JP2018505677A - インフルエンザヘマグルチニンに対する結合分子及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、系統発生学的グループ２の２つの異なるＨＡ亜型のＨＡを含む少なくとも２つのＡ型インフルエンザウイルス株のヘマグルチニン（ＨＡ）との特異的結合能を有するか；又は系統発生学的グループ１の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株及び系統発生学的グループ２の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株のヘマグルチニン（ＨＡ）との特異的結合能を有するか；又は少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株のヘマグルチニン（ＨＡ）との特異的結合能を有する単量体及び多量体結合分子に関する。この結合分子は、好ましくは、系統発生学的グループ２の少なくとも２つのＡ型インフルエンザウイルス株の中和能も有するか；又は系統発生学的グループ１の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株及び系統発生学的グループ２の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株の中和能も有するか；又は少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株の特異的中和能も有する。

Description

本発明は、医薬の分野に関する。本発明は、結合分子、詳細には、Ａ型及び／又はＢ型インフルエンザウイルスのインフルエンザヘマグルチニンに結合するシングルドメイン抗体及びマルチドメイン抗体を提供する。好ましくは、本結合分子はまた、Ａ型及び／又はＢ型インフルエンザウイルスの中和能も有する。本発明は、シングルドメイン抗体及びマルチドメイン抗体をコードする核酸分子、並びにそれを含む組成物を更に提供する。本発明は、Ａ型インフルエンザ及び／又はＢ型インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染症の診断、予防及び／又は治療に更に関する。

季節性Ａ型インフルエンザは公衆衛生上重要な問題であり、毎年世界で２５０，０００人以上が死亡していると共に、何百万人もの人々に経済的負担をもたらしている。汎流行インフルエンザは、新種のウイルスが出現して、免疫がほとんど又は全くない人々に全世界的に感染すると起こるものであり、ヒトの健康にとって一層大きい脅威となっている。例えば、１９１８年の「スペイン風邪」の世界的流行では、推定５千万人が死亡した。高病原性鳥インフルエンザ（ＨＰＡＩ）は感染したヒトにおいて５０％を超える死亡率を示しており、継続的に問題化している。Ｈ５及びＨ７インフルエンザウイルスは、世界の特定の場所の家禽に地域的に流行する。これらのウイルスは、現在のところ、ヒト間で易感染する能力はないように思われるが、トリＨ５型に関する最近のデータでは、哺乳類インビボモデル系において、このウイルスの空気感染による伝播が可能となるのに僅か数個のアミノ酸変化で十分であることが示されている。

これまで、Ｂ型インフルエンザウイルスはあまり注目されてこなかった。これは、Ｂ型インフルエンザウイルス − そもそも宿主がヒトに限られている − が、汎流行Ａ型インフルエンザ株の出現の鍵である病原体保有動物の大規模なリザーバーを有していないことが理由であり得る。しかしながら、毎年の流行の累積的な影響は世界的流行の影響を上回り、Ｂ型インフルエンザに起因する罹患率及び死亡率は、例えばＨ３Ｎ２ウイルスよりも低いが、概してＨ１Ｎ１ウイルスよりも高い。

インフルエンザウイルス感染の管理の中心はワクチンであるが、時宜を得た実施には幾つかの技術的課題を伴う。そうした課題としては、（ｉ）いずれのウイルス株が出現してヒト集団に感染するかの予測、（ｉｉ）新型ウイルス株が出現してから臨床認可済みのワクチンが利用可能となるまでの時間の遅れ、（ｉｉｉ）特定の患者集団、例えば高齢者、超若年者又は免疫不全者における低い免疫原性、及び（ｉｖ）世界的に見た製造能力の限界が挙げられる。

ノイラミニダーゼ阻害薬オセルタミビル及びザナミビル並びにＭ２阻害薬アマンタジン及びリマンタジンなどの抗ウイルス薬は、季節性及び汎流行性の両方のインフルエンザに対する治療選択肢群の重要な補強となる。しかしながら、これらの薬物は、感染後期に投与した場合には有効性が限られており、広範囲に及ぶ使用は耐性ウイルス株の出現をもたらす可能性がある。更に成人におけるオセルタミビルの使用は、悪心、嘔吐、精神医学的作用及び腎臓イベントなどの有害作用と関連付けられている。

抗体は、最も初期の防御剤クラスの１つに相当し、これまでのインフルエンザの世界的流行では回復期患者血清の受身伝達の使用が成功した。しかしながら、この手法は、（ｉ）適切な血清の供給が限られている、（ｉｉ）毒性リスクが高い、（ｉｉｉ）ロット間のばらつきが大きい、（ｉｖ）用量決定が不確か、及び（ｖ）投与が難しいため、世界規模での実施可能性は限られている。

組換えモノクローナル抗体技術の進歩により、この戦略は更に研究する価値があるものとなっているが、それは、分量に制限なく防御抗体を作製して備蓄し、世界的流行の緊急時に直ちに防御を提供し得ることが理由であるわけでは全くない。これが有効な戦略となるには、かかる抗体が異なるウイルス亜型にわたって中和活性を有することが必要となり得る。インフルエンザウイルスのウイルスコートタンパク質、詳細にはヘマグルチニン（ＨＡ）は絶えず変化しているため、これは大きい課題を提起する。

ヘマグルチニン又はＨＡは、インフルエンザウイルス外被にアンカリングした、以下の二重の機能を有する三量体糖タンパク質である。ＨＡは宿主細胞表面受容体シアル酸との結合に関与し、取り込み後にウイルス膜とエンドソーム膜との融合を媒介して、細胞のサイトゾルにおけるウイルスＲＮＡの放出をもたらす。ＨＡは、大きい可変の頭部ドメインと、小さいより高度に保存された茎部ドメインとを含む。ＨＡに対する多くの中和抗体は頭部領域の超可変領域にあるエピトープを認識し、従って宿主細胞との結合を妨げる。しかしながら、最近になって、ＨＡ茎部領域に結合して膜融合を妨げる新規モノクローナル抗体が同定されている（Ｃｏｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｄｒｅｙｆｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｅｋｉｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｅｋｉｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１及びＥｋｉｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｋａｓｈｙａｐ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｋｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｔｈｒｏｓｂｙ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｔｓｉｂａｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，２００９）。

これらの広域中和抗体の少なくとも一部は前例のない交差反応範囲を示しており、インフルエンザウイルスのある亜型、系統発生学的グループの範囲内の、又は更には異なるグループの及び亜型間の多くの異なる株の中和が可能となっている。これらの抗体の潜在的治療及び予防能力はマウス及びフェレットの両モデルで実証されており、幾つかは現在ヒト臨床試験で評価中である。しかしながら、これらのモノクローナル抗体にも、ある固有の制限があり、インフルエンザの予防及び／又は治療にそれらを広範に利用する上で大きい課題となり得る。これらの制限としては、（ｉ）非経口投与の必要性；（ｉｉ）高い商品原価；（ｉｉｉ）蔓延しているインフルエンザ株を完全には網羅できないこと；（ｉｖ）感染部位における低いバイオアベイラビリティ；及び（ｖ）薬剤耐性の出現リスクを挙げることができる。

シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、単一の抗原結合可変ドメインからなる抗体断片である。こうした断片には、従来のモノクローナル抗体と比べて、（ｉ）小さいサイズ（１５ｋＤａ）、（ｉｉ）低い微生物学的生産コスト、（ｉｉｉ）単純な操作で多重特異性フォーマットになる、（ｉｖ）安定性が高く、注射以外の投与経路に対応できる可能性がある、及び／又は（ｉｖ）埋もれた又は隠れたエピトープに到達できる可能性があることを含め、幾つかの利点がある。これらの有利な特性により、ｓｄＡｂは、特に感染症の分野でモノクローナル抗体に代わる魅力的な選択肢となっている。ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス、ＦＭＤＶ、ポリオウイルス及びロタウイルスを含め、幾つかの異なるウイルスに対するｓｄＡｂが文献に記載されている（Ｖａｎｌａｎｄｓｃｈｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

インフルエンザの中和能を有するＨＡ結合ｓｄＡｂも文献に記載されている。このように、Ｈｕｌｔｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）は、複数のＨ５Ｎ１ウイルスに対して中和活性を有するｓｄＡｂ（Ｉｎｆｌ−Ｃ８）を同定した。Ｉｎｆｌ−Ｃ８二量体及び三量体は、Ｈ５Ｎ１ウイルスに対する活性の向上及び広域化を示した。しかしながら、ＰＲ８（Ｈ１Ｎ１）又はＸ４７（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザウイルスの交差中和は観察されなかった。

国際公開第２００９／１４７２４８号パンフレットは、ＥＬＩＳＡでヘテロ亜型結合活性を示す幾つかのｓｄＡｂを開示している。しかしながら、これらのｓｄＡｂのいずれも、１つを除いてウイルス中和アッセイで活性を示さなかった。ＩＶ１４６と呼ばれるこの１つの中和ｓｄＡｂは、ＥＬＩＳＡで系統発生学的グループ１に限定された結合を示し、２つの異なるＨ５ウイルスの中和能を有した。

Ｔｉｌｌｉｂ ｅｔ ａｌ．（２０１３）は、Ｈ５Ｎ２株Ａ／マガモ／ペンシルベニア／１０２１８／８４に対してインビトロ及びインビボ中和活性を有する複数のｓｄＡｂを記載している。

Ｈｕｆｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５及び／又はＨ９ウイルスに対する亜型間交差中和活性を有する幾つかのｓｄＡｂを同定した。しかしながら、これらのｓｄＡｂのいずれもＨ７Ｎ２を中和することはできなかった。ｓｄＡｂのうちの１つを二量化すると、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５及びＨ９に対するその活性が改善したが、Ｈ７Ｎ２又はＨ３Ｎ２ウイルスの群間交差中和は得られなかった。

このように、これまで同定された単量体又は多量体ｓｄＡｂの中に、関連する全ての季節性（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２及びＢ）及び汎流行性（例えばＨ５Ｎ１及びＨ７Ｎ９）インフルエンザ株を中和可能なものは１つもない。Ａ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザウイルスによって引き起こされる呼吸器疾患が重症であること、及び季節的流行の経済的影響が大きく、且つ世界的流行のリスクが継続的に存在することを踏まえると、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスに対して広域の活性を有し、且つインフルエンザ感染の予防又は治療用医薬として用いることのできる有効な新規阻害薬が常に必要とされている。

本発明は、系統発生学的グループ２の２つの異なる亜型のＨＡを含む少なくとも２つのＡ型インフルエンザウイルス株のヘマグルチニン（ＨＡ）との特異的結合能を有するか；又は系統発生学的グループ１の少なくとも１つのＡ型インフルエンザ株及び系統発生学的グループ２の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株との特異的結合能を有するか；又は少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株のヘマグルチニン（ＨＡ）との特異的結合能を有する新規シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を提供する。特定の実施形態において、本ｓｄＡｂはまた、系統発生学的グループ２の２つのＨＡ異なる亜型を含む少なくとも２つの異なるＡ型インフルエンザウイルス株；又は系統発生学的グループ１の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株及び系統発生学的グループの少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株；又は少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株の中和能も有する。

本発明は、いわゆるマルチドメイン抗体、即ち、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つ、又は更により好ましくは少なくとも５つの本明細書に記載されるとおりのシングルドメイン抗体を含む結合分子を更に提供する。特定の実施形態において、マルチドメイン抗体は、系統発生学的グループ１の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株及び系統発生学的グループ２の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株の中和能を有する。特定の実施形態において、マルチドメイン抗体は、系統発生学的グループ１の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株及び系統発生学的グループ２の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株及び少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株、好ましくはＢ／山形系統の少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株及びＢ／ビクトリア系統の少なくとも１つのインフルエンザウイルス株の中和能を有する。特定の実施形態において、マルチドメイン抗体は、Ｈ１亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株など）、Ｈ３亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株など）、Ｈ５亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルス株など）、及びＨ７亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス（Ｈ７Ｎ９インフルエンザウイルス株など）、及び少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス、好ましくはＢ／山形系統の少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株及びＢ／ビクトリア系統の少なくとも１つのインフルエンザウイルス株の中和能を有する。

本発明は、ｓｄＡｂ又はマルチドメイン抗体をコードする核酸分子、並びに前記核酸分子を含むベクター及び宿主細胞を更に提供する。

本発明はまた、本明細書に記載されるとおりの１つ以上のｓｄＡｂ、マルチドメイン抗体、核酸分子及び／又はベクターを含む（医薬）組成物も提供する。

本発明によれば、新規インフルエンザヘマグルチニン結合分子が提供される。本結合分子はシングルドメイン抗体又はマルチドメイン抗体であってもよい。本発明の結合分子の少なくとも一部は、系統発生学的グループ間での交差中和性を有し、即ち、系統発生学的グループ１の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株及び系統発生学的グループ２の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株に結合してそれらを中和することが可能である点でユニークである。特定の実施形態において、本結合分子は、少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株、好ましくはＢ／山形系統の少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株及びＢ／ビクトリア系統の少なくとも１つのインフルエンザウイルス株との特異的結合能及びその中和能を有する。本発明の結合分子及び核酸配列は、更に原因となるインフルエンザ亜型と無関係に、インフルエンザ感染の診断用、予防用、及び／又は治療用薬剤としての使用に好適である。

ＥＬＩＳＡによるラマ＃３及び＃４の免疫応答の分析を示す。 Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＳＤ１０１６、ＳＤ１０３８及びＳＤ１０４５のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．５ｍｇ／ｋｇ ｓｄＡｂで治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／香港／１／１９６８−ＭＡ（Ｈ３Ｎ２）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＳＤ１０３６、ＳＤ１０４６及びＳＤ１０４８のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に５又は０．５ｍｇ／ｋｇ ｓｄＡｂで治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ｂ／フロリダ／４／２００６ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＳＤ１０８３及びＳＤ１０８４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に５又は０．５ｍｇ／ｋｇ ｓｄＡｂで治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＳＤ１０３８、ＭＤ１２１１、ＭＤ１２１２又はＳＤ１０３８とＳＤ１０３６との１：１混合物のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）にシングル又はマルチドメイン抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／香港／１／１９６８−ＭＡ（Ｈ３Ｎ２）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＳＤ１０３６、ＭＤ１２１１、ＭＤ１２１２又はＳＤ１０３６とＳＤ１０３８との１：１混合物のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）にシングル又はマルチドメイン抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／香港／１／１９６８−ＭＡ（Ｈ３Ｎ２）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＳＤ１０３８及びＭＤ１２１２のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に５、１．７、０．６又は０．２ｍｇ／ｋｇシングル又はマルチドメイン抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／香港／１／１９６８−ＭＡ（Ｈ３Ｎ２）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＳＤ１０３８及びＭＤ１２１２のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に５、１．７、０．６又は０．２ｍｇ／ｋｇシングル又はマルチドメイン抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ｂ／フロリダ／４／２００６ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ１２２１、ＭＤ１２２２及びＭＤ１２２４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に５又は０．５ｍｇ／ｋｇマルチドメイン抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ１３０１、ＭＤ２６０１及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に３ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ１３０１、ＭＤ２６０１及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．２、０．０５又は０．０１ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ１３０１、ＭＤ２６０１及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．２、０．０５又は０．０１ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ１３０１、ＭＤ２６０１及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．２、０．０５又は０．０１ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ２６１７のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）にＭＤ２６１７で鼻腔内治療（上）又は静脈内治療（下）したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ２６１７のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）にＭＤ２６１７で鼻腔内治療（上）又は静脈内治療（下）したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ｂ／フロリダ／４／２００６（上）又はＡ／香港／１／１９６８−ＭＡ（下）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ２６１７及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に（マルチドメイン）抗体で鼻腔内治療又は静脈内治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ｂ／フロリダ／４／２００６（上）又はＡ／香港／１／１９６８−ＭＡ（下）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ２６１７及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に（マルチドメイン）抗体で鼻腔内治療又は静脈内治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ｂ／フロリダ／４／２００６ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ２４０７、ＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．０２、０．１又は０．５ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ｂ／フロリダ／４／２００６ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ２４０７、ＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．０２、０．１又は０．５ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ｂ／フロリダ／４／２００６ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ２４０７、ＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．０２、０．１又は０．５ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ｂ／フロリダ／４／２００６ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．２、１又は５ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ｂ／フロリダ／４／２００６ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．２、１又は５ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ｂ／フロリダ／４／２００６ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ２４０７、ＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．０２、０．１又は０．５ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ｂ／フロリダ／４／２００６ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ２４０７、ＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．０２、０．１又は０．５ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ｂ／フロリダ／４／２００６ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ２４０７、ＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．０２、０．１又は０．５ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／香港／１／１９６８−ＭＡ（Ｈ３Ｎ２）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．６、１．７又は５ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／香港／１／１９６８−ＭＡ（Ｈ３Ｎ２）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．６、１．７又は５ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ２４０７、ＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．０１、０．０５又は０．２５ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ２４０７、ＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．０１、０．０５又は０．２５ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ２４０７、ＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．０１、０．０５又は０．２５ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．６、１．７又は５ｍｇ／ｋｇ（シングルドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．６、１．７又は５ｍｇ／ｋｇ（シングルドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。

