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CN107207611A - 针对流感血球凝集素的结合分子及其用途 - Google Patents

针对流感血球凝集素的结合分子及其用途 Download PDF

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CN107207611A CN201680008842.9A CN201680008842A CN107207611A CN 107207611 A CN107207611 A CN 107207611A CN 201680008842 A CN201680008842 A CN 201680008842A CN 107207611 A CN107207611 A CN 107207611A
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Abstract

本发明涉及单体和多聚体结合分子，这些单体和多聚体结合分子能够特异性结合至少两种A型流感病毒株的血球凝集素(HA)，所述病毒株包括来自系统发育组2的两种不同HA亚型的HA；或能够特异性结合至少一种来自系统发育组1的A型流感病毒株和至少一种来自系统发育组2的A型流感病毒株的血球凝集素(HA)；或能够特异性结合至少一种B型流感病毒株的血球凝集素(HA)。这些结合分子还优选地能够中和至少两种来自系统发育组2的A型流感病毒株；或能够中和至少一种来自系统发育组1的A型流感病毒株和至少一种来自系统发育组2的A型流感病毒株；或能够特异性中和至少一种B型流感病毒株。

Description

针对流感血球凝集素的结合分子及其用途
技术领域
本发明涉及医学领域。本发明提供了结合分子，特别是结合至A型和/或B型流感病毒的流感血球凝集素的单域抗体和多域抗体。优选地，该结合分子还能够中和A型和/或B型流感病毒。本发明进一步提供了编码这些单域抗体和多域抗体的核酸分子，以及包括这些核酸分子的组合物。本发明进一步涉及由A型流感和/或B型流感病毒引起的感染的诊断、预防和/或治疗。
背景技术
季节性A型流感是一个重要的公共健康问题，每年在全球范围内危害超过250,000人，同时产生数百万的经济负担。大流行性流感在新的病毒出现时发生，并感染全球具有很少免疫力或没有免疫力的人群，甚至对人类健康构成更大的威胁；例如，1918年“西班牙流感”大流行造成了估计5千万人死亡。持续关注的是高致病性禽流感(HPAI)，其在感染的人群中已经显示了高于50％的死亡率。H5以及H7流感病毒在世界某些部分的家禽中流行。目前，这些病毒看起来不能从人与人之间轻易传播，但针对禽类H5的最新数据表明仅有几个氨基酸变化足以使这种病毒能够在哺乳动物体内模型系统中通过气溶胶传播来扩散。
迄今为止，对B型流感病毒的关注较少。这可能是由于-主要限于作为宿主的人类-B型流感病毒缺乏出现大流行性A型流感株的关键的大型动物储主。然而，每年流行病的累积影响超过大流行病的累积影响，并且尽管归因于B型流感的发病率和死亡率低于例如H3N2病毒的发病率和死亡率，但是它们通常高于H1N1病毒的发病率和死亡率。
尽管疫苗是流感病毒感染控制的支柱，但是其及时的实施存在若干技术挑战。这些包括(i)预测哪些病毒株将出现并感染人类群体，(ii)出现新的病毒株与临床批准的疫苗的可用性之间的滞后期，(iii)某些患者群体(例如年老的、非常年幼的或免疫受损的)的免疫原性差，以及(iv)世界范围内有限的生产能力。
抗病毒药物，例如神经氨酸酶抑制剂(奥司他韦和扎那米韦)和M2抑制剂(金刚烷胺和金刚烷乙胺)是针对季节性和大流行性流感的治疗方案库的重要补充。然而，如果在感染后期给予，这些药物具有有限的效力，并且广泛使用可能导致抗性病毒株的出现。此外，奥司他韦在成人中的使用与恶心、呕吐、精神病学影响和肾脏事件等不良反应有关。
抗体代表了最早的保护剂类型之一，并且在以前的流感大流行中成功地使用了来自恢复期患者的血清的被动转移。然而，这种方法具有用于在全球尺度上实施的有限潜力，因为(i)适当的血清的限制供应，(ii)高风险的毒性，(iii)高的批次间变化，(iv)不确定的剂量，以及(v)给予的困难。
重组单克隆抗体技术的进展使得这一策略值得进一步研究，而不是因为可以生产和储存无限量的保护性抗体以便在大流行性紧急情况下提供及时的保护。为了使其成为有效策略，需要这样的抗体具有不同病毒亚型的中和活性。这呈现了一个重大的挑战，因为流感病毒的病毒外壳蛋白、特别是血球凝集素(HA)是不断变化的。
血球凝集素或HA是一种三聚体糖蛋白，其被锚定到流感病毒外壳上并具有双重功能：它负责与宿主细胞表面受体唾液酸的结合，并且在摄取之后它介导病毒与内体膜的融合，导致病毒RNA在该细胞的细胞溶质中的释放。HA包括一个大的且可变的头部结构域，以及一个较小的更保守的茎部结构域。大多数针对HA的中和抗体识别在头部区的超变区中的表位，并且因此干扰与宿主细胞的结合。然而最近，已经鉴定出结合至HA茎部区，并且干扰膜融合的新的单克隆抗体(Corti等人，2011；Dreyfus等人，2012；Ekiert等人，2009，Ekiert等人，2011和Ekiert等人，2012；Kashyap等人，2010；Krause等人，2012；Lee等人，2012；Sui等人，2009；Tan等人，2012；Throsby等人，2008；Tsibane等人，2012；Wang等人，2010；Yoshida等人，2009)。
这些广泛中和性抗体中的至少一些已经显示出前所未有的交叉反应性的广度，使得它们能够中和流感病毒的亚型、系统发育组、或甚至不同组和亚型之间的许多不同流感株。这些抗体的治疗和预防潜力已经在小鼠和白鼬模型中得到证实，并且目前在人类临床试验中正在对若干种抗体进行评估。然而，这些单克隆抗体还可能具有某些固有的局限性，这对于它们在流感预防和/或治疗中的广泛应用是重大的挑战。这些局限性可能包括(i)肠胃外给予的需要；(ii)高的商品成本；(iii)流行的流感株的不完全覆盖；(iv)在感染部位的低生物利用度；以及(v)出现抗药性的风险。
单域抗体(sdAb)是由单个抗原结合的可变结构域组成的抗体片段。这些片段比常规的单克隆抗体具有若干优势，这些优势包括：(i)尺寸小(15kDa)，(ii)低成本微生物生产，(iii)简单工程化为多特异性形式，(iv)具有支持不可注射的给予途径的潜力的高稳定性，和/或(iv)进入隐蔽或隐藏的表位的潜力。这些有利的特性使得sdAb成为单克隆抗体的具有吸引力的替代物，特别是在感染性疾病的领域中。对抗若干种不同病毒的中和sdAb已经在文献中进行了描述，这些病毒包括HIV、乙型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病毒、FMDV、脊髓灰质炎病毒、以及轮状病毒(Vanlandschoot等人，2011)。
能够中和流感的HA结合sdAb也已经在文献中进行了描述。因此，Hultberg等人(2011)鉴定了对抗多种H5N1病毒的具有中和活性的sdAb(Infl-C8)。Infl-C8二聚体和三聚体显示了对抗H5N1病毒的改进的和拓宽的活性。然而，没有观察到PR8(H1N1)或X47(H3N2)流感病毒的交叉中和。
WO 2009/147248披露了在ELISA中显示异源亚型结合活性的若干种sdAb。然而，除了一种sdAb之外，这些sdAb中没有一种在病毒中和测定法中是有活性的。中和sdAb的这一种，被称为IV146，在ELISA中显示出系统发育组1限制性结合，并能够中和2种不同的H5病毒。
Tillib等人(2013)描述了对抗H5N2株A/野鸭(Mallard duck)/宾夕法尼亚州/10218/84具有在体外和体内中和活性的多种sdAb。
Hufton等人(2014)鉴定了对抗H1、H2、H5和/或H9病毒具有交叉亚型中和活性的若干种sdAb。然而，这些sdAb均不能中和H7N2。这些sdAb中一者的二聚化改进了其对H1、H2、H5和H9的活性，但不导致H7N2或H3N2病毒的组间交叉中和。
迄今为止，鉴定出的单体或多聚体sdAb均不能中和所有相关的季节性(H1N1、H3N2和B)和大流行性(例如，H5N1和H7N9)流感株。鉴于由A型流感和B型流感病毒引起的呼吸系统疾病的严重程度、和季节性流行病的高的经济影响、以及针对大流行病的持续风险，存在对抗A型和B型流感病毒具有广泛活性并且可以作为用于预防或治疗流感感染的药物使用的新型有效的抑制剂的持续需要。
发明内容
本发明提供了如下新颖的单域抗体(sdAb)：这些新颖的单域抗体能够特异性结合至少两种A型流感病毒株的血球凝集素(HA)，所述至少两种流感病毒株包括来自系统发育组2的两种不同亚型的HA；或能够特异性结合来自系统发育组1的至少一种A型流感株和来自系统发育组2的至少一种A型流感病毒株；或能够特异性结合至少一种B型流感病毒株的血球凝集素(HA)。在某些实施例中，这些sdAb还能够中和至少两种来自系统发育组2的、包括两种HA不同亚型的、不同的A型流感病毒株；或至少一种来自系统发育组1的A型流感病毒株和至少一种来自系统发育组的A型流感病毒株；或至少一种B型流感病毒株。
本发明进一步提供了所谓的多域抗体，即包括如在此所述的至少两个，优选地至少三个，更优选地至少四个，或甚至更优选地至少五个单域抗体的结合分子。在某些实施例中，这些多域抗体能够中和至少一种来自系统发育组1的A型流感病毒株和至少一种来自系统发育组2的A型流感病毒株。在某些实施例中，这些多域抗体能够中和至少一种来自系统发育组1的A型流感病毒株和至少一种来自系统发育组2的A型流感病毒株，以及至少一种B型流感病毒株，优选地至少一种来自B/山形(Yamagata)谱系的B型流感病毒株和至少一种来自B/维多利亚(Victoria)谱系的流感病毒株。在某些实施例中，这些多域抗体能够中和含有H1亚型的HA的流感病毒(例如，H1N1流感病毒株)、含有H3亚型的HA的流感病毒(例如，H3N2流感病毒株)、含有H5亚型的HA的流感病毒(例如，H5N1流感病毒株)、和含有H7亚型的HA的流感病毒(例如，H7N9流感病毒株)，以及至少一种B型流感病毒，优选地至少一种来自B/山形谱系的B型流感病毒株和至少一种来自B/维多利亚谱系的流感病毒株。
此外，本发明提供了编码这些sdAb或多域抗体的核酸分子，以及含有所述核酸分子的载体和宿主细胞。
本发明还提供了包含如在此所述的一种或多种sdAb、多域抗体、核酸分子和/或载体的(药物)组合物。
根据本发明，提供了新颖的流感血球凝集素结合分子。这些结合分子可以是单域抗体或多域抗体。本发明的至少一些结合分子是独特的，因为它们在系统发育组之间是交叉中和的，即能够结合并且中和至少一种来自系统发育组1的A型流感病毒株和至少一种来自系统发育组2的A型流感病毒株。在某些实施例中，这些结合分子能够特异性结合并且中和至少一种B型流感病毒株，优选地至少一种来自B/山形谱系的B型流感病毒株和至少一种来自B/维多利亚谱系的流感病毒株。本发明的结合分子和核酸序列适合于用作流感感染(甚至不考虑致病流感亚型)的诊断剂、预防剂和/或治疗剂。
附图说明
图1显示了通过ELISA对在美洲驼#3和#4中免疫应答的分析。
图2显示了SD1016、SD1038和SD1045针对用A/波多黎各/8/1934-MA(H1N1)病毒的致死性激发的体内功效。显示了在激发前一天(在第0天)用0.5mg/kg sdAb处理的小鼠的存活曲线(左图)和体重减轻(右图)。
图3显示了SD1036、SD1046和SD1048针对用A/香港/1/1968-MA(H3N2)病毒的致死性激发的体内功效。显示了在激发前一天(在第0天)用5mg/kg或0.5mg/kg sdAb处理的小鼠的存活曲线(左图)和体重减轻(右图)。
图4显示了SD1083和SD1084针对用B/佛罗里达/4/2006病毒的致死性激发的体内功效。显示了在激发前一天(在第0天)用5mg/kg或0.5mg/kg sdAb处理的小鼠的存活曲线(左图)和体重减轻(右图)。
图5显示了SD1038、MD1211、MD1212、或者SD1038和SD1036的1:1混合物针对用A/波多黎各/8/1934-MA(H1N1)病毒的致死性激发的体内功效。显示了在激发前一天(在第0天)用单域或多域抗体处理的小鼠的存活曲线(左图)和体重减轻(右图)。
图6显示了SD1036、MD1211、MD1212、或者SD1036和SD1038的1:1混合物针对用A/香港/1/1968-MA(H3N2)病毒的致死性激发的体内功效。显示了在激发前一天(在第0天)用单域或多域抗体处理的小鼠的存活曲线(左图)和体重减轻(右图)。
图7显示了SD1038和MD1212针对用A/香港/1/1968-MA(H3N2)病毒的致死性激发的体内功效。显示了在激发前一天(在第0天)用5mg/kg、1.7mg/kg、0.6mg/kg或0.2mg/kg单域或多域抗体处理的小鼠的存活曲线(左图)和体重减轻(右图)。
图8显示了MD1221、MD1222和MD1224针对用B/佛罗里达/4/2006病毒的致死性激发的体内功效。显示了在激发前一天(在第0天)用5mg/kg或0.5mg/kg多域抗体处理的小鼠的存活曲线(左图)和体重减轻(右图)。
图9显示了MD1301、MD2601和CR9114针对用A/波多黎各/8/1934-MA(H1N1)病毒的致死性激发的体内功效。显示了在激发前一天(在第0天)用3mg/kg(多域)抗体处理的小鼠的存活曲线(左图)和体重减轻(右图)。
图10显示了MD1301、MD2601和CR9114针对用A/波多黎各/8/1934-MA(H1N1)病毒的致死性激发的体内功效。显示了在激发前一天(在第0天)用0.2mg/kg、0.05mg/kg或0.01mg/kg(多域)抗体处理的小鼠的存活曲线(左图)和体重减轻(右图)。
图11显示了MD2617针对用A/波多黎各/8/1934-MA(H1N1)病毒的致死性激发的体内功效。显示了在激发前一天(在第0天)用MD2617鼻内(顶部)或静脉内(底部)处理的小鼠的存活曲线(左图)和体重减轻(右图)。
图12显示了MD2617和CR9114针对用B/佛罗里达/4/2006(顶部)或A/香港/1/1968-MA(底部)病毒的致死性激发的体内功效。显示了在激发前一天(在第0天)用(多域)抗体鼻内或静脉内处理的小鼠的存活曲线(左图)和体重减轻(右图)。
图13显示了MD2407、MD3606和CR9114针对用B/佛罗里达/4/2006病毒的致死性激发的体内功效。显示了在激发前一天(在第0天)用0.02mg/kg、0.1mg/kg或0.5mg/kg(多域)抗体处理的小鼠的存活曲线(左图)和体重减轻(右图)。
图14显示了MD3606和CR9114针对用B/佛罗里达/4/2006病毒的致死性激发的体内功效。显示了在激发前一天(在第0天)用0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kg(多域)抗体处理的小鼠的存活曲线(左图)和体重减轻(右图)。
图15显示了MD2407、MD3606和CR9114针对用B/佛罗里达/4/2006病毒的致死性激发的体内功效。显示了在激发前一天(在第0天)用0.02mg/kg、0.1mg/kg或0.5mg/kg(多域)抗体处理的小鼠的存活曲线(左图)和体重减轻(右图)。
图16显示了MD3606和CR9114针对用A/香港/1/1968-MA(H3N2)病毒的致死性激发的体内功效。显示了在激发前一天(在第0天)用0.6mg/kg、1.7mg/kg或5mg/kg(多域)抗体处理的小鼠的存活曲线(左图)和体重减轻(右图)。
