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JP2018509385A - がんの処置および検出のための組成物および方法 - Google Patents

がんの処置および検出のための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

本明細書では、ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ３、およびＳＳＥＡ−４に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物、ならびにその使用方法も開示される。使用方法は、限定せずに述べると、がんの治療および診断法を含む。本開示の抗体は、ある特定のがん細胞表面に結合しうる。本明細書で開示される抗体の例示的な標的は、脳がん、皮膚がん、骨がん、肺がん、乳がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆管がん、膵臓がん、結腸がん、腎臓がん、子宮頸がん、卵巣がん、および／または前立腺がん内の癌腫などの癌腫を含みうる。

Description

本出願は、２０１５年１月１６日に出願された国際ＰＣＴ出願番号ＵＳ２０１５／０１１７４８；２０１５年１月１６日に出願された米国出願第１４／５９９、１７４号；および２０１４年１月１６日に出願されたＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ ＡＮＤ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＯＦ ＣＡＮＣＥＲＳという表題の米国仮特許出願第６１／９２８，１３２号の一部継続出願であり、これらに対する優先権の利益を主張し、これらの内容は、その全体が記載されているように本明細書に参考として援用される。
本明細書では、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、および／またはＳＳＥＡ−４に結合する抗体、ならびに関連の組成物および使用方法が開示される。使用方法は、限定せずに述べると、がんの治療および診断法を含む。
悪性神経膠腫のうちの６０〜７０％を占める多型性神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、神経膠腫のうちで最も侵襲性の高い形態であり、成人において最も一般的な原発性脳がんである（Ｌｏｕｉｓ ＤＮら（２００７年）Ｔｈｅ ２００７ ＷＨＯ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ １１４巻（２号）：９７〜１０９頁）。ＧＢＭに利用可能な、手術、および化学療法、または放射線療法を含む多くの処置にもかかわらず、ＧＢＭ患者の予後および生存率は未だに不良であり、生存期間中央値は、１４〜１５カ月である（Ｖａｎ Ｍｅｉｒ ＥＧら（２０１０年）Ｅｘｃｉｔｉｎｇ ｎｅｗ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏ−ｏｎｃｏｌｏｇｙ： ｔｈｅ ａｖｅｎｕｅ ｔｏ ａ ｃｕｒｅ ｆｏｒ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａ． ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ６０（Ｍｅｙｅｒ ＭＡ（２００８年）Ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａｓ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５９巻（１７号）：１８５０；著者回答１８５０）：１６６〜１９３頁）。ＧＢＭは、大半の抗がん薬に対する抵抗性が強いことが知られており、極めて浸潤性が高く、手術による完全な切除が妨げられるため、大半の患者は、複数の治療の後でもなお、腫瘍の再発または進行を発症する。死亡率が高いため、ＧＢＭの処置のための免疫療法および遺伝子療法など、新たな治療手法が提起されている（Ｍｅｙｅｒ ＭＡ（２００８年） Ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａｓ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５９巻（１７号）：１８５０；著者回答１８５０）。
グリコシル化の変化は、がん細胞の特徴であり、いくつかのグリカン構造は、周知の腫瘍マーカーである（Ｍｅｅｚａｎ Ｅ、Ｗｕ ＨＣ、Ｂｌａｃｋ ＰＨ、およびＲｏｂｂｉｎｓ ＰＷ（１９６９年）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｖｉｒｕｓ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｍｏｕｓｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ． ＩＩ． Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｙ ｓｅｐｈａｄｅｘ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８巻（６号）：２５１８〜２５２４頁；Ｈａｋｏｍｏｒｉ Ｓ（２００２年）Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ： ｎｅｗ ｗｉｎｅ ｉｎ ａｎ ｏｌｄ ｂｏｔｔｌｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９９巻（１６号）：１０２３１〜１０２３３頁）。これらの異常な変化は、Ｎ連結型グリカンの分枝（Ｌａｕ ＫＳおよびＤｅｎｎｉｓ ＪＷ（２００８年）Ｎ−Ｇｌｙｃａｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ． Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １８巻（１０号）：７５０〜７６０頁）およびシアル酸含量（ｖａｎ Ｂｅｅｋ ＷＰ、Ｓｍｅｔｓ ＬＡ、およびＥｍｍｅｌｏｔ Ｐ（１９７３年）Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｎｓｉｔｙ ｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｃｅｌｌｓ−−ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ？ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ３３巻（１１号）：２９１３〜２９２２頁）の全般的な増大、ならびにシアリルルイスｘ（ｓＬｅｘ）、シアリルＴｎ（ｓＴｎ）、ルイスｙ（Ｌｅｙ）、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、およびポリシアル酸など、ある特定のグリカンエピトープの過剰発現（Ｓｅｌｌ Ｓ（１９９０年）Ｃａｎｃｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ ２１巻（１０号）：１００３〜１０１９頁；Ｈａｋｏｍｏｒｉ ＳおよびＺｈａｎｇ Ｙ（１９９７年）Ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ４巻（２号）：９７〜１０４頁；Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ ＪおよびＥｐｅｎｅｔｏｓ ＡＡ（１９９４年）Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ａｌｔｅｒｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ： ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １２巻（６号）：２２７〜２３３頁）を含む。多くの腫瘍はまた、ある特定の糖脂質、とりわけ、シアル酸をグリカン鎖に結合させたスフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）である、ガングリオシドの発現の増大も呈する。ガングリオシドは通常、神経系内で観察され、腫瘍内、特に、悪性腫瘍と関連する複合体ガングリオシド中で上昇することが見出されている（Ｂｉｒｋｌｅ Ｓ、Ｚｅｎｇ Ｇ、Ｇａｏ Ｌ、Ｙｕ ＲＫ、およびＡｕｂｒｙ Ｊ（２００３年）Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ． Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ８５巻（３〜４号）：４５５〜４６３頁）。
ヒト神経膠腫は、ガングリオシドの発現を示すことが報告されている（Ｆｒｅｄｍａｎ Ｐら（１９８６年）Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａｓ． Ｎｅｕｒｏｌ Ｒｅｓ ８巻（２号）：１２３〜１２６頁；Ｙａｔｅｓ ＡＪ、Ｂｅｃｋｅｒ ＬＥ、およびＳａｃｈｓ ＬＡ（１９７９年）Ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ ｉｎ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ． Ｃｈｉｌｄｓ Ｂｒａｉｎ ５巻（１号）：３１〜３９頁；Ｔｒａｙｌｏｒ ＴＤおよびＨｏｇａｎ ＥＬ（１９８０年）Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａｓ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ３４巻（１号）：１２６〜１３１頁；Ｂｅｒｒａ Ｂ、Ｇａｉｎｉ ＳＭ、およびＲｉｂｏｎｉ Ｌ（１９８５年）Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｇｒａｄｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ３６巻（３号）：３６３〜３６６頁；Ｆｒｅｄｍａｎ Ｐ、ｖｏｎ Ｈｏｌｓｔ Ｈ、Ｃｏｌｌｉｎｓ ＶＰ、Ｇｒａｎｈｏｌｍ Ｌ、およびＳｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ Ｌ（１９８８年）Ｓｉａｌｙｌｌａｃｔｏｔｅｔｒａｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ， ａ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａｓ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ５０巻（３号）：９１２〜９１９頁；Ｍａｎｓｓｏｎ ＪＥら（１９８６年）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｃｔｏｔｅｔｒａｏｓｅ ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２０１巻（１号）：１０９〜１１３頁；Ｆｒｅｄｍａｎ Ｐ、ｖｏｎ Ｈｏｌｓｔ Ｈ、Ｃｏｌｌｉｎｓ ＶＰ、Ｄｅｌｌｈｅｄｅｎ Ｂ、およびＳｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ Ｌ（１９９３年）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ ＧＤ３ ａｎｄ ３’−ｉｓｏＬＭ１ ｉｎ ａｕｔｏｐｓｙ ｂｒａｉｎｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｕｍｏｒｓ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ６０巻（１号）：９９〜１０５頁）。神経膠腫関連ガングリオシドの一部は、正常組織内の発現がまれであるか、またはさらに、存在しない（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ Ｌら（１９８９年）Ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ： ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｆｒｏｍ ｅａｒｌｙ ｆｅｔａｌ ｓｔａｇｅ ｔｏ ａｄｖａｎｃｅｄ ａｇｅ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １００５巻（２号）：１０９〜１１７頁）ので、ターゲティング療法に適する（Ｋａｔｏ Ｙら（２０１０年）ＧＭａｂ−１， ａ ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｔｉ−３’−ｉｓｏＬＭ１／３’，６’−ｉｓｏＬＤ１ ＩｇＧ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ， ｒａｉｓｅｄ ｉｎ ｌａｃｔｏ−ｓｅｒｉｅｓ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３９１巻（１号）：７５０〜７５５頁）。よって、新規の神経膠腫関連ＧＳＬを発見すれば、神経膠腫に対する新たな療法を開発するための新たな標的がもたらされるであろう。
グロボ系列ＧＳＬは、ラクトシルセラミドへのＧａｌα１−４Ｇａｌ連結を特徴とし、この連結は、ラクトシルセラミド４−アルファ−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ａ４ＧＡＬＴ）により触媒される。グロボトリオシルセラミド（Ｇｂ３Ｃｅｒ）およびグロボシド（Ｇｂ４Ｃｅｒ）が、Ｐ式血液型システム（Ｓｃｈｅｎｋｅｌ−Ｂｒｕｎｎｅｒ Ｈ（１９９５年）Ｐ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｈｕｍａｎ Ｂｌｏｏｄ Ｇｒｏｕｐｓ， （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｉｅｎｎａ）、２１１〜２３４頁）の基盤を構成するのに対し、それぞれステージ特異的胚抗原３（ＳＳＥＡ−３）およびＳＳＥＡ−４としてもまた公知の、ガラクトシルグロボシド（Ｇｂ５Ｃｅｒ）およびシアリルガラクトシルグロボシド（シアリルＧｂ５Ｃｅｒ、ＳＧＧ、ＭＳＧＧ）（Ｋａｎｎａｇｉ Ｒら（１９８３年）Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎｓ （ＳＳＥＡ−３ ａｎｄ −４） ａｒｅ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｆ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｇｌｏｂｏ−ｓｅｒｉｅｓ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ． ＥＭＢＯ Ｊ ２巻（１２号）：２３５５〜２３６１頁）は、ヒト胚性幹細胞を規定する細胞表面マーカーとして広く使用されている。グロボ系列ＧＳＬはまた、腫瘍内でも観察されている。Ｇｌｏｂｏ Ｈ（フコシルＧｂ５Ｃｅｒ）は、卵巣がん、胃がん、前立腺がん、肺がん、乳がん、および膵臓がんなど、多くの上皮がん内で過剰発現し（Ｚｈａｎｇ Ｓら（１９９７年）Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｓ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ａｔｔａｃｋ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｉ． Ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ７３巻（１号）：４２〜４９頁）；ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｇｌｏｂｏ Ｈは、乳がん細胞上だけでなく、乳がん幹細胞上でもまた発現する（Ｃｈａｎｇ ＷＷら（２００８年）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｌｏｂｏ Ｈ ａｎｄ ＳＳＥＡ３ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｆｕｃｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ １ ａｎｄ ２ ｉｎ Ｇｌｏｂｏ Ｈ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０５巻（３３号）：１１６６７〜１１６７２頁；Ｈｕａｎｇ ＹＬら（２０１３年）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０巻（７号）：２５１７〜２５２２頁）。さらに、腎細胞癌内では、ＳＳＥＡ−４およびジシアロシルガラクトシルグロボシド（ジシアロシルＧｂ５Ｃｅｒ：ＤＳＧＧ）の高レベルの発現も観察されている（Ｓａｉｔｏ Ｓら（１９９７年）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｏｂｏ−ｓｅｒｉｅｓ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ８８巻（７号）：６５２〜６５９頁）が、グロボ系列ＧＳＬがＧＢＭ上で発現するのかどうかについては、依然として知られていない。
Ｌｏｕｉｓ ＤＮら（２００７年）Ｔｈｅ ２００７ ＷＨＯ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ １１４巻（２号）：９７〜１０９頁 Ｖａｎ Ｍｅｉｒ ＥＧら（２０１０年）Ｅｘｃｉｔｉｎｇ ｎｅｗ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏ−ｏｎｃｏｌｏｇｙ： ｔｈｅ ａｖｅｎｕｅ ｔｏ ａ ｃｕｒｅ ｆｏｒ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａ． ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ６０ Ｍｅｅｚａｎ Ｅ、Ｗｕ ＨＣ、Ｂｌａｃｋ ＰＨ、およびＲｏｂｂｉｎｓ ＰＷ（１９６９年）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｖｉｒｕｓ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｍｏｕｓｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ． ＩＩ． Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｙ ｓｅｐｈａｄｅｘ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８巻（６号）：２５１８〜２５２４頁 Ｈａｋｏｍｏｒｉ Ｓ（２００２年）Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ： ｎｅｗ ｗｉｎｅ ｉｎ ａｎ ｏｌｄ ｂｏｔｔｌｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９９巻（１６号）：１０２３１〜１０２３３頁 Ｌａｕ ＫＳおよびＤｅｎｎｉｓ ＪＷ（２００８年）Ｎ−Ｇｌｙｃａｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ． Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １８巻（１０号）：７５０〜７６０頁 ｖａｎ Ｂｅｅｋ ＷＰ、Ｓｍｅｔｓ ＬＡ、およびＥｍｍｅｌｏｔ Ｐ（１９７３年）Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｎｓｉｔｙ ｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｃｅｌｌｓ−−ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ？ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ３３巻（１１号）：２９１３〜２９２２頁 Ｓｅｌｌ Ｓ（１９９０年）Ｃａｎｃｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ ２１巻（１０号）：１００３〜１０１９頁 Ｈａｋｏｍｏｒｉ ＳおよびＺｈａｎｇ Ｙ（１９９７年）Ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ４巻（２号）：９７〜１０４頁
がんと関連し、かつ／またはこれを予測するグリカンマーカーを同定し、広範なスペクトルにわたるがんの診断および処置における使用のためのマーカーに対する抗体を開発することは、大きな関心の対象である。
本開示はまた、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４が、広範なスペクトルにわたるがんにおいて異常に発現するが、正常細胞上では発現しないという発見にも基づく。Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４を発現させるがん細胞は、脳がん、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆管がん、骨がん（骨肉腫）、皮膚がん、膵臓がん、結腸がん、腎臓がん、子宮頸がん、卵巣がんおよび前立腺がんを含むがこれらに限定されない。
一態様では、本開示は、アフィニティー成熟させたＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体を提供する。これらの抗体は、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈに対するアフィニティーおよび特異性を増大させている。このアフィニティーおよび感受性の増大により、本発明の分子を、（ａ）本発明の分子の感受性の増大、および／または（ｂ）本発明の分子の、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈへの緊密な結合により利益を得る適用および方法のために使用することが可能となる。
一実施形態では、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体は、１つまたは複数のＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ活性の部分的または全面的な遮断が所望される、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ媒介性障害の処置に有用である。一実施形態では、本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体を使用して、がんを処置する。
本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体は、質量分析または遺伝子操作を必要とせずに、免疫沈降、サンドイッチイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、または免疫顕微鏡法など、イムノアッセイによる、高感度で特異的なエピトープの検出を可能とする。これにより、これらの経路の正常な機能の観察および解明のいずれにおいても、ならびに経路の機能が異常な場合の検出にも、著明な利点がもたらされる。
一態様では、ＳＳＥＡ４／ＳＳＥＡ３／Ｇｌｏｂｏ Ｈは、がん細胞およびがん幹細胞に特異的に発現される３種のグリカンである。これら３種の糖脂質の合成のための重要な酵素であるベータ−３−ＧａｌＴ５のノックダウンは、がん細胞のアポトーシスを引き起こすが、正常細胞のアポトーシスは引き起こさない。したがって、抗体、特に、ＳＳＥＡ４に優先的にもしくは特異的に対する糖抗体（ｇｌｙｃｏａｎｔｉｂｏｄｙ）、および／またはＳＳＥＡ３／ＳＳＥＡ４／Ｇｌｏｂｏ Ｈに同時に対する抗体は、有効ながん治療剤である。別の態様では、３種のグリカンＳＳＥＡ４／ＳＳＥＡ３／Ｇｌｏｂｏ Ｈ、特にＳＳＥＡ３は、がん幹細胞マーカーとして有用である。
一態様では、ＳＳＥＡ４および／または組合せでのＳＳＥＡ４／ＳＳＥＡ３／Ｇｌｏｂｏ Ｈは、例えば、脳がん、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆管がん、皮膚がん、骨がん（骨肉腫）、膵臓がん、結腸がん、腎臓がん、子宮頸がん、卵巣がんおよび前立腺がんを含む異なるがんの処置のための治療標的として有用である。
一実施形態では、これらの例示的ながん型の細胞表面上で発現されるＳＳＥＡ４に対するヒト治療用抗体またはヒト化治療用抗体が提供される。
別の実施形態では、これらの例示的ながん型の細胞表面上で同時に発現されるＳＳＥＡ３／ＳＳＥＡ４／Ｇｌｏｂｏ Ｈに対するヒト治療用抗体またはヒト化治療用抗体が提供される。
一態様では、本開示は、ＳＳＥＡ−４に特異的な単離抗体を特徴とする。抗ＳＳＥＡ−４抗体は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（ＳＳＥＡ−４六糖）に結合する。一部の例では、抗体は、Ｎｅｕ５Ｇｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（ＳＳＥＡ−４六糖の類似体）に結合することが可能である。
本開示の別の態様は、ＳＳＥＡ−４に特異的な単離抗体およびその断片を特徴とする。抗ＳＳＥＡ−４抗体は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（ＳＳＥＡ−４六糖）およびＮｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１（ＳＳＥＡ−４六糖の断片）に結合する。一部の例では、抗体は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１に結合することが可能である。一部の例では、抗体は、Ｎｅｕ５Ｇｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（ＳＳＥＡ−４六糖の類似体）に結合することが可能である。
一態様では、本開示は、表１７−４（図１７）に示される（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）配列番号１５２から選択されるＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号１５３から選択されるＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号１５４から選択されるＨ−ＣＤＲ３
からそれぞれ選択される、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、およびＨ−ＣＤＲ３を含み；
（ｉｖ）〜（ｖｉ）：
（ｉｖ）配列番号１４９から選択されるＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号１５０から選択されるＬ−ＣＤＲ２；および
（ｖｉ）配列番号１５１から選択されるＬ−ＣＤＲ３
からそれぞれ選択される、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
一態様では、本開示は、配列番号１４７または配列番号１３７を有するＶＨおよび配列番号１４８または配列番号１３８を有するＶＬを含む単離抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
一態様では、本開示は、表１７−４（図１７）に示される（ｉ）〜（ｉｖ）：
（ｉ）配列番号１５９から選択されるＨ−ＦＲ１；
（ｉｉ）配列番号１６０から選択されるＨ−ＦＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号１６１から選択されるＨ−ＦＲ３；
（ｉｖ）配列番号１６２から選択されるＨ−ＦＲ４
からそれぞれ選択される、Ｈ−ＦＲ１、Ｈ−ＦＲ２、Ｈ−ＦＲ３、およびＨ−ＦＲ４をさらに含み；
（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）：
（ｖ）配列番号１５５から選択されるＬ−ＦＲ１；
（ｖｉ）配列番号１５６から選択されるＬ−ＦＲ２；
（ｖｉｉ）配列番号１５７から選択されるＬ−ＦＲ３；
（ｖｉｉｉ）配列番号１５８から選択されるＬ−ＦＲ４
からそれぞれ選択される、Ｌ−ＦＲ１、Ｌ−ＦＲ２、Ｌ−ＦＲ３、およびＬ−ＦＲ４を含む、単離抗体または抗原結合性断片を提供する。
一態様では、本開示は、図１６Ａに示される（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）配列番号５２または配列番号５６から選択されるＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号５４または配列番号５８から選択されるＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号６０または配列番号６３から選択されるＨ−ＣＤＲ３
からそれぞれ選択される、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、およびＨ−ＣＤＲ３を含み；
（ｉｖ）〜（ｖｉ）：
（ｉｖ）配列番号６６または配列番号７０から選択されるＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号６８または配列番号７２から選択されるＬ−ＣＤＲ２；および
（ｖｉ）配列番号７４または配列番号７７から選択されるＬ−ＣＤＲ３
からそれぞれ選択される、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
ある特定の実施形態では、単離抗体または抗原結合性断片は、図１６Ａに示される（ｉ）〜（ｉｖ）：
（ｉ）配列番号５１または配列番号５５から選択されるＨ−ＦＲ１；
（ｉｉ）配列番号５３または配列番号５７から選択されるＨ−ＦＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号５９または配列番号６２から選択されるＨ−ＦＲ３；
（ｉｖ）配列番号６１または配列番号６４から選択されるＨ−ＦＲ４
からそれぞれ選択される、Ｈ−ＦＲ１、Ｈ−ＦＲ２、Ｈ−ＦＲ３、およびＨ−ＦＲ４をさらに含み；
（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）：
（ｖ）配列番号６５または配列番号６９から選択されるＬ−ＦＲ１；
（ｖｉ）配列番号６７または配列番号７１から選択されるＬ−ＦＲ２；
（ｖｉｉ）配列番号７３または配列番号７６から選択されるＬ−ＦＲ３；
（ｖｉｉｉ）配列番号７５または配列番号７８から選択されるＬ−ＦＲ４
からそれぞれ選択される、Ｌ−ＦＲ１、Ｌ−ＦＲ２、Ｌ−ＦＲ３、およびＬ−ＦＲ４を含む。
本明細書で記載される例示的な抗体は、
ａ）組換え抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体断片、二特異性抗体、一特異性抗体、一価抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、または抗体の誘導体であること；ｂ）ヒト抗体、マウス抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体、抗原結合性断片、または抗体の誘導体であること；ｃ）単鎖抗体断片、マルチボディー、Ｆａｂ断片、ならびに／またはＩｇＧアイソタイプ、ＩｇＭアイソタイプ、ＩｇＡアイソタイプ、ＩｇＥアイソタイプ、ＩｇＤアイソタイプ、および／もしくはこれらのサブクラスの免疫グロブリンであること；ｄ）以下の特徴：（ｉ）がん細胞のＡＤＣＣおよび／もしくはＣＤＣを媒介すること；（ｉｉ）がん細胞のアポトーシスを誘導および／もしくは促進すること；（ｉｉｉ）がん細胞の標的細胞の増殖を阻害すること；（ｉｖ）がん細胞の食作用を誘導および／もしくは促進すること；ならびに／または（ｖ）細胞傷害剤の放出を誘導および／もしくは促進すること；ｅ）非がん細胞上、非腫瘍細胞上、および／または良性腫瘍細胞上で発現する抗原に結合しないことのうちの１つまたは複数を有すること
のうちの１つまたは複数の特徴を有しうる。
一部の例では、本明細書で記載される抗体のうちのいずれかを、患者もしくは回復した患者または健常者に由来するＢ細胞を使用して、ファージディスプレイ抗体ライブラリーまたは単一のＢ細胞により、Ｆａｂまたは単鎖として作り出すことができる。
別の態様では、本開示は、このような処置を必要とする対象に、本明細書で記載される１つまたは複数の抗体を含む、治療有効量の組成物を投与するステップを含む治療法を提供する。
一部の実施形態では、処置を必要とする対象（例えば、ヒト患者）は、がんを伴うか、がんを有することが疑われるか、またはがんの危険性があると診断される。がんの例は、脳がん、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆管がん、膵臓がん、結腸がん、腎臓がん、子宮頚がん、卵巣がん、および前立腺がんを含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、がんは、脳がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん、または膵臓がんである。一部の好ましい実施形態では、がんは、脳がんまたは多型性神経膠芽腫（ＧＢＭ）がんである。
一部の実施形態では、抗体は、ＳＳＥＡ−４を発現させるがん細胞をターゲティングすることが可能である。
処置は、腫瘍サイズの低減、悪性細胞の消失、転移の防止、再発の防止、播種性がんの軽減もしくは殺滅、生存の延長、および／または腫瘍のがんへの進行までの時間の延長を結果としてもたらす。
一部の実施形態では、処置は、さらなる治療を、前記対象に、抗体の前記投与の前、前記投与の間、または前記投与の後に投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、さらなる治療は、化学療法剤による処置である。一部の実施形態では、さらなる治療は、放射線療法である。
さらに、本開示は、対象におけるがんを診断するための方法であって、（ａ）ＧＭ３、ＧＭ２、ＧＭ１、ＧＤ１、ＧＤ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＴ１ｂ、Ａ２Ｂ５、ＬｅＸ、ｓＬｅＸ、ＬｅＹ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＴＦ、Ｔｎ、ｓＴｎ、ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＣＤ４５、ＣＤ９０、ＣＤ１３３からなるマーカーのパネルの発現を検出する、１つまたは複数のモノクローナル抗体を含み得る組成物を、対象から得られた細胞試料または組織試料に適用するステップと；（ｂ）モノクローナル抗体の、細胞試料または組織試料への結合についてアッセイするステップと；（ｃ）結合を、正常対照と比較して、対象におけるがんの存在を決定するステップとを含む方法を特徴とする。
検出および診断のためのがんの例は、脳がん、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆管がん、膵臓がん、結腸がん、腎臓がん、子宮頚がん、卵巣がん、および前立腺がんを含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、がんは、脳がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん、または膵臓がんである。
一部の実施形態では、がんは、脳がんまたは多型性神経膠芽腫（ＧＢＭ）がんであり、抗体は、抗ＳＳＥＡ−４モノクローナル抗体である。
さらに別の態様では、本開示は、脳がん、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆管がん、膵臓がん、結腸がん、腎臓がん、子宮頚がん、卵巣がん、および前立腺がんなどのがんの処置における使用のための医薬組成物を特徴とする。医薬組成物は、抗体またはこのような抗体をコードする核酸のうちのいずれかと、薬学的に許容される担体とを含み、このような医薬組成物を、がんを処置するための医薬の製造において使用する。
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細については、下記の記載に示す。本発明の他の特徴または利点は、以下の図面およびいくつかの実施形態についての詳細な記載から明らかであり、また、付属の特許請求の範囲からも明らかである。
グリカンおよび関連構造を記載するために本明細書で使用される記号、図形およびテキストに関する命名法は、例えば、Ａｊｉｔ Ｖａｒｋｉらによる「Ｓｙｍｂｏｌｓ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｇｌｙｃａｎ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． ２００９年１２月；９巻（２４号）：５３９８〜５３９９頁を含め、当技術分野で十分確立されており、理解されている。
図１Ａ〜１Ｂは、抗ＳＳＥＡ−４ ｍＡｂの、ＧＢＭ細胞株への結合特徴を示す図である。（図１Ａ）グロボ系列ＧＳＬの生合成についての概略図である。ＳＳＥＡ−４およびＧｌｏｂｏ Ｈの前駆体である、ＳＳＥＡ−３は、グロボシドから合成される。グリコシド連結およびグラフ内の注記には、略称で表示する（Ｇｌｃ：グルコース；Ｇａｌ：ガラクトース；ＧａｌＮＡｃ：Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｆｕｃ：フコース；ＮｅｕＡｃ：Ｎ−アセチルノイラミン酸）。（図１Ｂ）ＧＢＭ細胞を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲートＭＣ８１３−７０で染色し、染色強度を、フローサイトメトリーで解析した。検討された全ての細胞は、ＳＶ４０ラージＴ抗原で形質転換された正常ヒト胎児神経膠細胞株であるＳＶＧ ｐ１２を除き、ＧＢＭ細胞株であった。ＭＣ８１３−７０およびアイソタイプ対照で染色された細胞についてのヒストグラムを、それぞれ、グレーおよび白で示す。
図２Ａ〜２Ｈは、抗体のグリカン結合プロファイルを示す図である。スライドガラス上のグリカンマイクロアレイを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート抗体（１０μｇ／ｍＬ）と相互作用させ、６３５ｎｍのアレイスキャナーで読み取った。データは、平均±ＳＤとして提示する。（図２Ａ）ｍＡｂ ２７３についての結合プロファイル。（図２Ｂ）ｍＡｂ ６５１についての結合プロファイル。（図２Ｃ）ｍＡｂ ＶＫ９についての結合プロファイル。（図２Ｄ）ｍＡｂ Ｍｂｒ１についての結合プロファイル。（図２Ｅ）ｍＡｂ ４５についての結合プロファイル。（図２Ｆ）ｍＡｂ ４６についての結合プロファイル。（図２Ｇ）ｍＡｂ ４８についての結合プロファイル。（図２Ｈ）ＭＣ８１３−７０についての結合プロファイル。 図２Ａ〜２Ｈは、抗体のグリカン結合プロファイルを示す図である。スライドガラス上のグリカンマイクロアレイを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート抗体（１０μｇ／ｍＬ）と相互作用させ、６３５ｎｍのアレイスキャナーで読み取った。データは、平均±ＳＤとして提示する。（図２Ａ）ｍＡｂ ２７３についての結合プロファイル。（図２Ｂ）ｍＡｂ ６５１についての結合プロファイル。（図２Ｃ）ｍＡｂ ＶＫ９についての結合プロファイル。（図２Ｄ）ｍＡｂ Ｍｂｒ１についての結合プロファイル。（図２Ｅ）ｍＡｂ ４５についての結合プロファイル。（図２Ｆ）ｍＡｂ ４６についての結合プロファイル。（図２Ｇ）ｍＡｂ ４８についての結合プロファイル。（図２Ｈ）ＭＣ８１３−７０についての結合プロファイル。 図２Ａ〜２Ｈは、抗体のグリカン結合プロファイルを示す図である。スライドガラス上のグリカンマイクロアレイを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート抗体（１０μｇ／ｍＬ）と相互作用させ、６３５ｎｍのアレイスキャナーで読み取った。データは、平均±ＳＤとして提示する。（図２Ａ）ｍＡｂ ２７３についての結合プロファイル。（図２Ｂ）ｍＡｂ ６５１についての結合プロファイル。（図２Ｃ）ｍＡｂ ＶＫ９についての結合プロファイル。（図２Ｄ）ｍＡｂ Ｍｂｒ１についての結合プロファイル。（図２Ｅ）ｍＡｂ ４５についての結合プロファイル。（図２Ｆ）ｍＡｂ ４６についての結合プロファイル。（図２Ｇ）ｍＡｂ ４８についての結合プロファイル。（図２Ｈ）ＭＣ８１３−７０についての結合プロファイル。 図２Ａ〜２Ｈは、抗体のグリカン結合プロファイルを示す図である。スライドガラス上のグリカンマイクロアレイを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート抗体（１０μｇ／ｍＬ）と相互作用させ、６３５ｎｍのアレイスキャナーで読み取った。データは、平均±ＳＤとして提示する。（図２Ａ）ｍＡｂ ２７３についての結合プロファイル。（図２Ｂ）ｍＡｂ ６５１についての結合プロファイル。（図２Ｃ）ｍＡｂ ＶＫ９についての結合プロファイル。（図２Ｄ）ｍＡｂ Ｍｂｒ１についての結合プロファイル。（図２Ｅ）ｍＡｂ ４５についての結合プロファイル。（図２Ｆ）ｍＡｂ ４６についての結合プロファイル。（図２Ｇ）ｍＡｂ ４８についての結合プロファイル。（図２Ｈ）ＭＣ８１３−７０についての結合プロファイル。 図２Ａ〜２Ｈは、抗体のグリカン結合プロファイルを示す図である。スライドガラス上のグリカンマイクロアレイを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート抗体（１０μｇ／ｍＬ）と相互作用させ、６３５ｎｍのアレイスキャナーで読み取った。データは、平均±ＳＤとして提示する。（図２Ａ）ｍＡｂ ２７３についての結合プロファイル。（図２Ｂ）ｍＡｂ ６５１についての結合プロファイル。（図２Ｃ）ｍＡｂ ＶＫ９についての結合プロファイル。（図２Ｄ）ｍＡｂ Ｍｂｒ１についての結合プロファイル。（図２Ｅ）ｍＡｂ ４５についての結合プロファイル。（図２Ｆ）ｍＡｂ ４６についての結合プロファイル。（図２Ｇ）ｍＡｂ ４８についての結合プロファイル。（図２Ｈ）ＭＣ８１３−７０についての結合プロファイル。 図２Ａ〜２Ｈは、抗体のグリカン結合プロファイルを示す図である。スライドガラス上のグリカンマイクロアレイを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート抗体（１０μｇ／ｍＬ）と相互作用させ、６３５ｎｍのアレイスキャナーで読み取った。データは、平均±ＳＤとして提示する。（図２Ａ）ｍＡｂ ２７３についての結合プロファイル。（図２Ｂ）ｍＡｂ ６５１についての結合プロファイル。（図２Ｃ）ｍＡｂ ＶＫ９についての結合プロファイル。（図２Ｄ）ｍＡｂ Ｍｂｒ１についての結合プロファイル。（図２Ｅ）ｍＡｂ ４５についての結合プロファイル。（図２Ｆ）ｍＡｂ ４６についての結合プロファイル。（図２Ｇ）ｍＡｂ ４８についての結合プロファイル。（図２Ｈ）ＭＣ８１３−７０についての結合プロファイル。 図２Ａ〜２Ｈは、抗体のグリカン結合プロファイルを示す図である。スライドガラス上のグリカンマイクロアレイを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート抗体（１０μｇ／ｍＬ）と相互作用させ、６３５ｎｍのアレイスキャナーで読み取った。データは、平均±ＳＤとして提示する。（図２Ａ）ｍＡｂ ２７３についての結合プロファイル。（図２Ｂ）ｍＡｂ ６５１についての結合プロファイル。（図２Ｃ）ｍＡｂ ＶＫ９についての結合プロファイル。（図２Ｄ）ｍＡｂ Ｍｂｒ１についての結合プロファイル。（図２Ｅ）ｍＡｂ ４５についての結合プロファイル。（図２Ｆ）ｍＡｂ ４６についての結合プロファイル。（図２Ｇ）ｍＡｂ ４８についての結合プロファイル。（図２Ｈ）ＭＣ８１３−７０についての結合プロファイル。 図２Ａ〜２Ｈは、抗体のグリカン結合プロファイルを示す図である。スライドガラス上のグリカンマイクロアレイを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート抗体（１０μｇ／ｍＬ）と相互作用させ、６３５ｎｍのアレイスキャナーで読み取った。データは、平均±ＳＤとして提示する。（図２Ａ）ｍＡｂ ２７３についての結合プロファイル。（図２Ｂ）ｍＡｂ ６５１についての結合プロファイル。（図２Ｃ）ｍＡｂ ＶＫ９についての結合プロファイル。（図２Ｄ）ｍＡｂ Ｍｂｒ１についての結合プロファイル。（図２Ｅ）ｍＡｂ ４５についての結合プロファイル。（図２Ｆ）ｍＡｂ ４６についての結合プロファイル。（図２Ｇ）ｍＡｂ ４８についての結合プロファイル。（図２Ｈ）ＭＣ８１３−７０についての結合プロファイル。
図３Ａ〜３Ｂは、ＧＢＭ細胞株に由来するガングリオシドについての、ＨＰＴＬＣ免疫染色およびＭＡＬＤＩ−ＭＳプロファイルを示す図である。（図３Ａ）ガングリオシドを、ＨＰＴＬＣプレート上で分離し、ＭＣ８１３−７０ ｍＡｂで検出した。２０１２Ｅｐ（ヒト胚性癌細胞株）およびＹＡＣ−１（マウスリンパ腫細胞株）に由来するガングリオシドを適用して、それぞれ、ＳＳＥＡ−４およびＧＭ１ｂについての陽性対照として用いた。脂肪酸の鎖長が異なるＳＳＥＡ−４は、２つの近接するバンドとして泳動した。（図３Ｂ）ＤＢＴＲＧ ＧＢＭ細胞から抽出されたガングリオシドは、過メチル化しており、ＭＡＬＤＩ−ＭＳで解析した。ＤＢＴＲＧ細胞内の主要なガングリオシドは、ＧＭ３（ｍ／ｚ＝１３７１．９）、ＧＭ２（ｍ／ｚ＝１６１７．０）、Ｎｅｕ５Ａｃ−（ｎ）Ｌｃ４／Ｇｇ４Ｃｅｒ（ｍ／ｚ＝１８２１．１）、およびＮｅｕ５Ａｃ２−（ｎ）Ｌｃ４／Ｇｇ４Ｃｅｒ（ｍ／ｚ＝２１８２．３）であった。比較的弱いシグナルによってであるが、ＳＳＥＡ−４（Ｎｅｕ５Ａｃ−Ｈｅｘ４−ＨｅｘＮＡｃ−Ｃｅｒ、ｍ／ｚ＝２０２５．２）もまた観察された。グリカン部分は同じであるが、脂肪酸アシル含量が異なるガングリオシドを角括弧で一括する。
図４Ａ〜４Ｃは、ＧＢＭ内のＳＳＥＡ−４についての発現プロファイルを示す図である。ＭＣ−８１３−７０による免疫組織化学染色後における、正常脳組織（図４Ａ）およびＧＢＭ（図４Ｂ）についての代表的な画像である。パネルＢ内の挿入図は、小さな矩形の領域についての拡大写真を示す。スケールバー：１００μｍ。（図４Ｃ）ＳＳＥＡ−４ ＩＨＣについての統計学的結果。ＧＢＭ検体についての染色強度は、０（陰性：ｉ）、１＋（弱い：ｉｉ）、２＋（中程度：ｉｉｉ）、および３＋（強い：ｉｖ）としてグレード付けした。スケールバー：１００μｍ。グレードＩ（ｎ＝１５）検体、グレードＩＩ（ｎ＝３１）検体、グレードＩＩＩ（ｎ＝２４）検体、グレードＩＶ（ＧＢＭ、ｎ＝５５）検体、および正常脳組織（ｎ＝１９）を、ＩＨＣの後、ヘマトキシリンで対比染色した。組織についての染色強度は、０（陰性）、１＋（弱い）、２＋（中程度）、および３＋（強い）としてグレード付けした。
図５Ａ〜５Ｂは、抗ＳＳＥＡ−４の補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）による効果を示すグラフである。 図５Ａ〜５Ｂは、抗ＳＳＥＡ−４の補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）による効果を示すグラフである。
（図５Ａ）ＧＢＭ上のＭＣ８１３−７０。ＧＢＭ細胞株を、２０μｇ／ｍＬのウサギ補体で処理して、ＭＣ８１３−７０誘導性細胞溶解を観察した。ＭＣ８１３−７０のＣＤＣ活性は、「材料および方法」において記載される、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイにより測定した。データは、平均±ＳＤとして示す。（図５Ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＭＣＦ−７上のｍＡｂ ２７３。（図５Ｃ）ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒト膵臓がん細胞ＢｘＰＣ３上のｍＡｂ ４６およびｍＡｂ ４８。腫瘍細胞（細胞１０４個）のアリコートを、補体供給源としてのヒト血清またはウサギ血清２０μＬの存在下、多様な濃度の抗体８０μＬと共に、３７℃で２時間インキュベートした。細胞傷害作用を、７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）を添加した後において、腫瘍細胞集団内で決定した。
図６は、抗ＳＳＥＡ−４による、ＤＢＴＲＧ腫瘍成長の阻害を示すグラフである。０日目において、雄ヌードマウスの右脇腹に、ＤＢＴＲＧ細胞を接種し、１１、１５、および１９日目において、ＭＣ８１３−７０またはマウスＩｇＧ３アイソタイプ対照（１投薬当たり２００μｇ）を腹腔内投与し、３１日目において屠殺した。各群（ｎ＝３）内の腫瘍体積は、異なる時点において測定し、平均±ＳＤとして示した。Ｐ＝０．００１は、二元ＡＮＯＶＡにより得た。
図７Ａ〜７Ｄは、抗体の、がん細胞への結合を示すグラフである。（図７Ａ）乳がん細胞ＭＣＦ−７を、ｍＡｂ ２７３で染色した。（図７Ｂ）膵臓がん細胞（ＨＰＡＣおよびＢｘＰＣ３）および乳がん細胞ＭＣＦ−７を、ｍＡｂ ４５で染色した。（図７Ｃ）膵臓がん細胞（ＨＰＡＣおよびＢｘＰＣ３）および乳がん細胞ＭＣＦ−７を、ｍＡｂ ４６で染色した。（図７Ｄ）膵臓がん細胞（ＨＰＡＣおよびＢｘＰＣ３）および乳がん細胞ＭＣＦ−７を、ｍＡｂ ４８で染色した。これらの細胞は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート抗体で染色し、染色強度は、フローサイトメトリーで解析した。ｍＡｂおよびアイソタイプ対照で染色された細胞を、それぞれ、青および赤で示す。 図７Ａ〜７Ｄは、抗体の、がん細胞への結合を示すグラフである。（図７Ａ）乳がん細胞ＭＣＦ−７を、ｍＡｂ ２７３で染色した。（図７Ｂ）膵臓がん細胞（ＨＰＡＣおよびＢｘＰＣ３）および乳がん細胞ＭＣＦ−７を、ｍＡｂ ４５で染色した。（図７Ｃ）膵臓がん細胞（ＨＰＡＣおよびＢｘＰＣ３）および乳がん細胞ＭＣＦ−７を、ｍＡｂ ４６で染色した。（図７Ｄ）膵臓がん細胞（ＨＰＡＣおよびＢｘＰＣ３）および乳がん細胞ＭＣＦ−７を、ｍＡｂ ４８で染色した。これらの細胞は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート抗体で染色し、染色強度は、フローサイトメトリーで解析した。ｍＡｂおよびアイソタイプ対照で染色された細胞を、それぞれ、青および赤で示す。 図７Ａ〜７Ｄは、抗体の、がん細胞への結合を示すグラフである。（図７Ａ）乳がん細胞ＭＣＦ−７を、ｍＡｂ ２７３で染色した。（図７Ｂ）膵臓がん細胞（ＨＰＡＣおよびＢｘＰＣ３）および乳がん細胞ＭＣＦ−７を、ｍＡｂ ４５で染色した。（図７Ｃ）膵臓がん細胞（ＨＰＡＣおよびＢｘＰＣ３）および乳がん細胞ＭＣＦ−７を、ｍＡｂ ４６で染色した。（図７Ｄ）膵臓がん細胞（ＨＰＡＣおよびＢｘＰＣ３）および乳がん細胞ＭＣＦ−７を、ｍＡｂ ４８で染色した。これらの細胞は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート抗体で染色し、染色強度は、フローサイトメトリーで解析した。ｍＡｂおよびアイソタイプ対照で染色された細胞を、それぞれ、青および赤で示す。 図７Ａ〜７Ｄは、抗体の、がん細胞への結合を示すグラフである。（図７Ａ）乳がん細胞ＭＣＦ−７を、ｍＡｂ ２７３で染色した。（図７Ｂ）膵臓がん細胞（ＨＰＡＣおよびＢｘＰＣ３）および乳がん細胞ＭＣＦ−７を、ｍＡｂ ４５で染色した。（図７Ｃ）膵臓がん細胞（ＨＰＡＣおよびＢｘＰＣ３）および乳がん細胞ＭＣＦ−７を、ｍＡｂ ４６で染色した。（図７Ｄ）膵臓がん細胞（ＨＰＡＣおよびＢｘＰＣ３）および乳がん細胞ＭＣＦ−７を、ｍＡｂ ４８で染色した。これらの細胞は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート抗体で染色し、染色強度は、フローサイトメトリーで解析した。ｍＡｂおよびアイソタイプ対照で染色された細胞を、それぞれ、青および赤で示す。
図８は、ｍＡｂ ４５のアミノ酸配列（出現順にそれぞれ配列番号２３および２４）、ｍＡｂ ４６のアミノ酸配列（出現順にそれぞれ配列番号３３および３４）およびｍＡｂ ４８のアミノ酸配列（出現順にそれぞれ配列番号４３および４４）についての比較を示す図である。多重配列アライメントのために、ＣｌｕｓｔａｌＷでは、漸進的アライメント法を使用する。
図９は、ヒトＩｇＧ抗体の発現ベクターを示す図である。
図１０Ａ〜１０Ｂは、ファージディスプレイヒトナイーブｓｃＦｖライブラリーによる、ＳＳＥＡ−４についてのバイオパニングを示すグラフである。ＳＳＥＡ−４に結合したファージディスプレイｓｃＦｖの選択である。ファージディスプレイヒトナイーブｓｃＦｖライブラリーを使用して、ＳＳＥＡ−４−ＰＥＧコンジュゲートＤｙｎａｂｅａｄに結合するファージを選択した。ファージの回収率は、バイオパニングの第５のラウンドの後で、第１のラウンドと比較して増大した。ＰＢＳ（図１０Ａ）および０．０１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（図１０Ｂ）を、バイオパニング工程時の洗浄緩衝液系として使用した。 図１０Ａ〜１０Ｂは、ファージディスプレイヒトナイーブｓｃＦｖライブラリーによる、ＳＳＥＡ−４についてのバイオパニングを示すグラフである。ＳＳＥＡ−４に結合したファージディスプレイｓｃＦｖの選択である。ファージディスプレイヒトナイーブｓｃＦｖライブラリーを使用して、ＳＳＥＡ−４−ＰＥＧコンジュゲートＤｙｎａｂｅａｄに結合するファージを選択した。ファージの回収率は、バイオパニングの第５のラウンドの後で、第１のラウンドと比較して増大した。ＰＢＳ（図１０Ａ）および０．０１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（図１０Ｂ）を、バイオパニング工程時の洗浄緩衝液系として使用した。
図１１Ａ〜１１Ｄは、ＥＬＩＳＡによる、ＳＳＥＡ−４に結合したファージディスプレイｓｃＦｖのスクリーニングを示すグラフである。 図１１Ａ〜１１Ｄは、ＥＬＩＳＡによる、ＳＳＥＡ−４に結合したファージディスプレイｓｃＦｖのスクリーニングを示すグラフである。 図１１Ａ〜１１Ｄは、ＥＬＩＳＡによる、ＳＳＥＡ−４に結合したファージディスプレイｓｃＦｖのスクリーニングを示すグラフである。 図１１Ａ〜１１Ｄは、ＥＬＩＳＡによる、ＳＳＥＡ−４に結合したファージディスプレイｓｃＦｖのスクリーニングを示すグラフである。
ランダムに選択されたファージクローンを、ＥＬＩＳＡを介してスクリーニングして、異なる結合を明らかにした。（図１１Ａ）コロニーを、ＰＢＳ洗浄群から選択した。（図１１Ｂ〜１１Ｄ）コロニーを、ＰＢＳＴ０．０１洗浄群から選択した。８つのファージクローンが、ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡへの優れた結合活性（Ａ４９０≧０．２）を有することが見出された。対照ファージを、陰性対照（Ｎｅｇ）として使用した。市販の抗ＳＳＥＡ−４ ｍＡｂ（ＭＣ８１３−７０）を、陽性対照（Ｐｏｓ）として使用した。Ａ４９０：４９０ｎｍにおける吸光度。
図１２は、抗ＳＳＥＡ−４ファージクローンの、グロボ系列グリカンへの結合活性についての比較を示すグラフである。ＥＬＩＳＡを実施して、抗ＳＳＥＡ−４ファージクローンの、ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡ、Ｇｌｏｂｏ Ｈ−ＢＳＡ、およびＳＳＥＡ−３−ＢＳＡへの結合について検討した。市販の抗ＳＳＥＡ−４マウスモノクローナル抗体（ＭＣ８１３−７０）および対照ファージ（Ｃｏｎファージ）を、それぞれ、陽性対照および陰性対照として使用した。ｐＭＣ４８とは、Ｄｒ．Ｗｏｎｇの研究室により創出された抗ＳＳＥＡ−４マウスｍＡｂの、ファージディスプレイｓｃＦｖフォーマットである。Ａ４９０：４９０ｎｍにおける吸光度。
図１３Ａ〜１３Ｂは、ＥＬＩＳＡによる、ｐ２−７８ ｈＡｂの結合活性についての解析を示す図である。（図１３Ａ）ＩｇＧの純度は、クーマシーブルー染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。（図１３Ｂ）ＥＬＩＳＡを実施して、図に指し示される通り、１μｇ／ｍｌの抗ＳＳＥＡ−４ ｈＡｂの、グリカンへの結合について検討した。市販の抗ＳＳＥＡ−４マウスモノクローナル抗体（ＭＣ８１３−７０；０．５μｇ／ｍｌ）および正常ヒトＩｇＧ（ＮＨＩｇＧ）を、それぞれ、陽性対照および陰性対照として使用した。Ｈ．Ｃ．：重鎖。Ｌ．Ｃ．：軽鎖。Ａ４９０：４９０ｎｍにおける吸光度。 図１３Ａ〜１３Ｂは、ＥＬＩＳＡによる、ｐ２−７８ ｈＡｂの結合活性についての解析を示す図である。（図１３Ａ）ＩｇＧの純度は、クーマシーブルー染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。（図１３Ｂ）ＥＬＩＳＡを実施して、図に指し示される通り、１μｇ／ｍｌの抗ＳＳＥＡ−４ ｈＡｂの、グリカンへの結合について検討した。市販の抗ＳＳＥＡ−４マウスモノクローナル抗体（ＭＣ８１３−７０；０．５μｇ／ｍｌ）および正常ヒトＩｇＧ（ＮＨＩｇＧ）を、それぞれ、陽性対照および陰性対照として使用した。Ｈ．Ｃ．：重鎖。Ｌ．Ｃ．：軽鎖。Ａ４９０：４９０ｎｍにおける吸光度。
