, por exemplo, como descrito aqui nos exemplos a seguir. As células produtoras de anticorpos estão presentes a uma densidade suficientemente baixa para estarem bem separadas, permitindo a identificação e isolamento da célula produtora de anticorpos que produz anticorpos com a especificidade desejada. 0 antigénio estará presente em excesso e, preferivelmente, o antigénio está presente num excesso de 10-1 000 vezes relativamente às células produtoras de anticorpos. 17
Para identificar anticorpos que se ligam ao antigénio selecionado, anticorpos anti-anticorpo etiquetados são incorporados no ensaio. Esses anticorpos ligar-se-ão a todos os anticorpos produzidos pelas células produtoras de anticorpos, independentemente da sua especificidade de ligação. Esses anticorpos são facilmente produzidos pelo profissional, ou estão facilmente disponíveis no mercado. Preferivelmente, os anticorpos anti-anticorpo são anticorpos anti-Fc. Numa forma de realização da presente invenção, as células produtoras de anticorpos provêm de coelhos e os anticorpos anti-Fc etiquetados são anticorpos de cabra anti-Fc anti-coelho. A etiqueta conjugada aos anticorpos anti-anticorpo é qualquer etiqueta que possa ser detetada no ensaio por qualquer método adequado conhecido na área. Estão disponíveis muitos conjugados diferentes para etiquetagem dos anticorpos, por exemplo, etiquetas quimioluminescentes, enzimáticas e fluorescentes. Esses anticorpos são facilmente produzidos pelo profissional, ou estão facilmente disponíveis no mercado. De preferência, a etiqueta é tal que pode ser detetada por microscopia. Em geral, nos vários aspetos da invenção descritos aqui, a etiqueta utilizada é preferivelmente uma etiqueta fluorescente. Etiquetas fluorescentes particulares são aquelas que podem ser visualizadas por microscopia e podem incluir mas não estão limitadas a Aqua, Texas-Red, FITC, rodamina, derivados da rodamina, fluoresceina, derivados da fluoresceína, Cascade Blue, Cy5 e ficoeritrina. Preferivelmente, a referida etiqueta é o conjugado fluorescente isotiocianato de fluoresceína (FITC). 18 0 anticorpo anti-anticorpo etiquetado é utilizado no ensaio a uma concentração à qual é possível distinguir células que produzem anticorpos que se ligam ao antigénio selecionado daquelas células que não o fazem. A concentração ótima pode ser determinada empiricamente pelo profissional variando a concentração de anticorpo anti-anticorpo etiquetado. Num exemplo, o anticorpo etiquetado é um anticorpo etiquetado de modo fluorescente, e é utilizado a uma concentração que não é tão baixa que não possa ser detetada fluorescência e não tão alta que exista elevada fluorescência de fundo. Preferivelmente, o anticorpo anti-anticorpo etiquetado de modo fluorescente está em excesso, de modo que se liga a todos os anticorpos produzidos pela célula produtora de anticorpos sem causar excessiva fluorescência de fundo.
