TWI891771B

TWI891771B - 冠狀病毒疫苗

Info

Publication number: TWI891771B
Application number: TW110113785A
Authority: TW
Inventors: 赤畑渉; 強納森Ｆ史密斯; 司上野
Original assignee: 美商Ｖｌｐ醫療股份有限公司
Priority date: 2020-04-17
Filing date: 2021-04-16
Publication date: 2025-08-01
Also published as: US20250228931A1; EP4135847A4; JP2023523580A; JP7644993B2; JP2025071272A; TW202204623A; CN115867658A; EP4135847A1; US20210322541A1; WO2021210686A1; US12280102B2

Abstract

本發明提供一種單離聚核苷酸，其編碼α病毒非結構性蛋白質nsp1、nsp2、nsp3與nsp4及包含與訊號序列及/或跨膜域融合之冠狀病毒蛋白質之多肽。冠狀病毒蛋白質可為冠狀病毒棘(S)蛋白之S1次單元之受體結合域。RNA等多核苷酸係適合用作為對抗冠狀病毒感染之疫苗，尤其是對抗COVID-19感染之疫苗。

Description

冠狀病毒疫苗

本發明總體係有關疫苗領域、以及用以治療及/或免疫病毒感染之方法及組成物。特定言之，本發明係有關一種針對冠狀病毒，例如，SARS-CoV-2(COVID-19)之疫苗。

冠狀病毒為通常引起類似普通感冒之輕度至中度上呼吸道病況的大型病毒家族。然而，過去二十年來已經從動物宿主中發現三種會引起嚴重及廣泛傳播的病況及死亡的新型冠狀病毒。

冠狀病毒有數百種大多數在諸如：豬、駱駝、蝙蝠、與貓等動物中傳播。有時，彼等病毒會跳到人體(稱為外溢感染事件)而導致疾病。使人生病的七種已知冠狀病毒中有四種僅引發輕度至中度疾病。三種引發較嚴重甚至致死的疾病。SARS冠狀病毒(SARS-CoV)出現在2002年11月，並引發嚴重急性呼吸症候群(SARS)。該病毒在2004年消失。中東呼吸症候群(MERS)係由MERS冠狀病毒(MERS-CoV)引起。MERS係從駱駝的動物宿主傳播，並在2012年9月判別，並持續引起零星及局部的爆發。本世紀出現的第三種新型冠狀病毒稱為SARS-CoV-2。其引起在2019年12月從中國發生的冠狀病毒疾病2019(COVID- 19)，並於2020年3月11日由世界衛生組織(World Health Organization)宣佈為全球大流行(https：//www.niaid.nih.gov/diseases-conditions/coronaviruses)

大多數感染COVID-19病毒的人會出現輕度至中度呼吸病況，不需要特殊治療即可恢復。年長者及彼等患有諸如：心血管疾病、糖尿病、慢性呼吸疾病、與癌症等潛在性疾病的人較容易發展成嚴重病況。目前，沒有針對COVID-19的特定疫苗或治療。(https：//www.who.int/health-topics/coronavirus#tab=tab_1)

由於疫苗是供給給眾多健康的人，因此疫苗的安全性把關通常比投予給已患病的人之藥物更高。研究者對SARS-CoV-2(COVID-19)疫苗安全性的主要考量在於避免所謂的疾病增強現象，即接受疫苗接種的人在感染後發展出比從未接種的人更嚴重的疾病。在2004年報導的實驗性SARS疫苗報告中，接種疫苗的雪貂在感染病毒後，在肝臟發展出傷害性發炎。

抗體依賴性增強作用(ADE)為某些病毒(如：登革熱病毒、貓科冠狀病毒、及HIV)作為替代策略的機制，會感染展現Fc受體之宿主細胞，從而利用抗病毒體液免疫反應。ADE是否發生在SARS-冠狀病毒感染中尚有爭議，但已有報告指出對抗SARS-冠狀病毒之棘蛋白之抗體可能引發ADE效應。

德州休士頓貝勒醫學院(Baylor College of Medicine in Houston,Texas)的疫苗科學家Peter Hotez認為在將試驗轉移到人類之前，應先在動物測試有潛力的疫苗以排除疾病增強作用。他表示他了解希望快速推動SARS-CoV-2(COVID-19)疫苗至人體試驗的理由，但因為疫苗有增強疾病的可能性，他強調「我不確定這是你想要的疫苗」。(非專利文獻1)

因此相關技術領域中需要一種可以避免ADE效應且更安全之冠狀病毒疫苗。

[摘錄列表]

[專利文獻]

專利文獻1：WO 2019/124441

[非專利文獻]

非專利文獻1：Nature 579, 481 (2020)

本發明係有關一種新穎之抗原活性蛋白質/多肽，其可誘發對抗冠狀病毒之保護作用，同時使ADE可能性最小化。本文所揭示之蛋白質/多肽包括與訊號序列及/或跨膜域融合之冠狀病毒結構性蛋白質。冠狀病毒結構性蛋白質可能為棘(S)蛋白、核殼(N)蛋白、膜(M)蛋白、小套膜蛋白(E)或該等之組合。具體例可包括棘蛋白之S1及/或S2次單元，尤其是S1次單元之受體結合域。

另一項態樣中，本發明係有關一種新穎之多核苷酸，係編碼上文所述之可誘發對抗冠狀病毒之保護作用之新穎抗原活性蛋白質/多肽。

另一項態樣中，本發明係有關一種新穎之α病毒複製子(Replicon)，係可表現上文所述之抗原活性蛋白質/多肽。α病毒複製子包括諸如：編碼α病毒非結構性蛋白質nsp1、nsp2、nsp3與nsp4之RNA之多核苷酸，及編碼上文所述之抗原活性蛋白質/多肽作為目的基因(a gene of interest)之多核苷酸。

又另一項態樣中，本發明係有關一種疫苗，係包含上文所述之多肽或多核苷酸。尤其是，本發明提供一種疫苗，係包含：編碼α病毒非結構性蛋白質nsp1、nsp2、nsp3與nsp4之多核苷酸、及包含與訊號序列及/或跨膜域融合之冠狀病毒結構性蛋白質之多肽。該疫苗可用於預防及/或治療個體之冠狀病毒感染。

又另一項態樣中，本發明係有關一種免疫接種、預防或治療個體免於冠狀病毒感染之方法，係包括對有此需要之個體投予有效量之上文所述之多肽或多核苷酸。

再另一項態樣中，本發明係有關一種以上文所述之多肽或多核苷酸於醫藥製造之用途。

圖1係α病毒複製子之構築體。

圖2係構築體C之全長VEEV TC-83載體，係包括實施例3製造之SS1-RBD-GS-IgG4-CH₃(連接子(linker))-GS-TM1。

圖3係RBD於實施例3所製備之經α病毒複製子質體載體轉染之HEK293T細胞中之表現。

圖4-1係在免疫接種實施例4所製備之α病毒複製子顆粒第14天及第35天之小鼠血清中，對抗COVID-19棘蛋白之抗體效價。

圖4-2係在免疫接種實施例4所製備之α病毒複製子顆粒第14天及第35天之小鼠血清中，對抗COVID-19棘蛋白之抗體效價。

圖5-1係在免疫接種實施例4所製備之α病毒複製子顆粒第14天及第35天之小鼠血清中，對抗COVID-19 RBD之抗體效價。

圖5-2係在免疫接種實施例4所製備之α病毒複製子顆粒第14天及第35天之小鼠血清中，對抗COVID-19 RBD之抗體效價。

圖6係在免疫接種實施例4所製備之α病毒複製子顆粒第7天之小鼠血清中，對抗COVID-19棘S1抗原之抗體效價。

圖7係在免疫接種實施例8所製備之α病毒自行擴增RNA第14、28、及46天之小鼠血清中，對抗COVID-19 S1蛋白質之抗體效價。

本文所採用之「冠狀病毒」意指屬於冠狀病毒科(Coronaviridae)之單股正鏈(positive-sense)RNA病毒。冠狀病毒科病毒實施例包括但不限於：SARS-Cov、MERS-Cov及SARS-CoV-2(COVID-19)。SARS-CoV-2(COVID-19)可包括已知及未知之突變株。已知突變株可包括：COVID-19 E484K_N501Y_K417T突變株(巴西種突變株)、E484K_N501Y_K417N突變株(南非突變株)及E484K突變株。冠狀病毒基因體編碼許多種非結構性蛋白質、及包括棘(S)、核殼(N)、膜(M)及小套膜(E)之四種主要結構性蛋白質。棘(S)蛋白係一種由S1及S2次單元組成之大套膜醣蛋白。「受體-結合域(RBD)」位在S1次單元中。本文所採用之結構性蛋白質之較佳例為冠狀病毒RBD。COVID-19及其突變株之棘蛋白、棘蛋白之S1與S2次單元、及RBD已被確認並公開(Wrapp等人，Science 10.1126/science.abb2507(2020),Z.Wang等人，(預印本)bioRxiv 2021.01.15.426911；doi：https：//doi.org/10.1101/2021.01.15.426911)。

