HK1250725B - 中和抗流感结合分子及其用途 - Google Patents

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中和抗流感结合分子及其用途

相关申请的交叉引用

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技术领域

本发明涉及具有针对甲型和乙型流感病毒的广泛中和活性的双特异性抗体并且涉及此类抗体的用途。

背景技术

流感病毒引起年度流感流行和偶然的大流行，这对全世界公共健康构成重大威胁。季节性流感感染与每年200,000-500,000例死亡相关，特别是在幼儿、免疫功能低下的患者和老年人中。死亡率典型地在具有大流行性流感爆发的季节期间进一步增加。仍然存在对用于预防和治疗流感感染(特别是在服务不足的人群中)的强效抗病毒疗法的显著未满足的医疗需求。

存在三种类型的流感病毒，甲型、乙型和丙型。大多数流感疾病是由甲型和乙型流感病毒引起的(Thompson等人(2004)JAMA，292：1333-1340；和Zhou等人(2012)ClinInfect.Dis.[临床传染病]54：1427-1436)。流感病毒甲型、乙型和丙型的总体结构是相似的，并且包括围绕中心核的病毒包膜。病毒包膜包括两种表面糖蛋白：血球凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)；HA介导病毒与靶细胞的结合并进入靶细胞，而NA参与后代病毒从感染细胞的释放。

HA蛋白负责与宿主细胞受体的结合以及病毒和宿主细胞膜的融合，并且是保护性体液免疫反应的主要靶标。HA蛋白是三聚体结构的并且包括单一多肽前体HA0的三个相同拷贝，该多肽前体在蛋白水解成熟时裂解成含有球状头部(HA1)和茎区(HA2)的亚稳定的中间体(Wilson等人(1981)Nature[自然]，289：366-373)。膜远侧“球状头部”构成HA1结构的大部分并且包含用于病毒进入的唾液酸结合口袋和主要抗原结构域。从HA2和HA1残基组装的膜近侧“茎部”结构包含融合机器，其在晚期核内体的低pH环境中经历构象变化以便触发膜融合和渗透至细胞中。甲型流感亚型之间的序列同源性程度在HA1中(亚型之间34％-59％同源性)比在HA2区中(51％-80％同源性)低。

甲型流感病毒可以基于血球凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因中的基因变异而分类为亚型。血清学上，可以将甲型流感分为18个HA亚型，该18个HA亚型进一步分为两个不同系统发生组：组1(亚型H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17和H18)和组2(亚型H3、H4、H7、H10、H14和H15)。目前，在季节性流行病中，甲型流感H1和H3HA亚型主要与人类疾病相关，而编码H5、H7、H9和H10的病毒由于来自动物的直接传播引起分散性人类爆发。与甲型流感病毒相反，乙型流感病毒限于人类感染，并且乙型流感病毒不基于两种表面糖蛋白分为亚型。事实上，直至20世纪70年代，乙型流感病毒被分类为一个同质的组。然而，在整个20世纪70年代，乙型流感病毒开始分歧为两个抗原性可区分的世系，其在它们的第一个代表之后分别被命名为维多利亚(Victoria)和山形(Yamagata)世系，B/维多利亚/2/87和B/山形/16/88。(Biere等人，(2010)J Clin Microbiol[临床微生物学杂志]，48(4):1425-7；doi:10.1128/JCM.02116-09，电子出版2010年1月27日)。维多利亚和山形世系都促成年度流行病。尽管由乙型流感病毒引起的发病率低于与甲型H3N2流感相关的发病率，但它高于与甲型H1N1流感相关的发病率(Zhou等人(2012)Clin Infect.Dis.[临床传染病]54：1427-1436)。

由流感病毒感染引发的中和抗体通常靶向可变HA1球状头部以便防止病毒受体结合且通常是毒株特异性的。中和一种或多种亚型或世系的广泛的交叉反应性抗体是罕见的。最近，已经发现一些抗体可以中和组1和2中的多种亚型甲型流感病毒(Corti等人(2011)Science[科学]333(6044):850-856，Li等人(2012)PNAS 109(46):18897-18902，Dreyfus等人(2012)Science[科学]337(6100):1343-1348，以及Nakamura等人(2013)CellHost and Microbe[宿主细胞和微生物]14:93-103)或两个世系的乙型流感病毒(Dreyfus等人(2012)Science[科学]337(6100):1343-1348和Yasugi等人(2013)PLoS Path[PLoS病原体]9(2):e1003150.doi:10.1371/journal.ppat.1003150)，尽管大多数在广泛的覆盖面的宽度、阻力特征或效力上都有局限性。已经描述了仅一种抗体结合甲型流感和乙型流感HA蛋白，尽管当进行治疗给予时，此抗体在功能上不中和乙型流感病毒或减轻疾病(Dreyfus等人(2012)Science[科学]337(6100):1343-1348)。迄今为止，没有广泛中和或抑制广谱甲型流感病毒和乙型流感病毒感染或减轻由甲型流感病毒和乙型流感病毒引起的疾病的可用抗体。因此，需要鉴定防御多种流感病毒的新抗体。

发明内容

在一个实施例中，提供了特异地结合至甲型流感病毒和乙型流感病毒的分离的结合分子。在一个实施例中，该分离的结合分子包括第一结合结构域，该第一结合结构域能够结合至甲型流感病毒血球凝集素(HA)并中和至少一个组1亚型和至少1个组2亚型的甲型流感病毒；以及第二结合结构域，该第二结合结构域能够结合至乙型流感病毒血球凝集素(HA)并且中和处于至少两种系统发生的不同世系的乙型流感病毒。在一个实施例中，该第一结合结构域能够中和选自以下各项的一种或多种甲型流感病毒组1亚型：H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17、H18及其变体；以及选自以下各项的一种或多种甲型流感病毒组2亚型：H3、H4、H7、H10、H14和H15及其变体。在一个实施例中，该第二结合结构域能够中和处于山形和维多利亚世系两者的乙型流感病毒。

在一个实施例中，结合分子的第一结合结构域包括抗甲型流感病毒抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，结合分子的第二结合结构域包括抗乙型流感病毒抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，结合分子包括抗体重链的至少一个VH和抗体轻链的至少一个VL。在更具体的实施例中，第一结合结构域包括抗体重链的至少一个VH和抗体轻链的至少一个VL。在一个实施例中，第二结合结构域包括抗体重链的至少一个VH和抗体轻链的至少一个VL。

在一个实施例中，结合分子的第一结合结构域包括一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中该组六个CDR具有选自以下各项的氨基酸序列：

(a)与以下各项具有至少75％一致性的氨基酸序列：SEQ ID NO.:8的HCDR1、SEQID NO.:9的HCDR2、SEQ ID NO.:10的HCDR3、SEQ ID NO.:3的LCDR1、SEQ ID NO.:4的LCDR2和SEQ ID NO.:5的LCDR3；

(b)氨基酸序列：SEQ ID NO.:8的HCDR1、SEQ ID NO.:9的HCDR2、SEQ ID NO.:10的HCDR3、SEQ ID NO.:3的LCDR1、SEQ ID NO.:4的LCDR2和SEQ ID NO.:5的LCDR3；

(c)与以下各项具有至少75％一致性的氨基酸序列：SEQ ID NO.:18的HCDR1、SEQID NO.:19的HCDR2、SEQ ID NO.:20的HCDR3、SEQ ID NO.:13的LCDR1、SEQ ID NO.:14的LCDR2、SEQ ID NO.:15的LCDR3；以及

(d)氨基酸序列：SEQ ID NO.:18的HCDR1、SEQ ID NO.:19的HCDR2、SEQ ID NO.:20的HCDR3、SEQ ID NO.:13的LCDR1、SEQ ID NO.:14的LCDR2、SEQ ID NO.:15的LCDR3。

在一个实施例中，结合分子的第一结合结构域包括VH，该VH具有与选自SEQ IDNO.:7和SEQ ID NO.:17的氨基酸序列具有至少75％一致性的氨基酸序列。在一个实施例中，结合分子的第一结合结构域包括VL，该VL具有与选自SEQ ID NO.:2的氨基酸序列具有至少75％一致性的氨基酸序列；以及SEQ ID NO.:12的VL。在更具体的实施例中，结合分子的第一结合结构域包括VH和VL，该VH和VL分别与选自以下各项的VH和VL的氨基酸序列具有至少75％一致性：SEQ ID NO.:7的VH和SEQ ID NO.:2的VL；以及SEQ ID NO.:17的VH和SEQID NO.:12的VL。在一个实施例中，第一结合结构域包括选自以下各项的VH和VL：SEQ IDNO.:7的VH和SEQ ID NO.:2的VL；以及SEQ ID NO.:17的VH和SEQ ID NO.:12的VL。

在一个实施例中，第二结合结构域包括一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中该组六个CDR具有选自以下各项的氨基酸序列：

(a)与以下各项具有至少75％一致性的氨基酸序列：SEQ ID NO.:28的HCDR1、SEQID NO.:29的HCDR2、SEQ ID NO.:30的HCDR3、SEQ ID NO.:23的LCDR1、SEQ ID NO.:24的LCDR2和SEQ ID NO.:25的LCDR3；

(b)氨基酸序列：SEQ ID NO.:28的HCDR1、SEQ ID NO.:29的HCDR2、SEQ ID NO.:30的HCDR3、SEQ ID NO.:23的LCDR1、SEQ ID NO.:24的LCDR2和SEQ ID NO.:25的LCDR3；

(c)与选自以下各项的氨基酸序列具有至少75％一致性的氨基酸序列：SEQ IDNO.:44的HCDR1、SEQ ID NO.:45的HCDR2、SEQ ID NO.:46的HCDR3、SEQ ID NO.:39的LCDR1、SEQ ID NO.:40的LCDR2和SEQ ID NO.:41的LCDR3；

(d)氨基酸序列：SEQ ID NO.:44的HCDR1、SEQ ID NO.:45的HCDR2、SEQ ID NO.:46的HCDR3、SEQ ID NO.:39的LCDR1、SEQ ID NO.:40的LCDR2和SEQ ID NO.:41的LCDR3；

(e)与以下各项具有至少75％一致性的氨基酸序列：SEQ ID NO.:60的HCDR1、SEQID NO.:61的HCDR2、SEQ ID NO.:62的HCDR3、SEQ ID NO.:55的LCDR1、SEQ ID NO.:56的LCDR2、SEQ ID NO.:57的LCDR3；以及

(f)氨基酸序列：SEQ ID NO.:60的HCDR1、SEQ ID NO.:61的HCDR2、SEQ ID NO.:62的HCDR3、SEQ ID NO.:55的LCDR1、SEQ ID NO.:56的LCDR2、SEQ ID NO.:57的LCDR3。

在一个实施例中，结合分子的第二结合结构域包括VH，该VH具有与选自以下各项的VH的氨基酸序列具有至少75％一致性的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO.:27的VH；

(b)SEQ ID NO.:33的VH；

(c)SEQ ID NO.:36的VH；

(d)SEQ ID NO.:43的VH；

(e)SEQ ID NO.:49的VH；

(f)SEQ ID NO.:52的VH；

(g)SEQ ID NO.:59的VH；以及

(h)SEQ ID NO.:65的VH。

在一个实施例中，结合分子的第二结合结构域包括VL，该VL具有与选自以下各项的VL的氨基酸序列具有至少75％一致性的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO.:22的VL；

(b)SEQ ID NO.:32的VL；

(c)SEQ ID NO.:35的VL；

(d)SEQ ID NO.:38的VL；

(e)SEQ ID NO.:48的VL；

(f)SEQ ID NO.:51的VL；

(g)SEQ ID NO.:54的VL；以及

(h)SEQ ID NO.:64的VL。

在一个实施例中，结合分子的第二结合结构域包括VH和VL，该VH和VL分别与选自以下各项的VH和VL的氨基酸序列具有至少75％一致性：

(a)SEQ ID NO.:27的VH和SEQ ID NO.:22的VL；

(b)SEQ ID NO.:33的VH和SEQ ID NO.:32的VL；

(c)SEQ ID NO.:36的VH和SEQ ID NO.:35的VL；

(d)SEQ ID NO.:43的VH和SEQ ID NO.:38的VL；

(e)SEQ ID NO.:49的VH和SEQ ID NO.:48的VL；

(f)SEQ ID NO.:52的VH和SEQ ID NO.:51的VL；

(g)SEQ ID NO.:59的VH和SEQ ID NO.:54的VL；以及

(h)SEQ ID NO.:65的VH和SEQ ID NO.:64的VL。

在一个实施例中，结合分子的第二结合结构域包括选自以下各项的VH和VL：

(a)SEQ ID NO.:27的VH和SEQ ID NO.:22的VL；

(b)SEQ ID NO.:33的VH和SEQ ID NO.:32的VL；

(c)SEQ ID NO.:36的VH和SEQ ID NO.:35的VL；

(d)SEQ ID NO.:43的VH和SEQ ID NO.:38的VL；

(e)SEQ ID NO.:49的VH和SEQ ID NO.:48的VL；

(f)SEQ ID NO.:52的VH和SEQ ID NO.:51的VL；

(g)SEQ ID NO.:59的VH和SEQ ID NO.:54的VL；以及

(h)SEQ ID NO.:65的VH和SEQ ID NO.:64的VL。

在一个实施例中，结合分子包括至少两个抗体重链和至少两个抗体轻链。在一个实施例中，结合分子包括双特异性抗体。在一个实施例中，结合分子的一个或多个结合结构域包括可变片段(Fv)结构域。在一个实施例中，结合分子的一个或多个结合结构域包括scFv分子。在一个实施例中，结合分子的一个或多个结合结构域包括Fv结构域，并且一个或多个结合结构域包括scFv分子。在更具体的实施例中，结合分子的第一结合结构域包括抗甲型流感病毒Fv结构域。在一个实施例中，结合分子包括Fv结构域，该Fv结构域包括抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，并特异地结合抗甲型流感病毒。在一个实施例中，结合分子的第二结合结构域包括抗乙型流感病毒scFv分子。

在一个实施例中，第一结合结构域包括抗甲型流感病毒Fv结构域，并且第二结合结构域包括抗乙型流感病毒scFv分子。在一个实施例中，第一结合结构域的Fv结构域包含重链(HC)，该重链具有含氨基末端和羧基末端的多肽链，以及轻链(LC)，该轻链具有含氨基末端和羧基末端的多肽链，并且

(a)第二结合结构域共价连接至第一结合结构域的HC的羧基末端；

(b)第二结合结构域共价连接至第一结合结构域的HC的氨基末端；

(c)第二结合结构域共价连接至第一结合结构域的LC的氨基末端；或者

(d)第二结合结构域共价地插入第一结合结构域的HC的多肽链中。

在一个实施例中，该结合分子包括具有一个或多个N-末端结构域的抗体或其片段，其中一个或多个scFv分子共价附接至抗体或其片段的一个或多个N-末端结构域。在一个实施例中，抗体或其片段的N-末端结构域包括一个或多个Fv结构域，并且一个或多个scFv分子共价附接至抗体或其片段的一个或多个Fv结构域。在一个实施例中，N-末端结构域包括Fv结构域，该Fv结构域包括可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)。在一个实施例中，一个或多个scFv分子共价附接至抗体或其片段的一个或多个轻链可变结构域(VL)。在一个实施例中，该结合分子包括抗体或其片段，该抗体或其片段包括具有式scFv-L1-VL-CL的抗体轻链，其中scFv是scFv分子、L1是接头、VL是轻链可变结构域、CL是轻链恒定结构域、并且VL是轻链可变结构域。在一个实施例中，一个或多个scFv分子共价附接至抗体或其片段的一个或多个重链可变结构域(VH)。在一个实施例中，该重链包括式scFv-L1-VH-CH1-CH2-CH3，其中scFv是scFv分子、L1是接头、VH是重链可变结构域、CH1是重链恒定结构域结构域1、CH2是重链恒定结构域结构域2、并且CH3是重链恒定结构域结构域3。

在一个实施例中，该结合分子包括具有与选自SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:17的氨基酸VH结构域序列具有至少75％一致性的氨基酸序列的可变重链结构域(VH)。在一个实施例中，该结合分子包括具有与选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:12的氨基酸VL结构域序列具有至少75％一致性的氨基酸序列的可变轻链结构域(VL)。

在一个实施例中，该结合分子包括具有C-末端结构域的抗体或其片段，其中一个或多个scFv分子共价附接至抗体或其片段的C-末端结构域。在一个实施例中，该结合分子包括分别具有第一和第二C-末端结构域的第一和第二重链，其中一个或多个scFv分子共价附接至第一重链、第二重链、或其组合的C-末端结构域。在一个实施例中，该结合分子包括包括一个或多个重链恒定结构域的抗体或其片段，其中一个或多个scFv分子插入在一个或多个重链的一个或多个重链恒定结构域之间的重链中。在一个实施例中，一个或多个重链包括式VH-CH1-CH2-CH3，其中VH是重链可变结构域、CH1是重链恒定结构域结构域1、CH2是重链恒定结构域结构域2、并且CH3是重链恒定结构域结构域3。在一个实施例中，一个或多个重链包括式VH-CH1-L1-scFv-L2-CH2-CH3，其中L1和L2独立地是接头，并且scFv是scFv分子。在一个实施例中，一个或多个重链包括式VH-CH1-CH2-L1-scFv-L2-CH3，其中L1和L2独立地是接头，并且scFv是scFv分子。在一个实施例中，L1和L2独立地包括(a)[GGGGS]n(其中n是0、1、2、3、4或5(SEQ ID NO:93))、(b)[GGGG]n(其中n是0、1、2、3、4或5(SEQ ID NO:106))、或者(a)和(b)的组合。

在一个实施例中，scFv包括式：VH-LS-VL，并且其中VH是重链可变结构域、LS是接头、并且VL是轻链可变结构域。在一个实施例中，LS包括(a)[GGGGS]n(其中n是0、1、2、3、4或5(SEQ ID NO:93))、(b)[GGGG]n(其中n是0、1、2、3、4或5(SEQ ID NO:106))、或者(a)和(b)的组合。

在一个实施例中，第一结合结构域的重链和轻链通过一个或多个二硫键连接。在更具体的实施例中，第二结合结构域的scFv包括重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，并且scFv的VH在选自以下位置中的位置处包括半胱氨酸残基：43、44、100、101、105、及其组合，并且scFv的VL在选自以下位置中的位置处包括半胱氨酸残基：43、44、46、49、50、100、及其组合。在一个实施例中，scFv的VL和VH通过选自以下各项的二硫键连接：VL100-VH44、VL43-VH105、VL46-VH101、VL49-VH100、VL50-VH100、及其组合。在一个实施例中，scFv的VH和VL通过选自以下各项的二硫键连接：VH44-VL100、VH100-VL49、VH100-VL50、VH101-VL46、VH105-VL43、及其组合。

在一个实施例中，VH包括一组三个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3，其中该组三个CDR选自以下各项：

(a)与以下各项具有至少75％一致性的氨基酸序列：SEQ ID NO.:28的HCDR1、SEQID NO.:29的HCDR2、SEQ ID NO.:30的HCDR3；

(b)氨基酸序列：SEQ ID NO.:28的HCDR1、SEQ ID NO.:29的HCDR2、SEQ ID NO.:30的HCDR3；

(c)与以下各项具有至少75％一致性的氨基酸序列：SEQ ID NO.:44的HCDR1、SEQID NO.:45的HCDR2、SEQ ID NO.:46的HCDR3；

(d)氨基酸序列：SEQ ID NO.:44的HCDR1、SEQ ID NO.:45的HCDR2、SEQ ID NO.:46的HCDR3；

(e)与以下各项具有至少75％一致性的氨基酸序列：SEQ ID NO.:60的HCDR1、SEQID NO.:61的HCDR2、SEQ ID NO.:62的HCDR3；以及

(f)氨基酸序列：SEQ ID NO.:60的HCDR1、SEQ ID NO.:61的HCDR2、SEQ ID NO.:62的HCDR3。

在一个实施例中，VL包括一组三个CDR：LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中该组三个CDR选自以下各项：

(a)与以下各项具有至少75％一致性的氨基酸序列：SEQ ID NO.:23的LCDR1、SEQID NO.:24的LCDR2和SEQ ID NO.:25的LCDR3；

(b)氨基酸序列：SEQ ID NO.:23的LCDR1、SEQ ID NO.:24的LCDR2和SEQ ID NO.:25的LCDR3；

(c)与以下各项具有至少75％一致性的氨基酸序列：SEQ ID NO.:39的LCDR1、SEQID NO.:40的LCDR2和SEQ ID NO.:41的LCDR3；

(d)氨基酸序列：SEQ ID NO.:39的LCDR1、SEQ ID NO.:40的LCDR2和SEQ ID NO.:41的LCDR3；

(e)与以下各项具有至少75％一致性的氨基酸序列：SEQ ID NO.:55的LCDR1、SEQID NO.:56的LCDR2、SEQ ID NO.:57的LCDR3；以及

(f)氨基酸序列：SEQ ID NO.:55的LCDR1、SEQ ID NO.:56的LCDR2、SEQ ID NO.:57的LCDR3。

在一个实施例中，scFv具有与选自以下各项的氨基酸序列具有至少75％一致性的氨基酸序列：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:63。

在一个实施例中，结合分子是特异地结合至甲型流感病毒和乙型流感病毒的双特异性抗体，包括如下轻链，该轻链具有与SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:68的氨基酸序列具有至少75％一致性的氨基酸序列。在一个实施例中，双特异性抗体包括具有SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:68的氨基酸序列的轻链。在一个实施例中，结合分子是特异地结合至甲型流感病毒和乙型流感病毒的双特异性抗体，并且包括如下重链，该重链具有与SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有至少75％一致性的氨基酸序列。在一个实施例中，该重链具有SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:69的氨基酸序列。在一个实施例中，结合分子是特异地结合至甲型流感病毒和乙型流感病毒的双特异性抗体，并且包括具有与SEQ ID NO:66或SEQID NO:68的氨基酸序列具有至少75％一致性的氨基酸序列的轻链以及具有与SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有至少75％一致性的氨基酸序列的重链。

在一个实施例中，该双特异性抗体包括：

(a)具有包括SEQ ID NO:66的氨基酸序列的轻链以及具有包括SEQ ID NO:67的氨基酸序列的重链；或者

(b)具有包括SEQ ID NO:68的氨基酸序列的轻链以及具有包括SEQ ID NO:69的氨基酸序列的重链。

还提供的是包括或产生在此描述的结合分子或者双特异性抗体或片段的细胞。

还提供的是编码在此描述的结合分子或双特异性抗体的分离的多核苷酸。在一个实施例中，提供了载体，该载体包括编码在此描述的结合分子或双特异性抗体的多核苷酸。

在另一个实施例中，提供了宿主细胞，该宿主细胞包括编码在此描述的结合分子或双特异性抗体的多核苷酸。

在此还提供的是组合物，该组合物包括如在此描述的结合分子或双特异性抗体或其片段，以及药学上可接受的载体。还提供的是试剂盒，该试剂盒包括这样的组合物。在另一个实施例中，提供了在受试者预防或治疗甲型流感病毒或乙型流感病毒感染的方法，其中该方法包括向受试者给予有效量的这样的组合物。

在此还提供的是用于制造如在此描述的结合分子或双特异性抗体或其片段的方法。在一个实施例中，该方法包括在适合于结合分子或双特异性抗体或其片段的表达的条件下培养宿主细胞。在一个实施例中，该方法进一步包括从宿主细胞培养物中分离结合分子。

还提供的是使用在此描述的结合分子或双特异性抗体或其片段的方法。在一个实施例中，将结合分子或双特异性抗体或其片段用于在受试者中预防或治疗甲型流感感染、乙型流感感染或其组合。

在另一个实施例中，在此描述的结合分子或双特异性抗体或其片段适合用于制造用于在受试者中预防或治疗甲型流感感染、乙型流感感染或其组合的药剂。在一个实施例中，在此描述的结合分子或双特异性抗体或其片段用于制造用于在受试者中预防或治疗甲型流感和乙型流感感染的药剂。在一个实施例中，提供了用于在受试者中预防或治疗甲型流感感染、乙型流感感染或其组合的方法，该方法包括向受试者给予有效量的在此描述的结合分子或双特异性抗体或其片段。

在一个实施例中，提供了用于在受试者中预防或治疗甲型流感和乙型流感感染的方法，该方法包括向受试者给予有效量的在此描述的结合分子或双特异性抗体或其片段。

在一个实施例中，在此描述的结合分子或双特异性抗体或其片段适合于在体外诊断受试者中的甲型流感感染、乙型流感感染、或其组合。

附图说明

图1描绘了五种不同双特异性抗体(BiS)主链(BiS1、BiS2、BiS3、BiS4和BiS5)的通用结构式。scFv以深灰色描绘，并且IgG Fv以浅灰色描绘。

图2A-D显示在增加量的GL20/39 BiS4 43/105(Flu BiS)、GL20、或FBC39的存在下孵育的原代人天然杀伤(NK)细胞的ADCC活性。(A)A/加利福尼亚/07/2009 H1N1、(B)A/香港/8/68H3N2、(C)B/马来西亚/2506/2004维多利亚世系、和(D)B/四川(Sichuan)/379/99山形世系感染的A549细胞的感染细胞杀死通过乳酸脱氢酶(LDH)释放来测量。

图3A-C显示GL20/39 BiS4 43/105(Flu BiS)、GL20、或FBC39抗-HA抗体的ADCP和CDC活性。ADCP活性由人类巨噬细胞的百分比表示，这些人类巨噬细胞吞噬表达(A)A/南达科塔(South Dakota)/6/2007H1N1和(B)A/香港/8/68H3N2的HA蛋白质的MDCK靶细胞。(C)通过在幼兔补体的存在下从A/波多黎各(Puerto Rico)/8/34感染的MDCK细胞的LDH释放测量CDC介导的细胞杀死。

图4A-D显示当用致死剂量的A/Wilson Smith N/33H1N1(A和B)、rA/HK/68 H3N2(C和D)流感病毒感染前4小时，向小鼠给予不同浓度的GL20/39 BiS4 43/105(Flu BiS)、GL20、和非相关对照抗体(Ctl.mAb)时，在每个研究组中在感染后5天的存活率(A和C)和肺病毒滴度(B和D)。

图5A-D显示当用致死剂量的(A和B)B/佛罗里达/4/2006山形世系和(C和D)B/马来西亚/2506/2004维多利亚世系流感病毒感染前4小时，向小鼠给予不同浓度的GL20/39BiS4 43/105(Flu BiS)、FBC39、和非相关对照抗体(Ctl.mAb)时，在每个研究组中在感染后5天的存活率(A和C)和肺病毒滴度(B和D)。

图6A-F显示在每个研究组中在感染后5天的存活率(A和B)、肺病毒滴度(C和D)，以及感染后6天通过脉搏血氧仪测量的肺功能(E和F)，其中小鼠用致死剂量的A/WilsonSmith N/33H1N1流感病毒(A、C、E)或B/佛罗里达/4/2006山形世系病毒(B、D、F)感染。每天两次25mg/kg(BID)奥司他韦治疗5天，10mg/kg的GL20/39BiS4 43/105(Flu BiS)或10mg/kg的非相关对照抗体(Ctl.mAb)在不同的时间点(感染后第1天、第2天、第3天、第4天)启动。

具体实施方式

引言

在此描述的是结合分子例如抗体，包括但不限于双特异性抗体、人抗体、抗原结合片段、包括至少两个抗流感病毒结合结构域的其衍生物或轭合物。在一个实施例中，该结合分子包括特异地结合甲型流感病毒的第一结合结构域以及特异地结合乙型流感病毒的第二结合结构域。特异性结合甲型流感病毒的抗体描述在2013年10月2日提交的美国临时专利号61/885,808、和2014年5月23日提交的美国临时专利号62/002,414中，并且特异性结合乙型流感病毒的抗体描述在2014年7月15日提交的美国临时专利号62/024,804中，其中每个专利的披露内容通过引用以其全文特此结合。

在一个实施例中，该第一结合结构域特异地结合甲型流感病毒血球凝集素(HA)茎部。在更具体的实施例中，该第一结合结构域特异地结合甲型流感病毒血球凝集素(HA)茎部，并且中和甲型流感病毒的至少一个组1亚型和至少一个组2亚型。

在一个实施例中，该第二结合结构域特异地结合乙型流感病毒血球凝集素(HA)。在更具体的实施例中，该第二结合结构域特异地结合乙型流感病毒血球凝集素(HA)，并且在两个系统发生的不同世系中中和乙型流感病毒。在一个实施例中，该第二结合结构域特异地结合乙型流感病毒血球凝集素(HA)，并且在山形和维多利亚世系两者中中和乙型流感病毒。在另一个实施例中，该第二结合结构域特异地结合乙型流感病毒血球凝集素(HA)和甲型流感病毒血球凝集素(HA)，并且中和至少一种山形世系乙型流感病毒；至少一种维多利亚世系乙型流感病毒；至少一种甲型流感病毒亚型，及其组合。

在一个实施例中，与任一亲本抗体相比，该结合分子是针对一种或多种甲型流感病毒和/或乙型流感病毒株具有增强的中和活性的双特异性抗体。在一个实施例中，该结合分子是针对一种或多种甲型流感组1或组2病毒株具有增强的中和活性的双特异性抗体。在更具体的实施例中，该结合分子是针对选自以下亚型的甲型流感病毒组1病毒株具有增强的中和活性的双特异性抗体：H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17和H18。在更具体的实施例中，该结合分子是针对选自以下亚型的甲型流感病毒组2病毒株具有增强的中和活性的双特异性抗体：H3、H4、H7、H10、H14和H15。在一个实施例中，该结合分子是针对甲型流感病毒的H9亚型具有增强的中和活性的双特异性抗体。