定義
本発明において用いられるとおりの用語の一部の定義を以下に示す。

用語「結合分子」は、本明細書で使用されるとき、本発明に係るシングルドメイン抗体（単量体結合分子）及びマルチドメイン抗体（多量体結合分子）の両方を指す。

本明細書で使用されるとき、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、他のＶ領域又はＶドメインとは独立に抗原又はエピトープと特異的に結合する単一の単量体可変抗体ドメインからなる結合分子である。シングルドメイン抗体は当該技術分野において公知であり、通常、天然に存在する「重鎖単独」抗体、即ち軽鎖を欠く重鎖抗体に由来する。かかる重鎖単独抗体は、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）種、例えば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、又はアルパカから得ることができる（ラクダ科動物抗体とも称される）。前記重鎖単独抗体に由来する可変領域は、概してＶＨＨドメイン又はシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）として知られている。シングルドメイン抗体は、本明細書で使用されるとき、２本の重鎖と２本の軽鎖とを含む従来の免疫グロブリンから単離された単一の可変ドメイン（ＶＬ又はＶＨ）も指す。この免疫グロブリンは、好ましくはヒトであるが、げっ歯類を含めた他の哺乳類種の免疫グロブリンも含み得る。

本明細書で使用されるとき、用語「マルチドメイン抗体」は、互いに直接、或いは連結配列によって連結した少なくとも２つのシングルドメイン抗体を含む結合分子を指す。

Ａ型インフルエンザウイルスに関して用語「インフルエンザウイルス亜型」は、ヘマグルチニン（Ｈ）及びノイラミニダーゼ（Ｎ）ウイルス表面タンパク質の様々な組み合わせによって特徴付けられるＡ型インフルエンザウイルス株を指す。Ａ型インフルエンザウイルス亜型は、例えば「Ｈ１又はＨ３亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス」、又は「Ｈ１インフルエンザウイルス」「Ｈ３インフルエンザウイルス」など、そのＨ番号によるか、又は例えば「インフルエンザウイルス亜型「Ｈ３Ｎ２」又は「Ｈ５Ｎ１」など、Ｈ番号とＮ番号との組み合わせによって参照され得る。用語インフルエンザウイルス「亜型」は、具体的には、通常突然変異に起因する、異なる病原プロファイルを示すかかる亜型の範囲内にある個々のインフルエンザウイルス「株」を全て含み、自然分離株並びに人工の突然変異体又はリアソータントなどを含む。かかる株はまた、ウイルス亜型の様々な「分離株」とも称され得る。従って、本明細書で使用されるとき、用語「株」と「分離株」とは同義的に用いられ得る。

Ａ型インフルエンザウイルス亜型は、その系統発生学的グループを参照して更に分類することができる。系統発生解析から、インフルエンザヘマグルチニンは２つの主要なグループ、特に系統発生学的グループ１（「グループ１」インフルエンザウイルス）のＨ１、Ｈ２、Ｈ５及びＨ９亜型と、特に系統発生学的グループ２（「グループ２」インフルエンザウイルス）のＨ３、Ｈ４、Ｈ７及びＨ１０亜型とに細分化されることが示されている。

インフルエンザＢ型ウイルス株内のＨＡの抗原変異は、Ａ型株内で観察されるものより小さい。ヒトでは、Ｂ／山形／１６／８８系統（Ｂ／山形系統とも称される）及びＢ／ビクトリア／２／８７（Ｂ／ビクトリア）系統によって表されるとおりの、２つの遺伝的及び抗原的に異なる亜型、即ち「系統」のＢ型インフルエンザウイルスが出回っている。本明細書で使用されるとき、Ｂ型インフルエンザウイルス株は、「Ｂ／山形系統」又は「Ｂ／ビクトリア系統」に由来するインフルエンザウイルス株を参照する。

用語「中和する」は、本発明の結合分子に関連して本明細書で使用されるとき、中和が達成される機構に関わらず、インビトロで、及び／又は対象体内のインビボでインフルエンザウイルスの複製を阻害する結合分子を指す。従って、中和は、例えば、細胞表面へのウイルスの付着又は接着の阻害によるか、又はウイルスが標的細胞に付着した後のウイルス膜と細胞膜との融合の阻害によるか、又は感染細胞からのウイルスの放出の阻害によるなどして達成され得る。用語「交差中和する」又は「交差中和」は、本発明の結合分子に関連して本明細書で使用されるとき、本発明の結合分子が異なる亜型のＡ型及び／又はＢ型インフルエンザウイルスを中和する能力を指す。

本発明の結合分子に関して、用語「（免疫）特異的に結合する」は、目的のタンパク質のエピトープに結合するが、抗原性生体分子の混合物を含有する試料中の他の分子は実質的に認識及び結合しない結合分子を指す。結合は、共有結合性又は非共有結合性の相互作用又は両方の組み合わせによって媒介され得る。

本明細書で使用されるとき、用語「インフルエンザ」、又は「インフルエンザウイルス疾患」は、Ａ型又はＢ型インフルエンザウイルスによる細胞又は対象の感染によって起こる病的状態を指す。具体的な実施形態において、この用語は、Ａ型又はＢ型インフルエンザウイルスによって引き起こされる呼吸器疾患を指す。本明細書で使用されるとき、用語「インフルエンザウイルス感染」は、細胞又は対象におけるインフルエンザウイルスの侵入、増殖及び／又は存在を意味する。

図の詳細な説明
本発明の第１の態様において、系統発生学的グループ２の２つの異なる亜型のＨＡを含む少なくとも２つのＡ型インフルエンザウイルス株のヘマグルチニン（ＨＡ）との特異的結合能を有する新規シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、即ち、少なくとも２つの異なるＡ型インフルエンザウイルス株であって、系統発生学的グループ２の２つの異なるＨＡ亜型のＨＡを含む株のヘマグルチニン（ＨＡ）との特異的結合能を有するｓｄＡｂが提供される。加えて、系統発生学的グループ１の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株のＨＡとの結合能及び系統発生学的グループ２の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株のＨＡとの結合能を有するｓｄＡｂが提供される。更には、少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株のＨＡとの特異的結合能を有するｓｄＡｂが提供される。系統発生学的グループ２のＡ型インフルエンザウイルス株の２つの異なる亜型のＨＡとの特異的結合能を有するか、又は系統発生学的グループ１（Ｈ１、Ｈ２、及び／又はＨ５亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルスなど）と系統発生学的グループ２（Ｈ３、Ｈ７及び／又はＨ１０亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルスなど）との両方のＡ型インフルエンザウイルス株のＨＡとの結合能を有するシングルドメイン抗体については、これまで記載されたことがない。加えて、Ｂ型インフルエンザウイルスのＨＡとの特異的結合能を有するｓｄＡｂについても依然として記載されたことがない。

本発明のｓｄＡｂは、ＨＡの保存された中和エピトープに結合する。特定の実施形態において、本ｓｄＡｂは、Ａ型又はＢ型インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質の茎部領域にあるエピトープに結合する。他の実施形態において、本ｓｄＡｂは、ＨＡタンパク質の頭部領域にあるエピトープに結合する。特定の実施形態において、本ｓｄＡｂは、Ｂ型インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質の頭部領域にあるエピトープに結合する。

特定の好ましい実施形態において、本ｓｄＡｂはまた、系統発生学的グループ２の２つの異なる亜型のＨＡを含む少なくとも２つのＡ型インフルエンザウイルス株の中和能も有する。特定の実施形態において、本ｓｄＡｂは、系統発生学的グループ１の好ましくは少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株（例えばＨ１又はＨ５亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルスなど）及び系統発生学的グループ２の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株（例えばＨ３又はＨ７亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルスなど）；又は少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株、好ましくはＢ／山形系統の少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株及びＢ／ビクトリア系統の少なくとも１つのインフルエンザウイルス株の中和能を有する。

特定の実施形態において、本発明に係るシングルドメイン抗体は、ラクダ科動物ＶＨＨドメイン、即ち、いわゆるラクダ科動物（重鎖単独）抗体の可変ドメインである。更なる実施形態において、本シングルドメイン抗体はヒト化ラクダ科動物ＶＨＨドメインである。ラクダ科動物シングルドメイン抗体のヒト化には、単一のポリペプチド鎖における限られた量のアミノ酸の導入及び突然変異誘発が必要である。これは、２本の鎖、軽鎖及び重鎖におけるアミノ酸変化の導入並びに両鎖のアセンブリの維持が必要なｓｃＦｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２及びＩｇＧのヒト化と対照的である。ラクダ科動物ＶＨＨドメインのヒト化方法については、例えば、国際公開第２００８／０２００７９号パンフレット、国際公開第２００８／１４２１６４号パンフレット、国際公開第２０１０／１３９８０８号パンフレットに記載されているように、当該技術分野において公知である。本発明に係るｓｄＡｂのヒト化は実施例１１に記載する。

特定の実施形態において、本発明のシングルドメイン抗体は、
配列番号２２７、２２８及び２２９から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２３０、２３１及び２３２から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２３３、２３４及び２３５から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２３６、２３７及び２３８から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２３９、２４０及び２４１から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２４２、２４３及び２４４から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２４５、２４６及び２４７から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２４８、２４９、及び２５０から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２５１、２５２及び２５３から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２５４、２５５及び２５６から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２５７、２５８及び２５９から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２６０、２６１及び２６２から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２６３、２６４及び２６５から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２６６、２６７及び２６８から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２６９、２７０及び２７１から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２７２、２７３及び２７４から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２７５、２７６及び２７７から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２７８、２７９及び２８０から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２８１、２８２及び２８３から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２８４、２８５及び２８６から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２８７、２８８及び２８９から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２９０、２９１及び２９２から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２９３、１２２及び１２３から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号１２４、１２５及び１２６から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号１２７、１２８及び１２９から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号１３０、１３１及び１３２から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号１３３、１３４及び１３５から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号１３６、１３７及び１３８から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；又は
配列番号１３９、１４０及び１４１から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上
を含む。

用語「相補性決定領域」（ＣＤＲ）は、本明細書で使用されるとき、結合分子の可変領域内の配列であって、抗原上の認識されるエピトープと形状及び電荷分布が相補的な抗原結合部位に通常大きく寄与する配列を意味する。ＣＤＲ領域は、タンパク質上にその天然の立体構造で存在するとおりの、或いは場合によってはタンパク質上に例えばＳＤＳ中での可溶化によって変性したものとして存在するとおりの、タンパク質又はタンパク質断片の線状エピトープ、不連続エピトープ、又は立体エピトープに特異的であり得る。

特定の実施形態において、本シングルドメイン抗体は、
ａ）配列番号２２７のＣＤＲ１領域、配列番号２２８のＣＤＲ２領域、及び配列番号２２９のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｂ）配列番号２３０のＣＤＲ１領域、配列番号２３１のＣＤＲ２領域、及び配列番号２３２のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｃ）配列番号２３３のＣＤＲ１領域、配列番号２３４のＣＤＲ２領域、及び配列番号２３５のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｄ）配列番号２３６のＣＤＲ１領域、配列番号２３７のＣＤＲ２領域、及び配列番号２３８のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｅ）配列番号２３９のＣＤＲ１領域、配列番号２４０のＣＤＲ２領域、及び配列番号２４１のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｆ）配列番号２４２のＣＤＲ１領域、配列番号２４３のＣＤＲ２領域及び配列番号２４４のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｇ）配列番号２４５のＣＤＲ１領域、配列番号２４５のＣＤＲ２領域、及び配列番号２４７のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｈ）配列番号２４８のＣＤＲ１領域、配列番号２４９のＣＤＲ２領域、及び配列番号２５０のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｉ）配列番号２５１のＣＤＲ１領域、配列番号２５２のＣＤＲ２領域、及び配列番号２５３のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｊ）配列番号２５４のＣＤＲ１領域、配列番号２５５のＣＤＲ２領域、及び配列番号２５６のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｋ）配列番号２５７のＣＤＲ１領域、配列番号２５８のＣＤＲ２領域、及び配列番号２５９のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｌ）配列番号２６０のＣＤＲ１領域、配列番号２６１のＣＤＲ２領域及び配列番号２６２のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｍ）配列番号２６３のＣＤＲ１領域、配列番号２６４のＣＤＲ２領域、及び配列番号２６５のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｎ）配列番号２６６のＣＤＲ１領域、配列番号２６７のＣＤＲ２領域、及び配列番号２６８のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｏ）配列番号２６９のＣＤＲ１領域、配列番号２７０のＣＤＲ２領域、及び配列番号２７１のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｐ）配列番号２７２のＣＤＲ１領域、配列番号２７３のＣＤＲ２領域、及び配列番号２７４のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｑ）配列番号２７５のＣＤＲ１領域、配列番号２７６のＣＤＲ２領域、及び配列番号２７７のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｒ）配列番号２７８のＣＤＲ１領域、配列番号２７９のＣＤＲ２領域及び配列番号２８０のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｓ）配列番号２８１のＣＤＲ１領域、配列番号２８２のＣＤＲ２領域、及び配列番号２８３のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｔ）配列番号２８４のＣＤＲ１領域、配列番号２８５のＣＤＲ２領域、及び配列番号２８６のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｕ）配列番号２８７のＣＤＲ１領域、配列番号２８８のＣＤＲ２領域、及び配列番号２８９のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｖ）配列番号２９０のＣＤＲ１領域、配列番号２９１のＣＤＲ２領域、及び配列番号２９２のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｗ）配列番号２９３のＣＤＲ１領域、配列番号１２２のＣＤＲ２領域、及び配列番号１２３のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｘ）配列番号１２４のＣＤＲ１領域、配列番号１２５のＣＤＲ２領域及び配列番号１２６のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｙ）配列番号１２７のＣＤＲ１領域、配列番号１２８のＣＤＲ２領域、及び配列番号１２９のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｚ）配列番号１３０のＣＤＲ１領域、配列番号１３１のＣＤＲ２領域、及び配列番号１３２のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ａａ）配列番号１３３のＣＤＲ１領域、配列番号１３４のＣＤＲ２領域、及び配列番号１３５のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｂｂ）配列番号１３６のＣＤＲ１領域、配列番号１３７のＣＤＲ２領域、及び配列番号１３８のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；及び
ｃｃ）配列番号１３９のＣＤＲ１領域、配列番号１４０のＣＤＲ２領域、及び配列番号１４１のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体
からなる群から選択される。

特定の好ましい実施形態において、シングルドメイン抗体は、
ａ）配列番号２７５のＣＤＲ１領域、配列番号２７６のＣＤＲ２領域、及び配列番号２７７のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｂ）配列番号２８４のＣＤＲ１領域、配列番号２８５のＣＤＲ２領域、及び配列番号２８６のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｃ）配列番号１２４のＣＤＲ１領域、配列番号１２５のＣＤＲ２領域及び配列番号１２６のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｄ）配列番号１２７のＣＤＲ１領域、配列番号１２８のＣＤＲ２領域、及び配列番号１２９のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｅ）配列番号２６３のＣＤＲ１領域、配列番号２６４のＣＤＲ２領域、及び配列番号２６５のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；及び
ｆ）配列番号１３３のＣＤＲ１領域、配列番号１３４のＣＤＲ２領域、及び配列番号１３５のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体
からなる群から選択される。

更なる実施形態によれば、本発明に係るシングルドメイン抗体は、配列番号１〜２９からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は相同アミノ酸配列を含む。本明細書で使用されるとき、本発明の相同アミノ酸配列は、本発明の結合分子の機能的特性を実質的に変化させることのない、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換を含み得る。相同配列が配列同一性を指示する場合、それは、親配列と高い配列同一性（７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％超の配列同一性）を呈する配列を意味する。

特定の実施形態において、本明細書に記載されるアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸は突然変異していてもよく、即ち別のアミノ酸に置換されていてもよい。かかる突然変異が導入されることにより、翻訳後修飾の発生を防止し得る。最も一般的な修飾としては、タンパク質分解、グリコシル化、メチオニンの酸化、並びにアスパラギン及びグルタミン残基のアミド分解が挙げられる。他の修飾としては、ピログルタミン酸形成、アスパラギン酸異性化及びトリプトファン酸化が挙げられる。以下のアミノ酸残基及び配列モチーフが翻訳後修飾を受け易く、従って部位特異的突然変異誘発によって変化させてもよい：Ｎ末端グルタミン酸又はグルタミン、Ｎ−グリコシル化モチーフＡｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、溶媒に露出しているメチオニン又はトリプトファン残基、タンパク質分解切断部位Ａｓｐ−Ｐｒｏ、アミド分解モチーフＡｓｎ−Ｇｌｙ及びＧｌｎ−Ｇｌｙ及び／又はＡｓｐ異性化モチーフＡｓｐ−Ｇｌｙ。

