CN108368168B - 结合TNFα的抗体分子 - Google Patents

Abstract

本发明涉及对TNFα具有特异性的抗体分子，抗体分子的治疗用途以及产生所述抗体分子的方法。

Description

结合TNFα的抗体分子

本公开内容涉及TNF特异性抗体，包含其的制剂，其各自在治疗中的用途，表达和任选配制所述抗体的方法，编码抗体的DNA和包含所述DNA的宿主。

背景

肿瘤坏死因子(TNF)超家族是共有调节细胞存活和细胞死亡的主要功能的蛋白质家族。TNF超家族的成员共有共同的核心基序，其由两个反平行的β折叠片(具有反平行的β链)组成，形成“果冻卷(jelly roll)”β结构。TNF超家族成员共有的另一个共同特征是形成同源或异源三聚体复合物。TNF超家族成员的这些三聚体形式结合并激活特定的TNF超家族受体。

TNFα是形成对称同三聚体的TNF超家族的原型成员。TNFα生产的失调牵涉到许多具有重大医学重要性的病理状况。例如，TNFα牵涉到类风湿性关节炎、炎症性肠病(包括克罗恩氏病)、牛皮癣、阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森病(PD)、疼痛、癫痫、骨质疏松症、哮喘、系统性红斑狼疮(SLE)和多发性硬化症(MS)。

TNF超家族成员的已知拮抗剂是大分子的并且通过抑制TNF超家族成员与其受体的结合起作用。这样的拮抗剂的实例包括抗-TNFα抗体，特别是单克隆抗体，例如英夫利昔单抗

阿达木单抗

和赛妥珠单抗

或可溶性TNFα受体融合蛋白，例如依那西普

这些均抑制可溶性TNFα及其与受体TNFR1(负责炎症)的相互作用以及膜结合TNFα及其与受体TNFR2(参与免疫应答)的相互作用。

TNFa在类风湿性关节炎(RA)患者中作为疾病关键驱动因子的作用已得到充分证实。事实上，抗-TNFα抗体已经转化了患者护理，并且抗-TNFα加甲氨蝶呤现在是目前RA患者护理的黄金标准。

发明概述

因此，在一个方面，提供了包含具有可变区的重链或重链片段的抗TNF抗体或其结合片段，其中所述可变区包含独立选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的一个、两个或三个CDR，例如其中CDR H1是SEQ ID NO：1，CDR H2是SEQ ID NO：2和/或CDR H3是SEQID NO：3。

因此，在一个实施方案中，CDR H1是SEQ ID NO：1并且CDR H2是SEQ ID NO：2，或者CDR H1是SEQ ID NO：1并且CDR H3是SEQ ID NO：3，或者CDR H2是SEQ ID NO：2和CDR H3是SEQ ID NO：3。

在一个实施方案中，根据本公开内容的抗体或结合片段包含具有可变区的轻链或轻链片段，例如包含独立选自SEQ ID NO：4至10的一个、两个或三个CDR，特别是其中CDR L1具有SEQ ID NO：4或5给出的序列，CDR L2具有SEQ ID NO：6、7、8或9给出的序列，并且CDRL3具有SEQ ID NO：10给出的序列。

因此，在一个实施方案中，CDR L1是SEQ ID NO：4并且CDR L2是SEQ ID NO：6、7、8或9，CDR L1是SEQ ID NO：5并且CDR L2是SEQ ID NO：6、7、8或9或CDR L1是SEQ ID NO：4或5并且CDR L3是SEQ ID NO：10；或CDR L2是SEQ ID NO：6、7、8或9或CDR L1是SEQ ID NO：10。

在一个实施方案中，根据本公开内容的抗体或结合片段包含选自SEQ ID NO：1-10的CDR序列，例如其中CDR H1是SEQ ID NO：1，CDR H2是SEQ ID NO：2，CDR H3是SEQ ID NO：3，CDR L1是SEQ ID NO：4或5，CDR L2是SEQ ID NO：6、7、8或9，并且CDR L3是SEQ ID NO：10。

还提供了与本文明确公开的抗体或结合片段结合相同表位的抗体或结合片段。

在一个实施方案中，提供了交叉阻断针对人TNF的本文明确公开的抗体或结合片段或被所述抗体交叉阻断与人TNF的结合的抗体或结合片段。

本公开内容还扩展至编码如本文所述的抗体或片段的多核苷酸，例如DNA，例如其中DNA被整合到载体中。

还提供了包含所述多核苷酸的宿主细胞。

本文提供了表达抗体或片段的方法，提供了将抗体或片段缀合至聚合物如PEG的方法。

本公开内容还涉及包含所述抗体和片段的药物组合物。

在一个实施方案中，提供了治疗方法，其包括施用治疗有效量的如本文所述的抗体、片段或组合物。

本公开内容还扩展至用于治疗，特别是用于治疗免疫学病症、自身免疫病症和/或炎症性病症例如关节炎如炎症性关节炎，特别是类风湿性关节炎或强直性脊柱炎的根据本公开内容的抗体、片段或组合物。

附图说明

图1显示了与本公开内容的抗体和结合片段有关的各种序列

图2显示了CA2109小鼠Fab(fwk18 FAB)IgG1(fwk18 IgG)的滴定曲线，

图3/4显示了与本公开内容的抗体和结合片段有关的各种序列比对。

发明详述

如本文所用的TNF指细胞因子肿瘤坏死因子α，其人氨基酸序列显示在UniProt编号P01375中。

如本文所用的抗体分子是指抗体或其结合片段。

本文使用的术语“抗体”通常涉及完整(整个)抗体，即包含两条重链和两条轻链的元件。抗体可以包含其他额外的结合结构域，例如根据公开于WO 2007/024715中的分子DVD-Ig或WO2011/030107中所述的所谓(FabFv)₂Fc。因此，如本文所用的抗体包括二价、三价或四价全长抗体。

抗体的结合片段包括单链抗体(即全长重链和轻链)；Fab，修饰的Fab，Fab'，修饰的Fab'，F(ab’)₂，Fv，Fab-Fv，Fab-dsFv，单结构域抗体(例如VH或VL或VHH)，scFv，dsscFv，二价、三价或四价抗体，双scFv，双抗体(diabodies)，三链抗体(tribodies)，三抗体(triabodies)，四抗体(tetrabodies)和上述任一种的表位结合片段(参见例如Holligerand Hudson,2005,Nature Biotech.23(9):1126-1136；Adair and Lawson,2005,DrugDesign Reviews-Online 2(3),209-217)。用于产生和制造这些抗体片段的方法在本领域是公知的(参见例如Verma等人，1998，Journal of Immunological Methods，216，165-181)。Fab-Fv形式首先在WO2009/040562中公开并且其二硫化物稳定形式Fab-dsFv首先在WO2010/035012中公开。用于本发明的其他抗体片段包括国际专利申请WO2005/003169、WO2005/003170和WO2005/003171中描述的Fab和Fab'片段。多价抗体可以包含多种特异性，例如双特异性或可以是单特异性的(参见例如WO92/22583和WO05/113605)。后者的一个这样的例子是如WO92/22583中所述的Tri-Fab(或TFM)。

在一个实施方案中，提供了Fab片段。

在一个实施方案中，提供了Fab'片段。

典型的Fab'分子包含重链和轻链对，其中重链包含可变区V_H，恒定区C_H1和天然或修饰的铰链区，并且轻链包含可变区V_L和恒定区C_L。

在一个实施方案中，提供了根据本公开内容的Fab'的二聚体以产生F(ab’)₂，例如二聚化可以通过铰链进行。

在一个实施方案中，抗体或其结合片段包含结合结构域。结合结构域通常包含6个CDR，三个来自重链，三个来自轻链。在一个实施方案中，CDR在构架中并且一起形成可变区。因此在一个实施方案中，抗体或结合片段包含对抗原具有特异性的结合结构域，其包含轻链可变区和重链可变区。

应理解，可以对本发明提供的CDR或其他序列(例如可变结构域)进行一个或多个(例如1、2、3或4个)氨基酸取代、添加和/或缺失而不显著改变抗体结合TNF的能力。本领域技术人员可容易地测试任何氨基酸取代、添加和/或缺失的效果，例如通过使用本文所述的用于测定TNF结合/阻断的方法，特别是在实施例中描述的方法。

另外可以对用于本发明提供的抗体或片段中的重链和/或轻链构架区进行一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸取代、添加和/或缺失，并且其中保持或增加对TNF的结合亲和力。

通常根据Kabat等人设计的系统对抗体可变结构域中的残基进行编号。该系统在Kabat等人，1987，Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Departmentof Health and Human Services，NIH，USA(以下称为“Kabat等人(同上)”)中阐述。除非另有说明，否则在本说明书中使用该编号系统。

Kabat残基名称并不总是与氨基酸残基的线性编号直接对应。实际的线性氨基酸序列可以含有比严格Kabat编号更少或更多的氨基酸，其对应于基本可变域结构的结构组分(无论构架或互补决定区(CDR))的缩短或至其中的插入。通过将抗体序列中的同源残基与“标准”Kabat编号序列进行比对，可以确定给定抗体的正确Kabat编号残基。

根据Kabat编号系统，重链可变结构域的CDR位于残基31-35(CDR-H1)，残基50-65(CDR-H2)和残基95-102(CDR-H3)。然而，根据Chothia(Chothia,C.and Lesk,A.M.J.Mol.Biol.,196,901-917(1987))，与CDR-H1等同的环从残基26延伸至残基32。因此，除非另有说明，否则本文所用的“CDR-H1”旨在指代残基26至35，如由Kabat编号系统和Chothia拓扑环定义的组合所描述的。

根据Kabat编号系统，轻链可变结构域的CDR位于残基24-34(CDR-L1)，残基50-56(CDR-L2)和残基89-97(CDR-L3)。

本公开内容的抗体和片段阻断TNF结合和/或信号传导。如本文所使用的阻断是指物理阻断，例如阻塞受体，但也将包括抗体或片段结合表位的情况，这样的结合引起例如构象变化，这意味着受体的天然配体不再结合。本发明的抗体分子与TNF结合，从而降低或阻止(例如抑制/中和)TNF与其靶/受体的结合。

用于本公开内容的抗体可以使用本领域已知的任何合适的方法获得。TNF多肽/蛋白质包括融合蛋白，(重组或天然地)表达该多肽的细胞(例如活化的T细胞)可用于产生特异性识别TNF的抗体。多肽可以是“成熟”多肽或其生物活性片段或衍生物。

用于免疫宿主的多肽可以通过本领域公知的方法从包含表达系统的遗传改造的宿主细胞制备，或者它们可以从天然生物来源回收。在本申请中，术语“多肽”包括肽、多肽和蛋白质。除非另有说明，否则这些可互换使用。TNF多肽在一些情况下可以是更大蛋白质的一部分，例如融合至亲和标签或类似物的融合蛋白。

通过使用众所周知的常规方案，可以在需要免疫动物(优选非人动物)时通过给动物施用多肽获得针对TNF多肽产生的抗体，参见例如Handbook of ExperimentalImmunology,D.M.Weir(ed.),Vol 4,Blackwell Scientific Publishers,Oxford,England,1986。可以免疫许多温血动物，如兔，小鼠，大鼠，绵羊，牛，骆驼或猪。然而，小鼠，兔子，猪和大鼠通常是最合适的。

单克隆抗体可通过本领域已知的任何方法制备，如杂交瘤技术(Kohler和Milstein，1975，Nature，256：495-497)，三源杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，1983，Immunology Today，4:72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等人，Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，pp77-96，Alan R Liss，Inc.，1985)。

用于本发明的抗体还可以通过使用单淋巴细胞抗体方法通过克隆和表达由选择用于产生特异性抗体的单一淋巴细胞产生的免疫球蛋白可变区cDNA来产生，例如通过Babcook，J.等人，1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(15):7843-7848l；WO92/02551；WO2004/051268；WO2004/051268和国际专利申请号WO2004/106377描述的方法。

筛选抗体可使用测量与人TNF的结合的测定和/或测量阻断TNF与受体结合的能力的测定来进行。结合测定的一个例子是ELISA。适合的拮抗和阻断测定的实例在下文的实施例中描述。

本文使用的特异性意指仅识别其特异于的抗原的抗体，或与其非特异于的抗原的结合相比与其特异于的抗原具有显著更高的结合亲和力的抗体，例如至少5、6、7、8、9、10倍更高的结合亲和力。结合亲和力可以通过如下文所述的技术如BIAcore测量。

提供了根据本公开内容的某些抗体的氨基酸序列和多核苷酸序列，并且形成本发明的一个方面。

因此，在一个方面，提供了包含具有可变区的重链或重链片段的抗TNF抗体或其结合片段，其中所述可变区包含独立选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的一个、两个或三个CDR，例如其中CDR H1是SEQ ID NO：1，CDR H2是SEQ ID NO：2和/或CDR H3是SEQID NO：3。