如在此使用的，术语“中和”是指结合分子(如抗体、或其抗原结合片段)结合至感染原(例如甲型流感和/或乙型流感病毒)，并减少感染原的生物学活性(例如毒力)的能力。在一个实施例中，该结合分子免疫特异地结合甲型流感病毒；乙型流感病毒，或其组合的至少一种特异的表位或抗原决定簇。结合分子可以在病毒的生命周期过程中的不同点中和感染原(如甲型流感病毒和/或乙型流感病毒)的活性。例如，抗体可以通过干扰病毒与一种或多种细胞表面受体的相互作用来干扰该病毒附着至靶细胞。可替代地，抗体可以例如通过干扰经由受体介导的内吞作用进行的病毒内化来干扰该病毒与其受体的一种或多种附着后相互作用。

术语

在详细描述本发明之前，应当了解的是，本发明并不限于特定的组合物或方法步骤，因为这些组合物或方法步骤可以改变。必须注意的是，如本说明书和所附权利要求书中使用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数指代物，除非上下文明确地指示其他的情况。

术语“约”是指数量的变化，这种变化例如通过制备化合物、组合物、浓缩物或配制品所使用的典型测量和处理程序、通过在这些程序中无意的错误、通过执行方法所使用的起始材料或成分的制造、来源或纯度的差异以及类似考虑导致可能发生。术语“约”还涵盖由于化合物、组合物、浓缩物或配制品的老化而与具体起始浓度或混合物不同的量，以及由于混合或处理化合物、组合物、浓缩物或配制品而与具体起始浓度或混合物不同的量。当利用术语“约”修饰时，在此随附的权利要求书包括这些量的等效量。

除非另外定义，否则在本文使用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。例如，Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology[生物医学和分子生物学简明词典]，Juo，Pei-Show(2002)第2版，CRC出版社；Dictionary of Cell and Molecular Biology[细胞和分子生物学词典]，第3版(1999)Academic Press[学术出版社]；以及Oxford Dictionary Of Biochemistry AndMolecular Biology[牛津生物化学和分子生物学词典]，修订版，2000，Oxford UniversityPress[牛津大学出版社]为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的通用词典。

氨基酸可以在此通过它们的通常己知的三字母符号或通过由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号来提及。同样地，核苷酸可以通过它们的普遍公认的单字母代码而被提及。

定义

术语“核酸”或“多核苷酸”涵盖对应于一系列核苷酸的单体单元的任何物理串，包括但不限于核苷酸的聚合物(包括DNA和RNA聚合物)和经修饰的寡核苷酸(例如具有不是溶液中生物RNA或DNA典型的碱基的寡核苷酸，如2’-O-甲基化寡核苷酸)。多核苷酸可以包括常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，如在肽核酸(PNA)中所发现的)。核酸可以是单链的或双链的。除非另外指明，核酸序列涵盖除明确指示的序列之外的互补序列。

术语“基因”广泛用于指代与生物学功能相关联的核酸。因此，基因包括编码序列和/或其表达所需的调节序列。术语“基因”适用于特异性基因组序列，以及由该基因组序列编码的cDNA或mRNA。基因还包括例如形成用于其他蛋白质的识别序列的非表达核酸序列。非表达调节序列包括调节蛋白(如转录因子)结合的“启动子”和“增强子”，导致相邻或邻近序列的转录。例如，编码多肽的多核苷酸可以包括启动子和/或可操作地与一个或多个编码区相关联的其他转录或翻译控制元件。“可操作地相关联”是指基因产物的编码区按以下这种方式与一个或多个调节序列相关联，该方式使得该基因产物的表达处于这种或这些调节序列的影响或控制之下。“基因的表达”或“核酸的表达”是指如上下文指示的将DNA转录为RNA、将RNA翻译为多肽、或转录和翻译两者。

如在此使用的，术语“编码区”是指包括可以翻译氨基酸的密码子的核酸的部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA、或TAA)不翻译为氨基酸，但其通常被认为是编码区的部分。然而，侧翼序列(例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、和内含子)不被认为时编码区的部分。载体可以包含单个编码区，或者可以包含两个或更多个编码区。另外，载体、多核苷酸、或核酸可以编码异源编码区，这些异源编码区融合或未融合至编码感兴趣的基因产物(例如抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物)的核酸。异源编码区包括但不限于特化的元件或基序，如分泌信号肽或异源功能结构域。

术语“载体”是指核酸可以借此在生物体、细胞或细胞组件之间传播和/或传递的手段。载体包括但不限于能够自主地复制或整合至宿主细胞中的染色体的质粒、病毒、噬菌体、前病毒、噬菌粒、转座子、和人工染色体。载体还包括但不限于：不自主复制的裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、在相同链内包括DNA和RNA两者的多核苷酸、聚赖氨酸轭合的DNA或RNA、肽轭合的DNA或RNA、脂质体轭合的DNA。“表达载体”是能够促进并入其中的核酸的表达以及复制的载体如质粒。典型地，有待表达的核酸“可操作地连接”至启动子和/或增强子，并且经由启动子和/或增强子而经受转录调节控制。

术语“宿主细胞”是指含有异源核酸(如载体)的细胞，并支持核酸的复制和/或表达。宿主细胞可以是原核细胞(如大肠杆菌)或真核细胞(如酵母)、昆虫、两栖动物、鸟、或哺乳动物细胞(包括人类细胞，例如HEp-2细胞)和Vero细胞。

当提及异源或分离的核酸时，术语“引入”是指将核酸转移至真核或原核细胞，在该真核或原核细胞中该核酸可以并入细胞的基因组、转化成自主复制子或瞬时表达。术语包括这类方法如“感染”、“转染”、“转化”以及“转导”。可以使用各种方法将核酸引入宿主细胞，包括但不限于电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质介导的转染和脂质转染。

术语“表达”是指在功能性基因产物的合成中使用来自基因的信息的过程。基因产物通常是蛋白质，但也可以是功能性RNA。可以通过在蛋白质水平上确定相应的rRNA、tRNA、mRNA、snRNA和/或基因产物的的存在来检测基因表达。

“多肽”是指包括两个或更多个通过酰胺键(也称为肽键)线性地连接的氨基酸残基的分子，如肽或蛋白质。术语“多肽”是指具有两个或更多个氨基酸的任何一条或多条链，并且不是指产物的具体长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指具有两个或更多个氨基酸的一个或多个链的任何其他术语包含在“多肽”的定义中，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任何一个、或可与其互换使用。术语“多肽”还旨在指多肽在表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团来进行的衍生、蛋白水解裂解或通过非天然存在的氨基酸来进行的修饰。多肽可以来源于天然生物来源或通过重组技术来产生，并且不一定从指定的核酸序列翻译而来。它可以按任何方式、包括通过化学合成来产生。多肽的氨基酸残基可以是天然的或非天然的，并且可以是未经取代的、未经修饰的、取代的或修饰的。根据上下文，“氨基酸序列”是氨基酸残基的聚合物，例如蛋白质或多肽，或表示氨基酸聚合物的字符串。

如在此使用的，术语“抗体”是指包括通过多肽链的折叠形成的至少一个结合结构域的多肽或一组多肽，这些多肽链具有内表面形状和电荷分布与抗原的抗原决定簇的特征互补的三维结合空间。抗体典型地具有四聚体形式，具有两对多肽链，每条链具有一个“轻”链和一个"重"链，其中每条轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点。典型地，每条轻链通过一个共价二硫键与一条重链连接，然而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间变化。每条重链和轻链还具有规律性间隔的链间二硫桥。典型地，每条重链在一端具有可变结构域(VH)，随后是多个恒定结构域(CH)，并且每条轻链在一端具有可变结构域(VL)并且在其另一端具有恒定结构域(CL)，其中轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域比对，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域比对。

如在此使用的，术语“抗体”(antibody和antibodies)和“免疫球蛋白”涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、从至少两个不同表位结合片段形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、CDR-接合的、人抗体、人源化抗体、骆驼科(camelised)抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、单结构域抗体、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段、展现所希望的生物学活性的抗体片段(例如抗原结合部分)、二硫键连接的Fv(dsFv)、以及抗个体基因型(抗-Id)抗体、细胞内抗体、以及任何上述的表位结合片段或衍生物。具体地说，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，含有至少一个抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以具有任何同种型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、亚同种型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或同种异型(例如，Gm如G1m(f、z、a或x)、G2m(n)、G3m(g、b或c)、Am、Em、以及Km(1、2或3))。抗体可以源自于任何哺乳动物物种，包括但不限于人、猴、猪、马、兔、狗、猫、小鼠等等，或其他动物，如禽(例如鸡)。抗体可以与异源多肽序列(例如标记物)融合以促进纯化。

术语“特异地结合”是指将结合分子(如抗体或其片段、变体、或衍生物)与表位经由其抗原结合结构域结合比与随机的、不相关的表位结合更容易。术语“特异性”在此用于对某种结合分子结合至某种表位的相对亲和力进行定性。

如在此使用的，术语“亲和力”是指单独的表位与免疫球蛋白分子的结合结构域的结合强度的度量。

如在此使用的术语“表位”是指能够结合抗体结合结构域的蛋白质决定簇。表位通常包括如氨基酸或糖侧链的分子的化学活性表面基团，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于：在变性溶剂存在下，与前者的结合丧失但与后者的结合不丧失。

术语“分离的”是指生物材料(如核酸或蛋白质)，其基本上不含通常在其天然存在的环境中伴随或与其相互作用的组分。另一方面，分离的材料可以包括没有在其天然环境中发现与该材料一起的材料。例如，如果该材料处于其天然环境(例如细胞)中，该材料可能已经被放置在该环境中发现的材料非天然的细胞位置处。例如，如果将天然存在的核酸通过非天然存在的方式引入该核酸非天然的基因组位点中，则其可以被认为是分离的。此类核酸也被称为“异源”核酸。

术语“重组”是指已经通过人为干预人工地或合成地改变的材料。可以在其自然环境或状态内或从其中除去的材料上进行改变。例如，“重组核酸”可以是指通过重组核酸(例如在克隆、DNA改组或其他程序过程中，或通过化学或其他诱变)制成的核酸；并且“重组多肽”或“重组蛋白质”可以是指通过重组核酸的表达产生的多肽或蛋白质。

如在此使用的，术语“工程化”包括通过合成手段(包括例如重组技术、体外肽合成、肽的酶促或化学偶合或其组合)来操纵核酸或多肽分子。

如在此使用的，术语“有效量”或“治疗有效量”是指对于给定条件和给予方案实现所希望的临床结果所需或足够的治疗组合物的量，例如足以实现能够在受试者中预防或治疗流感感染的化合物的浓度的量。此类量和浓度可以由本领域普通技术人员确定。实际给予的治疗组合物的量将典型地由医师根据有关情况确定，该有关情况包括但不限于待治疗的病症、选择的给予途径、给予的实际化合物、年龄、体重和个体患者的反应、以及患者症状的严重程度。

如在此使用的，术语“治疗组合物”是指具有治疗用途的化合物或组合物，并且包括但不限于生物化合物(如抗体、蛋白质和核酸)、以及化学合成的小的有机分子化合物。

如在此使用的，术语“药物组合物”是指包括治疗有效量的治疗剂连同药学上可接受的载体(以及如果需要，一种或多种稀释剂或赋形剂)的组合物。如在此使用的，术语“药学上可接受的”意指其由联邦政府或州政府的监管机构批准或在美国药典、欧洲药典或其他普遍认可的药典中列出用于哺乳动物并且更具体地用于人。

如在此使用的，术语“协同效应”是指大于由化合物的组合所产生的累加的治疗效应的效应，其中由该组合获得的治疗效应超过了以另外的方式由单独给予单独的化合物所导致的累加效应。某些实施例包括在治疗甲型流感病毒和/或乙型流感病毒感染中产生协同效应的方法，其中所述效应是比相对应的累加效应大至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少200％、至少500％、或至少1000％。

如在此使用的，术语“治疗(treatment或treating)”是指治疗性治疗和防病性或预防性措施两者，其中目的是稳定、预防、减轻或减少一种或多种流感感染症状，或者延缓、预防或抑制流感感染进展。治疗还可以是指在受试者中清除或减少感染原(如甲型流感和/或乙型流感)，“治疗”还可以意指当与不接受治疗的期望的生存期相比延长的生存期。治疗不一定意味着感染完全治愈。

如在此使用的，术语“受试者”或“患者”是指脊索动物亚纲的任何成员，包括但不限于人类和其他灵长类动物，包括非人类灵长类动物(如黑猩猩和其他猿和猴类)。农场动物，如牛、绵羊、猪、山羊和马；驯养的哺乳动物，如狗和猫；实验室动物，包括啮齿类(如小鼠、大鼠和豚鼠)；禽，包括驯养的、野生的和狩猎的禽(如鸡、火鸡和其他鹑鸡类禽、鸭、鹅等)也是非限制性实例。术语"哺乳动物"和"动物"包括在该定义中。旨在覆盖成年和新生的哺乳动物两者。

结合分子

在此描述的是特异性结合至甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的结合分子。如在此使用的，术语“结合分子”是指能够以与抗体结合至抗原相似的方式结合至靶分子或抗原的分子。结合分子的实例包括完整抗体以及此类抗体的抗原结合片段、变体、类似物、或衍生物，例如天然存在的抗体或免疫球蛋白分子或工程化抗体分子或片段(包括双特异性抗体)。结合分子可以包括一个或多个结合结构域。尽管结合分子可以包括标准抗体结构，但是结合分子可以具有包括一个或多个结合结构域的其他结构。在一个实施例中，该结合分子包括至少两个结合结构域和至少两个结合特异性。

如在此使用的，“结合结构域”是指负责特异性结合至靶分子或抗原的结合分子的部分、区域或位点。在一个实施例中，该结合结构域包括抗体的可变片段(Fv)。在一个实施例中，该结合结构域包括抗体的可变重(VH)链序列和可变轻(VL)链序列。在一个实施例中，该结合结构域包括来自用适合的框架(FR)区定位的抗体的一个或多个、两个、三个、四个、五个或六个互补决定区(CDR)。例如如在人源化抗体中，结合结构域可以衍生自单个物种，或者结合结构域可以包括来自一个物种的CDR和来自另一物种的框架序列。

结合分子可以来自任何动物来源，包括但不限于禽和哺乳动物。结合分子的抗体或其片段可以是人类、鼠类、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马或鸡抗体。如在此使用的“人”抗体包含具有人类免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包含从人类免疫球蛋白文库分离的抗体或从针对一种或多种人类免疫球蛋白为转基因的并且不表达内源性免疫球蛋白的动物分离的抗体。

在一个实施例中，该结合分子包括能够结合至和/或中和甲型流感病毒的至少一个结合结构域。在另一个实施例中，该结合分子包括能够结合至和/或中和乙型流感病毒的至少一个结合结构域。在一个实施例中，该结合分子包括能够结合至和/或中和甲型流感病毒的第一结合结构域，以及能够结合至和/或中和乙型流感病毒的第二结合结构域。在更具体的实施例中，该结合分子包括第一结合结构域，该第一结合结构域能够结合至甲型流感病毒血球凝集素(HA)并中和甲型流感病毒的至少一个组1亚型和至少一个组2亚型；以及第二结合结构域，该第二结合结构域能够结合至乙型流感病毒血球凝集素(HA)并中和处于至少两种系统发生的不同世系的乙型流感病毒。在一个实施例中，该第一结合结构域能够中和选自以下各项的一种或多种甲型流感病毒组1亚型：H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17、H18及其变体；以及选自以下各项的一种或多种甲型流感病毒组2亚型：H3、H4、H7、H10、H14和H15及其变体。在一个实施例中，该第二结合结构域能够中和处于山形和维多利亚世系两者的乙型流感病毒。

抗体

该结合分子可以包括全长或完整抗体、抗体片段(包括抗原结合片段)、人类、人源化、翻译后修饰、嵌合或融合抗体、免疫轭合物、或其功能片段。在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域包括全长或完整抗体、或一个或多个抗体片段(包括抗原结合片段)。

抗体的“抗原结合片段”的实例包括：(i)Fab片段，其是包含抗体的VL结构域、VH结构域、CL结构域、以及CH1结构域的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，其是在铰链区包含由二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其包含VH结构域和CH1结构域；(iv)Fv片段，其包含抗体的单臂的VL结构域和VH结构域；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature[自然]341:544-546)，其包含VH结构域；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。抗原结合片段可以通过重组DNA技术，或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解来产生。

在一个实施例中，该抗原结合片段包括单链抗体，该单链抗体包括例如“单链可变片段”或“scFv”。术语“单链可变片段”或“scFv”是指融合蛋白，该融合蛋白包括免疫球蛋白的至少一个重链可变区(VH)和至少一个轻链可变区(VL)。可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些单链抗体片段。例如，可以使用重组方法通过合成接头将由单独的基因编码的Fv片段的VH和VL结构域接合，该合成接头使它们制备为单一多肽链，其中VL和VH区对形成单价分子(参见Bird等人(1988)Science[科学]242:423-426；以及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]85:5879-5883)。在一个实施例中，scFv的VH和VL区与至少约5个、10个、15个或20个并多达约10个、15个、20个、25个或30个氨基酸的短接头肽连接。ScFv接头是已知的，并包括富含甘氨酸(用于灵活性)的接头，以及包括丝氨酸或苏氨酸(用于溶解性)的接头。在一个实施例中，该接头将VH的N-末端与VL的C-末端连接。在其他实施例中，该接头将VH的C-末端与VL的N-末端连接。在一个实施例中，scFv保留原始免疫球蛋白的特异性，尽管去除了恒定区并引入了接头。用于产生单链Fv的方法包括描述在以下各项中的那些：美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston等人，(1991)Methods in Enzymology[酶学方法]203:46-88；Shu等人，(1993)PNAS 90:7995-7999；以及Skerra等人，(1988)Science[科学]240:1038-1040。

在一个实施例中，该结合分子包括至少一个结合结构域，该结合结构域包括抗甲型流感病毒抗体或其抗原结合片段。在另一个实施例中，该结合分子包括至少一个结合结构域，该结合结构域包括抗乙型流感病毒抗体或其抗原结合片段。在更具体的实施例中，该结合分子包括含有抗甲型流感病毒抗体或其抗原结合片段的至少一个结合结构域，以及含有抗乙型流感病毒抗体或其抗原结合片段的至少一个结合结构域。

如在此使用的，术语“抗体”(antibody和antibodies)(也被称为免疫球蛋白)涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、人抗体、人源化抗体、骆驼科抗体、嵌合抗体、单链抗体、单链Fv(scFv)、单结构域抗体、结构域抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、具有所希望的生物学活性的抗体片段(例如抗原结合片段)、二硫键连接的Fv(dsFv)、以及抗个体基因型抗体、细胞内抗体、及其抗原结合片段。

适合的免疫球蛋白分子可以具有任何同种型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、亚同种型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或同种异型(例如，Gm如G1m(f、z、a或x)、G2m(n)、G3m(g、b或c)、Am、Em、以及Km(1、2或3))。免疫球蛋白分子可以包括基于轻链恒定区的氨基酸序列的被分类为λ链或κ链的轻链。

典型的免疫球蛋白(抗体)结构单元是约150kD的四聚体，该四聚体包括两对多肽链，每对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50kD-70kD)。典型地，每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，尽管在不同免疫球蛋白同种型的重链之间的二硫键的数量可以改变。每条重链和轻链还具有规律性间隔的链间二硫桥。在大多数天然存在的抗体中，该两对多肽链一致的。然而，在工程化抗体中，该两对多肽链不一定是一致的，例如如在三功能抗体中。

抗体的轻链和重链两者可以分为“恒定”结构域和“可变”结构域。重链和轻链的C-末端部分被称为恒定结构域。“CH1结构域”是指位于可变重(VH)结构域和铰链区之间的重链免疫球蛋白恒定结构域。“CH2结构域”是指位于铰链区和CH3结构域之间的重链免疫球蛋白恒定结构域。“CH3结构域”是指位于CH2结构域的C-末端的重链免疫球蛋白恒定结构域。“CH4结构域”是指位于IgM和IgE抗体中的CH3结构域的C-末端的重链免疫球蛋白恒定结构域。术语“铰链区”是指将CH1结构域连接到CH2结构域的重链分子的部分。“CL结构域”是指位于可变轻(VL)结构域的C-末端的轻链免疫球蛋白恒定结构域。

每个重链和轻链的N-末端限定了被称为可变结构域的三维抗原结合位点可变区。轻链(VL)和重链(VH)的可变结构域包括约100个至110个或更多个氨基酸，并且主要负责抗原识别和特异性。轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域赋予生物学特性如分泌、经胎盘移动性(transplacental mobility)、Fc受体结合和补体结合。按照惯例，对于更远离抗体的抗原结合位点或N-末端的结构域，恒定区结构域的编号增加。

如在此使用的，术语“重链部分”是指衍生自免疫球蛋白重链的氨基酸序列，该氨基酸序列包括至少一个：VH、CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域、或者其变体或其片段。如在此使用的，术语“轻链部分”是指衍生自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列，该氨基酸序列包括至少一个VL或CL结构域。

抗体可变区

在一个实施例中，该结合分子包括至少一个抗原结合结构域，该抗原结合结构域包括可变片段(Fv)结构域。在一个实施例中，该结合分子包括至少一个结合结构域，该结合结构域包括至少一个抗体重链VH和至少一个抗体轻链VL。在更具体的实施例中，该结合分子包括第一结合结构域，该第一结合结构域包括至少一个抗体重链VH和至少一个抗体轻链VL，以及第二结合结构域，该第二结合结构域包括至少一个抗体重链VH和至少一个抗体轻链VL。在一个实施例中，该结合分子包括第一结合结构域，该第一结合结构域结合至甲型流感病毒并包括至少一个抗体重链VH和至少一个抗体轻链VL，以及第二结合结构域，该第二结合结构域结合至乙型流感病毒并包括至少一个抗体重链VH和至少一个抗体轻链VL。与甲型流感病毒和乙型流感病毒结合的抗体的示例性VH和VL结构域分别显示在表1和表2中。

表1：抗甲型流感病毒

表2：抗乙型流感病毒

在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个VH和/或VL结构域，该VH和/或VL结构域与表1和表2中披露的VH和/或VL序列中的一个或多个具有至少指定的百分比一致性。如在此使用的，术语“序列一致性百分比(％)”或“同源性”是指在比对序列并且(必要时)引入空位以获得最大的序列一致性百分比，并且不将任何保守取代视为序列一致性的部分之后，在候选序列中的氨基酸残基或核苷酸与参考序列(如亲本抗体序列)中的氨基酸残基或核苷酸一致的百分比。序列比对可以手动进行或使用以下各项来产生：使用Smith和Waterman，(1981)Ads App.Math.[应用数学进展]2,482，或Neddleman和Wunsch，(1970)J.MoI.Biol.[分子生物学杂志]48,443的同源算法，使用Pearson和Lipman，(1988)Proc.Natl Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]85,2444的相似搜索方法，或使用基于这些算法的一种或多种的计算机程序(威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics SoftwarePackage)，遗传学计算机组(Genetics Computer Group)575大学道，麦迪逊，威斯康星州中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA)。

在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域具有VH氨基酸序列，该VH氨基酸序列与在此描述的VH氨基酸序列(包括例如在表1或表2中显示的那些)具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％一致性。在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域具有VH氨基酸序列，该VH氨基酸序列与在此描述的VH氨基酸序列(包括例如在表1或表2中显示的那些)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。

在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域具有VL氨基酸序列，该VL氨基酸序列与在此描述的VL氨基酸序列(包括例如在表1或表2中显示的那些)具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或具有100％一致性。在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域具有VL氨基酸序列，该VL氨基酸序列与在此描述的VL氨基酸序列(包括例如在表1或表2中显示的那些)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。

在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域具有VH和VL氨基酸序列，该VH和VL氨基酸序列与在此描述的VH和VL氨基酸序列(包括例如在表1或表2中显示的那些)分别具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％一致性。在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域具有VH和VL氨基酸序列，该VH和VL氨基酸序列与在此描述的VH和VL氨基酸序列(包括例如在表1或表2中显示的那些)分别具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。

在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域具有VH和VL氨基酸序列，该VH和VL氨基酸序列与在表1中显示的VH和VL氨基酸序列分别具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％一致性。在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域具有VH和VL氨基酸序列，该VH和VL氨基酸序列与在表1中显示的VH和VL氨基酸序列分别具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。

在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域具有VH和VL氨基酸序列，该VH和VL氨基酸序列与在表2中显示的VH和VL氨基酸序列分别具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％一致性。在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域具有VH和VL氨基酸序列，该VH和VL氨基酸序列与在表2中显示的VH和VL氨基酸序列分别具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。

在一个实施例中，该结合分子包括第一结合结构域，该第一结合结构域具有VH和VL氨基酸序列，该VH和VL氨基酸序列与在表1中显示的VH和VL氨基酸序列分别具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％一致性，以及第二结合结构域，该第二结合结构域具有VH和VL氨基酸序列，该VH和VL氨基酸序列与在表2中显示的VH和VL氨基酸序列分别具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％一致性。在一个实施例中，该结合分子包括第一结合结构域，该第一结合结构域具有VH和VL氨基酸序列，该VH和VL氨基酸序列与在表1中显示的VH和VL氨基酸序列分别具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性，以及第二结合结构域，该第二结合结构域具有VH和VL氨基酸序列，该VH和VL氨基酸序列与在表2中显示的VH和VL氨基酸序列分别具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。

在一个实施例中，结合分子的第一结合结构域包括VH，该VH具有与选自SEQ IDNO.:7和SEQ ID NO.:17的氨基酸序列具有至少75％一致性的氨基酸序列。在一个实施例中，结合分子的第一结合结构域包括VL，该VL具有与选自SEQ ID NO.:2的氨基酸序列具有至少75％一致性的氨基酸序列；以及SEQ ID NO.:12的VL。在更具体的实施例中，结合分子的第一结合结构域包括VH和VL，该VH和VL分别与选自以下各项的VH和VL的氨基酸序列具有至少75％一致性：SEQ ID NO.:7的VH和SEQ ID NO.:2的VL；以及SEQ ID NO.:17的VH和SEQID NO.:12的VL。在一个实施例中，第一结合结构域包括选自以下各项的VH和VL：SEQ IDNO.:7的VH和SEQ ID NO.:2的VL；以及SEQ ID NO.:17的VH和SEQ ID NO.:12的VL。

互补决定区(CDR)

在天然存在的抗体中，被称为“互补决定区”或“CDR”的六个短的、非连续氨基酸序列存在于每个抗原结合结构域中。抗原结合结构域中的其余氨基酸被称为“框架”区。框架区作为支架起作用，该支架通过链间、非共价相互作用将CDR以正确取向进行定位。重链的三个CDR被指定为CDRH1、CDRH2、和CDRH3，并且轻链的三个CDR被指定为CDRL1、CDRL2、和CDRL3。

构成CDR和框架区的的氨基酸可以被本领域普通技术人员容易地鉴定，并且已经被Kabat等人，(1983)U.S.Dept.of Health and Human Services[美国卫生和人类服务部]，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”[免疫学上感兴趣的蛋白质序列]，并被Chothia等人，(1987)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917描述。Kabat等人和Chothia等人的定义包括重叠氨基酸残基。涵盖如由Kabat等人和Chothia等人定义的CDR的氨基酸残基列于下表3中。涵盖特定CDR的精确残基编号可以取决于CDR的序列和大小而改变。在给定抗体的可变区氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基处于特定CDR中。

表3：示例CDR定义¹

	Kabat	Chothia
			VH CDR1	31-35	26-32
VH CDR2	50-65	52-58
			VH CDR3	95-102	95-102
VL CDR1	24-34	26-32
			VL CDR2	50-56	50-52
VL CDR3	89-97	91-96

¹CDR的编号根据由Kabat等人列出的规范。

应用任一定义旨在处于如在此所定义并且使用的术语“CDR”的范围内。然而，除非另外规定，提及在此的结合分子、抗体、其抗原结合片段、其变体或其衍生物中特定氨基酸残基位置的编号是根据Kabat等人的编号系统。

在一个实施例中，在抗体的可变结构域、互补决定区(CDR)和框架区(FR)中的氨基酸遵循Kabat等人进行鉴定。可以通过抗体序列与“标准”Kabat编号序列在同源区的比对而对给定的抗体确定残基的Kabat编号。框架残基的最大比对可能需要在编号系统中插入“间隔”残基。另外，由于种间或等位基因差异，在任何给定的Kabat位点编号处的某些个别残基的身份在抗体链之间可以改变。

根据Kabat等人的编号系统，HCDR1在大约氨基酸31处(即，在第一个半胱氨酸残基之后大约9个残基处)开始，包括大约5-7个氨基酸，并且在下一个酪氨酸残基处结束。HCDR2在CDRH1末端之后的第十五个残基处开始，包括大约16-19个氨基酸，并且在下一个精氨酸或赖氨酸残基处结束。HCDR3在HCDR2末端之后的大约第三十三个氨基酸残基处开始；包括3-25个氨基酸；并且在序列W-G-X-G处结束，其中X是任何氨基酸。LCDR1在大约残基24(即，在半胱氨酸残基之后)处开始；包括大约10-17个残基；并且在下一个酪氨酸残基处结束。LCDR2在LCDR1末端之后大约第十六个残基处开始，并且包括大约7个残基。LCDR3在LCDR2末端之后的大约第三十三个残基处开始；包括大约7-11个残基并且在序列F-G-X-G处结束，其中X是任何氨基酸。CDR在抗体与抗体之间相当不同(并且根据限定将不展现与Kabat共有序列的同源性)。使用Kabat系统来编号的本发明的抗体的CDR重链和轻链序列示于下表4和表5中。

在一个实施例中，该结合分子包括至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。在一个实施例中，该结合分子包括在表4和表5中显示的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个重链CDR(HCDR)。在一个实施例中，该结合分子包括在表4和表5中显示的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个轻链CDR(LCDR)。在一个实施例中，该结合分子包括在表4和表5中显示的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HCDR，以及在表4和表5中显示的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个LCDR。