図１４Ａ〜１４Ｂは、グリカンアレイによる、ｐ２−７８ ｈＡｂの結合活性についての解析を示す図である。
（図１４Ａ）市販のＩｇＭ抗体であるＭＣ６３１（５μｇ／ｍｌ）を、陽性対照として使用した。（図１４Ｂ）ｐ２−７８ ｈＡｂ（７．５μｇ／ｍｌ）は、ＳＳＥＡ４、シアリル−ＳＳＥＡ４、ＳＳＥＡ４Ｇｃ、およびＧｂ５（ＳＳＥＡ３）、ならびにＧｌｏｂｏＨを認識した。
図１５Ａ〜１５Ｂは、ｈＭＣ４８ ｓｃＦｖファージクローンについての結合アッセイを示すグラフである。 図１５Ａ〜１５Ｂは、ｈＭＣ４８ ｓｃＦｖファージクローンについての結合アッセイを示すグラフである。
ヒト化ＭＣ４８クローンの結合活性については、ＥＬＩＳＡにより検討した。ヒト化ＭＣ４８変異体の第３のｓｃＦｖファージクローンは、ＳＳＥＡ−４（図１５Ａ）には、用量依存的に結合できたが、ＢＳＡ対照タンパク質（図１５Ｂ）には、結合できなかった。
図１６Ａは、例示的な抗体クローン由来のＶＨドメインおよびＶＬドメインの両方についての相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）およびフレームワーク領域１〜４（ＦＷ１〜４）を示す図である。可変ドメインは、ＩＭＧＴデータベースによりアライメントした。図１６Ｂは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインの両方についての相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）およびフレームワーク領域１〜４（ＦＷ１〜４）を示す図である。可変ドメインは、ＩＭＧＴデータベースによりアライメントした。 図１６Ａは、例示的な抗体クローン由来のＶＨドメインおよびＶＬドメインの両方についての相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）およびフレームワーク領域１〜４（ＦＷ１〜４）を示す図である。可変ドメインは、ＩＭＧＴデータベースによりアライメントした。図１６Ｂは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインの両方についての相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）およびフレームワーク領域１〜４（ＦＷ１〜４）を示す図である。可変ドメインは、ＩＭＧＴデータベースによりアライメントした。
図１７は、マウスモノクローナル抗体ＭＣ４８に基づく例示的な糖抗体変異体の例示的なアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す図である（ＭＣ４８は、ヒト化に使用される例示的な抗ＳＳＥＡ−４マウスモノクローナル抗体である）。例示的なヒト化糖抗体変異体は、実施例のセクションに示されるように作り出される。表１７−１から１７−４は、ヒト化の各対応するラウンドから得られた例示的なヒト化糖抗体配列を記載している。 図１７は、マウスモノクローナル抗体ＭＣ４８に基づく例示的な糖抗体変異体の例示的なアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す図である（ＭＣ４８は、ヒト化に使用される例示的な抗ＳＳＥＡ−４マウスモノクローナル抗体である）。例示的なヒト化糖抗体変異体は、実施例のセクションに示されるように作り出される。表１７−１から１７−４は、ヒト化の各対応するラウンドから得られた例示的なヒト化糖抗体配列を記載している。
図１８は、ｈＭＣ４８ ｓｃＦｖファージクローンについての結合アッセイを示す図である。ヒト化ＭＣ４８クローンの結合活性については、ＥＬＩＳＡにより検討した。ヒト化ＭＣ４８変異体の第４のｓｃＦｖファージクローンは、ＳＳＥＡ−４（Ａ）には、用量依存的に結合できたが、ＢＳＡ対照タンパク質（Ｂ）には、結合できなかった。
こうして、広範なスペクトルにわたるがんの診断および処置における使用のためのマーカーを指向する抗体法および組成物が提供される。Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４を三重ターゲティングする抗体、Ｇｌｏｂｏ ＨおよびＳＳＥＡ−３を二重ターゲティングする抗体、ならびに抗ＳＳＥＡ−４抗体を開発したが、本明細書では、これらが開示される。使用法は、限定せずに述べると、がんの治療および診断法を含む。本明細書で記載される抗体は、広範なスペクトルにわたる、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ３、およびＳＳＥＡ−４を発現させるがん細胞に結合することが可能であり、これにより、がんの診断および処置を容易とする。抗体によりターゲティングされうる細胞は、脳がん、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆管がん、膵臓がん、結腸がん、腎臓がん、子宮頚がん、卵巣がん、前立腺がん内の癌腫などの癌腫などを含む。
定義
本発明の実施では、そうでないことが指し示されない限りにおいて、当技術分野の範囲内にある、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技法を援用する。このような技法については、文献中で十分に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ＩおよびＩＩ巻（Ｄ． Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５年）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．、１９８７年）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）；Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；論叢であるＭｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ． Ｈ． ＭｉｌｌｅｒおよびＭ． Ｐ． Ｃａｌｏｓ編、１９８７年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５４および１５５巻（Ｗｕら編）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８８年）；ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ． Ｍ． ＷｅｉｒおよびＣ． Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６年）を参照されたい。
本明細書で使用される「グリカン」という用語は、多糖またはオリゴ糖を指す。本明細書では、グリカンはまた、糖タンパク質、糖脂質、糖ペプチド、糖プロテオーム、ペプチドグリカン、リポ多糖、またはプロテオグリカンなど、複合糖質の炭水化物部分を指すのにも使用される。グリカンは通例、単糖間のＯ−グリコシド連結だけからなる。例えば、セルロースとは、β−１，４連結Ｄ−グルコースから構成されるグリカン（または、より具体的には、グルカン）であり、キチンとは、β−１，４連結Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンから構成されるグリカンである。グリカンは、単糖残基のホモポリマーの場合も、ヘテロポリマーの場合もあり、直鎖状の場合も、分枝状の場合もある。グリカンは、糖タンパク質内およびプロテオグリカン内の場合と同様に、タンパク質に結合して見出される場合もある。グリカンは一般に、細胞の外部表面上で見出される。真核生物では、Ｏ連結型グリカンおよびＮ連結型グリカンが非常に一般的であるが、原核生物でも、それほど一般的ではないが、見出されうる。Ｎ連結型グリカンは、シークオン内のアスパラギンのＲ基窒素（Ｎ）に結合して見出される。シークオンとは、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ配列またはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ配列［配列中、Ｘは、プロリン（ｐｒａｌｉｎｅ）を除く任意のアミノ酸である］である。
本明細書で使用される「抗原」という用語は、免疫応答を誘発することが可能な任意の物質と定義される。
本明細書で使用される「免疫原性」という用語は、免疫原、抗原、またはワクチンが、免疫応答を刺激する能力を指す。
本明細書で使用される「ＣＤ１ｄ」という用語は、多様なヒト抗原提示細胞の表面上で発現する、糖タンパク質のＣＤ１（分化抗原群１）ファミリーのメンバーを指す。ＣＤ１ｄを提示した脂質抗原は、ナチュラルキラーＴ細胞を活性化させる。ＣＤ１ｄは、糖脂質抗原が結合する、深い抗原結合溝を有する。樹状細胞上で発現するＣＤ１ｄ分子は、Ｃ３４など、アルファＧａｌＣｅｒ類似体を含む糖脂質に結合し、これらを提示しうる。
本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、抗体またはＴ細胞受容体の抗原結合性部位に接触する、抗原分子の部分と定義される。
本明細書で使用される「ワクチン」という用語は、全病原生物（死滅させるかまたは弱毒化した）、またはこのような生物の構成要素であって、生物が引き起こす疾患に対する免疫を付与するのに使用される、タンパク質、ペプチド、または多糖などの構成要素からなる抗原を含有する調製物を指す。ワクチン調製物は、天然、合成、または組換えＤＮＡ技術により導出される場合がある。
本明細書で使用される「抗原特異的」という用語は、特定の抗原または抗原の断片を供給する結果として、特異的細胞増殖がもたらされるような細胞集団の特性を指す。
本明細書で使用される「特異的に結合すること」という用語は、結合対（例えば、抗体および抗原）の間の相互作用を指す。多様な場合において、特異的に結合することは、約１０〜６モル／リットル、約１０〜７モル／リットル、もしくは約１０〜８モル／リットル、またはそれ未満のアフィニティー定数により具体化することができる。
「単離」抗体とは、その天然環境の構成要素から同定および分離ならびに／または回収された抗体である。その天然環境の夾雑構成要素は、抗体の研究的使用、診断的使用、または治療的使用に干渉する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性溶質または非タンパク質性溶質を含みうる。一実施形態では、抗体を（１）例えば、ローリー法により決定される通り、抗体の９５重量％超まで精製し、一部の実施形態では、９９重量％超まで精製するか（２）例えば、スピニングカップ型シークェネーターを使用することにより、Ｎ末端のアミノ酸配列もしくは内部アミノ酸配列のうちの少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで精製するか、または（３）例えば、クーマシーブルーもしくは銀染色を使用して、還元条件下もしくは非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、均質性まで精製する。抗体の天然環境の少なくとも１つの構成要素が存在しないので、単離抗体は、組換え細胞内のｉｎ ｓｉｔｕの抗体を含む。しかし、通常、単離抗体は、少なくとも１つの精製ステップにより調製する。
本明細書で使用される「実質的に同様」、「実質的に同じ」、「同等」、または「実質的に同等」という語句は、当業者が、その値（例えば、Ｋｄ値、抗ウイルス効果など）により測定される生物学的特徴の文脈内では、２つの値の間の差違を、生物学的有意性および／または統計学的有意性がほとんどないかまたはないと考えるような、２つの数値（例えば、一方は、分子と関連し、他方は、基準／比較分子と関連する）の間の、十分に高度の類似性を描示する。前記２つの値の間の差違は、例えば、基準／比較分子についての値の関数として、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、および／または約１０％未満である。
本明細書で使用される「実質的に低減された」または「実質的に異なる」という語句は、当業者が、その値（例えば、Ｋｄ値）により測定される生物学的特徴の文脈内では、２つの値の間の差違を、統計学的有意性があると考えるような、２つの数値（一般に、一方は、分子と関連し、他方は、基準／比較分子と関連する）の間の、十分に高度の差違を描示する。前記２つの値の間の差違は、例えば、基準／比較分子についての値の関数として、約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、および／または約５０％超である。
「結合アフィニティー」とは一般に、分子（例えば、抗体）の単一の結合性部位と、その結合パートナー（例えば、抗原）との非共有結合的相互作用の総合計の強さを指す。そうでないことが指し示されない限りにおいて、本明細書で使用される「結合アフィニティー」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体および抗原）の間の１：１の相互作用を反映する、固有の結合アフィニティーを指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対するアフィニティーは一般に、解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。アフィニティーは、本明細書で記載される方法を含む、当技術分野で公知の一般的な方法により測定することができる。低アフィニティー抗体は一般に、抗原への結合が緩徐であり、たやすく解離する傾向があるのに対し、高アフィニティー抗体は一般に、抗原への結合が迅速であり、結合を長く維持する傾向がある。当技術分野では、結合アフィニティーを測定する様々な方法が公知であり、これらのうちのいずれかを、本発明の目的で使用することができる。具体的な例示的実施形態について、以下で記載する。
一実施形態では、本発明に従う「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」は、以下に記載される通りに、目的の抗体およびその抗原のＦａｂ形により実施される、放射性標識型抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定する。Ｆａｂの、抗原に対する、溶液中の結合アフィニティーは、Ｆａｂを、未標識抗原の滴定系列の存在下、最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原で平衡化し、次いで、結合した抗原を、抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートで捕捉する（Ｃｈｅｎら（１９９９年）、Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２９３巻：８６５〜８８１頁）ことにより測定する。アッセイのための条件を確立するには、マイクロ滴定プレート（Ｄｙｎｅｘ）を、一晩、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中に５μｇ／ｍｌの捕捉用抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）でコーティングし、その後、ＰＢＳ中に２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンで、室温（約２３℃）で２〜５時間遮断する。非吸着型プレート（Ｎｕｎｃ；型番２６９６２０）内では、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［１２５Ｉ］−抗原を、目的のＦａｂの系列希釈液と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａら（１９９７年）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５７巻：４５９３〜４５９９頁における、抗ＶＥＧＦ抗体であるＦａｂ−１２の評価と符合する）。次いで、目的のＦａｂを、一晩インキュベートするが、インキュベーションを長時間（例えば、６５時間）持続させて、平衡への到達を確保することができる。その後、室温におけるインキュベーション（例えば、１時間）のために、混合物を、捕捉用プレートに移す。次いで、溶液を除去し、プレートを、８回、ＰＢＳ中に０．１％のＴｗｅｅｎ−２０で洗浄する。プレートを乾燥させたら、１５０μｌ／ウェルのシンチレーション剤（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０；Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、プレートを、Ｔｏｐｃｏｕｎｔガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）上で、１０分間カウントする。最大結合の２０％未満またはそれと等しい結合をもたらす各Ｆａｂ濃度を、競合的結合アッセイにおける使用のために選択する。別の実施形態によれば、ＫｄまたはＫｄ値は、２５℃、抗原ＣＭ５チップを約１０応答単位（ＲＵ）で固定化して、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用する、表面プラズモン共鳴アッセイを使用することにより測定する。略述すると、供給元の指示書に従い、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５；ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化させる。５μｌ／分の流量での注射の前に、抗原を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で、５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈して、約１０応答単位（ＲＵ）のカップリングタンパク質を達成する。抗原を注射した後、１Ｍのエタノールアミンを注射して、未反応基を遮断する。各実験では、１つのスポットを、タンパク質を固定化させずに活性化させ、エタノールアミンで遮断して、基準の控除のために使用した。反応速度の測定のために、Ｆａｂの２倍の系列希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）を伴うＰＢＳ中、２５℃、約２５μｌ／分の流量で注射する。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純な一対一のラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．２）を使用して、会合センサーグラムと解離センサーグラムとを同時に当てはめることにより計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。例えば、Ｃｈｅｎ， Ｙ．ら（１９９９年）、Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２９３巻：８６５〜８８１頁を参照されたい。オン速度が、上記の表面プラズモン共鳴アッセイによる１０６Ｍ−１秒−１を超える場合、オン速度は、ストップフロー装備型分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、または攪拌式キュベットを伴う８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定される、抗原の濃度を増大させながらその存在下、２５℃で、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中に２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の、蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍのバンドパス）の増大または減少を測定する、蛍光クエンチング技法を使用することにより決定することができる。
また、本発明に従う「オン速度」または「会合速度（ｒａｔｅ ｏｆ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）」または「会合速度（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）」または「ｋｏｎ」も、２５℃、抗原ＣＭ５チップを約１０応答単位（ＲＵ）で固定化して、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用する、上で記載した表面プラズモン共鳴法により決定することができる。略述すると、供給元の指示書に従い、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５；ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化させる。５μｌ／分の流量での注射の前に、抗原を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で、５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈して、約１０応答単位（ＲＵ）のカップリングタンパク質を達成する。抗原を注射した後、１Ｍのエタノールアミンを注射して、未反応基を遮断する。反応速度の測定のために、Ｆａｂの２倍の系列希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）を伴うＰＢＳ中、２５℃、約２５μｌ／分の流量で注射する。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純な一対一のラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．２）を使用して、会合センサーグラムと解離センサーグラムとを同時に当てはめることにより計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算した。例えば、Ｃｈｅｎ， Ｙ．ら（１９９９年）Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２９３巻：８６５〜８８１頁を参照されたい。しかし、オン速度が、上記の表面プラズモン共鳴アッセイによる１０６Ｍ−１秒−１を超える場合、オン速度は、ストップフロー装備型分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、または攪拌式キュベットを伴う８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定される、抗原の濃度を増大させながらその存在下、２５℃で、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中に２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の、蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍのバンドパス）の増大または減少を測定する、蛍光クエンチング技法を使用することにより決定することができる。
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指すことを意図する。１つの種類のベクターは、さらなるＤＮＡセグメントをライゲーションしうる、環状の二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。別の種類のベクターは、ファージベクターである。別の種類のベクターは、さらなるＤＮＡセグメントを、ウイルスゲノムにライゲーションしうる、ウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内の自己複製が可能である（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、これにより、宿主ゲノムと共に複製されうる。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動的に連結される遺伝子の発現を方向付けることが可能である。本明細書では、このようなベクターを、「組換え発現ベクター」（または、単に、「組換えベクター」）と称する。一般に、組換えＤＮＡ技法において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドは、最も一般に使用されるベクターの形態であるので、本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」とを、互換的に使用する場合がある。
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、任意の長さのヌクレオチドポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは修飾塩基、および／またはそれらの類似体、あるいはＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼ、または合成反応によりポリマーに組み込まれうる任意の基質、がある。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体などの修飾ヌクレオチドを含みうる。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーのアセンブリーの前または後で施すことができる。ヌクレオチドの配列は、ヌクレオチド以外の構成要素により中断されうる。ポリヌクレオチドは、標識とのコンジュゲーションによるなど、合成の後でさらに修飾することができる。他の種類の修飾は、例えば、自然発生のヌクレオチドのうちの１つまたは複数の、類似体による「キャップ」置換、例えば、非帯電連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄａｔｅ）、カルバメートなど）を伴うヌクレオチド間修飾、および帯電連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を伴うヌクレオチド間修飾、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リシンなど）などのペンダント部分を含有するヌクレオチド間修飾、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を伴うヌクレオチド間修飾、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有するヌクレオチド間修飾、アルキル化剤を含有するヌクレオチド間修飾、修飾連結（例えば、アルファアノマー核酸など）を伴うヌクレオチド間修飾などのヌクレオチド間修飾のほか、ポリヌクレオチドの非修飾形態を含む。さらに、通常糖内に存在するヒドロキシル基のうちのいずれかを、例えば、ホスホネート基、リン酸基により置きかえる、標準的な保護基により保護する、またはさらなるヌクレオチドへのさらなる連結を調製するように活性化させることができ、あるいは固体支持体または半固体支持体にコンジュゲートさせることができる。５’末端および３’末端のＯＨは、リン酸化する、またはアミンもしくは１〜２０個の炭素原子による有機キャッピング基部分で置換することができる。他のヒドロキシルはまた、標準的な保護基に誘導体化することもできる。ポリヌクレオチドはまた、例えば、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−アリルリボース、２’−フルオロリボース、または２’−アジドリボース、炭素環式の糖類似体、α−アノマー糖、アラビノース、キシロース、またはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、アクリル類似体、およびメチルリボシドなどの塩基性ヌクレオシド類似体を含む、当技術分野で一般に公知の、リボース糖またはデオキシリボース糖の類似の形態も含有しうる。１つまたは複数のホスホジエステル連結を、代替的な連結基で置きかえることができる。これらの代替的な連結基は、リン酸を、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＨ２（「ホルムアセタール」）［式中、各ＲまたはＲ’は、独立に、Ｈであるか、または、任意選択で、エーテル（−Ｏ−）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはアラルジルを含有する、置換もしくは非置換アルキル（１〜２０個のＣ）である］で置きかえた実施形態を含むがこれらに限定されない。ポリヌクレオチド内の全ての連結は、同一である必要がない。前出の記載は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書で言及される全てのポリヌクレオチドに当てはまる。
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」とは一般に短く、一般に一本鎖であり、一般に、約２００ヌクレオチド未満の長さであるが必ずしもそうではない、一般に合成のポリヌクレオチドを指す。「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語は、相互に除外的ではない。ポリヌクレオチドについての上記の記載は、オリゴヌクレオチドにも同等かつ十分に適用可能である。
「抗体」（Ａｂ）および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体が、特異的抗原に対する結合特異性を呈示するのに対し、免疫グロブリンは、抗体および抗原特異性を一般に欠く他の抗体様分子の両方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系により産生されるレベルは低く、骨髄腫により産生されるレベルは高い。
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、最も広い意味で、互換的に使用され、モノクローナル抗体（例えば、全長または無傷のモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、一価抗体、多価抗体、多特異性抗体（それらが、所望の生物学的活性を呈示する限りにおいて、例えば、二特異性抗体）を含み、また、ある特定の抗体断片（本明細書でより詳細に記載される）も含みうる。抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、および／またはアフィニティー成熟抗体でありうる。
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。これらのドメインは一般に、抗体の最も可変的な部分であり、抗原結合性部位を含有する。
「可変」という用語は、可変ドメインのある特定の部分は、抗体間で配列が大幅に異なり、各特定の抗体の、その特定の抗原に対する結合および特異性において使用されるという事実を指す。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に、均等に配分されているわけではない。可変性は、軽鎖可変ドメイン内および重鎖可変ドメイン内の両方で相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる、３つのセグメント内に濃縮されている。可変ドメインのうちの、より高度に保存的な部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれている。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、大部分、ベータシート構造を接続し、場合によって、ベータシート構造の一部を形成するループを形成する、３つのＣＤＲにより接続されたベータシート立体構成を採用する、４つのＦＲ領域を含む。各鎖内のＣＤＲは、ＦＲ領域により、一体に近接して保持され、他の鎖に由来するＣＤＲと共に、抗体の抗原結合性部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年）を参照されたい）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合には直接関かわらないが、抗体の、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用への関与など、多様なエフェクター機能を呈示する。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる、各々が、単一の抗原結合性部位と、その名称がたやすく結晶化するその能力を反映する残りの「Ｆｃ」断片とを伴う、２つの同一の抗原結合性断片を生じさせる。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、抗原を架橋することがやはり可能な、Ｆ（ａｂ’）２断片をもたらす。
「Ｆｖ」とは、完全な抗原認識部位および抗原結合性部位を含有する、最小の抗体断片である。２つの鎖によるＦｖ分子種では、この領域は、緊密な非共有結合的会合下にある、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。単鎖によるＦｖ分子種では、１つの重鎖可変ドメインと、１つの軽鎖可変ドメインとは、軽鎖と、重鎖とが、２つの鎖によるＦｖ分子種における「二量体」構造と類似の「二量体」構造内で会合しうるように、可撓性のペプチドリンカーにより共有結合的に連結されうる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上で、抗原結合性部位を規定するのは、この立体構成においてである。併せて、６つのＣＤＲは、抗原結合特異性を、抗体に付与する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲだけを含むＦｖの半分）でもなお、結合性部位全体より小さなアフィニティーではあるが、抗原を認識し、抗原に結合する能力を有する。
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、重鎖のＣＨ１ドメインのカルボキシ末端において、抗体のヒンジ領域に由来する１つまたは複数のシステインを含むいくつかの残基の付加により、Ｆａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基が、遊離チオール基を保有するＦａｂ’のための、本明細書における呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元は、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として作製された。また、抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。
任意の脊椎動物種に由来する抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、２つの顕著に異なる種類のうちの１つに割り当てることができる。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）は、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元的立体構成は周知であり、一般に、例えば、Ａｂｂａｓら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、４版（２０００年）において記載されている。抗体は、抗体の、１つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合的会合または非共有結合的会合により形成される、より大型の融合分子の一部でありうる。
本明細書では、「全長抗体」、「無傷抗体」、および「全抗体」という用語は、互換的に使用されて、下記で規定される抗体断片ではなく、その実質的な無傷形態にある抗体を指す。用語は特に、Ｆｃ領域を含有する重鎖を伴う抗体を指す。
「抗体断片」は、無傷抗体の一部分だけを含み、この場合、部分は、無傷抗体内に存在する場合にその部分と通常関連する機能のうちの少なくとも１つであり、多ければ、これらの大半または全てを保持する。一実施形態では、抗体断片は、無傷抗体の抗原結合性部位を含み、これにより、抗原に結合する能力を保持する。別の実施形態では、抗体断片、例えば、Ｆｃ領域を含む抗体断片は、ＦｃＲｎへの結合、抗体半減期のモジュレーション、ＡＤＣＣ機能、および補体への結合など、無傷抗体内に存在する場合にＦｃ領域と通常関連する生物学的機能のうちの少なくとも１つを保持する。一実施形態では、抗体断片は、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が無傷抗体と実質的に同様の一価抗体である。例えば、このような抗体断片は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける安定性を断片に付与することが可能なＦｃ配列に連結された抗原結合性アームを含みうる。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体集団から得られた抗体を指す、例えば、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる、または均質なグリコフォームプロファイルのみを含む（集団中の糖抗体上に、単一のグリカンまたは単一のグリカンプロファイルのみを有する）可能な自然発生の突然変異を除き、同一である。２，３−シアリルおよび２，６−シアリル、ならびにＦｃ−２９７位における脱フコシル化複合二分岐グリカンを使用することによってエフェクター機能を増強するための均質な抗体組成物の例は、ＵＳ１２／９５９，３５１に記載されている。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、個別の抗体の混合物ではないものとしての抗体の性格を指し示す。このようなモノクローナル抗体は、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、この場合、標的結合性ポリペプチド配列は、単一の標的結合性ポリペプチド配列の、複数のポリペプチド配列からの選択を含む工程により得られたものであることが典型的である。例えば、選択工程は、固有のクローンの、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組換えＤＮＡクローンのプールなどの複数のクローンからの選択でありうる。選択された標的結合性配列は、例えば、標的に対するアフィニティーを改善し、標的結合性配列をヒト化し、細胞培養物中のその産生を改善し、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるその免疫原性を低減し、多特異性抗体を創出するなどするように、さらに改変させることができ、改変させた標的結合性配列を含む抗体もまた、本発明のモノクローナル抗体であることを理解されたい。異なる決定基（エピトープ）を指向する異なる抗体を含むことが典型的なポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を指向する。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は典型的に、他の免疫グロブリンが夾雑していないという点でも有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られるものとしての抗体の性格を指し示すものであり、任意の特定の方法による抗体の作製を要請するとはみなされないものとする。例えば、本発明に従い使用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５頁（１９７５年）；Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２版、１９８８年）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、５６３〜６８１頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１年））、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９２年）；Ｓｉｄｈｕら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３３８巻（２号）：２９９〜３１０頁（２００４年）；Ｌｅｅら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３４０巻（５号）：１０７３〜１０９３頁（２００４年）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１０１巻（３４号）：１２４６７〜１２４７２頁（２００４年）；およびＬｅｅら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、２８４巻（１〜２号）：１１９〜１３２頁（２００４年）を参照されたい）、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座またはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部または全部を有する動物によりヒト抗体またはヒト様抗体を作製する技術（例えば、ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；ＷＯ９１／１０７４１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０巻：２５５１頁（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻：２５５〜２５８頁（１９９３年）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７巻：３３頁（１９９３年）；米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号；Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ． Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８巻：８５６〜８５９頁（１９９４年）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６８巻：８１２〜８１３頁（１９９４年）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４巻：８４５〜８５１頁（１９９６年）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４巻：８２６頁（１９９６年）；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３巻：６５〜９３頁（１９９５年）を参照されたい）を含む様々な技法により作製することができる。
本明細書のモノクローナル抗体は具体的に、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一または相同である一方で、鎖の残りの部分は、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体のほか、それらが、所望の生物学的活性を呈示する限りにおいて、このような抗体の断片（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８１巻：６８５１〜６８５５頁（１９８４年））も含む。
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域に由来する残基を、所望の特異性、アフィニティー、および／または能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長動物など、非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域に由来する残基で置きかえた、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によって、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基を、対応する非ヒト残基で置きかえる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体内またはドナー抗体内で見出されない残基を含みうる。これらの修飾は、抗体の性能をさらに精緻化するように施す。一般に、ヒト化抗体は、超可変ループのうちの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲのうちの全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのうちの実質的に全てを含む。ヒト化抗体はまた、任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部分も含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２９頁（１９８８年）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．、２巻：５９３〜５９６頁（１９９２年）を参照されたい。また、以下の総説論文：ＶａｓｗａｎｉおよびＨａｍｉｌｔｏｎ、Ａｎｎ． Ａｌｌｅｒｇｙ， Ａｓｔｈｍａ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１巻：１０５〜１１５頁（１９９８年）；Ｈａｒｒｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ、２３巻：１０３５〜１０３８頁（１９９５年）；ＨｕｒｌｅおよびＧｒｏｓｓ、Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．、５巻：４２８〜４３３頁（１９９４年）、ならびにこれらの中で引用されている参考文献も参照されたい。
本明細書で使用される「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」という用語は、配列が超可変的であり、かつ／または構造的に規定されたループを形成する、抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は、６つの超可変領域：ＶＨ内の３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）およびＶＬ内の３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。多くの超可変領域の描写が本明細書において使用され、包含される。Ｋａｂａｔによる相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づき、最も一般に使用されている（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年））。これとは別に、Ｃｈｏｔｈｉａは、構造ループの位置に言及する（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１９６巻：９０１〜９１７頁（１９８７年））。ＡｂＭによる超可変領域は、ＫａｂａｔによるＣＤＲと、Ｃｈｏｔｈｉａによる構造ループとの折衷を表し、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ製のＡｂＭ抗体モデル作製ソフトウェアで使用されている。「Ｃｏｎｔａｃｔ」法による超可変領域は、利用可能な複合体結晶構造の解析に基づく。これらの超可変領域の各々に由来する残基を、下記に記述する。
Ｋａｂａｔ、ＡｂＭ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃｏｎｔａｃｔによるループ
Ｌ１：Ｌ２４〜Ｌ３４、Ｌ２４〜Ｌ３４、Ｌ２６〜Ｌ３２、Ｌ３０〜Ｌ３６
Ｌ２：Ｌ５０〜Ｌ５６、Ｌ５０〜Ｌ５６、Ｌ５０〜Ｌ５２、Ｌ４６〜Ｌ５５
Ｌ３：Ｌ８９〜Ｌ９７、Ｌ８９〜Ｌ９７、Ｌ９１〜Ｌ９６、Ｌ８９〜Ｌ９６
Ｈ１：Ｈ３１〜Ｈ３５Ｂ、Ｈ２６〜Ｈ３５Ｂ、Ｈ２６〜Ｈ３２、Ｈ３０〜Ｈ３５Ｂ
（Ｋａｂａｔによる番号付け）
Ｈ１：Ｈ３１〜Ｈ３５、Ｈ２６〜Ｈ３５、Ｈ２６〜Ｈ３２、Ｈ３０〜Ｈ３５
（Ｃｈｏｔｈｉａによる番号付け）
Ｈ２：Ｈ５０〜Ｈ６５、Ｈ５０〜Ｈ５８、Ｈ５３〜Ｈ５５、Ｈ４７〜Ｈ５８
Ｈ３：Ｈ９５〜Ｈ１０２、Ｈ９５〜Ｈ１０２、Ｈ９６〜Ｈ１０１、Ｈ９３〜Ｈ１０１
超可変領域は、以下の通り：ＶＬ内の２４〜３６または２４〜３４（Ｌ１）、４６〜５６または５０〜５６または４９〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７または８９〜９６（Ｌ３）、ならびにＶＨ内の２６〜３５（Ｈ１）、５０〜６５または４９〜６５（Ｈ２）、および９３〜１０２、９４〜１０２、または９５〜１０２（Ｈ３）の「拡張超可変領域」を含みうる。可変ドメイン残基は、Ｋａｂａｔら、前出に従い、これらの定義の各々について番号付けされる。
「フレームワーク」残基または「ＦＲ」残基とは、本明細書で規定される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
「Ｋａｂａｔによる可変ドメイン残基の番号付け」または「Ｋａｂａｔによるアミノ酸位置の番号付け」という用語、およびこれらの変化形は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年）で集成された抗体の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインについて使用されている番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用すると、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＨＶＲの短縮またはこれらへの挿入に対応する、より少ないアミノ酸またはさらなるアミノ酸を含有する場合がある。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後における単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従う残基５２ａ）と、重鎖ＦＲの残基８２の後における残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔに従う残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含みうる。Ｋａｂａｔによる残基の番号付けは、所与の抗体について、抗体の配列相同性領域における、「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付け配列とのアライメントにより決定することができる。
「単鎖Ｆｖ」抗体断片または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、この場合、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、ｓｃＦｖが、抗原への結合に所望の構造を形成することが可能である。ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６９〜３１５頁（１９９４年）を参照されたい。
「ダイアボディー」という用語は、２つの抗原結合性部位を伴う小型の抗体断片であって、同じポリペプチド鎖内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む断片（ＶＨ−ＶＬ）を指す。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能とするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは、別の鎖の相補性ドメインと対合し、２つの抗原結合性部位を創出するように強いられる。ダイアボディーについては、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０巻：６４４４〜６４４８頁（１９９３年）においてより十全に記載されている。
「ヒト抗体」とは、ヒトにより産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有し、かつ／または本明細書で開示される、ヒト抗体を作製するための技法のうちのいずれかを使用して作製された抗体である。ヒト抗体についてのこの定義は具体的に、非ヒト抗原結合性残基を含むヒト化抗体を除外する。
「アフィニティー成熟」抗体とは、その１つまたは複数のＨＶＲ内の１つまたは複数の改変であって、これらの改変を保有しない親抗体と比較して、抗体の抗原に対するアフィニティーの改善を結果としてもたらす改変を伴う抗体である。一実施形態では、アフィニティー成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位、またはさらにはピコモル単位のアフィニティーを有する。アフィニティー成熟抗体は、当技術分野で公知の手順により作製される。Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年）は、ＶＨドメインシャフリングおよびＶＬドメインシャフリングによるアフィニティー成熟について記載している。ＣＤＲ残基および／またはフレームワーク残基に対するランダム突然変異誘発については、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９１巻：３８０９〜３８１３頁（１９９４年）；Ｓｃｈｉｅｒら、Ｇｅｎｅ、１６９巻：１４７〜１５５頁（１９９５年）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５巻：１９９４〜２００４頁（１９９５年）；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４巻（７号）：３３１０〜９頁（１９９５年）；およびＨａｗｋｉｎｓら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２６巻：８８９〜８９６頁（１９９２年）により記載されている。
「遮断」抗体または「アンタゴニスト」抗体とは、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害または低減する抗体である。ある特定の遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的または完全に阻害する。
本明細書で使用される「アゴニスト抗体」とは、目的のポリペプチドの機能的活性のうちの少なくとも１つを模倣する抗体である。
「障害」とは、本発明の抗体による処置から利益を得る任意の状態である。これは、哺乳動物に、問題の障害への素因を与える病理学的状態を含む、慢性障害および急性障害または慢性疾患および急性疾患を含む。本明細書で処置される障害の非限定的な例は、がんを含む。
「細胞増殖性障害」および「増殖性障害」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖と関連する障害を指す。一実施形態では、細胞増殖性障害は、がんである。
本明細書で使用される「腫瘍」とは、悪性であれ、良性であれ、全ての新生物性細胞成長および増殖を指し、全ての前がん性細胞および前がん性組織ならびにがん性細胞およびがん性組織を指す。本明細書で言及される通り、「がん」、「がん性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」、および「腫瘍」という用語は、相互に除外的ではない。
「がん」および「がん性」という用語は、典型的には、未調節の細胞成長／増殖によって特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を指すか、またはこれについて記載する。がんの例は、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、および白血病を含むがこれらに限定されない。このようながんのより具体的な例は、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、肺扁平上皮癌、腹膜がん、肝細胞がん、消化器がん、膵臓がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝癌、白血病、および他のリンパ増殖性障害、ならびに多様な種類の頭頸部がんを含む。
本明細書で使用される「処置」とは、処置される個体または細胞の自然経過を改変しようとする試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病態の経過中に実施することができる。処置の望ましい効果は、疾患の発症または再発の防止、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的帰結の減殺、炎症および／または組織／器官損傷の防止または低減、疾患の進行速度の低減、疾患状態の回復または軽減、および寛解または予後の改善を含む。一部の実施形態では、本発明の抗体を使用して、疾患または障害の発症を遅延させる。