Para identificar células produtoras de anticorpos que produzem anticorpos que se ligam ao antigénio selecionado, a mistura de ensaio compreendendo uma população de células produtoras de anticorpos, o antigénio e anticorpo anti-anticorpo etiquetado é incubada no meio descrito acima, para permitir a ocorrência de ligação. Tempos e temperaturas de incubação ótimos podem ser determinados empiricamente pelo profissional. A incubação ocorrerá em qualquer recipiente adequado, como uma lâmina de microscópio, a qualquer temperatura adequada, por exemplo, entre 4°C ou próximo e 37°C ou próximo, durante qualquer período de tempo adequado, por exemplo, entre 5 minutos ou próximo e 5 horas ou próximo. Preferivelmente, a incubação da mistura de ensaio é efetuada numa lâmina de microscópio a 37°C durante um período até 1 hora. 0 anticorpo anti-anticorpo etiquetado é detetado utilizando qualquer método apropriado conhecido na área. 19
Preferivelmente, o anticorpo anti-anticorpo etiquetado é detetado utilizando um microscópio. Mais preferivelmente, o anticorpo anti-anticorpo é conjugado a uma etiqueta fluorescente, e a fluorescência é visualizada utilizando um microscópio invertido com uma lâmpada UV de vapor de mercúrio com uma montagem de filtros apropriada. Preferivelmente, a montagem de filtros é uma montagem de filtros de fluoresceina. Células produtoras de anticorpos que produzem um anticorpo que se liga ao antigénio selecionado são identificadas pela concentração aumentada de anticorpos anti-anticorpo etiquetados envolvendo a célula. Aquelas células produtoras de anticorpos que produzem anticorpos que não se ligam ao antigénio não ficarão rodeadas por uma concentração aumentada de anticorpos anti-anticorpo etiquetados. Células produtoras de anticorpos de alto rendimento são identificadas como sendo aquelas onde mais rapidamente aparece o aumento localizado da concentração de anticorpos anti-anticorpo. A célula produtora de anticorpos pode então ser isolada diretamente do ensaio utilizando técnicas comuns de micromanipulação, como uma pipeta fina de vidro e um micromanipulador. Anticorpos podem ser sintetizados direta ou indiretamente a partir da célula isolada produtora de anticorpos. A síntese direta pode ser realizada por cultura da célula produtora de anticorpos isolada num meio apropriado. Se o ensaio for utilizado para identificar uma célula produtora de anticorpos de alto rendimento, a célula será cultivada em condições apropriadas para reproduzir de modo clonal esta célula de alto rendimento. 20 A síntese indireta pode ser realizada por isolamento dos genes que codificam os anticorpos, ou partes destes, e sua expressão numa célula-hospedeiro. Os genes completos podem ser clonados, ou as regiões variáveis, ou porções destas que conferem a especificidade desejada do anticorpo podem ser clonadas e utilizadas para produzir anticorpos recombinantes. Anticorpos recombinantes podem tomar várias formas diferentes e incluem imunoglobulinas intactas, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e fragmentos de ligação a antigénios, tais como fragmentos Fv, Fab, Fab' e F(ab')2f e quaisquer derivados destes, como fragmentos Fv de cadeia simples. Os métodos para criar estas moléculas de anticorpos são bem conhecidos na área (ver, por exemplo, Boss, US 4, 816, 397; Shrader, WO 92/02551; Ward et al., 1989, Nature, 341, 544; Orlandi et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 8_6, 3833; Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81_, 6851; Riechmann et al., 1988, Nature, 322, 323; Bird et al., 1988, Science, 242, 423). Os tipos de sistemas de expressão disponíveis para produzir estas moléculas de anticorpos incluem sistemas de expressão bacterianos, de levedura, inseto e mamífero, cujos métodos são bem conhecidos na área (Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181).
Anticorpos obtidos de acordo com a presente divulgação podem ser utilizados sem modificação adicional, ou então, se desejado, após modificação incluindo conjugação a uma ou mais moléculas repórter ou efetoras, para qualquer finalidade de diagnóstico ou terapêutica adequada.
Descrição Breve das Figuras
Figura 1 Um ensaio de fluorescência homogéneo compreendendo células B de coelho, glóbulos vermelhos de ovelha 21 revestidos com antigénio e conjugado FITC específico de Fc de IgG de Cabra anti-Coelho. Ensaio visualizado utilizando um microscópio invertido com uma lâmpada UV de vapor de mercúrio e uma montagem de filtros de fluoresceína. Ampliação x8. (a) Imagem de fase do ensaio. (b) Imagem de fluorescência do ensaio. Fluorescência localizada em redor de células B que segregam anticorpos específicos para o antigénio.
