MXPA02001877A

MXPA02001877A - Pd-1, un receptor para b7-4, y usos del mismo.

Info

Publication number: MXPA02001877A
Application number: MXPA02001877A
Authority: MX
Inventors: Clive Wood
Original assignee: Dana Farber Cancer Inst Inc
Priority date: 1999-08-23
Filing date: 2000-08-23
Publication date: 2002-08-20
Also published as: JP2020028302A; JP2016166173A; US20020160000A1; HU228477B1; CA2925551A1; FR19C1019I1; FR17C1056I1; CY2017036I1; CY2017037I1; AU2005234733B2; CY2017037I2; LUC00052I2; JP2018100291A; FR17C1055I1; HUP0202449A2; HUS1700045I1; JP4896327B2; US7638492B2; WO2001014557A1; NO20020859L

Abstract

La invencion identifica PD-1 como un receptor para B7-4. B7-4 puede inhibir la activacion de celulas inmunologicas al unirse sobre un receptor inhibidor en una celula inmunologica. Por consiguiente, la invencion ofrece agentes para modular PD-1, B7-4, y la interaccion entre B7-4 y PD-1 con el objeto de modular una senal co-estimuladora o inhibidora en una celula inmunologica lo que resulta en la modulacion de la respuesta inmunologica.

Description

PD-l, UN RECEPTOR PARA B7-4, Y USOS DEL MISMO Apoyo financiero del gobierno El trabajo descrito aquí fue apoyado por las partidas AI 39671, AI 44690, CA 84500 y AI 41584 otorgadas por los National Institutes of Health [Institutos Nacionales de la Salud] . Por consiguiente el gobierno de los Estados Unidos de América puede tener ciertos derechos sobre esta invención. Solicitudes relacionadas Esta solicitud reclama prioridad con base en U.S.S.N. 60/150,390 presentada el día 23 de Agosto de 1999. Esta solicitud reclama también prioridad con base en U.S.S.N. 60/164,897, presentada el día 10 de Noviembre de 1999. Ambas solicitudes se incorporan aquí en su totalidad por referencia. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Para que las células T respondan a proteínas foráneas, las células de presentación de antígenos (APCs) deben proporcionar dos señales a los linfocitos T en reposo (Jenkins, M. y Schwarts, R. (1987) J. Exp. Med. 165:302-319; Mueller, D . L . et al . ( 1990) J. Iwm?nol . 144 : 3701-3709) . La primera señal , que proporciona especificidad a la respuesta inmunológica, es transducida a través del receptor de célula T ( TCR) después del reconocimiento del péptido antigénico foráneo presentado en el contexto del complej o de histocompatibilidad mayor (MHC) . La segunda señal , que se conoce como co-estimulación, induce la proliferación de las células T y las vuelve funcionales (Lenschow et al. (1996) Annu. i?ev. I munol. 14:233) . La co-estimulación no es específica para antígeno, ni restringida a MHC y se cree que es proporcionada por una o varias moléculas de superficie de células distintas expresadas por APCs (Jenkins, M. K. et al. (1988) J. Immunol. 140:3324-3330; Linsley, P.S. et al. (1991) J. Exp. Med. 173:721-730; Gi mi, C.D. et al. 1991 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:6575-6579; Young J.W. et al. (1992) J. Clin. Invest. 90:229-237; Koulova, L. et al. (1991) J. Exp. Med. 173:759-762; Reiser, H. et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:271-275; van-Seventer, G. A. et al. (1990) J. Immunol. 144:4579-4586; LaSalle, J. M. et al. (1991) J. Immunol. 147:774-80; Dustin, M. I. et al. (1989) J. Exp. Med. 169:503; Armitage, R.J. et al. (1992) Nature 357:80-82; Liu Y. et al (1992) J. Exp. Med. 175:437-445) . Las proteínas de CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2), expresadas en APCs, son moléculas co-estimuladoras críticas (Freeman et al. (1991) J. Exp. Med. 174: 625; Freeman et al. (1989) J. Immunol. 143:2714; Azuma et al. (1993) Nature 366:76; Freeman et al. (1993) Science 262:909). B7-2 parece desempeñar una función predominante durante las respuestas inmunológicas primarias, mientras que B7-1, que es regulada de manera ascendente posteriormente en el transcurso de una respuesta inmunológica, puede ser importante en la prolongación de respuestas de células T primarias o bien para co-estimular respuestas de células T secundarias (Bluestone (1995) Immuni ty 2:555) . Un receptor al cual se unen B7-1 y B7-2, CD28, es expresado de manera constitutiva en las células T en reposo e incrementa su expresión después de activación. Después de señalización a través del receptor de células T, ligación de CD28 y transducción de una señal co-estimuladora induce las células T a proliferar y secretar IL-2 (Linsley, P.S. et al. (1991) J. Exp. Med. 173:721-730; Gimmi, C.D. et al (1991) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 88:6575-6579; June, C.H. et al. (1990) Imm?nol . Today. 11:211-6; Harding, F.A. et al. (1992) Nature 356:607-609). Un segundo receptor, llamado CTLA4 (CD152) es homólogo a CD28 pero no es expresado en células T en reposo y aparece después de la activación de las células T (Brunet, J.F. et al. (1987) Nature 328:267-270). CTLA4 parece ser crítico para la regulación negativa de respuestas de células T (Waterhouse et al. (1995) Science 270:985). Se ha encontrado que el bloqueo de CTLA4 remueve señales inhibidoras, mientras que la agregación de CTLA4 proporciona señales de inhibición que regulan de manera descendente las respuestas de células T (Allison y Krummel (1995) Science 270:932). Las moléculas B7 tienen una afinidad más alta para CTLA4 que para CD28 (Linsley, P.S. et al. (1991) J. Exp. Med. 174:561-569) y se ha encontrado que B7-1 y B7-2 se unen en regiones distintas de la molécula CTLA4 y tienen características cinéticas diferentes de unión con CTLA4 (Linsley et al. (1994) Immuni ty 1:793). Una nueva molécula relacionada con CD28 y CTLA4, ICOS, ha sido identificada y parece ser importante en la producción de IL-10 (Hutloff et al. (1999) Nature 397:263; WO 98/38216), así como su ligando que es un nuevo miembro de la familia de B7 (Aicher A. et al. (2000) J. iJTuiiunoJ. 164:4689-96; Mages H.W. et al. (2000) Eur. J. Iwmunol . 30:1040-7; Brodie D. et al. (2000) Curr. Biol . 10:333-6; Ling V. et al. (2000) J. Immunol . 164:1653-7; Yoshinaga S.K. et al. (1999) Nature 402:827-32). Si las células T son estimuladas solamente a través del receptor de células T, sin recibir una señal co-estimuladora adicional, se vuelven anérgicas, no responden o bien mueren, lo que resulta en una modulación descendente de la repuesta inmunológica. La importancia de la vía co-estimuladora B7 :CD28/CTLA4 ha sido demostrada in vitro y en varios sistemas de modelo in vivo. El bloqueo de esa vía co-estimuladora resulta en el desarrollo de una tolerancia específica a antígeno en sistemas de murinos y en sistemas de seres humanos (Harding, F.A. et al. (1992) Na ture 356:607-609; Lenschow, D.J. et al. (1992) Science 257:789-792; Turka, L.A. et al. (1992) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 89:11102-11105; Gim i, C.D. et al. (1993) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 90:6586-6590; Boussiotis, V. et al. (1993) J. Exp. Med. 178:1753-1763). A la inversa, la expresión de B7 por células tumorales de murino negativas para B7 induce una inmunidad específica mediada por células T acompañada por rechazo de tumor y protección duradera contra reto tumoral (Chen, L. et al. (1992) Cell 71:1093-1102; Townsend, S.E. y Allison, J.P. (1993) Science 259:368-370; Baskar, S. et al (1993) Proc . Nati . Acad. Sci . 90:5687-5690). Por consiguiente, la manipulación de las vías co- estimuladoras ofrece un gran potencial para estimular o suprimir respuestas inmunológicas en seres humanos. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa, por lo menos en parte, en el descubrimiento que PD-l es un receptor para moléculas de B7-4 expresadas en células de presentación de antígenos. PD-l transmite una señal negativa a células inmunológicas, similar a CTLA4. Moléculas de B7-4 son expresadas en superficie de células de presentación de antígenos y ofrecen una señal co- estimuladora a células inmunológicas y pueden transmitir señales de modulación descendente a células inmunológicas, según la molécula con la cual se unen. Así, la modulación de PD-l, B7-4, y/o la interacción entre B7-4 y PD-l resulta en una modulación de la respuesta inmunológica. Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención ofrece un método para modular una respuesta inmunológica, que comprende la puesta en contacto de una célula inmunológica con un agente que modula la señalización a través de PD-l con el objeto de modular de esta manera la respuesta inmunológica. En una modalidad, la respuesta inmunológica es regulada de manera descendente. En otra modalidad, la señalización a través de PD-l es estimulada empleando un agente seleccionado dentro del grupo que consiste de: un anticuerpo activador que reconoce PD-l, una forma de B7-4 que se une con un receptor inhibidor, y una pequeña molécula que se une a PD-l. En una modalidad, la célula inmunológica es seleccionada dentro del grupo que consiste de: una célula T, una célula B, y una célula mieloide. En una modalidad, se induce anergía en la célula inmunológica. En una modalidad, el método comprende además la puesta en contacto de la célula inmunológica con un agente adicional que regula de manera descendente una respuesta inmunológica. En una modalidad, la respuesta inmunológica es regulada de manera ascendente . En una modalidad la señalización a través de PD-l es inhibida empleando un agente seleccionado dentro del grupo que consiste de: un agente de bloqueo que reconoce PD-l, una forma no activadora de B7-4, un anticuerpo que reconoce B7-4 y una forma soluble de PD-l.

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En una modalidad, el paso de puesta en contacto ocurre in vivo . En otra modalidad, el paso de puesta en contacto ocurre in vitro. En otro aspecto, la invención se refiere a un método para modular la interacción de B7-4 con un receptor inhibidor en una célula inmunológica, dicho método comprende la puesta en contacto de una célula de presentación de antígeno que expresa B7-4 con un agente seleccionado dentro del grupo que consiste de: una forma de B7-4, una forma de PD-l o un agente que modula la interacción entre B7-4 y PD-l de tal manera que se module la interacción de B7-4 con un receptor inhibidor en la célula inmunológica. En una modalidad, el método comprende además la puesta en contacto de la célula inmunológica o de la célula de presentación de antígeno con un agente adicional que modula una respuesta inmunológica . En una modalidad, el paso de puesta en contacto se efectúa in vi tro . En otra modalidad, el paso de puesta en contacto se efectúa in vivo. En una modalidad la célula inmunológica se selecciona dentro del grupo que consiste de: una célula T, una célula B, y una célula mieloide. En otro aspecto, la invención se refiere a un método para inhibir la activación en una célula inmunológica a través de un mecanismo no apoptótico, que comprende el incremento de la actividad o expresión de PD-l en una célula inmunológica de tal manera que se inhibe la activación de la célula inmunológica. En otro aspecto, la invención se refiere a una vacuna que comprende un antígeno y un agente que inhibe la señalización a través de PD-l en una célula inmunológica. En otro aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende un antígeno y un agente que promueve la señalización a través de PD-l en una célula inmunológica. En otro aspecto, la invención se refiere a un método para tratar a un sujeto que tiene una condición que puede beneficiarse de la regulación ascendente de una respuesta inmunológica, dicho método comprende la administración de un agente que inhibe la señalización a través de PD-l en una célula inmunológica del sujeto de tal manera que pueda tratarse una condición que puede beneficiarse de la regulación ascendente de una respuesta inmunológica. En una modalidad, el agente comprende una forma soluble de PD-l o B7-4. En una modalidad, el método comprende además la administración de un segundo agente que regula de manera ascendente una repuesta inmunológica en el sujeto. En una modalidad, la condición se selecciona dentro de grupo que consiste de: un tumor, una enfermedad neurológica o una enfermedad inmunosupresora. En otro aspecto, la invención se refiere a un método para tratar un sujeto que tiene una condición que puede beneficiarse de la regulación descendente de una respuesta inmunológica, dicho método comprende la administración de un agente que estimula la señalización a través de PD-l en una célula inmunológica del sujeto de tal manera que se pueda tratar una condición que podría beneficiarse de la regulación descendente de una respuesta inmunológica. En una modalidad, dicho agente se selecciona dentro del grupo que consiste de: una anticuerpo que estimula la señalización a través de PD-l, un anticuerpo biespecífico, y B7-4 soluble. En una modalidad, el método comprende además la administración de un segundo agente que regula además de manera descendente una respuesta inmunológica en el sujeto.

En una modalidad, la condición se selecciona dentro del grupo que consiste de: un trasplante, una alergia, y un trastorno autoinmunológico . En otro aspecto, la invención se refiere a un ensayo basado en células para tamizar para compuestos que modulan la actividad de B7-4 o PD-l, dicho ensayo comprende la puesta en contacto de una célula que expresa una molécula blanco B7-4 o una molécula blanco PD-l con un compuesto de prueba y determinar la capacidad del compuesto de prueba para modular la actividad de la molécula blanco B7-4 o PD-l. tÍ ..*.¡ ,*.?t?tlt* , . .,«-• ....,,. .j,-,^^^a^.a.*^-'^.J^^fy %ii.'!M|g^g|j|^^|[| jfj^||i En otro aspecto, la invención se refiere a un ensayo sin células para tamizar para compuestos que modulan la unión de B7-4 o PD-l con una molécula blanco, que comprende la puesta en contacto de una proteína de B7-4 o PD-l o bien una porción biológicamente activa de la misma con un compuesto de prueba y determinar la capacidad del compuesto de prueba para unirse con la proteína de B7-4 o PD-l o bien una porción biológicamente activa de la misma. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 representa la secuencia de nucleótidos que codifican B7-4, B7-4S secretado humano (SEQ ID NO:l). La figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos que codifica B7-4, B7-4M humano (SEQ ID NO:3). La figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos de B7-4S humano (SEQ ID NO: 2) e ilustra la señal IgV, IgC, y dominios de cola hidrofílica. La figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos de B7-4M humano (SEQ ID NO: 4) e ilustra la señal, IgV, IgC, y dominios de transmembrana y citoplásmicos. La figura 5 muestra la secuencia de nucleótidos de B7-4 de murino (SEQ ID NO: 22) . La figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos de B7-4 de murino (SEQ ID NO:23). La figura 7 muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos de B7-4 de ser humano y de murino.

La figura 8 ilustra los resultados de análisis FACS de unión de CD28Ig, CTLA4-Ig, Ig de control o células COS transfectadas con B7-4M. La figura 9 ilustra los resultados de análisis FACS de unión IgG y proteínas de fusión ICOS de murino-HIS por células COS transfectadas con B7-4M. La figura 10 ilustra los resultados de análisis FACS de unión de anticuerpos IgM, BBI, y 133 con células COS transfectadas con B7-4M. La figura 11 ilustra que células COS transfectadas con B7-4M (292) pueden co-estimular la proliferación de células T. La figura 12 ilustra que células COS transfectadas con B7-4M (292) pueden co-estimular la proliferación de células T. La figura 13 ilustra la unión de PD-l con células COS transfectadas con B7-4M. La figura 14 ilustra la capacidad de PD-l agregada y no de Flt4 par competir por la unión de PD-l con células COS transfectadas con B7-4M. La figura 15 ilustra la capacidad de PD-l para unirse con células COS transfectadas con B7-4 de conformidad con lo determinado por citometría de flujo. La figura 16 ilustra la capacidad de PD-l para unirse con células CHO transfectadas con B7-4, de conformidad con lo determinado por análisis BIACORE. La figura 17 ilustra la capacidad de B7-4M para transmitir una señal negativa a células T. La figura 18 ilustra la inhibición de la proliferación de células T y de proliferación de citocinas en células T humanas estimuladas en presencia de B7-4. La figura 19 muestra que la activación de receptores de células T/B7-4 en presencia de co-estimulación de CD28 resulta en la inhibición de la proliferación de células T.

La figura 20 ilustra la unión de PD-l con células CHO que expresan B7-4. La figura 21 ilustra la acción de PD-l en la inhibición de señales de CD28. La figura 22 ilustra la inhibición de producción de citocina por la vía PD-l:B7-4, de conformidad con lo medido por ELISA de citocina. La figura 23 ilustra la inhibición de producción de citocma por la vía PD-l:B7-4, de conformidad con lo medido por los niveles de ARNm de citocina. La figura 24 ilustra que el mecanismo de acción de la vía PD- l:B7-4 es de suspensión de ciclo celular. La figura 25 ilustra la capacidad de anticuerpos contra B7-4 para inhibir la interacción entre B7-4 y PD-l. La figura 26 ilustra la capacidad de anticuerpos contra PD-l para inhibir la interacción entre B7-4 y PD-l. La figura 27 ilustra la capacidad de B7-4Fc soluble para exacerbar una enfermedad en un modelo de murino de Í .?a,AJkA>**i?*-*.>t'-f?** t}^í Ai -• s . ...^rijf-tt^-- t«h-w-i encefalomielitis autoinmune experimental. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INTENCIÓN Además de los antígenos de activación de linfocitos B previamente caracterizados, por ejemplo, B^-l y B7-2, existen 5 otros antígenos en la superficie de células de presentación de antígenos que modulan la co-estimulación de células inmunológicas. Por ejemplo, polipéptidos de B7-4 han sido aislados a partir de bibliotecas de queratinocitos y ADNc placental. Se ha encontrado también que 37-4 co-esti ula o 10 inhibe las células T. La presente invención identifica PD-l como un receptor para B7-4. Células inmunológicas tienen receptores que transmiten señales de activación. Por ejemplo, células T tienen receptores de células T y el complejo de CD3, células B 15 tienen receptores de células B, y células mieloides tienen receptores de Fe. Además, células innunológicas llevan receptores que transmiten señales que proporcionan señales co-estimuladoras o receptores que transmiten señales que inhiben la señalización enviada por receptores. Por ejemplo, 20 CD28 transmite una señal co-estimuladora a células T. Después de la ligación del receptor de células T, la ligación de CD28 resulta en una señal co-estimuladora caracterizada por ejemplo por una regulación ascendente de receptor de IL-2ra, IL-2rß, IL-2r?, una transcripción incrementada de ARN 25 mensajero de IL-2, una expresión incrementada de genes de citocina (incluyendo IL-2, IFN-?, GM-CSF, y TNF-a) . La transmisión de una señal co-estimuladora permite que la célula avance a través del ciclo celular y, por consiguiente, incrementa la proliferación de células T (Greenfield et al. (1998) Cri t. Rev. Inmunol . 18:389). La unión de un receptor en una célula T que transmite una señal co-estimuladora a la célula por ejemplo, ligación de un receptor co-estimulador que lleva a secreción de citocinas y/o proliferación de la célula T) por una molécula de la familia B7, como por ejemplo, B7-4, resulta en co-estimulación. Así, la inhibición de una interacción entre una molécula de familia B7, como por ejemplo, B7-4, y un receptor que transmite una señal co-estimuladora en una célula inmunológica resulta en una modulación descendente de la respuesta inmunológica y/o la falta de respuesta específica, lo que se conoce como anergía de células inmunológicas. La inhibición de esta interacción puede lograrse empleando, como por ejemplo, fragmentos Fab anti-CD28, anticuerpos para B7-1, B7-2 y/o B7/4, o bien mediante la utilización de una forma soluble de un receptor al cual una molécula que es miembro de la familia B7 puede unirse como inhibidor competitivo (por ejemplo, CTLA4lg) . Receptores inhibidores que se unen con moléculas co-estimuladoras han sido también identificados en células inmunológicas. La activación de CTLA4, como por ejemplo, transmite una señal negativa a una células T. La *. ? ^^ - *-^*^»* -*.*^- t --***' »M?¡¿ participación de CTLA4 inhibe la producción ae IL-2 y puede inducir la suspensión del ciclo celular (Krummel y Allison (1996) J. Exp. Med. 183:2533) . Además, ratones que no tienen CTLA4 desarrollan una enfermedad linfoproliferativa (Tivol et al. (1995) I muni ty 3:541; Waterhouse et al. (1995) Science 270:985). El bloqueo de CTLA4 con anticuerpos puede remover una señal inhibidora, mientras que la agregación de CTLA4 con un anticuerpo transmite una señal inhibidora. Por consiguiente, según el receptor al cual se une la molécula co-estimuladora (es decir un receptor co-estimulador tal como CD28 o bien un receptor inhibidor como por ejemplo CTLA4) , ciertas moléculas B7 incluso pueden promover la coestimulación o inhibición de células T. PD-l es un miembro de la familia de las inmunoglobulinas (Ishida et al. (1992) EMBO J. 11:3887; Shinohara et al. (1994) Genomics 23:704). PD-l fue previamente identificada empleando un enfoque basado en clonación por sustracción diseñado para identificar moduladores de la muerte programada de las células (Ishida et al. (1992) EMBO J. 11:3887-95; Woronicz et al. (1995) Curr. Top. Microbiol . I munol . 200:137). Se cree que PD-l desempeña una función en la supervivencia de los linfocitos, como por ejemplo, durante selección clonal (Honjo (1992) Science 258:591; Ágata et al. (1996) Int. Immunology. 8:765; Nishimura et al. (1996) Int . Izn unoJogy 8:773) . PD-l fue también implicada como regulador .¿"^« de repuesta de células B (Nishimura (1998) Int . Im unology 10:1563). A diferencia de CTLA4, que se encuentra solamente en células T, PD-l se encuentra también en células B y en células mieloides. El presente descubrimiento que PD-l se une con B7-4 coloca PD-l en una familia de receptores inhibidores con CTLA . Mientras la participación de un receptor co-estimulador resulta en la señal co-estimuladora en una célula inmunológica, la participación de un receptor inhibidor, como por ejemplo, CTLA4 o PD-l (por ejemplo mediante reticulación o por agregación) provoca la transmisión de una señal inhibidora en una célula inmunológica lo que resulta en una modulación descendente de respuestas de células inmunológicas y/o en una anergía de células inmunológicas. Mientras la transmisión de una señal inhibidora provoca la modulación descendente de respuestas de células inmunológicas (y una modulación descendente resultante de la respuesta inmunológica global), la prevención de una señal inhibidora (por ejemplo, mediante la utilización de un anticuerpo no activador contra PD-l) en células inmunológicas provoca la modulación ascendente de respuestas de células inmunológicas (y una modulación ascendente resultante de una respuesta inmunológica) . La presente invención hace disponible agentes útiles para modular la actividad y/o expresión de PD-l; la interacción ..^.^^-ii-A- -entre PD-l y su(s) ligando (s) natural (es), (por ejemplo, B7-4); y agentes para modular la respuesta inmunológica a través de la modulación de la interacción entre PD-l y su ligando natural, como por ejemplo, B7-4. Agentes moduladores ejemplares para su uso en estos métodos se describen adicionalmente a continuación. Moléculas de polipéptidos y ácido nucleico de B7-4 y PD-l En una modalidad, un agente modulador útil para modular la actividad y/o expresión PD-l es una molécula de ácido nucleico de B7-4 y/o PD-l, de preferencia, una molécula de ácido nucleico de B7-4 y/o PD-l de ser humano. En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención codifican polipéptidos B7-4 o PD-l eucarióticos. La familia B7-4 de moléculas comparte numerosas regiones conservadas incluyendo dominios de señales, dominios de IgV y los dominios de IgC. Los dominios de IgV y los dominios de IgC son dominios de miembros de la superfamilia de Ig reconocidos en la técnica. Estos dominios corresponden a unidades estructurales que tienen patrones de pliegue distintos que se conocen pliegues de Ig. Los pliegues de Ig consisten de un emparedado de dos hojas ß, cada uno consistiendo de cadenas ß antiparalelas de 5-10 aminoácidos con un enlace disulfuro conservado entre las dos hojas en la mayoría de los dominios, sino en todos los dominios. Dominios de IgC de moléculas de Ig, TCR y MHC comparten los mismos jd.- .?-tiJÉÚiáH' g..Afc-t-t.. tipos de patrones de secuencia y se conocen como conjunto Cl dentro de la superfamilia de Ig. Otros dominios de IgC se encuentran dentro de otros conjuntos. Dominios de IgV comparten también patrones de secuencias que ser conocen como dominios de conjunto V. Dominios de IgV son más largos que los dominios de C y forman un par adicional de cadenas ß. Dos formas de moléculas B7-4 humanas han sido identificadas. Una forma es un polipéptido soluble de B7-4 que ocurre naturalmente, es decir, que tiene un dominio hidrofílico corto y ningún dominio de transmembrana, y se conoce aquí como B7-4S (se muestra en SEQ ID NO: 2) . La segunda forma es un polipéptido asociado a células, es decir, que tiene un dominio citoplásmico y de transmembrana, que se conoce aquí como B7-4M (se muestra en SEQ ID NO:4). Las proteínas de B7-4 comprenden una secuencia de señal, y un dominio de IgV y un dominio de IgC. La secuencia de señal de SEQ ID NO: 2 se muestra desde aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 18. La secuencia de señal de SEQ ID NO: 4 se muestra desde aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 18. El dominio de IgV de SEQ ID NO: 2 se muestra desde aproximadamente el aminoácido 19 hasta aproximadamente el aminoácido 134 y el dominio de IgV de SEQ ID NO: 4 se muestra desde aproximadamente el aminoácido 19 hasta aproximadamente el aminoácido 134. El dominio de IgC de SEQ ID NO: 2 se muestra desde JA-». .- Éfet.' aproximadamente el aminoácido 135 hasta aproximadamente el aminoácido 227, y el dominio de IgC de SEQ ID NO: 4 se muestra desde aproximadamente el aminoácido 135 hasta aproximadamente el aminoácido 227. La cola hidrofílica de la proteína de B7-4 ejemplifica en SEQ ID NO: 2 comprende una cola hidrofílica mostrada desde aproximadamente el aminoácido 228 hasta aproximadamente el aminoácido 245. El polipéptido de B7-4 ejemplifica en SEQ ID NO: 4 comprende un dominio de transmembrana mostrado desde aproximadamente el aminoácido 239 hasta aproximadamente el aminoácido 259 de SEQ ID NO: 4, y un dominio citoplásmico mostrado desde aproximadamente el aminoácido 260 hasta aproximadamente el aminoácido 290 de SEQ ID NO: . Se identificaron también moléculas B7-4 de murino. Las secuencias de ADNc de murino se presenta en la figura 5 y la secuencia de aminoácidos de B7-4 de murino se presenta en la figura 6. La presente invención se refiere también a estas moléculas de B7-4 de murino. PD-l ha sido identificado como un receptor que se une con B7-4. Las moléculas de PD-l son miembros de la superfamilia de gen de inmunoglobulinas. PD-l (Ishida et al. (1992) EMBO J. 11:3887; Shinohara et al. (1994) Genomics 23:704; Patente Norteamericana 5,698,520); tiene una región extracelular que contiene un dominio de superfamilia de inmunoglobulina, un dominio de transmembrana, y una región intracelular que influye un motivo inhibidor basado en tirosma de inmunoreceptor (ITIM) . Estas características definen también una familia más grande de moléculas, que se conocen como receptores inmunoinhibidores, que incluyen también gp49B, PIR-B, y los receptores inhibidores asesinos (KIRs) (Vivier y Daeron (1997) Immunol . Today 18:286). Se considera frecuentemente que el motivo ITIM tirosilfosforilado de estos receptores interactúa con el dominio de SH2 que contiene fosfatasas, lo que provoca señales de inhibición. Un subconjunto de estos receptores inmunomhibidores se une a moléculas de MHC, como por ejemplo, KIRs, Y CTLA4 se une a B7-4 y B7-2. Se ha propuesto que existe una relación filogenética entre los genes de MCH y B7 (Henry et al. (1999) Immunol . Today 20 (6) : 285-8) . La secuencia de nucleótidos de PD-l se muestra en SEQ ID NO: 10 y 11 y la secuencia de aminoácidos de PD-l se muestra en SEQ ID NO:12 (véase también Ishida et al. (1992) EMBO J. 11:3887; Shinohara et al. (1994) Genomics 23:704; Patente Norteamericana 5,698,520). PD-l fue previamente identificado empleando un enfoque basado en clonación por sustracción para seleccionar proteínas involucradas en la muerte apoptótica de células. PD-l es identificada aquí como miembro de la familia de moléculas CD28/CTLA-4 con base en su capacidad de unirse con B7-4. De la misma manera que CTLA4, PD-l es inducido rápidamente en la superficie de células T en respuesta a .^...¿ j anti-CD3 (Ágata et al . ( 1996) Int . Immunol . 8 : 765) . En contraste con CTLA4 , sin embargo, PD-l es también inducido en la superficie de células B (en respuesta a anti-IgM) . PD-l se encuentra también expresada en un subconjunto de timocitos y células mieloides (Ágata et al . ( 1996) supra; Nishimura et al . ( 1996) Int . Immunol 8 : 773) . La presente invención identifica B7-4 como un ligando de PD-l . Varios aspectos de la presente invenciones describirán con detalles adicionales en las subsecciones siguientes : I . Definiciones Como se emplea aquí, el término "célula inmunológica" incluye células que son de origen hematopoyético y que desempeñan una función en la respuesta inmunológica . Células inmunológicas incluyen linfocitos, como por ejemplo, células B y células T; células asesinas naturales; células mieloides, tales como monocitos, macrófagos, osinófilos, mastocitos, basófilos y granulocitos . Como se emplea aquí, el término "célula T" incluye células T de CD4+ Y células T de CD8+ . El término célula T incluye también células T auxiliares de tipo 1 y célula T auxiliares de tipo 2. El término "célula de presentación de antígeno" incluye células de presentación de antígeno profesionales (por ejemplo, linfocitos B, monocitos, células dendríticas, células de Langerhans) así como otras células de presentación de antígeno (por ejemplo queratinocitos, células endoteliales, astrositos, fibroblastos, oligoaendrocitos) . Como se emplea aquí, el término "respuesta inmunológica" incluye respuestas inmunológicas mediadas per célula T y/o por células B, influenciadas por la modulación de la co-estimulación de células T. Respuestas inmunológicas ejemplares incluyen respuestas de célula T, como por ejemplo, producción de citocinas, y citotoxicidad celular. Además, el término respuesta inmunológica incluye respuestas inmunológicas indirectamente efectuadas por activación de células T, como por ejemplo, producción de anticuerpos (respuestas humorales) y activación de células que responden a citocinas como por ejemplo, macrófagos. Como se emplea aquí, el término "receptor co-estimulador" incluye receptores que transmiten una señal de co-estimulación a una célula inmunológica, por ejemplo, CD28. Como se emplea aquí, el término "receptores inhibidores" incluye receptores que transmiten una señal negativa a una célula inmunológica (por ejemplo CTLA4 O PD-l) . Una señal inhibidora como translúcida por un receptor inhibidor puede ocurrir aún si un receptor o co-estimulador (como por ejemplo CD28) no está presente en la célula inmunológica, y por consiguiente, no es simplemente una función de competición entre receptores inhibidores y receptores co-estimuladores para unión de moléculas co-estimuladoras (Fallarino et al. (1998) J. Exp. Med. 188:205). La transmisión de una señal inhibidora a una célula inmunológica puede resultar en una falta de respuesta o anergía o bien muerte celular programada en la célula inmunológica. De preferencia, a transmisión de una señal inhibidora opera a través de un mecanismo que no incluye la apóptosis. Como se emplea aquí, el término "apóptosis" incluye la muerte programada de la célula que puede caracterizarse empleando técnicas conocidos. La muerte celular apoptótica puede caracterizarse como por ejemplo, por un encogimiento de las células, formación de ampollas en la membrana y condensación de cromatina culminando en la fragmentación de la célula. Células sometidas a apóptosis presentan también un patrón característico de disociación de ADN internucleosomal. Según la forma de la molécula B7-4 que se une a un receptor, ya sea una señal puede ser transmitida (por ejemplo, por una forma multivalente de una molécula de B7-4 que resulta en la recreticulación de receptor) , o bien una señal puede ser inhibida (por ejemplo, por la forma monovalente, soluble de una molécula B7-4) como por ejemplo, mediante competencia de formas activador de moléculas B7-4 para unión con el receptor. Sin embargo, existen casos en los cuales una molécula soluble puede ser estimuladora. Los efectos de los varios agentes moduladores pueden ser fácilmente demostrados empleando ensayos de tamizado de rutina de conformidad con lo descrito aquí.