「個体」または「対象」は、脊椎動物である。ある特定の実施形態では、脊椎動物は、哺乳動物である。哺乳動物は、農場動物（ウシなど）、競技動物、ペット（ネコ、イヌ、およびウマなど）、霊長動物、マウス、およびラットを含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、脊椎動物は、ヒトである。
処置を目的とする「哺乳動物」とは、ヒト、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなど、飼育動物および農場動物、ならびに動物園の動物、競技動物、またはペット動物を含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。ある特定の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
「有効量」とは、投与時において、かつ、所望の治療的結果または予防的結果を達成するのに必要な時間有効な量を指す。
本発明の物質／分子の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する物質／分子の能力などの因子に従い変化しうる。治療有効量はまた、物質／分子の任意の毒性効果または有害効果を、治療的に有益な効果が凌駕するときの量でもある。「予防有効量」とは、投与時において、かつ、所望の予防的結果を達成するのに必要な時間有効な量を指す。予防用量は、対象において、疾患の発症の前またはその早期に使用されるので、予防有効量は、治療有効量未満となることが典型的であろうが、必ずしもそうではない。
本明細書で使用される「細胞傷害剤」という用語は、細胞の機能を阻害もしくは防止し、かつ／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。用語は、放射性同位元素（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、およびＬｕの放射性同位元素）、化学療法剤（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロランブシル、ダウノルビシン、または他の挿入剤、核酸分解酵素などの酵素およびその断片、抗生剤、ならびに細菌由来、真菌由来、植物由来、または動物由来の低分子毒素または酵素活性毒素などの毒素であって、それらの断片および／または変異体を含む毒素、ならびに下記で開示される多様な抗腫瘍剤または抗がん剤を含むことを意図する。他の細胞傷害剤については、下記に記載する。殺腫瘍剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
「化学療法剤」とは、がんの処置において有用な化学化合物である。化学療法剤の例は、チオテパおよびシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）であるＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｉｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、およびトリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含めたエチレンイミンおよびメチルメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）；アセトゲニン（とりわけ、ブラタシンおよびブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体であるトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレチン（ｓｃｏｐｏｌｅｃｔｉｎ）、および９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン合成類似体、カルゼレシン合成類似体、およびビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体である、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；クロランブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｍａｐｈａｚｉｎｅ）、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどの窒素マスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）などのニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）；エンジイン抗生剤（例えば、カリケアマイシン、とりわけ、カリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．、３３巻：１８３〜１８６頁（１９９４年）を参照されたい）；ジネミシンＡを含むジネミシン；エスペラミシン；ならびにネオカルチノスタチン発色団、および関連の色素タンパク質である、エンジイン抗生剤（ａｎｔｉｏｂｉｏｔｉｃ）発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシンであるＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生剤；メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エフロルニチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシンおよびアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（とりわけ、Ｔ−２毒素、ベルカリンＡ、ロリジンＡ、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセルであるＴＡＸＯＬ（登録商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、パクリタキセルのＣｒｅｍｏｐｈｏｒ非含有アルブミン操作ナノ粒子製剤であるＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌｌ．）、およびドセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）であるＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｖｉｎ）；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤であるＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））；上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体；ならびにシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンによる組合せ療法の略号であるＣＨＯＰ、ならびにオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））を５−ＦＵおよびロイコボリンと組み合わせた処置レジメンの略号であるＦＯＬＦＯＸなど、上記のうちの２つまたはそれ超の組合せを含む。
Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ３、およびＳＳＥＡ−４を三重ターゲティングする抗体
本開示の一態様は、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ３、およびＳＳＥＡ−４を三重ターゲティングする新たな抗体を特徴とする。三重ターゲティング抗体は、Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（Ｇｌｏｂｏ Ｈ六糖）およびＧａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（ＳＳＥＡ−３五糖）およびＮｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（ＳＳＥＡ−４六糖）に特異的に結合する。一例では、三重ターゲティング抗体は、ｍＡｂ ６５１である。
ｍＡｂ ６５１とは、ハイブリドーマ細胞株により産生されるマウスモノクローナル抗体である。本明細書で記載される三重ターゲティング抗体は、ＭＣ６５１抗体と同じＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含有しうる。また、ＭＣ６５１と同じエピトープに結合する抗体も、本開示の範囲内にある。
Ｇｌｏｂｏ ＨおよびＳＳＥＡ３を二重ターゲティングする抗体
本開示の一態様は、Ｇｌｏｂｏ ＨおよびＳＳＥＡ３を二重ターゲティングする新たな抗体を特徴とする。二重ターゲティング抗体は、Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（Ｇｌｏｂｏ Ｈ六糖）およびＧａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（ＳＳＥＡ−３五糖）に特異的に結合する。一例では、二重ターゲティング抗体は、ｍＡｂ ２７３である。
ｍＡｂ ２７３とは、ハイブリドーマ細胞株により産生されるマウスモノクローナル抗体である。本明細書で記載される二重ターゲティング抗体は、ＭＣ２７３抗体と同じＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含有しうる。また、ＭＣ２７３と同じエピトープに結合する抗体も、本開示の範囲内にある。
ＳＳＥＡ４に特異的な抗体
本開示の一態様は、ＳＳＥＡ−４に特異的な、新たな抗体を特徴とする。抗ＳＳＥＡ−４抗体は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（ＳＳＥＡ−４六糖）に結合する。一部の例では、抗体は、Ｎｅｕ５Ｇｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（ＳＳＥＡ−４六糖の類似体）に結合することが可能である。抗体は、マウスＩｇＧ３（例えば、ｍＡｂ ＭＣ−８３１−７０）ではなく、抗体は、マウスＩｇＭ（例えば、抗ＲＭ１）ではないことが好ましい。抗体の例は、ｍＡｂ ４５およびｍＡｂ ４８を含むがこれらに限定されない。
ＭＣ４５モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株により産生される抗ＳＳＥＡ−４マウスモノクローナル抗体である。本明細書で記載される抗ＳＳＥＡ−４抗体は、ＭＣ４５抗体と同じＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含有しうる。また、ＭＣ４５と同じエピトープに結合する抗体も、本開示の範囲内にある。
モノクローナル抗体ＭＣ４８は、ハイブリドーマ細胞株により産生される。本明細書で記載される抗ＳＳＥＡ−４抗体は、抗体ＭＣ４８またはその変異体と同じＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含有しうる。また、ＭＣ４８と同じエピトープに結合する抗体も、本開示の範囲内にある。
本開示の一態様は、ＭＣ４８の修飾に基づくヒト化糖抗体を提供する。原型ならびにそれらのアミノ酸および核酸の構造／配列は、以下に提供される：
ＳＳＥＡ４に特異的な抗体およびその断片
本開示の一態様は、ＳＳＥＡ−４およびその断片に結合する、新たな抗体を特徴とする。抗ＳＳＥＡ−４抗体は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（ＳＳＥＡ−４六糖）およびＮｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１（ＳＳＥＡ−４六糖の断片）に結合する。一部の例では、抗体は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１に結合することが可能である。一部の例では、抗体は、Ｎｅｕ５Ｇｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（ＳＳＥＡ−４六糖の類似体）に結合することが可能である。一例では、抗体は、ｍＡｂ ４６である。
ＭＣ４６モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株により産生される。本明細書で記載される抗ＳＳＥＡ−４抗体は、ＭＣ４６抗体と同じＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含有しうる。また、ＭＣ４６と同じエピトープに結合する抗体も、本開示の範囲内にある。
「ＭＣ４５抗体」または「ｍＡｂ ４５」または「ＭＣ４５クローンに由来する抗体」とは、クローン４５に発現させた抗体、または他の方式で合成されているが、ＭＣ４５クローンに発現させた抗体と同じＣＤＲと、任意選択で、同じフレームワーク領域とを有する抗体を指す。同様に、ＭＣ４６抗体（ｍＡｂ ４６またはクローン４６）、ＭＣ４８抗体（ｍＡｂ ４８またはクローン４８）、ＭＣ２７３抗体（ｍＡｂ ２７３またはクローン２７３）、ＭＣ６５１抗体（ｍＡｂ ６５１またはクローン６５１）なども、対応するクローンに発現させた抗体、および／または他の方式で合成されているが、基準抗体と同じＣＤＲと、任意選択で、同じフレームワーク領域とを有する抗体を指す。
本明細書で記載される抗体のうちのいずれも、全長抗体またはその抗原結合性断片の場合がある。一部の例では、抗原結合性断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、または単鎖Ｆｖ断片である。一部の例では、抗原結合性断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、または単鎖Ｆｖ断片である。一部の例では、単離抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、または単鎖抗体である。
本明細書で記載される抗体のうちのいずれも、
ａ）組換え抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体断片、二特異性抗体、一特異性抗体、一価抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、または抗体の誘導体であること；ｂ）ヒト抗体、マウス抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体、抗原結合性断片、または抗体の誘導体であること；ｃ）単鎖抗体断片、マルチボディー、Ｆａｂ断片、ならびに／またはＩｇＧアイソタイプ、ＩｇＭアイソタイプ、ＩｇＡアイソタイプ、ＩｇＥアイソタイプ、ＩｇＤアイソタイプ、および／もしくはこれらのサブクラスの免疫グロブリンであること；ｄ）以下の特徴：（ｉ）がん細胞のＡＤＣＣおよび／もしくはＣＤＣを媒介すること；（ｉｉ）がん細胞のアポトーシスを誘導および／もしくは促進すること；（ｉｉｉ）がん細胞の標的細胞の増殖を阻害すること；（ｉｖ）がん細胞の食作用を誘導および／もしくは促進すること；ならびに／または（ｖ）細胞傷害剤の放出を誘導および／もしくは促進することのうちの１つまたは複数を有すること；ｅ）腫瘍特異的炭水化物抗原である、腫瘍関連炭水化物抗原に特異的に結合すること；ｆ）非がん細胞上、非腫瘍細胞上、良性がん細胞上、および／または良性腫瘍細胞上で発現する抗原に結合しないこと；ならびに／またはｇ）がん幹細胞上および通常のがん細胞上で発現する腫瘍関連炭水化物抗原に特異的に結合すること
のうちの１つまたは複数の特徴を有する。
抗体の、それらのそれぞれの抗原への結合は、特異的であることが好ましい。「特異的」という用語は、１つの結合対のメンバーが、その特異的結合パートナー以外の分子への著明な結合を示さず、例えば、本明細書で指定される分子以外の他の任意の分子との交差反応性が、約３０％未満、好ましくは、２０％、１０％、または１％である状況を指すのに一般に使用される。
抗体は、その標的エピトープに、高アフィニティー（低ＫＤ値）で結合するのに適し、ＫＤは、ナノモル単位の範囲またはこれより低値の範囲であることが好ましい。アフィニティーは、例えば、表面プラズモン共鳴など、当技術分野で公知の方法により測定することができる。
例示的な抗体調製物
本明細書で記載されるＧｌｏｂｏ ＨエピトープおよびＳＳＥＡ−４エピトープに結合することが可能な例示的な抗体は、当技術分野で公知の任意の方法により作製することができる。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
宿主動物の免疫化およびハイブリドーマ技術
抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体および抗ＳＳＥＡ−４抗体に対する例示的なポリクローナル抗体は、従来の任意の方法により、血清中の所望の抗体の増大について検討される免疫化哺乳動物から、血液を回収し、血清を血液から分離することにより調製することができる。ポリクローナル抗体は、ポリクローナル抗体を含有する血清を含み、同様に、ポリクローナル抗体を含有する画分は、血清から単離することができる。
ポリクローナル抗体は一般に、宿主動物（例えば、ウサギ、マウス、ウマ、またはヤギ）において、関連抗原およびアジュバントの、複数回の皮下（ｓｃ）注射または腹腔内（ｉｐ）注射により作製する。二官能性薬剤または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２などを使用して、関連抗原を、免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えば、スカシガイヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシン阻害剤にコンジュゲートさせることは、有用でありうる。
任意の哺乳動物は、所望の抗体を作製するための抗原で免疫化することができる。一般に、Ｒｏｄｅｎｔｉａ目、Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ目、またはＰｒｉｍａｔｅｓ目の動物を使用することができる。Ｒｏｄｅｎｔｉａ目の動物は、例えば、マウス、ラット、およびハムスターを含む。Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ目の動物は、例えば、ウサギを含む。Ｐｒｉｍａｔｅｓ目の動物は、例えば、Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、アカゲザル、ヒヒ、およびチンパンジーなど、Ｃａｔａｒｒｈｉｎｉ目のサル（旧世界ザル）を含む。
当技術分野では、動物を抗原で免疫化するための方法が公知である。抗原の腹腔内注射または皮下注射は、哺乳動物の免疫化のための標準的な方法である。より具体的には、抗原は、適量のリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）中、生理食塩液中などで希釈し、懸濁させることができる。所望の場合、抗原懸濁液は、フロイント完全アジュバントなど、適量の標準的なアジュバントと混合し、エマルジョンにして、次いで、哺乳動物に投与することができる。動物は、１ｍｇまたは１μｇのペプチドまたはコンジュゲート（それぞれ、ウサギ用またはマウス用）を、３体積のフロイント不完全アジュバントと組み合わせることにより、抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体に対して免疫化する。
動物には、力価がプラトーとなるまで、適量のフロイント不完全アジュバントと混合された抗原を、４〜２１日ごとに数回投与することにより追加免疫することができる。動物には、フロイント完全アジュバント中に元の量の５分の１〜１０分の１のペプチドまたはコンジュゲートを、複数の部位における皮下注射により追加免疫する。７〜１４日後、動物から採血し、血清を、抗体力価についてアッセイする。適切な担体はまた、免疫化のためにも使用することができる。上記の免疫化の後で、血清を、標準的な方法により、所望の抗体の量の増大について検討する。好ましくは、動物には、同じ抗原のコンジュゲートを追加免疫するが、異なるタンパク質へ、かつ／または異なる架橋試薬を介してコンジュゲートさせる。コンジュゲートはまた、組換え細胞培養物中で、タンパク質融合体としても作製することができる。また、アラムなどの凝集剤も、免疫応答を増強するのに使用すると適切である。
過去２０〜３０年間にわたり、ヒトｉｎ ｖｉｖｏにおける治療適用のためのキメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体を調製する、多数の方法が開発されている。最もよく使用され、実績のある方法は、ハイブリドーマ法を使用してマウスｍＡｂを調製し、次いで、ＶＨドメインおよびＶＬドメインのフレームワーク領域、ならびにｍＡｂの定常ドメインを、ヒトＶＨドメインおよびＶＬドメインの、最も相同なヒトフレームワーク領域、ならびに望ましいヒトγ免疫グロブリンのアイソタイプおよびサブクラスの定常領域に転換することにより、ｍＡｂをヒト化することである。臨床で使用されるＸｏｌａｉｒなど、多くのｍＡｂは、ヒトγ１アイソタイプおよびヒトγ１サブクラスならびにヒトκアイソタイプおよびヒトκサブクラスのヒト化ｍＡｂであり、この方法を使用して調製される。
一部の実施形態では、抗体は、従来のハイブリドーマ技術により作製することができる（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５頁（１９７５年））。ハイブリドーマ法では、マウス、または、ハムスターもしくはウサギなど、他の適切な宿主動物を、本明細書の上で記載した通りに免疫化して、免疫化のために使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、またはこれらを産生することが可能なリンパ球を誘発する。代替的に、リンパ球は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化することもできる。
モノクローナル抗体を調製するために、免疫細胞を、抗原で免疫化された哺乳動物から回収し、上で記載した、血清中に高レベルの所望の抗体について点検し、細胞融合にかける。細胞融合のために使用される免疫細胞は、脾臓から得ることが好ましい。上記の免疫細胞と融合させる、他の好ましい親細胞は、例えば、哺乳動物の骨髄腫細胞、より好ましくは、融合細胞を薬物により選択するための獲得特性を有する骨髄腫細胞を含む。
好ましい骨髄腫細胞は、融合が効率的であり、選択された抗体産生細胞による安定的で高レベルの抗体の産生を支援し、ＨＡＴ培地などの培地に対して感受性の骨髄腫細胞である。これらの中で、好ましい骨髄腫細胞株は、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１マウス腫瘍およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ． ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２細胞に由来するマウス骨髄腫細胞株などのマウス骨髄腫細胞株である。また、ヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の作製について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３巻：３００１頁（１９８４年）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７年））。
上記の免疫細胞および骨髄腫細胞は、公知の方法、例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎらによる方法（Ｇａｌｆｒｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、７３巻：３〜４６頁、１９８１年）に従い融合させることができる。ハイブリドーマ細胞を形成するように、ポリエチレングリコールなど、適切な融合剤を使用して、リンパ球を骨髄腫細胞と融合させる（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８６年））。細胞融合により結果として得られるハイブリドーマは、それらを、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含有する培地）など、標準的な選択培地中で培養することにより選択することができる。細胞の培養は、典型的にはＨＡＴ培地中で数日間〜数週間持続させ、その時間は、所望のハイブリドーマ（非融合細胞）を除き、他の全ての細胞を死滅させるのに十分である。次いで、標準的な限界希釈を実施して、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングおよびクローニングする。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、好ましくは非融合親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つまたは複数の物質を含有する、適切な培養培地中に播種し、成長させる。例えば、親骨髄腫細胞が、酵素である、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的にはＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を防止する物質である、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を含む。
ハイブリドーマ細胞が成長する培養培地を、抗原を指向するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにより決定する。酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および／または免疫蛍光における吸光度の測定を使用して、本発明の抗体の抗原結合活性を測定することができる。ＥＬＩＳＡでは、本発明の抗体を、プレート上に固定化し、本発明のタンパク質をプレートに適用し、次いで、抗体産生細胞の培養物上清または精製抗体など、所望の抗体を含有する試料を適用する。次いで、一次抗体を認識し、アルカリホスファターゼなどの酵素で標識された二次抗体を適用し、プレートをインキュベートする。次に、洗浄の後で、ｐ−ニトロフェニルリン酸などの酵素基質を、プレートに添加し、吸光度を測定して、試料の抗原結合活性を査定する。この方法では、Ｃ末端断片またはＮ末端断片など、タンパク質の断片を使用することができる。ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、本発明に従う抗体の活性を査定することができる。モノクローナル抗体の結合アフィニティーは、例えば、Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７巻：２２０頁（１９８０年）のスキャッチャード解析により決定することができる。
上で記載した方法を含む従来の方法のうちのいずれかを適用して、本明細書で記載されるエピトープに結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、さらなる特徴付けのために同定および選択することができる。
所望の特異性、アフィニティー、および／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後で、クローンを、限界希釈手順によりサブクローニングし、標準的な方法により成長させる（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８６年））。この目的に適する培養培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭ培地またはＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなど、従来の免疫グロブリン精製手順により、培養培地、腹水、または血清から適切に分離される。
加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍として、ｉｎ ｖｉｖｏで成長させることもできる。例えば、得られるハイブリドーマは、その後、マウスの腹腔に移植することができ、腹水を採取する。
得られるモノクローナル抗体は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、プロテインＡカラムもしくはプロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、または本発明のタンパク質をカップリングさせたアフィニティーカラムにより精製することができる。本発明の抗体は、本発明のタンパク質を精製および検出するためだけでなく、また、本発明のタンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストのための候補物質としても使用することができる。加えて、この抗体は、本発明のタンパク質と関連する疾患のための、抗体による処置へも適用することができる。
組換え技術
このようにして得られたモノクローナル抗体はまた、遺伝子操作技法を使用して、組換えにより調製することもできる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ Ｃ． Ａ． Ｋ．およびＬａｒｒｉｃｋ Ｊ． Ｗ．、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ ＬＴＤ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ刊、１９９０年を参照されたい）。抗体をコードするＤＮＡを、抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫化リンパ球などの免疫細胞からクローニングし、適切なベクターに挿入し、宿主細胞に導入して、組換え抗体を調製することができる。本発明はまた、上で記載したように調製した組換え抗体も提供する。
得られた抗体を、ヒト体内に投与する場合（抗体による処置）、免疫原性を低減するために、ヒト抗体またはヒト化抗体が好ましい。例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物は、タンパク質、タンパク質発現細胞、またはそれらの溶解物から選択される抗原で免疫化することができる。次いで、抗体産生細胞を動物から回収し、骨髄腫細胞と融合させて、タンパク質に対するヒト抗体を調製しうるハイブリドーマを得る。代替的に、抗体を産生する免疫化リンパ球などの免疫細胞は、がん遺伝子により不死化し、モノクローナル抗体を調製するために使用することができる。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、たやすく単離およびシークェンシングすることができる。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として用いられる。単離されたら、ＤＮＡを、発現ベクターに入れ、次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはこれ以外では免疫グロブリンタンパク質が産生されない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞内のモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体をコードするＤＮＡの、細菌内の組換え発現についての総説論文は、Ｓｋｅｒｒａら、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５巻：２５６〜２６２頁（１９９３年）およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ．、１３０巻：１５１〜１８８頁（１９９２年）を含む。
上で記載したハイブリドーマ細胞により産生される抗体をコードするＤＮＡを、日常的な技術を介して遺伝子改変して、遺伝子操作された抗体を作製することができる。ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、および二特異性抗体などの遺伝子操作された抗体は、例えば、従来の組換え技術を介して作製することができる。次いで、例えば、ヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメインのコード配列で、相同なマウス配列を置換すること（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、８１巻：６８５１頁）により、または、免疫グロブリンのコード配列へ、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部または一部を共有結合的に接合することにより修飾することができる。このようにして、標的抗原への結合特異性を有する、「キメラ」抗体または「ハイブリッド」抗体などの遺伝子操作された抗体を調製することができる。
当技術分野では、「キメラ抗体」の作製のために開発された技法が周知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８１巻、６８５１頁；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（１９８４年）、Ｎａｔｕｒｅ、３１２巻、６０４頁；およびＴａｋｅｄａら（１９８４年）、Ｎａｔｕｒｅ、３１４巻：４５２頁を参照されたい。
このような非免疫グロブリンポリペプチドで、抗体の定常ドメインを置換するか、または抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインを置換して、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位とを含む、キメラ二価抗体を創出することが典型的である。
キメラ抗体またはハイブリッド抗体はまた、架橋剤を伴う方法を含む、合成タンパク質化学において公知の方法を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで調製することもできる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することにより構築することができる。この目的に適する試薬の例は、イミノチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｔｅ）およびメチル−４−メルカプトブチルイミデートを含む。
当技術分野では、非ヒト抗体をヒト化するための方法が周知である。一般に、ヒト化抗体には、非ヒト供給源に由来する１つまたは複数のアミノ酸残基が導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と称することが多く、これは、「移入」可変ドメインから採取されることが典型的である。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らによる方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２７頁（１９８８年）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４〜１５３６頁（１９８８年））に従い、齧歯動物ＣＤＲまたは齧歯動物ＣＤＲ配列で、ヒト抗体の対応する配列を置換することにより、本質的に実施することができる。したがって、このような「ヒト化」抗体とは、実質的に無傷のヒト可変ドメインが、非ヒト種に由来する対応する配列で置換されているキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際は、ヒト化抗体は、一部のＣＤＲ残基と、おそらく、一部のＦＲ残基とが、齧歯動物抗体内の類似の部位に由来する残基で置換されているヒト抗体であることが典型的である。
ヒト化抗体を作製するのに使用される、軽鎖ヒト可変ドメインおよび重鎖ヒト可変ドメインのいずれの選択も、抗原性を低減するのに非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法に従い、齧歯動物抗体の可変ドメイン配列を、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに照らしてスクリーニングする。次いで、齧歯動物の配列に最も近接するヒト配列を、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として受容する（Ｓｉｍｓら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２２９６頁（１９９３年）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１９６巻：９０１頁（１９８７年））。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定の亜群についての、全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体のために使用することができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９巻：４２８５頁（１９９２年）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ． Ｉｍｍｎｏｌ．、１５１巻：２６２３頁（１９９３年））。
抗原に対する高アフィニティーおよび他の好適な生物学的特性を保持するように抗体をヒト化することは、さらに重要である。この目標を達成するために、好ましい方法に従い、ヒト化抗体を、親配列およびヒト化配列についての三次元モデルを使用する、親配列および多様な概念上のヒト化産物についての解析工程により調製する。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり、当業者は、これに精通している。選択された候補免疫グロブリン配列についての、蓋然的な三次元コンフォメーショナル構造を例示および表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示について検討することにより、候補免疫グロブリン配列の機能において推定される残基の役割についての解析、すなわち、候補免疫グロブリンが、その抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基についての解析が可能となる。このようにして、標的抗原に対するアフィニティーの増大など、所望の抗体特徴を達成するように、ＦＲ残基は、レシピエント配列および移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原への結合に対する影響に、直接、かつ、極めて実質的に関与する。
今や、代替的に、免疫化されると、内因性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することもできる。例えば、キメラの生殖細胞株列突然変異マウスにおける、抗体重鎖接合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性の欠失の結果として、内因性抗体産生の完全な阻害がもたらされることが記載されている。ヒト生殖細胞株列免疫グロブリン遺伝子アレイを、このような生殖細胞株列突然変異マウスに導入する結果として、抗原感作におけるヒト抗体の産生がもたらされる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０巻：２５５１頁（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻：２５５〜２５８頁（１９９３年）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．、７巻：３３頁（１９９３年）を参照されたい。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーから導出することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２７巻：３８１頁（１９９１年）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年））。
また、本明細書で記載される抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体および抗ＳＳＥＡ−４抗体（重鎖、軽鎖、またはこれらの両方を含む）をコードする核酸、核酸のうちの１つまたは複数を含む発現ベクターなどのベクター、およびベクターのうちの１つまたは複数を含む宿主細胞のうちのいずれも、本開示の範囲内にある。一部の例では、ベクターは、本明細書で記載される抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。一部の例では、ベクターは、本明細書で記載される抗ＳＳＥＡ−４抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。他の例では、ベクターは、それらの発現が、単一のプロモーターまたは２つの別個のプロモーターにより制御される場合がある、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方をコードするヌクレオチド配列を含む。本明細書ではまた、例えば、このセクションで記載される組換え技術を介して、本明細書で記載される抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体および抗ＳＳＥＡ−４抗体のうちのいずれかを作製するための方法も提供される。
抗体を調製するための他の技術
他の実施形態では、完全ヒト抗体は、特異的なヒト免疫グロブリンタンパク質を発現させるように操作された市販のマウスを使用することにより得ることができる。また、より所望される免疫応答（例えば、完全ヒト抗体）またはより頑健な免疫応答をもたらすようにデザインされたトランスジェニック動物も、ヒト化抗体またはヒト抗体の作製のために使用することができる。このような技術の例は、Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆ．）製のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（登録商標）、ならびにＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）製のＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＴＣ Ｍｏｕｓｅ（商標）である。別の代替法では、抗体は、ファージディスプレイ技術による組換えにより作製することができる。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号；同第５，５８０，７１７号；同第５，７３３，７４３号；および同第６，２６５，１５０号；ならびにＷｉｎｔｅｒら（１９９４年）、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２巻：４３３〜４５５頁を参照されたい。代替的に、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０年）、Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻：５５２〜５５３頁）を使用して、ヒト抗体および抗体断片を、非免疫化ドナーに由来する免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて産生することもできる。
無傷抗体（全長抗体）の抗原結合性断片は、日常的な方法を介して調製することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗体分子のペプシン消化により作製することができ、Ｆａｂ断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより作り出すことができる。
代替的に、本明細書で記載される抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体および抗ＳＳＥＡ−４抗体は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻：５５２〜５５４頁（１９９０年）；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）；およびＭａｒｋｓら、Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年）において記載されている技法を使用して作り出された抗体ファージライブラリー（例えば、単鎖抗体ファージライブラリー）から単離することができる。以下の刊行物は、鎖シャフリングによる高アフィニティー（ｎＭ範囲）のヒト抗体の作製（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年））、ならびに非常に大規模なファージライブラリーを構築するための戦略としての、コンビナトリアル感染およびｉｎ ｖｉｖｏにおける組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ．、２１巻：２２６５〜２２６６頁（１９９３年））について記載している。こうして、これらの技法は、モノクローナル抗体を単離するための、従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技法に対する実行可能な代替法である。
本明細書で記載される通りに得られた抗体は、均質となるまで精製することができる。例えば、抗体の分離および精製は、一般のタンパク質のために使用される分離法および精製法に従い実施することができる。例えば、抗体は、アフィニティークロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点分離法、およびその他の分離法および精製法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年）であるがこれらに限定されない分離法および精製法を、適切に選択し、組み合わせて使用することにより、分離および単離することができる。上記の通りに得られた抗体の濃度は、吸光度の測定、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などにより決定することができる。アフィニティークロマトグラフィーを除く例示的なクロマトグラフィーは、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなど（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ、Ｄａｎｉｅｌ Ｒ． Ｍａｒｓｈａｋら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９６年）を含む。クロマトグラフィー手順は、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣなどの液相クロマトグラフィーにより実行することができる。
抗体は、当技術分野で周知の方法を使用して特徴付けることができる。例えば、１つの方法は、抗原が結合するエピトープを同定すること、または「エピトープマッピング」である。当技術分野では、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９９９年の１１章において記載されている、抗体−抗原複合体の結晶構造の分解、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、および合成ペプチドベースのアッセイを含む、タンパク質上のエピトープの位置をマッピングし特徴付けるための多く方法が公知である。さらなる例では、エピトープマッピングを使用して、抗体が結合する配列を決定することができる。エピトープは、直鎖状エピトープ、すなわち、アミノ酸の単一の連なりの中に含有される直鎖状エピトープ、または単一の連なり（一次構造の直鎖状配列）の中に必ずしも含有されない可能性があるアミノ酸の三次元的相互作用により形成される、コンフォメーショナルエピトープの場合がある。長さを変化させるペプチド（例えば、少なくとも４〜６アミノ酸の長さ）を単離または合成し（例えば、組換えにより）、抗体を伴う結合アッセイのために使用することができる。別の例では、抗体が結合するエピトープは、標的抗原配列に由来する重複ペプチドを使用し、抗体による結合を決定することにより、体系的スクリーニングで決定することができる。遺伝子断片発現アッセイに従い、標的抗原をコードするオープンリーディングフレームを、ランダムに、または特異的遺伝子構築により断片化し、発現した抗原の断片の、被験抗体との反応性を決定する。例えば、ＰＣＲにより遺伝子断片を作製し、次いで、放射性アミノ酸の存在下、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、タンパク質に転写および翻訳させることができる。次いで、抗体の、放射性標識された抗原断片への結合を、免疫沈降およびゲル電気泳動により決定する。ある特定のエピトープはまた、ファージ粒子の表面上で表示されるランダムなペプチド配列の大規模ライブラリー（ファージライブラリー）を使用することにより同定することもできる。代替的に、重複ペプチド断片の規定されたライブラリーは、単純な結合アッセイにおいて、試験抗体への結合について調べることができる。
さらなる例では、抗原結合性ドメインに対する突然変異誘発、ドメインスワッピング実験、およびアラニン走査突然変異誘発を実施して、エピトープの結合に要請され、十分であり、かつ／または必要な残基を同定することができる。例えば、ドメインスワッピング実験は、候補抗体に対する結合エピトープ内の多様な残基が、近縁であるが抗原的に顕著に異なるタンパク質（ニュートロフィンタンパク質ファミリーの別のメンバーなど）に由来する配列で置きかえられた（スワッピングされた）、標的抗原の突然変異体を使用して実施することができる。抗体の、突然変異体の標的タンパク質への結合を評価することにより、特定の抗原断片の、抗体の結合に対する重要性を評価することができる。
代替的に、競合アッセイは、抗体（例えば、本明細書で記載されるＭＣ４５抗体）が、他の抗体と同じエピトープに結合するのかどうかを決定するように、同じ抗原に結合することが公知の他の抗体を使用して実施することができる。競合アッセイは、当業者に周知である。
例示的で適切な一般的抗体作製法のさらなる態様
当技術分野では、動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、またはウマ）においてモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体ならびにこれらの断片を作製する方法が周知である。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。「抗体」という用語は、無傷の免疫グロブリン分子のほか、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖抗体）、およびｄＡｂ（ドメイン抗体；Ｗａｒｄら（１９８９年）、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻、５４４頁）など、これらの断片を含む。
本明細書で開示される組成物は、本開示を読んだ当業者に同定可能な、さらなる活性剤、担体、媒体、賦形剤、または補助剤と併せて、医薬組成物中に含むことができる。
医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含むことが好ましい。このような医薬組成物中で、本明細書で開示される組成物は、「活性剤」とも称する「活性化合物」を形成する。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という表現は、医薬品の投与と適合性の、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。また、補助的な活性化合物も、組成物に組み込むことができる。医薬組成物は、その意図された投与経路と適合性となるように製剤化する。投与経路の例は、非経口投与、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口（例えば、吸入）投与、経皮（局所）投与、経粘膜投与、および直腸内投与を含む。非経口適用、皮内適用、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の構成要素：注射用水、生理食塩液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの滅菌希釈液；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；酢酸、クエン酸、またはリン酸などの緩衝剤；および塩化ナトリウムまたはテキストロースなど、張性を調整するための薬剤を含みうる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。非経口調製物は、アンプル内、使い捨て型のシリンジ内、またはガラス製もしくはプラスチック製の複数回投薬用バイアル内に封入することができる。
少なくとも１つの抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体、または抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体をコードする配列を含む、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物が提供される。ある特定の実施形態では、組成物は、医薬組成物でありうる。本明細書で使用される、組成物は、１つもしくは複数のＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈに結合する１つもしくは複数の抗体、および／または１つもしくは複数のＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈに結合する１つもしくは複数の抗体をコードする配列を含む、１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、当技術分野で周知の緩衝剤を含む、薬学的に許容される賦形剤などの適切な担体もさらに含みうる。
また、単離抗体およびポリヌクレオチドも提供される。ある特定の実施形態では、単離抗体およびポリヌクレオチドは、実質的に純粋である。
一実施形態では、抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体は、モノクローナル抗体である。別の実施形態では、抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体の断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、およびＦ（ａｂ’）２断片）が提供される。これらの抗体断片は、酵素的消化など、従来の手段により創出することもでき、組換え技法により作り出すこともできる。このような抗体断片は、キメラ抗体断片、ヒト化抗体断片、またはヒト抗体断片の場合がある。これらの断片は、下記に示される診断目的および治療目的に有用である。
当技術分野では、目的の抗体を得られうる、ファージディスプレイライブラリーを作り出すための様々な方法が公知である。目的の抗体を作り出す１つの方法は、Ｌｅｅら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．（２００４年）、３４０巻（５号）：１０７３〜９３頁において記載されている、ファージ抗体ライブラリーの使用を介する。
本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体は、コンビナトリアルライブラリーを使用して、１つまたは複数の所望の活性を伴う合成抗体クローンについてスクリーニングすることにより作製することができる。原則として、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質に融合させた、抗体可変領域の多様な断片（Ｆｖ）を表示するファージを含有するファージライブラリーをスクリーニングすることにより選択する。このようなファージライブラリーを、所望の抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによりパニングする。所望の抗原に結合することが可能なＦｖ断片を発現させるクローンを、抗原に吸着させ、これにより、ライブラリー内の非結合性クローンから分離する。次いで、結合性クローンを抗原から溶出させ、さらなる抗原吸着／溶出サイクルにより、さらに富化することができる。本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体のうちのいずれかは、適切な抗原スクリーニング手順をデザインして、目的のファージクローンについて選択した後で、目的のファージクローンに由来するＦｖ配列と、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ第９１−３２４２号、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．（１９９１年）、１〜３巻において記載されている、適切な定常領域（Ｆｃ）配列とを使用して、全長抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体クローンを構築することにより得ることができる。
