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JP2018100291A - Ｐｄ−１、ｂ７−４の受容体、およびその使用 - Google Patents

Ｐｄ−１、ｂ７−４の受容体、およびその使用 Download PDF

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JP2018100291A
JP2018100291A JP2018036350A JP2018036350A JP2018100291A JP 2018100291 A JP2018100291 A JP 2018100291A JP 2018036350 A JP2018036350 A JP 2018036350A JP 2018036350 A JP2018036350 A JP 2018036350A JP 2018100291 A JP2018100291 A JP 2018100291A
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cells
cell
nucleic acid
dna
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クライブ・ウッド
Clive Wood
ゴードン・ジェイ・フリーマン
Gordon J Freemann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
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Genetics Institute LLC
Original Assignee
Dana Farber Cancer Institute Inc
Genetics Institute LLC
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Abstract

【課題】ＰＤ−１を介するシグナリングをモジュレーションする作用剤に免疫細胞を接触させて免疫応答をモジュレーションすることを特徴とする免疫応答をモジュレーションする方法を提供すること。【解決手段】本発明は、ＰＤ−１をＢ７−４に対する受容体として同定する。Ｂ７−４は、免疫細胞上の阻害性受容体に結合すると、免疫細胞の活性化を阻害することができる。したがって、本発明は、ＰＤ−１、Ｂ７−４、ならびにＢ７−４とＰＤ−１との間の相互作用をモジュレーションするための作用剤を提供して、免疫細胞における共刺激または阻害性シグナルをモジュレーションし、免疫応答のモジュレーションを引き起こすものである。【選択図】なし

Description

政府資金援助
本明細書記載の研究は、National Institute of Healthにより付与されたＡＩ３９６７
１、ＡＩ４４６９０、ＣＡ８４５００およびＡＩ４１５８４によりサポートされた。それ
ゆえ、米国政府は本発明において一定の権利を有しうる。
関連出願
本願は、１９９９年８月２３日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／１５０，３９０に対して
優先権を主張するものである。本願は、１９９９年１１月１０日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．
６０／１６４８９７に対しても優先権を主張するものである。これらの出願はいずれも、
出典明示により本明細書に一体化される。
発明の背景
Ｔ細胞が外来蛋白に対して応答するためには、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって２つの
シグナルが休止中のＴリンパ球に与えられなくてはならない（Jenkins, M. and Schwartz
, R. (1987) J.Exp. Med. 165, 302-319; Mueller, D. L., et al. (1990) J. Immunol.
144,3701-3709）。第１のシグナルは免疫応答に特異性を付与するものであり、主要組
織適合複合体（ＭＨＣ）によって提示された外来抗原性ペプチドの認識後にＴ細胞受容体
（ＴＣＲ）を介して伝達される。第２のシグナルは共刺激（costimulation）と呼ばれる
ものであり、Ｔ細胞が増殖し、機能的になるように誘導する（Lenschow et al. 1996. An
nu. Rev.Immunol. 14: 233）。共刺激は抗原特異的でもなく、ＭＨＣにより制限されて
もおらず、ＡＰＣにより発現される１またはそれ以上の別個の細胞表面分子によって提供
されると考えられている（Jenkins, M.K., et al. 1988 J. Immunol. 140, 3324-3330; L
insley, P.S.,et al. 1991 J. Exp. Med. 173, 721-730; Gimmi, C.D., et al., 1991 P
roc. Natl.Acad. Sci. USA. 88, 6575-6579; Young, J.W., et al. 1992 J. Clin. Inve
st. 90,229-237; Koulova, L., et al. 1991 J. Exp. Med. 173, 759-762; Reiser, H.,
et al.1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 271-275; van-Seventer, G.A., et al.
(1990) J.Immunol. 144, 4579-4586; LaSalle, J.M., et al., 1991 J. Immunol. 147,
774-80;Dustin, M.I., et al., 1989 J. Exp. Med. 169, 503; Armitage, R.J., et al
. 1992 Nature 357,80-82; Liu, Y., et al. 1992 J. Exp. Med. 175, 437-445）。
ＡＰＣｓ上に発現されるＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）蛋白は重要
な共刺激分子である（Freeman et al. 1991. J. Exp. Med. 174:625; Freeman et al. 1
989 J. Immunol.143:2714; Azuma et al. 1993 Nature 366:76; Freeman et al. 1993.
Science 262:909）。Ｂ７−２は一次免疫応答の間に重要な役割を果たすように思われ、
Ｂ７−１は免疫応答の後半になってアップレギュレーションされ、一次Ｔ細胞応答の延長
または二次Ｔ細胞応答の共刺激において重要である可能性がある（Bluestone. 1995. Imm
unology. 2:555）。
Ｂ７−１およびＢ７−２が結合する１のリガンドであるＣＤ２８は、休止中のＴ細胞上
に構成的に発現され、活性化後に発現が増大する。Ｔ細胞受容体を介するシグナリング後
に、ＣＤ２８と共刺激シグナルの伝達が連携してＴ細胞の増殖およびＩＬ−２分泌を誘導
する（Linsley,P.S., et al. 1991 J. Exp. Med. 173, 721-730; Gimmi, C.D., et al.
1991 Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 88, 6575-6579; June, C.H., et al. 1990 Immunol.
Today. 11,211-6; Harding, F.A., et al. 1992 Nature. 356, 607-609）。ＣＴＬＡ４
（ＣＤ１５２）と呼ばれる第２のリガンドはＣＤ２８と相同的であるが、休止中のＴ細胞
上には発現されず、Ｔ細胞活性化後に出現する（Brunet, J. F., et al., 1987 Nature 3
28, 267-270）。ＣＤ２８とは対照的に、ＣＴＬＡ４はＴ細胞応答の負の調節において重
要であると思われる（Waterhouse et al. 1995. Science 270:985）。ＣＴＬＡ４のブロ
ックにより阻害シグナルが除去されることが見出されているが、ＣＴＬＡ４の凝集は、Ｔ
細胞応答をダウンレギュレーションする阻害シグナルを提供することが見出されている（
Allison andKrummel. 1995. Science 270:932）。Ｂ７分子はＣＤ２８に対するよりもＣ
ＴＬＡ４に対して高いアフィニティーを有し（Linsley, P. S. et al. (1991) J. Exp. M
ed. 174:561-569）、Ｂ７−１およびＢ７−２はＣＴＬＡ４分子の異なった領域に結合し
、ＣＴＬＡ４に対する異なった結合キネティクスを有することが見出されている（Linsle
y et al. (1994)Immunity 1:793）。ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４に関連する新たな分子で
あるＩＣＯＳが同定され、それは新たなＢ７ファミリーのメンバーであるリガンドを有す
るので（AicherA. et al. (2000) J. Immunol. 164:4689-96; Mages H. W. et al. (200
0) Eur. J.Immunol. 30:1040-7; Brodie D. et al. (2000) Curr. Biol. 10:333-6; Lin
g V. et al.(2000) J. Immunol. 164:1653-7; Yoshinaga S. K. et al. (1999) Nature
402:827-32）、ＩＬ−１０産生において重要であると思われる（Hutloffet al. (1999)
Nature 397:263;WO98/38216）。Ｔ細胞がさらなる共刺激シグナルを受け取ることなくＴ
細胞受容体を介してのみ刺激されるならば、それらは非応答性、アネルギー性となるか、
あるいは死滅し、免疫応答のダウンモジュレーションを生じさせる。
Ｂ７：ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４共刺激経路の重要性がin vitroにおいて示されており、さ
らにin vivoモデル系においても示されている。この共刺激経路をブロックすることは、
ネズミおよびヒトの系において抗原特異的耐性の発生を引き起こす（Harding, F. A. et
al. (1992)Nature 356:607-609; Lenschow, D. J. et al. (1992) Science 257:789-792
; Turka, L. A.et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11102-11105; Gimmi, C
. D. et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6586-6590; Boussiotis, V. et al
. (1993) J.Exp. Med. 178: 1753-1763）。逆に、Ｂ７陰性ネズミ腫瘍細胞によるＢ７の
発現により、Ｔ細胞により媒介される腫瘍拒絶を伴った特異的な免疫ならびに長期間持続
する腫瘍攻撃に対する防御が誘導される（Chen, L. et al. (1992) Cell 71:1093-1102;
Townsend, S. E.and Allison, J. P. (1993) Science 259:368-370; Baskar, S. et al.
(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5687-5690）。それゆえ、共刺激経路を操作するこ
とにより、ヒトにおいて免疫応答を刺激または抑制する大きな潜在能力が得られる。
発明の概要
本発明は、少なくとも一部には、ＰＤ−１が抗原提示細胞上に発現されたＢ７−４分子
の受容体であるという知見に基づく。ＰＤ−１はＣＴＬＡ４と同様に、免疫細胞に負のシ
グナルを伝達する。Ｂ７−４分子は抗原提示細胞表面上に発現され、共刺激シグナルを免
疫細胞に与え、結合する分子に応じて免疫細胞にダウンレギュレーションシグナルを伝達
することができる。かくして、ＰＤ−１、Ｂ７−４、および／またはＢ７−４とＰＤ−１
との間の相互作用をモジュレーションすることは、免疫応答のモジュレーションを生じさ
せる。
したがって、１の態様において、本発明は、ＰＤ−１を介するシグナリングをモジュレ
ーションする作用剤に免疫細胞を接触させて免疫応答をモジュレーションすることを特徴
とする免疫応答をモジュレーションする方法を提供する。
１の具体例において、免疫応答がダウンレギュレーションされる。
もう１つの具体例において、ＰＤ−１を認識する活性化抗体（activating antibody）
、阻害性受容体（inhibitoryreceptor）に結合するＢ７−４の一形態、およびＰＤ−１
に結合する小型分子からなる群より選択される作用剤を用いて、ＰＤ−１を介するシグナ
リングが刺激される。
１の具体例において、免疫細胞はＴ細胞、Ｂ細胞および骨髄細胞からなる群より選択さ
れる。
１の具体例において、免疫細胞においてアネルギーが誘導される。
１の具体例において、免疫応答をダウンレギュレーションするさらなる作用剤に免疫細
胞を接触させることをさらに特徴とする方法が提供される。
１の具体例において、免疫応答がアップレギュレーションされる。
１の具体例において、ＰＤ−１を認識するブロッキング抗体、Ｂ７−４の非活性化形態
、Ｂ７−４を認識する抗体、およびＰＤ−１の可溶性形態からなる群より選択される作用
剤を用いて、ＰＤ−１を介するシグナリングが阻害される。
１の具体例において、接触工程はin vivoにおいて行われる。もう１つの具体例におい
て、接触工程はinvitroにおいて行われる。
もう１つの態様において、本発明は、免疫細胞上の阻害性受容体とＢ７−４との相互作
用をモジュレーションする方法に関し、該方法は、Ｂ７−４を発現する抗原提示細胞を、
Ｂ７−４の一形態、ＰＤ−１の一形態からなる群より選択される作用剤、あるいはＢ７−
４とＰＤ−１との相互作用をモジュレーションする作用剤に接触させて、Ｂ７−４と免疫
細胞上の阻害性受容体との相互作用をモジュレーションすることを特徴とする。
１の具体例において、該方法は、免疫応答をモジュレーションするさらなる作用剤に免
疫細胞または抗原提示細胞を接触させることをさらに特徴とする。
１の具体例において、接触工程はin vivoにおいて行われる。もう１つの具体例におい
て、接触工程はinvitroにおいて行われる。
１の具体例において、免疫細胞はＴ細胞、Ｂ細胞および骨髄細胞からなる群より選択さ
れる。
もう１つの態様において、本発明は、非アポトーシス的機構を介して免疫細胞における
活性を阻害する方法に関し、該方法は、免疫細胞においてＰＤ−１の活性または発現を増
大させて、免疫細胞活性化を阻害することを特徴とする。
もう１つの態様において、本発明は、抗原と、免疫細胞においてＰＤ−１を介するシグ
ナリングを阻害する作用剤とを含むワクチンに関する。
もう１つの態様において、本発明は、抗原と、免疫細胞においてＰＤ−１を介するシグ
ナリングを促進する作用剤とを含む組成物に関する。
もう１つの態様において、本発明は、免疫応答のアップレギュレーションから利益を受
けるであろう症状を有する対象の治療方法に関し、該方法は、ＰＤ−１を介するシグナリ
ングを阻害する作用剤を対象の免疫細胞に投与して、免疫応答のアップレギュレーション
から利益を受けるであろう症状を治療することを特徴とする。
１の具体例において、作用剤は可溶性形態のＰＤ−１またはＢ７−４を含む。
１の具体例において、該方法は、免疫応答をアップレギュレーションする第２の作用剤
を対象に投与することをさらに特徴とする。
１の具体例において、該症状は、腫瘍、神経学的疾病または免疫抑制的疾病からなる群
より選択される。
もう１つの態様において、本発明は、免疫応答のダウンレギュレーションから利益を受
けるであろう症状を有する対象の治療方法に関し、該方法は、ＰＤ−１を介するシグナリ
ングを刺激する作用剤を対象の免疫細胞に投与して、免疫応答のダウンレギュレーション
から利益を受けるであろう症状を治療することを特徴とする。
１の具体例において、作用剤は、ＰＤ−１を介するシグナリングを刺激する抗体、二重
特異的（bispecific）抗体、および可溶性Ｂ７−４からなる群より選択される。
１の具体例において、該方法は、免疫応答をダウンレギュレーションする第２の作用剤
を対象に投与することをさらに特徴とする。
１の具体例において、該症状は、移植片、アレルギー、および自己免疫疾患からなる群
より選択される。
もう１つの態様において、本発明は、Ｂ７−４またはＰＤ−１の活性をモジュレーショ
ンする化合物をスクリーニングするための、細胞に基づくアッセイに関し、該方法は、Ｂ
７−４標的分子またはＰＤ−１標的分子を発現する細胞を試験化合物と接触させ、次いで
、Ｂ７−４またはＰＤ−１標的分子の活性をモジュレーションする試験化合物の能力を決
定することを特徴とする。
さらにもう１つの態様において、本発明は、標的分子へのＢ７−４またはＰＤ−１の結
合をモジュレーションする化合物をスクリーニングするための無細胞アッセイに関し、該
方法は、Ｂ７−４もしくはＰＤ−１蛋白またはその生物学的に活性のある部分を試験化合
物と接触させ、次いで、Ｂ７−４もしくはＰＤ−１蛋白またはその生物学的に活性のある
部分に結合する試験化合物の能力を決定することを特徴とする。
図１はヒト分泌Ｂ７−４、Ｂ７−４Ｓをコードするヌクレオチド配列を示す（配列番号：１）。 図２はヒト分泌Ｂ７−４、Ｂ７−４Ｍをコードするヌクレオチド配列を示す（配列番号：３）。 図３はヒトＢ７−４Ｓのアミノ酸配列を示し（配列番号：２）、シグナル、ＩｇＶ、ＩｇＣ、および親水性テイルドメインを示す。 図４はヒトＢ７−４Ｍのアミノ酸配列を示し（配列番号：４）、シグナル、ＩｇＶ、ＩｇＣ、および親水性テイルドメインを示す。 図５はネズミＢ７−４のヌクレオチド配列を示す（配列番号：２２）。 図５はネズミＢ７−４のヌクレオチド配列を示す（配列番号：２２）。 図６はネズミＢ７−４のアミノ酸配列を示す（配列番号：２３）。 図７はヒトおよびネズミのＢ７−４アミノ酸配列を比較したものである。 図８はＢ７−４ＭによりトランスフェクションされたＣＯＳ細胞によるＣＤ２８Ｉｇ、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、および対照Ｉｇの結合に関するＦＡＣＳ分析の結果を示す。 図８はＢ７−４ＭによりトランスフェクションされたＣＯＳ細胞によるＩｇＧおよびネズミＩＣＯＳ−ｈｉｓ融合蛋白の結合に関するＦＡＣＳ分析の結果を示す。 図１０はＢ７−４ＭによりトランスフェクションされたＣＯＳ細胞へのＩｇＭ、ＢＢ１および１３３抗体の結合に関するＦＡＣＳ分析の結果を示す。 図１１はＢ７−４Ｍ（２９２）でトランスフェクションされたＣＯＳ細胞がＴ細胞増殖を共刺激しうることを示す。 図１２はＢ７−４Ｍ（２９２）でトランスフェクションされたＣＯＳ細胞がＴ細胞増殖を共刺激しうることを示す。 図１３はＢ７−４によりトランスフェクションされたＣＯＳ細胞へのＰＤ−１の結合を示す。 Ｂ７−４ＭによりトランスフェクションされたＣＯＳ細胞へのＰＤ−１の結合に競合する、添加されたＰＤ−１の能力およびＦｌｔ４の無能力を示す。 図１５はフローサイトメトリーにより調べた、Ｂ７−４によりトランスフェクションされたＣＨＯ細胞に結合するＰＤ−１の能力を示す。 図１６はＢＩＡＣＯＲＥ分析により調べた、Ｂ７−４によりトランスフェクションされたＣＨＯ細胞に結合するＰＤ−１の能力を示す。 図１７はＴ細胞に負のシグナルを伝達するＢ７−４Ｍの能力を示す。 図１８はＢ７−４存在下でのヒトＴ細胞におけるＴ細胞増殖およびサイトカイン産生に対する阻害を示す。 図１９はＣＤ２８共刺激存在下でＴ細胞受容体／Ｂ７−４活性化がＴ細胞増殖を阻害することを示す。 図２０はＢ７−４を発現するＣＨＯ細胞へのＰＤ−１の結合を示す。 ＣＤ２８シグナル阻害におけるＢ７−４の作用を示す。 図２２はサイトカインＥＬＩＳＡにより測定された、ＰＤ−１：Ｂ７−４系によるサイトカイン産生の阻害を示す。 サイトカインｍＲＮＡレベルにより測定された、ＰＤ−１：Ｂ７−４経路によるサイトカイン産生の阻害を示す。 図２４はＰＤ−１：Ｂ７−４経路の作用機構が細胞周期停止であることを示す。 図２５はＢ７−４とＰＤ−１との間の相互作用を阻害する、Ｂ７−４に対する抗体の能力を示す。 図２６はＢ７−４とＰＤ−１との間の相互作用を阻害する、ＰＤ−１に対する抗体の能力を示す。 図２７は実験的なネズミの自己免疫性脳脊髄炎モデルにおいて疾病を悪化させる可溶性Ｂ７−４Ｆｃの能力を示す。
発明の詳細な説明
すでに特徴づけられているＢリンパ球活性化抗原、例えば、Ｂ７−１およびＢ７−２の
ほかに、免疫細胞の共刺激をモジュレーションする他の抗原が抗原提示細胞表面上に存在
する。例えば、Ｂ７−４ポリペプチドがケラチノサイトおよび胎盤のｃＤＮＡライブラリ
ーから単離されている。Ｂ７−４はＴ細胞を共刺激あるいは阻害することも見出されてい
る。
免疫細胞は活性化シグナルを伝達する受容体を有する。例えば、Ｔ細胞はＴ細胞受容体
およびＣＤ３複合体を有し、Ｂ細胞はＢ細胞受容体を有し、骨髄細胞はＦｃ受容体を有す
る。さらに、免疫細胞は、共刺激シグナルを提供するシグナルを伝達する受容体あるいは
受容体により媒介されるシグナリングを阻害するシグナルを伝達する受容体を有する。例
えば、ＣＤ２８は共刺激シグナルをＴ細胞に伝達する。Ｔ細胞受容体のライゲーション（
ligation）後に、ＣＤ２８のライゲーションは、例えばＩＬ−２ｒα、ＩＬ−２ｒβおよ
びＩＬ−２ｒγ受容体のアップレギュレーション、ＩＬ−２メッセンジャーＲＮＡの転写
増大、サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＴＮＦ−ａを包含）
遺伝子発現増大により特徴付けられる共刺激シグナルを生じさせる。共刺激シグナルの伝
達により細胞が細胞周期を経ることにより、Ｔ細胞増殖が促進される（Greenfield et al
. (1998) Crit.Rev. Immunol. 18:389）。Ｂ７−４のごときＢ７ファミリーの分子によ
る共刺激シグナルを細胞に伝達するＴ細胞上の受容体への結合（例えば、Ｔ細胞のサイト
カイン分泌および／または増殖を誘発する共刺激受容体のライゲーション）は共刺激を引
き起こす。よって、Ｂ７−４のごときＢ７ファミリー分子と免疫細胞に共刺激シグナルを
伝達する受容体との間の相互作用を阻害すると、免疫応答のダウンレギュレーションおよ
び／またはアネルギーと呼ばれる特別な無応答が引き起こされる。この相互作用を阻害す
ることは、例えば、抗−ＣＤ２８ Ｆａｂフラグメント、Ｂ−１、Ｂ７−２およｂ／また
はＢ７−４に対する抗体を用いることにより、あるいはＢ７ファミリーのメンバー分子が
競争阻害剤として結合しうる可溶性形態の受容体（例えば、ＣＴＬＡ４Ｉｇ）を用いるこ
とにより行うことができる。
共刺激分子に結合する阻害性受容体は免疫細胞上においても同定されている。ＣＴＬＡ
４の活性化は、例えば、負のシグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＴＬＡ４の使用によりＩＬ
−２産生が阻害され、細胞周期停止が誘導されうる（Krummel and Allison (1996) J. Ex
p. Med.183:2553）。さらに、ＣＴＬＡ４欠損マウスはリンパ球増殖性疾患を発症する（
Tivol et al.(1995) Immunity 3:541; Waterhouse et al. (1995) Science 270:985）。
抗体でのＣＴＬＡ４のブロックにより阻害性シグナルが除去されうるが、抗体とのＣＴＬ
Ａ４の凝集により阻害性シグナルが伝達される。それゆえ、共刺激分子が結合する受容体
（例えば、ＣＤ２８のごとき共刺激受容体またはＣＴＬＡ４のごとき阻害性受容体）に応
じて、ある種のＢ７分子はＴ細胞共刺激または阻害を促進しうる。
ＰＤ−１は分子の免疫グロブリンのメンバーである（Ishida et al. (1992) EMBO J. 1
1:3887;Shinohara et al. (1994) Genomics 23: 704）。プログラムされた細胞死に関す
る分子を同定するように設計された引き算クローニングに基づくアプローチによりＰＤ−
１はすでに同定されている（Ishida et al. (1992) EMBO J. 11:3887-95; Woronicz et a
l. (1995) Curr.Top. Microbiol. Immunol. 200:137）。ＰＤ−１は、例えば、クローン
選択中のリンパ球生き残りにおいて役割を果たしていると考えられている（Honjo (1992)
Science258:591; Agatab et al. (1996) Int. Immunology. 8:765; Nishimura et al.
(1996) Int.Immunology 8:773）。ＰＤ−１はＢ細胞応答のレギュレーターとしても関与
している（Nishimura(1998) Int. Immunology 10:1563）。Ｔ細胞上にのみ見出されるＣ
ＴＬＡ４とは異なり、ＰＤ−１はＢ細胞および骨髄細胞上ににおいても見出される。
ＰＤ−１がＢ７−４に結合するという今回の知見は、ＰＤ−１をＣＴＬＡ４とともに阻
害性受容体のファミリーに位置付けるものである。共刺激受容体の使用は免疫細胞におい
て共刺激シグナルを生じさせるが、阻害性受容体、例えば、ＣＴＬＡ４またはＰＤ−１の
使用は（例えば、架橋または凝集により）、免疫細胞において阻害性シグナルの伝達を引
き起こし、免疫細胞応答のダウンレギュレーションおよび／または免疫細胞アネルギーを
引き起こす。阻害性シグナルの伝達は免疫細胞応答のダウンモジュレーションを引き起こ
す（そして全体的な免疫応答のダウンレモジュレーションを引き起こす）が、免疫細胞に
おける阻害性シグナルの防止（例えば、ＰＤ−１に対する非活性化抗体を用いることによ
る）は免疫細胞応答のアップモジュレーションを引き起こす（そして免疫応答のアップモ
ジュレーションを引き起こす）。
本発明は、ＰＤ−１の活性および／または発現；ＰＤ−１とその本来のリガンド（例え
ば、Ｂ７−４）との相互作用をモジュレーションするのに有用な作用剤；ならびにＰＤ−
１とその本来のリガンド、例えばＢ７−４との相互作用のモジュレーションを介して免疫
応答をモジュレーションする作用剤を用いるものである。これらの方法に使用される典型
的なモジュレーション作用剤を以下においてさらに説明する。
Ｂ７−４およびＰＤ−１核酸ならびにポリペプチド分子
１の具体例において、ＰＤ−１の活性および／または発現をモジュレーションするのに
有用なモジュレーション作用剤はＢ７−４および／またはＰＤ−１核酸分子、好ましくは
、ヒトＢ７−４および／またはＰＤ−１核酸分子である。
１の具体例において、本発明の単離核酸分子は真核Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチ
ドをコードする。分子のＢ７−４ファミリーは、シグナルドメイン、ＩｇＶドメインおよ
びＩｇＣドメインを包含する多くの保存された領域を共有する。ＩｇＶドメインおよびＩ
ｇＣｄメインは当該分野において認識されているＩｇスーパーファミリーのメンバーのド
メインである。これらのドメインは、Ｉｇフォールドと呼ばれる独特な折り畳みパターン
を有する構造単位に対応する。Ｉｇフォールドは２枚のβシートから構成されており、各
シートは５−１０個のアミノ酸の逆平行β鎖からなり、すべてではないが大部分のドメイ
ンにおいて２枚のシート間に保存されたジスルフィド結合が存在する。Ｉｇ、ＴＣＲおよ
びＭＨＣ分子のＩｇＣドメインは同じタイプの配列パターンを有し、Ｉｇスーパーファミ
リー中のＣ１−セットと呼ばれる。他のＩｇＣドメインは他のセット中に含まれる。Ｉｇ
Ｖドメインも配列パターンを共有しており、Ｖセットドメインと呼ばれる。ＩｇＶドメイ
ンはＣ−ドメインよりも長く、β鎖のさらなるペアーを形成する。
２つの形態のヒトＢ７−４分子が同定されている。１の形態は天然に存在するＢ７−４
可溶性ポリペプチド、すなわち、短い親水性ドメインを有し、膜貫通ドメインを有しない
ものであり、本明細書ではＢ７−４Ｓという（配列番号：２に示す）。第２の形態は細胞
結合ポリペプチド、すなわち、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有するものであり
、本明細書ではＢ７−４Ｍという（配列番号：４に示す）。
Ｂ７−４蛋白はシグナル配列、ＩｇＶドメインおよびＩｇＣドメインを含む。配列番号
：２のシグナル配列は、ほぼアミノ酸１からほぼアミノ酸１８までに示される。配列番号
：４のシグナル配列は、ほぼアミノ酸１からほぼアミノ酸１８までに示される。配列番号
：２のＩｇＶドメインは、ほぼアミノ酸１９からほぼアミノ酸１３４までに示され、配列
番号：４のＩｇＶドメインは、ほぼアミノ酸１９からほぼアミノ酸１３４までに示される
。配列番号：２のＩｇＣドメインは、ほぼアミノ酸１３５からほぼアミノ酸２２７までに
示され、配列番号：４のＩｇＣドメインは、ほぼアミノ酸１３５からほぼアミノ酸２２７
までに示される。配列番号：２に示されるＢ７−４の親水性テイルは、ほぼアミノ酸２２
８からほぼアミノ酸２４５までに示される親水性テイルを含む。配列番号：４に示される
Ｂ７−４ポリペプチドは、配列番号：４のほぼアミノ酸２３９からほぼアミノ酸２５９で
示される膜貫通ドメインおよび配列番号：４のほぼアミノ酸２６０からほぼアミノ酸２９
０までで示される細胞質ドメインを含む。
ネズミＢ７−４分子も同定された。ネズミｃＤＮＡ配列を図５に示し、ネズミＢ７−４
アミノ酸配列を図６に示す。本発明はこれらのネズミＢ７−４配列にも関する。
本明細書においてＰＤ−１はＢ７−４に結合する受容体として同定されている。ＰＤ−
１分子は免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーである。ＰＤ−１（Ishida
et al.(1992) EMBO J. 11:3887; Shinohara et al. (1994) Genomics 23:704;米国特許
第５６９８５２０号）は、免疫グロブリンスーパーファミリードメインを含む細胞外領域
、膜貫通ドメイン、および免疫受容体のチロシンをベースにした阻害モチーフを含む細胞
内領域（ＩＴＩＭ）を有する。また、これらの特徴は、免疫阻害性受容体と呼ばれる分子
のより大きなファミリーを定義するものであり、該ファミリーはｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ−Ｂ
、およびキラー阻害性受容体（ＫＩＲｓ）（Vivier and Daeron (1997) Immunol. Today
18:286）をも包含する。これらの受容体のチロシルリン酸化ＩＴＩＭモチーフは、ホスフ
ァターゼを含むＳＨ２−ドメインと相互作用し、阻害性シグナルを生じさせると考えられ
る。これらの免疫阻害性受容体のサブセットはＭＨＣ分子、例えば、ＫＩＲｓに結合し、
ＣＴＬＡ４はＢ７−１およびＢ７−２に結合する。ＭＨＣ遺伝子とＢ７遺伝子との間には
系統発生論的関連性があると提案されている（Henry et al. (1999) Immunol. Today 20(
6):285-8）。
ＰＤ−１のヌクレオチド配列を配列番号：１０および１１に示し、ＰＤ−１のアミノ酸
配列を配列番号：１２に示す（Ishida et al. (1992) EMBO J. 11:3887; Shinohara et a
l. (1994)Genoimics 23:704;米国特許第５６９８５２０号参照）。アポトーシス性の細
胞死に関与する蛋白を選択するための引き算クローニングに基づくアプローチを用いてＰ
Ｄ−１がすでに同定されている。本明細書においてＰＤ−１は、Ｂ７−４に結合するその
能力に基づいて、分子のＣＤ２８／ＣＴＬＡ４ファミリーのメンバーとして同定されてい
る。ＣＴＬＡ４と同様に、ＰＤ−１は抗−ＣＤ３に応答してＴ細胞表面上に迅速に誘導さ
れる（Agataet al. (1996) Int. Immunol. 8:765）。しかしながら、ＣＴＬＡ４とは対
照的に、ＰＤ−１はＢ−細胞表面上にも誘導される（抗−ＩｇＭに応答して）。ＰＤ−１
は胸腺細胞および骨髄細胞のサブセット上にも発現される（Agata et al.上記文献；Nish
imura et al. (1996)Int. Immunol. 8:773）。本発明によりＢ７−４がＰＤ−１のリガ
ンドであると同定される。
本発明の種々の態様を以下のサブセクションにおいてさらに詳細に説明する。
Ｉ．定義
本明細書の用語「免疫細胞」は、造血系起源の細胞であって、免疫応答において役割を
果たす細胞を包含する。免疫細胞は、Ｂ細胞およびＴ細胞のごときリンパ球；ナチュラル
キラー細胞；単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球および顆粒球のごとき
骨髄細胞を包含する。
本明細書の用語「Ｔ細胞」は、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞を包含する。用語「Ｔ
細胞」は、Ｔヘルパー１型Ｔ細胞およびＴヘルパー２型Ｔ細胞も包含する。用語「抗原提
示細胞」は、専門的な抗原提示細胞（例えば、Ｂリンパ球、単球、樹状細胞、ランゲルハ
ンス細胞）ならびに他の抗原提示細胞（例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、星状細胞、
線維芽細胞、オリゴデンドロサイト）を包含する。
本明細書の用語「免疫応答」は、Ｔ細胞共刺激のモジュレーションにより影響を受ける
、Ｔ細胞により媒介されるおよび／またはＢ細胞により媒介される免疫応答を包含する。
典型的な免疫応答は、Ｔ細胞応答、例えば、サイトカイン産生、および細胞の細胞毒性を
包含する。さらに、用語「免疫応答」は、Ｔ細胞活性化により間接的に引き起こされる免
疫応答、例えば、抗体産生（体液性応答）およびサイトカイン応答性細胞、例えばマクロ
ファージの活性化を包含する。
本明細書の用語「共刺激受容体」は、共刺激シグナルを免疫細胞、例えばＣＤ２８に伝
達する受容体を包含する。本明細書の用語「阻害性受容体」は、免疫細胞（例えば、ＣＴ
ＬＡ４またはＰＤ−１）に負のシグナルを伝達する受容体を包含する。共刺激受容体（Ｃ
Ｄ２８のごとき）が免疫細胞上に存在しなくても阻害性受容体により変換されるような阻
害性シグナルが生じる可能性があり、よって、それは共刺激分子をめぐる阻害性受容体と
共刺激受容体との間の競争の単なる機能ではない（Fallarino et al. (1998) J. Exp. Me
d. 188:205）。免疫細胞への阻害性シグナルの伝達は免疫細胞における無応答またはアネ
ルギーまたはプログラムされた細胞死を引き起こす可能性がある。好ましくは、阻害性シ
グナルの伝達は、アポトーシスを包含しない機構を介して作動するものである。本明細書
の用語「アポトーシス」は、当該分野において知られた方法を用いて特徴づけることので
きるプログラムされた細胞死を包含する。アポトーシス性細胞死は、例えば、細胞収縮、
膜の空胞化および細胞断片化を最大化するクロマチン濃縮によって特徴づけることができ
る。アポトーシスを受けている細胞は特徴的なパターンのヌクレオソーム間ＤＮＡの開裂
も示す。
受容体に結合するＢ７−４分子の形態に応じて、シグナルが伝達され得るか（例えば、
受容体の架橋を生じさせる多価形態のＢ７−４分子により）、あるいは、例えば、受容体
への結合に関して活性化形態のＢ７−４分子と競争することによりシグナルが阻害され得
るか（例えば、可溶性の１価形態のＢ７−４分子により）のいずれかである。しかしなが
ら、可溶性分子が阻害性であり得る例がある。本明細書に記載されたような常套的なスク
リーニングアッセイによって種々のモジュレーション作用剤の効果を容易に示すことがで
きる。
活性化された免疫細胞に関する本明細書の用語「共刺激」は、受容体により媒介され、
増殖またはエフェクター機能を誘発する第２の非活性化シグナル（non-activating signa
l）（「共刺激シグナル」という）を提供する共刺激分子の能力を包含する。例えば、共
刺激シグナルは、例えば、Ｔ細胞受容体により媒介されるシグナルを受け取ったＴ細胞に
おけるサイトカイン分泌を引き起こしうる。例えば、活性化受容体（activating recepto
r）を介して細胞受容体により媒介されるシグナルを受け取った免疫細胞は、本明細書に
おいて「活性化された免疫細胞」と呼ばれる。
本明細書の用語「活性化受容体」は、抗原、複合体化抗原（例えば、ＭＨＣ分子の文脈
において）に結合する、あるいは抗体に結合する免疫細胞受容体を包含する。かかる活性
化受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、サイトカイン受容体、
ＬＰＳ受容体、補体受容体、およびＦｃ受容体を包含する。
例えば、Ｔ細胞受容体はＴ細胞上に存在し、ＣＤ３分子に結合する。ＭＨＣ分子の文脈
において、抗原により（ならびにポリクローナルＴ細胞活性化試薬により）Ｔ細胞受容体
が刺激される。ＴＣＲを介するＴ細胞活性化は多くの変化、例えば、蛋白リン酸化、膜脂
質の変化、イオンフラックス、環状ヌクレオチドの変化、ＲＮＡ転写の変化、蛋白合成の
変化、および細胞体積の変化を引き起こす。
Ｂ細胞受容体はＢ細胞上に存在する。Ｂ細胞抗原受容体は膜Ｉｇ（ｍＩｇ）と他の膜貫
通ポリペプチド（例えば、ＩｇαおよびＩｇβ）との間の複合体である。ｍＩｇのシグナ
ルトランスダクション機能は、オリゴマーまたは多量体抗原による受容体分子の架橋によ
り引き金を引かれる。Ｂ細胞は抗免疫グロブリン抗体によっても活性化されうる。ＢＣＲ
活性化により、チロシンリン酸化を包含する多くの変化がＢ細胞において起こる。
Ｆｃ受容体は免疫応答に関与する多くの細胞上に見出される。Ｆｃ受容体（ＦｃＲｓ）
は免疫グロブリン分子（Ｉｇｓ）のＦｃ部分に対する細胞表面受容体である。いままで同
定されたヒトＦｃＲｓのなかには、ＩｇＧを認識するもの（ＦｃγＲと命名）、ＩｇＥを
認識するもの（ＦｃεＲＩ）、ＩｇＡを認識するもの（Ｆｃα）、およびポリマー化した
ＩｇＭ／Ａを認識するもの（ＦｃμαＲ）がある。ＦｃＲｓは書きの細胞タイプに見出さ
れる：ＦｃεＲＩ（肥満細胞）、ＦｃεＲＩＩ（多くの白血球）、ＦｃαＲ（好中球）、
およびＦｃμαＲ（顆粒上皮、肝細胞）（Hogg, N. (1988) Immunol. Today 9:185-86）
。広範に研究さえｒたＦｃγＲｓは細胞免疫防御の要であり、炎症のメディエイタおよび
自己免疫性疾患の発症に関与する加水分解酵素の放出を刺激する要因である（Unkeless,
J. C. et al.(1988) Annu. Rev. UImmunol. 6:251-81）。ＦｃγＲｓは、エフェクター
細胞とＩｇを分泌するリンパ球との間の重要なリンクを提供する。なぜなら、マクロファ
ージ／単球、多型核白血球、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のＦｃγＲｓは、Ｉｇ
Ｇにより媒介される特異的認識のエレメントを付与するからである。ヒト白血球は、Ｉｇ
Ｇに対する少なくとも３種の異なる受容体を有する。それらはｈＦｃγＲＩ（単球／マク
ロファージ上に見出される）、ｈＦｃγＩＩ（単球、好中球、好酸球、血小板、おそらく
Ｂ細胞、およびＫ５６２細胞系上に見出される）、およびＦｃγＩＩＩ（ＮＫ細胞、好中
球、好酸球、およびマクロファージ上に見出される）である。
Ｔ細胞に関して、Ｔ細胞への共刺激シグナルの伝達は、シクロスポリンＡにより阻害さ
れないシグナリング経路を用いるものである。さらに、共刺激シグナルはＴ細胞における
サイトカイン（例えば、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１０）分泌を誘導する可能性があ
り、そして／あるいは抗原に対する無応答の誘導、アネルギーの誘導、またはＴ細胞にお
ける細胞死の誘導を妨害する可能性がある。
本明細書の用語「阻害性シグナル（inhibitory signal）」は、免疫細胞上の分子に対
する阻害性受容体（例えば、ＣＴＬＡ４またはＰＤ−１）を介して伝達されるシグナルを
いう。かかるシグナルは活性化受容体を介する（ＴＣＲ、ＣＤ３、ＢＣＲ、またはＦｃ分
子を介する）シグナルに拮抗し、例えば、第２のメッセンジャー生成阻害；増殖阻害；免
疫細胞におけるエフェクター機能阻害、例えば、食作用低下、抗体産生減少、細胞の細胞
毒性低下、免疫細胞のメディエイタ（サイトカイン（例、ＩＬ−２）および／またはアレ
ルギー応答のメディエイタのごとき）産生不能；あるいはアネルギー生起を引き起しうる
。
本明細書の用語「無応答」は、刺激、例えば、活性化受容体またはサイトカインを介す
る刺激に対する免疫細胞の屈曲（refractivity）を包含する。無応答は、例えば、免疫抑
制剤に対する曝露または高用量の抗原に対する曝露により生じ得る。本明細書の用語「ア
ネルギー」または「寛容」は、活性化受容体により媒介される刺激に対する屈曲を包含す
る。一般的には、かかる屈曲は抗原特異的であり、寛容化剤投与を止めた後も持続する。
例えば、Ｔ細胞におけるアネルギー（無応答に対抗するものとしての）は、例えば、ＩＬ
−２のごときサイトカイン産生欠如により特徴づけられる。Ｔ細胞が抗原に曝露され、第
２のシグナル（共刺激シグナル）の不存在下において最初のシグナル（Ｔ細胞受容体また
はＣＤ−３により媒介されるシグナル）を受け取った場合にＴ細胞アネルギーが生じる。
これらの条件下において、同じ抗原に対する細胞の再曝露は（再曝露が共刺激分子の存在
かにて起こる場合であっても）、サイトカイン産生は起こらず、かくして、増殖は起こら
ない。しかしながら、抗原性Ｔ細胞は無関係な抗原に対する応答を備えており、サイトカ
イン（例えば、ＩＬ−２）とともに培養された場合には増殖する可能性がある。例えば、
ＥＬＩＳＡまたはインジケーター細胞系を用いる増殖アッセイにより測定した場合、Ｔリ
ンパ球によるＩＬ−２産生欠損によるＴ細胞アネルギーが観察されうる。あるいはまた、
レポーター遺伝子を構築することもできる。例えば、アネルギー性Ｔ細胞は、５’ＩＬ−
２遺伝子エンハンサーの制御下の異種性プロモーターあるいはエンハンサー中に見出され
る他量体のＡＰ１配列により誘導されるＩＬ−２遺伝子転写を開始させることができない
（Kang etal. (1992) Science 257:1134）。
Ｂ７−４蛋白および核酸分子は特定の保存された構造上および機能上の特徴を有する分
子のファミリーを構成する。同様に、ＰＤ−１蛋白および核酸は保存された構造上および
機能上の特徴を有する分子のファミリーのメンバーである。用語「ファミリー」は、蛋白
および核酸をいう場合には、共通の構造ドメインまたはモチーフを有し、本明細書で定義
される十分なアミノ酸またはヌクレオチド配列の相同性を有する二種またはそれ以上の蛋
白または核酸分子を意味する。かかるファミリーのメンバーは天然に存在するものであっ
てもよく、あるいは天然に存在しないものであってもよく、同じ種由来のものであっても
よく、あるいは異なる種由来のものであってもよい。例えば、ファミリーはヒト起源の第
１の蛋白ならびにヒト起源の他の異なる蛋白を含んでいてもよく、あるいは非ヒト起源の
ホモログを含んでいてもよい。またファミリーのメンバーは共通の機能上の特徴を有して
いてもよい。本明細書に記載のＢ７−４分子は分子のＢ７ファミリーのメンバーである。
本明細書の用語「Ｂ７ファミリー」または「Ｂ７分子」は、Ｂ７ポリペプチド、例えばＢ
７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３（抗体ＢＢ−１により認識される）、Ｂ７ｈ（Swallow et a
l. (1999)Immunity 11: 423）、および／またはＢ７−４に対する配列相同性を有する共
刺激分子を包含する。例えば、デフォールトパラメータを用いるＮＣＢＩのＢＬＡＳＴプ
ログラムを用いて比較した場合（Blosum62 matrix with gap penalities set at existen
ce 11 andextension 1 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照)）、ヒトＢ７−１とＢ７−
２とは約２６％のアミノ酸同一性がある。
好ましいＢ７ポリペプチドは共刺激または阻害性シグナルを免疫細胞に提供し、そのこ
とにより免疫細胞の応答を促進しうるものである。例えば、共刺激受容体に結合する場合
において、例えば、可溶性形態で存在する場合には、Ｂ７−４は免疫細胞の共刺激を誘導
することができ、あるいは免疫細胞の共刺激を阻害することができる。阻害性受容体に結
合する場合、Ｂ７−４分子は阻害性シグナルを免疫細胞に伝達することができる。好まし
いＢ７ファミリーのメンバーはＢ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３（抗体ＢＢ−１により認識
される）、Ｂ７ｈおよびＢ７−４ならびにそれらの可溶性フラグメントまたは誘導体を包
含する。１の具体例において、Ｂ７ファミリーのメンバーは、免疫細胞上の１種またはそ
れ以上の受容体、例えばＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１および／または他の
受容体に結合し、受容体に応じて、阻害性シグナルまたは共刺激シグナルを免疫細胞、好
ましくはＴ細胞に伝達する能力を有する。
好ましいＰＤ−１分子は、例えば、可溶性のモノマー形態で存在する場合に、阻害性シ
グナルを免疫細胞に伝達し、そのことにより免疫細胞エフェクター機能を阻害することが
できるものであるか、あるいは免疫細胞の共刺激を促進（例えば、競争的阻害により）で
きるものである。好ましいＰＤ−１ファミリーのメンバーは、抗原提示細胞上の１種また
はそれ以上の受容体、例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−４、および／または他の分子
に結合するものである。
さらに、１の具体例において、蛋白ファミリーのメンバーである蛋白は、１またはそれ
以上の他のファミリーのメンバーの蛋白に対して生成した抗体により結合される。例えば
、抗−ＢＢ−１抗体はＢ７−４分子を認識する。
Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドについての本明細書の用語「活性」は、Ｂ７−４
またはＰＤ−１蛋白の構造に固有の活性を包含する。Ｂ７−４に関して用語「活性」は、
例えば、活性化された免疫細胞において共刺激シグナルをモジュレーションすることによ
り免疫細胞の共刺激をモジュレーションする能力、あるいは例えば免疫細胞上の天然受容
体を用いることにより免疫細胞における阻害性シグナルをモジュレーションすることによ
って刺激をモジュレーションする能力を包含する。活性化形態のＢ７−４分子が共刺激受
容体に結合する場合、共刺激シグナルが免疫細胞に発生する。活性化形態のＢ７−４分子
が阻害性受容体に結合する場合、阻害性シグナルが免疫細胞に発生する。
共刺激シグナルのモジュレーションは免疫細胞のエフェクター機能のモジュレーション
を引き起こす。したがって、用語「Ｂ７−４活性」は、Ｂ７−４ポリペプチドがその本来
の受容体に結合する能力、免疫細胞の共刺激または阻害性シグナルをモジュレーションす
る能力、ならびに免疫応答をモジュレーションする能力を包含する。
ＰＤ−１に関して、用語「活性」は、例えば抗原提示細胞上の本来的なリガンドを用い
ることによりＰＤ−１ポリペプチドが活性化免疫細胞において阻害性シグナルをモジュレ
ーションする能力を包含する。ＰＤ−１は、ＣＴＬＡ４と類似の様式で阻害性シグナルを
免疫細胞に伝達する。免疫細胞における阻害性シグナルのモジュレーションは、免疫細胞
の増殖および／または免疫細胞のサイトカイン分泌のモジュレーションを引き起こす。Ｐ
Ｄ−１は、Ｂ７分子の結合に関して共刺激受容体と競合することにより共刺激シグナルを
モジュレーションすることもできる。したがって、用語「ＰＤ−１活性」は、ＰＤ−１ポ
リペプチドがその本来のリガンドに結合する能力、免疫細胞の共刺激または阻害性シグナ
ルをモジュレーションする能力、ならびに免疫応答をモジュレーションする能力を包含す
る。
本明細書の用語「天然に存在する」核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド配列を有
するＲＮＡまたはＤＮＡ分子をいう（例えば、天然蛋白をコードするもの）。
本明細書の用語「アンチセンス」核酸分子は、蛋白をコードする「センス」核酸に相補
的なヌクレオチド配列、例えば、２本鎖ｃＤＮＡ分子のコーディング鎖に相補的なヌクレ
オチド配列、ｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列、または遺伝子のコーディング鎖
に相補的なヌクレオチド配列を含む。したがって、アンチセンス核酸分子はセンス核酸分
子に水素結合することができる。
本明細書の用語「コーディング領域」は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌク
レオチド配列の領域をいい、用語「非コーディング配列」はアミノ酸に翻訳されないヌク
レオチド配列の領域（例えば、５’および３’非翻訳領域）をいう。
本明細書の用語「ベクター」は、それに連結されている別の核酸分子を輸送しうる核酸
分子をいう。１のタイプのベクターは「プラスミド」であり、さらなるＤＮＡセグメント
がその中に連結されうる環状２本鎖ＤＮＡループをいう。別のタイプのベクターはウイル
スベクターであり、さらなるＤＮＡセグメントが該ベクター中のウイルスゲノム中に連結
されうる。ある種のベクターは、それが組み込まれた宿主細胞中において自律的複製をす
ることができる。宿主細胞中に導入された後、宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、そのこ
とにより宿主ゲノムとともに複製するものもある（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベク
ター）。そのうえ、ある種のベクターは、作動可能に連結されている遺伝子の発現を指令
しうる。かかるベクターを本発明において「組み換え発現ベクター」あるいは単に「発現
ベクター」という。一般的には、組み換えＤＮＡ法において有用な発現ベクターは、しば
しば、プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」
を混用する。なぜなら、プラスミドは最も通常に使用されるベクターの形態だからである
。しかしながら、本発明は、同等の機能を発揮する他の形態のかかるベクター、例えば、
ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトトウイルス、アデノウイルスおよびアデノ−関
連ウイルス）を包含するものとする。
本明細書の用語「宿主細胞」は、本発明の組み換え発現ベクターのごとき本発明の核酸
分子が導入された細胞をいう。用語「宿主細胞」および「組み換え宿主細胞」は混用され
る。かかる用語は特定の対象細胞のもならずかかる細胞の子孫もしくは潜在的子孫もいう
ことを理解すべきである。ある種の修飾は突然変異または環境の影響のいずれによっても
連続した世代を生じる可能性があり、実際には、かかる子孫は親細胞と同一ではないが、
本明細書の用語の範囲内に包含される。
本明細書の用語「トランスジェニック」動物は、その動物の１またはそれ以上の細胞が
「導入遺伝子」を含んでいる非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスを
いう。用語「導入遺伝子」は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組み
込まれたＤＮＡであって、成熟動物のゲノム中に残るものであり、例えば、トランスジェ
ニック動物の１またはそれ以上の細胞タイプまたは組織においてコードする遺伝子産物の
発現を指令するものである。
本明細書の用語「相同組み換え動物」は、１のタイプのトランスジェニック非ヒト動物
、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスをいい、該動物においては、内在性遺伝子
と動物の発生前に動物細胞（例えば、動物の胚性細胞）に導入された外来性ＤＮＡ分子と
の間の相同組み換えにより内在性遺伝子が変化している。
本明細書の用語「単離蛋白」は、細胞から単離された場合に、あるいは組み換えＤＮＡ
法により製造された場合において、実質的に他の蛋白、細胞性物質および培地を含まない
、あるいは化学合成された場合には化学前駆体または他の化学試薬を含まない蛋白をいう
。「単離」または「精製」された蛋白またはその生物学的に活性のある蛋白は、Ｂ７−４
またはＰＤ−１蛋白が由来した細胞または組織源由来の細胞性物質または他の混入蛋白を
実質的に含まず、あるいは化学合成の場合には化学前駆体または他の化学試薬を含まない
。用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、Ｂ７−４またはＰＤ−１が単離されあるい
は組み換え法により製造される細胞の細胞性成分から分離されているＢ７−４またはＰＤ
−１蛋白の調合物を意味する。１の具体例において、用語「細胞性物質を実質的に含まな
い」は、約３０％（乾燥重量で）未満の非Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白（本明細書におい
て「混入蛋白」ともいう）、より好ましくは約２０％の非Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白、
さらに好ましくは約１０％未満の非Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白、最も好ましくは約５％
未満の非Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白を有するＢ７−４またはＰＤ−１蛋白の調合物を包
含する。また、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白またはその生物学的に活性のある部分が組み
換え法により製造される場合、好ましくは、それは培地を含まないものであり、すなわち
、培地が蛋白調合物の体積の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましく
は約５％未満である。
用語「化学前駆体または他の化学試薬を実質的に含まない」は、蛋白合成に使用される
化学前駆体または化学試薬から蛋白が分離されているＢ７−４またはＰＤ−１蛋白の調合
物を包含する。１の具体例において、用語「化学前駆体または他の化学試薬を実質的に含
まない」は約３０％（乾燥重量で）未満の化学前駆体または非Ｂ７−４もしくはＰＤ−１
化学試薬、より好ましくは約２０％未満の化学前駆体または非Ｂ７−４もしくはＰＤ−１
化学試薬、さらに好ましくは約１０％未満の化学前駆体または非Ｂ７−４もしくはＰＤ−
１化学試薬、最も好ましくは約５％未満の化学前駆体または非Ｂ７−４もしくはＰＤ−１
化学試薬を有するＢ７−４またはＰＤ−１蛋白調合物を包含する。
また、本明細書の用語「抗体」は、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体の一部
」）を包含する。本明細書の用語「抗原結合部分」は、抗原との特異的な結合を保持する
１つまたはそれ以上の抗体のフラグメントをいう（例えば、Ｂ７−４）。抗体の抗原結合
機能が完全長抗体のフラグメントにより機能できることが示されている。用語抗体の「抗
原結合部分」中に包含される結合フラグメントの例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ
、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから成る単価のフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ部でジ
スルフィド架橋により結合される２つのＦａｂフラグメントから成る二価のフラグメント
であるＦ（ａｂ’）２フラグメント、；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦ
ｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単アームのＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖフラグ
メント；（ｖ）ＶＨドメインから成るｄＡｂフラグメント（Ward et al., (1989) Nature
341:544-546）；および（ｖｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含する。さらに、Ｆ
ｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によりコードされる
が、これらは組み換え法を使用して、単蛋白鎖として形成可能である合成リンカーにより
結合でき、ＶＬおよびＶＨ領域は対になり、単価の分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知
られている：例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; およびHuston et al.