因此，在一个实施方案，CDR H1是SEQ ID NO：1并且CDR H2是SEQ ID NO：2，或者CDR H1是SEQ ID NO：1并且CDR H3是SEQ ID NO：3，或者CDR H2是SEQ ID NO：2和CDR H3是SEQ ID NO：3。

在一个实施方案中，根据本公开内容的抗体或结合片段包含具有可变区的轻链或轻链片段，例如包含独立选自SEQ ID NO：4至10的一个、两个或三个CDR，特别是其中CDR L1具有SEQ ID NO：4或5给出的序列，CDR L2具有SEQ ID NO：6、7、8或9给出的序列，并且CDRL3具有SEQ ID NO：10给出的序列。

因此，在一个实施方案中，CDR L1是SEQ ID NO：4并且CDR L2是SEQ ID NO：6、7、8或9CDR L1是SEQ ID NO：5并且CDR L2是SEQ ID NO：6、7、8或9或CDR L1是SEQ ID NO：4或5并且CDR L3是SEQ ID NO：10；或CDR L2是SEQ ID NO：6、7、8或9或CDR L1是SEQ ID NO：10。

在一个实施方案中，根据本公开内容的抗体或结合片段包含选自SEQ ID NO：1-10的CDR序列，例如其中CDR H1是SEQ ID NO：1，CDR H2是SEQ ID NO：2，CDR H3是SEQ ID NO：3，CDR L1是SEQ ID NO：4或5，CDR L2是SEQ ID NO：6、7、8或9，并且CDR L3是SEQ ID NO：10。

在一个实施方案中，本发明的抗体包含具有3个重链CDR的重链，并且CDRH1的序列与SEQ ID NO：1给出的序列具有至少60％的同一性或相似性，CDRH2的序列与SEQ ID NO：2给出的序列具有至少60％的同一性或相似性，并且CDRH3的序列与SEQ ID NO：3给出的序列具有至少60％的同一性或相似性。

在一个实施方案中，本发明的抗体包含具有三个轻链CDR的轻链，并且CDRL1的序列与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5给出的序列具有至少60％的同一性或相似性，CDRL2的序列与SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9给出的序列具有至少60％的同一性或相似性，并且CDRL3的序列与SEQ ID NO：10给出的序列具有至少60％的同一性或相似性。

在一个实施方案中，根据本公开内容的抗体或结合片段是完全人的，例如从噬菌体文库或类似物制备。

在一个实施方案中，根据本公开内容的抗体或片段是人源化的。

人源化抗体(其包括CDR移植抗体)是具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的构架区的抗体分子(参见例如US 5,585,089；WO91/09967)。应该理解，可能仅需要转移CDR的特异性决定残基而不是整个CDR(参见例如Kashmiri等人，2005，Methods，36，25-34)。人源化抗体可以任选地进一步包含一个或多个衍生自CDR来源于的非人物种的构架残基。后者通常被称为供体残基。

因此，在本文所用的一个实施方案中，术语“人源化抗体分子”是指抗体分子，其中重链和/或轻链含有来自供体抗体(例如非人抗体如鼠单克隆抗体)的一个或多个CDR(如果需要，包括一个或多个修饰的CDR)移植到受体抗体(例如人抗体)的重链和/或轻链可变区构架中，任选地还包含衍生自CDR来源于的非人物种的一个或多个构架残基(供体残基)。对于综述，参见Vaughan等人，Nature Biotechnology,16,535-539,1998。在一个实施方案中，不是转移整个CDR，而是来自上文所述的任何一个CDR的仅一个或多个特异性决定残基被转移至人抗体构架(参见例如Kashmiri等人，2005，Methods，36,25-34)。在一个实施方案中，仅将来自上文所述的一个或多个CDR的特异性确定残基转移至人抗体构架。在另一个实施方案中，仅将来自以上描述的每个CDR的特异性确定残基转移至人抗体构架。

当移植CDR或特异性决定残基时，可关于CDR所来源于的供体抗体的种类/类型使用任何适当的受体可变区构架序列，包括小鼠、灵长类动物和人构架区。

适当地，根据本发明的人源化抗体具有包含人受体构架区以及本文具体提供的一个或多个CDR的可变结构域。因此，在一个实施方案中提供了阻断结合人TNF的人源化抗体，其中可变结构域包含人受体构架区和非人供体CDR。

可用于本发明的人构架的实例是KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(Kabat等人，同上)。例如，KOL和NEWM可用于重链，REI可用于轻链以及EU、LAY和POM可用于重链和轻链。可选择地，可使用人种系序列；这些可获自：http://www.imgt.org/。

在本发明的人源化抗体中，受体重链和轻链不一定需要来源于同一抗体并且如果需要的话，可包括具有来源于不同链的构架区的复合链。

本发明的人源化抗体的重链的一个此类合适构架区来自人VK1 2-1(U)A20 JK2或VH3 1-3 3-21 JH4受体构架(分别是SEQ ID NO：25和26)。

因此，在一个实例中，提供了包含一个或多个CDR的人源化抗体，所述CDR选自SEQID NO：1给出的CDR-H1的序列、SEQ ID NO：2给出的CDR-H2的序列和SEQ ID NO：3给出的CDRH3的序列，其中重链构架区来源于人受体构架VH3 1-3 3-21JH4(SEQ ID NO：26)。

因此，在一个实例中，提供了包含SEQ ID NO：1给出的CDR-H1的序列、SEQ ID NO：2给出的CDR-H2的序列和SEQ ID NO：3给出的CDRH3的序列的人源化抗体，其中重链构架区来源于人受体构架VH3 1-3 3-21JH4(SEQ ID NO：26)。

在一个实例中，抗体的重链可变结构域包含SEQ ID NO：12、16或28例如12或16给出的序列，。

本发明的人源化抗体的轻链的合适构架区源自人受体构架VK1 2-1(U)A20 JK2(SEQ ID NO：25)。

因此，在一个实例中，提供了包含SEQ ID NO：4或5中给出的CDR-L1的序列、SEQ IDNO：6、7、8或9给出的CDR-L2的序列和SEQ ID NO：10给出的CDRL3的序列的人源化抗体，其中轻链构架区来源于人受体构架VK1 2-1(U)A20 JK2。

在一个实例中，抗体的轻链可变结构域包含SEQ ID NO：11、15或27例如11或15给出的序列。在一个实例中，抗体的轻链可变结构域包含SEQ ID NO：29给出的序列。

在一个实施方案中，抗体或结合片段包含SEQ ID NO：12的重链可变区和SEQ IDNO：11的轻链可变区序列。

在一个实施方案中，抗体或结合片段包含SEQ ID NO：12的重链可变区和SEQ IDNO：29的轻链可变区序列。

在一个实施方案中，抗体或结合片段包含SEQ ID NO：16的重链可变区和SEQ IDNO：15的轻链可变区序列。

在一个实施方案中，抗体或结合片段包含SEQ ID NO：28的重链可变区和SEQ IDNO：27的轻链可变区序列。

在本发明的人源化抗体中，构架区不需要具有与受体抗体的构架区完全相同的序列。例如，不常见的残基可以被改变成对于该受体链种类或类型更频繁出现的残基。或者，受体构架区中所选择的残基可被改变以使得它们对应于在供体抗体中相同位置处发现的残基(参见Reichmann等人，1998,Nature,332,323-324)。这样的变化应保持在恢复供体抗体的亲和力所需的最低程度。用于选择受体构架区中可能需要被改变的残基的方案示于WO91/09967中。

因此在一个实施方案中，重链和/或轻链构架中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基被备选的氨基酸残基置换。

因此，在一个实例中提供了人源化抗体，其中重链可变结构域的位置24、48、49、71、73、78和93(Kabat编号)处的至少一个残基是供体残基，参见例如SEQ ID NO：12或SEQID NO：28给出的序列。

在一个实施方案中，重链可变结构域的残基24被备选氨基酸例如苏氨酸置换。

在一个实施方案中，重链可变结构域的残基48被备选氨基酸例如异亮氨酸置换。

在一个实施方案中，重链可变结构域的残基49被备选氨基酸例如甘氨酸置换。

在一个实施方案中，重链可变结构域的残基71被备选氨基酸例如缬氨酸置换。

在一个实施方案中，重链可变结构域的残基73被备选氨基酸例如赖氨酸置换。

在一个实施方案中，重链可变结构域的残基78被备选氨基酸例如丙氨酸置换。

在一个实施方案中，重链可变结构域的残基93被备选氨基酸例如苏氨酸置换。

在一个实施方案中，根据本公开内容，在人源化重链可变区中，残基48是异亮氨酸，残基49是甘氨酸，71是缬氨酸，73是赖氨酸，78是丙氨酸，残基93是苏氨酸。

因此，在一个实例中提供了人源化抗体，其中至少重链可变结构域的位置48、49、71、73、78和93(Kabat编号)的每个位置上的残基是供体残基，参见例如SEQ ID NO：12给出的序列。

在一个实例中，提供了人源化抗体，其中至少重链可变结构域的位置24、48、49、71、73、78和93(Kabat编号)的每个位置处的残基是供体残基，参见例如SEQ ID NO：28给出的序列。

在一个实例中，提供了人源化抗体，其中轻链可变结构域的位置65、71和87(Kabat编号)处的一个或多个残基是供体残基，参见例如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：27给出的序列。

在一个实例中，提供了人源化抗体，其中至少轻链可变结构域的位置65、71和87(Kabat编号)的每个位置处的残基是供体残基，参见例如SEQ ID NO：11给出的序列。

在一个实施方案中，轻链可变结构域的残基65被备选氨基酸例如苏氨酸置换。

在一个实施方案中，轻链可变结构域的残基71被备选氨基酸例如酪氨酸置换。

在一个实施方案中，轻链可变结构域的残基87被备选氨基酸例如苯丙氨酸置换。

在一个实施方案中，根据本公开内容，在人源化轻链可变区中，残基65是苏氨酸，残基71是酪氨酸且残基87是苯丙氨酸。

在一个实施方案中，本发明提供了结合人TNF的包含重链的抗体分子，其中重链的可变结构域包含与本文所述的序列例如SEQ ID NO：12、16或28给出的序列具有至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％96％,97％,98％或99％的同一性或相似性的序列。

在一个实施方案中，本发明提供了结合人TNF的包含轻链的抗体分子，其中轻链的可变结构域包含与SEQ ID NO：11、15或27给出的序列具有至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％96％,97％,98％或99％的同一性或相似性的序列。

在一个实施方案中，本发明提供了结合人TNF的抗体分子，其中所述抗体具有与本文所述的序列例如SEQ ID NO：12、15或28给出的序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％96％,97％,98％或99％的同一性或相似性的重链可变结构域，但其中抗体分子具有SEQ ID NO：1给出的CDR-H1的序列，SEQ ID NO：2给出的CDR-H2的序列和SEQ ID NO：3给出的CDR-H3的序列。

在一个实施方案中，本发明提供了结合人TNF的抗体分子，其中所述抗体具有与本文所述的序列例如SEQ ID NO：11、15或27给出的序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％96％,97％,98％或99％的同一性或相似性的轻链可变结构域，但其中抗体分子具有SEQ ID NO：4或5给出的CDR-L1的序列，SEQ ID NO：6、7、8或9给出的CDR-L2的序列和SEQ ID NO：10给出的CDR-L3的序列。

在一个实施方案中，本发明提供了结合人TNF的抗体分子，其中所述抗体具有与本文所述的序列例如SEQ ID NO：12给出的序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％96％,97％,98％或99％的同一性或相似性的重链可变结构域和与本文所述的序列例如SEQID NO：11给出的序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％96％,97％,98％或99％的同一性或相似性的轻链可变结构域，但其中抗体分子具有SEQ ID NO：1给出的CDR-H1的序列，SEQ ID NO：2给出的CDR-H2的序列和SEQ ID NO：3给出的CDR-H3的序列，SEQ ID NO：4或5给出的CDR-L1的序列，SEQ ID NO：6、7、8或9给出的CDR-L2的序列和SEQ ID NO：10给出的CDR-L3的序列。

在一个实施方案中，本发明提供了结合人TNF的抗体分子，其中所述抗体具有与本文所述的序列例如SEQ ID NO：16给出的序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％96％,97％,98％或99％的同一性或相似性的重链可变结构域和与本文所述的序列例如SEQID NO：15给出的序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％96％,97％,98％或99％的同一性或相似性的轻链可变结构域，但其中抗体分子具有SEQ ID NO：1给出的CDR-H1的序列，SEQ ID NO：2给出的CDR-H2的序列和SEQ ID NO：3给出的CDR-H3的序列，SEQ ID NO：4或5给出的CDR-L1的序列，SEQ ID NO：6、7、8或9给出的CDR-L2的序列和SEQ ID NO：10给出的CDR-L3的序列。