特定の実施形態において、本発明のｓｄＡｂはヒト化されている。従って、特定の実施形態において、本ｓｄＡｂは、配列番号１４６〜２２６及び３４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態において、本発明に係るシングルドメイン抗体は、配列番号１３（又は配列番号１７７〜１８７及び配列番号３４０からなる群から選択されるそのヒト化変異体）；配列番号１７（又は配列番号１４６〜１５６からなる群から選択されるそのヒト化変異体）；配列番号２０（又は配列番号１５７〜１７６からなる群から選択されるそのヒト化変異体）；配列番号２４（又は配列番号１８８〜１９７からなる群から選択されるそのヒト化変異体）；配列番号２５（又は配列番号１９８〜２０３からなる群から選択されるそのヒト化変異体）；及び配列番号２７（又は配列番号２０４〜２２６からなる群から選択されるそのヒト化変異体）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態において、本シングルドメイン抗体は、配列番号１８７、配列番号３４０、配列番号１５５、配列番号１７６、配列番号１９７、配列番号２０３及び配列番号２２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

本発明の第２の態様によれば、いわゆるマルチドメイン抗体、即ち上記に記載したとおりのシングルドメイン抗体を少なくとも２つ含む結合分子が提供される。例えば、第１のシングルドメイン抗体のＣ端側末端が次のシングルドメイン抗体のＮ端側末端に連結されて、二量体結合分子を形成し得る。特定の実施形態において、本マルチドメイン抗体は、上記に記載したとおりのシングルドメイン抗体を少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つ含んで、三量体、四量体、五量体などの多量体を形成する。連結されるｓｄＡｂは同じであってもよく、又は異なるｓｄＡｂ、即ち、異なるアミノ酸配列及びエピトープ特異性を有するｓｄＡｂであってもよい。

特定の実施形態において、本マルチドメイン抗体は単鎖分子である。特定の実施形態において、本マルチドメイン抗体は２本鎖分子であり、即ち、各々が少なくとも１つのシングルドメイン抗体を含む少なくとも２本の鎖を含む。これらの２本の鎖は同一であってもよく、又は異なってもよい。

シングルドメイン抗体は、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて連結され、本明細書に開示される任意のマルチドメイン抗体を形成し得る。従って、シングルドメイン抗体は化学的連結によって連結されてもよく、又は互いに直接連結されても、或いはショートポリペプチドリンカーによって連結されてもよい。かかるリンカー配列は、天然に存在する配列又は天然に存在しない配列であってもよい。リンカー配列は好ましくは、マルチドメイン抗体に十分な可動性をもたらすと同時に、タンパク質分解に耐性を示す。

特定の実施形態において、少なくとも２つのシングルドメイン抗体がペプチドリンカーを介して遺伝的に融合される。従って、シングルドメイン抗体は、完全なポリペプチドコンストラクト、即ち２つ以上のシングルドメイン抗体を含む結合分子をコードするポリヌクレオチドコンストラクト（又は核酸配列）を形成することにより、ＤＮＡレベルで遺伝的に融合される。

特定の実施形態において、少なくとも２つのシングルドメイン抗体が、１〜１００アミノ酸、好ましくは１〜８０アミノ酸、又は１〜６０アミノ酸、又は１０〜６０アミノ酸を含む連結配列によって連結される。リンカーの例としては、限定はされないが、表１５の連結配列が挙げられる。従って、特定の実施形態において連結配列は、配列番号１４２〜１４５から選択されるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態において、本マルチドメイン抗体は、少なくとも２つの本発明に係るｓｄＡｂを含む。少なくとも２つのｓｄＡｂは、表１４及び／又は表４０から選択され得る。特定の実施形態において、少なくとも２つのｓｄＡｂは、配列番号１〜２９及び配列番号１４６〜２２６からなる群から選択される。これらの少なくとも２つのｓｄＡｂは同じであってもよく（ホモ多量体）、又は異なってもよい（ヘテロ多量体）。

特定の実施形態において、本マルチドメイン抗体は、
ａ）配列番号２７５のＣＤＲ１領域、配列番号２７６のＣＤＲ２領域、及び配列番号２７７のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｂ）配列番号２８４のＣＤＲ１領域、配列番号２８５のＣＤＲ２領域、及び配列番号２８６のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｃ）配列番号１２４のＣＤＲ１領域、配列番号１２５のＣＤＲ２領域及び配列番号１２６のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｄ）配列番号１２７のＣＤＲ１領域、配列番号１２８のＣＤＲ２領域、及び配列番号１２９のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｅ）配列番号２６３のＣＤＲ１領域、配列番号２６４のＣＤＲ２領域、及び配列番号２６５のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；及び
ｆ）配列番号１３３のＣＤＲ１領域、配列番号１３４のＣＤＲ２領域、及び配列番号１３５のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体
からなる群から選択される少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つのｓｄＡｂを含む。

特定の実施形態において、本発明に係るマルチドメイン抗体は、配列番号１３（又は配列番号１７７〜１８７及び配列番号３４０からなる群から選択されるそのヒト化変異体）；配列番号１７（又は配列番号１４６〜１５６からなる群から選択されるそのヒト化変異体）；配列番号２０（又は配列番号１５７〜１７６からなる群から選択されるそのヒト化変異体）；配列番号２４（又は配列番号１８８〜１７７からなる群から選択されるそのヒト化変異体）；配列番号２５（又は配列番号１９８〜２０３からなる群から選択されるそのヒト化変異体）；及び配列番号２７（又は配列番号２０４〜２２６からなる群から選択されるそのヒト化変異体）からなる群から選択される少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つのｓｄＡｂを含む。

特定の実施形態において、本発明に係るマルチドメイン抗体は、配列番号３０〜７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態において、本発明のマルチドメイン抗体は、系統発生学的グループ１の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株（例えばＨ１及び／又はＨ５亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルスなど）及び系統発生学的グループ２の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株（例えばＨ３及び／又はＨ７亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルスなど）の中和能を有する。特定の実施形態において、本発明のマルチドメイン抗体は、系統発生学的グループ１の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株（例えばＨ１及び／又はＨ５亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルスなど）及び系統発生学的グループ２の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株（例えばＨ３及び／又はＨ７亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルスなど）及び少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株、好ましくはＢ／山形系統の少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株及びＢ／ビクトリア系統の少なくとも１つのインフルエンザウイルス株の中和能を有する。

特定の実施形態において、本マルチドメイン抗体は、Ｈ１亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株など）、Ｈ３亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株など）、Ｈ５亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルス株など）、Ｈ７亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス（Ｈ７Ｎ９インフルエンザウイルス株など）、及び少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス、好ましくはＢ／山形系統の少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株及びＢ／ビクトリア系統の少なくとも１つのインフルエンザウイルス株の中和能を有する。従って、本発明のマルチドメイン抗体は、好適には、更に原因となるインフルエンザ亜型と無関係に、インフルエンザ感染の予防及び／又は治療に使用することができる。

本発明によれば、本発明の交差中和マルチドメイン抗体は、他の小型及び大型抗インフルエンザ分子と比べて幾つかの利点を提供することが示されている。従って、本マルチドメイン抗体の親和性及び効力、並びに中和範囲は、例えばＣＲ９１１４（国際公開第２０１３／００７７７０号パンフレット）及びＦＩ６ｖ３（Ｃｏｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１）など、インフルエンザＨＡを標的化する既発表の広域中和Ａｂ（ｂｎＡｂ）の親和性、効力及び中和範囲より優れている。加えて、複数の独立した中和エピトープを標的化することによる本マルチドメイン抗体は、ＣＲ９１１４及びＦＩ６ｖ３と比べて薬物耐性インフルエンザ株が生じにくい。

従って、本明細書に記載されるとおり、本発明は、新規インフルエンザ結合及び交差中和結合分子を提供する。本結合分子は、単量体、即ちシングルドメイン抗体であってもよく、又は多量体、即ちマルチドメイン抗体であってもよい。本発明の結合分子はその標的に高い親和性及び特異性で結合する。これは、高頻度でオフターゲット結合を示して望ましくない副作用を生じる抗ウイルス薬などの小分子薬物と対照的である。加えて、本発明の結合分子は多様なＨＡエピトープに結合し、その一部は従来の抗体が到達できないものである。インフルエンザＨＡは頭部領域及び茎部領域の両方に複数のグリコシル化部位を含有する。これらの部位に結合した炭水化物により、ＨＡ分子上の一部が従来の抗体には到達不可能となっている。本発明の結合分子はより小さく、これらの機能上重要である可能性のあるエピトープをなおも標的化することが可能である。加えて、本発明の結合分子は広範囲にわたる極限条件下で安定している。本結合分子は典型的には高温（最高１００℃）、極端なｐＨ、変性剤及びタンパク質分解に耐性がある。本結合分子の有利な安定性は、コールドチェーン外に保管し得ると共に、モノクローナル抗体などの他のタンパク質薬物と比べて貯蔵寿命がより長い製品をもたらし得る。更には、本発明の結合分子は、全て１つの単一工程に従い作製及び精製することのできる単一のタンパク質である。

典型的には、本発明に係る結合分子は、グループ１のＡ型インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１など）及び／又はグループ２のＡ型インフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２など）、及び／又はＢ型インフルエンザウイルスのＨＡ、及び／又はそれらの断片に、１．０×１０^−６Ｍ、１．０×１０^−７Ｍ未満、好ましくは１．０×１０^−８Ｍ未満、より好ましくは１．０×１０^−９Ｍ未満の親和性定数（Ｋｄ値）で結合する。親和性定数は、例えば、表面プラズモン共鳴を用いて、例えばＢＩＡＣＯＲＥシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、又は実施例８に記載されるとおり計測することができる。

特定の実施形態において、本結合分子はＡ型及び／又はＢ型インフルエンザウイルスに対する中和活性を呈する。特定の実施形態において、本発明の結合分子は、宿主細胞のＡ型又はＢ型インフルエンザウイルス感染を、前記結合分子の非存在下での宿主細胞の前記インフルエンザウイルス感染と比べて少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、又は少なくとも１０％妨げる。中和活性は、例えば、本明細書に記載されるとおり計測することができる。中和活性を計測する代替的なアッセイが、例えば、ＷＨＯ Ｍａｎｕａｌ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ，Ｇｅｎｅｖａ：Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ，２００５，ｖｅｒｓｉｏｎ ２００２．５に記載されている。典型的には、本発明に係る結合分子は、例えば実施例に記載されるとおりのインビトロウイルス中和アッセイ（ＶＮＡ）で決定するとき、１０００ｎＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下の中和活性、より好ましくは１０ｎＭ以下、更により好ましくは１ｎＭ以下の中和活性を有する。

特定の実施形態において、本結合分子（即ちシングルドメイン抗体又はマルチドメイン抗体）はＦｃテールを更に含む。従って、特定の実施形態において、上記に記載されるとおりの結合分子は、抗体、好ましくはヒト抗体のＦｃ断片、例えば、ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ断片、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又はＩｇＧ４に連結されている。本発明によれば、本明細書に記載されるとおりの単量体又は多量体結合分子は、直接、或いはリンカーを用いてＦｃ断片と遺伝的に融合させてもよい。特定の実施形態において、本結合分子は、１〜１００アミノ酸、好ましくは１〜８０アミノ酸、又は１〜６０アミノ酸、又は１０〜６０アミノ酸を含む連結配列によってＦｃ断片に連結している。リンカーの例としては、限定はされないが、表１５の連結配列が挙げられる。従って、特定の実施形態において、連結配列は、配列番号１４２〜１４５から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ｓｄＡｂ又はマルチドメイン抗体はＦｃ断片のＣ末端に遺伝的に融合している。更なる実施形態において、シングルドメイン抗体又はマルチドメイン抗体はＦｃ断片のＮ末端及びＣ末端の両方に融合している。

特定の実施形態において、Ｆｃ断片は、最小限のエフェクター機能を有するように改変される。最小限のエフェクター機能及び保存された半減期を有するＦｃ断片については当該技術分野において記載されており、例えば、ＩｇＧ２、脱グリコシル化ＩｇＧ１（ＩｇＧ１ ａｇｌｙ）、Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換を有するＩｇＧ４（ＩｇＧ４ ＰｒｏＡｌａＡｌａ）、Ｈ２６８Ｑ／３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変化を有するＩｇＧ２（ＩｇＧ２ｍ４）及びＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ置換を含有するＩｇＧ２σと呼ばれるＩｇＧ２のＦｃ変異体が挙げられる。突然変異型のＩｇＧ４に関しては、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２４５Ａ置換によってＦｃγＲに対する特異的親和性が除かれている。

特定の実施形態において、Ｆｃ断片は、増強されたエフェクター機能を有するように改変される。従って本発明の結合分子は、Ｆｃ媒介エフェクター機能が増強されるように改変することができ、これは、インフルエンザ感染症の前臨床モデルにおいて、薬物の有効性に寄与することが示されている。エフェクター機能の増強に関連するヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインにおける幾つかの突然変異が、当該技術分野において記載されている。これらの突然変異としては、限定はされないが、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの両方を増加させる３３３位のアラニン突然変異体、ＦｃγＲＩＩＩａに対する高い親和性及びＦｃγＲＩＩｂに対する低い親和性によりＡＤＣＣの増強をもたらす三重突然変異体（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ）、及び向上したＦｃγＲＩＩＩａ親和性及び食作用の増強を媒介するＦｃγＲＩＩａ／ＦｃγＲＩＩｂ比を有する別の三重突然変異体（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｇ２３６Ａ）が挙げられる。エフェクター機能に影響を及ぼす他のＦｃ突然変異が、文献、例えばＳｔｒｏｈｌ，２００９に記載されている。特定の実施形態において、Ｆｃ断片は、長い血清中半減期を有するように改変される。血清中半減期の増加を伴う幾つかの改変Ｆｃ骨格が当該技術分野において公知である。これらのＦｃ変異体としては、限定はされないが、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（ＹＴＥ）突然変異を有するｈＩｇＧ１ Ｆｃ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ突然変異（ＱＬ）を有するｈＩｇＧ１又はｈＩｇＧ２ Ｆｃ、Ｎ４３４Ａ突然変異を有するｈＩｇＧ１ Ｆｃ、Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ突然変異（ＡＡＡ）を有するｈＩｇＧ１ Ｆｃ又はＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ（ＬＳ）置換を有するｈＩｇＧ１ Ｆｃが挙げられる（Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．、２０１１）。更なる実施形態において、本結合分子（即ち本発明に係るシングルドメイン抗体又はマルチドメイン抗体）は、ヒト血清アルブミン又は血清アルブミンに結合するシングルドメイン抗体に遺伝的に融合している。他の実施形態において、本発明に係るシングルドメイン抗体又はマルチドメイン抗体はＰＥＧに化学的にコンジュゲートしている。従って本発明の結合分子は、例えば僅か数時間〜数週間又は更には数ヵ月の範囲の血清中半減期を有するように改変することができる。これは、現在オセルタミビル及びザナミビルなどのノイラミニダーゼ阻害薬で用いられているとおりの１日２回レジメンに代わる、インフルエンザ感染の単回投与治療の可能性を開く。

更なる実施形態において、上記に記載したとおりのシングルドメイン抗体又はマルチドメイン抗体は、Ｆｃテール、好ましくはヘテロ二量体Ｆｃ分子の形成を促進するように改変されたＦｃテールに融合されてもよい。Ｆｃヘテロ二量体化を促進する突然変異については、当該技術分野において記載されている（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。特定の実施形態において、ＦＣヘテロ二量体化を促進する突然変異は、欧州特許第０８１２３５７Ｂ１号明細書及び欧州特許第０９７９２８１Ｂ１号明細書に記載されるとおりのノブ・イントゥ・ホール突然変異である。

特定の実施形態において、本発明に係るマルチドメイン抗体は、配列番号７４〜１０７、配列番号１１０〜１２１及び配列番号２９３〜３３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１本の鎖を含む。