Figura 2 Um ensaio de fluorescência homogéneo compreendendo células B de coelho, esférulas magnéticas revestidas com antigénio e conjugado FITC específico de Fc de IgG de Cabra anti-Coelho. Ensaio visualizado utilizando um microscópio invertido com uma lâmpada UV de vapor de mercúrio e uma montagem de filtros de fluoresceína. Ampliação x20. (a) Imagem de fase do ensaio. (b) Imagem de fluorescência do ensaio. Fluorescência localizada em redor de células B que segregam anticorpos específicos para o antigénio.
Figura 3 Deteção por ELISA da ligação específica ao antigénio de anticorpos produzidos em células CHO.
Figura 4 Um ensaio de fluorescência homogéneo compreendendo células B de coelho, células COS-1 transfetadas que expressam antigénio na sua superfície e conjugado FITC específico de Fc de IgG de Cabra anti-Coelho. Ensaio visualizado utilizando um microscópio invertido com uma lâmpada UV de vapor de mercúrio e uma montagem de filtros de fluoresceína. Ampliação x8. (a) Imagem de fase do ensaio. 22 (b) Imagem de fluorescência do ensaio. Fluorescência localizada em redor de células B que segregam anticorpos específicos para o antigénio.
Figura 5 Um ensaio de fluorescência homogéneo compreendendo células B de coelho, células CHO transfetadas que expressam antigénio na sua superfície e conjugado FITC específico de Fc de IgG de Cabra anti-Coelho. Ensaio visualizado utilizando um microscópio invertido com uma lâmpada UV de vapor de mercúrio e uma montagem de filtros de fluoresceína. Ampliação x8. (a) Imagem de fase do ensaio. (b) Imagem de fluorescência do ensaio. Fluorescência localizada em redor de células B que segregam anticorpos específicos para o antigénio.
Os exemplos seguintes são oferecidos a título ilustrativo e não limitativo. Nos exemplos utilizam-se as seguintes abreviaturas: ICM - meio de células imunológicas (RPMI + 10% soro fetal de bovino; 50 μΜ 2^-mercaptoetanol; 2 mM glutamina; 20 mM Hepes; e lx penicilina e estreptomicina) RPMI - meio de Roswell Park Memorial Institute PBS - Solução salina tamponada com fosfato
Exemplo 1
Identificação de células B produtoras de anticorpos específicos utilizando Glóbulos Vermelhos de Ovelha (SRBCs) revestidos com antigénio
Revestimento de SRBCs com antigénio O revestimento dos SRBCs (obtidos da TCS Biosciences) foi efetuado por ligação através de estreptavidina do antigénio 23 biotinilado à superfície de SRBCs revestidos com biotina. Os SRBCs revestidos com antigénio foram preparados no dia da utilização e armazenados a 5% (v/v) em meio de células imunológicas.
Identificação de células B que segregam anticorpos específicos para o antigénio A mistura de ensaio foi preparada em ICM e continha 10 pL de células B de coelho contendo 10-1 000 células B de uma população positiva por ELISA, 10 pL de SRBCs revestidos com antigénio (5% v/v) e 20 pL de conjugado FITC específico de Fc de IgG de Cabra anti-Coelho (Jackson ImmunoResearch) a concentrações variáveis para cada experiência (1:100, 1:200, 1:400 e 1:800). As experiências foram montadas para determinar a concentração ótima de conjugado FITC específico de Fc de IgG de Cabra anti-Coelho requerida para a identificação de células produtoras de anticorpos sem fluorescência de fundo excessiva.
Esta mistura de ensaio foi então aplicada em manchas (2-3 pL por mancha) em lâminas de "câmara" tratadas com Sigmacote® e foi inundada com óleo de parafina leve. As lâminas foram incubadas durante 20-30 minutos a 37°C e foram examinadas utilizando um microscópio invertido equipado com uma lâmpada UV de vapor de mercúrio e uma montagem de filtros de fluoresceína. Células B (células plasmáticas) que segregam anticorpos IgG específicos para o antigénio foram identificadas por um aumento focal da fluorescência envolvendo as referidas células. Ver Figura 1. Utilizando este método, verificou-se que a concentração ótima para o conjugado FITC específico de Fc de IgG de Cabra anti-Coelho é 1:400. Outras células B presentes na mistura, que não segregaram anticorpos específicos para o 24 antigénio, não exibiram fluorescência envolvente. Em controlos de SRBCs sem antigénio presente na superfície não foi observada fluorescência localizada em células B.