表4：如通过Kabat等人鉴定的抗甲型流感病毒抗体CDR

表5：如通过Kabat等人鉴定的抗乙型流感病毒抗体CDR

在另一个实施例中，可以使用免疫遗传学(IMGT)数据库(http://imgt.cines.fr)来鉴定抗体的可变结构域、互补决定区(CDR)和框架区(FR)中的氨基酸。Lefranc等人(2003)Dev Comp Immunol[发展与比较免疫学]27(1):55-77。使用免疫球蛋白(IgG)、T细胞受体(TcR)和主要组织相容性复合体(MHC)分子的序列信息开发了IMGT数据库，该IMGT数据库统一了跨越抗体λ和κ轻链、重链和T细胞受体链的编号并且避免对除了不常见的长插入之外的所有使用插入代码。IMGT还考虑并且结合了来自Kabat等人的对框架(FR)和互补决定区(CDR)的定义，来自Chothia等人的对高变环的表征连同来自X射线衍射研究的结构数据。使用IMGT系统编号的CDR重链和轻链序列显示在下表6中。

表6.如通过IMGT鉴定的抗乙型流感病毒抗体CDR

在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域包括选自HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3中的一个或多个(包括一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR)。在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域包括一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中CDR选自在表4至表6中显示的HCDR和LCDR。在另一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域包括一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中CDR包括如下氨基酸序列，该氨基酸序列与在表4至表6中显示的HCDR和LCDR的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％一致性。在另一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域包括一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中CDR包括如下氨基酸序列，该氨基酸序列与在表4至表6中显示的HCDR和LCDR的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。

在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域包括一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中CDR选自在表4中显示的HCDR和LCDR。在另一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域包括一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中CDR包括如下氨基酸序列，该氨基酸序列与在表4中显示的HCDR和LCDR的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％一致性。在另一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域包括一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中CDR包括如下氨基酸序列，该氨基酸序列与在表4中显示的HCDR和LCDR的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。

在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域包括一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中CDR选自在表5和表6中显示的HCDR和LCDR。在另一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域包括一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中CDR包括如下氨基酸序列，该氨基酸序列与在表5和表6中显示的HCDR和LCDR的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％一致性。在另一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域包括一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中CDR包括如下氨基酸序列，该氨基酸序列与在表5和表6中显示的HCDR和LCDR的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。

在一个实施例中，该结合分子包括第一结合结构域，该第一结合结构域包括在表4中显示的一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，以及第二结合结构域，该第二结合结构域包括选自在表5和表6中显示的HCDR和LCDR的一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3。在另一个实施例中，该结合分子包括第一结合结构域，该第一结合结构域包括一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中CDR包括如下氨基酸序列，该氨基酸序列与在表4中显示的HCDR和LCDR的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％一致性，并且包括第二结合结构域，该第二结合结构域包括一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中CDR包括如下氨基酸序列，该氨基酸序列与在表5和表6中显示的HCDR和LCDR的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％一致性。在另一个实施例中，该结合分子包括第一结合结构域，该第一结合结构域包括一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中CDR包括如下氨基酸序列，该氨基酸序列与在表4中显示的HCDR和LCDR的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性，并且包括第二结合结构域，该第二结合结构域包括一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中CDR包括如下氨基酸序列，该氨基酸序列与在表5和表6中显示的HCDR和LCDR的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。

在一个实施例中，该结合分子的第一结合结构域包括一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中CDR各自具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与以下氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％一致性：

(a)分别地，SEQ ID NO.:8的HCDR1、SEQ ID NO.:9的HCDR2、SEQ ID NO.:10的HCDR3、SEQ ID NO.:3的LCDR1、SEQ ID NO.:4的LCDR2、以及SEQ ID NO.:5的LCDR3；或者

(b)分别地，SEQ ID NO.:18的HCDR1、SEQ ID NO.:19的HCDR2、SEQ ID NO.:20的HCDR3、SEQ ID NO.:13的LCDR1、SEQ ID NO.:14的LCDR2、SEQ ID NO.:15的LCDR3；

在一个实施例中，该结合分子的第一结合结构域包括一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中CDR各自具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与以下氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性：

(a)分别地，SEQ ID NO.:8的HCDR1、SEQ ID NO.:9的HCDR2、SEQ ID NO.:10的HCDR3、SEQ ID NO.:3的LCDR1、SEQ ID NO.:4的LCDR2、以及SEQ ID NO.:5的LCDR3；或者

(b)分别地，SEQ ID NO.:18的HCDR1、SEQ ID NO.:19的HCDR2、SEQ ID NO.:20的HCDR3、SEQ ID NO.:13的LCDR1、SEQ ID NO.:14的LCDR2、SEQ ID NO.:15的LCDR3。

在一个实施例中，该第二结合结构域包括一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中CDR各自具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与以下氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％一致性：

(a)分别地，SEQ ID NO.:28的HCDR1、SEQ ID NO.:29的HCDR2、SEQ ID NO.:30的HCDR3、SEQ ID NO.:23的LCDR1、SEQ ID NO.:24的LCDR2、以及SEQ ID NO.:25的LCDR3；

(b)分别地，SEQ ID NO.:44的HCDR1、SEQ ID NO.:45的HCDR2、SEQ ID NO.:46的HCDR3、SEQ ID NO.:39的LCDR1、SEQ ID NO.:40的LCDR2、以及SEQ ID NO.:41的LCDR3；或者

(c)分别地，SEQ ID NO.:60的HCDR1、SEQ ID NO.:61的HCDR2、SEQ ID NO.:62的HCDR3、SEQ ID NO.:55的LCDR1、SEQ ID NO.:56的LCDR2、SEQ ID NO.:57的LCDR3；

在一个实施例中，该第二结合结构域包括一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中CDR各自具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与以下氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性：

(a)分别地，SEQ ID NO.:28的HCDR1、SEQ ID NO.:29的HCDR2、SEQ ID NO.:30的HCDR3、SEQ ID NO.:23的LCDR1、SEQ ID NO.:24的LCDR2、以及SEQ ID NO.:25的LCDR3；

(b)分别地，SEQ ID NO.:44的HCDR1、SEQ ID NO.:45的HCDR2、SEQ ID NO.:46的HCDR3、SEQ ID NO.:39的LCDR1、SEQ ID NO.:40的LCDR2、以及SEQ ID NO.:41的LCDR3；或者

(c)分别地，SEQ ID NO.:60的HCDR1、SEQ ID NO.:61的HCDR2、SEQ ID NO.:62的HCDR3、SEQ ID NO.:55的LCDR1、SEQ ID NO.:56的LCDR2、SEQ ID NO.:57的LCDR3；

框架区

重链和轻链的可变结构域各自包含四个框架区(FR1、FR2、FR3、FR4)，这些框架区是可变结构域的更高保守性的部分。重链的四个FR被指定为FRH1、FRH2、FRH3和FRH4，并且轻链的四个FR被指定为FRL1、FRL2、FRL3和FRL4。使用Kabat编号系统，FRH1从位置1开始并且在大约氨基酸30处结束；FRH2是大约从氨基酸36至49；FRH3是大约从氨基酸66至94；并且FRH4是大约氨基酸103至113。在一个实施例中，可以引入一个或多个修饰(如一个或多个FR残基的取代、缺失或插入)，例如以提高或优化结合分子的一个或多个结合结构域对于甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的结合亲和力。可以修饰的框架区残基的实例包括直接非共价结合抗原的那些(Amit等人，Science[科学]，233:747-753(1986))；与CDR相互作用/实现CDR的构象的那些(Chothia等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]，196:901-917(1987))；和/或参与VL-VH界面的那些(美国专利号5,225,539)。

在一个实施例中，出于“种系化”的目的，结合分子的一个或多个结合结构域的FR包括一个或多个氨基酸改变。在种系化中，将抗体重链和/或轻链的氨基酸序列与种系化重链和轻链氨基酸序列进行比较。在重链和/或轻链的某些框架残基与种系构型不同(例如，由于用来制备噬菌体文库的免疫球蛋白基因的体细胞突变)的情况下，可能希望的是改变的框架残基“回复突变”为种系构型(即，改变框架氨基酸序列，这样使得它们与种系框架氨基酸序列相同)。框架残基的这种“回复突变”(或“种系化”)可以通过用于引入特定突变的标准分子生物学方法(例如，定点诱变；PCR介导的诱变，等)来完成。

二硫键

如在此使用的，术语“二硫键”是指在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包括可以与第二硫醇基形成二硫键或二硫桥的硫醇基。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键连接，并且两个重链通过称为铰链区的重链的柔性区中的两个二硫键连接(典型地在对应于使用Kabat编号系统的239和242位置处)。

在一个实施例中，一个或多个氨基酸取代可以在框架区内进行，例如以提高抗体与其抗原的结合。在一个实施例中，可以修饰框架区的氨基酸序列以进行参与链内二硫键的一个或多个半胱氨酸残基的氨基酸取代或缺失，例如以产生缺少一个或多个链内二硫键的结合分子；以产生具有一个或多个另外的链内二硫键的结合分子；或者以改变一个或多个链内二硫键的位置。

在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个scFv。在一个实施例中，该scFv包括VH和VL，其中第一可变区结构域的C-末端与第二可变区结构域的N-末端通过柔性肽接头连接。在一个实施例中，可变重(VH)结构域的C-末端与可变轻(VL)结构域的N-末端连接。这可以被称为“VH-VL”或“HL”取向。在其他实施例中，可变轻(VL)结构域的C-末端与可变重(VH)结构域的N-末端连接。这可以被称为“VL-VH”或“LH”取向。可以改变连接scFv的VH和VL的接头(LS)的长度。在一个实施例中，该接头(LS)具有[GGGGS]n的氨基酸序列，其中n是0、1、2、3、4或5(SEQ ID NO:93)。在另一个实施例中，该接头(LS)具有[GGGG]n的氨基酸序列，其中n是0、1、2、3、4或5(SEQ ID NO:106)。在其他实施例中，该接头包括两个序列的组合。在更具体的实施例中，该接头包括GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:92)的氨基酸序列。

在其他实施例中，在scFv的VH和VL之间的二硫键的位置可以通过添加、去除、或改变scFv中的一个或多个半胱氨酸残基的位置而改变。在一个实施例中，scFv的VH包括在位置43、44、100、101、105、及其组合(如根据Kabat编号)的半胱氨酸残基。在一个实施例中，scFv的VL包括在位置43、44、46、49、50、100、及其组合(如根据Kabat编号)的半胱氨酸残基。在一个实施例中，scFv具有VL-VH取向，其中VL和VH通过在VL100-VH44、VL43-VH105、VL46-VH101、VL49-VH100、VL50-VH100、或其组合处的二硫键连接。在另一个实施例中，scFv具有VH-VL取向，其中VH和VL通过在VH44-VL100、VH100-VL49、VH100-VL50、VH101-VL46、VH105-VL43、或其组合处的二硫键连接。

双特异性抗体

在一个实施例中，该结合分子包括“双特异性抗体”。如在此使用的，术语“双特异性抗体”是指具有两个或更多个结合结构域的抗体或其抗原结合片段，该结合结构域可以特异性结合两个不同的靶分子或抗原。通常，双特异性抗体将一种或多种(通常至少两种)，并典型地被称为“亲本抗体”的两种不同的单克隆抗体的特异性和性质并入单个分子中。一些双特异性抗体表现出协同作用。在一个实施例中，与亲本抗体相比，双特异性抗体表现出针对一种或多种甲型流感和/或乙型流感病毒株的增强的中和活性。

在一个实施例中，与单一mAb相比，在此描述的双特异性抗体具有扩大的覆盖范围，并且还可显示一种或多种甲型流感病毒株的增强的中和活性。在一个实施例中，该结合分子是针对一种或多种甲型流感组1或组2病毒株具有增强的中和活性的双特异性抗体。在更具体的实施例中，该结合分子是针对选自以下亚型的甲型流感病毒组1病毒株具有增强的中和活性的双特异性抗体：H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17和H18。在更具体的实施例中，该结合分子是针对选自以下亚型的甲型流感病毒组2病毒株具有增强的中和活性的双特异性抗体：H3、H4、H7、H10、H14和H15。在一个实施例中，该结合分子是针对甲型流感病毒的H9亚型具有增强的中和活性的双特异性抗体。

在一个实施例中，该结合分子包括具有超过两个效价的双特异性抗体。例如，在一个实施例中，该结合分子包括三特异性抗体。三特异性抗体是已知的并且可以使用本领域技术人员已知的方法进行制备(Tutt等人，(1991)J.Immunol.[欧洲免疫学杂志]，147:60)。

可以通过细胞系(如三源杂交瘤和杂种杂交瘤)表达双特异性抗体或可以通过重组方式构建(和Heiss，Future Oncol.[未来肿瘤学]6:1387-94(2010)；Mabry和Snavely，IDrugs.13:543-9(2010))。

在一个实施例中，该结合分子包括双特异性抗体，该双特异性抗体包括至少两对重链和轻链、或其结合片段，其中第一对衍生自第一“亲本”抗体并具有第一结合特异性，并且第二对衍生自第二“亲本”抗体并具有第二结合特异性。在一个实施例中，该结合分子包括特异性结合甲型流感病毒的第一重链和轻链对、或其片段，以及特异性结合乙型流感病毒的第二重链和轻链对、或其片段。在一个实施例中，该结合分子包括双特异性抗体，该双特异性抗体包括指向两个不同靶分子或抗原的两个或更多个化学连接的Fab区。在更具体的实施例中，该结合分子包括特异性结合甲型流感病毒的一个或多个Fab区。在另一个实施例中，该结合分子包括特异性结合乙型流感病毒的一个或多个Fab区。在另一个实施例中，该结合分子包括双特异性抗体，该双特异性抗体包括一个或多个单链可变片段(scFv)。在一个实施例中，该结合分子包括特异地结合甲型流感病毒的至少一个scFv。在另一个实施例中，该结合分子包括特异地结合乙型流感病毒的至少一个scFv。

在一个实施例中，该结合分子是通过IgG抗体和一个或多个单链结合结构域的融合形成的双特异性抗体。在一个实施例中，该结合分子保留抗体核心结构(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)。在其他实施例中，不保留抗体核心结构(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)，例如在双抗体、三抗体、四抗体、迷你抗体和单链形式(scFv、Bis-scFv)中。在另一个实施例中，该双特异性抗体可以包括F(ab)₂融合，其中两个或更多个Fab片段与化学交联接头融合。许多双特异性抗体形式使用一个或多个接头，例如以便将抗体核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)与结合结构域(例如scFv)融合或将两个或更多个Fab片段或scFv融合。在一些实施例中，保留Fc结构域，并且因此保留Fc效应子功能。在其他实施例中，不保留Fc结构域。

在一个实施例中，该结合分子包括具有形成“Y”形分子的两个重链和两个轻链的不对称IgG样结构，其中抗体的第一“臂”特异地结合第一抗原并且抗体的第二“臂”结合第二抗原。

在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个抗体片段(如单链抗体)，该抗体片段包括一个或多个单独的或与以下各项没有、有一些或全部组合的重链可变区(VH)：铰链区(H)、CH1、CH2和CH3结构域，和/或包括一个或多个单独的或与CL结构域组合的轻链可变区(VL)。

在一个实施例中，该双特异性抗体包括一个或多个单链Fv(scFv)。在一个实施例中，该双特异性抗体包括两个或更多个scFv。在另一个实施例中，该双特异性抗体包括部分或全部免疫球蛋白“碱基”结构，例如包括一个或多个Fv结构域的IgA、IgD、IgE、IgG或IgM结构，例如一个或多个重链和一个或多个轻链，其中一个或多个scFv与免疫球蛋白“碱基”结构融合。在更具体的实施例中，该结合分子包括IgG结构，该IgG结构包括两个重链和两个轻链，其中一个或多个scFv与其融合。

在一个实施例中，抗体的形式可以是在此披露的任何形式。在另一个实施例中，该形式是Bis1、Bis2、Bis3、Bis4或Bis5中的任一个。在一个实施例中，第一结合结构域的Fv结构域包括具有氨基末端和羧基末端的重链(HC)，以及具有氨基末端和羧基末端的轻链(LC)，并且第二结合结构域使用一个或两个接头与第一结合结构域的HC的羧基末端共价连接。在一个实施例中，第一结合结构域的Fv结构域包括具有氨基末端和羧基末端的重链(HC)，以及具有氨基末端和羧基末端的轻链(LC)，并且第二结合结构域使用一个接头与第一结合结构域的HC的羧基末端共价连接。在一个实施例中，第一结合结构域的Fv结构域包括具有氨基末端和羧基末端的重链(HC)，以及具有氨基末端和羧基末端的轻链(LC)，并且第二结合结构域使用两个接头与第一结合结构域的HC的羧基末端共价连接。在一个实施例中，第一结合结构域的Fv结构域包括具有氨基末端和羧基末端的重链(HC)，以及具有氨基末端和羧基末端的轻链(LC)，并且第二结合结构域与第一结合结构域的HC的氨基末端共价连接。在一个实施例中，第一结合结构域的Fv结构域包括具有氨基末端和羧基末端的重链(HC)，以及具有氨基末端和羧基末端的轻链(LC)，并且第二结合结构域与第一结合结构域的LC的氨基末端共价连接。在另一个实施例中，第一结合结构域的Fv结构域包括具有氨基末端和羧基末端的重链(HC)和具有氨基末端和羧基末端的轻链(LC)，并且第二结合结构域沿着第一结合结构域的HC的多肽链共价地插入。

在一个实施例中，该结合分子包括双特异性抗体，该双特异性抗体包括具有式VH-CH1-H-CH2-CH3的抗体重链，其中VH是重链可变结构域、CH1是重链恒定区结构域1、H是铰链区、CH2是重链恒定区结构域2、并且CH3是重链恒定区结构域3。在一个实施例中，该结合分子是双特异性抗体，该双特异性抗体包括具有式VL-CL的抗体轻链，其中VL是可变轻链结构域并且CL是轻链恒定结构域。

在一个实施例中，该结合分子包括具有N-末端结构域的抗体重链，其中该抗体重链具有式VH-CH1-H-CH2-CH3，其中VH是重链可变结构域、CH1是重链恒定区结构域1、H是铰链区、CH2是重链恒定区结构域2、并且CH3是重链恒定区结构域3，以及具有N-末端结构域的抗体轻链，其中该抗体轻链具有式VL-CL，其中VL是可变轻链结构域并且CL是轻链恒定结构域，并且其中一个或多个scFv分子与抗体重链或抗体轻链的一个或多个N-末端结构域共价附接(图1)。

在更具体的实施例中，抗体或其片段的N-末端结构域包括一个或多个Fv结构域，并且一个或多个scFv分子与抗体或其片段的一个或多个Fv结构域共价附接(图1)。在更具体的实施例中，一个或多个scFv分子与抗体或其片段的一个或多个轻链可变结构域(VL)的N-末端结构域共价附接(图1)。在更具体的实施例中，该结合分子包括具有式scFv-L1-VL-CL的抗体轻链，其中scFv是scFv分子、L1是接头、VL是轻链可变结构域、VL是轻链可变结构域并且CL是轻链恒定结构域(图1)。

在一个实施例中，一个或多个scFv分子与抗体或其片段的一个或多个重链可变结构域(VH)的N-末端结构域共价附接(图1)。在一个实施例中，该重链具有式scFv-L1-VH-CH1-CH2-CH3，其中scFv是scFv分子、L1是接头、VH是重链可变结构域、CH1是重链恒定结构域结构域1、CH2是重链恒定结构域结构域2、并且CH3是重链恒定结构域结构域3(图1)。

在另一个实施例中，该结合分子包括具有C-末端结构域的抗体或其片段，其中一个或多个scFv分子与抗体或其片段的C-末端结构域共价附接(图1)。在一个实施例中，该结合分子包括分别具有第一和第二C-末端结构域的第一和第二重链，其中一个或多个scFv分子与第一重链、第二重链、或其组合的C-末端结构域共价附接(图1)。在一个实施例中，一个或多个重链具有式VH-CH1-CH2-CH3，其中VH是重链可变结构域、CH1是重链恒定结构域结构域1、CH2是重链恒定结构域结构域2、并且CH3是重链恒定结构域结构域3(图1)。在一个实施例中，一个或多个重链具有式VH-CH1-CH2-CH3-L1-scFv，其中L1是接头并且scFv是scFv分子(图1)。

在另一个实施例中，该结合分子包括具有C-末端结构域的抗体或其片段，其中一个或多个scFv分子与抗体或其片段的C-末端结构域共价附接(图1)。在一个实施例中，该结合分子包括分别具有第一和第二C-末端结构域的第一和第二重链，其中一个或多个scFv分子与第一重链、第二重链、或其组合的C-末端结构域共价附接(图1)。在一个实施例中，一个或多个重链具有式VH-CH1-CH2-CH3，其中VH是重链可变结构域、CH1是重链恒定结构域结构域1、CH2是重链恒定结构域结构域2、并且CH3是重链恒定结构域结构域3(图1)。在一个实施例中，一个或多个重链具有式VH-CH1-CH2-CH3-L1-scFvL2，其中L1和L2独立地是接头并且scFv是scFv分子(图1)。

在一个实施例中，该结合分子包括具有一个或多个重链恒定结构域的抗体或其片段，其中一个或多个scFv分子插入在一个或多个重链的一个或多个重链恒定结构域之间(图1)。在一个实施例中，一个或多个重链具有式VH-CH1-CH2-CH3，其中VH是重链可变结构域、CH1是重链恒定结构域结构域1、CH2是重链恒定结构域结构域2、并且CH3是重链恒定结构域结构域3(图1)。在一个实施例中，一个或多个重链具有式VH-CH1-L1-scFv-L2-CH2-CH3，其中L1和L2独立地是接头并且scFv是scFv分子(图1)。在一个实施例中，一个或多个重链具有式VH-CH1-CH2-L1-scFv-L2-CH3，其中L1和L2独立地是接头并且scFv是scFv分子。

在一个实施例中，该结合分子包括免疫球蛋白结构，例如具有一个或多个Fv结构域的IgG结构。在一个实施例中，该Fv结构域包括具有如下氨基酸序列的VH和VL序列，该氨基酸序列与在表1中显示的VH或VL序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％一致性。在另一个实施例中，Fv结构域包括VH和VL序列，该VH和VL序列与在表1中显示的VH或VL序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。在一个实施例中，该Fv结构域包括具有如下氨基酸序列的VH和VL序列，该氨基酸序列与在表2中显示的VH或VL序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％一致性。在另一个实施例中，Fv结构域包括VH和VL序列，该VH和VL序列与在表2中显示的VH或VL序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。

在一个实施例中，该结合分子包括具有一个或多个结合结构域的免疫球蛋白结构，该结合结构域包括选自HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3中的一个或多个(包括一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR)。在一个实施例中，该结合分子包括具有一个或多个结合结构域的免疫球蛋白结构，该结合结构域包括一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中CDR选自在表4至表6中显示的HCDR和LCDR。在另一个实施例中，该结合分子包括具有一个或多个结合结构域的免疫球蛋白结构，该结合结构域包括一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中CDR包括如下氨基酸序列，该氨基酸序列与在表4至表6中显示的HCDR和LCDR的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％一致性。在另一个实施例中，该结合分子包括具有一个或多个结合结构域的免疫球蛋白结构，该结合结构域包括一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中CDR包括如下氨基酸序列，该氨基酸序列与在表4至表6中显示的HCDR和LCDR的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。

在一个实施例中，该结合分子包括具有式VH-LS-VL或可替代地VL-LS-VH的一个或多个scFv，其中LS是接头序列。在一个实施例中，该scFv包括具有如下氨基酸序列的VH和VL序列，该氨基酸序列与在表1中显示的VH或VL序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％一致性。在另一个实施例中，该scFv包括VH和VL序列，该VH和VL序列与在表1中显示的VH或VL序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。在一个实施例中，该scFv包括具有如下氨基酸序列的VH和VL序列，该氨基酸序列与在表2中显示的VH或VL序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％一致性。在另一个实施例中，该scFv包括VH和VL序列，该VH和VL序列与在表2中显示的VH或VL序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。

在一个实施例中，该结合分子包括具有选自HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3中一个或多个(包括一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR)的scFv。在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个scFv，该scFv具有一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中CDR选自在表4至表6中显示的HCDR和LCDR。在另一个实施例中，该结合分子包括一个或多个scFv，该scFv具有一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中CDR包括如下氨基酸序列，该氨基酸序列与在表4至表6中显示的HCDR和LCDR的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％一致性。在另一个实施例中，该结合分子包括一个或多个scFv，该scFv具有一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中CDR包括如下氨基酸序列，该氨基酸序列与在表4至表6中显示的HCDR和LCDR的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。

在一个实施例中，该接头LS具有以下氨基酸序列：(a)[GGGGS]n，其中n是0、1、2、3、4或5(SEQ ID NO:93)、(b)[GGGG]n，其中n是0、1、2、3、4或5(SEQ ID NO:106)或者(a)和(b)的组合。例如，示例性接头包括：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:92)。在一个实施例中，该scFv与免疫球蛋白结构(例如IgG结构)经由具有以下氨基酸序列的接头(L1或L2)融合：(a)[GGGGS]n，其中n是0、1、2、3、4或5(SEQ ID NO:93)、(b)[GGGG]n，其中n是0、1、2、3、4或5(SEQ ID NO:106)或者(a)和(b)的组合，包括例如氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQID NO:92)。

在更具体的实施例中，该结合分子包括具有一个或多个Fv结构域的免疫球蛋白结构(例如IgG结构)，该Fv结构域包括具有与在表1中显示的VH或VL序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％一致性的氨基酸序列的VH和VL序列，或者与在表1中显示的VH或VL序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的VH和VL序列。在一个实施例中，具有式VH-LS-VL或可替代地VL-LS-VH(其中LS是接头序列)的一个或多个scFv与免疫球蛋白结构融合，并且scFv包括具有如下氨基酸序列的VH和VL序列，该氨基酸序列与在表2中显示的VH或VL序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％一致性。在另一个实施例中，该scFv包括VH和VL序列，该VH和VL序列与在表2中显示的VH或VL序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。在一个实施例中，该接头LS具有以下氨基酸序列：(a)[GGGGS]n，其中n是0、1、2、3、4或5(SEQ ID NO:93)、(b)[GGGG]n，其中n是0、1、2、3、4或5(SEQID NO:106)或者(a)和(b)的组合。例如，示例性接头包括：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO:92)。在一个实施例中，该scFv与免疫球蛋白结构(例如IgG结构)经由具有以下氨基酸序列的接头(L1或L2)融合：(a)[GGGGS]n，其中n是0、1、2、3、4或5(SEQ ID NO:93)、(b)[GGGG]n，其中n是0、1、2、3、4或5(SEQ ID NO:106)或者(a)和(b)的组合，包括例如氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:92)。

在一个实施例中，结合分子的第一结合结构域包括抗甲型流感病毒抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，结合分子的第二结合结构域包括抗乙型流感病毒抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，该第一结合结构域包括抗甲型流感病毒Fv结构域。在更具体的实施例中，该结合分子包括具有抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域的可变片段(Fv)结构域，其中该Fv特异地结合抗甲型流感病毒。在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域包括抗乙型流感病毒scFv分子。在一个实施例中，该结合分子包括第一结合结构域，该第一结合结构域包括抗甲型流感病毒Fv结构域，以及第二结合结构域，该第二结合结构域包括抗乙型流感病毒scFv分子。

在一个实施例中，该结合分子包括具有如下氨基酸序列的轻链，该氨基酸序列与SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:68的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一个实施例中，该结合分子包括具有SEQ ID NO:66或SEQ IDNO:68的氨基酸序列的轻链。

在一个实施例中，该结合分子是与甲型流感病毒和乙型流感病毒特异地结合的双特异性抗体，该双特异性抗体具有重链，该重链具有与SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在一个实施例中，该结合分子是与甲型流感病毒和乙型流感病毒特异地结合的双特异性抗体，该双特异性抗体具有包含SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:69的氨基酸序列的重链。

在一个实施例中，该结合分子包括具有如下氨基酸序列的轻链，该氨基酸序列与SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:68的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一个实施例中，该结合分子包括具有如下氨基酸序列的重链，该氨基酸序列与SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一个实施例中，该结合分子是与甲型流感病毒和乙型流感病毒特异地结合的双特异性抗体，该双特异性抗体包括轻链和重链，该轻链具有与SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:68的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，该重链具有与SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。

在一个实施例中，该结合分子是与甲型流感病毒和乙型流感病毒特异地结合的双特异性抗体，该双特异性抗体包括具有SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:68的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:69的氨基酸序列的重链。在一个实施例中，该结合分子是双特异性抗体，该双特异性抗体具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的轻链以及具有SEQID NO:67的氨基酸序列的重链。在一个实施例中，该结合分子是双特异性抗体，该双特异性抗体具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的重链。

在一个实施例中，该scFv分子包括VH结构域，该VH结构域具有一组三个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3，其中该组三个CDR包括与在表5和表6中显示的HCDR的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％一致性的氨基酸序列。在另一个实施例中，该结合分子包括VH结构域，该VH结构域具有一组三个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3，其中该组三个CDR包括与在表5和表6中显示的HCDR的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的氨基酸序列。

在一个实施例中，该scFv分子包括VL结构域，该VL结构域具有一组三个CDR：LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中该组三个CDR包括与在表5和表6中显示的LCDR的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％一致性的氨基酸序列。在另一个实施例中，该结合分子包括VL结构域，该VL结构域具有一组三个CDR：LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中该组三个CDR包括与在表5和表6中显示的LCDR的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的氨基酸序列。

在更具体的实施例中，该结合分子包括一个或多个scFv，该scFv具有与在SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:50、和SEQ ID NO:63中显示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个scFv，该scFv具有在SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:50、和SEQ ID NO:63中显示的氨基酸序列。

甲型流感结合结构域

在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域免疫特异地结合甲型流感病毒的至少一个特异性表位。如在此使用的，术语“结合结构域”或“抗原结合结构域”包括特异地结合抗原上的表位的位点。抗体的抗原结合结构域典型地包括免疫球蛋白重链可变区的至少一部分和免疫球蛋白轻链可变区的至少一部分，其中由这些可变区形成的结合位点决定抗体的特异性。