特定の実施形態において、本マルチドメイン抗体は２本の鎖を含み、これらの２本の鎖のアミノ酸配列は同一である。特定の実施形態において、これらの２本の鎖は、配列番号７４〜１０５及び配列番号２９３〜２９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、これらの２本のアミノ酸鎖は配列番号２９３〜２９８のアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態において、マルチドメイン抗体は２本の異なるアミノ酸鎖を含む。特定の実施形態において、これらの２本の異なるアミノ酸鎖は、
配列番号２９９のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３００のアミノ酸配列を含む１本の鎖；
配列番号３０１のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３０２のアミノ酸配列を含む１本の鎖；
配列番号３０３のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３０５のアミノ酸配列を含む１本の鎖；
配列番号３０６のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３０７のアミノ酸配列を含む１本の鎖；
配列番号３０８のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む１本の鎖；
配列番号３１０のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３１１のアミノ酸配列を含む１本の鎖；
配列番号３１２のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３１３のアミノ酸配列を含む１本の鎖；
配列番号３１５のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３１５のアミノ酸配列を含む１本の鎖；
配列番号３１６のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３１７のアミノ酸配列を含む１本の鎖；
配列番号３１８のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３１９のアミノ酸配列を含む１本の鎖；
配列番号１０６のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３１７のアミノ酸配列を含む１本の鎖；
配列番号３２０のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３２１のアミノ酸配列を含む１本の鎖；
配列番号３２２のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３２３のアミノ酸配列を含む１本の鎖；
配列番号３２４のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３２５のアミノ酸配列を含む１本の鎖；
配列番号３２６のアミノ酸配列を含む１本の鎖、配列番号３２７のアミノ酸配列を含む１本の鎖；
配列番号３２８のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３２９のアミノ酸配列を含む１本の鎖；
配列番号３３０のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３３１のアミノ酸配列を含む１本の鎖；
配列番号３３２のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３３３のアミノ酸配列を含む１本の鎖；
配列番号３３４のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３３５のアミノ酸配列を含む１本の鎖；
配列番号３３６のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３３７のアミノ酸配列を含む１本の鎖；及び
配列番号３３８のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３３９のアミノ酸配列を含む１本の鎖
からなる群から選択される。

特定の実施形態において、これらの２本の異なるアミノ酸鎖は、
配列番号３０１のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３０２のアミノ酸配列を含む１本の鎖；
配列番号３１０のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３１１のアミノ酸配列を含む１本の鎖；
配列番号３２２のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３２３のアミノ酸配列を含む１本の鎖；及び
配列番号３３０のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３３１のアミノ酸配列を含む１本の鎖
からなる群から選択される。

更に別の態様において、本発明は、上記に記載したとおりのシングルドメイン抗体又はマルチドメイン抗体をコードする核酸分子（核酸配列とも称される）を更に提供する。好ましくは、本核酸配列は、上記に記載したとおりのＣＤＲ領域の１つ以上を含む結合分子をコードする。

特定の実施形態において、本核酸配列は、配列番号１〜２９からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は相同アミノ酸配列を含むシングルドメイン抗体をコードする。

特定の実施形態において、本核酸配列は、配列番号１４６〜２２６及び配列番号３４０からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は相同アミノ酸配列を含むシングルドメイン抗体をコードする。

特定の実施形態において、本核酸配列は、配列番号３０〜１０７、配列番号１１０〜１２１及び配列番号２９３〜３３９からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は相同アミノ酸配列を含むマルチドメイン抗体をコードする。

本発明に係る核酸配列はポリマー形態のヌクレオチドを指し、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、並びに上記の合成形態及び混合ポリマーが含まれる。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド又はいずれか一方のタイプのヌクレオチドの修飾形態を指す。この用語にはまた、一本鎖及び二本鎖形態のＤＮＡも含まれる。当業者は、これらの核酸分子の機能変異体も本発明の一部であると意図されることを理解するであろう。機能変異体は、標準的な遺伝子コードを用いて直接翻訳されて、親核酸分子から翻訳されたものと同一のアミノ酸配列を提供し得る核酸配列である。

好ましい実施形態において、本発明に係る結合分子をコードする核酸分子は、酵母細胞又はヒト細胞などの哺乳類細胞における発現にコドンが最適化される。コドンの最適化方法は公知であり、これまでに記載がなされている（例えば国際公開第９６／０９３７８号パンフレット）。配列は、野生型配列と比較したとき、少なくとも１つの好ましくないコドンがより好ましいコドンに置き換えられている場合にコドンが最適化されていると見なされる。本明細書では、好ましくないコドンとは、生物において同じアミノ酸をコードする別のコドンと比べて使用される頻度が低いコドンであり、より好ましいコドンとは、生物において好ましくないコドンと比べてより高頻度に使用されるコドンである。特定の生物のコドン使用頻度については、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎにあるものなどのコドン頻度表を参照することができる。好ましくは２つ以上の好ましくないコドン、好ましくはほとんど又は全ての好ましくないコドンが、より好ましいコドンに置き換えられる。好ましくは、コドン最適化配列には、生物で最も高頻度に使用されるコドンが使用される。好ましいコドンに置き換えると、概して発現が高くなる。

また、当業者は、遺伝子コードの縮重の結果として、多数の異なる核酸分子が同じポリペプチドをコードし得ることも理解するであろう。また、当業者が、ルーチンの技術を用いて、ポリペプチドを発現させる任意の詳細な宿主生物のコドン使用を反映するため、核酸分子によってコードされるアミノ酸配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を作製し得ることも理解される。従って、特記されない限り、「アミノ酸配列をコードする核酸配列」には、互いの縮重型であり且つ同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列が含まれる。核酸配列はルーチンの分子生物学技術を用いてクローニングするか、又はＤＮＡ合成によってデノボ生成することができ、これらは、ＤＮＡ合成及び／又は分子クローニングの分野で業務を行っているサービス会社（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）によってルーチンの手順を用いて実施されてもよい。

本発明はまた、上記に記載したとおりの少なくとも１つの核酸配列を含むベクターも提供する。用語「ベクター」は、その複製場所、及び場合によっては発現場所となる宿主細胞に導入するため第２の核酸分子を挿入し得る核酸分子を指す。換言すれば、ベクターは、それに連結されている核酸分子の輸送能を有する。本明細書で使用されるとき、用語「ベクター」には、クローニングベクターも発現ベクターも企図される。ある種のベクターは、それが導入される宿主において自己複製能を有する（例えば、細菌性複製起点を有するベクターは細菌で複製することができる）。他のベクターは、宿主細胞への導入時に宿主のゲノムに組み込まれることができ、従って宿主ゲノムと共に複製される。本発明に係るベクターは、当業者に周知の方法によって容易に作製することができる。

特定の実施形態において、１つ以上の発現調節核酸配列に作動可能に連結された本発明に係る核酸分子を１つ以上含むベクターが提供される。用語「発現調節核酸配列」は、本明細書で使用されるとき、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要である、及び／又はその発現に影響を及ぼす核酸配列を指す。発現調節核酸配列、例えば、特に適切な転写開始、終結、プロモーター、エンハンサー配列など；リプレッサー又はアクチベーター配列；スプライシング及びポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質安定性を増強する配列；及び必要に応じて、タンパク質分泌を増強する配列は、選択の宿主生物において活性を示す任意の核酸配列であってよく、宿主生物と同種或いは異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来し得る。発現調節配列の同定及び使用は当業者にとってルーチンである。本発明に係る好適なベクターは、例えば、アデノベクター（例えばＡｄ２６又はＡｄ３５など）、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アルファウイルス、パラミクソウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスベクター等である。

特定の実施形態において、ベクターは、例えば、Ａｄａｍ ｅｔ ａｌ．（２０１４）、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）及びＳｕｓｃｏｖｉｃｈ ａｎｄ Ａｌｔｅｒ（２０１５）によって記載されるとおり、遺伝子療法の目的で使用される。

本発明は、本明細書に記載されるとおりのシングルドメイン抗体又はマルチドメイン抗体をコードする核酸配列を含む宿主細胞を更に提供する。「宿主細胞」は、本明細書で使用されるとき、クローニングベクター又は発現ベクターなどのベクターが導入されている細胞を指す。宿主細胞は原核生物細胞又は真核生物細胞であってもよい。

本発明は、上記に記載したとおりの１つ以上のシングルドメイン抗体、マルチドメイン抗体、核酸分子及び／又はベクターを含む医薬組成物を更に提供する。本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を更に含み得る。「薬学的に許容可能な賦形剤」とは、好適な組成物を調製するため本発明に係る結合分子などの活性分子と組み合わされる任意の不活性な物質が意味される。薬学的に許容可能な賦形剤は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントにとって非毒性である、製剤中の他の成分と適合する賦形剤である。薬学的に許容可能な賦形剤は当該技術分野において広く利用されており、公知である。本発明に係る医薬組成物は、少なくとも１つの他の治療用、予防用及び／又は診断用薬剤を更に含み得る。前記更なる治療用及び／又は予防用薬剤は、例えばＭ２阻害薬（例えば、アマンタジン、リマンタジン）及び／又はノイラミニダーゼ阻害薬（例えば、ザナミビル、オセルタミビル）など、例えば、インフルエンザウイルス感染を予防し及び／又は治療する能力も有する薬剤であってもよい。これらは、本発明の結合分子と組み合わせて使用され得る。本明細書における「組み合わせて」は、同時に、別個の製剤として、又は１つの単一の組み合わされた製剤として、又は別個の製剤として逐次的な投与レジメンに従い、任意の順序におけるものであることを意味する。

更なる態様において、本発明は、インフルエンザ感染の診断、予防及び／又は治療に使用される、本明細書に記載されるとおりのシングルドメイン抗体、マルチドメイン抗体、核酸分子、及び／又はベクターを提供する。本発明は、インフルエンザ感染の診断、予防及び／又は治療用医薬の製造における、本明細書に記載されるとおりのシングルドメイン抗体、マルチドメイン抗体、核酸分子、及び／又はベクターの使用を更に提供する。かかる感染は小さい集団に起こることもあるが、また季節的流行で、又は悪ければ何百万人もの人がリスクに曝される世界的規模の流行で全世界に広がることもある。本発明は、かかる季節的流行、並びに可能性として世界的流行を引き起こすインフルエンザ株の感染を中和することのできる結合分子を提供する。重要なことには、ここで、例えばＨ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９及びＨ１１亜型を包含する系統発生学的グループ１、及び例えばＨ３、Ｈ４、Ｈ７及びＨ１０亜型を包含する系統発生学的グループ２の両方の様々なインフルエンザ亜型、並びにＢ型インフルエンザ亜型の交差中和能が本発明の結合分子にあることが開示されているとおり、原因となるインフルエンザウイルスとは無関係に、本発明の結合分子による防御及び治療を想定することができる。

本発明は、対象においてインフルエンザを予防及び／又は治療する方法を更に提供し、この方法は、本明細書に記載されるとおりのシングルドメイン抗体、マルチドメイン抗体、核酸分子、及び／又はベクターの治療有効量を、それを必要としている対象に投与するステップを含む。用語「治療有効量」は、インフルエンザウイルスに感染した結果起こる状態を予防し、改善し及び／又は治療するのに有効な本明細書に定義するとおりの結合分子又は核酸分子の量を指す。本明細書において使用するとおりの改善とは、目に見える又は知覚できる疾患症状、ウイルス血症、又はインフルエンザ感染の任意の他の計測可能な徴候の低減を指し得る。予防には、インフルエンザウイルスの伝播を阻害し若しくは低減すること、又は症状の１つ以上の発生、発症又は進行を阻害し若しくは低減することが含まれる。

予防及び／又は治療は、インフルエンザ感染に罹患し易い患者集団が対象となり得る。かかる患者集団としては、限定はされないが、例えば、高齢者（例えば５０歳以上、６０歳以上、及び好ましくは６５歳以上）、若年者（例えば５歳以下、１歳以下）、入院中の患者及び抗ウイルス化合物による治療を受けたが不十分な抗ウイルス応答を示した既感染患者が挙げられる。

投薬量レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）が得られるように調整することができる。好適な投薬量範囲は、例えば、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０１〜１５ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。更に、例えば、単回ボーラスが投与されてもよく、数回の用量が時間をかけて投与されてもよく、又は必要と認められた場合に用量を比例的に減少又は増加させてもよい。

本発明に係る結合分子、核酸分子及び／又はベクターは対象に対し、例えば、静脈内に、鼻腔内に、経口吸入により、肺内に、皮下に、皮内に、硝子体内に、経口的に、筋肉内に等で投与されてもよい。最適な投与経路は、活性分子の物理化学的特性、臨床的状況の緊急性及び活性分子の血漿濃度と所望の治療効果との関係を含め、幾つかの要因に左右されることになる。

本発明の結合分子の高い安定性は、点鼻薬又は鼻腔内スプレーを使用した鼻腔内投与によるか、或いはネブライザー又は乾燥粉末吸入器を使用した吸入によるなど、代替的な無針送達の可能性を開く。特定の実施形態において、本発明に係る少なくとも１つのシングル又はマルチドメイン抗体をコードする核酸分子又はベクターは、従って、例えばＬｉｍｂｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３）によって記載されるとおり、鼻腔内投与される。

従来の抗体及び他の多くのバイオ医薬品と異なり、本発明の結合分子は、微生物系で極めて効率的に作製することができる。大規模製造で使用される微生物宿主細胞の例は、例えば酵母（Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ））及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。これらの微生物系は、生物医薬製造に最も費用効果の高い選択肢であると考えられる。低いＣＯＧは、インフルエンザ予防及び治療における抗インフルエンザ薬の広範な利用に必須である。特定の実施形態において、このように本発明は、結合分子の発現を誘導し得る条件下で本明細書に記載されるとおりの宿主細胞を培養するステップと、任意選択で、発現した結合分子を回収するステップとを含む、本発明に係る結合分子（即ちシングルドメイン抗体又はマルチドメイン抗体）の作製方法を提供する。培養培地からの結合分子の回収方法は、当業者に周知である。

特定の実施形態において、宿主細胞は微生物細胞、例えば、限定はされないが、酵母細胞又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。

更なる実施形態において、宿主細胞は哺乳類細胞、例えば、限定はされないが、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞又はＰＥＲ．Ｃ６細胞である。

本発明は、試料中のインフルエンザウイルスを検出する方法に更に関し、この方法は、ａ）本発明に係る結合分子の診断上有効な量を前記試料に接触させるステップと、ｂ）結合分子が試料中の分子に特異的に結合するかどうかを決定するステップとを含む。試料は、限定はされないが、感染した（可能性のある）対象からの血液、血清、組織又は他の生物学的材料を含め、生体試料であり得る。感染した（可能性のある）対象はヒト対象であり得るが、またインフルエンザウイルスのキャリアであることが疑われる動物も、インフルエンザウイルスの存在に関して本発明の結合分子を使用して検査される可能性がある。好ましくは、本発明の結合分子は、結合分子と試料中に存在し得るインフルエンザウイルス又はその抗原成分との間で免疫複合体の形成が可能な条件下で試料に接触させる。次に、それがある場合には試料中にインフルエンザウイルスが存在することの指標となる免疫複合体の形成を好適な手段によって検出及び計測し得る。かかる方法としては、特に、同種及び異種結合イムノアッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法、免疫組織化学、ＦＡＣＳ、ＢＩＡＣＯＲＥ及びウエスタンブロット分析が挙げられる。以下の非限定的な実施例において本発明を更に説明する。

実施例１：免疫化
重鎖抗体依存性免疫応答の誘導を目的として、表１に記載するスキームに従い４匹のラマ（ラマ・グラマ（Ｌａｍａ ｇｌａｍａ））をフロイントアジュバントの存在下でインフルエンザウイルス抗原（市販のワクチンＩｎｆｌｅｘａｌ（登録商標）及び組換えタンパク質）によって免疫した。

２回目、３回目、４回目、及び５回目の免疫化後の指示される時点で（表１）、ラマから静脈穿刺によって末梢血をクエン酸塩抗凝固試料チューブに採取した。

免疫化前（０日目）に採取した試料及び抗原投与後（２８日目及び１１２日目）に採取した血清試料の抗原特異的血清力価をＨＡ ＥＬＩＳＡで比較することにより、各動物の同種及び異種免疫応答を分析した。そのため、組換えＨＡタンパク質をＭａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルマイクロタイタープレートに捕捉した。ブロック後、血清試料の段階希釈物を加え、ヤギ抗ラマＩｇＧ−ＨＲＰを添加することにより、結合したラマＩｇＧを検出した。結果は図１に示す。これらのデータは、免疫した動物が全てＨＡに対して良好な同種及び異種免疫応答を生じたことを示している。

実施例２：ファージライブラリ構築
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を製造者の指示に従い使用して新鮮血液から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ＲＴ−ＰＣＲの出発物質としてＰＢＭＣから抽出した全ＲＮＡを用い、ＶＨＨコード遺伝子断片を増幅した。これらの断片をＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限部位を用いてＭ１３ファージミドベクターｐＤＶ−ＬｕｃＳｔｕｆｆｅｒ（ｐＤＶ−Ｃ０６由来；国際公開第０２／１０３０１２号パンフレットに記載されるとおり）にクローニングして、ＶＨＨドメインとＭ１３ファージのｐＩＩＩタンパク質との融合物（これらの２つのタンパク質間にはアンバー終止コドンが含まれる）を作成した。ライゲートしたベクターをＴＧ−１菌（Ａｇｉｌｅｎｔ）に形質転換し、１００〜１５０個の単一コロニーをＰＣＲで分析して各ライブラリの品質を決定した。挿入頻度及び完全性は典型的には９５％超であった。構築したライブラリの特性を表２に示す。ＣＴヘルパーファージを本質的に記載（国際公開第０２／１０３０１２号パンフレット）のとおり使用して個々の動物からのファージライブラリを調製し、滅菌ろ過し、選択に使用した。本明細書に示されるとおり、全ての免疫ラマから複合ファージライブラリを作成することができた。