(1988) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; およびOsbourn et al. 1998, Natu
reBiotechnology 16: 778参照）を形成できる。また、このような単鎖抗体は、用語、抗
体の「抗原結合部分」中に包含されるものとする。完全にＩｇＧ分子または他の異性体を
コードする発現ベクターを得るために、特定のｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ配列のいずれも
、ヒト免疫グロブリン不変領域ｃＤＮＡまたはゲノム配列に結合できる。また、ＶＨおよ
びＶｌは、蛋白化学または組み換えＤＮＡ法のいずれかを使用して、Ｆａｂ、Ｆｖまたは
他の免疫グロブリンのフラグメントの精製に使用できる。また、ジアボディー（diabody
）のような単鎖抗体の他の形態も包含される。ジアボディーは、二価の二重特異性抗体で
あり、その中において単ポリペプチド鎖上にＶＨおよびＶＬドメインが発現されているが
、非常に短いため同一の鎖上の２つのドメイン間を対にすることができないリンカーを使
用して、そのことにより、ドメインに他の鎖の相補的なドメインと対になるように強要し
、２つの抗原結合部位を形成させる（例えば、Holliger P., et al. (1993) Proc. Natl.
Acad.Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al.(1994) Structure 2:1121-112
3参照）。
さらに、抗体またはその抗原結合部分は、より大きな免疫付着分子の一部であり、抗体
または抗体の一部と１つまたはそれ以上の蛋白またはペプチドとの共有または非共有結合
により形成されうる。このような免疫付着分子の例は、四量体ｓｃＦｖ分子を作るストレ
プトアビジンコア領域の使用（Kipriyanov, S. M. et al. (1995) Human Antibodies and
Hybridomas6:93-101）および２価およびビオチン化ｓｃＦｖ分子を作るシステイン残基
、標識ペプチドおよびＣ−末端ポリヒスチジンタグの使用（Kipriyanov, S. M., et al.
(1994) Mol.Immunol. 31: 1047-1058）を含む。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメン
トのような抗体の一部は、完全な抗体各々のパパインおよびペプシン消化のような従来の
技術を使用して、完全な抗体から製造できる。さらに、抗体、抗体の一部および免疫付着
分子は、本明細書に記載されている標準的な組み換えＤＮＡ法を使用して得ることができ
る。
抗体は、多クローン性または単クローン性；異種、同種または同系；またはその修飾さ
れた形態であってもよく、例えば、ヒト化、キメラ等であってもよい。好ましくは、本発
明の抗体は、Ｂ７−４分子に特異的または実質的に特異的に結合する。本明細書の用語「
単クローン抗体」および「単クローン抗体組成物」は、抗原の特別なエピトープと免疫反
応する可能性のある抗原結合部位のただ１種を含む抗体分子の集団をいい、これに対して
、用語「多クローン抗体」および「多クローン抗体組成物」は、特別な抗原と作用する可
能性のある抗原結合部位の多種を含む抗体分子の集団をいう。単クローン抗体組成物は、
典型的には、それが免疫反応する特別な抗原との単結合性を示す。
本明細書の用語「ヒト化抗体」は、ヒト細胞により作られるより綿密な擬似抗体に変じ
られる可変および不変の領域を有する非ヒト細胞により作られる抗体を包含する。例えば
、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に見られるアミノ酸を組み入れるために非ヒト抗体
アミノ酸配列を変えることによる。本発明のヒト化抗体は、例えばＣＤＲ中のヒト生殖細
胞系免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでの無
作為または部位特異性突然変異体あるいはインビボでの体細胞突然変異体により導かれる
変異体）を包含する。また、本明細書の用語「ヒト化抗体」は、他の哺乳類の種、例えば
マウスの胚芽細胞系列由来のＣＤＲ配列をヒトフレームワーク配列に移植した抗体も包含
する。
本明細書の用語「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まな
い抗体をいう（例えば、特異的にＢ７−４に結合する単離抗体は、Ｂ７−４以外の抗原に
特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。さらに、単離抗体は、他の細胞物質および
／または化学物質を実質的に含まないものであってもよい。
遺伝学的コード（下記）により定義されるように、特別な蛋白のアミノ酸配列と蛋白を
コードできるヌクレオチド配列間に公知かつ明確な一致がある。同様に、遺伝学的コード
により定義されるように、特別な核酸分子のヌクレオチド配列とその核酸分子によりコー
ドされるアミノ酸配列間に公知かつ明確な一致がある。
Figure 2018100291
重要でよく知られた遺伝学的コードの特徴はその重複であり、したがって、蛋白の作成
に使用されるアミノ酸のほとんどに、１つ以上のコーディングヌクレオチドトリプレット
を使用できる（上図）。したがって、異なるヌクレオチド配列の多くは、与えられるアミ
ノ酸配列をコードできる。結果として、全ての生物で同様のアミノ酸配列を生じるので（
ある種の生物は、他よりも効果的にいくつかの配列に翻訳することができるが）、このよ
うなヌクレオチド配列は、機能的に等価であると見なされる。さらに、時折、プリンまた
はピリミジンのメチル化変異体を、特定のヌクレオチド配列で発見できる。このようなメ
チル化は、三ヌクレオチドコドンと対応するアミノ酸との間のコーディング関係に影響し
ない。
上記のことを考慮すると、本明細書のＢ７−４またはＰＤ−１をコードするＤＮＡまた
はＲＮＡ分子のヌクレオチド配列（またはその一部）は、遺伝学的コードをＤＮＡまたは
ＲＮＡ分子をアミノ酸配列への翻訳に使用して、Ｂ７−４またはＰＤ−１分子アミノ酸配
列を誘導することに使用できる。同様に、Ｂ７−４またはＰＤ−１−アミノ酸配列に関し
て、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白をコードできる対応するヌクレオチド配列を、遺伝学的
コードから推論できる（これはその縮重のため、いずれかの特定のアミノ酸配列に対する
複数の核酸配列を生じる）。したがって、また、本明細書のＢ７−４またはＰＤ−１ヌク
レオチド配列の記載および／または開示は、ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ
酸配列の記載および／または開示を包含する。同様に、また、本明細書のＢ７−４または
ＰＤ−１アミノ酸配列の記載および／または開示は、アミノ酸配列をコードできる全ての
可能性あるヌクレオチド配列の記載および／または開示も包含すると見なされるべきであ
る。
ＩＩ．単離核酸分子
１つの具体例において、請求した方法で使用されるモジュレーション作用剤は、Ｂ７−
４またはＰＤ−１蛋白まはたその生物学的部分をコードする単離核酸分子を包含する。ま
た、Ｂ７−４またはＰＤ−１−コーディング核酸（例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１ｍ
ＲＮＡ）を同定するためのハイブリッド形成プローブとしての使用に十分な核酸フラグメ
ント、およびＢ７−４またはＰＤ−１核酸分子の増幅または突然変異のためのＰＣＲプラ
イマーとして使用するフラグメントも提供される。本明細書の用語「核酸分子」は、ＤＮ
Ａ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）
を包含し、ＤＮＡまたはＲＮＡアナログは、ヌクレオチドアナログ使用して生成する。核
酸分子は、一重ストランドまたは二重ストランドであってもよいが、好ましくは二重スト
ランドＤＮＡである。
「単離」核酸分子は、核酸分子の天然源に存在する他の核酸分子から分離されたもので
ある。例えば、ゲノムＤＮＡに関しては、用語「単離」は、ゲノムＤＮＡが天然に関連す
るクロモソームから分離された核酸分子を包含する。好ましくは、「単離」核酸分子は、
核酸分子をデリバリーする生体のゲノムＤＮＡ中の本来的に核酸分子に隣接している配列
（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、種々の具
体例において、単離Ｂ７−４またはＰＤ−１核酸分子は、核酸をデリバリーする細胞のゲ
ノムＤＮＡ中の本来的に核酸分子に隣接している約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１
ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含むことができる。さらに
、ｃＤＮＡ分子のような「単離」核酸分子は、組み換え法により製造される場合、他の細
胞物質または培地から実質的に離れることができ、または化学合成される場合、化学前駆
体または他の化学物質を実質的に含まないものであってもよい。しかし、「単離」Ｂ７−
４またはＰＤ−１核酸分子は、通常にはゲノムＤＮＡ中のＢ７−４またはＰＤ−１に隣接
しない他のヌクレオチド配列に結合する（例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１ヌクレオチド
配列は、ベクター配列に結合できる）。ある種の好ましい具体例において、また、ｃＤＮ
Ａ分子のような「単離された」核酸分子は、他の細胞物質を含まないものであってもよい
。しかし、Ｂ７−４またはＰＤ−１核酸分子が、他の細胞物質を含まないことは、「単離
された」と見なされることに必要でない（例えば、他の哺乳類ＤＮＡから単離され、細菌
細胞に挿入されたＢ７−４またはＰＤ−１ＤＮＡ分子は、やはり「単離された」とみなさ
れる）。
本発明の核酸分子、例えば配列番号：１、３、１０または１１のヌクレオチド配列また
はその一部を有する核酸分子は、標準的な分子生物学の技術および本明細書に提供した配
列情報を使用して単離できる。例えば、ハイブリッド形成プローブとしての配列番号：１
、３、１０または１１の核酸配列の全てまたは一部を使用して、標準的なハイブリッド形
成およびクローニング法を使用してＢ７−４またはＰＤ−１核酸分子を分離できる（例え
ば、Sambrook,J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold S
pring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor
, NY, 1989記載のように）。
さらに、配列番号：１、３、１０または１１の全てまたは一部を包含する核酸分子は、
配列番号：１、３、１０または１１の配列の各々に基づいて設計される合成オリゴヌクレ
オチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により単離できる。
本発明の核酸は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは各々のゲノムＤＮＡを、テンプレートおよ
び特殊なオリゴヌクレオチドプライマーとして使用して、標準的なＰＣＲ増幅法により、
増幅できる。このように増幅された核酸は、適当なベクターにクローン化でき、ＤＮＡ配
列分析により特徴付けられる。さらに、Ｂ７−４またはＰＤ−１ヌクレオチド配列に対応
するオリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡシンセサイザーを使用する標準的な合成
法により製造できる。
好ましい具体例において、本発明の単離核酸分子は、配列番号：１、３、１０または１
１に示されるヌクレオチド配列を含む。
他の好ましい具体例において、本発明の単離核酸分子は、配列番号：１、３、１０また
は１１またはいずれかのヌクレオチド配列の一部に示されるヌクレオチド配列の相補物で
ある核酸分子を包含する。配列番号：１、３、１０または１１に示されるヌクレオチド配
列に相補的な核酸分子は、配列番号：１、３、１０または１１の各々に示されるヌクレオ
チド配列に十分に相補的な１つであり、したがって、配列番号：１、３、１０または１１
の各々に示されるヌクレオチド配列とハイブリッド形成でき、したがって安定なデュプレ
ックス（duplex）を形成できる。
さらにもう１つの好ましい具体例において、本発明の単離核酸分子は、配列番号：１、
３、１０または１１に示されるヌクレオチド配列またはいずれかのこれらのヌクレオチド
配列の一部に、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％
、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上で一致するヌクレオチド配列を包含す
る。
さらに、本発明の核酸分子は、配列番号：１、３、１０または１１の核酸配列の一部だ
けを含むことができ、例えば、プローブまたはプライマーをして使用できるフラグメント
またはＢ７−４またはＰＤ−１蛋白の生物学的部分をコードするフラグメントを含むこと
ができる。Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配
列は、他の種から得られるＢ７−４またはＰＤ−１ファミリーのホモログならびに、他の
Ｂ７−４またはＰＤ−１ファミリーメンバーの同定および／またはクローニングに使用す
るために設計されたプローブまたはプライマーの生成を可能にする。プローブ／プライマ
ーは、典型的には、実質的に好ましいオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは
、典型的には、ストリンジエンドな条件下で、配列番号：１、３、１０または１１のセン
ス配列、または配列番号：１、３、１０または１１の天然に生じる対立遺伝子の変異体ま
たは突然変異体の少なくとも約１２または１５、好ましくは約２０または２５、より好ま
しくは、約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５または７５個の連続したヌ
クレオチドとハイブリッド形成するヌクレオチド配列の領域を含む。典型的な具体例にお
いて、本発明の核酸分子は、少なくとも３５０、４００、４５０、５００、５５０、６０
０、６５０、７００、７５０または８００ヌクレオチドの長さであり、ストリンジエンド
なハイブリッド形成条件下で、配列番号：１、３、１０、または１１の核酸分子配列とハ
イブリッド形成するヌクレオチド配列を含む。
他の具体例において、第２の核酸分子は、配列番号：１、３、１０、または１１の少な
くとも約５００、６００、７００、８００、９００または１０００個の連続したヌクレオ
チドを含む。
１つの具体例において、例えば、プローブとして使用される本発明の核酸分子は、配列
番号：１のヌクレオチド約８１５〜約８５０または配列番号：１のヌクレオチドほぼ３２
０〜８５６から得られる配列番号：１の一部を含まない。他の具体例において、本発明の
核酸分子は、配列番号：３のヌクレオチドほぼ３１４〜７３４またはヌクレオチドほぼ８
３５〜ほぼ８６０またはほぼヌクレオチド１０８５〜ほぼ１１０４またはヌクレオチドほ
ぼ１２８６〜ほぼ１５３６から得られる配列番号：３の一部を含まない。
１つの具体例において、本発明の核酸分子は、配列番号：１または配列番号：３の少な
くとも約５００個の連続したヌクレオチドを含む。好ましい具体例において、本発明の核
酸分子は、配列番号：１の少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８０
０、少なくとも約９００または少なくとも９５０個の連続したヌクレオチドまたは配列番
号：３の約１０００連続ヌクレオチドを含む。他の具体例において、本発明の核酸分子は
、配列番号：３の少なくとも約１５００または１５５０個のヌクレオチドを含む。
好ましくは、本発明の単離核酸分子は、少なくとも配列番号：１（ヌクレオチド５９〜
７９３に示される）または配列番号：３（ヌクレオチド５３〜９２２に示される）のコー
ディング領域の一部を含む。他の具体例において、Ｂ７−４核酸分子は、配列番号：１の
ヌクレオチドほぼ１〜ヌクレオチドほぼ３１９を含む。他の具体例において、Ｂ７−４核
酸分子は、配列番号：１のヌクレオチドほぼ８５５〜ヌクレオチドほぼ９６８を含む。他
の具体例において、Ｂ７−４核酸分子は、配列番号：３のヌクレオチドほぼ１〜ヌクレオ
チドほぼ３１４を含む。他の具体例において、Ｂ７−４核酸分子は、配列番号：３のヌク
レオチドほぼ９５５〜ヌクレオチドほぼ１２８５を含む。他の具体例において、Ｂ７−４
核酸分子は、配列番号：３のヌクレオチドほぼ１５３５〜ヌクレオチドほぼ１５５２を含
む。
他の具体例において、本発明の核酸分子は、配列番号：１または配列番号：３の少なく
とも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なく
とも約９００、少なくとも約１０００個の連続したヌクレオチドを含む核酸分子と、少な
くとも７０％の同一性、より好ましくは８０％の同一性、およびさらにより好ましくは９
０％の同一性を有する。
Ｂ７−４またはＰＤ−１ヌクレオチド配列に基づくプローブは、同一または相同蛋白を
コードする転写またはゲノム配列の検出に使用できる。好ましい具体例において、さらに
、プローブは付着した標識群を含み、例えば、標識群は、放射性同位体、蛍光化合物、酵
素または酵素共コファクターであることができる。このようなプローブは、Ｂ７−４また
はＰＤ−１蛋白を誤って発現する細胞または組織の同定用の診断試験キットの一部として
、被験者から得た細胞の試料中のＢ７−４またはＰＤ−１コーディング核酸のレベルの測
定、例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１ ｍＲＮＡレベルの検出、またはゲノムＢ７−４ま
たはＰＤ−１遺伝子が変化または欠失しているかどうかを決定することにより使用できる
。
「Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白の生物学的活性部分」をコードする核酸フラグメントは
、Ｂ７−４またはＰＤ−１生物学的活性（Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白の生物学的活性は
本明細書に記載されている）を有し、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白のコードされた一部を
発現し（例えば、インビトロでの組み換え発現により）、およびＢ７−４またはＰＤ−１
蛋白のコードされた一部の活性を評価するポリペプチドをコードする配列番号：１、３、
１０または１１のヌクレオチド配列の一部を単離することにより調製できる。
遺伝学的コードの縮重のため配列番号：１、３、１０または１１と異なっているが、配
列番号：１、３、１０または１１によりコードされたものと同一のＢ７−４またはＰＤ−
１蛋白をコードする核酸分子は、本発明に包含される。したがって、他の具体例において
、本発明の単離核酸分子は、配列番号：２、４または１２に示されたアミノ酸配列を有す
る蛋白をコードするヌクレオチド配列を有する。他の具体例において、本発明の単離核酸
分子は、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白をコードするヌクレオチド配列を有する。
配列番号：１、３、１０または１１に示されたＢ７−４またはＰＤ−１ヌクレオチド配
列に加えて、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白のアミノ酸配列の変化を導くＤＮＡ配列多型が
、集団（例えば、ヒト集団）中に存在できることは、当業者により理解されるだろう。こ
のようなＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子のゲノム多型は、天然の対立遺伝子の変異のため
集団中の個体に存在できる。本明細書の用語「遺伝子」および「組み換え遺伝子」は、Ｂ
７−４またはＰＤ−１蛋白、好ましくは、哺乳類のＢ７−４またはＰＤ−１蛋白をコード
するオープンリーディングフレーム（open reading frame）を含み、さらに、非コーディ
ング調節配列およびイントロンを含むことができる核酸分子をいう。このような天然の対
立遺伝子の変異は、機能的および非機能的なＢ７−４またはＰＤ−１蛋白の両方を含み、
典型的には、Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子のヌクレオチド配列中の１〜５％の変異を起
こすことができる。天然の対立遺伝子の変異の結果得られ、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白
の機能活性が変化しないＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子中のこのようなヌクレオチドの変
異および得られたアミノ酸多型は、本発明の範囲に含まれる。
さらに、他のＢ７−４またはＰＤ−１ファミリーのメンバーをコードしているが、配列
番号：１、３、１０または１１のＢ７−４またはＰＤ−１ファミリー配列とは異なるヌク
レオチド配列を有する核酸分子は、本発明に含まれる。例えば、他のＢ７−４またはＰＤ
−１ ｃＤＮＡは、ヒトＢ７−４またはＰＤ−１のヌクレオチド配列に基づいて同定でき
る。さらに、異なる種から得られるＢ７−４またはＰＤ−１蛋白をコードしているが、配
列番号：１、３、１０または１１のＢ７−４またはＰＤ−１配列とは異なるヌクレオチド
配列を有する核酸分子は、本発明の範囲に含まれる。例えば、マウスＢ７−４またはＰＤ
−１ ｃＤＮＡは、ヒトＢ７−４またはＰＤ−１分子のヌクレオチド配列に基づいて同定
できる。
本発明のＢ７−４またはＰＤ−１ ｃＤＮＡの天然の対立遺伝子変異体およびホモログ
に対応する核酸分子は、本明細書に開示されるＢ７−４またはＰＤ−１核酸に対する相同
性に基づいて、標準的なハイブリッド形成法によるハイブリッド形成プローブとして本明
細書に開示されるｃＤＮＡまたはその一部を使用して、単離できる。例えば、Ｂ７−４ま
たはＰＤ−１ ＤＮＡは、ヒトゲノムＤＮＡライブラリーから、ハイブリッド形成プロー
ブとして配列番号：１、３、１０または１１の全てまたは一部、および標準的なハイブリ
ッド形成法を使用して単離できる（例えば、Sambrook, J., et al. Molecular Cloning:
A Laboratory Manual.2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor
, NY, 1989に記載のように)。さらに、Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子の全てまたは一部
を含む核酸分子は、配列番号：１、３、１０または１１の配列に基づいて設計されるオリ
ゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応により単離できる。例えば
、ｍＲＮＡは細胞から単離でき（例えば、The guanidinium-thiocyanate extraction pro
cedure ofChirgwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294-5299により）、およびｃＤ
ＮＡは逆転写を使用して調製できる（例えば、Moloney MLV reverse transcriptase, ava
ilable fromGibco/BRL, Bethesda, MD; or AMV reverse transcriptase, available fro
m SeikagakuAmerica, Inc., St. Petersburg, FL)。ＰＣＲ増幅用の合成オリゴヌクレオ
チドプライマーは、配列番号：１、３、１０または１１に示されたヌクレオチド配列に基
づいて設計できる。本発明の核酸分子は、にテンプレートとしてｃＤＮＡ、または代わり
ゲノムＤＮＡ、および適当なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して標準的なＰＣＲ増
幅法によって増幅できる。そのようにして増幅された核酸は、適当なベクター中にクロー
ン化でき、ＤＮＡ配列分析により特徴付けられる。さらに、Ｂ７−４またはＰＤ−１ヌク
レオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成法により、例えば、自動Ｄ
ＮＡシンセサイザーを使用して調製できる。
他の具体例において、本発明の単離核酸分子は、少なくとも１５、２０、２５、３０ま
たはそれ以上のヌクレオチドの長さであり、ストリンジエンドな条件下で、配列番号：１
、３、１０または１１のヌクレオチド配列を含む核酸分子とハイブリッド形成する。他の
具体例において、核酸分子は、少なくとも３０、５０、１００、１５０、２００、２５０
、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０または６００ヌクレオチドの長さで
ある。本明細書の用語「ストリンジエンドな条件下でのハイブリッド形成」は、ハイブリ
ッド形成ならびにヌクレオチド配列が、互いに少なくとも３０％、４０％、５０％または
６０％の相同性で、典型的に互いにハイブリッド形成したままでの洗浄のための条件を説
明するものである。好ましくは、配列が、互いに少なくとも約７０％、より好ましくは少
なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％または９０％の相同性で、
典型的に、互いにハイブリッド形成したままであるような条件である。このようなストリ
ンジエンドな条件は、当業者に公知のものであり、Current Protocols in Molecular Bio
logy, JohnWiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1.- 6.3.6.に見ることができる。厳しい
ハイブリッド形成条件の好ましく非制限的な例は、約４５℃で６Ｘの塩化ナトリウム／ク
エン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリッド形成、ついで、５０〜６５℃で０．２Ｘ
のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳでの１回またはそれ以上の洗浄である。好ましくは、ストリ
ンジエンドな条件下での、配列番号：１、３、１０または１１の配列とハイブリッド形成
する本発明の単離核酸分子は、天然に生じる核酸分子に対応する。
本明細書の用語「天然に生じる」核酸分子は、天然に生じる（例えば、天然蛋白をコー
ドする）ヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子をいう。配列番号：１、３、
１０および１１に示されるＢ７−４またはＰＤ−１ヌクレオチド配列に加えて、Ｂ７−４
またはＰＤ−１のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の軽微な変化を導くＤＮＡ配列多型が
、集団に存在しうることは当業者により理解されるだろう。Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝
子中のこのようなゲノム多型は、天然対立遺伝子の変異により集団中の個体に存在できる
。このような天然対立遺伝子の変異は、典型的に、遺伝子のヌクレオチド配列中に１〜２
％の変異を与えることができる。天然対立遺伝子の変異の結果得られ、Ｂ７−４またはＰ
Ｄ−１ポリペプチドの機能活性を変じないＢ７−４またはＰＤ−１中のこのようなヌクレ
オチド変異体および得られたアミノ酸多型は、本発明の範囲に含まれる。
集団中に存在できるＢ７−４またはＰＤ−１の天然に生じる対立遺伝子の変異体に加え
て、さらに、当業者は、例えば、配列番号：１、３、１０または１１のヌクレオチド配列
への突然変異により軽微な変化を導くとこができ、したがって、Ｂ７−４またはＰＤ−１
蛋白の機能活性を変えること無しに、コードされた蛋白のアミノ酸配列の変化を導くこと
ができることを理解するだろう。例えば、「非必須」なアミノ酸残基でのアミノ酸置換を
導くヌクレオチド置換は、配列番号：１、３、１０または１１の配列で形成できる。「非
必須」なアミノ酸残基は、Ｂ７−４またはＰＤ−１分子の機能活性を変えることなしに、
Ｂ７−４核酸分子の野生型の配列（例えば、配列番号：１、３、１０または１１の配列）
から変化させることができる残基である。好ましくは、Ｂ７−４を受容体に、またはＰＤ
−１を天然リガンド（例えば、アラニン走査（scanning）突然変異誘発スクリーンアッセ
イまたは他の認知されたスクリーンアッセイを使用して同定された）に結合させるために
必要であると考えられるＢ７−４またはＰＤ−１の細胞外液ドメイン中の残基は、変化さ
せない。Ｂ７−４分子に関して、非必須であり、したがって、置換されやすい代表的な残
基は、Ｂ７ファミリーメンバー（またはＢ７−４ファミリーメンバー）のアミノ酸配列の
並置比較を行い、保存されない残基を決定することにより、当業者により同定できる。こ
のような残基は保存されないので、より置換されやすい傾向がある。
したがって、本発明の他の態様は、Ｂ７−４またはＰＤ−１活性に必須でないアミノ酸
残基の変化を含むＢ７−４またはＰＤ−１蛋白をコードする核酸分子に関する。このよう
なＢ７−４またはＰＤ−１蛋白は、配列番号：２、４または１２から得るアミノ酸配列と
は異なっているが、やはり固有のＢ７−４活性を維持し、あるいはＰＤ−１の場合には、
Ｂ７−４への結合能力を維持する。Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白の非天然変異体をコード
する単離核酸分子は、コードされる蛋白中に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、付加ま
たは欠失が導入されるように、配列番号；１、３、１０または１１のヌクレオチド配列中
に１つまたはそれ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することができる。突
然変異は、位置特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発のような標準的な方法
により、配列番号：１、３、１０または１１中に導入されることができる。好ましくは、
保存的アミノ酸置換は、１つまたはそれ以上の非必須アミノ酸残基で起こる。「保存的ア
ミノ酸置換」は、アミノ酸残基を同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換する方法の１つ
である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義され、塩基性
側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸
、グルタミン酸）、非電荷の極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、
セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン
、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン
）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖
（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したが
って、好ましくは、Ｂ７−４またはＰＤ−１中の非必須なアミノ酸残基は、同様の側鎖フ
ァミリーの他のアミノ酸残基に置換される。
あるいは、他の具体例において、突然変異体は、例えば、飽和突然変異誘発により、Ｂ
７−４またはＰＤ−１コーディング配列の全てまたは一部と共にランダムに導かれ、得ら
れた突然変異体は、ＤＮＡに結合するおよび／または転写を活性化する能力をスクリーニ
ングでき、機能活性を維持する突然変異体を同定できる。突然変異誘発についで、コード
されたＢ７−４またはＰＤ−１突然変異蛋白は、宿主細胞中に、組み換え法により発現で
き、突然変異蛋白の機能活性は、Ｂ７−４またはＰＤ−１活性を評価するための当該分野
で利用できる分析を使用して決定できる。
したがって、本発明の他の態様は、活性化に必須でないアミノ酸残基の変化を含むＢ７
−４またはＰＤ−１蛋白をコードする核酸分子に関する。
さらなる本発明の他の態様は、Ｂ７−４またはＰＤ−１融合蛋白をコードする単離核酸
分子に関する。Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白、ポリペプチドまたはペプチドをコードする
第２のヌクレオチド配列に作動可能に結合される、少なくともＢ７−４またはＰＤ−１蛋
白、ポリペプチドまたはペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含むこのような
核酸分子は、標準的な組み換えＤＮＡ法により調製できる。
好ましい具体例において、突然変異Ｂ７−４蛋白は、：１）活性化された免疫細胞の増
殖および／またはエフェクター機能の共同刺激（または、例えば、可溶性形態中にあって
は共同刺激の阻害）；２）抗−Ｂ７ファミリー−または抗Ｂ７−４−抗体への結合；およ
び／または３）Ｂ７−４（例えばＰＤ−１）の天然受容体への結合の能力に関してアッセ
イされうる。
好ましい具体例において、突然変異ＰＤ−１蛋白は：１）（例えば、可溶性形態の場合
）活性化された免疫細胞の増殖および／またはエフェクター機能の共同刺激の阻害；２）
抗−ＰＤ−１抗体への結合；および／または３）ＰＤ−１の天然リガンド（例えば、Ｂ７
−４）への結合の能力に関してアッセイされうる。
上記Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白をコードする核酸分子に加えて、さらに、アンチセン
スな単離核酸分子は、モジュレーション作用剤として使用できる。「アンチセンス」核酸
は蛋白をコードする「センス」核酸に相補的なヌクレオチド配列、、例えば、二重ストラ
ンドｃＤＮＡ分子のコーディングストランドに相補的なヌクレオチド配列、またはｍＲＮ
Ａ配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。したがって、アンチセンス核酸は、センス核
酸と水素結合しうる。アンチセンス核酸は、Ｂ７−４またはＰＤ−１コーディングストラ
ンド全体、またはその蛋白にのみ相補的であり得る。１つの具体例において、アンチセン
ス核酸分子は、Ｂ７−４またはＰＤ−１をコードするヌクレオチド配列のコーディングス
トランドの「コーディング領域」に対してアンチセンスである。用語「コーディング領域
」は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域をいう。他の具体
例において、アンチセンス核酸分子は、Ｂ７−４またはＰＤ−１をコードするヌクレオチ
ド配列のコーディングストランドの「非コーディング領域」にアンチセンスである。用語
「非コーディング領域」は、アミノ酸に翻訳されないコーディング領域に隣接する５’お
よび３’配列をいう（例えば、また、５’および３’非翻訳領域をいう）。
本明細書で開示されたＢ７−４またはＰＤ−１をコードするコーディングストランド配
列が得られたならば、本発明のアンチセンス核酸は、Watson and Crick 塩基対合の法則
により設計できる。アンチセンス核酸分子は、Ｂ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡの完全
なコーディング領域に相補的でありえるが、より好ましくは、Ｂ７−４またはＰＤ−１
ｍＲＮＡのコーディングまたは非コーディング領域の蛋白だけにアンチセンスなオリゴヌ
クレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｂ７−４またはＰＤ−
１ ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周囲の領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌク
レオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５
０ヌクレオチドの長さであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、化学合成および当該分
野で公知の工程を使用する酵素ライゲーション反応（enzymatic ligation reaction）を
使用して構築できる。例えば、アンチセンス核酸分子（例えば、アンチセンスヌクレオチ
ド）は、天然に生じるヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増加し、アンチセンス
とセンス核酸の間に形成される二重鎖の物理的安定性を増加するように設計された様々に
修飾されたヌクレオチドを使用して化学的に合成でき、例えば、ホスホロチオエート誘導
体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用できる。アンチセンス核酸の生成に使用でき
る修飾ヌクレオチドの例は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウ
ラシル、５−ヨウドウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５
−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−
チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ
−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデシン、１−メチル
グアニン、１−メチルリノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−
メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチ
ルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウ
ラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル
、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−
５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシ
トシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メ
チルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（
ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロ
ピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを包含する。代わりに
、アンチセンス核酸は、核酸をアンチセンス配向（すなわち、挿入核酸から転写されたＲ
ＮＡは、関連する標的核酸にアンチセンス配向であり、これは以下のサブセクションにさ
らに記載する）にサブクローニングする発現ベクターを使用して生物学的に生産できる。
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、対象に投与され、またはin situにお
いて生産され、これらはハイブリッド形成し、またはＢ７−４またはＰＤ−１蛋白をコー
ドする細胞のｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡに結合し、したがって、例えば、転写
および／または翻訳を阻害することにより、蛋白の発現を阻害する。ハイブリッド形成は
、保存ヌクレオチド相補性により、または例えば、ＤＮＡデュプレックスに結合するアン
チセンス核酸分子の場合、二重螺旋の主要な溝での特別な相互作用により、安定なデュプ
レックスを形成できる。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例は、組織部位での
直接注入を含む。別法として、アンチセンス核酸分子を修飾して選択された細胞を標的化
し、ついで、全身に投与できる。例えば、全身投与するために、例えば、アンチセンス核
酸分子を、細胞表面の受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に結合することに
より、アンチセンス分子が選択された細胞表面で発現した受容体または抗原に結合するよ
うに特異的に修飾できる。また、アンチセンス核酸分子は、本明細書記載のベクターを使
用して細胞にデリバリーできる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を実現させるため
、アンチセンス核酸分子が、強力なｐｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの制御下
に置かれるベクター構造が好ましい。
さらなる具体例において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子で
ある。α−アノマー核酸分子は、相補的なＲＮＡと特異的な二重ストランドハイブリッド
を形成し、そこでは通常のβ−ユニットとは対照的にストランドは互いに平行に伸長する
（Gaultieret al. (1987) Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641）。また、アンチセンス
核酸分子は、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチドを含むことができ（Inoue et al. (1987
) Nucleic AcidsRes. 15:6431-6148)またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログを含むことが
できる（Inoueet al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330)。
さらなる他の具体例において、本発明のアンチセンス核酸分子は、リボザイムである。
リボザイムは、それに相補的な領域を有するｍＲＮＡのような一重ストランド核酸分子を
切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子である。したがって
、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（hammerhead ribozymes）（Haseloff
andGerlach (1988) Nature 334:585-591に記載）は、Ｂ７−４またはＰＤ−１ ｍＲＮ
Ａ転写物を触媒的に切断でき、したがって、Ｂ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡの翻訳を
阻害することに利用できる。Ｂ７−４またはＰＤ−１−コーディング核酸に対して特異性
を有するリボザイムは、本明細書に記載のＢ７−４またはＰＤ−１ｃＲＮＡのヌクレオ
チド配列（すなわち、配列番号：１、３、１０または１１）に基づいて設計できる。例え
ば、TetrahymenaＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体は、活性部位のヌクレオチド配列が、
Ｂ７−４またはＰＤ−１−コーディングｍＲＮＡに切断されるヌクレオチド配列に相補的
であるように構築できる。例えば、Cech らの米国特許第４，９８７，０７１号；およびC
echらの米国特許第５，１１６，７４２号参照。別法として、Ｂ７−４またはＰＤ−１ｍ
ＲＮＡは、ＲＮＡ分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを
選択することに使用できる。例えば、Bartel, D. and Szostak, J. W. (1993) Science 2
61:1411-1418参照。
代わりに、Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子発現は、Ｂ７−４またはＰＤ−１の調節領域
（regulatoryregion）（例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１プロモーターおよび／または
エンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列をターゲティングすることにより阻害でき、
標的細胞中のＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子の転写を防ぐ三重螺旋構造を形成する。一般
的に、Helene,C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6): 569-84; Helene, C. et al (199
2) Ann. N.Y.Acad. Sci. 660:27-36; and Maher, L. J. (1992) Bioessays 14(12):807-
15参照。
さらなる他の具体例において、本発明のＢ７−４またはＰＤ−１核酸分子は、塩基部、
糖部、またはリン酸骨格において修飾でき、例えば、安定性、ハイブリッド形成、または
分子の溶解性を改善できる。例えば、核酸分子のデオキシリボースリン酸骨格は、ペプチ
ド核酸を生じるよう修飾できる（Hyrup, B. and Nielsen, P. E. (1996) Bioorg. Med. C
hem. 4(1):5-23）。本明細書の用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボ
ースリン酸骨格を、擬似ペプチド骨格により置換し、４つの天然核塩基だけを維持た核酸
模倣物、例えば、ＤＮＡ模倣物を意味する。ＰＮＡの天然の骨格は、低イオン強度の環境
下でＤＮＡおよびＲＮＡに特異的なハイブリッド形成を可能にすることが示されている。
ＰＮＡオリゴマーの合成は、標準的な、Hyrup and Nielsen (1996) supra and Perry-O'K
eefe et al.(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-675に記載のように固相ペプ
チド法を使用して実行できる。
Ｂ７−４またはＰＤ−１核酸分子のＰＮＡは、治療および診断用に使用できる。例えば
、ＰＮＡは、アンチセンスまたは抗原作用剤として、遺伝子発現の配列特異的なモジュレ
ーションに、例えば、転写または翻訳の停止を誘発し、または複製を阻害することにより
、使用できる。また、Ｂ７−４またはＰＤ−１核酸分子のＰＮＡは、遺伝子中の単塩基対
突然変異体の分析に（例えば、ＰＮＡ−指向性ＰＣＲ制限）、他の酵素を組み合わせて使
用される場合には「人工制限酵素」として（例えば、上記Ｓ１ヌクレアーゼ（Hyrup and
Nielsen (1996)supra））、またはＤＮＡ配列またはハイブリッド形成用のプローブまた
はプライマーとして（Hyrup and Nielsen (1996) supra; Perry-O'Keefe et al. (1996)
supra）使用できる。
他の具体例において、Ｂ７−４またはＰＤ−１のＰＮＡは、親油性または他のヘルパー
基をＰＮＡに付着することにより、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成により、またはリポソー
ムまたは当業者に公知の薬剤デリバリーの他の方法により、（例えば、安定性または細胞
摂取を高めるため）修飾できる。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組み合わせ
ることができるＢ７−４またはＰＤ−１核酸分子のＰＮＡ−ＤＮＡキメラを得ることがで
きる。このようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮＡｓｅＨおよびＤＮＡポリ
メラーゼ）に、ＤＮＡ部分との相互作用を可能ならしめ、その一方で、ＰＮＡ部分は、高
い結合アフェニティーおよび特異性を提供するであろう。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基
の積み重ね、核塩基間の結合の数、および配向性に関して選択される適当な長さのリンカ
ーを使用して結合できる（Hyrup B. and Nielsen (1996) supra）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメ
ラの合成は、HyrupB. and Nielsen(1996) supra および Finn P. J. et al. (1996) Nuc
leic Acids Res.24(17):3357-63に記載のように実行できる。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準
的なホスホラミドカップリング化学物質を使用して、固体支持体上で合成できる。修飾ヌ
クレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ
−チミジンホスホラミド）は、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端間のリンカーとして使用できる
（Mag, M.et al. (1989) Nucleic acid Res. 17:5973-88)。ついで、ＰＮＡモノマーは
、キメラ分子を生成する段階的な方法で、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメ
ントとカップリングする（Finn P. J. et al. (1996) supra）。代わりに、キメラ分子は
、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントで合成できる（Peterser, K. H. et
al.(1975) Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:1119-11124）。
他の具体例において、オリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付加基（例えば、
インビボでの宿主細胞受容体のターゲティングのために）、あるいは細胞膜（例えば、Le
tsinger et al.(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre et al. (