在一个实施方案中，本发明提供了结合人TNF的抗体分子，其中所述抗体具有与本文所述的序列例如SEQ ID NO：28给出的序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％96％,97％,98％或99％的同一性或相似性的重链可变结构域和与本文所述的序列例如SEQID NO：27给出的序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％96％,97％,98％或99％的同一性或相似性的轻链可变结构域，但其中抗体分子具有SEQ ID NO：1给出的CDR-H1的序列，SEQ ID NO：2给出的CDR-H2的序列和SEQ ID NO：3给出的CDR-H3的序列，SEQ ID NO：4或5给出的CDR-L1的序列，SEQ ID NO：6、7、8或9给出的CDR-L2的序列和SEQ ID NO：10给出的CDR-L3的序列。

如本文所用，“同一性”表示在比对的序列中的任何特定位置上，氨基酸残基在序列之间是相同的。如本文所用，“相似性”表示在比对的序列中的任何特定位置，氨基酸残基在序列之间具有相似的类型。例如，亮氨酸可以取代异亮氨酸或缬氨酸。通常可以相互取代的其它氨基酸包括但不限于：

-苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸(具有芳香族侧链的氨基酸)；

-赖氨酸，精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；

-天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；

-天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；和

-半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。

同一性和相似性的程度可以容易地计算(Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing.Informaticsand Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；ComputerAnalysis of Sequence Data,Part 1,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,HumanaPress,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987,Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991,BLAST^TM软件可获自NCBI(Altschul,S.F.等人,1990,J.Mol.Biol.215:403-410；Gish,W.&States,D.J.1993,Nature Genet.3:266-272.Madden,T.L.等人,1996,Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul,S.F.等人,1997,Nucleic AcidsRes.25:3389-3402；Zhang,J.&Madden,T.L.1997,Genome Res.7:649-656)。

本发明的抗体分子可以包含具有全长重链和轻链的完整抗体分子或其片段，并且可以是但不限于Fab，修饰的Fab，Fab'，修饰的Fab'，F(ab’)₂，Fv，单结构域抗体(例如VH或VL或VHH)，scFv，dsscFv，二价、三价或四价抗体，双scFv，双抗体，三抗体，四抗体和上述任一种的表位结合片段(参见例如Holliger and Hudson,2005,Nature Biotech.23(9):1126-1136；Adair and Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online 2(3),209-217)。用于产生和制造这些抗体片段的方法在本领域是公知的(参见例如Verma等人，1998，Journalof Immunological Methods，216,165-181)。用于本发明的其他抗体片段包括国际专利申请WO2005/003169、WO2005/003170和WO2005/003171中描述的Fab和Fab'片段。多价抗体可以包含多种特异性，例如双特异性或可以是单特异性的(参见例如WO92/22853，WO05/113605，WO2009/040562和WO2010/035012)。

在一个实例中，本发明提供了包含本文所述的任何一种抗TNF抗体或其结合片段的多特异性抗体。多特异性抗体可以具有能够结合两种或更多种抗原的任何合适的抗体形式。多特异性抗体形式的例子是本领域已知的并且可以包括例如并且可以选自双抗体，scdiabody，三抗体，串联scFv，FabFv，Fab'Fv，FabdsFv，Fab-scFv，Fab-dsscFv，Fab-(dFcFv)2，FabFvFv，FabFvFc，diFab，diFab'，三链抗体，串联scFv-Fc，scFv-Fc-scFv，scdiabody-Fc，scdiabody-CH3，Ig-scFv，scFv-Ig，V-Ig，Ig-V，Duobody和DVD-Ig。在一个实例中，多特异性抗体是如WO2015/197772中所述的二硫化物稳定的抗体。

在本发明的一个方面中，多特异性抗体分子作为二聚体提供，其包含以下或由以下组成：

a)式(I)的多肽链：

VH1-CH1-X-V1；和

b)式(II)的多肽链：

VL1-CL-Y-V2；

其中：

VH1代表重链可变结构域；

CH1表示重链恒定区的结构域，例如其结构域1；

X代表键或接头；

Y代表键或接头；

V1代表dsFv，sdAb，scFv或dsscFv；

VL1代表轻链可变结构域；

CL表示来自轻链恒定区的结构域，如Ckappa；

V2代表dsFv，sdAb，scFv或dsscFv

其中VH1和VL1一起形成对第一抗原特异性的结合结构域，并且V1和V2各自分别结合第二和第三抗原，并且其中至少一种抗原是TNF。

在一个实例中，抗体分子是包含SEQ ID NO：21给出的序列的scFv。

在一个实例中，抗体分子包含一种或多种scFv分子，其包含SEQ ID NO：11和12、SEQ ID NO：15和16和/或SEQ ID NO：21给出的序列给出的序列。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体分子是包含SEQ ID NO：11和12(例如分别用于轻链和重链)中所示的可变区的抗体Fab或Fab'片段。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体分子是包含SEQ ID NO：15和16(例如分别用于轻链和重链)中所示的可变区的抗体Fab或Fab'片段。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体分子是包含SEQ ID NO：27和28(例如分别用于轻链和重链)中所示的可变区的抗体Fab或Fab'片段。

应该理解，本公开内容的scFv和Fab分子可以并入上文所述的任何合适的多特异性抗体分子，例如具有上述式I和II的多特异性抗体分子。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体分子是全长IgG1抗体，其包含示于SEQ IDNO：11和12(例如分别用于轻链和重链)中的可变区。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体分子是全长IgG1抗体，其包含示于SEQ IDNO：15和16(例如分别用于轻链和重链)中的可变区。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体分子是全长IgG1抗体，其包含示于SEQ IDNO：27和28(例如分别用于轻链和重链)中的可变区。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体分子是全长IgG4形式。在一个实施方案中，本公开内容的抗体分子是全长IgG4P形式。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体分子是全长IgG4或IgG4P抗体，其包含示于SEQ ID NO：11和12(例如分别用于轻链和重链)中的可变区。

如本文使用的IgG4P是野生型IgG4同种型的突变，其中氨基酸241被脯氨酸置换，参见例如如Angal等人，Molecular Immunology,1993,30(1),105-108中所述，第241位的丝氨酸已经改变为脯氨酸。

在一个实施方案中，根据本公开内容的抗体提供作为TNF结合抗体融合蛋白，其包含免疫球蛋白部分，例如Fab或Fab'片段，以及直接或间接连接至其的一个或两个单结构域抗体(dAb)，例如如WO2009/040562、WO2010035012、WO2011/030107、WO2011/061492和WO2011/086091中所述，其全部通过引用并入本文。

在一个实施方案中，融合蛋白包含两个结构域抗体，例如作为任选通过二硫键连接的可变重(VH)和可变轻(VL)配对。

在一个实施方案中，融合蛋白的Fab或Fab'元件与单结构域抗体具有相同或相似的特异性。在一个实施方案中，Fab或Fab'与单结构域抗体具有不同的特异性，也就是说融合蛋白是多价的。在一个实施方案中，根据本发明的多价融合蛋白具有白蛋白结合位点，例如其中的VH/VL对提供白蛋白结合位点。

在一个实施方案中，根据本公开内容的Fab或Fab'缀合至PEG分子或人血清白蛋白。

如果存在，本发明的抗体分子的恒定区结构域可以根据所提出的抗体分子的功能，特别是可能需要的效应子功能来选择。例如，恒定区结构域可以是人IgA，IgD，IgE，IgG或IgM结构域。特别地，当抗体分子打算用于治疗用途并且需要抗体效应子功能时，可以使用人IgG恒定区结构域，尤其是IgG1和IgG3同种型。或者，当抗体分子旨在用于治疗目的并且不需要抗体效应子功能时，可以使用IgG2和IgG4同种型。应该理解，也可以使用这些恒定区结构域的序列变体。例如，如Angal等人，Molecular Immunology，1993，30(1)，105-108中所述，可使用其中241位丝氨酸已被改变为脯氨酸的IgG4分子。本领域技术人员还将理解，抗体可以经历多种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度通常取决于用于表达抗体的宿主细胞系以及培养条件。这种修饰可能包括糖基化、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺化中的变化。频繁修饰是由于羧肽酶的作用导致的羧基末端碱性残基(例如赖氨酸或精氨酸)的丢失(如Harris，RJ，Journal of Chromatography 705：129-134,1995中所述)。因此，抗体重链的C-末端赖氨酸可能不存在。

在一个实施方案中，抗体重链包含CH1结构域，例如SEQ ID NO：34中所示的CH1序列，并且抗体轻链包含κ或λCL结构域，例如SEQ ID NO：33中所示的CL序列。

在一个实施方案中，抗体重链包含含有CH1、CH2和CH3结构域的全长恒定区，例如SEQ ID NO：35中所示的γ1恒定区序列或SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37中所示的γ4恒定区序列，并且抗体轻链包含κ或λCL结构域，例如SEQ ID NO：33中所示的CL序列。

在一个实施方案中，来自抗体分子的C端氨基酸在翻译后修饰期间被切割。

在一个实施方案中，来自抗体分子的N-末端氨基酸在翻译后修饰期间被切割。

本发明还提供了由本发明提供的抗体结合的人TNF的特定区域或表位，所述抗体特别是包含以下的抗体或结合片段：

·SEQ ID NO：12的重链序列和SEQ ID NO：11的轻链序列，

·SEQ ID NO：16的重链序列和SEQ ID NO：15的轻链序列，或者

·SEQ ID NO：28的重链序列和SEQ ID NO：27的轻链序列。

人TNF多肽的该特定区域或表位可通过本领域已知的任何合适的表位作图方法与本发明提供的任何一种抗体组合来鉴定。此类方法的实例包括就与本发明的抗体的结合筛选来源于TNF的不同长度的肽，其具有能够特异性结合含有该抗体识别的表位序列的抗体的最小片段。TNF肽可以通过合成或通过TNF多肽的蛋白水解消化产生。结合抗体的肽可以通过例如质谱分析来鉴定。在另一个实例中，可以使用NMR光谱学或X射线晶体学来鉴定由本发明的抗体结合的表位。在使用X-射线晶体学的一个实例中，表位被确定为TNF多肽上在抗体的

内的那些残基。在一个实例中，表位被确定为TNF多肽上在抗体的

内的那些残基。一旦鉴定出来，如果需要，可以使用结合本发明抗体的表位片段作为免疫原以获得结合相同表位的额外抗体。

在一个实施方案中，结合本发明上文所述的表位的抗体是完全人的。在一个实施例中，它们是人源化的。在一个实例中，它们对人TNF的亲和力为150pM或更低，通常为130pM或更低。

交叉阻断根据本发明的抗体分子的结合的抗体在阻断TNF活性方面可能同样有用，该抗体分子特别是包含以下的抗体分子：

SEQ ID NO：12给出的重链序列和SEQ ID NO：11给出的轻链序列中，

SEQ ID NO：16给出的重链序列和SEQ ID NO：15给出的轻链序列

SEQ ID NO：28给出的重链序列和SEQ ID NO：27给出的轻链序列。

因此，本发明还提供了抗TNF抗体分子，其交叉阻断上文所述的任何一种抗体分子与人TNF的结合和/或被这些抗体中的任何一种交叉阻断与人TNF的结合。在一个实施方案中，这样的抗体与上文所述的抗体结合相同的表位。在另一个实施方案中，交叉阻断性中和抗体结合与上文所述的抗体结合的表位毗邻和/或重叠的表位。

交叉阻断性抗体可使用本领域任何合适的方法鉴定，例如通过使用竞争性ELISA或BIAcore测定，其中交叉阻断性抗体与人TNF的结合阻止本发明抗体的结合或反之亦然。这样的交叉阻断测定可以使用分离的天然或重组TNF或合适的融合蛋白/多肽。在一个实例中，使用重组人TNF测量结合和交叉阻断。

在一个实施方案中，本发明提供的交叉阻断抗体以大于80％、例如大于85％、例如大于90％、特别是大于95％的抑制性抑制包含以下的抗体的结合：

SEQ ID NO：12给出的重链序列和SEQ ID NO：11给出的轻链序列，

SEQ ID NO：16给出的重链序列和SEQ ID NO：15给出的轻链序列

SEQ ID NO：28给出的重链序列和SEQ ID NO：27给出的轻链序列。

在一个实施方案中，本发明提供的交叉阻断性抗体是完全人的。在一个实施方案中，本发明提供的交叉阻断性抗体是人源化的。在一个实施方案中，本发明提供的交叉阻断性抗体对人TNF具有150pM或更低，130pM或更低或100pM或更低的亲和力。在一个实施方案中，本发明提供的交叉阻断性抗体对人TNF具有50pM或更低的亲和力。可以使用下文所述的方法来测量亲和力。