在更具体的实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域免疫特异地结合甲型流感病毒HA蛋白质的至少一个特异性表位。如在此使用的术语“表位”是指能够结合抗体的蛋白质决定簇。表位通常包括如氨基酸或糖侧链的分子的化学活性表面基团，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于：在变性溶剂存在下，与前者的结合丧失但与后者的结合不丧失。

在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段与至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17种或全部甲型流感亚型之间保守的表位结合。在另一个实施例中，抗体或其抗原结合片段与选自H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17和H18中的一种或多种、或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种甲型流感病毒组1亚型以及选自H3、H4、H7、H10、H14和H15中的一种或多种、或至少1、2、3、4、5或6种组2亚型之间保守的表位结合。

在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段以在约0.01ug/ml与约5ug/ml之间、或在约0.01ug/ml与约0.5ug/ml之间、或在约0.01ug/ml与约0.1ug/ml之间、或少于约5ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml、0.1ug/ml或0.05ug/ml的EC₅₀结合至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17种或所有甲型流感亚型。在另一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段以在约0.01ug/ml与约5ug/ml之间、或在约0.01ug/ml与约0.5ug/ml之间、或在约0.01ug/ml与约0.1ug/ml之间、或少于约5ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml、0.1ug/ml或0.05ug/ml的EC₅₀结合选自H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17和H18中的一种或多种、或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种甲型流感病毒组1亚型以及选自H3、H4、H7、H10、H14和H15中的一种或多种、或至少1、2、3、4、5或6种组2亚型。

在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段识别为线性表位抑或连续表位的表位。在另一个实施例中，抗体或其抗原结合片段识别非线性或构象表位。在一个实施例中，该表位位于HA2的高度保守的茎区中。在更具体的实施例中，该抗体或抗原结合片段结合HA2的高度保守的茎区中的构象表位。(Wilson等人(1981)Nature[自然]289:366-373)。在一个实施例中，该表位包含选自以下各项中的一个或多个氨基酸作为接触残基：HA2的茎区中的18、19、42、45、156和196。在更具体的实施例中，该表位包含选自HA2的茎区中的18、19、42和45中的一个或多个氨基酸作为接触残基。在另外的实施例中，该表位包含HA2的茎区中的氨基酸18、19、42和45作为接触残基。在又另外的实施例中，该表位包含HA2的茎区中的氨基酸18、19和42作为接触残基。

乙型流感结合结构域

在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域免疫特异地结合乙型流感病毒的至少一个特异性表位。在更具体的实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域免疫特异地结合乙型流感病毒HA蛋白质的至少一个特异性表位。在一个实施例中，该结合分子包括与表位特异性结合的一个或多个结合结构域，该表位存在于至少两个系统发生的不同的乙型流感世系中。在更具体的实施例中，该结合分子包括与表位结合的一个或多个结合结构域，该表位存在于至少一个乙型流感山形株和至少一个乙型流感维多利亚株中。在一个实施例中，该结合分子包括与表位结合的一个或多个结合结构域，该表位存在于山形世系和维多利亚世系两者的乙型流感病毒中。在一个实施例中，该结合成员包括与表位结合的一个或多个结合结构域，该表位在山形世系和维多利亚世系两者的乙型流感中是保守的。

在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域与至少一个乙型流感山形株和至少一个乙型流感维多利亚株结合，半最大效应浓度(EC₅₀)为：在约1ng/ml与约500ng/ml之间、或在约1ng/ml与约250ng/ml之间、或在约1ng/ml与约50ng/ml之间、或小于约500ng/ml、250ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、40ng/ml、30ng/ml、20ng/ml、或15μg/ml。在另一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域与山形和维多利亚世系的乙型流感病毒结合，EC₅₀为：在约1ng/ml与约500ng/ml之间、或在约1ng/ml与约250ng/ml之间、或在约1ng/ml与约50ng/ml之间、或小于约500ng/ml、250ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、40ng/ml、30ng/ml、20ng/ml、或15μg/ml。在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域与存在于山形世系和维多利亚世系两者中的乙型流感病毒中的表位结合，EC₅₀为：在约1ng/ml与约500ng/ml之间、或在约1ng/ml与约250ng/ml之间、或在约1ng/ml与约50ng/ml之间、或小于约500ng/ml、250ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、40ng/ml、30ng/ml、20ng/ml、或15μg/ml。

在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域与存在于乙型流感山形世系中的表位结合，EC₅₀为：在约1ng/ml与约100ng/ml之间、在1ng/ml与约50ng/ml之间、或在约1ng/ml与约25ng/ml之间、或小于约50ng/ml或25ng/ml；并且该结合结构域与存在于乙型流感维多利亚世系中的表位结合，EC₅₀为：在约1ng/ml与约500ng/ml之间、或在约1ng/ml与约250ng/ml之间、或在约1ng/ml与约50ng/ml之间、或小于约500ng/ml、250ng/ml、100ng/ml或50ng/ml。

在另一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域与存在于乙型流感山形世系中的表位结合，EC₅₀为：在约1ng/ml与约100ng/ml、在1ng/ml与约50ng/ml之间、或在约1ng/ml与约25ng/ml之间、或小于约50ng/ml或25ng/ml；并且该结合结构域与存在于乙型流感维多利亚世系中的表位结合，EC₅₀为：在约1ng/ml与约500ng/ml之间、或在约1ng/ml与约250ng/ml之间、或在约1ng/ml与约50ng/ml之间、或小于约500ng/ml、250ng/ml或100ng/ml；并且该结合结构域与甲型流感HA上的表位结合，EC₅₀为：在约1μg/ml与约50μg/ml之间、或小于约50μg/ml、25μg/ml、15μg/ml或10μg/ml。在另一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域与存在于乙型流感山形世系中的表位结合，EC₅₀为：在约1ng/ml与约100ng/ml之间、在1ng/ml与约50ng/ml之间、或在约1ng/ml与约25ng/ml之间、或小于约50ng/ml或25ng/ml；并且该结合结构域与存在于乙型流感维多利亚世系中的表位结合，EC₅₀为：在约1ng/ml与约500ng/ml之间、或在约1ng/ml与约250ng/ml之间、或在约1ng/ml与约50ng/ml之间、或小于约500ng/ml、250ng/ml或100ng/ml；并且该结合结构域与甲型流感H9HA上的表位结合，EC₅₀为：在约1μg/ml与约50μg/ml之间、或小于约50μg/ml、25μg/ml、15μg/ml或10μg/ml。

在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域识别表位，该表位是线性表位或连续表位。在另一个实施例中，该结合分子包括识别非线性表位或构象表位的一个或多个结合结构域。在一个实施例中，表位位于乙型流感的血球凝集素(HA)糖蛋白上。在更具体的实施例中，表位位于乙型流感的HA糖蛋白的头部区域。在一个实施例中，表位包括在乙型流感HA的头部区域中的位置128、141、150或235处作为接触残基的一个或多个氨基酸，这些氨基酸是根据如在Wang等人(2008)J.Virol.[病毒学杂志]82(6):3011-20中所述的H3编号系统来编号的。在一个实施例中，表位包括乙型流感HA的头部区域的序列中的氨基酸128作为接触残基。在另一个实施例中，表位包括乙型流感HA的头部区域的序列中的氨基酸141、150和235作为接触残基。

交叉反应性

在一个实施例中，可以根据结合分子识别或特异地结合的抗原的一个或多个表位或一个或多个部分来描述或指定。与抗体的抗原结合结构域特异性相互作用的靶分子的部分被称为“表位”或“抗原决定簇”。取决于抗原的大小、构象、和类型，靶抗原可以包括任何数量的表位。在一个实施例中，结合分子与在此描述的一种或多种抗体相同的表位，和/或将竞争性地抑制在此描述的抗体与特异地结合表位结合。

在一个实施例中，结合分子的一个或多个结合结构域展示与甲型流感病毒和乙型流感病毒的交叉反应性。如在此使用的，术语“交叉反应性”是指对一种抗原具有特异性的结合分子的结合结构域与第二抗原反应的能力。因此，如果结合分子结合至除了诱导其形成的表位以外的表位，那么它具有交叉反应性。

Fc区

在一个实施例中，该结合分子是在Fc区中被修饰以提供所希望的效应子功能或血清半衰期的抗体。在一个实施例中，该Fc区可以诱导细胞毒性，例如经由抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或通过在补体依赖性细胞毒性(CDC)中募集补体，或通过募集表达一个或多个效应子配体的非特异性细胞毒性细胞，这些效应子配体识别甲型流感病毒和/或乙型流感病毒上结合的抗体并且随后在抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)中引起该细胞的吞噬作用；或一些其他机制。在其他实施例中，希望消除或减少效应子功能以便于最小化副作用或治疗并发症。用于增强以及减少或消除Fc效应子功能的方法是已知的。在其他实施例中，可以修饰Fc区来增加对FcRn的结合亲和力并且因此增加血清半衰期。在仍然其他实施例中，可以将Fc区轭合至PEG或白蛋白以增加血清半衰期。在2013年10月2日提交的美国临时申请号61/885,808、2014年5月23日提交的62/002,414、和2014年7月15日提交的62/024,804中更充分地描述了Fc变体，将这些美国临时申请的披露内容通过引用以其全文特此结合。

结合特征

如以上描述的，在此描述的结合分子相对于其他多肽专有地或优先地免疫特异性地结合甲型流感病毒和/或乙型流感病毒蛋白质、肽、亚基、片段、部分或其任何组合的至少一个特异性表位或抗原决定簇。如在此使用的术语“表位”或“抗原决定簇”是指能够结合抗体的蛋白质决定簇。在一个实施例中，在此的术语“结合”涉及特异性结合。这些蛋白质决定簇或表位通常包括分子(如氨基酸或糖侧链)的化学活性表面基团，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于：在变性溶剂存在下，与前者的结合丧失但与后者的结合不丧失。如在此使用的术语“非连续表位”是指在从蛋白质的一级序列中的至少两个分开的区域形成的蛋白质抗原上的构象表位。

抗原与抗体之间的相互作用与其他非共价蛋白质-蛋白质相互作用相同。一般来说，抗原与抗体之间存在四种类型的结合相互作用：(i)氢键，(ii)分散力，(iii)路易斯酸与路易斯碱之间的静电力以及(iv)疏水相互作用。疏水相互作用是抗体-抗原相互作用的主要驱动力，并且是基于经由非极性基团的水的排斥而不是分子的吸引(Tanford，(1978)，Science[科学]，200:1012-8)。然而，某些物理力也促成抗原-抗体结合，例如表位形状与不同抗体结合位点的配合或互补。此外，其他材料和抗原可以与抗体发生交叉反应，由此竞争可获得的游离抗体。

抗原与抗体之间的结合的亲和力常数和特异性的测量可以协助确定使用在此描述的结合分子的预防、治疗、诊断或研究方法的功效。“结合亲和力”通常是指分子(例如，抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则如在此使用的，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体与抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由平衡解离常数(Kd)表示，计算为比率k_off/k_on。参见，例如Chen等人，(1999)J.Mol Biol.[分子生物学杂志]293：865-881。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并且倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并且倾向于更长地保持结合。测量结合亲和力的各种方法是本领域已知的。

在一个实施例中，结合分子包括在抗体的一个或多个可变区引入的一个或多个氨基酸改变，例如一个或多个取代、缺失和/或添加。在另一个实施例中，氨基酸改变被引入框架区。框架区残基的一个或多个改变可以导致对于抗原的结合分子的结合亲和力的改进。在一个实施例中，可以改变从约一个至约五个框架残基。

用于确定结合亲和力的方法包括通过使用感兴趣的抗体的Fab版本及其抗原进行的放射性标记的抗原结合测定(RIA)测量解离常数“Kd”，如由Chen等人(1999)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]293:865-881描述的。可替代地，可以通过使用表面等离子体共振测定来测量Kd值，该测定使用BIAcore^TM-2000或BIAcore^TM-3000(BIAcore公司，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州)。如果结合速率超过由表面等离子体共振测定的10⁶M^-1S^-1，那么结合速率可以通过使用在增加浓度的抗原的存在下测量荧光发射强度的增加或减少的荧光猝灭技术来确定。还可以使用上文描述的相同的表面等离子体共振技术来确定“结合速率”(on-rate或rate of association或association rate或k_on)。

适合于确定结合分子的结合特征的方法和试剂是本领域已知的和/或是可商购的(美国专利号6,849,425；6,632,926；6,294,391；6,143,574)。此外，被设计用于此类动力学分析的设备和软件是可商购的(例如A100和2000仪器；BiacoreInternational AB公司，乌普萨拉(Uppsala)，瑞典)。

在一个实施例中，包括抗原结合片段或其变体的结合分子可以在其对甲型流感病毒；乙型流感病毒；或其组合的结合亲和力方面进行描述或指定。典型地，具有高亲和力的抗体具有小于10^-7M的Kd。在一个实施例中，该结合分子或其抗原结合片段结合甲型流感病毒；乙型流感病毒；其片段或变体；或其组合，解离常数或Kd小于或等于5×10^-7M、10^-7M、5×10^-8M、10^-8M、5×10^-9M、10^-9M、5×10^-10M、10^-10M、5×10^-11M、10^-11M、5×10^-12M、10^-12M、5×10^{- 13}M、10^-13M、5×10^-14M、10^-14M、5×10^-15M或10^-15M。在更具体的实施例中，该结合分子或其抗原结合片段结合甲型流感病毒；乙型流感病毒、其片段或变体；或其组合，解离常数或Kd小于或等于5×10^-10M、10^-10M、5×10^-11M、10^-11M、5×10^-12M或10^-12M。本发明涵盖结合甲型流感病毒；乙型流感病毒；或其组合的结合分子或其抗原结合片段，解离常数或Kd在任何单独列举的值之间的范围内。

在另一个实施例中，该结合分子或其抗原结合片段结合甲型流感病毒；乙型流感病毒；其片段或变体；或其组合，解离常数或Kd小于或等于5×10^-2sec^-1、10^-2sec^-1、5×10^{- 3}sec^-1或10^-3sec^-1、5×10^-4sec^-1、10^-4sec^-1、5×10^-5sec^-1、或10^-5sec^-1、5×10^-6sec^-1、10^-6sec^-1、5×10^-7sec^-1或10^-7sec^-1。在更具体的实施例中，该结合分子或其抗原结合片段结合甲型流感多肽或其片段或变体，解离速率(k_off)小于或等于5×10^-4sec^-1、10^-4sec^-1、5×10^-5sec^-1、或10^-5sec^-1、5×10^-6sec^-1、10^-6sec^-1、5×10^-7sec^-1或10^-7sec^-1。本发明还涵盖结合甲型流感病毒；乙型流感病毒；或其组合的结合分子或其抗原结合片段，解离速率(k_off)在任何单独列举的值之间的范围内。

在另一个实施例中，该结合分子或其抗原结合片段结合甲型流感病毒；乙型流感病毒；其片段或变体；或其组合，结合速率(k_on)大于或等于10³M^-1sec^-1、5×10³M^-1sec^-1、10⁴M^-1sec^-1、5×10⁴M^-1sec^-1、10⁵M^-1sec^-1、5×10⁵M^-1sec^-1、10⁶M^-1sec-1、5×10⁶M^-1sec^-1、10⁷M^-1sec-1、或5×10⁷M^-1sec^-1。在更具体的实施例中，该结合分子或其抗原结合片段结合甲型流感病毒；乙型流感病毒；其片段或变体；或其组合，结合速率(k_on)大于或等于10⁵M^-1sec^-1、5×10⁵M^-1sec^-1、10⁶M^-1sec-1、5×10⁶M^-1sec^-1、10⁷M^-1sec^-1或5×10⁷M^-1sec^-1。本发明涵盖结合甲型流感病毒；乙型流感病毒；或其组合的抗体，结合速率(k_on)在任何单独列举的值之间的范围内。

在一个实施例中，可以将结合测定作为直接结合测定抑或作为竞争结合测定而进行。可以使用标准ELISA或标准流式细胞术测定来检测结合。在直接结合测定中，测试了候选结合分子或抗体与其同源抗原的结合。另一方面，竞争结合测定评估了候选结合分子或抗体与已知的抗体或其他结合特定抗原(例如甲型流感病毒HA或乙型流感病毒HA)的化合物竞争的能力。通常，可以使用允许结合分子与可以被检测的甲型流感病毒HA和/或乙型流感病毒HA结合的任何方法来检测和测量在此披露的结合分子的结合特征。

在一个实施例中，该结合分子能够与甲型流感病毒HA和/或乙型流感病毒HA免疫特异地结合，并且能够中和甲型流感病毒和/或乙型流感病毒感染。

在一个实施例中，结合分子的结合结构域的至少一个能够与甲型流感病毒HA免疫特异地结合，并且能够中和甲型流感病毒感染。甲型流感病毒的血球凝集素亚型落入两个主要系统发生分组中，这些分组被鉴别为组1，该组包括亚型H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17和H18；以及组2，该组包括亚型H3、H4、H7、H10、H14和H15。在一个实施例中，结合分子或其结合片段的至少一个结合结构域能够结合和/或中和选自以下各项的一种或多种甲型流感病毒组1亚型：H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17和H18及其变体。在另一个实施例中，结合分子或其结合片段的至少一个结合结构域能够结合和/或中和选自以下各项的一种或多种甲型流感病毒组2亚型：H3、H4、H7、H10、H14和H15及其变体。在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域能够与甲型流感病毒组1亚型H9免疫特异地结合。在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域能够免疫特异地结合并中和甲型流感病毒组1亚型H9。

在一个实施例中，结合分子的至少一个结合结构域能够免疫特异地结合并中和至少一个山形世系乙型流感病毒和至少一个维多利亚世系乙型流感病毒。在另一个实施例中，结合分子的至少一个结合结构域免疫特异地结合并中和山形世系和维多利亚世系乙型流感病毒两者。

在一个实施例中，结合分子或其抗原结合片段的至少一个结合结构域能够免疫特异地结合甲型流感病毒HA和乙型流感病毒HA两者，并且能够中和甲型流感病毒感染和乙型流感病毒感染两者。可以使用本领域已知的方法进行中和测定。术语“50％抑制浓度”(缩写为“IC₅₀”)代表甲型流感病毒和/或乙型流感病毒50％中和所需的抑制剂(例如在此描述的结合分子)的浓度。本领域的普通技术人员将了解，更低的IC₅₀值对应于更有效的抑制剂。

在一个实施例中，该结合分子或其结合片段在微量中和测定中对于中和甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的IC₅₀为：从约0.001μg/ml至约5μg/ml的范围、或从约0.001μg/ml至约1μg/ml的范围内的抗体，或小于5μg/ml、小于2μg/ml、小于1μg/ml、小于0.5μg/ml、小于0.1μg/ml、小于0.05μg/ml或小于0.01μg/ml。

在一个实施例中，该结合分子或其结合片段具有第一结合结构域，该第一结合域在微量中和测定中对于中和甲型流感病毒的IC₅₀为：在从约0.001μg/ml至约5μg/ml的范围、或从约0.001μg/ml至约1μg/ml的范围的抗体，或小于5μg/ml、小于2μg/ml、小于1μg/ml、小于0.5μg/ml、小于0.1μg/ml、小于0.05μg/ml或小于0.01μg/ml。在一个实施例中，该结合分子或其结合片段具有第二结合结构域，该第二结合结构域在微量中和测定中对于中和乙型流感病毒的IC₅₀为：从约0.001μg/ml至约50μg/ml的范围、或从约0.001μg/ml至约5μg/ml的范围的抗体、或从约0.001μg/ml至约1μg/ml的范围的抗体、或小于10μg/ml、小于5μg/ml、小于1μg/ml、小于0.5μg/ml、小于0.1μg/ml、小于0.05μg/ml或小于0.01μg/ml。

在一个实施例中，该结合分子具有结合结构域或其结合片段，在微量中和测定中对于中和乙型流感病毒的IC₅₀为：从约0.001μg/ml至约5μg/ml的范围、或从约0.001μg/ml至约1μg/ml的范围的抗体，或小于5μg/ml、小于2μg/ml、小于1μg/ml、小于0.5μg/ml、小于0.1μg/ml、小于0.05μg/ml或小于0.01μg/ml；并且在微量中和测定中对于中和甲型流感病毒的IC₅₀为：从约0.1μg/ml至约5μg/ml的范围、或从约0.1μg/ml至约2μg/ml的范围的抗体、或小于5μg/ml、小于2μg/ml、小于1μg/ml、或小于0.5μg/ml。

在某些实施例中，在此描述的结合分子可能诱导细胞死亡。“诱导细胞死亡”的抗体是引起活细胞变得无活力的抗体。体外细胞死亡可以在不存在补体和免疫效应细胞的情况下来进行确定，以便区分由抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)诱导的细胞死亡。因此，用于细胞死亡的测定可以使用热灭活的血清(即，在不存在补体的情况下)且在不存在免疫效应细胞的情况下进行。为了确定抗体是否能够诱导细胞死亡，可以相对于未处理的细胞评估膜完整性的丧失，如通过碘化丙啶(PI)、台盼蓝(参见Moore等人，(1995)，Cytotechnology[细胞技术学]17:1-11)、7AAD的摄取或本领域中熟知的其他方法所评价的。

在一个实施例中，该结合分子可以经由细胞凋亡诱导细胞死亡。“诱导细胞凋亡”的结合分子是诱导程序性细胞死亡的结合分子，如通过膜联蛋白V的结合、DNA断裂、细胞收缩、内质网的扩张、细胞破碎和/或膜囊泡(称为凋亡小体)的形成所确定的。多种方法可用于评估与细胞凋亡相关联的细胞事件。例如，可以通过膜联蛋白结合测量磷酯酰丝氨酸(PS)易位；可以通过DNA梯化(laddering)评价DNA断裂；并且可以通过亚二倍体细胞的任何增加来评价核/染色质凝聚连同DNA断裂。在一个实施例中，诱导细胞凋亡的抗体是在膜联蛋白结合测定中相对于未处理的细胞产生约2至50倍、在一个实施例中，约5至50倍、并且在一个实施例中，约10至50倍膜联蛋白结合诱导的抗体。

在另一个实施例中，在此描述的结合分子可以经由抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞介导的细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)来诱导细胞死亡。人IgG1亚类抗体的ADCC活性和CDC活性的表达通常涉及抗体的Fc区结合存在于效应细胞(如杀伤细胞、自然杀伤细胞或活化的巨噬细胞)表面上的抗体的受体(下文称为“FcγR”)。不同的补体组分可以被结合。关于结合，已经提出在抗体的铰链区中以及C区的第二结构域(下文称为“Cγ2结构域”)中的若干氨基酸残基是重要的(Greenwood等人(1993)Eur.J Immunol.[欧洲免疫学杂志]23(5):1098-104；Morgan等人(1995)Immunology[免疫学]86(2):319-324；Clark，M.(1997)Chemical Immunology[化学免疫学]65:88-110)，并且在Cγ2结构域中的糖链(Clark，M.(1997)Chemical Immunology[化学免疫学]65:88-110)也是重要的。

为了评估ADCC活性，可以使用体外ADCC测定，如描述在美国专利号5,500,362中的。该测定还可以使用可商购的试剂盒，例如CytoTox (普洛麦格公司(Promega))来进行。用于这类测定的有用的效应细胞包括但不限于，外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、以及NK细胞系。表达转基因Fc受体(例如CD16)和相关的信号传导多肽(例如FC_εRI-γ)的NK细胞系也可以充当效应细胞(WO 2006/023148)。在一个实施例中，NK细胞系包括CD16并且具有在NFAT启动子下的荧光素酶并且可以被用来测量NK细胞活化，而不是细胞溶解或细胞死亡。普洛麦格公司(Promega)出售相似的技术，其使用Jurkat细胞而不是NK细胞(普洛麦格ADCC报告生物测定#G7010)。例如，可以测定任何特定抗体通过补体活化和/或ADCC介导细胞溶解的能力。感兴趣的细胞在体外生长且进行标记；将结合分子与免疫细胞组合添加至细胞培养物中，这些免疫细胞可以通过抗原抗体复合物活化；即效应细胞参与ADCC应答。还可以针对补体活化对结合分子进行测试。在任一情况下，通过标记从溶解的细胞的释放来检测细胞溶解。细胞溶解的程度还可以通过检测细胞质蛋白(例如LDH)至上清液中的释放来测定。事实上，可以使用患者自身的血清作为补体和/或免疫细胞的来源来筛选抗体。然后，能够在体外测试中介导人ADCC的结合分子可以治疗性地用于该特定患者。结合分子的ADCC活性也可以例如在如Clynes等人，(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]95:652-656中披露的动物模型中进行体内评估。此外，用于调节(即，增加或降低)抗体的ADCC和任选地CDC活性的水平的技术是本领域中熟知的(例如，美国专利号5,624,821；6,194,551；7,317,091)。在此描述的结合分子可能能够诱导ADCC和/或CDC，或者可能已经进行修饰以具有诱导ADCC和/或CDC的能力。用于确定ADCC功能的测定可以使用人效应细胞来实施以便评定人ADCC功能。这类测定还可以包括旨在筛选通过坏死和/或凋亡机制诱导、介导、增强、阻断细胞死亡的抗体的那些测定。包括利用活性染料的测定的此类方法、检测和分析半胱天冬酶的方法、以及测量DNA断裂的测定可以用于评估用感兴趣的抗体在体外培养的细胞的凋亡活性。

多核苷酸

还在此提供的是对应于氨基酸序列并编码在此描述的结合分子的核苷酸序列。在一个实施例中，本发明提供包括编码在此描述的结合分子或其片段的核苷酸序列的多核苷酸，该多核苷酸包括例如编码包括CDR和FR的VH和VL区的多核苷酸序列，以及在细胞(例如哺乳动物细胞)中有效表达的表达载体。使用多核苷酸制备结合分子的方法是本领域已知的并且在下面进行简洁地描述。

还包括在严格或较低严格性杂交条件(例如，如在此定义的)下与编码在此描述的结合分子或其片段的多核苷酸杂交的多核苷酸。如在此使用的术语“严格性”是指杂交实验的实验条件(例如，温度和盐浓度)，指示在探针与过滤器结合的核酸之间的同源性的程度；严格性越高，探针与过滤器结合的核酸之间的同源性百分比越高。

严格杂交条件包括但不限于：在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中、在约45℃下与过滤器结合的DNA杂交，随后在约50℃-65℃下在0.2X SSC/0.1％SDS中洗涤一次或多次；高严格条件如在6X SSC中、在约45℃下与过滤器结合的DNA杂交，随后在约65℃下在0.1X SSC/0.2％SDS中洗涤一次或多次；或者本领域的技术人员已知的任何其他严格杂交条件(参见例如，Ausubel等人编辑，(1989)Current Protocols in Molecular Biology[当代分子生物学实验指南]，第1卷，Green Publishing Associates,Inc.[格林出版协会公司]和JohnWiley and Sons,Inc.[约翰威利父子出版公司]，纽约，第6.3.1至6.3.6页和第2.10.3页)。

基本上一致的序列包括多态性序列，即群体中的可替代序列或等位基因。等位基因差异可以小到一个碱基对。基本上一致的序列还可以包含诱变序列，包括具有沉默突变的序列。突变可以包含一个或多个残基改变、一个或多个残基的缺失、或一个或多个另外的残基的插入。

可以通过本领域已知的任何方法获得多核苷酸以及确定的多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果结合分子的核苷酸序列是已知的，那么编码该结合分子的多核苷酸可以从化学合成的寡核苷酸组装(例如，如在Kutmeier等人，(1994)，BioTechniques[生物技术]17:242中所描述)，简单地说，这涉及合成含有编码该结合分子的序列的部分的重叠寡核苷酸，退火并且连接那些寡核苷酸，并且然后通过PCR扩增所连接的寡核苷酸。

编码结合分子的多核苷酸还可以从来自合适来源的核酸产生。如果含有编码特定结合分子的核酸的克隆不可获得，但结合分子的序列是已知的，则编码免疫球蛋白的核酸可以化学合成，或通过使用与序列的3’和5’端可杂交的合成引物的PCR扩增，或通过使用对特定基因序列具有特异性的寡核苷酸探针以便鉴定例如来自cDNA文库的编码抗体的cDNA克隆来进行克隆，而从合适的来源(例如，抗体cDNA文库、或从表达抗体的任何组织或细胞(被选择以表达抗体的杂交瘤细胞)产生的cDNA文库、或从其分离的核酸(在一个实施例中，polyA+RNA))获得。然后可以使用本领域熟知的任何方法将通过PCR产生的扩增核酸克隆到可复制的克隆载体中。

一旦确定结合分子的核苷酸序列和相应的氨基酸序列，就可以使用本领域中熟知的用于操纵核苷酸序列的方法，例如重组DNA技术、定点诱变、PCR等(参见，例如以下文献中所描述的技术：Sambrook等人，(1990)，Molecular Cloning,A Laboratory Manual[分子克隆：实验手册]，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory[冷泉港实验室]，冷泉港，纽约；和Ausubel等人编辑，(1998)，Current Protocols in Molecular Biology[当代分子生物学实验指南]，John Wiley&Sons[约翰与威利父子公司]，纽约)来对结合分子的核苷酸序列进行操纵以产生具有不同氨基酸序列的结合分子，例如以产生氨基酸取代、缺失和/或插入。

结合分子的产生

用于产生和筛选多肽(如在此描述的结合分子)的重组DNA方法是常规的并且是本领域已知的(例如美国专利号4,816,567)。编码结合分子或其片段的DNA，例如编码VH结构域、VL结构域、scFv、或其组合的DNA可以插入合适的表达载体中，然后将其转染不以其他方式产生抗体蛋白质的合适的宿主细胞(如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞)中以获得结合分子。

在一个实施例中，含有编码结合分子、结合分子的重链或轻链或其结合结构域、结合结构域的重链或轻链可变结构域、或重链或轻链CDR的多核苷酸的表达载体可操作地连接至启动子。此类载体可以包含编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(参见例如，美国专利号5,981,216；5,591,639；5,658,759和5,122,464)，并且可以将抗体的可变结构域克隆至这样的载体中用于表达整个重链、整个轻链或整个重链和轻链两者。