As células B presentes nos focos fluorescentes foram depois recolhidas para tubos Eppendorf utilizando um aparato comum de micromanipulação (Eppendorf Transferman e CellTram Vario), e as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves do anticorpo foram subsequentemente isoladas por PCR.
Exemplo 2
Identificação de Células B produtoras de anticorpos específicos utilizando esférulas revestidas com antigénio
Utilizaram-se em todas as experiências esférulas magnéticas revestidas com estreptavidina 1 μΜ (New England Biolabs).
Determinação da densidade ótima para a monocamada de esférulas
Uma alíquota do lote de esférulas foi lavada 3x em PBS para remover conservante, utilizando um magnete, e foi ressuspensa no mesmo volume de meio de células imunológicas (ICM) (RPMI + 10% soro fetal de bovino; 50 μΜ 2-β-mercaptoetanol; 2 mM glutamina; 20 mM Hepes; e lx
Penicilina e Estreptomicina).
Prepararam-se diluições em série 2 vezes de esférulas em ICM, tendo sido utilizadas para determinar uma diluição com uma densidade de esférulas que produzisse uma monocamada uniforme quando as esférulas fossem aplicadas em manchas (2-3 pL por mancha) em lâminas tratadas com Sigmacote e recobertas com óleo de parafina leve. Determinou-se ser ótima uma diluição final de esférulas lavadas de 1/8. 25
Carga de antigénio sobre esférulas e identificação de células B específicas para o antigénio
Alíquotas de 50 pL de esférulas revestidas com estreptavidina foram lavadas e ressuspensas em 50 pL de PBS. Cada alíquota foi incubada com diferentes quantidades de antiqénio biotinilado do lote (1 mq/mL) , variando desde 0,1 pq até 25 pg. Estas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente com aqitação manual ocasional. As esférulas foram depois lavadas em PBS, utilizando um maqnete, e foram ressuspensas em 50 pL de ICM. A quantidade de 20 pL das esférulas carreqadas com antiqénio foi depois misturada com 40 pL de células B positivas por ELISA, 60 pL de ICM e 40 pL de uma diluição 1/400 de um conjuqado FITC especifico de Fc de IqG de Cabra anti-Coelho (Jackson ImmunoResearch).
Esta mistura foi então aplicada em manchas (2-3 pL por mancha) em lâminas de "câmara" tratadas com Siqmacote e foi inundada com óleo de parafina leve. As lâminas foram incubadas durante 20-30 minutos a 37°C e foram examinadas utilizando um microscópio invertido com uma lâmpada UV de vapor de mercúrio e uma montaqem de filtros de fluoresceina. Células B (células plasmáticas) que seqreqam anticorpos IqG específicos para o antiqénio foram identificadas por um aumento focal da fluorescência em redor das células B. Ver Fiqura 2. Utilizando este método determinou-se que 1 pq de antiqénio biotinilado por 50 pL de lote de esférulas é ótimo para a qeração de sinal para este antiqénio particular. Outras células B presentes na mistura, que não seqreqaram anticorpos específicos para o antiqénio, não 26 exibiram fluorescência envolvente. Em controlos não foi observada fluorescência localizada em células B quando as esférulas foram revestidas com outro antigénio irrelevante.