1987) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; ＰＣＴ出願ＷＯ８８／０９８１０参照
）または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ８９／１０１３４）の貫通を促進する作用
剤を包含する。加えて、オリゴヌクレオチドは、ハイブリッド形成により誘発される切断
剤（例えば、Krolet al. (1988) Biotechniques 6:958-976参照）または挿入剤（例えば
、Zon(1988) Pharm. Res. 5:539-549参照）で修飾できる。このために、オリゴヌクレオ
チドは、他の分子（例えば、ペプチド、ハイブリッド形成により誘発される架橋剤、運搬
剤またはハイブリッド形成により誘発される切断剤）に結合できる。
III．単離されたＢ７−４またはＰＤ−１蛋白および抗Ｂ７−４またはＰＤ−１抗体
さらに、単離されたＢ７−４またはＰＤ−１蛋白、およびその生物活性部分、並びに抗
Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白は、モジュレーション（モジュレーション）剤としても使用
され得る。一態様において、天然Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白は、標準蛋白精製技術を用
いた適当な精製計画により細胞または組織供給源から単離され得る。一態様において、Ｂ
７−４またはＰＤ−１蛋白は、組換えＤＮＡ技術により製造される。組換え発現に代わる
ものとして、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白またはポリペプチドは、標準ペプチド合成技術
を用いて化学合成され得る。
本発明の別の態様は、単離されたＢ７−４またはＰＤ−１蛋白に関するものである。好
ましくは、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白は、配列番号１、３、１０または１１によりコー
ドされるアミノ酸配列を含む。別の好ましい態様の場合、蛋白は、配列番号２、４または
１２のアミノ酸配列を含む。他の態様において、蛋白は、少なくとも５０％、少なくとも
６０％アミノ酸同一性、さらに好ましくは７０％アミノ酸同一性、さらに好ましくは８０
％、およびさらに好ましくは９０％または９５％アミノ酸同一性を有しており、アミノ酸
配列は配列番号２、４または１２に示されている。
他の態様において、本発明は、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白の単離部分を提供する。例
えば、Ｂ７−４蛋白は、シグナル配列、およびＩｇＶドメインおよびＩｇＣドメインを含
む。配列番号２のシグナル配列は、アミノ酸１付近からアミノ酸１８付近に示されている
。配列番号４のシグナル配列は、アミノ酸１付近からアミノ酸１８付近に示されている。
配列番号２のＩｇＶドメインは、アミノ酸１９付近からアミノ酸１３４付近に示されてお
り、配列番号４のＩｇＶドメインはアミノ酸１９付近からアミノ酸１３４付近に示されて
いる。配列番号２のＩｇＣドメインは、アミノ酸１３５付近からアミノ酸２２７付近に示
されており、配列番号４のＩｇＣドメインは、アミノ酸１３５付近からアミノ酸２２７付
近に示されている。配列番号２に例示されているＢ７−４分子の親水性テイルは、アミノ
酸２２８付近からアミノ酸２４５付近に示された親水性テイルを含む。配列番号４に例示
されたＢ７−４ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸２３９付近からアミノ酸２５９付
近に示された膜貫通ドメインおよび配列番号４のアミノ酸２６０付近からアミノ酸２９０
付近に示された細胞質ドメインを含む。ＰＤ−１ポリペプチドは２８８アミノ酸長であり
、そのドメイン構造は当業界では公知である（Shinoharaら（１９９４）Genomics ２３：
７０４）。予測される蛋白成熟形態は、約２６８アミノ酸を含み、細胞外ドメイン（１４
７アミノ酸）、膜貫通ドメイン（２７アミノ酸）、膜貫通領域（２７アミノ酸）および細
胞質ドメイン（９４アミノ酸）を含む。４つの潜在的Ｎ−グリコシル化部位は細胞外ドメ
インに見出される（米国特許５６９８５２０）。２個のシステイン残基（cys５４およびc
ys１２３）間の６８アミノ酸残基は、Ｖセット配列のジスルフィド結合免疫グロブリンド
メインとの類似点をもつ（米国特許５６９８５２０）。
さらに本発明は、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白の可溶性形態に関するものである。かか
る形態は、例えば配列番号２に示されているように天然に存し得るかまたは遺伝子工学的
に製造され得、例えばＢ７−４またはＰＤ−１蛋白の細胞外ドメインを含み得る。典型的
Ｂ７−４細胞外ドメインは、配列番号４のほぼアミノ酸１９−２３８を含む。典型的ＰＤ
−１細胞外ドメインは、配列番号１２のほぼアミノ酸２１−２８８を含む。
一態様において、Ｂ７−４ポリペプチドの細胞外ドメインは、Ｂ７−４ポリペプチドの
成熟形態、例えば、ＩｇＶおよびＩｇＣドメインを含むが、Ｂ７−４ポリペプチドの膜貫
通および細胞質ドメイン（例、配列番号４のアミノ酸１９付近からアミノ酸２３８）また
は配列番号２のアミノ酸１９付近からアミノ酸２４５は含まない。
一態様において、ＰＤ−１ポリペプチドの細胞外ドメインは、ＰＤ−１ポリペプチドの
成熟形態、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリードメイン（例、Ｖセット配列）を
含むが、ＰＤ−１ポリペプチドの膜貫通および細胞質ドメイン（例、配列番号１２のアミ
ノ酸２１−２８８付近）は含まない。
Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白の生物活性部分は、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白のアミノ
酸配列と充分な相同性を示すかまたはそこから誘導されたアミノ酸配列を含むペプチドを
含んでおり、完全長Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白より少ないアミノ酸を含み、Ｂ７−４ま
たはＰＤ−１蛋白の少なくとも一活性、好ましくは天然結合相手への結合能力を呈する。
典型的には、生物活性部分は、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白の少なくとも一活性を伴うド
メインまたはモチーフを含む。Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白の生物活性部分は、例えば少
なくとも１０、２５、５０、１００、１５０、２００またはそれ以上のアミノ酸長である
ポリペプチドであり得る。
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを測定するため、最適な
比較を目的として配列を並置する（例、ギャップは、最適なアラインメント（並置）のた
めに第１および第２アミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入され得、非相同性配
列は比較目的に関しては無視され得る）。好ましい態様において、比較目的用に並置させ
たレファレンス配列の長さは、レファレンス配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは
少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６
０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、８０％または９０％である。次いで、対応す
る位置にある残基を比較し、一配列における位置を他の配列で対応する位置と同じ残基が
占めるとき、分子はその位置において同一である。従って、２配列間の同一性パーセント
は、２配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一位置の＃／
位置の総＃×１００）。２配列間の同一性％は、２配列の最適アラインメントのために導
入される必要がある、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮した上での、配列が共
有する同一位置の数の関数である。ここで使用されているアミノ酸または核酸「同一性」
は、アミノ酸または核酸「相同性」と均等内容である。
配列比較および２配列間の同一性パーセントの測定は、数学的アルゴリズムを用いて遂
行され得る。好ましい態様において、２アミノ酸配列間の同一性パーセントは、ブロサム
６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、および１６、１４、１２、１０、８
、６または４のギャップ重量（gap weight）および１、２、３、４、５または６の長さ重
量（lengthweight）を用いた、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで
入手可能）におけるＧＡＰプログラムを用いて測定される。さらに別の好ましい態様にお
いて、２ヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳgapdna.ＣＭＰマトリックス
および４０、５０、６０、７０または８０のギャップ重量および１、２、３、４、５また
は６の長さ重量を用いた、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可
能）におけるＧＡＰプログラムを用いて測定される。
さらに本発明の核酸および蛋白配列を「クウェリー（query）配列」として使用するこ
とにより、パブリックデータベースに対する検索が遂行され、例えば他のファミリー構成
員または関連配列が同定され得る。かかる検索は、Altschulら（１９９０）J.Mol.Biol.
２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２.０
）を用いて遂行され得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、ス
コア＝１００、ワード長＝１２で遂行することにより、本発明のＢ７−４またはＰＤ−１
核酸分子と相同的なヌクレオチド配列が得られる。ＢＬＡＳＴ蛋白検索を、ＸＢＬＡＳＴ
プログラム、スコア＝５０、語長＝３で遂行することにより、本発明のＢ７−４またはＰ
Ｄ−１蛋白分子と相同的なアミノ酸配列が得られる。比較目的用のギャップトアラインメ
ントを得るためには、Altschulら（１９９７）Nucleic Acids Res.２５（１７）：３３８
９−３４０２記載の要領でギャップトＢＬＡＳＴが利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびギャ
ップトＢＬＡＳＴプログラムを用いるとき、それぞれのプログラム（例、ＸＢＬＡＳＴお
よびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターが使用され得る。例えば、存在１１および
伸長１で設定されたギャップペナルティーでデフォルトBlastnマトリックス１−３を用い
て、本発明のヌクレオチド配列を分析した。デフォルト設定：存在１１および伸長１で設
定されたギャップペナルティーでのブロサム６２マトリックスを用いて、本発明のアミノ
酸配列を分析した。http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照。
本発明はまた、Ｂ７−４またはＰＤ−１キメラまたは融合蛋白を提供する。ここで使用
されているＢ７−４またはＰＤ−１「キメラ蛋白」または「融合蛋白」は、非Ｂ７−４ま
たはＰＤ−１ポリペプチドに機能し得るように結合されたＢ７−４またはＰＤ−１ポリペ
プチドを含む。「Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチド」は、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポ
リペプチドに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含し、「非Ｂ７−４または
ＰＤ−１ポリペプチド」は、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白と実質的に相同的ではない蛋白
、例えばＢ７−４またはＰＤ−１蛋白とは異なり、同一または異なる生物体に由来する蛋
白に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。Ｂ７−４またはＰＤ−１融
合蛋白内では、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドは、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白の
全部または一部に対応し得る。好ましい態様において、Ｂ７−４またはＰＤ−１融合蛋白
は、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白の少なくとも１つの生物活性部分、例えばＢ７−４また
はＰＤ−１蛋白の細胞外ドメインを含む。融合蛋白内では、「機能し得るように結合され
た」の語は、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドおよび非Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリ
ペプチドが互いに枠内（in-frame）融合されていることを示すものとする。非Ｂ７−４ま
たはＰＤ−１ポリペプチドは、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドのＮ−末端またはＣ
−末端に融合され得る。
例えば、一態様では、融合蛋白は、Ｂ７−４またはＰＤ−１配列がＧＳＴ配列のＣ−末
端に融合されているＧＳＴ−Ｂ７−４またはＧＳＴ−ＰＤ−１融合蛋白である。別の態様
では、融合蛋白は、Ｂ７−４またはＰＤ−１ヌクレオチド配列がベクター、例えばｐＣＥ
Ｐ４−ＨＡベクター（Herrscher,R.F.ら（１９９５）Genes Dev.９：３０６７−３０８２
）に挿入されているＢ７−４またはＰＤ−１−ＨＡ融合蛋白であり、例えばＢ７−４また
はＰＤ１配列はインフルエンザ血球凝集素エピトープ標識に枠内融合されている。かかる
融合蛋白は、組換えＢ７−４またはＰＤ−１蛋白の精製を容易にし得る。
Ｂ７−４またはＰＤ−１融合蛋白は、Ｂ７４活性を有する第１ペプチドをコードするヌ
クレオチド配列および第１ペプチドの溶解性、親和力、安定性または結合価を改変する部
分、例えば免疫グロブリン定常部に対応する第２ペプチドをコードするヌクレオチド配列
の組換え発現により製造され得る。好ましくは、第１ペプチドは、Ｂ７−４ポリペプチド
の一部（例、活性化免疫細胞の共刺激または阻害をモジュレーションするのに充分である
配列番号４に示された配列のアミノ酸残基１−２３８または１９−２３８（シグナル配列
開裂後）の一部）から成る。別の好ましい態様において、第１ペプチドは、ＰＤ−１ポリ
ペプチドの一部（例、活性化免疫細胞の共刺激または阻害をモジュレーションするのに充
分である配列番号１２に示された配列のアミノ酸残基１−２８８（またはシグナルペプチ
ド開裂後の２１−２８８）の一部）から成る。第２ペプチドは、免疫グロブリン定常部、
例えばヒトＣγ１ドメインまたはＣγ４（例、ヒトＩｇＣγ１またはヒトＩｇＣγ４のヒ
ンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域、例えばCaponら、米国特許５１１６９６４、５５８０７
５６、５８４４０９５など参照、出典明示により本明細書の一部とする）を含み得る。生
成した融合蛋白は、改変されたＢ７−４またはＰＤ−１溶解性、結合親和力、安定性およ
び／または結合価（すなわち１分子当たりで利用可能な結合部位の数）を有し得、蛋白精
製効率を高め得る。組換え技術により製造される融合蛋白およびペプチドは、蛋白または
ペプチドを含む細胞および培地の混合物から分泌され単離され得る。別法として、蛋白ま
たはペプチドを細胞質により保持し、細胞を採取し、溶解し、蛋白を単離し得る。細胞培
養物は、典型的には宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養に適した培地は当
該分野で公知である。蛋白およびペプチドは、蛋白およびペプチド精製に関し当該分野で
公知の技術を用いて細胞培養培地、宿主細胞またはその両方から単離され得る。宿主細胞
をトランスフェクションし、蛋白およびペプチドを精製する技術は当該分野で公知である
。
特に好ましいＢ７−４またはＰＤ−１ Ｉｇ融合蛋白は、免疫グロブリン定常部（例、
Ｆｃ領域）に結合されたヒトＢ７−４またはＰＤ−１の細胞外ドメイン部分または可変部
様ドメインを含む。免疫グロブリン定常部は、免疫グロブリン構造に固有のエフェクター
活性を低減化または排除する遺伝子修飾を含み得る。例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポ
リペプチドの細胞外部分をコードするＤＮＡは、例えばＷＯ９７／２８２６７で示されて
いる通り、位置指定突然変異導入法により修飾されたヒトＩｇＧγ１および／またはＩｇ
Ｇγ４のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をコードするＤＮＡに連結され得る。
好ましくは、本発明のＢ７−４またはＰＤ−１融合蛋白は、標準組換えＤＮＡ技術によ
り製造される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントは、慣
用的技術に従い枠内で一緒に連結され、例えば平滑端状またはスタッガー端状末端を用い
て連結させ、制限酵素消化により適当な末端を提供し、適当な場合付着末端を補充し、ア
ルカリ性ホスファターゼ処理により望ましくない連結を回避し、酵素連結反応させる。別
の態様において、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む慣用的技術により合成され得
る。別法として、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、アンカープライマーを用いて実施
され得、これらは２つの連続遺伝子フラグメント間に相補的オーバーハングを生じさせ、
それに続いてアニーリングさせ、再増幅させてキメラ遺伝子配列を生成させ得る（例えば
、CurrentProtocols in Molecular Biology、Ausubelら編、ジョン・ウィリー・アンド
・サンズ：１９９２参照）。さらに、既に融合部分（例、ＧＳＴポリペプチドまたはＨＡ
エピトープ標識）をコードする多くの発現ベクターが市販されている。Ｂ７−４またはＰ
Ｄ−１をコードする核酸は、融合部分がＢ７−４またはＰＤ−１蛋白へ枠内融合されるよ
うにかかる発現ベクター中へクローン化され得る。
別の態様では、融合蛋白は、そのＮ−末端に異種シグナル配列を含むＢ７−４またはＰ
Ｄ−１蛋白である。ある種の宿主細胞（例、哺乳類宿主細胞）では、Ｂ７−４またはＰＤ
−１の発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を通して高められ得る。
本発明のＢ７−４またはＰＤ−１融合蛋白は、医薬組成物に組込まれ、対象にインビボ
投与され得る。Ｂ７−４またはＰＤ−１融合蛋白の使用は、免疫疾患、例えば自己免疫疾
患の処置、または移植体の拒絶阻害の症例に治療上有用である。さらに、本発明のＢ７−
４またはＰＤ−１融合蛋白を免疫原として使用することにより、対象において抗Ｂ７−４
またはＰＤ−１抗体が産生され、Ｂ７−４またはＰＤ−１が精製され、スクリーニングア
ッセイでＢ７−４とＢ７−４受容体、例えばＰＤ−１との相互作用を阻止する分子が同定
され得る。
好ましくは、本発明のＢ７−４またはＰＤ−１キメラまたは融合蛋白は、標準組換えＤ
ＮＡ技術により製造される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグ
メントは、慣用的技術に従い枠内で一緒に連結され、例えば平滑端状またはスタッガー端
状末端を用いて連結させ、制限酵素消化により適当な末端を提供し、適当な場合付着末端
を補充し、アルカリ性ホスファターゼ処理により望ましくない連結を回避し、酵素連結反
応させる。別の態様において、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む慣用的技術によ
り合成され得る。別法として、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、アンカープライマー
を用いて実施され得、これらは２つの連続遺伝子フラグメント間に相補的オーバーハング
を生じさせ、それに続いてアニーリングさせ、再増幅させてキメラ遺伝子配列を生成させ
得る（例えば、CurrentProtocols in Molecular Biology、Ausubelら編、ジョン・ウィ
リー・アンド・サンズ：１９９２参照）。さらに、既に融合部分（例、ＧＳＴポリペプチ
ド）をコードする多くの発現ベクターが市販されている。Ｂ７−４またはＰＤ−１をコー
ドする核酸は、融合部分がＢ７−４またはＰＤ−１蛋白へ枠内融合されるようにかかる発
現ベクターへクローン化され得る。
本発明はまた、Ｂ７−４またはＰＤ−１アゴニスト（ミメティクス（擬似物質）mimeti
cs）としてまたはＢ７−４またはＰＤ−１アンタゴニストとして機能するＢ７−４または
ＰＤ−１蛋白の変異体に関するものである。Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白の変異体は、突
然変異導入、例えばＢ７−４またはＰＤ−１蛋白の離散した点突然変異または末端切断に
より生成され得る。Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白のアゴニストは、Ｂ７−４またはＰＤ−
１蛋白の天然に存する形態の生物活性と実質的に同じものまたはそのサブセットを保持し
得る。Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白のアンタゴニストは、例えばＢ７−４またはＰＤ−１
蛋白の細胞活性を競争的にモジュレーションすることにより、Ｂ７−４またはＰＤ−１の
蛋白の天然に存する形態の活性の一つまたはそれ以上を阻害し得る。すなわち、特異的生
物作用は、制限された機能の変異型で処理することにより誘導され得る。一態様では、蛋
白の天然に存する形態の生物活性のサブセットを有する変異体で対象を処置すると、Ｂ７
−４またはＰＤ−１蛋白の天然に存する形態で処置した場合に対して対象における副作用
が少なかった。
一態様において、Ｂ７−４またはＰＤ−１アゴニスト（ミメティクス）としてまたはＢ
７−４またはＰＤ−１アンタゴニストとして機能するＢ７−４またはＰＤ−１蛋白の変異
体は、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白アゴニストまたはアンタゴニスト活性についてＢ７−
４またはＰＤ−１蛋白の突然変異体、例えば先端切除突然変異体の組み合わせライブラリ
ーをスクリーニングすることにより同定され得る。一態様において、Ｂ７−４またはＰＤ
−１変異体の雑多なライブラリーは、核酸レベルでの組み合わせ突然変異導入により生成
され、雑多な遺伝子ライブラリーによりコードされる。Ｂ７−４またはＰＤ−１変異体の
雑多な（variegated）ライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝
子配列へ酵素的に連結させることにより製造され得、その場合潜在的Ｂ７−４またはＰＤ
−１配列の縮重セットは、個々のポリペプチドとして、または別法として、そこにＢ７−
４またはＰＤ−１配列のセットを含む大型融合蛋白（例、ファージディスプレーの場合）
のセットとして発現可能である。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的Ｂ７−４または
ＰＤ−１変異体のライブラリーを製造するのに使用され得る様々な方法がある。縮重遺伝
子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成装置で遂行され得、次いで合成遺伝子は適当な発現
ベクターへ結合され得る。遺伝子の縮重セットの使用により、一混合物で、潜在的Ｂ７−
４またはＰＤ−１配列の目的とするセットをコードする配列が全て提供され得る。縮重オ
リゴヌクレオチドの合成方法は当業界では公知である（例えば、Narang,S.A.（１９８３
）Tetrahedron３９：３、Itakuraら（１９８４）Annu.Rev.Biochem.５３：３２３、Itak
uraら（１９８４）Science１９８：１０５６、Ikeら（１９８３）NucleicAcid Res.１１
：４７７参照）。
さらに、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白コーディング配列のフラグメントのライブラリー
を用いて、Ｂ７−４またはＰＤ−１フラグメントの雑多な集団を生成することにより、Ｂ
７−４またはＰＤ−１蛋白の変異体がスクリーニングされ、それに続いて選択され得る。
一態様において、コーディング配列フラグメントのライブラリーは、１分子につきほぼ１
回のみニッキングが行なわれ、二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを再生することにより異
なるニック産物からセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成させ、Ｓ１ヌ
クレアーゼ処理により再形成二本鎖から一本鎖部分を除去し、そして生成したフラグメン
トライブラリーを発現ベクターへ結合させる条件下、ヌクレアーゼでＢ７−４またはＰＤ
−１コーディング配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを処理することにより生成され得る。
この方法により、様々なサイズのＢ７−４またはＰＤ−１蛋白のＮ−末端、Ｃ−末端およ
び内部フラグメントをコードする発現ライブラリーが誘導され得る。
点突然変異または先端切除により製造された組み合わせライブラリーの遺伝子産物をス
クリーニングするため、および選択された特性を有する遺伝子産物に関してｃＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングするための幾つかの技術が当業界では知られている。上記技術
は、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白の組み合わせ突然変異導入により生成された遺伝子ライ
ブラリーの迅速なスクリーニングに適合し得る。高処理量分析ができる、大きな遺伝子ラ
イブラリーのスクリーニングに最も広範に使用されている技術は、典型的には遺伝子ライ
ブラリーを複製可能な発現ベクターへクローニングし、生成したベクターのライブラリー
で適当な細胞を形質転換し、そして目的とする活性の検出により、産物が検出された遺伝
子をコードするベクターの単離が容易になる条件下で組み合わせ遺伝子を発現させること
を含む。再帰アンサンブル突然変異導入法（Recursive ensemble mutagenesis, ＲＥＭ）
という、ライブラリーにおける機能性突然変異体の頻度を高める新規技術を、スクリーニ
ングアッセイと組み合わせて使用することにより、Ｂ７−４またはＰＤ−１変異体が同定
され得る（ArkinおよびYouvan（１９９２）Proc.Natl.Acad.Sci.USA８９：７８１１−７
８１５、Delagraveら（１９９３）ProteinEng.６（３）：３２７−３３１）。
一態様では、細胞に基くアッセイを利用することにより、雑多なＢ７−４またはＰＤ−
１ライブラリーが分析され得る。例えば、発現ベクターのライブラリーは、Ｂ７−４また
はＰＤ−１を普通に合成し、分泌する細胞系へトランスフェクションされ得る。次いで、
Ｂ７−４またはＰＤ−１および特定突然変異体Ｂ７−４またはＰＤ−１が分泌されるよう
にトランスフェクション細胞を培養すると、細胞上清でのＢ７−４またはＰＤ−１活性に
対する突然変異体の発現効果が、例えば若干数の機能的アッセイのいずれかにより検出さ
れ得る。次いで、プラスミドＤＮＡを細胞から回収し、Ｂ７−４またはＰＤ−１活性の阻
害または別法として強化について評価し、そして個々のクローンはさらに特性確認され得
る。
天然に存するアミノ酸のみで構成されるＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドに加えて
、Ｂ７−４またはＰＤ−１ペプチドミメティクスもまた提供される。ペプチド類似体は、
鋳型ペプチドの場合と類似した特性をもつ非ペプチド薬剤として製薬業界では常用されて
いる。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド・ミメティクス」または「ペプ
チドミメティクス」と呼ばれ（Fauchere,J.（１９８６）Adv.Drug Res.１５：２９、Vebe
rおよび Freidinger（１９８５）TINS３９２頁、および Evansら、（１９８７）J.Med.C
hem.３０：１２２９、出典明示により本明細書の一部とする）、通常コンピューター化分
子モデリングの助けにより開発される。治療上有用なペプチドと構造的に類似したペプチ
ドミメティクスを用いることにより、均等内容の治療または予防効果が生成され得る。一
般的に、ペプチドミメティクスは、パラダイムポリペプチド（すなわち、生物または薬理
活性を有するポリペプチド）、例えばヒトＢ７−４またはＰＤ−１と構造的に類似してい
るが、当業界では公知であり、さらに次の参考文献：Spatola,A.F.、“Chemistry and Bi
ochemistry ofAmino Acids,Peptides,and Proteins”中、Weinstein,B.編、Marcel Dekk
er、ニューヨーク、２６７（１９８３）、Spatola,A.F.、VegaData（１９８３年３月）
、第１巻、３刷、“PeptideBackbone Modifications”（概観）、Morley,J.S.（１９８
０）TrendsPharm.Sci.４６３−４６８頁（概観）、Hudson,D.ら（１９７９）Int.J.Pept
.Prot.Res.１４：１７７−１８５（−ＣＨ２ＮＨ、ＣＨ２ＣＨ２−）、Spatola,A.F.ら（
１９８６）LifeSci.３８：１２４３−１２４９（−ＣＨ２−Ｓ）、Hann,M.M.（１９８２
）J.Chem.Soc.PerkinTrans.I.３０７−３１４（−ＣＨ−ＣＨ−、シスおよびトランス）
、Almquist,R.G.ら（１９０）J.Med.Chem.２３：１３９２−１３９８（−ＣＯＣＨ２−）
、Jennings−White,C.ら（１９８２）TetrahedronLett.２３：２５３３（−ＣＯＣＨ２
−）、Szelke,M.ら、ヨーロッパ出願ＥＰ４５６６５（１９８２）ＣＡ：９７：３９４０
５（１９８２）（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）、Holladay,M.W.ら（１９８３）Tetrahedron
Lett.（１９８３）２４：４４０１−４４０４（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−）、およびHruby
,V.J.（１９８２）LifeSci.（１９８２）３１：１８９−１９９（−ＣＨ２−Ｓ−）に記
載されている方法により（各々、出典明示により本明細書の一部とする）、−ＣＨ２ＮＨ
−、ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯ
ＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−および−ＣＨ２ＳＯ−から成る群から選択された結合
によって所望により置換されていてもよい１個またはそれ以上のペプチド結合を有する。
特に好ましい非ペプチド結合は−ＣＨ２ＮＨ−である。かかるペプチドミメティクスは、
例えば、生産性がより経済的である、化学的安定性が大きい、薬理学的特性（半減期、吸
収、有効性、効力等）が高い、特異性が改変されている（例、広域スペクトルの生物活性
）、抗原性が低いことなどを含め、ポリペプチド態様を凌ぐ顕著な利点を有し得る。ペプ
チドミメティクスの標識は、直接的またはスペーサー（例、アミド基）を介して、定量的
構造活性データおよび／または分子モデリングにより予測されるペプチドミメティクス上
の非干渉性位置（複数も可）への１個またはそれ以上の標識の共有結合を通常伴う。上記
非干渉性位置は、一般的にペプチドミメティクスが結合することにより治療効果を生じる
高分子（複数も可）との直接接触を形成しない位置である。ペプチドミメティクスの誘導
体化（例、標識）は、ペプチドミメティクスの目的とする生物学的または薬理学的活性に
実質的には干渉するものであってはならない。
Ｂ７−４またはＰＤ−１アミノ酸配列の１個またはそれ以上のアミノ酸を同じタイプの
Ｄ−アミノ酸（例、Ｌ−リシンの代わりにＤ−リシン）と系統的に置換する方法を用いる
ことにより、さらに安定したペプチドが生成され得る。さらに、Ｂ７−４またはＰＤ−１
アミノ酸配列または実質的に同一となる配列変化を含む強制的（constrained）ペプチド
は、例えば、ペプチドを閉環する分子内ジスルフィド架橋を形成し得る内部システイン残
基を付加することによる、当該分野で公知の方法により生成され得る（RizoおよびGieras
ch（１９９２）Annu.Rev.Biochem.６１：３８７、出典明示により本明細書の一部とする
）。
ここで同定されたＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸配列によると、当業
者であれば、Ｂ７−４またはＰＤ−１ペプチド配列およびその配列変異型に対応するポリ
ペプチドを製造することは可能なはずである。上記ポリペプチドは、多くの場合大型ポリ
ペプチドの一部として、Ｂ７−４またはＰＤ−１ペプチド配列をコードするポリヌクレオ
チドの発現により原核生物または真核生物宿主細胞で製造され得る。別法として、上記ペ
プチドは、化学的方法により合成され得る。組換え宿主における異種蛋白の発現、ポリペ
プチドの化学合成およびインビトロ翻訳に関する方法は、当業界ではよく知られており、
Maniatisら、MolecularCloning：A Laboratory Manual（１９８９）、第２版、コールド
スプリングハーバー、ニューヨーク、Bergerおよび Kimmel、Methods in Enzymology、１
５２巻、Guideto Molecular Cloning Techniques（１９８７）、アカデミック・プレス
、インコーポレイテッド、サンディエゴ、カリフォルニア、Merrifield,J.（１９６９）J
.Am.Chem.Soc.９１：５０１、ChaikenI.M.（１９８１）CRC Crit.Rev.Biochem.１１：２
５５、Kaiserら（１９８９）Science２４３：１８７、Merrifield,B.（１９８６）Scien
ce２３２：３４２、Kent,S.B.H.（１９８８）Annu.Rev.Biochem.５７：９５７、およびO
fford,R.E.（１９８０）SemisyntheticProteins、ウィリー・パブリッシング（これらは
出典明示により本明細書の一部とする）にさらに詳述されている。
ペプチドは、典型的には直接化学合成により製造され、例えばＢ７−４／ＰＤ−１相互
作用のアゴニストまたはアンタゴニストとして使用され得る。ペプチドは、非ペプチド部
分がＮ−末端および／またはＣ−末端への共有結合により結合している、修飾ペプチドと
して製造され得る。ある好ましい態様では、カルボキシ末端またはアミノ末端、またはそ
の両方が化学的に修飾されている。末端アミノおよびカルボキシ基の最も一般的な修飾は
、それぞれアセチル化およびアミド化である。アミノ末端修飾、例えばアシル化（例、ア
セチル化）またはアルキル化（例、メチル化）およびカルボキシ末端修飾、例えばアミド
化、並びに他の末端修飾、例えば閉環は、本発明の様々な態様に組込まれ得る。ある種の
アミノ末端および／またはカルボキシ末端修飾および／またはコア配列へのペプチド伸長
により、有利な物理的、化学的、生化学的および薬理学的特性、例えば高い安定性、強い
効力および／または有効性、血清プロテアーゼに対する耐性、望ましい薬物動態学的特性
などが提供され得る。ペプチドを治療に使用することにより、例えば患者における共刺激
を改変することによって病気が処置され得る。
単離されたＢ７−４またはＰＤ−１蛋白、またはその一部もしくはフラグメント（また
はかかるポリペプチドをコードする核酸分子）を免疫原として使用すると、標準的なポリ
クローナルおよびモノクローナル抗体製造技術を用いることによりＢ７−４またはＰＤ−
１に結合する抗体が産生され得る。完全長Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白も使用され得、ま
たは別法として、本発明は、免疫原として使用されるＢ７−４またはＰＤ−１の抗原性ペ
プチドフラグメントを提供する。Ｂ７−４またはＰＤ−１の抗原性ペプチドが、少なくと
も８個のアミノ酸残基を含み、Ｂ７−４またはＰＤ−１のエピトープを含むことから、ペ
プチドに対して産生した抗体はＢ７−４またはＰＤ−１との特異的免疫複合体を形成する
。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、さらに好ましくは
少なくとも１５個のアミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸残基、
および最も好ましくは少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む。
別法として、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドの抗原性ペプチドフラグメントは、
免疫原として使用され得る。Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドの抗原性ペプチドフラ
グメントは、典型的には配列番号２、４または１２に示されたアミノ酸配列の少なくとも
８個のアミノ酸残基を含み、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドのエピトープを含むこ
とにより、ペプチドに対して産生した抗体はＢ７−４またはＰＤ−１分子との免疫複合体
を形成する。抗原性ペプチドに含まれる好ましいエピトープは、蛋白表面に位置するＢ７
−４またはＰＤ−１の領域、例えば親水性領域である。一態様において、抗体は、Ｂ７−
４またはＰＤ−１分子に実質的には特異的に結合する。別の態様において、抗体はＢ７−
４またはＰＤ−１ポリペプチドに特異的に結合する。
好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも約１０個のアミノ酸残基、さらに好ましく
は少なくとも約１５個のアミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも約２０個のアミノ酸
残基、および最も好ましくは少なくとも約３０個のアミノ酸残基を含む。抗原性ペプチド
に含まれる好ましいエピトープは、蛋白表面に位置するＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプ
チドの領域、例えば親水性領域であり、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドに特有であ
る。一態様において、上記エピトープは、一つの種、例えばマウスまたはヒト由来のＢ７
−４またはＰＤ−１蛋白に特異的であり得る（すなわち、種全体にわたって保存されてい
るわけではないＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドの領域に及ぶ抗原性ペプチドが免疫
原として使用される。上記非保存残基はアラインメント、例えば本明細書記載のものを用
いて測定され得る）。Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白の標準的な疎水性分析を遂行すること
により、親水性領域が確認され得る。
典型的にはＢ７−４またはＰＤ−１免疫原を用いて、適当な対象（例、ウサギ、ヤギ、
マウスまたは他の哺乳類）を免疫原で免疫化することにより抗体が産生される。適当な免
疫原性製品は、例えば組換え発現Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白または化学合成Ｂ７−４ま
たはＰＤ−１ペプチドを含み得る。さらにこの製品は、アジュバント、例えばフロイント
完全または不完全アジュバント、または同様の免疫刺激剤を含み得る。免疫原性Ｂ７−４
またはＰＤ−１製品で適当な対象を免疫化すると、ポリクローナル抗Ｂ７−４またはＰＤ
−１抗体応答が誘導される。
別の態様において、核酸ワクチンは、様々な手段、例えば注射（例、筋肉内、皮内、ま
たは粒子加速装置または圧縮ガスを用いて粒子を皮膚へ注入する遺伝子銃による表皮への
ＤＮＡコーティング金粒子のバイオリスティック注射）により投与され得る（Haynesら、
１９９６、J.Biotechnol.４４：３７）。別法として、核酸ワクチンは非侵襲性手段によ
り投与され得る。例えば、純粋または脂質製剤化ＤＮＡは、呼吸器系または標的とされる
他の場所にデリバリーされ得る、例、ＤＮＡの経口デリバリーによるパイエル板（Schubb
ert、１９９７、Proc.Natl.Acad.Sci.USA９４：９６１）。弱毒化微生物は粘膜表面への
デリバリーに使用され得る（Sizemoreら、１９９５、Science、２７０：２９）。
ポリクローナル抗Ｂ７−４またはＰＤ−１抗体は、適当な対象をＢ７−４またはＰＤ−
１免疫原で免疫化することにより上記要領で製造され得る。免疫化対象における抗Ｂ７−
４またはＰＤ−１抗体力価は、標準的技術、例えば固定化Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペ
プチドを用いた酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により時間経過ととも
にモニターされ得る。所望ならば、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドに対して指向し
た抗体分子を、哺乳類から（例、血液から）単離し、さらに公知技術、例えばプロテイン
Ａクロマトグラフィーにより精製すると、ＩｇＧフラクションが得られる。免疫後適当な
時点で、例えば抗Ｂ７−４またはＰＤ−１抗体力価が最高であるとき、抗体産生細胞は、
対象から入手され、標準的技術、例えばKohlerおよびMilstein（１９７５）Nature ２５
６：４９５−４９７により最初に報告されたハイブリドーマ技術（また、Brownら（１９
８１）J.Immunol.１２７：５３９−４６、Brownら（１９８０）J.Biol.Chem.２５５：４
９８０−８３、Yehら（１９７６）Proc.Natl.Acad.Sci.７６：２９２７−３１、および
Yehら（１９８２）Int.J.Cancer２９：２６９−７５も参照）、さらに最近のヒトＢ細胞
ハイブリドーマ技術（Kozborら（１９８３）Immunol.Today ４：７２）、ＥＢＶ−ハイブ
リドーマ技術（Coleら（１９８５）MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy、アラン
R.リス、インコーポレイテッド、７７−９６頁）またはトリオーマ技術によるモノクロ
ーナル抗体の製造に使用され得る。モノクローナル抗体ハイブリドーマ製造技術は公知で
ある（一般的には、Kenneth,R.H.、MonoclonalAntibodies: A New Dimension In Biolog
ical Analyses、プレナム・パブリッシング・コーポレーション、ニューヨーク、ニュー
ヨーク（１９８０）、Lerner,E.A.（１９８１）Yale J.Biol.Med.５４：３８７−４０２
、Gefter,M.L.ら（１９７７）SomaticCell Genet.３：２３１−３６参照）。簡単に述べ
ると、不死細胞系（代表的には骨髄種）を、上記要領でＢ７−４またはＰＤ−１免疫原に
より免疫化した哺乳類からのリンパ球（代表的には脾臓細胞）に融合させ、生成したハイ
ブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングにかけると、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペ
プチと好ましくは特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが同定
される。
リンパ球および不死化細胞系の融合に用いられる多くの公知プロトコルのいずれかが、
抗Ｂ７−４またはＰＤ−１モノクローナル抗体産生目的に適用され得る（例えば、Galfre
,G.ら（１９７７）Nature２６６：５５０５２、Gefterら（１９７７）前出、Lerner（１
９８１）前出、Kenneth（１９８０）前出参照）。さらに、当業者にとって、同様に有用
である上記方法の多くの変形があることは明らかである。典型的には、不死細胞系（例、
骨髄種細胞系）は、リンパ球と同じ種の哺乳類に由来する。例えば、ネズミハイブリドー
マは、本発明免疫原性製品により免疫化したマウスからのリンパ球を不死化マウス細胞系
と融合させることにより製造され得る。好ましい不死細胞系は、ヒポキサンチン、アミノ
プテリンおよびチミジンを含む培養培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性を示すマウス骨髄種
細胞系である。若干の骨髄種細胞系のいずれかは、標準的技術による融合相手として使用
され得、例えばＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８.６５３またはＳ
ｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄種系がある。これらの骨髄種系は、メリーランド、ロックビルの
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能である。典型
的には、ＨＡＴ感受性マウス骨髄種細胞は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を用
いてマウス脾臓細胞に融合される。次いで、融合から生成したハイブリドーマ細胞はＨＡ
Ｔ培地を用いて選択され、この場合非融合および非生産的融合骨髄種細胞は殺される（非
融合脾臓細胞は、形質転換されていないため数日後に死ぬ）。本発明モノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば標準ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、Ｂ７−４ま
たはＰＤ−１分子と結合する抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングする
ことにより検出される。
別のモノクローナル抗体分泌性ハイブリドーマ製造方法として、モノクローナル抗Ｂ７
−４またはＰＤ−１抗体は、Ｂ７−４またはＰＤ−１を伴う組換え組み合わせ免疫グロブ
リンライブラリー（例、抗体ファージディスプレーライブラリー）のスクリーニングによ
って、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドと結合する免疫グロブリンライブラリー構成
員が単離されることにより同定および単離され得る。ファージディスプレーライブラリー
を作成し、スクリーニングするキットは市販されている（例、ファルマシア・レコンビナ
ント・ファージ・アンチボディー・システム、カタログ番号２７−９４００−０１、およ
びストラタジーンSurfZAP（商標）ファージ・ディスプレー・キット、カタログ番号２４
０６１２）。さらに、抗体ディスプレーライブラリーの作成およびスクリーニングにおい
て特に使用され易い方法および試薬の例は、例えばLadnerら、米国特許第５２２３４０９
号、Kangら、国際公開番号ＷＯ９２／１８６１９、Dowerら、国際公開番号ＷＯ９１／１
７２７１、Winterら、国際公開ＷＯ９２／２０７９１、Marklandら、国際公開番号ＷＯ９
２／１５６７９、Breitlingら、国際公開ＷＯ９３／０１２８８、McCaffertyら、国際公
開番号ＷＯ９２／０１０４７、Garrardら、国際公開番号ＷＯ９２／０９６９０、Ladner
ら、国際公開番号ＷＯ９０／０２８０９、Fuchsら（１９９１）Biotechnology(NY)９：１
３６９−１３７２、Hayら（１９９２）Hum.Antibod.Hybridomas３：８１−８５、Huseら
（１９８９）Science２４６：１２７５−１２８１、Griffithsら（１９９３）EMBOJ. １
２：７２５−７３４、Hawkinsら（１９９２）J.Mol.Biol.２２６：８８９−８９６、Clar
ksonら（１９９０）Nature３５２：６２４−６２８、Gramら（１９９２）Proc.Natl.Acad
.Sci.USA８９：３５７６−３５８０、Garrardら（１９９１）Biotechnology(NY)９：１３
７３−１３７７、Hoogenboomら（１９９１）NucleicAcids Res.１９：４１３３−４１３
７、Barbasら（１９９１）Proc.Natl.Acad.Sci.USA８８：７９７８−７９８２、およびM
cCaffertyら（１９９０）Nature３４８：５５２−５５４において見出され得る。
さらに、組換え抗Ｂ７−４またはＰＤ−１抗体、例えばキメラおよびヒト化モノクロー
ナル抗体は、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含み、標準的組換えＤＮＡ技術を用いて製造
され得るものであり、本発明の範囲内に包含される。上記キメラおよびヒト化モノクロー
ナル抗体は、例えばRobinsonら、国際特許公開ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９、Akiraら
、ヨーロッパ特許出願１８４１８７、Taniguchi,M.、ヨーロッパ特許出願１７１４９６、
Morrisonら、ヨーロッパ特許出願１７３４９４、Neubergerら、ＰＣＴ出願ＷＯ８６／０
１５３３、Cabillyら、米国特許第４８１６５６７号、Cabillyら、ヨーロッパ特許出願１
２５０２３、Betterら（１９８８）Science２４０：１０４１−１０４３、Liuら（１９８
７）Proc.Natl.Acad.Sci.USA８４：３４３９−３４４３、Liuら（１９８７）J.Immunol.