通过常规技术可以将表达载体转移至宿主细胞中，并且通过常规技术来培养转染的细胞以产生结合分子。在一个实施例中，提供可操作地连接至异源启动子的宿主细胞，该宿主细胞含有编码结合分子或其片段、或其重链或轻链、或其部分、或单链抗体的多核苷酸。

作为用于表达重组抗体的宿主合适的哺乳动物细胞系是本领域中已知的，并且包括许多可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、人上皮肾293细胞、以及多种其他细胞系。不同的宿主细胞具有针对蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征性和特异性机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统以便确保所表达的抗体或其部分的正确修饰和加工。为此，可以使用具有用于初级转录物的适当加工、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机器(cellular machinery)的真核宿主细胞。这类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0(不内源性地产生任何功能性免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、SP20、CRL7O3O以及HsS78Bst细胞。通过使人淋巴细胞永生化而产生的人细胞系可以用来重组产生单克隆抗体。人细胞系PER.(库赛尔公司(Crucell)，荷兰)可以用来重组产生单克隆抗体。

可以用作表达重组抗体的宿主的另外的细胞系包括但不限于昆虫细胞(例如Sf21/Sf9，粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)Bti-Tn5b1-4)或酵母细胞(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia)、US 7326681；等)、植物细胞(US 20080066200)；以及鸡细胞(WO 2008142124)。

在一个实施例中，该结合分子在细胞系中稳定表达。稳定表达可以用于重组蛋白的长期、高产量生产。为了稳定表达，可以用包含表达控制元件(例如，启动子、增强子、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和选择性标志基因的适当工程化的载体转化宿主细胞。在引入外源DNA后，允许细胞在富集培养基中生长1-2天，并且然后切换至选择性培养基。在重组质粒中的选择性标记赋予对选择的抗性，并且允许已经将质粒稳定整合到其染色体中的细胞生长并且形成病灶，进而可以将其克隆并且扩增成细胞系。用于以高产量产生稳定细胞系的方法是在本领域中熟知的，并且试剂通常是可商购的。

在其他实施例中，该结合分子在细胞系中瞬时表达。瞬时转染是引入细胞中的核酸不会整合到该细胞的基因组或染色体DNA中并且在该细胞中维持为染色体外元件例如作为附加体的一个过程。

稳定或瞬时转染的细胞系被维持在本领域熟知的细胞培养基和条件中，从而导致结合分子的表达和产生。在某些实施例中，哺乳动物细胞培养基是基于可商购的培养基配制品，包括例如DMEM或汉姆氏(Ham’s)F12。在其他实施例中，将细胞培养基进行改良以便支持细胞生长和生物蛋白表达两者的增长。如在此使用的术语“细胞培养基”、“培养基”、以及“培养基配制品”是指在多细胞有机体或组织以外的人工体外环境中用于细胞的维持、生长、繁殖、或扩增的营养液。可以将细胞培养基优化以用于特定的细胞培养用途，包括例如，被配制来促进细胞生长的细胞培养物生长培养基，或者被配制来促进重组蛋白产生的细胞培养物生产培养基。术语营养素、成分、以及组分(component)在此可互换地使用，是指组成细胞培养基的组分(constituent)。

在一个实施例中，使用补料分批法维持细胞系。如在此使用的，“补料分批法”是指在首先用基础培养基孵育之后，供应另外的营养素给细胞培养物的方法。例如，补料分批法可以包括在给定的时期内根据所确定的补料时间表添加补充培养基。因此，“补料分批细胞培养”是指这样一种细胞培养：其中最初将细胞(典型地为哺乳动物细胞)和培养基供应至培养容器，并且在培养期间，连续地或以不连续递增方式将另外的培养营养素供给至培养物，在培养终止之前有或没有细胞和/或产物的定期收获。

细胞培养基以及其中包含的营养素是本领域技术人员已知的。在一个实施例中，细胞培养基包含基础培养基以及产生改良的基础培养基的至少一种水解产物，例如基于大豆的水解产物、基于酵母的水解产物、或这两种类型的水解产物的组合。在另一个实施例中，另外的营养素可以仅包含基础培养基如浓缩的基础培养基，或者可以仅包含水解产物或浓缩的水解产物。适合的基础培养基包括但不限于达尔伯克改良的伊格尔培养基(DMEM)、DME/F12、最低必需培养基(MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、α-最低必需培养基(α-MEM)、格拉斯哥最低必需培养基(G-MEM)、PF CHO(参见，例如，CHO无蛋白质培养基(西格玛)或用于无蛋白质的CHO细胞的EX-CELL^TM325PF CHO无血清培养基(SAFC生物科学公司))、以及伊斯科夫改良的达尔伯克培养基(Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium)。可以用于本发明的基础培养基的其他实例包括BME基础培养基(Gibco-英杰公司(Invitrogen)；还参见Eagle,H(1965)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.[实验生物学与医学学会会报]89，36)；杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified EagleMedium)(DMEM，粉末)(Gibco-英杰公司(#31600)；还参见Dulbecco和Freeman(1959)Virology[病毒学]8:396；Smith等人(1960)Virology[病毒学]12:185，体外组织培养标准委员会(Tissue Culture Standards Committee,In Vitro)6:2，93)；CMRL 1066培养基(Gibco-英杰公司(#11530)；还参见Parker等人(1957)特别出版物，纽约科学院，5:303)。

基础培养基可以是无血清的，意指该培养基不含血清(例如，胎牛血清(FBS)、马血清、山羊血清、或本领域的技术人员已知的任何其他动物源的血清)，或没有动物蛋白的培养基或化学上限定的培养基。

可以改良基础培养基以便去除在标准基础培养基中发现的某些非营养组分，如不同的无机和有机缓冲液、一种或多种表面活性剂、以及氯化钠。此类组分从基础细胞培养基的去除允许剩余营养组分的浓度增加，并且可以改进总体的细胞生长和蛋白质表达。另外，可以根据细胞培养条件的要求，将省去的组分添加回至含有改良的基础细胞培养基的细胞培养基中。在某些实施例中，细胞培养基包含改良的基础细胞培养基以及至少一种以下营养素：铁源、重组生长因子；缓冲液；表面活性剂；渗透性调节剂；能量源；以及非动物水解产物。另外，改良的基础细胞培养基可以任选地含有氨基酸、维生素、或氨基酸和维生素两者的组合。在另一个实施例中，改良的基础培养基进一步包含谷氨酰胺，例如L-谷氨酰胺和/或氨甲蝶呤。

纯化和分离

一旦已经产生结合分子，就可以通过本领域中已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法，例如，通过色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱(特别是通过对于特定抗原蛋白A或蛋白G的亲和力)、以及尺寸柱色谱(sizing column chromatography))、离心、差别溶解度、或者通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术将其纯化。此外，本发明的抗体或其片段可以融合至异源多肽序列(在此称为“标签”)，以便促进纯化。

在一个实施例中，提供基本上纯的/分离的结合分子。在一个实施例中，可以向患者给予这些分离的/纯化的重组表达的结合分子以便介导预防或治疗作用。预防剂是被设计且用于预防疾病、病症或感染发生的药物或治疗。治疗剂具体地涉及特定疾病、病症或感染的治疗。治疗剂量是用于治疗特定疾病、病症或感染所需的量。在另一个实施例中，这些分离的/纯化的抗体可以用于诊断流感病毒感染，例如甲型流感病毒感染、乙型流感病毒感染、或其组合。

糖基化

除了糖基化的改变抗体的效应子功能的能力之外，在可变区中的修改的糖基化还可以改变抗体对于抗原的亲和力。在一个实施例中，在本发明抗体的可变区中的糖基化模式被修改。例如，可以制作无糖基化的抗体(即，抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化作用例如以增加该抗体对抗原的亲和性。此类糖类修饰可以通过例如改变在抗体序列之内的一个或多个糖基化位点来完成。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，导致一个或多个可变区框架糖基化位点的消除，由此消除在那个位点的糖基化。这种无糖基化可以增加抗体对于抗原的亲和力。这种方法在美国专利号5,714,350和6,350,861中更详细地描述。还可以进行一个或多个氨基酸取代，氨基酸取代导致存在于Fc区中的糖基化位点(例如，IgG的天冬酰胺297)的消除。此外，无糖基化的抗体可以在缺乏必要的糖基化机器(machinery)的细菌细胞中产生。

变体和轭合物

在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个结合结构域，该结合结构域包括在可变轻(VL)结构域和/或可变重(VH)结构域和/或Fc区和翻译后修饰中的一个或多个氨基酸残基和/或多肽取代、添加和/或缺失。在一个实施例中，该结合分子包括一个或多个保守氨基酸取代。可以在涉及残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、和/或两亲性的相似性的基础上做出保守性氨基酸取代。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；以及带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。另外，甘氨酸和脯氨酸是能影响链取向的残基。非保守性取代将使得必需将这些类别之一的成员与另一类别中的成员交换。此外，如果希望的话，非典型氨基酸或化学氨基酸相似物可以作为取代或添加而被引入抗体序列中。非典型氨基酸总体上包括但不限于普通氨基酸的D-异构体、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、设计者(designer)氨基酸(例如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸、以及氨基酸相似物。

在一个实施例中，一个或多个半胱氨酸残基通常用丝氨酸进行取代，以提高分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可以将半胱氨酸键添加至抗体以改进它的稳定性(特别是在抗体是如Fv片段的抗体片段的情况下)。

在一个实施例中，将一个或多个突变引入抗体分子的一个或多个框架区。在另一个实施例中，将一个或多个突变引入抗体分子的一个或多个CDR区。

在一个实施例中，使用本领域已知的方法将结合分子轭合或共价附接至异源氨基酸序列或其他部分或物质。在一个实施例中，连接的物质是治疗剂、可检测的标记(在此还被称为报道分子)或固体支撑物。用于附接至抗体的合适的物质包括但不限于氨基酸、肽、蛋白质、多糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、半抗原、药物、激素、脂质、脂质组装体、合成聚合物、聚合微粒、生物细胞、病毒、荧光团、生色团、染料、毒素、酶、抗体、抗体片段、放射性同位素、固体基质、半固体基质、及其组合。用于将另一种物质轭合或共价附接至抗体的方法是已知的。

在一个实施例中，将该结合分子与固体载体轭合。结合分子可以轭合至固体载体作为筛选和/或纯化和/或制造过程的一部分。可替代地，结合分子可以轭合至固体载体作为诊断方法或组合物的一部分。固体载体典型地基本上不溶于液相。有大量载体可用并且为本领域的普通技术人员所已知。

在一个实施例中，该结合分子出于诊断和其他测定的目的轭合至标记，在该诊断和其他测定中可以检测到结合分子和/或其相关的配体。标记包括任何化学部分(有机的或无机的)，该化学部分在大于280nm的波长下展现出最大吸收并且在共价附接至结合分子时保留其光谱特性。标记物包括但不限于发色团、荧光团、荧光蛋白、磷光性染料、叠层染料(tandem dye)、颗粒、半抗原、酶以及放射性同位素。

在某些实施例中，该标记是酶。酶作为标签是令人希望的，因为可以获得可检测信号的扩大，导致测定灵敏度增加。酶自身不产生可检测的响应，但是当它被适当的底物接触时，起到分解底物的作用，这样使得被转化的底物产生荧光、比色或发光信号。因为标记试剂上的一种酶可以导致多个底物被转化成可检测的信号，所以酶将可检测的信号放大。选择酶底物以产生优选的可测量的产物，例如，比色、荧光或化学发光。这类底物在本领域中广泛使用且是本领域的技术人员熟知的。

在另一个实施例中，该标记是半抗原如生物素。生物素是有用的，这是因为它可以在酶系统中起作用以进一步放大可检测的信号并且它可以充当一个有待在亲和色谱中使用用于分离目的标签。出于检测目的，使用对于生物素具有亲和力的酶轭合物，如抗生物素蛋白-HRP。随后添加一种过氧化物酶底物以产生可检测的信号。半抗原还包括激素、天然存在和合成的药物、污染物、过敏原、影响分子、生长因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、氨基酸、肽、化学中间体、核苷酸及相似物。

在某些实施例中，荧光蛋白可以用作标记。荧光蛋白的实例包括绿色荧光蛋白(GFP)和藻胆蛋白以及其衍生物。

在某些实施例中，标记是放射性同位素。适合的放射性材料的实例包括但不限于：碘(¹²¹I、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹¹¹In、¹¹²In、^113mIn、^115mIn)、锝(⁹⁹Tc、^99mTc)、铊(²⁰¹Ti)、镓(⁶⁸Ga、⁶⁷Ga)、钯(¹⁰³Pd)、钼(⁹⁹Mo)、氙(¹³⁵Xe)、氟(¹⁸F)、¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、¹⁵⁹Gd、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁰La、¹⁷⁵Yb、¹⁶⁶Ho、⁹⁰Y、⁴⁷Sc、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁴²Pr、¹⁰⁵Rh、以及⁹⁷Ru。

医学治疗和用途

在此描述的结合分子及其抗原结合片段可以用于治疗甲型流感病毒感染和/或乙型流感病毒感染，用于预防甲型流感病毒感染和/或乙型流感病毒感染；用于检测、诊断和/或预后甲型流感病毒感染和/或乙型流感病毒感染；或其组合。

诊断的方法可以包括将结合分子或其片段与样品接触。这类样品可以是从例如鼻腔通道、鼻窦腔、唾液腺、肺、肝、胰腺、肾、耳、眼、胎盘、消化道、心脏、卵巢、垂体、肾上腺、甲状腺、脑或皮肤取得的组织样品。检测、诊断和/或预后方法还可以包括检测抗原/抗体复合物。

在一个实施例中，提供治疗受试者的方法，该方法包括向受试者给予有效量的结合分子或其结合片段、或者包括该结合分子或其结合片段的药物组合物。在一个实施例中，该结合分子或其结合片段是基本上纯的(即，基本上不含限制其作用或产生不希望的副作用的物质)。在一个实施例中，该结合分子或其结合片段在暴露后给予，或者在受试者已经暴露于甲型流感病毒和/或乙型流感病毒、或被甲型流感病毒和/或乙型流感病毒感染的之后给予。在另一个实施例中，该结合分子或其结合片段是在暴露前给予，或者向还没有暴露于甲型流感病毒和/或乙型流感病毒、或还没有被甲型流感病毒和/或乙型流感病毒感染的受试者给予。

在一个实施例中，将该结合分子或其结合片段给予至对于一种或多种甲型流感病毒亚型和/或乙型流感病毒菌株是血清反应阴性的受试者。在另一个实施例中，将该结合分子或其抗原结合片段给予至对于一种或多种甲型流感病毒亚型和/或乙型流感病毒株是血清反应阳性的受试者。在一个实施例中，在感染或症状发作的1天、2天、3天、4天、5天内向受试者给予该结合分子或其结合片段。在另一个实施例中，在感染或症状发作之后1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天之后，以及在感染或症状发作之后2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天内向受试者给予该结合分子或其结合片段。

在一个实施例中，该方法减轻在受试者中的甲型流感病毒和/或乙型流感病毒感染。在另一个实施例中，该方法预防受试者的甲型流感病毒和/或乙型流感病毒感染、降低受试者的甲型流感病毒和/或乙型流感病毒感染的风险或延迟受试者的甲型流感病毒和/或乙型流感病毒感染。在一个实施例中，受试者是动物。在一个实施例中，该受试者是脊索动物亚纲的成员，包括例如人类和其他灵长类动物，包括非人类灵长类动物(如黑猩猩和其他猿猴类)。在另一个实施例中，该受试者是农场动物如牛、绵羊、猪、山羊和马；驯养的动物，如狗和猫；实验室动物，包括啮齿类(如小鼠、大鼠和豚鼠)；禽，包括驯养的、野生的和狩猎的禽，如鸡、火鸡和其他鹑鸡类禽、鸭、鹅。在一个实施例中，受试者包括但不限于，特别是处于甲型流感病毒和/或乙型流感病毒感染的风险或易患甲型流感病毒和/或乙型流感病毒感染的受试者，包括例如，免疫功能低下的受试者。

治疗可以是单剂量方案或多剂量方案，并且该结合分子或其结合片段可以用于被动免疫或主动免疫接种。

在一个实施例中，将该结合分子或其结合片段与一种或多种抗病毒药物组合给予至受试者。在一个实施例中，将该结合分子或其结合片段与一种或多种小分子抗病毒药物(包括但不限于神经氨酸酶抑制剂(如奥司他韦扎那米韦)和金刚烷(如金刚烷胺和金刚乙胺))组合给予至受试者。

在另一个实施例中，提供用作预防或治疗甲型流感病毒和/或乙型流感病毒感染的药物的组合物。在另一个实施例中，将结合分子或其结合片段和/或具有结合分子或其抗原结合片段结合的表位的蛋白质用于制造治疗受试者和/或在受试者中诊断的药物。

也可以将如在此描述的结合分子及其片段用于诊断甲型流感病毒感染；乙型流感病毒感染；或其组合的试剂盒中。也可以将如在此描述的结合分子、抗体片段、或其变体和衍生物用于监测疫苗免疫原性的试剂盒中。

在一个实施例中，提供制备药物组合物的方法，该方法包括将在此描述的结合分子与一种或多种药学上可接受的载体混合的步骤。

各种递送系统是已知的并且可以用于给予在此描述的结合分子或其结合片段，包括但不限于，封装在脂质体、微颗粒、微胶囊中、能够表达该结合分子或片段的重组细胞、受体介导的内吞作用、电穿孔、构建作为逆转录病毒或其他载体的一部分的核酸等。引入方法包括但不限于，皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、以及口服途径。在一个实施例中，该结合分子可以作为具有编码结合分子的DNA或RNA的质粒例如通过电穿孔进行给予。这些组合物可以与其他生物学活性试剂(包括但不限于小分子抗病毒组合物)一起给予。给予可以是全身性的或局部的。也可以例如通过使用吸入器或雾化器以及具有雾化剂的制剂而采用肺部给予。在又另一个实施例中，可以在控制释放系统中递送该组合物。

在此还提供的是包括治疗有效量的结合分子或其结合片段，以及药学上可接受的载体的药物组合物。如在此使用的术语“药学上可接受的”意指由联邦政府或州政府的监管机构批准或在美国药典或其他普遍认可的药典中列出用于动物并且更具体地用于人。术语“载体”是指与治疗剂一起给予的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类药物载体可以为无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内给予药物组合物时，水是优选的载体。还可以将盐水溶液、水性右旋糖和甘油溶液用作液体载体，特别是用于注射溶液。适合的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇以及相似物。如果希望的话，该组合物还以含有少量湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取以下形式：溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、持续释放配制品以及相似物。该组合物可以与传统的结合剂和载体如甘油三酯一起配制为栓剂。口服配制品可以包含标准载体，如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。在一个实施例中，该药物组合物含有治疗有效量的抗体或其抗原结合片段(优选呈纯化形式)连同适合量的载体以便提供用于正确给予至患者的形式。该制剂应该符合给予方式的要求。典型地，对于抗体治疗剂，给予至患者的剂量在约0.1mg/kg至100mg/kg患者体重之间。

试剂盒

在一个实施例中，提供包括如在此描述的至少一种结合分子的制品，如无菌剂型和试剂盒。可以提供含有用于例如在ELISA或蛋白质印迹中体外检测和定量流感病毒的结合分子的试剂盒。适用于检测的结合分子可以提供有标记，如荧光或放射性标记。

示例性实施例

1.一种分离的结合分子，该结合分子特异地结合至甲型流感病毒和乙型流感病毒，该结合分子包含：

(a)第一结合结构域，该第一结合结构域能够结合至甲型流感病毒血球凝集素(HA)并且中和至少一个组1亚型和至少1个组2亚型的甲型流感病毒；以及

(b)第二结合结构域，该第二结合结构域能够结合至乙型流感病毒血球凝集素(HA)并且中和处于至少两种系统发生的不同世系中的乙型流感病毒。

2.根据权利要求1所述的分离的结合分子，其中该第一结合结构域能够中和选自以下各项的一种或多种甲型流感病毒组1亚型：H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17、H18及其变体；以及选自以下各项的一种或多种甲型流感病毒组2亚型：H3、H4、H7、H10、H14和H15及其变体。

3.根据权利要求1所述的分离的结合分子，其中该第二结合结构域能够中和处于山形和维多利亚世系两者中的乙型流感病毒。

4.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中该第一结合结构域包含抗甲型流感病毒抗体或其抗原结合片段。

5.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中该第二结合结构域包含抗乙型流感病毒抗体或其抗原结合片段。

6.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，该结合分子包含抗体重链的至少一个VH和抗体轻链的至少一个VL。

7.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中该第一结合结构域包含抗体重链的至少一个VH和抗体轻链的至少一个VL。

8.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中该第二结合结构域包含抗体重链的至少一个VH和抗体轻链的至少一个VL。

9.根据前述权利要求中任一项所述的分离的结合分子，其中该第一结合结构域包括一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中该组六个CDR具有选自以下各项的氨基酸序列：

(a)与以下各项具有至少75％一致性的氨基酸序列：SEQ ID NO.:8的HCDR1、SEQID NO.:9的HCDR2、SEQ ID NO.:10的HCDR3、SEQ ID NO.:3的LCDR1、SEQ ID NO.:4的LCDR2和SEQ ID NO.:5的LCDR3；

(b)氨基酸序列：SEQ ID NO.:8的HCDR1、SEQ ID NO.:9的HCDR2、SEQ ID NO.:10的HCDR3、SEQ ID NO.:3的LCDR1、SEQ ID NO.:4的LCDR2和SEQ ID NO.:5的LCDR3；

(c)与以下各项具有至少75％一致性的氨基酸序列：SEQ ID NO.:18的HCDR1、SEQID NO.:19的HCDR2、SEQ ID NO.:20的HCDR3、SEQ ID NO.:13的LCDR1、SEQ ID NO.:14的LCDR2、SEQ ID NO.:15的LCDR3；以及

(d)氨基酸序列：SEQ ID NO.:18的HCDR1、SEQ ID NO.:19的HCDR2、SEQ ID NO.:20的HCDR3、SEQ ID NO.:13的LCDR1、SEQ ID NO.:14的LCDR2、SEQ ID NO.:15的LCDR3。

10.根据前述权利要求中任一项所述的分离的结合分子，其中该第一结合结构域包含具有如下氨基酸序列的VH，该氨基酸序列与选自以下各项的VH的氨基酸序列具有至少75％一致性：

(a)SEQ ID NO.:7的VH；以及

(b)SEQ ID NO.:17的VH。

11.根据前述权利要求中任一项所述的分离的结合分子，其中该第一结合结构域包含具有如下氨基酸序列的VL，该氨基酸序列与选自以下各项的VL的氨基酸序列具有至少75％一致性：

(a)SEQ ID NO.:2的VL；以及

(b)SEQ ID NO.:12的VL。

12.根据前述权利要求中任一项所述的分离的结合分子，其中该第一结合结构域包含VH和VL，该VH和VL分别与选自以下各项的VH和VL的氨基酸序列具有至少75％一致性：

(a)SEQ ID NO.:7的VH和SEQ ID NO.:2的VL；以及

(b)SEQ ID NO.:17的VH和SEQ ID NO.:12的VL。

13.根据前述权利要求中任一项所述的分离的结合分子，其中该第一结合结构域包含选自以下各项的VH和VL：

(a)SEQ ID NO.:7的VH和SEQ ID NO.:2的VL；以及

(b)SEQ ID NO.:17的VH和SEQ ID NO.:12的VL。

14.根据前述权利要求中任一项所述的分离的结合分子，其中该第二结合结构域包括一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中该组六个CDR具有选自以下各项的氨基酸序列：

(a)与以下各项具有至少75％一致性的氨基酸序列：SEQ ID NO.:28的HCDR1、SEQID NO.:29的HCDR2、SEQ ID NO.:30的HCDR3、SEQ ID NO.:23的LCDR1、SEQ ID NO.:24的LCDR2和SEQ ID NO.:25的LCDR3；

(b)氨基酸序列：SEQ ID NO.:28的HCDR1、SEQ ID NO.:29的HCDR2、SEQ ID NO.:30的HCDR3、SEQ ID NO.:23的LCDR1、SEQ ID NO.:24的LCDR2和SEQ ID NO.:25的LCDR3；

(c)与选自以下各项的氨基酸序列具有至少75％一致性的氨基酸序列：SEQ IDNO.:44的HCDR1、SEQ ID NO.:45的HCDR2、SEQ ID NO.:46的HCDR3、SEQ ID NO.:39的LCDR1、SEQ ID NO.:40的LCDR2和SEQ ID NO.:41的LCDR3；

(d)氨基酸序列：SEQ ID NO.:44的HCDR1、SEQ ID NO.:45的HCDR2、SEQ ID NO.:46的HCDR3、SEQ ID NO.:39的LCDR1、SEQ ID NO.:40的LCDR2和SEQ ID NO.:41的LCDR3；

(e)与以下各项具有至少75％一致性的氨基酸序列：SEQ ID NO.:60的HCDR1、SEQID NO.:61的HCDR2、SEQ ID NO.:62的HCDR3、SEQ ID NO.:55的LCDR1、SEQ ID NO.:56的LCDR2、SEQ ID NO.:57的LCDR3；以及

(f)氨基酸序列：SEQ ID NO.:60的HCDR1、SEQ ID NO.:61的HCDR2、SEQ ID NO.:62的HCDR3、SEQ ID NO.:55的LCDR1、SEQ ID NO.:56的LCDR2、SEQ ID NO.:57的LCDR3。

15.根据前述权利要求中任一项所述的分离的结合分子，其中该第二结合结构域包含具有如下氨基酸序列的VH，该氨基酸序列与选自以下各项的VH的氨基酸序列具有至少75％一致性：

(a)SEQ ID NO.:27的VH；

(b)SEQ ID NO.:33的VH；

(c)SEQ ID NO.:36的VH；

(d)SEQ ID NO.:43的VH；

(e)SEQ ID NO.:49的VH；

(f)SEQ ID NO.:52的VH；

(g)SEQ ID NO.:59的VH；以及

(h)SEQ ID NO.:65的VH。

16.根据前述权利要求中任一项所述的分离的结合分子，其中该第二结合结构域包含具有如下氨基酸序列的VL，该氨基酸序列与选自以下各项的VL的氨基酸序列具有至少75％一致性：

(a)SEQ ID NO.:22的VL；

(b)SEQ ID NO.:32的VL；

(c)SEQ ID NO.:35的VL；

(d)SEQ ID NO.:38的VL；

(e)SEQ ID NO.:48的VL；

(f)SEQ ID NO.:51的VL；

(g)SEQ ID NO.:54的VL；以及

(h)SEQ ID NO.:64的VL。

17.根据前述权利要求中任一项所述的分离的结合分子，其中该第二结合结构域包含VH和VL，该VH和VL分别与选自以下各项的VH和VL的氨基酸序列具有至少75％一致性：

(a)SEQ ID NO.:27的VH和SEQ ID NO.:22的VL；

(b)SEQ ID NO.:33的VH和SEQ ID NO.:32的VL；

(c)SEQ ID NO.:36的VH和SEQ ID NO.:35的VL；

(d)SEQ ID NO.:43的VH和SEQ ID NO.:38的VL；

(e)SEQ ID NO.:49的VH和SEQ ID NO.:48的VL；

(f)SEQ ID NO.:52的VH和SEQ ID NO.:51的VL；

(g)SEQ ID NO.:59的VH和SEQ ID NO.:54的VL；以及

(h)SEQ ID NO.:65的VH和SEQ ID NO.:64的VL。

18.根据前述权利要求中任一项所述的分离的结合分子，其中该第二结合结构域包含选自以下各项的VH和VL：

(a)SEQ ID NO.:27的VH和SEQ ID NO.:22的VL；

(b)SEQ ID NO.:33的VH和SEQ ID NO.:32的VL；

(c)SEQ ID NO.:36的VH和SEQ ID NO.:35的VL；

(d)SEQ ID NO.:43的VH和SEQ ID NO.:38的VL；

(e)SEQ ID NO.:49的VH和SEQ ID NO.:48的VL；

(f)SEQ ID NO.:52的VH和SEQ ID NO.:51的VL；

(g)SEQ ID NO.:59的VH和SEQ ID NO.:54的VL；以及

(h)SEQ ID NO.:65的VH和SEQ ID NO.:64的VL。

19.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，该结合分子包含双特异性抗体。

20.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中一个或多个结合结构域包含可变片段(Fv)结构域。

21.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中一个或多个结合结构域包含scFv分子。

22.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中一个或多个结合结构域包含Fv结构域，并且一个或多个结合结构域包含scFv分子。

23.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中该第一结合结构域包含抗甲型流感病毒Fv结构域。

24.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，该结合分子包含两个抗体重链和两个抗体轻链。

25.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，该结合分子包含Fv结构域，该Fv结构域包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其中该Fv特异地结合抗甲型流感病毒。

26.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中该第二结合结构域包含抗乙型流感病毒scFv分子。

27.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中该第一结合结构域包含抗甲型流感病毒Fv结构域，并且该第二结合结构域包含抗乙型流感病毒scFv分子。

28.根据权利要求27所述的结合分子，其中该第一结合结构域的Fv结构域包含重链(HC)，该重链包含具有氨基末端和羧基末端的多肽链，以及轻链(LC)，该轻链包含具有氨基末端和羧基末端的多肽链，并且

(a)该第二结合结构域共价连接至该第一结合结构域的HC的羧基末端；

(b)该第二结合结构域共价连接至该第一结合结构域的HC的氨基末端；

(c)该第二结合结构域共价连接至该第一结合结构域的LC的氨基末端；或者

(d)该第二结合结构域共价地插入该第一结合结构域的HC的多肽链中。

29.根据权利要求28所述的结合分子，其中该结合分子包含抗体或其片段，该抗体或其片段包含具有式scFv-L1-VL-CL的抗体轻链，其中scFv是scFv分子、L1是接头、VL是轻链可变结构域、CL是轻链恒定结构域并且VL是轻链可变结构域。