実施例３：インフルエンザＨＡに対するシングルドメイン抗体の選択
上記に記載したＶＨＨファージディスプレイライブラリ、並びに本質的に米国特許第６，２６５，１５０号明細書、国際公開第９８／１５８３３号パンフレット、及び「Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，Ｔ．Ｋｕｈｌｍａｎ，２００１（これらは参照によって本明細書に援用される）に記載されるとおりの一般的なファージディスプレイ技術及びＭＡＢＳＴＲＡＣＴ（登録商標）技術を使用して、抗体断片を選択した。更に、本発明では、国際公開第０２／１０３０１２号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりの方法及びヘルパーファージを使用した。

Ａ型インフルエンザ（Ｈ１ Ａ／カリフォルニア／０７／２００９、Ｈ１ Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９、Ｈ２ Ａ／日本／３０５／１９５７、Ｈ３ Ａ／ブリスベン／１０／２００７、Ｈ７ Ａ／オランダ／２１９／２００３）及び／又はＢ型インフルエンザ（ビクトリアクレードＢ／ブリスベン／６０／２００８、山形クレードＢ／フロリダ／０４／２００６）のヘマグルチニン（ＨＡ）を標的タンパク質として、特異的結合剤の選択を実施した。標的タンパク質源は、昆虫細胞が産生した組換えタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，ＵＳＡ）又はインフルエンザに感染させて固定（３％パラホルムアルデヒド）したＭＤＣＫ細胞の表面上に発現したＨＡのいずれかであった。様々な選択条件を用いており、表３に要約する。「ＳＤ」はシングルドメイン抗体を指す。特に言及がない場合、選択はｐＨ７．４及び５μｇ／ｍｌ ＨＡタンパク質で実施した。ＣＲ８０３３及びＣＲ８０７１は、Ｂ型インフルエンザＨＡの頭部及び首部に結合するモノクローナル抗体（ＩｇＧ）である（Ｄｒｅｙｆｕｓ ｅｔ ａｌ．２０１２）。

第１ラウンド選択のため、イムノチューブをＨＡ（５．０μｇ／ｍＬ、ＰＢＳに希釈）で一晩被覆し、ブロック緩衝液（ＰＢＳ中２％脱脂粉乳（ＥＬＫ））で洗浄した。ファージディスプレイライブラリのアリコート（５〜１０μＬ）を２ｍＬブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中５％非熱失活ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％マウス血清、及び２％ＥＬＫ）にブロックし、イムノチューブに加えた。室温（ＲＴ）で２時間インキュベートした後、チューブを洗浄した（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で５〜１５回及びＰＢＳで３〜５回）。結合したファージをトリエチルアミン（１００ｍＭ）で１０分間溶出させて、ｐＨを７．５に調整した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅを溶出したファージに感染させて播き、３７℃で一晩インキュベートした。コロニーをカウントし（１Ｅ＋０４〜１Ｅ＋０６ＣＦＵ）、プレートから剥がし取って、エンリッチされたファージライブラリを調製した（国際公開第０２／１０３０１２号パンフレットに記載されるとおり）。

第２ラウンド選択は、第１ラウンドからレスキューされたファージを使用して実施し、本質的に同じプロトコルに従ったが、但し、抗原、ｐＨを変更し、及び／又はエピトープ遮断モノクローナル抗体を加えた。ＨＡの保存された茎部領域を特異的に標的化する強力な結合剤を選択するため、変異体パニング戦略を適用した。交差反応性のシングルドメインクローンを選択するため、第１ラウンド選択と比較してより低量の種々のＨＡ抗原も使用した。プロトコルに低ｐＨ洗浄ステップを導入して、茎部に結合することのできるファージが選択される可能性を高め、ｐＨ５．０で起こるＨＡの立体構造変化（Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．２０１３）をブロックした。ここでＨＡ被覆イムノチューブを５倍希釈のＴｒｙｐｌｅ Ｓｅｌｅｃｔ（組換えトリプシン；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に１０分間インキュベートして被覆ＨＡ_０を（ＨＡ_１〜ＨＡ_２に）切断し、続いて洗浄及びブロックステップを行った。ファージと共にインキュベートした後、先述のとおりチューブを洗浄し、続いてｐＨ５．１のクエン酸リン酸ナトリウム緩衝液で２０分間インキュベートした。３回のＰＢＳ洗浄ステップ後、上記に記載したとおりファージ溶出を継続した。選択中にＩｇＧ１抗体（１０μｇ／ｍＬ）を添加すると、ＨＡの頭部又は首部で免疫優位エピトープが遮断され、また、ＨＡの茎部に結合するシングルドメインファージが選択される可能性も増加させることができる。ＨＡ被覆イムノチューブのブロック中及びファージライブラリとのインキュベーション中に、抗体ＣＲ８０３３及びＣＲ８０７１（Ｄｒｅｙｆｕｓ ｅｔ ａｌ．２０１２）を加えた。

２回又は３回連続の選択ラウンドを実施した後、個々のｓｄＡｂを単離した。各選択のアウトプットをエンリッチメント因子に関して配列解析し、更なる分析に最良のセレクションを選択した。個々の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーをピッキングして、粗モノクローナルｓｄＡｂを含有するペリプラズム抽出物を調製した。端的には、溶出したファージを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＳＦ１１０培養物（２ＹＴ培地、１０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、４％グルコース）を感染させ、個々のコロニーをピッキングし、９６ディープウェルプレート（１ｍＬ ２ＹＴ−ＡＴＧ培地）で成長させた。ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加することによりＶＨＨドメイン発現を誘導した。細菌ペレットを氷上で１５０μＬ ＴＥＳ緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５００ｍＭスクロース、ｐＨ８．０）に３０分間溶解させることによりペリプラズム抽出物を調製した。浸透圧ショックによってペリプラズム画分を遊離させ、クリアリング及び滅菌ろ過したｓｄＡｂ含有上清を機能スクリーニングに使用した（実施例４を参照）。

Ｎｉ−ＮＴＡ ９６ウェルスピンプレートを製造者の指示に従い使用することにより、小規模製造のｓｄＡｂ（９６ディープウェルプレートで１ｍＬ）を精製及び濃縮した。

ペリプラズム抽出物生成と並行して、個々のクローンの残りの培養物を使用してグリセロールストックを作成し、ＶＨＨ遺伝子のシーケンシング用にプラスミドＤＮＡを単離した。ユニーク配列を更に調べた。

インフルエンザグループ１、グループ２又はＢ型由来のＨＡタンパク質を使用した交差選択、並びに低ｐＨでのストリンジェントな洗浄ステップにより、広域ＨＡ結合ファージを単離することが可能であった。小規模大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生のペリプラズム抽出物が、機能スクリーニングに好適な再現性のあるタンパク質レベルをもたらした。

実施例４：インフルエンザウイルス中和シングルドメイン抗体の機能スクリーニング
ＳｄＡｂ含有ペリプラズム抽出物を、哺乳類細胞のインフルエンザウイルス感染を防ぐそれらの能力に関してウイルス中和アッセイ（ＶＮＡ）で分析した。そのため、ＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＣＬ−３４）を９６ウェルプレートに播種し（４Ｅ＋０４細胞／ウェル）、４時間後にインフルエンザウイルス（１００ＴＣＩＤ５０／ウェル）の混合物と共にインキュベートし、ペリプラズム抽出物（１５μＬ／ウェル又はその希釈物）を滅菌ろ過した。３７℃及び１０％ＣＯ_２で３日間インキュベートした後、細胞培養上清中の新しく産生されたウイルスの量をＶ底プレートにおいて１％シチメンチョウ赤血球（ＴＲＢＣ）の血球凝集によって評価した（中和ｓｄＡｂは上清中のウイルス負荷を低下させてＴＲＢＣの血球凝集の防止をもたらす）。ペリプラズム抽出物に対するｓｄＡｂ入力濃度は未知であるため、試料はウイルス中和に関して陽性又は陰性のスコア化のみ行った。複数のインフルエンザ株を並行して試験して、好ましくは広域中和性のｓｄＡｂを選択した（表３ａを参照のこと）。

結論として、機能スクリーニングにより、中和Ａ型グループ１、Ａ型グループ２、Ａ型グループ１及び２、又はＢ型インフルエンザウイルスに分類することのできるｓｄＡｂが得られた。

実施例５：シングルドメイン抗体の発現及び精製
関連性のあるｓｄＡｂ配列を、Ｅｘｐｉ２９３懸濁細胞における使用に好適な標準的な真核細胞発現ベクターにクローニングした。産生ランは５〜６日間実施した。発現したｓｄＡｂを細胞培養培地に分泌させる。培地からグルコースを完全に枯渇させる前に、培養上清を回収し、遠心し、滅菌ろ過した。ニッケルイオンを含有する抗Ｈｉｓ樹脂（ｃＯｍｐｌｅｔｅ ＨＩＳ−Ｔａｇカラム；Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０６７８１５４３００１）を使用してｓｄＡｂを精製し、高濃度イミダゾール（３００ｍＭ）を使用して溶出させた。溶出物を脱塩カラム（ＨｉＰｒｅｐ ２６／１０脱塩カラム、ＧＥＨＣ カタログ番号１７−５０８７）を使用してその最終製剤化緩衝液（２０ｍＭ ＮａＡｃ、７５ｍＭ ＮａＣｌ、５％スクロースｐＨ５．５）と緩衝液交換し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ３Ｋスピンフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＵＦＣ９００３２４）を使用して濃縮した。濃度を決定した後、純ｓｄＡｂアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＳＥＣ、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ及びエンドトキシン測定によって更に特徴付けた。全てのコンストラクトについて、６００ｍＬのトランスフェクション容積から５ｍｇの精製ｓｄＡｂの最小収量が得られた。９５％を超える単量体含有量及び正しい分子質量を有するｓｄＡｂバッチのみを更なる特徴付けに使用した。

選択された適用には、タグ（例えばＨＩＳタグ）を有しないｓｄＡｂが望ましかった。非タグ付加ｓｄＡｂを多段階イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）によって精製した。クリアリング及びろ過した上清をｄＨ_２Ｏで２倍希釈して伝導性を低下させ、ｐＨを８．０に設定し、試料を正電荷Ｃａｐｔｏ Ｑ Ｉｍｐｒｅｓｓ樹脂（ＧＥＨＣ、カタログ番号１７−５４７０−０２）にロードした。非荷電ｓｄＡｂはフロースルー中に残り、次にこれをｐＨ３．５に調整した。ここで正電荷のｓｄＡｂを負電荷ＨｉＴｒａｐ Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓカラム（ＧＥＨＣ、カタログ番号１７−５４６８−５５）で捕捉し、高濃度塩化ナトリウムを使用して溶出させた。ｓｄＡｂのｐＩは大きく異なり得るが、ｐＨ８でマイナス〜＋１．０の電荷及びｐＨ３〜５の範囲で少なくとも＋１０超の電荷を有する分子にこの方法を用いた。溶出したｓｄＡｂを上記に記載したとおり更に処理した。

本明細書に示されるとおり、Ｅｘｐｉ２９３細胞発現並びにＨＩＳタグに基づく、及びタグ無しコンストラクトについてはイオン交換に基づく精製戦略により、高度な量及び質の単量体ｓｄＡｂコンストラクトが得られた。

実施例６：シングルドメイン抗体の特徴付け
インフルエンザウイルス中和範囲
実施例４に記載したとおりのウイルス中和アッセイを用いてインフルエンザウイルス株の大規模パネルで様々な濃度を調べることにより、精製ｓｄＡｂの中和力価を評価した。力価は表４〜表７に報告する。ｓｄＡｂは、その活性に基づき、Ａ型インフルエンザグループ１（Ｈ１、Ｈ５、Ｈ２、Ｈ６、Ｈ１１、Ｈ９、Ｈ８、及びＨ１２ウイルスが含まれる）中和分子、Ａ型インフルエンザグループ２（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ１４、Ｈ７、及びＨ１０ウイルスが含まれる）中和分子、及びＢ型インフルエンザ（山形、ビクトリア、及び先行（Ｐｒｅｄｅｃｅｓｓｏｒ）／旧型（Ｏｌｄ）ウイルスを含む）中和分子に分けることができる。興味深いことに、ｓｄＡｂの一部は、グループ１及びグループ２の両方のＡ型インフルエンザウイルスの中和能を有した（表６）。

ＨＡに対する結合範囲
バイオレイヤー干渉法プラットフォームＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４（Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ，Ｐａｌｌ）を使用して、特殊なセンサーの表面上における高速のディップ・アンド・リード法でタンパク質間相互作用の無標識リアルタイム結合解析を行った。機能化されたセンサーの先端で検出された質量のシフトから、組換えＨＡに対するｓｄＡｂの結合を調べることが可能であった。所定の濃度範囲にわたって実施することにより、全般的な結合のみならず、ｓｄＡｂのＫ_Ｄも決定することができた。

Ｃ末端ＨＩＳタグを有する精製ｓｄＡｂを抗Ｈｉｓセンサー（ローディング相、抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓセンサー、Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ、カタログ番号１８−００２０）上に捕捉した。続いてｓｄＡｂをロードしたセンサーを種々のＨＡ亜型（２０μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートして結合を調べた（会合相）。このアッセイの最後のステップは、キネティック緩衝液中でセンサーをインキュベートしてＨＡ−ｓｄＡｂ複合体の解離速度を決定することである。試験したｓｄＡｂの結合能を表８に掲載する。多くの場合、ｓｄＡｂは、それらが中和可能なよりも多くの株のＨＡに結合する。より広い結合スペクトルは、ＨＡに対するそれらの個々の親和性に関係している（Ｋ_Ｄ値を含む表９も参照のこと）。

無標識バイオレイヤー干渉法を用いて、ｓｄＡｂと種々のインフルエンザ株の組換えＨＡ分子との間の結合効力の尺度としての平衡解離定数（Ｋ_Ｄ値）も決定した。Ｋ_Ｄ値は、定常状態におけるｓｄＡｂ濃度範囲の結合反応（会合相のプラトーで計測した最後の１０秒の平均結合反応）をフィッティングして飽和の５０％の濃度を求めることにより決定した（これはＫ_Ｄ値（Ｒ＝Ｒ_ｍａｘ＊［ｓｄＡｂ］／（Ｋ_Ｄ＋［ｓｄＡｂ］））を反映する）。段階希釈物はデュプリケートで計測しており、幾何平均Ｋ_Ｄ値を表９に報告する。

シングルドメイン抗体と他のＨＡ結合剤との競合
ＨＡ上の既知のエピトープを用いたｓｄＡｂ自体の間での競合及び十分に特徴付けられているモノクローナル抗体（ＩｇＧ）を含めた他のＨＡ結合タンパク質との競合に関してｓｄＡｂをスクリーニングする結合競合試験を設計した。競合が観察された場合、両方の分子がＨＡの表面にある同様の又は少なくとも重複するエピトープに結合すると考えられる。

ここではＡｌｐｈａＬＩＳＡ競合アッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を確立し、これは、ビオチン化ＨＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１０μＬ、５０μＬ中０．５ｎＭ最終濃度）へのＩｇＧ又はＨｉｓタグ付加ｓｄＡｂ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、１０μＬ、５０μＬ中０．３ｎＭ最終濃度）の結合に依存するものであった。室温で２つのビーズ、ＨＡを認識するストレプトアビジンドナービーズ（１０μｇ／ｍＬの１０μＬ）及びＩｇＧ又は使用したｓｄＡｂのいずれかを認識する抗Ｆｃ又は抗Ｈｉｓアクセプタービーズ（１０μｇ／ｍＬ）と共に１時間インキュベートした後、ＨＡと結合剤との間の相互作用を検出した。更に１時間インキュベートした後に励起されたドナービーズ（６８０ｎｍ）及びアクセプタービーズがごく近接した場合、アクセプタービーズのルミネセンスシグナルとしてエネルギー移動（一重項酸素）を計測することができる。この均一系アッセイフォーマットのシグナル強度は、両結合パートナー間の結合強度（親和性／アビディティ）に正比例する。その親和性及び濃度（通常は１００ｎＭ〜０．５ｐＭの範囲で試験される）に依存して、競合相手がＡｌｐｈａＬＩＳＡシグナルを妨害するとシグモイド阻害曲線を得ることができ、これをＳＰＳＳで標準４パラメータロジスティック非線形回帰モデルを用いてフィッティングする。ｐＩＣ５０計算値の平均を表１０及び表１１に示す。