本文所採用之「冠狀病毒結構性蛋白質」可為自然存在之病毒結構性蛋白質或其經修飾的蛋白質。經修飾蛋白質可為自然存在之病毒結構性蛋白質之片段。一實施態樣中，經修飾蛋白質可與自然存在之病毒結構性蛋白質或其片段具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%胺基酸序列一致性。一實施態樣中，經修飾蛋白質為依據自然存在之病毒套膜蛋白質或其片段，缺失、取代、及/或增加至多10%胺基酸之突變體。

本文所採用之「跨膜域(TM)」為衍生自自然或合成來源之蛋白質。來源為自然時，有些態樣中之域係衍生自任何膜結合或跨膜蛋白質。一態樣中，膜結合或跨膜蛋白質為與COVID-19異源之蛋白質。該膜結合或跨膜蛋白質實施例可包括：T-細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154；如人類之TLR1-TLR10及小鼠之TLR1-TLR9、TLR11-TLR13之似Toll受體(TLR)；屬於GPCR趨化因子受體之介白素(IL)受體(如：IL-1-28受體)、RANTES受體(CCR1、CCR3、CCR5)、MIP-1受體、PF4受體、M-CSF受體及NAP-2受體；血球凝集素(HA)。另一態樣中，膜結合或跨膜蛋白質為衍生自COVID-19之蛋白質，如：COVID-19棘蛋白。

跨膜蛋白質實例亦可包括下列：

5-脂肪加氧酶-活化蛋白質、ABC轉運子(transporter)、ACBP、類澱粉蛋白β(A4)、Bcl-2抑制劑、BNIP、CAAX蛋白酶、細胞色素P450、E-NPP、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、脂肪酸去飽和酶、γ分泌酶、葡萄糖轉運子、血型醣蛋白、GPCR、HER2/ErbB2、HER3/ErbB3、HER4/ErbB4、HSD-11β、缺氧誘發之蛋白質、免疫球蛋白、胰島素受體、整合素(integrin)、離子通道、MAPEG、 MFS、MinK家族、MPP、肽酶(peptidase)AD、肽酶家族M48、肽酶MA、Jagged蛋白質、受體型激酶、SNARE複合物、硫酸酯酶、TNF受體、跨膜蛋白質14、轉運子、TROBP、VEGF受體、醛脫氫酶、氨及尿素轉運子、FMN-連接之氧化還原酶、含有富集白胺酸重覆序列(LRR)之跨膜蛋白質、白三烯(Leukotriene)C4合成酶、溶小體相聯膜醣蛋白、主要內在蛋白質(MIP)/FNT超級家族、微粒體前列腺素E合成酶、似N-(去氧)核糖基轉移酶膜蛋白、中性/鹼性神經醯胺酶、寡糖基轉移酶、五聚合配體閘控離子通道、似視紫質受體及幫浦、單螺旋ATP酶調節劑、鯊烯/蕃茄紅素合成酶、硬脂醯基-CoA去飽和酶1、錫蛋白(SNN)膜蛋白、T-細胞表面醣蛋白CD3 ζ鏈、三十四肽重覆序列(Tetratricopeptide repeat)(TPR)α-螺旋重覆序列蛋白質、含NAD(P)-結合性羅斯曼摺疊(Rossmann-fold)域之跨膜蛋白質。

此外，附著在脂質雙層或其他整體蛋白質及肽之單型/周邊蛋白質亦可作為跨膜蛋白質使用。該單型/周邊蛋白質之實例可包括：α/β-水解酶、膜聯蛋白(Annexins)、似Bet V1蛋白質、含C1域(domain)之蛋白質、含C2域之蛋白質、CoA-依賴性醯基轉移酶、含CRAL-TRIO域之蛋白質、似DNase I蛋白質、纖維蛋白原、FYVE/PHD鋅指蛋白質、似半乳糖-結合域蛋白質、醣脂轉移蛋白質、似免疫球蛋白超級家族(E組)蛋白質、脂質運載蛋白(Lipocalin)、脂肪加氧酶、PGBD超級家族、似PH域蛋白質、磷脂醯肌醇3-/4-激酶、似PLC磷酸二酯酶、磷酸酪胺酸蛋白質磷酸酶II、含P-環核苷三磷酸水解酶、蛋白質激酶超級家族、含PX域之蛋白質、蛋白皂角素(Saposin)、突觸核蛋白(Synuclein)及轉錄因子tubby。

本發明所採用之表述「跨膜域(transmembrane domain)」至少包括膜結合或跨膜蛋白質之跨膜區(群)。此外，跨膜域亦可包括近膜域(juxtamembrane domain，JMD)及/或膜結合或跨膜蛋白質之胞質尾(cytoplasmic tail)。

或者是，跨膜域在某些實例中為合成性。有些態樣中，合成性跨膜域主要包含疏水性殘基，如：白胺酸及纈胺酸。有些態樣中，可在合成性跨膜域之各端發現苯丙胺酸、色胺酸與纈胺酸之三聯體。

較佳之跨膜域可為彼等衍生自流感病毒血球凝集素(HA)、CD80、似Toll受體4(TLR4)或COVID-19棘蛋白。具體例可包括：由流感病毒血球凝集素之撓性近膜區或撓性連接子、跨膜域與胞質尾組成之蛋白質「HA(撓性-TM-Cyt)」；由人類CD80之跨膜域與胞質尾組成之蛋白質；由跨膜域(TM)與Toll/介白素-1受體域(TIR)組成之蛋白質；及由COVID-19棘(S)之近膜域(JMD)與TM組成之蛋白質。

本文所採用之「訊號序列」(有時候稱為訊號肽、靶向訊號、定位訊號、定位序列、導引肽、前導序列或前導肽)係依賴內文而為多核苷酸或多肽。訊號序列之長度為約9至200個核苷酸或3至70個胺基酸，其可視需要被納入至編碼區或蛋白質之5'或N-末端。有些訊號序列會在轉運至所需位點後，被例如訊號肽酶從蛋白質裂解。

有些實施態樣中，可以使用IL-2，尤其是人類IL-2之訊號序列。另一實施態樣中，可以使用COVID-19棘蛋白之訊號序列。

冠狀病毒結構性蛋白質、跨膜域及/或訊號序列能夠直接或間接融合。一實施態樣中，在該等間穿插一或兩個連接子。

冠狀病毒結構性蛋白質、跨膜域及/或訊號序列亦可被截短，並改用短的連接子置換。有些實施例中，冠狀病毒結構性蛋白質、跨膜域及/或訊號序列包括一或更多個肽連接子。

短連接子之實例係由2至25個胺基酸(例如：2、3、4、5或6個胺基酸)組成。通常，短連接子之長度為2至15個胺基酸，如：SG、GS、SGG、GGS SGSG及TRGGS。某些情況下，連接子可僅由一個胺基酸組成，如：甘胺酸(G)、絲胺酸(S)及半胱胺酸(C)。