As células B presentes nos focos fluorescentes foram depois recolhidas para tubos Eppendorf utilizando um aparato comum de micromanipulação (Eppendorf Transferman e CellTram Vario) , e as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves do anticorpo de uma das células foram subsequentemente isoladas por PCR. Foi produzido um IgG quimérico recombinante (regiões constantes humanas) por expressão transitória em células CHO. As transfeções de células CHO foram realizadas utilizando o procedimento de lipofectamina de acordo com as instruções do fabricante (InVitrogen, catálogo n° 18324). A ligação especifica de IgG ao antigénio foi confirmada por ELISA (Figura 3).
Exemplo 3
Identificação de células B produtoras de anticorpos especificos utilizando expressão de superfície de antigénio em células COS-1
Expressão Transitória de Antigénio em células COS-1 Células COS-1 que expressam de forma transitória o antigénio selecionado foram suspensas em Meio de células imunológicas. A densidade celular foi alterada para 2 x 107 células por mL.
Identificação de células B que segregam anticorpos específicos para o antigénio A mistura de ensaio foi preparada em ICM e continha 40 pL de células B positivas por ELISA, 40 pL de conjugado FITC especifico de Fc de IgG de Cabra anti-Coelho (Jackson 27
ImmunoResearch) a uma diluição 1:400 e 40 pL de suspensão de células COS-1.
Esta mistura de ensaio foi então aplicada em manchas (2-3 pL por mancha) em lâminas de "câmara" tratadas com Sigmacote e foi inundada com óleo de parafina leve. As lâminas foram incubadas durante 40 minutos a 37°C e foram examinadas utilizando um microscópio invertido com uma lâmpada UV de vapor de mercúrio e uma montagem de filtros de fluoresceina. Células B (células plasmáticas) que segregam anticorpos IgG específicos para o antigénio foram identificadas por um aumento focal da fluorescência envolvendo as células B. Ver Figura 4. Outras células B presentes na mistura, que não segregaram anticorpos específicos para o antigénio, não exibiram fluorescência envolvente. Em controlos de células COS-1 sem antigénio presente na superfície não foi observada fluorescência localizada em células B.
As células B presentes nos focos fluorescentes foram depois recolhidas para tubos Eppendorf utilizando um aparato comum de micromanipulação (Eppendorf Transferman e CellTram Vario), e as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves do anticorpo foram subsequentemente isoladas por PCR.
Exemplo 4
Identificação de células B produtoras de anticorpos específicos utilizando expressão de superfície de antigénio em células de Ovário de Hamster Chinês (CHO)
Expressão Transitória de Antigénio em células CHO 28 Células CHO que expressam de forma transitória o antigénio selecionado foram suspensas em Meio de células imunológicas. A densidade celular foi alterada para 2 x 107 células por mL.
Identificação de células B que segregam anticorpos específicos para o antigénio A mistura de ensaio foi preparada em ICM e continha 40 pL de células B positivas por ELISA, 40 pL de conjugado FITC especifico de Fc de IgG de Cabra anti-Coelho (Jackson ImmunoResearch) a uma diluição 1:400 e 40 pL de suspensão de células CHO.
Esta mistura de ensaio foi então aplicada em manchas (2-3 pL por mancha) em lâminas de "câmara" tratadas com Sigmacote e foi inundada com óleo de parafina leve. As lâminas foram incubadas durante 40 minutos a 37°C e foram examinadas utilizando um microscópio invertido com uma lâmpada UV de vapor de mercúrio e uma montagem de filtros de fluoresceina. Células B (células plasmáticas) que segregam anticorpos IgG específicos para o antigénio foram identificadas por um aumento focal da fluorescência envolvendo as células B. Ver Figura 5. Outras células B presentes na mistura, que não segregaram anticorpos específicos para o antigénio, não exibiram fluorescência envolvente. Em controlos de células CHO sem antigénio presente na superfície não foi observada fluorescência localizada em células B.
As células B presentes nos focos fluorescentes foram depois recolhidas para tubos Eppendorf utilizando um aparato comum de micromanipulação (Eppendorf Transferman e CellTram 29
Vario), e as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves do anticorpo foram subsequentemente isoladas por PCR.