图17显示了MD2407、MD3606和CR9114针对用A/波多黎各/8/1934-MA(H1N1)病毒的致死性激发的体内功效。显示了在激发前一天(在第0天)用0.01mg/kg、0.05mg/kg、或0.25mg/kg(多域)抗体处理的小鼠的存活曲线(左图)和体重减轻(右图)。
图18显示了MD3606和CR9114针对用A/波多黎各/8/1934-MA(H1N1)病毒的致死性激发的体内功效。显示了在激发前一天(在第0天)用0.6mg/kg、1.7mg/kg或5mg/kg(单域)抗体处理的小鼠的存活曲线(左图)和体重减轻(右图)。
定义
下面给出如本发明中使用的术语的一些定义。
如在此使用的术语“结合分子”是指根据本发明的单域抗体(单体结合分子)和多域抗体(多聚体结合分子)。
如在此使用的，单域抗体(sdAb)是由单个单体可变抗体结构域组成的结合分子，该单个单体可变抗体结构域特异性地结合独立于其他V区或结构域的抗原或表位。单域抗体是本领域已知的，并且是通常源自于天然存在的“仅重链”抗体，即不含轻链的重链抗体。这样的仅重链的抗体可以获得自骆驼科(Camelidae)物种，例如在骆驼、美洲驼、单峰骆驼、或羊驼中(也称为骆驼科(camelid)抗体)。源自于所述仅重链的抗体的可变区，通常被称为VHH结构域或单域抗体(sdAb)。如在此使用的，单域抗体还指的是来自包含两条重链和两条轻链的常规免疫球蛋白的分离的单个可变结构域(VL或VH)。该免疫球蛋白优选地是人源的，但还可以包括来自其他哺乳动物物种(包括啮齿类)的免疫球蛋白。
如在此使用的，术语“多域抗体”是指包含至少两种直接地或通过连接序列彼此连接的单域抗体的结合分子。
与A型流感病毒相关的术语“流感病毒亚型”是指由血球凝集素(H)和神经氨酸酶(N)病毒表面蛋白的各种组合表征的A型流感病毒株。A型流感病毒亚型可以由其H号表示，例如像“包括H1或H3亚型的HA的流感病毒”、或“H1流感病毒”、“H3流感病毒”，或由H号和N号的组合表示，例如像“流感病毒亚型“H3N2”或“H5N1”。术语流感病毒“亚型”具体包括这样的亚型中的所有个体流感病毒“株”，这些“株”通常是由突变引起的并且显示出不同的致病性谱，并且包括天然分离物以及人造突变体或重配体等。这些株还可以被称为病毒亚型的各种“分离物”。因此，如在此使用的，术语“株”和“分离物”可以互换使用。
这些A型流感病毒亚型可以通过参考其系统发育组进一步分类。系统发育分析表明了将流感血球凝集素细分为两个主要的组：尤其是在系统发育组1(“组1”流感病毒)中的H1、H2、H5和H9亚型，以及尤其是在系统发育组2(“组2”流感病毒)中的H3、H4、H7和H10亚型。
在B型流感病毒株中的HA的抗原变异小于在A型株中观察到的抗原变异。B型流感病毒的两种遗传性和抗原性不同的亚型或“谱系”在人体中循环，以B/山形/16/88(也称为B/山形)和B/维多利亚/2/87(B/维多利亚)谱系为代表。如在此使用的，B型流感病毒株被称为源自于“B/山形谱系”或“B/维多利亚谱系”的流感病毒株。
如在此使用的，与本发明的结合分子相关的术语“中和”是指结合分子在受试者中体外和/或体内抑制流感病毒复制的结合分子，而不论通过何种机制实现中和。因此，中和可以例如通过抑制病毒与细胞表面的附着或粘着或通过抑制病毒与细胞膜在病毒与靶细胞附着之后的融合，或通过抑制病毒从感染的细胞中出来等来实现。如在此使用的，与本发明的结合分子相关的术语“交叉中和”或“交叉中和作用”是指本发明的结合分子中和不同的A型和/或B型流感病毒亚型的能力。
关于本发明的结合分子，术语“(免疫)特异性结合”是指结合至感兴趣的蛋白质的表位的结合分子，但不实质性地识别和结合在含有抗原生物分子的混合物的样品中的其他分子。结合可以由共价或非共价相互作用或两者的组合介导。
如在此使用的，术语“流感”或“流感病毒疾病”是指由A型或B型流感病毒感染细胞或受试者而产生的病理状况。在具体的实施例中，该术语是指由A型或B型流感病毒引起的呼吸系统疾病。如在此使用的，术语“流感病毒感染”意指通过流感病毒在细胞或受试者中繁殖和/或存在的侵染。
具体实施方式
在本发明的第一方面，提供了能够特异性结合包含来自系统发育组2的两种不同亚型的HA的至少两种A型流感病毒株的血球凝集素(HA)的新颖的单域抗体(sdAb)，即sdAb能够特异性结合至少两种不同的A型流感病毒株的血球凝集素(HA)，所述病毒株包含来自系统发育组2的两种不同的HA亚型的HA。另外，提供了能够结合至少一种来自系统发育组1的A型流感病毒株的HA以及结合至少一种来自系统发育组2的A型流感病毒株的sdAb。此外，提供了能够特异性结合至少一种B型流感病毒株的HA的sdAb。以前没有对能够特异性结合来自系统发育组2的A型流感病毒株的两种不同亚型的HA，或能够结合来自系统发育组1(例如包括H1、H2和/或H5亚型的HA的流感病毒)和系统发育组2(例如包括H3、H7和/或H10亚型的HA的流感病毒)二者的A型流感病毒株的HA的单域抗体进行描述。另外，还没有对能够特异性结合B型流感病毒的HA的sdAb进行描述。
本发明的这些sdAb结合在HA中保守的中和表位。在某些实施例中，这些sdAb结合在A型或B型流感病毒的HA蛋白的茎部区中的表位。在其他实施例中，这些sdAb结合在该HA蛋白的头部区中的表位。在某些实施例中，该sdAb结合在B型流感病毒的HA蛋白的头部区中的表位。
在某些优选的实施例中，这些sdAb还能够中和至少两种包含来自系统发育组2的两种不同亚型的HA的A型流感病毒株。在某些实施例中，这些sdAb能够中和优选地至少一种来自系统发育组1的A型流感病毒株(例如像含有H1或H5亚型的HA的流感病毒)和至少一种来自系统发育组2的A型流感病毒株(例如像含有H3或H7亚型的HA的流感病毒)；或至少一种B型流感病毒株，优选地至少一种来自B/山形谱系的B型流感病毒株和至少一种来自B/维多利亚谱系的流感病毒株。
在某些实施例中，根据本发明的单域抗体是骆驼科VHH结构域，即所谓的骆驼科(仅重链)抗体的可变结构域。在另外的实施例中，该单域抗体是人源化骆驼科VHH结构域。骆驼科单域抗体的人源化需要在单个多肽链中引入和诱变有限量的氨基酸。这与scFv、Fab、(Fab)2和IgG的人源化相反，需要在两条链(轻链和重链)中引入氨基酸变化，并且保留两条链的组装。用于这些骆驼科VHH结构域的人源化的方法是本领域已知的，例如像在WO2008/020079、WO 2008/142164、WO 2010/139808中描述的。根据本发明，这些sdAb的人源化在实例11中进行了描述。
在某些实施例中，本发明的单域抗体包括：
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:227、228和229；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:230、231和232；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:233、234和235；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:236、237和238；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:239、240和241；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:242、243和244；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:245、246和247；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:248、249和250；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:251、252和253；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:254、255和256；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:257、258和259；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:260、261和262；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:263、264和265；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:266、267和268；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:269、270和271；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:272、273和274；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:275、276和277；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:278、279和280；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:281、282和283；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:284、285和286；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:287、288和289；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:290、291和292；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:293、122和123；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:124、125和126；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:127、128和129；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:130、131和132；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:133、134和135；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:136、137和138；或
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:139、140和141。
如在此使用的，术语“互补决定区”(CDR)意指结合分子的可变区内的序列，其通常在很大程度上贡献与在抗原上识别的表位在形状和电荷分布上是互补的抗原结合位点。CDR区域可以针对存在于处于其天然构象中的蛋白质上，或者在某些情况下，存在于变性的蛋白质上(例如通过溶解在SDS中)的蛋白质或蛋白质片段的线性表位、不连续表位、或构象表位是特异性的。
在某些实施例中，该单域抗体选自下组，该组由以下各项组成：
a)单域抗体，包含SEQ ID NO:227的CDR1区、SEQ ID NO:228的CDR2区、和SEQ IDNO:229的CDR3区；
b)单域抗体，包含SEQ ID NO:230的CDR1区、SEQ ID NO:231的CDR2区、和SEQ IDNO:232的CDR3区；
c)单域抗体，包含SEQ ID NO:233的CDR1区、SEQ ID NO:234的CDR2区、和SEQ IDNO:235的CDR3区；
d)单域抗体，包含SEQ ID NO:236的CDR1区、SEQ ID NO:237的CDR2区、和SEQ IDNO:238的CDR3区；
e)单域抗体，包含SEQ ID NO:239的CDR1区、SEQ ID NO:240的CDR2区、和SEQ IDNO:241的CDR3区；
f)单域抗体，包含SEQ ID NO:242的CDR1区、SEQ ID NO:243的CDR2区、和SEQ IDNO:244的CDR3区；
g)单域抗体，包含SEQ ID NO:245的CDR1区、SEQ ID NO:245的CDR2区、和SEQ IDNO:247的CDR3区；
h)单域抗体，包含SEQ ID NO:248的CDR1区、SEQ ID NO:249的CDR2区、和SEQ IDNO:250的CDR3区；
i)单域抗体，包含SEQ ID NO:251的CDR1区、SEQ ID NO:252的CDR2区、和SEQ IDNO:253的CDR3区；
j)单域抗体，包含SEQ ID NO:254的CDR1区、SEQ ID NO:255的CDR2区、和SEQ IDNO:256的CDR3区；
k)单域抗体，包含SEQ ID NO:257的CDR1区、SEQ ID NO:258的CDR2区、和SEQ IDNO:259的CDR3区；
l)单域抗体，包含SEQ ID NO:260的CDR1区、SEQ ID NO:261的CDR2区、和SEQ IDNO:262的CDR3区；
m)单域抗体，包含SEQ ID NO:263的CDR1区、SEQ ID NO:264的CDR2区、和SEQ IDNO:265的CDR3区；
n)单域抗体，包含SEQ ID NO:266的CDR1区、SEQ ID NO:267的CDR2区、和SEQ IDNO:268的CDR3区；
o)单域抗体，包含SEQ ID NO:269的CDR1区、SEQ ID NO:270的CDR2区、和SEQ IDNO:271的CDR3区；
p)单域抗体，包含SEQ ID NO:272的CDR1区、SEQ ID NO:273的CDR2区、和SEQ IDNO:274的CDR3区；
q)单域抗体，包含SEQ ID NO:275的CDR1区、SEQ ID NO:276的CDR2区、和SEQ IDNO:277的CDR3区；
r)单域抗体，包含SEQ ID NO:278的CDR1区、SEQ ID NO:279的CDR2区、和SEQ IDNO:280的CDR3区；
s)单域抗体，包含SEQ ID NO:281的CDR1区、SEQ ID NO:282的CDR2区、和SEQ IDNO:283的CDR3区；
t)单域抗体，包含SEQ ID NO:284的CDR1区、SEQ ID NO:285的CDR2区、和SEQ IDNO:286的CDR3区；
u)单域抗体，包含SEQ ID NO:287的CDR1区、SEQ ID NO:288的CDR2区、和SEQ IDNO:289的CDR3区；
v)单域抗体，包含SEQ ID NO:290的CDR1区、SEQ ID NO:291的CDR2区、和SEQ IDNO:292的CDR3区；
w)单域抗体，包含SEQ ID NO:293的CDR1区、SEQ ID NO:122的CDR2区、和SEQ IDNO:123的CDR3区；
x)单域抗体，包含SEQ ID NO:124的CDR1区、SEQ ID NO:125的CDR2区、和SEQ IDNO:126的CDR3区；
y)单域抗体，包含SEQ ID NO:127的CDR1区、SEQ ID NO:128的CDR2区、和SEQ IDNO:129的CDR3区；