抗体の抗原結合性ドメインは、約１１０アミノ酸の２つの可変（Ｖ）領域であって、１つずつが軽（ＶＬ）鎖および重（ＶＨ）鎖に由来し、いずれもが、３つの超可変ループまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）を提示する、Ｖ領域から形成される。Ｗｉｎｔｅｒら、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２巻：４３３〜４５５頁（１９９４年）において記載される通り、可変ドメインは、ＶＨとＶＬとが、短い可撓性ペプチドを介して共有結合的に連結された、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、またはそれらの各々が、定常ドメインに融合し、非共有結合的に相互作用する、Ｆａｂ断片として、ファージ上に機能的に表示することができる。本明細書で使用される、ｓｃＦｖをコードするファージクローンおよびＦａｂをコードするファージクローンを、まとめて、「Ｆｖファージクローン」または「Ｆｖクローン」と称する。
ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングし、ファージライブラリー内でランダムに組み換えることができ、次いで、これを、Ｗｉｎｔｅｒら、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２巻：４３３〜４５５頁（１９９４年）において記載されている通り、抗原結合性クローンについて検索することができる。免疫化供給源に由来するライブラリーは、ハイブリドーマの構築を要請せずに、免疫原に対する高アフィニティー抗体を提供する。代替的に、ナイーブレパートリーをクローニングして、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯ Ｊ、１２巻：７２５〜７３４頁（１９９３年）により記載される通り、免疫化を伴わずに、広範にわたる、非自己抗原に対するヒト抗体と、また自己抗原に対するヒト抗体とによる、単一の供給源を提供することもできる。最後に、ナイーブライブラリーはまた、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２７巻：３８１〜３８８頁（１９９２年）により記載されている通り、幹細胞に由来する、再配置されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダムな配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して、高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける再配置を達成することにより、合成で作製することもできる。
繊維状ファージを、マイナーコートタンパク質ｐＩＩＩへの融合により抗体断片を表示するのに使用する。抗体断片は、例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年）により記載されている通り、ＶＨドメインとＶＬドメインとが、同じポリペプチド鎖上で、可撓性のポリペプチドスペーサーにより接続される、単鎖Ｆｖ断片として、または、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９巻：４１３３〜４１３７頁（１９９１年）において記載されている通り、一方の鎖が、ｐＩＩＩに融合し、他方の鎖が、細菌宿主細胞ペリプラズムに分泌され、ここで、Ｆａｂ−コートタンパク質構造のアセンブリーが、野生型コートタンパク質の一部を取り換えることにより、ファージ表面上に提示される、Ｆａｂ断片として表示することができる。
一般に、抗体遺伝子断片をコードする核酸は、ヒトまたは動物から採取された免疫細胞から得られる。抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈクローンに好適なバイアスのかかったライブラリーが所望される場合、対象を、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈで免疫化して、抗体応答を発生させ、脾臓細胞および／もしくは循環Ｂ細胞、または他の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、ライブラリー構築のために回収する。一実施形態では、抗ヒトＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈクローンに好適なバイアスのかかったヒト抗体遺伝子断片ライブラリーは、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈによる免疫化から、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈに対するヒト抗体を産生するＢ細胞がもたらされるように、機能的なヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを保有する（かつ、機能的な内因性抗体産生系を欠く）トランスジェニックマウスにおいて、抗ヒトＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体応答を発生させることにより得る。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスの作製については、下記に記載する。
抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ反応性細胞集団についてのさらなる富化は、例えば、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈアフィニティークロマトグラフィーによる細胞の分離、または蛍光色素標識されたＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈへの細胞の吸着に続く、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）による、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ特異的抗体を発現させるＢ細胞を単離するのに適するスクリーニング手順を使用することにより得ることができる。
代替的に、非免疫化ドナーに由来する、脾臓細胞および／もしくはＢ細胞、または他のＰＢＬの使用から、可能な抗体レパートリーの、より良好な表示がもたらされ、また、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈが抗原性でない任意の動物（ヒトまたは非ヒト）種を使用する、抗体ライブラリーの構築も可能となる。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける抗体遺伝子の構築を組み込むライブラリーのためには、幹細胞を対象から採取して、再配置されていない抗体遺伝子セグメントをコードする核酸を得る。目的の免疫細胞は、ヒト種、マウス種、ラット種、ウサギ目動物種、オオカミ科動物種、イヌ科動物種、ネコ科動物種、ブタ科動物種、ウシ科動物種、ウマ科動物種、および鳥類種など、様々な動物種から得ることができる。
抗体可変遺伝子セグメント（ＶＨセグメントおよびＶＬセグメントを含む）をコードする核酸を、目的の細胞から回収し、増幅した。再配置されたＶＨ遺伝子ライブラリーおよびＶＬ遺伝子ライブラリーの場合、所望のＤＮＡは、Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８６巻：３８３３〜３８３７頁（１９８９年）において記載される通り、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡを、リンパ球から単離した後で、再配置されたＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子の５’末端および３’末端にマッチするプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を施し、これにより、発現のための、多様なＶ遺伝子レパートリーを作製することにより得ることができる。Ｖ遺伝子は、Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９年）およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻：５４４〜５４６頁（１９８９年）において記載されている通り、成熟Ｖドメインをコードするエクソンの５’末端におけるバックプライマーと、Ｊセグメントに基づくフォワードプライマーとにより、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡから増幅することができる。しかし、ｃＤＮＡから増幅するためには、バックプライマーはまた、Ｊｏｎｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、９巻：８８〜８９頁（１９９１年）において記載されている通り、リーダーエクソン、およびＳａｓｔｒｙら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８６巻：５７２８〜５７３２頁（１９８９年）において記載されている通り、定常領域内のフォワードプライマーに基づく場合がある。相補性を最大化するため、Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９年）、またはＳａｓｔｒｙら（１９８９年）において記載されている通り、プライマー内に縮重を組み込むことができる。ある特定の実施形態では、例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年）による方法において記載されている通り、またはＯｒｕｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１巻：４４９１〜４４９８頁（１９９３年）による方法において記載されている通り、免疫細胞の核酸試料中に存在する、全ての利用可能なＶＨ配置およびＶＬ配置を増幅するために、各Ｖ遺伝子ファミリーにターゲティングされたＰＣＲプライマーを使用することにより、ライブラリーの多様性を最大化する。増幅されたＤＮＡを、発現ベクターにクローニングするために、Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９年）において記載されている通り、まれな制限部位を、ＰＣＲプライマー内に、一方の端部におけるタグとして、または、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）において記載されている通り、タグ付けされたプライマーを伴う、さらなるＰＣＲ増幅により導入することができる。
合成により再配置されたＶ遺伝子のレパートリーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、Ｖ遺伝子セグメントから導出することができる。ヒトＶＨ遺伝子セグメントの大半は、クローニングおよびシークェンシングされ（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２７巻：７７６〜７９８頁（１９９２年）において報告されている）、マッピングされており（Ｍａｔｓｕｄａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、３巻：８８〜９４頁（１９９３年）において報告されている）；ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２７巻：３８１〜３８８頁（１９９２年）において記載されている通り、これらのクローニングされたセグメント（Ｈ１ループおよびＨ２ループの全ての主要なコンフォメーションを含む）を使用して、多様な配列および長さのＨ３ループをコードするＰＣＲプライマーにより、多様なＶＨ遺伝子レパートリーを作り出すことができる。また、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９巻：４４５７〜４４６１頁（１９９２年）において記載される通り、単一の長さの長いＨ３ループに焦点を当てた、全ての配列多様性を伴うＶＨレパートリーを作製することもできる。ヒトＶκセグメントおよびＶλセグメントは、クローニングおよびシークェンシングされており（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３巻：１４５６〜１４６１頁（１９９３年）において報告されている）、合成軽鎖レパートリーを作製するのに使用することができる。ＶＨおよびＶＬのフォールドの範囲、ならびにＬ３およびＨ３の長さに基づく、合成によるＶ遺伝子レパートリーは、大幅な構造的多様性を有する抗体をコードする。Ｖ遺伝子をコードするＤＮＡの増幅の後、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２７巻：３８１〜３８８頁（１９９２年）による方法に従い、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、生殖細胞株列のＶ遺伝子セグメントを再配置することができる。
抗体断片のレパートリーは、ＶＨ遺伝子レパートリーと、ＶＬ遺伝子レパートリーとを、いくつかの方式で一体に組み合わせることにより構築することができる。各レパートリーは、異なるベクター内で創出することができ、ベクターは、例えば、Ｈｏｇｒｅｆｅら、Ｇｅｎｅ、１２８巻：１１９〜１２６頁（１９９３年）において記載されている通り、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、またはｉｎ ｖｉｖｏにおけるコンビナトリアル感染、例えば、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１巻：２２６５〜２２６６頁（１９９３年）において記載されているｌｏｘＰ系により組み換えることができる。ｉｎ ｖｉｖｏにおける組換え手法では、Ｆａｂ断片の２本鎖としての性質を利用して、Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換効率により付与される、ライブラリーサイズに対する制限を克服する。ナイーブＶＨレパートリーと、ナイーブＶＬレパートリーとは、一方はファージミドへ、他方はファージベクターに、個別にクローニングする。次いで、各細胞が、異なる組合せを含有し、ライブラリーサイズが、存在する細胞の数（クローン約１０１２個）だけにより制限されるように、２つのライブラリーを、ファージミド含有細菌へのファージ感染により組み合わせる。ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子が、単一のレプリコンに組み換えられ、ファージビリオンに共パッケージングされるように、いずれのベクターも、ｉｎ ｖｉｖｏにおける組換えシグナルを含有する。これらの巨大ライブラリーは、アフィニティーの良好な（約１０−８ＭのＫｄ−１）多数の多様な抗体をもたらす。
代替的に、レパートリーは、例えば、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８８巻：７９７８〜７９８２頁（１９９１年）において記載されている通り、同じベクターに逐次的にクローニングする、または、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）において記載されている通り、ＰＣＲにより一体にアセンブルし、次いで、クローニングすることができる。また、ＰＣＲアセンブリーも、ＶＨ ＤＮＡおよびＶＬ ＤＮＡを、可撓性のペプチドスペーサーをコードするＤＮＡと接合して、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）レパートリーを形成するのに使用することができる。さらに別の技法では、Ｅｍｂｌｅｔｏｎら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０巻：３８３１〜３８３７頁（１９９２年）において記載されている通り、「インセルＰＣＲアセンブリー」を使用して、ＶＨ遺伝子とＶＬ遺伝子とを、リンパ球内で、ＰＣＲにより組み合わせ、次いで、連結された遺伝子のレパートリーをクローニングする。
ライブラリーのスクリーニングは、当技術分野で公知の任意の技法により達成することができる。例えば、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ標的は、吸着プレートのウェルをコーティングし、吸着プレートに固定された宿主細胞上で発現させるのに使用することも、細胞分取で使用することも、ストレプトアビジンコーティングビーズによる捕捉のために、ビオチンにコンジュゲートさせることも、ファージディスプレイライブラリーをパニングするための当技術分野で公知の、他の任意の方法において使用することもできる。
ファージライブラリー試料は、ファージ粒子のうちの少なくとも一部分と吸着材との結合に適する条件下で、固定化されたＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈと接触させる。通常、ｐＨ、イオン強度、温度などを含む条件は、生理学的条件を模倣するように選択する。固相に結合したファージは、洗浄し、次いで、例えば、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８８巻：７９７８〜７９８２頁（１９９１年）において記載されている通り、酸により、または、例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年）において記載されている通り、アルカリにより、または、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）による抗原競合法と類似の手順における、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗原の競合により溶出させる。ファージは、単一のラウンドの選択で約２０×〜約１，０００倍に富化することができる。さらに、富化されたファージは、細菌培養物中で成長させ、さらなるラウンドの選択にかけることができる。
選択の効率は、洗浄時における解離反応速度、および単一のファージ上の複数の抗体断片が、抗原と同時に係合しうるのかどうかを含む多くの因子に依存する。解離反応速度が速く（かつ、結合アフィニティーが弱い）抗体は、短い洗浄、多価ファージディスプレイ、および固相内の抗原の高いコーティング密度を使用することにより保持することができる。高密度は、多価相互作用を介してファージを安定化させるだけでなく、解離したファージの再結合に好適でもある。解離反応速度が遅く（かつ、結合アフィニティーが良好な）抗体の選択は、Ｂａｓｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、８巻：３０９〜３１４頁（１９９０年）およびＷＯ９２／０９６９０において記載されている通り、長い洗浄および一価ファージディスプレイ、ならびにＭａｒｋｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年）において記載されている通り、抗原の低コーティング密度を使用することにより促進することができる。
ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈに対するアフィニティーがわずかに異なる場合でもなお、アフィニティーの異なるファージ抗体の間で選択することは可能である。しかし、選択された抗体のランダム突然変異（例えば、上で記載したアフィニティー成熟技法の一部において実施される）は、大半が抗原に結合し、少数はより高いアフィニティーで結合する多くの突然変異体をもたらす可能性が高い。ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈを制限すると、まれに、高アフィニティーのファージも競合に耐えない可能性がある。全てのより高いアフィニティーの突然変異体を保持するため、ファージは、過剰なビオチニル化ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈと共にインキュベートすることもできるが、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈの標的モルアフィニティー定数より低いモル濃度のビオチニル化ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈと共にインキュベートすることもできる。次いで、高アフィニティー結合性ファージは、ストレプトアビジンコーティング常磁性ビーズにより捕捉することができる。このような「平衡捕捉」により、抗体を、それらの結合アフィニティーに従い、低アフィニティーの極過剰なファージから、アフィニティーの高さがわずか２倍の突然変異体クローンの単離を可能とする感度で選択することが可能となる。また、固相に結合したファージの洗浄で使用される条件も、解離反応速度に基づき弁別するように操作することができる。
抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈクローンは、活性が選択されたクローンでありうる。一実施形態では、本発明は、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈリガンドと、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈとの結合は遮断するが、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈリガンドと、第２のタンパク質との結合は遮断しない、抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体を提供する。このような抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体に対応するＦｖクローンは、（１）抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈクローンを、上記のセクションＢ（Ｉ）（２）で記載した通りファージライブラリーから単離し、任意選択で、単離されたファージクローン集団を、適切な細菌宿主内で成長させることにより増幅し；（２）それぞれ遮断活性および非遮断活性が所望される、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈおよび第２のタンパク質を選択し；（３）抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈファージクローンを、固定化されたＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈに吸着させ；（４）過剰な第２のタンパク質を使用して、第２のタンパク質の結合決定基と重複するかまたは共有される、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ結合性決定基を認識する、任意の所望されないクローンを溶出させ；（５）ステップ（４）の後で吸着を維持したクローンを溶出させることにより選択することができる。任意選択で、本明細書で記載される選択手順を、１回または複数回繰り返すことにより、所望の遮断／非遮断特性を伴うクローンをさらに富化することもできる。
本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、ハイブリドーマまたはファージＤＮＡ鋳型から、重鎖および軽鎖の目的のコード領域を特異的に増幅するようにデザインされたオリゴヌクレオチドプライマーを使用することにより）、たやすく単離およびシークェンシングされる。単離されたら、ＤＮＡを、発現ベクター内に入れ、次いで、これを、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはこれ以外では免疫グロブリンタンパク質が産生されない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞内の所望のモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体コードＤＮＡの、細菌内の組換え発現についての総説論文は、Ｓｋｅｒｒａら、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５巻：２５６頁（１９９３年）およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖｓ、１３０巻：１５１頁（１９９２年）を含む。
本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域をコードする公知のＤＮＡ配列（例えば、適切なＤＮＡ配列は、Ｋａｂａｔら、前出から得ることができる）と組み合わせて、全長重鎖および／もしくは全長軽鎖または部分長重鎖および／もしくは部分長軽鎖をコードするクローンを形成することができる。ＩｇＧ定常領域、ＩｇＭ定常領域、ＩｇＡ定常領域、ＩｇＤ定常領域、およびＩｇＥ定常領域を含む、任意のアイソタイプの定常領域を、この目的のために使用することができ、このような定常領域を、任意のヒト種または動物種から得うることを理解されたい。１つの動物（ヒトなど）種の可変ドメインＤＮＡから導出され、次いで、「ハイブリッド」の全長重鎖および／または全長軽鎖のためのコード配列を形成するように、別の動物種の定常領域ＤＮＡに融合させたＦｖクローンは、本明細書で使用される「キメラ」抗体および「ハイブリッド」抗体の定義に含まれる。一実施形態では、ヒト可変ＤＮＡから導出されたＦｖクローンを、ヒト定常領域ＤＮＡに融合させて、全てのヒト全長重鎖および／もしくはヒト全長軽鎖またはヒト部分長重鎖および／もしくはヒト部分長軽鎖のコード配列を形成する。
ナイーブライブラリーにより産生される抗体（天然または合成）は、中程度のアフィニティー（約１０６〜１０７Ｍ−１のＫｄ−１）のものでありうるが、また、Ｗｉｎｔｅｒら（１９９４年）、前出において記載されている通り、アフィニティー成熟も、二次ライブラリーを構築し、ここから再選択することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣することができる。例えば、エラープローンポリメラーゼ（Ｌｅｕｎｇら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、１巻：１１〜１５頁（１９８９年）において報告されている）を、Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２６巻：８８９〜８９６頁（１９９２年）による方法、またはＧｒａｍら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９巻：３５７６〜３５８０頁（１９９２年）による方法で使用することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ランダムに、突然変異を導入することができる。加えて、アフィニティー成熟は、例えば、目的のＣＤＲにわたり、ランダムな配列を保有するプライマーを伴うＰＣＲを、選択された個々のＦｖクローン内で使用して、１つまたは複数のＣＤＲをランダムに突然変異させ、より高いアフィニティーのクローンについてスクリーニングすることにより実施することもできる。ＷＯ９６０７７５４（１９９６年３月１４日公開）は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域内で突然変異誘発を誘導して、軽鎖遺伝子のライブラリーを創出するための方法について記載した。別の有効な手法は、Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年）において記載されている通り、非免疫化ドナーから得られた自然発生のＶドメイン変異体のレパートリーを伴うファージディスプレイにより選択されたＶＨドメインまたはＶＬドメインを組み換え、数回のラウンドにわたる鎖リシャフリングにより、より高いアフィニティーについてスクリーニングすることである。この技法は、アフィニティーが１０−９Ｍの範囲の抗体および抗体断片の作製を可能とする。
抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体を作り出す他の方法
当技術分野では、抗体のアフィニティーを作り出し、評価する他の方法が周知であり、例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５頁（１９７５年）；米国特許第４，８１６，５６７号；Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８６年；Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３巻：３００１頁（１９８４年）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７年；Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７巻：２２０頁（１９８０年）；Ｅｎｇｅｌｓら、Ａｇｎｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．、２８巻：７１６〜７３４頁（１９８９年）；Ａｂｒａｈｍｓｅｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．、４巻：３９０１頁（１９８５年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、４４巻（１９７６年）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８１巻：６８５１〜６８５５頁（１９８４年）において記載されている。
一般的な方法
したがって、本開示の一態様は、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ３、およびＳＳＥＡ−４を三重ターゲティングする単離抗体を特徴とする。三重ターゲティング抗体は、Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（Ｇｌｏｂｏ Ｈ六糖）およびＧａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（ＳＳＥＡ−３五糖）およびＮｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（ＳＳＥＡ−４六糖）に特異的に結合する。一例では、三重ターゲティング抗体は、ｍＡｂ ６５１である。
本開示の別の態様は、Ｇｌｏｂｏ ＨおよびＳＳＥＡ３を二重ターゲティングする単離抗体を特徴とする。二重ターゲティング抗体は、Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（Ｇｌｏｂｏ Ｈ六糖）およびＧａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（ＳＳＥＡ−３五糖）に特異的に結合する。一例では、二重ターゲティング抗体は、ｍＡｂ ２７３である。
さらに別の態様では、本開示は、ＳＳＥＡ−４に特異的な単離抗体を特徴とする。抗ＳＳＥＡ−４抗体は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（ＳＳＥＡ−４六糖）に結合する。一部の例では、抗体は、Ｎｅｕ５Ｇｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（ＳＳＥＡ−４六糖の類似体）に結合することが可能である。抗体は、マウスＩｇＧ３（例えば、ｍＡｂ ＭＣ−８３１−７０）ではなく、抗体は、マウスＩｇＭ（例えば、抗ＲＭ１）ではないことが好ましい。抗体の例は、ｍＡｂ ４５およびｍＡｂ ４８を含むがこれらに限定されない。
本開示の別の態様は、ＳＳＥＡ−４に特異的な単離抗体およびその断片を特徴とする。抗ＳＳＥＡ−４抗体は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（ＳＳＥＡ−４六糖）およびＮｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１（ＳＳＥＡ−４六糖の断片）に結合する。一部の例では、抗体は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１に結合することが可能である。一部の例では、抗体は、Ｎｅｕ５Ｇｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（ＳＳＥＡ−４六糖の類似体）に結合することが可能である。一例では、抗体は、ｍＡｂ ４６である。
Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４を三重ターゲティングする抗体、Ｇｌｏｂｏ ＨおよびＳＳＥＡ−３を二重ターゲティングする抗体、ならびに抗ＳＳＥＡ−４抗体を開発したが、本明細書では、これらが開示される。本開示による抗体は、治療剤中でも、診断においても、研究用ツールとしても使用することができる。
したがって、本開示の一態様は、Ｆｃ上に単一の均一なＮ−グリカンを含むモノクローナル抗体の均質な集団の組成物に関し、構造は、エフェクター細胞機能の有効性を増強するために最適化されたＮ−グリカン構造である。
好ましい実施形態では、Ｎ−グリカンは、Ｆｃ領域のＡｓｎ−２９７に結合している。
好ましい実施形態では、Ｎ−グリカンは、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の構造からなる。
本明細書で記載される糖抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生されうる。糖抗体は、Ｆｃ糖鎖工学によって作り出されうる。ある特定の実施形態では、糖抗体は、哺乳動物細胞培養によって得られたモノクローナル抗体から酵素的または化学酵素的に操作される。
一部の実施形態では、本明細書で記載される糖抗体のＦｃ領域は、対応するモノクローナル抗体中の野生型Ｆｃ領域と比較して、ＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合アフィニティーの増大を呈示する。
一部の実施形態では、本明細書で記載される糖抗体は、野生型免疫グロブリンと比較して、増強された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）活性を呈示する。
一部の実施形態では、糖抗体は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、およびヒトＩｇＧ４からなる群から選択される。モノクローナル抗体は、ヒト化、ヒトまたはキメラでありうる。
本明細書で記載される糖抗体は、がん、自己免疫障害、炎症性障害または感染性疾患と関連する抗原に結合しうる。例示的ながん関連抗原は、例えば、Ｇｌｏｂｏ−Ｈ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４を含みうる。
他の態様では、本明細書で開示される抗体は、グリカンの変異体および誘導体を検出できる。例えば、グリカンの還元性末端は、遊離である、または天然（例えば、ＳＳＥＡ４糖脂質）もしくは非天然（例えば、グリカンアレイを作製するため、または診断目的のためのコンジュゲーションのためのリンカー）であるテールに連結される。これらの誘導体は全て、抗体によって認識されうる。
したがって、ある特定の診断実施形態およびアレイ実施形態では、本発明の抗体は、本明細書で記載されるグリカンだけでなく、その酸化型変異体もまた検出できる。本発明の抗体は、前記酸化型変異体とのコンジュゲーション産物もまた検出できる。
ある特定の態様では、本開示は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１、およびその酸化型変異体、ならびに前記酸化型変異体とのコンジュゲーション産物、およびその酸化型変異体、ならびに前記酸化型変異体とのコンジュゲーション産物に特異的に結合する単離ヒト化モノクローナル糖抗体を提供する；前記酸化型変異体は、グリカンの第一級アルコールの、カルボニルへの転換産物であり、コンジュゲーション産物は、カルボニルの、第一級アミンまたは第二級アミン部分を有するイミンへの転換産物である。
例えば、第一級アルコールを含むグリカンは、当業者に公知の方法によって、酸化型変異体に転換されうる。非限定的な例として、ガラクトース上の第一級アルコールは、グリカンを、酸化剤、例えば、過ヨウ素酸ナトリウム（ｍ−過ヨウ素酸ナトリウム）、または過ヨウ素酸の別の塩（例えば、カリウム、アンモニウム、マンガン、リチウム）と接触させることによって、アルデヒドに転換されうる。グリカン中の糖部分の１つまたは複数が、酸化されうる。酸化剤の濃度は、水または適切な緩衝液中、１マイクロモル、５マイクロモル、１０マイクロモル、２５マイクロモル、５０マイクロモル、１００マイクロモル、２００マイクロモル、５００マイクロモル、７５０マイクロモル、１ミリモル、５ミリモル、１０ミリモル、２５ミリモル、５０ミリモル、１００ミリモル、または５００ミリモルでありうる。温度は、５〜４５セルシウス度、好ましくは１５〜４０セルシウス度、より好ましくは３５〜４０セルシウス度でありうる。反応時間は、１０秒間〜２０分間、好ましくは３０秒間〜１０分間でありうる。適切な緩衝液は、生理食塩液、リン酸塩、ＣＨＥＳ、ＭＥＳ、ホウ酸塩、酢酸塩、炭酸塩、ギ酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩を含む、または排除しうる。穏やかに酸性の緩衝液を使用することが好ましい。トリスまたはグリシンまたは遊離糖は、反応において競合するので、これらを含まない緩衝液を使用することが好ましい。転換は、当業者に公知の方法による透析または遠心透析（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｄｉａｌｙｓｉｓ）によって精製されうる。
コンジュゲーション産物は、当業者に公知の方法によって、参照により本明細書に組み込まれるＧ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第３版、ＩＳＢＮ： ９７８−０−１２−３８２２３９−０、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、２０１３年に記載されるように、酸化型産物と、適切なアミン、ヒドラジン、ヒドラジド、またはオキソ−アミンとの反応から形成されうる。非限定的な例として、第一級アミンは、グリカン内のガラクトースの過ヨウ素酸酸化された第一級アルコールから形成された単一のアルデヒド官能基を有するグリカンと反応しうる。正味の産物はイミンである。イミンは、当業者に公知の方法、例えば、シアノ水素化ホウ素還元によってアルコールへと任意選択でさらに還元されて、加水分解に対してより安定なコンジュゲーション産物を形成しうる。一部の態様では、アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、またはオキソ−アミンは、コンジュゲーション産物のさらなる修飾のために、アレイ、レポーター分子、またはビオチンにさらに共有結合的に連結されうる。一部の態様では、レポーター分子は、蛍光分子でありうる。一部の態様では、レポーター分子は、放射性標識された分子でありうる。一部の態様では、レポーター分子は、固有のスペクトル特徴（例えば、ＩＲスペクトル、Ｒａｍａｎスペクトル、またはＮＭＲスペクトル）を有する分子でありうる。一部の態様では、アレイは、固体表面、化学修飾された表面、ポリマーコーティングされた表面、ビーズ、ゲル、粒子、またはナノ粒子でありうる。一部の態様では、ナノ粒子は、蛍光である、または光ルミネセンスを呈しうる。一部の態様では、コンジュゲーション産物は、カルボニルの、第一級アミンまたは第二級アミン部分を有するイミンへの転換産物でありうる。
一般に、本発明は、アフィニティー成熟させたＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体を提供する。これらの抗体は、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈに対するアフィニティーおよび特異性を増大させている。このアフィニティーおよび感受性の増大により、本発明の分子を、（ａ）本発明の分子の感受性の増大、および／または（ｂ）本発明の分子の、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈへの緊密な結合により利益を得る適用および方法のために使用することが可能となる。
一態様では、ＳＳＥＡ４／ＳＳＥＡ３／ＧｌｏｂｏＨは、がん細胞およびがん幹細胞に特異的に発現される３種のグリカンである。これら３種の糖脂質の合成のための重要な酵素であるベータ−３−ＧａｌＴ５のノックダウンは、がん細胞のアポトーシスを引き起こすが、正常細胞のアポトーシスは引き起こさない。抗体、特に、ＳＳＥＡ４に優先的にもしくは特異的に対する糖抗体、および／またはＳＳＥＡ３／ＳＳＥＡ４／ＧｌｏｂｏＨに同時に対する抗体は、有効ながん治療剤である。別の態様では、３種のグリカンＳＳＥＡ４／ＳＳＥＡ３／ＧｌｏｂｏＨ、特にＳＳＥＡ３は、がん幹細胞マーカーとして有用である。
一態様では、ＳＳＥＡ４および／または組合せでのＳＳＥＡ４／ＳＳＥＡ３／ＧｌｏｂｏＨは、例えば、脳がん、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆管がん、膵臓がん、結腸がん、腎臓がん、骨がん（骨肉腫）、皮膚がん、子宮頸がん、卵巣がん、および前立腺がんを含む異なるがんの処置のための治療標的として有用である。
一実施形態では、これらの例示的ながん型の細胞表面上で発現されるＳＳＥＡ４に対するヒト治療用抗体またはヒト化治療用抗体が提供される。
別の実施形態では、これらの例示的ながん型の細胞表面上で同時に発現されるＳＳＥＡ３／ＳＳＥＡ４／Ｇｌｏｂｏ−Ｈに対するヒト治療用抗体またはヒト化治療用抗体が提供される。
さらに、本開示は、グロボ系列スフィンゴ糖脂質合成をモジュレートするために有用な抗体および／または結合性断片の産生を誘発しうるＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ関連エピトープ（天然および修飾型）をターゲティングする免疫原性コンジュゲート組成物も対象とする。さらに、本開示は、過剰増殖疾患および／または過剰増殖状態の処置または検出のために本明細書で記載される組成物を使用する方法も対象とする。
一実施形態では、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体は、１つまたは複数のＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ活性の部分的または全面的な遮断が所望される、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ媒介性障害の処置に有用である。一実施形態では、本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体を使用して、がんを処置する。
本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体は、質量分析または遺伝子操作を必要とせずに、サンドイッチアッセイ、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、または免疫顕微鏡法など、イムノアッセイによる、高感度で特異的なエピトープの検出を可能とする。これにより、これらの経路の正常な機能の観察および解明のいずれにおいても、ならびに経路の機能が異常な場合の検出にも、著明な利点がもたらされる。
本発明のＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体はまた、疾患の発生および発症機序における役割を決定するのにも使用することができる。例えば、上で記載した通り、本発明のＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体を使用して、ＴＡＣＡ（腫瘍関連炭水化物抗原）が通常一過性で発現するのかどうか（これは、１つまたは複数の疾患状態と相関しうる）を決定することができる。
本発明のＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体を使用して、さらに、本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体が特異的でない、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈの正常な活性には干渉せずに、１つまたは複数のＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈの調節が異常であるか、または機能が異常である疾患を処置することができる。
別の態様では、本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体は、多様な細胞型内および組織内のがん状態を検出するための試薬としても有用性を見出す。
さらに別の態様では、本抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体は、活性遮断パターンが、本発明の対象の抗体の活性遮断パターンと類似する、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈアンタゴニストを開発するのに有用である。例えば、本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体を使用して、同じＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈへの結合特徴、および／またはＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ経路の遮断能を有する他の抗体を決定および同定することができる。
さらなる例として、本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体を使用して、直鎖状エピトープおよびコンフォメーショナルエピトープを含む、本明細書で例示される抗体と実質的に同じ、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈの抗原決定基に結合する、他の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体を同定することができる。
本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体を、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈが関与する生理学的経路に基づくアッセイで使用して、１つまたは複数の結合パートナーの、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈへの結合を遮断するのに、抗体と同様の薬理学的効果を呈示する、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈの低分子アンタゴニストについてスクリーニングすることができる。
抗体の作製は、ハイブリドーマ技法、および結合剤分子についてのファージディスプレイライブラリーのスクリーニングなど、本明細書で記載される方法を含む当技術分野における日常的な技術を使用して達成することができる。当技術分野では、これらの方法が十分に確立されている。
略述すると、本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体は、コンビナトリアルライブラリーを使用して、１つまたは複数の所望の活性を伴う合成抗体クローンについてスクリーニングすることにより作製することができる。原則として、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質に融合させた、抗体可変領域の多様な断片（Ｆｖ）を表示するファージを含有するファージライブラリーをスクリーニングすることにより選択する。このようなファージライブラリーを、所望の抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによりパニングする。所望の抗原に結合することが可能なＦｖ断片を発現させるクローンを、抗原に吸着させ、これにより、ライブラリー内の非結合性クローンから分離する。次いで、結合性クローンを抗原から溶出させ、さらなる抗原吸着／溶出サイクルにより、さらに富化することができる。本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体のうちのいずれかは、適切な抗原スクリーニング手順をデザインして、目的のファージクローンについて選択した後で、目的のファージクローンに由来するＦｖ配列と、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ第９１−３２４２号、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．（１９９１年）、１〜３巻において記載されている、適切な定常領域（Ｆｃ）配列とを使用して、全長抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体クローンを構築することにより得ることができる。
一実施形態では、本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体は、モノクローナル抗体である。本発明の範囲内にはまた、本明細書で提供される抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体の、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、およびＦ（ａｂ’）２断片、ならびにこれらの変化形などの抗体断片も包含される。これらの抗体断片は、酵素的消化など、従来の手段により創出することもでき、組換え技法により作り出すこともできる。このような抗体断片は、キメラ抗体断片、ヒト抗体断片、またはヒト化抗体断片でありうる。これらの断片は、本明細書で示される実験目的、診断目的、および治療目的に有用である。
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得ることができる、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる、考えられる自然発生の突然変異を除き同一である。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、個別の抗体の混合物ではないものとしての抗体の性格を指し示す。
本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５頁（１９７５年）により初めて記載されたハイブリドーマ法を含む当技術分野で公知の様々な方法を使用して作製することもでき、代替的に、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号）により作製することもできる。
ベクター、宿主細胞、および組換え法
本発明の抗体を組換えにより作製するには、本発明の抗体をコードする核酸を単離し、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために、複製可能なベクターに挿入する。抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、たやすく単離およびシークェンシングされる。多くのベクターが、利用可能である。ベクターの選択は、使用される宿主細胞に部分的に依存する。宿主細胞は、原核生物由来の細胞または真核生物（一般に、哺乳動物）由来の細胞のいずれかを含むがこれらに限定されない。ＩｇＧ定常領域、ＩｇＭ定常領域、ＩｇＡ定常領域、ＩｇＤ定常領域、およびＩｇＥ定常領域を含む、任意のアイソタイプの定常領域を、この目的のために使用することができ、このような定常領域を、任意のヒト種または動物種から得うることを理解されたい。
原核宿主細胞を使用する抗体の作製
ベクターの構築
本発明の抗体のポリペプチド構成要素をコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組換え技法を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞から単離およびシークェンシングすることができる。代替的に、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成器またはＰＣＲ技法を使用して合成することもできる。得られたら、ポリペプチドをコードする配列を、原核宿主内で異種ポリヌクレオチドを複製し、発現させることが可能な組換えベクターに挿入する。利用可能であり、当技術分野で公知の多くのベクターは、本発明の目的で使用することができる。適切なベクターの選択は、ベクターに挿入される核酸のサイズ、およびベクターで形質転換される特定の宿主細胞に主に依存する。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、またはこれらの両方）、およびそれが常在する特定の宿主細胞に対するその適合性に応じて、多様な構成要素を含有する。ベクターの構成要素は一般に、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合性部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸インサート、および転写終結配列を含むがこれらに限定されない。
一般に、宿主細胞に適合性の種に由来するレプリコンおよび制御配列を含有するプラスミドベクターは、これらの宿主と関連させて使用する。ベクターは通常、複製部位のほか、形質転換された細胞内の表現型による選択を実現することが可能なマーキング配列も保有する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、Ｅ．ｃｏｌｉ種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２を使用して形質転換することが典型的である。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン（Ａｍｐ）耐性およびテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性をコードする遺伝子を含有し、これにより、形質転換された細胞を同定するための容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体、または他の微生物性プラスミドもしくはバクテリオファージはまた、微生物が内因性タンパク質を発現させるために使用しうるプロモーターも含有しうるか、またはこれを含有するように修飾することができる。特定の抗体を発現させるために使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例については、Ｃａｒｔｅｒら、米国特許第５，６４８，２３７号において詳細に記載されている。
加えて、宿主微生物に適合性のレプリコンおよび制御配列を含有するファージベクターも、形質転換ベクターとして、これらの宿主と関連させて使用することができる。例えば、λＧＥＭ（商標）１１などのバクテリオファージを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２など、易感染性の宿主細胞を形質転換するのに使用しうる組換えベクターの作製において活用することができる。
本発明の発現ベクターは、ポリペプチド構成要素の各々をコードする、２つまたはこれを超えるプロモーター−シストロン対を含みうる。プロモーターとは、シストロンに対して上流（５’）に位置する非翻訳の調節配列であって、その発現をモジュレートする。原核プロモーターは、誘導的プロモーターと構成的プロモーターとの２つのクラスに分けられることが典型的である。誘導的プロモーターとは、培養条件の変化、例えば、栄養物質の存在もしくは非存在、または温度の変化に応答して、シストロンの高レベルの転写をその制御下で開始するプロモーターである。
様々な潜在的宿主細胞により認識される多数のプロモーターが周知である。選択されたプロモーターは、制限酵素消化を介して、供給源ＤＮＡから取り出し、単離されたプロモーター配列を、本発明のベクターに挿入することにより、軽鎖または重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作動可能に連結することができる。天然のプロモーター配列および多くの異種プロモーターの両方を使用して、標的遺伝子の増幅、および／または発現を方向付けることができる。一部の実施形態では、異種プロモーターは一般に、天然の標的ポリペプチドのプロモーターと比較して、発現させる標的遺伝子の転写の増大および収率の上昇を可能とするので活用される。