Como se emplea aquí, el término "co-estimula" con referencia a células inmunológicas activadas incluye la capacidad de una molécula co-estirauladora para proporcionar una segunda señal mediada por receptor no activador (una "señal co-estimuladora") que induce la proliferación o función efectora. Por ejemplo, una señal co-estimuladora puede resultar en secreción de citocinas, como por ejemplo, en una célula T que ha recibido una señal mediada por receptor de célula T. Células inmunológicas que ha recibido una señal mediada por receptor de célula, como por ejemplo, a través de un receptor activador se conocen aquí como "células inmunológicas activadas". Como se emplea aquí, el término "receptor activador" incluye receptores de células inmunológicas que unen antígeno, antígeno formado en complejo (por ejemplo, en el contexto de moléculas MHC) o bien se unen con anticuerpos. Tales receptores activadores incluyen receptores de células T (TCR), receptores de células B (BCR) , receptores de citocinas, receptores de LPS, receptores de complemento y receptores de Fe. Por ejemplo, receptores de célula T están presentes en células T y están asociados con moléculas de CD3. Los receptores de célula T son estimulados por antígeno en el contexto de las moléculas de MHC (así como por reactivos de activación de células T policlonales) . La activación de *itt?. -*..J**^ ^ ,. ^i-Á __ ,..t .^-t-^*~^-*«l----*-¿ células T, a través de TCR resulta en numerosos cambios, como por ejemplo, fosforilación de proteína, cambios de líquidos de membranas, flujos de iones, alteraciones cíclicas de nucleótidos, cambios de transcripción de ARN, cambios de síntesis de proteína, y cambios de volumen de célula. Los receptores de célula B están presentes en células B. Los receptores de antígeno de células B son un complejo entre Ig de membrana (mlg) y otros polipéptidos de transmembrana (por ejemplo, Iga y Igß) . La función de transmisión de señales de mlg es desencadenada por la reticulación de moléculas de receptor por antígeno oligoméricos o multiméricos. Las células B pueden también ser activadas por anticuerpos anti-inmunoglobulina. Al efectuarse una activación de BCR, varios cambios ocurren en células B, incluyendo fosforilación de tirosina. Receptores de Fe se encuentran en muchas células que participan en respuestas inmunológicas . Los receptores de Fe ( FcRs) son receptores de superficie celular para la porción Fe de moléculas de inmunoglobulina ( Igs) . Entre los FcRs humanos que han sido identificados a la fecha se encuentran los que reconocen IgG (designados Fc? R) , IgE ( Fce Rl ) , IgA ( Fca) , e IgM/A polimerizado ( FcµaR) . FcRs se encuentran en los siguientes tipos de células : Fce Rl (mastocitos ) , Fce R. II (muchos leucocitos ) , FcaR (neutrófilos ) , y Fcµa R (epitelio glandular hepatocitos ) (Hogg, N. ( 1988 ) I munol . ijjiíí ..saáis?:. tt«fais fei«- * *, . n¡aM.- <. . *-, m» « t-.<fa. — Today 9:185-86). Los Fc?Rs ampliamente estudiados son centrales en las defensas inmunológicas celulares, y son responsables para estimular la liberacicr. de mediadores de inflamación y enzimas hidrolíticas involucradas en la patogénesis de enfermedades autoinmunes (Unkeless, J. C. et al. (1988) Annu. Rev. Immunol . 6:251-81). Los Fc?Rs proporcionan un enlace crucial entre células efectoras y los linfocitos que secretan Ig, puesto que los Fc?Rs de macrófago/monocito, leucocito polimorfonuclear y célula asesina natural (NK) confieren un elemento de reconocimiento específico mediado por IgG. Leucocitos humanos tienen por lo menos tres receptores diferentes para IgG: h Fc?RI (encontrado en monocitos/macrófagos), hFc? RII (en monocitos, neutrófilos, eusinófilos, plaquetas, posiblemente en células B, y la línea de células K562), y Fc? III (en célula NK, neutrófilos, eosinófilos, y macrófagos) . Con relación a las células T, la transmisión de una señal co-estimuladora a una célula T incluye una vía de señalización que no es inhibida por ciclosporina A. Además, una señal co-estimuladora puede inducir la secreción de citocinas (por ejemplo, IL-2 y/o IL-10) en una célula T y/o puede prevenir la inducción de la falta de respuesta a antígeno, la inducción de anergía, o la inducción de la muerte celular en la célula T. Como se emplea aquí, el término "señal inhibidora" se refiere a una señal transmitida a través de un receptor inhibidor (por ejemplo, CTLA4 o PD-l) para una molécula en una célula inmunológica. Dicha señal antagoniza una señal a través de un receptor activador (por ejemplo, a través de una molécula TCR, CD3, BCR, o Fe) y puede resultar por ejemplo en la inhibición de una segunda generación de mensajero; una inhibición de proliferación; una inhibición de función efectora en la célula inmunológica como por ejemplo, fagocitosis reducida, producción reducida de anticuerpos, citotoxicidad celular reducida, la incapacidad de la célula inmunológica para producir mediadores (como por ejemplo citocinas (por ejemplo IL-2) y/o mediadores de respuestas alérgicas); o bien el desarrollo de anergía. Como se emplea aquí, el término "falta de respuestas" incluye el carácter refractario de las células inmunológicas a la estimulación, por ejemplo, estimulación a través de un receptor activador o una citocina. La falta de respuesta puede ocurrir, como por ejemplo, debido a exposición a inmunosupresores o bien exposiciones a altas dosis de antígeno. Como se emplea aquí, el término "anergía" o "tolerancia" incluye el carácter refractario a la activación de estimulación mediada por receptores. Dicho carácter refractario es generalmente específico para antígenos y persisten después de la suspensión de la exposición al antígeno que provoca la tolerancia. Por ejemplo, una anergía ^á? en células T (a diferencia de la falta de respuesta) se caracteriza por la falta de producción de citocinas como por ejemplo, IL-2. La anergía de las células T ocurre cuando células T están expuestas a un antígeno y reciben una primera señal (una señal mediada por CD-3 o receptor de células T) en ausencia de una segunda señal (una señal co-estimuladora) . En estas condiciones, una reexposición de las células al mismo antígeno (aún si ocurre una reexposición en presencia de una molécula co-estimuladora) resulta en la no producción de citocinas y, por consiguiente, no proliferación. Células T anérgicas puede sin embargo presentar respuestas a antígenos no relacionados y pueden proliferar si se cultivan con citocinas (por ejemplo, IL-2) . Por ejemplo, la anergía de células T puede también observarse por la falta de producción de IL-2 por linfocitos T según lo medido por ELISA o bien por un ensayo de proliferación utilizando una línea de células indicadoras. Alternativamente, se puede emplear un constructo de gen reportero. Por ejemplo, células T anérgicas no inician la transcripción de gen IL-2 inducida por un promotor heterólogo bajo el control del realzador de gen de 5' IL-2 o bien por un multímero de la secuencia de API que puede encontrarse dentro del realzador (Kang et al. (1992) Science 257:1134) . La proteína de B7-4 y moléculas de ácido nucleico comprenden una familia de moléculas que tienen ciertas características estructurales y funcionales conservadas. De manera similar, las moléculas de ácido nucleico y proteínas de PD-l son miembros de una familia de moléculas que tienen características estructurales y funcionales conservadas. El término "familias" cuando se refiere a las moléculas de ácido nucleico y proteína tiene el propósito de significar dos o más moléculas de ácido nucleico o proteínas que tienen un dominio estructural en común o motivo en común y que tienen suficiente homología de secuencias de nucleótidos o aminoácidos de conformidad con lo definido aquí. Tales miembros de familia pueden ocurrir de manera natural o no natural y pueden provenir de la misma especie o de especies diferentes. Por ejemplo, una familia puede contener una primera proteína de origen humano, así como otras proteínas distintas de origen humano o alternativamente puede comprender homólogos de origen no humano. Miembros de una familia pueden también tener características funcionales comunes. Las moléculas de B7-4 descritas aquí son miembros de la familia B7 de moléculas. El término "familia B7" o "moléculas de B7" como se emplea aquí incluye moléculas co- estimuladoras que comparten homología de secuencias con polipéptidos de B7 como por ejemplo, con B7-1, B7-2, B7-3 (reconocidos por el anticuerpo BB-1), B7h (Swallow et al. (1999) Imm?nity 11:423), y/o B7-4. Por ejemplo, B7-1 y B7-2 humanas comparten aproximadamente una identidad de secuencias de aminoácidos del 26% cuando se comparan empleando el programa BLAST en NCBI con los parámetros por omisión (matriz Blosum62 con penalidades de espacio establecidas en existencia 11 y extensión 1 (véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov)). Los polipéptidos de B7 preferidos pueden proporcionar señales co-estimuladoras o inhibidoras a células inmunológicas con el objeto de promover o inhibir de esta forma respuestas de células inmunológicas. Por ejemplo, cuando está unida a un receptor co-estimulador, B7-4 puede inducir la coestimulación de células inmunológicas o puede inhibir la coestimulación de células inmunológicas, como por ejemplo, cuando está presente en forma soluble. Cuando están unidas a un receptor inhibidor, moléculas de B7-4 pueden transmitir una señal inhibidora a una célula inmunológica. Miembros de familia B7 preferidos incluyen B7-1, B7-2, B7-3 (reconocida por el anticuerpo BB-1), B7h, y B7-4 y fragmentos solubles o derivados. En una modalidad, miembros de familia B7 se unen con uno o varios receptores en una célula inmunológica, como por ejemplo, CTLA4, CD28, ICOS, PDl y/o otros receptores y, según el receptor, tienen la capacidad de transmitir una señal inhibidora o una señal co-estimuladora a una célula inmunológica de preferencia una célula T. Moléculas de PD-l preferidas pueden transmitir una señal inhibidora a una célula inmunológica y por consiguiente inhibir la función efectcra de célula inmunológica o bien pueden promover la co-estimulación (por ejemplo, por inhibición competitiva) , de células inmunológicas como por ejemplo, cuando están presentes en forma monomérica, soluble. Miembros de la familia PD-l preferidos se unen a uno o varios receptores, como por ejemplo, B7-1, B7-2, B7-4, y/o otras moléculas en células de presentación de antígeno y comparten identidad de secuencia con PD-l. Además, en una modalidad, proteínas que son miembros de una familia de proteína están unidas por anticuerpos generados contra proteínas miembros de una o varias a otras familias. Por ejemplo, el anticuerpo BB-1 reconoce moléculas B7-4. Como se emplea aquí, el término "actividad" con relación a polipéptido B7-4 o PD-l incluye actividades inherentes en la estructura de una proteína de B7-4 o PD-l. Con relación a B7-4, el término "actividad" incluye la capacidad de modular una co-estimulación de células inmunológicas, como por ejemplo, mediante la modulación de una señal co-estimuladora en una célula inmunológica activada, o bien de modular la inhibición mediante la modulación de una señal inhibidora en una célula inmunológica, como por ejemplo, mediante el enganchamiento de un receptor natural en una célula inmunológica. Cuando una forma activadora de la molécula de B7-4 se une a un receptor co-estimulador, se genera una señal co-estimuladora en la célula inmunológica. Cuando una forma activadora de la - --Ht ,'fc-molécula B7-4 se une a un receptor inhibidor, se genera una señal inhibidora en la célula inmunológica. La modulación de una señal co-estimuladora resulta en la modulación de la función efectora de una célula ínmunológica. Así, el término "actividad B7-4" incluye la capacidad de un polipéptido de B7-4 para unirse con su(s) receptor (es) natural (es), la capacidad de modular señales co-estimuladoras o inhibidoras de células inmunológicas y la capacidad de modular la respuesta inmunológica. Con relación a PD-l, el término "actividad" incluye la capacidad de un polipéptido de PD-l para modular una señal inhibidora en una célula inmunológica activada, como por ejemplo, mediante el enganchamiento de un ligando natural en una célula de presentación de antígeno. PD-l transmite una señal inhibidora a una célula inmunológica de una manera similar a CTLA4. La modulación de una señal inhibidora en una célula inmunológica resulta en la modulación de la proliferación de y/o secreción de citocinas por una célula inmunológica. PD-l puede también modular una señal co-estimuladora mediante competición con un receptor co-estimulador para unión de una molécula de B7. Así, el término "actividad PD-l" incluye la capacidad de un polipéptido de PD-l para unirse con su(s) ligando (s) natural (es), la capacidad de modular señales co-estimuladoras o inhibidoras de células inmunológicas, y la capacidad de modular la ?&áÉMñ . i r ^ b ^^¿tJi *^*^AÍ^^Í.^t^^^&^l?iÉg^ÍSi respuesta inmunológica. Como se emplea aquí, una molécula de ácido nucleico que "ocurre naturalmente" se refiere a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótido que ocurre en la naturaleza (por ejemplo, que codifica una proteína natural) . Como se emplea aquí, una molécula de ácido nucleico de "antisentidos" comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria de un ácido nucleico de "sentidos" que codifica una proteína, por ejemplo, complementaria de la cadena codificadora de una molécula de ADNc de doble cadena, complementaria de una secuencia de ARNm o bien complementaria de la cadena codificadora de una gen. Por consiguiente, una molécula de ácido nucleico de antisentido puede unirse con hidrógeno a una molécula de ácido nucleico de sentido. Como se emplea aquí, el término "región codificada" se refiere a regiones de una secuencia de nucleótidos que comprende codones que son traducidos en residuos de aminoácidos, mientras que el término "región no codificada" se refiere a regiones de una secuencia de nucleótidos que no son traducidas en aminoácidos (por ejemplo, regiones no traducidas 5' y 3') . Como se emplea aquí, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otra molécula de ácido nucleico a la cual se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido" que se refiere a un bucle de ADN de doble cadena circular en donde se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde segmentos de ADN pueden ser ligados en ei genoma viral. Ciertos vectores pueden presentar una replicación autónoma en una célula huésped en donde están introducidos (por ejemplo, vectores bacteriano que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores de mamíferos episomales) .Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episomales) están integradas el genoma de una célula huésped al introducirse en la célula huésped y por consiguiente son replicados junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores pueden dirigir la expresión de genes a los cuales están operativamente enlazados. Tales vectores se conocen aquí como "vectores de expresión recombinante" o simplemente "vectores de expresión". En general, vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante tienen frecuentemente la forma de plásmidos. En la presente especificación, las palabras "plásmido" y "vector" pueden ser utilizadas de manera intercambiable puesto que el plásmido es la forma de vector más comúnmente empleada. Sin embargo, la invención tiene el propósito de incluir otras formas de vectores de expresión, como por ejemplo vectores virales (por ejemplo, virus asociado con adeno, adenovirus y retrovirus defectuosos para replicación) , que desempeñan funciones equivalentes.

Como se emplea aquí, el término "célula huésped" tiene el propósito de referirse a una célula en la cual una molécula de ácido nucleico de la presente invención, como por ejemplo un vector de expresión recombinante de la presente invención, ha sido introducida. Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" se emplean de manera intercambiable aquí. Se entenderá que tales términos se refieren no solamente a la célula blanco particular sino a la progenie o progenie potencial de dicha célula. Debido a ciertas modificaciones que pueden ocurrir en generaciones subsecuentes debido ya sea a mutación o influencias ambientales, dicha progenia de hecho puede no ser idéntica a la célula de origen, pero sigue siendo incluida dentro del alcance del término según se emplea aquí. Como se emplea aquí, un "animal transgénico" se refiere a un animal no humano, de preferencia un mamífero, con mayor preferencia un ratón, en donde una o varias de la células del animal incluye un "transgen". El término "transgen" se refiere a ADN exógeno integrado en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico y que permanece en el genoma del animal maduro, por ejemplo, dirigiendo la expresión de un producto génico codificado en uno o varios tipos de células o tejidos del animal transgénico. Como se emplea aquí, un "animal recombinante homólogo" se refiere a un tipo de animal no humane transgénico, de preferencia un mamífero, con mayor preferencia un ratón, en donde un gen endógeno ha sido alterado por recombinación homologa entre el gen endógeno y una molécula de ADN exógena introducida en una célula del animal, como por ejemplo, una célula embriónica del animal, antes del desarrollo del animal. Como se emplea aquí, una "proteína aislada" se refiere a una proteína sustancialmente exenta de otras proteínas, material celular y medio de cultivo cuando es aislada de otras células o producida por técnicas de ADN recombinante o precursores químicos o bien otros químicos cuando es sintetizada químicamente. Una proteína "aislada" o "purificada" o una porción biológicamente activa de la misma es sustancialmente libre de material celular o bien de otras proteínas contaminantes de la célula o fuente tisular de donde la proteína de B7-4 o PD-l es derivada o bien sustancialmente libre de precursores químicos o bien otros químicos cuando es sintetizada químicamente. La expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de proteína de B7-4 o PD-l en donde la proteína es separada de los componentes celulares de las células a partir de las cuales es aislada o producida recombinantemente. En una modalidad, la expresión "sustancialßente libre de material celular" incluye preparaciones de proteína de B7-4 o PD-l que tienen menos que aproximadamente 30% (en peso seco) de proteína no-B7-4 o PD-l (se conocen aquí como "proteína de combinación"), con mayor preferencia menos que aproximadamente 20% de proteína no-B7-4 o PD-l, con preferencia todavía mayor menos que aproximadamente 10% de proteína no-B7-4 o PD-l, y muy especialmente menos que aproximadamente 5% de proteína no-B7-4 o PD-l. Cuando la proteína de B7-4 o PD-l o una porción biológicamente activa de la misma es producida de manera recombinante, de preferencia se encuentra también sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos que aproximadamente 20%, con mayor preferencia menos que 10%, y muy especialmente menos que aproximadamente 5% del volumen de la preparación de proteína. La expresión "sustancialmente libre de precursores químicos o bien otros químicos" incluye preparaciones de proteína de B7-4 o PD-l en donde la proteína se encuentra separada de los precursores químicos u otros químicos involucrados en la síntesis de la proteína. En una modalidad, la expresión "sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos" incluye preparaciones de proteína de B7-4 o PD-l que tienen menos que aproximadamente 30% (en peso seco) de precursores químicos o químicos no-B7-4 o PD-l, con mayor preferencia menos que aproximadamente 20% de precursores químicos o químicos no-B7-4 o PD-l, con preferencia todavía tMA mayor menos que aproximadamente 10% de precursores químicos o químicos no-B7-4 o PD-l, y muy especialmente menos que aproximadamente 5% de precursores químicos o químicos no-B7-4 o PD-l. El término "anticuerpo" como se emplea aquí, incluye también una "porción de unión con antígenos" de un anticuerpo (o bien simplemente "porción de anticuerpos") . El término "porción de unión con anticuerpos", como se emplea aquí, se refiere a uno o varios fragmentos de un anticuerpo que conserva la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, B7-4). Se ha mostrado que la función de unión con antígeno de un anticuerpo puede efectuarse a través de fragmentos de anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "porción de unión de anticuerpos" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CHI; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo único de un anticuerpo, (v) , un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste de un dominio VH; y (vi) una región de determinación de complementaridad aislada (CDR) . Además, aún cuando los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, pueden ser unidos empleando métodos recombinantes por un enlazador sintético que les permite ser elaborado como una cadena de proteína única en donde las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (se conocer, como Fv de cadena única (scFv) ; véase como por ejemplo, 3ird et al. (1988) Science 242:423-426; and Houston et al. (1988) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 85:5879-5883; y Osbourn et al. 1998, Nature Biotechnology 16:778). Tales anticuerpos de cadena única tienen también el propósito de ser abarcados dentro de la expresión "porción de unión de antígenos" de un anticuerpo. Cualquier secuencia de VH y VL de scFv específico puede estar unida a secuencias genómicas o ADNc de región constante de inmunoglobulina humana con el objeto de generar vectores de expresión que codifican moléculas de IgG completas o bien otros isotipos. VH y VI pueden también ser utilizados en la generación de Fab, Fv u otros fragmentos de inmunoglobulinas utilizando ya sea química de proteína o bien tecnología de ADN recombinante. Otras formas de anticuerpos de cadena única, tales como "diabodies" también están incluidos. Los "diabodies" son anticuerpos biespecíficos, bivalentes en donde los dominios VH y VL son expresados en una cadena de polipéptidos única, pero utilizando un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, obligando así los dominios a aparearse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de enlace de antígeno (véase como por ejemplo Holliger, P., et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Scí. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123). Además, un anticuerpo o porción de unión con antígeno del mismo puede ser parte de una molécula de inmunoadhesión más grande, formada por asociación covalente o no covalente del anticuerpo o porción de anticuerpo con uno o varios otros péptidos o proteínas. Ejemplos de tales moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de una región de núcleo de estreptavidina para formar una molécula de scFv tetra érica (Kipriyanov, S.M. et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) y utilizar un residuo de cisteína, un péptido marcador y una etiqueta de polihistidina de terminal C para formar moléculas de scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov, S.M. et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058).