１３９：３５２１−３５２６、Sunら（１９８７）Proc.Natl.Acad.Sci. ８４：２１４−
２１８、Nishimuraら（１９８７）CancerRes.４７：９９９−１００５、Woodら（１９８
５）Nature３１４：４４６−４４９、およびShawら（１９８８）J.Natl.CancerInst.８
０：１５５３−１５５９、Morrison,S.L.(１９８５)Science２２９：１２０２−１２０７
、Oiら（１９８６）Biotechniques４：２１４、Winter 米国特許５２２５５３９、Jones
ら（１９８６）Nature３２１：５５２−５２５、Verhoeyanら（１９８８）Science２３９
：１５３４、およびBeidlerら（１９８８）J.Immunol.１４１：４０５３−４０６０に記
載された方法を用いることにより、当業界で公知の組換えＤＮＡ技術により製造され得る
。
さらに、ヒト化抗体は、標準的プロトコル、例えば米国特許５５６５３３２に開示され
たものに従い製造され得る。別の態様において、抗体鎖または特異的結合対構成成分は、
当業界公知の技術を用いて、例えば米国特許５５６５３３２、５８７１９０７または５７
３３７４３の記載に従い、特異的結合対構成成分のポリペプチド鎖および複製可能遺伝子
ディスプレーパッケージの一成分の融合体をコードする核酸分子を含むベクターおよび単
結合対構成成分の第２ポリペプチド鎖をコードする核酸分子を含むベクター間の組換えに
より製造され得る。細胞内抗体の使用による細胞での蛋白機能の阻害もまた、当該分野で
公知である（例えばCarlson,J.R.（１９８８）Mol.Cell.Biol.８：２６３８−２６４６
、Biocca,S.ら（１９９０）EMBOJ.９：１０１−１０８、Werge,T.M.ら（１９９０）FEBS
Lett.２７４：１９３−１９８、Carlson,J.R.（１９９３）Proc.Natl.Acad.Sci.USA９
０：７４２７−７４２８、Marasco,W.A.ら（１９９３）Proc.Natl.Acad.Sci.USA９０：７
８８９−７８９３、Biocca,S.ら（１９９４）Biotechnology(NY)１２：３９６−３９９、
Chen,S-Yら（１９９４）Hum.GeneTher.５：５９５−６０１、Duan,L.ら（１９９４）Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA９１：５０７５−５０７９、Chen,S-Yら（１９９４）Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA ９１：５９３２−５９３６、Beerli,R.R.ら（１９９４）J.Biol.Chem.２６９
：２３９３１−２３９３６、Beerli,R.R.ら（１９９４）Biochem.Biophys.Res.Commun.２
０４：６６６−６７２、Mhashilkar,A.M.ら（１９９５）EMBO J.１４：１５４２−１５５
１、Richardson,J.H.ら（１９９５）Proc.Natl.Acad.Sci.USA９２：３１３７−３１４１
、MarascoらによるＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０２６１０、およびDuanらによるＰＣＴ公
開番号ＷＯ９５／０３８３２参照）。
一態様において、本発明で使用される抗体は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体
は、単一抗体分子内に２種の異なる抗原に関する結合部位を有する。抗原結合は、同時ま
たは逐次的であり得る。トリオーマおよびハイブリッドハイブリドーマは、二重特異性抗
体を分泌し得る細胞系の２例である。ハイブリッドハイブリドーマまたはトリオーマが産
生する二重特異性抗体の例は、米国特許４４７４８９３に開示されている。二重特異性抗
体は、化学的手段（Staerzら（１９８５）Nature３１４：６２８、およびPerezら（１９
８５）Nature３１６：３５４)およびハイブリドーマ技術（StaerzおよびBevan（１９８
６）Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８３：１４５３、およびStaerzおよびBevan（１９８６）
Immunol,Today７：２４１）により構築された。二重特異性抗体はまた、米国特許５９５
９０８４に記載されている。二重特異性抗体のフラグメントは米国特許５７９８２２９に
記載されている。
二重特異性薬剤はまた、異なる抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞を融合す
ることによって異種ハイブリドーマを製造した後、両抗体を生産および共構築（co-assen
mling）するクローンを同定することにより生成され得る。それらはまた、完全免疫グロ
ブリン鎖またはその一部分、例えばＦａｂおよびＦｖ配列の化学的または遺伝子的コンジ
ュゲーションにより生成され得る。抗体成分はＰＤ−１またはＢ７−４に結合し得る。
抗Ｂ７−４またはＰＤ−１抗体（例、モノクローナル抗体）を用いると、標準的技術、
例えばアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降によりＢ７−４またはＰＤ−１
ポリペプチドが単離され得る。抗Ｂ７−４またはＰＤ−１抗体により、細胞からの天然Ｂ
７−４またはＰＤ−１ポリペプチドおよび宿主細胞において発現される遺伝的組換えによ
り製造されたＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドの精製は容易になり得る。さらに、抗
Ｂ７−４またはＰＤ−１抗体は、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白の検出（例、細胞リゼイト
または細胞上清において）に使用され得る。抗体を検出可能な物質にカップリング（すな
わち、物理的結合）させることにより検出は容易になり得る。従って、一態様において、
本発明の抗Ｂ７−４またはＰＤ−１抗体は、検出可能な物質により標識される。検出可能
な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、ルミネセンス（発光）物質および
放射性物質がある。適当な酵素の例には、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性
ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼがあり、適当
な補欠分子族複合体の例にはストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが
あり、適当な蛍光性物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン
イソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシ
ルクロリドまたはフィコエリスリンがあり、ルミネセンス物質の例にはルミノールがあり
、そして適当な放射性物質の例には１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓおよび３Ｈがある。
本発明のさらに別の態様は、次の工程を含む方法により得られる抗Ｂ７−４またはＰＤ
−１抗体に関するものである：
（ａ）免疫原性Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白またはＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチ
ドに特有なその免疫原性部分により動物を免疫化し、そして
（ｂ）Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白に特異的に結合する抗体を動物から単離する。
IV．組換え発現ベクターおよび宿主細胞
Ｂ７−４またはＰＤ−１ファミリーの蛋白（またはその一部分）をコードする核酸分子
は、ベクター、好ましくは発現ベクターに含まれ得る。ここで使用されている「ベクター
」の語は、それに結合されている別の核酸を輸送し得る核酸分子を包含する。ベクターの
一タイプは「プラスミド」であり、追加的ＤＮＡセグメントが連結され得る環状二本鎖Ｄ
ＮＡループを包含する。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、その場合追加
的ＤＮＡセグメントがウイルスゲノムへ連結され得る。ある種のベクターは、それらが導
入される宿主細胞において自己複製し得る（例、細菌性複製起点を有する細菌性ベクター
およびエピソーム性哺乳類ベクター）。他のベクター（例、非エピソーム性哺乳類ベクタ
ー）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムへ組込まれ、それによって宿主ゲノムと
一緒に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが機能し得るように結合されて
いる遺伝子の発現を指令し得る。上記ベクターは、ここでは「発現ベクター」と称される
。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはプラスミド形態であることが
多い。本明細書の場合、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であること
から、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用され得る。しかしながら、本発
明は、かかる他の形態の発現ベクターで均等内容の機能を果たすもの、例えばウイルスベ
クター（例、複製能欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ伴生ウイルス）を
包含するものと考えられる。
組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の指標細胞（複数も可）におけるＰＤ−
１またはＢ７−４分子の発現、例えば構成的または誘導性発現に適した形態で本発明の核
酸分子を含み得、このことは、組換え発現ベクターが、発現に使用される宿主細胞に基い
て選択された１つまたはそれ以上の調節配列を含むことを意味するもので、発現されるべ
き核酸配列に機能し得るように結合されている。組換え発現ベクター内で、「機能し得る
ように結合されている」は、興味の対象であるヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の
（例、インビトロ転写／翻訳系における、またはベクターが宿主細胞へ導入されたとき宿
主細胞における）発現を可能にする状態で調節配列（複数も可）に結合されていることを
意味するものとする。「調節配列」の語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現
制御エレメント（例、ポリアデニル化シグナル）を包含する。上記調節配列は、例えば G
oeddel（１９９０）MethodsEnzymol.１８５：３−７に記載されている。調節配列には、
多くのタイプの宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を指令するものおよびあ
る種の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指令するもの（例、組織特異的調
節配列）がある。当業者であれば、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選
択、目的蛋白の発現レベルなどの因子により異なり得ることを認識するはずである。本発
明の発現ベクターは、宿主細胞に導入されることにより、ここに記載されたように（例、
Ｂ７−４またはＰＤ−１ファミリーの蛋白、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白の突然変異形態
、融合蛋白など）核酸によりコードされる、融合蛋白またはペプチドを含む蛋白またはペ
プチドを製造し得る。
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物または真核生物細胞におけるＢ７−４または
ＰＤ−１蛋白の発現を目的として設計され得る。例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白は
、細菌細胞、例えばエシェリシア・コリ（E.coli）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベ
クターを用いる）、酵母細胞または哺乳類細胞で発現され得る。適当な宿主細胞について
は、Goeddel（１９９０）前出でさらに検討されている。別法として、組換え発現ベクタ
ーは、例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転
写および翻訳され得る。
原核生物における蛋白の発現は、融合または非融合蛋白の発現を指令する構成的または
誘導性プロモーターを含むベクターによりエシェリシア・コリ（E.coli）で行なわれるこ
とが多い。融合ベクターは、その中にコードされた蛋白に若干のアミノ酸を、通常には組
換え蛋白のアミノ末端に付加する。上記融合ベクターは、典型的には１）組換え蛋白の発
現を高める、２）組換え蛋白の溶解性を高める、および３）アフィニティー精製における
リガンドとして作用することにより組換え蛋白の精製で有用である、といった３つの目的
に適うものである。多くの場合、融合発現ベクターでは、蛋白分解性開裂部位が融合部分
および組換え蛋白の接合点に導入されることにより、融合蛋白精製後に続いて組換え蛋白
が融合部分から分離され得る。上記酵素およびそれらの同族認識配列には、因子Ｘａ、ト
ロンビンおよびエンテロキナーゼがある。典型的融合発現ベクターには、ｐＧＥＸ（ファ
ルマシア・バイオテク・インコーポレイテッド、Smith,D.B.および Johnson,K.S.（１９
８８）Gene６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（ニューイングランド・バイオラブズ、ベヴァ
リー、マサチューセッツ）およびｐＲＩＴ５（ファルマシア、ピスキャタウェイ、ニュー
ジャージー）があり、それぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルト
ースＥ結合蛋白またはプロテインＡを標的組換え蛋白に融合させる。
精製融合蛋白は、Ｂ７−４またはＰＤ−１活性アッセイ（例、下記で詳述されている直
接アッセイまたは競争的アッセイ）において、または例えばＢ７−４またはＰＤ−１蛋白
に特異的な抗体の生成に使用され得る。
適当な誘導性非融合エシェリシア・コリ（E.coli）発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（
Amannら（１９８８）Gene６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ１１ｄ（Studierら（１９
９０）MethodsEnzymol.１８５：６０−８９）がある。ｐTrcベクターからの標的遺伝子
発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転
写に依存する。ｐＥＴ１１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、共発現されたウイルス性
ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎ１）が介在するＴ７ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターか
らの転写に依存する。このウイルス性ポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写
制御下Ｔ７ｇｎ１遺伝子をもつ内在プロファージから宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨ
ＭＳ１７４（ＤＥ３）により供給される。
エシェリシア・コリ（E.coli）における組換え蛋白発現を最大化する一戦略は、蛋白加
水分解的に組換え蛋白を開裂する能力が損なわれた宿主細菌で蛋白を発現させることであ
る（Gottesman,S.（１９９０）MethodsEnzymol.１８５：１１９−１２８）。別の戦略は
、発現ベクターへ挿入される核酸の核酸配列を改変することにより、各アミノ酸に関する
個々のコドンが優先的にエシェリシア・コリ（E.coli）で利用されるものとなるようにす
る方法である（Wadaら（１９９２）NucleicAcids Res.２０：２１１１−２１１８）。本
発明の核酸配列の上記改変は、標準ＤＮＡ合成技術により実施され得る。
別の態様において、Ｂ７−４またはＰＤ−１発現ベクターは、酵母発現ベクターである
。酵母エス・セレベシアエ（S.cerevisiae）で発現するベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅ
ｃ１（Baldariら（１９８７）EMBOJ.６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（KurjanおよびHe
rskowitz（１９８２）Cell３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Schultzら（１９８
７）Gene５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（インビトロゲン・コーポレーション、サ
ンディエゴ、カリフォルニア）およびｐｉｃＺ（インビトロゲン・コーポレーション、サ
ンディエゴ、カリフォルニア）がある。
別法として、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドは、バキュロウイルス発現ベクター
を用いて昆虫細胞で発現され得る。培養昆虫細胞（例、Ｓｆ９細胞）における蛋白発現に
利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Smithら（１９８３）Mol.C
ell Biol.３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Lucklow,V.A.およびSummer
s,M.D.（１９８９）Virology１７０：３１−３９）がある。
さらに別の態様では、本発明の核酸は、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞で発現
される。哺乳類発現ベクターの例には、ｐＭｅｘ−ＮｅｏＩ、ｐＣＤＭ８（Seed,B.（１
９８７）Nature３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Kaufmanら（１９８７）EMBOJ.６
：１８７−１９５）がある。哺乳類細胞で使用される場合には、発現ベクターの制御機能
は、ウイルス調節エレメントにより提供されることが多い。例えば、一般的に使用される
プロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアン
ウイルス４０から誘導される。原核生物および真核生物の両細胞に関する他の適当な発現
系については、Sambrook,J.ら、MolecularCloning: A Laboratory Manual.2nd,ed.,Cold
SpringHarbor Laboratory、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コ
ールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９）の１６および１７章参照。
別の態様において、組換え哺乳類発現ベクターは、特定細胞型で優先的に核酸の発現を
指令し得る（例、組織特異的調節エレメントは核酸の発現に使用される）。組織特異的調
節エレメントは当業界では公知である。適当な組織特異的プロモーターの非限定的な例に
は、アルブミンプロモーター（肝臓特異的、Pinkertら（１９８７）Genes Dev.１：２６
８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（Calameおよび Eaton（１９８８）Adv.Immuno
l.４３：２３５−２７５）、特にＴ細胞受容体プロモーター（WinotoおよびBaltimore（
１９８９）EMBOJ.８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Banerjiら（１９８３）
Cell３３：７２９−７４０、QueenおよびBaltimore（１９８３）Cell３３：７４１−７
４８）、ニューロン特異的プロモーター（例、ニューロフィラメントプロモーター、Byrn
eおよび Ruddle（１９８９）Proc.Natl.Acad.Sci.USA８６：５４７３−５４７７）、膵臓
特異的プロモーター（Edlundら（１９８５）Science ２３０：９１２−９１６）、および
乳腺特異的プロモーター（例、乳漿プロモーター、米国特許第４８７３３１６号およびヨ
ーロッパ出願公開第２６４１６６号）がある。また、発達的調節プロモーター、例えばネ
ズミホックス（hox）プロモーター（KesselおよびGruss（１９９０）Science２４９：３
７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（Campesおよび Tilghman（１
９８９）GenesDev.３：５３７−５４６）も包含される。
さらに、哺乳類細胞で使用される誘導性調節系は当業界では公知であり、例えば遺伝子
発現が重金属イオン（例えば、Mayoら（１９８２）Cell ２９：９９−１０８、Brinster
ら（１９８２）Nature２９６：３９−４２、Searleら（１９８５）Mol.Cell.Biol.５：１
４８０−１４８９参照）、熱ショック（例、Nouerら（１９９１）Heat Shock Response中
、Nouer,L.編、ＣＲＣ、ボカラトン、フロリダ、１６７−２２０頁参照）、ホルモン（例
、Leeら（１９８１）Nature２９４：２２８−２３２、Hynesら（１９８１）Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA ７８：２０３８−２０４２、Klockら（１９８７）Nature３２９：７３４−７
３６、IsraelおよびKaufman(１９８９)Nucl.Acids Res.１７：２５８９−２６０４、お
よびＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２３４３１参照）、ＦＫ５０６−関連分子（例、ＰＣＴ公
開番号ＷＯ９４／１８３１７参照）またはテトラサイクリン類（Gossen,M.および Bujard
,H.（１９９２）Proc.Natl.Acad.Sci.USA８９：５５４７−５５５１、Gossen,M.ら（１
９９５）Science２６８：１７６６−１７６９、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２９４４２、
およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／０１３１３参照）により調節される系がある。従って、
別の態様では、本発明は、Ｂ７−４またはＰＤ−１ ＤＮＡが誘導性真核生物プロモータ
ーに機能し得るように結合されていることにより、真核生物細胞におけるＢ７−４または
ＰＤ−１蛋白の誘導性発現が可能となる組換え発現ベクターを提供する。
さらに本発明は、アンチセンス配向で発現ベクターへクローン化された本発明ＤＮＡ分
子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子は、Ｂ７−４またはＰＤ
−１ ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写による
）を可能にする形で調節配列に機能し得るように結合されている。アンチセンス配向でク
ローン化された核酸に機能し得るように結合された調節配列であって、様々な細胞型にお
けるアンチセンスＲＮＡ分子の連続発現を指令するもの、例えばウイルスプロモーターお
よび／またはエンハンサーが選択され得るか、またはアンチセンスＲＮＡの構成的、組織
特異的または細胞型特異的発現を指令する調節配列が選択され得る。アンチセンス発現ベ
クターは、アンチセンス核酸が高効率調節領域の制御下で製造される組換えプラスミド、
ファージミドまたは弱毒化ウイルス形態であり得、その活性はベクターが導入されている
細胞型により決定され得る。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節を検討したも
のについては、Weintraub,H.ら（１９８６）“AntisenseRNA as a molecular tool for
geneticanalysis”Reviews-Trends in Genetics、第１巻（１）を参照。
さらに本発明は、本発明組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞に関するもので
ある。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」の語は、ここでは互換的に使用されている
。上記の語は特定対象細胞だけでなくかかる細胞の子孫または潜在的子孫も包含するもの
と理解すべきである。突然変異または環境的影響故にある種の修飾が後続の世代で行われ
得るため、上記子孫は事実上親細胞と同一ではあり得ないが、依然としてここで使用され
ている語の範囲内に包含される。
宿主細胞は原核生物または真核生物であり得る。例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白
は、細菌細胞、例えばエシェリシア・コリ（E.coli）、昆虫細胞、酵母または哺乳類細胞
（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）で発現され得る
。他の適当な宿主細胞も当業者に公知である。
ベクターＤＮＡは、慣用的形質転換またはトランスフェクション技術により原核生物ま
たは真核生物細胞へ導入され得る。ここで使用されている「形質転換」および「トランス
フェクション」の語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈澱、ＤＥＡＥ−デキ
ストラン介在トランスフェクション、リポフェクション（脂質小胞を介する遺伝子導入）
または電気穿孔を含め、外来核酸（例、ＤＮＡ）を宿主細胞へ導入するための様々な当業
界公認の技術を包含するものとする。宿主細胞の適当な形質転換またはトランスフェクシ
ョン方法は、Sambrookら（MolecularCloning:A Laboratory Manual．2nd,ed.,Cold Spri
ng HarborLaboratory、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド
スプリングハーバー、ニューヨーク、１９８９）、および他の研究室マニュアルに見出さ
れ得る。
哺乳類細胞の安定したトランスフェクションを行うために、使用される発現ベクターお
よびトランスフェクション技術により、細胞の小フラクションのみが外来ＤＮＡをそれら
のゲノムへ組込み得ることは知られている。これらの成分を同定および選択するために、
選択マーカー（例、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子は、一般的に興味の対象
である遺伝子と一緒に宿主細胞へ導入される。好ましい選択マーカーには、薬剤、例えば
Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートに対する耐性を付与するものがある
。選択マーカーをコードする核酸は、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白をコードするものと同
じベクターで宿主細胞へ導入され得るかまたは別々のベクターで導入され得る。導入され
た核酸により安定してトランスフェクションされた細胞は、薬剤選別により同定され得る
（例、選択マーカー遺伝子が組込まれた細胞は生残り、他の細胞は死ぬ）。
本発明の宿主細胞、例えば培養された原核生物または真核生物宿主細胞は、Ｂ７−４ま
たはＰＤ−１蛋白の製造（すなわち発現）に使用され得る。従って、本発明は、さらに本
発明の宿主細胞を用いたＢ７−４またはＰＤ−１蛋白の製造方法を提供する。前記方法の
一態様は、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白が製造されるように、本発明の宿主細胞（Ｂ７−
４またはＰＤ−１蛋白をコードする組換え発現ベクターが導入された）を適当な培養培地
で培養することを含む。別の態様において、前記方法はさらに、培地または宿主細胞から
のＢ７−４またはＰＤ−１蛋白の単離を含む。
ある種の宿主細胞はまた、ヒト以外のトランスジェニック動物の製造に使用され得る。
例えば、一態様において、宿主細胞は、Ｂ７−４またはＰＤ−１コーディング配列が導入
された受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、上記宿主細胞を用いることにより
、外来性Ｂ７−４またはＰＤ−１配列がゲノムに導入された非ヒトトランスジェニック動
物または内在性Ｂ７−４またはＰＤ−１配列が改変された相同的組換え動物が製造され得
る。上記動物は、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドの機能および／または活性を研究
並びにＢ７−４またはＰＤ−１活性のモジュレーターを同定および／または評価するのに
有用である。ここで使用されている「トランスジェニック動物」は、ヒト以外の動物、好
ましくは哺乳類、さらに好ましくはげっ歯動物、例えばラットまたはマウスであり、この
場合動物の細胞の１個またはそれ以上が導入遺伝子（トランスジーン）を含んでいる。ト
ランスジェニック動物の他の例には、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、雌牛、ヤギ、ニ
ワトリ、両生類などがある。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲ
ノムに組込まれており、成熟動物のゲノムに残存している外性ＤＮＡであり、それによっ
てトランスジェニック動物の１種またはそれ以上の細胞型または組織におけるコードされ
た遺伝子産物の発現が指令される。ここで使用されている「相同的組換え動物」は、ヒト
以外の動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスであり、この場合内在性Ｂ７−
４またはＰＤ−１遺伝子は、動物の発生前に、動物の一細胞、例えば動物の胚性細胞へ導
入された内在性遺伝子および外来性ＤＮＡ分子間の相同的組換えにより改変されている。
トランスジェニック動物は、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染
により、Ｂ７−４またはＰＤ−１をコードする核酸分子を受精卵母細胞の雄性前核へ導入
し、偽妊娠した雌フォスター（養育）動物において卵母細胞を発達させることにより製造
され得る。配列番号１、３、１０または１１のＢ７−４またはＰＤ−１ｃＤＮＡ配列は
、非ヒト動物のゲノムへ導入遺伝子として導入され得る。別法として、ヒトＢ７−４また
はＰＤ−１遺伝子の非ヒト相同体、例えばマウスまたはラットＢ７−４またはＰＤ−１遺
伝子が導入遺伝子として使用され得る。別法として、Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子相同
体、例えば別のＢ７−４またはＰＤ−１ファミリーの構成員が、配列番号１、３、１０ま
たは１１のＢ７−４またはＰＤ−１ファミリーｃＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーション
に基いて単離され（さらに上記サブセクションＩで詳記されている）、導入遺伝子として
使用され得る。また、イントロン配列およびポリアデニル化シグナルを導入遺伝子に含ま
せることにより、導入遺伝子の発現効率を高められ得る。組織特異的調節配列（複数も可
）は、Ｂ７−４またはＰＤ−１導入遺伝子へ機能し得るように結合されることにより、特
定細胞に対してＢ７−４またはＰＤ−１蛋白の発現を指令し得る。胚操作および顕微注入
によるトランスジェニック動物、特に例えばマウスといった動物の製造方法は、当業界で
は既に慣用的なものになっており、例えば、両方ともLederらによる米国特許第４７３６
８６６号および同４８７０００９号、Wagnerらによる米国特許第４８７３１９１号および
Hogan,B.Manipulating the Mouse Embryo（コールドスプリングハーバー・ラボラトリ
ー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、１９８６）で報告されている
。他のトランスジェニック動物の製造には類似方法も使用される。トランスジェニック創
始動物は、そのゲノムにおけるＢ７−４またはＰＤ−１導入遺伝子の存在および／または
動物の組織または細胞におけるＢ７−４またはＰＤ−１ ｍＲＮＡの発現に基いて同定さ
れ得る。次いで、トランスジェニック創始動物を用いることにより、導入遺伝子を有する
動物が追加的に産み出され得る。さらに、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白をコードする導入
遺伝子をもつトランスジェニック動物は、他の導入遺伝子をもつ他のトランスジェニック
動物へとさらに繁殖され得る。
相同的組換え動物を作製するため、Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子の少なくとも一部分
を含むもので、そこに欠失、付加または置換が導入されていることによりＢ７−４または
ＰＤ−１遺伝子が改変、例えば機能的に崩壊されているベクターを製造する。Ｂ７−４ま
たはＰＤ−１遺伝子は、ヒト遺伝子（例、配列番号１、３、１０または１１）であり得る
が、さらに好ましくはヒトＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子の非ヒト相同体である（例、配
列番号１、３、１０または１１のヌクレオチド配列を伴いストリンジェントなハイブリダ
イゼーションにより単離されたｃＤＮＡ）。例えば、マウスＢ７−４またはＰＤ−１遺伝
子を用いることにより、マウスゲノムにおいて内在性Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子を改
変するのに適した相同的組換えベクターが構築され得る。好ましい態様では、相同的組換
え時、内在性Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子が機能崩壊されるようにベクターが設計され
る（すなわち、もはや機能性蛋白をコードしない、「ノックアウト」ベクターとも称され
る）。別法として、相同的組換え時、内在性Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子は突然変異誘
発または他の形で改変されるが、依然として機能性蛋白をコードするようにベクターが設
計され得る（例、上流調節領域を改変することにより、内在性Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋
白の発現が改変され得る）。相同的組換えベクターでは、Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子
の改変部分の５'および３'両末端にＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子の追加的核酸配列が隣
接していることにより、ベクターが担う内在性Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子および胚性
幹細胞における内在性Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子間で相同的組換えが行われ得る。追
加的フランキングＢ７−４またはＰＤ−１核酸配列は、内在性遺伝子との有効な相同的組
換えにとって充分な長さを有する。典型的には、数キロベースのフランキングＤＮＡ（５
'および３'の両末端）がベクターに含まれている（例、相同的組換えベクターの記載につ
いては、Thomas,K.R.およびCapecchi,M.R.（１９８７）Cell５１：５０３参照）。ベク
ターは胚性幹細胞系へ（例、電気穿孔により）導入され、導入されたＢ７−４またはＰＤ
−１遺伝子が内在性Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子と相同的に組換えられている細胞が選
択される（例、Li,E.ら（１９８２）Cell６９：９１５参照）。次いで、選択された細胞
は動物（例、マウス）の未分化胚芽細胞へ注入され、凝集キメラが形成される（例、Brad
ley,A.、Teratocarcinomasand Embryonic Stem Cells:A Practical Approach、Robertso
n,E.J.編（ＩＲＬ、オクスフォード、１９８７）１１３−１５２頁参照）。次いで、キメ
ラ胚を適当な偽妊娠雌養育（フォスター）動物へ移植し、胚を分娩させ得る。生殖細胞に
相同的組換えＤＮＡをもつ子孫を用いることにより、動物の全細胞が導入遺伝子の生殖系
列伝達により相同的組換えＤＮＡを含む動物が産み出され得る。相同的組換えベクターお
よび相同的組換え動物の構築方法は、Bradley,A.（１９９１）Curr.Opin.Biotechnol.２
：８２３−８２９および Le MouellecらによるＰＣＴ国際公開第ＷＯ９０／１１３５４号
、Smithiesらによる同第ＷＯ９１／０１１４０号、Zijlstraらによる同第ＷＯ９２／０９
６８号、およびBernsらによる同第ＷＯ９３／０４１６９号に詳述されている。
前述のものに加えて、熟練した専門技術者であれば、相同的組換えに関して当業界で知
られている他の方法も本発明に適用され得ることは認めるはずである。酵素補助部位特異
的組込み系は当業界では公知であり、第２標的ＤＮＡ分子において予め決められた位置に
ＤＮＡ分子を組込むのに適用され得る。上記酵素補助組込み系の例には、Creリコンビナ
ーゼ−lox標的系（例、Baubonis,W.およびSauer,B.（１９９３）Nucl.Acids Res.２１：
２０２５−２０２９、および Fukushige,S.および Sauer,B.（１９９２）Proc.Natl.Acad
.Sci.USA８９：７９０５−７９０９に記載されたもの）およびＦＬＰリコンビナーゼ−Ｆ
ＲＴ標的系（例、Dang,D.T.およびPerrimon,N.（１９９２）Dev.Genet.１３：３６７−
３７５、およびFiering,S.ら（１９９３）Proc.Natl.Acad.Sci.USA９０：８４６９−８
４７３に記載のもの）がある。テトラサイクリン調節誘導性相同的組換え系、例えばＰＣ
Ｔ公開第ＷＯ９４／２９４４２号およびＰＣＴ公開第ＷＯ９６／０１３１３号に記載され
たものもまた使用され得る。
例えば、別の態様では、導入遺伝子の発現調節を可能にすべく選択された系を含むトラ
ンスジェニック非ヒト動物が製造され得る。かかる系の一例は、バクテリオファージＰ１
のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の記述
については、例えばLaksoら（１９９２）Proc.Natl.Acad.Sci.USA８９：６２３２−６２
３６参照。リコンビナーゼ系の別の例は、サッカロマイシス・セレヴィシアエ（Saccharo
mycescerebvisiae）のＦＬＰリコンビナーゼ系である（O'Gormanら（１９９１）Science
２５１：１３５１−１３５５）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系を導入遺伝子の発現
調節に使用する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択された蛋白の両方をコードする導
入遺伝子を含む動物が要求される。上記動物は、例えば、一方は選択された蛋白をコード
する導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む２種のトラ
ンスジェニック動物を交配することにより、「二重」トランスジェニック動物の構築を通
して提供され得る。
また、ここに記載されているヒト以外のトランスジェニック動物のクローンは、Wilmut
,I.ら（１９９７）Nature３８５：８１０−８１３およびＰＣＴ国際公開第ＷＯ９７／０
７６６８号および同第ＷＯ９７／０７６６９号記載の方法により製造され得る。簡単に述
べると、トランスジェニック動物からの細胞、例えば体細胞は、単離され、成長周期を脱
し、Ｇ０期へ入るように誘導され得る。次いで、静止細胞は、例えば電気パルスの使用を
通じて、静止細胞が単離されたのと同種の動物からの除核卵母細胞へ融合され得る。次い
で、再構築された卵母細胞は、それが桑実胚または芽細胞に発達するように培養され、次
いで偽妊娠した雌フォスター動物へ移される。この雌フォスター動物から生まれた子孫は
、細胞、例えば体細胞が単離された動物のクローンとなる。
Ｖ.医薬組成物
Ｂ７−４またはＰＤ−１モジュレーター（例、Ｂ７−４またはＰＤ−１阻害または刺激
剤、例えば上記のＢ７−４またはＰＤ−１核酸分子、蛋白、抗体または、Ｂ７−４または
ＰＤ−１活性および／または発現のモジュレーターまたはＢ７−４およびＰＤ−１間にお
ける相互作用のモジュレーターとして同定された化合物）は、投与に適した医薬組成物に
組込まれ得る。上記組成物は、典型的には核酸分子、蛋白または抗体および医薬的に許容
される担体を含む。ここで使用されている「医薬的に許容される担体」の語は、医薬投与
に適合したあらゆる溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸
収遅延剤などを全て包含するものとする。医薬活性物質に関する上記媒質および薬剤の使
用については当業界では公知である。慣用的媒質または薬剤が活性化合物と不適合性であ
る場合を除いて、組成物中におけるその使用が考えられる。補足的活性化合物もまた、組
成物中に組込まれ得る。
本発明医薬組成物は、意図されたその投与経路と適合するように製剤化される。投与経
路の例には、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例、吸入）、経皮（局所）、経
粘膜および直腸投与がある。非経口、皮内または皮下適用に使用される溶液または懸濁液
は、次の成分：滅菌希釈剤、例えば注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコ
ール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒、抗菌剤、例えばベンジル
アルコールまたはメチルパラベン、酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナ
トリウム、キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸、緩衝液、例えばアセテート、シ
トレートまたはホスフェートおよび張性調節剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロ
ースを含み得る。ｐＨは酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムにより調節さ
れ得る。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または
マルチプルドーズバイアルに封入され得る。
注射可能用途に適した医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液およ