當冠狀病毒結構性蛋白質透過化學交聯連接子，以化學接合跨膜域及/或訊號序列時，交聯連接子實例包括但不限於：SMPH、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、及SIA。亦可採用可從市面上取得之化學交聯連接子。

亦可使用IgG-衍生之物質作為連接子。IgG-衍生之物質實例包括IgG1至IgG4，其包括(i)全長(鉸鍊-CH₂CH₃)、(ii)半長(鉸鍊-CH₃)及(iii)短(僅12aa鉸鍊)。較佳例為IgG4-CH₃。

本文所採用之「α病毒」意指屬於披膜病毒科(Togaviridae)病毒之含RNA病毒。披膜病毒科病毒實例包括但不限於：東部馬腦炎病毒(Eastern Equine Encephalitis Virus，EEEV)、委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan Equine Encephalitis Virus，VEEV)、沼澤地病毒(Everglades Virus)、米坎波病毒(Mucambo Virus)、皮克孫納病毒(Pixuna Virus)、西部馬腦炎病毒(Western Equine Encephalitis Virus，WEEV)、辛德比病毒(Sindbis Virus)、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Virus)、米德堡病毒(Middleburg Virus)、屈公病毒(Chikungunya Virus，CHIKV)、歐尼恩病毒(O’nyong-nyong Virus)、紅河病毒(Ross River Virus)、巴馬森林病毒 (Barmah Forest Virus)、蓋塔病毒(Getah Virus)、鷺山病毒(Sagiyama Virus)、貝巴魯病毒(Bebaru Virus)、馬亞羅病毒(Mayaro Virus)、烏納病毒(Una Virus)、奧拉病毒(Aura Virus)、瓦塔羅阿病毒(Whataroa Virus)、巴班肯病毒(Babanki Virus)、孜拉加奇病毒(Kyzylagach Virus)、高原J病毒(Highlands J Virus))、摩根堡病毒(Fort Morgan Virus)、恩杜姆病毒(Ndumu Virus)、博吉河病毒(Buggy Creek Virus)及奧克博病毒(Ockelbo Virus)。

「α病毒結構性蛋白質」意指與自然存在之病毒蛋白殼或套膜蛋白質具有至少約80%胺基酸序列一致性之多肽或其片段。一實施態樣中，α病毒結構性蛋白質與下列病毒具有至少約85%、90%、95%或更高的胺基酸序列一致性：東部馬腦炎病毒(Eastern Equine Encephalitis Virus，EEEV)、委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan Equine Encephalitis Virus，VEEV)、沼澤地病毒(Everglades Virus)、米坎波病毒(Mucambo Virus)、皮克孫納病毒(Pixuna Virus)、西部馬腦炎病毒(Western Equine Encephalitis Virus，WEEV)、辛德比病毒(Sindbis Virus)、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Virus)、米德堡病毒(Middleburg Virus)、屈公病毒(Chikungunya Virus，CHIKV)、歐尼恩病毒(O’nyong-nyong Virus)、紅河病毒(Ross River Virus)、巴馬森林病毒(Barmah Forest Virus)、蓋塔病毒(Getah Virus)、鷺山病毒(Sagiyama Virus)、貝巴魯病毒(Bebaru Virus)、馬亞羅病毒(Mayaro Virus)、烏納病毒(Una Virus)、奧拉病毒(Aura Virus)、瓦塔羅阿病毒(Whataroa Virus)、巴班肯病毒(Babanki Virus)、孜拉加奇病毒(Kyzylagach Virus)、高原J病毒(Highlands J Virus))、摩根堡病毒(Fort Morgan Virus))、恩杜姆病毒(Ndumu Virus)、或博吉河病毒(Buggy Creek Virus)。α病毒結構性蛋白質之野生型胺基酸序列可取自GenBank。

一具體實施態樣中，α病毒為CHIKV，例如：CHIKV株37997或LR2006 OPY-1。其他實施態樣中，α病毒為VEEV，例如：VEEV株TC-83。

「α病毒複製子」意指可於活體內(in vivo)，在標靶細胞中主導其自行擴增之RNA分子。該複製子編碼催化RNA擴增之聚合酶(群)(nsp1、nsp2、nsp3、nsp4)，且包含複製所需之cis RNA序列，該等cis RNA序列可被所編碼之聚合酶(群)辨識及利用。α病毒複製子通常依序包含下列元素：5' UTR、編碼α病毒非結構性蛋白質(nsp1、nsp2、nsp3、nsp4)之序列、3' UTR、與多腺核苷酸(poly A)訊號。α病毒複製子亦包含一或多個主導目的基因表現之病毒次基因體啟動子。彼等序列可能具有先前技術中教示之一或多個突變。

本發明提供之α病毒複製子可具有圖1所示之構築體。

本揭示內容中，「包含(comprises)」、「涵括(comprising)」、「含有(containing)」、及「具有(having)」及類似名詞可具有美國專利法(U.S.Patent law)所賦與之意義，且可意指「包括(includs)」、「包括(including)」、及類似名詞；「基本上由....組成(consisting essentially of)或基本上組成為(consists essentially」同樣具有美國專利法所賦與之意義，且該名詞係開放性，只要超過其等所列舉者之存在不會改變所列舉者之基礎或新穎特徵則可容許存在超過其等所列舉者，但不包括先前技術之實施例。

「片段」意指份多肽或核酸分子的一部。這一部分較佳包含參考核酸分子或多肽全長之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%。片段可包含10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000個核苷酸或胺基酸。

「參考」意指標準或對照條件。

「參考序列」係作為序列比對基礎之指定序列使用。參考序列可為指定序列之子集或全部；例如：全長cDNA或基因序列之節段、或完整cDNA或基因序列。針對多肽，參考多肽序列之長度通常為至少約16個胺基酸，較佳至少約20個胺基酸，更佳至少約25個胺基酸，及甚至更佳約35個胺基酸、約50個胺基酸、或約100個胺基酸。針對核酸，參考核酸序列之長度通常為至少約50個核苷酸，較佳至少約60個核苷酸，更佳至少約75個核苷酸，及甚至更佳約100個核苷酸或約300個核苷酸或其近似或其之間任何整數。

序列一致性通常係採用序列分析軟體量測(例如：序列分析套裝軟體(Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710 University Avenue,Madison,Wis.53705)、BLAST、BESTFIT、GAP、或PILEUP/PRETTYBOX程式)。此等軟體針對各種不同取代、缺失、與/或其他修飾設定同源程度，來匹配相同或類似序列。保守性取代(Conservative substitutions)通常包括在下列群組內之取代：甘胺酸、丙胺酸；纈胺酸、異白胺酸、白胺酸；天冬胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸；絲胺酸、蘇胺酸；離胺酸、精胺酸；及苯丙胺酸、酪胺酸。決定一致性程度之策略實例可採用BLAST程式，機率分數在e<"3>與e<"100>之間則表示為極相關之序列。

「有效量」意指使疾病之症狀達到比未處理患者相對緩解時所需之製劑用量。用於實施本發明來預防或治療疾病之活性化合物(群)有效量會隨個體之投藥方式、年齡、體重、與一般健康而定。最後將由參與之醫師或獸醫決定適當量及劑量療程。此等量即稱為「有效」量。

可由全身投藥法，例如：肌內投藥、皮下投藥、或靜脈內投藥1至4次而得到令人滿意的結果，用量為每次10³-10¹⁰感染單位(Infection uint，IU)或0.01-500μg，較佳為每次10⁵-10¹⁰IU或0.1-100μg，例如：每一次10⁷-10⁹IU或1-50μg。複製子較佳可調配成適合依慣用方式投予之疫苗。