生物分子如抗体或片段含有酸性和/或碱性官能团，由此给该分子带来净正电荷或负电荷。总的“观察到的”电荷的量将取决于实体的绝对氨基酸序列，3D结构中带电基团的局部环境以及分子的环境条件。等电点(pI)是其中特定分子或其溶剂可接近表面不携带净电荷的pH。在一个实例中，本发明的TNF抗体和片段可以被工程改造以具有合适的等电点。这可能导致具有更稳健性质、特别是合适的溶解度和/或稳定性特征和/或改善的纯化特性的抗体和/或片段。

因此，在一个方面，本发明提供了被工程改造为具有与最初鉴定的抗体的等电点不同的等电点的人源化TNF抗体。例如，抗体可以通过用一个或多个碱性氨基酸残基置换氨基酸残基，例如置换酸性氨基酸残基来工程化。或者，可以引入碱性氨基酸残基或可以去除酸性氨基酸残基。或者，如果分子具有不可接受的高pI值，则可根据需要引入酸性残基以降低pI。重要的是，在操纵pI时必须注意保持抗体或片段的期望活性。因此在一个实施方案中，工程化抗体或片段具有与“未修饰”的抗体或片段相同或基本相同的活性。

诸如**ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html和http://www.iut- arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html的程序可用于预测抗体或片段的等电点。备选地或另外地，可以使用任何合适的标准实验室技术来测量pI。

本发明的抗体分子适合具有高结合亲和力，特别是在纳摩尔范围内的亲和力。亲和力可以使用分离的天然或重组TNF或合适的融合蛋白/多肽利用本领域已知的任何合适的方法测量，包括如本文实施例中所述的BIAcore。在一个实例中，使用重组人TNF测量亲和力。

合适地，本发明的抗体分子对分离的人TNF具有约1nM或更低的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的抗体分子具有约500pM或更低的结合亲和力(即更高的亲和力)。在一个实施方案中，本发明的抗体分子具有约250pM或更低的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的抗体分子具有约200pM或更低的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的抗体分子具有约150pM或更低的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明提供具有约100pM或更低的结合亲和力的抗TNF抗体。在一个实施方案中，本发明提供了具有约100pM或更低的结合亲和力的人源化抗TNF抗体。在一个实施方案中，本发明提供具有50pM或更低的结合亲和力的抗TNF抗体。

本领域普通技术人员使用常规技术可以确定本发明的抗体或结合片段的亲和力以及结合剂(例如抗体)抑制结合的程度，例如由Scatchard等人描述的那些(Ann.KY.Acad.Sci.51：660-672(1949))或通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如BIAcore的系统。对于表面等离子体共振，靶标分子被固定在固相上，并且暴露于沿着流动池流动的流动相中的配体。如果配体与固定靶标发生结合，则局部折射率改变，导致SPR角度的改变，其可以通过检测反射光强度的变化实时监测。可以分析SPR信号的变化速率以产生结合反应的缔合和解离阶段的表观速率常数。这些值的比例给出表观平衡常数(亲和力)(参见例如Wolff等人，Cancer Res.53：2560-65(1993))。

应该理解的是，可以使用本领域已知的任何合适的方法来改变由本发明提供的抗体的亲和力。本发明因此还涉及本发明抗体分子的变体，其具有改善的对TNF的亲和力。这些变体可通过许多亲和力成熟方案获得，包括突变CDR(Yang等人，J.Mol.Biol.,254,392-403,1995)，链改组(Marks等人，Bio/Technology,10,779-783,1992)，使用大肠杆菌的增变菌株(Low等人，J.Mol.Biol.,250,359-368,1996)，DNA改组(Patten等人，Curr.Opin.Biotechnol.,8,724-733,1997)，噬菌体展示(Thompson等人，J.Mol.Biol.,256,77-88,1996)和有性PCR(Crameri等人，Nature,391,288-291,1998)。Vaughan等人(同上)讨论了这些亲和力成熟的方法。

在一个实施方案中，本发明的抗体分子阻断人TNF活性。适合确定抗体阻断TNF的能力的测定法是本领域已知的。

如果需要，用于本发明的抗体可缀合至一种或多种效应分子。将理解效应分子可以包括单个效应分子或连接起来以形成可附着至本发明的抗体的单个部分的两个或更多个这样的分子。当期望获得连接至效应分子的抗体片段时，这可以通过其中抗体片段直接或经由偶联剂连接至效应分子的标准化学或重组DNA方法来制备。用于将这样的效应分子缀合至抗体的技术是本领域熟知的(参见，Hellstrom等人，Controlled Drug Delivery,2nd Ed.,Robinson et al.,eds.,1987,pp.623-53；Thorpe等人，1982,Immunol.Rev.,62:119-58和Dubowchik等人，1999,Pharmacology and Therapeutics,83,67-123)。具体的化学方法包括例如，描述于WO 93/06231,WO 92/22583,WO 89/00195,WO 89/01476和WO03031581中的那些。可选择地，当效应分子是蛋白质或多肽时，连接可使用重组DNA方法来实现，例如如WO 86/01533和EP0392745中所描述的。

本文所用的术语“效应分子”包括例如抗肿瘤剂，药物，毒素，生物活性蛋白例如酶，其它的抗体或抗体片段，合成的或天然存在的聚合物，核酸及其片段例如DNA、RNA及其片段，放射性核素特别是放射性碘化物、放射性同位素，螯合金属，纳米颗粒以及报告基团例如荧光化合物或可通过NMR或ESR光谱来检测的化合物。

效应分子的实例可以包括细胞毒素或细胞毒性剂，包括对细胞有害的任何试剂(例如杀死)。实例包括：环丙沙星类，多拉司他汀类，埃博霉素类，星形孢菌素类，美登木素生物碱类，海绵类毒素，根霉素类，海肾毒素类，杀鼠灵类，半粒杀菌素类，紫杉醇类，细胞松弛素B，短杆菌肽D，溴乙锭，依米丁，丝裂霉素，依托泊苷，tenoposide，长春新碱，长春碱，秋水仙碱，，二羟基炭疽菌素二酮，米托蒽醌，光辉霉素，放线菌素D，1-去氢睾酮，糖皮质激素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。

效应分子还包括但不限于抗代谢物(例如甲氨蝶呤，6-巯基嘌呤，6-硫鸟嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)，烷化剂(例如氮芥，thioepa苯丁酸氮芥，美法仑，卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀CCNU)，环磷酰胺，白消安，二溴甘露糖醇，链脲佐菌素，丝裂霉素C和顺铂-二氯二铂铂(II)(顺铂)顺铂)，蒽环类抗生素(例如柔红霉素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如更生霉素(原放线菌素)，光辉霉素，安曲霉素(AMC)，卡奇霉素或多卡米霉素)和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。

其它效应分子可包括螯合的放射性核素例如¹¹¹In和⁹⁰Y、Lu¹⁷⁷、铋²¹³、锎²⁵²、铱¹⁹²和钨¹⁸⁸/铼¹⁸⁸；或者药物，例如但不限于，烷基磷酸胆碱、拓扑异构酶I抑制剂、紫杉烷类和苏拉明。

其它效应分子包括蛋白质、肽和酶。感兴趣的酶包括但不限于，蛋白水解酶，水解酶，裂解酶，异构酶，转移酶。感兴趣的蛋白质、多肽和肽包括但不限于，免疫球蛋白，毒素例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素，蛋白质例如胰岛素、肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生的生长因子或组织纤维蛋白溶酶原激活物，血栓形成剂或抗血管生成剂例如血管抑素或内皮抑素，或者，生物反应调节剂例如淋巴因子、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、神经生长因子(NGF)或其它生长因子和免疫球蛋白。

其它效应分子可包括可用于例如诊断的可检测物质。可检测物质的实例包括各种酶，辅基，荧光材料，发光材料，生物发光材料，放射性核素，正电子发射金属(用于正电子发射断层摄影术)，以及非放射性顺磁金属离子。对于可缀合至抗体用作诊断剂的金属离子，通常参见美国专利No.4,741,900。合适的酶包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基包括抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白和生物素；合适的荧光材料包括伞形酮，荧光素，异硫氰酸荧光素，若丹明，二氯三嗪基胺荧光素，丹磺酰氯和藻红蛋白；合适的发光材料包括鲁米诺；合适的生物发光材料包括萤光素酶，萤光素和水母发光蛋白；合适的放射性核素包括¹²⁵I,¹³¹I,¹¹¹In和⁹⁹Tc。

在另一实例中，效应分子可增加抗体的体内半衰期，和/或降低抗体的免疫原性和/或增强抗体穿过上皮屏障至免疫系统的递送。这种类型的合适的效应分子的实例包括聚合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物，例如在WO05/117984中所述的那些。

当效应分子是聚合物时，其可通常是合成的或天然存在的聚合物，例如任选取代的直链或支链聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧亚烷基聚合物或分支或不分支的多糖例如同或杂-多糖。

可存在于上述合成聚合物上的具体的任选取代基包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基。

合成聚合物的具体实例包括任选取代的直链或支链聚(乙二醇)、聚(丙二醇)聚(乙烯醇)或其衍生物，特别是任选取代的聚(乙二醇)例如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。

具体的天然存在的聚合物包括乳糖，直链淀粉，葡聚糖，糖原或其衍生物。

在一个实施方案中，聚合物是白蛋白或其片段，如人血清白蛋白或其片段。

如本文所用的“衍生物”旨在包括反应性衍生物，例如巯基选择性反应基团如马来酰亚胺等。反应基团可以直接地或通过接头区段连接至聚合物。将理解，这样的基团的残基将在一些情况下作为抗体片段与聚合物之间的连接基团而形成产物的部分。聚合物的大小可根据需要而不同，但通常将在从500Da至50000Da，例如从5000至40000Da例如从20000至40000Da的平均分子量范围内。聚合物大小可具体地基于产物的预期用途例如定位至某些组织如肿瘤或延长循环半衰期的能力来进行选择(关于综述参见Chapman,2002,AdvancedDrug Delivery Reviews,54,531-545)。因此，例如，当产物旨在离开循环并穿透组织，例如用于肿瘤的治疗时，可有利地使用小分子量聚合物，例如具有约5000Da的分子量。对于其中产物保留在循环中的应用，可有利地使用较高分子量的聚合物，例如具有从20000Da至40000Da的范围内的分子量。

合适的聚合物包括聚亚烷基聚合物例如聚(乙二醇)或特别是甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，并且特别地具有约15000Da至约40000Da范围内的分子量。

在一个实例中，用于本发明的抗体附着至聚(乙二醇)(PEG)部分。在一个具体的实例中，抗体是抗体片段并且可通过位于抗体片段中的任何可用的氨基酸侧链或末端氨基酸官能团，例如任何游离的氨基、亚氨基、巯基、羟基或羧基来附着PEG分子。这样的氨基酸可天然存在于抗体片段中，或者可使用重组DNA方法被工程改造至片段中(参见例如US 5,219,996；US 5,667,425；WO98/25971,WO2008/038024)。在一个实例中，本发明的抗体分子是经修饰的Fab片段，其中所述修饰是一个或多个氨基酸至其重链的C-末端的添加以允许效应分子的附着。适当地，所述额外的氨基酸形成含有一个或多个效应分子可附着于的半胱氨酸残基的经修饰的铰链区。可将多个位点用于连接两个或多个PEG分子。

合适的PEG分子通过位于抗体片段中的至少一个半胱氨酸残基的巯基进行共价连接。附着至经修饰的抗体片段的每个聚合物分子可共价连接至位于该片段中的半胱氨酸残基的硫原子。共价键通常将是二硫键或，特别是硫-碳键。当巯基被用作连接点时，可使用适当活化的效应分子，例如巯基选择性衍生物如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物。活化的聚合物可在如上所述的聚合物修饰的抗体片段的制备中用作起始材料。活化的聚合物可以是含有巯基反应基团(例如α-卤代羧酸或酯例如碘乙酰胺，酰亚胺例如马来酰亚胺，乙烯基砜或二硫化物)的任何聚合物。这样的起始材料可商购获得(例如，从Nektar，前身是ShearwaterPolymers Inc.,Huntsville,AL,USA)，或者可以用常规的化学方法从商购可得的起始材料制备。具体的PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺(可获自Nektar，其前身是Shearwater；RappPolymere；以及SunBio)和M-PEG-SPA(可获自Nektar，其前身是Shearwater)。

在一个实施方案中，抗体是修饰的Fab片段、Fab'片段或diFab，其是PEG化的，即具有共价附着至其的PEG(聚(乙二醇))，例如根据EP 0948544或EP 1090037中公开的方法PEG化(还参见"Poly(ethyleneglycol)Chemistry,Biotechnical and BiomedicalApplications",1992,J.Milton Harris(ed),Plenum Press,New York,"Poly(ethyleneglycol)Chemistry and Biological Applications",1997,J.Milton Harrisand S.Zalipsky(eds),American Chemical Society,Washington DC和"BioconjugationProtein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences",1998,M.Aslam andA.Dent,Grove Publishers,New York；Chapman,A.2002,Advanced Drug DeliveryReviews 2002,54:531-545)。在一个实例中，PEG附着至铰链区中的半胱氨酸。在一个实例中，PEG修饰的Fab片段具有共价连接至经修饰的铰链区中的单个巯基的马来酰亚胺基团。赖氨酸残基可被共价连接至马来酰亚胺基团并且赖氨酸残基上的每个胺基可附着具有约20,000Da的分子量的甲氧基聚(乙二醇)聚合物。因此附着至Fab片段的PEG的总分子量可以是大约40,000Da。