Lisboa, 14 de Dezembro de 2011
Claims (15)
1 REIVINDICAÇÕES 1. Ensaio homogéneo in vitro para identificar uma célula produtora de anticorpos que produz um anticorpo que se liga a um antigénio selecionado, que compreende: a) proporcionar uma população de células produtoras de anticorpos; b) incubar, numa lâmina de microscópio, a referida população de células produtoras de anticorpos com um antigénio selecionado conjugado a uma esférula ou acoplado a um eritrócito, ou antigénio expresso na superfície de uma célula, e um anticorpo anti-anticorpo etiquetado, em que o referido anticorpo anti-anticorpo é capaz de distinguir células produtoras de um anticorpo que se liga ao antigénio selecionado daquelas células que não o fazem, e em que o anticorpo anti- anticorpo etiquetado é etiquetado com um conjugado fluorescente; e c) sem necessidade de remover anticorpos anti-anticorpo etiquetados não ligados, identificar uma célula produtora de anticorpos capaz de produzir um anticorpo que se liga ao antigénio selecionado por deteção, utilizando um microscópio, da concentração aumentada de anticorpos anti-anticorpo etiquetados envolvendo a célula.
2. Ensaio da reivindicação 1, em que o antigénio é acoplado a um eritrócito.
3. Ensaio da reivindicação 1, em que o antigénio é acoplado a uma esférula. 2
4. Ensaio da reivindicação 3, em que o antigénio é acoplado a uma esférula via um anticorpo policlonal.
5. Ensaio da reivindicação 4, em que o anticorpo policlonal é um fragmento de anticorpo.
6. Ensaio da reivindicação 5, em que o anticorpo policlonal é um fragmento de anticorpo Fab, Fab' ou F(ab')2·
7. Ensaio da reivindicação 1, em que a célula que expressa o antigénio é uma célula transfetada.
8. Ensaio da reivindicação 1, em que a célula que expressa o antigénio é uma célula tumoral.
9. Ensaio das reivindicações 1 até 8, em que o antigénio é um agente infecioso.
10. Ensaio das reivindicações 1 até 9, em que o anticorpo anti-anticorpo etiquetado é um anticorpo anti-Fc.
11. Ensaio da reivindicação 10, em que o anticorpo anti- anticorpo etiquetado de modo fluorescente é etiquetado com FITC.
12. Ensaio da reivindicação 11, em que o anticorpo anti- anticorpo etiquetado com FITC é um anticorpo anti-Fc.
13. Ensaio das reivindicações 1 até 12, em que as células produtoras de anticorpos são células B, células plasmáticas, plasmablastos, células B ativadas ou células B de memória. 3
14. Ensaio das reivindicações 1 até 13, em que a célula produtora de anticorpos é uma célula de hibridoma ou uma célula de mamífero manipulada para expressar anticorpos.
15. Método in vitro para produzir um anticorpo que se liga a um antigénio selecionado, que compreende: a) proporcionar uma população de células produtoras de anticorpos; b) incubar, numa lâmina de microscópio, a referida população de células produtoras de anticorpos com um antigénio selecionado conjugado a uma esférula ou acoplado a um eritrócito, ou antigénio expresso na superfície de uma célula, e um anticorpo anti-anticorpo etiquetado, em que o referido anticorpo anti-anticorpo é capaz de distinguir células produtoras de um anticorpo que se liga ao antigénio selecionado daquelas células que não o fazem, e em que o anticorpo anti-anticorpo etiquetado é etiquetado com um conjugado fluorescente; c) sem necessidade de passos de lavagem, identificar uma célula produtora de anticorpos que produz um anticorpo que se liga ao antigénio selecionado por deteção, utilizando um microscópio, da concentração aumentada de anticorpos anti-anticorpo etiquetados envolvendo a célula; d) isolar a célula produtora de anticorpos identificada; e e) sintetizar, a partir daquela, um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Lisboa, 14 de Dezembro de 2011
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