表１０及び表１１は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ ｐＩＣ５０値の平均を示す（最大半量阻害濃度の負の対数、値が高いほど、指数関数的により大きい効力を示す）。「Ｈ１＿Ｃａｌ＿ＨＡ」はＨ１Ｎ１ Ａ／カリフォルニア／０７／２００９を指し、「Ｈ１＿ＮＣａ＿ＨＡ」はＨ１Ｎ１ Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９のＨＡを指し、「Ｈ５＿Ｖｉｅ＿ＨＡ」はＨ５Ｎ１ Ａ／ベトナム／１２０３／２００４のＨＡを指し、「Ｈ３＿Ｂｒｉ＿ＨＡ」はＨ３Ｎ２ Ａ／ブリスベン／１０／２００７のＨＡを指し、「Ｈ３＿Ｗｉｓ＿ＨＡ」はＡ／ウィスコンシン／６７／２００５のＨＡを指し、「Ｈ７＿Ｎｅｔ＿ＨＡ」はＨ７Ｎ７ Ａ／オランダ／２１９／２００３のＨＡを指し；Ｂ＿Ｂｒｉ＿ＨＡ」はＢ／ブリスベン／６０／２００８のＨＡを指し；「Ｂ＿Ｆｌｏ＿ＨＡ」はＢ／フロリダ／０４／２００６のＨＡを指し、「ＣＲ８０３３」、「ＣＲ８０７１」及び「ＣＲ９１１４」は、Ｄｒｅｙｆｕｓ ｅｔ ａｌ．２０１２によって特徴付けられるＨＡ結合ＩｇＧである。「２Ｄ１」は、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０）によって特徴付けられるＨＡの受容体結合部位に結合するＩｇＧを指す。「ＣＲ８０２０」は、Ｅｋｉｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２０１１）によって特徴付けられるＨＡの茎部に結合するＩｇＧである。「３９．２９」は、国際公開第２０１４０７８２６８号パンフレットに特徴付けられるＨＡの茎部に結合するＩｇＧである。「タグ無し」型と指示されているものを除き、全てのＳＤｘｘｘｘが、検出に用いられるＨｉｓタグを有する。空白セルは「未試験」を意味する。

受容体結合の遮断 − 血球凝集抑制
一般的な種類のＨＡアッセイである血球凝集抑制アッセイを用いることにより、ｓｄＡｂがＨＡ頭部領域の上部近傍に結合して標的細胞、ここでは赤血球上のシアル酸受容体との相互作用を物理的に遮断する能力を試験した。十分な濃度のｓｄＡｂがシアル酸との相互作用を遮断する場合、「凝集反応」（赤血球が一体に集塊化する）が抑制される。ｓｄＡｂの段階希釈物をＰＢＳ（２５μＬ／ウェル）に調製し、２５μＬの８ＨＡＵ／５０μＬウイルス希釈物を添加して混合した。３７℃で１時間インキュベートした後、５０μＬの１％シチメンチョウ赤血球（ＴＲＢＣ）を添加して混合した。室温で３０〜６０分間インキュベートした後、凝集パターンを目視で（涙滴形の形成）スコア化する。４レプリケートの試料及び陽性対照抗体に加えて、入力ウイルスの逆滴定を取る。血球凝集抑制価、ＴＲＢＣ上のシアル酸受容体とのウイルスの相互作用が全て遮断されるときの最小濃度を、スピアマン−カーバーの式を用いて計算した。結果は表１２に示す。全てのＡ型インフルエンザ結合ｓｄＡｂが陰性であった（即ちＨＩ価＞５０μｇ／ｍＬを有する）。

その結合及び中和プロファイルと併せて、ＳＤ１０８４は強力なＨＡ頭部結合剤であることが示されたと共に、シアル酸受容体との結合を防ぐ。

茎部結合ｓｄＡｂによるＨＡの立体構造変化の抑制
茎部結合ｓｄＡｂが、それらの競合抗体と同様に、ＨＡの立体構造変化を防止し、それによりウイルス融合及び続く感染を阻止することを立証するため、低ｐＨ処理後のＨＡ頭部（ＨＡ１）の存在及びＨＡ１とＨＡ２との間を結び付けているジスルフィド架橋の還元を計測するアッセイが開発されている（Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．２０１３）。

立体構造変化アッセイは、無標識検出に基づき、バイオレイヤー干渉法プラットフォームＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４（Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ，Ｐａｌｌ）を用いて実施される。初めにＣ末端ビオチン化組換えＨＡのバッチを切断する（２５０μｇのＨＡを１０μＬ ０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡと共に３７℃で２０分間インキュベートし、次に３０μＬ ＤＴＩを添加してトリプシン活性を停止させる）。次にＯｃｔｅｔのストレプトアビジンセンサー（Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ、カタログ番号１８−５０２０）上にＨＡ（２μｇ／ｍＬ）を捕捉し、続いて結合パートナー（最大５０ｎＭのｓｄＡｂ、陽性及び陰性対照抗体）と共にインキュベートする。このインキュベーションステップ後、センサーをｐＨ範囲（０．２ｐＨ刻みでｐＨ６．５〜５．０）に曝す。結合パートナーがＨＡを安定化させず抑止しない場合、ＨＡは立体構造変化を起こす。ＨＡ１頭部ドメインが離れる一方で、融合機構を包含するＨＡ２ドメインが融合ペプチドをリフォールディングして外側に突出させる。ここでＨＡ１はジスルフィド架橋を介してＨＡ２に結び付いているに過ぎず、この架橋は最終アッセイステップでＤＴＴへの曝露（ＰＢＳ中５０ｍＭ ＤＴＴ）によって還元され得る。次にＨＡ１がビオチン化ＨＡ２ドメインから解離すると、検出器上で大幅な質量低下が検出されることになる。結果は表１３に要約する。

これらの結果は、ＨＡ茎部結合ｓｄＡｂがそれらの中和プロファイルに従いＨＡの立体構造変化を防ぐ能力を有することを示している。この能力には、後期エンドソームにおける条件と同様の低ｐＨでｓｄＡｂが結合したまま留まることが必要である。立体構造変化の阻止レベルは、それぞれのインフルエンザ株に対するそれらの中和力価と正の相関を有する。

シングルドメイン抗体配列
選択され且つ特徴付けられた本発明に係るｓｄＡｂの配列を表１４に掲載する。ＣＤＲ領域の配列を表１４ａに掲載する。

結論として、精製単量体ｓｄＡｂコンストラクトで実施したウイルス中和アッセイにより、４つの異なるクラスのｓｄＡｂが確認された：Ａ型インフルエンザグループ１、Ａ型インフルエンザグループ２、Ａ型インフルエンザグループ１及びグループ２、又はＢ型インフルエンザ中和ｓｄＡｂ。それにも関わらず、結合試験は、多くのＡ型グループ１又はＡ型グループ２中和ｓｄＡｂが、それらが中和できないグループに属するＨＡにも結合し得ることを示している。これにより、極めて多数のＡ型グループ１及びＡ型グループ２結合ｓｄＡｂがもたらされる。Ａ型及びＢ型インフルエンザを中和し、又は少なくとも結合することのできるｓｄＡｂは見出されなかった。更なる特徴付けのため、広域の結合及び中和能を有するｓｄＡｂを選択した（ＳＤ１０３８、ＳＤ１０３６、ＳＤ１０８３、及びＳＤ１０８４を含む）。ＨＡに対する親和性を決定すると、選択のｓｄＡｂの結合強度と中和力価との間に正の相関が示される。既知のＨＡ結合分子を用いた競合アッセイによるエピトープマッピングから、ＳＤ１０８４を除く全てが、ＨＡの保存された茎部に結合することが明らかになった。競合が起こった濃度は中和力価と正の相関を有し、即ち、結合及び競合が強力であるほど中和力価が低くなることを意味する。他方でＳＤ１０８４は、血球凝集抑制アッセイで実証されたとおり、ＨＡ頭部のシアル酸結合部位の近傍又はその部位に結合し、受容体結合を遮断することによってインフルエンザウイルスの細胞侵入を防ぐことができる。選択された他の全てのｓｄＡｂは、立体構造変化アッセイで実証されるとおり、ＨＡの茎部のＨＡ１及びＨＡ２に結合し、融合過程でのＨＡの立体構造変化を防ぐことができる。

実施例７：ｓｄＡｂホモ及びヘテロ二量体の生成及び特徴付け
ｓｄＡｂホモ及びヘテロ二量体の生成
ｓｄＡｂホモ及びヘテロ二量体を作成するため、それらのｓｄＡｂコード配列を共にクローニングするか、或いは完全長遺伝子を直接合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、真核細胞発現ベクターにライゲートした。ｓｄＡｂ二量体コンストラクトでは、第１のｓｄＡｂ（前）のＣ末端を第２のｓｄＡｂ（後ろ）のＮ末端に連結した。異なる長さ（１０、１５、３５、及び５７アミノ酸）のリンカー配列はアミノ酸グリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）からなる。共にクローニングすると、第１のｓｄＡｂに直接続く制限部位（ＮｏｔＩ）が３つの更なるアラニン（Ａ）残基をもたらす。リンカー配列を表１５に示し、ｓｄＡｂ二量体の完全なアミノ酸配列を表１６（Ａ型インフルエンザ標的化コンストラクト）及び表１７（Ｂ型インフルエンザ標的化コンストラクト）に示す。ｓｄＡｂの位置（前又は後ろ）は、コンストラクトにおいて、最適な組み合わせが実現するように変えた。発現及び精製は実施例５に記載されるとおり実施した。

ｓｄＡｂホモ及びヘテロ二量体によるインフルエンザ中和
精製ｓｄＡｂホモ及びヘテロ二量体を実施例６に記載されるとおりのインフルエンザウイルス中和アッセイで試験し、ｓｄＡｂ構成単位と比較したときに効力及び範囲の向上が示された。結果は、Ａ型インフルエンザ中和二量体について表１８に示し、Ｂ型インフルエンザ中和二量体について表１９に示す。

ｓｄＡｂホモ及びヘテロ二量体のＨＡ結合
精製ｓｄＡｂホモ及びヘテロ二量体を実施例６に記載されるとおりの結合アッセイで試験し、ｓｄＡｂ構成単位と比較したときに結合強度（アビディティ）の向上が示された。結果は、Ａ型インフルエンザ中和二量体について表２０に示す。

実施例８：マルチドメイン抗体コンストラクトの生成及び特徴付け
ｓｄＡｂ多量体の生成
ｓｄＡｂ多量体（三量体、四量体及び五量体）を作成するため、ｓｄＡｂコード配列を共にクローニングするか、或いは完全長遺伝子を直接合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、真核細胞発現ベクターにライゲートした。異なる長さ（１０又は３５アミノ酸）のリンカー配列はアミノ酸グリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）からなる。共にクローニングすると、第１のｓｄＡｂに直接続く制限部位（ＮｏｔＩ）が３つの更なるアラニン（Ａ）アミノ酸をもたらし、第２のｓｄＡｂに直接続く２つの連続する制限部位（ＰａｃＩ及びＸｈｏＩ）が５つの更なるアミノ酸（ＬＩＮＬＥ）をもたらす。リンカー配列を表１５に示し、ｓｄＡｂ三量体の完全なアミノ酸配列を表２３に示し、ｓｄＡｂ四量体及び五量体の完全なアミノ酸配列を表２４に示す。コンストラクト内におけるｓｄＡｂの位置は、最適な組み合わせが実現するように変えた。発現及び精製は実施例５に記載されるとおり実施した。

マルチドメイン抗体によるインフルエンザ中和
精製マルチドメイン抗体を実施例６に記載されるとおりのインフルエンザウイルス中和アッセイで試験し、ｓｄＡｂ構成単位と比較したときに効力及び範囲の向上が示された。結果は、インフルエンザ中和三量体について表２５に示し、四量体及び五量体について表２６に示す。

ＨＡに対するマルチドメイン抗体結合
無標識バイオレイヤー干渉法を用いることにより、ｐＨ７．４におけるマルチドメイン抗体と種々のインフルエンザ株の組換えＨＡ分子との間の結合効力の尺度としての平衡解離定数（Ｋ_Ｄ値）を決定した。Ｋ_Ｄ値は、定常状態におけるＭＤ濃度範囲の結合反応（会合相のプラトーで計測した最後の１０秒の平均結合反応）をフィッティングして飽和の５０％の濃度を求めることにより決定した（これはＫ_Ｄ値（Ｒ＝Ｒ_ｍａｘ＊［ｓｄＡｂ］／（Ｋ_Ｄ＋［ｓｄＡｂ］））を反映する）。段階希釈物はデュプリケートで計測しており、幾何平均Ｋ_Ｄ値を表２７に報告する。

茎部結合ｓｄＡｂによるＨＡの立体構造変化の阻害
ＨＡ茎部結合ｓｄＡｂ構成単位を含有するマルチドメイン抗体が、それらの競合抗体と同様に、ＨＡの立体構造変化を防ぎ、それによりウイルス融合、続いて感染を阻止することを立証するため、実施例６に記載されるとおりアッセイを実施した。結果は表２９に要約する。

３つ以上のｓｄＡｂを共に連結すると、個々の構成単位と比較して効力及び中和範囲が大幅に向上し得る。従って、ｓｄＡｂのいずれか個々によっては中和できなかったであろうインフルエンザ株を、同じｓｄＡｂの多量体コンストラクトによって確実に中和することができる。Ａ型インフルエンザグループ１、Ａ型インフルエンザグループ２、又はＢ型インフルエンザを中和するｓｄＡｂの組み合わせは、事実上試験した全ての株の中和能を有するマルチドメインをもたらした。中和範囲の増加は、使用されるｓｄＡｂの基礎的な結合範囲に関係する。コンストラクトの二価の性質に関係する可能性のある他の中和機構に加えて、ＨＡに対するアビディティの増加が、この記載される向上に関与するものと考えられる。試験した二量体及びマルチドメインについて、ウイルス中和機構としてのウイルス融合の遮断が確認された。

実施例９：Ｆｃ融合コンストラクトの生成及び特徴付け
Ｆｃ融合コンストラクトの生成
ｓｄＡｂ及びｓｄＡｂ多量体は、抗体のＦｃ領域に融合させることができる。Ｆｃ領域は、ヒンジ領域と、続くＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含有する抗体、例えばヒトＩｇＧ１分子の一部として定義される。種々のＦｃ融合コンストラクトが生成され、ＨＡ結合、インビトロ中和及びインビボ有効性に関してｓｄＡｂ多量体及びモノクローナル抗体と比較されている。

Ｆｃ断片のＣ末端及び／又はＮ末端に表１５に示すとおりの更なるリンカーを伴い又は伴わず、ｓｄＡｂ又はｓｄＡｂ多量体を融合した。Ｆｃ融合コンストラクトを哺乳類細胞で発現させて、二量体Ｆｃ分子として培地中に分泌させた。これらのＦｃ融合コンストラクトの完全なアミノ酸配列を表３０に示す。コンストラクト内でのｓｄＡｂ又はｓｄＡｂ多量体の位置は、最適な組み合わせが実現するように変えた。ホモ二量体並びにヘテロ二量体Ｆｃ融合分子を生成した。ヘテロ二量体Ｆｃ融合物は、Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）によって記載されるとおり、ＣＨ３ドメインに単一点突然変異を導入することにより生成した。これらの突然変異はＫ４０９Ｒ及びＦ４０５Ｌであり、これらの突然変異を含有するＦｃ鎖は、それぞれ、ＦｃＧａ及びＦｃＧｂと称される。

Ｆｃ融合コンストラクトを懸濁Ｅｘｐｉ２９３細胞で発現させた。Ｋ４０９Ｒ又はＦ４０５Ｌ突然変異を有するヘテロ二量体Ｆｃコンストラクトの配列を含有するＤＮＡコンストラクトを、２つの連続オープンリーディングフレームを含有する単一のベクターとしてトランスフェクトした。一過性トランスフェクション及び発現を供給業者の指示に従い実施し、これはヒトＩｇＧコンストラクトの作製に関する既報告の条件と同様であった（Ｄｒｅｙｆｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。可能性のある凝集物及び不純物を調製用ゲルろ過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇ又はＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって除去した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、予想される分子量に対応する画分をプールして、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ３０Ｋ遠心フィルタを使用して濃縮した。全ての製造ランにおいて、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって安定に連結した二量体Ｆｃ融合分子が得られた。ＦｃＧａ及びＦｃＧｂの両方を同じ細胞にトランスフェクトした場合、Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）によって記載されるとおり、精製Ｆｃ融合タンパク質をインビトロでの制御された還元条件に供してＦｃ融合物を半分の分子に分け、再アセンブル及び再酸化させて純粋なヘテロ二量体Ｆｃ融合分子を形成した。