z)单域抗体，包含SEQ ID NO:130的CDR1区、SEQ ID NO:131的CDR2区、和SEQ IDNO:132的CDR3区；
aa)单域抗体，包含SEQ ID NO:133的CDR1区、SEQ ID NO:134的CDR2区、和SEQ IDNO:135的CDR3区；
bb)单域抗体，包含SEQ ID NO:136的CDR1区、SEQ ID NO:137的CDR2区、和SEQ IDNO:138的CDR3区；以及
cc)单域抗体，包含SEQ ID NO:139的CDR1区、SEQ ID NO:140的CDR2区、和SEQ IDNO:141的CDR3区。
在某些优选的实施例中，该单域抗体选自下组，该组由以下各项组成：
a)单域抗体，包含SEQ ID NO:275的CDR1区、SEQ ID NO:276的CDR2区、和SEQ IDNO:277的CDR3区；
b)单域抗体，包含SEQ ID NO:284的CDR1区、SEQ ID NO:285的CDR2区、和SEQ IDNO:286的CDR3区；
c)单域抗体，包含SEQ ID NO:124的CDR1区、SEQ ID NO:125的CDR2区、和SEQ IDNO:126的CDR3区；
d)单域抗体，包含SEQ ID NO:127的CDR1区、SEQ ID NO:128的CDR2区、和SEQ IDNO:129的CDR3区；
e)单域抗体，包含SEQ ID NO:263的CDR1区、SEQ ID NO:264的CDR2区、和SEQ IDNO:265的CDR3区；以及
f)单域抗体，包含SEQ ID NO:133的CDR1区、SEQ ID NO:134的CDR2区、和SEQ IDNO:135的CDR3区。
根据另外的实施例，根据本发明的单域抗体包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:1-29，或同源氨基酸序列。如在此使用的，本发明的同源氨基酸序列可以包括一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代，这些添加、缺失或取代没有实质性地改变本发明的结合分子的功能特征。在同源序列表示序列一致性的情况下，它表示呈现与亲本序列高度序列一致性(大于70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％序列一致性)的序列。
在某些实施例中，在此描述的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸可以是突变的，即被另一种氨基酸取代。可以引入此类突变以防止翻译后修饰的发生。最普遍的修饰包括蛋白质水解、糖基化作用、甲硫氨酸的氧化、以及天冬酰胺和谷氨酰胺残基的脱酰胺化。其他修饰包括焦谷氨酸形成、天冬氨酸异构化和色氨酸氧化。以下氨基酸残基和序列基序易受翻译后修饰的影响，并且可以因此通过以下定点诱变而改变：N-末端谷氨酸或谷氨酰胺、N-糖基化基序Asn-Xxx-Ser/Thr、溶剂暴露的甲硫氨酸或色氨酸残基、蛋白质水解切割位点Asp-Pro、脱酰胺作用基序Asn-Gly和Gln-Gly、和/或Asp异构化基序Asp-Gly。
在某些实施例中，本发明的sdAb是人源化的。因此，在某些实施例中，这些sdAb包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:146-226和340。
在某些实施例中，根据本发明的单域抗体包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:13或其人源化变体，该人源化变体选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:177-187和SEQ ID NO:340；SEQ ID NO:17或其人源化变体，该人源化变体选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:146-156；SEQ ID NO:20或其人源化变体，该人源化变体选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:157-176；SEQ ID NO:24或其人源化变体，该人源化变体选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:188-197；SEQ ID NO:25或其人源化变体，该人源化变体选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:198-203；以及SEQID NO:27或其人源化变体，该人源化变体选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:204-226。
在某些实施例中，该单域抗体包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:340、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:197、SEQ IDNO:203、和SEQ ID NO:221。
根据本发明的第二方面，提供了所谓的多域抗体，即包含如上所述的至少两个单域抗体的结合分子。例如，第一个单域抗体的C-末端可以连接至下一个单域抗体的N-末端以形成二聚体结合分子。在某些实施例中，这些多域抗体包括至少三个、至少四个、或至少五个如上所述的单域抗体以形成多聚体，例如三聚体、四聚体、五聚体等。这些连接的sdAb可以是相同或可以是不同的sdAb，即具有不同的氨基酸序列和表位特异性的sdAb。
在某些实施例中，这些多域抗体是单链分子。在某些实施例中，这些多域抗体是双链分子，即包括至少两条链，每一条链包含至少一个单域抗体。这两条链可以是相同的或可以是不同的。
使用本领域已知的任何方法，可以将这些单域抗体连接以形成在此披露的任何多域抗体。因此，这些单域抗体可以通过化学键连接，或者可以直接地或通过短的多肽接头连接在一起。这样的接头序列可以是天然存在的序列或非天然存在的序列。该接头序列优选为多域抗体提供足够的灵活性，并且同时对蛋白质水解是耐受的。
在某些实施例中，该至少两个单域抗体经由肽接头进行遗传融合。因此，通过形成编码完整多肽构建体的多核苷酸构建体(或核酸序列)，这些单域抗体在DNA水平上进行遗传融合，即该结合分子包含两个或更多个单域抗体。
在某些实施例中，该至少两个单域抗体通过含有从1至100个氨基酸，优选地从1至80个氨基酸、或从1至60个氨基酸、或从10至60个氨基酸的连接序列进行连接。接头的实例包括但不限于在表15中的连接序列。因此，在某些实施例中，该连接序列包含选自SEQ IDNO:142-145的氨基酸序列。
在某些实施例中，根据本发明的这些多域抗体包含至少两个sdAb。该至少两个sdAb可以选自表14和/或表40。在某些实施例中，该至少两个sdAb选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:1-29和SEQ ID NO:146-226。该至少两个sdAb可以是相同的(同源多聚体)或可以是不同的(异源多聚体)。
在某些实施例中，这些多域抗体包含至少两个，优选地至少三个，更优选地至少四个sdAb，该sdAb选自下组，该组由以下各项组成：
a)单域抗体，其包含SEQ ID NO:275的CDR1区、SEQ ID NO:276的CDR2区、和SEQ IDNO:277的CDR3区；
b)单域抗体，其包含SEQ ID NO:284的CDR1区、SEQ ID NO:285的CDR2区、和SEQ IDNO:286的CDR3区；
c)单域抗体，其包含SEQ ID NO:124的CDR1区、SEQ ID NO:125的CDR2区、和SEQ IDNO:126的CDR3区；
d)单域抗体，其包含SEQ ID NO:127的CDR1区、SEQ ID NO:128的CDR2区、和SEQ IDNO:129的CDR3区；
e)单域抗体，其包含SEQ ID NO:263的CDR1区、SEQ ID NO:264的CDR2区、和SEQ IDNO:265的CDR3区；以及
f)单域抗体，其包含SEQ ID NO:133的CDR1区、SEQ ID NO:134的CDR2区、和SEQ IDNO:135的CDR3区。
在某些实施例中，根据本发明的这些多域抗体包含至少两个，优选地至少三个，更优选地至少四个sdAb，这些sdAb选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:13，或其人源化变体，该人源化变体选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:177-187和SEQ ID NO:340；SEQ ID NO:17或其人源化变体，该人源化变体选自下组，该组由以下各项组成：SEQ IDNO:146-156；SEQ ID NO:20或其人源化变体，该人源化变体选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:157-176；SEQ ID NO:24或其人源化变体，该人源化变体选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:188-177；SEQ ID NO:25或其人源化变体，该人源化变体选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:198-203；以及SEQ ID NO:27或其人源化变体，该人源化变体选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:204-226。
在某些实施例中，根据本发明的这些多域抗体包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:30-73。
在某些实施例中，本发明的这些多域抗体能够中和至少一种来自系统发育组1的A型流感病毒株(例如像含有H1和/或H5亚型的HA的流感病毒)和至少一种来自系统发育组2的A型流感病毒株(例如像含有H3和/或H7亚型的HA的流感病毒)。在某些实施例中，本发明的这些多域抗体能够中和至少一种来自系统发育组1的A型流感病毒株(例如像含有H1和/或H5亚型的HA的流感病毒)和至少一种来自系统发育组2的A型流感病毒株(例如像含有H3和/或H7亚型的HA的流感病毒)，以及至少一种B型流感病毒株，优选地至少一种B/山形谱系的B型流感病毒株和至少一种B/维多利亚谱系的流感病毒株。
在某些实施例中，这些多域抗体能够中和含有H1亚型的HA的流感病毒(例如H1N1流感病毒株)、含有H3亚型的HA的流感病毒(例如H3N2流感病毒株)、含有H5亚型的HA的流感病毒(例如H5N1流感病毒株)、含有H7亚型的HA的流感病毒(例如H7N9流感病毒株)，以及至少一种B型流感病毒，优选地至少一种来自B/山形谱系的B型流感病毒株和至少一种来自B/维多利亚谱系的流感病毒株。
本发明的这些多域抗体因此可以合适地用于预防和/或治疗流感感染，甚至不考虑致病流感亚型。
根据本发明，已经显示本发明的交叉中和的多域抗体提供相对于其他小的和大的抗流感分子的若干优点。因此，多域抗体的亲和力、效力、以及中和的广度优于所公布的广泛中和靶向流感HA的Ab(bnAb)，如例如，CR9114(WO 2013/007770)和FI6v3(Corti等人，2011)的亲和力、效力、以及中和的广度。另外，通过靶向多个独立中和的表位的这些多域抗体相比CR9114和FI6v3更不易于抗药性流感株的开发。
如在此所述的，本发明因此提供了新颖的流感结合分子和交叉中和的结合分子。这些结合分子可以是单体的(即单域抗体)或多聚体的(即多域抗体)。本发明的这些结合分子以高亲和力和特异性结合它们的靶标。这与小分子药物(如抗病毒药物)形成对比，这些药物经常显示脱靶结合，导致不希望的副作用。另外，本发明的这些结合分子结合多种HA表位，其中一些是常规抗体达不到的。流感HA含有在头部和茎部区的多个糖基化位点。附着于这些位点的碳水化合物使得HA分子上的一些部分是常规抗体达不到的。本发明的较小结合分子仍然能够靶向这些潜在的功能上重要的表位。另外，本发明的这些结合分子在广泛的极端条件下是稳定的。它们通常对高温(高达100℃)、极端pH、变性剂、和蛋白质水解是耐受的。这些结合分子的有利稳定性可以产生可以在冷链外保存并且比其他蛋白质药物(如单克隆抗体)具有更长的保存期限的产物。此外，本发明的结合分子全部都是可以在一个单一过程之后产生和纯化的单一蛋白质。
典型地，根据本发明的结合分子结合组1的A型流感病毒(例如H1N1)、和/或组2的A型流感病毒(例如H3N2)、和/或B型流感病毒的HA、和/或其片段，其中亲和力常数(Kd-值)低于1.0x 10-6M、1.0x 10-7M、优选地低于1.0x 10-8M、更优选地低于1.0x 10-9M。可以例如使用表面等离子体共振，例如使用BIACORE系统(瑞典乌普萨拉市法玛西亚生物传感器AB公司(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden))，或如在实例8中所述的测量亲和力常数。
在某些实施例中，这些结合分子展示出针对A型和/或B型流感病毒的中和活性。在某些实施例中，相对于在不存在所述结合分子的情况下通过A型或B型流感病毒对宿主细胞的感染，本发明的结合分子防止A型或B型流感病毒感染宿主细胞至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％、或至少10％。可以例如如本文所述的测量中和活性。测量中和活性的替代性试验描述于例如WHO Manual on Animal InfluenzaDiagnosis and Surveillance,Geneva:World Health Organisation,2005,version2002.5[关于动物流感诊断和监视的WHO手册，日内瓦：世界卫生组织，2005，2002.5版本]中。典型地，如在体外病毒中和测定(VNA)中确定的，例如在实例中所述，根据本发明的结合分子具有1000nM或更少，优选地100nM或更少，更优选地10nM或更少，甚至更优选地1nM或更少的中和活性。
在某些实施例中，这些结合分子(即，单域抗体或多域抗体)进一步包括Fc尾部。因此，在某些实施例中，将如上所述的这些结合分子连接至抗体(优选地人抗体)的Fc片段，例如人IgG抗体的Fc片段，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgG4。根据本发明，如在此所述的单体或多聚体结合分子可以直接地或使用接头与Fc片段进行遗传融合。在某些实施例中，通过包含从1至100个氨基酸，优选地从1至80个氨基酸，或从1至60个氨基酸，或从10至60个氨基酸的连接序列将这些结合分子连接至Fc片段。接头的实例包括但不限于在表15中的连接序列。因此，在某些实施例中，该连接序列包含选自SEQ ID NO:142-145的氨基酸序列。在某些实施例中，将sdAb或多域抗体遗传融合至Fc片段的C-末端。在另外的实施例中，将单域抗体或多域抗体融合至Fc片段的N-末端和C-末端。
在某些实施例中，该Fc片段被工程改造成具有最小的效应子功能。在本领域中已描述了具有最小的效应子功能和保守的半衰期的Fc片段，并且包括例如IgG2、未糖基化的IgG1(IgG1agly)、具有S228P/L234A/L235A取代的IgG4(IgG4ProAlaAla)、具有H268Q/309L/A330S/P331S改变的IgG2(IgG2m4)以及含有V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S取代的IgG2的Fc变体(被命名为IgG2σ)。关于IgG4的突变形式，针对FcγR的特异性亲和力已经通过L234A/L245A取代被消除。