30.根据权利要求28所述的结合分子，其中该重链包含式scFv-L1-VH-CH1-CH2-CH3，其中scFv是scFv分子、L1是接头、VH是重链可变结构域、CH1是重链恒定结构域结构域1、CH2是重链恒定结构域结构域2、并且CH3是重链恒定结构域结构域3。

31.根据权利要求28-30中任一项所述的结合分子，该结合分子包含具有如下氨基酸序列的可变重链结构域(VH)，该氨基酸序列与选自SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:17的氨基酸VH结构域序列具有至少75％一致性。

32.根据权利要求28-31中任一项所述的结合分子，该结合分子包含具有如下氨基酸序列的可变轻链结构域(VL)，该氨基酸序列与选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:12的氨基酸VL结构域序列具有至少75％一致性。

33.根据权利要求28所述的结合分子，其中该结合分子包含分别具有第一和第二C-末端结构域的第一和第二重链，其中一个或多个scFv分子共价附接至第一重链、第二重链、或其组合的C-末端结构域。

34.根据权利要求28所述的结合分子，其中一个或多个重链包含式VH-CH1-CH2-CH3，其中VH是重链可变结构域、CH1是重链恒定结构域结构域1、CH2是重链恒定结构域结构域2、并且CH3是重链恒定结构域3。

35.根据权利要求34所述的结合分子，其中一个或多个重链包含式VH-CH1-L1-scFv-L2-CH2-CH3，其中L1和L2独立地是接头并且scFv是scFv分子。

36.根据权利要求34所述的结合分子，其中一个或多个重链包含式VH-CH1-CH2-L1-scFV-L2-CH3，其中L1和L2独立地是接头并且scFv是scFv分子。

37.根据权利要求34所述的结合分子，其中一个或多个重链包含式VH-CH1-CH2-CH3-L1-scFV-L2-CH3，其中L1和L2独立地是接头并且scFv是scFv分子。

38.根据权利要求35、36或37所述的结合分子，其中L1和L2独立地包含(a)[GGGGS]n，其中n是0、1、2、3、4或5；(b)[GGGG]n，其中n是0、1、2、3、4或5；或(a)和(b)的组合。

39.根据权利要求21-38所述的结合分子，其中该scFv包含式：VH-LS-VL，并且其中VH是重链可变结构域、LS是接头、并且VL是轻链可变结构域。

40.根据权利要求39所述的结合分子，其中LS包含(a)[GGGGS]n，其中n是0、1、2、3、4或5；(b)[GGGG]n，其中n是0、1、2、3、4或5；或(a)和(b)的组合。

41.根据权利要求28所述的结合分子，其中该第二结合结构域的重链和轻链通过一个或多个二硫键连接。

42.根据权利要求41所述的结合分子，其中该第二结合结构域的scFv包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，并且该scFv的VH在选自以下位置的位置处包括半胱氨酸残基：位置43、44、100、101、105、及其组合，并且该scFv的VL在选自以下位置的位置处包括半胱氨酸残基：位置43、44、46、49、50、100、及其组合。

43.根据权利要求42所述的结合分子，其中该scFv的VL和VH通过选自以下各项的二硫键连接：VL100-VH44、VL43-VH105、VL46-VH101、VL49-VH100、VL50-VH100、及其组合。

44.根据权利要求42所述的结合分子，其中该scFv的VH和VL通过选自以下各项的二硫键连接：VH44-VL100、VH100-VL49、VH100-VL50、VH101-VL46、VH105-VL43、及其组合。

45.根据权利要求39所述的结合分子，其中VH包含一组三个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3，其中该组三个CDR选自：

(a)与以下各项具有至少75％一致性的氨基酸序列：SEQ ID NO.:28的HCDR1、SEQID NO.:29的HCDR2、SEQ ID NO.:30的HCDR3；

(b)氨基酸序列：SEQ ID NO.:28的HCDR1、SEQ ID NO.:29的HCDR2、SEQ ID NO.:30的HCDR3；

(c)与以下各项具有至少75％一致性的氨基酸序列：SEQ ID NO.:44的HCDR1、SEQID NO.:45的HCDR2、SEQ ID NO.:46的HCDR3；

(d)氨基酸序列：SEQ ID NO.:44的HCDR1、SEQ ID NO.:45的HCDR2、SEQ ID NO.:46的HCDR3；

(e)与以下各项具有至少75％一致性的氨基酸序列：SEQ ID NO.:60的HCDR1、SEQID NO.:61的HCDR2、SEQ ID NO.:62的HCDR3；以及

(f)氨基酸序列：SEQ ID NO.:60的HCDR1、SEQ ID NO.:61的HCDR2、SEQ ID NO.:62的HCDR3。

46.根据权利要求39所述的结合分子，其中VL包含一组三个CDR：LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中该组三个CDR选自：

(a)与以下各项具有至少75％一致性的氨基酸序列：SEQ ID NO.:23的LCDR1、SEQID NO.:24的LCDR2和SEQ ID NO.:25的LCDR3；

(b)氨基酸序列：SEQ ID NO.:23的LCDR1、SEQ ID NO.:24的LCDR2和SEQ ID NO.:25的LCDR3；

(c)与以下各项具有至少75％一致性的氨基酸序列：SEQ ID NO.:39的LCDR1、SEQID NO.:40的LCDR2和SEQ ID NO.:41的LCDR3；

(d)氨基酸序列：SEQ ID NO.:39的LCDR1、SEQ ID NO.:40的LCDR2和SEQ ID NO.:41的LCDR3；

(e)与以下各项具有至少75％一致性的氨基酸序列：SEQ ID NO.:55的LCDR1、SEQID NO.:56的LCDR2、SEQ ID NO.:57的LCDR3；以及

(f)氨基酸序列：SEQ ID NO.:55的LCDR1、SEQ ID NO.:56的LCDR2、SEQ ID NO.:57的LCDR3。

47.根据权利要求21-46中任一项所述的结合分子，其中该scFv具有选自以下各项的氨基酸序列：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:63。

48.一种特异地结合至甲型流感病毒和乙型流感病毒的双特异性抗体，该双特异性抗体包含具有如下氨基酸序列的至少一个轻链，该氨基酸序列与SEQ ID NO:66或SEQ IDNO:68的氨基酸序列具有至少75％一致性。

49.根据权利要求48所述的双特异性抗体，该双特异性抗体包含具有如下氨基酸序列的至少一个轻链，该氨基酸序列包含SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:68。

50.一种特异地结合至甲型流感病毒和乙型流感病毒的双特异性抗体，该双特异性抗体包含具有如下氨基酸序列的至少一个重链，该氨基酸序列与SEQ ID NO:67或SEQ IDNO:69的氨基酸序列具有至少75％一致性。

51.根据权利要求50所述的双特异性抗体，该双特异性抗体包含具有如下氨基酸序列的至少一个重链，该氨基酸序列包含SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:69。

52.一种特异地结合至甲型流感病毒和乙型流感病毒的双特异性抗体，该双特异性抗体包含具有如下氨基酸序列的至少一个轻链，该氨基酸序列与SEQ ID NO:66或SEQ IDNO:68的氨基酸序列具有至少75％一致性，以及具有如下氨基酸序列的至少一个重链，该氨基酸序列与SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有至少75％一致性。

53.根据权利要求52所述的双特异性抗体，该双特异性抗体包含：

(a)具有包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的至少一个轻链和具有包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的至少一个重链；或者

(b)具有包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的至少一个轻链和具有包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的至少一个重链。

54.一种细胞，该细胞包含或产生根据权利要求1-47中任一项所述的结合分子、如权利要求48-53所述的双特异性抗体或其片段、或其任何组合。

55.一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码根据权利要求1-47中任一项所述的结合分子、或如权利要求48-53所述的双特异性抗体或其片段的核酸。

56.一种载体，该载体包括如权利要求55所述的多核苷酸。

57.一种宿主细胞，该宿主细胞包括如权利要求55所述的多核苷酸或如权利要求56所述的载体。

58.一种组合物，该组合物包含根据权利要求1-47中任一项所述的结合分子、如权利要求48-53所述的双特异性抗体或其片段、以及药学上可接受的载体。

59.一种试剂盒，该试剂盒包含如权利要求58所述的组合物。

60.一种在对其有需要的受试者中预防或治疗甲型流感病毒或乙型流感病毒感染的方法，该方法包含向受试者给予有效量的如权利要求58所述的组合物。

61.一种制造根据权利要求1-47中任一项所述的结合分子、或如权利要求48-53所述的双特异性抗体或其片段的方法，该方法包含在适合于该结合分子或双特异性抗体或其片段表达的条件下培养根据权利要求57所述的宿主细胞。

62.根据权利要求61所述的方法，该方法进一步包括从该宿主细胞培养物中分离该结合分子。

63.根据权利要求1-47中任一项所述的结合分子、或如权利要求48-53所述的双特异性抗体或其片段，用于在受试者中预防或治疗甲型流感感染、乙型流感感染、或其组合。

64.根据权利要求1-47中任一项所述的结合分子、或如权利要求48-53所述的双特异性抗体或其片段在制造用于在受试者中预防或治疗甲型流感感染、乙型流感感染或其组合的药物中的用途。

65.根据权利要求1-47中任一项所述的结合分子、或如权利要求48-53所述的双特异性抗体或其片段在制造用于在受试者中预防或治疗甲型流感感染和乙型流感感染的药物中的用途。

66.一种用于在受试者中预防或治疗甲型流感感染、乙型流感感染、或其组合的方法，该方法包括向该受试者给予有效量的根据权利要求1-47中任一项所述的结合分子、或如权利要求48-53所述的双特异性抗体或其片段。

67.一种用于在受试者中预防或治疗甲型流感感染和乙型流感感染的方法，该方法包括向该受试者给予有效量的根据权利要求1-47中任一项所述的结合分子、或如权利要求48-53所述的双特异性抗体或其片段。

68.根据权利要求1-47中任一项所述的结合分子、或如权利要求48-53所述的双特异性抗体或其片段用于在受试者中在体外诊断甲型流感感染、乙型流感感染或其组合的用途。

实例

实例1.双特异性抗体构建体的制备

特异地结合甲型流感病毒的抗-HA IgG抗体描述在2013年10月2日提交的美国临时申请号61/885,808、和2014年5月23日提交的美国临时申请号62/002,414中，并且特异地结合乙型流感病毒的抗HA IgG抗体描述在2014年7月15日提交的美国临时申请号62/024,804中。简言之，这些抗体是识别甲型流感病毒(FY1和GL20)和乙型流感病毒(FBD94、FBC39、和FBC39FTL)的广泛交叉反应性抗体。使用这些抗体的IgG VH和VL基因序列构建了一系列双特异性(BiS)抗体。所得的双特异性抗体结合了不同的抗甲型流感或抗乙型流感HA mAb的互补活性，以产生能够中和所有甲型流感和乙型流感病毒株的单抗样分子。

图1显示了五种不同BiS主链的取向的示意图。在例如产生的Bis-Flu A+B抗体中，将抗-Flu A抗体(FY1或其优化的形式GL20)用作IgG，将抗-Flu B抗体(FBD94、FBC39或其优化的形式FBC39FTL)用作scFv，其中该scFv以不同的Bis形式沿着IgG结构插入不同的位置。使用衍生出Bis抗体的两个IgG的缩写，接着使用的BiS形式，并然后接着用于在scFv中形成稳定的二硫键的两个半胱氨酸残基的氨基酸位置来命名BiS构建体。

A.FY1/39BiS2 100/44

使用以下方法来产生FY1/39 BiS2 100/44构建体，该构建体包括FY1/39 Bis2100/44轻链(SEQ ID NO:107)和FY1/39 Bis2 100/44重链(SEQ ID NO:108)。简言之，将含有FY1VH和VL序列(pOE-FY1载体)的载体用BssHII/BsiWI消化以获得FY1VL DNA(SEQ IDNO:1)。然后将FY1VL DNA(SEQ ID NO:1)凝胶纯化并克隆到含有轻链、scFv和重链序列(BiS2载体)的载体(该载体已经用BssHII/BsiWI消化)中以形成FY1LC-BiS2载体。

通过GeneArt合成FBC39scFv-FY1VH DNA(SEQ ID NO:111)，并使用以下在5’和3’末端含有BsrGI/Sall的识别序列的引物进行PCR扩增。

正向引物：TTCTCTCCACAGGTGTACACTCCGACATCCAGATGACCCAGTCTC(SEQ ID NO:70)

反向引物：GGATGGGCCCTTGGTCGACGCGCTTGACACGGTGACCATAGTC(SEQ ID NO:71)

验证FBC39scFv-FY1VH DNA(SEQ ID NO:111)的扩增，并将DNA进行凝胶纯化。

然后将FY1-LC-BiS2载体用BsrGI/SalI消化，并将载体条带进行凝胶纯化。将纯化的FY1-LC-BiS2载体用FBC39scFv-FY1VH(SEQ ID NO:111)PCR产物通过使用In-Fusion系统进行融合以产生FY1/39BiS2 100/44构建体。用FY1/39 BiS2 100/44构建体转化Stellar感受态细胞，并且对菌落进行测序检测正确的FY1VL、VH和FBC39scFv序列。

B.FY1/39 BiS4 100/44

使用类似的方法来产生FY1/39 BiS4 100/44构建体，该构建体包括FY1/39 Bis4100/44轻链(SEQ ID NO:109)和FY1/39 Bis4 100/44重链(SEQ ID NO:110)。简言之，将pOE-FY1-VL载体用BssHII/BsiWI消化以获得FY1VL DNA(SEQ ID NO:1)。然后将FY1VL DNA(SEQ ID NO:1)进行凝胶纯化并克隆到含有轻链、VH、CH1、scFv、CH2和CH3序列的载体(BiS4载体)(该载体已经用BssHII/BsiWI消化)以产生FY1-LC BiS4载体。

使用以下引物，从通过Geneart合成的FBC39scFv-FY1VH DNA(SEQ ID NO:111)扩增FBC39scFv DNA(SEQ ID NO:112)：

正向引物：

CTCTGGCGGAGGGGGATCCGACATCCAGATGACCCAGTCTC(SEQ ID NO:72)

反向引物：

GTGAGTTTTGTCGGATCCCCCTCCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGG(SEQ IDNO:73)

然后将FY1-LC-BiS4载体用BsrGI/SalI消化，并将载体条带进行凝胶纯化。将含有FY1VL和VH序列(pOE-FY1)的载体用BsrGI/SalI消化以获得FY1VH(SEQ ID NO:6)。

然后将FY1-LC-Bis4载体(用BsrGI/SalI消化，在第5和6行中描述的)与FY1 VH(SEQ ID NO:6)连接以获得载体BiS4-FY1，将其用BamHI消化并进行凝胶纯化。然后将纯化的BiS4-FY1载体与以上使用In-Fusion系统获得的FBC39 scFv PCR产物融合以获得FY1/39BiS4 100/44构建体。用FY1/39BiS4 100/44构建体转化Stellar感受态细胞，并且对菌落进行测序检测正确的FY1VL、VH和FBC39scFv序列。

C.FY1/39 BiS1 100/44

使用类似的方法来产生FY1/39 BiS1 100/44构建体，该构建体包括FY1/39 Bis1100/44轻链(SEQ ID NO:113)和FY1/39 Bis1 100/44重链(SEQ ID NO:114)。

使用以下引物从上文描述的FY1/FBC39 BiS4 100/44(SEQ ID NO:109)扩增FY1VL：

BiS1FY1-VL正向引物:

AGGGGGATCCGGCGGAGGGGGCTCTGATATTCAGATGACCCAGAGCCC

(SEQ ID NO:76)

BiS1FY1-VL反向引物：

TGGTGCAGCCACCGTACGTTTGATCTCCACCTTAGTGCCC(SEQ ID NO:77)

使用以下引物，从通过GeneArt合成和FBC39scFv-FY1VH DNA(SEQ ID NO:111)扩增FBC39scFv：

BiS1FBC39正向引物：

CTGGCTCCCCGGGGCGCGCTGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCC

(SEQ ID NO:74)

BiS1FBC39反向引物：

CCCCTCCGCCGGATCCCCCTCCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTC

(SEQ ID NO:75)

将FBC39scFv和FY1-VL PCR条带进行凝胶纯化。

将FY1/FBC39BiS4 100/44用BsrGI/SalI消化以获得FY1VH，将FY1VH条带进行凝胶纯化。将FY1VH(SEQ ID NO:6)与含有scFv、LC和HC序列的载体(BiS1载体)连接，该载体已经用BsrGI/SalI消化。

然后将所得的载体FY1HC BiS1用BssHII/BsiWI消化，将载体条带进行凝胶纯化，并且使用In-Fusion系统与FBC39scFv和FY1VL PCR产物融合以形成FY1/39BiS1 100/44构建体。用FY1/39 BiS1 100/44构建体转化Stellar感受态细胞，并且对菌落进行测序检测正确的FY1VL、VH和FBC39scFv序列。

D.FY1/39 BiS3 100/44

将含有FY1/39Bis3 100/44轻链(SEQ ID NO:115)和FY1/39Bis3 100/44重链(SEQID NO:116)的FY1/39BiS3 100/44构建体以类似的方式构建。

使用以下引物从通过GeneArt合成的FBC39scFv-FY1VH DNA(SEQ ID NO:111)扩增FBC39scFv(SEQ ID NO:112)。

正向引物：

AAAGGCGGAGGGGGATCCGGCGGAGGGGGCTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTC(SEQ ID NO:78)

反向引物：

TCAATGAATTCGCGGCCGCTCATGAGGAGACGGTGACCGTGGTC(SEQ ID NO:79)

验证FBC scFv DNA的扩增并进行凝胶纯化。

将FY1/FBC39 BiS4 100/44用BssHII/SalI消化以获得FY1LC/VH。将FY1LC/VH条带进行凝胶纯化并且与含有LC、HC和scFv序列的载体(BiS3载体)(该载体已经用BssHII/SalI消化)结合以形成FY1BiS3载体。

然后将FY1BiS3载体用BamHI消化并进行凝胶纯化。使用In-Fusion系统，然后将纯化的FY1BiS3载体与FBC39scFv(SEQ ID NO:112)PCR产物融合以形成FY1/39BiS3 100/44构建体。用FY1/39BiS3 100/44构建体转化Stellar感受态细胞，并且对菌落进行测序检测正确的FY1VL、VH和FBC39scFv序列。

E.FY1/94BiS2 100/44

将含有FY1/94Bis2 100/44轻链(SEQ ID NO:117)和FY1/94Bis2 100/44重链(SEQID NO:118)的FY1/94BiS2 100/44如下进行构建。

通过Eurofin合成FBD94scFv DNA(SEQ ID NO:119)，并且使用以下引物将其扩增以插入BiS2载体中：

正向引物：

TTCTCTCCACAGGTGTACACTCCGAAATTGTGTTGACACAGTCTC(SEQ ID NO:80)

反向引物：

CCCCTCCGCCGGATCCCCCTCCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTC

(SEQ ID NO:81)

使用以下引物，将FY1VH(SEQ ID NO:6)从FY1/39BiS4 100/44(SEQ ID NO:110)进行PCR扩增：

正向引物：

AGGGGGATCCGGCGGAGGGGGCTCTCAGGTCCAGCTGCAGGAGAGC

(SEQ ID NO:82)

反向引物：

GGATGGGCCCTTGGTCGACGCGCTTGACACGGTGACCATAGTC(SEQ ID NO:83)

验证PCR产物、FBD94scFv DNA(SEQ ID NO:119)和FY1VH(SEQ ID NO:6)的扩增，并将PCR产物进行凝胶纯化。将BiS2-FY1-LC载体通过用BsrGI/SalI消化而线性化，并使用In-Fusion系统将其与FBD94scFv DNA(SEQ ID NO:119)和FY1VH(SEQ ID NO:6)融合。使用含有重叠序列的引物和载体控制载体内PCR产物的取向。用FY1/94BiS2 100/44构建体转化Stellar感受态细胞，并且对菌落进行测序检测正确的FY1VL、VH和FBD94scFv序列。

F.FY1/94BiS4 100/44

如下构建FY1/94BiS4 100/44：

通过Eurofin合成FBD94scFv(SEQ ID NO:119)，并且使用以下引物将其进行扩增用于插入含有轻链、VH、CH1、scFv、CH2和CH3序列的载体(BiS4载体)中：

正向引物：

CTCTGGCGGAGGGGGATCCGAAATTGTGTTGACACAGTCTC

(SEQ ID NO:84)

反向引物：

GTGAGTTTTGTCGGATCCCCCTCCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGG(SEQ IDNO:85)

验证PCR产物的扩增，并将FBD94进行凝胶纯化。

使用BamHI将BiS4-FY1载体(上文描述的)线性化，并使用In-Fusion系统将其与FBD94融合。用FY1/94BiS4 100/44构建体转化Stellar感受态细胞，并且对菌落进行测序检测正确的FY1VL、VH和FBD94scFv序列。

G.FY1/39BiS4 43/105

将含有FY1/39Bis4 43/105轻链(SEQ ID NO:120)和FY1/39Bis4 43/105重链(SEQID NO:121)的FY1/39BiS4 43/105如下进行构建：

通过Eurofin合成FBC39-43/105scFv DNA，并且使用以下引物将其扩增用于插入BiS4载体中：

正向引物：

CTCTGGCGGAGGGGGATCCGACATCCAGATGACCCAGTCTC(SEQ ID NO:86)

反向引物：

GTGAGTTTTGTCGGATCCCCCTCCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGG(SEQ IDNO:87)

验证PCR产物的扩增并进行凝胶纯化。

用BamHI将BiS4-FY1载体线性化并使用In-Fusion系统将其与上文获得的FBC39-43/105scFv DNA(SEQ ID NO:124)融合。用FY1/39BiS4 43/105构建体转化Stellar感受态细胞，并且对菌落进行测序检测正确的FY1VL、VH和FBC39-43/105scFv序列。

H.GL20/39BiS4 100/44

将包括GL20/39BiS4 100/44重链(SEQ ID NO:66)和GL20/39BiS4 100/44轻链(SEQ ID NO:67)的GL20/39BiS4 100/44以类似的方式构建。

将含有FY-GL20LC和HC(pOE-FY1-GL20)的载体用BssHII/SalI消化以获得GL20LC(VL-CL)和VH(SEQ ID NO:123)，将其进行凝胶纯化。将FY1/39BiS4 100/44载体用BssHII/SalI消化，并且与GL20LC/VH(SEQ ID NO:123)连接。对菌落进行测序检测正确的GL20VL、VH和FBC39scFv序列。

I.GL20/39BiS4 43/105

将包括GL20/39BiS4 43/105重链(SEQ ID NO:68)和GL20/39BiS4 43/105轻链(SEQ ID NO:69)的GL20/39BiS4 43/105用类似的方式构建。将pOE-FY1-GL20用BssHII/SalI消化以获得GL20LC/VH(SEQ ID NO:123)，将其进行凝胶纯化。将FY1/39 BiS4 43/105轻链(SEQ ID NO:120))用BssHII/SalI消化并与GL20LC/VH(SEQ ID NO:123)连接。对菌落进行测序检测正确的GL20VL、VH和FBC39-43/105scFv序列。

J.GL20/39FTL BiS4 100/44

将GL20/39FTL BiS4 100/44以类似的方式构建。

通过Eurofin合成FBC39FTL scFv DNA(SEQ ID NO:124)，并且使用以下引物将其扩增用于插入BiS4载体中：

正向引物：

CTCTGGCGGAGGGGGATCCGACATCCAGATGACCCAGTCTC(SEQ ID NO:88)

反向引物：

GTGAGTTTTGTCGGATCCCCCTCCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGG(SEQ IDNO:89)

验证PCR产物的扩增，并纯化FBC39FTL scFv DNA(SEQ ID NO:124)。用BamHI将GL20/39BiS443/105载体线性化，并且使用In-Fusion系统与FBC39FTL scFvDNA(SEQ ID NO:124)融合。对菌落进行测序检测正确的GL20VL、VH和FBC39FTL scFv序列。

K.GL20/39FTL BiS443/105

将包括GL20/39FTL BiS443/105轻链(SEQ ID NO:125)和GL20/39FTL BiS4 43/105重链(SEQ ID NO:126)的GL20/39FTL BiS443/105以类似的方式构建。

通过Eurofin合成FBC39FTL43/105scFv DNA(SEQ ID NO:127)，并且使用以下引物将其扩增用于插入BiS4载体中：

正向引物：

CTCTGGCGGAGGGGGATCCGACATCCAGATGACCCAGTCTC(SEQ ID NO:90)

反向引物：

GTGAGTTTTGTCGGATCCCCCTCCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGG(SEQ IDNO:91)

将扩增的PCR产物纯化并与线性化的GL20/39BiS443/105载体(用BamHI消化的)融合，对菌落进行测序检测正确的GL20VL、VH和FBC39FTL-43/105 scFv序列。

L.BiS5GL20-FBC39

FY1GL20VL-Cκ

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYTHWYQQKPGKAPKLLIYAASSRGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:128)

FY1GL20VH–Fc(CH3-)–接头–FBC39scFv–接头–Fc(-CH3)

_QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSYNAVWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRS GWYNDYAESVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSGHITVFGVNVDAFDMWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGCGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNAWMSWVRQAPGKCLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSLRTEDTAVYYCATDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:129)

M.BiS5GL20-FBC39-43-105

FY1GL20VL-Cκ

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYTHWYQQKPGKAPKLLIYAASSRGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:130)

FY1GL20VH-Fc(CH3-)-接头-FBC39(43-105)scFv-接头-Fc(-CH3)

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSYNAVWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSGWYNDYAESVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSGHITVFGVNVDAFDMWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKCPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSLRTEDTAVYYCATDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGCGTTVTVSSGGGGSGGGGSGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:131)

实例2：BiS构建体表达

通过瞬时转染衍生自293F或CHO细胞的哺乳动物细胞系产生重组抗体。在7-10天的培养之后，收集转染的细胞中的上清液。使用蛋白A柱(HiTrap蛋白质A HP，来自GE医疗公司(GE Healthcare))进行纯化。通过HPLC-SEC分析确定单体含量，并且通过尺寸排阻色谱法除去聚集体。

实例3：BiS4构建体优化

将FY1/39BiS4构建体用作主链来优化scFv以产生仍然活跃的高单体表达构建体。对于这些研究，scFv的取向从VL/VH改变为VH/VL，scFv接头长度从20个氨基酸改变为10个、15个或25个氨基酸，将稳定的二硫键除去或位置从100/44改变为四个不同位置，并且FBC39的框架区完全被种系化。表7提供构建体的具体信息。

表7.

这些优化的BiS4构建体的表达和活性不受到接头长度的大的影响。然而，二硫键的位置对于表达和活性都是重要的。在不含二硫键、二硫键位置改变为43/105、46/101或49/100的构建体、或具有二硫键100/44的种系化的FBC39构建体中观察到最佳表达特征。然而，虽然表达得到改善，但如下面实例4和5所述，这些克隆中许多失去了通过HA结合和中和测量的抗病毒活性。一个构建体(FY1/39 BiS4 43/105)显示出比FY1/39 BiS4 100/44更好的表达谱，并保持功能性抗病毒活性。由于这两种构建体(FY1/FBC39 BiS4 100/44和BiS43/105)显示出良好的表达以及良好的功能活性，所以分别构建了具有BiS4 100/44和BiS43/105取向的优化的BiS克隆(GL20/FBC39Bis)。

实例4.Flu A+B BiS构建体与甲型流感和乙型流感病毒的HA蛋白质结合

测试Flu A+B BiS构建体以便使用HA交叉反应性ELISA结合测定法确定它们是否保留了亲本IgG构建体的特异性。将384-孔Maxisorb ELISA板(Nunc公司)在4℃下用1ug/ml的PBS中的重组HA包被过夜，这些重组HA衍生自甲型流感株、A/加利福尼亚/07/2009H1N1(A/CA/09)和A/珀斯/2009H3N2(A/PTH/09)、以及乙型流感株山形世系的B/佛罗里达/4/2006(B/FLA/06)和维多利亚世系的B/布里斯班/60/2008(B/BNE/08)。将板用含有0.1％v/v吐温-20的PBS洗涤以便去除未包被的蛋白质，并且在室温下添加含有1％(w/v)酪蛋白的封闭溶液(赛默科技公司(Thermo Scientific))持续1小时。弃去封闭溶液，并且添加3倍连续稀释的在PBS中的抗-HA IgG和BiS抗体中的每一种，并在室温下孵育1小时。将板洗涤三次并且使用过氧化物酶轭合的山羊抗人IgG(H+L)抗体(KPL)检测结合的IgG和BiS抗体。通过用四甲基联苯胺(TMB)单组分底物(KPL)孵育、接着添加2N硫酸来终止反应之后测量在450nm下的颜色变化来计算结合活性。

表8显示了从结合曲线计算的EC₅₀值。如预期的，Flu A IgG mAb(FY1和GL20)结合至两种甲型流感HA蛋白质，并且三种Flu B IgG mAb(FBD94、FBC39和FBC39FTL)结合至乙型流感HA蛋白质。所有BiS构建体与属于甲型和乙型的所有四种流感HA蛋白结合。FBC39和FBD94的BiS4构建体显示出最好的总体结合。当将优化的IgG放置于在100/44或43/105具有二硫键的BiS4构建体中时，GL20/39 BiS4 43/105显示对于A/CA/09、A/PTH/09、和B/FL/06的最好的总体结合(EC50值为<1nM)，以及对于更难以结合的B/BNE/08(EC50值为小于10nM)。

表8.