Ｆｃ含有マルチドメイン抗体によるインフルエンザ中和
精製Ｆｃ含有シングル及びマルチドメイン抗体コンストラクトを実施例６に記載されるとおりのインフルエンザウイルス中和アッセイで試験し、ｓｄＡｂ構成単位と比較したときに効力及び範囲の向上が示された。結果は、インフルエンザ中和Ｆｃ融合コンストラクトについて表３１〜表３７に示す。

機能性Ｆｃ受容体結合（抗体依存性細胞傷害）
ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）レポーターバイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、細胞が発現するヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）に対する機能的結合を計測した。標的Ａ５４９細胞をＢ／ブリスベン／６０／２００８又はＢ／フロリダ／０４／２００６に感染させるか、又はＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）中のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＨ３Ｎ２ Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５ ＨＡをコードするプラスミドでトランスフェクトした。２４時間後、ＨＡを発現する標的細胞を白色９６ウェルプレートに播種し、Ｆｃ融合コンストラクトの段階希釈物又はＩｇＧ対照抗体と共に３０分間インキュベートした。更なる陰性対照として、Ｆｃ断片にＬＡＬＡ点突然変異を担持するコンストラクトを使用した。ＬＡＬＡ点突然変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｈｅｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．２００７により記載されるとおり）は、ヒトＦｃγ受容体に対する結合の大幅な低下及びＡＤＣＣの誘導を示す。最後に、標的細胞にジャーカットエフェクターＴ細胞（ＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８及びＮＦＡＴ−ＲＥルシフェラーゼを安定に発現する）を加えて６時間インキュベートした。ウェルにＢｉｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、ルミネセンスプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）でルミネセンス（ＲＬＵ単位）を計測した。ＳＰＳＳで標準４パラメータロジスティック非線形回帰モデルを使用してＲＬＵデータをフィッティングした。

全てのＳＤ／ＭＤ Ｆｃ融合コンストラクト（ＬＡＬＡ型を除く）がロバストなＡＤＣＣ誘導を示すことから、細胞の表面にあるインフルエンザＨＡ上の茎部エピトープとの結合によってＦｃγＲＩＩＩａ受容体発現細胞との生産的な相互作用が可能となることが示唆される。結果は表３８に要約する。

ｓｄＡｂ又はｓｄＡｂ多量体をヒトＩｇＧ１のＦｃ断片と融合すると、使用される個々のｓｄＡｂ又はマルチドメイン構成単位の効力及び中和範囲を維持するＨＡ結合分子がもたらされる。ｓｄＡｂ構成単位は、Ｆｃ断片のＮ末端にもＣ末端にも融合させることができる。発現時、２つのＦｃ鎖が二価抗体様分子を形成する。従って、ｓｄＡｂ又はマルチドメイン部分が異なる２つの別々のＦｃ鎖コンストラクトを同じ細胞で発現させること、及び二重特異性抗体様分子を作成することも可能である。ｓｄＡｂ及び／又はマルチドメインがＦｃ断片のＮ末端及び／又はＣ末端に付加されたホモ二量体及びヘテロ二量体Ｆｃ融合コンストラクトの作成は成功しており、Ａ型及びＢ型インフルエンザにわたるそれらの中和範囲が実証されている。ｓｄＡｂ又はマルチドメイン部分による中和を指図することに加え、融合コンストラクトのＦｃ部分は、感染細胞又はトランスフェクト細胞の表面のＨＡに結合したとき、エフェクター細胞の表面にあるＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）受容体との生産的な相互作用を促進することができる。これは、インビボでは、ＮＫ細胞の活性化と、続くＡＤＣＣの誘導につながり得る。エフェクター機能の誘導の次に、Ｆｃ部分はまた新生児Ｆｃ受容体とも相互作用して、長い生体内半減期をもたらすことができる。

実施例１０：シングルドメイン及びマルチドメイン抗体のインビボ有効性
Ａ型インフルエンザグループ１シングルドメイン抗体のインビボ有効性
例示的Ａ型インフルエンザグループ１シングルドメイン抗体ＳＤ１０１６、ＳＤ１０３８及びＳＤ１０４５を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）にＳＤ１０１６、ＳＤ１０３８又はＳＤ１０４５を０．５ｍｇ／ｋｇの単一用量で鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の８匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを２５×ＬＤ_５０のインフルエンザ株Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２１日間にわたって生存及び体重をモニタした。ＳＤ１０３８及びＳＤ１０１６の両方の投与は媒体対照群と比較して生存率の統計学的に有意な改善をもたらした一方、ＳＤ１０４５の投与は生存期間の改善をもたらすのみであった（図２を参照のこと）。

Ａ型インフルエンザグループ２シングルドメイン抗体のインビボ有効性
例示的Ａ型インフルエンザグループ２シングルドメイン抗体ＳＤ１０３６、ＳＤ１０４６及びＳＤ１０４８を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）に５ｍｇ／ｋｇの用量のＳＤ１０４６又はＳＤ１０４８又は２つの用量（０．５ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇ）のＳＤ１０３６を鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の８匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを２５×ＬＤ５０のインフルエンザ株Ａ／香港／１／１９６８−ＭＡ（Ｈ３Ｎ２）で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２１日間にわたって生存及び体重をモニタした。この試験は、ＳＤ１０３６、ＳＤ１０４６又はＳＤ１０４８の鼻腔内投与がＡ／香港／１／１９６８−ＭＡウイルスの致死的攻撃誘発に対する完全防御を提供することを示している（図３を参照のこと）。

Ｂ型インフルエンザシングルドメイン抗体のインビボ有効性
例示的Ｂ型インフルエンザシングルドメイン抗体ＳＤ１０８３及びＳＤ１０８４を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）に５ｍｇ／ｋｇの単一用量のＳＤ１０８４又は２つの用量（０．５ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇ）のＳＤ１０８３を鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の８匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを２５×ＬＤ５０のインフルエンザ株Ｂ／フロリダ／４／２００６で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２１日間にわたって生存及び体重をモニタした。この試験は、ｓｄＡｂ ＳＤ１０８４がＢ／フロリダ／４／２００６による致死的攻撃誘発に対する１００％の防御を提供する一方、ＳＤ１０８３は最も高い５ｍｇ／ｋｇの用量で部分的防御を提供するのみであることを示している。それより低い用量のＳＤ１０８３は生存期間の改善をもたらすのみであった（図４）。

Ｈ１Ｎ１モデルにおけるＡ型インフルエンザシングル及びマルチドメイン抗体のインビボ有効性
例示的Ａ型インフルエンザｓｄＡｂ ＳＤ１０３８及び例示的Ａ型インフルエンザマルチドメイン抗体ＭＤ１２１１及びＭＤ１２１２を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）に１ｍｇ／ｋｇの用量のＭＤ１２１１又はＭＤ１２１２又は単独（０．５ｍｇ／ｋｇ）若しくはＳＤ１０３６との１：１混合物（総用量＝１ｍｇ／ｋｇ）のいずれかのＳＤ１０３８を鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の８匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを２５×ＬＤ５０のインフルエンザ株Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２１日間にわたって生存及び体重をモニタした。この試験は、ＳＤ１０３８、ＭＤ１２１１、ＭＤ１２１２又はＳＤ１０３８とＳＤ１０３６との１：１混合物の鼻腔内投与がＡ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡウイルスの致死的攻撃誘発に対する完全防御を提供することを示している。体重曲線は、ＭＤ１２１１及びＭＤ１２１２の有効性がｓｄＡｂ（混合物）より優れていることを示している（図５）。

Ｈ３Ｎ２モデルにおけるＡ型インフルエンザシングル及びマルチドメイン抗体のインビボ有効性
例示的Ａ型インフルエンザｓｄＡｂ ＳＤ１０３６及び例示的Ａ型インフルエンザマルチドメイン抗体ＭＤ１２１１及びＭＤ１２１２を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）に５ｍｇ／ｋｇの用量のＭＤ１２１１又はＭＤ１２１２又は単独（２．５ｍｇ／ｋｇ）若しくはＳＤ１０３８との１：１混合物（総用量＝５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかのＳＤ１０３６を鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の８匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを２５×ＬＤ５０のインフルエンザ株Ａ／香港／１／１９６８−ＭＡ（Ｈ３Ｎ２）で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２１日間にわたって生存及び体重をモニタした。この試験は、ＳＤ１０３６、ＭＤ１２１１、ＭＤ１２１２又はＳＤ１０３６とＳＤ１０３８との１：１混合物の鼻腔内投与がＡ／香港／１／１９６８−ＭＡウイルスの致死的攻撃誘発に対する完全防御を提供することを示している。体重曲線は、ＭＤ１２１１及びＭＤ１２１２の有効性がｓｄＡｂ（混合物）より優れていることを示している（図６）。

Ｈ３Ｎ２モデルにおけるＳＤ１０３８単量体及び二量体のインビボ有効性の比較
例示的Ａ型インフルエンザシングルドメイン抗体ＳＤ１０３８及び例示的Ａ型インフルエンザマルチドメイン抗体ＭＤ１２１２を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）に４つの用量（５ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ又は０．２ｍｇ／ｋｇ）のＳＤ１０３８又はＭＤ１２１２を鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の８匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを２５×ＬＤ５０のインフルエンザ株Ａ／香港／１／１９６８−ＭＡ（Ｈ３Ｎ２）で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２１日間にわたって生存及び体重をモニタした。この試験は、ＳＤ１０３８がＡ／香港／１／１９６８−ＭＡウイルスの致死的攻撃誘発に対して部分的防御を提供するのみであること、及び防御レベルが用量依存的であることを示している。対照的に、二量体ＳＤ１０３８（ＭＤ１２１２）は４つ全ての用量群で１００％の防御を提供する（図７）。

Ｂ型インフルエンザマルチドメイン抗体のインビボ有効性
例示的Ｂ型インフルエンザマルチドメイン抗体ＭＤ１２２１、ＭＤ１２２２及びＭＤ１２２４を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）に５ｍｇ／ｋｇの単一用量のＭＤ１２２１又はＭＤ１２２４又は２つの用量（０．５ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇ）のＭＤ１２２２を鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の８匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを２５×ＬＤ５０のインフルエンザ株Ｂ／フロリダ／４／２００６で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２１日間にわたって生存及び体重をモニタした。この試験は、３つ全てのマルチドメイン抗体がＢ／フロリダ／４／２００６による致死的攻撃誘発に対する１００％の防御を提供することを示している（図８）。

静脈内投与後のＨ１Ｎ１に対するＡ型及びＢ型インフルエンザマルチドメイン抗体のインビボ有効性
例示的Ａ型及びＢ型インフルエンザマルチドメイン抗体ＭＤ１３０１及びＭＤ２６０１を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）に３ｍｇ／ｋｇの単一用量のＭＤ１３０１又はＭＤ２６０１を静脈内投与した。ＣＲ９１１４を陽性対照としてとった。緩衝溶液のみの投与を受けた別の８匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを２５×ＬＤ５０のインフルエンザ株Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２１日間にわたって生存及び体重をモニタした。この試験は、Ｆｃ含有マルチドメイン抗体ＭＤ２６０１が静脈内投与後に完全防御を提供する一方、Ｆｃ不含ＭＤ１３０１が生存に効果を及ぼさないことを示している。対照抗体ＣＲ９１１４はＡ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）による致死的攻撃誘発に対して部分的防御を提供するのみである（図９）。

鼻腔内投与後のＨ１Ｎ１に対するＡ型及びＢ型インフルエンザマルチドメイン抗体のインビボ有効性
例示的Ａ型及びＢ型インフルエンザマルチドメイン抗体ＭＤ１３０１及びＭＤ２６０１及び基準抗体ＣＲ９１４を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）に３つの用量（０．２、０．０５又は０．０１ｍｇ／ｋｇ）のＭＤ１３０１、ＭＤ２６０１又は基準抗体ＣＲ９１１４を鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の８匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを２５×ＬＤ５０のインフルエンザ株Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２１日間にわたって生存及び体重をモニタした。この試験は、最小有効用量（１００％防御を提供する最も低い用量として定義される）がＦｃ含有抗体ＭＤ２６０１及びＣＲ９１１４について０．０５ｍｇ／ｋｇであり、Ｆｃ不含ＭＤ１３０１について０．２ｍｇ／ｋｇであることを示している。０．０５ｍｇ／ｋｇ ＣＲ９１１４を投与されたマウスは、同じ用量のＭＤ２６０１を投与されたマウスよりも大きい体重減少を示した（図１０）。

Ｈ１Ｎ１に対するＡ型及びＢ型インフルエンザマルチドメイン抗体ＭＤ２６１７のインビボ有効性
例示的マルチドメイン抗体ＭＤ２６１７を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）にＭＤ２６１７を鼻腔内に０．２ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ又は０．０１ｍｇ／ｋｇで、或いは静脈内に３、１又は０．３ｍｇ／ｋｇで投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の８匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを２５×ＬＤ５０のＡ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２１日間にわたって生存及び体重をモニタした。ＭＤ２６１７の用量０．２ｍｇ／ｋｇの鼻腔内投与又は３ｍｇ／ｋｇの静脈内投与は、媒体対照群と比較して生存率の統計学的に有意な改善をもたらした（図１１）。

Ｈ３Ｎ２及びＢ型フロリダに対するＡ型及びＢ型インフルエンザマルチドメイン抗体ＭＤ２６１７のインビボ有効性
例示的マルチドメイン抗体ＭＤ２６１７を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）にＭＤ２６１７を鼻腔内に０．５ｍｇ／ｋｇで、或いは静脈内に２ｍｇ／ｋｇで投与した。２ｍｇ／ｋｇで静脈内投与したＣＲ９１１４を陽性対照としてとった。緩衝溶液のみの投与を受けた別の８匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを２５×ＬＤ５０のＡ／香港／１／１９６８−ＭＡ（Ｈ３Ｎ２）又はＢ／フロリダ／４／２００６で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２１日間にわたって生存及び体重をモニタした。ＭＤ２６１７の鼻腔内投与並びに静脈内投与は媒体対照群と比較して生存率の統計学的に有意な改善をもたらした。

鼻腔内投与後のＢ型フロリダに対するＡ型及びＢ型インフルエンザマルチドメイン抗体ＭＤ２４０７及びＭＤ３６０６のインビボ有効性
例示的マルチドメイン抗体ＭＤ２４０７及びＭＤ３６０６及び基準抗体ＣＲ９１１４を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）に３つの用量（０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ又は０．５ｍｇ／ｋｇ）のＭＤ２４０７、ＭＤ３６０６又はＣＲ９１１４を鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の８匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを２５×ＬＤ５０のインフルエンザ株Ｂ／フロリダ／４／２００６で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２１日間にわたって生存及び体重をモニタした。０．０２、０．１及び０．５ｍｇ／ｋｇ ＭＤ２４０７及びＭＤ３６０６の投与は媒体対照群と比較して生存率の統計学的に有意な改善をもたらした一方、ＣＲ９１１４の投与は０．１及び０．５ｍｇ／ｋｇで生存率の改善をもたらすのみであった（図１３）。

静脈内投与後のＢ型フロリダに対するＡ型及びＢ型インフルエンザマルチドメイン抗体ＭＤ３６０６のインビボ有効性
例示的マルチドメイン抗体ＭＤ３６０６及び基準抗体ＣＲ９１１４を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）に３つの用量（０．２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇ）のＭＤ３６０６又はＣＲ９１１４を静脈内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の８匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを２５×ＬＤ５０のインフルエンザ株Ｂ／フロリダ／４／２００６で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２１日間にわたって生存及び体重をモニタした。この試験は、ＭＤ３６０６が１ｍｇ／ｋｇもの低い用量に至るまでＢ／フロリダ／４／２００６に対する完全防御を提供することを示している。対照的に基準抗体ＣＲ９１１４は、最も高い５ｍｇ／ｋｇの用量で部分的防御を提供するのみである（図１４）。

鼻腔内投与後のＨ３Ｎ２に対するＡ型及びＢ型インフルエンザマルチドメイン抗体ＭＤ２４０７及びＭＤ３６０６のインビボ有効性
例示的マルチドメイン抗体ＭＤ２４０７、ＭＤ３６０６及び基準抗体ＣＲ９１１４を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）に３つの用量（０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ又は０．５ｍｇ／ｋｇ）のＭＤ２４０７、ＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４を鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の８匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを２５×ＬＤ５０のインフルエンザ株Ａ／香港／１／１９６８−ＭＡ（Ｈ３Ｎ２）で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２１日間にわたって生存及び体重をモニタした。この試験は、ＭＤ２４０７及びＣＲ９１１４が、それぞれ０．１及び０．５ｍｇ／ｋｇの低い用量に至るまでＡ／香港／１／１９６８−ＭＡに対する完全防御を提供することを示している。ＭＤ３６０６は、最も低い０．０２ｍｇ／ｋｇの用量であっても完全防御を提供する（図１５）。