原核宿主を伴う使用に適するプロモーターは、ＰｈｏＡプロモーター、β−ガラクタマーゼプロモーター系およびラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにｔａｃプロモーターまたはｔｒｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターを含む。しかし、細菌内で機能的な他のプロモーター（他の公知の細菌プロモーターまたはファージプロモーターなど）も同様に適する。それらのヌクレオチド配列は公表されており、これにより、当業者が、リンカーまたはアダプターを使用して、それらを、標的軽鎖および標的重鎖をコードするシストロンに、作動可能にライゲーションして、任意の要請される制限部位を施すことが可能となる（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら（１９８０年）、Ｃｅｌｌ、２０巻：２６９頁）。
本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、発現させたポリペプチドの、膜を越えた移行を方向付ける、分泌シグナル配列構成要素を含む。一般に、シグナル配列は、ベクターの構成要素の場合もあり、ベクターに挿入された標的ポリペプチドＤＮＡの一部の場合もある。本発明の目的で選択されたシグナル配列は、宿主細胞により認識およびプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）シグナル配列であるものとする。異種ポリペプチドにとって天然のシグナル配列を認識およびプロセシングしない原核宿主細胞のためには、シグナル配列を、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、または耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、およびＭＢＰからなる群から選択される、原核シグナル配列で置換する。本発明の一実施形態では、発現系のシストロンの両方で使用されるシグナル配列は、ＳＴＩＩシグナル配列またはその変異体である。
別の態様では、本発明に従う免疫グロブリンの産生は、宿主細胞の細胞質内で生じることが可能であり、したがって、各シストロン内の分泌シグナル配列の存在を要請しない。この点で、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、細胞質内で機能的免疫グロブリンを形成するように、発現し、フォールドし、アセンブルされる。ある特定の宿主株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｒｘＢ株）は、ジスルフィド結合形成に好適な細胞質条件をもたらし、これにより、発現したタンパク質サブユニットの適正なフォールディングおよびアセンブリーを可能とする（ＰｒｏｂａおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｇｅｎｅ、１５９巻：２０３頁（１９９５年））。
本発明の抗体はまた、分泌され、適正にアセンブルされた、本発明の抗体の収率を最大化するために、発現するポリペプチド構成要素の定量比をモジュレートしうる発現系を使用することによって作製することもできる。このようなモジュレーションは、ポリペプチド構成要素について、翻訳強度を同時にモジュレートすることにより、少なくとも一部達成する。
翻訳強度をモジュレートするための１つの技法は、Ｓｉｍｍｏｎｓら、米国特許第５，８４０，５２３号において開示されている。この技法では、シストロン内の翻訳開始領域（ＴＩＲ）の変異体を活用する。所与のＴＩＲについて、翻訳強度がある範囲にある、一連のアミノ酸配列変異体または核酸配列変異体を創出し、これにより、特異的な鎖の所望の発現レベルについて、この因子を調整するための簡便な手段をもたらすことができる。ＴＩＲ変異体は、アミノ酸配列を改変させうるコドン変化を結果としてもたらす、従来の突然変異誘発技法により作り出すことができる。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列の変化は、サイレントである。ＴＩＲ内の改変は、例えば、シグナル配列の改変と共に、シャイン−ダルガーノ配列の数または間隔の改変を含みうる。突然変異体のシグナル配列を作り出すための１つの方法は、シグナル配列のアミノ酸配列を変化させない（すなわち、変化がサイレントである）コード配列の起始部における「コドンバンク」の作製である。これは、各コドンの第３のヌクレオチド位置を変化させることにより達成することができ；加えて、ロイシン、セリン、およびアルギニンなど、一部のアミノ酸が、第１の位置および第２の位置を複数有し、これにより、バンクの作製に複雑性を付加しうる。突然変異誘発のこの方法については、Ｙａｎｓｕｒａら（１９９２年）、ＭＥＴＨＯＤＳ： Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、４巻：１５１〜１５８頁において詳細に記載されている。
一実施形態では、その中の各シストロンのＴＩＲ強度がある範囲にあるベクターのセットを作り出す。この限定的なセットにより、各鎖の発現レベルについての比較のほか、多様なＴＩＲ強度の組合せの下における、所望の抗体産物の収率についての比較ももたらされる。ＴＩＲ強度は、Ｓｉｍｍｏｎｓら、米国特許第５，８４０，５２３号において詳細に記載されている通り、レポーター遺伝子の発現レベルを定量化することにより決定することができる。翻訳強度の比較に基づき、所望の個々のＴＩＲが、本発明の発現ベクター構築物内で組み合わされるように選択される。
本発明の抗体を発現させるのに適する原核宿主細胞は、古細菌およびグラム陰性菌またはグラム陽性菌などの真正細菌を含む。有用な細菌の例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）種、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｒｈｉｚｏｂｉａ属、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ属、またはＰａｒａｃｏｃｃｕｓ属を含む。一実施形態では、グラム陰性細胞を使用する。一実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、本発明のための宿主として使用する。Ｅ．ｃｏｌｉ株の例は、Ｗ３１１０株（Ｂａｃｈｍａｎｎ、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２巻（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．： Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９８７年）、１１９０〜１２１９頁；ＡＴＣＣ受託番号：２７，３２５）、および、遺伝子型Ｗ３１１０ ΔｆｈｕＡ （ΔｔｏｎＡ） ｐｔｒ３ ｌａｃ Ｉｑ ｌａｃＬ８ ΔｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ−ｆｅｐＥ） ｄｅｇＰ４１ ｋａｎＲ（米国特許第５，６３９，６３５号）を有する３３Ｄ３株を含むその派生株を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ ２９４（ＡＴＣＣ：３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ λ１７７６（ＡＴＣＣ：３１，５３７）およびＥ．ｃｏｌｉ ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ：３１，６０８）など、他の株およびそれらの派生株もまた、適する。これらの例は、限定的なものではなく、例示的なものである。当技術分野では、規定された遺伝子型を有する上述の細菌のうちのいずれかの派生株を構築するための方法が公知であり、例えば、Ｂａｓｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、８巻：３０９〜３１４頁（１９９０年）において記載されている。細菌の細胞内のレプリコンの複製能力を考慮して、適切な細菌を選択することが、一般に必要である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ属種、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ属種は、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、またはｐＫＮ４１０など、周知のプラスミドを使用して、レプリコンを供給する場合に、宿主として使用するのに適しうる。典型的には、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌するべきあり、望ましくは、さらなるプロテアーゼ阻害剤を細胞培養物中に組み込みうる。
抗体の作製
宿主細胞を、上で記載した発現ベクターで形質転換し、プロモーターを誘導するか、形質転換細胞を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように改変された、従来の栄養物質培地中で培養する。
形質転換とは、ＤＮＡが、染色体外エレメントとして、または染色体への組込みにより複製可能となるように、ＤＮＡを、原核宿主に導入することを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換は、このような細胞に適切な標準的技法を使用してなされる。細胞壁による実質的な障壁を含有する細菌細胞には、塩化カルシウムを援用するカルシウム処置を一般に使用する。形質転換のための別の方法では、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを援用する。さらに別の技法では、電気穿孔が使用される。
本発明のポリペプチドを作製するのに使用される原核細胞は、当技術分野で公知であり、選択された宿主細胞の培養に適する培地中で成長させる。適切な培地の例は、必要な栄養補充物質を加えたルリアブロス（ＬＢ）を含む。一部の実施形態では、培地はまた、発現ベクターを含有する原核細胞の増殖を選択的に可能とするように、発現ベクターの構築に基づき選び出される、選択用薬剤も含有する。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を発現させる細胞を成長させるために、アンピシリンを、培地に添加する。
炭素供給源、窒素供給源、および無機リン酸供給源のほかに、また、任意の必要な補充物質も、適切な濃度で、単独、または複合窒素供給源など、別の補充物質または培地との混合物として、含むことができる。任意選択で、培養培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコール酸、ジチオエリトリトール、およびジチオトレイトールからなる群から選択される、１つまたは複数の還元剤を含有しうる。
原核宿主細胞は、適切な温度で培養する。Ｅ．ｃｏｌｉを成長させるには、例えば、成長は、約２０℃〜約３９℃、約２５℃〜約３７℃、および約３０℃を含むがこれらに限定されない温度範囲で行う。培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて、約５〜約９の範囲の任意のｐＨでありうる。Ｅ．ｃｏｌｉでは、ｐＨは、約６．８〜約７．４、または約７．０でありうる。
誘導的プロモーターを、本発明の発現ベクター内で使用する場合、タンパク質発現は、プロモーターの活性化に適する条件下で誘導する。本発明の一態様では、ＰｈｏＡプロモーターを、ポリペプチドの転写を制御するために使用する。したがって、形質転換された宿主細胞は、誘導のためのリン酸限界培地中で培養する。一実施形態では、リン酸限界培地は、Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２年）、２６３巻：１３３〜１４７頁を参照されたい）。当技術分野で公知の通り、援用されるベクター構築物に従い、他の様々な誘導剤を使用することができる。
一実施形態では、発現した本発明のポリペプチドは、宿主細胞のペリプラズムに分泌され、ここから回収される。タンパク質の回収は、一般に、浸透圧ショック、超音波処理、または溶解などの手段による微生物の破壊を伴うことが典型的である。細胞を破壊したら、細胞破砕物または全細胞は、遠心分離または濾過により除去することができる。タンパク質は、例えば、アフィニティー樹脂クロマトグラフィーにより、さらに精製することができる。代替的に、タンパク質を、培養培地に輸送し、その中で単離することもできる。細胞は、培養物から除去し、産生されたタンパク質のさらなる精製のために、培養物上清を、濾過および濃縮することができる。発現させたポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびウェスタンブロットアッセイなど、一般に公知の方法を使用して、さらに単離および同定することができる。
本発明の一態様では、抗体の作製を、発酵工程により大量に行う。組換えタンパク質の作製のためには、多様な大スケールの流加発酵手順が利用可能である。大スケールの発酵体積は、少なくとも１０００リットル、例えば、約１，０００〜１００，０００リットルである。これらの発酵槽では、撹拌用インペラーを使用して、酸素および栄養物質、とりわけ、グルコース（一般的な炭素／エネルギー供給源）を分配する。小スケールの発酵とは一般に、容積が約１００リットルを超えず、約１リットル〜約１００リットルの範囲にありうる発酵槽内の発酵を指す。
発酵工程では、タンパク質発現の誘導は、細胞を、適切な条件下で、所望の密度、例えば、ＯＤ５５０で約１８０〜２２０（この段階では、細胞は、早期定常相にある）まで成長させた後で、開始することが典型的である。当技術分野で公知であり、上で記載した通り、援用されるベクター構築物に従い、様々な誘導剤を使用することができる。細胞は、誘導前に、より短い期間で成長させることができる。細胞は通例、約１２〜５０時間誘導するが、より長い誘導時間も、より短い誘導時間も、使用することができる。
本発明のポリペプチドの作製収率および作製品質を改善するために、多様な発酵条件を改変することができる。例えば、分泌される抗体ポリペプチドの適正なアセンブリーおよびフォールディングを改善するために、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、および／またはＤｓｂＧ）、またはＦｋｐＡ（シャペロン活性を伴う、ペプチジルプロピルｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−イソメラーゼ）など、シャペロンタンパク質を過剰発現させる、さらなるベクターを使用して、宿主原核細胞を共形質転換することができる。シャペロンタンパク質は、適正なフォールディングおよび細菌宿主細胞内で産生される異種タンパク質の可溶性を促進することが裏付けられている（Ｃｈｅｎら（１９９９年）、Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ、２７４巻：１９６０１〜１９６０５頁；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第６，０８３，７１５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第６，０２７，８８８号；ＢｏｔｈｍａｎｎおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ （２０００年）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７５巻：１７１００〜１７１０５頁；ＲａｍｍおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００年）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７５巻：１７１０６〜１７１１３頁；Ａｒｉｅら（２００１年）、Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３９巻：１９９〜２１０頁）。
発現させた異種タンパク質（とりわけ、タンパク質分解に対して感受性の異種タンパク質）のタンパク質分解を最小化するため、タンパク質分解酵素について欠損する、ある特定の宿主株を、本発明のために使用することができる。例えば、宿主細胞株は、Ｐｒｏｔｅａｓｅ ＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｍｉ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｖ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ ＶＩ、およびこれらの組合せなど、公知の細菌プロテアーゼをコードする遺伝子内に、遺伝子突然変異を施すように改変することができる。一部のＥ．ｃｏｌｉプロテアーゼ欠損株が利用可能であり、例えば、Ｊｏｌｙら（１９９８年）、前出；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第５，２６４，３６５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第５，５０８，１９２号；Ｈａｒａら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、２巻：６３〜７２頁（１９９６年）において記載されている。
一実施形態では、タンパク質分解酵素について欠損し、１つまたは複数のシャペロンタンパク質を過剰発現させるプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株を、本発明の発現系内の宿主細胞として使用する。
抗体の精製
一実施形態では、本明細書で作製される抗体タンパク質をさらに精製して、さらなるアッセイのための、実質的に均質な調製物を得、使用する。当技術分野で公知の、標準的なタンパク質精製法を援用することができる。以下の手順：免疫アフィニティーカラム上またはイオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のまたはＤＥＡＥなどカチオン交換樹脂上のクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、および例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を使用するゲル濾過は、適切な精製手順を例示するものである。
一態様では、固相上に固定化されたプロテインＡを、本発明の抗体産物の免疫アフィニティー精製のために使用する。プロテインＡとは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅａｓに由来する、４１ｋＤの細胞壁タンパク質であって、抗体のＦｃ領域に、高アフィニティーで結合する（Ｌｉｎｄｍａｒｋら（１９８３年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．、６２巻：１〜１３頁）。プロテインＡを固定化する固相は、ガラス表面もしくはシリカ表面を含むカラム、またはＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）カラムもしくはケイ酸カラムでありうる。一部の適用では、カラムを、グリセロールなどの試薬でコーティングすると、夾雑物の非特異的結合を防止する可能性が高い。
精製の第１のステップとして、上で記載した細胞培養物に由来する調製物を、プロテインＡを固定化した固相に適用して、目的の抗体の、プロテインＡへの特異的結合を可能とすることができる。次いで、固相を洗浄すると、固相に非特異的に結合した夾雑物が除去される。最後に、目的の抗体を、固相から、溶出により回収する。
真核宿主細胞を使用する抗体の作製
ベクターの構成要素は一般に、以下：シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列のうちの１つまたは複数を含むがこれらに限定されない。
（ｉ）シグナル配列構成要素
真核宿主細胞における使用のためのベクターはまた、シグナル配列、または、目的の成熟タンパク質もしくは成熟ポリペプチドのＮ末端において特異的切断部位を有する、他のポリペプチドも含有しうる。選択される異種シグナル配列は一般に、宿主細胞により認識およびプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）異種シグナル配列である。哺乳動物細胞の発現では、哺乳動物シグナル配列のほか、ウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルも利用可能である。
このような前駆体領域のＤＮＡを、リーディングフレーム内で、抗体をコードするＤＮＡにライゲーションする。
（ｉｉ）複製起点
一般に、複製起点構成要素は、哺乳動物の発現ベクターに必要とされない。例えば、ＳＶ４０による起点は、初期プロモーターを含有するというだけで使用されうることが典型的である。
（ｉｉｉ）選択遺伝子構成要素
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択用マーカーとも称する、選択遺伝子を含有しうる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生剤または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）該当する場合、栄養要求性欠損を補完する、または（ｃ）複合培地から得られない必須の栄養物質を供給する、タンパク質をコードする。
選択スキームの１つの例では、宿主細胞の成長を止める薬物を活用する。異種遺伝子による形質転換に成功した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を産生し、これにより、選択レジメンに耐えて存続する。このような優性選択の例では、薬物である、ネオマイシン、ミコフェノール酸、およびハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞に適する選択用マーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩおよびＩＩ（例えば、霊長動物メタロチオネイン遺伝子）、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなど、抗体核酸を取り込む能力のある細胞の同定を可能とする選択用マーカーである。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞はまず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストである、メトトレキセート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地中で、形質転換細胞の全てを培養することにより同定することができる。野生型ＤＨＦＲを援用する場合に適切な宿主細胞は、例えば、ＤＨＦＲ活性を欠損させたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば；ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−９０９６）を含む。
代替的に、抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質、およびアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）など、別の選択用マーカーをコードするＤＮＡ配列で形質転換または共形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、アミノグリコシド抗生剤、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８など、選択用マーカーのための選択用薬剤を含有する培地中の細胞成長により選択することができる。米国特許第４，９６５，１９９号を参照されたい。
（ｉｖ）プロモーター構成要素
発現ベクターおよびクローニングベクターは通例、宿主生物により認識され、目的のポリペプチド（例えば、抗体）をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含有する。真核生物のプロモーター配列は、公知である。事実上全ての真核遺伝子は、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置する、ＡＴに富む領域を有する。多くの遺伝子の転写の始点から７０〜８０塩基上流に見出される別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域［配列中、Ｎは、任意のヌクレオチドでありうる］である。大半の真核遺伝子の３’末端は、ポリＡテールの、コード配列の３’末端への付加のシグナルでありうる、ＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの配列の全ては、真核発現ベクターに挿入するのに適する。
哺乳動物宿主細胞内のベクターからの抗体ポリペプチドの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ２など）、ウシパピローマウイルス、ニワトリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られたプロモーター、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターもしくは免疫グロブリンプロモーターに由来するプロモーター、または熱ショックプロモーターに由来するプロモーターにより制御することができるが、このようなプロモーターが、宿主細胞株に適合性があることを条件とする。
ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点もまた含有する、ＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として簡便に得られる。ウシパピローマウイルスをベクターとして使用して、哺乳動物宿主内でＤＮＡを発現させるための系は、米国特許第４，４１９，４４６号において開示されている。この系の改変については、米国特許第４，６０１，９７８号において記載されている。また、単純ヘルペスウイルスに由来するチミジンキナーゼプロモーターの制御下、マウス細胞内の、ヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現についての、Ｒｅｙｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２９７巻：５９８〜６０１頁（１９８２年）も参照されたい。代替的に、ラウス肉腫ウイルス長末端リピートも、プロモーターとして使用することができる。
（ｖ）エンハンサーエレメント構成要素
高等真核生物による、本発明の抗体ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列を、ベクターに挿入することにより増大させうることが多い。今や、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン）に由来する、多くのエンハンサー配列が、公知である。しかし、真核細胞ウイルスに由来するエンハンサーを使用することが典型的である。例は、複製起点の後期側（１００〜２７０ｂｐ）にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。真核プロモーターの活性化のための増強エレメントについては、また、Ｙａｎｉｖ、Ｎａｔｕｒｅ、２９７巻：１７〜１８頁（１９８２年）も参照されたい。エンハンサーは、ベクターに、抗体ポリペプチドコード配列の５’または３’の位置にスプライスされる場合もあるが、一般に、プロモーターの５’の部位に位置する。
（ｖｉ）転写終結構成要素
真核宿主細胞内で使用される発現ベクターはまた、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有することが典型的である。このような配列は一般に、真核生物ＤＮＡもしくは真核生物ｃＤＮＡ、またはウイルスＤＮＡもしくはウイルスｃＤＮＡの５’非翻訳領域、場合によって、３’非翻訳領域から得られる。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分内のポリアデニル化断片として転写される、ヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結構成要素は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６およびその中で開示されている発現ベクターを参照されたい。
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択および形質転換
本明細書のベクター内でＤＮＡをクローニングするかまたは発現させるのに適する宿主細胞は、脊椎動物宿主細胞を含む本明細書で記載される高等真核細胞を含む。培養物（組織培養物）中の脊椎動物細胞の繁殖は、日常的な手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞株（ＣＯＳ−７；ＡＴＣＣ：ＣＲＬ１６５１）；ヒト胎児由来腎臓細胞株（２９３細胞または懸濁培養物中で成長させるためにサブクローニングされた２９３細胞；Ｇｒａｈａｍら、Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．、３６巻：５９頁（１９７７年））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／ＤＨＦＲ−（ＣＨＯ；Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７７巻：４２１６頁（１９８０年））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４；Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．、２３巻：２４３〜２５１頁（１９８０年））；サル腎臓細胞（ＣＶ１；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ７０）；アフリカグリーンモンキー腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６；ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ；ＡＴＣＣ：ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、３８３巻：４４〜６８頁（１９８２年））；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒトヘパトーマ細胞株（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
宿主細胞は、抗体の作製のための、上で記載した発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導するか、形質転換細胞を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように改変された、従来の栄養物質培地中で培養する。
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
本発明の抗体を作製するのに使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養することができる。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞の培養に適する。加えて、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ．、５８巻：４４頁（１９７９年）、Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０２巻：２５５頁（１９８０年）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；もしくは同第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国特許再交付第３０，９８５号において記載されている培地のうちのいずれかを、宿主細胞のための培養培地として使用することもできる。これらの培地のうちのいずれかには、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸など）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生剤（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬など）、微量元素（通例マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、ならびにグルコースもしくは同等のエネルギー供給源を補充することができる。また、他の任意の必要な補充物質も、当業者に公知の適切な濃度で含むことができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に対して既に使用された培養条件であり、当業者に明らかである。
（ｉｘ）抗体の精製
組換え技法を使用する場合、抗体は、細胞内で産生させること、または培地に直接分泌させることができる。抗体を細胞内で産生させる場合、最初のステップとして、宿主細胞または溶解させた断片のいずれかである粒子状破砕物は一般に、例えば、遠心分離または限外濾過により除去する。抗体を培地に分泌させる場合、このような発現系に由来する上清は一般に、まず、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ限外濾過ユニットまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を前出のステップのうちのいずれかに含み、タンパク質分解を阻害することができ、抗生剤を含み、偶発性の夾雑物の成長を防止することができる。
細胞から調製される抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーは一般に、許容可能な精製技法である。プロテインＡなどのアフィニティー試薬の、アフィニティーリガンドとしての適性は、抗体内に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡを使用して、ヒトγ１重鎖、ヒトγ２重鎖、またはヒトγ４重鎖に基づく抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．、６２巻：１〜１３頁（１９８３年））。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプおよびヒトγ３のために推奨される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．、５巻：１５６７〜１５７５頁（１９８６年））。アフィニティーリガンドを結合させるマトリックスは大部分、アガロースであることが多いが、他のマトリックスも利用可能である。ＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）またはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなど、力学的に安定的なマトリックスは、アガロースに対して達成しうる流量より大きな流量およびアガロースに対して達成しうる加工時間より短い加工時間を可能とする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合は、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ． Ｔ． Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が精製のために有用である。また、イオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、ヘパリン上のクロマトグラフィー、アニオン交換樹脂上またはカチオン交換樹脂上（ポリアスパラギン酸カラムなど）のＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿など、タンパク質精製のための他の技法も、回収される抗体に応じて利用可能である。
任意の予備的精製ステップの後、目的の抗体と夾雑物とを含む混合物を、必要に応じて、例えば、ｐＨを約２．５〜４．５の間とする溶出緩衝液を使用し、一般に低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で実施される、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーにより、さらなる精製ステップにかけることができる。
当技術分野では、一般に、研究、検査、および臨床使用における使用のための抗体を調製するための技法および方法論が十分に確立されており、上記とも符合し、かつ／または目的の特定の抗体に適切であると当業者にみなされていることに留意されたい。
活性アッセイ
本発明の抗体は、それらの物理的特性／化学的特性および生物学的機能について、当技術分野で公知の多様なアッセイにより特徴付けることができる。
精製された抗体は、Ｎ末端シークェンシング、アミノ酸解析、非変性サイズ除外高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析、イオン交換クロマトグラフィー、およびパパイン消化を含むがこれらに限定されない、一連のアッセイによりさらに特徴付けることができる。
必要な場合は、抗体を、それらの生物学的活性について解析する。一部の実施形態では、本発明の抗体を、それらの抗原結合活性について調べる。当技術分野で公知であり、本明細書で使用しうる抗原結合性アッセイは、限定せずに述べると、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、ナノ粒子イムノアッセイ、アプタマーイムノアッセイ、およびプロテインＡイムノアッセイなどの技法を使用する、任意の直接的結合アッセイまたは競合的結合アッセイを含む。
抗体断片
本発明は、抗体断片を包含する。ある特定の状況では、全抗体ではなく、抗体断片を使用することが有利である。より小サイズの断片は、急速なクリアランスを可能とし、充実性腫瘍への接近の改善をもたらしうる。
抗体断片を産生するための多様な技法が開発されている。従来、これらの断片は、無傷抗体のタンパク質分解性消化を介して導出した（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４巻：１０７〜１１７頁（１９９２年）；およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻：８１頁（１９８５年）を参照されたい）。しかし、今やこれらの断片は、組換え宿主細胞に直接産生させることができる。Ｆａｂ抗体断片、Ｆｖ抗体断片、およびＳｃＦｖ抗体断片は全て、Ｅ．ｃｏｌｉ内で発現し、Ｅ．ｃｏｌｉから分泌され、このため、これらの断片の大量の作製が容易に可能となりうる。抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリーから単離することができる。代替的に、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収し、化学的にカップリングさせて、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することもできる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：１６３〜１６７頁（１９９２年））。別の手法に従い、Ｆ（ａｂ’）２断片を、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含む、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長したＦａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片については、米国特許第５，８６９，０４６号において記載されている。当業者には、抗体断片を作製するための他の技法も明らかであろう。他の実施形態では、選択抗体は、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および同第５，５８７，４５８号を参照されたい。ＦｖおよびｓＦｖは、定常領域を欠く無傷の結合部位を伴う唯一の分子種であり、このため、ｉｎ ｖｉｖｏにおける使用時に非特異的結合を低減するのに適する。ｓＦｖによる融合タンパク質を構築して、ｓＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにおけるエフェクタータンパク質の融合をもたらすことができる。Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編、前出を参照されたい。例えば、抗体断片はまた、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載の通り、「直鎖状抗体」でもありうる。このような直鎖状抗体断片は、一特異性であっても二特異性であってもよい。
ヒト化抗体
本発明は、ヒト化抗体を包含する。当技術分野では、非ヒト抗体をヒト化するための多様な方法が公知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒト供給源から導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有しうる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と称することが多く、これは、「移入」可変ドメインから採取されることが典型的である。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らによる方法（Ｊｏｎｅｓら（１９８６年）、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８年）、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２７頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４〜１５３６頁）に従い、超可変領域配列で、ヒト抗体の対応する配列を置換することにより、本質的に実施することができる。したがって、このような「ヒト化」抗体とは、実質的に無傷に満たないヒト可変ドメインが、非ヒト種に由来する対応する配列で置換されているキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際は、ヒト化抗体は、一部の超可変領域残基と、おそらく、一部のＦＲ残基とが、齧歯動物抗体内の類似の部位に由来する残基で置換されているヒト抗体であることが典型的である。
ヒト化抗体を作製するのに使用される、軽鎖ヒト可変ドメインおよび重鎖ヒト可変ドメインのいずれの選択も、抗原性を低減するのに重要でありうる。いわゆる「ベストフィット」法に従い、齧歯動物抗体の可変ドメイン配列を、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに照らしてスクリーニングする。次いで、齧歯動物の配列に最も近接するヒト配列を、ヒト化抗体のためのヒトフレームワークとして受容する（Ｓｉｍｓら（１９９３年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２２９６頁；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１９６巻：９０１頁）。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定の亜群についての、全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体のために使用することができる（Ｃａｒｔｅｒら（１９９２年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９巻：４２８５頁；Ｐｒｅｓｔａら（１９９３年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２６２３頁）。
抗原に対する高アフィニティーおよび他の好適な生物学的特性を保持するように抗体をヒト化することがさらに一般に望ましい。この目標を達成するために、１つの方法に従い、ヒト化抗体を、親配列およびヒト化配列についての三次元モデルを使用する、親配列および多様な概念上のヒト化産物についての解析工程により調製する。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり、当業者は、これに精通している。選択された候補免疫グロブリン配列についての、蓋然的な三次元コンフォメーショナル構造を例示および表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示について検討することにより、候補免疫グロブリン配列の機能において推定される残基の役割についての解析、すなわち、候補免疫グロブリンが、その抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基についての解析が可能となる。このようにして、標的抗原に対するアフィニティーの増大など、所望の抗体特徴を達成するように、ＦＲ残基は、レシピエント配列および移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、超可変領域の残基は、抗原への結合に対する影響に、直接、かつ、極めて実質的に関与する。
ヒト抗体
本発明のヒト抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体は、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローンの可変ドメイン配列を、上で記載した、公知のヒト定常ドメイン配列と組み合わせることにより構築することができる。代替的に、本発明のヒトモノクローナル抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体は、ハイブリドーマ法により作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の作製のための、ヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株については、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３巻：３００１頁（１９８４年）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７年）；およびＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻：８６頁（１９９１年）により記載されている。
今や、免疫化されると、内因性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することができる。例えば、キメラの生殖細胞株列突然変異マウスにおける、抗体重鎖接合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性の欠失の結果として、内因性抗体産生の完全な阻害がもたらされることが記載されている。ヒト生殖細胞株列免疫グロブリン遺伝子アレイを、このような生殖細胞株列突然変異マウスに導入する結果として、抗原感作におけるヒト抗体の産生がもたらされる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０巻：２５５１頁（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻：２５５頁（１９９３年）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７巻：３３頁（１９９３年）を参照されたい。
遺伝子シャフリングはまた、ヒト抗体を、非ヒト抗体、例えば、齧歯動物抗体から導出するのにも使用することができ、この場合、ヒト抗体は、非ヒト出発抗体と同様のアフィニティーおよび特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法に従い、上で記載したファージディスプレイ技法により得られる、非ヒト抗体断片の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のいずれかを、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置きかえ、非ヒト鎖／ヒト鎖によるｓｃＦｖキメラまたはＦａｂキメラの集団を創出する。抗原による選択の結果として、非ヒト鎖／ヒト鎖によるキメラｓｃＦｖまたはキメラＦａｂが単離され、ここで、ヒト鎖は、初代ファージディスプレイクローン内で、対応する非ヒト鎖を除去したときに破壊された抗原結合性部位を回復する、すなわち、エピトープにより、ヒト鎖パートナーの選択が統御される（刷り込まれる）。残存する非ヒト鎖を置きかえるために工程を繰り返すと、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日に公開された、ＰＣＴ ＷＯ９３／０６２１３を参照されたい）。従来の、非ヒト抗体の、ＣＤＲグラフティングによるヒト化と異なり、この技法は、非ヒト由来のＦＲ残基またはＣＤＲ残基を有さない、完全ヒト抗体をもたらす。
二特異性抗体
二特異性抗体とは、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、二特異性抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である。ある特定の実施形態では、結合特異性のうちの一方は、特異的リシン連結を含む、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈに対するものであり、他方は、他の任意の抗原に対するものである。ある特定の実施形態では、二特異性抗体は、２つの異なるリシン連結を有する、２つの異なるＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈに結合しうる。二特異性抗体は、全長抗体として、または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二特異性抗体）として調製することができる。
当技術分野では、二特異性抗体を作製するための方法が公知である。従来、二特異性抗体の組換えによる作製は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づき、この場合、２つの重鎖は、異なる特異性を有する（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ、３０５巻：５３７頁（１９８３年））。免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖とのランダムな取合せのために、これらのハイブリドーマ（クァドローマ）は、そのうちの１つだけが正確な二特異性構造を有する、１０の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生する。通例、アフィニティークロマトグラフィーステップによりなされる、正確な分子の精製は、いくぶん煩瑣であり、産物の収率も低い。同様の手順は、１９９３年５月１３日に公開されたＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１０巻：３６５５頁（１９９１年）において開示されている。
異なる実施形態に従い、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を伴う抗体の可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させる。融合は、例えば、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域のうちの少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。ある特定の実施形態では、軽鎖の結合に必要な部位を含有する、第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）は、融合体のうちの少なくとも１つの中に存在する。免疫グロブリン重鎖融合体と、所望の場合、免疫グロブリン軽鎖とをコードするＤＮＡを、別個の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物に共トランスフェクトする。構築において使用される、不等比の３つのポリペプチド鎖から、最適の収率を得る実施形態では、これにより、３つのポリペプチド断片の相互の比率を調整するのに大きな柔軟性がもたらされる。しかし、少なくとも２つの、等比のポリペプチド鎖を発現させる結果として、高収率がもたらされる場合、または比が特段の重要性を有さない場合は、ポリペプチド鎖の２つまたは３つ全てのコード配列を、１つの発現ベクター内に挿入することが可能である。
この手法の一実施形態では、二特異性抗体は、一方のアームにおける、第１の結合特異性を伴う、ハイブリッドの免疫グロブリン重鎖と、他方のアームにおける、ハイブリッドの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性をもたらす）とから構成される。免疫グロブリン軽鎖が、二特異性分子の半分だけに存在することにより、容易な分離の方途がもたらされるので、この非対称性構造により、所望の二特異性化合物の、望ましくない免疫グロブリン鎖の組合せからの分離が容易となることが見出された。この手法は、ＷＯ９４／０４６９０において開示されている。二特異性抗体を作り出すことのさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１巻：２１０頁（１９８６年）を参照されたい。
別の手法に従い、抗体分子対の間のインターフェースを操作して、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の百分率を最大化することができる。インターフェースは、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子のインターフェースに由来する、１つまたは複数の小型のアミノ酸側鎖を、より大型の側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置きかえる。大型のアミノ酸側鎖を、より小型の側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置きかえることにより、大型の側鎖と相補的な、同一または同様なサイズの「空隙」を、第２の抗体分子のインターフェース上に創出する。これにより、ホモ二量体など、他の望ましくない最終生成物に対する、ヘテロ二量体の収率を増大させるための機構がもたらされる。
二特異性抗体は、架橋抗体または「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲート内の抗体のうちの一方をアビジンへ、他方をビオチンにカップリングさせることができる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を、望ましくない細胞にターゲティングするため（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置のため（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／００３７３、およびＥＰ０３０８９）に提起されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋法を使用して作製することができる。当技術分野では、適切な架橋剤が周知であり、多数の架橋技法と共に、米国特許第４，６７６，９８０号において開示されている。
また、二特異性抗体を、抗体断片から作り出すための技法も、文献に記載されている。例えば、二特異性抗体は、化学連結を使用して調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻：８１頁（１９８５年）は、無傷抗体を、タンパク質分解により切断して、Ｆ（ａｂ’）２断片を作り出す手順について記載している。これらの断片を、ジチオール複合体化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、近接のジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィドの形成を防止する。次いで、作り出されたＦａｂ’断片を、チオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に転換する。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体のうちの一方を、メルカプトエチルアミンによる還元によって、Ｆａｂ’−チオールに再転換し、等モル量である他方のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二特異性抗体を形成する。作製された二特異性抗体は、酵素を選択的に固定化するための薬剤として使用することができる。