Porciones de anticuerpo, tales como fragmentos Fab y F(ab')2 pueden ser preparadas a partir de anticuerpos enteros utilizando técnicas convencionales como por ejemplo digestión de papaína o pepsina, respectivamente, de anticuerpos enteros. Además, anticuerpos, porciones de anticuerpo y moléculas de inmunoadhesión pueden ser obtenidos utilizando técnicas de ADN recombinante estándares, de conformidad con lo descrito aquí . .aateafrS-á*'*-»» Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales; xenogeneicos, alogeneicos, o singeneicos; o bien formas modificadas de los mismos, por ejemplo, formas humanizadas, quiméricas, etc. De preferencia, anticuerpos de la presente invención se unen específicamente o sustancialmente específicamente con moléculas de B7-4. Los términos "anticuerpos monoclonales" y "composición de anticuerpo monoclonal", como se emplean aquí, se refieren a una población de moléculas de anticuerpo que contienen solamente una especie de un sitio de unión con antígeno que puede inmunoreaccionar con un epítopo particular de un antígeno, mientras que el término "anticuerpos policlonales" y la expresión "composición de anticuerpo policlonal" se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contienen múltiples especies de sitios de unión con antígeno que pueden interactuar con un antígeno particular. Una composición de anticuerpo monoclonal presenta típicamente una afinidad de unión específica para un antígeno particular con el cual inmunoreacciona . La expresión "anticuerpo humanizado" como se emplea aquí, tiene el propósito de incluir anticuerpos elaborados por una célula no humana que tiene regiones variables y constantes que han sido alteradas para parecerse de manera más estrecha a anticuerpos elaborados por una célula humana. Por ejemplo, mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos de anticuerpo no humano para incorporar aminoácidos encontrados en secuencias de inmunoglobulina de línea germinal de ser humano. Los anticuerpos humanizados de la presente invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal de ser humano (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica para sitio in vi tro o bien mediante mutación somática in vivo) , por ejemplo en CDRs. La expresión "anticuerpo humanizado", como se emplea aquí, incluye también anticuerpos en los cuales secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, como por ejemplo ratón, han sido injertados en secuencias estructurales humanas . Un "anticuerpo aislado", como se emplea aquí, se refiere a un anticuerpo sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une de manera específica con B7-4 es sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente con antígenos otros que B7-4) . Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o químico. Existe una correspondencia conocida y clara entre la secuencia de aminoácidos de una proteína particular y las secuencias de nucleótidos que pueden codificar para la proteína, de conformidad con lo definido por el código genético (se muestra a continuación) . De la misma manera, existe una correspondencia conocida y clara entre la secuencia de nucleótidos de una molécula ¿e ácido nucleico particular y la secuencia de aminoácidos codificada por esta molécula de ácido nucleico, de conformidad con lo definido por el código genético. CÓDIGO GENÉTICO Alanina (Ala, A) GCA, GCC, GCG, GCT Arginina (Arg, R) AGA, ACG, CGA, CGC, CGG, CGT Asparagina (Asn, N) AAC, AAT Ácido aspártico (Asp, D) GAC, GAT Cisteína (Cys, C) TGC, TGT Ácido glutámico (Glu, E) GAA, GAG Glutamina (Gln, Q) CAÁ, CAG Glicina (Gly, G) GGA, GGC, GGG, GGT Histidina (His, H) CAC, CAT Isoleucina (lie, I) ATA, ATC, ATT Leucina (Leu, L) CTA, CTC, CTG, CTT, TTA, TTG Lisina (Lys, K) AAA, AAG Metionina (Met, M) ATG Fenilalanina (Phe, F) TTC, TTT Prolina (Pro, P) CCA, CCC, CCG, CCT Serina (Ser, S) AGC, AGT, TCA, TCC, TCG, TCT Treonina (Thr, T) ACÁ, ACC, ACG, ACT Triptófano (Trp, W) TGG Tirosina (Tyr, Y) TAC, TAT Valina (Val, V) GTA, GTC, GTG, GTT Señal de terminación (Fin) TAA, TAG, TGA Una característica importante y bien conocida del código genético es su redundancia, por lo que, para la mayoría de los aminoácidos utilizados para formar proteínas, se puede emplear más que un triplete de nucleótidos codificadores (ilustrado arriba) . Por consiguiente, numerosas secuencias de nucleótidos diferentes pueden codificar para una secuencia de aminoácidos dada. Tales secuencia de nucleótidos se consideran funcionalmente equivalentes puesto que resultan en la producción de la misma secuencia de aminoácidos en todos los organismos (aun cuando ciertos organismos pueden traducir ciertas secuencias de manera más eficiente que otros) . Además, ocasionalmente, una variante metilada de una purina o pirimidina puede encontrarse en una secuencia de nucleótidos dada. Tales metilaciones no afectan la relación de codificación entre el codón de trinucleótido y el aminoácido correspondiente . Tomando en cuenta lo anterior, la secuencia de nucleótidos de una molécula de ADN o ARN que codifica para un polipéptido de B7-4 o PD-l de la invención (o bien cualquier porción del mismo) puede utilizarse para derivar la secuencia de aminoácidos de B7-4 o PD-l, utilizando el código genético para traducir la molécula de ADN o ARN en una secuencia de aminoácidos. De la misma manera, para cualquier secuencia de aminoácidos de B7-4 o PD-l, secuencia de nucleótidos correspondientes que pueden codificar proteínas de B7-4 o PD- 1 pueden ser deducidas del código genético (debido a su redundancia, esto producirá numerosas secuencias de ácidos nucleicos para cualquier secuencia de aminoácidos dada) . Así, la descripción y/o divulgación aquí de una secuencia de nucleótidos de B7-4 o PD-l debe considerarse como incluyendo también la descripción y/o divulgación de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos. De manera similar, una descripción y/o divulgación de secuencia de aminoácido de B7-4 o PD-l debe considerarse que incluye también la descripción y/o divulgación ce todas las' secuencias posibles de nucleótidos que pueden codificar la secuencia de aminoácidos. II. Moléculas de ácido nucleico aisladas En una modalidad, agentes de modulación para su uso en los métodos reclamados comprenden moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican proteínas de B7-4 o PD-l o bien porciones biológicamente activas de las mismas. Fragmentos de ácido nucleico suficientes para su uso como sondas de hibridación para identificar ácidos nucleicos que codifican B7-4 o PD-l (por ejemplo, ARNm de B7-4 o PD-l) y fragmentos para su uso como cebadores de reacción en cadena de polimerasa para la amplificación o mutación de moléculas de ácido nucleico de B7-4 o PD-l se proporcionan también. Como se emplea aquí, el término "molécula de ácido nucleico" incluye moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o bien ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o ARN generado empleando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser de cadena única o bien de cadena doble, pero se prefiere el ADN de cadena doble. Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula que es separada de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural de la molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, en cuanto al ADN genómico, el término "aislado" incluye moléculas de ácido nucleico separadas del cromosoma con el cual el ADN genómico está asociado naturalmente. De preferencia, una molécula de ácido nucleico "aislada" no tiene secuencias que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico (es decir, secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo a partir del cual se deriva la molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, en varias modalidades, la molécula de ácido nucleico de B7-4 o PD-l aislada puede contener menos que aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb o 0.1 kb de las secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula a partir de la cual se deriva el ácido nucleico. Además, una molécula de ácido nucleico ÍA AÁ- .Á i*¿ -jM í£?-*,ímÍ?t**': -. - i.-.-u, ^-^.-a-j-.a--—•---*•--—«.~»--~--r.fig- *. "aislada", como por ejemplo la molécula de ADNc, puede estar sustancialmente libre de otro material molecular, o bien medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o bien sustancialmente libre de precursores químicos o bien otros químicos cuando se sintetiza químicamente. Una molécula de ácido nucleico de B7-4 o PD-l "aislada" puede sin embargo estar unida a otra secuencia de nucleótidos que no flanquean normalmente las secuencias de B7-4 o PD-l en el ADN genómico (por ejemplo, las secuencias de nucleótidos de B7-4 o PD-l pueden estar unidas a secuencias de vector) . En ciertas modalidades preferidas, una molécula de ácido nucleico "aislada", como por ejemplo una molécula de ADNc, puede también estar libre de otro material celular. Sin embargo, no es necesario que la molécula de ácido nucleico de B7-4 o PD-l esté libre de otro material celular para que se considere como "aislada" (por ejemplo, una molécula de ADN de B7-4 o PD-l separada de otro ADN de mamífero e insertada en una célula bacteriana se consideraría todavía como "aislada") . Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 3, 10 o bien 11 o una porción de la misma, puede ser aislada utilizando técnicas de biología molecular estándares y la información de secuencia proporcionada aquí. Por ejemplo, utilizando la totalidad o una porción de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 3, 10 o bien 11, como sonda de hibridación, moléculas de ácido nucleico de B7-4 o PD-l pueden ser aisladas empleando técnicas estándares de hibridación y clonación (por ejemplo, de conformidad con lo descrito en Sambrook, J. et al . Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2da . edición, Cold Spring Harbor Labora tory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989) . Además, una molécula de ácido nucleico que abarca la totalidad o una parte de SEQ ID NO: 1, 3, 10, o bien 11 puede ser aislada por la reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando cebadores de oligonucleótidos sintéticos diseñados con base en la secuencia de SEQ ID NO: 1, 3, 10, o bien 11, respectivamente . Un ácido nucleico de la presente invención puede ser amplificado empleando ADNc, ARNm o bien alternativamente, ADN genómico, como templado e cebadores de oligonucleótidos apropiados de conformidad con técnicas de amplificación por reacción en cadena de polimerasa estándares. El ácido nucleico amplificado de esta forma puede ser clonado en un vector apropiado y caracterizado por análisis de secuencias de ADN. Además, oligonucleótidos que corresponden a secuencias de nucleótidos de B7-4 o PD-l pueden ser preparados por técnicas sintéticas estándares, por ejemplo, utilizando un sintetizador automático de ADN.

En una modalidad preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1, 3, 10, o bien 11. En otra modalidad preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención comprende una molécula de ácido nucleico que es un complemento de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1, 3, 10, o bien 11, o una porción de cualesquiera de estas secuencias de nucleótidos. Una molécula de ácido nucleico que es complementaria de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1, 3, 10 o bien 11, es una molécula que es suficientemente complementaria con la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1, 3, 10 o bien 11, respectivamente, de tal manera que puede hibridarse con la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1, 3, 10 o bien 11, respectivamente, formando de esta manera un dúplex estable. En otra modalidad preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención comprende una secuencia de nucleótidos que presenta un nivel de homología de por lo menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o más con la secuencia de nucleótidos, (por ejemplo, con la longitud entera de la secuencia de nucleótidos) mostrada en SEQ ID NO: 1, 3, 10, o bien 11, o una porción de cualesquiera de estas secuencias de nucleótidos .

A.-t- á .i.a AiJflt^it.-a.M .h.

Además, la molécula de ácido nucleico de la presente invención puede comprender solamente una porción de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 3, 10 o bien 11, por ejemplo, un fragmento que puede ser utilizado como una sonda o cebador o un fragmento que codifica una porción biológicamente activa de una proteína de B7-4 o PD-l. La secuencia de nucleótidos determinada a partir de la clonación de los genes de B7-4 o PD-l permite la generación de sondas e cebadores diseñados para utilizarse en la identificación y/o clonación de otros miembros de la familia B7-4 o PD-l, así como homólogos de la familia B7-4 o PD-l de otras especies. La sonda/el cebador comprende típicamente un oligonucleótido sustancialmente purificado. El oligonucleótido comprende típicamente una región de secuencia de nucleótidos que se híbrida en condiciones estrictas con por lo menos aproximadamente 12 o 15, de preferencia aproximadamente 20 0 25, con mayor preferencia aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, o bien 75 nucleótidos consecutivos en una secuencia de sentido de SEQ ID NO: 1, 3, 10 o bien 11, o una variante alélica que ocurre naturalmente o un mutante de SEQ ID NO: 1, 3, 10 o bien 11. En una modalidad ejemplar, una molécula de ácido nucleico de la presente invención comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, o bien 800 nucleótidos de longitud y se híbrida, en condiciones de hibridación estrictas, con una molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 3, 10 o bien 11. En otra modalidad, una segunda molécula de ácido nucleico comprende por lo menos aproximadamente 500, 600, 700, 800, 900, o bien 1000 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 1, 3, 10 o bien 11, . En una modalidad, una molécula de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, para unir con una sonda, no incluye la porción de SEQ ID NO: 1 de aproximadamente el nucleótido 815 hasta aproximadamente el nucleótido 850 de SEQ ID NO: l o bien de aproximadamente el nucleótido 320 hasta aproximadamente el nucleótido 856 de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico de la presente invención no incluye la porción de SEQ ID NO: 3 desde aproximadamente el nucleótido 314 hasta aproximadamente el nucleótido 734, o bien de aproximadamente el nucleótido 835 hasta aproximadamente el nucleótido 860, o bien de aproximadamente el nucleótido 1085 hasta aproximadamente el nucleótido 1014 o bien del nucleótido aproximadamente 1286 al nucleótido aproximadamente 1536 de SEQ ID NO: 3. En una modalidad, una molécula de ácido nucleico de la presente invención comprende por lo menos aproximadamente 500 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3. En una modalidad preferida, una molécula de ácido nucleico de la presente invención comprende por lo menos aproximadamente ^^^^^^ l^-t- ^.J---.-J-^.....^>,.. .tí.? ^.^t^^A*^»i^^^fe-^afei-a-^-s- a^-_. 600, por lo menos aproximadamente 700, por lo menos aproximadamente 800, por lo menos aproximadamente 900 o por lo menos aproximadamente 950 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 1, o bien aproximadamente 1000 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 3. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico de la presente invención comprende por lo menos aproximadamente 1500 o 1550 nucleótidos de SEQ ID NO: 3. De preferencia, una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención comprende por lo menos una porción de la región codificadora de SEQ ID NO: 1 (mostrada en los nucleótidos 59-793) o SEQ ID NO: 3 (mostrada en los nucleótidos 53-922) . En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico de B7-4 comprende de aproximadamente el nucleótido 1 hasta aproximadamente el nucleótido 319 de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico de B7-4 comprende de aproximadamente el nucleótido 855 hasta aproximadamente el nucleótido 968 de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico de B7-4 comprende de aproximadamente el nucleótido 1 a aproximadamente el nucleótico 314 de SEQ ID NO: 3. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico de B7-4 comprende de aproximacamente el nucleótido 955 hasta aproximadamente el nucleótico 1285 de SEQ ID NO: 3. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico de B7-4 comprende del nucleótido 1535 hasta aproximadamente el nucleótido 1552 de SEQ ID NO: 3. En otras modalidades, una molécula de ácido nucleico de la presente invención tiene una identidad de por lo menos el 70%, con mayor preferencia una identidad de por lo menos el 80%, y con preferencia aun mayor una identidad de por lo menos el 90% con una molécula de ácido nucleico que comprende: por lo menos aproximadamente 500, por lo menos aproximadamente 600, por lo menos aproximadamente 700, por lo menos aproximadamente 800, por lo menos aproximadamente 900, o por lo menos aproximadamente 1000 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3. Sondas basadas en las secuencias de nucleótidos de B7-4 o PD- 1 pueden ser empleadas para detectar transcritos o secuencias genómicas que codifican las mismas proteínas o proteínas homologas. ?n modalidades preferidas, la sonda comprende además un gr_po de etiqueta fijado ahí, por ejemplo, el grupo de etiqueta puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un co-factor de enzima. Tales sondas pueden utilizarse como parte de un conjunto de elementos de prueba de diagnóstico para identificar células o tejidos que expresan de manera errónea una proteína de B7-4 o PD-l, como por ejemplo mediante la medición del nivel de ácido nucleico que codifica B7-4 o PD-l en una muestra de células a partir de un sujeto, por ejemplo, detectando los niveles de A? m de B7-4 o PD-l o bien determinando si un gen de B7-4 o PD-l genómico ha presentado una ßutación o ha sido removido . Un fragmento de ácido nucleico que codifica una "porción biológicamente activa de una proteína de B7-4 o PD-l" puede prepararse mediante el aislamiento de una porción de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 3, 10 o bien 11 que codifica un polipéptido que tiene una actividad biológica de B7-4 o PD-l (las actividades biológicas de las proteínas (B7- 4 o PD-l se describen aquí), expresando la porción codificada de la proteína de B7-4 o PD-l (por ejemplo, por expresión recombinante in vi tro) y evaluando la actividad de la porción codificada de la proteína de B7-4 o PD-l. Moléculas de ácido nucleico que difieren de SEQ ID NO: 1, 3, 10 o bien 11 debido a degeneración del código genético y por consiguiente codifican la misma proteína de B7-4, PD-l que la proteína codificada por SEQ ID NO: 1, 3, 10 o bien 11, se encuentran dentro del marco de la presente invención. Por consiguiente, en otra modalidad, una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, 4, o bien 12. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de B7-4 o PD-l. Además de las secuencias de nucleótidos de B7-4 o PD-l mostradas en SEQ ID NO: 1, 3, 10 o bien 11, los expertos en la materia observaron que polimorfismos de secuencias de ADN que provocan cambios en las secuencias de aminoácidos de las proteínas de B7-4 o bien PD-l pueden existir dentro de una población (por ejemplo, la población humana) . Dicho polimorfismo genético en los genes de B7-4 o PD-l puede existir entre individuos dentro de una población debido a una variación alélica natural. Como se emplea aquí, los términos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que incluyen un marco abierto de lectura que codifica una proteína de B7-4 o PD-l, de preferencia una proteína de B7-4 o PD-l de mamífero, y puede incluir además secuencias reguladoras no codificadoras, e intrones. Tales variaciones alélicas naturales incluyen tanto proteínas de B7-4 o PD-l funcionales como no funcionales y pueden resultar típicamente en una variación de 1-5% en la secuencia de nucleótidos de un gen de B7-4 o PD-l. Tales variaciones de nucleótidos y polimorfismos resultantes de aminoácidos en genes de B7-4 o PD-l que son el resultado de una variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional de una proteína de B7-4 o PD-l se contemplan dentro del alcance de la presente invención. Además, moléculas de ácido nucleico que codifican otros miembros de la familia de B7-4 o PD-l y, por consiguiente, que tienen una secuencia de nucleótidos que difiere de las secuencias de la familia de B7-4 o PD-lde SEQ ID NO: 1, 3, 10 o bien 11 se contemplan dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, otro ADNc de B7-4 o PD-l puede ser identificado con base en la secuencia de nucleótidos de B7-4 o PD-l de ser humano. Además, moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de B7-4 o PD-l de diferentes especies y por consiguiente que tienen una secuencia de nucleótidos que difiere de las secuencias de B7-4 o PD-l de SEQ ID NO: 1, 3, 10 o bien 11 se contemplan dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, un ADNc de B7-4 o PD-l de ratón puede ser identificado con base en la secuencia de nucleótidos de una molécula de B7-4 o PD-l de ser humano. Moléculas de ácido nucleico que corresponden a variantes alélicas naturales y homólogos de los ADNc de B7-4 o PD-l de la presente invención pueden ser aisladas con base en su homología con los ácidos nucleicos de B7-4 o PD-l divulgados aquí utilizando los ADNc divulgados aquí o bien una porción de los mismos, como una sonda de hibridación de conformidad con técnicas estándares de hibridación. Por ejemplo, un ADN de B7-4 o PD-l puede ser aislado de una biblioteca de ADN genómico humano utilizando la totalidad o una porción de SEQ ID NO: 1, 3, 10 o bien 11 como una sonda de hibridación y técnicas estándares de hibridación (por ejemplo, de conformidad ccn lo descrito en Sambrook, J., et al . Molecular Cl oning: A Labora tory Manual , 2 da . edición, Cold Spring MJ-Mb tÍ-JÍ--l- I-Í<MM-uJlMi?uj.j¿—K.»» - « ».n.?. ¿,¿.j,-.ái?-.-fcta..»...-jataít£..- f;..*.^'.!-A ih!tj|< Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989) . Además, una molécula de ácido nucleico que abarca la totalidad o una porción de un gen de B7-4 o PD-l puede ser aislada por la reacción en cadena de polimerasa utilizando cebadores de oligonucleótidos diseñados con base en la secuencia de SEQ ID NO: 1, 3, 10 o bien 11. Por ejemplo, se puede aislar ARNm a partir de células (por ejemplo, mediante el procedimiento de extracción de tiocianato de guanidio de Chirgwin et al., (1979) Bi ochemi stry 18:5294-5299) y el ADNc puede ser preparado empleando transcriptasa reversa (por ejemplo, transcriptasa reversa Moloney MLV, disponible en Gibco/BRL, Bethesda, MD; o bien transcriptasa reversa AMV (disponible en Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL) . Sintéticos de oligonucleótidos para amplificación por reacción en cadena de polimerasa pueden ser diseñados con base en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1, 3, 10 o bien 11. Una molécula de ácido nucleico de la presente invención puede ser amplificada utilizando ADNc, o bien, alternativamente, ADN genómico, como templado, e cebadores de oligonucleótidos apropiados de conformidad con técnicas estándares de amplificación por reacción en cadena de polimerasa. El ácido nucleico amplificado de esta forma puede ser clonado en un vector apropiado y caracterizado por análisis de secuencias de ADN. Además, oligonucleótidos correspondientes a una secuencia de nucleótidos de B7-4 o PD-l pueden prepararse por técnicas sintéticas estándares, por ejemplo, utilizando un sintetizador de ADN automatizado. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención tiene por lo menos 15, 20, 25, 30 o más nucleótidos de longitud y se híbrida en condiciones estrictas con la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 3, 10 o bien 11. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico tiene una longitud de por lo menos 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, o 600 nucleótidos. Como se emplea aquí, el término "se híbrida en condiciones estrictas" describe condiciones para hibridación y lavado en las cuales secuencias de nucleótidos que presentan una homología de por lo menos 30%, 40%, 50%, o 60% entre ellas permanecen típicamente hibridadas entre ellas. De preferencia, las condiciones son tales que secuencias que presentan una homología de por lo menos aproximadamente 70%, con mayor preferencia por lo menos aproximadamente 80%, con preferencia aun mayor, por lo menos aproximadamente 85% o 90% entre ellas permanecen típicamente hibridadas entre ellas. Tales condiciones estrictas son conocidas de los expertos en la materia y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Un ejemplo preferido, no limitativo de condiciones de hibridación estrictas son hibridación en 6X cloruro de íi a 1 A-^Ate-^.--. -.«a*.*.... .-<*>. ^+*A*? áé¿ sodio/citrato de sodio (SSC) a una temperatura de aproximadamente 45° C, seguido por uno o varios lavados en 0.2 X SSC, SDS al 0.1% a una temperatura de 50-65° C. De preferencia, una molécula aislada de ácido nucleico de la presente invención que se híbrida en condiciones estrictas con la secuencia de SEQ ID NO: 1, 3, 10 o bien 11 corresponde a una molécula de ácido nucleico que ocurre naturalmente. Como se emplea aquí, una molécula de ácido "que ocurre naturalmente" se refiere a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que ocurre en la naturaleza (por ejemplo, que codifica una proteína natural). Además, de las secuencias de nucleótidos de B7-4 o PD-l mostradas en SEQ ID NO: 1, 3, 10 o bien 11, se debe observar por parte de los expertos en la materia que polimorfismos de secuencias de ADN que provocan cambios menores en las secuencias de nucleótidos o aminoácidos de una B7-4 o PD-l pueden existir dentro de una población. Dicho polimorfismo genético en un gen de B7-4 o PD-l puede existir entre individuos dentro de una población debido a variación alélica natural. Tales variaciones alélicas naturales pueden resultar típicamente en una variación de 1-2% en cuanto a la secuencia de nucleótidos del gen. Tales variaciones de nucleótidos y polimorfismos de aminoácidos resultantes en una B7-4 o PD-l que son el resultado de una variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional de un polipéptido de B7-4 o i &!!&**.*£ * ^^Á^¡¡^ PD-l se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Además de variantes alélicas que ocurren naturalmente de secuencias de B7-4 o PD-l que pueden existir en la población, la persona experta en la materia observará además que cambios menores pueden ser introducidos por mutación en secuencias de nucleótidos, por ejemplo, de SEQ ID NO: 1, 3, 10 o bien 11, provocando de esta forma cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada, sin alterar la actividad funcional de una proteína de B7-4 o PD-l. Por ejemplo, sustituciones de nucleótidos que provocan sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos "no esenciales" pueden efectuarse en la secuencia de SEQ ID NO: 1, 3, 10 o bien 11. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede ser alterado desde la secuencia de tipo silvestre de una molécula de ácido nucleico de B7-4 (por ejemplo, la secuencia de SEQ ID NO: 1, 3, 10 o bien 11) sin alterar la actividad funcional de una molécula de B7-4 o PD- 1. De preferencia, residuos en el dominio extracelular de B7- 4 o PD-l que son requeridos para unión de B7-4 con un receptor o PD-l con un ligando natural (por ejemplo, identificado mediante un tamiz de mutagenesis de exploración de alanina o bien otro ensayo de tamizado reconocido en la técnica) no son alterados. Para moléculas de B7-4, residuos ejemplares que no son esenciales y por consiguiente que se prestan a sustitución pueden ser identificados por una persona con conocimientos ordinarios en la materia efectuando un alineamiento de aminoácidos de miembros de la familia B7 (o bien miembros de la familia de B7-4) y determinar los residuos que no son conservados. Tales residuos, puesto que no han sido conservados, presentan una mayor probabilidad de prestarse a una sustitución. Por consiguiente, otro aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de B7-4 o PD-l que contienen cambios en residuos de aminoácidos y que no son esenciales para una actividad de B7-4 o PD-l. Tales proteínas de B7-4 o PD-l difieren en cuanto a secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, o bien 12 y sin embargo conservan una actividad de B7-4 inherente o bien, en el caso de PDl, conservan la capacidad de unirse a B7-4. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una variante no natural de una proteína de B7-4 o PD-l puede ser creada mediante la introducción de una o varias sustituciones, adiciones o remociones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 3, 10 o bien 11, de tal manera que se introduzca una o varias sustituciones, adiciones o remociones de aminoácidos en la proteína codificada. Mutaciones pueden ser introducidas en SEQ ID NO: 1, 3, 10 o bien 11 por técnicas estándares como por ejemplo mutagenesis dirigida a sitios y mutagenesis mediada por reacción en cadena de polimerasa. De preferencia, sustituciones conservadoras de aminoácidos se efectúan en uno o varios ' residuos de aminoácidos no esenciales. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es una sustitución en la cual el residuo de aminoácido es reemplazado por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica, e incluyen cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales acidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína) , cadenas laterales no polares 'por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas en posición beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) , y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) .