び滅菌注射可能溶液または分散液をその場で製造するための滅菌粉末が含まれ得る。静脈
内投与の場合、適当な担体には、生理食塩水、静菌水、クレモフォーＥＬ（商標）（ＢＡ
ＳＦ、パーシッパニー、ニュージャージー）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）がある。
どの場合も、組成物は無菌状態でなくてはならず、容易に注射できる程度には流動性であ
るべきである。組成物は、製造および貯蔵条件下で安定していなくてはならず、微生物、
例えば細菌および真菌の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば水
、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリ
エチレングリコールなど）を含む溶媒または分散液媒質およびその適当な混合物であり得
る。例えば、コーティング、例えばレシチンの使用により、分散液の場合に必要とされる
粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により適切な流動性が維持され得る。
微生物作用の阻止は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、
フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成され得る。多くの場合、組成
物中に等張剤、例えば糖類、ポリアルコール類、例えばマニトール、ソルビトール、塩化
ナトリウムを含むのが好ましい。注射可能組成物の長期間吸収は、吸収を遅延させる薬剤
、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含ませることにより達
成され得る。
滅菌注射可能溶液は、上記で列挙した成分の１種または組み合わせと共に適当な溶媒に
必要量の活性化合物（例、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白または抗Ｂ７−４またはＰＤ−１
抗体）を含有させ、次いで必要に応じて滅菌濾過することにより製造され得る。一般的に
、分散液は、塩基性分散媒質および上記で列挙されたものから必要とされる他の成分を含
む滅菌賦形剤に活性化合物を組込むことにより製造される。滅菌注射可能溶液製造用滅菌
粉末の場合、好ましい製造方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、予め滅菌濾過しておい
たその溶液から有効成分に加えて所望の追加的成分から成る粉末が生成される。
経口組成物は、一般的に不活性希釈剤または食用担体を含む。それらはゼラチンカプセ
ルに封入されるかまたは錠剤に圧縮成型され得る。経口治療投与を目的とする場合、活性
化合物は賦形剤と共に組込まれ、錠剤、トローチまたはカプセル形態で使用され得る。経
口組成物はまた、口内洗浄剤として使用される流動担体を用いて製造され得、流動担体中
の化合物は経口適用され、スイッシュ（swish）され、吐き出されるかまたは嚥下される
。医薬的に適合し得る結合剤、および／またはアジュバント材料は、組成物の一部として
含まれ得る。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、下記成分のいずれか、または似た
性質の化合物：結合剤、例えば微晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン、賦
形剤、例えば澱粉または乳糖、崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲルまたはコーンスタ
ーチ、滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Sterotes）、滑剤、
例えばコロイド状二酸化珪素、甘味剤、例えばしょ糖またはサッカリン、または香味料、
例えばペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料を含み得る。
吸入投与の場合、化合物は、適当な推進剤、例えば気体、例えば二酸化炭素を含む加圧
容器またはディスペンサーからのエアゾールスプレー、またはネブライザーの形態でデリ
バリーされる。
全身投与はまた、経粘膜または経皮手段で行われ得る。経粘膜または経皮投与の場合、
浸透させるべきバリアーに適した浸透剤が製剤に使用される。上記浸透剤は一般的に当業
界では公知であり、例えば、経粘膜投与の場合、デタージェント、胆汁酸塩、およびフシ
ジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻用スプレーまたは坐剤の使用を通して達成され得
る。経皮投与の場合、活性化合物は、当業界で一般的に知られている通り軟膏、膏薬、ゲ
ルまたはクリームに製剤化される。
化合物はまた、直腸デリバリー用の坐剤（例、慣用的坐薬基剤、例えばカカオバターお
よび他のグリセリド類による）または停留浣腸形態で製造され得る。
一態様において、モジュレーター剤は、体内からの急速な排出から化合物を保護する担
体を用いて製造され、例えば移植体（インプラント）およびマイクロカプセル封入デリバ
リー系を含む放出制御製剤がある。生物分解性、生物適合性ポリマー、例えばエチレンビ
ニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよ
びポリ乳酸が使用され得る。上記製剤の製造方法は、当技術分野に精通した者には当然明
白なものである。これらの材料はまた、アルザ・コーポレーションおよびノヴァ・ファー
マシューティカルズ、インコーポレイテッドから購入され得る。リポソーム懸濁液（ウイ
ルス抗原に対するモノクローナル抗体により感染した細胞に標的化されたリポソームを含
む）はまた、医薬的に許容し得る担体としても使用され得る。これらは、例えば米国特許
第４５２２８１１号に記載された通り、当業界の専門技術者には公知の方法に従い製造さ
れ得る。
投与し易く用量を均一にするために単位用量形態で経口または非経口組成物を製剤する
のは特に有利である。ここで使用されている単位用量形態は、処置される対象にとって単
位用量として適する物理的に独立した単位を包含しており、各単位は必要とされる医薬用
担体と共に所望の治療効果を生じるように計算された予め定められた量の活性化合物を含
む。本発明の単位用量形態に関する詳細は、活性化合物特有の特徴および達成すべき特定
治療効果、および個体の処置を目的としたかかる活性化合物調合の当技術分野に内在する
限界により直接必然的に決定される。
上記化合物の毒性および治療効率は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量
）およびＥＤ５０（集団の５０％における治療有効量）を決定するため、細胞培養物また
は実験動物における標準製薬方法により測定され得る。毒性および治療効果間の用量比が
治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表され得る。大きな治療指数を呈する化合
物が好ましい。毒性副作用を呈する化合物が使用され得る場合、非感染細胞への潜在的損
傷を最小にすることにより副作用を低減化するためには罹患組織部位へ上記化合物を標的
化するデリバリー系の設計は慎重に行うべきである。
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトで使用するための範囲の
用量を製剤化するのに使用され得る。上記化合物の用量は、好ましくは毒性を全くまたは
ほとんど伴わずにＥＤ５０を含む循環濃度範囲内に存する。用量は、使用される用量形態
および使用される投与経路によりこの範囲内で変動し得る。本発明方法で使用される化合
物の場合、治療有効量は最初に細胞培養アッセイから評価され得る。用量を動物モデルで
製剤化することにより、細胞培養で測定されたＩＣ５０（すなわち、徴候の半最大阻害を
達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲が得られる。上記情報を使用するこ
とにより、より正確にヒトにおける有用な用量が測定され得る。血漿レベルは、例えば高
速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。
本発明核酸分子は、ベクターへ挿入され、遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺
伝子治療ベクターは、例えば静脈内注射、局所投与（米国特許５３２８４７０参照）また
は定位注射（例えばChenら（１９９４）Proc.Natl.Acad.Sci.USA９１：３０５４−３０
５７参照）により対象へデリバリーされ得る。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容し
得る希釈液中に遺伝子治療ベクターを含み得るか、または遺伝子デリバリービークルが埋
封された遅速放出マトリックスを含み得る。別法として、完全な遺伝子デリバリーベクタ
ーが組換え細胞から無傷で製造され得る場合（例、レトロウイルスベクター）、医薬製剤
は遺伝子デリバリー系を生産する１個またはそれ以上の細胞を含み得る。
医薬組成物は容器、投与に関する使用説明書と一緒にパックまたはディスペンサー中に
封入され得る。
VI.本発明の用途および方法
ここに記載されているＢ７−４および／またはＰＤ−１モジュレーター剤、例えば核酸
分子、蛋白、蛋白相同体および抗体は、下記方法の一つまたはそれ以上で使用され得る：
ａ）例えば免疫応答のアップまたはダウンモジュレーションによる処置方法、ｂ）スクリ
ーニングアッセイ、ｃ）予測的医学（例、診断的アッセイ、予知検査、モニター的臨床試
験、および薬理遺伝学）。単離された本発明核酸分子は、下記で詳述されている通り、例
えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白を発現させ（例えば、遺伝子治療適用での宿主細胞に
おける組換え発現ベクターによる）、Ｂ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡ（例、生物学的
サンプル中）またはＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子における遺伝的改変を検出し、そして
Ｂ７−４またはＰＤ−１活性をモジュレーションするのに使用され得る。Ｂ７−４または
ＰＤ−１蛋白は、Ｂ７−またはＰＤ−１阻害剤の不十分または過剰な生産を特徴とする疾
患の処置に使用され得る。さらに、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白は、天然に存するＢ７−
４またはＰＤ−１結合相手に関するスクリーニング、Ｂ７−４またはＰＤ−１活性をモジ
ュレーションする薬剤または化合物に関するスクリーニング、およびＢ７−４もしくはＰ
Ｄ−１蛋白の不十分または過剰な生産またはＢ７−４またはＰＤ−１野生型蛋白と比べて
低下または異常活性を有するＢ７−４もしくはＰＤ−１蛋白形態の生産を特徴とする疾患
の処置に使用され得る。さらに、本発明の抗Ｂ７−４またはＰＤ−１抗体は、Ｂ７−４ま
たはＰＤ−１蛋白の検出および単離、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白の生物学的利用能の調
節、および例えばＢ７−４およびＰＤ−１の相互作用をモジュレーションすることによる
、Ｂ７−４またはＰＤ−１活性のモジュレーションに使用され得る。
Ａ．処置方法：
本発明は、異常型Ｂ７−４またはＰＤ−１発現または活性に伴う疾患の危険がある（ま
たは感受性がある）かまたは罹患している対象の予防的および治療的処置方法を提供する
。
１．予防方法
一態様において、本発明は、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドまたはＢ７−４また
はＰＤ−１ポリペプチド発現または少なくとも１つのＢ７−４またはＰＤ−１活性をモジ
ュレーションする薬剤を対象に投与することによる、対象において異常型Ｂ７−４または
ＰＤ−１発現または活性に伴う疾患または病状を防ぐ方法を提供する。異常型Ｂ７−４ま
たはＰＤ−１発現または活性により誘発されるかまたはそれに起因する疾患の危険がある
対象は、例えばここに記載されている診断または予知検査法のいずれかまたは組み合わせ
により確認され得る。予防薬の投与は、疾患または障害を阻止するかまたは他の場合その
進行を遅らせるように、Ｂ７−４またはＰＤ−１異常型を特徴とする徴候が現れる前に行
われ得る。Ｂ７−４またはＰＤ−１異常型または状態のタイプにより、例えば、Ｂ７−４
またはＰＤ−１ポリペプチド、Ｂ７−４またはＰＤ−１アゴニストまたはＢ７−４または
ＰＤ−１アンタゴニスト薬剤が対象を処置するために使用され得る。適当な薬剤は、臨床
的徴候に基いて決定され得、例えばここに記載されているスクリーニングアッセイを用い
て確認され得る。
２．治療方法
本発明の別の態様は、治療目的のためにＢ７−４またはＰＤ−１発現または活性をモジ
ュレーションする方法に関するものである。Ｂ７−４は、活性化免疫細胞の共刺激および
増殖を阻害し、ＰＤ−１を介して免疫細胞に阻害シグナルを伝達することが立証された。
従って、Ｂ７−４またはＰＤ−１の活性および／または発現並びにＢ７−４およびＰＤ−
１間の相互作用をモジュレーションすることにより、免疫応答がモジュレーションされ得
る。Ｂ７−４が共刺激性受容体に結合する態様においては、Ｂ７−４活性のアップレギュ
レーションにより免疫応答のアップレギュレーションが誘発され、Ｂ７−４活性のダウン
レギュレーションにより免疫応答のダウンレギュレーションが誘発されることを理解すべ
きである。Ｂ７−４が阻害性受容体に結合する態様においては、Ｂ７−４活性のアップレ
ギュレーションにより免疫応答のダウンレギュレーションが誘発され、Ｂ７−４活性のダ
ウンレギュレーションにより免疫応答のアップレギュレーションが誘発される。好ましい
態様では、Ｂ７−４は阻害性受容体に結合する。特に好ましい態様では、Ｂ７−４はＰＤ
−１に結合する。
本発明のモジュレーション方法では、細胞をＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドのモ
ジュレーター、例えばＢ７−４および／またはＰＤ−１の発現または活性をモジュレーシ
ョンする薬剤、またはＢ７−４およびＰＤ−１の相互作用をモジュレーションする薬剤と
接触させる。
Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白活性をモジュレーションする薬剤は、ここに記載されてい
る薬剤であり、例えばＢ７−４またはＰＤ−１蛋白の核酸または蛋白分子、天然に存する
標的分子（例、Ｂ７−４の場合にはＰＤ−１またはＰＤ−１の場合にはＢ７−４）、Ｂ７
−４またはＰＤ−１抗体、Ｂ７−４またはＰＤ−１アゴニストまたはアンタゴニスト、Ｂ
７−４またはＰＤ−１アゴニストまたはアンタゴニストのペプチドミメティクス、または
他の小分子がある。
Ｂ７−４またはＰＤ−１の発現をモジュレーションする薬剤は、例えばアンチセンス核
酸分子、トリプレックスオリゴヌクレオチド、またはＢ７−４もしくはＰＤ−１蛋白発現
のためのリボザイムまたは組換えベクターである。例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリ
ペプチド翻訳開始部位周囲の領域に相補的なオリゴヌクレオチドが合成され得る。１種ま
たはそれ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、典型的には２００μg／mlで細胞培
地に加えるか、または患者に投与することにより、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチド
の合成が阻止され得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞に吸収され、Ｂ７−４ま
たはＰＤ−１ ｍＲＮＡとハイブリダイズすることにより翻訳を阻止する。別法として、
二本鎖ＤＮＡに結合してトリプレックス構築物を形成することによりＤＮＡ巻き戻しおよ
び転写を阻止するオリゴヌクレオチドが使用され得る。いずれの結果としても、Ｂ７−４
またはＰＤ−１ポリペプチドの合成は遮断される。ＰＤ−１発現がモジュレーションされ
るとき、好ましくはかかるモジュレーションはＰＤ−１遺伝子をノックアウトする以外の
手段により行なわれる。
発現をモジュレーションする薬剤はまた、それらが細胞におけるＰＤ−１またはＢ７−
４の量を制御するという事実により、細胞におけるＰＤ−１またはＢ７−４活性の総量を
モジュレーションする。
一態様において、Ｂ７−４の阻害活性またはＰＤ−１の阻害活性を刺激する薬剤は、Ｂ
７−４またはＰＤ−１のアゴニストである。上記薬剤の例には、活性Ｂ７−４またはＰＤ
−１蛋白および細胞に導入されたＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドをコードする核酸
分子がある。
別の態様において、薬剤はＢ７−４の共刺激または阻害活性またはＰＤ−１の阻害活性
を阻害するもので、Ｂ７−４またはＰＤ−１のアンタゴニストである。上記薬剤の例には
、アンチセンスＢ７−４またはＰＤ−１核酸分子、抗Ｂ７−４またはＰＤ−１抗体、Ｂ７
−４またはＰＤ−１分子の可溶性不活化形態、およびＢ７−４またはＰＤ−１阻害剤があ
る。
これらのモジュレーター薬剤は、インビトロ（例、細胞を薬剤と接触させることによる
）または別法としてインビボ（例、薬剤を対象に投与することによる）で投与され得る。
それ自体、本発明は、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白のモジュレーションが功を奏する疾患
または障害、例えば免疫応答のアップまたはダウンレギュレーションが功を奏するか、ま
たはＢ７−４またはＰＤ−１蛋白または核酸分子の異常型発現または活性を特徴とする疾
患に苦しむ個体の処置方法を提供する。一態様において、この方法では、薬剤（例、ここ
に記載されたスクリーニングアッセイにより確認された薬剤）またはＢ７−４またはＰＤ
−１発現または活性をモジュレーション（例、アップレギュレーションまたはダウンレギ
ュレーション）する薬剤の組み合わせを投与する。別の態様において、この方法では、低
減化または異常型Ｂ７−４またはＰＤ−１発現または活性を補償する療法としてＢ７−４
またはＰＤ−１蛋白または核酸分子を投与する。
Ｂ７−４またはＰＤ−１活性の刺激は、Ｂ７−４またはＰＤ−１が異常にダウンレギュ
レーションされている状況および／または高いＢ７−４またはＰＤ−１活性が有利な効果
を有すると思われる状況では望ましい。同様に、Ｂ７−４またはＰＤ−１活性の阻害は、
Ｂ７−４またはＰＤ−１が異常にアップレギュレーションされている状況および／または
低いＢ７−４またはＰＤ−１活性が有利な効果を有すると思われる状況では望ましい。当
業者であれば、Ｂ７−４が共刺激性のものに結合する態様では、Ｂ７−４の刺激およびＰ
Ｄ−１の刺激が免疫細胞共刺激、従って免疫応答に対する反対の効果を有することは認め
るはずである。かかる場合においては、一分子の活性の刺激が望ましいとき、他分子の活
性の抑制が望ましい。
Ｂ７−４のダウンモジュレーションに使用される薬剤（Ｂ７−４アンタゴニスト）の例
には、（例えば）アンチセンス分子、Ｂ７−４を認識する抗体、免疫細胞におけるＢ７−
４およびその天然受容体の一つの相互作用を遮断する化合物がある（例、可溶性１価Ｂ７
−４分子、およびＢ７−４リガンドの可溶性形態または対象スクリーニングアッセイで確
認された化合物）。ＰＤ−１のダウンモジュレーションに使用される薬剤（ＰＤ−１アン
タゴニスト）の例には、（例えば）アンチセンス分子、ＰＤ−１に結合するが免疫細胞へ
の阻害シグナルを伝達しない抗体（「非活性化抗体」（non-activating antibody））、
およびＰＤ−１の可溶性形態がある。
Ｂ７−４のアップモジュレーションに使用される薬剤（Ｂ７−４アゴニスト）の例には
、（例えば）Ｂ７−４ポリペプチドをコードする核酸分子、Ｂ７−４の多価形態、Ｂ７−
４の発現を高める化合物、およびＢ７−４を発現する細胞などがある。ＰＤ−１のアップ
モジュレーションに使用される薬剤（ＰＤ−１アゴニスト）の例には、（例えば）ＰＤ−
１を介して阻害性シグナルを伝達する抗体、ＰＤ−１の発現を促進する化合物、ＰＤ−１
をコードする核酸分子、およびＰＤ−１を介してシグナルを伝達するＢ７−４の形態があ
る。
３．Ｂ７−４またはＰＤ−１のモジュレーションによる免疫応答のダウンレギュレーシ
ョン
本発明によると、Ｂ７−４ポリペプチドの阻害機能をアップレギュレーションするかま
たはその共刺激機能をダウンレギュレーションすることにより免疫応答をダウンレギュレ
ーションする多くの態様がある。ダウンレギュレーションは、既に起こっている免疫応答
を阻害または遮断する形態であり得るかまたは免疫応答の誘導阻止を含み得る。
活性化免疫細胞の機能は、免疫細胞応答のダウンレギュレーションにより、または免疫
細胞における特異的アネルギーの誘導により、またはその両方により阻害され得る。
例えば、抗Ｂ７−４抗体またはＢ７−４ポリペプチド（例、Ｂ７−４ポリペプチドの可
溶性モノマー形態、例えばＢ７−４−Ｉｇ）および／または共刺激性受容体とＢ７−４の
相互作用を遮断する抗Ｂ７−４抗体を用いることにより、共刺激性シグナルが阻害され、
それによって免疫応答がダウンモジュレーションされ得る。
さらに、Ｂ７−４が阻害性受容体に結合する態様では、阻害性受容体に結合しているＢ
７−４の形態、例えば細胞表面における多価Ｂ７−４を使用することにより、免疫応答が
ダウンモジュレーションされ得る。
同様に、ＰＤ−１経路もまた、薬剤を用いて免疫応答をダウンレギュレーションするこ
とにより刺激され得る。免疫細胞でのＢ７−４と刺激性受容体との相互作用の阻害（例、
ＰＤ−１および／またはＣＴＬＡ４の可溶性形態を用いることによる）またはＰＤ−１の
活性化（例、ＰＤ−と架橋を形成する活性化抗体を用いる）により、免疫細胞への負のシ
グナルが提供され得る。
本発明の一態様では、ＰＤ−１活性を刺激するのに使用される活性化抗体は、二重特異
性抗体である。例えば、かかる抗体は、ＰＤ−１結合部位および免疫細胞、例えばＴ細胞
、Ｂ細胞または骨髄細胞において細胞表面受容体を標的化する別の結合部位を含み得る。
一態様において、かかる抗体は、ＰＤ−１結合部位を含むことに加えて、さらに活性化ま
たは阻害性受容体、例えばＢ細胞抗原受容体、Ｔ細胞抗原受容体またはＦｃ受容体に近接
した分子と結合する結合部位を含むことにより特異的細胞集団に対し分子を標的化させ得
る。例えば、ＣＤ３抗原、Ｔ細胞受容体鎖、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＴＬＡ−４、免疫グ
ロブリン、Ｂ細胞受容体、Ｉｇアルファ、Ｉｇベータ、ＣＤ２２またはＦｃ受容体が使用
され得る。上記抗体（または他の二重特異性薬剤）は、当該分野において認識されており
、例えば本明細書記載の要領で製造され得る。二重特異性抗体に関するこの第２抗原の選
択により、阻害に関して標的化される細胞集団の選択に柔軟性が与えられる。
別の態様では、ＰＤ−１および細胞における活性化または阻害性受容体の共連結反応に
より、ＰＤ−１を介した負のシグナルの発生が促進され得る。上記共連結反応は、例えば
二重特異性薬剤、例えばＰＤ−１および受容体に伴う分子の両方に特異性を有するここに
記載された二重特異性抗体の使用により達成され得る。別の態様において、ＰＤ−１を介
して負のシグナルを伝達する薬剤の多価形態を用いることにより、ＰＤ−１を介した負の
シグナルの伝達が促進され得、例えばビーズまたは表面に提示された薬剤がある。別の態
様では、かかる多価薬剤は、２種の特異性を含むことにより、ＰＤ−１および受容体また
は受容体随伴分子（例、抗ＣＤ３およびＢ７−４を含むビーズ）の共連結反応が達成され
得る。
Ｂ７−４と共刺激性受容体の相互作用を遮断または阻害する薬剤（例、Ｂ７−４の可溶
性形態またはＢ７−４に対する阻止抗体）並びにＢ７−４伝達阻害性シグナルを促進する
薬剤またはＰＤ−１を活性化するＰＤ−１のアゴニスト（例、ＰＤ−１活性化抗体または
ＰＤ−１活性化小分子）は、それらが免疫細胞増殖および／またはエフェクター機能を阻
害するかまたはインビトロアッセイに加えられたときにアネルギーを誘導する能力により
確認され得る。例えば、細胞は、活性化受容体を介してシグナル伝達に刺激を加える薬剤
の存在下で培養され得る。当該分野で認識されている若干の細胞活性化リードアウト法を
用いることにより、活性剤の存在下例えば細胞増殖またはエフェクター機能（例、抗体産
生、サイトカイン生成、食作用）が測定され得る。試験薬剤がこの活性化を遮断する能力
は、測定されている増殖またはエフェクター機能を減少させる薬剤の能力を測定すること
により容易に決定され得る。
本発明の一態様においては、抗原をＰＤ−１アゴニストと共投与することにより、寛容
が特異的抗原に対して誘導される。例えば、寛容は、特異的蛋白に対して誘導され得る。
一態様では、免疫応答が望ましくないアレルゲンまたは外来蛋白に対する免疫応答が阻害
され得る。例えば、因子VIIIが投与されている患者は、この血餅形成因子に対して抗体を
産生することが多い。Ｂ７−４伝達共刺激性シグナルを遮断する薬剤またはＰＤ−１伝達
阻害性シグナルを刺激する薬剤を組換え因子VIIIと組み合わせて（または因子VIIIに物理
的に結合させること、例えば架橋形成による）共投与することにより、ダウンモジュレー
ションが誘発され得る。
一態様において、Ｂ７−４第１ペプチドが別のＢリンパ球抗原（例、Ｂ７−１またはＢ
７−２）の活性を有する第２ペプチドに融合されて成る融合蛋白を用いることにより、免
疫細胞における共刺激性受容体とＢ７−４の相互作用が遮断され、免疫応答がダウンモジ
ュレーションされ得る。別法として、２種の別々のペプチド（例えば、Ｂ７−２および／
またはＢ７−１とＢ７−４ポリペプチド）、または阻止抗体の組み合わせ（例、Ｂ７−４
ポリペプチドに対する抗体と抗Ｂ７−２および／またはＢ７−１モノクローナル抗体）を
、単一組成物として合わせるかまたは別々に投与（同時または連続して）することにより
、対象において免疫細胞伝達免疫応答がダウンレギュレーションされ得る。さらに、Ｂ７
−１および／またはＢ７−１活性と共に、Ｂ７−４ポリペプチド活性を有する１つまたは
それ以上のペプチドの治療有効量を他のダウンレギュレーション試薬と共に使用すると、
免疫応答に影響が及ぼされ得る。他の免疫モジュレーション試薬の例には、共刺激性シグ
ナルを遮断する抗体（例、ＣＤ２８、ＩＣＯＳに対する）、ＣＴＬＡ４を介した阻害性シ
グナルを活性化する抗体、および／または他の免疫細胞マーカーに対する（例、対ＣＤ４
０、対ＣＤ４０リガンドまたは対サイトカイン）抗体、融合蛋白（例、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ
、ＰＤ−１−Ｆｃ）および免疫抑制剤（例、ラパマイシン、シクロスポリンＡまたはＦＫ
５０６）がある。
Ｂ７−４および／またはＰＤ−１ペプチドはまた、細胞破壊により免疫細胞機能を遮断
する治療剤の構築に有用であり得る。例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドの一
部分を毒素と結合させることにより、それが結合している細胞の破壊を誘発し得る細胞傷
害性薬剤が生成され得る。
細胞傷害性薬剤を製造するため、本発明のポリペプチドは、当業界公知の技術例えば架
橋形成または組換えＤＮＡ技術を用いて毒素に連結または機能し得るように結合され得る
。免疫毒素の製造は、一般的に、当業界ではよく知られている（例、米国特許第４３４０
５３５号およびＥＰ４４１６７号参照、両方とも出典明示により本明細書の一部とする）
。毒素部分をポリペプチドとコンジュゲートするのに有効に使用され得るものであって、
リンカーを含む多数のタイプのジスルフィド結合が知られている。一態様において、立体
障害をもつジスルフィド結合を含むリンカーは、インビボ安定性がより高いことにより作
用部位での結合前に毒素部分の放出が阻止されるため好ましい。
本発明のポリペプチドまたは抗体にコンジュゲートされ得る広く多様な毒素が知られて
いる。例としては、多くの有用な植物、真菌または細菌由来の毒素、例えば様々なＡ鎖毒
素、特にリシンＡ鎖、リボソーム不活化蛋白、例えばサポリンまたはゲロニン、アルファ
、−サルシン、アスペルギリン、レストリクトシン、リボヌクレアーゼ、例えば胎盤リボ
ヌクレアーゼ、アンギオゲニク、ジフテリア毒素、およびシュードモナス外毒素などがあ
る。本発明に関して使用するのに好ましい毒素部分は、炭水化物残基を修飾または除去す
るよう処理された毒素Ａ鎖、脱グリコシル化Ａ鎖である（米国特許５７７６４２７）。
上記細胞傷害性薬剤の１種または組み合わせ（例、Ｂ７−４リシン単独またはＢ７−２
リシンまたはＢ７−１リシンとの組み合わせ）を患者に注入することにより、特に活性化
免疫細胞がさらに多量のＢ７−４リガンドを発現するという事実に照らし合わせても、免
疫細胞の死が誘発され得る。例えば、ＰＤ−１は活性化リンパ球表面で誘導されるため、
ＰＤ−１に対する抗体は、Ｆｃ−Ｒ依存的機構によるかまたは抗体への細胞傷害性薬剤（
例、リシン、サポリンまたはカリチェアミシン）のコンジュゲーションによる除去によっ
てこれらの特異的細胞の除去を標的化するのに使用され得る。一態様において、抗体毒素
は二重特異性抗体であり得る。上記二重特異性抗体は、例えばある種のタイプの細胞での
み見出されるマーカー、例えばＴＣＲ、ＢＣＲまたはＦｃＲ分子を用いた、特異的細胞集
団の標的化に有用である。
Ｂ７−４ポリペプチド共刺激的機能のダウンレギュレーションまたは阻止またはＢ７−
４またはＰＤ−１阻害機能の活性化（例、ＰＤ−１の負のシグナル発生機能に刺激を与え
ることによる）は、例えば組織、皮膚および臓器移植状況、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）
、または自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデスおよび多発性硬化症において、免
疫応答をダウンモジュレーションするのに有用である。例えば、免疫細胞機能の遮断によ
り、組織移植における組織破壊が低減化される。典型的には、組織移植の場合、免疫細胞
が異物として認識後、移植体を破壊する免疫反応により移植拒絶が開始される。免疫細胞
における共刺激性受容体（複数も可）とＢ７分子の相互作用を阻止または遮断する分子（
例えばＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドの可溶性モノマー形態）を移植前または移植
時に単独または別のダウンモジュレーション薬剤と共に投与すると、共刺激性シグナルの
発生が阻止され得る。さらに、Ｂ７−４共刺激性シグナルの阻害、またはＢ７−４または
ＰＤ−１阻害性シグナルの促進はまた、免疫細胞をアネルギー化するのに十分であり得、
それによって対象における寛容が誘導され得る。Ｂ７−４伝達共刺激性シグナルの遮断に
よる長期寛容の誘導により、これらの遮断性試薬を反復投与する必要性が回避され得る。
対象において充分な免疫抑制または寛容を達成するため、他の分子の共刺激性機能を遮
断することが望ましい場合もあり得る。例えば、Ｂ７−１およびＢ７−４、Ｂ７−２およ
びＢ７−４、またはＢ７−１およびＢ７−２およびＢ７−４の機能を遮断するのが望まし
い場合もあり、移植前または移植時にこれらの抗原の各々の活性を有するペプチドまたは
これらの抗原に対する阻止抗体の組み合わせの可溶性形態が投与され得る（別々にまたは
単一組成物で一緒に）。別法として、Ｂ７−４またはＰＤ−１の阻害活性を促進し、Ｂ７
−１および／またはＢ７−２の共刺激活性を阻止することが望ましい場合もあり得る。本
発明のダウンモジュレーション方法に関して使用され得る他のダウンモジュレーション薬
剤には、例えばＣＴＬＡ４により阻害性シグナルを伝達する薬剤、ＣＴＬＡ４の可溶性形
態、ＣＴＬＡ４を介して阻害性シグナルを活性化する抗体、他の免疫細胞マーカーまたは
他の受容体リガンド対の可溶性形態に対する阻止抗体（例、ＣＤ４０およびＣＤ４０リガ
ンド間の相互作用を破壊する薬剤（例、抗ＣＤ４０リガンド抗体））、サイトカインに対
する抗体または免疫抑制剤がある。別の態様では、少なくとも２種の異なるＢ７−４抗体
の組み合わせを投与することにより、最適な遮断活性が達成され得る。
例えば、Ｂ７−４ポリペプチド共刺激を遮断またはＢ７−４またはＰＤ−１阻害機能を
活性化することはまた、自己免疫疾患の処置においても有用である。多くの自己免疫疾患
は、自己組織に対し反応性を示し、疾患の病状に関与するサイトカインおよび自己抗体の
生産を促す免疫細胞の不適当な活性化の結果である。自己反応性免疫細胞の活性化を阻止
することにより、病気の徴候が低減化または排除され得る。共刺激性受容体とＢ７分子の
受容体：リガンド相互作用を破壊することによる免疫細胞の共刺激性を遮断する試薬を投
与することは、免疫細胞活性化を阻止し、病気のプロセスに関与し得る自己抗体またはサ
イトカインの生産を阻止するのに有用である。従って、Ｂ７−４またはＰＤ−１の阻害機
能を促進する薬剤は、自己反応性免疫細胞の抗原特異的寛容を誘導し得るため、病気の長
期軽減がもたらされ得る。自己免疫疾患の阻止または軽減における試薬の効力は、ヒト自
己免疫疾患の若干の充分に特性確認された動物モデルを用いて測定され得る。例としては
、ネズミの実験的自己免疫脳炎、ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスまたはＮＺＢハイブリッ
ドマウスにおける全身性エリテマトーデス、ネズミの自己免疫コラーゲン関節炎、ＮＯＤ
マウスおよびＢＢラットにおける真性糖尿病、およびネズミの実験的筋無力症がある（Pa
ul編、FundamentalImmunology，ラベン・プレス、ニューヨーク、１９８９、８４０−８
５６頁参照）。
免疫細胞活性化の阻止は、例えばＩｇＥ生産阻止による、アレルギーおよびアレルギー
反応の処置において治療上有用である。Ｂ７−４またはＰＤ−１阻害機能を促進する薬剤
をアレルギー対象に投与することにより、対象における免疫細胞伝達アレルギー応答が阻
止され得る。ＰＤ−１ポリペプチドの活性化はまた、アレルギーの処置にも有用であり得
る。免疫細胞のＢ７−４共刺激の阻害またはＢ７−４またはＰＤ−１阻害経路の刺激は、
適当なＭＨＣ分子と共にアレルゲンに暴露することにより達成され得る。アレルギー反応
は、アレルゲン侵入経路およびマスト細胞または好塩基性細胞におけるＩｇＥの沈澱パタ
ーンにより、事実上全身的または局所的であり得る。すなわち、局所的または全身的な免
疫細胞伝達アレルギー応答の阻害は、Ｂ７−４と共刺激性受容体の相互作用を阻止する薬
剤またはＢ７−４またはＰＤ−１の阻害機能を促進する薬剤の阻害性形態を投与すること
により行なわれ得る。
Ｂ７−４共刺激活性の遮断による免疫細胞活性化の阻害またはＰＤ−１阻害活性の刺激
はまた、免疫細胞のウイルス感染症において治療上重要であり得る。例えば、後天性免疫
不全症候群（ＡＩＤＳ）の場合、免疫細胞活性化によりウイルス複製が刺激される。Ｂ７
−４／共刺激性受容体相互作用の遮断またはＢ７−４またはＰＤ−１阻害機能の刺激によ
り、ウイルス複製の阻害が誘発され、それによって、ＡＩＤＳの経過が改善され得る。Ｂ
７−４活性またはＢ７−４とその天然結合相手（複数も可）、例えばＰＤ−１との相互作
用の刺激による免疫応答のダウンレギュレーションはまた、妊娠持続を促すのに有用であ
り得る。Ｂ７−４は、通常胎盤栄養膜、すなわち母体および胎児間の界面を形成する細胞
層で高度発現され、胎児の母体拒絶阻止においてある一定の役割を演じ得る。胚または胎
児の免疫学的拒絶故に自然流産の危険がある女性（例、「予知検査法」の項に記載されて
いる、Ｂ７−４活性についてスクリーニングにより確認された場合、以前に自然流産の経
験がある場合または妊娠しにくかった場合）は、Ｂ７−４の活性またはその天然結合相手
（複数も可）、例えばＰＤ−１との相互作用を刺激する薬剤で処置され得る。
Ｂ７−４活性あるいはその本来の結合相手（複数も可）、例えばＰＤ−１とのＢ７−４
の相互作用を刺激することによる免疫応答のダウンレギュレーションはまた、自己由来組
織の自己免疫発作を処置するのに有用であり得る。例えば、Ｂ７−４は、通常心臓で高度
発現され、自己免疫発作から心臓を保護する。これは、Ｂａｌｂ／ｃＰＤ−１ノックアウ
トマウスが、血栓症を伴う心臓において重症の自己免疫発作を呈するという事実により立
証されている。すなわち、自己免疫発作により誘発または増悪される状態（例、この例で
は、心臓病、心筋梗塞またはアテローム性動脈硬化症）は、Ｂ７−４活性またはその本来
の結合相手、例えばＰＤ−１へのＢ７−４の結合を増すことにより改善または改良され得
る。従って、Ｂ７−４活性またはＢ７−４とのＢ７−４の相互作用を刺激することによる
、自己免疫発作により増悪された状態、例えば自己免疫疾患（および例えば心臓病、心筋
梗塞およびアテローム性動脈硬化症等の状態）をモジュレーションすることも本発明の範
囲内に含まれる。
４．免疫応答のアップレギュレーション
また、免疫応答をアップレギュレーションする手段としてＢ７−４共刺激活性のアップ
レギュレーションまたはＰＤ−１またはＢ７−４阻害活性の阻害は、治療上有用である。
免疫応答のアップレギュレーションは、存在する免疫応答を高めるかまたは初回免疫応答
を誘導する形態であり得る。例えば、Ｂ７−４共刺激活性の刺激またはＢ７−４またはＰ
Ｄ−１阻害活性の阻害による免疫応答の促進は、微生物、例えば細菌、ウイルスまたは寄
生虫感染症の場合に有用である。例えば、一態様では、免疫細胞において共刺激性シグナ
ルを促進するＢ７−４の形態（例、多価形態のＢ７−４ペプチド（例、可溶性多価形態ま
たは細胞表面で発現された形態））またはＢ７−４と阻害性受容体との相互作用を阻止す
る薬剤またはＰＤ−１による阻害性シグナルの伝達を阻止する薬剤、例えばＰＤ−１に対
する非活性化抗体は、抗体および細胞仲介応答のアップレギュレーションが、ウイルスを
迅速または完全に除去させることから、有益である状況において治療上有用である。これ
らには、ウイルス性皮膚疾患、例えばヘルペスまたは帯状疱疹があり、その場合上記薬剤
は皮膚へ局所的にデリバリーされ得る。さらに、全身的ウイルス性疾患、例えばインフル
エンザ、一般的な風邪および脳炎は、上記薬剤の全身的投与により軽減され得る。
場合によっては、免疫応答をさらに増大させるために、免疫応答をアップレギュレーシ
ョンする他の薬剤、例えば共刺激性受容体を介してシグナルを伝達する他のＢ７ファミリ
ー構成成分の形態をさらに投与することが望ましいこともあり得る。
別法として、患者から免疫細胞を除去し、免疫細胞において共刺激性シグナルを促進す
るＢ７−４の一形態またはＢ７−４と阻害性受容体との相互作用を阻止する薬剤、または
ＰＤ−１による阻害性シグナルの伝達を阻止する薬剤と免疫細胞をインビトロで接触させ
、インビトロで刺激された免疫細胞を患者に再導入することにより、免疫応答が感染患者
において高められ得る。別の態様において、免疫応答を高める方法では、患者から感染細
胞、例えばウイルス感染細胞を分離し、細胞がそれらの表面でＢ７−４分子の全部または
一部を発現するように、共刺激性受容体に結合するＢ７−４の一形態をコードする核酸分
子によりそれらをトランスフェクションし、そしてトランスフェクション細胞を患者に再
導入する。トランスフェクションされた細胞は、共刺激性シグナルをデリバリーし得るこ
とにより、免疫細胞をインビボで活性化する。
免疫細胞において共刺激性シグナルを促進するＢ７−４の形態、またはＢ７−４と阻害
性受容体の相互作用を阻止する薬剤、またはＰＤ−１による阻害性シグナルの伝達を阻止
する薬剤が、様々なポリペプチド、例えば病原体由来のポリペプチドに対するワクチンに
おいて予防的に使用され得る。病原体、例えばウイルスに対する免疫性は、適当なアジュ
バント中、免疫細胞において共刺激性シグナルを促進するＢ７−４の一形態、または阻害
性受容体とＢ７−４の相互作用を阻止する薬剤、またはＰＤ−１による阻害性シグナルの
伝達を阻止する薬剤と一緒にウイルス蛋白を接種することにより誘導され得る。別法とし
て、病原性抗原および共刺激性受容体に結合するＢ７−４の一形態の両方についてコード
する遺伝子を含むベクターが、予防接種に使用され得る。核酸ワクチンは、様々な手段に
より、例えば注射（例えば筋肉内、皮内、または粒子加速物質または圧縮気体を用いて粒
子を皮膚へ注入させる遺伝子銃による表皮へのＤＮＡ被覆金粒子のバイオリスティック注
射（Haynesら、１９９６、J.Biotechnol.４４：３７））により投与され得る。別法とし
て、核酸ワクチンは、非侵襲的手段により投与され得る。例えば、純粋または脂質製剤化
ＤＮＡは、呼吸器系または標的とされる他の場所へデリバリーされ得、例えばＤＮＡの経
口デリバリーによるパイエル板がある（Schubbert．１９９７、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
９４：９６１）。弱毒化微生物は、粘膜表面へのデリバリーに使用され得る（Sizemoreら
、１９９５、Science、２７０：２９）。
一態様において、共刺激性シグナルを伝達するＢ７−４ポリペプチドの一形態は、例え
ば、Ｂ７−４ポリペプチドおよびＭＨＣクラスＩα鎖蛋白およびβ２ミクログロブリンを
共発現するようにトランスフェクションされた細胞によってクラスＩＭＨＣ蛋白と共に
投与されることにより、Ｔ細胞の活性化を誘発し、感染からの免疫性を提供し得る。例え
ば、ワクチンが有用である病原体には、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、エプスタイン‐バールウイ
ルス、サイトメガロウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、結核、マラリアおよび住血吸虫
症がある。
別の適用例において、Ｂ７−４共刺激機能のアップレギュレーションまたは促進は腫瘍
免疫性の誘導に有用である。Ｂ７−４抗原をコードする核酸分子によりトランスフェクシ
ョンされた腫瘍細胞（例、肉腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、神経細胞芽細胞腫、癌腫）
を対象に投与することにより、対象における腫瘍特異的寛容が克服され得る。所望ならば
、腫瘍細胞は、Ｂ７ポリペプチド（例、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−４）の組み合わせを
発現するようにトランスフェクションされ得る。例えば、患者から得られた腫瘍細胞は、
Ｂ７−４ポリペプチド単独またはＢ７−１活性および／またはＢ７−２活性を有するペプ
チドとの組み合わせの発現を指令する発現ベクターによりエクスビボでトランスフェクシ
ョンされ得る。トランスフェクションされた腫瘍細胞を患者に戻すことにより、トランス
フェクションされた細胞の表面でペプチド発現が誘発される。別法として、遺伝子療法技
術は、インビボトランスフェクション用腫瘍細胞の標的化に使用され得る。
さらに、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスII分子を欠くか、または充分な量のＭＨＣ
クラスＩまたはＭＨＣクラスII分子を発現し得ない腫瘍細胞は、ＭＨＣクラスＩα鎖蛋白
およびβ２ミクログロブリン蛋白またはＭＨＣクラスIIα鎖蛋白およびＭＨＣクラスIIβ
鎖蛋白の全部または一部（例、細胞質−ドメイン先端切除部分）をコードする核酸でトラ
ンスフェクションされることにより、細胞表面でＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスII蛋
白を発現し得る。Ｂリンパ球抗原（例、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−４）の活性を有する
ペプチドと共に適当なクラスＩまたはクラスII ＭＨＣを発現させると、トランスフェク
ション腫瘍細胞に対してＴ細胞仲介免疫応答が誘導される。所望により、ＭＨＣクラスII
関連蛋白、例えばインバリアント鎖の発現を遮断するアンチセンス構築物をコードする遺
伝子はまた、Ｂ７−４ポリペプチドをコードするＤＮＡと共トランスフェクションされる
ことにより、腫瘍関連抗原の提示を促進し、腫瘍特異的免疫性を誘導し得る。Ｂ７陰性ネ
ズミ腫瘍細胞によるＢ７−１の発現は、腫瘍拒絶および長期間防御を伴うＴ細胞仲介特異
的免疫を誘導することにより、マウスにおける腫瘍攻撃を行うことが示された（Chen,L.