在某些实施例中，该Fc片段被工程改造成具有增强的效应子功能。本发明的结合分子因此可以被工程改造以增强Fc-介导的效应子功能，其在流感感染的临床前模型中已显示有助于药物效力。本领域中已经描述了与增强的效应子功能相关的人IgG1的CH2结构域中的若干个突变。这些突变包括但不限于在位置333处的丙氨酸突变(其增加ADCC和CDC二者)、三突变体(S239D/I332E/A330L)(对FcγRIIIa具有较高亲和力且对FcγRIIb具有较低亲和力，导致增强的ADCC)、以及另一个三突变体(S239D/I332E/G236A)(具有改进的FcγRIIIa亲和力和介导增强的吞噬作用的FcγRIIa/FcγRIIb比率)。影响效应子功能性的其他Fc突变已经描述在文献(例如Strohl，2009)中。在某些实施例中，该Fc片段被工程改造以具有延长的血清半衰期。具有增加的血清半衰期的若干个工程改造的Fc主链在本领域中是已知的。这些Fc变体包括但不限于具有M252Y/S254T/T256E(YTE)突变的hIgG1Fc、携带T250Q/M428L突变(QL)的hIgG1或hIgG2Fc、具有N434A突变的hIgG1Fc、具有T307A/E380A/N434A突变(AAA)的hIgG1Fc或具有M428L/N434S(LS)取代的hIgG1Fc(Kuo等人，2011)。在另外的实施例中，将这些结合分子(即，根据本发明的单域抗体或多域抗体)遗传融合至人血清白蛋白或结合血清白蛋白的单域抗体上。在其他实施例中，根据本发明的这些单域抗体或多域抗体化学共轭至PEG。因此，本发明的这些结合分子可以被工程改造以具有从例如仅几个小时至若干个周或甚至几个月的血清半衰期范围。这开启了流感感染的单剂量治疗的可能性，而不是像目前使用的神经氨酸酶抑制剂(如奥司他韦和扎那米韦)的2x每日方案。
在另外的实施例中，如上所述的单域抗体或多域抗体可以融合至Fc尾部，优选地是被工程改造以促进异二聚体Fc分子形成的Fc尾部。已经在本领域描述了突变促进Fc-异源二聚体化(Klein等人，2012)。在某些实施例中，如在EP 0812357B1和EP 0979281B1中所述，促进FC-异源二聚体化的突变是突出物入洞(knob-into-holes)突变。
在某些实施例中，根据本发明的多域抗体包括至少一条链，该链含有选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:74-107、SEQ ID NO:110-121、和SEQ ID NO:293-339。
在某些实施例中，这些多域抗体包括两条链，其中这两条链的氨基酸序列是相同的。在某些实施例中，这两条链包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ IDNO:74-105和SEQ ID NO:293-298。在某些实施例中，这两条氨基酸链包括SEQ ID NO:293-298的氨基酸序列。
在某些实施例中，这些多域抗体包括两条不同的氨基酸链。在某些实施例中，这两条不同的氨基酸链选自下组，该组由以下各项组成：
包括SEQ ID NO:299的氨基酸序列的一条链和包括SEQ ID NO:300的氨基酸序列的一条链；
包括SEQ ID NO:301的氨基酸序列的一条链和包括SEQ ID NO:302的氨基酸序列的一条链；
包括SEQ ID NO:303的氨基酸序列的一条链和包括SEQ ID NO:305的氨基酸序列的一条链；
包括SEQ ID NO:306的氨基酸序列的一条链和包括SEQ ID NO:307的氨基酸序列的一条链；
包括SEQ ID NO:308的氨基酸序列的一条链和包括SEQ ID NO:309的氨基酸序列的一条链；
包括SEQ ID NO:310的氨基酸序列的一条链和包括SEQ ID NO:311的氨基酸序列的一条链；
包括SEQ ID NO:312的氨基酸序列的一条链和包括SEQ ID NO:313的氨基酸序列的一条链；
包括SEQ ID NO:315的氨基酸序列的一条链和包括SEQ ID NO:315的氨基酸序列的一条链；
包括SEQ ID NO:316的氨基酸序列的一条链和包括SEQ ID NO:317的氨基酸序列的一条链；
包括SEQ ID NO:318的氨基酸序列的一条链和包括SEQ ID NO:319的氨基酸序列的一条链；
包括SEQ ID NO:106的氨基酸序列的一条链和包括SEQ ID NO:317的氨基酸序列的一条链；
包括SEQ ID NO:320的氨基酸序列的一条链和包括SEQ ID NO:321的氨基酸序列的一条链；
包括SEQ ID NO:322的氨基酸序列的一条链和包括SEQ ID NO:323的氨基酸序列的一条链；
包括SEQ ID NO:324的氨基酸序列的一条链和包括SEQ ID NO:325的氨基酸序列的一条链；
包括SEQ ID NO:326的氨基酸序列的一条链和包括SEQ ID NO:327的氨基酸序列的一条链；
包括SEQ ID NO:328的氨基酸序列的一条链和包括SEQ ID NO:329的氨基酸序列的一条链；
包括SEQ ID NO:330的氨基酸序列的一条链和包括SEQ ID NO:331的氨基酸序列的一条链；
包括SEQ ID NO:332的氨基酸序列的一条链和包括SEQ ID NO:333的氨基酸序列的一条链；
包括SEQ ID NO:334的氨基酸序列的一条链和包括SEQ ID NO:335的氨基酸序列的一条链；
包括SEQ ID NO:336的氨基酸序列的一条链和包括SEQ ID NO:337的氨基酸序列的一条链；以及
包括SEQ ID NO:338的氨基酸序列的一条链和包括SEQ ID NO:339的氨基酸序列的一条链。
在某些实施例中，这两条不同的氨基酸链选自下组，该组由以下各项组成：
包括SEQ ID NO:301的氨基酸序列的一条链和包括SEQ ID NO:302的氨基酸序列的一条链；
包括SEQ ID NO:310的氨基酸序列的一条链和包括SEQ ID NO:311的氨基酸序列的一条链；
包括SEQ ID NO:322的氨基酸序列的一条链和包括SEQ ID NO:323的氨基酸序列的一条链；以及
包括SEQ ID NO:330的氨基酸序列的一条链和包括SEQ ID NO:331的氨基酸序列的一条链。
在又另一个方面，本发明进一步提供了编码如上所述的单域抗体或多域抗体的核酸分子(也称为核酸序列)。优选地，这些核酸序列编码含有如上所述的一个或多个CDR区的结合分子。
在某些实施例中，这些核酸序列编码单域抗体，该单域抗体包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:1-29，或同源的氨基酸序列。
在某些实施例中，这些核酸序列编码单域抗体，该单域抗体包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:146-226和SEQ ID NO:340，或同源的氨基酸序列。
在某些实施例中，这些核酸序列编码多域抗体，该多域抗体包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:30-107、SEQ ID NO:110-121和SEQ ID NO:293-339，或同源的氨基酸序列。
根据本发明的核酸序列是指核苷酸的聚合体形式，并且包括上述的RNA、mRNA、cDNA、基因组DNA和合成形式、以及混合的聚合物。核苷酸是指核糖核苷酸、脱氧核苷酸、或核苷酸的两种类型中任一者的经修饰的形式。该术语还包括DNA的单链和双链形式。熟练的技术人员应理解，这些核酸分子的功能变体也旨在是本发明的一部分。功能变体是可以使用标准遗传密码来直接翻译以提供一种与翻译自母体核酸分子的氨基酸序列相同的氨基酸序列的核酸序列。
在优选的实施例中，将编码根据本发明的结合分子的核酸分子是密码子优化用于在酵母细胞或哺乳动物细胞(例如人细胞)中表达。密码子优化的方法已知并且已经在先前描述(例如WO 96/09378)。如与一个野生型序列相比，如果至少一个非优选密码子被更优选的密码子置换，那么认为一个序列是密码子优化的。在此，一个非优选密码子是在一种生物体中不如另一个编码相同氨基酸的密码子经常地使用的一个密码子，并且一个更优选的密码子是在一种生物体中比一个非优选密码子更经常地使用的一个密码子。对于特定生物体的密码子使用的频率可见于密码子频率表，如在http://www.kazusa.or.jp/codon中。优选地多于一个非优选密码子，优选地最多的或所有非优选密码子，被更优选的密码子置换。优选地，在一种生物体中最经常使用的密码子用于一种密码子优化的序列。被优选的密码子置换一般引起更高表达。
本领域技术人员还将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的核酸分子可以编码相同的多肽。还应当理解，普通技术人员可以使用常规技术制造不影响由核酸分子编码的氨基酸序列的核苷酸取代，以反映将表达多肽的任何具体宿主生物体的密码子使用。因此，除非另外说明，否则“编码氨基酸序列的核酸序列”包括彼此呈简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。核酸序列可以使用常规的分子生物学技术克隆，或通过DNA合成重新产生，这可以通过在DNA合成和/或分子克隆领域具有业务的服务公司(例如基因艺术公司(GeneArt)、金斯瑞公司(GenScript)、生命科技公司(Life Technologies)、欧陆公司(Eurofins))使用常规程序执行。
本发明还提供了含有如上所述的至少一种核酸序列的载体。术语“载体”是指其中可以插入第二核酸分子用于引入宿主细胞中并在该宿主细胞中复制，并且在某些情况下表达的核酸分子。换言之，载体能够转运与其连接的核酸分子。通过如在此使用的术语“载体”考虑克隆载体以及表达载体。某些载体能够在其被引入的宿主中自主复制(例如，具有细菌复制起点的载体可以在细菌中复制)。其他载体可以在引入到宿主细胞后被整合到宿主细胞的基因组中，并且从而随着宿主基因组一起复制。通过本领域技术人员熟知的方法可以轻易地制备根据本发明的载体。
在某些实施例中，提供了根据本发明的一种或多种核酸分子，该核酸分子可操作地连接至一种或多种表达调节核酸序列。如在此使用的术语“表达调节核酸序列”是指在特定宿主生物体中需要和/或影响可操作地连接的编码序列的表达的核酸序列。这些表达调节核酸序列，例如尤其适合的转录起始、终止、启动子、增强子序列；抑制子或激活子序列；有效的RNA加工信号例如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(例如，核糖体结合位点)；增强蛋白质稳定性的序列；并且当需要时，增强蛋白质分泌的序列可以是在选择的宿主生物体中显示活性的任何核酸序列，并且可以源自于编码与宿主生物体同源或异源的蛋白质的基因。表达调节序列的鉴定和使用对于本领域技术人员是常规的。根据本发明适合的载体是，例如腺病毒载体，例如像Ad26或Ad35、腺病毒相关的载体(AAV)、慢病毒、甲病毒、副粘病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、反转录病毒载体等。
在某些实施例中，使用用于基因治疗目的的载体，如例如由Adam等人(2014)、Johnson等人(2009)、以及Suscovich和Alter(2015)所描述的。
本发明进一步提供了包括如在此所述的编码单域抗体或多域抗体的核酸序列的宿主细胞。如在此使用的“宿主细胞”是指其中已经引入了载体(如克隆载体或表达载体)的细胞。这些宿主细胞可以是原核的或真核的。
本发明进一步提供了包括如上所述的一种或多种单域抗体、多域抗体、核酸分子和/或载体的药物组合物。本发明的这些药物组合物可以进一步包括至少一种药学上可接受的赋形剂。“药学上可接受的赋形剂”意指与活性分子(例如根据本发明的结合分子)组合用于制备合适的组合物的任何惰性物质。药学上可接受的赋形剂是一种在所用剂量和浓度下对接受者无毒并且与配制品的其他成分相容的赋形剂。药学上可接受的赋形剂广泛适用并且在本领域中是已知的。根据本发明的药物组合物可以进一步包括至少一种其他的治疗剂、预防剂和/或诊断剂。所述另外的治疗剂和/或预防剂可以是例如还能够预防和/或治疗流感病毒感染的试剂，例如像M2抑制剂(例如，金刚胺、金刚烷乙胺)和/或神经氨酸酶抑制剂(例如，扎那米韦、奥司他韦)。这些可以与本发明的结合分子组合使用。本文中的“组合”意指作为单独的配制品或作为单一组合的配制品同时地进行，或作为单独配制品以任何顺序按照顺序给予方案进行。
在另外的方面，本发明提供了如在此所述的单域抗体、多域抗体、核酸分子和/或载体，用于在流感感染的诊断、预防和/或治疗中使用。此外，本发明提供了如在此所述的单域抗体、多域抗体、核酸分子和/或载体在制造用于诊断、预防和/或治疗流感感染的药物中的用途。此类感染可以发生在小群体中，但还可以在季节性流行病中，或更严重地在数百万个体处于风险中的全球大流行病中传播到世界各地。本发明提供可以中和引起此类季节性流行病以及潜在的大流行病的流感株感染的结合分子。重要的是，现在可以使用本发明的结合分子来设想保护和治疗，而不考虑致病性流感病毒，因为已经披露了本发明的结合分子能够交叉中和系统发育组1(涵盖例如，H1、H2、H5、H6、H8、H9和H11亚型)和系统发育组2(涵盖例如H3、H4、H7和H10亚型)二者的各种流感亚型，以及B型流感亚型。
本发明进一步提供了用于在受试者中预防和/或治疗流感的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予如在此所述的治疗有效量的单域抗体、多域抗体、核酸分子和/或载体。术语“治疗有效量”是指如在此定义的结合分子或核酸分子用于预防、改善和/或治疗由流感病毒感染引起的病症有效的量。如在此使用的，改善可以是指减少流感感染的可见或可察觉的疾病症状、病毒血症、或任何其他可测量的表现形式。预防涵盖抑制或减少流感病毒的传播，或抑制或减少一种或多种症状的发作、发展或进展。
预防和/或治疗可以靶向易受流感感染影响的患者群组。这样的患者群组包括但不限于例如老年人(例如≥50岁、≥60岁并且优选地≥65岁)、年幼者(例如≤5岁、≤1岁)、住院的患者、以及已经用抗病毒化合物进行治疗但已经显示出不充分抗病毒应答的已被感染的患者。
可以调节剂量方案以提供最佳的期望反应(例如，治疗反应)。适合的剂量范围可以是例如0.01-100mg/kg体重、优选地0.1-50mg/kg体重、优选地0.01-15mg/kg体重。此外，例如，可以给予单次推注，可以随着时间给予若干次剂量，或者可以根据需要按比例减少或增加剂量。
根据本发明的结合分子、核酸分子和/或载体，可以例如静脉内、鼻内、经口吸入、肺、皮下、皮内、玻璃体内、口服、肌内等给予至受试者。最佳的给予途径将受多种因素的影响，这些因素包括活性分子的物理化学性质、临床表现的紧急性、以及活性分子的血浆浓度与所希望的治疗效果之间的关系。
本发明的结合分子的高稳定性开启了替代性、无针递送的可能性，例如通过使用鼻滴或鼻喷雾剂或使用喷雾器或干粉吸入器经吸入进行鼻内给予。在某些实施例中，编码至少一种根据本发明的单域抗体或多域抗体的核酸分子或载体因此是鼻内给予的，如例如由Limberis等人(2013)所述的。