-＝无结合

为了进一步表征结合作用的动力学，使用384孔倾斜孔板使用ForteBio Octet QK384动力学分析仪(门洛帕克(Menlo Park)，加利福尼亚)进行亲和力测量。将所有试剂在Octet动力学缓冲液(ForteBio公司)中稀释。在抗-His Ni-NTA传感器上以8μg/mL固定不同流感病毒的His-标记的HA：甲型流感亚型H1(A/加利福尼亚/7/04(H1N1))、甲型流感亚型H3(A/珀斯/16/09(H3N2))、乙型流感世系维多利亚(B/布里斯班/60/2008(维多利亚))、和乙型流感世系山形(B/佛罗里达/4/2006(山形))。然后在来自100nM的2倍稀释液与零mAb对照中监测抗HA mAb结合/解离。将结合和解离原始数据针对在零mAb对照中的任何漂移进行校正，并且然后输出至图板棱柱(GraphPad Prism)(圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚州)用于进行亲和力曲线拟合。使用全局结合/解离方程式来对数据进行拟合，其中所施加的限制为>5×10^-6sec^-1。如表9所示，两种BiS构建体显示出与属于甲型流感和乙型流感株的所有四种HA蛋白质具有高亲和力结合。

表9.

实例5.Flu A+B BiS构建体的体外中和活性

改进的微量中和测定是基于先前描述的加速的病毒抑制测定，使用神经氨酸酶活性(NA)作为读出(Hassantoufighi,A.等人，2010，Vaccine[疫苗]28:790)。简言之，对MDCK细胞进行测定，将该MDCK细胞培养在补充有抗生素、谷氨酰胺(完全MEM培养基)以及10％(v/v)胎牛血清的MEM培养基(英杰公司(Invitrogen))中。在384孔板的一式两份孔中，将60TCID₅₀(50％组织培养物感染剂量)的病毒添加至含有0.75ug/ml TPCK胰蛋白酶的MEM培养基(沃辛顿公司(Worthington))中的三倍抗体稀释液。在室温下孵育30分钟之后，将2×10⁴个细胞/孔添加至该板。在33oC下在5％CO₂孵育器中孵育大约40小时之后，通过将荧光标记的底物甲基伞形酮基-N-乙酰基神经氨酸(MU-NANA)(西格玛公司(Sigma))添加至每个孔并且在37oC下孵育1小时来测量NA活性。通过使用Envision荧光计(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))读取荧光来定量由NA活性表示的病毒复制，该荧光计使用以下设置，：激发355nm，发射460nm；每孔10次发光。中和滴度(50％抑制浓度[IC₅₀])被表示为与细胞对照孔相比使荧光信号降低50％的最终抗体浓度。

在表10和表11中使用的甲型流感和乙型流感病毒株如下所列：

在表10中：A/WSN/33(A/Wilson Smith N/33(H1N1))；A/BJ/95(A/北京/262/95(H1N1))；A/SI/06(A/所罗门群岛/3/2006(H1N1))；A/CA/09(A/加利福尼亚/07/2009(H1N1))；A/HK/68(A/香港/8/68(H3N2))；A/VIC/75(A/维多利亚/3/75(H3N2))；A/SD/93(A/山东(Shangdong)/9/93(H3N3))；A/Pan/99(冷适应的(ca)A/巴拿马//2007/99(H3N2))；B/BJ/97(ca B/北京/243/97(维多利亚))；B/HK/01(B/香港/330/2001(维多利亚))；B/MY/04(B/马来西亚/2506/2004(维多利亚))；B/OH/05(B/俄亥俄(Ohio)/1/2005(维多利亚))；B/YI/98(B/山梨(Yamanashi)/166/98(山形))；B/SIC/99(B/四川(Sichuan)/379/99(山形))；以及B/FLA/06(B/佛罗里达/4/2006(山形))。

在表11中：A/WSN/33H1(A/Wilson Smith N/33(H1N1))；A/PR/34H1(A/波多黎各/8/34(H1N1))；A/FM/47H1(A/蒙默斯堡(Fort Monmouth)/1/47(H1N1))；A/BJ/95H1(ca A/北京/262/95(H1N1))；A/SZ/95H1(A/深圳(Shenzhen)/227/95(H1N1))；A/NC/99H1(ca A/新喀里多尼亚(New Caledonia)/20/99(H1N1))；A/SI/06 H1(A/所罗门群岛/3/2006(H1N1))；A/SD/07H1(ca A/南达科塔/6/2007(H1N1))；A/CA/09H1(ca A/加利福尼亚/7/2009(H1N1))；A/BS/10H1(A/布里斯班/10/2010(H1N1))；A/HK/10H1(A/香港/2212/2010(H1N1))；A/NH/10H1(A/新罕布什尔(New Hampshire)/04/2010(H1N1))；A/WS/12H1(A/华盛顿/24/2012(H1N1))；A/NY/12H1(A/纽约/36/2012(H1N1))；A/BO/13H1(A/玻利维亚(Bolivia)/559/2013(H1N1))；A/Jap/57H2(ca A/日本/57(H2N2))；A/VN/04H5(ca A/越南/1203/04(H5N1))；A/Alb/85H6(ca A/野鸭/亚伯达(Alberta)/89/85(H6N2))；A/HK/97H9(ca A/鸡/香港/G9/97(H9N2))；A/HK/68H3(A/香港/8/68(H3N2))；A/Vic/75H3(A/维多利亚/3/75(H3N2))；A/SD/93H3(A/山东/9/93(H3N2))；A/WH/95H3(ca A/武汉(Wuhan)/359/95(H3N2))；A/SY/97H3(ca A/悉尼/5/97(H3N2))；APA/99 H3(ca A/巴拿马/2007/99(H3N2))；A/CA/04H3(A/加利福尼亚/7/2004(H3N2))；A/WS/05H3(A/威斯康星(Wisconsin)/67/2005(H3N2))；A/珀斯/09H3(ca A/珀斯/16/2009(H3N2))、A/VC/11H3(A/维多利亚/361/2011(H3N2))；A/BR/11H3(A/柏林/93/2011(H3N2))；A/NY/12H3A/纽约/39/2012(H3N2))；A/X/12H3(A/德克萨斯/50/2012(H3N2))；A/AS/13H3(A/美属萨摩亚(AmericanSomoa)/4786/2013(H3N2))；A/SW/13H3(A/瑞士/9715293/2013(H3N2))；A/PU/14H3(A/帕劳群岛(Palau)/6759/2014(H3N2))；A/NC/14H3(A/新喀里多尼亚/71/2014(H3N2))；A/IN/11H3v(A/印第安纳/10/2011(H3N2v))；A/MN/10H3v(A/明尼苏达(Minnesota)/11/2010(H3N2v))；A/BC/04H7(ca A/不列颠哥伦比亚/CN-6/04(H7N3-LP)；B/Lee/40(B/Lee/40)；B/AA/66(ca B/安阿伯市(Ann Arbor)/1/66)；B/HK/72(B/香港/5/72)；B/BJ/97(ca B/北京/243/97(维多利亚))、B/HK/01(B/香港/330/2001(维多利亚))；B/MY/04(B/马来西亚/2506/2004(维多利亚))；B/OH/05(B/俄亥俄/1/2005(维多利亚))；B/BNE/08(ca B/布里斯班/60/2008(维多利亚))；B/NV/11(B/内华达(Nevada)/3/2011(维多利亚))；B/NJ/12(B/新泽西(New Jersey)/01/2012(维多利亚))；B/TX/13(B/德克萨斯/2/2013(维多利亚))；B/Wis/13(B/威斯康星/5/2013(维多利亚))；B/Yam/88(B/山形/16/88(山形))；B/AA/94(ca B/安阿伯市/2/94(山形))；B/geo/98(ca B/芝加哥/02/98(山形))；B/YSI/98(ca B/山梨/166/98(山形))；B/Joh/99(caB/约翰尼斯堡(Johannesburg)/5/99(山形))；B/Sic/99(B/四川/379/99(山形))；B/Vic/00(ca B/维多利亚/504/2000(山形))；B/Shg/02(B/上海/361/02(山形))；以及B/FL/06(B/佛罗里达/4/2006(山形))；B/WS/10(B/威斯康星/1/2010(山形))；B/Mass/12(B/马萨诸塞(Massachusetts)/2/2012(山形))；B/AZ/13(B/亚利桑那(Arizona)/8/2013(山形))；B/PH/13(B/普吉岛(Phuket)/3073/2013(山形))。

表10.

表10显示来自两个独立实验的平均IC₅₀。亲本IgG FY1和GL20中和了所有甲型流感株，并且与所测试的乙型流感株没有交叉反应性。如预期的那样，FBD94、FBC39和FBC39LTLIgG中和对所测试的甲型流感株没有活性的所有乙型流感株。然而，类似于结合实验，BiS4构建体显示出对所测试的所有甲型流感和乙型流感株具有中和活性的最佳总体中和特征。用优化的抗体克隆、GL20/39BiS4 100/44和GL20/39BiS4 43/105产生的BiS4构建体显示出对在亲本BiS4上测试的所有株的改进的总体中和。对于所测试的所有15种甲型流感病毒和乙型流感病毒，GL20/39 BiS4 43/105都产生<50nM的IC₅₀值。

为了确认对于优化的BiS4构建体维持了宽泛的覆盖，测试了39种甲型流感和25种乙型流感病毒的较大的板的中和作用。表11显示来自两个独立实验的平均IC₅₀。GL20/39BiS4 100/44和GL20/39BiS4 43/105展示了对所测试的所有病毒的中和活性。对于GL20IgG、GL20/39BiS4 100/44和GL20/39BiS4 43/105，甲型流感病毒的平均值IC₅₀(nM)分别是8.2、8.0和7.5，表明BiS构建体维持了亲本IgG的总体中和活性。对于FBC39IgG、GL20/39BiS4 100/44、和GL20/39BiS4 43/105，乙型流感病毒的平均值IC₅₀(nM)分别是4、13.9和9.0。与亲本IgG mAb相比，BiS构建体展现出针对乙型病毒的活性降低>10倍，然而，总体中和活性维持在与对甲型流感病毒相似的水平。尽管两种BiS构建体(GL20/39BiS4 100/44和GL20/39BiS4 43/105)显示出相似的特征，但是GL20/39BiS4 43/105展现出对于所有病毒更好的总体中和特征(IC₅₀值<50nM)。如先前描述的，像甲型流感mAb GL20，FBC39mAb除了乙型流感株外还能够中和甲型流感A/HK/97H9株。当构建成BiS4形式时，BiS4抗体显示出与任一种亲本mAb相比时对A/HK/97H9增强的中和活性，对于GL20/39 BiS4 100/44和GL/20/39BiS4 43/105分别具有1.6和1.1的IC₅₀值(nM)，以及对于GL20和FBC39分别具有3.0和13.3的IC₅₀值(nM)。

表11.

实例6.红血球凝集抑制活性

将BiS构建体的乙型流感mAb部分结合至HA蛋白质的球形头部，并抑制病毒进入宿主细胞。为了确定这种相同的作用机制对BiS构建体的乙型流感功能性是否重要，我们使用不同组的乙型流感病毒株进行红血球凝集抑制(HAI)测定。通过测量病毒介导的红血球凝集的抑制，HAI测定检测阻断细胞表面表达的唾液酸的病毒受体结合的抗体。将乙型流感病毒(如实例5中描述的缩写)调节至在不存在抗体的情况下通过与0.05％土耳其红血细胞(Lampire生物实验室)一起孵育来确定的4个HA单位。在96孔U型底板中，将GL20/39BiS4100/44、GL20/39BiS4 43/105、和FBC39IgG以两倍增量连续稀释，并且将稀释的病毒添加至这些孔中。在孵育30至60分钟后，添加50ul的0.05％土耳其红血细胞。将板孵育另外的30至60min，并观察凝集。HAI滴度被确定为完全抑制凝集的抗体最小有效浓度(nM)。表12显示两种GL20/39BiS4构建体针对所测试的所有乙型流感株具有HAI活性，提供了BiS构建体结合至乙型流感HA的球形头部的证据。HAI活性的总体效力在两种构建体之间变化，GL20/39BiS4 43/105导致比GL20/39BiS4 100/44更有效的抑制作用，具有与FBC39亲本mAb在许多所测试的病毒上相似的活性。

表12.

实例7.Flu A+B BiS构建体的体外Fc-效应子功能

流感HA单克隆抗体具有通过Fc效应子功能如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和补体依赖性杀伤(CDC)清除病毒感染的细胞的潜力。为了证实BiS构建体对其亲本IgG mAb展现出类似水平的这些效应子功能，我们在三种不同的体外测定中测试了它们以确定ADCC、ADCP和CDC活性。ADCC测定测量当被抗体激活时，原代人类NK细胞杀死流感感染细胞的能力。将A549细胞用A/加利福尼亚/07/2009H1N1在10的感染复数(MOI)、A/香港/8/68H3N2在10的MOI、B/马来西亚/2506/2004维多利亚世系在20的MOI、以及B/四川/379/99山形世系在10的MOI下感染，并在37℃下孵育15小时。在效应子:靶标比率为6:1下，将感染的细胞与稀释系列GL20、FBC39或GL20/39BiS4 43/105孵育，然后与阳性地选自人类外周血单核细胞(PBMC)(美天旎公司(Miltenyi))的纯化的NK细胞孵育。将感染的细胞、抗体和NK细胞孵育4小时，并且通过LDH释放(罗氏公司(Roche))测量细胞杀死。图2显示，GL20/39BiS4 43/105表现出与GL20相比对甲型流感感染的A549细胞大约3倍减少的剂量依赖性杀死，对于GL20和GL20/39BiS4 43/105，IC₅₀值(nM)分别为0.024和0.086(对于A/加利福尼亚/07/2009H1N1)，以及0.018和0.052(对于A/香港/8/68H3N2)(A和B)。GL20/39BiS4 43/105表现出与FBC39IgG相同的剂量依赖性反应，对于FBC39和GL20/39BiS4 43/105，计算的IC₅₀值(nM)分别为1.45和1.50(对于B/马来西亚/2506/2004维多利亚)，以及0.85和0.42(对于B/四川/379/99山形)(C和D)。

为了测量抗-HA BiS体在ADCP测定中介导吞噬作用的能力，我们使用分别衍生自A/南达科塔/6/2007H1N1和A/香港/8/68H3N2的HA蛋白质稳定转染的MDCK细胞作为靶细胞。从PBMC分离人单核细胞，并且在M-CSF存在下培养7天以便分化成巨噬细胞。将人巨噬细胞和表达HA的靶细胞分别用紫色和绿色(CellTrace紫或CSFE，英杰公司)荧光标记。将标记的效应子和靶细胞在IgG或BiS抗体的稀释系列存在下以6:1比率孵育2小时，然后通过流式细胞术进行分析。将吞噬作用百分比测量为针对绿色靶细胞也为阳性的紫色染色的巨噬细胞(双阳性)的百分比。图3显示，GL20/39BiS4 43/105具有与GL20IgG针对H1表达细胞和H3表达细胞相似的ADCP活性，如预期的，FBC39IgG没有显示表达甲型流感的细胞的吞噬作用。

为了测量抗-HA BiS抗体介导的补体依赖性细胞杀伤，我们使用流感感染的MDCK细胞作为靶标。在该CDC测定中，将MDCK细胞用A/波多黎各/8/34以2的MOI感染，与GL20IgG、GL20/39BiS4 43/105、或不相关的对照mAb的稀释系列，在衍生自自兔的补体(Cedarlane公司)的存在下以1:18的效应物:靶标比率孵育。通过LDH释放(罗氏公司)测量细胞杀死。图3C显示，GL20/39BiS 43/105表现出与GL20IgG相似水平的细胞杀死能力。

实例8.在甲型流感和乙型流感感染的致死小鼠模型中对Flu A+B BiS构建体进行 体内预防性保护

为了测试预防的功效，向六至八周龄的BALB/c(Harlan实验室(HarlanLaboratories)小鼠给予单次腹膜内注射(IP)GL20IgG(3mg/kg、0.3mg/kg或0.03mg/kg)，或相等摩尔当量的GL20/39BiS4 43/105(100μl体积)。给药后四小时，将小鼠鼻内接种在50μl体积中的2.5倍50％小鼠致死剂量(2.5MLD₅₀)的A/Wilson Smith N/33H1N1(A/WSN/33)或7MLD₅₀的7:1A/波多黎各/8/34:A/香港/8/68HA重配株(rA/HK/68)，用于在甲型流感感染模型中的研究；或者在使用乙型流感感染模型的研究中，在50μl体积中的7MLD₅₀的B/佛罗里达/4/2006山形世系(B/FLA/06)或10MLD₅₀的B/马来西亚/2506/2004维多利亚世系(B/MAL/04)。8-10只小鼠的组在病毒激发当天称重，并且每天监测体重损失和存活率持续14天(体重损失≥25％的小鼠被实施安乐死)。此外，在感染后第5天从另外4只动物收集肺进行病毒滴定。使用Teen Lysing Matrix A，在10％w/v溶液和Fastprep24匀浆器中将肺匀浆。在384孔黑色组织培养板中以一式四份在连续稀释的肺匀浆上进行TCID50定量。然后将胰蛋白酶MDCK细胞以2.0×10⁴个细胞/孔加入匀浆中，然后将板在33℃下、用5％CO₂孵育大约40小时。如上所述通过添加40μM MU-NANA测量病毒复制。使用Karber方法(Karber等人，1931Arch.Exp.Pathol.Pharmak.[实验病理学和药理学档案]162:480-3)计算感染的病毒滴度，并将阳性样品定义为高于单独的细胞的平均值的大于10个标准偏差的样品。

针对甲型流感感染的预防活性

GL20/39BiS4 43/105和亲本IgG GL20两者都以类似的剂量依赖性方式为小鼠提供了甲型流感的致死激发的保护。像GL20一样，IP注射3mg/kg当量的BiS分子保护了100％的用A/WSN/33H1病毒激发的动物，并且IP注射3mg/kg和0.3mg/kg当量的BiS分子预防了100％的用rA/HK/68H3病毒激发的动物的致死性(图4A和4C)。当在感染后第5天收获的肺中评估病毒滴度时，两种抗体分子降低了病毒肺滴度，在3mg/kg当量剂量下降低更明显。将BiS与IgG进行比较，我们看到两组中类似的病毒滴度降低，其中GL20处理的动物在H1模型中具有略低的病毒滴度，而BiS在H3模型中显示较低的病毒滴度(图4B和4D)。总体上，这些数据显示GL20/39BiS443/105可以预防致死性，并将肺病毒复制减少到与GL20IgG相似的程度。

针对乙型流感感染的预防活性

GL20/39BiS4 43/105和亲本FBC39IgG两者都以剂量依赖性方式赋予了对致死性乙型流感感染的保护。IP注射3mg/kg当量的BiS分子保护了100％的用B/FLA/06山形世系和B/MAL/04维多利亚世系病毒激发的动物(图5A和C实线)。尽管BiS和FBC39在3mg/kg剂量提供完全的保护(100％存活率)，但是在两种乙型流感感染模型中在0.3mg/kg剂量水平下FBC39比FBC39显示更好的保护。当感染后第5天评估肺中的病毒滴度时，两种抗体分子都降低病毒肺滴度，这在3mg/kg当量剂量下最明显。将BiS与IgG进行比较，我们在B/FLA/06山形感染模型中看到相似的病毒滴度降低，然而，在B/Mal/04维多利亚株感染的小鼠中在降低病毒肺滴度方面BiS比FBC39的有效性低(图5B和5D)总之，图4和图5中的这些数据显示，GL20/39 BiS4 43/105在甲型流感和乙型流感致死感染模型中都可以有效地预防致死性并减少肺病毒复制。

实例9.Flu A+B BiS构建体与奥司他韦相比在甲型流感和乙型流感感染的致死小 鼠模型中的体内治疗性保护

为了直接比较BiS分子对小分子NA抑制剂奥司他韦的治疗功效，我们使用了甲型流感和乙型流感感染的流感小鼠模型。

GL20/39BiS4 43/105和奥司他韦的治疗比较(图5)

将小鼠用2.5MLD₅₀的A/WSN/33H1病毒或7MLD₅₀的B/FLA/06山形世系病毒接种，然后用单IV剂量以10mg/kg当量(14.1mg/kg)的GL20/39BiS4 43/105或25mg/kg BID进行处理，在感染后第1天、第2天、第3天或第4天开始口服奥司他韦5天。监测每组10只动物的体重减轻和存活率，并且如上所述处死4只动物以测量肺病毒滴度。此外，作为肺功能的非侵入性读出，在感染后第6天使用脉搏血氧仪(小鼠ox)对每组4只动物测量氧饱和度水平。

当在感染后第2天给予时，用BiS分子治疗保护了100％的用A/WSN/33或B/FLA/06致死感染的小鼠(图6A和6B)。甚至当治疗延迟直到感染后第3天，BiS分子仍然预防50％的甲型流感或乙型流感病毒之一感染的动物的致死性。在甲型流感感染模型中，奥司他韦显示当在第1天或以后给予治疗时无保护作用，然而当在乙型流感感染后第1天或第2天开始给予时，其提供了良好的保护(具有90％-100％的存活率)。尽管奥司他韦在乙型流感模型中保护良好，但是当在感染后第2天、第3天或第4天给予时，BiS显示比奥司他韦更好的保护(具有更高的存活率)的趋势(图6A和6B)。

图6(C和D)显示BiS或奥司他韦治疗的小鼠中感染后5天的肺病毒滴度在用A/WSN/33H1N1病毒感染后的不同时间用BiS分子治疗以时间依赖性方式抑制肺病毒复制从大于3log的病毒减少(当治疗是在感染后第1天开始时)至1log的病毒滴度减少(当治疗是在感染后第4天开始时)(图6C)。当与奥司他韦比较时，当在感染后第2天、第3天或第4天开始治疗时，BiS分子显示出1-2log更大的减少。

为了评估不同治疗对肺功能的影响，通过脉搏血氧仪测量氧饱和度水平(图6E和6F)。仅用不相关的对照mAb治疗感染的动物显示，与初治动物的氧饱和度百分比降低98％相比，A/WSN/33的氧饱和度百分比降低至80％以及在感染后第6天降低至78％。用GL20/39BiS4 43/105治疗预防即使当治疗延迟直至感染后第四天时氧饱和度水平降低至90％以下，然而奥司他韦治疗的动物显示与用不相关的对照mAb治疗的那些相似水平的氧饱和度(图6E)。当小鼠用B/FLA/06感染，然后用BiS或奥司他韦治疗时，当在感染后第1天开始治疗时，两种试剂都保护肺功能，BiS治疗的动物具有稍高的氧饱和度水平(图6F)。在感染后第2天开始治疗时，BiS治疗的动物中，每4只治疗的动物中有3只显示出比奥司他韦治疗的动物更显著改善的肺功能(平均92％相比于86％)。总体上，这两项研究显示，当治疗在感染后直至第3天开始时，GL20/39 BiS4 43/105可以在用致死剂量的甲型流感和乙型流感感染的动物中预防致死性、减少病毒滴度、和保护肺功能。

通过引用的结合

在此引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等以及其中引用的参考文献(如同它们还未曾引用过的程度)通过引用以其全文结合在此。

序列

SEQ ID NO:1(FY1 VL核酸序列)

GACATCCAGATGACCCAGTCGCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTAACCATCACTTGCCGGACAAGTCAGAGCCTTAGTAGCTATTTACATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA

SEQ ID NO:2(FY1 VL氨基酸序列)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIK

SEQ ID NO:3 LCDR1 RTSQSLSSYLH

SEQ ID NO:4 LCDR2 AASSLQS

SEQ ID NO:5 LCDR3 QQSRT

SEQ ID NO:6(FY1 VH核酸序列)

CAGGTACAGCTGCAGGAGTCGGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAATGCTGTTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCAGAATCTGTGAAAAGTCGAATAACCGTCAATCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCACCTGAAGTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTTTTACTGTGTACGATCTGGCCACATTACGGTTTTTGGAGTGAATGTTGACGCTTTTGATATGTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAG

SEQ ID NO:7(FY1 VH氨基酸序列)

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNNAVWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAESVKSRITVNPDTSKNQFSLHLKSVTPEDTAVFYCVRSGHITVFGVNVDAFDMWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:8 HCDR1 SNNAVWN

SEQ ID NO:9 HCDR2 RTYYRSKWYNDYAESVKS

SEQ ID NO:10 HCDR3 SGHITVFGVNVDAFDM

SEQ ID NO:11(GL20 VL核酸序列)

GATATTCAGATGACCCAGAGCCCTTCCAGCCTGTCCGCTTCAGTGGGGGATCGAGTGACCATTACCTGCCGAACCAGCCAGAGCCTGAGCTCCTACACGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAAGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCTTCTAGTCGGGGGTCCGGAGTGCCAAGCCGGTTCTCCGGATCTGGGAGTGGAACCGACTTTACCCTGACAATTTCAAGCCTGCAGCCCGAGGATTTCGCTACATACTACTGTCAGCAGAGCAGAACTTTCGGGCAGGGCACTAAGGTGGAGATCAAA

SEQ ID NO:12(GL20 VL氨基酸序列)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYTHWYQQKPGKAPKLLIYAASSRGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIK

SEQ ID NO:13 LCDR1 RTSQSLSSYTH

SEQ ID NO:14 LCDR2 AASSRGS

SEQ ID NO:15 LCDR3 QQSRT

SEQ ID NO:16(GL20 VH核酸序列)

CAGGTCCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCCGGACTGGTCAAGCCTTCACAGACACTGAGCCTGACATGCGCCATTAGCGGAGATAGCGTGAGCTCCTACAATGCCGTGTGGAACTGGATCAGGCAGTCTCCAAGTCGAGGACTGGAGTGGCTGGGACGAACATACTATAGATCCGGGTGGTACAATGACTATGCTGAATCAGTGAAAAGCCGAATTACTATCAACCCCGATACCTCCAAGAATCAGTTCTCTCTGCAGCTGAACAGTGTGACCCCTGAGGACACAGCCGTGTACTACTGCGCCAGAAGCGGCCATATCACCGTCTTTGGCGTCAATGTGGATGCTTTCGATATGTGGGGGCAGGGGACTATGGTCACCGTGTCAAGC

SEQ ID NO:17(GL20 VH氨基酸序列)

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSYNAVWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSGWYNDYAESVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSGHITVFGVNVDAFDMWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:18 HCDR1 SYNAVWN

SEQ ID NO:19 HCDR2 RTYYRSGWYNDYAESVKS

SEQ ID NO:20 HCDR3 SGHITVFGVNVDAFDM

SEQ ID NO:21(FBC39 VL DNA)

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGATATTAGCACCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGATTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTTTTGTCAGCAGGCTAACAGTTTCCCTCCGACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAAC

SEQ ID NO:22(FBC39 VL蛋白质)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO:23(FBC39 LCDR-1-Kabat)：RASQDISTWLA

SEQ ID NO:24(FBC39 LCDR-2-Kabat)：AASSLQS

SEQ ID NO:25(FBC39 LCDR-3-Kabat)：QQANSFPPT

SEQ ID NO:26(FBC39 VH DNA)

GAGGTGCAGCTGGTGGTGTCTGGGGGAGGCTTGGTAAAGCCTGGGGGGTCCCTTAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACTCAGTTTCCTTAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTGGCCGTATTAAAAGTAATACTGATGGTGGGACAACAGACTACGCCGCACCCGTGAAAGGCAGATTCAGCATCTCAAGAGACGATTCAAAGAACATGCTGTTTCTGCATATGAGCAGCCTGAGAACCGAGGACACAGCCGTCTATTACTGCGCCACAGATGGACCTTACTCTGACGATTTTAGAAGTGGTTATGCCGCACGCTACCGTTATTTCGGAATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAG

SEQ ID NO:27(FBC39 VH蛋白质)

EVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSLRTEDTAVYYCATDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:28(FBC39 HCDR-1-Kabat)：NAWMS

SEQ ID NO:29(FBC39 HCDR-2-Kabat)：RIKSNTDGGTTDYAAPVKG

SEQ ID NO:30(FBC39 HCDR-3-Kabat)：DGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVSEQ ID NO:31(FBC39 scFv氨基酸序列):

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGCGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNAWMSWVRQAPGKCLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSLRTEDTAVYYCATDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:32(FBC39 VL蛋白质-scFv)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGCGTKLEIK

SEQ ID NO:33(FBC39 VH蛋白质-scFv)

EVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNAWMSWVRQAPGKCLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSLRTEDTAVYYCATDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:34(FBC39-43/105 scFv氨基酸序列):

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKCPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSLRTEDTAVYYCATDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGCGTTVTVSS

SEQ ID NO:35(FBC39 VL蛋白质–scFv 43/105)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKCPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO:36(FBC39 VH蛋白质–scFv 43/105)

EVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSLRTEDTAVYYCATDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGCGTTVTVSS

SEQ ID NO:37(FBC39 FTL VL DNA)

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGATATTAGCACCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGATTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAGCAGGCTAACAGTTTCCCTCCGACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAAC

SEQ ID NO:38(FBC39 FTL VL蛋白质)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPPTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO:39(FBC39 FTL LCDR-1-Kabat)：RASQDISTWLA

SEQ ID NO:40(FBC39 FTL LCDR-2-Kabat)：AASSLQS

SEQ ID NO:41(FBC39 FTL LCDR-3-Kabat)：QQANSFPPT

SEQ ID NO:42(FBC39 FTL VH DNA)

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTAAAGCCTGGGGGGTCCCTTAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCCTTAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTTGGCCGTATTAAAAGTAATACTGATGGTGGGACAACAGACTACGCCGCACCCGTGAAAGGCAGATTCACCATCTCAAGAGACGATTCAAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAGCAGCCTGAAAACCGAGGACACAGCCGTCTATTACTGCACCACAGATGGACCTTACTCTGACGATTTTAGAAGTGGTTATGCCGCACGCTACCGTTATTTCGGAATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

SEQ ID NO:43(FBC39 FTL VH蛋白质)

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFLNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMSSLKTEDTAVYYCTTDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:44(FBC39 FTL HCDR-1-Kabat)：NAWMS

SEQ ID NO:45(FBC39 FTL HCDR-2-Kabat)：RIKSNTDGGTTDYAAPVKGSEQ ID NO:46(FBC39 FTL HCDR-3-Kabat)：DGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDV

SEQ ID NO:47(FBC39FTL scFv氨基酸序列):

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPPTFGCGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFLNAWMSWVRQAPGKCLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMSSLKTEDTAVYYCTTDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:48(FBC39 FTL VL蛋白质-scFv)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPPTFGCGTKLEIK

SEQ ID NO:49(FBC39 FTL VH蛋白质-scFv)

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFLNAWMSWVRQAPGKCLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMSSLKTEDTAVYYCTTDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:50:(FBC39FTL-43/105 scFv氨基酸序列)：

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKCPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPPTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFLNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMSSLKTEDTAVYYCTTDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGCGTTVTVSS

SEQ ID NO:51(FBC39 FTL VL蛋白质–scFv 43/105)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKCPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPPTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO:52(FBC39 FTL VH蛋白质–scFv 43/105)

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFLNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMSSLKTEDTAVYYCTTDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGCGTTVTVSS

SEQ ID NO:53(FBD94 VL DNA)

GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACTCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCGGAGTATTACCACCTTCTTAGCCTGGTACCAACAAAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTACGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCGTCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAACAGCCTAGAGCCTGACGATTTTGCAATTTATTACTGTCAGCAGCGTGACCACTGGCCTCCGATCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAAC

SEQ ID NO:54(FBD94 VL蛋白质)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASRSITTFLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGVPARFSGSGSGTDFTLTINSLEPDDFAIYYCQQRDHWPPIFGQGTRLEIK

SEQ ID NO:55(FBD94 LCDR-1-Kabat)：RASRSITTFLA

SEQ ID NO:56(FBD94 LCDR-2-Kabat)：DASNRAT

SEQ ID NO:57(FBD94 LCDR-3-Kabat)：QQRDHWPPI

SEQ ID NO:58(FBD94 VH DNA)

GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAACCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGTTTCTGGATTCATCTTTGAAGATTATGCCATAAACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAATTATTAGTTGGGACAGTGGTAGGATAGGCTACGCGGACTCTGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCTCGTTTCTGCAAATGAACAGTCTGAGACCCGAAGACACGGCCGTGTATTATTGTGTAAAAGATATGTTGGCGTATTATTATGATGGTAGCGGCATCAGGTACAACCTCTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAG

SEQ ID NO:59(FBD94 VH蛋白质)

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAVSGFIFEDYAINWVRQAPGKGLEWVSIISWDSGRIGYADSVRGRFTISRDNAKNSSFLQMNSLRPEDTAVYYCVKDMLAYYYDGSGIRYNLYGMDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:60(FBD94 HCDR-1-Kabat)：DYAIN

SEQ ID NO:61(FBD94 HCDR-2-Kabat)：IISWDSGRIGYADSVRG

SEQ ID NO:62(FBD94 HCDR-3-Kabat)：DMLAYYYDGSGIRYNLYGMDV

SEQ ID NO:63(FBD94 scFv氨基酸序列):

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASRSITTFLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGVPARFSGSGSGTDFTLTINSLEPDDFAIYYCQQRDHWPPIFGCGTRLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAVSGFIFEDYAINWVRQAPGKCLEWVSIISWDSGRIGYADSVRGRFTISRDNAKNSSFLQMNSLRPEDTAVYYCVKDMLAYYYDGSGIRYNLYGMDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:64(FBD94 VL蛋白质-scFv)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASRSITTFLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGVPARFSGSGSGTDFTLTINSLEPDDFAIYYCQQRDHWPPIFGCGTRLEIK

SEQ ID NO:65(FBD94 VH蛋白质-scFv)

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAVSGFIFEDYAINWVRQAPGKCLEWVSIISWDSGRIGYADSVRGRFTISRDNAKNSSFLQMNSLRPEDTAVYYCVKDMLAYYYDGSGIRYNLYGMDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:66(GL20/39 BiS4 100/44轻链)：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYTHWYQQKPGKAPKLLIYAASSRGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:67(GL20/39 BiS4 100/44重链)：

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSYNAVWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSGWYNDYAESVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSGHITVFGVNVDAFDMWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGCGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNAWMSWVRQAPGKCLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSLRTEDTAVYYCATDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:68(GL20/39 BiS4 43/105轻链)：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYTHWYQQKPGKAPKLLIYAASSRGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:69(GL20/39 BiS4 43/105重链)：

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSYNAVWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSGWYNDYAESVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSGHITVFGVNVDAFDMWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKCPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSLRTEDTAVYYCATDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGCGTTVTVSSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:70(FBC39 scFv-FY1 VH DNA，用于FY1/39 BiS2 100/44正向引物)

TTCTCTCCACAGGTGTACACTCCGACATCCAGATGACCCAGTCTC

SEQ ID NO:71(FBC39 scFv-FY1 VH DNA，用于FY1/39 BiS2 100/44反向引物)

GGATGGGCCCTTGGTCGACGCGCTTGACACGGTGACCATAGTC

SEQ ID NO:72(FBC39 scFv FY1/39 BiS4 100/44正向引物)

CTCTGGCGGAGGGGGATCCGACATCCAGATGACCCAGTCTC

SEQ ID NO:73(FBC39 scFv FY1/39 BiS4 100/44反向引物)

GTGAGTTTTGTCGGATCCCCCTCCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGG

SEQ ID NO:74(BiS1 FBC39正向引物):

CTGGCTCCCCGGGGCGCGCTGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCC

SEQ ID NO:75(BiS1 FBC39反向引物):

CCCCTCCGCCGGATCCCCCTCCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTC

SEQ ID NO:76(BiD1 FY1-VL正向引物):

AGGGGGATCCGGCGGAGGGGGCTCTGATATTCAGATGACCCAGAGCCC

SEQ ID NO:77(BiS1 FY1-VL反向引物):

TGGTGCAGCCACCGTACGTTTGATCTCCACCTTAGTGCCC

SEQ ID NO:78(FY1/39 BiS3 100/44-FBC39 scFv正向引物):

AAAGGCGGAGGGGGATCCGGCGGAGGGGGCTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTC

SEQ ID NO:79(FY1/39 BiS3 100/44-FBC39 scFv反向引物):

TCAATGAATTCGCGGCCGCTCATGAGGAGACGGTGACCGTGGTC

SEQ ID NO:80(FY1/94 BiS2 100/44-FBD94 scFv正向引物):

TTCTCTCCACAGGTGTACACTCCGAAATTGTGTTGACACAGTCTC

SEQ ID NO:81(FY1/94 BiS2 100/44-FBD94 scFv反向引物):

CCCCTCCGCCGGATCCCCCTCCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTC

SEQ ID NO:82(FY1/94 BiS2 100/44–FY1 VH正向引物):

AGGGGGATCCGGCGGAGGGGGCTCTCAGGTCCAGCTGCAGGAGAGC

SEQ ID NO:83(FY1/94 BiS2 100/44–FY1 VH反向引物):

GGATGGGCCCTTGGTCGACGCGCTTGACACGGTGACCATAGTC

SEQ ID NO:84(FY1/94 BiS4 100/44–FBD94 scFv正向引物):

CTCTGGCGGAGGGGGATCCGAAATTGTGTTGACACAGTCTC

SEQ ID NO:85(FY1/94 BiS4 100/44–FBD94 scFv反向引物):

GTGAGTTTTGTCGGATCCCCCTCCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGG

SEQ ID NO:86(FY1/39 BiS4 43/105-FBC39-43/105 scFv正向引物):

CTCTGGCGGAGGGGGATCCGACATCCAGATGACCCAGTCTC

SEQ ID NO:87(FY1/39 BiS4 43/105-FBC39-43/105 scFv反向引物):

GTGAGTTTTGTCGGATCCCCCTCCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGG

SEQ ID NO:88(GL20/39FTL BiS4 100/44-FBC39FTL scFv正向引物):

CTCTGGCGGAGGGGGATCCGACATCCAGATGACCCAGTCTC

SEQ ID NO:89(GL20/39FTL BiS4 100/44-FBC39FTL scFv反向引物):

GTGAGTTTTGTCGGATCCCCCTCCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGG

SEQ ID NO:90(GL20/39FTL BiS4 43/105-FBC39FTL43/105 scFv正向引物):

CTCTGGCGGAGGGGGATCCGACATCCAGATGACCCAGTCTC

SEQ ID NO:91(GL20/39FTL BiS4 43/105-FBC39FTL43/105 scFv反向引物):

GTGAGTTTTGTCGGATCCCCCTCCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGG

SEQ ID NO:92(Gly/ser接头)

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO:93(Gly/ser接头)

[GGGGS]n，其中n是0、1、2、3、4或5

SEQ ID NO:94(FBC-39 LCDR-1-IMGT)：QDISTW

SEQ ID NO:95(FBC-39 LCDR-2-IMGT)：AAS

SEQ ID NO:96(FBC-39 LCDR-3-IMGT)：QQANSFPPT

SEQ ID NO:97(FBC-39 HCDR-1-IMGT)：GLSFLNAW

SEQ ID NO:98(FBC-39 HCDR-2-IMGT)：IKSNTDGGTT

SEQ ID NO:99(FBC-39 HCDR-3-IMGT)：TDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVW

SEQ ID NO:100(FBC-39 FTL LCDR-1-IMGT)：QDISTW

SEQ ID NO:101(FBC-39 FTL LCDR-2-IMGT)：AAS

SEQ ID NO:102(FBC-39 FTL LCDR-3-IMGT)：QQANSFPPT

SEQ ID NO:103(FBC-39 FTL HCDR-1-IMGT)：GFTFLNAW

SEQ ID NO:104(FBC-39 FTL HCDR-2-IMGT)：IKSNTDGGTT

SEQ ID NO:105(FBC-39 FTL HCDR-3-IMGT)：TTDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDV

SEQ ID NO:106(Gly/ser接头)

[GGGG]n，其中n是0、1、2、3、4或5

SEQ ID NO:107(FY1/39 Bis2 100/44轻链)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:108(FY1/39 Bis2 100/44重链)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGCGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNAWMSWVRQAPGKCLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSLRTEDTAVYYCATDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNNAVWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAESVKSRITVNPDTSKNQFSLHLKSVTPEDTAVFYCVRSGHITVFGVNVDAFDMWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:109(FY1/39 Bis4 100/44轻链)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:110(FY1/39 Bis4 100/44重链)

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNNAVWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAESVKSRITVNPDTSKNQFSLHLKSVTPEDTAVFYCVRSGHITVFGVNVDAFDMWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGCGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNAWMSWVRQAPGKCLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSLRTEDTAVYYCATDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:111(FBC39 scFv-FY1 VH DNA)：

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGATATTAGCACCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGATTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTTTTGTCAGCAGGCTAACAGTTTCCCTCCGACTTTTGGCTGCGGGACCAAGCTGGAGATCAAAGGCGGAGGGGGCTCTGGGGGAGGGGGCAGCGGCGGCGGAGGATCTGGGGGAGGGGGCAGCGAGGTGCAGCTGGTGGTGTCTGGGGGAGGCTTGGTAAAGCCTGGGGGGTCCCTTAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACTCAGTTTCCTTAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGTGCCTGGAGTGGGTTGGCCGTATTAAAAGTAATACTGATGGTGGGACAACAGACTACGCCGCACCCGTGAAAGGCAGATTCAGCATCTCAAGAGACGATTCAAAGAACATGCTGTTTCTGCATATGAGCAGCCTGAGAACCGAGGACACAGCCGTCTATTACTGCGCCACAGATGGACCTTACTCTGACGATTTTAGAAGTGGTTATGCCGCACGCTACCGTTATTTCGGAATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGCGGAGGGGGATCCGGCGGAGGGGGCTCTCAGGTCCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGACTGGTCAAGCCTTCACAGACACTGAGCCTGACATGCGCCATTAGCGGAGATAGCGTGAGCTCCAACAATGCCGTGTGGAACTGGATCAGGCAGTCTCCAAGTCGAGGACTGGAGTGGCTGGGACGAACATACTATAGATCCAAGTGGTACAATGACTATGCTGAATCAGTGAAAAGCCGAATTACTGTCAACCCCGATACCTCCAAGAATCAGTTCTCTCTGCACCTGAAAAGTGTGACCCCTGAGGACACAGCCGTGTTCTACTGCGTCAGAAGCGGCCATATCACCGTCTTTGGCGTCAATGTGGATGCTTTCGATATGTGGGGGCAGGGGACTATGGTCACCGTGTCAAGC

SEQ ID NO:112(FBC39 scFv DNA)：

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGATATTAGCACCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGATTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTTTTGTCAGCAGGCTAACAGTTTCCCTCCGACTTTTGGCTGCGGGACCAAGCTGGAGATCAAAGGCGGAGGGGGCTCTGGGGGAGGGGGCAGCGGCGGCGGAGGATCTGGGGGAGGGGGCAGCGAGGTGCAGCTGGTGGTGTCTGGGGGAGGCTTGGTAAAGCCTGGGGGGTCCCTTAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACTCAGTTTCCTTAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGTGCCTGGAGTGGGTTGGCCGTATTAAAAGTAATACTGATGGTGGGACAACAGACTACGCCGCACCCGTGAAAGGCAGATTCAGCATCTCAAGAGACGATTCAAAGAACATGCTGTTTCTGCATATGAGCAGCCTGAGAACCGAGGACACAGCCGTCTATTACTGCGCCACAGATGGACCTTACTCTGACGATTTTAGAAGTGGTTATGCCGCACGCTACCGTTATTTCGGAATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

SEQ ID NO: 113(FY1/39 Bis1 100/44轻链)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGCGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNAWMSWVRQAPGKCLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSLRTEDTAVYYCATDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 114(FY1/39 Bis1 100/44重链)

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNNAVWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAESVKSRITVNPDTSKNQFSLHLKSVTPEDTAVFYCVRSGHITVFGVNVDAFDMWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 115(FY1/39 Bis3 100/44轻链)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 116(FY1/39 Bis3 100/44重链)

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNNAVWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAESVKSRITVNPDTSKNQFSLHLKSVTPEDTAVFYCVRSGHITVFGVNVDAFDMWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGCGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNAWMSWVRQAPGKCLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSLRTEDTAVYYCATDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:117(FY1/94 Bis2 100/44轻链)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:118(FY1/94 Bis2 100/44重链)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASRSITTFLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGVPARFSGSGSGTDFTLTINSLEPDDFAIYYCQQRDHWPPIFGCGTRLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAVSGFIFEDYAINWVRQAPGKCLEWVSIISWDSGRIGYADSVRGRFTISRDNAKNSSFLQMNSLRPEDTAVYYCVKDMLAYYYDGSGIRYNLYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNNAVWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAESVKSRITVNPDTSKNQFSLHLKSVTPEDTAVFYCVRSGHITVFGVNVDAFDMWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:119(FBD94 scFv DNA)：

GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACTCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCGGAGTATTACCACCTTCTTAGCCTGGTACCAACAAAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTACGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCGTCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAACAGCCTAGAGCCTGACGATTTTGCAATTTATTACTGTCAGCAGCGTGACCACTGGCCTCCGATCTTCGGCTGTGGGACACGACTGGAGATTAAAGGAGGCGGAGGATCTGGTGGTGGTGGATCTGGCGGCGGAGGAAGTGGTGGCGGAGGCTCTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAACCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGTTTCTGGATTCATCTTTGAAGATTATGCCATAAACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGTGCCTGGAGTGGGTCTCAATTATTAGTTGGGACAGTGGTAGGATAGGCTACGCGGACTCTGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCTCGTTTCTGCAAATGAACAGTCTGAGACCCGAAGACACCGCCGTGTATTATTGTGTAAAAGATATGTTGGCGTATTATTATGATGGTAGCGGCATCAGGTACAACCTCTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

SEQ ID NO:120(FY1/39 Bis4 43/105轻链)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:121(FY1/39 Bis4 43/105重链)

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNNAVWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAESVKSRITVNPDTSKNQFSLHLKSVTPEDTAVFYCVRSGHITVFGVNVDAFDMWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKCPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSLRTEDTAVYYCATDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGCGTTVTVSSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:122(FBC39-43/105 scFv DNA)：

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGATATTAGCACCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAATGCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGATTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTTTTGTCAGCAGGCTAACAGTTTCCCTCCGACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGAGGATCTGGTGGTGGTGGATCTGGCGGCGGAGGAAGTGGTGGCGGAGGCTCTGAGGTGCAGCTGGTGGTGTCTGGGGGAGGCTTGGTAAAGCCTGGGGGGTCCCTTAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACTCAGTTTCCTTAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTGGCCGTATTAAAAGTAATACTGATGGTGGGACAACAGACTACGCCGCACCCGTGAAAGGCAGATTCAGCATCTCAAGAGACGATTCAAAGAACATGCTGTTTCTGCATATGAGCAGCCTGAGAACCGAGGACACAGCCGTCTATTACTGCGCCACAGATGGACCTTACTCTGACGATTTTAGAAGTGGTTATGCCGCACGCTACCGTTATTTCGGAATGGACGTCTGGGGCTGCGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

SEQ ID NO:123(GL20 LC/VH)：

GATATTCAGATGACCCAGAGCCCTTCCAGCCTGTCCGCTTCAGTGGGGGATCGAGTGACCATTACCTGCCGAACCAGCCAGAGCCTGAGCTCCTACACGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAAGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCTTCTAGTCGGGGGTCCGGAGTGCCAAGCCGGTTCTCCGGATCTGGGAGTGGAACCGACTTTACCCTGACAATTTCAAGCCTGCAGCCCGAGGATTTCGCTACATACTACTGTCAGCAGAGCAGAACTTTCGGGCAGGGCACTAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGTGAGCTAGCGATGATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGACTCTATAGGCACACCCCTTTGGCTCTTATGCATGAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACAGACTGTTCCTTTCCTGGGTCTTTTCTGCAGGCACCGTCGCCGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTAAGGGGCTCACAGTAGCAGGCTTGAGGTCTAGACATATATATGGGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTaCActccCAGGTCCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCCGGACTGGTCAAGCCTTCACAGACACTGAGCCTGACATGCGCCATTAGCGGAGATAGCGTGAGCTCCTACAATGCCGTGTGGAACTGGATCAGGCAGTCTCCAAGTCGAGGACTGGAGTGGCTGGGACGAACATACTATAGATCCGGGTGGTACAATGACTATGCTGAATCAGTGAAAAGCCGAATTACTATCAACCCCGATACCTCCAAGAATCAGTTCTCTCTGCAGCTGAACAGTGTGACCCCTGAGGACACAGCCGTGTACTACTGCGCCAGAAGCGGCCATATCACCGTCTTTGGCGTCAATGTGGATGCTTTCGATATGTGGGGGCAGGGGACTATGGTCACCGTGTCAAGC

SEQ ID NO:124(FBC39FTL scFv DNA)：

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGATATTAGCACCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGATTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAGCAGGCTAACAGTTTCCCTCCGACTTTTGGCTGCGGGACCAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGAGGATCTGGTGGTGGTGGATCTGGCGGCGGAGGAAGTGGTGGCGGAGGCTCTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTAAAGCCTGGGGGGTCCCTTAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCCTTAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGTGCCTGGAGTGGGTTGGCCGTATTAAAAGTAATACTGATGGTGGGACAACAGACTACGCCGCACCCGTGAAAGGCAGATTCACCATCTCAAGAGACGATTCAAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAGCAGCCTGAAAACCGAGGACACAGCCGTCTATTACTGCACCACAGATGGACCTTACTCTGACGATTTTAGAAGTGGTTATGCCGCACGCTACCGTTATTTCGGAATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

SEQ ID NO:125(GL20/39FTL Bis4 43/105轻链)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYTHWYQQKPGKAPKLLIYAASSRGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:126(GL20/39FTL Bis4 43/105重链)

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSYNAVWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSGWYNDYAESVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSGHITVFGVNVDAFDMWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKCPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPPTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFLNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMSSLKTEDTAVYYCTTDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGCGTTVTVSSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:127(FBC39FTL43/105 scFv DNA)：

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGATATTAGCACCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAATGCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGATTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAGCAGGCTAACAGTTTCCCTCCGACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGAGGATCTGGTGGTGGTGGATCTGGCGGCGGAGGAAGTGGTGGCGGAGGCTCTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTAAAGCCTGGGGGGTCCCTTAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCCTTAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTGGCCGTATTAAAAGTAATACTGATGGTGGGACAACAGACTACGCCGCACCCGTGAAAGGCAGATTCACCATCTCAAGAGACGATTCAAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAGCAGCCTGAAAACCGAGGACACAGCCGTCTATTACTGCACCACAGATGGACCTTACTCTGACGATTTTAGAAGTGGTTATGCCGCACGCTACCGTTATTTCGGAATGGACGTCTGGGGCTGCGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

SEQ ID NO:128(GL20/39FTL Bis5 43/105轻链)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYTHWYQQKPGKAPKLLIYAASSRGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:129(GL20-FBC39 BiS5-GL20VH–Fc(CH3-)–接头–FBC39 scFv–接头–Fc(-CH3))

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSYNAVWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSGWYNDYAESVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSGHITVFGVNVDAFDMWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGCGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNAWMSWVRQAPGKCLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSLRTEDTAVYYCATDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:130(GL20/39FTL Bis5 43/105轻链)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYTHWYQQKPGKAPKLLIYAASSRGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:131(GL20VH BiS5–Fc(CH3-)–接头–FBC39(43-105)scFv–接头–Fc(-CH3))

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSYNAVWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSGWYNDYAESVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSGHITVFGVNVDAFDMWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKCPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSLRTEDTAVYYCATDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGCGTTVTVSSGGGGSGGGGSGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Claims (17)

1.一种特异地结合至甲型流感病毒和乙型流感病毒的分离的结合分子，该分离的结合分子包含：

(a)第一结合结构域，该第一结合结构域能够结合至甲型流感病毒血球凝集素（HA）并且中和至少一个组1亚型和至少1个组2亚型的甲型流感病毒，其中该第一结合结构域包括第一组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中该第一组六个CDR具有选自以下(i)或(ii)的氨基酸序列：

(i)氨基酸序列：SEQ ID NO.: 8的HCDR1、SEQ ID NO.: 9的HCDR2、SEQ ID NO.: 10的HCDR3、SEQ ID NO.: 3的LCDR1、SEQ ID NO.: 4的LCDR2和SEQ ID NO.: 5的LCDR3；以及

(ii)氨基酸序列：SEQ ID NO.: 18的HCDR1、SEQ ID NO.: 19的HCDR2、SEQ ID NO.: 20的HCDR3、SEQ ID NO.: 13的LCDR1、SEQ ID NO.: 14的LCDR2、SEQ ID NO.: 15的LCDR3；以及

(b)第二结合结构域，该第二结合结构域能够结合至乙型流感病毒血球凝集素（HA）并且中和处于至少两种系统发生的不同世系中的乙型流感病毒，其中该第二结合结构域包括第二组六个CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中该第二组六个CDR具有选自以下(i)、(ii)或(iii)的氨基酸序列：

(i)氨基酸序列：SEQ ID NO.: 28的HCDR1、SEQ ID NO.: 29的HCDR2、SEQ ID NO.: 30的HCDR3、SEQ ID NO.: 23的LCDR1、SEQ ID NO.: 24的LCDR2和SEQ ID NO.: 25的LCDR3；

(ii)氨基酸序列：SEQ ID NO.: 44的HCDR1、SEQ ID NO.: 45的HCDR2、SEQ ID NO.: 46的HCDR3、SEQ ID NO.: 39的LCDR1、SEQ ID NO.: 40的LCDR2和SEQ ID NO.: 41的LCDR3；以及

(iii)氨基酸序列：SEQ ID NO.: 60的HCDR1、SEQ ID NO.: 61的HCDR2、SEQ ID NO.:62的HCDR3、SEQ ID NO.: 55的LCDR1、SEQ ID NO.: 56的LCDR2、SEQ ID NO.: 57的LCDR3。

2.根据权利要求1所述的分离的结合分子，其中该第一结合结构域能够中和选自以下各项的一种或多种甲型流感病毒组1亚型：H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17、H18及其变体；以及选自以下各项的一种或多种甲型流感病毒组2亚型：H3、H4、H7、H10、H14和H15及其变体；并且其中该第二结合结构域能够中和处于山形和维多利亚世系两者中的乙型流感病毒。

3.根据权利要求1所述的分离的结合分子，其中该第一结合结构域包含抗甲型流感病毒抗体或其抗原结合片段，并且该第二结合结构域包含抗乙型流感病毒抗体或其抗原结合片段。

4.根据权利要求1所述的分离的结合分子，其中：

(a)该第一结合结构域包含VH和VL，该VH和VL分别与选自以下各项的VH和VL的氨基酸序列具有至少75%一致性：

(i)SEQ ID NO.: 7的VH和SEQ ID NO.: 2的VL；以及

(ii)SEQ ID NO.: 17的VH和SEQ ID NO.: 12的VL；和

(b)该第二结合结构域包含VH和VL，该VH和VL分别与选自以下各项的VH和VL的氨基酸序列具有至少75%一致性：

(i)SEQ ID NO.: 27的VH和SEQ ID NO.: 22的VL；

(ii)SEQ ID NO.: 33的VH和SEQ ID NO.: 32的VL；

(iii)SEQ ID NO.: 36的VH和SEQ ID NO.: 35的VL；

(iv)SEQ ID NO.: 43的VH和SEQ ID NO.: 38的VL；

(v)SEQ ID NO.: 49的VH和SEQ ID NO.: 48的VL；

(vi)SEQ ID NO.: 52的VH和SEQ ID NO.: 51的VL；

(vii) SEQ ID NO.: 59的VH和SEQ ID NO.: 54的VL；以及

(viii) SEQ ID NO.: 65的VH和SEQ ID NO.: 64的VL。

5.根据权利要求1所述的分离的结合分子，其中该结合分子是双特异性抗体。

6.根据权利要求5所述的分离的结合分子，其中该第一结合结构域包含抗甲型流感病毒Fv结构域，并且该第二结合结构域包含抗乙型流感病毒scFv分子。

7.根据权利要求6所述的分离的结合分子，其中该第一结合结构域的Fv结构域包含重链（HC），该重链包含具有氨基末端和羧基末端的多肽链，以及轻链（LC），该轻链包含具有氨基末端和羧基末端的多肽链，并且

(a)该第二结合结构域共价连接至该第一结合结构域的HC的羧基末端；

(b)该第二结合结构域共价连接至该第一结合结构域的HC的氨基末端；

(c)该第二结合结构域共价连接至该第一结合结构域的LC的氨基末端；或者

(d)该第二结合结构域共价地插入该第一结合结构域的HC的多肽链中。

8.根据权利要求6所述的分离的结合分子，其中：

(a)该第一结合结构域的Fv结构域包含选自以下各项的VH和VL：

(i)SEQ ID NO.: 7的VH和SEQ ID NO.: 2的VL；以及

(ii)SEQ ID NO.: 17的VH和SEQ ID NO.: 12的VL；和

(b)该第二结合结构域的scFv包含选自以下各项的VH和VL：

(i)SEQ ID NO.: 27的VH和SEQ ID NO.: 22的VL；

(ii)SEQ ID NO.: 33的VH和SEQ ID NO.: 32的VL；

(iii)SEQ ID NO.: 36的VH和SEQ ID NO.: 35的VL；

(iv)SEQ ID NO.: 43的VH和SEQ ID NO.: 38的VL；

(v)SEQ ID NO.: 49的VH和SEQ ID NO.: 48的VL；

(vi)SEQ ID NO.: 52的VH和SEQ ID NO.: 51的VL；

(vii) SEQ ID NO.: 59的VH和SEQ ID NO.: 54的VL；以及

(viii) SEQ ID NO.: 65的VH和SEQ ID NO.: 64的VL。

9.根据权利要求1所述的分离的结合分子，其中所述第一结合结构域包含一个或多个重链恒定结构域并且所述第二结合结构域包含插入在所述第一结合结构域的一个或多个重链恒定结构域之间的scFv。

10.根据权利要求1所述的分离的结合分子，其中所述第一结合结构域包含式VH-CH1-CH2-CH3并且所述第二结合结构域包含scFv，

其中VH是重链可变结构域，CH1是重链恒定结构域结构域1，CH2是重链恒定结构域结构域2，并且CH3是重链恒定结构域结构域3，并且所述分离的结合分子具有式VH-CH1-L1-scFv-L2-CH2-CH3，其中L1和L2独立地是接头并且scFv是第二结合结构域的scFv分子；并且

其中所述第二结合结构域的scFv的VL在选自43、44、46、49、50或100的位置处包含半胱氨酸残基，并且所述第二结合结构域的scFv的VH在选自位置43、44、100、101或105的位置处包含半胱氨酸残基。

11.根据权利要求1所述的分离的结合分子，其包括具有选自以下各项的轻链和重链的双特异性抗体：

(i)SEQ ID NO.: 66的轻链和SEQ ID NO.: 67的重链；

(ii)SEQ ID NO.: 68的轻链和SEQ ID NO.: 69的重链；

(iii)SEQ ID NO.: 109的轻链和SEQ ID NO.: 110的重链；

(iv)SEQ ID NO.: 120的轻链和SEQ ID NO.: 121的重链；和

(v)SEQ ID NO.: 125的轻链和SEQ ID NO.: 126的重链。

12.一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码根据权利要求1-11中任一项所述的分离的结合分子的核酸。

13.一种载体，该载体包含如权利要求12所述的多核苷酸。

14.一种宿主细胞，该宿主细胞包含如权利要求12所述的多核苷酸。

15.一种组合物，该组合物包含根据权利要求1-11中任一项所述的分离的结合分子以及药学上可接受的载体。

16.一种用于制造根据权利要求1-11中任一项所述的分离的结合分子的方法，该方法包括在适合于该结合分子的表达的条件下培养宿主细胞。

17.根据权利要求1-11中任一项所述的分离的结合分子在制备用于在受试者中预防或治疗甲型流感感染、乙型流感感染或其组合的方法的药物中的用途，其中该方法包括向该受试者给予有效量的所述的分离的结合分子。