Así, un residuo de aminoácido no esencial en una B7-4 o PD-l es de preferencia reemplazado por otro residuo de aminoácido de la mis a familia de cadenas laterales. Alternativamente, en otra modalidad, mutaciones pueden ser introducidas de manera aleatoria en toda la secuencia codificadora de B7-4 o PD-l o en una parte de dicha secuencia, cerno por ejemplo mediante mutagénesis por --_rife ^i»£*3*i &?£m saturación, y los mutantes resultantes pueden ser tamizados para determinar su capacidad para unirse con ADN y/o activar la transcripción, para identificar mutantes que conservan una actividad funcional. Después de la mutagénesis, la proteína de B7-4 o PD-l mutante codificada puede ser expresada de manera recombinante en una célula huésped y la actividad funcional de la proteína mutante puede ser determinada empleando ensayos disponibles en la técnica para evaluar la actividad de B7-4 o PD-l. Por consiguiente, otro aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de B7-4 o PD-l que contienen cambios en residuos de aminoácidos que no son esenciales para la actividad. Otro aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican proteínas de fusión B7-4 o PD-l. Tales moléculas de ácido nucleico que comprenden por lo menos una primera secuencia de nucleótidos que codifica una proteína P7-4 o PD-l, polipéptido o péptido enlazado operativamente a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteína, polipéptido o péptido no B7-4 o PD-l, pueden prepararse por técnicas estándares de ADN recombinar.te . En una modalidad preferida, una proteína de B7- 4 mutante puede ser ensayada para la capacidad de: 1) coestimular (o bien inhibir la co-estimulación por ejemplo en forma soluble; la proliferación y/o función efectora de células inmunológicas activas; 2) unirse con un anticuerpo anti-familia B7 o anti-B7-4; y/o 3) unirse con un receptor natural o varios receptores naturales de B7-4 (por ejemplo, PD-l) . En una modalidad preferida, una proteína mutante de PD-l puede ser ensayada para determinar la capacidad de: 1) inhibir la co-estimulación (por ejemplo en forma soluble) de la proliferación y/o función efectora de células inmunológicas activadas; 2) unirse a un anticuerpo anti-PD-1; y/o 3) unirse a un ligando natural o a varios ligandos naturales de PD-l (por ejemplo, B7-4) . Además, de las moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de B7-4 o PD-l descritas arriba, moléculas de ácido nucleico aisladas que son de antisentido pueden emplearse - como agentes de modulación. Un ácido nucleico de "antisentido" comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria de un ácido nucleico de "sentido" que codifica una proteína como por ejemplo, complementaria de la cadena codificadora de una molécula de ADNc de cadena doble o bien complementaria de una secuencia de ARNm. Por consiguiente, un ácido nucleico de antisentido puede unir hidrógeno con un ácido nucleico de sentido. El ácido nucleico de antisentido puede ser complementario de una cadena codificadora de B7-4 o PD-l entera, o bien solamente de una porción de dicha cadena. En una rr.odaiidad, la molécula de ácido nucleico de antisentido es de antisentido con relación a una "región codificadora" de la cadena codificadora de una secuencia de nucleótidos que codifica B7-4 o PD-l. El término "región codificadora" se refiere a la región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones que son traducidos en residuos de aminoácidos. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico de antisentido es de antisentido con relación a una "región no codificadora" de la cadena codificadora de una secuencia de nucleótidos que codifica B7-4 o PD-l. El término "región no codificadora" se refiere a las secuencias 5' y 3' que flanquean la región codificadora que no son traducidas en aminoácidos (es decir, se conocen también como regiones no traducidas 5' y 3' ) . Dadas las secuencias de cadena codificadora que codifican B7-4 o PD-l divulgadas aquí, ácidos nucleicos de antisentido de la invención pueden ser diseñados de conformidad con las reglas de apareamiento de bases de Watson y Crick. La molécula de ácido nucleico de antisentido puede ser complementaria con relación a la región codificadora entera de ARNm de B7-4 o PD-l, pero con mayor preferencia es un oligonucleótido que es de antisentido solamente con relación a una parte de la región codificadora o no codificadora de ARNm de B7-4 o PD-l. Por ejemplo, el oligonucleótido de antisentido puede ser complementario de la región que rodea el sitio de inicio de traducción de ARNm de B7-4 o PD-l. Un -, ,l.l-,i-i¿l¿Í oligonucleótido de antisentido puede tener, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos ce longitud. Un ácido nucleico de antisentido de la presente invención puede construirse empleando reacciones de síntesis química y ligación enzimática empleando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido de antisentido) puede ser sintetizada químicamente utilizando nucleótidos que ocurren naturalmente o bien nucleótidos modificados de varias formas diseñados para incrementar la estabilidad biológica de las moléculas o bien para incrementar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos de antisentido y de sentido, por ejemplo, derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina pueden emplearse. Ejemplos de r.ucleótidos modificados que pueden ser utilizados para generar el ácido nucleico de antisentido incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitocina, 5- (carboxihidrcxilmetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2, 2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitocina, 5-metilcitccina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5- n-aa»- metilaminómetiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5' -metoxicarboximetiluracilo, 5- metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v) , wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitocina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metiléster de ácido uracil-5- oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v) , 5-metil-2- tiouracilo, 3- (3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w, y 2, 6-diaminopurina. Alternativamente, el ácido nucleico de antisentido puede ser producido biológicamente empleando un vector de expresión en donde un ácido nucleico ha sido subclonado en una orientación de antisentido (es decir, el ARN transcrito a partir del ácido nucleico insertado es de una orientación de antisentido con relación a un ácido nucleico blanco de interés, descrito con mayores detalles en la sección siguiente) . Las moléculas de ácido nucleico de antisentido de la invención son típicamente administradas a un sujeto o generadas in si tu de tal manera que puedan hibridarse o unirse con ARNm celular y/o ADN genómico que codifica una proteína de B7-4 o PD-l con el objeto de inhibir de esta forma la expresión de la proteína, por ejemplo, mediante la inhibición de la transcripción y/o traducción. La hibridación puede ser por complementaridad de nucleótidos convencional con el objeto de formar un dúplex estable, o bien, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico de antisentido que se une a dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en la hendidura mayor de la doble hélice. Un ejemplo de una vía de administración de moléculas de ácido nucleico de antisentido de la invención incluye la inyección directa en el sitio del tejido. Alternativamente, moléculas de ácido nucleico de antisentido pueden ser modificadas para enfocarse hacia células seleccionadas y después administrarse sistémicamente. Por ejemplo, para una administración sistémica, moléculas de antisentido pueden ser modificadas de tal manera que se unan específicamente a receptores o antígenos expresados en una superficie de células seleccionada, por ejemplo, por unión de las moléculas de ácido nucleico de antisentido con péptidos o anticuerpos que se unen a receptores de superficie celular o antígenos. Las moléculas de ácido nucleico de antisentido pueden también ser administradas a células utilizando los vectores descritos aquí. Para lograr concentraciones intracelulares suficientes de las moléculas de antisentido, constructos de vector en donde la molécula de ácido nucleico de antisentido es colocada bajo el control de un promotor pol II o pol III fuerte se prefieren. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico de antisentido de la invención es una molécula de ácido nucleico a-anomérica. La molécula de ácido nucleico a-anomérica forma híbridos específicos de doble cadena con ARN complementario en donde, a diferencia de las unidades ß habituales, las cadenas son paralelas entre ellas (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids . Res . 15:6625-6641). La molécula de ácido nucleico de antisentido puede también comprender un 2'-o- metilribonucleótido (Inoue et al. (1987) N?cleic Acids Res . 15:6131-6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue et al. (1987) FEBS Lett . 215:327-330). En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico de antisentido de la invención es una ribozima. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas con actividad ribonucleasa que pueden disociar una molécula de ácido nucleico de cadena única, como por ejemplo un ARNm, con la cual tienen una región complementaria. Así, ribozimas (por ejemplo, ribozimas de cabeza de martillo (descritas en Haseloff y Gerlach (1988) Na ture 334:585-591)) pueden emplearse para disociar catalíticamente transcriptos de ARNm de B7-4 o PD-l con el objeto de inhibir de esta forma la traducción de ARNm de B7-4 o PD-l. Una ribozima que tiene especialidad para un ácido nucleico que codifica B7-4 o PD-l puede ser diseñada con base en la secuencia de nucleótidos de un ADNc de B7-4 o PD-l divulgado aquí (por ejemplo, SEQ ID NO: 1, 3, 10 o bien 11) . Por ejemplo, un derivado de ARN de L-19 IVS de Tetrahymena puede ser construido en el cual la secuencia de nucleótidos del sitio activo es complementaria a la secuencia de nucleótidos a disociar en un ARNm que codifica B7-4 o PD-l. Véase, por ejemplo, Cech et al., Patente Norteamericana No. 4,987,071; y Cech et al., Patente Norteamericana No. 5,116,742. Alternativamente, se puede utilizar el ARNm de B7- 4 o PD-l para seleccionar un ARN catalítico que tiene una actividad ribonucleasa específica a partir de un conjunto de moléculas de ARN. Véase, por ejemplo, Bartel, D. y Szostak, J.W. (1993) Science 261:1411-1418. Alternativamente, la expresión de genes de B7-4 o PD-l puede ser inhibida mediante el enfoque de secuencias de nucleótidos complementarias de la región reguladora de B7-4 o PD-l (por ejemplo, el promotor y/o realzador de B7-4 o PD-l) con el objeto de formar estructura helicoidales triples que impiden la transcripción del gen de B7-4 o PD-l en células blanco. Véase, en términos generales, Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des . 6(6): 569-84; Helene, C. et al. (1992) Ann . N. Y. Acad. Sci . 660:27-36; y Maher, L.J. (1992) Bioessays 14 (12)807-15. En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico de B7-4 o PD-l de la presente invención pueden ser modificadas en la porción de base, porción de azúcar, o estructura de fosfato para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, hibridación, o solubilidad de la molécula. Por ejemplo, la estructura de fosfato de desoxiribosa de las moléculas de ácido nucleico puede ser modificada con el objeto de generar ácidos nucleicos de péptidos (véase, Hyrup, B. y Nielsen, P.E. (1996) Bioorg. Med. Chem. 4(l):5-23). Como se emplea aquí, los términos "ácidos nucleicos de péptidos" o bien "PNAs" se refieren a mímicas de ácido nucleico, por ejemplo, mímicas de ADN, en donde la estructura de fosfato de desoxiribosa es reemplazada por una estructura de pseudopéptido y solamente las cuatro nucleobases naturales se conservan. La estructura neutral de PNAs permite una hibridación específica de ADN y ARN en condiciones de baja fuerza iónica. La síntesis de oligómeros de PNA puede ser efectuada empleando protocolos estándares de síntesis de péptidos en fase sólida de conformidad con lo descrito en Hyrup y Nielsen (1996) supra y Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 93:14670-675. Los PNAs de moléculas de ácido nucleico de B7-4 o PD-l pueden emplearse en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Por ejemplo, PNAs pueden emplearse como agentes de antisentido o antigénico para modulación específica de secuencias de expresión de gen, mediante, por ejemplo, la inducción de suspensión de transcripción o traducción o bien inhibición de replicación. Los PNAs de moléculas de ácido nucleico de B7-4 o PD-l pueden también ser utilizados en el análisis de mutaciones de pares de bases individuales en un gen (por ejemplo, mediante fijación por reacción en cadena de polimerasa dirigida hacia PNA) ; como "enzimas de restricción artificiales" cuando se utilizan en combinación con otras enzimas (por ejemplo, SI nucleasas (Hyrup y Nielsen (1996) supra) ) ; o bien como sondas o cebadores para secuenciamiento de ADN o hibridación (Hyrup B. y Nielsen (1996) supra; Perry-0' Keefe et al. (1996) supra) . En otra modalidad, PNAs de B7-4 o PD-l pueden ser modificados (por ejemplo, para incrementar la estabilidad o la absorción celular) , mediante la fijación de grupos auxiliares lipofílicos o bien de otros tipos PNA, mediante la formación de quimeras PNA-ADN, o bien mediante el uso de liposomas u otras técnicas de administración de fármaco conocidas. Por ejemplo, quimeras de PNA-ADN de moléculas de ácido nucleico de B7-4 o PD-l pueden ser generadas las cuales pueden combinar las propiedades provechosas de PNA y de ADN. Tales quimeras permiten que enzimas de reconocimiento de ADN (por ejemplo RNAsa H y ADN polimerasas) interactúen con la porción de ADN mientras que la porción de PNA proporciona una alta afinidad de unión y especificidad. Quimeras de PNA-ADN pueden estar unidas empleando enlazadores de longitudes apropiadas seleccionados en términos de apilamiento de bases, números de uniones entra las nucleobases y orientación (Hyrup B. y Nielsen (1996) supra ) . La síntesis de quimeras PNA-ADN puede efectuarse de conformidad con lo descrito en Hyrup B. And Nielsen (1996) supra y Finn P. J. et al. (1996) Nucleic Acids Res . 24 (17) :3357-63. Por ejemplo, una cadena de ADN puede ser sintetizada en un soporte sólido empleando química de acoplamiento de fosforamidita estándar. Análogos de nucleocitcs modificados, (por ejemplo, 5'-(4-metoxitritil) amino-5'-desoxi-timidinfosforamidita) , pueden utilizarse como enlazador entre PNA y el extremo 5' de ADN {Mag. et al. (1989) Nucleic Acid Res . 17:5973-88). Monómeros de PNA son después acoplados de manera escalonada con el objeto de producir una molécula quimérica con un segmento de PNA de 5' y un segmento de ADN de 3' (Finn P. J. et al. (1996) supra) . Alternativamente, moléculas quiméricas pueden ser sintetizadas con un segmento de ADN de 5' y un segmento de PNA de 3' (Petersen, K.H. et al. (1975) Bioorganic Med. Chem. Let t . 5:1119-1124) . En otras modalidades, el oligonucleótido puede incluir otros grupos adjuntados tales como péptidos (por ejemplo, para enfocar receptores de células huésped in vivo) , o bien agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular (véase, por ejemplo, Letsinger et al. (1989) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 86:6553:6565; Lemaitre et al. (1987) Proc . Nati . Acad Sci . USA 84:648-652; Publicación PCT No. W088/09811) o bien la barrera hematoencefálica (véase, por ejemplo, Publicación PCT No. W089/10134) . Además, oligonucleóticos pueden ser modificados con agentes de disociación activados por hibridación (véase, por ejemplo, Krol et al. (1388) Biotechniques 6:958-976 o bien agentes de intercalación (véase, por ej emplo, Zon (1988) Pharm. Res. 5 : 539-549) . Para este propósito, el oligonucleótido puede estar conjugado con otra molécula (por ejemplo, un péptido, agente de reticulación activado por hibridación, agente de transporte, o bien agente de disociación activado por hibridación) . III. Proteinas de B7-4 o PD-l aisladas y anticuerpos anti-B7-4 o PD-l Además, proteínas de B7-4 o PD-l aisladas así como porciones biológicamente activas de las mismas, así como anticuerpos anti-B7-4 o PD-l puede emplearse como agentes de modulación. En una modalidad, proteínas de B7-4 o PD-l nativas pueden ser aisladas de células o fuentes de tejido a través de un esquema de purificación apropiado utilizando técnicas estándares de purificación de proteína. En otra modalidad, proteínas de B7-4 o PD-l son producidas mediante técnicas de ADN recombinante. De manera alternativa a la expresión recombinante, una proteína o polipéptido de B7-4 o PD-l puede ser sintetizado químicamente empleando técnicas estándares de síntesis de péptidos. Otro aspecto de la invención se refiere a proteínas de B7-4 o PD-l aisladas, de preferencia, las proteínas de B7-4 o PD-l comprenden una secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 1, 3, 10 o 11. En otra modalidad preferida, la proteína comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4 O ßt.í£ t.Á,A*A±Á-*.-Í?-í' J -Í .-t.-faananA..-»-» .-^»¿- - ... - i * *..*. -.- . :*. :..:* -***lí j.* --*.. ,-.i*-**L:±* 12. En otras modalidades, la proteína tiene una identidad de aminoácidos de por lo menos 50%, por lo menos 60%, con mayor preferencia tiene una identidad de aminoácidos de por lo menos 70%, con mayor preferencia 80% y especialmente tiene una identidad de aminoácidos de 90% o 95% con la secuencia de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 2, 4, o 12. En otras modalidades, la invención ofrece porciones aisladas de una proteína de B7-4 o PD-l. Por ejemplo, proteínas de B7-4 comprenden una secuencia de señales, y un dominio de IgV y IgC. La secuencia de señal de SEQ ID NO: 2 se muestra desde aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 18. La secuencia de señal de SEQ ID NO: 4 se muestra desde aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 18. El dominio de igV de SEQ ID NO: 2 se muestra desde aproximadamente el aminoácido 19 hasta aproximadamente el aminoácido 134 y el dominio de IgV de SEQ ID NO: 4 se muestra desde aproximadamente el aminoácido 19 hasta aproximadamente el aminoácido 134. El dominio de IgC de SEQ ID NO: 2 se muestra desde aproximadamente el aminoácido 135 hasta aproximadamente el aminoácido 227 y el dominio de IgC de SEQ ID NO: 4 se muestra desde aproximadamente el aminoácido 135 hasta aproximadamente el aminoácido 227. La cola hidrofílica de la molécula B7-4 ejemplificada en SEQ ID NO: 2 comprende una cola hídrofílica mostrada desde aproximadamente el aminoácido 228 hasta aproximadamente el aminoácido 245. El polipéptido de B7-4 ejemplificada en SEQ ID NO : 4 comprende un dominio de transmembrana mostrado desde aproximadamente el aminoácido 239 hasta aproximadamente el aminoácido 259 de SEQ ID NO : 4 y un dominio citoplásmico mostrado desde aproximadamente el aminoácido 260 hasta aproximadamente el aminoácido 290 de SEQ ID NO: 4. El polipéptido de PD-l tiene una longitud de 288 aminoácidos y su estructura de dominio es conocida en la técnica (Shinohara et al . ( 1994 ) Genomics 23 : 704) . La forma madura predicha de la proteína contiene aproximadamente 268 aminoácidos y comprende un dominio extracelular ( 147 aminoácidos) , un dominio de transmembrana (27 aminoácidos) una región de transmembrana (27 aminoácidos) y un dominio citoplásmico ( 94 aminoácidos) . Cuatro sitios potenciales de N-glicosilación se encuentran en el dominio extracelular ( Patente norteamericana 5, 698 , 520) . Los 68 residuos de aminoácidos entre dos residuos de cisteína (cys 54 y cys 123 / se parecen a un dominio de inmunoglobulina unido a disul furo de las secuencias de grupo V ( Patente norteamericana 5, 698 , 520 ) . La presente invención ser refiere a formas solubles de proteínas de B7-4 o PD-l . Tales formas pueden ocurrir naturalmente, como por ej emplo, como se muestra en SEQ ID NO: 2 o bien pueden ser manipuladas y pueden comprender, como por ej emplo, un dominio extracelular de una proteína de B7- 4 c PD-l. Dominios extracelulares de B7-4 ejemplares comprenden de aproximadamente los aminoácidos 19-238 de SEQ ID NO: 4. Dominios extracelulares ejemplares de PD-l comprenden los aminoácidos 21-288 de SEQ ID NO: 12. En una modalidad, el dominio extracelular de un polipéptido de B7-4 comprende la forma madura de un polipéptido de B7-4, como por ejemplo, los dominios de IgV e IgC, pero no los dominios de transmembrana ni citoplásmico de un polipéptido de B7-4 (por ejemplo, desde aproximadamente el aminoácido 19 hasta el aminoácido 238 de SEQ ID NO: 4) o bien desde aproximadamente el aminoácido 19 hasta el aminoácido 245 de SEQ ID NO: 2. En una modalidad, el dominio extracelular de un polipéptido de PD-l comprende la forma madura de un polipéptido de PD-l, por ejemplo, dominios de superfamilia de inmunoglobulina (por ejemplo, secuencias de conjunto V), pero no los dominios de transmembrana ni citoplásmicos de un polipéptido PD-l (por ejemplo, desde aproximadamente aminoácidos 21-288 de SEQ ID NO: 12) . Porciones biológicamente activas de una proteína de B7-4 o PD-l incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente homologas con la secuencia de aminoácidos de la proteína de B7-4 o PD-l o bien derivadas de dicha prcteína, que incluyen menos aminoácidos que las proteínas de 37-4 o PD-l de longitud completa y muestran por lo menos una actividad de una proteína de B7-4 o PD-l, de preferencia la capacidad de unirse a un socio de unión natural. Típicamente, porciones biológicamente activas comprenden un dominio o motivo con por lo menos una actividad de la proteína de B7-4 o PD-l. Una porción biológicamente activa de una proteína de B7-4 o PD-l puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, por lo menos 10, 25, 50, 100, 150, 200 o más aminoácidos de longitud. Para determinar la identidad porcentual de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias son alineadas para propósitos de comparación óptima (por ejemplo, espacios pueden ser introducidos en una secuencia o en ambas secuencias de una primera y de una segunda secuencias de aminoácido o ácido nucleico para alineamiento óptimo y secuencias no homologas pueden ser desechadas para propósitos de comparación) . En una modalidad preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada para propósitos de comparación por lo menos 30%, con preferencia por lo menos 40%, con mayor preferencia por lo menos 50%, con preferencia aún mayor por lo menos 60%, y con preferencia todavía mayor por lo menos 70%, 80%, o 90% de la longitud de la secuencia de referencia. Los residuos en las posiciones correspondientes son después comparados y cuando una posición en una secuencia es ocupada por el mismo residuo en la posición correspondiente en la otra secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esta posición. La identidad porcentual entre dos secuencias, por consiguiente, depende del número de posiciones idénticas compartidas por dos secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones x 100) . La identidad porcentual entre las dos secuencias depende del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, tomando en cuenta el número de espacios, y la longitud de cada espacio, que deben ser introducidos para alineamiento óptimo de las dos secuencias. Como se emplea aquí, la "identidad" de aminoácidos o ácido nucleico es equivalente a "homología" de aminoácidos o ácido nucleico. La comparación de secuencias y determinación de la identidad porcentual entre dos secuencias puede lograrse empleando una algoritmo matemático. En una modalidad preferida, la identidad porcentual entre dos secuencias de aminoácidos es determinada empleando el programa GAP en el paquete de programática GCG (disponible en http://www.gcg.com) , empleando ya sea una matriz Blosum62 o bien una matriz PAM 250, y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o bien 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o bien 6. En otra modalidad preferida, la identidad porcentual entre dos secuencias de nucleótidos es determinada empleando el programa GAP en el paquete de programática GCG (disponible en http: //www, gcg. com) , empleando una matriz NWSgapdna CMP y un j^ m¿^^^ &&AÉ peso de espacio de 40, 50, 60, 70, 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o bien 6. Las secuencias de ácidos nucleicos y proteína de la presenté invención pueden emplearse adicionalmente como una "secuencia de investigación" para efectuar una búsqueda en base de datos pública, por ejemplo para identificar otros miembros de familia o bien secuencias relacionadas. Tales búsquedas pueden efectuarse empleando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul et al. (1990) J. Mol . Biol . 215:403-10. Búsquedas de nucleótidos BLAST pueden efectuarse con el programa NBLAST, resultado = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homologas a moléculas de ácido nucleico de B7-4 o PD-l de la invención. Búsquedas de proteína con BLAST pueden efectuarse con el programa XBLAST resultado = 50, longitud de palabra = 3 con el objeto de obtener secuencias de aminoácidos homologas a moléculas de proteína de B7-4 o PD-l de la invención. Para obtener alineamientos con espacios para propósitos de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST de conformidad con lo descrito en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res . 25 (17) :3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, los parámetros por omisión de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) pueden emplearse. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos de la invención fueron analizadas empleando la matriz Blastn por omisión 1-3 - »^-£- con penalidades de espacio establecidas de la siguiente manera: existencia 11 y extensión 1. Las secuencias de amino ácidos de la presente invención fueron analizadas empleando los ajustes por omisión: la matriz Blosum 62 con penalidades por espacio establecidas en existencia 11 y extensión 1. Véase http://ncbi .nim.nih.gov. La invención proporciona también proteínas de B7-4 o PD-l quiméricas o de fusión. Como se emplea aquí, una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" B7-4 o PD-l comprende un polipéptido de B7-4 o PD-l unido operativamente a un polipéptido no B7-4 o PD-l. Un "polipéptido B7-4 o PD-l" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a un polipéptido de B7-4 o PD-l, mientras que un "polipéptido no-B7-4 o PD-l" ser refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a una proteína que no es sustancialmente homologa con la proteína de B7-4 o PD-l como por ejemplo, una proteína que es diferente de la proteína de B7-4 o PD-l y que es derivada del mismo organismo o de un organismo diferente. Dentro de una proteína de fusión B7-4 o PD-l, el polipéptido de B7-4 o PD-l puede corresponder a la totalidad de una proteína de B7-4 o PD-l o bien a una porción de la misma. En una modalidad preferida, una proteína de fusión de B7-4 o PD- 1 comprende por lo menos una porción biológicamente activa de una proteína de B7-4 o PD-l como por ejemplo, un dominio extracelular de una proteína de B7-4 o PD-l. Dentro de la proteína de fusión, el término "operativamente enlazada* tiene el propósito de indicar que el polipéptido B7-4 o PD-l y el polipéptido no-B7-4 o PD-l están fusionados en marco entre ellos. El polipéptido no-B7-4 o PD-l puede estar fusionado con la N-terminal o C-terminal del polipéptido de B7-4 o PD-l. Por ejemplo, en una modalidad, la proteína de fusión es una proteína de fusión GST-B7-4 o GST-PD-1 en donde las secuencias de B7-4 o PD-l están fusionadas en la C-terminal de las secuencias GST. En otra modalidad, la proteína de fusión es proteína de fusión B7-4 o PD-l-HA en donde las secuencias de nucleótidos de B7-4 o PD-l esta insertada en un vector como por ejemplo vector Pcep4-HA (Herrscher, R. F. et al. (1995) Genes Dev. 9:3067-3082) de tal manera que las secuencias de B7-4 o PD-l estén fusionadas en marco con una etiqueta de epítopo de hemaglutinina de influenza. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de una proteína de B7-4 o PD-l recombinante. Una proteína de fusión B7-4 o PD-l puede ser producida mediante al expresión recombinante de una secuencia de nucleóticos que codifica un primer péptido que tiene una activada B7-4 y una secuencia de nucleótidos que codifica un segundo péptido que corresponde a una porción que altera la solubilidad, afinidad, estabilidad o valencia del primer péptido, como por ej emplo, una región constante de inmunoglobulina . De preferencia, el primer péptido consiste de una porción del polipéptido de B7-4 (por ejemplo, una porción de residuos de aminoácidos 1-238 o bien 19-238 (después de la disociación de la secuencia de señal de la secuencia mostrada en SEQ ID NO : 4 que es suficiente para modular la co-estimulación o inhibición de células inmunológicas activadas ) . En otra modalidad preferida, el primer péptico consiste de una porción de un polipéptido de PD- l (por ej emplo, una porción de residuos de aminoácidos 1-288 (o bien 21-288 después de la disociación del péptido ce señal ) de la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 12 que es suficiente para modular la co-estimulación o inhibición ce células inmunológicas activadas ) . El segundo péptido puede incluir una región constante de inmunoglobulina, como per ej emplo, un dominio C?l humano o un dominio C?4 humano ( per ej emplo, la bisagra, las regiones CH2 Y CH3 de C?l de ser humano, o bien IgC?4 de ser humano, véase como por ej emplo, Capón et al . Patentes Norteamericanas 5, 116, 964 ; 5, 580 , 756; 5, 844 , 095 y similares, que se incorporan aquí per referencia) . Una proteína de fusión resultante puede tener solubilidad, afinidad de unión, estabil idad y / o valencia ce B7-4 o PD- l alteradas ( es decir, el número de sitios de unión disponibles por molécula ) y puede incrementar la eficiencia de puri ficación de proteína . Proteínas de fusión y pépti cs producidos por técnicas recombinantes pueden ser secretados y aislados a partir de una mezcla de células y medio que contiene la proteína o el péptido. Alternativamente, la proteína o el péptido pueden ser retenidos citoplásmicamente y las células cosechadas, usadas, y la proteína aislada. Un cultivo celular típico incluye células huéspedes, medios y otros subproductos. Medios adecuados para cultivo celular son bien conocidos en la técnica. Proteína y péptidos pueden ser aislados de medios de cultivo de células, células huéspedes, o ambos utilizando técnicas conocidas para la purificación de proteínas y péptidos. Técnicas para transfectar células huéspedes y purificar proteínas y péptidos son conocidas en la técnica. Proteínas de fusión de Ig de B7-4 o PD-l particularmente preferidas incluyen la porción de dominio extracelular o la porción de tipo región variable de una B7-4 o PD-l de ser humano acoplado a una región constante de inmunoglobulina (por ejemplo, la región Fe) . La región constante de inmunoglobulina puede contener modificaciones genéticas que reducen o eliminan la actividad efectora inerte en la estructura de la inmunoglobulina. Por ejemplo, ADN que codifica la porción extracelular de un polipéptido de B7-4 o PD-l puede estar unido a ADN que codifica la bisagra, regiones CH2 y CH3 de IgG?l y/o IgG?4 de ser humano modificada por mutagénesis dirigida a sitios, por ejemplo, de i« i.».& . conformidad con lo presentado en WO 97/28627. De preferencia, una proteína de fusión de B7-4 o PD-l de la presente invención es producida por técnicas estándares de ADN recombinante. Por ejemplo, fragmentos de ADN que codifican para las diferentes secuencias de polipéptidos están ligados juntos en marco de conformidad con técnicas convencionales como por ejemplo, empleando terminales de extremo de punta plana o de extremos escalonados para ligación, digestión con enzimas de restricción con el objeto de proporcionar terminales apropiadas, relleno de extremos cohesivos según lo apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar unión indeseable y ligación enzimática. En otra modalidad, el gen de fusión puede ser sintetizado por técnicas convencionales que incluyen sintetizadores automáticos de ADN. Alternativamente, la amplificación por reacción en cadena de polimerasa de fragmentos de gen puede llevarse a cabo utilizando cebadores de ancla con el objeto de proporcionar salientes complementarias entre dos fragmentos génicos consecutivos que pueden subsecuentemente ser fusionadas y reamplificadas con el objeto de generar una secuencia de gen quimérico (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Además, muchos vectores de expresión están comercialmente disponibles los cuales codifican ya una porción de fusión (por ejemplo, un polipéptido de GST o un etiqueta de epítopo HA) . N ácido nucleico que codifica B7-4 o PD-l puede ser clonado en dicho vector de expresión de tal manera que la porción de fusión este unida en marco con la proteína de B7-4 o PD-l. En otra modalidad, la proteína de fusión es una proteína de B7-4 o PD-l que contiene una secuencia de señal heteróloga en su N-terminal. En ciertas células huéspedes (por ejemplo, células huéspedes de mamíferos) la expresión y/o secreción B7-4 o PD-l puede incrementarse a través del uso de una secuencia de señal heteróloga. Las proteínas de fusión B7-4 o PD-l de la presente invención pueden ser incorporadas en composiciones farmacéuticas y administradas a un sujeto in vivo. El uso de proteínas de fusión B7-4 o PD-l es útil terapéuticamente para el tratamiento de trastornos inmunológicos, por ejemplo, enfermedades auto inmunes, o bien en el caso de inhibir el rechazo de trasplantes. Además, las proteínas de fusión B7-4 o PD-l de la presente invención pueden ser utilizadas como inmunógenos para producir anticuerpos ant?-B7-4 o PD-l en un sujeto para purificar B7-4 o PD-l y en ensayos de tamizado para identificar moléculas que inhiben la interacción de B7-4 o PD-l con un receptor de B7-4, por ejemplo, PD-l. De preferencia, una proteína de fusión o quimérica de B7-4 o PD-l de la presente invención es producida por técnicas estándares de ADN recombinante. Por ejemplo, fragmentos de ADN que codifican secuencias de polipéptido diferentes están ligados juntos en marco de conformidad con técnicas convencionales, cono por ej emplo, mediante el empleo de terminales con puntas planas o terminales con puntas escalonadas para ligación, digestión con enzimas de restricción para proporcionar terminales apropiadas, relleno de extremos cohesivos según lo apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar unión indeseable, y ligación enzimática . En otra modalidad, el gen de fusión puede ser sintetizado por técnicas convencionales que incluyen sintetizadores automáticos de ADN . Alternativamente, la amplificación por reacción en cadena de polimerasa de fragmentos de gen puede efectuarse empleando cebadores de ancla que proporcionan salientes complementarías entre dos fragmentos de gen consecutivos que pueden ser fusionadas y reamplificadas subsecuentemente para generar una secuencia de gen quimérico . (Véase, por ej emplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds, Ausubel et al . John Wiley & Sons : 1992 ) . Además, muchos vectores de expresión están comercialmente disponibles los cuales codifican ya una porción de fusión (por ej emplo, un polipéptido GST) . Un ácido nucleico que codifica B7-4 o PD- l puede ser clonado en un vector de expresión de ese tipo de tal manera que la porción de fusión se encuentre enlazada en marco con la proteína de B7-4 o PD-l .