与常规抗体和许多其他生物制药不同，本发明的结合分子可以在微生物系统中非常有效地生产。在大规模制造中使用的微生物宿主细胞的实例是例如酵母(巴斯德毕赤酵母(P.pastoris))和大肠杆菌(E.coli)。这些微生物系统被认为是生物制药制造中最具成本效益的选择。低COG是在流感预防和治疗中广泛使用抗流感药物的先决条件。在某些实施例中，本发明因此提供用于产生根据本发明的结合分子(即，单域抗体或多域抗体)的方法，该方法包括在有助于该结合分子表达的条件下培养如本文所述的宿主细胞，并且任选地回收该表达的结合分子。从培养基中回收这些结合分子的方法是本领域技术人员熟知的。
在某些实施例中，这些宿主细胞是微生物细胞，例如但不限于酵母细胞或大肠杆菌。
在另外的实施例中，这些宿主细胞是哺乳动物细胞，例如但不限于CHO细胞、HEK细胞或PER.C6细胞。
本发明进一步涉及检测样品中流感病毒的方法，其中该方法包括以下步骤：a)使所述样品与诊断有效量的根据本发明的结合分子接触，以及b)确定结合分子是否特异性结合样品中的分子。该样品可以是生物样品，该生物样品包括但不限于来自(潜在地)被感染的受试者的血液、血清、组织或其他生物材料。(潜在地)被感染的受试者可以是人类受试者，但是也可以使用本发明的结合分子对被怀疑是流感病毒携带者的动物测试流感病毒的存在。优选地，在允许可能存在于样品中的结合分子和流感病毒或其抗原组分之间形成免疫复合物的条件下使本发明的结合分子与样品接触。然后通过适合的方法来检测和测量指示样品中流感病毒的存在的免疫复合物的形成(如果有的话)。这样的方法尤其包括均质和异质结合免疫测定，如放射免疫测定(RIA)、ELISA、免疫荧光、免疫组织化学、FACS、BIACORE以及蛋白质印迹分析。在以下非限制性实例中进一步阐明了本发明。
实例
实例1：免疫
为了诱导重链抗体依赖性免疫应答，根据在表1中所描述的方案，在弗氏佐剂(Freund's adjuvant)的存在下，使用流感病毒抗原(商业疫苗和重组蛋白质)对四头美洲驼(大羊驼(Lama glama))进行免疫。
表1：美洲驼免疫方案。
在第2次、第3次、第4次和第5次免疫(表1)后的指定时间点，在柠檬酸盐抗凝血样品管中通过静脉穿刺从美洲驼中收集外周血。
通过比较在免疫之前(第0天)收集的样品与给予抗原之后(第28天和第112天)收集的血清样品在HA ELISA中的抗原特异性血清滴度来分析每只动物的同源和异源免疫应答。为此，在Maxisorp 96孔微量滴定板中捕获重组HA蛋白。阻断后，添加连续稀释的血清样品，并且通过添加山羊抗美洲驼IgG-HRP来检测结合的美洲驼IgG。结果显示在图1中。这些数据显示所有免疫的动物产生针对HA的良好的同源和异源的免疫应答。
实例2：噬菌体文库构建
根据制造商的说明书，使用Ficoll-Paque plus(GE医疗集团(GE Healthcare))，从新鲜血液中分离外周血单核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC)。从PBMC中提取的总RNA充当用于RT-PCR的起始材料，以扩增编码基因片段的VHH。将这些片段经由SfiI和NotI限制性位点克隆进M13噬菌粒载体pDV-LucStuffer(pDV-C06来源的；如在WO 02/103012中描述的)中以产生VHH结构域与M13噬菌体的pIII蛋白质的融合(包括两种蛋白质之间的AMBER终止密码子)。将连接的载体转化到TG-1细菌(安捷伦公司(Agilent))中，并且经由PCR分析100-150个单菌落以确定每个文库的质量。插入的频率和完整性通常大于95％。构建的文库的特征显示在表2中。通过使用基本上如(WO 02/103012)所述的CT辅助噬菌体制备来自各个动物的噬菌体文库，将其进行无菌过滤，并用于选择。如本文所示，可以从所有免疫的美洲驼中产生复杂的噬菌体文库。
表2：VHH噬菌体文库的特征。
实例3：针对流感HA的单域抗体的选择
使用以上描述的VHH噬菌体展示文库、和基本上如在美国专利号6,265,150中、在WO 98/15833中、以及在T.Kuhlman(2001)的“Phage display,A Laboratory Manual[噬菌体展示：实验室手册]”中(将这些文献通过引用并入本文)所述的一般噬菌体展示技术和技术来选择抗体片段。此外，在本发明中使用如在WO 02/103012(将其通过引用并入本文)中所述的方法和辅助噬菌体。
使用A型流感(H1A/加利福尼亚/07/2009、H1A/新喀里多尼亚/20/1999、H2A/日本/305/1957、H3A/布里斯班/10/2007、H7A/荷兰/219/2003)和/或B型流感(维多利亚分枝B/布里斯班/60/2008、山形分枝B/佛罗里达/04/2006)的血球凝集素(HA)作为靶蛋白进行特异性结合蛋白的选择。靶蛋白来源是昆虫细胞产生的重组蛋白(美国康涅狄格州蛋白质科学公司(Protein Sciences,Connecticut,USA))或在流感感染并且固定(3％低聚甲醛)的MDCK细胞表面上表达的HA。使用各种选择条件并将其总结在表3中。“SD”是指单域抗体。如果没有另外提及，否则在pH 7.4下、且用5μg/ml HA蛋白进行选择。CR8033和CR8071是结合至B型流感HA的头部和颈部的单克隆抗体(IgG)(Dreyfus等人，2012)。
表3：噬菌体展示选择条件
对于第一轮选择，将免疫管用HA(5.0μg/mL，在PBS中稀释)包被过夜，并用阻断缓冲液(在PBS中2％脱脂奶粉(ELK))洗涤。将这些噬菌体展示文库的等分试样(5-10μL)用2mL阻断缓冲液(5％非热灭活的胎牛血清(FBS)、1％小鼠血清、和在PBS中的2％ELK)阻断，并且将其添加至免疫管中。在室温(RT)下孵育2h后，将管子洗涤(用在PBS中的0.05％吐温(Tween)-20洗涤5至15次，并且用PBS洗涤3至5次)。将结合的噬菌体用三乙胺(100mM)洗脱10min，并且将pH调节至7.5。在37℃下，将大肠杆菌XL1-Blue用经洗脱的噬菌体感染、涂板、并且孵育过夜。对菌落进行计数(在1E+04CFU和1E+06CFU之间)，并将其从这些板上刮下以制备富集的噬菌体文库(如在WO 02/103012中所述)。
使用从第一轮挽救的噬菌体，并遵循基本上相同的方案(除了改变的抗原、pH、和/或添加表位阻断的单克隆抗体)进行第二轮选择。应用变体淘选策略，目的是选择特异性靶向HA的保守茎区的强结合蛋白。为了选择交叉反应性单域克隆，还使用与第一轮选择相比较少量的不同HA抗原。在该方案中引入低pH洗涤步骤以增加选择可结合至茎部上并且阻断在pH 5.0下发生的HA的构象变化的噬菌体的机会(Brandenburg等人，2013)。对此将HA包被的免疫管与5倍稀释的Tryple Select(重组胰蛋白酶；英杰公司(Invitrogen))孵育10min，以切割包被的HA0(为HA1-HA2)，随后进行洗涤和阻断步骤。在与噬菌体孵育后，如前所述洗涤管子，随后在pH 5.1的柠檬酸磷酸钠缓冲液中孵育20分钟。在三次PBS洗涤步骤之后，如上所述继续进行噬菌体洗脱。在选择期间添加IgG1抗体(10μg/mL)阻断在HA头部或颈部的免疫优势表位，并且还可以增加选择与HA的茎部结合的单域噬菌体的机会。在HA包被的免疫管的封闭期间以及在与这些噬菌体文库孵育期间，添加抗体CR8033和CR8071(Dreyfus等人，2012)。
在各个sdAb分离之前进行了连续两轮至三轮的选择。针对富集因子进行每个选择输出的序列分析，并且挑选最佳的选择用于进一步分析。挑取各个大肠杆菌菌落以制备含有粗制的单克隆sdAb的周质提取物。简言之，使用经洗脱的噬菌体感染大肠杆菌菌株SF110'培养物(2YT培养基，10μg/mL四环素，4％葡萄糖)，挑取各个菌落并在96孔深孔板(1mL 2YT-ATG培养基)中生长。通过添加IPTG(1mM)诱导VHH结构域表达。通过在冰上将细菌球粒溶解在150μL TES缓冲液(100mM Tris-HCl、1mM EDTA、500mM蔗糖，pH 8.0)中30min制备周质提取物。渗透休克释放周质部分，并将澄清的且无菌过滤的含sdAb的上清液用于功能筛选(参见实例4)。
根据制造商的说明书，通过使用Ni-NTA 96孔旋转板来纯化并且浓缩来自小规模生产(96孔深孔板中的1mL)的sdAb。
与周质提取物的产生同时发生，使用各个克隆的剩余培养物产生甘油储液，并分离质粒DNA用于VHH基因的测序。进一步测试独特序列。
使用来自组1、组2、或B型流感的HA蛋白的交叉选择以及在低pH下的严格洗涤步骤允许广泛的HA结合噬菌体的分离。小规模大肠杆菌生产的周质提取物产生适用于功能筛选的可重复的蛋白质水平。
实例4：流感病毒中和单域抗体的功能筛选
在病毒中和测定(VNA)中分析含sdAb的周质提取物的预防流感病毒感染哺乳动物细胞的能力。为此，将MDCK细胞(ATCC，目录#CCL-34)接种在96孔板(4E+04细胞/孔)中，并且4h后，与流感病毒(100TCID50/孔)和无菌过滤的周质提取物(15μL/孔或其稀释液)的混合物一起孵育。在37℃和10％CO2下孵育3天后，通过在V底板中1％火鸡红细胞(TRBC)的血细胞凝集来评估在细胞培养物上清液中新产生的病毒的量(中和sdAb降低在上清液中的病毒载量，从而防止TRBC的血细胞凝集)。由于sdAb输入浓度对于周质提取物是未知的，所以样品对病毒中和仅评分为阳性或阴性。平行测试多种流感株，以选择优选地广泛中和的sdAb(参见表3a)。
总之，功能筛选导致可被分类为中和A型组1、A型组2、A型组1和组2、或B型流感病毒的sdAb。
表3a：功能筛选流感中和单域抗体(‘+’代表中和，‘-’代表没有中和，A g1是指A型流感组1，A g2是指A型流感组2，B是指B型流感；空单元格表示‘未经测试的’)
实例5：单域抗体表达和纯化
将相关的sdAb序列克隆到适合用于Expi293悬浮细胞的标准真核表达载体中。将生产运行进行5-6天。表达的sdAb分泌到细胞培养基中。在从培养基中完全消耗葡萄糖之前，将培养物上清液收获，离心并无菌过滤。使用含有镍离子的抗His树脂(完全HIS-Tag柱；罗氏公司(Roche)，目录#06781543001)纯化sdAb，并使用高浓度的咪唑(300mM)洗脱。使用脱盐柱(HiPrep 26/10脱盐柱，GEHC目录#17-5087)将该洗脱物的缓冲液更换为其最终、配制缓冲液(20mM NaAc75mM NaCl、5％蔗糖，pH 5.5)，并使用Amicon Ultra 3K旋转过滤器(密理博公司(Millipore)，目录#UFC900324)进行浓缩。在确定浓度之后，通过SDS-PAGE、HPSEC、SEC-MALS、和内毒素测定进一步表征纯的sdAb等分试样。针对所有构建体，获得600mL转染体积中5mg纯化的sdAb的最小产率。仅具有超过95％的单体含量和正确的分子量的sdAb批次用于进一步表征。
对于所选择的应用，需要没有标记(例如HIS标签)的sdAb。将非标记的sdAb经由多步骤离子交换色谱(IEX)进行纯化。将澄清的且过滤的上清液在dH2O中稀释两倍以降低电导率，将pH设定为8.0，并且将样品加载到带正电的Capto Q Impress树脂(GEHC，目录#17-5470-02)上。将不带电的sdAb保留在流出物中，然后将其调节至pH 3.5。现在，将带正电荷的sdAb在带负电荷的HiTrap Capto SP ImpRes柱(GEHC，目录#17-5468-55)上捕获，并且使用高浓度的氯化钠进行洗脱。sdAb的pI可以变化很大，并且将该方法用于在pH 8下具有负电荷至+1.0电荷，并且在pH 3至5的范围内具有至少为+10以上的电荷的分子。如上所述进一步处理洗脱的sdAb。
如本文所示，基于HIS标签以及对于无标签的构建体基于离子交换的Expi293细胞表达和纯化策略的产生高数量和质量的单体sdAb构建体。
实例6：单域抗体的特征
流感病毒中和的广度
使用如实例4中所述的病毒中和测定，通过在一大组流感病毒株中测试一系列的浓度来评估纯化的sdAb的中和效价。将效价报告于表4-7中。基于其活性，sdAb可以被细分为A型流感组1(涵盖H1、H5、H2、H6、H11、H9、H8和H12病毒)中和分子、A型流感组2(涵盖H3、H4、H14、H7和H10病毒)中和分子、以及B型流感(涵盖山形、维多利亚、和祖先/古老(Predecessor/Old)病毒)中和分子。有趣的是，一些sdAb能够中和来自组1和组2二者的A型流感病毒(表6)。
表4.针对A型组1分类的单域抗体的平均中和效价(nM)(空单元格表示‘未经测试的’)。
表5.针对A型组2分类的单域抗体的平均中和效价(nM)(空单元格表示‘未经测试的’)。
表6.针对A型组1和组2分类的单域抗体的平均中和效价(nM)(空单元格表示‘未经测试的’)
表7.针对B型分类的单域抗体的平均中和效价(nM)(空单元格表示‘未经测试的’)。
结合HA的广度
生物膜层干涉技术平台Octet Red384(FortéBio公司，Pall)用于在特定传感器表面上的快速浸渍和读取方法中蛋白质-蛋白质相互作用的无标签实时结合分析。在功能化传感器的尖端检测的质量的变化允许研究sdAb与重组HA的结合。当在一系列的浓度范围内进行时，不仅确定了sdAb的一般结合，而且还确定了sdAb的KD。
在抗His传感器(加载阶段，抗-五-His传感器，FortéBio公司，目录#18-0020)上捕获具有C-末端HIS标签的经纯化的sdAb。随后将sdAb加载的传感器与不同的HA亚型(20μg/mL)一起孵育以测试结合(缔合相)。测定的最后一步是将传感器在动力学缓冲液中孵育，以确定HA-sdAb复合物的解离速率。将测试的sdAb的结合能力列于表8中。通常，sdAb结合比其能够中和的更多的菌株的HA。更广泛的结合谱与其对HA的各自的亲和力有关(还参见表9的KD值)。
表8.sdAb与HA结合的无标记检测(‘+’表示与HA的结合，‘-’表示无结合，A g1是指A型流感组1，A g2是指A型流感组2，B是指B型流感；空单元格表示‘未经测试的’)。
还使用无标记生物膜层干涉技术来确定平衡解离常数(KD值)作为不同流感株的sdAb和重组HA分子之间的结合效力的测量。通过拟合在稳定状态下的sdAb浓度范围的结合反应(在缔合相中在平台测量的最后10秒的平均结合反应))来确定KD值，以获得在50％饱和度下的浓度，该浓度反映了KD值(R＝Rmax*[sdAb]/(KD+[sdAb]))。以一式两份测量连续稀释，并且将几何平均KD值报告于表9中。
表9.所选择的sdAb的亲和力。sdAb与HA结合的几何平均KD值(nM)(空单元格表示‘未经测试的’)
单域抗体与其他HA结合蛋白的竞争
设计结合竞争研究以筛选sdAb在其自身与其他HA结合蛋白(包括在HA上具有已知表位的良好表征的单克隆抗体(IgG))之间的竞争。如果观察到竞争，则假定两个分子在HA的表面上结合相似的或至少重叠的表位。
对此建立了AlphaLISA竞争测定(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))，其依赖于被IgG或His标记的sdAb(珀金埃尔默公司，10μL，在50μL中0.3nM的终浓度)结合的生物素化的HA(蛋白质科学公司(Protein Sciences)，10μL，在50μL中0.5nM的终浓度)。在RT下孵育1h后，使用两个珠(使用了识别HA的链霉亲和素供体珠(10μL，10μg/mL)和识别IgG或sdAb的抗Fc或抗His受体珠(10μg/mL))检测HA和结合蛋白之间的相互作用。如果在孵育另外一个小时后，激发的供体珠(680nm)和受体珠紧密相邻，则可以测量作为受体珠发光信号的能量转移(单线态氧)。处于这种均质测定形式的信号强度直接与两种结合配偶体之间的结合强度(亲和力/亲合力)成比例。取决于其亲和力和浓度(通常在从100nM至0.5pM的范围内测试)，竞争者可以破坏AlphaLISA信号，导致在SPSS中用标准的四参数逻辑非线性回归模型拟合的Sigmoidal抑制剂曲线。将计算的pIC50值的平均值显示于表10和表11中。