近年の進展は、二特異性抗体を形成するように、化学的にカップリングさせうる、Ｆａｂ’−ＳＨ断片の、Ｅ．ｃｏｌｉからの直接的回収を容易としている。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１７５巻：２１７〜２２５頁（１９９２年）は、完全ヒト化二特異性抗体であるＦ（ａｂ’）２分子の作製について記載している。各Ｆａｂ’断片を、Ｅ．ｃｏｌｉから個別に分泌させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、指向性化学的カップリングにかけて、二特異性抗体を形成する。このようにして形成された二特異性抗体は、ＨＥＲ２受容体を過剰発現させる細胞、および正常ヒトＴ細胞に結合すること、ならびにヒト細胞傷害性リンパ球の、ヒト乳腺腫瘍標的に対する溶解活性を誘発することが可能であった。
また、二特異性抗体断片を、組換え細胞培養物から直接、作製および単離するための多様な技法も記載されている。例えば、二特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して作製されている（Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８巻（５号）：１５４７〜１５５３頁（１９９２年））。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質に由来するロイシンジッパーペプチドを、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に、遺伝子融合により連結した。抗体のホモ二量体を、ヒンジ領域において還元して、単量体を形成し、次いで、これを再酸化して、抗体のヘテロ二量体を形成した。この方法はまた、抗体のホモ二量体を作製するためにも活用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０巻：６４４４〜６４４８頁（１９９３年）により記載されている「ダイアボディー」技術は、二特異性抗体断片を作製するための代替的な機構を提供している。断片は、同じ鎖上の２つのドメインの間の対合を可能とするには短すぎるリンカーにより、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、１つの断片のＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別の断片の相補的なＶＬドメインおよびＶＨドメインと対合することを強いられ、これにより、２つの抗原結合性部位を形成する。また、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用により、二特異性抗体断片を作製するための別の戦略も、報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２巻：５３６８頁（１９９４年）を参照されたい。
二価を超える抗体が想定されている。例えば、三特異性抗体を調製することができる（Ｔｕｔｔら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻：６０頁（１９９１年））。
多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現させる細胞により、二価抗体より急速に内部化（および／または異化）されうる。本発明の抗体は、３つまたはこれを超える抗原結合性部位を伴う多価抗体（ＩｇＭクラス以外の抗体である）（例えば、四価抗体）の可能性があり、これは、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により、たやすく作製することができる。多価抗体は、二量体化ドメインおよび３つまたはこれを超える抗原結合性部位を含みうる。二量体化ドメインは、例えば、Ｆｃ領域またはヒンジ領域を含む（またはこれらからなる）。この状況では、抗体は、Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域に対してアミノ末端側にある、３つまたはこれを超える抗原結合性部位とを含む。一実施形態では、多価抗体は、例えば、３つ〜約８つ、または４つの抗原結合性部位を含む（またはこれらからなる）。多価抗体は、少なくとも１つのポリペプチド鎖（例えば、２つのポリペプチド鎖）を含み、ここで、ポリペプチド鎖は、２つまたはこれを超える可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃ［配列中、ＶＤ１は、第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の可変ドメインであり、Ｆｃは、Ｆｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１およびＸ２は、アミノ酸またはポリペプチドを表し、ｎは、０または１である］を含みうる。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＨ−ＣＨ１−可撓性リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖；またはＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を含みうる。本明細書の多価抗体は、少なくとも２つ（例えば、４つ）の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含みうる。本明細書の多価抗体は、例えば、約２つ〜約８つの軽鎖可変ドメインポリペプチドを含みうる。本明細書で想定される軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、任意選択で、ＣＬドメインをさらに含む。
抗体変異体
一部の実施形態では、本明細書で記載される抗体のアミノ酸配列修飾が想定される。例えば、アミノ酸配列修飾は、抗体の結合アフィニティーおよび／または他の生物学的特性を改善するのに望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化を抗体核酸に導入することにより、またはペプチド合成により調製する。このような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／または抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入、および／または抗体のアミノ酸配列内の残基の置換を含む。最終構築物が、所望の特徴を保有するという条件で、欠失、挿入、および置換の任意の組合せを作製して、最終的な構築物に到達することができる。アミノ酸改変は、配列を作製するときに、対象抗体のアミノ酸配列内に導入することができる。
突然変異誘発に好ましい位置である、抗体のある特定の残基または領域の同定に有用な方法は、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ （１９８９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：１０８１〜１０８５頁により記載されている通り、「アラニン走査突然変異誘発」と呼ばれる。本明細書では、標的残基の残基または基を同定し（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＧｌｕなどの帯電残基）、アミノ酸の抗原との相互作用に影響を及ぼすように、中性アミノ酸または負に帯電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）で置きかえる。次いで、置換の部位において、または置換の部位に代えて、さらなる変異体または他の変異体を導入することにより、置換に対する機能的な感受性を顕示するアミノ酸位置を精緻化する。したがって、アミノ酸配列の変化形を導入するための部位は、あらかじめ決定するが、突然変異自体の性質は、あらかじめ決定する必要がない。例えば、所与の部位における突然変異の性能を解析するには、アラニン走査またはランダム突然変異誘発を、標的コドンまたは標的領域において施し、発現させた免疫グロブリンを、所望の活性についてスクリーニングする。
アミノ酸配列の挿入は、長さが１残基〜１００またはこれを超える残基を含有するポリペプチドの範囲の、アミノ末端融合体および／またはカルボキシル末端融合体のほか、単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を伴う抗体、または細胞傷害性ポリペプチドに融合させた抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体のＮ末端またはＣ末端の、酵素への融合体（例えば、ＡＤＥＰＴの場合）、または抗体の血清中半減期を延長するポリペプチドへの融合体を含む。
別の種類の変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子内の少なくとも１つのアミノ酸残基を、異なる残基で置きかえている。置換突然変異誘発のために、最も大きな関心の対象となる部位は、超可変領域を含むが、また、ＦＲの改変も想定される。保存的置換を、「好ましい置換」の表題の下に、表Ａに示す。このような置換が、生物学的活性の変化を結果としてもたらす場合は、表Ａで「例示的置換」と名指されるか、またはアミノ酸クラスに言及して、下記でさらに記載される、より実質的な変化を導入し、産物をスクリーニングすることができる。
表Ａ
元の例示的な好ましい
残基置換
Ａｌａ（Ａ）Ｖａｌ；Ｌｅｕ；Ｉｌｅ Ｖａｌ
Ａｒｇ（Ｒ）Ｌｙｓ；Ｇｌｎ；Ａｓｎ Ｌｙｓ
Ａｓｎ（Ｎ）Ｇｌｎ；Ｈｉｓ；Ａｓｐ、Ｌｙｓ；Ａｒｇ Ｇｌｎ
Ａｓｐ（Ｄ）Ｇｌｕ；Ａｓｎ Ｇｌｕ
Ｃｙｓ（Ｃ）Ｓｅｒ；Ａｌａ Ｓｅｒ
Ｇｌｎ（Ｑ）Ａｓｎ；Ｇｌｕ Ａｓｎ
Ｇｌｕ（Ｅ）Ａｓｐ；Ｇｌｎ Ａｓｐ
Ｇｌｙ（Ｇ）Ａｌａ Ａｌａ
Ｈｉｓ（Ｈ）Ａｓｎ；Ｇｌｎ；Ｌｙｓ；Ａｒｇ Ａｒｇ
Ｉｌｅ（Ｉ）Ｌｅｕ；Ｖａｌ；Ｍｅｔ；Ａｌａ；Ｌｅｕ
Ｐｈｅ；ノルロイシン
Ｌｅｕ（Ｌ）ノルロイシン；Ｉｌｅ；Ｖａｌ；Ｉｌｅ
Ｍｅｔ；Ａｌａ；Ｐｈｅ
Ｌｙｓ（Ｋ）Ａｒｇ；Ｇｌｎ；Ａｓｎ Ａｒｇ
Ｍｅｔ（Ｍ）Ｌｅｕ；Ｐｈｅ；Ｉｌｅ Ｌｅｕ
Ｐｈｅ（Ｆ）Ｔｒｐ；Ｌｅｕ；Ｖａｌ；Ｉｌｅ；Ａｌａ；Ｔｙｒ Ｔｙｒ
Ｐｒｏ（Ｐ）Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ（Ｓ）Ｔｈｒ Ｔｈｒ
Ｔｈｒ（Ｔ）Ｖａｌ；Ｓｅｒ Ｓｅｒ
Ｔｒｐ（Ｗ）Ｔｙｒ；Ｐｈｅ Ｔｙｒ
Ｔｙｒ（Ｙ）Ｔｒｐ；Ｐｈｅ；Ｔｈｒ；Ｓｅｒ Ｐｈｅ
Ｖａｌ（Ｖ）Ｉｌｅ；Ｌｅｕ；Ｍｅｔ；Ｐｈｅ；Ｌｅｕ
Ａｌａ；ノルロイシン
抗体の生物学的特性の実質的な修飾は、（ａ）例えば、シートコンフォメーションもしくはヘリックスコンフォメーションとしての置換エリア内のポリペプチド骨格の構造；（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性；または（ｃ）側鎖のバルクを維持することに対するそれらの効果が著明に異なる置換を選択することにより達成する。アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性（Ａ． Ｌ． Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２版、７３〜７５頁、Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５年））：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非帯電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｏ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）
に従い群分けすることができる。
代替的に、自然発生の残基は、一般的な側鎖特性に基づく群：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向性に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
に分けることができる。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを、別のクラスのメンバーと交換することを伴う。また、このような置換残基を、保存的置換部位へ、または残りの（非保存的な）部位に導入することもできる。
１つの種類の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つまたは複数の超可変領域残基の置換を伴う。一般に、さらなる開発のために選択される、結果として得られる変異体では、生物学的特性は、それらが作り出された親抗体と比べて修飾されている（例えば、改善されている）。このような置換変異体を作り出すための簡便な方途は、ファージディスプレイを使用するアフィニティー成熟を伴う。略述すると、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７カ所の部位）を突然変異させて、各部位における全ての可能なアミノ酸置換を作り出す。このようにして作り出された抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内にパッケージングされたファージコートタンパク質（例えば、Ｍ１３の遺伝子ＩＩＩ産物）のうちの少なくとも一部との融合体として表示される。次いで、ファージディスプレイされた変異体を、本明細書で開示される通り、それらの生物学的活性（例えば、結合アフィニティー）についてスクリーニングする。修飾のための候補超可変領域部位を同定するために、走査突然変異誘発（例えば、アラニン走査）を実施して、抗原への結合に著明に寄与する超可変領域残基を同定することができる。代替的に、または加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造を解析して、抗体と抗原との接触点を同定することも有益でありうる。このような接触残基および隣接残基は、本明細書で詳述される技法を含む、当技術分野で公知の技法に従う置換のための候補である。このような変異体を作り出したら、変異体のパネルを、本明細書で記載される技法を含む、当技術分野で公知の技法を使用するスクリーニングにかけ、１つまたは複数の関連アッセイにおいて優れた特性を伴う抗体を、さらなる開発のために選択することができる。
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野で公知の様々な方法により調製する。これらの方法は、天然供給源（自然発生のアミノ酸配列変異体の場合）からの単離、またはオリゴヌクレオチド媒介型（または部位指向）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、および抗体の、以前に調製された変異体もしくは非変異変化形に対する、カセット型突然変異誘発による調製を含むがこれらに限定されない。
１つまたは複数のアミノ酸修飾を、本発明の抗体のＦｃ領域内に導入し、これにより、Ｆｃ領域変異体を作り出すことが望ましい場合がある。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジシステインのアミノ酸位置を含む、１つまたは複数のアミノ酸位置におけるアミノ酸修飾（例えば、置換）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃ領域）を含みうる。
イムノコンジュゲート
別の態様では、本発明は、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌由来、真菌由来、植物由来、もしくは動物由来の酵素活性毒素、またはこれらの断片）、または放射性同位元素（すなわち、放射性コンジュゲート）などの細胞傷害剤にコンジュゲートさせた抗体を含む、イムノコンジュゲートまたは抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。
細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤、すなわち、がんの処置において、腫瘍細胞を死滅させるかまたは阻害する薬物を局所送達するために、抗体−薬物コンジュゲートを使用すること（ＳｙｒｉｇｏｓおよびＥｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９年）、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９巻：６０５〜６１４頁；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−ＤｕｖａｚおよびＳｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７年）、Ａｄｖ． Ｄｒｇ Ｄｅｌ． Ｒｅｖ．、２６巻：１５１〜１７２頁；米国特許第４，９７５，２７８号）により、薬物部分の、腫瘍へのターゲティング送達、および腫瘍細胞内の蓄積が可能となり、この場合、これらの薬剤をコンジュゲートさせずに全身投与すれば、許容不可能なレベルの毒性が、消失が求められる腫瘍細胞のほか、正常細胞にも結果としてもたらされうる（Ｂａｌｄｗｉｎら（１９８６年）、Ｌａｎｃｅｔ（１９８６年３月１５日）：６０３〜０５頁；Ｔｈｏｒｐｅ（１９８５年）、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ‘８４： Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａ． Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５〜５０６頁）。こうして、毒性を最小としながら、有効性を最大とすることが探索される。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれも、これらの戦略において有用であると報告されている（Ｒｏｗｌａｎｄら（１９８６年）、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、２１巻：１８３〜８７頁）。これらの方法で使用される薬物は、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキセート、およびビンデシンを含む（Ｒｏｗｌａｎｄら（１９８６年）、前出）。抗体−毒素コンジュゲート内で使用される毒素は、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシンなどの低分子毒素（Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００年）、Ｊｏｕｒ． ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、９２巻（１９号）：１５７３〜１５８１頁；Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００年）、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔｅｒｓ、１０巻：１０２５〜１０２８頁；Ｍａｎｄｌｅｒら（２００２年）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１３巻：７８６〜７９１頁）、メイタンシノイド（ＥＰ１３９１２１３；Ｌｉｕら（１９９６年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９３巻：８６１８〜８６２３頁）、およびカリケアマイシン（Ｌｏｄｅら（１９９８年）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５８巻：２９２８頁；Ｈｉｎｍａｎら（１９９３年）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５３巻：３３３６〜３３４２頁）を含む。毒素は、それらの細胞傷害効果および細胞増殖抑制効果を、チューブリンへの結合、ＤＮＡへの結合、またはトポイソメラーゼの阻害を含む機構により及ぼしうる。一部の細胞傷害薬は、大型の抗体またはタンパク質受容体のリガンドにコンジュゲートさせると、不活性または低活性となる傾向がある。
抗体の誘導体
本発明の抗体は、当技術分野で公知であり、たやすく利用可能な、さらなる非タンパク質性部分を含有するように、さらに修飾することができる。一実施形態では、抗体の誘導体化に適する部分は、水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、およびこれらの混合物を含むがこれらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中のその安定性のために、製造において有利でありうる。ポリマーは、任意の分子量であることが可能であり、分枝状であっても非分枝状であってもよい。抗体に結合させるポリマーの数は変更が可能であり、１つを超えるポリマーを結合させる場合、ポリマーは、同じ、または、異なる分子の場合がある。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／または種類は、改善される抗体の特定の特性または機能、抗体の誘導体が規定された条件下の治療で使用されるのかどうかなどを含むがこれらに限定されない検討項目に基づき決定することができる。
別の実施形態では、放射線への曝露により選択的に加熱されうる、抗体と非タンパク質性部分とのコンジュゲートが提供される。一実施形態では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、１０２巻：１１６００〜１１６０５頁（２００５年））。放射線は、任意の波長のものであることが可能であり、通常の細胞には有害でないが、非タンパク質性部分を、抗体−非タンパク質性部分に近位の細胞が死滅する温度まで加熱する波長を含むがこれらに限定されない。
医薬製剤
本発明の抗体を含む治療用製剤は、所望の程度の純度を有する抗体を、任意選択の、生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６版、Ｏｓｏｌ， Ａ．編（１９８０年））と、水溶液、凍結乾燥製剤、または他の乾燥製剤の形態で混合することにより、保管用に調製する。許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤は、援用される投与量および濃度で、レシピエントに対して非毒性であり、リン酸、クエン酸、ヒスチジン、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖、および、グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
本明細書の製剤はまた、処置される特定の適応症に対する必要に応じて、１つを超える活性化合物であって、互いに対して有害な影響を及ぼし合わない相補的活性を伴う活性化合物を含むがこれらに限定されない活性化合物も含有しうる。このような分子は、意図される目的に有効な量で組合せの中に適切に存在する。
有効成分はまた、例えば、コアセルベーション技法により、または界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）内、またはマクロエマルジョン中の、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル内またはゼラチンマイクロカプセル内およびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル内に封入することもできる。このような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６版、Ｏｓｏｌ， Ａ．編（１９８０年）において開示されている。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける投与のために使用される製剤は、滅菌製剤でなければならない。これは、滅菌濾過膜を介する濾過によりたやすく達成される。
持続放出調製物を調製することができる。適切な持続放出調製物の例は、本発明の免疫グロブリンを含有する固体の疎水性ポリマーによる半透性マトリックスを含み、このマトリックスルは、成型品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態にある。持続放出マトリックスの例は、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーと、酢酸ロイプロリドとから構成される注射用マイクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーが、１００日間超にわたり分子の放出を可能とするのに対し、ある特定のハイドロゲルは、タンパク質を放出する期間が短い。封入された免疫グロブリンは、長時間体内にとどまる場合、３７℃の水分に曝露される結果として、変性または凝集し、生物学的活性の喪失および可能な免疫原性の変化を結果としてもたらす場合がある。関与する機構に応じた、安定化のための妥当な戦略を案出することができる。例えば、凝集機構は、チオ−ジスルフィド交換を介する、分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることがわかっていれば、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液を凍結乾燥させ、水分含量を制御し、適切な添加剤を使用し、特異的なポリマーマトリックス組成物を開発することにより達成することができる。
使用
本発明の抗体は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、およびｉｎ ｖｉｖｏにおける治療法において使用することができる。本発明の抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、および／またはｉｎ ｖｉｖｏにおける特異的抗原活性を、部分的または完全に遮断するアンタゴニストとして使用することができる。さらに、本発明の抗体の少なくとも一部は、他の種に由来する抗原活性を中和しうる。したがって、本発明の抗体を使用して、例えば、抗原を含有する細胞培養物中、ヒト対象、または、本発明の抗体が交差反応する抗原を有する他の哺乳動物対象（例えば、チンパンジー、ヒヒ、マーモセット、カニクイザル、およびアカゲザル、ブタ、またはマウス）における特異的抗原活性を阻害することができる。一実施形態では、本発明の抗体は、抗原活性を阻害するように、抗体を抗原と接触させることにより、抗原活性を阻害するために使用することができる。一実施形態では、抗原は、ヒトタンパク質分子である。
一実施形態では、本発明の抗体は、抗原活性が有害である障害を患う対象において、抗原を阻害するための方法であって、対象における抗原活性を阻害するように、対象に、本発明の抗体を投与するステップを含む方法において使用することができる。一実施形態では、抗原は、ヒトタンパク質分子であり、対象は、ヒト対象である。代替的に、対象は、本発明の抗体が結合する抗原を発現させる哺乳動物でありうる。なおさらなる対象は、抗原を導入した（例えば、抗原の投与により、または抗原トランス遺伝子の発現により）哺乳動物でありうる。本発明の抗体は、ヒト対象に、治療目的で投与することができる。さらに、本発明の抗体は、抗体が交差反応する抗原を発現させる非ヒト哺乳動物（例えば、霊長動物、ブタ、またはマウス）に、獣医学的目的で、またはヒト疾患の動物モデルとして、投与することもできる。後者に関して、このような動物モデルは、本発明の抗体の治療有効性の査定（例えば、投与量および投与の時間経過についての検査）に有用でありうる。本発明の抗体を使用して、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ ＨおよびＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ化タンパク質の異常な発現および／または活性と関連する疾患、障害、または状態であって、がん、筋障害、ユビキチン経路関連の遺伝子障害、免疫／炎症性障害、神経障害、および他のユビキチン経路関連障害を含むがこれらに限定されない疾患、障害、または状態を処置するか、阻害するか、進行を遅延させるか、防止する／再発を遅延させるか、回復させるか、または防止することができる。
一態様では、本発明の遮断抗体は、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈに特異的である。
ある特定の実施形態では細胞傷害剤とコンジュゲートさせた本発明の抗体を含むイムノコンジュゲートを、患者に投与する。一部の実施形態では、イムノコンジュゲート、および／またはそれが結合する抗原は、それらの細胞表面上にＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈと関連する１つまたは複数のタンパク質を発現させる細胞により内部化され、結果として、それが会合する標的細胞の殺滅におけるイムノコンジュゲートの治療有効性の増大をもたらす。一実施形態では、細胞傷害剤は、標的細胞内の核酸をターゲティングするか、またはこれに干渉する。このような細胞傷害剤の例は、本明細書で言及される化学療法剤（メイタンシノイドまたはカリケアマイシンなど）、放射性同位元素、またはリボヌクレアーゼもしくはＤＮＡエンドヌクレアーゼのうちのいずれかを含む。
本発明の抗体は、治療において、単独で、または他の組成物と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体は、別の抗体および／またはアジュバント／治療剤（例えば、ステロイド）と共に共投与することができる。例えば、本発明の抗体は、処置スキームにおいて、例えば、がん、筋障害、ユビキチン経路関連の遺伝子障害、免疫／炎症性障害、神経障害、および他のユビキチン経路関連障害を含む、本明細書で記載される疾患のうちのいずれかの処置において、抗炎症剤および／または抗敗血症剤と組み合わせることができる。上で言及された、このような組合せ療法は、組合せ投与（２つまたはこれを超える薬剤が、同じ製剤中または個別の製剤中に含まれる場合）と、個別投与とを含み、個別投与の場合、本発明の抗体の投与は、１つまたは複数の補助療法の投与の前、および／またはこれらの後で施すことができる。
本発明の抗体（および補助療法剤）は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、および鼻腔内、ならびに、局所的処置に所望の場合、病変内投与を含む任意の適切な手段により投与することができる。非経口注入は、筋内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または皮下投与を含む。加えて、抗体は、特に、抗体の用量を減じるパルス注入により投与するのに適する。投与は、任意の適切な経路によって、例えば、投与が短期であるのか、長期であるのかに部分的に応じて、静脈内または皮下注射などの注射を介することが可能である。
抗体の調製および投与では、本発明の抗体の結合標的の位置を考慮する場合がある。結合標的が、細胞内分子である場合、本発明のある特定の実施形態は、結合標的が位置する細胞に導入される抗体またはその抗原結合性断片を提供する。一実施形態では、本発明の抗体は、細胞内でイントラボディーとして発現させることができる。本明細書で使用される「イントラボディー」という用語は、Ｍａｒａｓｃｏ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、４巻：１１〜１５頁（１９９７年）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３４巻：１６３〜１７０頁（２００４年）；米国特許第６，００４，９４０号および同第６，３２９，１７３号；米国特許出願公開第２００３／０１０４４０２号；ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２００３／０７７９４５号において記載されている通り、細胞内で発現し、標的分子に選択的に結合することが可能な、抗体またはその抗原結合性部分を指す。イントラボディーの細胞内発現は、所望の抗体またはその抗原結合性部分をコードする核酸（その抗体または抗原結合性断片をコードする遺伝子と通常関連する、野生型のリーダー配列および分泌シグナルを欠く）を、標的細胞に導入することによりなされる。核酸を細胞に導入する、任意の標準的な方法であって、マイクロ注射、遺伝子銃注射、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム、および、目的の核酸を保有するレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびワクシニアベクターによるトランスフェクションを含むがこれらに限定されない方法を使用することができる。ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈへの細胞内結合、および１つまたは複数のＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ媒介性細胞内経路のモジュレーションが可能な、１つまたは複数のイントラボディーを発現させるように、本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体の全部または一部分をコードする、１つまたは複数の核酸を、標的細胞に送達することができる。
別の実施形態では、内部化抗体が提供される。抗体は、抗体の細胞への送達を増強するある特定の特徴を保有する場合もあり、このような特徴を保有するように修飾される場合もある。当技術分野では、これを達成するための技法が公知である。例えば、抗体のカチオン化は、その細胞への取込みを容易とすることが公知である（例えば、米国特許第６，７０３，０１９号を参照されたい）。また、リポフェクションまたはリポソームも、抗体を細胞に送達するのに使用することができる。抗体断片を使用する場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の阻害性断片が一般に有利である。例えば、抗体の可変領域配列に基づき、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するペプチド分子をデザインすることができる。このようなペプチドは、化学合成する、かつ／または組換えＤＮＡ技術により作製することができる。例えば、Ｍａｒａｓｃｏら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０巻：７８８９〜７８９３頁（１９９３年）を参照されたい。
モジュレーターポリペプチドの、標的細胞への侵入は、当技術分野で公知の方法により増強することができる。例えば、ＨＩＶ ＴａｔまたはＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメインタンパク質に由来する配列など、ある特定の配列は、異種タンパク質の、細胞膜を越えた効率的な取込みを方向付けることが可能である。例えば、Ｃｈｅｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９９９年）、９６巻：４３２５〜４３２９頁を参照されたい。
結合標的が脳内に位置する場合、本発明のある特定の実施形態は、血液脳関門を越える抗体またはその抗原結合性断片を提供する。ある特定の神経変性疾患は、抗体または抗原結合性断片が、脳にたやすく導入されうるような、血液脳関門の透過性の増大と関連する。血液脳関門が無傷を維持する場合は、物理的方法、脂質ベースの方法、ならびに受容体およびチャネルベースの方法を含むがこれらに限定されない、血液脳関門を越えて分子を輸送するための、当技術分野で公知のいくつかの手法が存在する。
抗体または抗原結合性断片を、血液脳関門を越えて輸送する、物理的方法は、血液脳関門を全体として迂回する方法、または血液脳関門内に開口部を創出する方法を含むがこれらに限定されない。迂回法は、脳への直接的注射（例えば、Ｐａｐａｎａｓｔａｓｓｉｏｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、９巻：３９８〜４０６頁（２００２年）を参照されたい）、間質内注入／対流増強型送達（例えば、Ｂｏｂｏら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９１巻：２０７６〜２０８０頁（１９９４年）を参照されたい）、および送達デバイスの脳内への植込み（例えば、Ｇｉｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、９巻：５８９〜５９５頁（２００３年）；およびＧｌｉａｄｅｌ Ｗａｆｅｒｓ（商標）、Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌを参照されたい）を含むがこれらに限定されない。関門内に開口部を創出する方法は、超音波（例えば、米国特許公開第２００２／００３８０８６号を参照されたい）、浸透圧（例えば、高張性マンニトールの投与による（Ｎｅｕｗｅｌｔ， Ｅ． Ａ．、Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ、１および２巻、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）））、例えば、ブラジキニンまたは透過剤Ａ−７による透過化（例えば、米国特許第５，１１２，５９６号、同第５，２６８，１６４号、同第５，５０６，２０６号、および同第５，６８６，４１６号を参照されたい）、および血液脳関門を夾叉するニューロンの、抗体または抗原結合性断片をコードする遺伝子を含有するベクターによるトランスフェクション（例えば、米国特許公開第２００３／００８３２９９号を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。
抗体または抗原結合性断片を、血液脳関門を越えて輸送する、脂質ベースの方法は、抗体または抗原結合性断片を、血液脳関門の血管内皮上の受容体に結合する抗体または抗原結合性断片にカップリングさせたリポソーム内に封入する方法（例えば、米国特許出願公開第２００２００２５３１３号を参照されたい）、および抗体または抗原結合性断片を、低密度リポタンパク質粒子（例えば、米国特許出願公開第２００４０２０４３５４号を参照されたい）またはアポリポタンパク質Ｅ（例えば、米国特許出願公開第２００４０１３１６９２号を参照されたい）でコーティングする方法を含むがこれらに限定されない。
抗体または抗原結合性断片を、血液脳関門を越えて輸送する、受容体およびチャネルベースの方法は、グルココルチコイド遮断剤を使用して、血液脳関門の透過性を増大させる方法（例えば、米国特許出願公開第２００２／００６５２５９号、同第２００３／０１６２６９５号、および同第２００５／０１２４５３３号を参照されたい）；カリウムチャネルを活性化させる方法（例えば、米国特許出願公開第２００５／００８９４７３号を参照されたい）、ＡＢＣ薬物輸送体を阻害する方法（例えば、米国特許出願公開第２００３／００７３７１３号を参照されたい）；抗体をトランスフェリンでコーティングし、１つまたは複数のトランスフェリン受容体の活性をモジュレートする方法（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１２９１８６号を参照されたい）、および抗体をカチオン化する方法（例えば、米国特許第５，００４，６９７号を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。
本発明の抗体組成物は、「医薬品の製造および品質管理に関する基準」に準拠する方式で、製剤化、投薬および投与される。この文脈で検討される因子は、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与法、投与のスケジュール指定、および医療従事者に公知の他の因子を含む。抗体は、問題の障害を防止または処置するのに現在使用されている、１つまたは複数の薬剤と共に製剤化する必要はないが、任意選択で、これらと共に製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する本発明の抗体の量、障害または処置の種類、および上で論じた他の因子に依存する。他の薬剤は一般に、本明細書で記載される通り同じ投与量および投与経路で、または本明細書で記載される投与量の約１〜９９％で、または経験的／臨床的に適切であると決定される任意の投与量および任意の経路で使用される。
疾患を防止または処置するために、本発明の抗体の適切な投与量（単独で、または、化学療法剤など、他の薬剤と組み合わせて使用する場合）は、処置される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度および経過、抗体が予防目的で投与されるのか、治療目的で投与されるのか、既往の治療、患者の臨床歴および抗体への応答、ならびに主治医の判断に依存する。抗体は、患者に一度に、または一連の処置にわたり投与するのに適する。疾患の種類および重症度に応じて、抗体約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）が、例えば、１回または複数回の個別投与によるのであれ、連続注入によるのであれ、患者に投与するための初期の候補投与量でありうる。典型的な毎日の１回分の投与量は、上で言及した因子に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはこれを超える範囲でありうる。数日間またはこれを超えて長期にわたる繰返し投与では、状態に応じて、処置は一般に、疾患症状の所望される抑制が生じるまで持続される。１つの例示的な抗体の投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇのうちの１つまたは複数の用量（またはこれらの任意の組合せ）を、患者に投与することができる。このような用量は、間欠的に、例えば、毎週または３週間ごとに（例えば、患者が抗体の投薬を、約２〜約２０回、または例えば、約６回施されるように）投与することができる。初期の高負荷用量に続き、１回または複数回の低用量を投与することができる。例示的な投薬レジメンは、初期負荷用量約４ｍｇ／ｋｇに続いて、毎週の維持用量約２ｍｇ／ｋｇの抗体を投与することを含む。しかし、他の投与レジメンも、有用でありうる。この治療の進捗状況は、従来の技法およびアッセイにより、容易にモニタリングされる。
製品
本発明の別の態様では、上で記載した障害の処置、防止、および／または診断に有用な材料を含有する製品が提供される。製品は、容器、および容器上における標識もしくはパッケージ添付文書、または容器と関連する標識もしくはパッケージ添付文書を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどを含む。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成することができる。容器は、それ自体で、または別の組成物と組み合わされると、状態を処置、防止、および／または診断するのに有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを含みうる（例えば、容器は、静脈内注射用溶液バッグまたは皮下注射用注射針で穿刺可能な止栓を有するバイアルの場合がある）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の抗体である。標識またはパッケージ添付文書は、組成物が、選択状態を処置するために使用されることを指し示す。さらに、製品は、（ａ）組成物がその中に含有された第１の容器であって、組成物が本発明の抗体を含む、容器と；（ｂ）組成物がその中に含有された第２の容器であって、組成物がさらなる細胞傷害性またはこれ以外の治療剤を含む、容器とを含みうる。本発明のこの実施形態における製品は、組成物を使用して、特定の状態を処置しうることを指し示す、パッケージ添付文書もさらに含みうる。代替的に、または加えて、製品は、静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩液、リンゲル液、およびテキストロース溶液など、薬学的に許容される緩衝液を含む第２の（または第３の）容器もさらに含みうる。製品は、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、注射針、およびシリンジを含む、販売上のおよび使用者の観点から望ましい他の材料もさらに含む。
ある特定の実施形態では、処置される対象は、哺乳動物である。ある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。ある特定の実施形態では、対象は、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、またはヤギなどの馴致動物である。ある特定の実施形態では、対象は、イヌまたはネコなどの愛玩動物である。ある特定の実施形態では、対象は、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、またはヤギなどの家畜動物である。ある特定の実施形態では、対象は、動物園の動物である。別の実施形態では、対象は、齧歯動物、イヌ、または非ヒト霊長動物などの研究用動物である。ある特定の実施形態では、対象は、トランスジェニックマウスまたはトランスジェニックブタなどの非ヒトトランスジェニック動物である。
医薬組成物および製剤
本明細書で記載される抗体を調製した後で、「あらかじめ凍結乾燥させた製剤」を作製することができる。製剤を調製するための抗体は、本質的に純粋であることが好ましく、本質的に均質であることが所望される（すなわち、夾雑タンパク質などを含まない）。「本質的に純粋な」タンパク質とは、組成物の総重量に基づき、少なくとも約９０重量％のタンパク質、好ましくは、少なくとも約９５重量％を含む組成物を意味する。「本質的に均質な」タンパク質とは、組成物の総重量に基づき、少なくとも約９９重量％のタンパク質を含む組成物を意味する。ある特定の実施形態では、タンパク質は、抗体である。
あらかじめ凍結乾燥させた製剤中の抗体の量は、所望の投薬容量、投与方式などを考慮に入れて決定する。選択タンパク質が、無傷抗体（全長抗体）である場合、約２ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、約５ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬであり、最も好ましくは、約２０〜３０ｍｇ／ｍＬが、例示的な出発タンパク質濃度である。タンパク質は一般に、溶液中に存在する。例えば、タンパク質は、ｐＨ緩衝溶液中に、ｐＨ約４〜８で、好ましくは、約５〜７で存在しうる。例示的な緩衝剤は、ヒスチジン、リン酸、トリス、クエン酸、コハク酸、および他の有機酸を含む。緩衝剤濃度は、例えば、緩衝剤および製剤（例えば、再構成製剤）の所望の等張性に応じて、約１ｍＭ〜約２０ｍＭ、または約３ｍＭ〜約１５ｍＭでありうる。下記で裏付けられる通り、ヒスチジンは、凍結乾燥保護特性を有しうるので、好ましい緩衝剤は、ヒスチジンである。コハク酸は、別の有用な緩衝剤であることが示された。
凍結乾燥保護剤を、あらかじめ凍結乾燥させた製剤に添加する。好ましい実施形態では、凍結乾燥保護剤は、スクロースまたはトレハロースなどの非還元糖である。あらかじめ凍結乾燥させた製剤中の凍結乾燥保護剤の量は一般に、再構成すると、結果として得られる製剤が等張性となるような量である。しかしまた、高張性の再構成製剤も、適切でありうる。加えて、凍結乾燥保護剤の量は、凍結乾燥時に、許容不可能な量のタンパク質の分解／凝集が生じるほどに少なすぎてはならない。凍結乾燥保護剤が、糖（スクロースまたはトレハロースなど）であり、タンパク質が、抗体である場合、例示的な、あらかじめ凍結乾燥させた製剤中の凍結乾燥保護剤濃度は、約１０ｍＭ〜約４００ｍＭ、好ましくは、約３０ｍＭ〜約３００ｍＭ、最も好ましくは、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭである。
タンパク質と凍結乾燥保護剤との比は、タンパク質と凍結乾燥保護剤との各組合せについて選択する。タンパク質濃度が高い等張性の再構成製剤を作り出すための、選択タンパク質としての抗体、および凍結乾燥保護剤としての糖（例えば、スクロースまたはトレハロース）の場合、凍結乾燥保護剤と抗体とのモル比は、１モルの抗体に対して約１００〜約１５００モルの凍結乾燥保護剤、好ましくは、１モルの抗体に対して約２００〜約１０００モルの凍結乾燥保護剤、例えば、１モルの抗体に対して約２００〜約６００モルの凍結乾燥保護剤でありうる。
本発明の好ましい実施形態では、あらかじめ凍結乾燥させた製剤に、界面活性剤を添加することが望ましいことが見出されている。代替的に、または加えて、界面活性剤は、凍結乾燥製剤および／または再構成製剤に添加することもできる。例示的な界面活性剤は、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０または８０）；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）；Ｔｒｉｔｏｎ；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウリル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｌａｕｒｅｌ ｓｕｌｆａｔｅ）；オクチルグリコシドナトリウム；ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、リノレイルスルホベタイン、またはステアリルスルホベタイン；ラウリルサルコシン、ミリスチルサルコシン、リノレイルサルコシン、またはステアリルサルコシン；リノレイルベタイン、ミリスチルベタイン、またはセチルベタイン；ラウロアミドプロピルベタイン、コカミドプロピルベタイン、リノレアミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルベタイン、パルミドプロピル（ｐａｌｎｉｄｐｒｏｐｙｌ）ベタイン、またはイソステアラミドプロピルベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）；ミリスタミドプロピルジメチルアミン、パルミドプロピルジメチルアミン、またはイソステアラミドプロピルジメチルアミン；ココイルメチルタウリンナトリウムまたはオレオイルメチルタウリン二ナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌ ｏｌｅｙｌ−ｔａｕｒａｔｅ）；ならびにＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）シリーズ（Ｍｏｎａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｐａｔｅｒｓｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリプロピレングリコール（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌ ｇｌｙｃｏｌ）、およびエチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＰＦ６８など）などの非イオン界面活性剤を含む。添加される界面活性剤の量は、界面活性剤により、再構成されるタンパク質の凝集を低減し、再構成後における粒子状物質の形成を最小化するような量である。例えば、界面活性剤は、あらかじめ凍結乾燥させた製剤中に、約０．００１〜０．５％の量で、好ましくは、約０．００５〜０．０５％で存在しうる。
本発明のある特定の実施形態では、凍結乾燥保護剤（スクロースまたはトレハロースなど）と、増量剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）との混合物を、あらかじめ凍結乾燥させた製剤の調製物中で使用する。増量剤により、その中に過剰なポケットなどを伴わずに、均一な凍結乾燥ケーキの作製を可能とすることができる。
それらが、製剤の所望の特徴に有害な影響を及ぼさないという条件で、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６版、Ｏｓｏｌ， Ａ．編（１９８０年）において記載されているものなど、他の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤を、あらかじめ凍結乾燥させた製剤（および／または凍結乾燥製剤および／または再構成製剤）中に含むことができる。許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤は、援用される投与量および濃度で、レシピエントに対して非毒性であり、さらなる緩衝化剤；防腐剤；共溶媒；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ポリエステルなどの生体分解性ポリマー；ならびに／またはナトリウムなどの塩形成対イオンを含む。
本明細書で記載される医薬組成物および製剤は、安定的であることが好ましい。「安定的な」製剤／組成物とは、その中の抗体が、保管時に、その物理的および化学的な安定性および完全性を本質的に保持する製剤／組成物である。当技術分野では、タンパク質の安定性を測定するための多様な解析技法が利用可能であり、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２４７〜３０１頁、Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．刊（１９９１年）；およびＪｏｎｅｓ， Ａ．、Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．、１０巻：２９〜９０頁（１９９３年）において総説されている。安定性は、選択された温度で、選択された期間測定することができる。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける投与のために使用される製剤は、滅菌製剤でなければならない。これは、凍結乾燥および再構成の前に、または凍結乾燥および再構成の後で、滅菌濾過膜を介する濾過によりたやすく達成される。代替的に、混合物全体の無菌性は、タンパク質を除く成分を、例えば、約１２０℃で約３０分間、オートクレーブにかけることにより達成することができる。
タンパク質、凍結乾燥保護剤、および他の任意選択の構成要素を一体に混合した後で、製剤を凍結乾燥させる。Ｈｕｌｌ５０（登録商標）（Ｈｕｌｌ、ＵＳＡ）フリーズドライヤーまたはＧＴ２０（登録商標）（Ｌｅｙｂｏｌｄ−Ｈｅｒａｅｕｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）フリーズドライヤーなど、多くの異なるフリーズドライヤーが、この目的で利用可能である。フリーズドライは、製剤を凍結させ、その後、一次乾燥に適する温度で、凍結させた内容物から、氷を昇華させることにより達成する。この条件下で、生成物温度は、製剤の共晶融点または崩壊温度を下回る。一次乾燥のための保管温度は、約５０〜２５０ｍＴｏｒｒの範囲であることが典型的である適切な圧力で、約−３０〜２５℃の範囲となる（一次乾燥時に、生成物が凍結を維持するという条件で）ことが典型的である。主に、製剤、サイズ、および試料を保持する容器の種類（例えば、ガラスバイアル）、ならびに液体の体積により、乾燥に要請される時間が指示され、これは、数時間〜数日間（例えば、４０〜６０時間）の範囲でありうる。二次乾燥段階は、容器の種類およびサイズ、ならびに援用されるタンパク質の種類に主に依存して、約０℃〜４０℃で実行することができる。しかし、本明細書では、二次乾燥ステップは、必要でない場合もあることが見出された。例えば、凍結乾燥のうちの全水除去期を通した保管温度は、約１５〜３０℃（例えば、約２０℃）でありうる。二次乾燥に要請される時間および圧力は、例えば、温度および他のパラメータに依存して、適切な凍結乾燥ケーキを生成する時間および圧力である。二次乾燥時間は、生成物中に所望される残りの水分レベルにより指示され、少なくとも約５時間（例えば、１０〜１５時間）を要することが典型的である。圧力は、一次乾燥ステップ中に援用される圧力と同じでありうる。フリーズドライ条件は、製剤およびバイアルサイズに応じて変化しうる。
場合によって、移出ステップを回避するために、タンパク質製剤は、タンパク質の再構成が実行される容器内で凍結乾燥させることが望ましい場合がある。この場合の容器は、例えば、３、５、１０、２０、５０、または１００ｃｃのバイアルでありうる。一般的な仮定として述べると、凍結乾燥は、その水分含量が約５％未満、好ましくは、約３％未満である凍結乾燥製剤を結果としてもたらす。