ら（１９９２）Cell７１、１０９３−１１０２、Townsend,S.E.およびAllison,J.P.（１
９９３）Science２５９、３６８−３７０、Baskar,S.ら（１９９３）Proc.Natl.Acad.Sci
.９０、５６８７−５６９０）。すなわち、ヒト対象における免疫細胞仲介免疫応答の誘
導は、対象において腫瘍特異的寛容を克服するのに充分であり得る。
別の態様において、免疫応答は、先在する寛容が克服されるように、Ｂ７−４に結合す
る共刺激性受容体を介したシグナルの伝達によるかまたはＢ７−４に結合する阻害性受容
体、例えばＰＤ−１を介したシグナル発生阻止により刺激され得る。例えば、対象が顕著
な免疫応答を展開し得ない抗原、例えば自己由来抗原、例えば腫瘍特異的抗原に対する免
疫応答は、ＰＤ−１の阻害活性または阻害性リガンドへのＢ７−４の結合能力を阻止する
薬剤を投与することにより誘導され得る。例えば、一態様では、可溶性ＰＤ−１または可
溶性Ｂ７−４を使用することにより（ＰＤ−１ＦｃまたはＢ７−４Ｆｃ）、例えば腫瘍細
胞に対する免疫応答が促進され得る。一態様において、自己由来抗原、例えば腫瘍特異的
抗原は、ＰＤ−１の阻害活性または阻害性リガンドへのＢ７−４の結合能力を阻止する薬
剤と共投与され得る。別の態様において、免疫応答を抗原（例、自己由来抗原）に対して
刺激することにより、神経疾患が処置され得る。別の態様では、ＰＤ−１アンタゴニスト
をアジュバントとして使用することにより、能動免疫化プロセスにおいて外来抗原に対す
る応答が増大され得る。
さらに別の態様では、阻害性受容体に結合するかまたは共刺激性受容体へのＢ７−４の
結合と競争するＢ７−４の一形態（例、ＰＤ−１に結合するＢ７−４の形態または天然に
存する可溶性分子）の生産を、例えばアンチセンスＲＮＡを用いて阻害することにより、
免疫応答がアップレギュレーションされ得る。例えば、一態様では、抗腫瘍免疫性を増大
させるために腫瘍細胞による阻害性Ｂ７−４分子の生産が阻害され得る。
一態様においては、免疫細胞を、対象から入手し、共刺激性分子と結合するＢ７−４の
一形態の存在下またはＢ７−４またはＰＤ−１阻害性シグナルを抑制する薬剤の存在下エ
クスビボで培養することにより、免疫細胞の集団が膨張する。さらに別の態様では、次に
免疫細胞を対象に投与する。当業界では公知の通り、例えば免疫細胞に１次活性化シグナ
ルおよび共刺激性シグナルを提供することにより免疫細胞が刺激され、インビトロで増殖
し得る。また、様々な形態のＢ７−４蛋白または共刺激性受容体に結合するかまたはＰＤ
−１を介してシグナル発生を阻止する薬剤を用いることにより、免疫細胞の増殖が共刺激
され得る。一態様では、ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／２９４３６号記載の方法に従い免疫細胞
をエクスビボで培養する。共刺激性分子は、可溶性であり、細胞膜に結合されるかまたは
固体表面、例えばビーズに結合され得る。
Ｂ．Ｂ７−４および／またはＰＤ−１のモジュレーションによりモジュレーションされ
たサイトカインの同定
ここに記載されているＢ７−４およびＰＤ−１分子を用いることにより、Ｂ７−４およ
び／またはＰＤ−１活性のモジュレーションに応答して免疫細胞により生産されるかまた
はその生産が免疫細胞で促進または阻害されるサイトカイン類が同定され得る。ＰＤ−１
を発現する免疫細胞は、１次活性化シグナルで最適以下にインビトロ刺激され得、例えば
、Ｔ細胞は、ホルボールエステル、抗ＣＤ３抗体または好ましくはＭＨＣクラスII分子を
随伴した抗原で刺激され、例えばＢ７ファミリー抗原の刺激形態により、例えばＢ７ポリ
ペプチドをコードしその表面でペプチドを発現させる核酸でトランスフェクションされた
細胞により、またはペプチドの可溶性刺激性形態により、共刺激性シグナルを与えられ得
る。培地へ放出された既知サイトカインは、ＥＬＩＳＡまたはサイトカインを遮断してサ
イトカインにより誘導される免疫細胞増殖または他細胞型増殖を阻止する抗体能力により
同定され得る。例えば、ＩＬ−４ ＥＬＩＳＡキットは、ＩＬ−７阻止抗体の場合と同様
ジェンザイム（ケンブリッジ、マサチューセッツ）から入手できる。ＩＬ−９およびＩＬ
−１２に対する阻止抗体は、ジェネティクス・インスティテュート（ケンブリッジ、マサ
チューセッツ）から入手できる。次いで、サイトカインプロフィールに対するＢ７−４と
ＰＤ−１の相互作用を刺激または阻止する効果が測定され得る。
上記のインビトロ免疫細胞共刺激性アッセイは、Ｂ７−４および／またはＰＤ−１のモ
ジュレーションによりモジュレーションされ得る新規サイトカイン同定方法においても使
用され得る。例えば、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４経路の刺激がＩＬ−２分泌を促進すると思わ
れる場合、ＩＣＯＳ経路の刺激はＩＬ−１０分泌を促進すると思われる（Hutloffら、１
９９、Nature３９７：２６３）。共刺激時、例えば免疫細胞増殖時に誘導された特定活
性が既知サイトカインに対する阻止抗体の付加により阻止され得ない場合、この活性は未
知サイトカインの作用から生じ得る。共刺激後、このサイトカインは慣用的方法により培
地から精製され、その活性はその免疫細胞増殖誘導能力により測定され得る。
寛容の誘導においてある一定の役割を演じ得るサイトカインを同定するため、上記のイ
ンビトロＴ細胞共刺激性アッセイが使用され得る。この場合、Ｔ細胞は、１次活性化シグ
ナルを与えられ、選択されたサイトカインと接触させられるが、共刺激性シグナルは与え
られない。免疫細胞を洗浄し、休止させた後、細胞を１次活性化シグナルおよび共刺激性
シグナルの両方により再攻撃する。免疫細胞が応答（例、サイトカインを増殖または生産
）しない場合、それらは寛容にされており、サイトカインは寛容の誘導を阻止していない
。しかしながら、免疫細胞が応答する場合、寛容の誘導はサイトカインにより阻止されて
いる。寛容の誘導を阻止し得るそれらのサイトカイン類は、移植レシピエントまたは自己
免疫疾患対象において寛容を誘導するより有効な手段としてＢリンパ球抗原を遮断する試
薬と共にインビボ遮断に関して標的化され得る。例えば、サイトカイン阻止抗体が、Ｂ７
−４またはＰＤ−１阻止活性を促進する薬剤と一緒に対象に投与され得る。
Ｃ．Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドの発現をモジュレーションする分子の同定
本発明の蛋白およびペプチドを用いて生産される抗体は、細胞でのＢ７−４またはＰＤ
−１ポリペプチド発現をモジュレーションする分子に関するスクリーニングアッセイで使
用され得る。例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチド発現の変化（例、活性化シグ
ナルに応答して）において最高点を極める細胞内シグナル伝達経路をモジュレーションす
る分子は、細胞表面における１個またはそれ以上のＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチド
の発現をアッセイすることにより同定され得る。分子の存在下における適当な抗体による
免疫蛍光染色の低減化は、分子が細胞内シグナリングを阻止することを示す。Ｂ７−４ま
たはＰＤ−１ポリペプチド発現をアップレギュレーションする分子により、免疫蛍光染色
が高められる。別法として、ポリペプチド発現に対する分子の作用は、本発明プローブを
用いて細胞性ｍＲＮＡレベルを検出することにより測定され得る。例えば、Ｂ７−４また
はＰＤ−１ポリペプチドを発現する細胞を、試験される分子と接触させると、細胞におけ
るｍＲＮＡレベルの増加または減少が、標準的技術、例えばノーザン・ハイブリダイゼー
ション分析または検出可能マーカーで標識されたｃＤＮＡプローブを用いるｍＲＮＡまた
は総ポリ（Ａ＋）ＲＮＡの慣用的ドットブロットにより検出され得る。Ｂ７−４またはＰ
Ｄ−１ポリペプチドの発現をモジュレートする分子は、免疫応答を単独または上記の可溶
性の阻止性または刺激性試薬と共にアップレギュレーションまたはダウンレギュレーショ
ンするのに治療上有用である。例えば、Ｂ７−４の発現を阻害する分子は第２薬剤と一緒
に投与され得、例えば、免疫抑制剤またはＰＤ−１の発現を阻害する分子は、免疫刺激物
質、例えばアジュバントと共に与えられ得る。Ｂ７−４またはＰＤ−１をモジュレーショ
ンする能力について試験され得る分子の例としては、例えば、ＩＬ−４、γＩＮＦ、ＩＬ
−１０、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦおよびプロスタグランジンなどのサイトカイン類があ
る。
Ｄ．スクリーニングアッセイ
本発明は、モジュレーター、すなわちＢ７−４またはＰＤ−１蛋白に結合し、例えばＢ
７−４またはＰＤ−１発現またはＢ７−４またはＰＤ−１活性に対して刺激性または阻害
性効果を有する候補または試験化合物または薬剤（例、ペプチド、ペプチドミメティクス
、小分子または他の薬剤）の同定方法（ここでは「スクリーニングアッセイ」とも称され
る）を提供する。
一態様において、本発明は、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白またはポリペプチドまたはそ
の生物学的活性部分に結合するかまたはその活性をモジュレーションする、例えばＢ７−
４またはＰＤ−１ポリペプチドがその同起源の結合相手または相互作用体（インターアク
ター）分子（例、細胞内インターアクター分子）と相互作用する能力をモジュレーション
する候補または試験化合物をスクリーニングするアッセイを提供する。本発明の試験化合
物は、生物学的ライブラリー、空間的にアドレス可能な平行固相または液相ライブラリー
、デコンヴォルーション（deconvolution）を必要とする合成ライブラリー方法、「１ビ
ーズ１化合物」ライブラリー方法、およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用い
る合成ライブラリー方法を含む、当業界公知のコンビナトリアルライブラリー方法におけ
る多様な方法のいずれかを用いて得られる。生物学的ライブラリー方法はペプチドライブ
ラリーに限定され、他の４方法は化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは小分子
ライブラリーに適用可能である（Lam,K.S.（１９９７）Anticancer Drug Des.１２：１４
５）。
分子ライブラリー合成方法の例は、当業界では例えば DeWittら（１９９３）Proc.Natl
.Acad.Sci.USA９０：６９０９、Erbら（１９９４）Proc.Natl.Acad.Sci.USA９１：１１４
２２、Zuckrmannら（１９９４）J.Med.Chem.３７：２６７８、Choら（１９９３）Science
２６１：１３０３、Carrellら（１９９４）Angew.Chem.Int.Ed.Engl.３３：２０５９、Ca
rellら（１９９４）Angew.Chem.Int.Ed.Engl.３３：２０６１、およびGallopら（１９９
４）J.Med.Chem.３７：１２３３において見出され得る。
化合物のライブラリーは、溶解状態（例、Houghten（１９９２）Biotechniques １３：
４１２−４２１）、またはビーズ（Lam（１９９１）Nature３５４：８２−８４）、チッ
プ（Fodor（１９９３）Nature３６４：５５５−５５６）、細菌（Ladner ＵＳＰ５２２
３４０９）、胞子（LadnerＵＳＰ'４０９）、プラスミド（Cullら（１９９２）Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA ８９：１８６５−１８６９）またはファージ（ScottおよびSmith（１９
９０）Science２４９：３８６−３９０）、（Devlin（１９９０）Scence２４９：４０４
−４０６）、（Cwirlaら（１９９０）Proc.Natl.Acad.Sci.USA８７：６３７８−６３８
２）、（Felici（１９９１）J.Mol.Biol.２２２：３０１−３１０）、（Ladner前出）で
提供され得る。
別の態様では、アッセイは、Ｂ７−４標的分子（細胞内相互作用分子またはＰＤ−１受
容体）またはＰＤ−１標的分子（例、Ｂ７−４リガンドまたは細胞内相互作用分子）を発
現する細胞を試験化合物と接触させ、試験化合物がＢ７−４またはＰＤ−１標的分子の活
性をモジュレーション（例、刺激または阻止）する能力を測定することを含む、細胞に基
いたアッセイである。試験化合物がＢ７−４またはＰＤ−１標的分子の活性をモジュレー
ションする能力を測定するのは、例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白がＢ７−４または
ＰＤ−１標的分子に結合またはそれと相互作用する能力を測定することにより遂行され得
る。Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白がその結合相手と結合するかまたはそれと相互作用する
能力の測定は、例えば直接結合を測定することにより行われ得る。
直接結合アッセイでは、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白とＢ７−４またはＰＤ−１標的分
子の結合が、複合体における標識蛋白を検出することにより測定され得るように、Ｂ７−
４またはＰＤ−１蛋白（またはそれらの各標的分子）を放射性同位元素または酵素性標識
と結合させ得る。例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１分子、例えばＢ７−４またはＰＤ−１
蛋白は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈにより直接的または間接的に標識され、放
射性同位元素は、放射線放射の直接計数またはシンチレーション計数法により検出され得
る。別法として、Ｂ７−４またはＰＤ−１分子は、例えばセイヨウワサビペルオキシダー
ゼ、アルカリ性ホスファターゼまたはルシフェラーゼにより酵素標識され、酵素標識は適
当な基質から生成物への変換の測定により検出され得る。
反応体のいずれかを標識することなく、化合物がＢ７−４またはＰＤ−１およびその標
的分子間の相互作用をモジュレーションする能力を測定することもこの発明の範囲内に含
まれる。例えば、マイクロフィジオメーター（microphysiometer）を用いることにより、
Ｂ７−４またはＰＤ−１または標的分子のいずれも標識することなく、Ｂ７−４またはＰ
Ｄ−１とその標的分子の相互作用が検出され得る（McConnell,H.M.ら（１９９２）Scienc
e２５７：１９０６−１９１２）。ここで使用されている「マイクロフィジオメーター」
（例、サイトセンサー）は、光アドレス可能電位差センサー（ＬＡＰＳ）を用いて細胞が
その環境を酸性化させる速度を測定する分析器具である。この酸性化速度の変化は、化合
物および受容体間の相互作用の指標として使用され得る。
好ましい態様において、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白がＢ７−４またはＰＤ−１標的分
子に結合するかまたはそれと相互作用する能力の測定は、Ｂ７−４、ＰＤ−１または適当
な標的分子の活性を測定することにより達成され得る。例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１
または適当な標的分子の活性は、細胞第２メッセンジャーの誘導（例、チロシンキナーゼ
活性）を検出するか、適当な基質の触媒／酵素活性を検出するか、リポーター遺伝子（検
出可能なマーカー、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードす
る核酸に機能し得るように結合された標的応答性調節エレメントを含む）の誘導を検出す
るか、あるいはＢ７−４、ＰＤ−１または適当な標的分子により調節された細胞性応答を
検出することにより測定され得る。例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白がＢ７−４また
はＰＤ−１標的分子に結合するかまたはそれと相互作用する能力は、例えば増殖アッセイ
で免疫細胞共刺激または阻止をモジュレーションする化合物の能力を測定することにより
、またはＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドの一部分を認識する抗体へのＢ７−４また
はＰＤ−１ポリペプチドの結合能と干渉させることにより測定され得る。
本発明アッセイのさらに別の態様は、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白またはその生物学的
活性部分を試験化合物と接触させ、試験化合物のＢ７−４またはＰＤ−１蛋白またはその
生物学的活性部分への結合能を測定する細胞不含有アッセイである。Ｂ７−４またはＰＤ
−１蛋白への試験化合物の結合は、上記要領で直接的または間接的に測定され得る。好ま
しい態様において、このアッセイは、Ｂ７−４またはＰＤ−１と結合してアッセイ混合物
を形成する既知化合物とＢ７−４またはＰＤ−１蛋白またはその生物学的活性部分とを接
触させ、アッセイ混合物を試験化合物と接触させ、そして試験化合物がＢ７−４またはＰ
Ｄ−１蛋白と相互作用する能力を測定することを含むもので、その場合、試験化合物がＢ
７−４またはＰＤ−１蛋白と相互作用する能力の測定では、試験化合物が既知化合物と比
べてＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドまたはその生物学的活性部分と優先的に結合す
る能力を測定する。
アッセイの別の態様は、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白またはその生物学的部分を試験化
合物と接触させ、試験化合物がＢ７−４またはＰＤ−１蛋白またはその生物学的活性部分
の活性をモジュレーション（例、刺激または阻害）する能力を測定する無細胞アッセイで
ある。試験化合物がＢ７−４またはＰＤ−１蛋白の活性をモジュレーションする能力の測
定は、例えば、直接結合の測定に関する上記方法の一つによって、Ｂ７−４またはＰＤ−
１蛋白がＢ７−４またはＰＤ−１標的分子と結合する能力を測定することにより行われ得
る。Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白がＢ７−４またはＰＤ−１標的分子と結合する能力の測
定はまた、リアルタイム生体分子相互作用分析法（ＢＩＡ）（Sjolander,S.および Urban
iczky,C.（１９９１）Anal.Chem.６３：２３３８−２３４５およびSzaboら（１９９５）C
urr.Opin.Struct.Biol.５：６９９−７０５）といった技術を用いて行われ得る。ここで
使用されている「ＢＩＡ」は、リアルタイムで生物特異的相互作用を試験する技術であり
、反応体のいずれかを標識することない（例、ＢＩＡコア）。表面プラスモン共鳴（ＳＰ
Ｒ）の光学的現象の変化は、生物分子間における実時間反応の指標として使用され得る。
さらに別の態様において、無細胞アッセイは、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白と結合して
アッセイ混合物を形成する既知化合物とＢ７−４またはＰＤ−１蛋白またはその生物学的
活性部分を接触させ、アッセイ混合物を試験化合物と接触させ、そして試験化合物がＢ７
−４またはＰＤ−１蛋白と相互作用する能力を測定することを含み、その場合、試験化合
物がＢ７−４またはＰＤ−１蛋白と相互作用する能力の測定は、Ｂ７−４またはＰＤ−１
蛋白がＢ７−４またはＰＤ−１標的分子と優先的に結合するかまたはその活性をモジュレ
ーションする能力の測定を含む。
本発明の無細胞アッセイは、蛋白（例、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白またはその生物学
的活性部分、またはＢ７−４またはＰＤ−１が結合する結合相手）の可溶性および／また
は膜結合両形態の使用に基いて行われ得る。蛋白の膜結合形態を使用する（例、細胞表面
Ｂ７−４またはＰＤ−１受容体）無細胞アッセイの場合、蛋白の膜結合形態が溶解状態で
維持されるように可溶化剤を使用することが望ましいこともあり得る。上記可溶化剤の例
には、非イオン系デタージェント、例えばｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコ
シド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ
−メチルグルカミド、トリトン（登録商標）Ｘ−１００、トリトン（登録商標）Ｘ−１１
４、テシット（登録商標）、イソトリデシポリ（エチレングリコールエーテル)ｎ、３−
［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰ
Ｓ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロ
パンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、またはＮ−ドデシル＝Ｎ,Ｎ−ジメチル−３−アモ
ニオ−１−プロパンスルホネートがある。
上記本発明アッセイ方法の複数の態様においては、Ｂ７−４またはＰＤ−１または適当
な標的分子を固定化することにより、蛋白の一方または両方の複合体未形成形態から複合
体形成形態を分離し易くし、アッセイの自動化に適応させるのが望ましい場合もあり得る
。Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白への試験化合物の結合、または候補化合物の存在および不
存在下におけるＢ７−４またはＰＤ−１蛋白と標的分子の相互作用は、反応物を入れるの
に適しておればいずれの容器でも行われ得る。上記容器の例には、マイクロタイタープレ
ート、試験管および微細遠心管がある。一態様において、蛋白の一方または両方をマトリ
ックスに結合させ得るドメインを加えた融合蛋白が提供され得る。例えば、グルタチオン
−Ｓ−トランスフェラーゼ／Ｂ７−４またはＰＤ−１融合蛋白またはグルタチオン−Ｓ−
トランスフェラーゼ／標的融合蛋白は、グルタチオンセファロースビーズ（シグマ・ケミ
カル、セントルイス、ミズーリ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート
に吸着され得、次いでこれらを試験化合物または試験化合物および非吸着標的蛋白または
Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白と合わせ、複合体形成に導く条件（例、塩およびｐＨに関す
る生理学的条件）下で混合物をインキュベーションする。インキュベーション後、ビーズ
またはマイクロタイタープレートのウェルを洗浄して未結合成分を全て除去し、ビーズの
場合にはマトリックスを固定化し、例えば上記要領で直接的または間接的に複合体を測定
する。別法として、複合体はマトリックスから解離され、Ｂ７−４またはＰＤ−１結合ま
たは活性レベルは標準技術を用いて測定され得る。
また、蛋白をマトリックスに固定させる他の技術も本発明のスクリーニングアッセイで
使用され得る。例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白またはＢ７−４またはＰＤ−１標的
分子は、ビオチンおよびストレプトアビジンのコンジュゲーションを利用して固定化され
得る。ビオチニル化Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白または標的分子は、当業界公知の技術（
例、ビオチニル化キット、ピアス・ケミカル、ロックフォード、イリノイ）を用いてビオ
チン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から製造され、ストレプトアビジンで
コーティングした９６ウェルプレート（ピアス・ケミカル）のウェルに固定され得る。別
法として、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白または標的分子と反応するが、Ｂ７−４またはＰ
Ｄ−１蛋白とその標的分子の結合には干渉しない抗体は、プレートのウェルに誘導体化さ
れ、未結合標的またはＢ７−４またはＰＤ−１蛋白は抗体コンジュゲーションによりウェ
ルにトラップされ得る。上記複合体の検出方法は、ＧＳＴ−固定化複合体に関する上記方
法に加えて、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白または標的分子と反応性のある抗体を用いた複
合体の免疫検出法、並びにＢ７−４またはＰＤ−１蛋白または標的分子に伴う酵素活性の
検出に依存した酵素結合アッセイがある。
別の態様において、試験化合物がＢ７−４またはＰＤ−１蛋白の活性をモジュレーショ
ンする能力の測定は、Ｂ７−４の下流で機能する分子、例えばＢ７−４と相互作用する分
子、または例えばＰＤ−１の細胞質ドメインと相互作用することによりＰＤ−１の下流で
機能する分子の活性をモジュレーションする試験化合物の能力を測定することにより行わ
れ得る。例えば、第２メッセンジャーのレベルが測定され得るか、適当な標的に対するイ
ンターアクター分子の活性が測定され得るか、または先に記載された要領で適当な標的へ
のインターアクターの結合が測定され得る。
別の態様において、Ｂ７−４またはＰＤ−１発現のモジュレーターは、細胞を候補化合
物と接触させ、細胞におけるＢ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡまたは蛋白の発現を測定す
る方法で確認される。候補化合物の存在下におけるＢ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡまた
は蛋白の発現レベルを、候補化合物の不存在下におけるＢ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡ
または蛋白の発現レベルと比較する。次いで、候補化合物は、この比較に基いたＢ７−４
またはＰＤ−１発現のモジュレーターとして同定され得る。例えば、Ｂ７−４またはＰＤ
−１ｍＲＮＡまたは蛋白の発現が候補化合物の不存在下よりもその存在下における方が大
きい（例、統計的に有意に大きい）とき、候補化合物はＢ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡ
または蛋白発現の刺激因子として同定される。別法として、Ｂ７−４またはＰＤ−１ｍＲ
ＮＡまたは蛋白の発現が候補化合物の不存在下よりもその存在下における方が小さい（例
、統計的に有意に小さい）とき候補化合物はＢ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡまたは蛋白
発現の阻止因子として同定される。細胞におけるＢ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡまたは
蛋白発現レベルは、Ｂ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡまたは蛋白検出に関してここに記載
されている方法により測定され得る。
本発明のさらに別の態様において、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白、好ましくはその膜結
合形態は、２−ハイブリッドアッセイまたは３−ハイブリッドアッセイにおける「ベイト
（おとり）蛋白」として（例えば、米国特許第５２８３３１７号、Zervosら（１９９３）
Cell ７２：２２３−２３２、Maduraら（１９９３）J.Biol.Chem.２６８：１２０４６−
１２０５４、Bartelら（１９９３）Biotechniques１４：９２０−９２４、Iwabuchiら（
１９９３）Oncogene８：１６９３−１６９６、およびBrent、ＷＯ９４／１０３００参照
）、Ｂ７−４またはＰＤ−１に結合またはそれと相互作用し、Ｂ７−４またはＰＤ−１活
性に関与する他の蛋白（「Ｂ７−４またはＰＤ−１結合蛋白」または「Ｂ７−４またはＰ
Ｄ−１ｂｐ」）を同定するのに使用され得る。上記Ｂ７−４またはＰＤ−１結合蛋白はま
た、例えばＢ７−４またはＰＤ−１介在シグナル伝達経路の上流または下流エレメントと
して、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白またはＢ７−４またはＰＤ−１標的によるシグナルの
伝搬に関与すると思われる。別法として、上記Ｂ７−４またはＰＤ−１結合蛋白は、Ｂ７
−４またはＰＤ−１阻害因子であり得る。
２−ハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインから成る、
ほとんどの転写因子のモジュラー性質に基いている。簡単に述べると、このアッセイは、
２種の異なるＤＮＡ構築物を使用する。一方の構築物では、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白
をコードする遺伝子は、既知転写因子（例、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合性ドメインをコー
ドする遺伝子に融合されている。他方の構築物では、未同定蛋白（「プレイ（捕獲物、pr
ey)」または「サンプル」）をコードする、ＤＮＡ配列ライブラリーからのＤＮＡ配列は
、既知転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「ベイト」および「
プレイ」蛋白がインビボで相互作用してＢ７−４依存的複合体を形成できる場合、転写因
子のＤＮＡ結合性および活性化ドメインは極めて接近した状態におかれる。この接近によ
り、転写因子に応答性がある転写調節部位に機能し得るように結合されたリポーター遺伝
子（例、LacZ）の転写が可能となる。リポーター遺伝子の発現が検出され得、機能的転写
因子を含む細胞コロニーが単離され、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白と相互作用する蛋白を
コードするクローン化遺伝子を得るのに使用され得る。
さらにこの発明は、上記スクリーニングアッセイにより同定される新規薬剤に関するも
のである。従って、適当な動物モデルで本明細書の記載に従い同定された薬剤をさらに使
用することも本発明の範囲内に含まれる。例えば、本明細書の記載に従い同定された薬剤
（例、Ｂ７−４またはＰＤ−１モジュレーション薬剤、アンチセンスＢ７−４またはＰＤ
−１核酸分子、Ｂ７−４またはＰＤ−１特異的抗体、またはＢ７−４またはＰＤ−１結合
相手）を動物モデルで使用することにより、かかる薬剤による処置の効力、毒性または副
作用が測定され得る。別法として、本明細書の記載に従い同定された薬剤を動物モデルで
使用することにより、かかる薬剤の作用機構が測定され得る。さらに、この発明は、ここ
に記載された処置に関する上記スクリーニングアッセイにより同定された新規薬剤の使用
に関するものである。
Ｆ．検出アッセイ
ここで同定されたｃＤＮＡ配列（および対応する完全遺伝子配列）の一部分またはフラ
グメントは、ポリヌクレオチド試薬として多様な方法で使用され得る。例えば、これらの
配列を使用することにより、（ｉ）染色体におけるそれらの各遺伝子がマッピングされ、
従って、遺伝的疾患に関連した遺伝子領域の位置が確認され、（ii）微小な生物学的サン
プル（組織型別）から個体が確認され、そして（iii）生物学的サンプルの法医学的同定
が促され得る。これらの適用は下記小節に記載されている。
１．染色体マッピング
一旦遺伝子の配列（または配列の一部分）が単離されると、この配列を用いることによ
り染色体における遺伝子の位置がマッピングされ得る。このプロセスは、染色体マッピン
グと呼ばれる。従って、ここに記載されている、Ｂ７−４ヌクレオチド配列の一部分また
はフラグメントは、染色体におけるＢ７−４遺伝子の位置のマッピングに使用され得る。
染色体に対するＢ７−４配列のマッピングは、病気に関連した遺伝子とこれらの配列の相
互関係を明らかにする上で重要な第一段階である。
簡単に述べると、Ｂ７−４ヌクレオチド配列からＰＣＲプライマー（好ましくは長さ１
５−２５ｂｐ）を製造することにより、Ｂ７−４遺伝子が染色体に対してマッピングされ
得る。Ｂ７−４配列のコンピューター分析を用いることにより、ゲノムＤＮＡにおいて複
数のエクソンに及ぶわけではない、すなわち増幅プロセスを複雑にすることのないプライ
マーが予測され得る。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハ
イブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用され得る。Ｂ７−４配列に対応するヒト遺伝子
を含むハイブリッドのみ、増幅されたフラグメントを生じる。
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳類（例、ヒトおよびマウス細胞）からの体細胞を融
合することにより製造される。ヒトおよびマウス細胞のハイブリッドが成長および分裂す
るとき、それらは徐々に無作為な順序でヒト染色体を失うが、マウス染色体は保持してい
る。特定酵素を欠くが故にマウス細胞は成長し得ないが、ヒト細胞は成長し得る培地を用
いることにより、必要とされる酵素をコードする遺伝子を含む一つのヒト染色体が保持さ
れる。様々な培地を用いることにより、ハイブリッド細胞系のパネルが確立され得る。一
パネルにおける各細胞系は、単一ヒト染色体または少数のヒト染色体、および完全なセッ
トのマウス染色体を含むため、特定ヒト染色体に対する個々の遺伝子のマッピングが容易
に行われ得る。（D'Eustachio,P.ら（１９８３）Science２２０：９１９−９２４）。ヒ
ト染色体のフラグメントのみを含む体細胞ハイブリッドはまた、転座および欠失を伴うヒ
ト染色体を用いることにより製造され得る。
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定染色体に特定配列を割当てる迅速な方
法である。単一のサーマルサイクラーを用いると、３個またはそれ以上の配列が一日に割
当てられ得る。Ｂ７−４ヌクレオチド配列を用いてオリゴヌクレオチドプライマーを設計
することにより、特異的染色体からのフラグメントのパネルで部分的位置推定が達成され
得る。同様に配列をその染色体に対してマッピングするのに使用され得る他のマッピング
戦略には、insitu ハイブリダイゼーション（Fan,Y.ら（１９９０）Proc.Natl.Acad.Sci
.USA、８７：６２２３−２７に記載）、標識フローソート（flow-sorted）染色体による
プレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーとのハイブリダイゼーシ
ョンによる前選別がある。
さらに、中期染色体スプレッドへのＤＮＡ配列の蛍光in situ ハイブリダイゼーション
（ＦＩＳＨ）を用いることにより、一段階で正確な染色体位置決定が行われ得る。染色体
スプレッドは、有糸分裂紡錘体を崩壊させる化学物質、例えばコルセミドにより分裂が中
期で遮断された細胞を用いて行われ得る。染色体は、トリプシンで簡単に処理され、次い
でギエムザにより染色され得る。明暗バンドのパターンが各染色体で展開することにより
、染色体が個々に同定され得る。ＦＩＳＨ技術は、５００または６００塩基程度の短いＤ
ＮＡ配列で使用され得る。しかしながら、１０００塩基より大きいクローンは、単純な欠
失に関して充分なシグナル強度を伴う特有の染色体位置に結合する可能性が高い。好まし
くは、１０００塩基、およびさらに好ましくは２０００塩基あれば、妥当な時間量で良い
結果を得るのに充分である。この技術の検討については、Vermaら、Human Chromosomes:
A Manual ofBasic Techniques（ペルガモン・プレス、ニューヨーク、１９８８）参照。
染色体マッピング用試薬は、単一染色体またはその染色体における単一部位をマークす
るのに個々に使用され得るか、または試薬のパネルは多様な部位および／または多様な染
色体をマークするのに使用され得る。遺伝子の非コーディング領域に対応する試薬が実際
にマッピング目的には好ましい。コーディング配列は、遺伝子ファミリー内に保存されて
いる可能性が高いため、染色体マッピング中におけるクロスハイブリダイゼーションの機
会が多くなると思われる。
一旦配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体における配列の物理的位置
は、遺伝地図データと相互関係を示し得る（上記データは、例えば、McKusick,V.、Mende
lianInheritance in Manに見出される、ジョーンズ・ホプキンス・ユニバーシティー・
ウェルチ・メディカル・ライブラリーを通じてオンラインで入手可能）。次いで、同じ染
色体領域にマッピングされた、遺伝子と病気の間の関係は、例えば Egeland,J.ら（１９
８７）Nature３２５：７８３−７８７に記載された、連鎖分析（物理的近接遺伝子の共
遺伝）を通して確認され得る。
さらに、Ｂ７−４遺伝子に関連した病気に罹患および非罹患の個体間におけるＤＮＡ配
列の差異が測定され得る。突然変異が罹患個体の一部または全部では観察されるが、非罹
患個体からは全く観察されない場合、突然変異は特定疾患の誘因であると考えられる。罹
患および非罹患個体の比較は、一般的にまず染色体における構造的改変、例えば染色体拡
散から認識できるかまたはＤＮＡ配列に基いたＰＣＲを用いて検出可能な欠失または転座
を探すことを含む。最後に、幾つかの個体からの遺伝子を完全に配列決定することにより
、突然変異の存在が確認され、多型からの突然変異が区別され得る。
２．組織タイピング
本発明のＢ７−４配列はまた、微細な生物学的サンプルからの個体の確認に使用され得
る。例えば、アメリカ合衆国軍は、その人員の身元確認を目的とする制限切断断片長多型
（ＲＦＬＰ）の使用を考えている。この技術では、個人のゲノムＤＮＡを１種またはそれ
以上の制限酵素で消化し、サザーン・ブロットでプローブすると、同定するための特有な
バンドが生成される。この方法によると、喪失、交換または盗難され得るため、積極的な
確認が困難である現行「認識票」の限界が黙認されることはない。本発明の配列は、ＲＦ
ＬＰ用の追加的ＤＮＡマーカーとして有用である（米国特許５２７２０５７に記載）。
さらに、本発明の配列を使用することにより、個体ゲノムから選択された部分の実際の
一塩基毎のＤＮＡ配列を決定する代替的技術が提供され得る。すなわち、本明細書に記載
されたＢ７−４ヌクレオチド配列を使用することにより、配列の５'および３'末端から２
種のＰＣＲプライマーが製造され得る。次いで、これらのプライマーを用いて、個体のＤ
ＮＡが増幅され、それに続いてその配列決定が行われ得る。
この方法で製造された、個体からの対応するＤＮＡ配列のパネルにより、特有な個体同
定手段が提供され得るもので、これは、各個体が対立遺伝子の異なる故に上記ＤＮＡ配列
の特有なセットを有することによる。本発明の配列を使用することにより、個体および組
織から上記同定配列が得られる。本発明のＢ７−４ヌクレオチド配列は、ヒトゲノムの一
部分を特有な形で表す。対立遺伝子変異は、これらの配列のコーディング領域ではある程
度まで、および非コーディング領域ではかなりの程度まで起こる。個人間における対立遺
伝子変異は、各５００塩基当たり約１回の頻度で起こると評価されている。本明細書に記
載されている配列は各々、ある程度まで、個体からのＤＮＡが同定目的のために比較され
得る標準として使用され得る。非コーディング領域に見られる多型の数が多いため、個体
を同定するのに必要な配列は少ない。配列番号１または３の非コーディング配列は、各々
が１００塩基の非コーディング増幅配列を生じる恐らくは１０〜１０００プライマーから
成るパネルにより積極的な個体同定手段を快適な形で提供し得る。予測されたコーディン
グ配列が使用される場合、積極的な個体同定に関してより適当なプライマー数は、５００
−２０００となる。
本明細書に記載されたＢ７−４ヌクレオチド配列からの試薬のパネルを用いることによ
り、個体に特有な同定データベースを作成する場合、それらの同じ試薬が後で個体からの
組織同定に使用され得る。特有な同定データベースを用いると、生存または死亡している
個体の積極的な確認手段は極めて小さな組織サンプルからでも作成され得る。
３．法医学的生物学における部分的Ｂ７−４配列の使用
ＤＮＡに基く同定技術はまた、法医学的生物学でも使用され得る。法医学的生物学は、
例えば犯罪的行為の犯人を積極的に確認する手段として犯罪現場で発見された生物学的証
拠の遺伝子タイピングを用いる科学分野である。かかる確認を行うため、ＰＣＲ技術を用
いることにより、犯罪現場で発見された非常に小さな生物学的サンプル、例えば組織、例
えば毛髪または皮膚、または体液、例えば血液、唾液または精液から採取されたＤＮＡ配
列が増幅され得る。次いで、増幅された配列は標準と比較され得、それによって生物学的
サンプルの出所が確認され得る。
本発明の配列を用いることにより、例えば別の「同定マーカー」（すなわち、特定個体
に特有なものである別のＤＮＡ配列）を提供することによりＤＮＡに基く法医学的同定手
段の信頼度を高め得る、ヒトゲノムにおける特異的な位置に標的化されたポリヌクレオチ
ド試薬、例えばＰＣＲプライマーが提供され得る。上で述べたところによると、実際の塩
基配列情報は、制限酵素生成フラグメントにより形成されたパターンに代わる正確な手段
として同定に使用され得る。非コーディング領域で見られる多型の数が多いと、この技術
を用いて個体を識別するのが容易になるため、非コーディング領域に標的化された配列は
、この用途に特に適している。ポリヌクレオチド試薬の例には、少なくとも２０塩基、好
ましくは少なくとも３０塩基の長さを有するＢ７−４ヌクレオチド配列またはその一部分
がある。
さらに、本明細書に記載されたＢ７−４ヌクレオチド配列を用いることにより、ポリヌ
クレオチド試薬、例えば、 in situ ハイブリダイゼーション技術で特異的組織、例えば
脳組織を同定するのに使用され得る例えば標識または標識可能なプローブが提供され得る
。これは、法医学病理学者が出所不明の組織を提示された場合に非常に有用である。上記
Ｂ７−４プローブのパネルは、種および／または器官タイプによる組織の確認に使用され
得る。
同様の方式で、これらの試薬、例えばＢ７−４プライマーまたはプローブは、汚染物質
に関する組織培養物のスクリーニング（すなわち、培養物中における異なるタイプの細胞
から成る混合物の存在に関するスクリーニング）に使用され得る。
Ｇ．予測的医学
本発明はまた、診断的アッセイ、予知アッセイおよびモニタリング臨床試験が予知（予
測）目的に使用されることにより、個体を予防的に処置する予測的医学分野に関するもの
である。従って、本発明の一態様は、生物学的サンプル（例、血液、血清、細胞、組織）
の状況でＢ７−４またはＰＤ−１蛋白および／または核酸発現並びにＢ７−４またはＰＤ
−１活性を測定するための診断的アッセイに関するものであり、それによって個体が異常
型のＢ７−４またはＰＤ−１発現または活性に関連した病気または障害に罹患しているか
、または発病の危険に瀕しているか否かが決定される。本発明はまた、個体が、Ｂ７−４
またはＰＤ−１蛋白、核酸発現または活性に関連した疾患を発病する危険があるか否かを
測定するための予知（または予測的）アッセイを提供する。例えば、Ｂ７−４またはＰＤ
−１遺伝子における突然変異は、生物学的サンプルでアッセイされ得る。上記アッセイを
予知または予測目的で使用することにより、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白、核酸発現また
は活性を特徴とするかまたはそれに関連した疾患の発病前に個体を予防的に処置し得る。
本明細書に記載されたアッセイ、例えば前記診断的アッセイまたは後記アッセイはまた、
自然流産する傾向の検出に使用され得る。
本発明の別の態様は、臨床試験においてＢ７−４またはＰＤ−１の発現または活性に対
する薬剤（例、薬物、化合物）の影響をモニターすることに関するものである。
これらおよび他の薬剤については下記の項でより詳細に記載されている。
１．診断的アッセイ
生物学的サンプルにおけるＢ７−４またはＰＤ−１蛋白または核酸の存在または不存在
を検出する方法の例では、生物学的サンプルを試験対象から入手し、Ｂ７−４またはＰＤ
−１蛋白または核酸の存在が生物学的サンプルから検出されるように、Ｂ７−４またはＰ
Ｄ−１蛋白またはＢ７−４またはＰＤ−１蛋白をコードする核酸（例、ｍＲＮＡ、ゲノム
ＤＮＡ）を検出し得る化合物または薬剤と生物学的サンプルを接触させる。Ｂ７−４また
はＰＤ−１ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するのに好ましい薬剤は、Ｂ７−４また
はＰＤ−１ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る標識核酸プローブであ
る。核酸プローブは、例えばヒトＢ７−４またはＰＤ−１核酸、例えば配列番号１、３、
１０または１１の核酸またはその一部分、例えば少なくとも１５、３０、５０、１００、
２５０または５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、ストリンジェント条件
下でＢ７−４またはＰＤ−１ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズす
るのに充分なものであり得る。本発明の診断的アッセイで使用される他の適当なプローブ
もここに記載されている。
好ましいＢ７−４またはＰＤ−１蛋白検出薬剤は、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白に結合
し得る抗体、好ましくは検出可能な標識を伴う抗体である。抗体は、ポリクローナルまた
は好ましくはモノクローナルであり得る。無傷の抗体またはそのフラグメント（例、Ｆａ
ｂまたはＦ（ａｂ’)２）が使用され得る。プローブまたは抗体に関する「標識された」
の語は、検出可能な物質をプローブまたは抗体に結合（すなわち、物理的結合）させるこ
とによるプローブまたは抗体の直接標識、並びに直接標識されている別の試薬との反応性
によるプローブまたは抗体の間接標識を包含するものとする。間接標識の例には、蛍光標
識２次抗体を用いて１次抗体を検出する方法およびビオチンでＤＮＡプローブを末端標識
することにより蛍光標識ストレプトアビジンにより検出させ得る方法が含まれる。「生物
学的サンプル」の語は、対象から単離された組織、細胞および生物学的流体、並びに対象
内に存在する組織、細胞および流体を包含するものとする。すなわち、本発明の検出方法
を用いることにより、インビトロおよびインビボで生物学的サンプルにおけるＢ７−４ま
たはＰＤ−１ ｍＲＮＡ、蛋白、またはゲノムＤＮＡが検出され得る。例えば、Ｂ７−４
またはＰＤ−１ ｍＲＮＡのインビトロ検出技術には、ノーザン・ハイブリダイゼーショ
ンおよび insitu ハイブリダイゼーションがある。Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白のイン
ビトロ検出技術には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ法）、ウエスタン・ブロッ
ト、免疫沈降法および免疫蛍光法がある。Ｂ７−４またはＰＤ−１ゲノムＤＮＡのインビ
トロ検出技術にはサザーン・ハイブリダイゼーションがある。さらに、Ｂ７−４またはＰ
Ｄ−１蛋白のインビボ検出技術には、標識抗Ｂ７−４またはＰＤ−１抗体を対象に導入す
る技術がある。例えば、抗体は、対象におけるその存在および位置が標準的技術により検
出され得る放射性マーカーで標識され得る。
一態様において、生物学的サンプルは、試験化合物からの蛋白分子を含む。別法として
、生物学的サンプルは、試験対象からのｍＲＮＡ分子または試験対象からのゲノムＤＮＡ
分子を含み得る。好ましい生物学的サンプルは、対象から慣用的手段により単離された血
清サンプルである。
別の態様において、本発明方法では、さらに対照対象から対照生物学的サンプルを入手
し、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在が生物学的サンプ
ルから検出されるように、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを
検出し得る化合物または薬剤と対照サンプルを接触させ、そして対照サンプルにおけるＢ
７−４またはＰＤ−１蛋白、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を試験サンプルにおける
Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と比較する。
本発明はまた、生物学的サンプルにおいてＢ７−４またはＰＤ−１の存在を検出するた
めのキットを包含する。例えば、キットは、生物学的サンプルにおいてＢ７−４またはＰ
Ｄ−１蛋白またはｍＲＮＡを検出し得る標識化合物または薬剤、サンプル中のＢ７−４ま
たはＰＤ−１の量を測定する手段、およびサンプル中のＢ７−４またはＰＤ−１の量を標
準と比較する手段を含み得る。化合物または薬剤は、適当な容器にパッケージされ得る。
さらにこのキットは、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白または核酸の検出にキットを使用する
ための使用説明書も含み得る。
２．予知的アッセイ
さらに、本明細書に記載されている診断方法を用いることにより、異常型Ｂ７−４また
はＰＤ−１発現または活性に関連した病気または障害を発症する危険がある対象が認識さ
れ得る。例えば、本明細書に記載されたアッセイ、例えば前述の診断的アッセイまたは後
記アッセイは、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白、発現または活性に関連した疾患を発病する
危険がある対象を認識するのに使用され得る。すなわち、本発明は、試験サンプルを対象
から入手し、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白または核酸（例、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を
検出する、異常型Ｂ７−４またはＰＤ−１発現または活性と関連した病気または障害の確
認方法であって、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白または核酸の存在が、異常型Ｂ７−４また
はＰＤ−１発現または活性と関連した病気または障害に罹患しているかまたはその危険が
ある対象に特徴的なものである方法を提供する。ここで使用されている「試験サンプル」
は、興味の対象から得られた生物学的サンプルを包含する。例えば、試験サンプルは、生
物体液（例、血清）、細胞サンプルまたは組織であり得る。
さらに、ここに記載されている予知的アッセイを用いると、対象に薬剤（例、アゴニス
ト、アンタゴニスト、ペプチドミメティクス、蛋白、ペプチド、核酸、小分子または他の
薬剤候補）を投与することにより、異常型Ｂ７−４またはＰＤ−１発現または活性と関連
した病気または障害が処置され得るか否かが測定され得る。すなわち、本発明は、異常型
Ｂ７−４またはＰＤ−１発現または活性と関連した疾患用の薬剤によって対象が有効に処
置され得るか否かを測定する方法であって、試験サンプルを入手し、Ｂ７−４またはＰＤ
−１蛋白または核酸発現または活性を検出する方法（例、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白ま
たは核酸発現または活性の存在量が、薬剤を投与されることにより異常型Ｂ７−４または
ＰＤ−１発現または活性と関連した疾患が処置され得る対象にとって特徴的なものである
）を提供する。
また本発明方法を用いると、Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子における遺伝子改変を検出
することにより、遺伝子が改変された対象がＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子と関連した疾
患にかかる危険があるか否かが決定され得る。好ましい態様において、本方法は、対象か
らの細胞サンプルにおいて、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白をコードする遺伝子の完全性ま
たはＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子の誤発現に影響を及ぼす改変の少なくとも一つを特徴
とする遺伝子改変の存在または不存在を検出することを含む。例えば、上記遺伝子改変は
、１）Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子からの１個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失、
２）Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子への１個またはそれ以上のヌクレオチドの付加、３）
Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子の１個またはそれ以上のヌクレオチドの置換、４）Ｂ７−
４またはＰＤ−１遺伝子の染色体転位、５）Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子のメッセンジ
ャーＲＮＡ転写物のレベルの改変、６）Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子の異常型修飾、例
えばゲノムＤＮＡのメチル化パターンの場合、７）Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子のメッ
センジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、８）Ｂ７−４または
ＰＤ−１蛋白の非野生型レベル、９）Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子の対立遺伝子喪失、
および１０）Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白の不適当な翻訳後修飾のうち少なくとも一つの
存在を確認することにより検出され得る。ここに記載されているように、当該分野ではＢ
７−４またはＰＤ−１遺伝子における改変の検出に使用され得る多数のアッセイ技術が知
られている。好ましい生物学的サンプルは、対象から慣用的手段により単離された組織ま
たは血清サンプル、例えば心臓組織サンプルである。
ある種の態様において、改変の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例、米国特
許第４６８３１９５および４６８３２０２号参照）、例えばアンカーＰＣＲまたはＲＡＣ
Ｅ ＰＣＲまたは別法としてライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例、Landegranら（１９
８８）Science２４１：１０７７−１０８０、およびNakazawaら（１９９４）Proc.Natl.