「個體」意指哺乳動物，包括但不限於人類或非人類哺乳動物，如：牛、馬、犬、羊或貓類。

本文所採用之術語「治療(treat、treating)」、「治療(treatment)」及類似名詞係指減輕或緩解與其相關之疾患及/或症狀。咸了解，雖然沒有排除，但治療疾患或病症並不要求完全消除與其相關之疾患、病症或症狀。

本文所採用之術語「預防(prevent、preventing、prevention)」、預防性治療(prophylactic treatment)及類似名詞係指使尚未發展出疾患或病症，但處於發展風險或容易發展之個體降低發展出該疾患或病症之機率。

除非另有其他說明或由內文顯而易見，否則咸了解本文所採用之術語「或」為包涵性。

除非另有其他說明或由內文顯而易見，否則咸了解本文所採用之術語「一種」、「一個」、與「該」意指單數或複數。

本技術領域咸了解，本說明書及申請專利範圍所說明之多核苷酸序列將在代表性DNA序列中述及「T」，但若該序列代表RNA時，則「T」將被「U」取代。

本文所提供之任何疫苗組成物或方法可與本文所提供1種以上的任何其他疫苗組成物及方法組合。

術語「載體」係指核酸序列可用來在生物體、細胞、或細胞組份之間繁殖及/或轉移之手段。載體包括可自主式複製或可整合進入宿主細胞之染色體中之質體、病毒、細菌噬菌體、原病毒、噬菌粒(phagemid)、轉位子(transposon)、人造染色體等。載體亦可為不可自主複製之裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、由同一股內之DNA與RNA二者構成之多核苷酸、與聚離胺酸接合之DNA或RNA、與肽接合之DNA或RNA、與脂質體接合之DNA等。許多但並非所有常見之實施態樣中，本發明載體為質體或桿粒(bacmid)。

通常，計畫表現之核酸分子係「以可操縱方式連接」啟動子及/或加強子，且受到啟動子及/或加強子之轉錄調節控制。

轉染之方法及表現媒體之選擇將隨所選擇之宿主而定。轉染方法說明於例如：Ausubel等人(如上述文獻)；表現媒體可選自彼等提供於例如：Cloning Vectors：A Laboratory Manual(P.H.Pouwels等人，1985,Supp.1987)。本節所摘錄參考文獻之內容已以引用方式併入本文中。

有多種不同表現系統可製造本發明之構築體。適用於製造該構築體之表現載體包括但不限於：染色體-、游離型-及病毒-衍生型載體，例如：衍生自細菌質體、細菌噬菌體、轉位子、酵母游離基因、嵌入元素、酵母染色體元素、病毒(如：α病毒(例如：屈公病毒(Chikungunya Virus)(CHIKV)及委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan Equine Encephalitis Virus)(VEEV))、桿狀病毒、乳突多瘤空泡病毒(papova virus)(如：SV40)、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、假性狂犬病病毒及反轉錄病毒)之載體、及衍生自該等組合之載體。

本文所採用構築體及/或載體包含編碼非結構性蛋白質nsp1、nsp2、nsp3與nsp4之α病毒多核苷酸及編碼多肽之目的基因，該多肽包括與如上文所述之訊號序列及/或跨膜域融合之冠狀病毒結構性蛋白質。構築體或載體之具體例示於圖1。

載體可為例如：噬菌體、質體、病毒或反轉錄病毒載體。包含核苷酸之構築體及/或載體應以可操縱方式連接適當啟動子，其非限制性實例為如：CMV啟動子、噬菌體λPL啟動子、大腸桿菌(E.coli)lac、phoA及tac啟動子、SV40早發型與晚發型啟動子、及反轉錄病毒LTR之啟動子。其他合適之啟動子係所屬技術領域具有通常知識者已知，且隨宿主細胞及/或所需表現率而定。表現構築體將進一步包含轉錄起始點、終止位點，及在轉錄區中包含供轉譯之核糖體結合位點。由構築體表現之轉錄本之編碼部份較佳包括位在起點的轉譯起始密碼子，及在適當位於所要轉譯之多肽的末端包括中止密碼子。

載體較佳將包括至少一個可選拔標記(marker)。此等標記包括針對真核細胞培養物之二氫葉酸還原酶、G418或新黴素(neomycin)抗性，及針對培養大腸桿菌(E.coli)及其他細菌之四環素(tetracycline)、康黴素(kanamycin)或胺苄青黴素(ampicillin)抗性基因。較佳載體為病毒載體，如：桿狀病毒、痘病毒(例如：牛痘病毒、鳥痘病毒、金絲雀痘病毒、禽痘病毒、浣熊痘病毒、豬痘病毒，等等)、腺病毒(例如：犬腺病毒)、疱疹病毒、及反轉錄病毒。本發明可使用之其他載體包括用於細菌之載體，其包含pQE70、pQE60及pQE-9、pBluescript載體、Phagescript載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。其中較佳之真核細胞載體為pFastBacl pWINEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl與pSG、pSVK3、pBPV、pMSG、及pSVL。其他合適之載體係所屬技術領域具有通常知識者咸了解。

重組構築體可被製備並用於轉染至真核細胞及/或原核細胞中，可表現包括本文說明之彼等蛋白質的病毒蛋白質。因此一實施態樣中，本發明提供宿主細胞，係在可以形成α病毒複製子顆粒條件下包含：含有編碼α病毒結構性蛋白質(包括蛋白殼、E3、E2、6K、及E1或其一部份)之核酸之載體(或載體群)；含有編碼α病毒nsp1、nsp2、nsp3及nsp4之核酸之載體；及至少一種所需冠狀病毒基因。

一實施態樣中，該載體為重組桿狀病毒、另一實施態樣中，該重組桿狀病毒係轉染至昆蟲細胞中。一較佳實施態樣中，該細胞為昆蟲細胞。另一實施態樣中，該昆蟲細胞為Sf9細胞。

一種製造多肽之特定細菌表現系統為大腸桿菌(E.coli)pET表現系統(Novagen,Inc.,Madison,Wis)。根據此表現系統，編碼多肽之DNA以設計成容許表達之方向嵌入至pET載體中。由於編碼此等多肽之基因係在T7調節訊號之控制下，因此藉由在宿主細胞中誘發T7 RNA聚合酶之表現來達成多肽表現。此點通常利用可因應IPTG誘導作用表現T7 RNA聚合酶之宿主菌株來達成。一旦製成，即隨後根據本領域已知之標準方法，例如：本文說明之彼等方法，單離重組多肽。

根據所選用之載體及宿主細胞，構築體在可以表現重組蛋白質並產生α病毒複製子之條件下，培養已轉染載體之宿主細胞而製造，並形成包含被α病毒結構性蛋白質粒子封裝之α病毒複製子之構築體。一實施態樣中，本發明包括製造構築體之方法，其涉及由包含編碼α病毒非結構性蛋白質nsp1、nsp2、nsp3與nsp4之多核苷酸之載體、及編碼包含與訊號序列及/或跨膜域融合之冠狀病毒結構性蛋白質之多肽的至少一種目的基因、及至少一種分別編碼至少一種α 病毒結構性蛋白質之載體共同轉染至合適宿主細胞中，並在可以形成構築體之條件下表現該α病毒結構性蛋白質。另一實施態樣中，真核細胞係選自下列各者所組成之群中：酵母、昆蟲、兩棲動物、禽類或哺乳動物細胞。適當生長條件之選擇係本領域範圍內或所屬技術領域具有通常知識者之技術範圍內。

使細胞生長來產生本發明α病毒複製子顆粒之方法包括但不限於：批次、批次進料、連續及灌流細胞培養技術。一實施態樣中，由經過編碼α病毒複製子之載體及包含編碼蛋白殼之多肽之載體、及包含編碼套膜蛋白質之多核苷酸之載體共同轉染之細胞，如：彼等衍生自CHIKV或VEEV者，於生物反應器或發酵槽中生長，細胞在其中繁殖及表現用於純化及單離之蛋白質(例如：重組蛋白質)。通常，在無菌、控制之溫度及大氣條件下培養細胞。生物反應器為用於培養細胞的槽，其中可監測環境條件，如：溫度、大氣、攪拌及/或pH。一實施態樣中，生物反應器為不銹鋼槽。另一實施態樣中，該生物反應器為預先除菌的塑膠袋(例如：Cellbag.RTM.,Wave Biotech,Bridgewater,N.J.，所摘錄文件之內容已以引用方式併入本文中)。其他實施態樣中，該預先除菌之塑膠袋為約10L至1000L的袋子。