タンパク質を患者に投与する場合、再構成製剤中のタンパク質濃度が、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、例えば、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約４００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは、約８０ｍｇ／ｍＬ〜約３００ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは、約９０ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬとなるように、所望の段階において、凍結乾燥製剤を、希釈剤で再構成することが典型的である。再構成製剤中のこのような高タンパク質濃度は、再構成製剤の皮下送達を意図する場合に特に有用であると考えられる。しかし、静脈内投与など、他の投与経路では、再構成製剤中のより低濃度のタンパク質が所望でありうる（例えば、再構成製剤中に約５〜５０ｍｇ／ｍＬまたは約１０〜４０ｍｇ／ｍＬのタンパク質）。ある特定の実施形態では、再構成製剤中のタンパク質濃度は、あらかじめ凍結乾燥させた製剤中の濃度より著明に高濃度である。例えば、再構成製剤中のタンパク質濃度は、あらかじめ凍結乾燥させた製剤の約２〜４０倍（ｔｉｍｅｓ）、好ましくは、３〜１０倍（ｔｉｍｅｓ）、最も好ましくは、３〜６倍（ｔｉｍｅｓ）（例えば、少なくとも３倍（ｆｏｌｄ）または少なくとも４倍（ｆｏｌｄ））でありうる。
再構成は一般に、完全な水和を確保するように、約２５℃の温度で行うが、所望に応じて、他の温度も援用することができる。再構成に要請される時間は、例えば、希釈剤の種類、賦形剤およびタンパク質の量に依存する。例示的な希釈剤は、滅菌水、静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩液）、滅菌生理食塩液、リンゲル液、またはテキストロース溶液を含む。希釈剤は、任意選択で、防腐剤を含有する。例示的な防腐剤については、上で記載しており、ベンジルアルコールまたはフェノールアルコールなど、芳香族アルコールが好ましい防腐剤である。援用される防腐剤の量は、異なる防腐剤濃度を、タンパク質に対する適合性について評価し、防腐剤の有効性試験を行うことにより決定する。例えば、防腐剤が、芳香族アルコール（ベンジルアルコールなど）である場合、防腐剤は、約０．１〜２．０％、好ましくは、約０．５〜１．５％、最も好ましくは、約１．０〜１．２％の量で存在しうる。好ましくは、再構成製剤は、バイアル１つ当たり、６０００個未満の粒子を有し、これらは、＞１０μｍのサイズである。
治療適用
本明細書では、このような処置を必要とする対象に、本明細書で記載される１つまたは複数の抗体を含む、治療有効量の組成物を投与するステップを含む治療法について記載する。
一部の実施形態では、処置を必要とする対象（例えば、ヒト患者）は、がんを伴うか、がんを有することが疑われるか、またはがんの危険性があると診断される。がんの例は、脳がん、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆管がん、膵臓がん、結腸がん、腎臓がん、子宮頚がん、卵巣がん、および前立腺がんを含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、がんは、脳がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん、または膵臓がんである。一部の好ましい実施形態では、がんは、脳がんまたは多型性神経膠芽腫（ＧＢＭ）がんである。
好ましい実施形態では、抗体は、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４を発現させるがん細胞をターゲティングすることが可能である。一部の実施形態では、抗体は、がん細胞上のＧｌｏｂｏ ＨおよびＳＳＥＡをターゲティングすることが可能である。一部の実施形態では、抗体は、がんにおけるＳＳＥＡをターゲティングすることが可能である。
したがって、抗体は、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４に対する三重ターゲティング抗体である。一部の実施形態では、抗体は、Ｇｌｏｂｏ ＨおよびＳＳＥＡ−３に対する二重ターゲティング抗体と、抗ＳＳＥＡ−４抗体との混合物である。一部の実施形態では、抗体は、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４に対する三重ターゲティング抗体と、抗ＳＳＥＡ−４抗体との混合物である。一部の実施形態では、抗体は、抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体と、抗ＳＳＥＡ−３抗体と、抗ＳＳＥＡ−４抗体との混合物である。一部の実施形態では、抗体は、抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体と、抗ＳＳＥＡ−４抗体との混合物である。一部の実施形態では、抗体は、抗ＳＳＥＡ−４抗体である。
処置は、腫瘍サイズの低減、悪性細胞の消失、転移の防止、再発の防止、播種性がんの軽減もしくは殺滅、生存の延長、および／または腫瘍のがんへの進行までの時間の延長を結果としてもたらす。
一部の実施形態では、処置は、さらなる治療を、前記対象に、抗体の前記投与の前、前記投与の間、または前記投与の後に投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、さらなる治療は、化学療法剤による処置である。一部の実施形態では、さらなる治療は、放射線療法である。
本発明の方法は、初期腫瘍を処置および防止し、これにより、いっそうの進行期への進行を防止し、その結果として、進行がんと関連する罹患率および死亡率の低減をもたらすのに特に有利である。本発明の方法また、例えば、原発性腫瘍を除去した後でも遷延する休眠腫瘍である、腫瘍の再発もしくは腫瘍の再成長、または、腫瘍の発生を低減もしくは防止するのにも有利である。
一部の実施形態では、本明細書で開示される方法は、例えば、がんが、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、および／またはＳＳＥＡ−４の発現の増大により特徴付けられる場合、がんの処置または防止に有用である。一部の実施形態では、がんは、がん幹細胞を含む。一部の実施形態では、がんは、前がん、および／または悪性がん、および／または治療抵抗性がんである。一部の実施形態では、がんは、脳がんである。
本発明の方法では、がんは、例えば、乳がん、結腸直腸がん、直腸がん、肺がん、腎細胞がん、神経膠腫（例えば、退形成性星状細胞腫、退形成性乏突起星状細胞腫、退形成性希突起神経膠腫、多型性神経膠芽腫（ＧＢＭ））、腎臓がん、前立腺がん、肝臓がん、膵臓がん、軟組織肉腫、カルチノイド癌、頭頸部がん、黒色腫、および卵巣がんなどの充実性腫瘍でありうる。一実施形態では、がんは、脳がんまたはＧＢＭである。本明細書で開示される方法を実施するために、本明細書で記載される少なくとも１つの抗体を含有する、上で記載した有効量の医薬組成物／製剤を、処置を必要とする対象（例えば、ヒト）に、例えば、ボーラスとして、もしくはある期間にわたる連続注入による静脈内投与、筋内経路、腹腔内経路、脳脊髄内経路、皮下経路、関節内経路、滑膜内経路、髄腔内経路、経口経路、吸入経路、または局所経路などの適切な経路を介して、投与することができる。ジェット噴霧器および超音波噴霧器を含む、液体製剤のための市販の噴霧器は、投与に有用である。液体製剤は、直接噴霧することができ、凍結乾燥粉末は、再構成の後で噴霧することができる。代替的に、抗体は、フルオロカーボン製剤および計量型吸入器を使用してエアゾール化する、または凍結乾燥および粉砕された粉末として吸入することもできる。
本明細書で記載される方法により処置される対象は、哺乳動物、より好ましくは、ヒトでありうる。哺乳動物は、農場動物、競技動物、ペット、霊長動物、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、およびラットを含むがこれらに限定されない。処置を必要とするヒト対象は、脳がん、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆管がん、膵臓がん、結腸がん、腎臓がん、子宮頚がん、卵巣がん、および前立腺がんを含むがこれらに限定されないがんを有するか、これらの危険性があるか、またはこれらを有することが疑われるヒト患者でありうる。がんを有する対象は、日常的な医学的検査により同定することができる。
本明細書で使用される「有効量」とは、単独で、または１つもしくは複数の他の活性剤と組み合わせて、対象に治療効果を付与するのに要請される各活性剤の量を指す。当業者により認識されている通り、有効量は、処置される特定の状態、状態の重症度、個々の患者のパラメータであって、医療従事者の知見および専門知識の範囲内にある、年齢、健康状態、体格、性別、および体重、処置の持続期間、併用療法（存在する場合）の性格、具体的な投与経路などの因子を含むパラメータに応じて変化する。これらの因子は、当業者に周知であり、日常的な実験だけで対処することができる。個々の構成要素またはそれらの組合せの最大用量、すなわち、穏当な医学的判断に従う、安全最高用量を使用することが一般に好ましい。しかし、当業者は、患者が、医学的理由、心理的理由、または事実上他の任意の理由で、低用量または忍容可能用量を主張することを理解する。
半減期など、経験的な検討項目は一般に、投与量の決定に寄与する。例えば、ヒト化抗体または完全ヒト抗体など、ヒト免疫系に適合性の抗体を使用し、抗体の半減期を延長し、抗体が宿主の免疫系に攻撃されることを防止することができる。投与頻度は、治療の経過にわたり決定および調整することができ、一般に、がんの処置、および／または抑制、および／または回復、および／または遅延に基づくが必ずしもそうではない。代替的に、本明細書で記載される抗体の持続的連続放出製剤は、適切でありうる。当技術分野では、持続放出を達成するための、多様な製剤およびデバイスが公知である。
一例では、本明細書で記載される抗体の投与量は、抗体の１回または複数回の投与を施された個体において、経験的に決定することができる。個体には、抗体の投与量を漸増させて施す。抗体の有効性を評価するために、日常的な慣行に従い、疾患（例えば、がん）の指標を追跡することができる。
一般に、本明細書で記載される抗体のうちのいずれかを投与するための、初期候補投与量は、約２ｍｇ／ｋｇでありうる。本開示の目的で、典型的な毎日の投与量は、上で言及した因子に応じて、約０．１μｇ／ｋｇ〜３μｇ／ｋｇ〜３０μｇ／ｋｇ〜３００μｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはこれ超のうちのいずれかの範囲でありうる。数日間またはこれを超えて長期にわたる繰返し投与では、状態に応じて、症状の所望の抑制が生じるまで、またはがんもしくはその症状を緩和するのに十分な治療レベルが達成されるまで、処置を持続する。例示的な投薬レジメンは、約２ｍｇ／ｋｇの初期用量に続いて、毎週の維持用量約１ｍｇ／ｋｇの抗体、または約２ｍｇ／ｋｇの初期用量に続いて、隔週の維持用量約１ｍｇ／ｋｇを投与することを含む。しかし、他の投与レジメンも、実施者が達成したいと望む薬物動態的減衰のパターンに応じて有用でありうる。例えば、毎週１〜４回の投薬が想定される。一部の実施形態では、約３μｇ／ｍｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ（約３μｇ／ｍｇ、約１０μｇ／ｍｇ、約３０μｇ／ｍｇ、約１００μｇ／ｍｇ、約３００μｇ／ｍｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、および約２ｍｇ／ｋｇなど）の範囲の投薬を使用することができる。一部の実施形態では、投薬頻度は、毎週１回、２週間ごと、４週間ごと、５週間ごと、６週間ごと、７週間ごと、８週間ごと、９週間ごと、もしくは１０週間ごと；または毎月１回、２カ月ごと、もしくは３カ月ごと、またはこれより長い間隔である。この治療の進捗状況は、従来の技法およびアッセイにより、容易にモニタリングされる。投薬レジメン（使用される抗体を含む）は、時間と共に変化しうる。
本開示の目的で、本明細書で記載される抗体の適切な投与量は、援用される特異的抗体（またはその組成物）、がんの種類および重症度、抗体が予防目的で投与されるのか、治療目的で投与されるのか、既往の治療、患者の臨床歴および抗体への応答、ならびに主治医の判断に依存する。本明細書で記載される抗体の投与は、あらかじめ選択された期間にわたり本質的に持続的な場合もあり、例えば、がんの発症の前に、発症時に、または発症の後おける、間隔を置いた一連の投薬の場合もある。
本明細書で使用される「処置すること」という用語は、１つまたは複数の活性剤を含む組成物の、がん、がんの症状、またはがんに対する素因を有する対象への、がん、がんの症状、またはがんに対する素因を治癒させるか、治すか、緩和するか、軽減するか、変化させるか、修復するか、回復するか、改善するか、またはこれに影響を及ぼすことを目的とする適用または投与を指す。
がんを緩和することは、がんの発症もしくは進行を遅延させること、またはがんの重症度を軽減することを含む。がんを緩和することは必ずしも、治癒結果を要請しない。本明細書で使用される、がんの発症を「遅延させること」とは、がんの進行を延期し、妨害し、遅らせ、妨げ、安定化させ、かつ／または先送りすることを意味する。この遅延は、処置されるがんおよび／または個体の履歴に応じて、時間の長さが変化するものである場合がある。がんの発症を「遅延させる」かもしくは緩和するか、またはがんの発病を遅延させる方法とは、方法を使用しない場合と比較して、所与の時間枠内における、がんの１つまたは複数の症状の発症の可能性（危険性）を低減し、かつ／または所与の時間枠内における、症状の広がりを軽減する方法である。このような比較は、統計学的に有意な結果をもたらすのに十分な多数の対象を使用する臨床研究に基づくことが典型的である。
がんの「発症」または「進行」とは、がんの初期発現および／またはその後の進行を意味する。がんの発症は、検出可能な場合があり、当技術分野で周知の、標準的な臨床的技法を使用して評価することができる。しかし、発症とはまた、検出不能でありうる進行も指す。本開示の目的で、発症または進行とは、症状の生物学的経過を指す。「発症」は、発生、再発、および発病を含む。本明細書で使用される、がんの「発病」または「発生」は、初期発病および／または再発を含む。
薬の技術分野における当業者に公知である、従来の方法を使用して、処置される疾患の種類または疾患の部位に応じて、医薬組成物を対象に投与することができる。この組成物はまた、他の従来の経路を介して投与することもでき、例えば、経口、非経口、吸入スプレーにより、局所、直腸内、鼻腔内、口腔内、膣内、または植込み式レザバーを介して投与することもできる。本明細書で使用される「非経口」という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋内、関節内、動脈内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、病変内、および頭蓋内の注射法または注入法を含む。加えて、医薬組成物は、対象に、１カ月、３カ月、もしくは６カ月のデポ注射用の材料および方法、または生体分解性の材料および方法などを使用する、注射用デポ投与経路を介して投与することもできる。
注射用組成物は、植物油、ジメチルアセトアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｃｔａｍｉｄｅ）、ジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｆｏｒｍａｍｉｄｅ）、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、およびポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）など、多様な担体を含有しうる。静脈内注射のためには、水溶性抗体を、点滴法により投与することができ、これにより、抗体と生理学的に許容される賦形剤とを含有する医薬製剤を注入する。生理学的に許容される賦形剤は、例えば、５％のテキストロース、０．９％の生理食塩液、リンゲル液、または他の適切な賦形剤を含みうる。筋内調製物、例えば、抗体の適切な可溶性塩形態による滅菌製剤は、注射用水、０．９％の生理食塩液、または５％のグルコース溶液などの医薬賦形剤中に溶存させ、投与することができる。
診断適用
本明細書では、対象におけるがんを診断するための方法であって、（ａ）ＧＭ３、ＧＭ２、ＧＭ１、ＧＤ１、ＧＤ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＴ１ｂ、Ａ２Ｂ５、ＬｅＸ、ｓＬｅＸ、ＬｅＹ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＴＦ、Ｔｎ、ｓＴｎ、ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＣＤ４５、ＣＤ９０、ＣＤ１３３からなるマーカーのパネルの発現を検出する、１つまたは複数のモノクローナル抗体を含む組成物を、対象から得られた細胞試料または組織試料に適用するステップと；（ｂ）モノクローナル抗体の、細胞試料または組織試料への結合についてアッセイするステップと；（ｃ）結合を、正常対照と比較して、対象におけるがんの存在を決定するステップとを含む方法が記載される。
検出および診断のためのがんの例は、脳がん、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆管がん、膵臓がん、結腸がん、腎臓がん、子宮頚がん、卵巣がん、および前立腺がんを含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、がんは、脳がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん、または膵臓がんである。
一部の実施形態では、マーカーは、ＧＭ２、ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ｂ、Ａ２Ｂ５、Ｔｆ、Ｔｎ、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ２４、ＣＤ４４、およびＣＤ９０からなる。一部の実施形態では、組成物は、ＧＭ２、ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ｂ、Ａ２Ｂ５、Ｔｆ、Ｔｎ、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ２４、ＣＤ４４、およびＣＤ９０を検出することが可能な複数のモノクローナル抗体を含む。
一部の実施形態では、抗体は、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４を発現させるがん細胞を検出することが可能である。一部の実施形態では、抗体は、がん細胞上のＧｌｏｂｏ ＨおよびＳＳＥＡを検出することが可能である。一部の実施形態では、抗体は、がんにおけるＳＳＥＡを検出することが可能である。一部の実施形態では、がんは、脳がんまたは多型性神経膠芽腫（ＧＢＭ）であり、抗体は、抗ＳＳＥＡ−４モノクローナル抗体である。
Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、および／またはＳＳＥＡ−４に特異的なモノクローナル抗体を、単独で、または組合せで、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの診断アッセイのために使用して、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４を発現させるがん細胞（例えば、本明細書で指し示される、ＧＢＭ、ある特定の充実性腫瘍細胞、および造血系がん細胞）を検出することができる。例えば、試料（例えば、血液試料または組織生検）を、患者から得、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４に対する三重ターゲティング抗体、または抗ＳＳＥＡ−４抗体と組み合わせたＧｌｏｂｏ Ｈ／ＳＳＥＡ−３二重ターゲティング抗体と接触させ、患者試料中の、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４を発現させるがん細胞の存在を、抗体の結合を検出することにより決定することができる。抗体の結合は、直接（例えば、抗体自体を標識する場合）、または、二次抗体など、第２の検出剤を使用することにより検出することができる。検出用標識は、本発明の抗体と、直接的に、または、例えば、キレート剤もしくはリンカーを介して、間接的に会合させることができる。
一部の実施形態では、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、および／またはＳＳＥＡ−４に特異的なモノクローナル抗体を、がんを有するか、またはがんを有することが疑われる個体に由来する生物学的試料と接触させ、試料中の細胞に結合する抗体を決定し、このとき、抗体の結合が通常より高度または低度であれば、個体ががんを有することが指し示される。一部の実施形態では、生物学的試料は、血液試料または血液画分（例えば、血清、血漿、血小板、赤血球、白血球）である。一部の実施形態では、生物学的試料は、例えば、公知の腫瘍の境界を決定するように、組織試料（生検）、例えば、疑わしい腫瘍部位、または罹患していることが公知の組織に由来する。一部の実施形態では、生物学的試料は、炎症部位から得られる。
生検は、組織、すなわち、非流体細胞型から試料を得るように実施することが典型的である。適用される生検技法は、査定される組織型（例えば、乳房、皮膚、結腸、前立腺、腎、肺、膀胱、リンパ節、肝、骨髄、気道、または肺）に依存する。がんの場合、技法はまた、他の因子の中で、腫瘍のサイズおよび種類（例えば、固体、懸濁物、または血液）にも依存する。生検法は、例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｋａｓｐｅｒら編、１６版、２００５年、７０章、および第Ｖ部の全体において論じられている。
試料中の細胞に結合する抗体を検出する任意の方法を、本診断アッセイのために使用することができる。当技術分野では、例えば、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡法、ＥＬＩＳＡなど、抗体の結合を検出する方法が周知である。一部の実施形態では、方法は、決定するステップの前に、生物学的試料を、検出のために調製するステップを含む。例えば、細胞の亜集団（例えば、白血球）を、個体に由来する試料の残余（例えば、他の血液構成要素）から分離することもでき、より容易な検出のために、組織中の細胞を懸濁させることもできる。
一部の実施形態では、試料中の、Ｇｌｏｂｏ Ｈ／ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４を発現させる細胞の百分率を決定し、対照、例えば、がんを有することが公知の個体もしくは個体群に由来する試料（陽性対照）、またはがんを有さないことが公知の個体もしくは個体群に由来する試料（正常対照、非疾患対照、または陰性対照）と比較する。一部の実施形態では、対照は、所与の組織について確立される、Ｇｌｏｂｏ Ｈ／ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４発現の標準的な範囲である。Ｇｌｏｂｏ Ｈ／ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４を発現させる細胞の百分率が正常より高いかもしくは低いこと、または発現レベルが高いかももしくは低いことから、個体ががんを有することが指し示される。
一実施形態では、血液試料または組織試料など、生物学的試料中のＧｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４を検出するキットが提供される。例えば、対象におけるがんの診断を確認するために、生検を実施して、組織学的検査のための組織試料を得ることができる。代替的に、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４の存在を検出するのに、血液試料を得ることもできる。ポリペプチドを検出するためのキットは、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４に特異的に結合する、例えば、本明細書で開示される抗体のうちのいずれかの、１つまたは複数の抗体を含むことが典型的である。さらなる実施形態では、抗体を標識する（例えば、蛍光標識、放射性標識、または酵素標識により）。
一実施形態では、キットは、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４に特異的に結合する、１つまたは複数の抗体の使用手段を開示する指示材料を含む。指示材料は、電子形態（コンピュータ用ディスケットまたはコンパクトディスクなど）の書面の場合もあり、視覚的形態（ビデオファイルなど）の場合もある。キットはまた、キットがデザインされる特定の適用を容易とするさらなる構成要素も含みうる。したがって、例えば、キットは加えて、標識を検出する手段（酵素標識のための酵素基質、蛍光標識を検出するフィルターセット、二次抗体などの適切な二次標識など）も含有しうる。キットは加えて、緩衝剤、および特定の方法を実施するために日常的に使用される他の試薬も含みうる。当業者には、このようなキットおよび適切な内容物が周知である。
当技術分野では、細胞表面マーカーの存在または非存在を決定する方法が周知である。例えば、抗体は、酵素、磁気ビーズ、コロイド状の磁気ビーズ、ハプテン、蛍光色素、金属化合物、放射性化合物、または薬物を含むがこれらに限定されない、他の化合物にコンジュゲートさせることができる。抗体はまた、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、または免疫組織化学アッセイなどであるがこれらに限定されないイムノアッセイにおいても活用することができる。抗体はまた、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）のためにも使用することができる。ＦＡＣＳでは、他のより精緻なレベルの検出の中では、複数の有色チャネル、小角および鈍角の光散乱検出チャネル、ならびにインピーダンスチャネルを援用して、細胞を分離または分取する（米国特許第５，０６１，６２０号を参照されたい）。これらのアッセイでは、本明細書で開示される、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４に結合するモノクローナル抗体のうちのいずれかを、使用することができる。したがって、抗体は、限定せずに述べると、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳ、組織免疫組織化学、ウェスタンブロット、または免疫沈降を含む、従来のイムノアッセイにおいて使用することができる。
腫瘍を病期分類し、かつ／またはその予後を決定するための方法
本開示の別の態様は、ヒト患者における腫瘍を病期分類し、かつ／またはその予後を決定するための方法であって、（ａ）ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、およびＧｌｏｂｏ Ｈからなるマーカーの発現を検出する、１つまたは複数の抗体を含む組成物を、患者から得られた細胞試料または組織試料に適用するステップと；（ｂ）モノクローナル抗体の、細胞試料または組織試料への結合についてアッセイするステップと；（ｃ）被験試料中のマーカーの発現レベルを、基準試料中のレベルと比較するステップと；（ｄ）患者における腫瘍の病期および／または予後を、ステップ（ｃ）で同定された転帰に基づき決定するステップとを含む方法を特徴とする。
一部の実施形態では、がんは、脳がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん、または膵臓がんである。一部の好ましい実施形態では、がんは、脳がんまたはＧＢＭである。
一部の実施形態では、抗体は、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４を発現させるがん細胞を検出することが可能である。一部の実施形態では、抗体は、がん細胞上のＧｌｏｂｏ ＨおよびＳＳＥＡを検出することが可能である。一部の実施形態では、抗体は、がんにおけるＳＳＥＡを検出することが可能である。一部の実施形態では、がんは、脳がんまたは多型性神経膠芽腫（ＧＢＭ）がんであり、抗体は、抗ＳＳＥＡ−４モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、がんが、脳がんまたはＧＢＭである場合、抗体は、抗ＳＳＥＡ−４である。
幹細胞の単離および富化
本発明の別の態様は、ＧＢＭ幹細胞の単離を特徴とし、より特定すると、マーカーであるＧＤ２＋ＳＳＥＡ４＋ＣＤ１３３＋について陽性のＧＢＭ幹細胞を特徴とする。本明細書では、幹細胞を、他の細胞から分離するのに、細胞表面マーカーであるＧＤ２、ＳＳＥＡ４、およびＣＤ１３３と、フローサイトメトリーとを使用して、幹細胞を、ＧＢＭ腫瘍細胞から単離し、富化し、かつ自己再生させるための方法が開示される。本明細書では、ＧＤ２＋ＳＳＥＡ４＋ＣＤ１３３＋ＧＢＭ幹細胞の単離集団を含む組成物が開示される。
蓄積される証拠は、バルク腫瘍が、がん始原細胞またはがん幹細胞様細胞（ＣＳＣ）と呼ばれる、細胞の小亜集団を宿しうることを示す。それらは、分化不良、自己再生コンピテンス、および免疫欠損マウスにおける腫瘍の惹起の特徴を有する。このため、ＣＳＣの、バルク腫瘍からの、プロスペクティブな同定および単離は、治療パラダイムを開発するために極めて重要である。ＣＳＣの富化についての多くの報告は、ＣＤ１３３、Ａ２Ｂ５、ＳＳＥＡ−１、またはインテグリンが陽性のがん細胞を分取することにより達成されているが、これらの細胞の識別は、なおも不明瞭であり、ＣＳＣ内のこれらのマーカーの役割は、不明確なままである。
多くの特異的グリカンが、腫瘍細胞表面上のそれらの分布、ならびに腫瘍の増殖、転移、および血管新生を調節する能力について報告されている。これにより、腫瘍上のグリカンは、がんの治療標的でありうる、機能的バイオマーカーとして作用しうることが示唆される。ＧＢＭのＣＳＣ内のグリカン関連マーカーについて探索するため、本発明者らはまず、様々な神経膠腫細胞株を、ＥＧＦおよびＦＧＦを補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中で培養して、幹細胞様細胞を富化した。この問題を解明するために、本発明者らは、フローサイトメトリーにおいて利用可能な抗体染色のパネルにより、ニューロスフェア様細胞の表面上におけるグリカン関連分子の発現を観察した。興味深いことに、ｂ系列のジシアロガングリオシドであるＧＤ２は、異なるＧＢＭ細胞株から培養されたニューロスフェアの表面上で突出して発現する。ＧＤ２は、神経芽細胞腫内、黒色腫内、および他の一部の腫瘍内で顕著に発現することが見出されている。ＧＤ２の分布が、ニューロン内、皮膚メラニン細胞内、および感覚神経線維内に限局されていることは、注目に値する。したがって、ＧＤ２の正常組織内の限局的発現は、ＧＤ２を、適切な治療標的とする。さらに、いくつかの報告により、ＧＤ２はまた、マウス神経幹細胞およびヒト神経幹細胞の表面上にも存在することが指し示されている。最も重要なことは、ＧＤ２が、乳がん幹細胞を同定しうることである。これらの知見に基づき、本発明者らは、ＧＤ２が、神経膠芽腫幹細胞（ＧＳＣ）を同定するマーカーとして機能することも可能であり、現行のマーカーと組み合わせて、明確なＧＳＣを正確に認識するマーカーとして機能することも可能であることを仮定する。
ＧＤ２と、ＳＳＥＡ４およびＣＤ１３３との組合せによってＧＢＭ幹細胞の集団をより特異的に決定しうるのかどうかを理解するために、本発明者らは、ＧＤ２＋ＳＳＥＡ４＋ＣＤ１３３＋集団の自己再生能および腫瘍形成性を、他の集団と比較する。
ＧＢＭ腫瘍に由来する細胞を、単一の細胞懸濁液に解離し、抗ＧＤ２抗体（ＢＤ）、抗ＳＳＥＡ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ１３３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で標識した。次いで、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ）を使用して、これらの標識された細胞を物理的に分取した。自己再生能を検出するために、ＧＢＭ腫瘍細胞を解離し、染色し、９６ウェルプレート内に播種した。直径が１００ｕｍを超えるニューロスフェアの数を計算した。腫瘍形成性については、細胞１０，０００〜１０個を含む、多様な数の細胞を、免疫欠損マウスに、皮下注射または頭蓋内注射した。ＧＤ２＋ＳＳＥＡ４＋ＣＤ１３３＋集団では、腫瘍の発病が、他の集団と比較して著明に迅速であることが観察される。
さらなる精緻化を伴わずに述べると、当業者は、上の記載に基づき、本発明を十全に活用しうると考えられる。したがって、以下の具体的実施形態は、単に例示的なものであり、本開示の残りの部分について、いかなる形であれ、限定的なものではないと解釈されるものとする。本明細書で引用される全ての刊行物は、本明細書で言及される目的または主題について、参照により組み込まれる。
（実施例１）
ＧＢＭ細胞株上のグリカンエピトープについてのフローサイトメトリー解析
本発明者らは、４つのヒトＧＢＭ細胞株：Ｇ５Ｔ、ＬＮ−１８、Ｕ−１３８、およびＵ−２５１において、多様なグリカンエピトープの発現レベルについて、フローサイトメトリーにより解析した。検討されるグリカンエピトープは、Ｏ連結型グリカン（Ｔｎ、ｓＴｎ、ＴＦ）、ルイス抗原（Ｌｅｘ、ＬｅｙおよびｓＬｅｘ）、複合体ガングリオシド ［ＧＭ２、ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＴ１ｂ、およびＡ２Ｂ５（ｃ系列ガングリオシド）］、およびグロボ系列ＧＳＬ（ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、およびＧｌｏｂｏ Ｈ；図１Ａ）を含む。本発明者らの結果は、これらの４つのＧＢＭ細胞株の大半は、高レベルのＴｎ、ＴＦ、Ｌｅｘ、およびＬｅｙ、低レベルのｓＬｅｘを発現させ、ｓＴｎは発現させないことを示した（表７）。加えて、これらの４つのＧＢＭ細胞株は、本発明者らが検討した全てのガングリオシドについて、陽性であった。グロボ系列ＧＳＬの発現レベルに関して、Ｕ−２５１は、抗ＳＳＥＡ−４抗体であるＭＣ８１３−７０について弱い染色を示し、Ｇ５Ｔ、Ｕ−１３８、およびＬＮ−１８は、ＭＣ８１３−７０について、高染色強度を表示した（図１Ｂ）。抗ＳＳＥＡ−３抗体であるＭＣ６３１についての陽性染色は、これらの４つの細胞株の中で、Ｇ５Ｔ上だけで観察され、抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体であるＶＫ９について陽性染色を示す細胞株は見られなかった（表７）。本発明者らは、より多くのＧＢＭ細胞株内のグロボ系列ＧＳＬの発現パターンについてさらに検討し、ＧＢＭ細胞株１７例のうち９例が、強いＭＣ８１３−７０染色シグナルを示し（ＳＳＥＡ−４ｈｉ）；３例が弱く染色され（ＳＳＥＡ−４ｌｏ）、５例はＭＣ８１３−７０により染色されないことを見出した（図１Ａ）。細胞株１７例のうち９例は、ＭＣ６３１染色について陽性であり、６例は、ＶＫ９染色について陽性であった。不死化ヒト胎児神経膠細胞であるＳＶＧ ｐ１２は、非常に弱いＭＣ８１３−７０染色シグナルを示したが、ＭＣ６３１染色シグナルまたはＶＫ−９染色シグナルは示さなかった（図１）。これらの結果は、検討されたＧＢＭ細胞株の大半が、抗ＳＳＥＡ−４抗体により陽性染色されることを、ＭＣ８１３−７０を例として使用して指し示した。
（実施例２）
ＧＢＭがん細胞内のＳＳＥＡ−４発現の検証
抗ＳＳＥＡ−４抗体が、ＧＢＭ細胞内の糖タンパク質上の、伸展したコア１Ｏ−グリカンに結合しうる可能性を除外するために、本発明者らは、ＤＢＴＲＧ細胞を、メタノールで処理して、脂質を除去してから、抗ＳＳＥＡ−４抗体であるＭＣ８１３−７０による染色を行った。メタノール処理されると、フローサイトメトリーおよび免疫蛍光顕微鏡法により解析される通り、ＭＣ８１３−７０の免疫反応性が消滅したことから、ＭＣ８１３−７０の免疫反応性は、糖脂質に対するものであり、糖タンパク質に対するものではないことが示唆される。ＳＳＥＡ−４エピトープの、ＧＢＭ細胞表面上の存在を確認するため、本発明者らは、α２，３−シアリダーゼで処理されたＤＢＴＲＧ細胞上のＭＣ６３１染色をさらに実施したところ、結果は、α２，３−シアリダーゼで処理すると、細胞は、ＭＣ８１３−７０陰性およびＭＣ６３１陽性となったことから、ＧＢＭ細胞が、ＳＳＥＡ−４を発現させると裏付けられることを示した。
ＳＳＥＡ−４の発現をさらに検証するため、次に、本発明者らは、アニオン交換クロマトグラフィーを使用して、ガングリオシド（シアル酸を伴う糖脂質）を精製し、精製されたガングリオシドを、ＨＰＴＬＣプレート上で展開し、オルシノール−Ｈ２ＳＯ４染色または免疫ブロット法により視覚化した。３つの異なるＧＢＭ細胞株に由来する、精製されたガングリオシドは、同様なパターンを呈示し、夥多なＧＭ３、ＧＭ２、Ｎｅｕ５Ａｃ−（ｎ）Ｌｃ４／Ｇｇ４Ｃｅｒ、およびＮｅｕ５Ａｃ２−（ｎ）Ｌｃ４／Ｇｇ４Ｃｅｒを伴った。ＴＬＣ上では、ＭＣ８１３−７０により、ＤＢＴＲＧおよびＤ５４ＭＧに由来する２つのガングリオシドが認識された（異なる鎖長の脂肪酸のために）が、ＧＢＭ ８９０１細胞に由来するガングリオシドは認識されなかった（図３Ａ）ことは、フローサイトメトリー解析の結果と符合した。ＧＢＭガングリオシドにおける免疫反応性の二重バンドの位置は、高レベルのＳＳＥＡ−４糖脂質を発現させることが公知の胚性癌腫細胞である２１０２Ｅｐ細胞（Ｋａｎｎａｇｉ Ｒら（１９８３年）Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎｓ （ＳＳＥＡ−３ ａｎｄ −４） ａｒｅ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｆ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｇｌｏｂｏ−ｓｅｒｉｅｓ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ． ＥＭＢＯ Ｊ ２巻（１２号）：２３５５〜２３６１頁）から精製されたガングリオシドにおける位置と同じであった（図３Ａ、レーン４）。二重バンドは、ＧＭ１ｂが主要なガングリオシドであるＹＡＣ−１細胞（Ｚａｒｅｉ Ｍ、Ｍｕｔｈｉｎｇ Ｊ、Ｐｅｔｅｒ−Ｋａｔａｌｉｎｉｃ Ｊ、およびＢｉｎｄｉｌａ Ｌ（２０１０年）Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＭ１ｂ ｐａｔｈｗａｙ Ｎｅｕ５Ａｃ− ａｎｄ Ｎｅｕ５Ｇｃ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ ｂｙ ｏｎ−ｌｉｎｅ ｎａｎｏＨＰＬＣ−ＱＴｏＦ ＭＳ ａｎｄ ｔａｎｄｅｍ ＭＳ： ｔｏｗａｒｄ ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｏｍｉｃｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ． Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０巻（１号）：１１８〜１２６頁）内で、ＭＣ８１３−７０陽性糖脂質が、ＭＣ８１３−７０により検出される距離より短い距離において展開された（図３Ａ、レーン５）ことから、ＭＣ８１３−７０は、ＧＭ１ｂに対して弱い交差反応性を有することが裏付けられる。ＭＣ６３１による免疫ブロット法により、ＭＣ６３１もまた、ＭＣ８１３−７０陽性糖脂質を、ＭＣ８１３−７０が認識するより低いアフィニティーではあるが、認識しうることが明らかになった。ＭＣ８１３−７０陽性糖脂質上のシアル酸の数を検討するため、本発明者らは、ガングリオシドを、異なる塩条件で溶出させ、ＭＣ８１３−７０による免疫ブロット法を実施した。低塩条件で溶出する画分において、２つのバンドが出現したので、結果により、ＭＣ８１３−７０反応性のガングリオシドは、モノシアリル化されていることが裏付けられた。次に、本発明者らは、シアリダーゼを使用して、このＭＣ８１３−７０反応性のモノシアロガングリオシド上の、シアル酸の連結について解明した。ＴＬＣプレート上で展開したガングリオシドを、α２，３−シアリダーゼまたはシアル酸の全ての連結を切断するシアリダーゼで処理し、ＭＣ８１３−７０およびＭＣ６３１によりブロッティングした。結果は、シアリダーゼ処理の後でＭＣ８１３−７０の免疫反応性が消滅する一方で、ＭＣ６３１により、ＭＣ８１３−７０反応性の二重項に類似する位置において強いシグナルが検出されたことから、α２，３連結シアル酸の存在が指し示されることを示した。
本発明者らは、また、ＤＢＴＲＧ細胞に由来するガングリオシドについても、ＭＡＬＤＩ−ＭＳプロファイリングにより解析した（図３Ｂ）。スペクトルは、セラミド（Ｃｅｒ）部分の予測される異質性に起因して、シグナルクラスター内で生じる、いくつかの主要なピークを主調とした。スフィンゴシンおよび脂肪酸アシル鎖と組み合わせた、ヘキソース（Ｈｅｘ）残基、Ｎ−アセチルヘキソサミン（ＨｅｘＮＡｃ）残基、またはＮｅｕＡｃ残基の過メチル化に当てはめた、主要な分子イオンのｍ／ｚ値に基づき、それぞれのガングリオシドプロファイルを割り当てた。ＭＳプロファイリングにより、ＤＢＴＲＧ細胞内のガングリオシドの主要な分子種は、ＧＭ３、ＧＭ２、Ｎｅｕ５Ａｃ−（ｎ）Ｌｃ４／Ｇｇ４Ｃｅｒ、およびＮｅｕ５Ａｃ２−（ｎ）Ｌｃ４／Ｇｇ４Ｃｅｒであることが明らかとなったことは、ＨＰＴＬＣの結果と符合した。また、低強度であるが、ＳＳＥＡ−４を表す、Ｎｅｕ５Ａｃ−Ｈｅｘ４−ＨｅｘＮＡｃ−Ｃｅｒによるシグナル（ｍ／ｚ＝２０２５．２）も検出されたことから、ＤＢＴＲＧ細胞内のＳＳＥＡ−４の存在が反映される。これらのデータにより、ＭＣ８１３−７０反応性のガングリオシドは、ＳＳＥＡ−４であり、全ガングリオシドの副次的な構成物であるにもかかわらず、ＳＳＥＡ−４は、ＧＢＭ細胞内で発現したことが裏付けられる。
（実施例３）
ＧＢＭ組織内のＳＳＥＡ−４の発現
ＳＳＥＡ−４は、幹細胞のために広く使用されるマーカーであるが、ＧＢＭ組織内のほか、正常脳組織内のＳＳＥＡ−４の発現についての情報は、知られていない。ＳＳＥＡ−４が、ＧＢＭ細胞株に加えて、臨床ＧＢＭ検体中でも過剰発現するのかどうかについて理解するため、本発明者らは、ヒト組織マイクロアレイ上の免疫組織化学により、グレードＩ〜ＩＶの星状細胞腫内および正常脳組織内のＳＳＥＡ−４の発現について解析した（図４）。本発明者らは、５５例中３８例のＧＢＭ組織検体（６９％）が、ＭＣ８１３−７０染色について陽性であり、ＧＢＭ検体のうちの約半分が、強く（≧２＋）染色されることを見出した。陽性検体中で示される通り、ＳＳＥＡ−４は、ＧＢＭ細胞の原形質膜上に位置した。さらに、約５５％の低グレードの星状細胞腫検体も、ＭＣ８１３−７０により弱く染色され（１＋と評定された）、ＳＳＥＡ−４強度のスコアは、星状細胞腫のグレードと正に相関した。これに対し、大半の正常脳組織は、ＳＳＥＡ−４陰性であった。結果は、ＳＳＥＡ−４が、腫瘍内、特に、ＧＢＭ腫瘍内で高度に発現することを示した。
（実施例４）
抗ＳＳＥＡ−４は、ＧＢＭ細胞株に対するＣＤＣを媒介する
ＳＳＥＡ−４をターゲティングすれば、ＧＢＭ細胞内の補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）が誘発されるのかどうかについて調べるため、ＧＢＭ細胞株を、ＭＣ８１３−７０およびウサギ補体で処理し、細胞死により引き起こされる、乳酸デヒドロゲナーゼの放出レベルを検出することにより、ＣＤＣの程度を査定した。図５は、補体の存在下では、ｍＡｂ ＭＣ８１３−７０により、生存ＧＢＭ細胞の数が目覚ましく低減されることを示した。本発明者らは、ＳＳＥＡ−４ｈｉ ＧＢＭ細胞株内の著明なＣＤＣ：ＤＢＴＲＧ細胞に対する７１．７％の細胞傷害作用、ＬＮ−２２９細胞に対する４６．６％の細胞傷害作用、Ｇ５Ｔ細胞に対する６７％の細胞傷害作用、およびＬＮ−１８細胞に対する６５．４％の細胞傷害作用を観察した。ＭＣ８１３−７０媒介性ＣＤＣは、ＳＳＥＡ−４の発現が低度であるかまたはＳＳＥＡ−４を発現させない２つのＧＢＭ細胞株である、Ｈｓ６８３およびＵ８７は死滅させなかった。したがって、ＭＣ８１３−７０がＣＤＣを媒介するレベルは、各ＧＢＭ細胞株内のＳＳＥＡ−４の発現レベルと正に相関した。
（実施例５）
抗ＳＳＥＡ−４抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける脳がんの成長を抑制する
ＭＣ８１３−７０が、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＧＢＭ腫瘍成長を抑制することが可能であるのかどうかについて点検するため、腫瘍が蝕知可能な腫瘤に成長した時点（注射後１１日目において１５〜３０ｍｍ３）で、ＭＣ８１３−７０を、ＤＢＴＲＧ細胞を皮下注射されたヌードマウスに投与した。ＭＣ８１３−７０（２００μｇ）を、各マウスの腹腔内に、４日ごとにのべ３回にわたり施し、比較のために、並行して、無関係のマウスＩｇＧ３（アイソタイプ対照）も注射した。実験により、ＭＣ８１３−７０を投与することにより、ＤＢＴＲＧ腫瘍の成長を阻害しうることが明らかとなった（図６）。ＤＢＴＲＧ腫瘍の成長は、ＭＣ８１３−７０で処理されたマウス３匹中２匹において、完全に抑制され、３匹目のマウスは、抗体による処置の中止後において、腫瘍を発症した。マウスＩｇＧ３を注射された対照群では、ＭＣ８１３−７０処置を施されるマウスと比較して、ＤＢＴＲＧ腫瘍は、侵襲的に成長した（３１日目における腫瘍体積は、平均で１８４ｍｍ３であった）。これらのデータにより、ＭＣ８１３−７０は、おそらく、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＣＤＣおよび抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を介して、ＳＳＥＡ−４を発現させるＧＢＭ腫瘍の成長を阻害することが可能であることが裏付けられた。
（実施例６）
多様ながん細胞株上のＧｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ３、およびＳＳＥＡ−４の発現
ＳＳＥＡ−４は、腎癌上（Ｓａｉｔｏ Ｓら（１９９７年）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｏｂｏ−ｓｅｒｉｅｓ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ８８巻（７号）：６５２〜６５９頁）、類基底細胞肺がん上（Ｇｏｔｔｓｃｈｌｉｎｇ Ｓら（２０１３年）Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ−４ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｂａｓａｌｏｉｄ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ． Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ ４１巻（３号）：６５６〜６６３頁）、卵巣上皮癌上（Ｙｅ Ｆ、Ｌｉ Ｙ、Ｈｕ Ｙ、Ｚｈｏｕ Ｃ、およびＣｈｅｎ Ｈ（２０１０年）Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ４ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｉｎｔ Ｊ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｃａｎｃｅｒ ２０巻（６号）：９５８〜９６４頁）、乳がん上（Ｈｕａｎｇ ＹＬら（２０１３年）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０巻（７号）：２５１７〜２５２２頁）、および口腔がん上（Ｎｏｔｏ Ｚら（２０１３年）ＣＤ４４ ａｎｄ ＳＳＥＡ−４ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａｎ ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＨＳＣ−４ ｐｏｓｓｅｓｓ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ． Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌ）で発現することが報告されている。本実施例では、本発明者らは、フローサイトメトリーにより、多様ながん細胞株上のＳＳＥＡ−３、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、およびＳＳＥＡ−４の発現レベルについて解析した。表７において示される通り、本発明者らは、合計１３４例のがん細胞株（１７例の脳がん細胞株、２０例の肺がん細胞株、２３例の乳がん細胞株、１３例の口腔がん細胞株、２例の食道がん細胞株、６例の胃がん細胞株、１０例の肝臓がん細胞株、５例の胆管がん細胞株、８例の膵臓がん細胞株、７例の結腸がん細胞株、６例の腎臓がん細胞株、４例の子宮頸がん細胞株、９例の卵巣がん細胞株、および４例の前立腺がん細胞株）について検討した。
グロボ系列ＧＳＬの発現は、フローサイトメトリーにより決定した。フローサイトメトリーにおいて、全細胞のうちの１５％超が陽性である細胞株は、陽性と標識する。
本発明者らは、ＳＳＥＡ−４が、あらゆる種類のがん細胞株（１３４例のがん細胞株中９６例のがん細胞株）内で発現することを見出した。また、Ｇｌｏｂｏ Ｈも、がん細胞株のうちの多く（１３４例のうちの８８例）、優先的に、肺がん細胞株、乳がん細胞株、膵臓がん細胞株、結腸がん細胞株、胃がん細胞株、口腔がん細胞株、肝臓がん細胞株、腎臓がん細胞株において発現した。本発明者らは、また、がん細胞株のうちの多く（１３４例のうちの７０例）が、ＳＳＥＡ−４とＧｌｏｂｏ Ｈとを同時に発現させることも観察した。他方、ＳＳＥＡ−３の発現は常に、ＳＳＥＡ−４の高発現に後続したことから、ＳＳＥＡ−４およびＧｌｏｂｏ Ｈが、がん細胞上で主要なグロボ系列ＧＳＬであることが指し示される。
ＳＳＥＡ−４の識別を検証するため、本発明者らは、９例のＭＣ８１３−７０陽性細胞株のほか、ＭＣ８１３−７０陰性白血病細胞株であるＴＦ１ａに由来するガングリオシドを精製し、ＨＰＴＬＣプレート上で免疫染色を実施した。予測される通り、ＳＳＥＡ−４は、これら９例のがん細胞株内で検出されたが、ＴＦ１ａ内では検出されず、強度は、フローサイトメトリーにより検討される幾何平均蛍光強度と良好に相関した。これらの結果により、ＳＳＥＡ−４は、様々ながん細胞株内で発現する可能性があり、複数種類のがんについての潜在的な標的として用いられうることが明らかとなった。
（実施例７）
がん細胞上およびがん幹細胞様細胞上のグリカン関連分子の発現
がん幹細胞様細胞については、８例の神経膠芽腫細胞株を、ＡＴＣＣから集め、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７補充物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびヒト組換えｂＦＧＦおよびヒト組換えＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌずつ；Ｕｐｓｔａｔｅ）からなるＮＳＭを伴う超低結合型ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内で維持した。培地は、３日ごとに交換し、全ての細胞は、５％のＣＯ２および３７℃の加湿雰囲気中で培養した。
ＬＮ１８細胞株上、Ｕ１３８細胞株上、Ｕ２５１細胞株上、ＤＢＴＲＧ細胞株上、およびＧ５Ｔ細胞株上、ならびにこれらのスフェア上の多様なマーカーについての発現プロファイルを検討した。１７のグリカン（ＧＭ３、ＧＭ２、ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＴ１ｂ、Ａ２Ｂ５、ＬｅＸ、ｓＬｅＸ、ＬｅＹ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＴＦ、Ｔｎ、およびｓＴｎ）、および５つの糖タンパク質（ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＣＤ４５、ＣＤ９０、ＣＤ１３３）を含む、合計２２のマーカーについて検討した。抗Ｇｌｏｂｏ Ｈモノクローナル抗体は、自家作製した。マーカーに特異的な他の抗体は、下記に列挙される販売元から購入した。ＣＤ１３３／１、およびＣＤ１３３／２は、ＣＤ１３３糖タンパク質の異なるエピトープに対する抗体とした。
細胞（１×１０５個）を、多様な濃度の抗体を含有する５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液（１％のＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）中に再懸濁させ、氷上で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後で、必要な場合、細胞を、Ａｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗マウス抗体またはＦＩＴＣ−抗ウサギ抗体（１：１００；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共に、氷上で３０分間インキュベートしてから、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上の解析にかけた。
ガングリオシドの発現パターンの中で、本発明者らは、ＧＤ２が、５つのＧＢＭニューロスフェア細胞内で、大きな比重を占め、一貫して発現することを見出した。しかし、ネオラクト系列の経路では、多能性幹細胞についての周知のマーカーであるＬｅＸは、これらの群間で有意差を示さなかった。さらに、ＧＭ２、ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ｂ、Ａ２Ｂ５、Ｔｆ、Ｔｎ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ２４、ＣＤ４４、およびＣＤ９０も、５つのＧＢＭ細胞内で高度に発現した。興味深いことに、グロボ系列の経路では、ＳＳＥＡ４の発現は、ニューロスフェア細胞内ではなく、親細胞内で夥多であったことから、ＳＳＥＡ４を、ＧＢＭ細胞の治療標的として用いうることが指し示される。
（実施例８）
ＧＤ２を加えたＳＳＥＡ−４およびＣＤ１３３による、ＧＢＭ幹細胞の富化
ＧＤ２と、ＳＳＥＡ４およびＣＤ１３３との組合せによってＧＢＭ幹細胞の集団をより特異的に決定しうるのかどうかを理解するために、本発明者らは、ＧＤ２＋ＳＳＥＡ４＋ＣＤ１３３＋集団の自己再生能および腫瘍形成性を、他の集団と比較する。
ＧＢＭ腫瘍に由来する細胞を、単一の細胞懸濁液に解離し、抗ＧＤ２抗体（ＢＤ）、抗ＳＳＥＡ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ１３３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で標識した。次いで、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ）を使用して、これらの標識された細胞を物理的に分取した。自己再生能を検出するために、ＧＢＭ腫瘍細胞を解離し、染色し、９６ウェルプレート内に播種した。直径が１００ｕｍを超えるニューロスフェアの数を計算した。腫瘍形成性については、細胞１０，０００〜１０個を含む、多様な数の細胞を、免疫欠損マウスに、皮下注射または頭蓋内注射した。ＧＤ２＋ＳＳＥＡ４＋ＣＤ１３３＋集団では、腫瘍の発病が、他の集団と比較して著明に迅速となることが観察される。
（実施例９）
抗Ｇｌｏｂｏ Ｈモノクローナル抗体の作製
Ｇｌｏｂｏ Ｈに特異的なｍＡｂを開発するために、ハイブリドーマ方法論を援用した。６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｇｌｏｂｏ Ｈワクチンにより、３回皮下免疫化した。３回の免疫化は、２週間おきに施した。各ワクチン接種は、２μｇのＧｌｏｂｏ Ｈを含有した。全ての血清は、４，０００×ｇで１０分間の遠心分離により得た。血清学的応答は、グリカンマイクロアレイにより解析した。最終追加免疫は、２μｇのＧｌｏｂｏ Ｈにより、腹腔内に施し、３日後、免疫化されたマウスに由来する脾臓細胞を、ハイブリドーマを作り出すために使用した。
所望の抗原結合活性を伴う抗体を分泌するハイブリドーマ細胞は、以下の通りにスクリーニングした。０．１Ｍ、ｐＨ９．６の炭酸緩衝液中に４μｇ／ｍＬのＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎと共に、４℃で一晩インキュベートすることにより、マイクロ滴定プレートをコーティングした。ウェルを、ｐＨ＝７．３のＰＢＳ中に１％のＢＳＡで、１時間遮断し、４μｇ／ｍＬのＧｌｏｂｏＨ−ビオチンと共に、１時間インキュベートした。抗血清は、３７℃で１時間、多様な希釈率でインキュベートした。洗浄の後で、リガンドと結合した抗体を、１：１０，０００のＦｃγ断片特異的ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）により検出し、３７℃で１時間インキュベートした後で、ＴＭＢ基質を伴うインキュベーションを施した。ＯＤは、４５０ｎｍで決定した。陽性クローンを、さらなる特徴付けのために選択した。本研究では、２つの例示的なクローンである、ｍＡｂ ２７３およびｍＡｂ ６５１を、Ｇｌｏｂｏ Ｈに特異的に結合するものとして同定した。マウスモノクローナルのアイソタイプ解析には、ＩｓｏＱｕｉｃｋ Ｓｔｒｉｐｓ ａｎｄ Ｋｉｔｓを使用した（Ｓｉｇｍａ；Ｉ９５３５）。ハイブリドーマ培地を、反応バイアルに添加する。ストリップが直立していることを確認しながら、ストリップを、試料に挿入する。試料は、ストリップを伝って上行する。ストリップを５分間発色させてから、最終的な解釈を施す。