*-A . -*.¿í , <^ , ** ** ^» &te ^ ?^& ^& é&xJ&^&^-A La presente invención se refiera también a variantes de las proteínas de B7-4 o PD-l que funcionan ya sea como agonistas (miméticos) de B7-4 o PD-l o bien cómo antagonistas de B7-4 o PD-l. Variantes de las proteínas de B7-4 o PD-l pueden ser generadas por mutagénesis, como por ejemplo, mutación de puntos discretos o bien truncado de una proteína de B7-4 o PD-l. Un agonista de las proteínas de B7-4 o PD-l puede conservar sustancialmente las mismas actividades biológicas o bien un subconjunto de las actividades biológicas de la forma que ocurre naturalmente de una proteína de B7-4 o PD-l. Un antagonista de una proteína de B7-4 o PD-l puede inhibir una o varias de las actividades de la forma que ocurre naturalmente de la proteína de B7-4 o PD-l por ejemplo mediante la modulación competitiva de una actividad celular de una proteína de B7-4 o PD-l. Así, efectos biológicos específicos pueden ser provocados por el tratamiento con una variante de función limitada. En una modalidad, el tratamiento de un sujeto con una variante que tiene un subconjunto de las actividades biológicas de la forma que ocurre naturalmente de la proteína tiene menos efectos colaterales en un sujeto en comparación con el tratamiento con la forma que ocurre naturalmente de la proteína de B7-4 o PD-l. En una modalidad, variantes de una proteína de B7-4 o PD-l que funcionan ya sea como agonistas (miméticos) de B7-4 o ?D-1, o bien como antagonistas de B7-4 o PD-l, pueden ser identificadas por el tamizado de bibliotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo, mutantes por truncado, de una proteíns de B7-4 o PD-l para actividad agonista o antagonista de proteína de B7-4 o PD-l. En una modalidad, Una biblioteca variada de variantes de B7-4 o PD-l es generada mediante la mutagénesis combinatoria a nivel de ácido nucleico y es codificado por una biblioteca variada de genes. Una biblioteca variada de variantes de B7-4 o PD-l puede ser producida, por ejemplo, mediante el enlace enzimático de une mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias de genes de tal manera que un conjunto degenerado de secuencias potenciales de B7-4 o PD-l pueda expresarse como polipéptidos individuales, o bien alternativamente, como un conjunto de proteínas de fusión más grande (por ejemplo, para presentación de fagos) que contienen el grupo de secuencias B7-4 o PD-l. Existen varios métodos que pueden ser utilizados para producir bibliotecas de variantes potenciales de B7-4 c PD-l a partir de una secuencia degenerada de oligonucleótidos. La síntesis química de una secuencia degenerada de gen puede efectuarse en un sintetizador automático de ADN, y el gen sintético es después ligado en un vector de expresión apropiado. El uso de un conjunte degenerado de genes permite proporcionar, en una mezcla, todas las secuencias codificadoras del conjunto deseado de Aj=a-a»ttii&&J.¡sj^_^ni^JJ.^„<a>_ ^^* iií??.¿s? £ttí-L£^*^.-'?,^L?tlt.í. secuencias potenciales de B7-4 o PD-l. Métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu . Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res . 11: 477. Además, bibliotecas de fragmentos de la secuencia de codificación de proteína de B7-4 o PD-l puede ser utilizada para generar una población variada de fragmentos de B7-4 o PD-l para tamizado y selección subsecuente de variantes de una proteína de B7-4 o PD-l. En una modalidad, una biblioteca de fragmentos de secuencia codificadora puede ser generada mediante el tratamiento de un fragmento de cadena doble por reacción en cadena de polimerasa de una secuencia codificadora de B7-4 o PD-l con una nucleasa en condiciones en donde ocurre un corte aproximadamente una vez por molécula, desnaturalizando el ADN de cadena doble, renaturalizando el ADN para formar un ADN de cadena doble que puede incluir pares de sentido/antisentido de diferentes productos cortados, remover porciones de cadena única de dúplex reformados por tratamiento con SI nucleasa, y ligando la biblioteca de fragmentos resultante en un vector de expresión. A través de este método, se puede derivar una biblioteca de expresión que codifica N-terminal, C-terminal así como fragmentos internos de varios tamaños de la proteína í*d*Á? 1 &JL,i»Mi&s>i.,-**.Jr*zá*. de B7-4 o PD-l. Se conocen varias técnicas para tamizar productos de gen de bibliotecas combinatorias elaboradas por mutaciones de puntos o truncado, y para tamizar bibliotecas de ADMc para productos 5 génicos que tienen una propiedad seleccionada. Tales técnicas son adaptables para tamizado rápido de las bibliotecas de genes que son generadas por la mutagenesis combinatoria de proteínas de B7-4 o PD-l. Las técnicas más ampliamente utilizadas, que son adecuadas para análisis de alto 10 rendimiento, para tamizar grandes bibliotecas de genes, incluyen típicamente la clonación de la biblioteca de genes en vectores de expresión replicables, la transformación de células apropiadas con la biblioteca de vectores resultante, y la expresión de los genes combinatorios en condiciones en 15 las cuales la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto fue detectado. Una mutagenesis recursiva de ensambles (REM) , una nueva técnica que incrementa la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, puede emplearse en 20 combinación con los ensayos de tamizado para identificar variantes de B7-4 o PD-l (Arkin y Youvan (1992) Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 89:7811-7815; Delagrave et al . (1993) Protein Eng. 6(3) :327-331) . En una modalidad, ensayos basados en células pueden ser 25 explotados para analizar una biblioteca de B7-4 o PD-l t- variada. Por ejemplo, una biblioteca de vectores de expresión puede ser transfectada en una línea de células que sintetiza y secreta habitualmente B7-4 o PD-l. Las células transfectadas son después cultivadas de tal manera que B7-4 o PD-l y un mutante particular de B7-4 o PD-l sean secretados y el efecto de la expresión del mutante sobre la actividad de B7-4 o PD-l en sobrenadantes de células pueda ser detectada, por ejemplo, por cualesquiera de numerosos ensayos funcionales. El ADN de plásmido puede ser después recuperado de las células que califican para inhibición, o bien alternativamente, potenciación de actividad de B7-4 o PD-l, y los clones individuales pueden ser caracterizados adicionalmente . Además, de los polipéptidos de B7-4 o PD-l que consisten solamente de aminoácidos que ocurren naturalmente, se proporcionan también peptidomiméticos de B7-4 o PD-l. Análogos de péptidos son utilizados habítualmente en la industria farmacéutica como fármacos no péptidos con propiedades análogas a las propiedades del péptido de templado. Estos tipos de compuestos no péptidos se conocen como "miméticos de péptido" o bien "péptido mimético" (Fauchere, J. (1986) Adv. Drug Res-, 15:29; Veber y Freidinger (1985) TINS p. 392; y Evans et al. (1987) J. Med. Chem. 30:1229, que se incorporan aquí por referencia) y son desarrollados habitualmente con la ayuda de un modelado molecular computarizado. Miméticos de péptidos que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles pueden ser utilizados para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. En general, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido de paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una actividad biológica o farmacológica) , como por ejemplo, B7-4 o PD-l de ser humano, pero tienen uno o varios enlaces péptido opcionalmente remplazados por un enlace seleccionado dentro del grupo que consiste de: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis y trans), -COCH2, -CH(0H)CH2-, y -CH2SO-, por métodos conocidos en la técnica y descritos adicionalmente en las siguientes referencias: Spatola, A.F. en "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins" Weinstein, B., ed., Marcel Dekker, Nueva York, página 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (Marzo de 1983); Vol. 1, Número 3, "Peptide Backbone Modifications" (reseña general); Morley, J.S. (1980) Trends Pharm. Sci. páginas 463-468 (reseña general); Hudson, D. et al. (1979) Int. J. Pept. Prot. Res. 14:177-185 (-CH2NH-, CH2CH2-) ; Spatola, A.F. et al. (1986) Life Sci. 38:1243-1249 (-CH2-S); Hann, M.M. (1982) J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 307-314 (-CH-CH-, cis y trans); Almquist, R. G. et aJ. (190) J. Med. Chem. 23:1392-1398 (-CHOCH2-); Jennings-White, C. et al. (1982) Tetrahedron Lett. 23:2533 (-C0CH2-) ; Szelke, M. et al. European Appln. EP 45665 (1982) CA: 97: 39405 ^ teska, , JJ-íÍ &&¿B « *¿ Á,im¿ &. fejj&ijjfcsj (1982) (-CH(0H)CH2-) ; Holladay, M. W. et al. (1983) Tetrahedron Lett . (1983) 24:4401-4404 (-C(0H)CH2-) ; y Hruby, V. J. (1982) Life Sci . (1982) 31: 189-199 (-CH2-S-) ; cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia. Un enlace no péptido particularmente preferido es -CH2NH-. Tales miméticos de péptidos pueden tener ventajas significativas en comparación con modalidades de polipéptidos, incluyendo como por ejemplo: una producción más económica, una mayor estabilidad química, propiedades farmacológicas mejoradas (vida media, absorción, potencia, eficacia, etc.), especificidad alterada (por ejemplo un amplio espectro de actividades biológicas) , antigenicidad reducida, y otras características. El etiquetado de los peptidomiméticos incluye habitualmente la fijación covalente de una o varias etiquetas, directamente o bien a través de un espaciador (por ejemplo, un grupo amidas), en posición(es) que no interfiere (n) en el péptido mimético que son predichas por datos cuantitativos de actividad estructural y/o modelado molecular. Tales posiciones que no interfieren en general son posiciones que no forman contactos directos con la(s) macromolécula (s) a la(s) cual (es) se une el péptido mimético para producir el efecto terapéutico. La derivación (por ejemplo, etiquetado) de peptidomiméticos no debe interferir sustancialmente con la actividad biológica o farmacológica deseada del péptido mimético. í*.t í at.-1 jLJ .?i.Z -híí* ^**.l*** ,-: . , í*** ,. .... ? - .- ^?B^!-t-tti^<»AaJilttJfc-l¿i-.---h-!-» Una sustitución sistemática de uno o varios aminoácidos de una secuencia de aminoácidos de B7-4 o PD-l con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) puede emplearse para generar péptidos más estables. Además, péptidos restringidos que comprenden una secuencia de aminoácidos B7-4 o PD-l o una variación de secuencia sustancialmente idéntica pueden ser generados por métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch (1992) Annu . Rev. Biochem. 61:387, que se incorpora aquí por referencia); por ejemplo, por adición de residuos de cisteína internos capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido. Las secuencias de aminoácidos de polipéptidos de B7-4 o PD-l identificados aquí permitirán a los expertos en la materia producir polipéptidos que corresponden a secuencias de péptidos de B7-4 o PD-l y secuencias variantes de las mismas. Tales polipéptidos pueden ser producidos en células huéspedes procarióticas o eucarióticas mediante la expresión de los polinucleótidos que codifican una secuencia de péptido de B7-4 o PD-l, frecuentemente como parte de un polipéptido mayor. Alternativamente, tales péptidos pueden ser sintetizados por métodos químicos. Métodos de expresión de proteínas heterólogas en huéspedes recombinantes, síntesis química de polipéptidos y en traducción in vi tro son métodos bien conocidos en la técnica y descritos adicionalmente en i*?. ? -á*¿*.ILi*¿ ?i ...

Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2da. edición, Cold Spring Harbor, N.Y.; Berger y Kimmel, Methods in Enzymology, volumen 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Merrifield, J. (1969) J. Ara. Chem. Soc. 91:501; Chaiken I.M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11: 255: Kaiser et al. (1989) Science 243:187: Merrifield, B. (1986) Science 232:342; Kent, S.B.H. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57:957; y Offord, R.E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing, que se incorporan aquí por referencia) . Péptidos pueden ser producidos, típicamente por síntesis química directa, y utilizados, por ejemplo, como agonistas o antagonistas de una interacción B7-4/PD-1. Péptidos pueden ser producidos como péptidos modificados, con porciones no péptidos fijadas por unión covalente con la N-terminal y/o C-terminal . En ciertas modalidades preferidas, ya sea la carboxi-terminal o la amino-terminal, o ambas, son modificadas químicamente. Las modificaciones más comunes de los grupos amino y carboxilo de la terminal son la acetilación y la amidación, respectivamente. Modificaciones de amino terminal tales como acilación (por ejemplo, acetilación) o bien alquilación (por ejemplo, metilación) y modificaciones de carboxi-terminal tales como amidación, así como otras modificaciones de terminales, incluyendo ciclización, pueden ser incorporadas en varias modalidades de la invención. Ciertas modificaciones de amino-terminal y/o carboxi-terminal y/o extensiones de péptido a la secuencia de núcleo pueden proporcionar propiedades físicas, químicas, bioquímicas y farmacológicas provechosas como por ejemplo: estabilidad incrementada, mayor potencia y/o eficacia, resistencia a proteasas séricas, propiedades farmacocinéticas deseables, y otras. Péptidos pueden ser utilizados de manera terapéutica para tratar enfermedades, por ejemplo, mediante la alteración de la co-estimulación en un paciente. Una proteína de B7-4 o PD-l aislada, o una porción o fragmento de la misma (o bien una molécula de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido) , puede emplearse como un inmunógeno para generar anticuerpos que se unen con B7-4 o PD-l empleando técnicas estándares para la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales. Una proteína de B7-4 o PD-l de longitud completa puede ser utilizada, o bien alternativamente la invención ofrece fragmentos de péptidos antigénicos de B7-4 o PD-l para su uso como inmunógenos. El péptido antigénico de B7-4 o PD-l comprende por lo menos 8 residuos de aminoácidos y abarca un epítopo de B7-4 o PD-l de tal manera que un anticuerpo preparado contra el péptido forme un complejo inmune específico con B7-4 o PD-l. De preferencia, el péptido antigénico comprende por lo menos 10 residuos de aminoácidos, con mayor preferencia por lo menos 15 residuos de aminoácidos, con preferencia aun mayor por lo Hi" ¡* -*"»-•«"*-* menos 20 residuos de aminoácidos, y muy especialmente por lo menos 30 residuos de aminoácidos. Alternativamente, un fragmento de péptido antigénico de un polipéptido de B7-4 o PD-l puede ser utilizado como el inmunógeno. Un fragmento de péptido antigénico de un polipéptido de B7-4 o PD-l comprende típicamente por lo menos 8 residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, 4, o bien 12 y abarca un epítopo de un polipéptido de B7-4 o PD-l de tal manera que un anticuerpo preparado contra el péptido forme un complejo inmune con una molécula de B7-4 o PD-l. Epítopos preferidos abarcados por el péptido antigénico son regiones de B7-4 o PD-l que se encuentran en la superficie de la proteína, por ejemplo, regiones hidrofílicas. En una modalidad, un anticuerpo se une sustancialmente de manera específica a una molécula de B7-4 o PD-l. En otra modalidad, un anticuerpo se une específicamente a un polipéptido de B7-4 o PD-l. De preferencia, el péptido antigénico comprende por lo menos aproximadamente 10 residuos de aminoácidos, con mayor preferencia por lo menos aproximadamente 15 residuos de aminoácidos, con preferencia aun mayor por lo menos aproximadamente 20 residuos de aminoácidos, y muy especialmente por lo menos aproximadamente 30 residuos de aminoácidos. Los epítopos preferidos abarcados por el péptido antigénico son regiones de un polipéptido de B7-4 o PD-l que se encuentran en la superficie de la proteína como por ejemplo, regiones hidrofílicas y que son únicas para un polipéptido de B7-4 o PD-l. En una modalidad, tales epítopos pueden ser específicos para una proteína de B7-4 o PD-l de una especie, como por ejemplo ratón o ser humano (es decir, un péptido antigénico que abarca una región de un polipéptido de B7-4 o PD-l que no es conservado entre especies es utilizado como inmunógeno; tales residuos no conservados pueden ser determinados empleando un alineamiento tal como lo proporcionado aquí) . Un análisis de hidrofobicidad estándar de la proteína de B7-4 o PD-l puede efectuarse con el objeto de identificar regiones hidrofílicas. Un inmunógeno de B7-4 o PD-l se utiliza típicamente para preparar anticuerpos mediante la inmunización de un sujeto adecuado, (por ejemplo, conejo, cabra, ratón u otro mamífero) con el inmunógeno. Una preparación inmunogénica apropiada puede contener, por ejemplo, una proteína de B7-4 o PD-l expresada de manera recombinante o bien un péptido de B7-4 o PD-l químicamente sintetizado. La preparación puede incluir además un adyuvante, como por ejemplo adyuvante completo de Freund o bien adyuvante incompleto de Freund, o bien un agente inmunoestimulador similar. La inmunización de un sujeto adecuado con una preparación inmunogénica de B7-4 o PD-l induce una respuesta de anticuerpo ant-B7-4 o PD-l policlonal. .i í i-i mí En otra modalidad, vacunas de ácido nucleico pueden ser administradas de varias maneras, por ejemplo, mediante inyección (por ejemplo, inyección intramuscular, intradérmica, o bien biolística de partículas de oro revestidas con ADN en la epidermis con una pistola génica que utiliza un acelerador de partículas o bien un gas comprimido para inyectar las partículas en la piel (Haynes et al., 1996, J. Biotechnol . 44:37)). Alternativamente, vacunas de ácido nucleico pueden ser administradas por medios no invasivos. Por ejemplo, se puede administrar ADN puro o formulado con lípidos al sistema respiratorio o bien a otras partes, por ejemplo, parches de Peyers por administración oral de ADN (Schubbert. 1997. Proc . Nati . Acad. Sci . USA 94:961).

Microorganismos atenuados pueden ser utilizados para administración a superficies mucosales (Sizemore et al. 1995, Science . 270:29) . Anticuerpos anti-B7-4 o PD-l policlonales pueden ser preparados de conformidad con lo descrito arriba por inmunización de un sujeto adecuado con un inmunógeno para B7-4 o PD-l. El título de anticuerpo anti-B7-4 o PD-l en el sujeto inmunizado puede ser monitoreado con el paso del tiempo por técnicas estándares, como por ejemplo un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) utilizando un polipéptido de B7-4 o PD-l inmovilizado. Si se desea, las moléculas de anticuerpo dirigidas hacia un polipéptido de B7- Í¿Mí *t..-* ~¿iJSa-* '-'~ - ***Aj?*i?iá*? 4 o PD-l pueden ser aisladas del mamífero (por ejemplo, de la sangre) y purificadas adicionalmente por técnicas bien conocidas, como por ejemplo, cromatografía de proteína A para obtener la fracción IgG. En un momento apropiado después de la inmunización, por ejemplo, cuando los títulos de anticuerpo anti-B7-4 o PD-l están en su nivel más elevado, se puede obtener células productoras de anticuerpos a partir del sujeto y se pueden utilizar dichas células para preparar anticuerpos monoclonales por técnicas estándares, como por ejemplo técnica de hibridoma originalmente descrita por Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497 (véase también Brown et al. (1981) J. Immunol . 127:539-46; Brown et al. (1980) J. Biol . Chem. 255:4980-83; Yeh et al. (1976) Proc. Na ti . Acad. Sci . 76:2927-31; y Yeh et al. (1982) Int. J. Cáncer 29:269-75), la técnica de hibridomas B humanas más reciente (Kozbor et al. (1983) Immunol . Today 4:72), la técnica de EBV-hibridoma (Colé et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., páginas 77-96) o bien técnicas de trioma. La tecnología para producir hibridomas de anticuerpos monoclonales es bien conocida (véase, en términos generales, Kenneth, R. H. en Monoclonal Antibodies : A New Dimensión In Biological Analices, Plenum Publishing Corp., Nueva York., Nueva York (1980); Lerner, E.