另一實施態樣中，如α病毒複製子之RNA分子係可採用本領域習知之製程由模板DNA序列產生。活體外轉錄(in vitro transcription，IVT)法允許RNA分子的模板主導合成(template-directed synthesis)。IVT法可以合成大量RNA轉錄本。一般而言，IVT利用包含所需序列上游之啟動子序列之DNA模板。啟動子序列最常來源於細菌噬菌體，如：T7、T3或SP6啟動子序列，但亦容許許多其他啟動子序列，包括彼等重新設計者。DNA模板之轉錄通常最好採用對應於特定細菌噬菌體啟動子序列之RNA聚合酶達成。RNA聚合酶實施例包括但不限於：T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、或SP6 RNA聚合酶等。IVT通常從dsDNA開始，但可在單股上進行。用於活體外轉錄之套組為諸如：T7轉錄套組(RiboMax^TM Express Large Scale RNA production System,Promega(WI USA))。

本文所採用之術語「醫藥上可接受之載劑(carrier)」意指適合投予人類或其他脊椎動物之1種以上的可相容之固體或液體填料、稀釋劑或囊封物質(encapsulating substance)，包括所屬技術領域具有通常知識者已知之任何及所有水性溶劑(例如：水、醇性/水性溶液、生理鹽水溶液、非經腸式媒劑，如：氯化鈉及林格氏右旋糖(Ringer's dextrose))、非水性溶劑(例如：丙二醇、聚乙二醇、植物油、及注射用有機酯類，如：油酸乙酯)、勻散介質、包衣、界面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如：抗細菌或抗真菌劑、抗氧化劑、螯合劑、及惰性氣體)、等滲劑、延遲吸收劑、鹽類、藥物、藥物安定劑、凝膠、結合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、染劑、流體及營養素補充劑、類似材料及其組合。疫苗組成物中各種不同組份之pH及確實濃度係依據習知參數調整。

囊封物質係指在其中封裝多核苷酸或載體之傳遞媒劑(delivery vehicle)，如：複製子顆粒(例如：美國專利公告案案號2019-0185822中說明之α病毒複製子顆粒，該文件之內容已以引用方式併入本文中)及脂質傳遞系統(例如：脂質體)。

有些實施態樣中，本發明疫苗組成物或調配物包含脂質傳遞系統，例如：脂質體、脂質複合粒(lipoplex)、脂質奈米粒子、或其任何組合。多核苷酸，例如本文所說明α病毒複製子係可使用1種以上的脂質體、脂質複合粒、或脂質奈米粒子調配。可使用脂質體、脂質複合粒、或脂質奈米粒子改善多核苷酸主導蛋白質製造之效率，因為此等調配物可以藉由該多核苷酸提高細胞轉染；及/或提高所編碼蛋白質之轉譯。亦可使用脂質體、脂質複合粒、或脂質奈米粒子來提高多核苷酸之穩定性。

脂質體為人工製備之囊泡，其主要由脂質雙層構成，且可作為投予醫藥調配物之傳遞媒劑使用。脂質體可呈不同大小。多層囊泡(MLV)可達數百奈米直徑，且可包含一系列被狹窄水性區間分隔之同心雙層。小型單層囊泡(SUV)之直徑可小於50nm，大型單層囊泡(LUV)之直徑可在50與500nm之間。脂質體設計可包括(但不限於)：調理素(opsonin)或配體，以改善脂質體對不健康組織的附著性、或激活諸如但不限於內噬作用的事件。脂質體可以包含低或高pH值，以改善醫藥調配物之傳遞。

脂質體的形成可能依賴所囊封之醫藥調配物及脂質體成份、讓脂質囊泡勻散其中之介質性質、所囊封物質之有效濃度與其潛在毒性、囊泡之施用及/或傳遞期間所涉及之任何額外過程、囊泡針對計畫用途之最佳大小、聚合度分佈性及儲存壽命、及批次與批次之間之再現性、及安全與有效脂質體產物之放大規模生產等而定。

有些實施態樣中，多核苷酸，例如本文所說明α病毒複製子係可藉由脂質體囊封及/或可以包含在水性核心中，然後使用脂質體囊封。

有些實施態樣中，多核苷酸，例如：文所說明α病毒複製子係可調配在陽離子性含油水性乳液，其中乳液粒子包含油核心及陽離子性脂質，係可與將分子錨定在乳液粒子上之多核苷酸交互作用。有些實施態樣中，本文所說明之多核苷酸可以在包含連續疏水相且將親水相勻散其中之含水油性乳液中調配。

有些實施態樣中，多核苷酸，例如本文所說明α病毒複製子係可調配在脂質-聚陽離子複合物。聚陽離子之非限制性實例可包括陽離子性肽或多肽，例如但不限於：聚離胺酸、聚鳥胺酸及/或聚精胺酸、及陽離子性肽。

有些實施態樣中，多核苷酸，例如本文所說明α病毒複製子係可調配於脂質奈米粒子(LNP)中。

脂質奈米粒子調配物通常包含1種以上的脂質。有些實施態樣中，脂質為陽離子性或可離子化脂質。有些實施態樣中，脂質奈米粒子調配物進一步包含其他組份，其他組份包括磷酸脂質、結構性脂質、四級胺化合物、及可以減少粒子凝集之分子，例如：PEG或PEG-修飾之脂質。有些實施態樣中，脂質組成物中之陽離子性或可離子化脂質含量範圍為約0.01mol%至約99mol%。

LNP包含pH-敏感性可離子化陽離子性脂質，其吸引陰離子性核酸形成自行組裝之奈米粒子之核心，而確保高度囊封。在生理性pH下，LNP為中性，可消除出現在永久性陽離子性分子上之毒性機轉。

此等相同pH-敏感性脂質負責因應胞內體之酸性環境，並啟動胞內體瓦解，及釋放核酸至細胞中。

此基於複製子之疫苗技術為針對疫苗接種之獨特平台技術，因為RNA可以自行擴增製造疫苗抗原，並傳遞至細胞器官。此外，此基於複製子之疫苗技術克服與基於DNA之疫苗相關之常見挑戰，如：基因體整合之風險或投藥所需之高劑量及裝置，例如：電穿孔法，且依據自行擴增系統，預期在最小劑量下出現高於mRNA技術之免疫原性。

根據本發明，新穎之抗原性-活性蛋白質/多肽亦適用於製造診斷用抗體及對抗冠狀病毒之保護作用，同時使ADE可能性最小化。本文所揭示之蛋白質/多肽包括編碼與訊號序列及/或與跨膜域(TMD)序列融合之冠狀病毒RBD之最小序列，希望使免疫原性最大化及使ADE最小化。

本發明將參考下列實施例詳細說明，然而並無意限制本申請案之範圍。

[實施例1]

各個編碼如下所示之構築體1-8之基因係由Integrated DNA Technologies,Inc.合成(https：//www.idtdna.com/pages)。

1.由COVID-19-RBD序列與hIL-2訊號序列及HA(撓性域-跨膜(TM)-胞質尾(Cyt))融合之構築體

(SEQ ID NO：1)

hIL-2訊號序列：MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO：2)

COVID19-RBD： (SEQ ID NO：3)

HA(撓性-TM-Cyt)：GVKLESMGIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI(SEQ ID NO：4)

hIL-2：人類介白素-2

HA(撓性-TM-Cyt)：流感病毒之多肽

2.由COVID-19-RBD序列與hIL-2訊號序列及HA(撓性-TM-Cyt)融合之構築體

(SEQ ID NO：5)