具体的PEG分子包括Ν,Ν'-双(甲氧基聚(乙二醇)MW 20,000)修饰的赖氨酸的2-[3-(N-马来酰亚胺基)丙酰胺基]乙基酰胺，也称为PEG2MAL40K(可获自Nektar，其前身是Shearwater)。

PEG接头的替代来源包括NOF，其供给GL2-400MA3(其中在下述结构中的m是5)和GL2-400MA(其中m是2)并且n是约450：

也就是说每个PEG为约20,000Da。

因此在一个实施方案中，PEG是2,3-双(甲基聚氧乙烯-氧)-1-{[3-(6-马来酰亚胺-1-氧代己基)氨基]丙氧基}己烷(2臂分支PEG，-CH₂)₃NHCO(CH₂)₅-，Mw40,000，称为SUNBRIGHT GL2-400MA3。

其它可选择的PEG效应分子为以下类型：

其可获自Dr Reddy、NOF和Jenkem

在一个实施方案中，提供了PEG化的(例如用本文所述的PEG)抗体，通过在或大致在链中氨基酸232例如重链的氨基酸232(通过连续编号)处的半胱氨酸氨基酸残基进行附着。

在一个实施方案中，本公开内容提供了包含一种或多种PEG聚合物，例如1或2种聚合物如40kDa的聚合物的Fab'PEG分子。

根据本公开内容的Fab'-PEG分子可以是特别有利的，因为它们具有独立于Fc片段的半衰期。在一个实例中，本发明提供治疗通过阻断人TNF而改善的疾病的方法，其包括施用治疗有效量的抗TNF抗体或其结合片段，其中所述抗体或其结合片段具有不依赖于Fc与TNF的结合的半衰期。

在一个实施方案中，提供了与聚合物(例如PEG分子，淀粉分子或白蛋白分子)缀合的Fab'。

在一个实施方案中，提供了与聚合物(例如PEG分子，淀粉分子或白蛋白分子)缀合的scFv。

在一个实施方案中，抗体或片段与淀粉分子缀合，例如以增加半衰期。将淀粉与蛋白质缀合的方法如US 8,017,739中所述，其通过引用并入本文。

本发明还提供了编码本发明抗体分子的重链和/或轻链的分离的DNA序列。合适地，DNA序列编码本发明抗体分子的重链或轻链。本发明的DNA序列可以包含例如通过化学加工产生的合成DNA、cDNA、基因组DNA或其任何组合。

编码本发明抗体分子的DNA序列可以通过本领域技术人员熟知的方法获得。例如，编码部分或全部抗体重链和轻链的DNA序列可根据需要从所测定的DNA序列或基于相应的氨基酸序列合成。

编码受体构架序列的DNA对于本领域技术人员来说是广泛可用的，并且可以基于其已知的氨基酸序列容易地合成。

分子生物学的标准技术可用于制备编码本发明抗体分子的DNA序列。所需的DNA序列可以使用寡核苷酸合成技术完全或部分合成。可酌情使用定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)技术。

本文提供了合适的DNA序列的实例。

SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：17中提供了编码2109gL18轻链可变区的合适DNA序列的实例。

SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：18中提供了编码2109gH2重链可变区的合适DNA序列的实例。

因此，在一个实例中，本发明提供了编码本发明的抗体Fab或Fab'片段的重链的分离的DNA序列，其包含SEQ ID NO：13、17、14或18给出的序列(例如13和14或17和18)。

在一个实例中，本发明提供了编码本发明的IgG4(P)抗体的重链和轻链的分离的DNA序列，其中编码重链的DNA包含SEQ ID NO：13或17给出的序列并且编码轻链的DNA包含SEQ ID NO：14或18给出的序列。

在一个实例中，本发明提供了编码本发明IgG1抗体的重链和轻链的分离的DNA序列，其中编码重链的DNA包含SEQ ID NO：13或17给出的序列和DNA编码轻链包含SEQ ID NO：14或18给出的序列。

在一个实例中，本发明提供了编码本发明的Fab-dsFv抗体的重链和轻链的分离的DNA序列，其中编码重链的DNA包含SEQ ID NO：13或17给出的序列和编码轻链的DNA包含SEQID NO：14或18给出的序列。

本发明还涉及包含本发明的一个或多个DNA序列的克隆或表达载体。因此，提供了包含编码本发明抗体的一个或多个DNA序列的克隆或表达载体。合适地，克隆或表达载体包含分别编码本发明抗体分子的轻链和重链的两个DNA序列和合适的信号序列。在一个实例中，载体包含重链和轻链之间的基因间序列(参见WO03/048208)。

可籍以构建载体的一般方法、转染方法和培养方法是本领域技术人员所熟知的。在这方面，参考“Current Protocols in Molecular Biology”,1999,F.M.Ausubel(ed),Wiley Interscience,New York和Cold Spring Harbor Publishing生产的ManiatisManual。

还提供了包含含有编码本发明的抗体的一种或多种DNA序列的一种或多种克隆或表达载体的宿主细胞。因此，本发明还提供了用于表达根据本发明的抗体的宿主细胞，其包含：

i)编码所述抗体的重链的DNA序列，和

ii)编码所述抗体的轻链的DNA序列

其中所述DNA序列在一种或多种克隆或表达载体中提供。

任何合适的宿主细胞/载体系统可用于编码本发明的抗体分子的DNA序列的表达。可使用细菌例如大肠杆菌以及其它微生物系统(特别是用于表达抗体片段)或者还可使用真核例如哺乳动物的宿主细胞表达系统(特别是用于表达全长抗体)。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO、骨髓瘤或杂交瘤细胞。

用于本发明的合适类型的中国仓鼠卵巢(CHO细胞)可以包括CHO和CHO-K1细胞，包括可以与DHFR选择性标记一起使用的dhfr-CHO细胞，例如CHO-DG44细胞和CHO-DXB11细胞或可以与谷氨酰胺合成酶选择性标记一起使用的CHOK1-SV细胞。用于表达抗体的其他细胞类型包括淋巴细胞系，例如NSO骨髓瘤细胞和SP2细胞，COS细胞。

本发明还提供了用于产生根据本发明的抗体分子的方法，包括在适合于导致从编码本发明的抗体分子的DNA表达蛋白的条件下培养含有本发明的载体的宿主细胞，和分离抗体分子。

抗体分子可以仅包含重链或轻链多肽，在这种情况下，只需要使用重链或轻链多肽编码序列来转染宿主细胞。为了产生包含重链和轻链的产物，可用两种载体转染细胞系，第一载体编码轻链多肽以及第二载体编码重链多肽。可选择地，可以使用单一载体，所述载体包含编码轻链和重链多肽的序列。

根据本公开内容的抗体和片段以高水平从宿主细胞表达。因此抗体和/或片段的特性有利于商业加工。

因此提供了一种方法，其用于培养宿主细胞并表达抗体或其片段，分离后者并任选将其纯化以提供分离的抗体或片段。在一个实施方案中，该方法进一步包括将效应分子缀合至分离的抗体或片段的步骤，例如缀合至PEG聚合物，特别是如本文所述的。

在一个实施方案中，提供了纯化抗体(特别是根据本发明的抗体或片段)的方法，其包括以下步骤：以非结合模式进行阴离子交换色，使得杂质保留在柱上，并且抗体被洗脱。

因此，如果适当的话，色谱步骤可以包括一个或多个洗涤步骤。

纯化过程还可以包括一个或多个过滤步骤，例如渗滤步骤。

因此，在一个实施方案中，提供纯化的抗TNF抗体或片段，例如人源化抗体或片段，特别是根据本发明的抗体或片段，其是基本上纯化的，特别是不含或基本上不含内毒素和/或宿主细胞蛋白质或DNA。

如上文使用的纯化形式旨在表示至少90％纯度，例如91,92,93,94,95,96,97,98,99％w/w或更高纯度。

基本上不含内毒素通常是指每mg抗体产物1EU的内毒素含量或更少，例如每mg产物0.5或0.1EU。

基本上不含宿主细胞蛋白质或DNA通常旨在表示每毫克抗体产物400μg或更少的宿主细胞蛋白质和/或DNA含量，例如100μg/mg或更少，特别是20μg/mg，视情况而定。

本发明的抗体分子也可以用于诊断，例如在涉及TNF的疾病状态的体内诊断和成像中。

因为本发明的抗体可用于病理状况的治疗和/或预防，所以本发明还提供了包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的本发明的抗体分子的药物或诊断组合物。因此，提供了本发明的抗体分子用于制备药剂的用途。

通常将提供组合物作为通常会包括药学上可接受的载体的无菌药物组合物的一部分。本发明的药物组合物可另外包含药学上可接受的赋形剂。

本发明还提供了用于制备药物或诊断组合物的方法，包括将本发明的抗体分子与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体一起添加和混合。

抗体分子可以是药物或诊断组合物中的唯一活性成分，或者可以伴随有其他活性成分，包括其他抗体成分或非抗体成分例如类固醇或其他药物分子，特别是半衰期不依赖于TNF结合的药物分子。

药物组合物适当地包括治疗有效量的本发明的抗体。如本文所用的术语“治疗有效量”是指治疗、改善或预防目标疾病或病况，或表现出可检测的治疗或预防效果所需的治疗剂的量。对于任何抗体，治疗有效量可最初在细胞培养测定中或在动物模型通常为啮齿类动物、兔、狗、猪或灵长类动物中进行评估。动物模型还可用来确定施用的适当浓度范围和途径。这样的信息随后可用于确定在人类中施用的有用剂量和途径。

用于人受试者的精确治疗有效量将取决于疾病状态的严重性，受试者的一般健康，受试者的年龄、体重和性别，饮食，施用的时间和频率，药物组合物，反应敏感性以及对治疗的耐受性/反应性。这个量可以通过常规实验确定并在临床医师的判断范围内。通常，治疗有效量将为0.01mg/kg至500mg/kg，例如0.1mg/kg至200mg/kg，如100mg/Kg。

药物组合物可方便地提供于含有预定量的本发明的活性剂的单位剂量形式中。

根据本公开内容的抗体的治疗剂量在体内显示没有明显的毒理学效应。

组合物可以单独地施用给患者或可以与其它试剂、药物或激素组合施用(例如同时，相继或分开)。

本文使用的药剂是指当施用时具有生理影响的实体。

本文使用的药物是指在治疗剂量下具有适当的生理影响的化学实体。

在一个实施方案中，根据本公开内容的抗体或片段与免疫抑制剂疗法(例如类固醇，特别是泼尼松)一起使用。

在一个实施方案中，根据本公开内容的抗体或片段与利妥昔单抗或其他B细胞疗法一起使用。

在一个实施方案中，根据本公开内容的抗体或片段与任何B细胞或T细胞调节剂或免疫调节剂一起使用。实例包括甲氨蝶呤，微炔醇酯(microphenyolate)和硫唑嘌呤。

施用本发明的抗体分子的剂量取决于待治疗的病症的性质，炎症存在的程度，以及取决于抗体分子是预防性地使用还是用于治疗的现有病况。

给药频率取决于抗体的半衰期，其靶标介导的处置，其作用持续时间和抗药物抗体的存在。如果抗体具有短的半衰期(几小时)或有限的活性，和/或如果希望输送少量药物(例如用于皮下注射)，则可能需要频繁地进行给药，频率为每天一次或更多次。或者，如果抗体半衰期长，活性持续时间长或可大剂量给药(例如通过输注)，则给药可能不频繁，每天一次或每几天、几周或几个月一次。在一个实施方案中，在给药之间允许足够的时间以允许抗药物抗体水平下降。

本文使用的半衰期旨在表示分子在循环中例如在血清/血浆中的持续时间。

如本文所用的药效学是指根据本公开内容的分子的生物学作用的特征谱和特别是持续时间。

药学上可接受的载体本身不应当诱导对接受该组合物的个体有害的抗体的产生并且不应具有毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的高分子例如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物和非活性病毒颗粒。

可使用药学上可接受的盐例如无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，或有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。

治疗组合物中药学上可接受的载体还可包含液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。此外，辅助性物质例如润湿剂或乳化剂或pH缓冲物质可存在于此类组合物中。这样的载体使药物组合物能够配制成片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆剂和悬浮液，用于由患者摄取。