A. (1981) YaJe J. Biol . Med. 53:387-402; Gefter, M.L. et al. (1977) Soma ti c Cell Genet . 3:231-36). En resumen, una línea de células inmortales (típicamente un mieloma) es fusionada con linfocitos (típicamente esplenocitos) a partir de un mamífero inmunizado con un inmunógeno para B7-4 o PD-l de conformidad con lo descrito arriba, y los sobrenadantes de cultivo de las células de hibridoma resultantes son tamizados para identificar un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que se une con un polipéptido de B7-4 o PD-l, de preferencia de manera específica. Cualesquiera de los muchos protocolos bien conocidos utilizados para fusionar linfocitos y líneas de células inmortalizadas pueden aplicarse para el propósito de generar un anticuerpo monoclonal anti-B7-4 o PD-l (véase, por ejemplo, Galfre, G. et al. (1977) Nature 266:55052; Gefter et al. (1977) supra; Lerner (1981) supra ; Kenneth (1980) supra) . Además, la persona con conocimientos ordinarios en la materia apreciará que existen muchas variaciones de dichos métodos que pueden también ser útiles. Típicamente, la línea de células inmortales (por ejemplo, una línea de células de mieloma) es derivada de la misma especie de mamífero que los linfocitos. Por ejemplo, hibridomas de munno pueden elaborarse mediante la función de linfocitos de un ratón inmunizado con una preparación inmunogénica de la presente invención con una línea de células de ratón inmortalizadas. Líneas de células inmortales preferidas son líneas de células de mieloma de ratón que son sensibles al medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT") . Cualesquiera de numerosas líneas de células de mieloma pueden utilizarse como socio de fusión de conformidad con técnicas estándares, por ej emplo, las líneas de mieloma P3-NSl/l-Ag4-1 , P3-x63-Ag8. 653 o Sp2/0-Agl4 . Estas líneas de mieloma están disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC) , Rockville, Md. Típicamente, células de mieloma de ratón sensibles a HAT son fusionados sobre esplenocitos de ratón utilizando polietilenglicol ( "PEG" ) . Células de hibridoma que resultan de esta fusión son después seleccionadas empleando un medio HAT que mata las células de mieloma no fusionadas y las células de mieloma fusionadas de manera improductiva ( los esplenocitos no fusionados mueren después de varios días puesto que no están transformados ) . Las células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la invención son detectadas por tamizado de los sobrenadantes de cultivo de hibridoma para anticuerpos que se unen a una molécula de B7-4 o PD-l , por ej emplo, empleando un ensayo ELISA estándar . Como alternativa para la preparación de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales, un anticuerpo anti-B7-4 o PD-l monoclonal puede ser identificado y aislado mediante eí tamizado de una biblioteca de inmunoglobulina combinatoria recombinante (por ej emplo, una biblioteca de visualización de fagos de anticuerpo) con B7-4 o PD-l con el objeto de aislar de esta forma miembros de biblioteca de inmunoglobulmas que se unen con un polipéptido de B7-4 o PD-l. Conjuntos de elementos para generar y tamizar bibliotecas de visualización de fagos están disponibles en el comercio (por ejemplo, the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, No. de catálogo 27-9400-01; y el Stratagene Surf ZAP™ Phage Display Ki t, No. de catálogo 240612) . Además, ejemplos de métodos y reactivos particularmente adecuados para su uso en la generación y en el tamizado de biblioteca de presentación de anticuerpos pueden encontrarse por ejemplo en Ladner et al. Patente Norteamericana No. 5,223,409; Kang et al. Publicación Internacional WO 92/18619; Dower et al. Publicación Internacional No. WO 91/17271; Winter et al. Publicación Internacional WO 92/20791; Markland et al, Publicación Internacional No. WO 92/15679; Breitling et al. Publicación Internacional WO 93/01288; McCafferty et al., Publicación Internacional No. WO 92/01047; Garrard et al. Publicación Internacional No. WO 92/09690; Ladner et al. Publicación Internacional No. WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Biotechnology (NY) 9:1369-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkms et al. (1992) J. Mol . Biol . 226:889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Biotecnnol ogy (NY) 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) .- ? ? M'?* ÍZ&S ^* Nucleic Acids Res . 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 88:7978-7982; y McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554. Además, anticuerpos recombinantes anti-B7-4 o PD-l, como por ejemplo anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden tanto porciones humanas como porciones no humanas, que pueden elaborarse empleando técnicas estándares de ADN recombinante, se encuentran dentro del alcance de la invención. Tales anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados pueden ser producidos por técnicas de ADN recombinante conocidas, por ejemplo, empleando métodos descritos en Robinson et al., Publicación de Patente Internacional PCT/US86/02269; Akira et al. Solicitud de Patente Europea 184,187; Taniguchi, M. Solicitud de Patente Europea 171,496; Morrison et al. Solicitud de Patente Europea 173,494; Neuberger et al. Solicitud PCT WO 86/01533; Cabilly et al. Patente Norteamericana No. 4,816,567; Cabilly et al. Solicitud de Patente Europea 125,023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. I munol . 139:3521-3526; Sun et al . (1987) Proc . Nati . Acad. Sci . 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cáncer Res . 47:999-1005; Wood et al. (1985) Na ture 314:446-449; y Shaw et al. (1988) J. Na ti . Cáncer Inst . 80:1553-1559); Morrison, S.L. (1985) Sci ence 229:1202-1207; Oi et al. (1986) Biotechniques 4;214; i d-, i Winter Patente Norteamericana 5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; y Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141-4053-4060. Además, anticuerpos humanizados pueden elaborarse de conformidad con protocolos estándares tales como los divulgados en la Patente Norteamericana 5,565,332. En otra modalidad, cadenas de anticuerpos o bien miembros de pares de unión específicos pueden ser producidos por recombinación entre vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican una fusión de una cadena de polipéptidos de un miembro de par de unión específico y un componente de un paquete de presentación de genes replicable y vectores que contienen moléculas de ácido nucleico que codifican una segunda cadena de polipéptidos de un miembro individual de pares de unión empleando técnicas conocidas como por ejemplo las técnicas descritas en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,565,332, 5,871,907 o 5,733,743. El uso de anticuerpos intracelulares para inhibir la función de proteína en una célula es también conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Carlson, J.R. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:2638-2646; Biocca, S. et al. (1990) EMBO J. 9:101-108; Werge, T.M. et al. (1990) FEBS Lett. 274:193-198; Carlson, J.R. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:7427-7428; Marasco, W. A. et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:7889-7893; Biocca, S. et al. (1994) Biotechnology (NY) 12:396-399; Chen, S-Y. et al. (1994) Hum. Gene Ther. 5:595-601; Duan, L. et al. (1994) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 91:5075-5079; Chen, S-Y. et al. (1994) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 91:5932-5936; Beerli, R.R. et al. (1994) J. Biol . Chem. 269:23931-23936; Beerli, R.R. et al. (1994) Biochem. Biophys . Res . Commun. 204:666-672; Mhashilkar, A.M. et al. (1995) EMBO J. 14:1542-1551; Richardson, J.H. et al. (1995) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 92:3137-3141; Publicación PCT No. WO 94/02610 por Marasco et al.; y Publicación PCT No. WO 95/03832 por Duan et al.). En una modalidad, un anticuerpo para su uso en la presente invención es un anticuerpo biespecífico. Un anticuerpo biespecífico tiene sitios de unión para dos antígenos diferentes dentro de una sola molécula de anticuerpo. La unión de antígeno puede ser simultánea o secuencial. Tpomas e hibridomas híbridos son dos ejemplos de líneas de células que pueden secretar anticuerpos biespecíficos. Ejemplos de anticuerpos biespecíficos producidos por un hibridoma híbrido o un trioma se presentan en la Patente Norteamericana No. 4,474,893. Anticuerpos biespecíficos han sido construidos por medios químicos (Staerz et al. (1985) Na ture 314:628, y Pérez et al. (1985) Na ture 316:354) y tecnología de hibridoraa (Staerz y Bevan (1986) Proc. Na ti . Acad. Sci . USA, 83:1453, y Staerz y Bevan (1986) Immunol . Today 7:241). Anticuerpos biespecíficos se describen también en la Patente Norteamericana No. 5,959,084. Fragmentos de anticuerpos líÍ.*Á.J li ?*>j . **? J&J <&&** * ** **** ¿* -ife.fc ¿ ? .=^^^-3fcl -?-£--é<--J--i-i *¿'-*g-- -5-*&AdSfcs3 biespecíficos se describen en la Patente Norteamericana 5,798,229. Agentes biespecíficos pueden también ser generados haciende heterohibridomas por fusión de hibridomas o bien de otras células formando anticuerpos diferentes, seguido por la identificación de clones que producen y co-ensamblan ambos anticuerpos. Pueden también ser generados por conjugación química o genética de cadenas de inmunoglobulina completas o porciones de las mismas como por ejemplo secuencias de Fab y Fv. El componente de anticuerpo puede unirse con PD-l o B7-4. Un anticuerpo anti-B7-4 o PD-l (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal) puede utilizarse para aislar un polipéptido de B7-4 o PD-l por técnicas estándares como por ejemplo cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Anticuerpos anti-B7-4 o PD-l pueden facilitar la purificación de polipéptidos de B7-4 o PD-l naturales a partir de células y de polipéptidos de B7-4 o PD-l producidos recombinantemente expresados en células huéspedes. Además, un anticuerpo anti-B7-4 o PD-l puede ser utilizado para detectar una proteína de B7-4 o PD-l (por ejemplo, en un lisado celular o bien sobrenadante celular. La detección puede ser facilitada por acoplamiento (es decir, enlace físico) del anticuerpo con una sustancia detectable. Por consiguiente, en una modalidad, un anticuerpo anti-B7-4 o PD-l de la presente invención es etiquetado con una sustancia detectable. Ejemplos de l ?mt?^iáiih?ii nía sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, y materiales radioactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, o bien acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo o bien ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; y ejemplos de material radioactivo adecuado incluyen 125I, :31I, 55S, y 3H. Otro aspecto de la invención se refiere a anticuerpos anti-B7 -4 o PD-l que pueden obtenerse a través de un proceso que comprende: (a) inmunizar un animal con una proteína de B7-4 o PD-l inmunogénica, o bien una porción inmunogénica de la misma única para un polipéptido de B7-4 o PD-l; y (b) aislar del animal anticuerpos que se unen específicamente con una proteína de B7-4 o PD-l. IV. Vectores de expresión recombinante y células huéspedes Moléculas de ácido que codifican una proteína de la familia de B7-4 o PD -1 (o bien una porción de la misma) pueden estar contenidas en vectores, de preferencia vectores de expresión. Como se emplea aquí el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otra molécula de ácido nucleico al cual ha sido unida. Un tipo de vectores "plásmido" que se refiere a un bucle de ADN de doble cadena circular en donde segmentos de ADN adicional pueden ser ligados. Otro tipo de vector es un vector viral donde segmentos adicionales de ADN pueden ser ligados en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en donde son introducidos (por ejemplo vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores de mamíferos episomales) otros vectores (por ejemplo vectores mamíferos no episomales) son integrados en el genoma de una célula huésped al efectuarse la introducción en la célula huésped y por consiguiente son replicados juntos con el genoma huésped. Además, ciertos vectores pueden dirigir la expresión de genes con los cuales están operativamente enlazados. Tales vectores se conocen aquí como vectores de expresión. En general vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinantes tienen frecuentemente la forma de plásmidos. En la presente especificación, los términos "plásmidos" y "vector" pueden emplearse de manera intercambiable puesto que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector. Sin embargo, la invención tiene el propósito de incluir otras formas de vectores de expresión por ejemplo vectores virales (por AfcatAJ ejemplo, virus asociados con adeno, adenovirus y retrovirus defectuosos para replicación) , que tienen funciones equivalentes. Vectores de expresión recombinante pueden comprender una molécula de ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para expresión, por ejemplo expresión constitutiva o inducible de una molécula de PD-l o B7-4 en la(s) célula (s) indicadora (a) del ácido nucleico en una célula huésped, lo que significa que los vectores de expresión recombinante incluyen una o varias secuencias reguladoras, seleccionadas con base en las células huéspedes a utilizar para expresión, que es unida operativamente con la secuencia de ácidos nucleicos a expresar. Con relación a un vector de expresión recombinante, la expresión "operativamente enlazada" significa que la secuencia de nucleótidos de interés está unida a la(s) secuencia (s) reguladora (s) de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o bien en una célula huésped cuando el vector es introducido en la célula huésped) el término "secuencia regulador" incluye promotores, realzadores o bien otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) . Tales secuencias reguladoras son descritas, por ejemplo en Goeddel (1990) Methods Ezymol . 185:3-7. Secuencias reguladoras incluyen las secuencias que dirigen la ian J . &&s ^&é ^% ^&« expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de célula huésped y las secuencias que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solamente en ciertas células huéspedes (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas para tej idos) . Los expertos en la materia observarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, y similares . Los vectores de expresión de la presente invención pueden ser introducidos en células huéspedes con el obj eto de producir de esta forma proteínas o péptidos incluyen proteínas de fusión o péptidos de fusión codificados por ácidos nucleicos de conformidad con lo descrito aquí (por ejemplo, proteínas de las familias de B7-4 o PD-l , formas mutantes de proteínas de B7-4 o PD-l , proteínas de fusión o similares . Los vectores de expresión recombinantes de la presente invención pueden ser diseñados para la expresión de proteínas de B7-4 o PD-l en células procarióticas o eucarióticas . Por ej emplo proteínas de B7-4 o PD-l pueden ser expresadas en células bacterianas tales como E. coli , células de insecto (empleando vectores de expresión de baculovirus) , células de levadura o bien células de mamífero . Células huéspedes adecuadas se comentan adicionalmente en Goeddel ( 1990) supra . Alternativamente, el vector de expresión recombmante puede l-it. Í.?. .* A.tMá-i- ser transcrito y trasladado in vitro, por ejemplo usando secuencias reguladoras de promotores de T7 y T7 polimerasa . La expresión de proteínas en procariotas se efectúa con mayor frecuencia en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión ya sea de proteínas de fusión o ya sea de proteínas no de fusión . Vectores de fusión agregan un número de aminoácidos de proteína codificada habitualmente a la terminal amino de la proteína recombinantes . Tales vectores de fusión sirven típicamente 3 propósitos : ( 1 ) incrementa la expresión de proteína recombinante; (2) incrementar la solubilidad de la proteína recombinante; y ( 3) ayudar a la purificación de la proteína recombinante mediante su acción como ligando en purificación por afinidad . Frecuentemente en vectores de expresión de fusión, un sitio de disociación proteolítica es introducido en la unión de la porción de fusión y de la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante de la porción de fusión después de la purificación de la proteína de fusión . Tales enzimas y sus secuencias de reconocimiento correspondiente, incluyen factor Xa, trombina y enteroquinasa . Vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX ( Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. y Johnson, K. S . ( 1998 ) Gene 67 : 31-40 ) , pMAL (New England Biobals, Beverly, MA) y pRIT5 ( Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan glutationa S-transferasa (GST) proteína de unión de fa <k.*A,?k*i..,.?**k*? maltosa E o bien proteína A, sobre la respectivamente, sobre la proteína recombinante objetivo. Proteínas de fusión purificadas pueden ser utilizadas en ensayos de actividad B7-4 o PD-l (por ejemplo ensayos directos o ensayos competitivos descritos con detalles a continuación) o bien para generar anticuerpos específicos para proteínas de B7-4 o PD-l, por ejemplo. Ejemplos de vectores de expresión de E. coli de no fusión inducibles adecuados incluyen pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315) y pET lid (Studier et al. (1990) Methods Enzymol , 185:60-89). Una expresión de gen blanco a partir del vector pTrc se pasa en la t transcripción de ARN polimerasa de huésped a partir de un promotor de fusión híbrido trp-lac. La expresión de gen blanco a partir del vector pET lid se basa en una transcripción a partir de un promotor de fusión T7 gn 10-lac mediado por una ARN polimerasa viral coexpresada (T7-gnl) esta polimerasa viral es suministrada por cepas huéspedes BL21 (DE3) o HMS174 (DE3) a partir de un prófago residente que aloja un gen T7 gnl bajo el control de transcripción del promotor lacUV5. Una estrategia para optimizar la expresión de proteína recombinante en E. coli es expresar la proteína en una bacteria huésped con una capacidad afectada para disociar proteolíticamente la proteína recombinantes (Gottesman, S. (1990) Methods Enzymol 185:119-128) . Otra estrategia es t- l á?ii?i.ol¡???.?¿ r'ri ÉI >«A - - - -• *-* - -* - •- a - . . ..,., —,-,-,., .,, ..^-^-A-fa?-fc^i?^«fa ->*i? alterar la secuencia de ácidos nucleicos del ácido nucleico a insertar en el vector de expresión de tal manera que los codones individuales para cada aminoácido sean los codones empleados de preferencia en E. coli (Wada et al, (1992) Nucleic Acids Res . 20:2111-2118) . Dicha alteración de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención puede efectuarse por técnicas estándares de síntesis de ADN. En otra modalidad, el vector de expresión de B7-4 PD-l es un vector de expresión de levadura. Ejemplos de vectores en levadura S. cerevisiae incluyen pYepSecl (Baldari, et al. (1987) EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) , y picZ (Invitrogen Corp. San Diego, CA) . Alternativamente un polipéptido de B7-4 o PD-l puede ser expresado en células de insecto utilizando vectores de expresión de baculovirus, vectores de baculovirus disponibles para expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (por ejemplo células Sf9) incluyen la serie pAc (Smith et al, (1983) -Mol . Cell Biol . 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow, V.A. y Summer, M.D. (1989) Virology 170:31-39). En otra modalidad, un ácido nucleico de la presente invención es expresado en células de mamífero utilizando un vector de expresión de mamífero. Ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pMEx-Neol, pCDM8 (Seed, B. (1987) Na t ure í.*.A.Ú*l -Jt¡&&á ,^ iÉ^ 329:840) y pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195). Cuando se utilizan en células de mamíferos, las funciones de control de vector de expresión son proporcionadas frecuentemente por elementos reguladores virales. Por ejemplo, promotores comúnmente empleados son derivados de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y virus de simio 40. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procarióticas como para células eucarióticas véanse capítulos 16 y 17 de Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Labora tory Manual : 2da . edición. , Cold Spring Harbor Laboratory , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY, 1989. En otra modalidad, el vector de expresión de mamífero recombinante puede dirigir la expresión del ácido nucleico de preferencia en un tipo particular de células (por ejemplo elementos específicos para tejido son empleados con el objeto de expresar el ácido nucleico) . Elementos reguladores específicos para tejido son conocidos en la técnica. Ejemplos no limitativos de promotores específicos para tejido incluyen el promotor de albúmina (específico para hígado; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277), promotores específicos para linfoide (Caíame y Eaton (1988) Adv. Immunol 43:235-275) en particular promotores de los receptores de célula T (Winoto y Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) e inmunoglobulina (Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen y baltimore (1983) CelJ 33:741-748) promotores específicos para neuronas (por ejemplo el promotor de neurofilamentos; Byrne y Ruddle (1989) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 86:5473-5477), promotores específicos para páncreas (Edlund et al. (1985) Science 230:912-916), y promotores específicos para glándulas mamarias (promotor de suero de leche, patente norteamericana número 4,873,316 así como publicación de solicitud europea número 264,166). Promotores regulados por desarrollo están también incluidos, por ejemplo, los promotores hox de murino (Kessel y Gruss (1990) Science 249:374-379) y el promotor de a-fetoproteína (Campes y Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537- 546) . Además sistemas reguladores inducibles para su uso en células de mamífero se conocen en la técnica, por ejemplo sistemas en los cuales la expresión de genes es regulada por iones de metales pesados (véase, por ejemplo Mayo et al. (1982) Cell 29-90-108; Brinster et al. (1982) Na ture 296:39-42; Searle et al (1985) Mol . Cell . Biol . 5:1480-1489), choque térmico (véase por ejemplo Nouer et al. (1991) en Heat Shock Response, ed. Nouer, L., CRC, Boca Ratón, FL., páginas 167- 220), hormonas (véase por ejemplo Lee et al (1981) Na ture 294:228-232; Hynes et al. (1981) Proc . Nati . Acad Sci . USA 78:2038-2042; Klock et al. (1987) Na t ure 329:734-736; Israel y Kaufman (1989) Nucí . Acíds . Res. 17:2589-2604; y PCT Publicación ?o. W093/23421), moléculas relacionas con FK506 (véase por ejemplo, publicación PCT número W094/18317) o bien tetraciclinas (Gossen, M y Bujard, H. (1992) Proc. Nati . Acad Sci , USA 89:5547-5551; Gossen, M. et al (1995) Science 268:1766-1769; Publicación PCT No. WO 94/29442; y publicación PCT No. W096/01313) . Por consiguiente, en otra modalidad, la invención ofrece un vector de expresión recombinante en un ADN de B7-4 o PD-l se encuentra unido de manera operativa con un promotor eucariótico inducible permitiendo la expresión inducible de una proteína de B7-4 o PD-l en células eucarióticas. La invención ofrece además un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN de la invención clonada del vector de expresión en una orientación de antisentido. Es decir, la molécula de ADN se encuentra unida operativamente a una secuencia reguladora a una manera que permite la expresión (por transcripción de la molécula de ARN que es de antisentido con relación a ARNm de B7-4 o PD-1. Secuencias reguladoras unidas operativamente a un ácido nucleico clonado en la orientación de antisentido pueden seleccionarse las cuales dirigen la expresión continua de la molécula de ARN de antisentido en varios tipos de células, por ejemplo promotores virales y/o realzadores, o bier. secuencias reguladoras pueden ser seleccionadas las cuales dirigen la expresión constitutiva, específica para t ejido c bien específica para tipo de células de ARN de antisentido. l«k,i,v¡ní ¡i?*,m*ál, El vector de expresión de antisentido puede encontrarse en forma de un plásmido recombinantes, fagémido o bien virus atenuado en donde ácidos nucleicos de antisentido son producidos bajo el control de una región reguladora de alta eficiencia cuya actividad puede ser determinada por el tipo de células en donde se introduce el vector. Para un comentario de la regulación de la expresión de genes empleando genes de antisentido véase Weintraub, H. et al. (1986) "Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis" Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1). La invención se refiere además a células huéspedes en las cuales se ha introducido un vector de expresión recombinantes de la presente invención. El término "célula huésped" y "célula huésped recombinante" se emplean de manera intercambiable, aquí. Se entiende que tales términos se refieren no solamente a una célula sujeto particular sino a la progenie o a la progenie potencial de dicha célula. Puesto que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones subsecuentes debido ya sea a mutaciones o bien a influencias ambientales, dicha progenie de hecho puede no ser idéntica a la célula de origen, pero se incluyen también dentro del alcance del término según se emplea aquí. Una célula huésped puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, una proteína de B7-4 o PD-l puede ser expresada en células bacterianas tales como E. coli , .UÉ?Á, células de insecto, o bien células de mamífero. (Por ejemplo células de hámster chino (CHO) o bien células COS) . Otras células huéspedes adecuadas son conocidas de los expertos en la materia. ADN de vector puede ser introducido en células procarióticas o eucarióticas a través de técnicas convencionales de transformación o transfección. Como se emplean aquí, los términos "transformación" y "transfección" tienen el propósito de referirse a varias técnicas conocidas para introducir ácido nucleico foráneo (por ejemplo ADN) en una célula huésped, incluyendo co-precipitación con cloruro de calcio o fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, l pofección o bien electroporación. Métodos adecuados para transformar o transfectar células huéspedes pueden encontrarse en Sambroock et al. (Molecular Cloning: A Labora tory Manual , 2da . edición, Cold Spring Harbor Labora tory, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor NY, 1989) y otros manuales de laboratorio. Para una transfección estable de células de mamíferos se sabe que según el vector de expresión utilizado y según la técnica de transfección empleada, solamente una pequeña fracción de células pueden integrar el ADN foráneo en su genoma. Con el objeto de identificar y seleccionar estos integrantes, se introduce generalmente un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo resistencia a los antibióticos) en ?taauáSMi?J tt .- ..-»»»•*- jaÉaé Áiin i.í J las células huéspedes junto con el gen de interés. Marcadores seleccionables apropiados incluyen los marcadores que confieren resistencia al fármaco, como por ejemplo G418, higromicina y metotrexato. Ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable puede ser introducido en una célula huésped en el mismo vector que el vector que codifica una proteína de B7-4 o PD-l o bien pude ser introducido en un vector separado. Células transfectadas de manera estable con el ácido nucleico introducido pueden ser identificadas por selección de fármaco (por ejemplo, las células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán mientras que las otras células morirán) . Una la célula huésped de la presente invención por ejemplo la célula huésped procariótica o eucariótica en cultivo puede emplearse para producir (es decir, expresar) una proteína de B7-4 o PD-l. por consiguiente, la invención ofrece también métodos para producir una proteína de B7-4 o PD-l empleando las células huéspedes de la invención. En una modalidad, el método comprende el cultivo de la célula huésped de la invención (en donde se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica una proteína de B7-4 o PD-l) en un medio adecuado de tal manera que se produzca una proteína de B7-4 o PD-l. En otra modalidad, el método comprende además el aislamiento de una proteína de B7-4 o PD-l a partir del medio o de la célula huésped.