圖示中之「C」：連接子(半胱胺酸)

連接子係在胺基酸序列中以下底線表示。

3.由COVID-19-RBD序列利用連接子與hIL-2訊號序列及HA(撓性-TM-Cyt)融合之構築體

(SEQ ID NO：6)

圖示中之「GS」：連接子(GGATCC)

連接子係在胺基酸序列中以下底線表示。

人類IgG4 CH3： (SEQ ID NO：7)

4.由COVID-19-RBD序列利用連接子與hIL-2訊號序列及HA(撓性-TM-Cyt)融合之構築體

(SEQ ID NO：8)

圖示中之「C」、「CGS」及「GS」：連接子

連接子係在胺基酸序列中以下底線表示。

5.由COVID-19-RBD序列與hIL-2訊號序列及人類TLR4(TM-Toll/介白素-1受體域(TIR))融合之構築體

(SEQ ID NO：9)

人類TLR4(TM-TIR)： (SEQ ID NO：10)

6.由COVID-19-RBD基因序列與hIL-2訊號序列及人類TLR4(TM-TIR)融合之構築體

(SEQ ID NO：11)

圖示中之「C」及「CGS」：連接子

連接子係在胺基酸序列中以下底線表示。

7.由COVID-19-RBD序列利用連接子與hIL-2訊號序列及人類TLR4(TM-TIR)融合之構築體

(SEQ ID NO：12)

圖示中之「GS」：連接子

連接子係在胺基酸序列中以下底線表示。

8.由COVID19 RBD序列利用連接子與hIL-2訊號序列及人類TLR4(TM-TIR)融合之構築體

(SEQ ID NO：13)

圖示中之「C」、「CGS」及「GS」：連接子

連接子係在胺基酸序列中以下底線表示。

有關hIL-2訊號序列、COVID19-RBD、人類IgG4 CH3及HA(撓性-TM-Cyt)之資訊亦可從國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)網站及UniProt網站取得。

hIL-2訊號序列

https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/P60568

UniProtKB/Swiss-Prot：P60568.1

COVID19-RBD

https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_045512

NCBI參考序列：NC_045512.2

HA(撓性-TM-Cyt)

https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/P03452

UniProtKB/Swiss-Prot：P03452.2

人類IgG4

https：//www.uniprot.org/uniprot/P01861

UniProtKB：P01861

[實施例2]

各個編碼以下所示之構築體A-O之基因係由Integrated DNA Technologies,Inc.合成(https：//www.idtdna.com/pages)。

構築體A：SS1-RBD1(330-521)(SEQ ID NO：37)

構築體B：SS2-RBD1(330-521)-TM2(SEQ ID NO：38)

構築體C：SS1-RBD1(330-521)-GS-連接子-GS-TM1(SEQ ID NO：39)

構築體D：SS1-RBD1(330-521)-GS-連接子-GS-TM2(SEQ ID NO：40)

構築體E：SS1-RBD2(330-530)-GS-連接子-GS-TM1(SEQ ID NO：41)

構築體F：SS1-RBD2(330-530)-GS-連接子-GS-TM2(SEQ ID NO：42)

構築體G：SS2-RBD1(330-521)-GS-連接子-GS-TM1(SEQ ID NO：43)

構築體H：SS2-RBD1(330-521)-GS-連接子-GS-TM2(SEQ ID NO：44)

構築體I：SS2-RBD2(330-530)-GS-連接子-GS-TM1(SEQ ID NO：45)

構築體J：SS2-RBD2(330-530)-GS-連接子-GS-TM2(SEQ ID NO：46)

構築體K：SS3-RBD3(327-531)-TM2(SEQ ID NO：47)

構築體L：SS1-RBD2(330-521)-TM2(SEQ ID NO：48)

構築體M：SS1-RBD3(327-531)-C-TM3(SEQ ID NO：49)

構築體N：SS3-RBD3(327-531)-TM3(SEQ ID NO：50)

構築體O：SS3-RBD1(330-521)-TM3(SEQ ID NO：51)

訊號序列

SS1：COVID-19訊號序列(1-15)：MFVFLVLLPLVSSQC(SEQ ID NO：14)

SS2：hIL-2訊號序列：MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO：15)

SS3：COVID-19訊號序列(1-13)：MFVFLVLLPLVSS(SEQ ID NO：16)

COVID-19-RBD

RBD1：COVID-19 RBD胺基酸位置330與521

RBD2：COVID-19 RBD胺基酸位置330與530

RBD3：COVID-19 RBD胺基酸位置327與531

RBD1： (SEQ ID NO：17)

RBD2： (SEQ ID NO：18)

RBD3： (SEQ ID NO：19)

連接子

人類IgG4-CH3

(SEQ ID NO：20)

跨膜-細胞質(TM-Cyt)

TM1：人類CD80*(TM-Cyt)： LLPSWAIT LISVNGIFVI CCLTYCFAPR CRERRRNERL RRESVRPV(SEQ ID NO：21)

* CD80：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_005182

TM2：HA(撓性-TM-Cyt)： GVKLESMGIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI(SEQ ID NO：22)

TM3：COVID19(JMD-TM)： GKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT(SEQ ID NO：23)

棘蛋白之近膜域(JMD)為鄰近跨膜域之富集芳香系胺基酸區，其高度保留在所有冠狀病毒中(Howard等人，JOURNAL OF VIROLOGY,Mar.2008,p.2883-2894 Vol.82,No.6，該參考文獻內容已以引用方式併入本文中)。

JMD：GKYEQYIKWPWYIWL(SEQ ID NO：24)

TM： GFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT(SEQ ID NO：25)

[實施例3]

複製子載體的製作。α病毒複製子之構築體圖示已示於圖1。

將實施例1與2製備之目的DNA之各基因選殖至在次基因體(SG)啟動子控制下之複製子載體中。編碼各片段之VEEV複製子質體係嵌插在AscI與SbfI限制位點來產生，得到全長VEEV TC-83複製子構築體。全長VEEV TC-83質體載體之一實施例示於於圖2。

SG啟動子、5'UTR、3’UTR及多腺核苷酸尾(poly A tail)之核苷酸序列如下。RNA序列係採用彼等DNA序列作為模板得到。

SG啟動子：cctgaatggactacgacatagtctagtccgccaag(SEQ ID NO：26)

5'UTR：ataggcggcgcatgagagaagcccagaccaattacctacccaaa(SEQ ID NO：27)

3’UTR： gcgatcgcatacagcagcaattggcaagctgcttacatagaactcgcggcgattggcatgccgccttaaaatttttattttatttttcttttcttttccgaatcggattttgtttttaatatttc(SEQ ID NO：28)

多腺核苷酸尾：aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa(SEQ ID NO：29)

VEEV TC-83複製子nsP1-4胺基酸序列如下。

(SEQ ID NO：30)

對應nsp3之胺基酸序列係以下底線表示。

本實施例中，對應於SEQ ID NO：30中1330-1886之nsp3之胺基酸序列被以下所示之序列置換。下底線之序列係與SEQ ID NO：30之差異。

(SEQ ID NO：31)

[實施例4]

α病毒複製子顆粒的製作

將10μg之實施例3製備之全長複製子質體、1μg之VEEV Env表現質體及1μg之VEEV蛋白殼NLS突變株(或1μg之VEEV蛋白殼表現質體)轉染至HEK293T細胞中。轉染48至96小時後收集上清液。複製子顆粒採用離子交換管柱純化。使用純化之粒子製劑之稀釋液感染HET293T或Vero細胞，以測定感染效價。純化之複製子顆粒用於製造供診斷及免疫接種之抗原。

[實施例5]