静脈内投与後のＨ３Ｎ２に対するＡ型及びＢ型インフルエンザマルチドメイン抗体ＭＤ３６０６のインビボ有効性
例示的マルチドメイン抗体ＭＤ３６０６及び基準抗体ＣＲ９１１４を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）に３つの用量（０．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇ）のＭＤ３６０６又はＣＲ９１１４を静脈内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の８匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを２５×ＬＤ５０のインフルエンザ株Ａ／香港／１／１９６８−ＭＡ（Ｈ３Ｎ２）で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２１日間にわたって生存及び体重をモニタした。用量１．７ｍｇ／ｋｇもの低さに至るまでのＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４の投与が、媒体対照群と比較して生存率の統計学的に有意な改善をもたらした。５又は１．７ｍｇ／ｋｇ ＭＤ３６０６で治療したマウスは、同じ用量のＣＲ９１１４で治療したマウスよりも小幅な体重減少を示した（図１６）。

鼻腔内投与後のＨ１Ｎ１に対するＡ型及びＢ型インフルエンザマルチドメイン抗体ＭＤ２４０７及びＭＤ３６０６のインビボ有効性
例示的マルチ抗体ＭＤ２４０７、ＭＤ３６０６及び基準抗体ＣＲ９１１４を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）に３つの用量（０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ又は０．５ｍｇ／ｋｇ）のＭＤ２４０７、ＭＤ３６０６又はＣＲ９１１４を鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の８匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを２５×ＬＤ５０のインフルエンザ株Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２１日間にわたって生存及び体重をモニタした。０．２５及び０．０５ｍｇ／ｋｇ ＭＤ２４０７又はＣＲ９１１４の投与は、媒体対照群と比較して生存率の統計学的に有意な改善をもたらした一方、ＭＤ３６０６については、この改善は最も低い０．０１ｍｇ／ｋｇの用量に至るまで有意であった（図１７）。

静脈内投与後のＨ１Ｎ１に対するＡ型及びＢ型インフルエンザマルチドメイン抗体ＭＤ３６０６のインビボ有効性
例示的マルチドメイン抗体ＭＤ３６０６及び基準抗体ＣＲ９１１４を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）に３つの用量（０．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇ）のＭＤ３６０６又はＣＲ９１１４を静脈内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の８匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを２５×ＬＤ５０のインフルエンザ株Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２１日間にわたって生存及び体重をモニタした。１．７及び５ｍｇ／ｋｇ ＭＤ３６０６及び５ｍｇ／ｋｇ ＣＲ９１１４の投与は、媒体対照群と比較して生存率の統計学的に有意な改善をもたらした（図１８）。

実施例１１：ｓｄＡｂヒト化
ｓｄＡｂ ＳＤ１０３６、ＳＤ１０３８、ＳＤ１０４６、ＳＤ１０８３、ＳＤ１０８４及びＳＤ１０８７のタンパク質配列をＩＭＧＴヒトＶ遺伝子データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に対してＢＬＡＳＴにかけた。続いて各ｓｄＡｂを最も相同なヒトＶ遺伝子配列とアラインメントした。各ｓｄＡｂのＦＲ４配列をヒトＪコンセンサス配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳとアラインメントした。アラインメントしたヒトＶ及びＪ配列と比べたｓｄＡｂフレームワーク領域（ＦＲ）におけるアミノ酸の違いを表３９に示す。

続いて、異なる組み合わせの非ヒトＦＲ残基をそれらのヒト均等物に置き換えた、複数の一連のｓｄＡｂ変異体を作製した。全ての変異体で、ＦＲ２の残基３７、４４、４５及び４７並びにＦＲ４の１０３は維持した。可能性のあるＭｅｔ酸化部位を取り除くため、２つのＭｅｔ残基（一方はＳＤ１０８７のＣＤＲ２に位置し、他方はＳＤ１０３８のＣＤＲ３に位置する）も突然変異させた。ｓｄＡｂ ＳＤ１０３６、ＳＤ１０３８、ＳＤ１０４６、ＳＤ１０８３、ＳＤ１０８４及びＳＤ１０８７の全ての変異体のアミノ酸配列を表４０に掲載する。ヒト化ｓｄＡｂ変異体は、温度安定性、（ＨＥＫ２９３細胞における）発現レベル及びインビトロ中和活性について分析した。温度安定性は、選択したｓｄＡｂに関して、ＤＳＣを用いてそれらの融解温度を計測することにより評価した。インビトロ中和活性は、ＭＤＣＫ細胞及び約１００ ＴＣＩＤ_５０のインフルエンザウイルスを使用した標準３日間ＶＮＡで決定した。ＩＣ_５０値、融解温度及び発現レベルを表４１〜表４３に掲載する。アラインメントしたヒトＶ及びＪ配列と比べたｓｄＡｂフレームワーク領域（ＦＲ）における異なるアミノ酸の数並びに％ＦＲ同一性計算値も掲載する。

ＳＤ１０３６のヒト化：
ＳＤ１０３６については、１１個のヒト化変異体を作製した。これらの変異体のうちの幾つかは、親ｓｄＡｂと等しい、又は場合によってはむしろ良好な中和活性を示した。発現レベルに大きい差は観察されなかった一方、ＳＤ１０３６変異体の大多数について、融解開始温度が増加した。変異体ＳＤ３０９７は、試験した全てのグループ２インフルエンザ株のなかでヒト生殖細胞系列に対するＦＲ突然変異数が最も少なく、Ｔ_ｍ開始値が高く、加えて強力な中和を示すため、これを最終的なヒト化変異体として選択した。

ＳＤ１０３８のヒト化：
ＳＤ１０３８については、２１個のヒト化変異体を作製した。ＳＤ３０３１〜３３を除く全ての変異体が、親ｓｄＡｂとしての４つのグループ１株と同程度の中和活性を示した。ＳＤ１０３８変異体のほとんどについて、Ｈ３株Ａ／ブリスベン／１０／０７及びＡ／香港／１／６８に対するＩＣ_５０値がやや高かった。変異体ＳＤ３１１９は、試験した全てのインフルエンザ株のなかでヒト生殖細胞系列に対するＦＲ突然変異数が最も少なく、Ｔ_ｍ開始値が高く、且つ強力な中和を示すため、これを最終的なヒト化変異体として選択した。この変異体では、ＣＤＲ３のＭｅｔがＩｌｅに置き換えられている。

ＳＤ１０４６のヒト化：
ＳＤ１０４６については、１１個のヒト化変異体を作製した。第１の一連の変異体は、親ｓｄＡｂと比較して中和活性の強い低下を示した。第２の一連の変異体を作製し、これらはＶＮＡにおいてＳＤ１０４６と極めて類似した活性を示した。これらの変異体のうち、ＳＤ３０９９は、ヒト生殖細胞系列に対するＦＲ突然変異数が最も少なく、且つ高い温度安定性を示すため、これを最終的なヒト化変異体として選択した。

ＳＤ１０８３のヒト化：
ＳＤ１０８３については、１０個のヒト化変異体を作製した。これらの変異体のうちの幾つかはＨＥＫ２９３細胞で低い発現レベルを示し、２つは全く発現しなかった。十分に発現した３つの変異体のうち、ＳＤ３０８７を最終的なヒト化変異体として選択した。このｓｄＡｂは、ＶＮＡにおいて親ＳＤ１０８３よりも強力で、且つＴ_ｍ開始値が実質的に高い。

ＳＤ１０８４のヒト化：
ＳＤ１０８４については、６個のヒト化変異体を作製した。これらの変異体のうちの４つが、ＶＮＡにおいて親ｓｄＡｂと同程度の中和活性を示した。これらの変異体のうち、ＳＤ３０８５は、Ｔ_ｍ開始値が最も高く、且つヒト生殖細胞系列と比べてＦＲ突然変異が僅か２つであるため、これを最終的なヒト化変異体として選択した。

ＳＤ１０８７のヒト化：
ＳＤ１０８７については、２３個のヒト化変異体を作製した。第１の一連の８個の変異体は、ＶＮＡにおいて２つのＢ型インフルエンザ株と比べて計測可能な活性を示さなかった。第２の一連のＳＤＡｂを作製し、これには、ＳＤ１０８７と同程度のＩＣ_５０値を示す幾つもの変異体が含まれた。これらの変異体の温度安定性は親分子より低かった。ＣＤＲ２にＭｅｔの置換を含むこれらの変異体のいずれも、ＶＮＡにおいて活性を示さなかった。ＳＤ３０９３は、Ｔ_ｍ開始値の低下が少なく、ＶＮＡにおけるその活性がＳＤ１０８７と同等であったためこれを最終的なヒト化変異体として選択した。

実施例１２：ヒト化ｓｄＡｂ多量体Ｆｃ融合コンストラクトの生成及び特徴付け
Ｆｃ融合コンストラクトの生成
実施例１１に記載するヒト化ｓｄＡｂ変異体を使用して多量体Ｆｃ融合コンストラクトを生成した。ヒト化多量体結合分子、即ち少なくとも２つのヒト化ｓｄＡｂを含む多量体結合分子を、Ｆｃ領域のＮ末端に直接融合した。Ｆｃ融合コンストラクトを哺乳類細胞で発現させて、二量体Ｆｃ分子として培地中に分泌させた。これらのＦｃ融合コンストラクトの完全なアミノ酸配列を表４４に示す。ホモ二量体並びにヘテロ二量体Ｆｃ融合分子を生成した。ヘテロ二量体Ｆｃ融合物は、Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）によって記載されるとおり２つのＦｃ鎖のＣＨ３ドメインに単一点突然変異（Ｋ４０９Ｒ及びＦ４０５Ｌ）を導入することによるか、又は欧州特許第０８１２３５７Ｂ１号明細書及び欧州特許第０９７９２８１Ｂ１号明細書に記載されるとおりノブ・イントゥ・ホール突然変異を導入することにより生成した。

ヒト化ｓｄＡｂ多量体Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子コンストラクトを哺乳類細胞発現にコドン最適化し、Ｌｏｎｚａ ｐＥＥ１２．４ベクターに導入した。これらの発現ベクター（ＣＤ４ ＨＣシグナルペプチドを利用する）を増幅し、精製し、滅菌水中＞５ｍｇ／ｍＬの最終濃度に濃縮して、電気穿孔を用いてＣＨＯ細胞株にトランスフェクトした。２つの個々の鎖をコードする等量のベクターのコトランスフェクションにより、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を作製した。上述のとおり単一のベクターコンストラクトを使用してホモ二量体Ｆｃ融合物を作製した。標準的な懸濁相振盪フラスコ手順を用いて細胞培養物を成長させた。ろ過した培養上清をＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラムに適用し、ＰＢＳで洗浄し、０．１Ｍ酢酸ナトリウム ｐＨ３．５で溶出し、２．５Ｍトリス ｐＨ７．２を用いて中和して、ｄＰＢＳに透析した。

ヒト化ｓｄＡｂ多量体Ｆｃ融合タンパク質によるインフルエンザ中和
精製Ｆｃ融合タンパク質を実施例６に記載されるとおりのインフルエンザウイルス中和アッセイで試験し、対応する野生型バージョンと比較したときに同程度の効力及び範囲が示された。種々のインフルエンザ株に対する平均中和力価を表４５に要約する。

参考文献
Ａｄａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１４；２１（１１）：１５２８−１５３３．
Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１３；８（１２）：ｅ８００３４．
Ｃｏｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１１；３３３：８５０−８５６．
Ｄｒｅｙｆｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２；３３７：１３４３−１３４８．
Ｅｋｉｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９；３２４：２４６−２５１．
Ｅｋｉｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１１；３３３：８４３−８５０．
Ｅｋｉｅｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１２；４８９：５２６−５３２．
Ｈｅｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２００７；４４９：１０１−１０４．
Ｈｕｆｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１４；９（８）：ｅ１０３２９４．
Ｈｕｌｔｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１１；６（４）：ｅ１７６６５．
Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ，２００９；１５（８）：９０１−９０６．
Ｋａｓｈｙａｐ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．，２０１０；６：ｅ１０００９９０．
Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ，２０１２；４（６）：６５３−６６３
Ｋｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，２０１２；８６：６３３４−６３４０．
Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ，２０１１；３（５）：４２２−４３０．
Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ，２０１３；１１０（１３）：５１４５−５０．
Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０１２；１０９：１７０４０−１７０４５．
Ｌｉｍｂｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．，２０１３；５（１８７）：１−８．
Ｓｔｒｏｈｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９；２０：６８５−６９１．
Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２００９；１６：２６５−２７３．
Ｓｕｓｃｏｖｉｃｈ ａｎｄ Ａｌｔｅｒ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，２０１５；１４（２）：２０５−２１９．
Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，２０１２；８６：６１７９−６１８８．
Ｔｈｒｏｓｂｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２００８；３：ｅ３９４２．
Ｔｉｌｌｉｂ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．，２０１３；９７（３）：２４５−５４．
Ｔｓｉｂａｎｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．，２０１２；８：ｅ１００３０６７．
Ｖａｎｌａｎｄｓｃｈｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１；９２（３），３８９−４０７．
Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．，２０１０ｂ；６：ｅ１０００７９６．
Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０；３２８（５９７６）：３５７−６０．
Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．，２００９；５：ｅ１０００３５０．

Claims (22)

1. 系統発生学的グループ２の２つの異なるＨＡ亜型のＨＡを含む少なくとも２つのＡ型インフルエンザウイルス株のヘマグルチニン（ＨＡ）との特異的結合能を有するか；又は系統発生学的グループ１の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株及び系統発生学的グループ２の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株のヘマグルチニン（ＨＡ）との特異的結合能を有するか；又は少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株のヘマグルチニン（ＨＡ）との特異的結合能を有するシングルドメイン抗体。
2. ＨＡの茎部領域のエピトープに結合する、請求項１に記載のシングルドメイン抗体。
3. Ｂ型インフルエンザＨＡの頭部領域のエピトープに結合する、請求項１に記載のシングルドメイン抗体。
4. ラクダ科動物ＶＨＨである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体。
5. 系統発生学的グループ２の２つの異なるＨＡ亜型のＨＡを含む少なくとも２つのＡ型インフルエンザウイルス株；又は系統発生学的グループ１の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株及び系統発生学的グループ２の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株；又は少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株の中和能を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体。
6. 配列番号２２７、２２８及び２２９から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２３０、２３１及び２３２から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２３３、２３４及び２３５から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２３６、２３７及び２３８から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２３９、２４０及び２４１から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２４２、２４３及び２４４から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２４５、２４６及び２４７から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２４８、２４９、及び２５０から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２５１、２５２及び２５３から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２５４、２５５及び２５６から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２５７、２５８及び２５９から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２６０、２６１及び２６２から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２６３、２６４及び２６５から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２６６、２６７及び２６８から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２６９、２７０及び２７１から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２７２、２７３及び２７４から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２７５、２７６及び２７７から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２７８、２７９及び２８０から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２８１、２８２及び２８３から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２８４、２８５及び２８６から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２８７、２８８及び２８９から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２９０、２９１及び２９２から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２９３、１２２及び１２３から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号１２４、１２５及び１２６から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号１２７、１２８及び１２９から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号１３０、１３１及び１３２から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号１３３、１３４及び１３５から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号１３６、１３７及び１３８から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；又は
   配列番号１３９、１４０及び１４１から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上
   を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体。
7. 配列番号１〜２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体。
8. ヒト化ラクダ科動物ＶＨＨである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体。
9. 前記ヒト化シングルドメイン抗体が、配列番号１４６〜２２６及び配列番号３４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のシングルドメイン抗体。
10. Ｆｃテールを更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体。
11. 前記ＦｃテールがヒトＩｇＧ Ｆｃテールである、請求項１０に記載のシングルドメイン抗体。
12. 少なくとも２つの、請求項１〜９のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体を含むマルチドメイン抗体。
13. 系統発生学的グループ１の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株、系統発生学的グループ２の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株及び少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株のヘマグルチニン（ＨＡ）との特異的結合能を有する、請求項１２に記載のマルチドメイン抗体。
14. 系統発生学的グループ１の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株及び系統発生学的グループ２の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株及び少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株の中和能を有する、請求項１２又は１３に記載のマルチドメイン抗体。
15. Ｆｃテールを更に含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗体。
16. 前記ＦｃテールがヒトＩｇＧ Ｆｃテールである、請求項１５に記載のマルチドメイン抗体。
17. 配列番号３０〜１０７、配列番号１１０〜１２１及び配列番号２９３〜３３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗体。
18. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体又は請求項１２〜１７のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗体をコードする核酸分子。
19. 請求項１８に記載の核酸分子を含むベクター。
20. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗体、請求項１８に記載の核酸分子、及び／又は請求項１９に記載のベクターを含む医薬組成物。
21. インフルエンザ感染の診断、予防及び／又は治療において使用される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗体、請求項１８に記載の核酸分子、又は請求項１９に記載のベクター。
22. インフルエンザ感染の診断、予防及び／又は治療用医薬の製造における、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗体、請求項１８に記載の核酸分子、又は請求項１９に記載のベクターの使用。