表10和表11显示了AlphaLISA pIC50值的平均值(半数最大抑制浓度的负对数，较高值表示指数较大的效力)。‘H1_Cal_HA’是指H1N1A/加利福尼亚/07/2009；‘H1_NCa_HA’是指H1N1A/新喀里多尼亚/20/1999的HA；‘H5_Vie_HA’是指H5N1A/越南/1203/2004的HA；‘H3_Bri_HA’是指H3N2A/布里斯班/10/2007的HA；‘H3_Wis_HA’是指A/威斯康辛/67/2005的HA；‘H7_Net_HA’是指H7N7A/荷兰/219/2003的HA；‘B_Bri_HA’是指B/布里斯班/60/2008的HA；‘B_Flo_HA’是指B/佛罗里达/04/2006的HA；‘CR8033’、‘CR8071’和‘CR9114’是结合由Dreyfus等人(2012)表征的IgG的HA。‘2D1’是指结合HA的受体结合位点、由Xu等人(2010)表征的IgG。‘CR8020’是结合HA的茎部、由Ekiert等人(2011)表征的IgG。‘39.29’是结合HA的茎部的、在WO2014078268中被表征的IgG。除了指定的‘无标记的’版本，所有SDxxxx都具有用于检测的His标签。空单元格表示‘未经测试的’。
表10：SdAb竞争结合A型流感HA。
表11：SdAb竞争结合B型流感HA。
受体结合的阻断-血凝抑制
使用血凝抑制测定(HA测定的常见变化)来测试sdAb在HA头部区的顶部附近结合并物理阻断与靶细胞(这里是红细胞)上的唾液酸受体的相互作用的能力。如果在足够浓度下的sdAb阻断与唾液酸的相互作用，那么“凝集”(红细胞聚集在一起)被抑制。在PBS(25μL/孔)中制备sdAb的系列稀释，并添加和混合25μL的8HAU/50μL病毒稀释液。在37℃下孵育1h后，添加和混合50μL的1％火鸡红细胞(TRBC)。在RT下孵育30至60min后，将凝集模式进行目测评分(撕裂形成)。除了一式四份的样品和阳性对照抗体之外，还采取输入病毒的反向滴定。使用公式计算血凝抑制效价，即在TRBC上病毒与唾液酸受体的所有相互作用被阻断的最小浓度。
结果显示于表12中。所有A型流感结合的sdAb均为阴性(即，具有HI效价>50μg/mL)。
表12.单域抗体的血凝抑制效价(μg/mL)(空单元格表示‘未经测试的’)。
结合其结合与中和的特征曲线，SD1084被证明是一种有效的HA头部结合蛋白，并防止与唾液酸受体的结合。
抑制由茎部结合的sdAb引起的HA的构象变化
为了证明茎部结合的sdAb，与其竞争的抗体相似，防止HA的构象变化，从而阻断病毒融合和随后的感染，已经开发了一种测定，该测定测量在低pH处理后的HA头部(HA1)的存在以及在HA1和HA2之间连接的二硫键的还原(Brandenburg等人，2013)。
构象变化测定是基于无标记检测，并且使用生物膜层干涉技术平台Octet Red384(FortéBio公司，Pall)进行。首先将一批C-末端生物素化的重组HA切割(在37℃下将250μg的HA与10μL的0.05％胰蛋白酶-EDTA孵育20min，然后添加30μL DTI以终止胰蛋白酶活性)。然后在Octet中的链霉亲和素传感器(FortéBio公司，目录#18-5020)上捕获HA(2μg/mL)，随后将其与结合配偶体(sdAb，在高达50nM的阳性和阴性对照抗体)一起孵育。在该孵育步骤之后，传感器将暴露于一系列pH范围(pH 6.5至5.0，以0.2pH的步幅)。如果该结合配偶体不稳定并且扣留HA，它将经历构象变化；HA1头部结构域离开，而涵盖融合机器的HA2结构域重折叠并使融合肽向外突出。现在HA1只能经由二硫键连接到HA2，该二硫键可以在最后的测定步骤中通过DTT暴露(PBS中的50mM DTT)被还原。然后HA1将从生物素化的HA2结构域解离，导致在检测器上检测到显著的质量损失。结果汇总在表13中。
表13.防止由单域抗体引起的HA的构象变化。‘++’是指HA的构象变化的强抑制，并且‘+’是指HA的构象变化的中等抑制。‘-’是指没有抑制。空单元格表示‘未经测试的’。
结果表明，HA茎部结合的sdAb能够根据它们的中和特征曲线防止HA的构象变化。这种能力需要sdAb在低pH值下(与晚期内体的条件相似)保持结合。构象变化的阻断水平与它们在各自流感株上的中和效价呈正相关。
单域抗体序列
将根据本发明的所选择的和表征的sdAb的序列列于表14中。将CDR区的序列列于表14a中。
表14.根据本发明的单域抗体的序列。
表14a.根据本发明的单域抗体的CDR区的序列
总之，用纯化的、单体sdAb构建体进行的病毒中和测定确认了四种不同的sdAb分类：A型流感组1、A型流感组2、A型流感组1和组2、或B型流感中和sdAb。然而，结合研究表明，许多A型组1或A型组2中和sdAb还可以结合属于其不能中和的组的HA。这导致显著更多数量的A型组1和A型组2结合sdAb。未发现可以中和或至少结合A型流感和B型流感的sdAb。选择能够广泛结合与中和的sdAb用于进一步表征(包括SD1038、SD1036、SD1083和SD1084)。对HA的亲和力的确定显示在所选择的sdAb的结合强度与中和效价之间呈正相关。用已知的HA结合分子经由竞争测定的表位作图显示除SD1084之外的所有sdAb结合HA的保守茎部。竞争发生的浓度与中和效价呈正相关，意味着较强的结合和竞争导致较低的中和效价。另一方面，SD1084在HA头部的唾液酸结合位点附近或该位点处结合，如在血凝抑制测定中所证实的，并且SD1084可以通过阻断受体结合来防止流感病毒进入细胞。所有其他所选择的sdAb可以结合在HA的茎部中的HA1和HA2，并且如在构象变化测定中所证实的在融合过程期间防止HA的构象变化。
实例7：sdAb同源二聚体和异源二聚体的产生和特征
sdAb同源二聚体和异源二聚体的产生
为了产生sdAb同源二聚体和异源二聚体，将sdAb编码序列克隆在一起一起，抑或直接合成全长基因(金斯瑞公司(Genscript))并将其连接到真核表达载体中。在sdAb二聚体构建体中，第一个sdAb(前)的C-末端连接到第二个sdAb的N-末端(后)。不同长度(10个、15个、35个和57个氨基酸)的接头序列由氨基酸甘氨酸(G)和丝氨酸(S)组成。当克隆在一起时，直接在第一个sdAb后面的限制性位点(NotI)导致三个另外的丙氨酸(A)残基。接头序列显示在表15中，并且sdAb二聚体的完整氨基酸序列显示在表16(靶向A型流感的构建体)和表17(靶向B型流感的构建体)中。sdAb在构建体中的位置(前或后)是变化的，以允许最佳组合。如在实例5中所述进行表达和纯化。
表15.用于产生多域抗体构建体的接头序列。
表16.SD1036和SD1038同源二聚体和异源二聚体的序列。
表17.SD1083和SD1084同源和异源二聚体的序列。
由sdAb同源二聚体和异源二聚体引起的流感中和
如在实例6中所述的在流感病毒中和测定中测试纯化的sdAb同源二聚体和异源二聚体，并且这些二聚体当与sdAb结构单元相比时显示了改进的效力和广度。对于A型流感中和二聚体的结果显示在表18中，并且对于B型流感中和二聚体的结果显示在表19中。
表18.SD1036和SD1038同源二聚体和异源二聚体的流感中和效价(还列出sdAbSD1036和SD1038的效价用于比较，空单元格表示‘未经测试的’)。
表19.SD1083和SD1084同源二聚体和异源二聚体的流感中和效价(还列出sdAbSD1083和SD1084的效价用于比较，空单元格表示‘未经测试的’)。
HA结合sdAb同源二聚体和异源二聚体
如在实例6中所述的，在结合测定中测试纯化的sdAb同源二聚体和异源二聚体，并且当与sdAb结构单元相比时显示了改进的结合强度(亲合力)。对于A型流感中和二聚体的结果显示在表20中。
表20.SD1036和SD1038同源二聚体和异源二聚体的几何平均KD值(nM)(空单元格表示‘未经测试的’)。
实例8：多域抗体构建体的产生和特征
sdAb多聚体的产生
为了产生sdAb多聚体(三聚体、四聚体和五聚体)，将sdAb编码序列克隆在一起，抑或直接合成全长基因(金斯瑞公司(Genscript))并将其连接到真核表达载体中。不同长度(10个或35个氨基酸)的接头序列由氨基酸甘氨酸(G)和丝氨酸(S)组成。当克隆在一起时，直接在第一个sdAb后面的限制性位点(NotI)导致三个另外的丙氨酸(A)氨基酸和直接在第二个sdAb后面的2个连续的限制性位点(PacI和XhoI)导致5个另外的氨基酸(LINLE)。接头序列显示在表15中，并且sdAb三聚体的完整氨基酸序列显示在表23中并且sdAb四聚体和五聚体的完整氨基酸序列显示在表24中。sdAb在构建体中的位置是变化的，以允许最佳组合。如在实例5中所述进行表达和纯化。
表23.三聚体多域抗体构建体的序列。
表24.四聚体和五聚体多域抗体构建体的序列。
由多域抗体引起的流感中和
如在实例6中所述的在流感病毒中和测定中测试纯化的多域抗体，并且当与sdAb结构单元相比时显示了改进的效力和广度。对于流感中和三聚体的结果显示在表25中，并且对于四聚体和五聚体的结果显示在表26中。
表25.三聚体多域抗体构建体的平均中和效价(nM)(空单元格表示‘未经测试的’)。
表26.四聚体和五聚体多域抗体构建体的平均中和效价(nM)(空单元格表示‘未经测试的’)。
多域抗体与HA结合
在pH 7.4下，还使用无标记生物膜层干涉技术来确定平衡解离常数(KD值)作为不同流感株的多域抗体和重组HA分子之间的结合效力的测量。通过拟合在稳定状态下的MD浓度范围的结合反应(在缔合相的平台上测量的最后10秒的平均结合反应))来确定KD值，以获得在50％饱和度下的浓度，该浓度反映了KD值(R＝Rmax*[sdAb]/(KD+[sdAb]))。以一式两份测量连续稀释，并且将几何平均KD值报告于表27中。
表27.在pH 7.4下多域抗体构建体与HA结合的几何平均KD值(nM)(空单元格表示‘未经测试的’)。
抑制由茎部结合的sdAb引起的HA的构象变化
为了证明含有HA茎部结合sdAb结构单元的多域抗体与其竞争的抗体类似，防止HA的构象变化，从而阻断病毒融合和随后的感染，如在实例6中所述的进行测定。结果汇总在表29中。
表29.防止由多域抗体引起的HA的构象变化。‘++’是指HA的构象变化的强抑制，并且‘+’是指HA的构象变化的中等抑制。‘-’是指没有抑制。空单元格表示‘未经测试的’。
与单个结构单元相比，将3个或更多个sdAb连接在一起可以显著提高中和的效力和广度。因此，不能被sdAb中任一者单独中和的流感株能可靠地被相同sdAb的多聚体构建体中和。中和A型流感组1、A型流感组2或B型流感的sdAb的组合产生能够中和几乎所有测试株的多结构域。中和的广度的增加与使用的sdAb的潜在结合广度有关。除了与构建体的二价性质相关的可能的其他中和机制之外，对HA的亲合力的增加被认为是所描述的改进的原因。病毒融合的阻断被证实为所测试的二聚体和多结构域的病毒中和机制。
实例9：Fc-融合构建体的产生和特征
Fc融合构建体的产生
SdAb和sdAb多聚体可以与抗体的Fc区融合。该Fc区被定义为抗体(例如人IgG1分子)的一部分，其含有在CH2和CH3区后面的铰链区。已经产生了不同的Fc融合构建体，并且关于HA结合、体外中和以及体内功效，将其与sdAb多聚体和单克隆抗体进行比较。
在如表15中所示的另外的接头存在或不存在的情况下，将sdAb或sdAb多聚体融合至Fc片段的C-末端和/或N-末端。Fc融合构建体在哺乳动物细胞中表达，并作为二聚体Fc分子分泌到培养基中。Fc融合构建体的完整氨基酸序列显示在表30中。sdAb或sdAb多聚体在构建体中的位置是变化的，以允许最佳组合。产生同源二聚体以及异源二聚体的Fc-融合分子。如由Labrijn等人(2013)所描述的，通过在CH3结构域中引入单点突变产生异源二聚体的Fc融合。这些突变是K409R和F405L，并且含有这些突变的Fc链分别被称为FcGa和FcGb。
Fc融合构建体在悬浮的Expi293细胞中表达。将包含具有K409R或F405L突变的异源二聚体Fc构建体的序列的DNA构建体作为包含两个连续开放阅读框的单一载体进行转染。瞬时转染和表达根据供应商的说明书进行，并且与以前报道的用于生产人IgG构建体的条件相似(Dreyfus等人，2012)。通过制备型凝胶过滤(Superdex 75pg或Superdex 200pg柱，GE医疗集团(GE Healthcare))除去可能的聚合物和杂质。在SDS-PAGE上分析样品，并且将对应于期望分子量的级分合并并使用Amicon Ultra 30K离心过滤器进行浓缩。所有的生产运行产生在铰链区通过二硫键稳定地连接的二聚体的Fc融合分子。如由Labrijn等人(2013)所述的，在FcGa和FcGb二者被转染到相同细胞中的情况下，使纯化的Fc融合蛋白在体外经受控制的还原条件，该控制的还原条件将Fc-融合物分离成半分子并允许重组和再氧化以形成纯的异源二聚体的Fc融合分子。
表30.Fc融合构建体的序列。
由含有Fc的多域抗体引起的流感中和
如在实例6中所述的，在流感病毒中和测定中测试经纯化的含有Fc的单域抗体和多域抗体构建体，并且这些构建体当与sdAb结构单元相比时显示了改进的效力和广度。对于流感中和Fc融合构建体的结果显示在表31-37中。
表31.sdAb Fc融合构建体的平均中和效价(nM)(空单元格表示‘未经测试的’)。
表32.sdAb二聚体Fc融合构建体的平均中和效价(nM)(空单元格表示‘未经测试的’)。
表33.sdAb二聚体Fc融合构建体的平均中和效价(nM)(空单元格表示‘未经测试的’)。
表34.sdAb三聚体Fc融合构建体的平均中和效价(nM)(空单元格表示‘未经测试的’)。
表35.sdAb四聚体Fc融合构建体的平均中和效价(nM)(空单元格表示‘未经测试的’)。
表36.sdAb五聚体Fc融合构建体的平均中和效价(nM)(空单元格表示‘未经测试的’)。
表37.异源二聚体Fc融合构建体的平均中和效价(nM)(空单元格表示‘未经测试的’)。
功能性Fc受体结合(抗体依赖性细胞毒性)
使用ADCC(抗体依赖性细胞毒性)报告生物测定(普洛麦格公司(Promega))测量与细胞表达的人FcγRIIIa(CD16a)的功能性结合。使用Lipofectamine 2000(英杰公司(Invitrogen))在OPTI-MEM I(吉博科公司(Gibco))中，用B/布里斯班/60/2008或B/佛罗里达/04/2006感染靶A549细胞，或用编码H3N2A/威斯康辛/67/2005HA的质粒转染靶A549细胞。24小时后，将表达HA的靶细胞接种到白色96孔板中，并用Fc融合构建体或IgG对照抗体的连续稀释液孵育30min。使用在Fc片段中携带LALA点突变的构建体作为另外的阴性对照。这些LALA点突变(如由Hessel等人(2007)所述的L234A、L235A)显示了显著降低的与人Fcγ受体的结合和ADCC的诱导。最后，将Jurkat效应子T细胞(稳定表达FcγRIIIa V158和NFAT-RE荧光素酶)添加至靶细胞中并孵育6h。将Bio-Glo荧光素酶测定底物溶液(普洛麦格公司(Promega))添加至孔中，并用发光板读数器(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))测量发光(以RLU计)。在SPSS中使用标准四参数对数非线性回归模型来拟合RLU数据。