Acad.Sci.USA ９１：３６０−３６４参照）においてプローブ／プライマーの使用を必要
としており、後者の方は、Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子において点突然変異を検出する
のに特に有用であり得る（Abravayaら（１９９５）Nucleic Acids Res.２３：６７５−６
８２参照）。この方法は、患者から細胞のサンプルを採取し、サンプルの細胞から核酸（
例、ゲノム、ｍＲＮＡまたは両方）を単離し、Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子（存在する
場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が行われる条件下Ｂ７−４またはＰＤ−１遺
伝子と特異的にハイブリダイズする一つまたはそれ以上のプライマーと核酸サンプルを接
触させ、そして増幅産物の存在または不存在を検出するか、または増幅産物のサイズを検
出し、対照サンプルと長さ比較する段階を含み得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本
明細書に記載された突然変異検出に使用される技術のいずれかと共に予備的増幅段階とし
て使用するのが望ましいことであり得ると予測される。
別の増幅方法には、持続的配列複製法（Guatelli,J.C.ら、（１９９０）Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅システム（Kwoh,D.Y.ら（１９８９）P
roc.NatlAcad.Sci.USA８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−ベータ・レプリカーゼ（Lizar
di,P.M.ら（１９８８）Biotechnology６：１１９７）、または他の核酸増幅方法があり
、次いで当業者によく知られた技術を用いて増幅された分子の検出が行なわれる。これら
の検出計画は、存在する核酸分子の数が非常に低い場合、上記分子の検出に特に有用であ
る。
別の態様において、サンプル細胞からのＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子における突然変
異は、制限酵素開裂パターンの改変により確認され得る。例えば、サンプルおよび対照Ｄ
ＮＡを単離し、増幅（所望ならば）し、１種またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで
消化し、フラグメント長のサイズをゲル電気泳動により測定し、比較する。サンプルおよ
び対照ＤＮＡ間のフラグメント長サイズの差異は、サンプルＤＮＡにおける突然変異を示
す。さらに、配列特異的リボザイムの用途（例えば、米国特許第５４９８５３１号参照）
については、リボザイム開裂部位の発生または喪失による特異的突然変異の存在について
評価するのに利用され得る。
他の態様において、Ｂ７−４またはＰＤ−１における遺伝子突然変異は、サンプルおよ
び対照核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを、数百または数千のオリゴヌクレオチドプロー
ブを含む高密度アレイにハイブリダイズさせることにより同定され得る（Cronin,M.T.ら
（１９９６）Hum.Mutat.７：２４４−２５５、Kozal,M.J.ら（１９９６）Nat.Med.２：７
５３−７５９）。例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１における遺伝子突然変異は、前出のCr
onin,M.T.ら（１９９６）に記載された光−生成ＤＮＡプローブ（light-generatedDNA p
robes）を含む二次元アレイで確認され得る。簡単に述べると、プローブの第１ハイブリ
ダイゼーションアレイを用いて、サンプルおよび対照におけるＤＮＡの長い伸長鎖を走査
し、連続オーバーラッププローブの線形アレイを作成することにより配列間の塩基変化を
確認し得る。この段階により、点突然変異の確認が行われる。この段階の後、第２ハイブ
リダイゼーションアレイによって、検出された全ての変異または突然変異に相補的な小さ
い特化されたプローブアレイを用いることにより特異的突然変異の特性確認が行われる。
各突然変異アレイは、平行プローブセットにより構成されており、一方は野生型遺伝子に
相補的であり他方は突然変異遺伝子に相補的である。
さらに別の態様では、当業界で公知の様々な配列決定反応のいずれかを用いることによ
り、Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子の直接配列決定が行われ、サンプルＢ７−４またはＰ
Ｄ−１の配列を対応する野生型（対照）配列と比較することにより突然変異が検出され得
る。配列決定反応の例には、マクサムおよびギルバート（（１９７７）Proc.Natl.Acad.S
ci.USA ７４：５６０）またはサンガー（（１９７７）Proc.Natl.Acad.Sci.USA７４：５
４６３）により開発された技術に基くものがある。また、質量スペクトル計測による配列
決定を含め（例、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９４／１６１０１、Cohenら（１９９６）Adv.Chr
omatogr.３６：１２７−１６２、およびGriffinら（１９９３）Appl.Biochem.Biotechno
l.３８：１４７−１５９参照）、診断的アッセイ（（１９９５）Biotechniques１９：４
４８）の遂行時には様々な自動化配列決定方法のいずれかが利用され得ると考えられる。
Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子において突然変異を検出する他の方法には、開裂薬剤か
らの防御を用いてＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ２本鎖におけるミスマッチ
塩基を検出する方法がある（Myersら（１９８５）Science ２３０：１２４２）。一般に
、当業界の「ミスマッチ開裂」技術は、組織サンプルから得られた潜在的突然変異体ＲＮ
ＡまたはＤＮＡと野生型Ｂ７−４またはＰＤ−１配列を含む（標識）ＲＮＡまたはＤＮＡ
をハイブリダイズさせることにより形成されたヘテロ２本鎖を提供することにより開始さ
れる。２本鎖デュプレックスは、デュプレックスの１本鎖領域、例えば対照およびサンプ
ル鎖間における塩基対ミスマッチ故に存在する領域を開裂する薬剤で処理される。例えば
、ＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスをリボヌクレアーゼで処理し、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリ
ッドをＳ１ヌクレアーゼで処理することにより、ミスマッチ領域が酵素的に消化され得る
。他の態様において、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスをヒドロキシ
ルアミンまたは四酸化オスミウムおよびピペリジンで処理することにより、ミスマッチ領
域が消化され得る。ミスマッチ領域の消化後、生成した物質を変性ポリアクリルアミドゲ
ルでサイズにより分離し、突然変異部位を測定する。例えば、Cottonら（１９８８）Proc
.Natl.Acad.Sci.USA８５：４３９７、Saleebaら（１９９２）MethodsEnzymol.２１７：
２８６−２９５参照。好ましい態様では、対照ＤＮＡまたはＲＮＡが検出用に標識され得
る。
さらに別の態様において、ミスマッチ開裂反応は、細胞のサンプルから得られたＢ７−
４またはＰＤ−１ ｃＤＮＡにおける点突然変異を検出しマッピングするために特定され
た系において２本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチ塩基対を認識する１種または以上の蛋白（
いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を使用する。例えば、エシェリシア・コリ（E.
coli）のmutＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチのＡを開裂し、ヒーラ細胞からのチミジンＤＮ
ＡグリコシラーゼはＧ／ＴミスマッチのＴを開裂する（Hsuら（１９９４）Carcinogenesi
s１５：１６５７−１６６２）。実例的態様によると、Ｂ７−４配列、例えば野生型Ｂ７
−４またはＰＤ−１配列に基いたプローブを、試験細胞（複数も可）からのｃＤＮＡまた
はＤＮＡ産物とハイブリダイズさせる。デュプレックスをＤＮＡミスマッチ修復酵素で処
理し、開裂産物がある場合、それらは、電気泳動プロトコルなどから検出され得る。例え
ば、米国特許第５４５９０３９号参照。
他の態様において、電気泳動移動度の変化を利用することにより、Ｂ７−４またはＰＤ
−１遺伝子における突然変異が確認され得る。例えば、１本鎖コンホーメーション多型（
ＳＳＣＰ）を用いることにより、突然変異体および野生型核酸間における電気泳動移動度
の差異が検出され得る（Oritaら（１９８９）Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８６：２７６６、
Cotton（１９９３）Mutat.Res.２８５：１２５−１４４、およびHayashi（１９９２）Ge
net.Anal.Tech.Appl.９：７３−７９も参照）。サンプルおよび対照Ｂ７−４またはＰＤ
−１核酸の１本鎖ＤＮＡフラグメントは変性され、そして復元され得る。１本鎖核酸の２
次構造は配列により変化し、電気泳動移動度が変化することにより、単一塩基の変化でさ
え検出可能となる。ＤＮＡフラグメントは標識されるかまたは標識プローブにより検出さ
れ得る。アッセイの感度は（ＤＮＡよりも）ＲＮＡを用いることにより高められ得、この
場合２次構造は配列変化に対する感受性が高くなる。好ましい態様において、対象方法は
ヘテロデュプレックス分析を用いることにより、電気泳動移動度の変化に基いて２本鎖ヘ
テロデュプレックス分子を分離する（Keenら（１９９１）Trends Genet.７：５）。
さらに別の態様では、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を用いて、変性剤の勾配を含
むポリアクリルアミドゲルにおける突然変異体または野生型フラグメントの動きをアッセ
イする（Myersら（１９８５）Nature３１３：４９５）。ＤＧＧＥを分析方法として使用
するとき、ＤＮＡに修飾を加え、例えばＰＣＲによって約４０bpの高融点ＧＣ−豊富ＤＮ
ＡのＧＣクランプを付加することにより、完全には変性しないということが確実にされ得
る。他の態様において、温度勾配が変性勾配の代わりに使用され、対照およびサンプルＤ
ＮＡの移動度の差異が確認される（Rosenbaumおよび Reissner（１９８７）Biophys.Chem
.２６５：１２７５３）。
他の点突然変異検出技術の例には、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション
、選択的増幅または選択的プライマー伸長があるが、これらに限定はされない。例えば、
既知突然変異が中央に配置され、次いで完全マッチが見出される場合のみハイブリダイゼ
ーションさせ得る条件下標的ＤＮＡとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー
が製造され得る（Saikiら（１９８６）Nature３２４：１６３、Saikiら（１９８９）Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA８６：６２３０）。オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション
膜に結合させ、標識標的ＤＮＡとハイブリダイズさせるとき、上記対立遺伝子特異的オリ
ゴヌクレオチドはＰＣＲ増幅標的ＤＮＡまたは若干の異なる突然変異体とハイブリダイゼ
ーションされる。
別法として、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術が本発明に関連し
て使用され得る。特異的増幅用プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、興味
の対象である突然変異を分子の中心（従って、増幅は引き算ハイブリダイゼーションによ
る）（Gibbsら（１９８９）NucleicAcids Res.１７：２４３７−２４４８）または、適
当な条件下でミスマッチによりポリメラーゼ伸長が阻止または低減化され得る１のプライ
マーの先端３'末端（Prossnerら（１９９３）Tibtech１１：２３８）に担い得る。さらに
突然変異領域に新規制限部位を導入して開裂に基く検出手段を作成することが望ましいも
のであり得る（Gaspariniら（１９９２）Mol.CellProbes６：１）。ある種の態様では、
また増幅用Taqリガーゼを用いても増幅が遂行され得ると予測される（Barany（１９９１
）Proc.Natl.Acad.Sci.USA８８：１８９）。かかる場合では、５'配列の３'末端に完全な
合致が存在する場合のみ連結反応が起こるため、増幅の存在または不存在を探すことによ
り特異的部位における既知突然変異の存在の検出が可能となる。
本明細書記載の方法は、例えば、ここに記載されている少なくとも１種のプローブ核酸
または抗体試薬を含む予めパッケージされた診断用キットを利用することにより遂行され
得、好都合にはこれを例えば臨床設定で使用することにより、Ｂ７−４またはＰＤ−１遺
伝子に関与する疾患または病気の徴候または家族歴を呈する患者が診断され得る。
さらに、Ｂ７−４またはＰＤ−１が発現される細胞型または組織であれば、本明細書に
記載された予知的アッセイで利用され得る。
VII．Ｂ７−４またはＰＤ−１モジュレーション剤の投与
本発明のＢ７−４またはＰＤ−１モジュレーション剤は、免疫細胞仲介免疫応答を促進
または抑制するためインビボ医薬投与に適した生物学的適合形態で対象に投与される。「
インビボ投与に適した生物学的適合形態」は、投与される蛋白の形態で蛋白の治療効果が
毒性作用より影響力がある場合を包含する。語の主題は、免疫応答が誘導され得る生きて
いる生物体、例えば哺乳類を包含するものとする。対象の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マ
ウス、ラットおよびそのトランスジェニック種がある。本明細書に記載された薬剤の投与
は、治療活性量の薬剤を単独または医薬的に許容し得る担体と組み合わせて含む薬理学的
形態で行われ得る。
本発明治療組成物の治療活性量の投与は、所望の成果を達成するのに必要な用量および
期間に有効な量として定義される。例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドの治療
活性量は、様々な因子、例えば個体の病状、年齢、性別および体重、並びに個体において
所望の応答を誘導するペプチドの能力により異なり得る。服用方法を調節することにより
、最適治療応答が提供され得る。例えば、幾つかの分割用量が毎日投与され得るかまたは
治療状況の緊急性が示すところに従い用量は比例的に低減化され得る。
Ｂ７−４またはＰＤ−１モジュレーション剤（例、ペプチド、核酸分子、抗体、ペプチ
ドミメティクスまたは小分子）は、慣用的方法で例えば注射（皮下、静脈内など）、経口
投与、吸入、経皮適用または直腸投与により投与され得る。投与経路により、活性化合物
は、化合物を不活化し得る酵素、酸および他の自然条件の作用から化合物を保護する物質
でコーティングされ得る。例えば、非経口投与以外の方法によりＢ７−４またはＰＤ−１
モジュレーション剤を投与するためには、ペプチドの不活化を阻止する物質でペプチドを
コーティングするかまたはその物質とペプチドを共投与するのが望ましい場合があり得る
。
Ｂ７−４またはＰＤ−１モジュレーション剤は、適当な担体、希釈液またはアジュバン
ト中で個体に投与され得、酵素阻害剤と共にまたは適当な担体、例えばリポソーム中で共
投与され得る。医薬的に許容し得る希釈液には、食塩水および水性緩衝液がある。アジュ
バントはその最も広い意味で使用され、免疫刺激性化合物、例えばインターフェロンも包
含する。ここで考えられるアジュバントには、レゾルシノール類、非イオン性界面活性剤
、例えばポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエー
テルがある。酵素阻害剤には、膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスフェ
ート（ＤＥＥＰ）およびトラシロールがある。リポソームには、水中油中水型乳剤および
慣用的リポソームが含まれる（Sternaら（１９８４）J.Neuroimmunol.７：２７）。
活性化合物はまた、非経口的または腹腔内的に投与され得る。また、分散液もグリセリ
ン、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物および油中で製造され得る。通常の貯
蔵および使用条件下では、これらの製剤は微生物の増殖を阻止するための保存剤を含み得
る。
注射可能用途に適した医薬組成物には、滅菌水溶液（水可溶性の場合）または分散液お
よび滅菌注射可能溶液または分散液の即座製造用滅菌粉末がある。どの場合も、組成物は
無菌状態でなくてはならず、容易に注射できる程度には流動性がなくてはならない。組成
物は製造および貯蔵条件下で安定していなくてはならず、微生物、例えば細菌および真菌
の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオー
ル（例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど
）およびその適当な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば
、コーティング、例えばレシチンの使用、分散液の場合には要求される粒子サイズの維持
および界面活性剤の使用により維持され得る。微生物作用の阻止は、様々な抗菌および抗
真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサー
ルなどにより達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば糖類、ポリアルコール類、例え
ばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含ませるのが好ましい。注
射可能組成物の長期間吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウ
ムおよびゼラチンを組成物に含ませることにより達成され得る。
滅菌注射可能溶液は、上記で列挙された成分の一つまたは組み合わせと共に適当な溶媒
中必要とされる量で活性化合物（例、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチド）を含有させ
た後、必要に応じて滅菌濾過することにより製造され得る。一般的に、分散液は、基本的
分散媒質および上記で列挙されたものから必要とされる他の成分を含む滅菌賦形剤中に活
性化合物を含有させることにより製造される。滅菌注射可能溶液製造用滅菌粉末の場合、
好ましい製造方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、有効成分（例、ペプチド）と先に
滅菌濾過された溶液からの追加的な所望の成分があればそれも含む粉末が生成される。
上記要領で、活性化合物が好適に保護されている場合、蛋白は例えば不活性希釈液また
は同化可能な食餌性担体とともに経口投与され得る。ここで使用されている「医薬的に許
容される担体」は、あらゆる溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張
および吸収遅延剤などを全て包含する。医薬的活性物質用の上記媒質および薬剤の使用は
当該分野ではよく知られている。慣用的媒質または薬剤が活性化合物と不適合性である場
合を除き、治療組成物中におけるその使用が考えられる。また補足的活性化合物も組成物
中に含有され得る。
投与を容易にし、用量を均一にするために非経口組成物を単位用量形態で製剤化するの
が特に有利である。ここで使用されている単位用量形態は、処置される哺乳類対象に対す
る単位用量として適した物理的に独立した単位を包含し、各単位は、必要とされる医薬用
担体と共に所望の治療効果を生じるよう計算された予め定められた量の活性化合物を含む
。本発明の単位用量形態に関する具体的内容は、（ａ）活性化合物特有の特徴および達成
すべき特定の治療効果、および（ｂ）個体における感受性を処置するため上記活性化合物
を調合する場合の当該分野固有の制限により直接的に規定される。
本発明の一態様では、Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白に対する抗体の治療有効量が対象に
投与される。ここで定義されている抗体の治療有効量（すなわち有効用量）は、約０.０
０１〜３０mg／kg（体重）、好ましくは約０.０１〜２５mg／kg（体重）、さらに好まし
くは約０.１〜２０mg／kg（体重）、さらに好ましくは約１〜１０mg／kg、２〜９mg／kg
、３〜８mg／kg、４〜７mg／kgまたは５〜６mg／kg（体重）の範囲である。当業者であれ
ば、ある種の因子が対象を効果的に処置するのに要求される用量に影響し得、それには病
気または障害の重症度、先行処置、対象の全般的健康状態および／または年齢、並びに他
に存在する病気が含まれるが限定はされないことを認識するはずである。さらに、治療有
効量の抗体による対象の処置は、単一処置を含み得るかまたは、好ましくは一連の処置を
含み得る。好ましい例では、対象を、約１〜１０週間、好ましくは約２〜８週間、さらに
好ましくは約３〜７週間、さらに好ましくは約４、５または６週間、週に１回約０.１〜
２０mg／kg（体重）の範囲の抗体で処理する。また、処置に使用される抗体の有効用量は
特定処置の経過中に増加または減少し得ると考えられる。用量の変化は本明細書記載の診
断的アッセイの結果によるものであり得る。
Ｂ７−４またはＰＤ−１蛋白の発現または活性に対する薬剤（例、薬物または化合物）
の影響のモニタリングは、基本的薬剤スクリーニングでも臨床試験でも適用され得る。例
えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子発現、蛋白レベルを増加させるかまたはＢ７−４ま
たはＰＤ−１活性をアップレギュレーションするものとして本明細書記載のスクリーニン
グアッセイにより測定された薬剤の有効性は、Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子発現、蛋白
レベルの減少、またはＢ７−４またはＰＤ−１活性のダウンレギュレーションを呈する対
象の臨床試験でモニターされ得る。他方、Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子発現、蛋白レベ
ルを減少させるか、またはＢ７−４またはＰＤ−１活性をダウンレギュレーションするも
のとしてスクリーニングアッセイにより測定された薬剤の有効性は、Ｂ７−４またはＰＤ
−１遺伝子発現、蛋白レベルの増加、またはＢ７−４またはＰＤ−１活性のアップレギュ
レーションを呈する対象の臨床試験でモニターされ得る。上記臨床試験において、Ｂ７−
４またはＰＤ−１遺伝子、および好ましくは、疾患に関与した他の遺伝子の発現または活
性は、特定細胞の表現型の「リードアウト（read out）」またはマーカーとして使用され
得る。
限定を意図したものではないが、例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１活性をモジュレーシ
ョンする（例、本明細書記載のスクリーニングアッセイで確認されたもの）薬剤（例、化
合物、薬物または小分子）での処理により細胞においてモジュレーションされる遺伝子、
例えばＢ７−４またはＰＤ−１が同定され得る。すなわち、例えば臨床試験においてＢ７
−４またはＰＤ−１関連疾患に対する薬剤の効果を試験するために、細胞を単離し、ＲＮ
Ａを調製し、Ｂ７−４またはＰＤ−１およびＢ７−４またはＰＤ−１関連疾患に関与する
他の遺伝子の発現レベルについてそれぞれ分析し得る。遺伝子発現レベル（すなわち、遺
伝子発現パターン）は、本明細書に記載された、ノーザン・ブロット分析またはＲＴ−Ｐ
ＣＲにより、または別法として本明細書記載の方法の一つにより、生産された蛋白の量を
測定することにより、またはＢ７−４またはＰＤ−１または他の遺伝子の活性レベルを測
定することにより定量され得る。この点で、遺伝子発現パターンは、薬剤に対する細胞の
生理学的応答の指標である、マーカーとしての役割を果たし得る。従って、この応答状態
は、個体の薬剤処置の前、およびその間の様々な時点で測定され得る。
好ましい態様において、本発明は、薬剤（例、本明細書記載のスクリーニングアッセイ
により確認されたアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティクス、蛋白、ペプチド
、核酸、小分子または他の薬剤候補）による対象の処置の有効性をモニターする方法であ
って、（i）薬剤投与前に対象から投与前サンプルを入手し、（ii）投与前サンプルにお
いてＢ７−４またはＰＤ−１蛋白、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出し、
（iii）対象から１個またはそれ以上の投与後サンプルを入手し、（iv）投与後サンプル
においてＢ７−４またはＰＤ−１蛋白、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現または活性レ
ベルを検出し、（v）投与前サンプルにおけるＢ７−４またはＰＤ−１蛋白、ｍＲＮＡま
たはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを、投与後サンプル（複数も可）におけるＢ７
−４またはＰＤ−１蛋白、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの場合と比較し、および（vi）そ
れによって対象への薬剤投与を改変する段階を含む方法を提供する。例えば、薬剤投与の
増加は、Ｂ７−４またはＰＤ−１の発現または活性を検出されたレベルよりも高くする、
すなわち薬剤の有効性を高めるのに望ましい手段であり得る。他方、薬剤投与の減少は、
Ｂ７−４またはＰＤ−１の発現または活性を検出されたレベルよりも低くする、すなわち
薬剤の有効性を低下させるのに望ましい手段であり得る。かかる態様によると、Ｂ７−４
またはＰＤ−１発現または活性は、観察可能な表現型応答の不存在下であっても、薬剤有
効性の指標として使用され得る。
以下、実施例によりこの発明をさらに説明するが、それらを限定的なものと解すべきで
ない。この出願全体を通して引用された全ての参考文献、特許および公開特許出願の内容
、並びに図面および配列リストは出典明示により本明細書の一部とする。
（実施例）
実施例１．Ｂ７−４ ｃＤＮＡ分子の単離
ヒトＢ７−１の細胞外ドメインの蛋白配列を用いることにより、相同性ポリペプチドを
コードする核酸分子について公開データベースを検索した。ＥＳＴデータベースにおける
２種のオーバーラップ配列ＡＡ２９２２０１およびＡＡ３９９４１６が同定された。これ
らの配列を用いて、次の要領でヒト活性化ケラチノサイトおよび胎盤ｃＤＮＡライブラリ
ーから完全長Ｂ７−４ ｃＤＮＡを単離した。
これらのＥＳＴから配列５'−ＣＡＧＣＴＡＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡ−
３'（配列番号５）および５'−ＡＧＧＴＧＣＴＡＧＧＧＧＡＣＡＧＴＧＴＴＡＧＡＣＡ−
３'（配列番号６）をもつオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチド
を用いることにより、濾胞性リンパ腫の症例の脾臓、活性化Ｂ細胞、ＩＮＦ−γ活性化ケ
ラチノサイト、正常な脾臓および胎盤からのｍＲＮＡの逆転写により調製されたｃＤＮＡ
を鋳型として用いてＰＣＲ反応をプライミングした。条件は、９４℃で１分、９４℃で３
０秒、５６℃で３０秒、６８℃で１分を３５サイクル；６８℃で３分、４℃保持であった
。鋳型は全て３８９bpの予測されたサイズのバンドを与えた。ＩＮＦ−γ活性化ケラチノ
サイトのＰＣＲからの３８９bp産物を、アガロースゲル電気泳動により精製し、０.０５
ミリモルのビオチン−２１−ｄＵＴＰおよび上記プライマーを含むＰＣＲ反応において０
.１２ngを鋳型として使用した。条件は、９４℃で１分、９４℃で３０秒、５６℃で３０
秒、６８℃で２分を２０サイクル；６８℃で５分、４℃保持であった。ビオチニル化ＰＣ
Ｒ産物をヌクレオスピンカラム（クロンテク）で精製し、クロンキャプチャーｃＤＮＡ選
別方法（クロンテク）においてプローブとして使用した。６０ngの変性ビオチニル化ＰＣ
Ｒ産物を、３０μlの最終体積中２ミリモルのＣｏＣｌ２、１×ＲｅｃＡ緩衝液、１μgの
ＲｅｃＡ蛋白、１×ＡＴＰとインキュベーションした。反応物を３７℃で１５分インキュ
ベーションした。その混合物に、０.７μgの活性化ケラチノサイトｃＤＮＡライブラリー
のプラスミドＤＮＡおよび０.４μgのヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーを加え、インキュベ
ーションを２０分間続行した。５０ngのＥｃｏＲＶ消化ラムダＤＮＡを反応物に加え、５
分間インキュベーションした。０.６μlの１０％ＳＤＳおよび５.６μgのプロテイナーゼ
Ｋを加え、３７℃で１０分間インキュベーションした。１μgの０.１モルＰＭＳＦを加え
ることにより、プロテイナーゼＫを不活化した。ストレプトアビジン磁気ビーズを１０分
間剪断したサケ精子ＤＮＡ５μgとプレインキュベーションし、ビーズを磁石で捕捉し、
上清を除去し、ビーズを３０μlの結合緩衝液（１ミリモルのＥＤＴＡ、１モルのＮａＣ
ｌ、１０ミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５）に再懸濁した。ビーズを反応物に加え
、反応物を室温で穏やかに混合しながら３０分間インキュベーションした。ビーズを磁石
で捕捉し、上清を除去した。ビーズを１mlの洗浄緩衝液（１ミリモルのＥＤＴＡ、２モル
のＮａＣｌ、１０ミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５）で洗浄し、ビーズを磁石で捕
捉し、上清を除去した。洗浄手順を３回反復した。１mlの滅菌Ｈ２Ｏを洗浄したビーズに
加え、３７℃で５分間インキュベーションし、ビーズを磁石で捕捉し、上清を除去した。
０.１mlの溶離緩衝液（１ミリモルのＥＤＴＡ、０.１ＮのＮａＯＨ）を加え、室温で５分
間インキュベーションすることにより捕捉されたＤＮＡを溶離し、ビーズを磁石で捕捉し
、上清を除去し、新しいチューブに取っておいた。担体およびｐＨ中和剤を含む沈澱混合
物２２.５μlを２.５倍量のエタノールと一緒に加えた。プラスミドＤＮＡを遠心分離に
より濃縮し、Ｈ２Ｏに再溶解した。プラスミドＤＮＡを電気穿孔によりエシェリシア・コ
リ（E.coli）ＤＨ１０Ｂ／Ｐ３へ再導入し、７.５μg／mlのテトラサイクリンおよび２５
μg／mlのアンピシリンを含むＬＢ−寒天プレートで選別した。コロニーをナイトラン（n
ytran）フィルターに取り上げ、５'−ＣＡＧＣＴＡＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＧＡＣＴＡＣＡ
Ａ−３'（配列番号７）、５'−ＡＧＧＴＧＣＴＡＧＧＧＧＡＣＡＧＴＧＴＴＡＧＡＣＡ−
３'（配列番号８）および５'−ＴＣＧＣＴＴＧＴＡＧＴＣＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＴＡ−３
'（配列番号９）の配列をもつ３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた。
オリゴは全てＡＡ２９２２０１配列からである。最終洗浄条件は、２×ＳＳＣ、０.１％
ＳＤＳ、５５℃で２０分間であった。２つのハイブリダイズしているコロニーを採取し、
ｃＤＮＡインサートの配列を決定した。
配列決定により、２形態のＢ７−４分子が示された。第１形態の分泌されたＢ７−４（
Ｂ７−４Ｓ）は、膜アンカーを伴わず短い疎水性ドメインを有する蛋白をコードする。こ
の形態のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および２に示されてい
る。第２形態のＢ７−４膜（Ｂ７−４Ｍ）は、膜貫通および短い細胞質ドメインを有する
蛋白をコードする。この形態のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３
および４に示されている。同定されたＢ７−４ファミリーの両構成員は、図３および４で
説明されているように、シグナル、ＩｇＶおよびＩｇＣドメインを有する。Ｂ７−４Ｍ形
態は、Ｂ７−１およびＢ７−２が約２６％の同一性を有する場合の条件下、存在１１およ
び伸長１で設定されたギャップペナルティでデフォルトBlosum６２マトリックスを用いて
計算したところ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照）ヒトＢ７−１とは約２１％のアミ
ノ酸同一性およびヒトＢ７−２とは約２０％のアミノ酸同一性を有する。
実施例２．Ｂ７−４ ｍＲＮＡの発現：ノーザン・ブロット分析
Ｂ７−４の可溶性形態のｍＲＮＡは、他のサイズもあり得るが、約１.２kbであると予
測される。第２形態のｍＲＮＡは約３.８kbであり、少数のｍＲＮＡは１.６および６.５k
bである。
Ｂ７−４ポリペプチドの発現を分析した。グアニジンチオシアネートによるホモジネー
ト化および塩化セシウム遠心分離によりＲＮＡを調製した。等量のＲＮＡ（約２μgポリ(
Ａ)＋ＲＮＡ）をアガロースゲル電気泳動にかけ、ブロットし、そしてＢ７−４Ｓおよび
Ｂ７−４Ｍの両形態に共通した３２Ｐ標識Ｂ７−４ｃＤＮＡの一部分とハイブリダイズ
させた。これらのＢ７−４ ｍＲＮＡは、胎盤、肺および心臓では高度発現され、胸腺で
は中程度に発現される。さらに、これらのＢ７−４ ｍＲＮＡは、骨格筋、腎臓、膵臓、
前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸および末梢血白血球では弱く発現される。それらはまた
、肝臓または脳では非常に弱く発現されることが見出された。Ｂ７−４ｍＲＮＡは非刺
激単球では発現されなかったが、ＩＦＮ−γにより強く誘導された。同様に、これらのポ
リペプチドの発現は、ＴＰＡ／ＩＦＮ−γによりケラチノサイトで、およびＩＦＮ−γに
より樹状細胞で誘導されることが見出された。これらのＢ７−４ｍＲＮＡは、非刺激Ｂ
細胞では発現されなかったが、Ｉｇ架橋により誘導された。
また、これらのＢ７−４ ｍＲＮＡの発現を様々な細胞系で調べた。それらがＢ細胞系
、例えば Raji、Ramos、ＬＢＬ、Ｎalm６およびＤＨＬ−４では発現されるところは見出
されなかった。それらはまた、Ｔ細胞系、例えばJurkat、Rex、ＣＥＭ、ＨＰＢ‐ＡＬＬ
、Peer４およびＨ９またはＨＴＬＶ−１形質転換Ｔ細胞系、例えばＳＰＰおよびＭＴ２ま
たは脊髄系Ｕ９３７では発現されなかった。
実施例３．Ｂ７−４ ｍＲＮＡ発現のさらなる特徴付け：ノーザン・ブロット分析
マウスおよびヒト多重組織ノーザン・ブロット（クロンテク、パロアルト、カリフォル
ニア）を、製造業者の使用説明書に従いＱｕｉｋＨｙｂ（ストラタジーン、ラジョラ、カ
リフォルニア）において３２Ｐ−ｄＣＴＰ放射性標識ｃＤＮＡプローブによりプローブし
た。ヒトＢ７−４プローブは、配列番号１のコーディング領域および３'非翻訳領域に及
ぶｃＤＮＡの１kbＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩフラグメントにより構成された。マウスＢ７−
４プローブは、コーディング領域からの３００bp ｃＤＮＡフラグメントにより構成され
た。対照アクチンプローブはクロンテクにより供給された。ブロットを、室温で２×ＳＳ
Ｃ、０.１％ＳＤＳ、次に６５℃で０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中２回洗浄し、オート
ラジオグラフィーにより調べた。
Ｂ７−４ ｍＲＮＡは、心臓、ヒト胎盤およびヒト胎児肝臓では高レベルで、そして脾
臓、リンパ節、胸腺およびマウス肝臓では低レベルで発現された。
Ｂ７−４ ｍＲＮＡは、ＰＵ５−１.８、ＲＡＷ２６４.７、Ｋ−Ｂalb、Ｍ−ＭＳＶ−Ｂ
ａｌｂ／３Ｔ３、Ｈｅｐａ１−６、Ｒ１.１、Ｌ１２１０、Ｐ３８Ｄ１、Ｐ８１５および
ＮＢ４１Ａ３細胞を含む、様々な形質転換マウス細胞系で発現された。
実施例４．Ｂ７−４ ｍＲＮＡ発現のさらなる特徴付け：定量的ＰＣＲ、ジーンチップ
ハイブリダイゼーション、およびＲＮＡブロット分析
抗原提示細胞におけるＢ７−４ ｍＲＮＡ発現を調べ、それらの細胞におけるＢ７−１
およびＢ７−２の発現と比較した。定量的ＰＣＲ分析の場合、細胞ＲＮＡをデオキシリボ
ヌクレアーゼ処理し、再抽出し、そして第１鎖ｃＤＮＡに変換した。ＦＡＭ（６−カルボ
キシフルオレセイン）−標識ヒトＢ７−４、Ｂ７−１、Ｂ７−２およびＧＡＰＤＨプロー
ブをＰＥバイオシステムズから購入した（Ｂ７−４：プライマー５'−ＧＣＣＧＡＡＧＴ
ＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＡＧ−３'（配列番号１３）および５'−ＴＣＴＣＡＧＴＧＴＧＣＴ
ＧＧＴＣＡＣＡＴ−３'（配列番号１４）、プローブ５'−ＦＡＭ−ＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣ
ＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡ−３'（配列番号１５）、Ｂ７−１：プライマー５'−ＡＣＧＴＧＡ
ＣＣＡＡＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＧＡＡ−３'（配列番号１６）および５'−ＴＧＣＣＡＧＣ
ＴＣＴＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＡＴ−３'（配列番号１７）、プローブ５'−ＦＡＭ−ＴＧ
ＧＣＡＡＣＧＣＴＧＴＣＣＴＧＴＧＧＴＣＡＣ−３'（配列番号１８）、Ｂ７−２：プラ
イマー５'−ＧＧＧＣＣＧＣＡＡＡＧＴＴＴＴＧＡＴ−３'（配列番号１９）および５'−
ＧＣＣＣＴＴＧＴＣＣＴＴＧＡＴＣＴＧＡＡＧＡ−３'（配列番号２０）、プローブ５'−
ＦＡＭ−ＣＧＧＡＣＡＧＴＴＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＴＣＡＣＡ−３'（配列番号２
１））。
製造業者の使用説明書に従い、パーキン・エルマーＴａｑＭａｎ（商標）ＥＺキットか
らの試薬を用いてＰＣＲ反応を９６ウェルプレートでセットアップした。分析された４遺
伝子の各々について標準曲線を構成した。４０サイクルのＰＣＲをＡＢＩプリズム７７０
０配列検出装置で実施し、ＧＡＰＤＨを用いてＢ７−４、Ｂ７−１およびＢ７−２の結果
を正規化した。
アフィメトリックスＭｕ１９ＫｓｕｂＡチップをジーンチップ・ハイブリダイゼーショ
ン分析に使用した。ネズミＢ７−４の一部分の配列は、このチップでのジ・インティテュ
ート・フォー・ゲノミック・リサーチの発現された配列標識ＴＣ１７７８１により表され
る。ＲＮＡ単離、チップ・ハイブリダイゼーションおよび走査は、Byrne,M.C.ら（２００
０）Curr.Prot.Mol.Biol.Suupl.４９：２２.２.１−２２.２.１３の記載に従い遂行され
た。
ＲＮＡブロットハイブリダイゼーションの場合、１.６kbヒトおよび３.６kbネズミＢ７
−４ ｃＤＮＡをＸｂａＩ消化により切除し、γ−３２Ｐ−ＡＴＰおよびＤＮＡポリメラ
ーゼＩのクレノウ断片での無作為プライミングにより標識した。Freeman,G.J.ら（１９９
２）J.Immunol.１４９：３７９５−３８０１の記載に従いＲＮＡブロットをハイブリダイ
ズさせた。
ヒト樹状細胞を末梢血から取り出した。フィコール勾配での分画化後、単核細胞を単離
した。非付着細胞を除去し、残りの細胞を１５０ng／mlヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄシステ
ムズ）および１００ng／mlヒトＩＬ−４（Ｒ＆Ｄシステムズ）中で２日間培養した。非付
着樹状細胞を単離し（ＣＤ８０＋ＣＤ８６＋ＨＬＡ−ＤＲ＋ＣＤ５４＋ＣＤ５８＋ＣＤ１
ａ＋）、ＧＭ−ＣＳＦ単独で培養するかまたはＧＭ−ＣＳＦ、２.５μg／ml ＬＰＳ（シ
グマ・ケミカルズ）および１０μg／mlのヒトインターフェロン−γにより活性化した。
活性化の４時間および２０時間後に、細胞を採取し、ＲＮeasyキット（キアゲン）を用い