ｍＡｂ ２７３およびｍＡｂ ６５１のＶＨ遺伝子セグメントおよびＶＬ遺伝子セグメントを、ＰＣＲにより、抗体を分泌するハイブリドーマクローンから増幅した。このようにして得られた遺伝子セグメントをシークェンシングして、ｍＡｂ ２７３およびｍＡｂ ６５１のＶＨ配列およびＶＬ配列を決定したが、これらを表１および２に示す。
（実施例１０）
抗ＳＳＥＡ−４モノクローナル抗体の作製
ＳＳＥＡ−４に特異的なｍＡｂを開発するために、ハイブリドーマ方法論を援用した。６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＳＳＥＡ−４ワクチンにより、３回皮下免疫化した。３回の免疫化は、２週間おきに施した。各ワクチン接種は、２μｇのＳＳＥＡ−４を含有した。全ての血清は、４，０００×ｇで１０分間の遠心分離により得た。血清学的応答は、グリカンマイクロアレイにより解析した。最終追加免疫は、２μｇのＳＳＥＡ−４により、腹腔内に施し、３日後、免疫化されたマウスに由来する脾臓細胞を、ハイブリドーマを作り出すために使用した。
所望の抗原結合活性を伴う抗体を分泌するハイブリドーマ細胞は、以下の通りにスクリーニングした。０．１Ｍ、ｐＨ９．６の炭酸緩衝液中に４μｇ／ｍＬのＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎと共に、４℃で一晩インキュベートすることにより、マイクロ滴定プレートをコーティングした。ウェルを、ｐＨ＝７．３のＰＢＳ中に１％のＢＳＡで、１時間遮断し、４μｇ／ｍＬのＳＳＥＡ−４−ビオチンと共に、１時間インキュベートした。抗血清は、３７℃で１時間、多様な希釈率でインキュベートした。洗浄の後で、リガンドと結合した抗体を、１：１０，０００のＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体またはＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）により検出し、３７℃で１時間インキュベートした後で、ＴＭＢ基質を伴うインキュベーションを施した。ＯＤは、４５０ｎｍで決定した。陽性クローンを、さらなる特徴付けのために選択した。本研究では、３つの例示的なクローンである、４５、４６、および４８を、ＳＳＥＡ−４に特異的に結合するものとして同定した。マウスモノクローナルのアイソタイプ解析には、ＩｓｏＱｕｉｃｋ Ｓｔｒｉｐｓ ａｎｄ Ｋｉｔｓを使用した（Ｓｉｇｍａ；Ｉ９５３５）。ハイブリドーマ培地を、反応バイアルに添加する。ストリップが直立していることを確認しながら、ストリップを、試料に挿入する。試料は、ストリップを伝って上行する。ストリップを５分間発色させてから、最終的な解釈を施す。
ｍＡｂ ４５、ｍＡｂ ４６、およびｍＡｂ ４８のＶＨ遺伝子セグメントおよびＶＬ遺伝子セグメントを、ＰＣＲにより、抗体を分泌するハイブリドーマクローンから増幅した。このようにして得られた遺伝子セグメントをシークェンシングして、ｍＡｂ ４５、ｍＡｂ ４６、およびｍＡｂ ４８のＶＨ配列およびＶＬ配列を決定したが、これらを表３〜５に示す。
（実施例１１）
キメラ抗体の作製
ｍＡｂ ２７３およびｍＡｂ ６５１のＶＨ遺伝子セグメントおよびＶＬ遺伝子セグメントを、ＰＣＲにより、抗体を分泌するハイブリドーマクローンから増幅した。このようにして得られた遺伝子セグメントをシークェンシングして、ｍＡｂ ２７３およびｍＡｂ ６５１のＶＨ配列およびＶＬ配列を決定したが、これらを表１および２に示す。重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、図９に示すヒトＩｇＧ１抗体発現ベクターにクローニングした。ＶＨでは、酵素部位ＢｓｉＷＩおよびＡｐａＩを使用し、ＶＬでは、酵素部位ＢｓＰＥＩおよびＮｈｅＩを使用した。ベクターは、２９３Ｆ細胞またはＣＨＯ−Ｓ細胞のいずれかに、一過性にトランスフェクトした。組換えキメラＡｂは、結合アッセイおよび補体依存性腫瘍細胞溶解アッセイのためのさらなる研究のために精製した。
ｍＡｂ ４６およびｍＡｂ ４８のＶＨ遺伝子セグメントおよびＶＬ遺伝子セグメントを、ＰＣＲにより、抗体を分泌するハイブリドーマクローンから増幅した。このようにして得られた遺伝子セグメントをシークェンシングして、ｍＡｂ ４６およびｍＡｂ ４８のＶＨ配列およびＶＬ配列を決定したが、これらを表５および４に示す。重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、図９に示すヒトＩｇＧ１抗体発現ベクターにクローニングした。ＶＨでは、酵素部位ＢｓｉＷＩおよびＡｐａＩを使用し、ＶＬでは、酵素部位ＢｓＰＥＩおよびＮｈｅＩを使用した。ベクターは、２９３Ｆ細胞またはＣＨＯ−Ｓ細胞のいずれかに、一過性にトランスフェクトした。組換えキメラＡｂは、結合アッセイおよび補体依存性腫瘍細胞溶解アッセイのためのさらなる研究のために精製した。
（実施例１２）
グリカンアレイによる、抗体についての結合解析
ｍＡｂ ２７３およびｍＡｂ ６５１、ならびに抗ＳＳＥＡ−４（ｍＡｂ ４５、ｍＡｂ ４６、およびｍＡｂ ４８）を、下で記載されるグリカン結合研究にかけた。１５２の化学合成グリカンを合成し、グリカンマイクロアレイ上にスポッティングした。グリカンアレイを、抗体と共に、多様な希釈率、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、スライドを、各回０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。次に、Ｃｙ５コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＭ抗体またはＣｙ５コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を、スライドに添加した。最後に、スライドを、ＰＢＳＴで３回洗浄した。マイクロアレイスライドは、乾燥させてから、マイクロアレイ蛍光チップリーダー（４０００Ｂ；Ｇｅｎｅｐｉｘ）により、６３５ｎｍで走査した。データは、ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ−６．０（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）ソフトウェアにより解析した。本研究から得られた結果を、図２に示す。
ｍＡｂ ２７３は、Ｇｌｏｂｏ Ｈ六糖エピトープであるＦｕｃα１→２Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（グリカンアレイ上の＃５３）、およびセグメントであるＧａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（グリカンアレイ上の＃５７）に結合することが可能である。ｍＡｂ ６５１は、グリカンエピトープであるＦｕｃα１→２Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（グリカンアレイ上の＃５３）、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（グリカンアレイ上の＃５７）、およびＮｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（グリカンアレイ上の＃１２）を認識する。
ｍＡｂ ４５は、ＳＳＥＡ−４六糖エピトープであるＮｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（グリカンアレイ上の＃１２）、および類似体であるＮｅｕ５Ｇｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（グリカンアレイ上の＃４９）に結合することが可能である。ｍＡｂ ４６は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（グリカンアレイ上の＃１２）、Ｎｅｕ５Ｇｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（グリカンアレイ上の＃４９）、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１（グリカンアレイ上の＃１１）、およびＮｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１（グリカンアレイ上の＃１０）に結合する。ｍＡｂ ４８は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（グリカンアレイ上の＃１２）、およびＮｅｕ５Ｇｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（グリカンアレイ上の＃４９）に結合することが可能である。
グリカンマイクロアレイはまた、ＭＣ８１３−７０の結合特異性について精査するのにも使用した。図２（Ｈ）において示される通り、本発明者らは、グリカンマイクロアレイ上の１５２の化学合成グリカンの中で、ＭＣ８１３−７０は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（グリカンアレイ上の＃１２）、およびＮｅｕ５Ｇｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（グリカンアレイ上の＃４９）を認識することを見出した。ＭＣ８１３−７０は、ＧＭ１ｂ（グリカンアレイ上の＃１０４）またはＧＤ１ａ（グリカンアレイ上の＃１０６）に結合しない。
本発明者らはまた、グリカンアレイを、ＭＣ４５、ＭＣ４８、およびＭＣ８１３−７０の、表面上のＳＳＥＡ−４六糖に対する解離定数を決定するのにも使用したが、ＭＣ４５、ＭＣ４８、およびＭＣ８１３についてのＫｄ値を下記に示す。これらの結果は、これらのｍＡｂが、ＳＳＥＡ−４に対して高度に特異的であることを示した。
（実施例１３）
フローサイトメトリーによる、がん細胞に対する抗体についての結合解析
ｍＡｂ ２７３、ならびに抗ＳＳＥＡ−４（ｍＡｂ ４５、ｍＡｂ ４６、およびｍＡｂ ４８）の、がん細胞株への結合について、検討した。細胞（１×１０５個）を、多様な濃度の抗体を含有する１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（１％のＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）中に再懸濁させ、氷上で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後で、細胞を、６４９標識ヤギ抗マウス抗体（１：１００；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共に、氷上で３０分間インキュベートしてから、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上の解析にかけた。結果を、図７Ａ〜Ｄに示す。乳がん細胞ＭＣＦ−７を、ｍＡｂ ２７３で染色した（図７Ａ）。膵臓がん細胞（ＨＰＡＣおよびＢｘＰＣ３）および乳がん細胞ＭＣＦ−７を、ｍＡｂ ４５で染色した（図７Ｂ）。膵臓がん細胞（ＨＰＡＣおよびＢｘＰＣ３）および乳がん細胞ＭＣＦ−７を、ｍＡｂ ４６で染色した（図７Ｃ）。膵臓がん細胞（ＨＰＡＣおよびＢｘＰＣ３）および乳がん細胞ＭＣＦ−７を、ｍＡｂ ４８で染色した（図７Ｄ）。
（実施例１４−１）
抗体は、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を媒介する
ｍＡｂ ２７３が、Ｇｌｏｂｏ Ｈを発現させる細胞に対するＣＤＣを媒介する能力について検討した。ＭＣＦ−７細胞を、補体の供給源としてのヒト血清の存在下で検討した。細胞死は、生存能力プローブである７−ＡＡＤを添加することにより評価した。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターを使用して、７−ＡＡＤ測定の結果に基づき、特異的溶解百分率を計算した。抗体は、４０μｇ／ｍＬで約３０％の殺滅活性を示した。図５（Ｂ）において示される通り、ｍＡｂ ２７３は、Ｇｌｏｂｏ Ｈを発現させる細胞に対する補体依存性細胞傷害作用を媒介することに成功しうる。
（実施例１４−２）
例示的なｍＡｂ ４６およびｍＡｂ ４８が、ＳＳＥＡ−４を発現させる細胞に対するＣＤＣを媒介する能力について検討した。Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ膵臓腺癌細胞（ＢｘＰＣ３）を、補体の供給源としてのウサギ血清の存在下で検討した。細胞死は、生存能力プローブである７−ＡＡＤを添加することにより評価した。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターを使用して、７−ＡＡＤ測定の結果に基づき、特異的溶解百分率を計算した。抗体は、４０μｇ／ｍＬで約２０％の殺滅活性を示した。図５（Ｃ）において示される通り、ｍＡｂ ４６およびｍＡｂ ４８は、ＳＳＥＡ−４を発現させる細胞に対するＣＤＣを媒介することに成功した。
材料および方法
試薬：抗Ｌｅｘ抗体、抗ｓＬｅｘ抗体、および抗ＧＤ２抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）から購入した。抗ＧＤ１ａ抗体、抗ＧＴ１ｂ抗体、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８抗Ａ２Ｂ５抗体は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）から購入した。抗ＧＭ１抗体および抗ＧＭ２抗体は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。抗Ｌｅｙ抗体および抗ｓＴｎ抗体は、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）から購入した。抗ＴＦ抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から購入した。抗Ｔｎ抗体は、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から購入した。蛍光標識ＭＣ８１３−７０または精製ＭＣ８１３−７０および蛍光標識ＭＣ６３１または精製ＭＣ６３１は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。ＭＣ８１３−７０腹水は、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａから購入した。個々の実験におけるこれらの抗体の用法については、以下の段落で記載した。
細胞培養物：Ｕ−２５１細胞、Ｕ−１３８細胞、ＬＮ−１８細胞、Ｔ９８細胞、ＬＮ−２２９細胞、Ｕ８７細胞、Ｕ−３７３細胞、Ｈｓ６８３細胞、Ｄ５４ＭＧ細胞、ＧＢＭ ８４０１細胞、ＧＢＭ ８９０１細胞、Ｇ５Ｔ細胞、Ｇ９Ｔ細胞、ＳＮＢ７５細胞、Ａ１７２細胞、およびＳＦ１２６細胞は、１０％のＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ）を補充した高グルコースＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で日常的に維持した。ＤＢＴＲＧ細胞は、１０％のＦＢＳを伴うＲＰＭＩ １６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で維持した。
フローサイトメトリー：細胞（１×１０５個）を、５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液（１％のＦＢＳを伴うＰＢＳ溶液）中に０．５μｇのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート抗ＳＳＥＡ−３ ｍＡｂ（ＭＣ−６３１）、抗ＳＳＥＡ−４ ｍＡｂ（ＭＣ８１３−７０）、またはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲート抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ ｍＡｂ（ＶＫ９；Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹのＰｈｉｌｉｐ Ｏ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎからの恵与）で、氷上で３０分間染色した。レクチン染色では、細胞を、ビオチニル化レクチンを含有する、レクチン結合緩衝液［１％のＢＳＡ、０．５ｘ Ｃａｒｂｏ−Ｆｒｅｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ緩衝液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＣａＣｌ２］中で、氷上で３０分間インキュベートした。レクチン結合緩衝液で２回洗浄した後で、細胞を、ストレプトアビジン−ＡＰＣ（ＦＡＣＳ緩衝液中で１：５００に希釈された；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と共に、氷上で３０分間インキュベートした。２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後で、細胞を、１μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有する２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、解析にかけた。データ取得は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により実施し、データ解析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して実施した。生細胞（ＰＩ陰性）を、解析のためにゲートにかけた。メタノール洗浄では、細胞を洗浄し、ＰＢＳ中に４％のパラホルムアルデヒドで、室温で１５分間固定した後、メタノール中で１０分間インキュベートしてから、特異的抗体により染色した。
免疫蛍光染色：細胞は、組織培養用プラスチックチャンバースライド（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）上に、一晩播種して、十分な結合を可能とし、４％のパラホルムアルデヒドで、室温で１５分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ＰＢＳ中に３％のＢＳＡで遮断した。次いで、細胞を、１０μｇ／ｍＬのｍＡｂ ＭＣ８１３−７０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と共に、一晩インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＩｇＧ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と共に、室温で２時間インキュベートした。核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（２μｇ／ｍＬ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で対比染色した。全ての画像は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１顕微鏡により取得した。
免疫組織化学：正常脳検体およびＧＢＭ検体に対するＭＣ８１３−７０染色のために、合計１９例の正常脳切片と、５５例のＧＢＭ切片とを含む、３つの異なる組織マイクロアレイスライド（Ｂｉｏｍａｘ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）について調べた。スライドは、５６℃で１時間乾燥させ、キシレン中で脱パラフィンし、段階濃度のアルコール中で再水和させた後、遮断緩衝液［０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を伴うＰＢＳ中に２％のＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）］により、室温で３０分間処理した。次いで、スライドを、ｍＡｂ ＭＣ８１３−７０（遮断緩衝液中に１０μｇ／ｍＬ）と共に、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳＴで静かに洗浄した後で、検体上の免疫反応性を、ＳｕｐｅｒＳｅｎｓｉｔｉｖｅ（商標）Ｐｏｌｙｍｅｒ−ＨＲＰ ＩＨＣ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＧｅｎｅｘ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）により検出し、スライドは、ヘマトキシリンで対比染色し、マウンティングのために前処理した。
グリカンアレイの作製：マイクロアレイは、ロボット式ピン（ＳＭＰ３；ＴｅｌｅＣｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）により、スポット１つ当たり約０．６ｎＬの沈着量でプリント（ＢｉｏＤｏｔ；Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）した。アミン含有グリカンプリンティング緩衝液（３００ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．５、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性化スライドガラス上にスポッティングした。各グリカンは、Ｋｄ決定のために、１００μＭずつの４連または５０μＭずつの６連でプリントした。プリントされたスライドは、湿度８０％で３０分間インキュベートした後、一晩乾燥にかけた。残りのＮＨＳ基は、スライドを、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ａｐｐｌｅｔｏｎ、ＷＩ）中で、１時間浸漬することにより遮断した。
Ａｂ結合アッセイ：ｍＡｂ ＭＣ８１３−７０ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を、１００μＬのＰＢＳ−Ｂ−Ｔ（ｐＨ７．４、３％のＢＳＡおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を伴う）中で調製し、グリッドを覆うように適用した。湿室内で３０分間のインキュベーションの後、スライドを、ＰＢＳＴおよび脱イオン水ですすぎ、送風乾燥させた。スライドは、Ｇｅｎｅｐｉｘ ４３００Ａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）により、６３５ｎｍで走査した。データは、ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ−６．０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により解析した。
シアリダーゼ処理：細胞を洗浄し、ＰＢＳ緩衝液中に、細胞１×１０７個／ｍＬで再懸濁させた。細胞を、５００ｍＵのα２，３シアリダーゼ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）／細胞１０６個／１００μＬを伴うかまたは伴わずに、３７℃で１時間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、表面染色およびフローサイトメトリーにかけた。シアリダーゼ処理の効率は、α２，３連結シアル酸を認識する、ビオチニル化Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓレクチンＩＩ（ＭＡＬ ＩＩ；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により測定した。
スフィンゴ糖脂質の抽出：細胞（４×１０７個）を採取し、ＰＢＳで洗浄し、水中でホモジナイズした。ホモジネート３体積当たり、メタノール８体積およびクロロホルム４体積を添加し、試料を、水浴型超音波処理器内で、３０分間インキュベートした。３０００×ｇで１５分間の遠心分離の後で、ペレットを、４：８：３のクロロホルム／メタノール／水により繰り返し抽出し、合わせた上清を、窒素流下で乾燥させた。次いで、全脂質抽出物を、クロロホルム／メタノール／水（３０／６０／８、ｖ／ｖ／ｖ）中に溶存させ、ガングリオシドを、アニオン交換クロマトグラフィーに基づく、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−２５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）により精製した。中性の糖脂質を含有する、未結合のフロースルーを回収し、乾燥させた。クロロホルム／メタノール／水（３０／６０／８、ｖ／ｖ／ｖ）による洗浄の後で、ガングリオシドを、クロロホルム／メタノール／ＮａＣｌ水溶液（０．０２、０．２、および０．８Ｍで段階的に）（３０／６０／８、ｖ／ｖ／ｖ）で溶出させた後、Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）で脱塩した。抽出物を窒素下で乾燥させ、ガングリオシド残基のほか、中性糖脂質残基を、１００μＬのクロロホルム／メタノール（２／１、ｖ／ｖ）中に再溶存させた。
高速薄層クロマトグラフィー：ＧＳＬは、ガラス充填シリカゲル６０プレコーティング高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）プレート（Ｍｅｒｃｋ）上で分離した。ガングリオシドは、クロロホルム／メタノール／水（１２０／８５／２０、ｖ／ｖ／ｖ）中で、中性ＧＳＬは、クロロホルム／メタノール／水（１２０／７０／１７、ｖ／ｖ／ｖ）中で、各々２ｍＭのＣａＣｌ２を補充して、それぞれ、クロマトグラフにかけた。解析目的では、ＧＳＬを、３ＭのＨ２ＳＯ４中に０．３％のオルシノールで染色し、次いで、青紫色のスポットが出現するまで、あらかじめ加熱された加熱プレート（１１０℃）に移した。調製目的では、ガングリオシドを、アセトン／水（４／１、ｖ／ｖ）中に０．０２％のプリムリン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で染色した。ガングリオシドのスポットは、ＵＶ光下、ペンシルでマークし、吸着型スクレーパー（Ｓｉｇｍａ）でプレートからこすり取り、ガングリオシドは、１０分間の超音波処理下で、クロロホルム／メタノール／水（３０／６０／８、ｖ／ｖ／ｖ）により抽出した。シリカは、遠心分離により除去し、再度再抽出し、合わせた上清を乾燥させ、メタノール中に再溶存させた。
ＴＬＣ免疫染色：ＧＳＬを、上で記載したＨＰＴＬＣプレート上で分離した。クロマトグラフィーの後で、ＴＬＣプレートを空気乾燥させ、ヘキサン／クロロホルム（４２：８、ｖ／ｖ）中２．１％のポリ（イソブチル−メタクリレート）（Ｓｉｇｍａ）中に、３回浸漬し、ＰＢＳ中に、３７℃で一晩浸した。プレートを乾燥させ、ＰＢＳ中、室温で３０分間遮断し、ＭＣ８１３−７０またはＭＣ−６３１（５μｇ／ｍＬ）と共に、室温で２時間反応させた。ＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）で、３回静かに洗浄し、プレートを、ビオチニル化二次抗体（１μｇ／ｍＬ）と共に、１時間インキュベートした後、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（１：１０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を伴うインキュベーションにかけた。ＰＢＳＴによる洗浄の後で、ＴＬＣプレートを、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で展開した。蒸留水で洗浄することにより、反応を停止させ、プレートを空気乾燥させた。
ＭＡＬＤＩ−ＭＳプロファイリングおよびＭＳ／ＭＳ解析：過メチル化グリカンについてのＭＡＬＤＩ−ＭＳ解析は、ＡＢＩ ４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）により、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）をマトリックス（１０ｍｇ／ｍＬ）として使用して行った。低エネルギーおよび高エネルギーによる衝突誘導性解離を伴うＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳシークェンシングは、Ｑ／ＴＯＦ Ｕｌｔｉｍａ ＭＡＬＤＩ（Ｗａｔｅｒｓ Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）および４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｚｅｒにより、上で記載したＤＨＢマトリックスを使用して実行した。
補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）アッセイ：（ＭＣ８１３−７０）ｍＡｂなどの例示的な抗ＳＳＥＡ４ ｍＡｂのＣＤＣ活性は、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ、ＷＩ）を使用する、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイにより測定した。細胞（１×１０４個）を、９６ウェルプレートの各ウェル内に播種し、一晩の成長の後で、ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、細胞を、ウサギ補体を伴う、５０μＬのフェノールレッド非含有ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ（１：５の希釈率；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に１μｇのＭＣ８１３−７０またはマウスＩｇＧ３アイソタイプ対照と共にインキュベートした。５％のＣＯ２によるインキュベーター内、３７℃で１時間インキュベーションの後、培養物上清に放出されるＬＤＨの量を測定することにより、細胞溶解度を決定した。最大ＬＤＨ放出は、キットにより提供されているＬｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで細胞を溶解させることにより決定した。特異的溶解の百分率は、式：溶解％＝［被験放出−自発放出］／［最大放出−自発放出］×１００に従い計算した。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍成長：ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ＣｒｌＮａｒｌマウスは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｔａｉｗａｎ）から購入し、特別な無病原体条件下で維持した。動物の健康状態は、毎日モニタリングした。動物およびそれらのケアを伴う手順は、国内および海外の法律および政策に準拠して、Ａｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに従い行った。ＤＢＴＲＧ細胞（１×１０７／２５０μＬのＰＢＳ）を、マウス（８〜１０週齢）の脇腹領域に皮下注射して、異種移植モデルを作り出した。１１、１５、および１９日目に、各マウスに、２００μｇのＭＣ８１３−７０（腹水から精製された）またはマウスＩｇＧ３アイソタイプ対照Ａｂを腹腔内注射した。腫瘍サイズは、ノギスで、長さ（Ｌ）および幅（Ｗ）を測定することにより決定し、腫瘍体積は、１／２×ＬＷ２として計算した（ｍｍ３単位で）。
（実施例１５）
例示的なファージディスプレイによるバイオパニング手順
クローン２．５×１０１０個を含有する、ファージディスプレイヒトナイーブｓｃＦｖライブラリー（Ｌｕら、２０１１年）から、ＰＥＧコンジュゲートカルボキシルＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、室温（ＲＴ）で１時間、非特異的結合を控除し、その後、ＳＳＥＡ−４−ＰＥＧを固定化したＤｙｎａｂｅａｄｓと共に、４℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳまたは０．０１％のＴｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ０．０１）を含有するＰＢＳによる洗浄の後で、ＳＳＥＡ−４−ＰＥＧ−Ｄｙｎａｂｅａｄｓに結合したファージを、Ｅ−ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞を伴う、３７℃で０．５時間の感染により回収した。感染細胞の一部は、系列希釈して、力価を決定し、他の細胞は、Ｍ１３ＫＯ７ファージによりレスキューし、増幅した。レスキューされたファージ力価を決定した後で、次のラウンドのバイオパニングを実施した。バイオパニングの第４のラウンドおよび第５のラウンドにおいて、ファージクローンをランダムに選択して、ＥＬＩＳＡスクリーニングのために培養した。
選択されたファージクローンのＥＬＩＳＡスクリーニング
抗原認識を検出するために、マイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を、それぞれ、０．２μｇ／ｍｌのＳＳＥＡ−４−ＢＳＡ、Ｇｌｏｂｏ Ｈ−ＢＳＡ、ＳＳＥＡ−３−ＢＳＡ、およびＢＳＡでコーティングした。選択されたファージクローンを、３％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中に１：２で希釈し、各ウェルに添加した。プレートを、ＲＴで１時間インキュベートし、ＰＢＳＴ０．１で洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートマウス抗Ｍ１３ファージ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共にインキュベートした。プレートを再度洗浄し、ＯＰＤおよびＨ２Ｏ２を添加した。３ＮのＨＣｌによる反応の終結の後で、マイクロプレートリーダー（６８０型；ＢｉｏＲａｄ）を使用して４９０ｎｍを使用して、吸光度を測定した。本発明者らは、ファージミドを、ＥＬＩＳＡ陽性ファージクローンから抽出して、自動シークェンシングにより、ｓｃＦｖコード領域を同定した。
抗ＳＳＥＡ−４ヒトＩｇＧの構築および発現
選択されたｓｃＦｖのＶＨ領域を、ＡｇｅＩ部位およびＮｈｅＩ部位により、ヒト免疫グロブリンガンマ１重鎖のシグナルペプチド領域および定常領域を含有する修飾発現ベクターであるｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−Ｇａｍｍａ１にクローニングした。選択されたｓｃＦｖのＶＬ領域を、ＡｇｅＩ部位およびＥｃｏＲＶ部位により、ヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖のシグナルペプチド領域および定常領域を含有する修飾発現ベクターであるｐ−Ｋａｐｐａ−ＨｕＧｓにクローニングした。両方のプラスミドを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクトし、血清非含有培地中、３７℃で１週間持続的にインキュベートして、ヒト抗体を作製した。
抗ＳＳＥＡ−４ヒトＩｇＧの精製
培養培地を回収し、遠心分離し、小孔サイズを０．４５μｍとする膜で濾過した。次いで、抗ＳＳＥＡ−４ヒトＩｇＧを精製するために、上清を、プロテインＧカラムクロマトグラフィー（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけた。溶出物をＰＢＳにより透析した後で、通例通り、クーマシーブルー染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、抗体について検討した。抗体の濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および分光光度計により評価した。
ＭＣ４８のヒト化
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号をＱ９ＵＬ７３およびＡＹ５７７２９８とする２つのヒト遺伝子は、それぞれ、ＭＣ４８ ＶＨおよびＭＣ４８ ＶＬと最も類似した。本発明者らは、Ｑ９ＵＬ７３遺伝子の修飾フレームワーク（ＦＲ）１〜ＦＲ４からなる第１のヒト化ＭＣ４８（ｈＭＣ４８）ＶＨ、および受託番号：ＡＹ５７７２９８による４つのＦＲからなる第１のｈＭＣ４８ ＶＬ、ＰＤＢの１ＹＹ８に従うＶＨによる第２のｈＭＣ４８ ＦＲに対し、第１の配列と同じである第２のｈＭＣ４８ ＶＬ、ならびにＱ９ＵＬ７３遺伝子のＦＲ１、２、および４を修飾する第３のｈＭＣ４８ ＶＨ配列、ならびにヒトＡＹ５７７２９８遺伝子へＦＲ２およびＦＲ４を変化させる第３のｈＭＣ４８ ＶＬを含む、３つのＭＣ４８配列をヒト化した。これらのヒト化配列の全ては、ＭＣ４８のＶＨおよびＶＬのうちの、保存的ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３であった。
ヒト化ＭＣ４８変異体の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の構築
ヒト化ＭＣ４８配列（ＶＨ−ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ−ＶＬ（配列番号１１５））のｓｃＦｖ形態を遺伝子合成し（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、Ｓｆｉ ＩおよびＮｏｔ Ｉ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で切り出した。ゲル抽出の後、消化された産物を、ｐＣＡＮＴＡＢ−５Ｅファージミド（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にクローニングした。
ヒト化ＭＣ４８（ｈＭＣ４８）ｓｃＦｖファージクローンの作製
ｈＭＣ４８変異体ファージミドを、ＴＧ１ Ｅ−ｃｏｌｉに形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２％のグルコースを含有する２ｘ ＹＴ培地（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）中に回収し、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（ＮＥＢ）により、３７℃で１時間レスキューした。１，５００×ｇで１０分間の遠心分離の後で、これらのペレットを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２ｘ ＹＴ培地中で、一晩再懸濁させて、ｓｃＦｖファージを作り出した。
ＥＬＩＳＡによる、ｈＭＣ４８ ｓｃＦｖファージクローンについての結合アッセイ
ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡを、ＥＬＩＳＡプレート上、０．２μｇ／ｍｌの濃度でコーティングした。洗浄および遮断の後で、系列希釈されたファージを、ＲＴで１．５時間インキュベートした。洗浄の後で、１：１０００に希釈されたＨＲＰコンジュゲート抗Ｍ１３抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ＲＴで１時間添加した。次いで、液体基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の発色は、３ＮのＨＣｌで停止させた。光学密度は、４５０ｎｍで測定した。
結果
ＳＳＥＡ−４に結合するファージディスプレイｓｃＦｖの同定
ＳＳＥＡ−４に結合する抗体を同定するため、本発明者らは、本発明者らによる以前の報告（Ｌｕら、２０１１年）で記載した通りに確立された、２．５×１０１０のメンバーを含有するファージディスプレイヒトナイーブｓｃＦｖライブラリーを使用した。まず、このライブラリーから、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ結合性ファージを取り除き、次いで、ＳＳＥＡ−４−ＰＥＧコンジュゲートＤｙｎａｂｅａｄｓにより、ＳＳＥＡ−４結合性ファージについて選択した。バイオパニング時において、本発明者らは、ＰＢＳおよび０．０１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ０．０１）の２つの緩衝液系を使用した。５ラウンドにわたるアフィニティー選択の後、第５のラウンドのファージ回収物は、ＰＢＳ系およびＰＢＳＴ０．０１系のそれぞれにおいて、第１のラウンドの約５５倍〜８０倍に増大した（図１０）。ファージクローンをランダムに選択し、ＥＬＩＳＡにより、ＳＳＥＡ−４結合について調べた（図１１）。本発明者らは、ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡには特異的に結合するが、ＢＳＡ対照タンパク質には特異的に結合しない７つのクローンを見出した。８つの個々のクローン全てをシークェンシングすることにより、本発明者らは、顕著に異なるヒトＶＨコード領域およびヒトＶＬコード領域を含有する、２つの固有の抗ＳＳＥＡ−４ファージクローン（ｐ１−５２およびｐ２−７８）を同定した（図１６Ａ）。
２つのファージクローンの特異性および結合アフィニティーを検討するため、本発明者らは、ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡ、Ｇｌｏｂｏ Ｈ−ＢＳＡ、およびＳＳＥＡ−３−ＢＳＡを含む、グロボ系列グリカンに対する同じファージ力価を使用して、比較ＥＬＩＳＡを実施した（図１２）。ｐ２−７８ファージクローンは、ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡおよびＳＳＥＡ−３−ＢＳＡに対する強い結合、ならびにＧｌｏｂｏ Ｈ−ＢＳＡに対するわずかに弱い結合を示した。しかし、本発明者らは、ｐ１−５２ファージクローンの、ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡに対する結合活性は、非常に弱いことを見出した。したがって、本発明者らは、さらなる研究のために、ｐ２−７８クローンに焦点を当てた。
ＳＳＥＡ−４に対する完全ヒト抗体（ｈＡｂ）を確立するため、本発明者らは、ｐ２−７８ ｓｃＦｖのＶＨコード配列およびＶＬコード配列を、それぞれ、ヒトＩｇＧ１骨格に分子操作した。抗ＳＳＥＡ−４ ｐ２−７８ ｈＡｂは、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現系を使用して作製し、次いで、プロテインＧセファロースカラムを通して精製した。本発明者らは、クーマシーブルー染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、抗体の純度について検討した（図１３Ａ）。結果は、抗体の純度レベルが、９５％を超えることを示す。その後、本発明者らは、ＥＬＩＳＡを実施して、ｐ２−７８ ｈＡｂの、グロボ系列グリカンに対する結合活性について精査した（図１３Ｂ）。本発明者らは、ｐ２−７８ ｈＡｂは、ＳＳＥＡ−４およびＳＳＥＡ−３には結合するが、Ｇｌｏｂｏ Ｈには結合しないことから、ｐ２−７８のヒトＩｇＧ変化形が、結合エピトープであるＳＳＥＡ−４を認識するように、その親ｓｃＦｖ変化形の活性を保持すると裏付けられることを見出した。
本発明者らは、２０３の異なるグリカンを含有するグリカンアレイを使用して、ｐ２−７８ ｈＡｂの特異性をさらに確認した。結果は、ｐ２−７８ ｈＡｂが、ＳＳＥＡ４、シアリル−ＳＳＥＡ４、ＳＳＥＡ４Ｇｃ、およびＧｂ５（ＳＳＥＡ３）を認識することを示した（図１４Ｂ）。興味深いことに、ｐ２−７８ ｈＡｂはまた、ＧｌｏｂｏＨも認識し、ＥＬＩＳＡアッセイからの結果と類似した（図１２）。市販のＩｇＭ抗体であるＭＣ６３１を、陽性対照として使用した（図１４Ａ）。
ヒト化ＭＣ４８ ｍＡｂの開発
非ヒト化マウスｍＡｂは、臨床状況では、それらの血清中半減期が短く、ヒトエフェクター機能を誘発することができず、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答をもたらすこと（ＬｏＢｕｇｌｉｏら、１９８９年）を含む、ある特定の限界を有しうる。したがって、ｍＡｂは、それらのＣＤＲを、ヒトＩｇ分子のＶＨ ＦＲおよびＶＬ ＦＲにグラフティングすることにより、ヒト化することができる（Ｒｏｇｕｓｋａら、１９９４年）。
ヒト化ＭＣ４８を開発するため、本発明者らは、ハイブリドーマ細胞に由来するＭＣ４８のＶＨ可変領域およびＶＬ可変領域をシークェンシングした（表４）。ＭＣ４８のＶＨ可変領域およびＶＬ可変領域の、ＮＣＢＩ ＩｇＢＬＡＳＴデータベースを用いたアライメントの後で、本発明者らは、ＭＣ４８のＦＲを修飾し、第１、第２、第３、および第４のヒト化ＭＣ４８配列を作り出した（表１７、図１７）。次に、本発明者らは、これらのヒト化ＭＣ４８配列に従い、ファージディスプレイｓｃＦｖフォーマットを構築し、作り出した。ヒト化ＭＣ４８ファージクローンの結合活性を決定するため、本発明者らは、ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡについての、固体ベースのＥＬＩＳＡコーティングを実行した（図１５および１８）。本発明者らは、ヒト化ＭＣ４８ ｓｃＦｖファージが、ＳＳＥＡ−４を、用量依存的に認識しうることを見出した。データは、第４のヒト化ＭＣ４８ ｓｃＦｖファージが、マウスｍＡｂ ＭＣ４８と比較して、その結合アフィニティーを維持することを示した。
（実施例１６）
補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）アッセイ。
例示的なヒト化ＭＣ ４８がＳＳＥＡ−４発現細胞のＣＤＣを媒介する能力を検討する。Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓの乳癌細胞または膵臓癌細胞を、一晩の成長のために９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、その後アッセイした。次いで、細胞を、補体の供給源としてのウサギ血清（１：５希釈；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在下で、ＲＰＭＩ中に系列希釈した濃度のヒト化ＭＣ ４８またはヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と共にインキュベートした。細胞死は、生存能力プローブである７−ＡＡＤを添加することにより評価する。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターを使用して、７−ＡＡＤ測定の結果に基づき、特異的溶解百分率を計算する。抗体は、アイソタイプ対照と比較して、１０μｇ／ｍＬで顕著な殺滅活性を示す。示されるように、ヒト化ＭＣ４８−４は、ＳＳＥＡ−４発現細胞のＣＤＣを首尾よく媒介する。

Claims (25)

  1. Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１に特異的に結合する単離ヒト化モノクローナル糖抗体。
  2. Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１およびＧａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１にさらに結合する、請求項１に記載の単離ヒト化モノクローナル糖抗体。
  3. ＩｇＧまたはＩｇＭである、請求項１または２に記載の単離糖抗体。
  4. Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１にさらに結合する、請求項１に記載の単離糖抗体。
  5. Ｎｅｕ５Ａｃα２−８→Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１にさらに結合する、請求項４に記載の単離糖抗体。
  6. ＩｇＧ１である、請求項４または５に記載の単離糖抗体。
  7. Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１、Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１、ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１およびＮｅｕ５Ａｃα２−８→Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１に特異的に結合する単離ヒト化モノクローナル抗体。
  8. 前記抗原結合性断片が、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、または単鎖Ｆｖ断片である、請求項７に記載の単離抗体。
  9. 配列番号１４７または配列番号１３７を有するＶＨおよび配列番号１４８または配列番号１３８を有するＶＬを含む、請求項７に記載の単離抗体。
  10. （ｉ）〜（ｉｉｉ）：
    （ｉ）配列番号１５２（ＧＦＳＬＴＳＹＧ）から選択されるＨ−ＣＤＲ１；
    （ｉｉ）配列番号１５３（ＩＷＧＥＧＳＴ）から選択されるＨ−ＣＤＲ２；
    （ｉｉｉ）配列番号１５４（ＡＭＴＧＴＡＹ）から選択されるＨ−ＣＤＲ３
    からそれぞれ選択される、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、およびＨ−ＣＤＲ３を含み；
    （ｉｖ）〜（ｖｉ）：
    （ｉｖ）配列番号１４９（ＳＳＶＳＹ）から選択されるＬ−ＣＤＲ１；
    （ｖ）配列番号１５０（ＤＴＳ）から選択されるＬ−ＣＤＲ２；および
    （ｖｉ）配列番号１５１（ＨＱＷＳＳＳＰＨＴ）から選択されるＬ−ＣＤＲ３
    からそれぞれ選択される、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３を含む、請求項９に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
  11. （ｉ）〜（ｉｖ）：
    （ｉ）配列番号１５９（ＱＶＱＬＫＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳ）から選択されるＨ−ＦＲ１；
    （ｉｉ）配列番号１６０（ＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＶ）から選択されるＨ−ＦＲ２；
    （ｉｉｉ）配列番号１６１（ＮＹＨＳＶＬＩＳＲＬＴＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＬＮＳＬＱＴＤＤＴＡＴＹＹＣ）から選択されるＨ−ＦＲ３；
    （ｉｖ）配列番号１６２（ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）から選択されるＨ−ＦＲ４
    からそれぞれ選択される、Ｈ−ＦＲ１、Ｈ−ＦＲ２、Ｈ−ＦＲ３、およびＨ−ＦＲ４をさらに含み；
    （ｖ）〜（ｖｉｉｉ）：
    （ｖ）配列番号１５５（ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳ）から選択されるＬ−ＦＲ１；
    （ｖｉ）配列番号１５６（ＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹ）から選択されるＬ−ＦＲ２；
    （ｖｉｉ）配列番号１５７（ＫＬＳＳＧＶＰＧＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣ）から選択されるＬ−ＦＲ３；
    （ｖｉｉｉ）配列番号１５８（ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ）から選択されるＬ−ＦＲ４
    からそれぞれ選択される、Ｌ−ＦＲ１、Ｌ−ＦＲ２、Ｌ−ＦＲ３、およびＬ−ＦＲ４を含む、請求項９に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
  12. がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、前記対象に、有効量の、請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離抗体、および薬学的に許容される担体またはそれらの組合せを投与するステップを含む方法。
  13. 前記がんが、脳がん、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆管がん、膵臓がん、結腸がん、腎臓がん、子宮頸がん、卵巣がんおよび前立腺がんからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
  14. 対象におけるがんを検出するための方法であって、
    （ａ）ＧＭ３、ＧＭ２、ＧＭ１、ＧＤ１、ＧＤ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＴ１ｂ、Ａ２Ｂ５、ＬｅＸ、ｓＬｅＸ、ＬｅＹ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、シアリルＳＳＥＡ−４、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、Ｇｂ４、ＴＦ、Ｔｎ、ｓＴｎ、ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＣＤ４５、ＣＤ９０、ＣＤ１３３／１、およびＣＤ１３３／２からなるマーカーのパネルの発現を検出する、１つまたは複数のモノクローナル抗体を、前記対象から得られた細胞試料または組織試料に適用するステップと；
    （ｂ）前記１つまたは複数のモノクローナル抗体の、前記細胞試料または前記組織試料への結合についてアッセイするステップと；
    （ｃ）前記結合を、正常対照と比較して、前記対象における前記がんの存在を決定するステップと
    を含む方法。
  15. 請求項１から１１に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物。
  16. がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、前記対象に、治療有効量の、請求項１５に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
  17. 前記がんの細胞が、前記細胞の表面上に、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ３および／またはＳＳＥＡ４抗原のうちの少なくとも１つを発現する、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記がんの細胞が、前記細胞の表面上にＳＳＥＡ４抗原を発現する、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記がんの細胞が、前記細胞の表面上に、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４抗原を同時に発現する、請求項１６に記載の方法。
  20. 前記がんが、脳がん、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆管がん、膵臓がん、結腸がん、腎臓がん、骨がん（骨肉腫）、皮膚がん、子宮頸がん、卵巣がん、および前立腺がんからなる群から選択される、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. Ｆｃ領域のＡｓｎ−２９７に結合している、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の構造からなるＮ−グリカンを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
  22. 抗体のＦｃ領域のＡｓｎ−２９７に結合している、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の構造からなるＮ−グリカンを含み、Ｇｌｏｂｏ−Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４からなる群から選択される、がんと関連する少なくとも１つの抗原に特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片。
  23. 抗ＳＳＥＡ４特異的糖抗体である、請求項２１に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
  24. Ｇｌｏｂｏ−Ｈおよび／またはＳＳＥＡ３に対して交差反応性を有する抗ＳＳＥＡ４特異的糖抗体である、請求項２３に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
  25. Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１、およびその酸化型変異体、ならびに前記酸化型変異体とのコンジュゲーション産物に特異的に結合する単離ヒト化モノクローナル糖抗体。
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