RBD於HEK293T細胞中之表現

使用Fectopro轉染試劑(Polyplus)及2ug之各複製子質體轉染293T細胞(6.25x10^5個細胞/孔)。西方墨點法係直接由上清液在未純化顆粒(左圖)下進行，或由溶胞液部份(右圖)使用與作為一級抗體之Covid-19-RBD及作為次級抗體之連接辣根過氧化酶之羊抗兔子免疫球蛋白反應之抗血清，在轉染72小時後進行。亦使用與作為一級抗體之Covid-19-RBD及作為次級抗體之連接辣根過氧化酶之羊抗兔子免疫球蛋白反應之抗血清，在轉染72小時後進行西方墨點法，以證實來自構築體K及構築體O之抗原於溶胞液部份中之表現。

結果示於圖3。

縮寫定義如下：

ssRBD：構築體A

hIL-2ssRBD-TM：構築體1(小鼠HA)

ssRBD-連接子-TM：構築體C(TM1：小鼠CD80，連接子：小鼠IgG4-CH3)

小鼠：CD80(TM-Cyt)

TLVLFGAGFGAVITVVVIVVIIKCFCKHRSCFRRNEASRETNNSLTFGPEEALAEQTVFL(SEQ ID NO：32)

小鼠IgG4-CH3

(SEQ ID NO：33)

證實所有試驗顆粒於細胞中之表現。如預期，沒有跨膜序列之ssRBD係分泌至細胞培養物之培養基中，而各個與跨膜序列連接之RBD構築體則保留在細胞中，未分泌至培養基中。

[實施例6]

免疫原性

採用實施例4製備之下列複製子顆粒疫苗。

VRep ssRBD：VEEV顆粒封裝構築體A

VRep sshIL2 RBD HA：VEEV顆粒封裝構築體1

VRep ssRBD mIgG4 CD80：VEEV複製子顆粒封裝構築體C(TM1：小鼠CD80，連接子：小鼠IgG4-CH3)

對照組：沒有目的基因之VEEV複製子

DNA疫苗：表現COVID-19之棘蛋白之DNA

小鼠接受指定之複製子顆粒(RBD或RBD-連接子-TM，10^7IU/劑)、對照複製子顆粒或DNA疫苗(20ug/劑)經肌肉內免疫接種3次(第1天、第7天、第14天)，並於第14天(第2次免疫接種後7天)及第35天(第3次免疫接種後21天)收集血清。此等血清進行對抗COVID-19-棘S1或RBD抗原之ELISA分析檢測。代號顯示各組5隻小鼠之平均值，誤差長條顯示平均值標準誤差(s.e.m.)。採用Prism軟體計算擬合曲線。此等結果示於圖4(4-1及4-2)及圖5(5-1及5-2)。

圖4與5顯示在免疫接種複製子疫苗後，使抗體對抗重組冠狀病毒RBD及棘S1達到顯著較高效價。相反地，使用DNA疫苗則誘發極低抗體效價。

[實施例7]

免疫原性

採用實施例4製備之下列複製子顆粒疫苗。

CD80：VEEV顆粒封裝構築體C

HA No.1：VEEV顆粒封裝構築體K

對照組：PBS

由小鼠經肌肉內接種指定之複製子疫苗(CD80或HA No.1，10^5IU/劑)或PBS，並於免疫接種7天後收集血清。由此等血清進行對抗COVID-19-棘S1抗原之ELISA分析。代號顯示各組5隻小鼠之平均值，誤差長條顯示平均值標準誤差(s.e.m.)。此等結果示於圖6。

圖6顯示在免疫接種複製子疫苗後，使抗體對抗重組冠狀病毒棘S1達到顯著較高效價。

[實施例8]

囊封在脂質奈米粒子(LNP)中之自行擴增RNA(saRNA)製法

採用實施例3所製備之包含編碼構築體C之DNA序列之載體。DNA經過線性化作為模板使用。依據T7轉錄套組提供之製程(RiboMax^TM Express Large Scale RNA production system,Promega,(WI USA))，由T7進行活體外轉錄。線性DNA模板與T7酵素及rNTP混合，合成出RNA。純化之RNA產物使用牛痘封端酵素封端，產生自行擴增RNA。

所得之saRNA囊封在脂質奈米粒子中，產生saRNA(RBD-CD80TM)顆粒。採用沒有RNA之脂質奈米粒子作為對照組。

[實施例9]

免疫接種

採用實施例8所製備的使用LNP調配之saRNA。

免疫接種之量：

0.3ug saRNA(RBD-CD80TM)

1ug saRNA(RBD-CD80TM)

10ug saRNA(RBD-CD80TM)

沒有RNA(對照組)

採用使用LNP(Genvoy)調配之指定量saRNA或沒有RNA(對照組)。取4-6週齡小鼠(每組n=5)，於第0天及第28天，經肌肉內注射接種使用LNP調配之saRNA。

於第14、28及46天為小鼠抽血。採用ELISA測定經過免疫接種之小鼠之血清中對抗S1蛋白質之抗體效價。在板上塗佈S1蛋白質(Sinobio 100ng/ml)。結果示於圖7。

[實施例10]

COVID-19 RBD可衍生自COVID-19突變株。亦採用包含COVID-19訊號序列、衍生自COVID-19突變株之COVID-19 RBD、及人類HA(撓性-TM-Cyt)之構築體之下列胺基酸序列來產生示於圖1之α病毒複製子。此實施例中，目的基因被編碼下列胺基酸序列之多核苷酸置換。囊封在脂質奈米粒子(LNP)中之自行擴增RNA(saRNA)係依實施例8之相同方式產生。

衍生自COVID-19 E484K_N501Y_K417T突變株(巴西種突變株)之構築體

(SEQ ID NO：34)

衍生自COVID-19 E484K_N501Y_K417N突變株(南非突變株)之構築體

(SEQ ID NO：35)

衍生自COVID-19 E484K突變株之構築體

(SEQ ID NO 36)

<110> 美商VLP醫療股份有限公司(VLP THERAPEUTICS INC.)

<120> 冠狀病毒疫苗

<130> 584197

<140> TW 110113785

<141> 2021-04-16

<150> US63/011561

<151> 2020-04-17

<150> US63/050442

<151> 2020-07-10

<150> US63/088723

<151> 2020-10-07

<160> 51

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 272

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含hIL-2訊號序列、COVID-19-RBD及HA的融合蛋白

<400> 1

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類IL-2訊號序列

<400> 2

<210> 3

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> COVID19-RBD

<400> 3

<210> 4

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 流感HA(撓性-TM-Cyt)

<400> 4

<210> 5

<211> 274

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含hIL-2訊號序列、COVID-19-RBD及HA(撓性-TM-Cyt)的融合蛋白

<400> 5

<210> 6

<211> 383

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含hIL-2訊號序列、COVID-19-RBD、人類IgG4CH3及HA(撓性-TM-Cyt) 的融合蛋白

<400> 6

<210> 7

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類IgG4 CH3(連接子)

<400> 7

<210> 8

<211> 385

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> 8

<210> 9

<211> 435

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含hIL-2訊號序列、COVID-19-RBD及人類TLR4(TM-TIR)的融合蛋白

<400> 9

<210> 10

<211> 209

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類TLR4(TM-Toll/介白素-1受體結構域)

<400> 10

<210> 11

<211> 437

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> 11

<210> 12

<211> 544

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含hIL-2訊號序列、COVID-19-RBD、人類IgG4CH3及人類TLR4(TM-TIR) 的融合蛋白

<400> 12

<210> 13

<211> 546

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含hIL-2訊號序列、COVID19-RBD、人類IgG4CH3及人類TLR4(TM-TIR) 的融合蛋白

<400> 13

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> COVID-19訊號序列(1-15)

<400> 14

<210> 15

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類IL-2訊號序列

<400> 15

<210> 16

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> COVID-19訊號序列(1-13)

<400> 16

<210> 17

<211> 192

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> COVID-19 RBD(AA 330-521)

<400> 17

<210> 18

<211> 201

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> COVID-19 RBD(AA 330-530)

<400> 18

<210> 19

<211> 205

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> COVID-19 RBD(AA 327-531)

<400> 19

<210> 20

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類IgG4-CH3(連接子)