所有SD/MD Fc融合构建体(LALA版本除外)显示强烈的ADCC诱导，表明与在细胞表面的流感HA上的茎部表位的结合允许与表达FcγRIIIa受体的细胞的生产性相互作用。结果汇总在表38中。
表38.功能性Fc受体结合(ADCC诱导)。“++”是指EC50<0.1μg/mL；“+”是指EC50<0.5μg/mL；“-”是指EC50>0.5μg/mL；空单元格表示‘未经测试的’。
将sdAb或sdAb多聚体融合到人IgG1的Fc片段导致HA结合分子，该HA结合分子保留所使用的单个sdAb或多域结构单元的中和的效力和广度。sdAb结构单元可以融合到Fc片段的N-末端和C-末端。在表达过程中，两个Fc链形成二价抗体样分子。因此，也可能在相同的细胞中表达在其sdAb或多结构域部分方面有差异的两种不同的Fc链构建体并产生双特异性抗体样分子。已经成功地产生了与Fc片段的N-末端和/或C-末端附接的具有sdAb和/或多结构域的同源二聚体和异源二聚体Fc融合构建体，并且证明了其跨越A型流感和B型流感的中和的广度。除了通过sdAb或多结构域部分的直接中和之外，当在感染或转染的细胞表面上结合HA时，融合构建体的Fc部分可以促进与效应细胞表面上的FcγRIIIa(CD16a)受体的生产性相互作用。这可以在体内导致NK细胞的激活，并且随后诱导ADCC。在效应子功能的诱导之后，该Fc部分还可以与新生的Fc受体相互作用，导致延长的体内半衰期。
实例10：单域抗体和多域抗体的体内功效
A型流感组1单域抗体的体内功效
选择示例性A型流感组1单域抗体SD1016、SD1038和SD1045用于使用Balb/C小鼠的体内流感中和研究。简言之，对6-8周龄的雌性Balb/C小鼠(n＝8)用SD1016、SD1038或SD1045以0.5mg/kg的单次剂量进行鼻内给药。仅接受缓冲溶液的另一组8只小鼠充当运载体对照组。给予后一天，用25x LD50的流感株A/波多黎各/8/1934-MA(H1N1)对小鼠进行鼻内激发。感染后对存活率和体重监测21天。与运载体对照组相比，SD1038和SD1016二者的给予导致在存活比例上具有统计学显著的改善，然而SD1045的给予仅导致在存活时间上的改善(参见图2)。
A型流感组2单域抗体的体内功效
选择示例性A型流感组2单域抗体SD1036、SD1046和SD1048用于使用Balb/C小鼠的体内流感中和研究。简言之，对6-8周龄的雌性Balb/C小鼠(n＝8)用SD1046或SD1048以5mg/kg的剂量或用SD1036以2个剂量(0.5mg/kg或5mg/kg)进行鼻内给药。仅接受缓冲溶液的另一组8只小鼠充当运载体对照组。给予后一天，用25x LD50的流感株A/香港/1/1968-MA(H3N2)对小鼠进行鼻内激发。感染后对存活率和体重监测21天。本研究显示，SD1036、SD1046或SD1048的鼻内给药提供了针对A/香港/1/1968-MA病毒的致死性激发的全面保护(参见图3)。
B型流感单域抗体的体内功效
选择示例性B型流感单域抗体SD1083和SD1084用于使用Balb/C小鼠的体内流感中和研究。简言之，对6-8周龄的雌性Balb/C小鼠(n＝8)用SD1084以5mg/kg的单次剂量或用SD1083以2个剂量(0.5mg/kg或5mg/kg)进行鼻内给药。仅接受缓冲溶液的另一组8只小鼠充当运载体对照组。给予后一天，用25x LD50的流感株B/佛罗里达/4/2006对小鼠进行鼻内激发。感染后对存活率和体重监测21天。本研究显示sdAb SD1084提供了针对用B/佛罗里达/4/2006的致死性激发的100％保护，然而SD1083仅提供了在5mg/kg的最高剂量下的部分保护。较低剂量的SD1083仅导致在存活时间上的改善(图4)。
在H1N1模型中A型流感单域抗体和多域抗体的体内功效
选择示例性A型流感sdAb SD1038和示例性A型流感多域抗体MD1211和MD1212用于使用Balb/C小鼠的体内流感中和研究。简言之，对6-8周龄的雌性Balb/C小鼠(n＝8)用MD1211或MD1212以1mg/kg的剂量或用SD1038(0.5mg/kg)(单独或与SD1036以1:1混合(总剂量＝1mg/kg))进行鼻内给药。仅接受缓冲溶液的另一组8只小鼠充当运载体对照组。给予后一天，用25x LD50的流感株A/波多黎各/8/1934-MA(H1N1)对小鼠进行鼻内激发。感染后对存活率和体重监测21天。本研究显示SD1038、MD1211、MD1212或者SD1038与SD1036的1:1混合物的鼻内给予提供了针对A/波多黎各/8/1934-MA病毒的致死性激发的全面保护。体重曲线表明MD1211和MD1212的功效优于sdAb(混合物)的功效(图5)。
在H3N2模型中A型流感单域抗体和多域抗体的体内功效
选择示例性A型流感sdAb SD1036和示例性A型流感多域抗体MD1211和MD1212用于使用Balb/C小鼠的体内流感中和研究。简言之，对6-8周龄的雌性Balb/C小鼠(n＝8)用MD1211或MD1212以5mg/kg的剂量或用SD1036(2.5mg/kg)(单独或与SD1038以1:1混合(总剂量＝5mg/kg))进行鼻内给药。仅接受缓冲溶液的另一组8只小鼠充当运载体对照组。给予后一天，用25x LD50的流感株A/香港/1/1968-MA(H3N2)对小鼠进行鼻内激发。感染后对存活率和体重监测21天。本研究显示SD1036、MD1211、MD1212或者SD1036与SD1038的1:1混合物的鼻内给予提供了针对A/香港/1/1968-MA病毒的致死性激发的全面保护。体重曲线表明MD1211和MD1212的功效优于sdAb(混合物)的功效(图6)。
在H3N2模型中SD1038单体和二聚体的体内功效的比较
选择示例性A型流感单域抗体SD1038和示例性A型流感多域抗体MD1212用于使用Balb/C小鼠的体内流感中和研究。简言之，对6-8周龄的雌性Balb/C小鼠(n＝8)用SD1038或MD1212以4个剂量(5mg/kg、1.7mg/kg、0.6mg/kg或0.2mg/kg)进行鼻内给药。仅接受缓冲溶液的另一组8只小鼠充当运载体对照组。给予后一天，用25x LD50的流感株A/香港/1/1968-MA(H3N2)对小鼠进行鼻内激发。感染后对存活率和体重监测21天。本研究显示SD1038仅提供针对A/香港/1/1968-MA病毒的致死性激发的部分保护，并且该保护水平是剂量依赖性的。与此相反，二聚体SD1038(MD1212)在所有4个剂量组中提供100％保护(图7)。
B型流感多域抗体的体内功效
选择示例性B型流感多域抗体MD1221、MD1222和MD1224用于使用Balb/C小鼠的体内流感中和研究。简言之，对6-8周龄的雌性Balb/C小鼠(n＝8)用MD1221或MD1224以5mg/kg的单次剂量或用MD1222以2个剂量(0.5mg/kg或5mg/kg)进行鼻内给药。仅接受缓冲溶液的另一组8只小鼠充当运载体对照组。给予后一天，用25x LD50的流感株B/佛罗里达/4/2006对小鼠进行鼻内激发。感染后对存活率和体重监测21天。本研究显示所有3种多域抗体提供针对用B/佛罗里达/4/2006的致死性激发的100％保护(图8)。
在静脉内给予后A型流感和B型流感多域抗体对抗H1N1的体内功效
选择示例性A型流感和B型流感多域抗体MD1301和MD2601用于使用Balb/C小鼠的体内流感中和研究。简言之，对6-8周龄的雌性Balb/C小鼠(n＝8)用MD1301或MD2601以3mg/kg的单次剂量进行静脉内给药。将CR9114作为阳性对照。仅接受缓冲溶液的另一组8只小鼠充当运载体对照组。给予后一天，用25x LD50的流感株A/波多黎各/8/1934-MA(H1N1)对小鼠进行鼻内激发。感染后对存活率和体重监测21天。本研究显示含有Fc的多域抗体MD2601在静脉内给予后提供全面保护，然而不含有Fc的MD1301对存活期没有影响。对照抗体CR9114仅提供针对用A/波多黎各/8/1934-MA(H1N1)的致死性激发的部分保护(图9)。
在鼻内给予后A型流感和B型流感多域抗体对抗H1N1的体内功效
选择示例性A型流感和B型流感多域抗体MD1301和MD2601以及参比抗体CR914用于使用Balb/C小鼠的体内流感中和研究。简言之，对6-8周龄的雌性Balb/C小鼠(n＝8)用MD1301、MD2601或参比抗体CR9114以3个剂量(0.2mg/kg、0.05mg/kg或0.01mg/kg)进行鼻内给药。仅接受缓冲溶液的另一组8只小鼠充当运载体对照组。给予后一天，用25x LD50的流感株A/波多黎各/8/1934-MA(H1N1)对小鼠进行鼻内激发。感染后对存活率和体重监测21天。本研究显示最小有效剂量(被定义为提供100％保护的最小剂量)对于含有Fc的抗体MD2601和CR9114是0.05mg/kg，并且对于不含Fc的MD1301是0.2mg/kg。接受0.05mg/kgCR9114的小鼠与接受相同剂量的MD2601的小鼠相比，显示出更大的体重下降(图10)。
A型流感和B型流感多域抗体MD2617对抗H1N1的体内功效
选择示例性多域抗体MD2617用于使用Balb/C小鼠的体内流感中和研究。简言之，对6-8周龄的雌性Balb/C小鼠(n＝8)用MD2617以0.2mg/kg、0.05mg/kg或0.01mg/kg进行鼻内给药，或以3mg/kg、1mg/kg或0.3mg/kg进行静脉内给药。仅接受缓冲溶液的另一组8只小鼠充当运载体对照组。给予后一天，用25x LD50的A/波多黎各/8/1934-MA(H1N1)对小鼠进行鼻内激发。感染后对存活率和体重监测21天。与运载体对照组相比，将MD2617以0.2mg/kg的剂量鼻内给予或以3mg/kg静脉内给予导致在存活比例上具有统计学显著的改善(图11)。
A型流感和B型流感多域抗体MD2617对抗H3N2和B型佛罗里达的体内功效
选择示例性多域抗体MD2617用于使用Balb/C小鼠的体内流感中和研究。简言之，对6-8周龄的雌性Balb/C小鼠(n＝8)用MD2617以0.5mg/kg进行鼻内给药或以2mg/kg进行静脉内给药。将以2mg/kg静脉内给药的CR9114作为阳性对照。仅接受缓冲溶液的另一组8只小鼠充当运载体对照组。给予后一天，用25x LD50的A/香港/1/1968-MA(H3N2)或B/佛罗里达/4/2006对小鼠进行鼻内激发。感染后对存活率和体重监测21天。与运载体对照组相比，MD2617的鼻内给予和静脉内给予导致在存活比例上具有统计学显著的改善。
在鼻内给予后A型流感和B型流感多域抗体MD2407和MD3606对抗B型佛罗里达的体内功效
选择示例性多域抗体MD2407和MD3606以及参比抗体CR9114用于使用Balb/C小鼠的体内流感中和研究。简言之，对6-8周龄的雌性Balb/C小鼠(n＝8)用MD2407、MD3606或CR9114以3个剂量(0.02mg/kg、0.1mg/kg或0.5mg/kg)进行鼻内给药。仅接受缓冲溶液的另一组8只小鼠充当运载体对照组。给予后一天，用25x LD50的流感株B/佛罗里达/4/2006对小鼠进行鼻内激发。感染后对存活率和体重监测21天。与运载体对照组相比，0.02mg/kg、0.1mg/kg和0.5mg/kg的MD2407和MD3606的给予导致在存活比例上具有统计学显著的改善，然而以0.1mg/kg和0.5mg/kg的CR9114的给予仅导致在存活比例上的改善(图13)。
在静脉内给予后A型流感和B型流感多域抗体MD3606对抗B型佛罗里达的体内功效
选择示例性多域抗体MD3606和参比抗体CR9114用于使用Balb/C小鼠的体内流感中和研究。简言之，对6-8周龄的雌性Balb/C小鼠(n＝8)用MD3606或CR9114以3个剂量(0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kg)进行静脉内给药。仅接受缓冲溶液的另一组8只小鼠充当运载体对照组。给予后一天，用25x LD50的流感株B/佛罗里达/4/2006对小鼠进行鼻内激发。感染后对存活率和体重监测21天。本研究显示MD3606在低至1mg/kg的剂量提供针对B/佛罗里达/4/2006的全面保护。与此相反，参比抗体CR9114在5mg/kg的最高剂量处仅提供部分保护(图14)。
在鼻内给予后A型流感和B型流感多域抗体MD2407和MD3606对抗H3N2的体内功效
选择示例性多域抗体MD2407、MD3606和参比抗体CR9114用于使用Balb/C小鼠的体内流感中和研究。简言之，对6-8周龄的雌性Balb/C小鼠(n＝8)用MD2407、MD3606和CR9114以3个剂量(0.02mg/kg、0.1mg/kg或0.5mg/kg)进行鼻内给药。仅接受缓冲溶液的另一组8只小鼠充当运载体对照组。给予后一天，用25x LD50的流感株A/香港/1/1968-MA(H3N2)对小鼠进行鼻内激发。感染后对存活率和体重监测21天。本研究显示MD2407和CR9114分别在低至0.1mg/kg和0.5mg/kg的剂量提供针对A/香港/1/1968-MA的全面保护。MD3606甚至在0.02mg/kg的最低剂量处提供全面保护(图15)。
在静脉内给予后A型流感和B型流感多域抗体MD3606对抗H3N2的体内功效
选择示例性多域抗体MD3606和参比抗体CR9114用于使用Balb/C小鼠的体内流感中和研究。简言之，对6-8周龄的雌性Balb/C小鼠(n＝8)用MD3606或CR9114以3个剂量(0.6mg/kg、1.7mg/kg或5mg/kg)进行静脉内给药。仅接受缓冲溶液的另一组8只小鼠充当运载体对照组。给予后一天，用25x LD50的流感株A/香港/1/1968-MA(H3N2)对小鼠进行鼻内激发。感染后对存活率和体重监测21天。与运载体对照组相比，在低至1.7mg/kg的剂量的MD3606和CR9114的给予导致在存活比例上具有统计学显著的改善。用5mg/kg或1.7mg/kgMD3606处理的小鼠比用相同剂量的CR9114处理的小鼠显示出更小的体重下降(图16)。
在鼻内给予后A型流感和B型流感多域抗体MD2407和MD3606对抗H1N1的体内功效
选择示例性多域抗体MD2407、MD3606和参比抗体CR9114用于使用Balb/C小鼠的体内流感中和研究。简言之，对6-8周龄的雌性Balb/C小鼠(n＝8)用MD2407、MD3606或CR9114以3个剂量(0.02mg/kg、0.1mg/kg或0.5mg/kg)进行鼻内给药。仅接受缓冲溶液的另一组8只小鼠充当运载体对照组。给予后一天，用25x LD50的流感株A/波多黎各/8/1934-MA(H1N1)对小鼠进行鼻内激发。感染后对存活率和体重监测21天。与运载体对照组相比，0.25mg/kg和0.05mg/kg的MD2407或CR9114的给予导致在存活比例上具有统计学显著的改善，然而对于MD3606在低至0.01mg/kg的最低剂量处该改善是显著的(图17)。
在静脉内给予后A型流感和B型流感多域抗体MD3606对抗H1N1的体内功效