合适的施用形式包括适于肠胃外施用的形式，例如通过注射或输注，例如通过快速浓注或连续输注。当产品用于注射或输注时，其可采取于油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并可含有配制剂例如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。可选择地，抗体分子可以是干燥形式，用于在使用之前与适当的无菌液体重建。

经配制后，本发明的组合物可以直接施用给受试者。待治疗的受试者可以是动物。然而，在一个或多个实施方案中，可使组合物适合于施用给人受试者。

适宜地，在根据本公开内容的制剂中，最终制剂的pH与抗体或片段的等电点的值不相似，例如如果蛋白质的pI在8-9或以上的范围内，那么pH值为7的制剂可能是合适的。不希望受理论束缚，据信这可能最后提供具有改善的稳定性的最终制剂，例如抗体或片段保留在溶液中。

在一个实例中，在4.0至7.0范围内的pH的药物制剂包含：1至200mg/mL根据本公开内容的抗体分子，1至100mM缓冲剂，0.001至1％表面活性剂，a)10至500mM的稳定剂，b)10至500mM的稳定剂和5至500mM的张力剂，或c)5至500mM的张力剂。

本发明的药物组合物可通过任何数量的途径进行施用，包括但不限于，口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、经皮(例如，参见WO98/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道内或直肠途径。无痛皮下喷射器(hypospray)也可用于施用本发明的药物组合物。通常，治疗组合物可以制备成可注射物，如液体溶液或悬浮液。还可制备适合于在注射之前溶于或悬浮于液体媒介物中的固体形式。

组合物的直接递送通常将通过注射皮下地、腹膜内、静脉内或肌肉内地或递送至组织的细胞间隙来实现。还可将组合物施用至损伤中。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。

将理解组合物中的活性成分将是抗体分子。因此，其将易于在胃肠道中降解。因此，如果组合物将通过使用胃肠道的途径施用，则组合物将需要含有保护抗体免于降解但当其被胃肠道吸收后释放抗体的试剂。

药学上可接受的载体的详尽讨论可见于Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company,N.J.1991)。

在一个实施方案中，制剂被提供为用于局部施用(包括吸入)的制剂。

合适的可吸入的制剂包括可吸入粉剂，含有气体推进剂的计量气雾剂或不含气体推进剂的可吸入溶液。根据本公开内容的含有活性物质的可吸入粉剂可仅由上述活性物质或由上述活性物质与生理上可接受的赋形剂的混合物组成。

这些可吸入粉剂可包括单糖(例如葡萄糖或阿拉伯糖)、二糖(例如乳糖，蔗糖，麦芽糖)、寡糖和多糖(例如葡聚糖)，多元醇(例如山梨醇，甘露醇，木糖醇)，盐(例如氯化钠，碳酸钙)或这些彼此的混合物。适宜使用单糖或二糖，特别地但不排他地以其水合物的形式使用乳糖或葡萄糖。

用于在肺中沉积的颗粒需要小于10微米例如1-9微米，例如1至5μm的粒度。活性成分(例如抗体或片段)的粒度具有首要的重要性。

可用于制备可吸入气雾剂的气体推进剂是本领域已知的。合适的气体推进剂选自烃类例如正丙烷、正丁烷或异丁烷以及卤代烃例如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、环丙烷或环丁烷的氯化和/或氟化的衍生物。上述气体推进剂可以独自地或以其混合物使用。

特别合适的气体推进剂是选自TG 11、TG 12、TG 134a和TG227的卤代烷衍生物。在上述卤代烃中，TG134a(1,1,1,2-四氟乙烷)和TG227(1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)及其混合物是特别适合的。

含气体推进剂的可吸入气雾剂还可含有其它成分如共溶剂、稳定剂、表面活性剂(表面活化剂)、抗氧化剂、润滑剂和用于调节pH的装置。所有这些成分是本领域已知的。

根据本发明的含气体推进剂的可吸入气雾剂可含有按重量计高达5％的活性物质。根据本发明的气雾剂含有例如按重量计0.002至5％，按重量计0.01至3％，按重量计0.015％至2％，按重量计0.1至2％，按重量计0.5至2％或按重量计0.5％至1％的活性成分。

可选择地，至肺的局部施用还可以是通过液体溶液或悬浮液制剂的施用，例如采用装置诸如喷雾器，例如连接至压缩器的喷雾器(例如，由Pari Respiratory Equipment,Inc.,Richmond,Va.制造的连接至Pari Master(R)压缩器的Pari LC-Jet Plus(R)喷雾器)。

本发明的抗体可分散在溶剂中，例如以溶液或悬浮液的形式进行递送。所述抗体可悬浮于适当的生理溶液中，例如盐水或其他药学上可接受的溶剂或缓冲溶液。本领域中已知的缓冲溶液的实例可含有每1ml水中0.05mg至0.15mg依地酸二钠、8.0mg至9.0mg氯化钠、0.15mg至0.25mg聚山梨醇酯、0.25mg至0.30mg无水柠檬酸、以及0.45mg至0.55mg柠檬酸钠以获得约4.0至5.0的pH。悬浮液可使用例如冻干抗体。

治疗性悬浮液或溶液制剂还可包含一种或多种赋形剂。赋形剂是本领域熟知的，并且包括缓冲剂(例如，柠檬酸盐缓冲剂，磷酸盐缓冲剂，乙酸盐缓冲剂和碳酸氢盐缓冲剂)、氨基酸、尿素、醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白(例如，血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露醇、山梨醇和甘油。溶液或悬浮液可以封装在脂质体或可生物降解的微球体中。制剂通常将采用无菌制造工艺以基本上无菌的形式来提供。

这可包括产生和过滤灭菌用于所述制剂的缓冲溶剂溶液，在无菌缓冲溶剂溶液中无菌悬浮抗体，和通过本领域技术人员熟悉的方法将制剂分配到无菌容器中。

根据本公开内容的可喷雾制剂可以例如提供为包装在箔膜中的单个剂量单位(例如，密封的塑料容器或小瓶)。每个小瓶含有一定体积例如2ml的溶剂/溶液缓冲液中的单位剂量。

本文公开的抗体可以是适合于通过喷雾输送。还可预见的是，本发明的抗体可以通过使用基因疗法来施用。为了实现此，将在适当的DNA元件控制下编码抗体分子的重链和轻链的DNA序列引入到患者，以使得抗体链从所述DNA序列表达并在原位装配。

TNFα是TNF超家族的原型成员。TNFα是介导免疫调节和炎症反应的多效细胞因子。在体内，已知TNFα参与对细菌、寄生虫和病毒感染的应答。具体而言，已知TNFα在类风湿性关节炎(RA)，炎症性肠病(包括克罗恩氏病)，牛皮癣，阿尔茨海默病(AD)，帕金森病(PD)，疼痛，癫痫，骨质疏松症，哮喘，脓毒症，发热，系统性红斑狼疮(SLE)和多发性硬化症(MS)和癌症中起作用。也已知TNFα在肌萎缩侧索硬化(ALS)，缺血性中风，免疫复合物介导的肾小球肾炎，狼疮性肾炎(LN)，抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA-)相关肾小球肾炎，微小病变，糖尿病性肾病(DN)，急性肾损伤(AKI)，梗阻性尿路病，肾同种异体移植排斥，顺铂诱导的AKI和梗阻性尿路疾病中起作用。

因此，本发明的抗体或组合物可以(直接或间接)用于治疗、预防或改善任何可以被其他TNFα拮抗剂治疗、预防或改善的病症。

本发明的抗体和组合物因此有益于治疗和/或预防各种人类疾病。这些包括自身免疫和炎症性疾病；神经病症和神经退行性疾病；疼痛和伤害性疾病；和心血管疾病。

炎性和自身免疫性疾病包括全身性自身免疫性疾病，自身免疫性内分泌疾病和器官特异性自身免疫性疾病。系统性自身免疫病症包括系统性红斑狼疮(SLE)，牛皮癣，血管炎，多肌炎，硬皮病，多发性硬化症，强直性脊柱炎，类风湿性关节炎和舍格伦综合征。自身免疫性内分泌疾病包括甲状腺炎。器官特异性自身免疫性疾病包括艾迪生病，溶血性或恶性贫血，肾小球性肾炎(包括古德帕斯彻氏综合征)，格雷夫斯病，特发性血小板减少性紫癜，胰岛素依赖性糖尿病，青少年糖尿病，葡萄膜炎，炎性肠病(包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)，天疱疮，特应性皮炎，自身免疫性肝炎，原发性胆汁性肝硬化，自身免疫性肺炎，自身免疫性心脏炎，重症肌无力，自发性不育，骨质疏松症，哮喘和肌营养不良(包括杜氏肌营养不良)。

神经和神经退行性疾病包括阿尔茨海默病，帕金森病，亨廷顿舞蹈病，中风，肌萎缩性侧索硬化，脊髓损伤，头部创伤，癫痫发作和癫痫。

心血管疾病包括血栓形成，心脏肥大，高血压，心脏不规则收缩(例如心力衰竭期间)和性功能障碍(包括勃起功能障碍和女性性功能障碍)。

具体而言，本发明的组合物的抗体可用于治疗或预防炎性病症，CNS病症，免疫病症和自身免疫性疾病，疼痛，骨质疏松症，发热和器官移植排斥。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或组合物可用于治疗或预防类风湿性关节炎，炎性肠病(包括克罗恩氏病)，牛皮癣，阿尔茨海默病，帕金森病，癫痫，哮喘，脓毒病，系统性红斑狼疮，多发性硬化症，哮喘，鼻炎，癌症和骨质疏松症。在另一个优选的实施方案中，本发明的抗体或组合物可用于治疗或预防类风湿性关节炎(RA)，非特异性炎性关节炎，糜烂性骨疾病，软骨炎，软骨退化和/或破坏，幼年炎性关节炎，斯蒂尔病(幼年和/或成人发作)，幼年特发性关节炎，少年特发性关节炎(少关节和多关节形式)，炎症性肠病(包括克罗恩病，溃疡性结肠炎，不确定结肠炎，囊袋炎)，牛皮癣，银屑病性关节炎，强直性脊柱炎，舍格伦氏病，阿尔茨海默氏病(AD)，白塞病，帕金森病(PD)，肌萎缩侧索硬化症(ALS)，缺血性中风，疼痛，癫痫，骨质疏松症，骨质缺乏，慢性病贫血，恶病质，糖尿病，血脂异常，代谢综合征，哮喘，慢性阻塞呼吸道(或肺)疾病，败血症，发热，呼吸窘迫综合征，系统性红斑狼疮(SLE)，多发性硬化(MS)免疫复合物介导的肾小球性肾炎，狼疮性肾炎(LN)，抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA-)相关肾小球肾炎，微小病变，糖尿病性肾病(DN)，急性肾损伤(AKI)，梗阻性尿路病，肾同种异体移植排斥，顺铂诱导的AKI和梗阻性尿路疾病，眼病(包括糖尿病性视网膜病，糖尿病性黄斑水肿，早产儿视网膜病，年龄相关性黄斑变性，黄斑水肿，增生性和/或非增殖性视网膜病，角膜血管化包括新血管形成，视网膜静脉阻塞，各种形式的葡萄膜炎和角膜炎)，甲状腺炎，纤维化疾病包括各种形式的肝纤维化，各种形式的肺纤维化，系统性硬化症，硬皮病，癌症和癌症相关的并发症(包括骨骼并发症，恶病质和贫血)。

根据本公开内容的抗体和片段可以用于治疗或预防。

本发明还提供了降低个体中不需要的抗体浓度的方法，包括向个体施用治疗有效剂量的本文所述的抗TNF抗体或其结合片段的步骤。

本发明进一步提供了根据本发明的抗体分子在制备用于治疗和/或预防本文所述的病理性病症例如自身免疫性疾病的药物中的用途。

在一个实施方案中，本公开内容包括抗体或其片段作为用于诊断的试剂(例如缀合至报道分子)的用途。因此提供了被标记的根据本公开内容的抗体或片段。在一个方面，提供了包含根据本公开内容的抗体或片段的柱子。

在本说明书的上下文中的“包含”旨在意指“包括”。

在技术上合适时，本发明的实施方案可以被组合。

本文将实施方案描述为包括某些特征/元件。本公开内容还延伸到由所述特征/元件组成或基本上由其组成的单独实施方案。

技术参考文献诸如专利和申请均通过引用并入本文。

仅通过举例说明的方式在以下参照附图的实施例中进一步描述本发明，其中：

实施例

实施例1：分离中和性抗人TNF-α可变区：

进行以下免疫接种以产生用于B细胞培养和抗体筛选的材料：

用与小分子苯并咪唑化合物(化合物1)(如WO2013/186229和PCT/EP2015/074527中所述)预先络合的人TNF-α免疫的3次注射免疫5只Sprague Dawley大鼠。产生血清并在ELISA中测试与人TNF-α的结合。滴度在超过100,000稀释度的范围内是可测量的，因此被认为对于B细胞培养是可以接受的。