てＲＮＡを単離した。
磁気活性化細胞選別によりネズミ骨髄単核細胞から顆粒球、リンパ球およびＩａ＋細胞
を免疫枯渇させ、ペトリ皿でＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４により培養した。樹状細胞を培
養７日後の非付着集団として採取すると、７５−８０％ＣＤ１１ｃ＋、高ＩＡ＋細胞であ
ることが立証された。細胞をＬＰＳおよびヒトインターフェロン−γにより活性化した。
ＲＮＡブロットハイブリダイゼーションによるヒト血液単核細胞における発現の分析は
、Ｂ７−２が非刺激単核細胞により発現されることはないが、インターフェロン−γ処理
時には急速にアップレギュレーションされることを立証した。別のプロ炎症性サイトカイ
ン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αで単核細胞を処理すると、培地単独の場合に見出される
のと類似した低レベルの誘導がもたらされたが、これはプラスチックへの付着による活性
化の結果であると思われる。主要４.２kb Ｂ７−４ ｍＲＮＡに加えて、マイナーな１.８
kb Ｂ７−４ ｍＲＮＡ群もインターフェロン−γ処理単核細胞において観察された。Raji
細胞系によってではなく、細胞表面免疫グロブリン架橋により活性化されたヒトＢ細胞に
よるＢ７−４の発現もまた観察された。同様に、Ｂ７−１は非刺激単核細胞により発現さ
れることはないが、Ｂ７−４発現と類似したキネティクスでインターフェロン−γに応答
してアップレギュレーションされる。対照的に、Ｂ７−２ｍＲＮＡは単核細胞で構成的
に発現され、インターフェロン−γまたはＴＮＦ−α処理はレベルに影響を及ぼさない。
また、ヒト樹状細胞によるＢ７−４、Ｂ７−１およびＢ７−２ｍＲＮＡ発現を定量的
ＰＣＲにより調べた。ヒト末梢血由来の樹状細胞を、顆粒球−マクロファージコロニー刺
激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）単独で処理するかまたはＧＭ−ＣＳＦ、リポ多糖（ＬＰＳ）およ
びインターフェロン−γにより活性化した。ＬＰＳおよびインターフェロン−γによる活
性化の結果として、Ｂ７−４ ｍＲＮＡは、非誘導細胞に対して、４時間後には１６倍増
加および２０時間後には３４倍増加で急速に誘導された。Ｂ７−１およびＢ７−２ｍＲ
ＮＡもまた活性化後に誘導された。Ｂ７−１は４時間後に２１倍および２０時間後に２２
倍で誘導された。Ｂ７−２は４時間後にもほとんど誘導を示さなかったが、発現は２０時
間後に５倍誘導された。ＬＰＳおよびインターフェロン−γで処理したネズミ骨髄由来の
樹状細胞によるＢ７−４の発現を、ジーンチップ（商標）ハイブリダイゼーションを用い
て調べた。これらの細胞におけるＢ７−４発現は、ヒト樹状細胞で観察されたものと類似
したパターンに従っており、誘導の６および２０時間後には非誘導細胞に対してＢ７−４
ｍＲＮＡの５倍誘導が観察された。これらのデータは、Ｂ７−４が抗原提示細胞および
リンパ球により発現されること、およびそれがＢ７−１およびＢ７−２と類似した形で樹
状細胞において誘導されることを示している。ヒトケラチノサイトをホルボールエステル
およびインターフェロン−γで処理してもＢ７−４が誘導された。
ネズミ組織において、約３.７kbのＢ７−４ ｍＲＮＡ転写物がノーザン・ブロット・ハ
イブリダイゼーションにより検出された。ネズミＢ７−４ｍＲＮＡの分布はヒトＢ７−
４のそれと密接に近似しており、心臓、胸腺および肺では高レベルであり、腎臓、脾臓お
よび肝臓では低レベルであった。
実施例５．Ｂ７−４の染色体局在性
Ｂ７−４遺伝子の染色体局在性を、クァンタム（トロント、カナダ）から購入できる単
染色体ブロットキットを用いて測定した。Ｂ７−４ＳおよびＢ７−４Ｍの両方を認識する
配列でブロットをプローブした。この方法を用いると、Ｂ７−４ポリペプチドはヒト染色
体９に局在し、Ｂ７−１およびＢ７−２はヒト染色体３に局在していた。ブチロフィリン
類はまた、Ｂ７−４群との限られたアミノ酸配列同一性を共有しており、染色体６におけ
る主要組織適合性遺伝子複合体に局在していた。Ｂ７−４の染色体位置は、クァンタム・
テクノロジーズ（カナダ）から入手され得る単染色体体細胞ハイブリッドＤＮＡ鋳型のＰ
ＣＲ増幅におけるＢ７−４特異的プライマーを用いて確認された。
実施例６．Ｔ細胞リガンドまたは抗体へのＢ７−４分子の結合
ＣＯＳ細胞をベクターＤＮＡ（ｐｃＤＮＡＩ）、またはＢ７−４ＭｃＤＮＡを含む発
現プラスミドによりトランスフェクションした。７２時間後、トランスフェクションされ
たＣＯＳ細胞を、３７℃で３０分間０.５ミリモルＥＤＴＡ含有ＰＢＳ中においてインキ
ュベーションすることにより脱離させた。
Ｂ７−４Ｍを発現するＣＯＳ細胞が様々なＴ細胞受容体および抗体に結合する能力を試
験した。Ｂ７−４トランスフェクションＣＯＳ細胞によるＣＤ２８Ｉｇ、ＣＴＬＡ４−Ｉ
ｇおよび対照Ｉｇの結合のＦＡＣＳ分析は、ＣＤ２８ＩｇもＣＴＬＡ４−ＩｇもＢ７−４
とは結合しないことを示した（図８）。Ｂ７−４Ｍを発現するＣＯＳ細胞がＩｇＧおよび
ネズミＩＣＯＳ−his融合蛋白に結合する能力についても試験した。ヒトＢ７−４とネズ
ミＩＣＯＳの結合は全く検出されなかった（図９）。図１０に示されているところによる
と、ＦＡＣＳ分析は、ＢＢ１（抗Ｂ７−１および抗Ｂ７−３）の結合を示したが、Ｂ７−
４トランスフェクションＣＯＳ細胞に対するＩｇＭまたは１３３（抗Ｂ７）抗体について
は示さなかった。
実施例７．Ｂ７−４分子によるＴ細胞増殖の共刺激
Ｂ７−４ポリペプチドがヒトＴ細胞増殖を共刺激する能力を試験した。
先に報告されているように（Gimmi,C.D.ら（１９９３）Proc.Natl.Acad.Sci.USA ９０
、６５８６−６５９０）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞およびマクロファージに対して
指向したモノクローナル抗体を用いた免疫磁気ビーズ枯渇法によりヒトＣＤ２８＋Ｔ細胞
を単離した。Ｂ７−４およびベクタートランスフェクションＣＯＳ細胞をトランスフェク
ションの７２時間後に採取し、１時間２５μl／mlのマイトマイシン−Ｃとインキュベー
ションし、充分に洗浄した。実験をされたことがない１０５のＴ細胞を、プレート結合抗
ＣＤ３ ｍＡｂ＋示されたＤＮＡ構築物によりトランスフェクションされた２００００の
マイトマイシン−ｃ処理ＣＯＳ細胞により刺激した。
７２時間インキュベーションの最後の１２時間に組込まれた３Ｈ−チミジン（１μCi）
によりＴ細胞増殖を測定した。図１１および１２に示されている通り、Ｂ７−４を発現す
るＣＯＳ細胞は、Ｔ細胞増殖を共刺激し得る。
実施例８．Ｂ７−４に対するネズミ抗体の生成
ネズミまたはヒトＢ７−４ ｃＤＮＡ全体を含む哺乳類発現ベクター（ｐＥＦ６または
ｐｃＤＮＡ３.１（インビトロゲン））を製造した。ｃＤＮＡ／ベクター構築物を、１mg
／mlで０.９％食塩水に溶かした（ＴＥまたはＰＢＳではない）。
免疫化前、０.９％食塩水中１mg／mlの心臓毒素（シグマ＃Ｃ−１７７７）７８μlを、
免疫化されているマウスの各後脚の前脛骨筋に注射した。次いで、各マウスを５日間単独
で放置した。
マウスに麻酔をかけた後、１mg／ml精製Ｂ７−４ ｃＤＮＡ／ベクター構築物（０.９％
食塩水中）５０μlを、各再生前脛骨筋に注射した。
免疫化の約６日後標準方法を用いて、例えばＥＬＩＳＡアッセイで抗体力価を測定した
。ｃＤＮＡ免疫化を３サイクルの間２−４週間ごとに反復した（抗体力価が＞１：１００
００になるまで）。次いで、ＰＤＬ−１でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞でマウス
に追加免疫した。
適当な抗体力価を有するマウスから単離した脾臓細胞を採取した。脾臓細胞を融合相手
ＳＰ２−０）と融合することによりハイブリドーマを製造した。ハイブリドーマおよび抗
体を、標準方法を用いて操作した（例えば、“Antibodies:A Laboratory Manual”、Harl
ow,E.およびLane,D.、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー（１９８８）参照、
出典明示により本明細書の一部とする）。
抗体２Ａ３、１０Ｄ９、５Ａ９および１１Ｄ１２は、スクリーニングアッセイで選択さ
れたものに含まれた。これらの抗体は、ヒトＢ７−４によりトランスフェクションされた
ＣＯＳまたはＣＨＯ細胞には結合するが、模擬トランスフェクション細胞またはマウスＢ
７−４によりトランスフェクションされた細胞には結合しないことが見出された。抗体を
用いることにより、様々な細胞集団におけるＢ７−４の存在が検出された。Ｂ７−４発現
は、特に心臓組織、腫瘍細胞（肺腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、胸部腫瘍細胞、上皮腫瘍細胞
および扁平上皮癌を含む）、胎盤および胸腺上皮で観察された。
実施例９．Ｂ７−４に対する完全ヒト抗体の産生
この実施例では、Ｂ７−４またはＰＤ−１に対する完全ヒト抗体を、ヒト免疫グロブリ
ン遺伝子に関してトランスジェニックであるマウスにおいて産生させる。トランスジェニ
ックマウスは、標準的方法を用いて、例えば Hoganら、“Manipulating the Mouse Embry
o:A LaboratoryManual”（コールドスプリングハーバー・ラボラトリー、出典明示によ
り本明細書の一部とする）に従い製造されるかまたは購入される。胚性幹細胞を公開され
た方法（Teratocarcinomasand embryonic stem cells:a practical approach、Robertso
n,E.J.編、ＩＲＬプレス、ワシントンＤＣ、１９８７、Zjilstraら（１９８９）Nature
３４２：４３５−４３８、および Schwartzbergら（１９８９）Science ２４６：７９９
−８０３、各々出典明示により本明細書の一部とする）に従い操作する。ＤＮＡクローニ
ング方法は、Sambrook,J.ら、MolecularCloning:A Laboratoty Manual、第２版（１９８
９、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー
、ニューヨーク、出典明示により本明細書の一部とする）に従い実施される。オリゴヌク
レオチドは、例えばアプライド・バイオシステムズのオリゴヌクレオチド合成装置で製造
業者により提供された仕様書に従い合成するかまたは購入する。
精製または組換えＢ７−４またはＰＤ−１またはＢ７−４またはＰＤ−１の細胞外ドメ
インの免疫原性部分を少なくとも含む融合蛋白を用いてトランスジェニックマウスを免疫
化する。１００μLのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中約４００μgのＢ７−４またはＰＤ−
１を、各マウスに腹腔内注射する。約６日後、後方眼窩洞出血により血清サンプルを集め
る。
Ｂ７−４またはＰＤ−１に関する抗体反応性および特異性を、間接的酵素結合イムノソ
ルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて評価する。幾つかの免疫グロブリンスーパーフ
ァミリー分子を対照（例、ＣＴＬＡ４およびＣＤ２８）として試験することにより、Ｂ７
−４またはＰＤ−１に関する抗体の抗体特異性を分析する。Ｂ７−４またはＰＤ−１に結
合するヒト可変域を有する抗体は、マウス免疫グロブリンとの交差反応性をもたないヒト
ＩｇＭおよびヒトＩｇＧサブクラスに特異的な酵素コンジュゲートにより検出される。簡
単に述べると、ＰＶＣマイクロタイタープレートは、ＰＢＳ中５μg／mLＢ７−４により
３７℃で一夜ウェルをコーティングすることにより、Ｂ７−４またはＰＤ−１でコーティ
ングされる。血清サンプルをＰＢＳ、５％血清、０.５％トウィーン−２０中で希釈し、
ウェルにおいて室温で１時間、次いで同希釈液中抗ヒトＩｇＧＦｃおよびＩｇＧ Ｆ(ab'
)セイヨウワサビペルオキシダーゼまたは抗ヒトＩｇＭＦｃセイヨウワサビペルオキシダ
ーゼとインキュベーションする。室温で１時間後、ＡＢＴＳ基質（シグマ、セントルイス
、ミズーリ）を加えることにより酵素活性を評価し、４１５−４９０nmで３０分後読み取
る。同マウスからの免疫前血清サンプルにおいて、同じ標的抗原に対するヒト抗体の力価
についても試験する。
適当な抗体力価を有するマウスから単離された脾臓細胞を採取する。脾臓細胞を適当な
融合相手（例、骨髄腫細胞）に融合することにより、ハイブリドーマが製造される。“An
tibodies:ALaboratory Manual”Ed Harlowおよび David Lane（コールドスプリングハー
バー・ラボラトリー（１９８８）、出典明示により本明細書の一部とする）に従いハイブ
リドーマおよび抗体に操作を加える。
ネズミ抗体のネズミＶＨおよびＶＬドメインの相補性決定配列を用いて、ヒト免疫グロ
ブリンのフレームワーク領域へ移植することにより、Ｂ７−４またはＰＤ−１に対するヒ
ト化抗体が生成され得る（Riechmannら、１９８８、Nature３３２：３２３、Verhoeyenら
、１９８８、Science２３９：１５３４）。
実施例１０．Ｂ７−４またはＰＤ−１と反応性のあるヒト単鎖Ｆｖの生成
モノクローナル抗体分泌性ハイブリドーマを製造する別の方法として、抗Ｂ７−４また
は抗ＰＤ−１抗体（抗体の単鎖Ｆｖ様部分）を、イギリス国メルボルン、ケンブリッジ・
アンチボディー・テクノロジー、リミテッドからのＭ１３バクテリオファージで示された
ヒト免疫グロブリン配列の組み合わせライブラリーをスクリーニングすることにより同定
および単離した（Winterら、１９９４、Annu.Rev.Immunol.１９９４、１２：４３３、Hoo
genboomら、１９９８、Immunotechnology４：１）。ＰＤ−１.ＦｃまたはＢ７−４.Ｆｃ
を用いることにより、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドに結合する免疫グロブリンラ
イブラリー構成員を単離した。ファージディスプレーライブラリーの作成およびスクリー
ニング用キットは市販されており、標準方法を用いてｓｃＦｖを生成した（Helfrichら、
J.Immunol.Methods２０００、２３７：１３１−４５、Cardosoら、Scand.J.Immunol２０
００、５１：３３７−４４）。ＰＤ−１.ＦｃまたはＢ７−４.Ｆｃをプラスチックに固定
し、ファージ発現性特異的ｓｃＦｖを、パンイングおよび多ラウンドの豊富化により選別
した（Griffithsら、１９９３、EMBOJ.、１２：７２５）。
実施例１１．Ｂ７−４に関する受容体の同定
ヒト免疫グロブリンガンマ１またはネズミＩｇガンマ２ａのヒンジＣＨ２−ＣＨ３ドメ
インに融合させたヒトＰＤ−１の細胞外領域（ＦｃＲおよび相補体相互作用を遮断する突
然変異を伴う）から成る融合蛋白を用いることにより、ＰＤ−１に結合するリガンドにつ
いて検索した。この検索の一部として、ガンマ−インターフェロンで刺激された単球の細
胞表面の染色が見出された。ノーザン・ブロット・ハイブリダイゼーションにより観察さ
れたところによると、Ｂ７−４はガンマ−インターフェロンによる刺激後に単球で誘導さ
れる。
Ｂ７−４発現ベクターにより一時的にトランスフェクションされたＣＯＳ細胞の表面へ
のＰＤ−１−Ｆｃ（ヒトＩｇガンマ１）の結合を試験した。リポフェクトアミン(Lipofec
tAMINE)トランスフェクション試薬を用いてＢ７−４ＭまたはＢ７−１によりＣＯＳ細胞
をトランスフェクションした。４８時間後、細胞を、ヒトＰＤ−１−Ｆｃ、ネズミＰＤ−
１−Ｆｃ、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ、Ｆｌｔ４−ＦｃまたはＩｇＧの後フィコエリトリン（ＰＥ
）にコンジュゲートされた抗ＩｇＧにより染色した。次いで、細胞をフローサイトメトリ
ーにより分析した。図１３に示されている通り、Ｂ７−４を発現するＣＯＳ細胞はヒトＰ
Ｄ−１−ＦｃおよびネズミＰＤ−１−Ｆｃの両方と結合したが、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ、Ｆｌ
ｔ４−ＦｃまたはヒトＩｇＧとは結合しなかった。陽性対照として、Ｂ７−１発現ＣＯＳ
細胞はＣＴＬＡ４−Ｆｃとは結合するが、ＰＤ−１−ＦｃまたはＩｇＧとは結合しないこ
とが立証された。
さらに、トランスフェクションされたＣＯＳ細胞単層の原位置(in situ)アッセイを遂
行した。単層を、ＰＤ−１Ｆｃ、ＣＴＬＡ４ＦｃまたはヒトＩｇＧ１によりプローブし、
Ｆｃ部分に対して指向され、アルカリ性ホスファターゼにコンジュゲートされた２次抗体
により結合を検出した。結合を、色素原基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホ
スフェートおよびニトロブルーテトラゾリウムおよび光学顕微鏡により視覚化した。平行
して、Ｂ７−４でトランスフェクションされた細胞は、ＰＤ−１−Ｆｃには結合するが、
ＣＴＬＡ４−Ｆｃ（ヒトＩｇガンマ１）またはＦｌｔ４−Ｆｃ、ヒトＩｇガンマ１に結合
されたネズミＦｌｔ４の細胞外領域には結合しないことが見出された。平行して、ＰＤ−
１Ｆｃは、模擬トランスフェクションされたＣＯＳ細胞の表面、Ｂ７−１またはＢ７−２
でトランスフェクションされたＣＯＳ細胞の表面とは結合しなかった。
別の実験において、ＢＩＡＣＯＲＥに基くアッセイを用いると、Ｂ７−１またはＢ７−
２の可溶性形態へのＰＤ−１−Ｆｃの結合は全く検出されず、Ｂ７−４への結合は検出さ
れた。平行して、ｈＣＴＬＡ４は、Ｂ７−４ではなくＢ７−１に結合することが示された
。ＰＤ−１−ＦｃまたはＣＴＬＡ４−Ｆｃは固定化され、条件は、Fitzら（１９９７）On
cogene１５：６１３による記載内容と本質的に同じであった。完全長Ｂ７−４ＭまたはＢ
７−４−Ｆｃによりトランスフェクションされた細胞からの濃縮ＣＯＳ細胞培地を注射し
、リアルタイム生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）（Sjolander,S.および Urbaniczky,C.（
１９９１）Anal.Chem.６３：２３３８−２３４５およびSzaboら（１９９５）Curr.Opin.
Struct.Biol.５：６９９−７０５）を用いて相互作用を測定した。ヒトＢ７−４は、ヒト
およびマウスＰＤ−１に結合することが見出され、この結合は、共に注射されたＣＴＬＡ
４−ＦｃではなくＰＤ−１−Ｆｃとの競争により阻止された。これらの実験は、固定化Ｐ
Ｄ−１−Ｆｃへの可溶性Ｂ７−４−Ｆｃ融合蛋白の結合を立証し、またＢ７−４ＭｃＤ
ＮＡトランスフェクション細胞の条件培地におけるＢ７−４の可溶性形態の存在を立証し
ており、恐らく流れ落ちた結果であると思われる。
図１４は、Ｆｌｔ４（血管内皮成長因子Ｃの受容体）ではなくＰＤ−１がＢ７−４への
ＰＤ−１の結合を競争的に阻害する能力を説明している。Ｂ７−４Ｍを発現するＣＯＳ細
胞へのヒトＰＤ−１ガンマ２ａ融合蛋白の結合は、パネルＡに示されている。この結合は
、ＰＥに結合された抗ガンマ２ａ特異的試薬により検出された。ＩｇＧ１に結合されたヒ
トＰＤ−１は、５０μg／ml、６.２５μg／ml、１００μg／mlまたは２５μg／mlで加え
られ、結合に関して競争することが見出された。対照として、１００μg／mlでのＦｌｔ
４ＩｇＧ１が、Ｂ７−４へのＰＤ−１の結合に関して競争するところは見出されなかった
。
さらに別の実験において、Ｂ７−４がＰＤ−１に結合する能力を、フローサイトメトリ
ーおよびＢＩＡＣＯＲＥ結合アッセイにより測定した。フローサイトメトリーにより検出
されたところでは（図１５）、ヒトおよびネズミＰＤ−１.Ｉｇ融合蛋白は、ＣＨＯ細胞
で発現されたヒトおよびネズミＢ７−４の両方に結合した。しかしながら、ヒトＣＴＬＡ
−４.Iｇも、ヒトＣＤ２８.Ｉgも、ヒトＩＣＯＳ.Ｉｇも、Ｂ７−４発現細胞系には結合
しなかった。ＰＤ−１融合蛋白は、ベクター単独でトランスフェクションされたＣＨＯ細
胞とは結合しなかった。ＰＤ−１：Ｂ７−４相互作用のさらなる確認は、ＢＩＡＣＯＲＥ
装置による表面プラスモン共鳴を用いて達成された。ヒトおよびネズミＰＤ−１.Ｉｇ蛋
白およびヒトＣＴＬＡ−４.Ｉｇを、デキストランチップのフローセル表面に固定し、可
溶性ヒトＢ７−４.Ｉｇへの結合について試験した。Ｂ７−４.Ｉｇは、ヒトおよびネズミ
ＰＤ−１.Ｉｇの両方に結合したが、ヒトＣＴＬＡ−４.Ｉｇには結合しなかった（図１６
）。この結合は、共に注射された可溶性ＰＤ−１.Ｉｇとの競争により遮断されたが、Ｃ
ＴＬＡ−４.Ｉｇの場合にはされなかった。ヒトＢ７−１およびＢ７−２の可溶性形態は
、固定化ヒトＰＤ−１とは結合しなかった。
これらのデータは、ＰＤ−１がＢ７−４と結合すること、およびこの相互作用はＰＤ−
１の作用を調節し得ることを立証している。
実施例１２．Ｂ７−４は免疫細胞への負のシグナルを伝達し得る。
この実施例では、１ウェル当たり５×１０５Jurkat Ｔ細胞を、抗ＣＤ３コーティング
ビーズ（１：１の割合で）および可溶性抗ＣＤ２８により刺激した。Ｂ７−４を発現する
細胞または陰性対照、いわゆるＥＺＺをウェルへ滴定した。上清を４８時間目に採取し、
ヒトＩＬ−２に関するＥＬＩＳＡによりアッセイした。図１７は、ＣＯＳＢ７−４細胞
の数（図で右方の棒線）の増加によりＩＬ−２生産が減少することを示している。
同様のアッセイフォーマットを用い、例えばＰＢＭＣからのヒトＰＨＡ芽細胞を固定化
抗ＣＤ３および可溶性抗ＣＤ２８により刺激した場合、Ｂ７−４を発現するＣＯＳ細胞で
滴定することにより、Ｔ細胞増殖の減少が観察された。
実施例１３．ＰＤ−１：Ｂ７−４相互作用は、ＣＤ３仲介Ｔ細胞増殖を阻止する。
ＰＤ−１：Ｂ７−４相互作用の機能的重要性を調べるため、Ｂ７−４とその受容体の相
互作用の機能的結果についてもヒトＴ細胞を用いて調べた。末梢血単核細胞をフィコール
−ハイパーク勾配遠心分離法により単離した。モノクローナル抗体および免疫磁性ビーズ
のカクテル（パーセプティブ・バイオシステムズ）を用いた負の選択法により、ＣＤ４＋
Ｔ細胞集団（８５−９０％純度）を精製した。抗ＣＤ３、対照ＩｇＧおよび融合蛋白を、
製造業者の使用説明書に従い先に報告された要領（Blair,P.ら（１９９８）J.Immunol.１
６０：１２−１５）でポリウレタン被覆トシル活性化ダイナビーズ（ダイナル）に共有結
合させた。示された濃度の抗ＣＤ３抗体（ＵＣＨＴ１、ファーミンゲン）を１×１０７ビ
ーズ／ml（０.１モルリン酸緩衝液、ｐＨ７.４）に加えた。対照ＩｇＧをビーズ懸濁液に
加えることにより、結合中５μg／mlという一定の総Ｉｇ濃度を維持した。同様に、抗Ｃ
Ｄ３／Ｂ７−４.Ｉｇ（γ２ａ）ビーズを指示された抗ＣＤ３抗体濃度で製造し、この場
合Ｂ７−４.Ｉｇが総結合蛋白の４０％を占め(２μg／１０７ビーズ）、対照ＩｇＧが残
りの総結合蛋白を全て構成する一定濃度であった。１０５Ｔ細胞を９６ウェルの平底プレ
ートで培養し、指示された濃度の抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８.２、ファーミンゲン）の存
在または不存在下１ビーズ対１細胞という割合でビーズを加えた。１μCi ３Ｈチミジン
／ウェルによる４日アッセイの最後の６時間培養物を標識することにより、増殖を測定し
た。サイトカインＥＬＩＳＡによる分析の場合、培養物を上記と同様に設定し、上清を指
示された時間で採取した。市販されているＥＬＩＳＡキット（ジェンザイム）を用いてイ
ンターフェロン−γ、ＩＬ−１０およびＩＬ−２濃度を測定した。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得られた精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３ｍＡｂおよび
ヒトＢ７−４.Ｉｇまたは対照Ｉｇでコーティングしたビーズにより活性化した。刺激の
９６時間後に増殖およびサイトカイン生産を評価した。図１８に示されているように、抗
ＣＤ３ｍＡｂ／Ｂ７−４.Ｉｇコーティングビーズにより活性化された細胞は、抗ＣＤ３
ｍＡｂ／対照Ｉｇ活性化細胞に対して増殖の６９％減少を示した。さらに、Ｂ７−４の存
在下における細胞活性化により、サイトカイン分泌も減少した。Ｂ７−４の存在下では、
インターフェロン−γおよびＩＬ−１０分泌はそれぞれ約８０％および６０％の率で減少
した（図１８）。ＩＬ−２生産については、２４および９６時間後の両方でこれらの活性
化条件下検出には至らなかった。しかしながら、可溶性抗ＣＤ２８形態で共刺激を与えた
条件下では、Ｂ７−４の存在下における細胞活性化によりＩＬ−２生産が減少した。すな
わち、Ｂ７−４の存在下におけるネズミおよびヒトＴ細胞の活性化により、増殖およびサ
イトカイン分泌の両方が阻止される。
実施例１４．ＰＤ−１：Ｂ７−４相互作用の結果は、Ｔ細胞受容体およびＣＤ２８シグ
ナルの強度により異なる。
Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８およびＰＤ−１伝達シグナル間の関係を調べるため、一定濃度
のＢ７−４.Ｉｇおよび増加濃度の可溶性抗ＣＤ２８ｍＡＢで、最適下限または最適濃度
の抗ＣＤ３ ｍＡＢによりヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激した。抗ＣＤ３ｍＡＢコーティング
ビーズを用いることにより、最適下限および最適Ｔ細胞刺激に要求される濃度を確立した
。最適以下のＴ細胞受容体結合条件下（１μg／mlの抗ＣＤ３ ｍＡｂ）、共刺激が存在し
ない場合最少の増加が観察された（図１９Ａ）。増加濃度の可溶性抗ＣＤ２８ｍＡＢを
加えることにより、増殖は３０倍まで増加した。これらの条件で、Ｂ７−４の存在下にお
けるＴ細胞活性化により、増殖は８０％低減化した（図１９Ａ）。Ｂ７−４刺激により伝
達される増殖の阻止を取り戻すのに最大レベルの共刺激（２５０ng／mlの抗Ｃｄ２８）が
要求された。反対に、Ｔ細胞受容体活性化の飽和条件下では（２μg／mlの抗ＣＤ３ ｍＡ
Ｂ）、Ｔ細胞増殖のＢ７−４伝達阻止はＣＤ２８共刺激が存在しない場合のみ観察された
（図１９Ｂ）。
実施例１５．Ｂ７−４がＣＤ２８シグナルおよびサイトカイン生産を阻止する能力
ＰＤ−１：Ｂ７−４経路の阻害効果は、ＴＣＲおよびＣＤ２８を通るシグナルの強度に
より決定されると思われるため（先の実施例参照）、弱いＣＤ３／ＣＤ２８伝達応答は容
易にダウンレギュレーションされる。ＣＤ２８シグナルおよびＰＤ−１：Ｂ７−４経路の
相互作用を試験するため、前活性化ＤＯ１１.１０ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＨＯ−ＩＡｄ／
Ｂ７.２またはＣＨＯ−ＩＡｄ／Ｂ７.２／Ｂ７−４により提示されたＯＶＡペプチドによ
り活性化した。
Ｂ７−４を検出するため、５×１０４ＣＨＯトランスフェクション体を、５μg／mlの
ヒトＰＤ−１Ｉｇ（ｈＰＤ−１−Ｉｇ）（ジェネティクス・インスティテュート、ケンブ
リッジ、マサチューセッツ）とインキュベーションし、ヤギ抗ネズミＩｇＧ２ａ−フィコ
エリトリン（ＰＥ）（サザーン・バイオテクノロジー・アソーシエイツ・インコーポレイ
テッド、アラバマ）により展開した。さらに、細胞を５μg／mlの抗ＩＡ−ＰＥまたはＢ
７.２−ＰＥ（ファーミンゲン、サンディエゴ、カリフォルニア）で別々に染色した。各
段階後、細胞をＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０.０２％アジ化ナトリウムで３回洗浄した。最終
インキュベーション後、細胞を１％パラホルムアルデヒドで固定した。１００００の事象
をＦＡＣＳカリバー（ベクトン・ディッキンソン、マウンテンビュー、カリフォルニア）
で分析した。全イソタイプ対照は全てファーミンゲンから得られたものであった。
脾臓細胞をＤＯ１１.１０マウスから調製し、トリス−ＮＨ４Ｃｌで処理することによ
り、赤血球を取り除いた。細胞を、１０ＦＣＳ（シグマ、セントルイス、ミズーリ）、２
ミリモルのＬ−グルタミン、１００Ｕ／mlのペニシリン、１００μg／mlのストレプトマ
イシン、２５０ng／mlのアンフォテリシンＢ、１０ミリモルのＨＥＰＥＳ、５０マイクロ
モルの２−ＭＥ（全てライフ・テクノロジーズから）および１５mg／mlのゲンタマイシン
（バイオ・ウィタッカー、ウォーカーズビル、メリーランド）を補ったＲＰＭＩ１６４０
（ライフ・テクノロジーズ、グランドアイランド、ニューヨーク）中で７２時間１μg／m
lのＯＶＡペプチド（アナリティカル・バイオテクノロジー・サービシーズ、ボストン、
マサチューセッツ）と培養した。磁力活性化細胞選別分離カラム（ミルテニイ・バイオテ
ク、オーバーン、カリフォルニア）を用いた正の選択法により、ＣＤ４＋Ｔ細胞を精製し
たところ、純度は＞９８％であった。再刺激前に一晩細胞を休眠させた。
３７℃で１６時間５０μg／mlのマイトマイシンＣ（ブリストル・ラボラトリーズ、プ
リンストン、ニュージャージー）とのインキュベーションによりＣＨＯ細胞の増殖を阻止
した。インキュベーション期間の最後に、細胞をＰＢＳ中１０ミリモルのＥＤＴＡにより
採取し、２回洗浄し、１時間氷上で放置した。それに続いて、細胞を３回洗浄し、培養培
地に再懸濁した。１０５の前活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を、９６ウェルプレートにおいて様々
な濃度のＯＶＡペプチドおよび１０４のマイトマイシンＣ処理ＣＨＯトランスフェクショ
ン体と培養した。増殖をアッセイするため、培養物を４８時間インキュベーションし、イ
ンキュベーション期間の最終６時間１μCi／ウェルの［３Ｈ］チミジン（ニューイングラ
ンド・ヌクリアー、ボストン、マサチューセッツ）を用いてパルスした。
Ｂ７およびＩＡｄの発現は、全ＣＨＯトランスフェクション体において類似していた（
図２０）。予想通り、Ｂ７.２の導入により、全抗原濃度でのＴ細胞による増殖性応答が
増加した（図２１）。しかしながら、Ｂ７−４は低いペプチド濃度（０.０１μg／mlおよ
び０.００１μg／ml）で応答を阻止した（図２１）。
サイトカイン生産を阻止するＰＤ−１：Ｂ７−４経路の能力を調べるために、ＣＨＯ細
胞トランスフェクション体により提示されたＯＶＡペプチドにより活性化されたＤＯ１１
.１０ＣＤ４＋Ｔ細胞からの上清を分析した。上清のアリコートを培養開始後様々な時点
で採取した。ｍＡｂおよびファーミンゲンからの組換えサイトカイン標準物質を用いてＩ
Ｌ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０レベルを分析した。検出限界は次の通り
であった：ＩＬ−２、２０pg／ml、ＩＬ−４、４０pg／ml、ＩＦＮ−γ、１００pg／mlお
よびＩＬ−１０、２００pg／ml。ＤＯ１１.１０ ＣＤ４＋Ｔ細胞を０.１μg／mlのペプチ
ドおよびＢ７−４と培養したとき、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０の
生産は著しく阻止された（図２２）。この濃度では、弱い増殖阻止があるだけであった。
しかしながら、Ｂ７−４は０.０１μg／mlペプチドでサイトカイン生産を顕著に阻害して
おり、増殖阻止と一致していた（図２３）。ＩＬ−１０はこれらの活性化条件下では検出
されなかった。従って、Ｂ７−４によるＰＤ−１連結により、Ｔ細胞増殖が影響されない
ときでもサイトカイン生産はダウンレギュレーションされ得る。
サイトカイン生産の減少がｍＲＮＡレベルの低下に起因するか否かを測定するため、リ
ボヌクレアーゼ保護アッセイを使用した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を様々なＣＨＯ細胞トランスフ
ェクション体および０.０１μg／mlのＯＶＡペプチドにより再刺激した。４８時間後、細
胞を採取し、トリゾール（TRIzol、商標）試薬（ライフ・テクノロジーズ）を用いてｍＲ
ＮＡを単離した。製造業者の使用説明書に従いリボクアント（RiboQuant）マルチプロー
ブキットｍＣＫ１（ファーミンゲン）を用いたリボヌクレアーゼ保護アッセイにより、５
μgのｍＲＮＡをサイトカインレベルについて分析した。ＣＨＯ−ＩＡｄ／Ｂ７.２により
提示された０.０１μg／mlのＯＶＡペプチドによる刺激後、前活性化ＤＯ１１−１０ＣＤ
４＋Ｔ細胞においてＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−２、ＩＬ−６およびＩＦ
Ｎ−γｍＲＮＡの転写物レベルが検出された。しかしながら、Ｂ７−４の導入により、サ
イトカインｍＲＮＡレベルは著しく低減化した。非刺激Ｔ細胞培養物またはＣＨＯ−ＩＡ
ｄにより提示されたペプチドで活性化されたＴ細胞においては、サイトカインに関するｍ
ＲＮＡのアップレギュレーションはごく僅かなものであった。さらに、これらの結果は、
ＰＤ−１：Ｂ７−４経路には少なくとも抗原性刺激が弱いかまたは限定的であるときに強
いＢ７／ＣＤ２８シグナルと拮抗する能力があること、および強い抗原性刺激の条件下で
は少なくともサイトカイン生産が阻止されることを立証している。
実施例１６．ＰＤ−１：Ｂ７−４経路の作用機構
ＣＴＬＡ−４の架橋は、特定の実験を受けたことがないＴ細胞において細胞周期の進行
を阻止することが示された（Krummel.M.F.および Allison,J.P.（１９９６）J.Exp.Med.
１８３：２５３３−２５４０、Walunas,T.L.ら（１９９６）J.Exp.Med.１８３：２５４１
−２５５０）。アポトーシスが行なわれているネズミ細胞系からＰＤ−１を単離したため
、ＰＤ−１：Ｂ７−４経路の可能な作用機構はプログラム化細胞死を増加させることにな
り得る。この論点に取り組むため、ＤＯ１１.１０ ＣＤ４＋Ｔ細胞を０.０１μg／mlのペ
プチドおよび様々なＣＨＯトランスフェクション体により再刺激し、細胞周期の進行を分
析した。前と同じ要領でＣＤ４＋Ｔ細胞を０.０１μg／mlペプチドにより再刺激した。３
６時間の培養後、細胞を採取し、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣで染色した。細胞をＰＢＳで洗浄し
、氷上で１時間７０％エタノールに固定し、次いで１０μg／mlのリボヌクレアーゼ（シ
グマ）および５０μg／mlよう化プロピジウム（シグマ）を含むＰＢＳに再懸濁した。染
色の１時間以内に分析を遂行した。
４８時間後、細胞を採取し、ＣＤ４−ＦＩＴＣで染色した。透過性にした後、細胞をヨ
ウ化プロピジウムとインキュベーションし、Ｇ０／Ｇ１、Ｓ／Ｇ２およびサブジプロイド
集団を分析した。ＣＨＯ−ＩＡｄにより提示されたペプチドで再刺激されたＣＤ４＋Ｔ細
胞は、アポトーシスの指標である、サブジプロイド集団における細胞の大部分を有する（
図２４）。ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＨＯ−ＩＡｄ／Ｂ７−２により提示されたペプチドにより
刺激された培養物では、Ｓ／Ｇ２相における細胞数は増加し、サブジプロイド集団での数
は減少していたことから、細胞がその周期中にあり、Ｂ７／ＣＤ２８共刺激によるアポト
ーシスから救済されたことがわかった。Ｂ７−４の導入により、Ｇ０／Ｇ１期における細
胞数が増加した（図２４）。Ｂ７−４培養物には、ＣＨＯ−ＩＡｄ／Ｂ７培養物の場合と
同等のレベルのアポトーシスが存在した。これはアネキシン染色により確認された。ＰＤ
−１：Ｂ７−４経路による細胞進行の阻止により、Ｔ細胞活性化のダウンレギュレーショ
ンにおけるその役割が確認される。
実施例１７．ヒトＰＤ−１Ｆｃへのビオチニル化ヒトＢ７−４Ｆｃの結合阻止
ネズミＩｇγ２ａのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインにＰＤ−１またはＢ７−４の細胞
外領域を結合することにより、Ｆｃ融合蛋白を生成した。リポフェクタミン（LipofectAM
INE、ギブコ−ＢＲＬ）で一時的にトランスフェクションされたＣＨＯ細胞または安定し
たトランスフェクションＣＨＯ細胞系において組換え蛋白を製造し、プロテインＡ−セフ
ァロースを用いて条件培地から精製した。
Ｂ７−４またはＰＤ−１に対する抗体がヒトＢ７−４ＦｃおよびヒトＰＤ−１Ｆｃの相
互作用を阻止する能力を、標準ＥＬＩＳＡ方法を用いて試験した。簡単に述べると、ヒト
ＰＤ−１Ｆｃ分子を９６ウェルプレートに固定し、遮断し、洗浄した。ビオチニル化Ｂ７
−４Ｆｃ分子（１００ng／ml）を約２０００、７００、２００、７０、２５、８および１
.１８ng／mlの濃度でウェルに加えた（図２５）。ウェルを、ストレプアビジン（StrepAv
idin）をコンジュゲートしたセイヨウワサビペルオキシダーゼとインキュベーションし、
洗浄し、標準的方法を用いて発色させた。Ｂ７−４FcのＥＤ５０は、１０８ng／mlである
ことが見出された。
ヒトＢ７−４（１０Ｄ９および１１Ｄ１２）またはヒト免疫グロブリンのscＦｖ部分（
Ｂ７−４−１、Ｂ７−４−６およびＢ７−４−１２）に対するネズミ抗体が、ヒトＰＤ−
１Ｆｃへのビオチニル化ヒトＢ７−４Ｆｃの結合を阻止する能力を７種の濃度の阻害剤で
試験した。ＩＣ５０は、０.５ナノモル〜２４ナノモルの範囲であることが見出され、デ
ータは図２５に示されている。
また、上記と同じＥＬＩＳＡ方法を用いて、ＰＤ−１特異的scＦｖを、ＰＤ−１Ｆｃへ
のＢ７−４Ｆｃの結合を阻止するそれらの能力について試験した。ＰＤ−１と反応性のあ
るヒトscＦｖ（ＰＤ１−１７scＦｖ）は、図２６で示されている通り特異的結合を阻止す
ることが見出された（１０−７および１０−８間のＥＣ５０）。ＰＤ１−１７scＦｖのＶ
LおよびＶHドメインを用いて、完全ＩｇＧを生成した。簡単に述べると、ＶＨおよびＶＬ
コーディング領域を、発現ベクターのゲノムＣＨおよびＣＬ遺伝子配列に結合させた。生
成した発現ベクターを、ヒト２９３細胞中に一時的にトランスフェクションし、ＩｇＧを
馴化培地から採取した。移植された全ＩｇＧ分子の効力は、scＦｖ抗体の場合よりも高か
った（１０−８モルおよび１０−９モル間のＥＣ５０）。
実施例１８．ネズミモデルにおいて可溶性Ｂ７−４Ｆｃの投与は病気を増悪させる。
Ｂ７−４／ＰＤ−１経路のモジュレーションがインビボで免疫調節活性を有するか否か
を測定するため、ヒトの病気である多発性硬化症と多くの臨床的および病理学的特徴を共
有し得る実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）のネズミモデルにおいて蛋白を評価した。雌
ＳＪＬ／Ｊマウスを、完全フロイントアジュバント中プロテオリピド蛋白（ＰＬＰ）１０
０μgにより免疫化した。１０日後、脾臓を摘出し、単細胞懸濁液に調製し、次いで９６
時間５μgのＰＬＰによりインビトロで再刺激した。細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、次い
で腹腔内注射により特定の実験を受けたことがないＳＪＬ／Ｊマウスに１５×１０６細胞
を移入した。自己反応性(autoreactive)Ｔ細胞の養子免疫伝達により、レシピエントのマ
ウスに急性麻痺が誘発され、このマウスに尾部の正常な感受性を喪失するという徴候が現
れ、それに続いて完全な後脚麻痺へと進行する。この麻痺症状の発現は、ＣＮＳにおける
活性化Ｔ細胞およびマクロファージの著しい浸潤と一致する。ほとんどの条件下で、これ
は病気の急性モデルであり、短期間の麻痺の後には自然回復が見られる。Ｂ７−４Ｆｃを
評価するため、細胞移入の０、２、４、７および１１日後に１００μlの滅菌食塩水中蛋
白２００μgをマウスに皮下注射した（ｎ＝１０）。対照マウス（ｎ＝１０）には等量の
食塩水のみを与えた。全動物を病気の臨床徴候について定期的にモニターし、次の通り評
価した：１．尾部の正常な感受性の喪失、２．後脚虚弱／部分的後脚麻痺、３．完全後脚
麻痺、４．後および前脚麻痺、５．瀕死状態。
図２７に示された実験では、臨床疾患の発生および開始は両群で類似していた。しかし
ながら、Ｂ７−４Ｆｃで処理されたマウスは重い病状を発現し、動物の大多数は完全後お
よび前脚麻痺へと急速に進行した（Ｂ７−４Ｆｃおよび対照マウスについてはそれぞれ９
／１０および１／１０）。病気の臨床的徴候に関連した死亡率は、対照群では１０％およ
びＢ７−４Ｆｃ処理マウスでは７０％であった。さらに、処理は１１日目に停止されたと
いう事実にも拘わらず、実際に生存しているＢ７−４Ｆｃ処理マウスでは臨床的病状の回
復が実質的に遅れていた。
結論として、Ｔ細胞により媒介される自己免疫性の養子免疫伝達モデルを用いると、可
溶性Ｂ７−４Ｆｃを投与することにより、病気の臨床的徴候が増悪する結果、死亡率は高
まり、麻痺からの回復は遅れる。これらの発見は、ＣＮＳへの炎症性細胞の高い活性化／
浸潤と一致しており、インビボでのＢ７−４Ｆｃ蛋白に関する免疫調節潜在性を明らかに
立証している。
均等内容事項
当業者であれば、ここに記載された本発明の実施態様について多くの均等内容事項を認
めるはずであり、または常用の実験を用いるだけでそれらを確かめることができるはずで
ある。かかる均等内容事項は、本明細書の請求の範囲に包含されるものとする。

Claims (1)

  1. 本明細書に記載の発明。
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