Ciertas células huéspedes pueden también ser utilizadas para producir animales transgénicos no humanos. Por ejemplo, en una modalidad, una célula huésped es un oocito fertilazo o bien una célula madre embriónica en donde secuencias codificadoras de B7-4 o PD-l han sido introducidas. Tales células huéspedes pueden también ser utilizadas para crear animales transgénicos no humanos en donde secuencias de B7-4 o PD-l exógenos han sido introducidas en su genoma o bien animales recombinantes homólogos en donde secuencias de B7-4 o PD-l endógenas han sido alteradas. Tales animales son útiles para la función y/o actividad de un polipéptido de B7-4 o PD-l y para identificar y/o evaluar moduladores de la actividad B7-4 o PD-l. Como se emplea aquí, un animal transgénico es un animal no humano de preferencia un mamífero con mayor preferencia un roedor como por ejemplo una rata o un ratón en donde una de las células del animal incluye (n) un transgen. Otros ejemplos de animales transgénicos incluyen primates, borregos, perros, vacas, cabras, pollos, anfibios y similares. Un transgen es un ADN exógeno integrado en el genoma de una célula a partir de la cual un animal transgénico se desarrolla y que permanece en el genoma del animal madura, dirigiendo de esta forma la expresión de un producto tranegénico codificado en uno o varios tipos de células o tejidos del animal transgénico. Como se emplea aquí un "animal rectbinante homólogo" es un animal no humano, de preferencia un mamífero, con mayor preferencia un ratón en donde un gen de B7-4 o PD-l endógeno ha sido alterado por recombinaciones homologas entre el gen endógeno y una molécula de ADN exógena introducida en una célula del animal, por ejemplo, una célula embriónica del animal, antes del desarrollo del animal. Un animal transgénico puede ser creado mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico que codifica B7-4 o PD-l en el pronúcleo macho de un oocito fertilizado por ejemplo, mediante microinyección, infección retroviral, y permitiendo que el oocito se desarrolle en un animal receptor hembra pseudopreñada. La secuencia de ADNc de B7-4 o PD -1 de SEQ ID No. 1, 3, 10 o bien 11 puede ser introducida como un transgen de un animal no humano. Alternativamente, un homologo no humano de un gen de B7-4 o PD-l humano, como por ejemplo un gen de B7-4 o PD-l de ratón o de rata, puede utilizarse como transgen. Alternativamente, un homólogo de gen de B7-4 o PD-l como por ejemplo otro miembro de la familia B7-4 o PD-l, puede ser aislado con base en hibridación en las secuencias de ADNc de la familia de B7-4 o PD-l de SEQ ID No: 1, 3, 10 o bien 11 (que se describen con mayores detalles en la subsección I arriba y utilizarse como transgen. Secuencias intrónicas y señales de poliadenilación pueden también incluirse en el transgen con el objeto de incrementar la eficiencia de expresión del transgen. Una secuencia reguladora específica para tejido o varias secuencias reguladoras específicas para tejido puede (n) estar unida (s) de manera operativa a un transgen de B7-4 o PD-l para dirigir la expresión de la proteína de B7-4 o PD-l para dirigir la expresión de la proteína de B7-4 o PD-l a células particulares. Métodos para generar animales transgénicos a través de manipulación de embriones y microinyección especialmente animales tales como ratones, ya son convencionales en la técnica y se describen en las patentes norteamericanas números 4,736,866 y 4,870,009, ambas de Leder et al., Patente norteamericana No. 4,873,191 de Wagner et al. y en Hogan B. Manipulating The Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1986) . Métodos similares se emplean para la producción de otros animales transgénicos. Un animal fundador transgénico puede ser identificado con base en la presencia de un transgen de B7-4 PD-l en su genoma y/o la expresión de ARNm de B7-4 o PD-1 en células o tejidos de los animales, ün animal fundador transgénico puede ser utilizado después para criar animales adicionales que llevan el transgen. Además animales transgénicos que llevan un transgen que codifican una proteína de B7-4 o PD-l pueden ser cruzados adicionalmente con otros animales transgénicos que llevan otros transgenes. Para crear un animal recombinante homólogo se prepara un vector que contiene por lo menos una porción de un gen de B7- • a-.t m-tJ*-',* .9 ¡?í .'JtlÍ...* É? . . i l¡ l tmlmt np***?*£ Á^* :L¡ n?k! <rra„-~*r.**i*..,-íi¿~» í 4 o PD-l en donde se ha introducido una reacción, adición o substitución para alterar de esta forma por ejemplo, trastornar funcionalmente el gen de B7-4 o PD-l. El gen de B7-4 o PD-l puede ser un gen humano (por ejemplo, las SEQ ID No: 1, 3, 10 o bien 11), pero con mayor preferencia es un homólogo no humano de un gen de B7-4 o PD-l (por ejemplo un ADNc aislado por hibridación estricta con secuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 1, 3, 10 o bien 11). Por ejemplo, un gen de B7-4 o PD-l de ratón puede ser utilizado para construir un vector de recombinación homologa adecuado para alterar un gen de B7-4 o PD-l endógeno en el genoma del ratón. En una modalidad preferida, el vector es diseñado de tal manera que al efectuarse una recombinación homologa, el gen de B7-4 o PD-l endógeno presente un trastorno funcional (por ejemplo, ya no codifica una proteína funcional, lo que se conoce también como un vector "noqueado") . Alternativamente, el vector puede ser diseñado de tal manera que al efectuarse una recombinación homologa, el gen de B7-4 o PD-l endógeno presenta mutación o bien es alterado de otra manera pero sigue codificando una proteína funcional, por ejemplo, la región reguladora puede presentar alteración cor. el objeto de modificar de esta forma la expresión de la proteína de B7-4 o PD-l endógena. En el vector de recombinación homologa, la porción alterada del gen de B7-4 o PD-l está flanqueada en sus extremos 5' y 3' por una secuencia adicional de ácido nucleico del gen de B7-4 o PD-l para permitir la recombinación homologa entre el gen de B7-4 o PD-l exógeno llevado por el vector y un gen de B7-4 o PD-l endógeno en una célula madre embriónica. La secuencia adicional de ácidos nucleicos de B7-4 o PD-l de flanqueo es de una longitud suficiente para una recombinación homologa exitosa con el gen endógeno. Típicamente, se incluyen varios kilobases de ADN de flanco (tanto en el extremo 5' como en el extremo 3') son incluidos en el vector (véase por ejemplo Thomas K. R. y Capecchi, M. R. (1987) Cell 51:503 para una descripción de vectores de recombinación homologa) . El vector es introducido en una línea de célula madre embriónica (por ejemplo, por electroporación) y las células en las cuales el gen de B7-4 o PD-l introducido se ha recombinado de manera homologa con el gen de B7-4 o PD-l endógeno se seleccionan (véase por ejemplo Li. E. et al (1992) Cell 69:915). Las células seleccionadas son inyectadas en un blastocistos de un animal (por ejemplo un ratón) para formar quimeras de agregación (véase por ejemplo Bradley, A. en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells : A Practical Approach, Robertson, E. J. ed. (IRL, Oxford, 1987) pp. 113-152). Un embrión quimérico puede después ser implantado en un animal receptor hembra pseudopreñada adecuado y el embrión llevado a término. La progenie que presentan el ADN recombinado de manera homologa en sus células germinales puede ser utilizada para criar animales en los cuales todas las células del animal contienen el ADN recombinado de manera homologa por transmisión de línea germinal del transgen. Métodos para construir vectores de recombinación homólogos y animales recombinantes homólogos se describen adicionalmente en Bradley, A. (1991) Curr. Opin . Biotechnol . 2:823-829 y en las publicaciones internacionales PCT números: WO 90/11354 por Le Mouellec et al.; WO 91/01140 por Smithies et al; WO 92/0968 por Zijlstra et al.; y WO 93/04169 por Berns et al. Además de lo anterior, la persona experta en la materia observará que otros enfoques conocidos en la técnica para recombinación homologa pueden aplicarse a la presente invención. Sistemas de integración específicos para sitios auxiliados por enzimas son conocidos en la técnica y pueden ser aplicados para integrar una molécula de ADN en una ubicación predeterminada en una ubicación de una molécula de ADN blanco. Ejemplos de tales sistemas de integración auxiliados por encimas incluyen el sistema de blanco Cre recombinasa-lox (por ejemplo de conformidad con lo descrito en Baubonis, W. y Sauer B. (1993) Nucí . Acids Res . 21:2025- 2029; y Fukushige S. y Sauer, B (1992) Proc Nati . Acad Sci . USA 89:7905-7909) y el sistema blanco FLP recombinasa-FRT (por ejemplo de conformidad con lo descrito con Dang D. T. y Pemmon N. (1992) Dev. Genet . 13:367-375; y Fiering, S. et al. Q993) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 90:8469-8473). Sistemas de recombinación homologa inducibles regulados por tetraciclina, tales como los descritos en la publicación PCT número WO 94/29442 y ' la publicación PCT número WO 96/01313 puede también emplearse. Por ejemplo, en otra modalidad, animales no humanos transgénicos pueden ser producidos los cuales contienen sistemas seleccionados que permiten la expresión regulada del transgen. Un ejemplo del sistema de este tipo es el sistema de cre/loxP recombinasas de bacteriófago Pl . Para una descripción del sistema cre/loxP recombinasas, véase por ejemplo Lakso et al. (1992) Proc . Nati . Acad Sci . USA 89:6232-6236. Otro ejemplo de un sistema de recombinasa es el sistema de FLP recombinasa de Saccharomyces cerevi siae (O' Gorman et al (1991) Science 251:1351-1355). Si se emplea un sistema cre/loxP recombinasa para regular la expresión del transgen, animales que contiene transgenes que codificar-tanto la Cre recombinasa como una proteína seleccionada se requieren. Tales animales pueden ser proporcionados a través de la construcción de animales transgénicos "dobles", por ejemplo cruzando dos animales transgénicos, uno conteniendo un transgen que codifica una proteína seleccionada y el otro conteniendo un transgen que codifica una recombinasa. Clones de los animales transgénicos no humanos descritos aquí pueden ser también ser producidos de conformidad con los métodos descritos en Wilmut, I. et al. (1997) Nature 385:810- 813 y en las publicaciones internacionales PCT Nos WO 97/07668 y WO 97/07669. En resumen una célula, por ejemplo una célula somática, de un animal transgénico puede ser aislada e inducido a salir del ciclo de crecimiento y entrar en la fase G;. La célula quiescente puede ser después fusionada, por ejemplo a través del uso de impulsos eléctricos, en un oocito enucleado de un animal de la misma especie de la cual se aisló la célula quiescente. El oocito reconstruido es después cultivado de tal manera que se desarrolla en mórula y después es transferido a un animal receptor hembra pseudopreñado. La cría nacida de este animal receptor hembra será un clon del animal a partir del cual se aisló la célula, por ejemplo, la célula somática. V. Composiciones Farmacéuticas Moduladores de B7-4 o PD -1 (por ejemplo, agentes inhibidores o estimuladores de B7-4 o PD-l, incluyendo moléculas de ácido nucleico, proteínas, anticuerpos de B7-4 o PD-l descritos arriba, o bien compuestos identificadores como moduladores de actividad y/o expresión de B7-4 o PD-l o bien moduladores de la interacción entre B7-4 y PD-l pueden ser incorporados en composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración. Tales composiciones comprenden la molécula, proteína o anticuerpo de ácido nucleico y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se emplea aquí, la expresión "vehículo farmacéuticarente aceptable" incluye todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungales, agentes de retardos de absorción e isotónicos y similares, compatibles con administración farmacéutica . El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocidos en la técnica . Excepto en la medida en que un medio convencional o agente es incompatible con el compuesto activo se contempla el uso del mismo en las composiciones . Compuestos activos complementarios pueden también ser incorporados en las composiciones . Una composición farmacéutica de la presente invención es formulada de tal manera que sea compatible con su vía prevista de administración . Ej emplos de vías de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ej emplo por inhalación) , transdérmica ( tópica) transmucosal y rectal . Soluciones o suspensiones empleadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes : un diluyente estéril, como por ej emplo agua para inyección, solución salina, aceites fij ados, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol , o bien otros solventes sintéticos ; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o bien metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes de quelación tales como ácido etilendiamina tetraacético; amortiguadores tales como acetatos, citratos o fosfatos; y agentes para ajustar la tonicidad como por ejemplo cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ser ajustado con ácidos o bases como por ejemplo ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede estar en ampolletas, jeringas desechables, frascos de vidrio o de plástico que contienen múltiples dosis. Composiciones farmacéuticas adecuadas para inyecciones incluyen soluciones acuosas estériles (cuando están solubles en agua) o bien dispersiones o polvos estériles para las preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En el caso de administración intravenosa, vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteristática, Cremophor EL® (BASF, Parsippany NJ) o bien solución salina amortiguada con fosfato (PBS) en todos los casos, la composición debe ser estéril y debe estar en estado fluido en la medida en que existe capacidad de administración con jeringas. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe ser protegida contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un solvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. Se puede mantener la propia fluidez, por ejemplo .«JaAftikAit • "• * 'MiHifa mediante el uso de un revestimiento, por ejemplo lecitina, mediante el mantenimiento requerido de partículas de dispersión y mediante el uso de surfactantes. La prevención de la acción de microorganismos puede lograrse a través de varios factores antibacterianos y antifungales, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. Una absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser causada por la inclusión en la composición de un agente que retarda la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina. Soluciones inyectables estériles pueden ser preparadas mediante la incorporación del compuesto activo (por ejemplo, una proteína de B7-4 o PD-l o bien anticuerpo anti-B7-4 o PD-1) en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno de los ingredientes enumerados arriba o bien una combinación de dichos ingredientes, según lo requerido, seguido por esterilización filtrada. En general, se preparan dispersiones mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos entre los enumerados arriba. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secados en vacío y liofilización que proporciona un polvo de un ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente filtrada estéril del mismo. Composiciones orales incluyen generalmente un diluyente inerte o un vehículo comestible. Pueden estar en cápsulas de gelatina o bien comprimidas en tabletas. Para el propósito de administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y utilizarse en forma de tabletas, trociscos o cápsulas. Composiciones orales pueden también prepararse empleando un vehículo fluido para su uso como enjuague bucal, en donde el compuesto en el vehículo fluido es aplicado oralmente y se hacen gárgaras y se expectora o se traga. Agentes de enlace farmacéuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes pueden incluirse corno parte de la composición. Las tabletas, pildoras, trociscos y similares pueden contener cualesquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglomerante como por ejemplo celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente como por ejemplo almidón lactosa, un agente de desintegración como por ejemplo ácido algínico, primogel, o bien almidón de maíz; un lubricante como por ejemplo estearato de magnesio o Sterotes; un agente de deslizamiento como por ejemplo dióxido de silicio coloidal; un endulzante como por ejemplo sucrosa o sacarina; o bien un agente saborizante como por ejemplo menta, salicilato de metilo, o sabor a naranja. Para administración por inhalación, los compuestos son administrados en forma de un rocío de aerosol a partir de un recipiente bajo presión o aparato surtidor que contiene un impelante adecuado como por ejemplo gas de tipo dióxido o un atomizador. La administración sistémica puede también ser transmucosal o transdérmica. En el caso de administración transmucosal o transdérmica, agentes de penetración apropiados para la barrera a premiar se emplean en la formulación. Tales agentes de penetración son generalmente conocidos en la técnica e incluyen por ejemplo, para la administración transmucosal, detergentes, sales biliares, y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosal puede lograrse a través del uso de rocíos nasales o supositorios. Para administración transdérmica los compuestos activos son formulados en ungüentos, bálsamos, geles o bien cremas como se sabe generalmente en la técnica. Los compuestos pueden tamcién preparar en forma de supositorios (por ejemplo con bases convencionales para supositorios tales como manteca de cocoa y otros glicéridos) o bien enemas de retención par¿ administración rectal. En una modalidad, se preparan agentes moduladores con vehículos que protegen el compuesto contra una eliminación rápida del cuerpo, como por ejemplo una formulación de liberación controlada, que incluyen implantes y sistemas de administración microencapsulados. Polímeros biodegradables, biocompatibles pueden emplearse como por ejemplo acetato de etileno vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágena, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Métodos para la preparación de tales formulaciones deben ser aparentes para los expertos en la materia. Los materiales pueden ser obtenidos también comercialmente en Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. Suspensiones liposomales (incluyendo liposomas enfocados a células infectadas con anticuerpos monoclonales para antígenos virales) pueden también ser empleadas con vehículos farmacéuticamente aceptables. Pueden prepararse de conformidad con métodos conocidos por parte de los expertos en la materia, por ejemplo, de conformidad con lo descrito con la patente norteamericana número 4,522,811. Es especialmente provechoso formular composiciones orales o parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La expresión forma unitaria de dosificación como se emplea aquí se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo que se calcula para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención depende directamente de las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular a lograr, y de las limitaciones inherentes a la técnica de formar compuestos con dicho compuesto activo para el tratamiento de individuos. La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos pueden determinarse por procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos de células o bien en animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población) . La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es lo que se conoce como el índice terapéutico que puede expresarse como la proporción LD50/ED50. Compuestos que muestran índices terapéuticos grandes son preferidos. Mientras que se pueden emplear compuestos que presentan ejemplos colaterales tóxicos se debe tomar precauciones para diseñar un sistema de administración que enfoca dichos compuestos hacia el sitio del tejido afectado con el objeto de minimizar el daño potencial a células no infectadas y, por consiguiente, reducir los efectos colaterales. Los datos obtenidos a partir de los ensayos de cultivo de células y estudios con animales pueden emplearse para formular un rango de dosificación para su uso en seres humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra de preferencia dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poco toxicidad o sin ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este rango según la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier coapuesto utilizado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva puede ser estimada inicialmente a partir de ensayos de cultivo de células. Una dosis puede ser formulada en modelos de animales para lograr un rango de concentración plasmática circulante que incluye la IC50 (es decir la concentración de compuestos de prueba que logra una inhibición semimáxima de los síntomas) de conformidad con lo determinado con cultivo de células. Dicha información puede ser utilizada para determinar con mayor precisión dosis útiles en seres humanos. Los niveles plasmáticos pueden ser medidos, por ejemplo, por cromatografía de líquido de alto desempeño . Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser insertadas en vectores y utilizadas como vectores para terapia génica. Vectores de terapia génica pueden ser suministrados a un sujeto por ejemplo mediante inyección intravenosa, administración local (véase Patente Norteamericana número 5,328,470) o bien mediante inyección estereotáctica (véase, por ejemplo, Chen et al. (1994) Proc . <!>A-Íl-iAJ «J MlU -ail-*—....lá—pii.!.,, ..i li I - --1" -"-.^.,fa,tftf8."»---^^^-'-^^-=i'^-*^^fff ..l«ÍÍ Nati . Acad. Sci . USA 91:3054-3057). La preparación farmacéutica del vector de terapia génica puede incluir el vector de terapia génica en un diluyente aceptable o bien puede comprender una matriz de liberación lenta en donde el vehículo de administración de gen se encuentra integrado. Alternativamente, cuando el vector de administración de gen completo puede ser reproducido intacto a partir de células recombinantes, por ejemplo vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o varias células que producen el sistema de administración de genes. Las composiciones farmacéuticas pueden estar incluidas en un recipiente, empaque o bien surtidor junto con instrucciones para administración. VI . Usos y métodos de la invención Los agentes moduladores de B7-4 y/o PD-l, por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico, proteínas homologas de proteína, anticuerpos descritos aquí pueden utilizarse en uno o varios de los siguientes métodos: a) métodos de tratamiento, por ejemplo por modulación ascendente o descendente de ia respuesta inmunológica; b) ensayo de tamizado; c) medicina predictiva (por ejemplo ensayos de diagnóstico, ensayos ce pronóstico, ensayos de químicos de monitoreo, y farmacogenética) . Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la invención pueden emplearse, por ejemplo para expresar proteína de B7-4 PD-l (por ejemplo a través de un vector ae expresión recombinante en una célula huésped en aplicaciones de terapia génica) para detectar ARNm de B7-4 o PD-l (por ejemplo, en una muestra biológica) o una alteración genética en gen de B7-4 o PD-l y para modular la actividad de B7-4 PD-1 como se describe con mayores detalles a continuación. Las proteínas de B7-4 o PD-l pueden utilizarse para tratar trastornos caracterizados por una producción insuficiente o excesiva de inhibidores de B7-4 o PD-l. además, las proteínas de B7-4 o PD-l pueden utilizarse para tamizar socios de enlace de B7-4 o PD-l que ocurren naturalmente para tamizar fármacos o compuestos que modulan la actividad de B7-4 o PD-l así como para tratar trastornos caracterizados por producción insuficiente o excesiva de proteína de B7-4 o PD-l o producción de formas de proteína de B7-4 o PD-l que tienen una actividad disminuida o aberrante en comparación con proteína de B7-1 o PD-l de equipo silvestre. Además, los anticuerpos anti-B7-4 o PD-l de la invención pueden emplearse para detectar y aislar proteínas de B7-4 o PD-l, regular la biodisponibilidad de proteínas de B7-4 o PD-l, y modular la actividad B7-4 o PD-l, por ejemplo, mediante la modulación de la interacción de B7-4 y PD-l. A. Métodos de tratamiento: La presente invención ofrece métodos profilácticos y terapéuticos de tratar un sujeto en riesgo de presentar un trastorno o susceptible de presentar un trastorno o que tiene . l. t -.i. í ? Í . . .I -* . . *&*.*.«,. . •" - • -' * "***-fat» un trastorno asociado con una expresión o actividad aberrante de B7-4 PD-l. 1. Métodos profilácticos En un aspecto, la invención proporciona un método para prevenir en un sujeto, una enfermedad o condición asociada con una expresión o actividad aberrante de B7-4 o PD-l, mediante la administración al sujeto de un polipéptido de B7- 4 o PD-l o un agente que modula la expresión de polipéptidos de B7-4 o PD-l o por lo menos una actividad de B7-4 o PD-l. sujetos en riesgo de una enfermedad provocada o a la cual contribuye una expresión o actividad aberrante de B7-4 o PD-l pueden ser identificados por ejemplo mediante cualesquiera de los ensayos de diagnóstico o pronóstico descritos aquí o bien a través de una combinación de dichos ensayos. La administración de un agente profiláctico puede ocurrir antes de la manifestación de síntomas característicos de aberración de B7-4 o PD-l, de tal manera que se previene una enfermedad o un trastorno, o bien, alternativamente se retarda su avance. Según el tipo de aberración o condición de B7-4 o PD-l, por ejemplo, un polipéptido de B7-4 o PD-l, un agonista de B7-4 o PD-l, o un antagonista de B7-4 o PD-l puede utilizarse para tratar el paciente. El agente apropiado puede ser determinado con base en indicaciones clínicas y puede ser identificado, por ejemplo, utilizando ensayos de tamizado descritos aquí. 2. Métodos terapéuticos Otro aspecto de la invención se refiere a métodos para modular la expresión o actividad de B7-4 o PD-l para propósitos terapéuticos. Se ha demostrado que B7-4 inhibe la co-estimulación de proliferación de células inmunológicas activadas y transmite una señal inhibidora a células inmunológicas a través de PD-l. por consiguiente la actividad y/o expresión de B7-4 o PD-l así como la interacción entre B7-4 y PD-l pueden ser moduladas con el objeto de modular la respuesta inmunológica se entenderá que en modalidades en donde B7-4 se une a un receptor co-estimulador, la regulación ascendente de la actividad de B7-4 resulta en una regulación ascendente de respuestas inmunológicas, mientras que una regulación descendente de la actividad de B7-4 resulta en una regulación descendente de respuestas inmunológicas. En modalidades en las cuales B7-4 se une a receptores inhibidores, la regulación ascendente de la actividad B7-4 resulta en una regulación descendente de respuestas inmunológicas. Mientras que una regulación descendente de la actividad de B7-4 resulta en una regulación ascendente de respuestas inmunológicas. En una modalidad preferida B7-4 se une a receptores inhibidores. En una modalidad particularmente preferida, B7-4 se une a PD-l. Métodos moduladores de la presente invención incluyen la puesta en contacto de una célula con un modulador de un polipéptido de B7-4 o PD-l, por ejemplo, un agente que modula la expresión o actividad de B7-4 y/o PD-l o un agente que modula la interacción de B7-4 y PD-l. Un agente que modula la actividad de proteína de B7-1 o PD-l es un agente de conformidad con lo descrito aquí, como por ejemplo un ácido nucleico o una molécula de proteína, una molécula blanco que ocurre naturalmente de una proteína de B7-4 o PD-l (por ejemplo, PD-l en el caso de B7-4 en el caso de PD-l), un anticuerpo para B7-4 o PD-l, un agonista o antagonista de B7-4 o PD-4, un péptido mimético de un agonista o antagonista de B7-4 o PD-l o bien otras moléculas pequeñas. Un agente que modula la expresión de B7-4 o PD-l es por ejemplo una molécula de ácido nucleico de antisentido, oligonucleótido de triples, o bien una ribozima o un vector recombinante para expresión de una proteína de B7-4 o PD-l. por ejemplo, un oligonucleótido complementario del área alrededor de un sitio de inicio de traducción de polipéptido de B7-4 o PD-l puede sintetizarse. Uno o varios oligonucleótidos de antisentido pueden agregarse a medio de células, típicamente a 200 µg/ml o bien pueden administrarse a un paciente para prevenir la síntesis de un polipéptido de B7-4 o PD-l. El oligonucleótido de antisentido es absorbido por células y se híbrida con un ARNm de B7-4 o PD-l para prevenir la traducción. Alternativamente, un oligonucleótido que se une con ADN de cadena doble para formar un constructo triples para prevenir el desenrollado y la transcripción de ADN puede emplearse. Como resultado de cualesquiera de estos, la síntesis de un polipéptido de B7-4 o PD-l es bloqueada. Cuando la expresión de PD-l es modulada, de preferencia, dicha modulación ocurre por un medio otro que mediante el noqueado del gen de PD-l. Agentes que modulan la expresión, a partir del hecho que controla la cantidad de PD-l o B7-4 en una célula, modulan también la cantidad total de actividad de PD-l o B7-4 en una célula. En una modalidad, un agente que estimula una actividad inhibidora de B7-4 o una actividad inhibidora de PD-l es un agonista de B7-4 o PD-l. ejemplos de tales agentes incluyen proteína de B7-4 o PD-l y una molécula de ácido nucleico que codifica polipéptido de B7-4 o PD-l que han sido introducidos en la célula. En otra modalidad, el agente inhibe la actividad co-estimuladora o inhibidora de B7-4 o la actividad inhibidora de PD-l y es un agonista de B7-4 o PD-l. Ejemplos de tales agentes incluyen moléculas de ácido nucleico de B7-4 o PD-l de antisentido, anticuerpos anti-B7-4 o PD-l, formas no activadores, solubles de moléculas de B7-4 o PD-l así como inhibidores de B7-4 o PD-l. Estos agentes moduladores pueden ser administrados in vi tro J ká?É (por ejemplo, mediante el contacto de una célula ccn un agente), o alternativamente, in vi vo (por ejemplo, mediante la administración de un agente a un sujeto) . Como tai, la presente invención proporciona métodos para tratar un individuo que padece de una enfermedad o trastorno que podría beneficiarse de la modulación de proteína de B7-4 o PD-l por ejemplo, un trastorno que podría beneficiarse de una modulación ascendente o descendente de la respuesta inmunológica o bien que se caracteriza por una expresión o actividad aberrante de proteína de B7-4 o PD-l o molécula de ácido nucleico. En una modalidad, el ácido incluye la administración de un agente (por ejemplo, un agente identificado mediante un ensayo de tamizado descrito aquí), o una combinación de agentes que modula (por ejemplo regula de manera ascendente o regula de manera descendente) la expresión o actividad de B7-4 o PD-l. En otra modalidad, el método incluye la administración de una proteína de B7-4 o PD-l o molécula de ácido nucleico como terapia para compensar la expresión o actividad reducida o aberrante de B7-4 o PD-l. La estimulación de la actividad de B7-1 o PD-l es deseable en situaciones en las cuales B7-4 o PD-l es regulado de manera descendente en forma anormal y/o en las cuales una actividad incrementada de B7-4 o PD-l tendrá probablemente un efecto benéfico. De la misma manera, la inhibición de la actividad de B7-4 o PD-l es deseable en situaciones en las cuales B7-4 ?mí .*^ú^ ,.Át ??jíÁl -ffim -i$?¡í, ¿ ** * - * £ *,. >. ~«.?.« -**>-. o PD-l es regulado de manera ascendente en forma anormal y/o en situaciones en las cuales una actividad disminuida de B7-4 o PD-l tendrá probablemente un efecto benéfico. Una persona con conocimientos normales en la materia podrá reconocer que en modalidades en las cuales B7-4 se une a un co-estimulador, la estimulación de B7-4 y la estimulación de PD-l tienen efectos opuestos sobre la co-estimulación de las células inmunológicas y por consiguiente sobre la respuesta inmunológica. En un caso de este tipo, cuando la estimulación de la actividad de una molécula es deseable, la supresión de la actividad de la otra molécula es deseable. Agentes ejemplares para su uso para modular de manera descendente B7-4 (antagonistas de B7-4) incluyen (por ejemplo) : moléculas de antisentido, anticuerpos que reconocen B7-4, compuestos que bloquean la interacción de B7-4 y uno de sus receptores que ocurren naturalmente en una célula inmunológica (por ejemplo, moléculas B7-4 monovalentes, solubles, así como formas solubles de ligandos de B7-4 o compuestos identificados en los ensayos de tamizado de sujeto) . Agentes ejemplares para su uso en la modulación descendente de PD-l (antagonistas de PD-l) incluyen (por ejemplo) : moléculas de antisentido, anticuerpos que se unen con PD-l, pero no transducen una señal inhibidora a la célula inmunológica ("anticuerpos no activadores") y formas solubles de PD-l. 4.?Á .