选择示例性多域抗体MD3606和参比抗体CR9114用于使用Balb/C小鼠的体内流感中和研究。简言之，对6-8周龄的雌性Balb/C小鼠(n＝8)用MD3606或CR9114以3个剂量(0.6mg/kg、1.7mg/kg或5mg/kg)进行静脉内给药。仅接受缓冲溶液的另一组8只小鼠充当运载体对照组。给予后一天，用25x LD50的流感株A/波多黎各/8/1934-MA(H1N1)对小鼠进行鼻内激发。感染后对存活率和体重监测21天。与运载体对照组相比，1.7mg/kg和5mg/kgMD3606以及5mg/kg CR9114的给予导致在存活比例上具有统计学显著的改善(图18)。
实例11：sdAb人源化
将sdAb SD1036、SD1038、SD1046、SD1083、SD1084和SD1087的蛋白质序列针对IMGT人V基因数据库(http://www.imgt.org)进行检索。随后将每个sdAb与最同源的人V基因序列进行比对。将每个sdAb的FR4序列与人J共有序列WGQGTLVTVSS进行比对。相对于比对的人V和J序列，sdAb框架区(FR)中的氨基酸差异显示在表39中。
表39.相对于最接近的人V基因序列和共有J序列在框架区中的氨基酸差异
随后制备了多个系列的sdAb变体，其中非人FR残基的不同组合被其人源等同物置换。FR2中的残基37、44、45和47以及FR4中的残基103保留在所有变体中。两个Met残基(一个位于SD1087的CDR2中，另一个位于SD1038的CDR3中)也被突变，目的是去除潜在的Met氧化位点。sdAb SD1036、SD1038、SD1046、SD1083、SD1084和SD1087的所有变体的氨基酸序列在表40中列出。分析人源化sdAb变体的温度稳定性、表达水平(在HEK293细胞中)、和体外中和活性。使用DSC通过测量其解链温度来评估所选择的sdAb的温度稳定性。在标准的3天VNA中，使用MDCK细胞和流感病毒的近似100TCID50确定体外中和活性。将IC50值、解链温度和表达水平在表41-43中列出。相对于比对的人V和J序列以及所计算的％FR一致性，还列出了在sdAb框架区(FR)中氨基酸差异的数目。
表40.本发明的人源化结合分子的序列
表41.人源化B型流感sdAb的平均中和效价(nM)、HEK293表达水平、温度稳定性、和序列的特征(空单元格表示‘未确定的’)
表42.人源化A型流感sdAb SD1036和SD1046的平均中和效价(nM)、HEK293表达水平、温度稳定性和序列特征(空单元格表示‘未确定的’)
表43.人源化A型流感sdAb SD1038的平均中和效价(nM)、HEK293表达水平、温度稳定性和序列特征(空单元格表示‘未确定的’)
SD1036的人源化：
对于SD1036制备了11种人源化变体。相比亲本sdAb，这些变体中的若干种显示出相等或在某些情况下甚至更好的中和活性。在表达水平中没有观察到主要差异，然而对于大多数SD1036变体，解链的起始温度增加了。选择变体SD3097作为最终人源化变体，因为其具有最低数量的相对于人类种系的FR突变、高Tm起始值，并且另外显示对所测试的所有组2流感株的有效中和。
SD1038的人源化：
对于SD1038制备了21种人源化变体。除了SD3031-33之外，所有变体显示出与亲本sdAb相似的针对4个组1株的中和活性。对于大多数的SD1038变体，针对H3株A/布里斯班/10/07和A/香港/1/68的IC50值略高。选择变体SD3119作为最终人源化变体，因为其具有最低数量的相对于人类种系的FR突变、高Tm起始值，并且显示对所测试的所有流感株的有效中和。在该变体中，CDR3中的Met被Ile置换。
SD1046的人源化：
对于SD1046制备了11种人源化变体。与亲本sdAb相比，第一系列变体显示出强烈降低的中和活性。制备了第二系列变体，其在VNA中显示出与SD1046非常相似的活性。在这些变体中，选择SD3099作为最终人源化变体，因为其具有最低数量的相对于人类种系的FR突变，并且显示出高的温度稳定性。
SD1083的人源化：
对于SD1083制备了10种人源化变体。这些变体中的若干种在HEK293细胞中显示出低的表达水平，并且其中有2种变体根本没有表达。在表达良好的3种变体中，选择SD3087作为最终人源化变体。该sdAb在VNA中比亲本SD1083更有效力，并且具有实质更高的Tm起始值。
SD1084的人源化：
对于SD1084制备了6种人源化变体。这些变体中的四种在VNA中显示出与亲本sdAb相似的中和活性。在这些变体中，选择SD3085作为最终的人源化变体，因为它具有最高的Tm起始值和仅2个相对于人类种系的FR突变。
SD1087的人源化：
对于SD1087制备了23种人源化变体。第一系列的8种变体在VNA中没有显示出针对2种B型流感株的可测量的活性。制备了第二系列的sdAb，其包括显示与SD1087类似的IC50值的许多变体。这些变体的温度稳定性低于亲本分子。在VNA中，在CDR2中含有Met的取代的变体均不显示活性。选择SD3093作为最终的人源化变体，因为它仅显示适度的Tm起始值的降低，并且其在VNA中的活性等于SD1087的活性。
实例12：人源化sdAb多聚体Fc融合构建体的产生和特征
Fc融合构建体的产生
将在实例11中所描述的人源化sdAb变体用于产生多聚体Fc融合构建体。将这些人源化多聚体结合分子(即包括至少两个人源化sdAb的多聚体结合分子)直接与Fc区的N-末端融合。Fc融合构建体在哺乳动物细胞中表达，并作为二聚体Fc分子分泌到培养基中。Fc融合构建体的完整氨基酸序列显示在表44中。产生同源二聚体以及异源二聚体的Fc融合分子。如由Labrijn等人(2013)所述通过在2条Fc链的CH3结构域中引入单点突变(K409R和F405L)，或如在EP 0812357B1和EP 0979281B1中所述通过引入突出物入洞(knob-into-holes)突变产生异源二聚体Fc融合。
将编码人源化sdAb多聚体Fc融合蛋白的基因构建体进行密码子优化用于哺乳动物细胞表达，并且接合到Lonza pEE12.4载体中。将这些表达载体(其利用CD4HC信号肽)进行扩增、纯化、并在无菌水中浓缩至终浓度>5mg/mL，用于使用电穿孔的CHO细胞系的转染。通过将等量的编码2条单独的链的载体共转染来产生异源二聚体Fc融合蛋白。使用如上所述的单一载体构建体产生同源二聚体Fc融合蛋白。使用标准的悬浮相摇瓶方法使细胞培养物生长。将过滤的培养物上清液应用至HiTrap MabSelect SuRe柱上，用PBS洗涤，用0.1M乙酸钠(pH 3.5)洗脱，用2.5M Tris pH 7.2中和，并在dPBS中透析。
表44.人源化sdAb多聚体Fc融合构建体的氨基酸序列
由人源化sdAb多聚体Fc融合蛋白引起的流感中和
如在实例6中所述的在流感病毒中和测定中测试纯化的Fc融合蛋白，并且这些Fc融合蛋白当与对应的野生型版本相比时显示了相似的效力和广度。将对不同流感株的平均中和效价汇总在表45中。
表45.人源化sdAb多聚体Fc融合构建体的平均中和效价(nM)
参考文献
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Claims (22)

1.单域抗体，该单域抗体能够特异性结合至少两种A型流感病毒株的血球凝集素(HA)，所述病毒株包括来自系统发育组2的两种不同的HA亚型的HA；或能够特异性结合至少一种来自系统发育组1的A型流感病毒株和至少一种来自系统发育组2的A型流感病毒株的血球凝集素(HA)；或能够特异性结合至少一种B型流感病毒株的血球凝集素(HA)。
2.根据权利要求1所述的单域抗体，该单域抗体结合在HA的茎部区中的表位。
3.根据权利要求1所述的单域抗体，该单域抗体结合在B型流感HA的头部区中的表位。
4.根据权利要求1、2或3所述的单域抗体，该单域抗体是骆驼科VHH。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的单域抗体，该单域抗体能够中和至少两种A型流感病毒株，所述病毒株包括来自系统发育组2的两种不同的HA亚型的HA；或至少一种来自系统发育组1的A型流感病毒株和至少一种来自系统发育组2的A型流感病毒株；或至少一种B型流感病毒株。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的单域抗体，其中该单域抗体包括：
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:227、228和229；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:230、231和232；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:233、234和235；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:236、237和238；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:239、240和241；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:242、243和244；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:245、246和247；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:248、249和250；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:251、252和253；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:254、255和256；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:257、258和259；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:260、261和262；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:263、264和265；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:266、267和268；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:269、270和271；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:272、273和274；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:275、276和277；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:278、279和280；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:281、282和283；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:284、285和286；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:287、288和289；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:290、291和292；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:293、122和123；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:124、125和126；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:127、128和129；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:130、131和132；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:133、134和135；
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:136、137和138；或
一种或多种CDR序列，其选自SEQ ID NO:139、140和141。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的单域抗体，其中该单域抗体包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:1至29。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的单域抗体，其中该sdAb是人源化骆驼科VHH。
9.根据权利要求8所述的单域抗体，其中该人源化单域抗体包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:146-226和SEQ ID NO:340。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的单域抗体，该单域抗体进一步包括Fc尾部。
11.根据权利要求10所述的单域抗体，其中该Fc尾部是人IgG Fc尾部。
12.多域抗体，该多域抗体包括至少两个根据权利要求1-9中任一项所述的单域抗体。
13.根据权利要求12所述的多域抗体，该多域抗体能够特异性结合至少一种来自系统发育组1的A型流感病毒株、至少一种来自系统发育组2的A型流感病毒株、和至少一种B型流感病毒株的血球凝集素(HA)。
14.根据权利要求12或13所述的多域抗体，该多域抗体能够中和至少一种来自系统发育组1的A型流感病毒株、和至少一种来自系统发育组2的A型流感病毒株、以及至少一种B型流感病毒株。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的多域抗体，该多域抗体进一步包括Fc尾部。
16.根据权利要求15所述的多域抗体，其中该Fc尾部是人IgG Fc尾部。
17.根据权利要求12-16中任一项所述的多域抗体，该多域抗体包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:30-107、SEQ ID NO:110-121和SEQ ID NO:293-339。
18.核酸分子，该核酸分子编码根据权利要求1-11中任一项所述的单域抗体，或根据权利要求12-17中任一项所述的多域抗体。
19.载体，该载体包含根据权利要求18所述的核酸分子。
20.药物组合物，该药物组合物包括根据权利要求1-11中任一项所述的单域抗体、根据权利要求12-17中任一项所述的多域抗体、根据权利要求18所述的核酸分子、和/或根据权利要求19所述的载体。
21.根据权利要求1-11中任一项所述的单域抗体、根据权利要求12-17中任一项所述的多域抗体、根据权利要求18所述的核酸分子、或根据权利要求19所述的载体，用于在流感感染的诊断、预防和/或治疗中使用。
22.根据权利要求1-11中任一项所述的单域抗体、根据权利要求12-17中任一项所述的多域抗体、根据权利要求18所述的核酸分子、或根据权利要求19所述的载体在制造用于流感感染的诊断、预防和/或治疗的药物中的用途。
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