<400> 20

<210> 21

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類CD80跨膜-細胞質

<400> 21

<210> 22

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 流感HA(撓性-TM-Cyt)

<400> 22

<210> 23

<211> 70

<212> PRT

<213> COVID-19近膜結構域及跨膜結構域

<400> 23

<210> 24

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> COVID-19棘蛋白的近膜結構域

<400> 24

<210> 25

<211> 55

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> COVID-19棘蛋白的跨膜結構域

<400> 25

<210> 26

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SG啟動子

<400> 26

<210> 27

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5’UTR

<400> 27

<210> 28

<211> 125

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3’UTR

<400> 28

<210> 29

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 多腺核苷酸尾

<400> 29

<210> 30

<211> 2493

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VEEV TC-83複製子nsP1-4胺基酸序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1880)..(1880)

<223> Xaa可以是任何天然存在的胺基酸

<400> 30

<210> 31

<211> 557

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VEEV TC-83 nsp3 E242K

<220>

<221> misc_feature

<222> (551)..(551)

<223> Xaa可以是任何天然存在的胺基酸

<400> 31

<210> 32

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 老鼠CD80(TM-Cyt)

<400> 32

<210> 33

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 老鼠IgG4-CH3

<400> 33

<210> 34

<211> 266

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 源自COVID-19 E484K_N501Y_K417T突變體(巴西菌株突變體)的構築體

<400> 34

<210> 35

<211> 266

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 源自COVID-19 E484K_N501Y_K417N突變體(南非突變體)的構築體

<400> 35

<210> 36

<211> 266

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 源自COVID-19 E484K突變體的構築體

<400> 36

<210> 37

<211> 207

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含COVID-19訊號序列(1-15)及COVID-19 RBD(330-521)的融合蛋白

<400> 37

<210> 38

<211> 260

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含hIL-2訊號序列、COVID-19 RBD(330-521)及HA(撓性-TM-Cyt)的融合蛋白

<400> 38

<210> 39

<211> 364

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含COVID-19訊號序列(1-15)、COVID-19 RBD(330-521)、人類IgG4CH3及人類CD80(TM-Cyt)的融合蛋白

<400> 39

<210> 40

<211> 366

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含COVID-19訊號序列(1-15)、COVID-19 RBD(330-521)、人類IgG4CH3及 HA(撓性-TM-Cyt)的融合蛋白

<400> 40

<210> 41

<211> 373

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含COVID-19訊號序列(1-15)、COVID-19 RBD(330-530)、人類IgG4CH3及人類CD80(TM-Cyt)的融合蛋白

<400> 41

<210> 42

<211> 375

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含COVID-19訊號序列(1-15)、COVID-19 RBD(330-530)、人類IgG4CH3及 HA(撓性-TM-Cyt)的融合蛋白

<400> 42

<210> 43

<211> 369

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含hIL-2訊號序列、COVID-19 RBD(330-521)、人類IgG4CH3及人類CD80 (TM-Cyt)的融合蛋白

<400> 43

<210> 44

<211> 371

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含hIL-2訊號序列、COVID-19 RBD(330-521)、人類IgG4CH3及HA(撓性-TM- Cyt)的融合蛋白

<400> 44

<210> 45

<211> 378

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含hIL-2訊號序列、COVID-19 RBD(330-530)、人類IgG4CH3及人類CD80 (TM-Cyt)的融合蛋白

<400> 45

<210> 46

<211> 380

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含hIL-2訊號序列、COVID-19 RBD(330-530)、人類IgG4CH3及HA(撓性-TM- Cyt)的融合蛋白

<400> 46

<210> 47

<211> 266

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含COVID-19訊號序列(1-13)、COVID-19 RBD(327-531)及HA(撓性-TM- Cyt)的融合蛋白

<400> 47

<210> 48

<211> 264

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含COVID-19訊號序列(1-15)、COVID-19 RBD(330-521)及HA(撓性-TM- Cyt)的融合蛋白

<400> 48

<210> 49

<211> 291

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含COVID-19訊號序列(1-15)、COVID-19 RBD(327-531)及COVID19(JMD- TM)的融合蛋白

<400> 49

<210> 50

<211> 288

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含COVID-19訊號序列(1-13)、COVID-19 RBD(327-531)及COVID19(JMD- TM)的融合蛋白

<400> 50

<210> 51

<211> 275

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含COVID-19訊號序列(1-13)、COVID-19 RBD(330-521)及COVID19(JMD- TM)的融合蛋白

<400> 51

Claims

一種單離之多核苷酸，係編碼委內瑞拉馬腦炎病毒非結構性蛋白質nsp1、nsp2、nsp3與nsp4及多肽，該多肽包含SARS-CoV-2之S1次單元之受體結合域，該受體結合域係與訊號序列融合以及與跨膜域或經修飾跨膜域融合，其中，前述訊號序列係衍生自人類IL-2或SARS-CoV-2棘蛋白，前述跨膜域係衍生自流感血球凝集素(Influenza Hemagglutinin，HA)、CD80或TLR4，前述經修飾跨膜域包含SARS-CoV-2棘(S)之近膜域(JMD)及跨膜域。
如請求項1所述之多核苷酸，其中，前述訊號序列係衍生自人類IL-2。
如請求項1所述之多核苷酸，其中，前述訊號序列係衍生自SARS-CoV-2棘蛋白。
如請求項1至3中任一項所述之多核苷酸，其中，前述跨膜域及/或訊號序列係利用連接子與前述SARS-CoV-2之S1次單元之受體結合域融合。
如請求項4所述之多核苷酸，其中，前述連接子為IgG4CH3及/或短連接子。
如請求項1所述之多核苷酸，其中，前述多肽係編碼選自SEQ ID NO：1、5、6、8、9、11、12、13、34、35、36-51之胺基酸序列。
如請求項6所述之多核苷酸，其中，前述多肽係編碼選自SEQ ID NO：37-51之胺基酸序列。
如請求項1至3、6及7中任一項所述之多核苷酸，其中，前述多核苷酸為RNA。
如請求項1至3、6及7中任一項所述之多核苷酸，其中，前述多核苷酸為DNA。
一種載體，係包含請求項1至9中任一項所述之多核苷酸。
如請求項10所述之載體，係包含啟動子、5' UTR、編碼委內瑞拉馬腦炎病毒非結構性蛋白質nsp1、nsp2、nsp3及nsp4之多核苷酸、SG啟動子、編碼多肽之目的基因、3'UTR、及多腺核苷酸尾，其中，該多肽包含SARS-CoV-2之S1次單元之受體結合域，該受體結合域係與訊號序列融合，以及與跨膜域或經修飾跨膜域融合。
一種疫苗組成物，係包含請求項1至9中任一項所述之多核苷酸或請求項10至11中任一項所述之載體、及醫藥上可接受之載劑。
如請求項12所述之疫苗組成物，其中，前述醫藥上可接受之載劑為傳遞媒劑。
如請求項13所述之疫苗組成物，其中，前述傳遞媒劑為由1種以上的α病毒結構性蛋白質或脂質傳遞系統組成之粒子。
一種請求項1至9中任一項所述之多核苷酸或請求項10至11中任一項所述之載體之用途，係用於藥物的製造。
如請求項15所述之用途，其中，前述藥物係用於在個體中誘發免疫調節(immunomodulation)。
如請求項15所述之用途，其中，前述藥物係用以治療或預防個體因感染冠狀病毒引起之症狀。
一種多肽，係包含SARS-CoV-2之S1次單元之受體結合域，該受體結合域係與訊號序列融合，以及與跨膜域或經修飾跨膜域融合，其中，前述訊號序列係衍生自人類IL-2或SARS-CoV-2棘蛋白，前述跨膜域係衍生自流感血球凝集素(Influenza Hemagglutinin，HA)、CD80或TLR4，前述經修飾跨膜域包含SARS-CoV-2棘(S)之近膜域(JMD)及跨膜域。