B细胞培养物使用类似于Zubler等人(1985)和Lightwood等人(2013)描述的方法制备。简而言之，将含有B细胞的脾细胞以每孔约5000个细胞的密度在条形码化的96孔组织培养板中用200μl/孔RPMI 1640培养基(Gibco BRL)(补充有10％FCS(PAA laboratoriesltd)，2％HEPES(Sigma Aldrich)，1％L-谷氨酰胺(Gibco BRL)，1％青霉素/链霉素溶液(Gibco BRL)，0.1％β-巯基乙醇(Gibco BRL)，2-5％活化的脾细胞培养物上清液和γ辐射的鼠胸腺瘤细胞(5x10⁴/孔))在37℃，5％CO₂的环境中培养7天。该项目期间筛选了超过7000万个B细胞。

B细胞培养上清液中人TNF特异性抗体的存在使用基于均匀荧光的结合测定来确定，所述测定使用涂布有生物素化的人TNF作为靶抗原来源的10微米超级抗生物素蛋白(superavidin)聚合物珠(Bangs laboratories)。使用Matrix Platemate液体处理器将10ul上清液从条形码化的96-孔组织培养板转移到含有5000个涂覆的珠子的条形码化的384-孔黑壁测定板中。用山羊抗大鼠或小鼠IgG Fcγ特异性Cy-5缀合物(Jackson)显示结合。在Applied Biosystems 8200细胞检测系统上读板。

或者，使用ELISA分析来鉴定阳性孔。用2μg/ml TNF包被384孔ELISA板，然后将10ul B细胞培养物上清液加入到经封闭的板中。孵育1小时后，洗涤平板并用山羊抗大鼠Fc-特异性HRP缀合物(Jackson)显示结合。

初次筛选后，使用Aviso Onyx命中挑选机器人将阳性上清液汇总到96孔的条形码化的主平板上，将细胞培养板中的B细胞冷冻在-80℃。然后在Biacore测定中筛选主平板以鉴定含有高亲和力抗体的孔。

为了鉴定能够中和TNFα的生物学活性的抗体，我们使用主平板中的B细胞培养物上清液进行了基于细胞的TNFα报道测定。该测定使用HEK-293-CD40-BLUE细胞(Invivogen)，所述HEK-293-CD40-BLUE细胞被工程化以响应通过NFκB途径操作的许多刺激(包括人TNFα)而分泌碱性磷酸酶。在该测定中，以1:2.5的单一稀释度直接使用含有抗体的上清液。选择含有高亲和性阻断性抗体(在Biacore中低于100pM且在报道分析中显示>90％抑制)的孔用于进一步分析。

为了允许从感兴趣的孔中获得抗体可变区基因，需要进行去卷积步骤，以便能够鉴定含有异质B细胞群的给定孔中的抗原特异性B细胞。这是使用荧光焦点法实现的。简而言之，将来自阳性孔的免疫球蛋白分泌性B细胞与包被有生物素化人TNF和山羊抗大鼠Fcγ片段特异性FITC缀合物(Jackson)的1：1200最终稀释液的链霉抗生物素蛋白珠(NewEngland Biolabs)混合。在37℃静置孵育1小时后，由于B细胞周围存在荧光晕，可以鉴定抗原特异性B细胞。然后用Eppendorf显微操纵器挑取使用Olympus显微镜鉴定的这些单个B细胞，并将其放入PCR管中。

使用重链和轻链可变区特异性引物通过逆转录(RT)-PCR从单细胞中回收已知为2102、2101、2109和2111的四种不同抗体的抗体可变区基因。在Aviso Onyx液体处理机器人上进行两轮PCR，其中嵌套2°PCR在3'和5'末端引入限制性位点，允许将大鼠可变区克隆到小鼠γ1IgG或Fab(VH)或小鼠κ(VL)哺乳动物表达载体中。使用Fectin 293(Invitrogen)将重链和轻链构建体共转染到HEK-293细胞中，并以1ml体积在48孔板中表达重组抗体。表达5-7天后，收集上清液并对抗体进行进一步筛选。

在HEK-293-CD40-BLUE报告基因测定中以多种浓度筛选重组大鼠/小鼠嵌合IgG和Fab分子，以计算EC50值并确定最大百分比抑制。测试Fab片段以确保抗体在单价时具有活性。还在Biacore实验中分析IgG以确定对人TNF的结合亲和力。Biacore实验的测定形式是通过固定的抗小鼠IgG-Fc捕获小鼠IgG，然后在捕获的表面上滴定人TNF。BIA(Biamolecular Interaction Analysis)使用Biacore T200(GE Healthcare)进行。Affinipure F(ab')2片段山羊抗小鼠IgG，Fc片段特异性(Affinipure F(ab')2 Fragmentgoat anti-human IgG-F(ab')2 fragment specific，Jackson ImmunoResearch)通过胺偶联化学固定在CM5传感器芯片上至约5000个响应单位(RU)的水平。使用HBS-EP缓冲液(10mMHEPES pH 7.4,0.15M NaCl，3mM EDTA，0.05％表面活性剂P20，GE Healthcare)作为运行缓冲液，流速为10μL/分钟。0.5μg/mL的小鼠IgG的10μL注射液用于通过固定的抗小鼠IgG-Fc进行的捕获。人TNF以20nM以30μL/min的流速注射到捕获的小鼠IgG上两次。表面通过40mMHCl的2×10μL注射液再生，通过5mM NaOH的5μL注射液以10μL/min的流速散布。按照标准程序使用T200评估软件(版本1.0)分析扣除背景的结合曲线。

表4：

使用HEK-293-CD40-BLUE报道测定(Invivogen)测定中和。显示EC50和中和％。进行Biacore分析以确定结合动力学。显示了缔合速率(ka)、解离速率(kd)和亲和常数(KD)。

图2显示了CA2109大鼠/小鼠Fab(fwk18FAB)IgG1(fwk18IgG)的滴定曲线。如上所述使用HEK-293-CD40-BLUE报道测定(Invivogen)测定数据。

如以下表4a所示，将如上所述分离的所有四种抗体(2101、2109、2111和2102)就对于人TNF(hTNF)和食蟹猴TNF(cTNF)的食蟹猴和人TNF交叉反应性筛选为大鼠/人嵌合Fab。

Biacore实验的测定形式是通过固定的抗人F(ab')捕获大鼠/人嵌合Fab，然后在捕获的表面上滴定人或食蟹猴TNF。BIA(Biamolecular Interaction Analysis)使用Biacore T200(GE Healthcare)进行。通过胺偶联化学将Affinipure F(ab')2片段山羊抗人IgG-F(ab')2片段特异性(Jackson ImmunoResearch)固定在CM5传感器芯片上至约5000个响应单位(RU)的水平。使用HBS-EP缓冲液(10mM HEPES pH 7.4,0.15M NaCl，3mM EDTA，0.05％表面活性剂P20，GE Healthcare)作为运行缓冲液，流速为10μL/分钟。用固定化的人IgG-F(ab')2将0.5μg/mL的大鼠/人嵌合体的10μL注射液用于捕获。将人或食蟹猴TNF以30μL/min的流速分别注射到捕获的大鼠/人嵌合Fab上(分别为5nM或3.125nM)。表面通过50mMHCl的2×10μL注射液再生，通过5mM NaOH的5μL注射液以10μL/min的流速散布。按照标准程序使用T200评估软件(版本1.0)分析扣除背景的结合曲线。

表4a

发现抗体2102对食蟹猴TNF具有低得多的亲和力。该抗体还在人源化过程中丧失亲和力，因此没有进一步研究。

基于这项工作，由于其食蟹猴/人交叉反应性(表4a)、高亲和力(表4)和有效的中和活性(图2和表4)，CA2109被选为主要的候选物。基于这些性质选择该抗体用于人源化。

选择具有相似亲和力和中和特性的两种其它抗体与CA2109平行进行人源化，这些是2101和2111。然而，2101在人源化后不能保持对TNF的亲和力，因此该抗体不再进一步研究。将抗体2109和抗体2111都成功人源化，然后转化为scFv形式并在L929TNF抑制测定(下文描述的测定)中筛选以确认中和活性(表5)。

表5

L929细胞系是一种对TNF-α的细胞毒性作用敏感的鼠纤维肉瘤细胞系。TNF通过结合人、食蟹猴或鼠TNF-α的TNF受体刺激以诱导细胞凋亡。细胞用增加TNF-α杀伤的敏感性的放线菌素D共同处理。通过荧光素酶反应(CellTiter-Glo，Promega)通过检测ATP水平(其随着生存力降低而降低)来确定用放线菌素-D/TNF-α和每种抗TNF抗体处理后的L929细胞的活力。

在预孵育1小时后，在384孔平底板中在最终体积为30μl的每种抗体或对照化合物存在下用2.35μg/ml放线菌素D和100pg/ml人TNFα处理L929细胞。在37℃、5％CO2下24小时后，通过CellTiter-Glo(Promega Ltd)测量细胞活力。

从表5中可以看出，抗体2111在该测定中在重-轻(HL)或轻-重(LH)取向中不保留作为scFv的活性(与人源化Fab相比)。只有抗体2109保留食蟹猴-人交叉反应性、高亲和力和中和能力以及作为人源化scFv的热稳定性。下文更详细地描述了抗体CA2109的人源化。

实施例2：抗TNF-α抗体CA2109的人源化

通过将互补决定区(CDR)移植到人种系构架上来将抗体CA2109人源化。大鼠抗体(供体)序列与人种系(受体)构架的比对与设计的人源化序列一起显示在图3和4中。

选择的轻链种系受体序列是人VK1 2-1(U)A20V区加JK2J区(V BASE，http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)。选择的重链种系受体序列是人VH3 1-3 3-21V区加JH4J区(VBASE，http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)。从供体移植到受体序列的CDR如Kabat(Kabat等人，1987)所定义，除了使用组合的Chothia/Kabat定义的CDR-H1以外。

编码初始V区序列的基因是由Entelechon GmbH通过自动合成方法设计和构建的，并且通过寡核苷酸定向诱变修饰以产生经移植形式gL1、gL18、gH1和gH2。将gL18基因序列亚克隆到含有编码人C-κ恒定区(Km3同种异型)的DNA的UCB Celltech人轻链表达载体pMhCK delta中。将gH2序列亚克隆到含有编码人重链γ-1CH1恒定区的DNA的UCB Celltech表达载体pMhg1Fab中。

为了保持完整的活性并保持高热稳定性，人源化重链的48位(异亮氨酸)、49位(甘氨酸)、71位(缬氨酸)、73位(赖氨酸)、78位(丙氨酸)和93位(苏氨酸)(Kabat编号)的供体残基被保留。类似地，保留人源化轻链的65位(苏氨酸)、71位(酪氨酸)和87位(苯丙氨酸)(Kabat编号)处的供体残基。另外，通过将位置31、50和52处的天冬酰胺残基分别突变为丝氨酸、天冬氨酸和丝氨酸，从而去除轻链中的3个脱酰胺位点。图1、3和4、SEQ ID NO：11和12中显示了最终选择的可变移植序列gL18和gH2。

如以上实施例1中所述，仅抗体2109保留食蟹猴-人交叉反应性、高亲和力和中和能力以及作为人源化scFv的热稳定性。抗体2109在包括IgG、Fab和scFv的多种抗体形式中具有相同活性的能力使其成为有用的多功能抗体，其可以单独用作单特异性抗体或掺入多特异性抗体形式中。

序列表

<110> UCB生物制药私人有限公司

<120> 结合TNFα的抗体分子

<130> PF0057_WO

<150> GB1522394.4

<151> 2015-12-18

<160> 37

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体2109的CDR序列 - CDRH1

<400> 1

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn Tyr Ile His

1 5 10

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体2109的CDR序列 - CDRH2

<400> 2

Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Ala His Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Thr

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体2109的CDR序列 - CDRH3

<400> 3

Arg Tyr Tyr Ser Ala Met Pro Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体2109的CDR序列 - CDRL1

<400> 4

Arg Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly Leu Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体2109的CDR序列 - CDRL1

<400> 5

Arg Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Gly Leu Ala

1 5 10

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体2109的CDR序列 - CDRL2

<400> 6

Asp Ser Ser Thr Leu His Thr

1 5

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体2109的CDR序列 - CDRL2

<400> 7

Asn Ser Asn Thr Leu His Thr

1 5

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体2109的CDR序列 - CDRL2

<400> 8

Asn Ser Ser Thr Leu His Thr

1 5

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体2109的CDR序列 - CDRL2

<400> 9

Asp Ser Asn Thr Leu His Thr

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体2109的CDR序列 - CDRL3

<400> 10

Gln Gln Asn Tyr Asp Phe Pro Leu Thr

1 5

<210> 11

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体2109 gL18的轻链可变区

<400> 11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ser Ser Thr Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Thr Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asn Tyr Asp Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr

100 105

<210> 12

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体2109 gH2的重链可变区

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Ala His Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Arg Tyr Tyr Ser Ala Met Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 13

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码抗体2109 gL18的轻链可变区的DNA

<400> 13

gatatacaga tgacccaatc accaagctct ctgagtgctt ccgttggcga tcgcgttaca 60

attacctgcc gagctagcga ggatatatac tcaggactgg cctggtacca gcaaaagcct 120

ggcaaagtgc ctaagctcct gatctacgac tccagtaccc tgcacactgg tgtgccaagc 180

cgctttagcg gaactggatc tggaaccgac tatacactga cgatttcctc actgcaaccg 240

gaagacgtgg caacctactt ctgtcagcaa aactacgact tccccttgac gtttgggcaa 300

gggacaaagc tggagatcaa acgtacc 327

<210> 14

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码抗体2109 gH2的重链可变区的DNA

<400> 14

gaagttcaac tggtcgaaag cggaggtggg ctcgtgaaac ctggcggatc tctgcgattg 60

tcatgtgctg caagcggcta cacgtttacc gataactata tccactgggt gcgacaagca 120

ccagggaagg gactggaatg gattggatat attaacccga gctccgccta cgcacactac 180

aacgagaaat tcaagacccg attcaccatc tccgtggaca aagccaagaa ctccgcttac 240

ctgcaaatga actctctgcg ggccgaagac actgccgtgt attactgcac ccgccgatac 300

tatagcgcta tgccctttgc ctactgggga caagggacac tggtcactgt ctcaagt 357

<210> 15

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体2109 gL18的轻链可变区

<400> 15

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ser Ser Thr Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Thr Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asn Tyr Asp Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr

100 105

<210> 16

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体2109 gH2的重链可变区

<400> 16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Ala His Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Arg Tyr Tyr Ser Ala Met Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 17

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码抗体2109 gL18的轻链可变区的DNA

<400> 17

gatatccaga tgacccagtc gccgtccagc ctctccgcct ccgtgggaga cagagtgacg 60

atcacttgca gagcatcaga ggacatctac tctggccttg cttggtatca gcagaagccg 120

ggaaaggtgc ccaaactgct catctatgac tcctcgaccc tccacacggg agtgccatcg 180

cgcttcagcg ggaccggatc tgggaccgac tacaccctga ccatttcatc gctccagccg 240

gaggatgttg ccacttactt ctgccaacag aattacgact tcccacttac ttttggatgt 300

ggcactaagc tcgaaatcaa gcgcacc 327

<210> 18

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码抗体2109 gH2的重链可变区的DNA

<400> 18

gaagtgcagt tggtggagtc ggggggaggg ttggtgaagc caggaggatc attgcggttg 60

tcatgtgcgg cttcgggcta cactttcact gacaattaca ttcactgggt gcgacaagca 120

ccagggaagt gcctcgaatg gattggctac atcaacccgt caagcgcata cgcccattac 180

aacgaaaagt tcaagacccg gttcaccatc tccgtggata aggcgaaaaa cagcgcgtac 240

cttcagatga actccctgcg ggccgaggat accgccgttt actactgcac tagacggtac 300

tacagcgcca tgccgttcgc gtactgggga caaggcactc tggtcaccgt gtcgtcg 357

<210> 19

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体2109 gH2gL18的scFv (VH-VL)

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Ala His Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Arg Tyr Tyr Ser Ala Met Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr

130 135 140

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

145 150 155 160

Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly Leu Ala Trp Tyr Gln

165 170 175

Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ser Ser Thr

180 185 190

Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Thr Gly Ser Gly Thr

195 200 205

Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr

210 215 220

Tyr Phe Cys Gln Gln Asn Tyr Asp Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr

245

<210> 20

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码抗体2109 gH2gL18的scFv (VH-VL)的DNA

<400> 20

gaagttcaac tggtcgaaag cggaggtggg ctcgtgaaac ctggcggatc tctgcgattg 60

tcatgtgctg caagcggcta cacgtttacc gataactata tccactgggt gcgacaagca 120

ccagggaagg gactggaatg gattggatat attaacccga gctccgccta cgcacactac 180

aacgagaaat tcaagacccg attcaccatc tccgtggaca aagccaagaa ctccgcttac 240

ctgcaaatga actctctgcg ggccgaagac actgccgtgt attactgcac ccgccgatac 300

tatagcgcta tgccctttgc ctactgggga caagggacac tggtcactgt ctcaagtgga 360

ggtggcggtt ctggcggtgg cggttccggt ggcggtggat cgggaggtgg cggttctgat 420

atacagatga cccaatcacc aagctctctg agtgcttccg ttggcgatcg cgttacaatt 480

acctgccgag ctagcgagga tatatactca ggactggcct ggtaccagca aaagcctggc 540

aaagtgccta agctcctgat ctacgactcc agtaccctgc acactggtgt gccaagccgc 600

tttagcggaa ctggatctgg aaccgactat acactgacga tttcctcact gcaaccggaa 660

gacgtggcaa cctacttctg tcagcaaaac tacgacttcc ccttgacgtt tgggcaaggg 720

acaaagctgg agatcaaacg tacc 744

<210> 21

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体2109 gH2gL18的dsscFv (VH-VL)

<400> 21

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Ala His Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Arg Tyr Tyr Ser Ala Met Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr

130 135 140

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

145 150 155 160

Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly Leu Ala Trp Tyr Gln

165 170 175

Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ser Ser Thr

180 185 190

Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Thr Gly Ser Gly Thr

195 200 205

Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr

210 215 220

Tyr Phe Cys Gln Gln Asn Tyr Asp Phe Pro Leu Thr Phe Gly Cys Gly

225 230 235 240

Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr

245

<210> 22

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码抗体2109 gH2gL18的dsscFv (VH-VL)的DNA

<400> 22

gaagtgcagt tggtggagtc ggggggaggg ttggtgaagc caggaggatc attgcggttg 60

tcatgtgcgg cttcgggcta cactttcact gacaattaca ttcactgggt gcgacaagca 120

ccagggaagt gcctcgaatg gattggctac atcaacccgt caagcgcata cgcccattac 180

aacgaaaagt tcaagacccg gttcaccatc tccgtggata aggcgaaaaa cagcgcgtac 240

cttcagatga actccctgcg ggccgaggat accgccgttt actactgcac tagacggtac 300

tacagcgcca tgccgttcgc gtactgggga caaggcactc tggtcaccgt gtcgtcggga 360

ggaggaggct cgggtggagg cggatcgggt ggcggaggga gcggcggagg cggttcggat 420

atccagatga cccagtcgcc gtccagcctc tccgcctccg tgggagacag agtgacgatc 480

acttgcagag catcagagga catctactct ggccttgctt ggtatcagca gaagccggga 540

aaggtgccca aactgctcat ctatgactcc tcgaccctcc acacgggagt gccatcgcgc 600

ttcagcggga ccggatctgg gaccgactac accctgacca tttcatcgct ccagccggag 660

gatgttgcca cttacttctg ccaacagaat tacgacttcc cacttacttt tggatgtggc 720

actaagctcg aaatcaagcg cacc 744

<210> 23

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 大鼠抗体2109的轻链可变区

<400> 23

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Glu Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Gly

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro His Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Ser Asn Thr Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Thr Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asn Tyr Asp Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 24

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 大鼠抗体2109的重链可变区

<400> 24

Glu Val Gln Leu His Gln Ser Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Ala His Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Thr Arg Arg Tyr Tyr Ser Ala Met Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 25

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人VK1 2-1(U) A20 JK2受体构架

<400> 25

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 26

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人VH3 1-3 3-21 JH4受体构架

<400> 26

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Thr Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 27

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体2109 gL1的轻链可变区

<400> 27

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Gly

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Ser Asn Thr Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Thr Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asn Tyr Asp Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 28

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体2109 gH1的重链可变区

<400> 28

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Ala His Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Arg Tyr Tyr Ser Ala Met Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 29

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体2109 gL18的轻链可变区

<400> 29

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ser Ser Thr Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Thr Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asn Tyr Asp Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 30

<211> 324

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠重链g1恒定区

<400> 30

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro

100 105 110

Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu

115 120 125

Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser

130 135 140

Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu

145 150 155 160

Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

165 170 175

Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn

180 185 190

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro

195 200 205

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln

210 215 220

Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val

225 230 235 240

Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val

245 250 255

Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln

260 265 270

Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn

275 280 285

Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val

290 295 300

Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His

305 310 315 320

Ser Pro Gly Lys

<210> 31

<211> 102

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠重链g1 Fab无铰链恒定区

<400> 31

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Val Pro Arg Asp Cys

100

<210> 32

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠轻链恒定区

<400> 32

Arg Thr Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg

35 40 45

Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu

65 70 75 80

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100 105

<210> 33

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链恒定区

<400> 33

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 34

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链γ1 Fab CH1无铰链恒定区

<400> 34

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

100

<210> 35

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链γ1全长恒定区

<400> 35

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 36

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链γ4全长恒定区

<400> 36

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 37

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链γ4P全长恒定区

<400> 37

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

Claims (23)

1.一种抗TNF抗体或其抗原结合片段，其包含具有可变区的重链或重链片段，其中所述可变区包含三个CDR，其中CDR H1是SEQ ID NO：1给出的序列，CDR H2是SEQ ID NO：2给出的序列，和CDR H3是SEQ ID NO：3给出的序列，

其中所述抗体或其抗原结合片段还包含具有包含三个CDR的可变区的轻链或其片段，其中CDR L1是SEQ ID NO：4给出的序列，CDR L2是SEQ ID NO：6给出的序列，和CDR L3是SEQID NO：10给出的序列。

2.权利要求1的抗TNF抗体或其抗原结合片段，其具有包含SEQ ID NO：12给出的重链可变区的重链并且具有包含SEQ ID NO：11给出的轻链可变区的轻链、具有包含SEQ ID NO：16给出的重链可变区的重链并且具有包含SEQ ID NO：15给出的轻链可变区的轻链或具有包含SEQ ID NO：28给出的重链可变区的重链并且具有包含SEQ ID NO：27给出的轻链可变区的轻链。

3.权利要求1的抗TNF抗体或其抗原结合片段，其具有包含SEQ ID NO：12给出的重链可变区的重链和包含SEQ ID NO：11给出的轻链可变区的轻链。

4.权利要求1的抗TNF抗体或其抗原结合片段，其具有包含SEQ ID NO：16给出的重链可变区的重链和包含SEQ ID NO：15给出的轻链可变区的轻链。

5.权利要求1的抗TNF抗体或其抗原结合片段，其具有包含SEQ ID NO：28给出的重链可变区的重链和包含SEQ ID NO：27给出的轻链可变区的轻链。

6.权利要求1或权利要求2的抗TNF抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人源化的。

7.权利要求1的抗TNF抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是scFv、dsscFv、Fv、Fab、Fab'、Fab-Fv或Fab-dsFv片段。

8.权利要求1的抗TNF抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与选自淀粉、白蛋白和聚乙二醇的聚合物缀合。

9.权利要求8的抗TNF抗体或其抗原结合片段，其中所述聚合物是具有5-50kDa范围内的分子量的PEG。

10.权利要求1的抗TNF抗体，其中所述抗体是全长抗体。

11.权利要求10的抗TNF抗体，其中所述全长抗体选自IgG1，IgG4和IgG4P。

12.权利要求1的抗TNF抗体或其抗原结合片段，其是人源化的。

13.权利要求1的抗TNF抗体或其抗原结合片段，其对人TNF具有150pM或更高的结合亲和力。

14.一种分离的DNA，其编码权利要求1至13中任一项的抗体的重链和轻链。

15.一种克隆或表达载体，其包含一种或多种根据权利要求14的DNA序列。

16.权利要求15的载体，其中所述载体包含(i)SEQ ID NO：17、18和/或22给出的序列。

17.一种宿主细胞，其包含一种或多种根据权利要求15或权利要求16的克隆或表达载体。

18.产生对人TNF具有结合特异性的抗体的方法，包括培养权利要求17的宿主细胞并分离抗体。

19.一种药物组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的权利要求1至13中任一项所定义的抗TNF抗体或其抗原结合片段。

20.权利要求19的药物组合物，其包含其他活性成分。

21.权利要求1至13中任一项所定义的抗体或其抗原结合片段或权利要求19或20所定义的组合物，其用于治疗。

22.权利要求1至13中任一项所定义的抗体或其抗原结合片段或权利要求19或20所定义的组合物在制备用于治疗以下疾病中的一种或多种的药物中的用途：自身免疫性和炎症性病症；神经病症和神经退行性病症；疼痛和伤害性病症；和心血管病症。

23.权利要求1至13中任一项所定义的抗体或其抗原结合片段或权利要求19或20所定义的组合物在制备用于治疗以下疾病中的一种或多种的药物中的用途：类风湿性关节炎，克罗恩氏病，银屑病，系统性红斑狼疮，阿尔茨海默病，帕金森病和癫痫。

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