Ejemplos ejemplares para su uso en la modulación ascendente de B7-4 (agonistas de B7-4) incluyen (por ejenplo) : moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de B7-4, formas multivalentes de B7-4, compuestos que incrementan la expresión de B7-4, y células que expresan B7-4, etc. ejemplos ejemplares para su uso en la modulación ascendente de PD-l (agonistas de PD-l) incluyen (por ejemplo) : anticuerpos que transmiten una señal inhibidora a través de FD-1, compuestos que incrementan la expresión de PD-l, moléculas de ácido nucleico que codifican PD-l, y formas de B7-4 que transducen una señal a través de PD-l. 3. Regulación descendente de respuestas inmunológicas mediante modulación de B7-4 o PD-l Existen numerosas modalidades de la invención para regular de manera ascendente la función inhibidora o bien para regular de manera descendente la función co-estimuladora de un polipéptido de B7-4 con el objeto de regular de esta forma de manera descendente las respuestas inmunológicas. La regulación descendente puede tener la forma de la inhibición o del núcleo de una respuesta inmunológica ya en progreso o bien puede involucrar la prevención de la inducción de una respuesta inmunológica. Las funciones de células inmunológicas activadas pueden ser inhibidas mediante la regulación descendente ce respuestas de células inmunológicas o bien mediante la inducción de anergía específica en células inmunológicas o bien ambas cosas. Por ejemplo, anticuerpos ant?-B7-4 o bien polipéptidos de B7-4 (por ejemplo, formas monoméricas solubles de un polipéptidc de B7-4 como por ejemplo B7-4-Ig) , y/o anticuerpos anti-B7-4 que bloquean la interacción de B-7-4 con un receptor co-estimulador pueden emplearse para inhibir una señal co-estimuladora, y, por consiguiente, regular de manera descendente la respuesta inmunológica. Además, en modalidades en las cuales B7-4 se une a u receptor inhibidor, formas de B7-4 que se unen con el receptor inhibidor, por ejemplo B7-4 multivalente en una superficie de célula pueden emplearse para modular de manera descendente la respuesta inmunológica. De la mima manera, la vía de PD-l puede ser también estimulada mediante el uso de un agente para modular de esta forma de manera descendente la respuesta inmunológica. La inhibición de la interacción de B7-4 con un receptor estimulador en una célula inmunológica (por ejemplo mediante el uso de una forma soluble (PDl- y/o CTLA4) o bien activación de PD-l (utilizando un anticuerpo activador que atraviesa PD-1) puede proporcionar señales negativas a células inßBRológicas . En una modalidad de la invención, un anticuerpo activador utilizado para estimular la actividad de PD-l es un anticuerpo biespecífico. Por ejemplo, dicho anticuerpo puede . -aStit comprender un sitio de unión de PD-l y otro sitio de unión que enfoca un receptor de superficie de célula en una célula inmunológica, por ejemplo, en una célula T, una célula B o bien una célula mieloide. En una modalidad, dicho anticuerpo, además de comprender un sitio de unión de PD-l, puede comprender además un sitio de unión que se une a una molécula que se encuentra cerca de un receptor activador o inhibidor, por ejemplo un receptor de antígeno de célula B, un receptor de antígeno de célula T o un receptor de Fe con el objeto de enfocar la molécula a una población de células específicas. Por ejemplo, se puede emplear un antígeno de CD3, una cadena de receptor de células T, LFA-1, CD2, CTLA-4, inmunoglobulina, receptor de célula B, Ig alfa, Ig beta, CD22, o bien un receptor de FC. Tales anticuerpos (o bien otros agentes biespecíficos son conocidos en la técnica y pueden ser producidos, por ejemplo, de conformidad con lo descrito aquí. La selección de este segundo antígeno para el anticuerpo biespecífico proporciona flexibilidad para seleccionar una población de células a enfocar para inhibición. En otra modalidad, la coligación de PD-l y un receptor activador o inhibidor en una célula puede incrementar la generación de una señal negativa a través de PD-l. Dicha coligación puede lograrse, por ejemplo, mediante el uso de un agente biespecífico, por ejemplo un anticuerpo biespecífico de conformidad con lo descrito aquí que tiene una especificidad tanto para PD-l como para una molécula asociada con un receptor. En otra modalidad, el use de una forma multivalente de un agente que transmite una señal negativa a través de PD-l puede emplearse para incrementar la transmisión de una señal negativa a través de PD-l, un agente presentado en una perla o una superficie. En otra modalidad, dicho agente multivalente puede comprender dos especificidades para lograr la coligación de PD-l y un receptor o una molécula asociada con receptor (por ejemplo una perla que comprende anti CD3 y B7-4) . Agentes que bloquean o inhiben la interacción de B7-4 con un receptor co-estimulador (por ejemplo, formas solubles de B7-4 o anticuerpos bloqueadores para B7-4) así como agentes que promueven una señal inhibidora mediada por B7-4 o agonistas de PD-l que activan PD-l (por ejemplo anticuerpos activadores de PD-l o bien moléculas pequeñas activadores de PD-l) pueden ser identificados por su capacidad para inhibir la proliferación de células inmunológicas y/o función efectora o bien para inducir anergía cuando se agregan a un ensayo in vitro. Por ejemplo, células pueden ser cultivadas en presencia de un agente que estimula una transducción de señal a través de un receptor activador. Numerosas lecturas reconocidas en las técnicas de activación de células pueden emplearse para medir, por ejemplo, la proliferación de t«¿„í-¿. Á A. i t».3 laA3¿j ^^^¿ células o la función efectora, (por ejemplo, producción de anticuerpos, producción de citocinas, fagocitosis) en presencia del agente activador. La capacidad de un agente de prueba para bloquear esta activación puede ser determinada fácilmente mediante la medición de la capacidad del agente para efectuar una disminución de la proliferación o función efectora que se está midiendo. En una modalidad de la invención la tolerancia es inducida contra antígenos específicos mediante la co-administración de un antígeno con un agonista de PD-l. Por ejemplo, la tolerancia puede ser^ inducida a proteínas específicas. En una modalidad, respuestas inmunológicas a alérgenos o proteínas foráneas a las cuales una respuesta inmunológica es indeseable pueden ser inhibidas. Por ejemplo, pacientes que reciben factor VIII generan frecuentemente anticuerpos contra este factor de coagulación. La co-administración de un agente que bloquea una señal co-estimuladora medida por B7-4 o un agente que estimula una señal inhibidora mediada por PD-l en combinación con factor recombinante VIII o bien mediante enlace físico con VIII por ejemplo, mediante reticulación puede resultar en una modulación descendente . En una modalidad, proteínas de fusión que comprenden un primer péptido de B7-4 fusionado con un segundo péptido que tiene una actividad de otro antígeno de linfocito B (por ejemplo B7-1 a B7-2), pueden emplearse para bloquear la interacción de B7-4 con un receptor co-estimulador en una célula inmunológica para modular de manera descendente respuestas inmunológicas. Alternativamente, dos péptidos preparados (por ejemplo un polipéptido de B7-4 con B7-2 y/o B7-1) o una combinación de anticuerpos bloqueadores (por ejemplo anticuerpos contra un polipéptido de B7-4 con anticuerpos monoclonales anti-B7-2 y/o anti-B7-l) pueden combinarse como una composición única o bien administrarse para la venta (de manera simultánea o secuencial) con el objeto de regular de manera descendente respuestas inmunológicas mediadas por células inmunológicas en un sujeto. Además, una cantidad terapéuticamente activa de uno o varios péptidos que tienen una actividad de polipéptido de B7-4, con B7-1 y/o actividad de B7-1 puede utilizarse en combinación de otros reactivos de modulación descendente con el objeto de influenciar respuestas inmunológicas. Ejemplos de otros reactivos inmunomoduladores incluyen anticuerpos que bloquean una señal co-estimuladora (por ejemplo contra CD28, ICOS), anticuerpos que activan una señal inhibidora a través de CTL4 y/o anticuerpo contra otros marcadores de células inmunológicas (contra CD40, contra ligando de CD40, o bien contra citocinas) , proteínas de fusión (por ejemplo, CTLA4- Fc, PD-l-Fc) y fármacos inmunosupresores (por ejemplo rapamicina, ciclosporina A o FK506) . Los péptidos de B7-4 o PD-l pueden ser también útiles en la > . a.iÍi..i- l.Í.?i-.J .a,i£:Lj?» i.,.. . ,S?**. .- - ..*-* . construcción de agentes terapéuticos que bloquean la función de células inmunológicas mediante la destrucción de células, por ejemplo porciones de un polipéptido de B7-4 o PD-l pueden estar unidas a una toxina para hacer que un agente citotóxico 5 pueda desencadenar la destrucción de células a las cuales se une. Para formar agente citotóxicos los polipéptidos de la presente invención pueden estar unidos, o bien fijados operativamente, a toxinas empleando técnicas bien conocidas, 10 por ejemplo reticulación o bien a través de técnicas de ADN recombinante. La preparación de inmunotoxinas se conoce bien en general (véase por ejemplo patentes norteamericanas número 4,340,535 y EP 44167, ambas incorporándose aquí por referencia. Numerosos tipos de enlazadores que contienen 15 enlaces de disulfuro son conocidos que pueden ser empleados exitosamente para configurar la porción de toxina con un polipéptido. En una modalidad, enlazadores que contienen un enlace disulfuro estéricamente "impedido" se prefieren debido a su mayor estabilidad in vivo evitando así la liberación de 20 la porción de toxina antes de la unión en el sitio de acción. Se conoce una amplia gama de toxinas que pueden ser conjugadas con polipéptidos o anticuerpos de la invención. Ejemplos incluyen numerosas toxinas derivadas de plantas útiles, hongos o hasta bacterias que, a título de ejemplo, 5 incluyen varias toxinas de cadena A especialmente cadena A de 'St& ?*..jñ*-* ?*. i *¡*.*.t*~í*.J¿***í.jsi -..- ... .... .* .Ji. ricina, proteínas desactivadoras de ribosoma tales como saporina o gelonina, alfa-sarcina, aspergilina, restrictocina, ribonucleasas tales como ribonucleasa de placenta, toxina de difteria, angiogénica, así como exotoxina de pseudomonas, etc. Una porción de toxina preferida para su uso con relación a la presente invención es la cadena A que ha sido tratada para modificar o remover residuos de carbonato, cadena A desglicosilada. (Patente Norteamericana No. 5,776,427) . La infusión de uno de estos agentes citotóxicos o una combinación de tales agentes citotóxicos, (por ejemplo, B7-4- ricina, sola o en combinación B7-2-ricina o bien B7-1- ricina) , en un paciente puede resultar en la muerte de las células inmunológicas especialmente to ando en cuenta la presencia de células inmunológicas activadas que expresan cantidades más altas de ligandos B7-4. por ejemplo, puesto que PD-l es inducido en la superficie de linfocitos activados, un anticuerpo contra PD-l puede ser utilizado para enfocar la depleción de estas células específicas por mecanismos dependientes de Fc-R o bien por ablación por conjugación de un fármaco citotóxico (por ejemplo ricina, saporina, o bien caliqueamicina) al anticuerpo. En una modalidad, la toxina de anticuerpo puede ser un anticuerpo biespecífico. Tales anticuerpos biespecíficos son útiles para enfocar una población de células específicas empleando por ?' Ai&A .ii&áiííiJ *...*_ *. .**,.* *?',.^. ,tM t*».^--u-^-*irt »¿-M»a ejemplo un marcador encontrado solamente en cierto tipo ae células, por ejemplo, una molécula TSR, BCR o FcR. La regulación descendente o la prevención de funciones co- esti uladoras de polipéptido de B7-4 o activación de una función inhibidora B7-1 o PD-l (por ejemplo mediante ia estimulación de la función de señalización negativa de PD-l) es útil para regular de manera descendente la respuesta inmunológica, por ejemplo, en situaciones de transplante de tejido, piel u órgano, en enfermedad de injerto versus huésped (GVHD) , o en enfermedades autoinmunes teles como lupus eritematoso sistémico, y esclerosis múltiple. Por ejemplo, el bloqueo de la función de células inmunológicas resulta en una destrucción reducida de tejido en transplante de tejido. Típicamente, en transplante de tejido, el rechazo del transplante es iniciado a través de su reconocimiento como foráneo por células inmunológicas seguido por una reacción inmunológica que destruye el transplante. La administración de una molécula que inhibe o bloquea la interacción de una molécula B7 con un receptor co-estimulador o varios receptores co-estimuladores en células inmunológicas (por ejemplo la forma monomérica soluble de un polipéptido de B7-4 a PD-l) sola o en combinación con otro agente de modulación descendente antes del transplante o al momento del transplante puede inhibir la generación de una señal co- estimuladora. Además, la inhibición de señales co- j ?.. aLa.-4»á . -c -¿ estimuladoras de B7-4, o la promoción de una señal inhibidora de B7-4 o PD-l puede también ser suficiente para anergizar las células inmunológicas induciendo por consiguiente tolerancia en un sujeto. La inducción de tolerancia de largo plazo mediante el bloqueo de una señal co-estimuladora mediada por B7-4 puede evitar la necesidad de repetir la administración de estos reactivos bloqueadores. Para lograr una inmunosupresión o tolerancia suficiente en un sujeto, puede ser también deseable bloquear la función coestimuladora de otras moléculas. Por ejemplo, puede ser deseable bloquear la función de B7-1 y 37-4, B7-2 y B7-4 o B7-1 y B7-2 y B7-4 mediante la administración de una forma soluble de una composición de péptidos que tienen una actividad de cada uno de estos antígenos o bien mediante el bloqueo de anticuerpos contra estos antígenos (separadamente o junto en una composición única antes del transplante o al momento del transplante. Alternativamente, puede ser deseable promover la actividad inhibidora de B7-4 o PD-l e inhibir una actividad co-estimuladora de B7-1 y/o B7-2. Otros agentes de modulación descendente que pueden ser utilizados en conexión con los métodos de modulación descendente de la invención incluyen, por ejemplo agentes que transmiten una señal inhibidora a través de CTLA4, formas solubles de CTLA4, anticuerpos que activan una señal inhibidora a través de CTLA4, anticuerpos bloqueadores contra otros marcadores de fcj-¿-fc»-_ l.lt-Í-.-»?,_, ¿fea. células inmunológicas o bien formas de solubles de otros pares de receptores-ligandos (agentes que trastornan la interacción entre CD40 y ligando de ZDA O (por ejemplo, anticuerpos antiligando de CD40) ) , anticuerpos contra 5 citocinas o bien fármacos inmunosupresores. En otra modalidad, una combinación de por lo menos dos anticuerpos de B7-4 diferentes pueden ser administrados para lograr una actividad de bloqueo óptima. Por ejemplo, el bloque de la estimulación de polipéptido de 10 B7-4 o activación de una función inhibidora de B7-4 o PD-l es también útil para tratar una enfermedad autoinmunológica. Muchos trastornos autoinmunológicos son el resultado de una activación inapropiada de células inmunológicas que reaccionan contra el tejido mismo y que promueven la 15 producción de citocinas y anticuerpos involucrados en la patología de las enfermedades. La prevención de la activación de células inmunológicas autoreactivas puede reducir o eliminar los síntomas de una enfermedad. La administración de reactivos que bloquean la co-estimulación de células 20 inmunológicas mediante el trastorno de las interacciones receptor: ligando de moléculas de B7 con receptores co- estimuladores es útil para inhibir la activación de células inmunológicas y prevenir la producción de autoanticuerpos o citocinas que pueden estar involucrados en el proceso de la 25 enfermedad. Además, agentes que promueven una función --É-É-Í-i-^-W--B-ttÍiif¡« -fc-.M-.t. t . »— * •» ».ti. ^»..a.»^.-i--..-..-MM-»-^?.Ji8atifc.Ji-a».jt ¿MlaA At-ü J- inhibidora de B7-4 o PD-l pueden inducir una tolerancia específica para antígenos o células inmunolcgicas autoreactivas que podrían provocar un alivio de largo plazo de la enfermedad. La eficacia de reactivos para prevenir o mitigar trastornos autoinmunes puede ser determinada utilizando numerosos modelos de animales bien caracterizados de enfermedades autoinmunológicas humanas. Ejemplos incluyen encefalitis autoinmunológica experimental de murino lupus eritematoso sistémico en ratones MRL/lpr.'ipr o bien ratones híbridos NZB, artritis de colágena aatoinmunológica de murino, diabetes mellitus en ratones NOD y ratas BB, así como myasthenia gravis experimental en murinos (véase Paul ed. Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, páginas 840-856) . La inhibición de la activación de células inmunológicas es terapéuticamente útil para el tratamiento de alergia y reacciones alérgicas, por ejemplo, mediante la inhibición de la producción de IgE. Un agente que promueve una función inhibidora de B7-4 o PD-l puede ser administrado a un paciente alérgico con el objeto de inhibir respuestas alérgicas mediadas por células inmunológicas en el sujeto. La activación de un polipéptido de PD-l puede también ser útil para tratar alergias. La inhibición de la co-estimulación de B7-4 de células inmunológicas o estimulación de una vía inhibidora de B7-4 o PD-l puede estar acompañada por exposición a alérgeno en combinación con moléculas de MHC apropiadas. Reacciones alérgicas pueden ser sistémicas o bien de naturaleza local, según la vía de entrada del alérgeno y según el patrón de depósito de IgE en mastocitos o basofilos. 5 Así, se logra la inhibición de respuestas alérgicas mediadas por células inmunológicas local o sistémicamente mediante la administración de una forma inhibidora de un agente que inhibe la interacción de B7-4 con un receptor co-estimulador o un agente que promueve una función inhibidora de B7-4 o PD- 10 1. La inhibición de activación de célula inmunológicas a través del bloqueo de una actividad co-estimuladora de B7-4 o estimulación de actividad inhibidora de PD-l puede también ser importante terapéuticamente en infecciones virales de 15 células inmunológicas. Por ejemplo en el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) la replicación viral es estimulada por la activación de células inmunológicas. El bloqueo de una interacción de B7-4/receptor co-estimulador o la estimulación de una función inhibidora de B7-4 o PD-l 20 puede resultar en la inhibición de replicación viral y por consiguiente mejorar la evolución del SIDA. La regulación descendente de una respuesta inmunológica a través de la estimulación de actividad de B7-4 o interacción de B7-4 con su socio de enlace natural o sus socios de enlace naturales, 25 por ejemplo, PD-l, puede también ser útil para promover el *^f^ •* ¡¿U Má- í**- vA^.». mantenimiento del embarazo. B7-4 es normalmente expresada con mayor nivel en trofoblastos placentales, la capa de células que forma la interfaz entre la madre y el feto y puede desempeñar una función en la prevención del rechazo materno del feto. Hembras en riesgo de aborto espontáneo (por ejemplo, las identificadas por tamizado para detectar actividad de B7-4, según se describe en la sección de "ensayos de pronósticos", que han tenido aborto espontáneo previo o bien que han tenido dificultadas para concebir) debido a rechazo inmunológico del embrión o ael feto pueden ser tratadas con agentes que estimulan la actividad de B7-4 o su interacción con su socio de enlace natural o socios de enlace naturales, por ejemplo PD-l. La regulación descendente de una respuesta inmunológica a través de la estimulación de actividad de B7-4 o interacción B7-4 con su socio de enlace natural o sus socios de enlace naturales, por ejemplo PD-l, puede también ser útil para el tratamiento de un ataque autoinmunológico de tejidos autólogos. Por ejemplo, B7-4 es normalmente expresada de manera elevada en el corazón y protege el corazón contra un ataque autoinmunológico. Esto es evidenciado por el hecho que ratones Balb/c noqueados en cuanto a PD-l presentan ataque autoinmune masivo en el corazón con trombosis. Así, condiciones provocadas o exacerbadas por un ataque inmunológico (por ejemplo, enfermedad cardiaca, infarto del ,¿H miocardio o bien aterosclerosis) pueden ser mejoradas mediante el incremento de la actividad B7-4 o enlazando B7-4 con su socio de enlace natural, ?D-1. por consiguiente, dentro del alcance de la presente invención se encuentra la modulación de condiciones exacerbadas por ataque autoinmune como por ejemplo trastornos auto nmunológicos (así como condiciones tales como enfermedad cardiaca, infarto del miocardio y aterosclerosis mediante la estimulación de la actividad B7-4 o interacción de B7-4 con B7-4. 4. Regulación ascendente de respuestas inmunológicas La regulación ascendente de actividad co-estimuladora de B7-4 o la inhibición de una actividad inhibidora de PD-l o B7-4 como medio para regular de manera ascendente las respuestas inmunológicas es también útil en la terapia una regulación ascendente de respuestas inmunológicas puede tener la forma del incremento de una respuesta inmunológica existe o bien provocar una respuesta inmunológica inicial. Por ejemplo, el incremento de una respuesta inmunológica a través de la estimulación de la actividad co-estimuladora de B7-4 o la inhibición de la actividad inhibidora de B7-4 o PD-l es útil en casos de infecciones con microbios, por ejemplo bacteria, virus, o parásitos. Por ejemplo, en una modalidad, una forma de B7-4 que promueve una señal co-estimuladora en una célula inmunológica (por ejemplo un péptido de B7-4 en una forma multivalente (por ejemplo una forma multivalente soluble o una forma expresada en una superficie celular) ) o un agente que inhibe la interacción de B7-4 con una receptor inhibidor o un agente que inhibe la transducción de una señal inhibidora a través de PD-l, por ejemplo, un anticuerpo no activador contra PD-l es terapéuticamente útil en situaciones en donde la regulación ascendente de respuestas mediadas por células y anticuerpos, resultando en una depuración más rápida y más completa del virus sería útil. Estas situaciones incluyen enfermedades cutáneas virales tales como herpes o zona, en dicho caso puede ser administrado tópicamente a la piel, además enfermedades virales sistémicas tales como influenza, el resfriado común y la encefalitis pueden ser mitigadas mediante la administración de tales agentes sistémicamente . En ciertos casos, puede ser deseable administrar además otros agentes que regulan de manera ascendente las respuestas inmunológicas, por ejemplo, de otros miembros de familia de B7 que transducen señales a través de receptores co- esti uladores, con el objeto de incrementar adicionalmente la respuesta inmunológica. Alternativamente respuestas inmunológicas pueden ser incrementadas en un paciente infectado mediante la remoción de células inmunológicas del paciente. Poniendo en contacto las células inmunológicas in vitro con una forma de B7-4 que promueve una señal co-estimuladora en una célula inmunológica o un agente que inhibe la interacción B7-4 con un receptor inhibidor, o un agente que inhibe la transducción de una señal inhibidora a través de PD-l, y reintroduciendo las células inmunológicas estimuladas in vitro en el paciente. En otra modalidad, un método para incrementar respuestas inmunológicas incluye el aislamiento de células infectadas de un paciente, por ejemplo células infectadas viralmente, transfectándolas con una molécula de ácido nucleico que codifica una forma de B7-4 que se une a un receptor coestimulador de tal manera que las células expresen la totalidad de una parte de la molécula de B7-4 en su superficie, y reintroduciendo las células transfectadas en el paciente. Las células transfectadas pueden suministrar una señal co-estimuladora a células inmunológicas in vivo y por consiguiente activarlas. Formas de B7-4 que promueven una señal co-estimuladora en una célula inmunológica o bien un agente que inhibe la interacción de B7-4 con un receptor inhibidor, o un agente que inhibe la transducción de una señal inhibidora a través de PD-l pueden emplearse profilácticamente en vacunas contra varios polipéptidos, por ejemplo polipéptidos derivados de patógenos. La inmunidad contra un patógeno, por ejemplo, un virus puede ser inducida mediante el hecho de vacunar con una proteína viral junto con una forma de B7-4 que promueve una señal co-estimuladora en una célula inmunológica o un agente que inhibe la interacción de B7-4 con un receptor inhibidor, o un agente que inhibe la transduccicn de una señal inhibidora a través de PD-l en un ady-vante apropiado. Alternativamente, un vector que comprende genes que codifican tanto para un antígeno patogénico como una forma de B7-4 que se une a receptores co-estimuladores puece emplearse para propósitos de vacunación. Vacunas de ácido nucleico pueden ser administradas de varias maneras, por ejemplo, por inyección (por ejemplo, intramuscular, intradérmica, o bien la inyección biolística de partículas de oro revestidas con {ADN en la epidermis con una pistola génica que utiliza un acelerador de partículas o un gas comprimido para inyectar las partículas en la piel (Haynes et al, 1996 J. Biotechnol 44:37)). Alternativamente, vacunas de ácido nucleico pueden ser administradas por medio no invasivos. Por ejemplo, ADN puro o formulados por lípidos puede ser administrado al sistema respiratorio o bien enfocado a ctras partes, por ejemplo parches de Peyers para administración oral de ADN (Schubbert, 1997, Proc . Nati . Acad. Sci . USA 94:961). Microorganismos atenuados pueden ser utilizados para su administración a superficies mucosales (Size ore et al, 1995, Science 270:29) . En una modalidad, una forma de polipéptido de B7-4 que transmite una señal co-estimuladora puede ser administrada con proteínas de MHC de clase I mediante, por ejemplo una célula transfectada para co-expresar un polipéptido de B7-4 y proteína de cadena Alfa de clase I de MHC y microglobulina B2 para resultar en una activación de células T y proporcionar inmunidad contra la infección. Por ejemplo, patógenos para los cuales vacunas son útiles incluyen hepatitis B, hepatitis C, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus, VIH-1, VIH-2, tuberculosis, malaria y esquistosomiasis. En otra aplicación, la regulación ascendente o el incremento de una función co-estimuladora de B7-4 es útil para inducir inmunidad contra tumores. Las células tumorales, por ejemplo sarcoma, melanoma, linfoma, leucemia, neuroblastoma, carcinoma, transfectadas con una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno de B7-4 pueden ser administradas a un sujeto para superar la tolerancia específica al tumor en el sujeto. En caso deseado, la célula tumoral puede ser transfectada para expresar una combinación de polipéptidos de B7 (por ejemplo B7-1, B7-2, B7-4) . Por ejemplo, células tumorales obtenidas de un paciente pueden ser transfectadas ex vivo con un vector de expresión dirigiendo la expresión de un polipéptido de B7-4 solo o en combinación con un péptido que tiene una actividad B7-1 y/o una actividad B7-2. Las células tumorales transfectadas son devueltas al paciente para resultar en la expresión de los péptidos en la superficie de la célula transfectada. Alternativamente, técnicas de terapia génica pueden utilizarse para enfocar una célula tumoral para transfección in vivo. Además, células tumorales que no tienen moléculas de MCH de clase I o MHC de clase I o bien que no expresan cantidades suficientes de moléculas de MHC clase I o MHC clase II, pueden ser transfectadas con ácido nucleico que codifica la totalidad o una parte (por ejemplo una porción truncada de dominio citoplásmico) de una proteína de cadena alfa de MHC clase I y proteína de microglobulina B2 o una proteína de cadena alfa de MHC clase I y una proteína de cadena beta de MHC clase II. Con el objeto de expresar de esta forma proteínas de MHC clase I en la superficie de la célula. La expresión de MHC de clase I o clase II apropiado en combinación con un péptido que tiene la actividad de un antígeno de linfocito B (por ejemplo B7-1, B7-2, B7-4) induce una respuesta inmunológica mediada por células T contra la célula tumoral transfectada. Opcionalmente un gen que codifica un constructo de antisentido que bloquea la expresión de una proteína asociada MHC clase II como por ejemplo la cadena invariante, puede también ser transfectado con un ADN que codifica un polipéptido de B7-4 con el objeto de promover la presentación de antígenos asociados con tumor e inducir la inmunidad específica contra tumor. La expresión de B7-1 por células tumorales de murino negativas para B7 induce una inmunidad específica mediada por células T acompañada por rechazo de tumor y protección prolongada Á- id LA . *-**», - -¿tai >í- AL.Í.I contra reto de tumor con ratones (Chen L., et al. '1992) Cell 71, 1093-1102; Townsend, S.E. and Allison, J. P. (1993) Sci ence 259, 368-370; Baskar S. et al. (1993) Proc . Na ti . Acad. Sci . 90, 5687-5690) . Así, la inducción de una respuesta inmunológica mediada por células inmunológicas en un sujeto humano puede ser suficiente para superar la tolerancia específica para tumor en el sujeto. En otra modalidad, la respuesta inmunológica puede ser estimulada por la transmisión de una señal a través de un receptor co-estimulador que se une a B7-4 o bien mediante la inhibición de señalización a través de un receptor inhibidor que se une a B7-4, por ejemplo PD-l de tal manera que se supere la tolerancia preexistente. Por ejemplo, respuestas inmunológicas contra antígenos par los cuales un sujeto no puede formar una respuesta inmunológica significativa, por ejemplo, antígeno específico para tumor, pueden ser inducidas por administración de un agente que inhibe la actividad inhibidora de PD-l o la capacidad de B7-4 para unirse a un ligando inhibidor. Por ejemplo en una modalidad, PD-l soluble o B7-4 soluble puede emplearse (por ejemplo, PD-l Fe o B7-4 Fe) para incrementar una respuesta inmunológica, por ejemplo a una célula tumoral. En una modalidad, un antígeno autólogo, por ejemplo el antígeno específico para tumor puede ser coadministrado con un agente que inhibe la actividad inhibidora de PD-l o la capacidad de B7-4 para unirse a un ligando inhibidor. En otra modalidad, ana respuesta inmunológica puede ser estimulada contra un antígeno (por ejemplo un antígeno autólogo) para tratar un trastorno neurológico. En otra modalidad, antagonistas de PD-l pueden ser empleadas como adyuvantes para reforzar respuestas a antígenos foráneos en el proceso de una inmunización activa. En otra modalidad, la producción de una forma de B7-4 que se une a un receptor inhibidor o que compite con la unión de B7- 4 a un receptor co-estimulador (por ejemplo una forma de B7-4 que se une a PD-l o una molécula soluble que ocurre naturalmente) puede ser inhibida por ejemplo, utilizando ARN de antisentido con el objeto de regular de manera ascendente la respuesta inmunológica. Por ejemplo, en una modalidad, la producción de moléculas inhibidoras de B7-4 por una célula tumoral puede ser inhibida con el objeto de incrementar la inmunidad antitumor. En una modalidad, células inmunológicas se obtienen a partir de un sujeto y se cultiva ex vivo en presencia de una forma de B7-4 que se une a una molécula co-estimuladora o bien en presencia de un agente que inhibe una señal inhibidora de B7- 4 o PD-l, con el objeto de ampliar la población de células inmunológicas. En una modalidad adicional, las células inmunológicas son administradas después a un sujeto, las células inmunológicas pueden ser estimuladas para proliferar in vitro, mediante, por ejemplo, el hecho de proporcionar a las células inmunológicas una señal de activación primaria y una señal co-estimuladora como se conoce en la técnica. Varias formas de proteínas de B7-4 o agentes que se unen a un receptor co-estimulador o que inhiben la señalización a través de PD-l pueden también utilizarse para co-estimular la proliferación de células inmunológicas. En una modalidad, células inmunológicas son cultivadas ex vivo de conformidad con el método descrito en la solicitud PCT número WO 94/29436. La molécula co-estimuladora puede estar soluble, fijada sobre una membrana celular o bien fijada sobre una superficie sólida como por ejemplo una perla. B. Identificación de citocinas moduladas por modulación de B7-4 y/o PD-l Las moléculas de B7-4 PD-l descritas aquí pueden ser utilizadas para identificar citocinas que son producidas o cuya producción es incrementada o inhibida en células inmunológicas en respuesta a la modulación de la actividad de B7-4 y/o PD-l. Células inmunológicas que expresan PD-l pueden ser estimuladas de manera subóptima in vi zro con una señal de activación primaria, por ejemplo, células T pueden ser estimuladas con forboléster, anticuerpos anti-CD3 o bien de preferencia antígeno en asociación con una molécula de MHC clase II, y recibir una señal co-estimuladora, por ejemplo, a través de una forma estimuladora " de antígeno de la familia B7, por ejemplo, por una célula transfectada por ácido nucleico que codifica un polipéptido de B7 y que expresa el péptido en su superficie o bien mediante una forma estimuladora soluble del péptido. Citocinas conocidas liberadas en el medio pueden ser identificadas por ELISA o bien por la capacidad de un anticuerpo que bloquea la citocina para inhibir la proliferación de células inmunológicas o bien la proliferación de otros tipos de células que es inducida por la citocina. Por ejemplo, un conjunto de elementos IL-4 ELISA se encuentra disponible en Genzyme (Cambridge MA) , así como un anticuerpo de bloqueo de IL-7. Anticuerpos de bloqueo contra IL-9 e IL-12 están disponibles en Genetics Institute (Cambridge MA) . El efecto de estimular o bloquear la interacción de B7-4 con PD-l en el perfil de citocina puede entonces determinarse. Un ensayo de co-estimulación de células inmunológicas in vitro de conformidad con lo descrito arriba puede también emplearse en un método para identificar citocinas novedosas que pueden ser moduladas por la modulación de B7-4 y/o PD-l. Por ejemplo, cuando la estimulación de la vía CD28/CTLA4 parece incrementar la secreción de IL-2, la estimulación de la vía ICOS parece incrementar la secreción de IL-10 (Hutloff et al. 199 Nature 397:263). Si una actividad particular inducida al efectuarse la co-estimulación, por ejemplo, proliferación de células inmunológicas no puede ser inhibida por adición de anticuerpos de bloqueo a citocinas conocidas, la actividad puede resultar de una citocina desconocida. Después de la co-estimulación, esta citocina puede ser codificada del medio por métodos convencionales y su actividad puede ser medida por su capacidad para inducir la proliferación de células inmunológicas. Para identificar citocinas que pueden desempeñar una función en la inducción de la tolerancia, se puede emplear el ensayo de co-estimulación de células T in vitro descrito arriba. En este caso, células T reciben la señal de activación primaria y son puestas en contacto con una citocina seleccionada, pero no reciben la señal co-estimuladora. Después del lavado y reposo de las células inmunológicas las células son retadas con una señal de activación primaria y con una señal co- estimuladora. Si las células inmunológicas nc responden (por ejemplo proliferan o producen citocinas) se han vuelto toleradas y la citocina no impidió la inducción de la tolerancia. Sin embargo, si las células inmunológicas responden, se evitó la inducción de la tolerancia por la citocina. Estas citocinas que pueden prevenir la inducción de la tolerancia pueden ser enfocadas para bloqueo in vivo en combinación con reactivos que bloquean antígenos de linfocito B como un medio más eficiente para inducir la tolerancia en receptores de transplantes o bien en sujetos con enfermedades autoinmunológicas. Por ejemplo, se puede administrar un anticuerpo de bloqueo de citocina a un sujeto junto con un agente que promueve una actividad inhibidora de B7-4 o PD-l. C. Identificación de moléculas que modulan la expresión de un polipéptido de B7-4 o PD-l Los anticuerpos producidos empleando las proteínas y péptidos de la presente invención pueden emplearse en un ensayo de tamizado para moléculas que modulan la expresión de polipéptido de B7-4 o PD-l en células. Por ejemplo, moléculas que modulan las vías de señalización intracelulares que culminan en cambios en la expresión de polipéptidos de B7-4 o PD-l (por ejemplo, en respuesta a señales de activación) pueden ser identificadas mediante el ensayo de la expresión de uno o varios polipéptidos de B7-4 o PD-l en la superficie de la célula. Una tinción inmunofluorescente reducida por un anticuerpo apropiado en presencia de la molécula indica que la molécula inhibe las señales intracelulares. Moléculas que regulan de manera ascendente la expresión de polipéptidos B7- 4 o PD-l resultan en una tinción inmunofluorescente incrementada. Alternativamente, el efecto de una molécula sobre la expresión de un péptido puede ser determinada mediante la detección de niveles de ARNm celular utilizando una sonda de la invención. Una célula que expresa un polipéptido de B7-4 o PD-l puede entrar en contacto con una molécula a probar, y un incremento o una disminución de los niveles de ARNm en la célula detectada por técnicas estándares como por ejemplo análisis de hibridación Northern ?ti A ttJtA. 1 blot o bien de puntos convencionales de ARNm o bien poli (A+ ) ARNs totales uti l i zando una sonda de ADNc etiquetada con un marcador detectable . Moléculas que modulan la expresión de un polipéptido de B7-4 o PD-l son terapéuticamente útiles ya sea para regular de manera ascendente o para regular de manera descendente respuestas inmunológicas solas o en combinación con reactivos de bloqueo o de estimulación solubles de conformidad con lo descrito arriba . Por ej emplo, una molécula que inhibe la expresión B7-4 puede ser administrada j unto con un segundo agente, como por ej emplo, un inmunosupresor o una molécula que inhibe la expresión de PD-l puede administrarse con un in unoestimulante como por ej emplo, un adyuvante . Moléculas ej emplares que pueden ser probadas para su capacidad para modular B7-4 o PD-l incluyen citocinas tales como IL-4 , ?lNF, IL- 10 , IL-12 , GM-CSF y prostagladínas . D . Ensayos de tamizado La invención ofrece un método ( que se conoce también aquí como un "ensayo de tamizado" ) para identificar moduladores, es decir, compuestos o agentes candidatos o de prueba (por ej emplo, péptidos , peptidomiméticos , pequeñas moléculas o bien otros fármacos ) que se unen a proteínas de B7-4 o PD-l , tienen un efecto estimulador o inhibidor por ej emplo sobre la expresión de B7-4 o PD-l o bien sobre la actividad de B7-4 o PD-l .

En una modalidad, la invención ofrece ensayos para tamizar compuestos candidatos o compuestos de prueba que se unen con la proteína de B7-4 o PD-l o polipépt do c porción biológicamente activa de la misma o que modulan la actividad de una proteína de B7-4 o PD-l, o de un polipéptido o porción biológicamente activa de la misma, por ejemplo, modulan la capacidad de polipéptido de B7-4 o PD-l para mteractuar con su socio de enlace correspondiente o una molécula que interactúa (por ejemplo, una molécula de interacción intracelular) . Los compuestos de prueba de la presente invención pueden ser obtenidos empleando cualesquiera de numerosos enfoque en métodos de bibliotecas combinatorias que se conocen en la técnica, incluyen: bibliotecas biológicas; métodos de biblioteca sintética que requieren deconvolución; métodos de biblioteca de "una perla un compuesto"; y métodos de biblioteca sintética que utilizan selección por cromatografía por afinidad. El enfoque de biblioteca biológica es limitado a bibliotecas de péptidos mientras que los demás cuatro enfoques pueden aplicarse a bibliotecas de péptidos, oligómeros que no son péptidos o bien moléculas pequeñas (Lam, K.S. (1997) Anticancer Drug Des . 12:145). Ejemplos de métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares pueden encontrarse en la técnica, por ejemplo en: DeWitt et al. (1993) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 90:6909; Erb et al. (1994) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 91:11422; Zucker ann É-toAA-tai i,-. -i*..á i.**^*** et al. (1994) J. Med. Chem. 37:2678; C.-.c et al. (1993) Sci ence 261:1303; Carrell et al. (1994) Ar.zew. Chem . Int . Ed. Engl . 33:2059; Carell et al. (1994) An?ew Chem . Int . Ed. Engl . 33:2061; y en Gallop et al. (1954) J. Med. Chem. 37:1233. Bibliotecas de compuestos pueden presentarse en solución (por ejemplo, Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421), o bien en perlas (Lam (1991) Na ture 354:82-84), en plaquetas (Fodor (1993) Nature 364:555-556), en bacterias (Ladner USP 5,223,409), en esporas (Ladner USP 09) , en plásmidos (Culi et al. (1992) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 89:1865-1869) o bien en fagos (Scott y Smith (1990) Science 249:386-390); (Devlin (1990) Science 249:404-406); Cwirla et al. (1990) Proc . Nati .

Acad. Sci . USA 87:6378:6382); (Felici (1591) J. Mol . Biol . 222:301-310); (Ladner supra). En otra modalidad, un ensayo es un ensayo basado en células que comprende la puesta en contacto de una célula que expresa una molécula blanco de B7-4 (una molécula de interactor intracelular o bien un receptor de PD-l), o bien una molécula blanco de PD-l (por ejemplo, una molécula de interactor intracelular o ligando de B7-4) con un compuesto de prueba y mediante la determinación de la capacidaa del compuesto de prueba para modular (por ejemplo, estimular o inhibir) la actividad de la molécula blanco de 37-4 o PD-l. La determinación de la capacidad del compuesto de prueba para i-^ .^j ^SJjtL-fc t-fe**'. modular la actividad de una molécula blanco de B7-4 o PD-l puede lograrse, por ejemplo, mediante la determinación de la capacidad de la proteína de B7-4 o PD-l para unirse o interactuar con la molécula blanco de B7-4 o PD-l. La 5 determinación de la capacidad de la proteína de B7-4 o PD-l para unirse o interactuar con su socio de enlace puede lograrse, por ejemplo, mediante la medición de la unión directa. En el ensayo de unión directa, la proteína de B7-4 o PD-l (o 10 bien sus moléculas blanco respectivas) puede acoplarse con un radioisótopo o una etiqueta enzimática de tal manera que la unión de la proteína de B7-4 o PD-l con una molécula blanco de B7-4 o PD-l pueda ser determinada mediante la detección de la proteína etiquetada en un complejo. Por ejemplo, moléculas 15 de B7-4 o PD-l, por ejemplo, proteínas de B7-4 o PD-l, pueden ser etiquetadas con 125I, 35S, ~4C, o JH, ya sea directa o indirectamente, y el radioisótopo detectado por conteo directo de radio-emisión o por conteo de centelleo. Alternativamente, moléculas de B7-4 o PD-l pueden ser 20 etiquetadas enzimáticamente por ejemplo con peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, o luciferaza, y la etiqueta enzimática puede ser detectada por determinación de conversión de un sustrato apropiado en producto. También dentro del marco de la presente invención se 25 encuentra la determinación de la capacidad de un compuesto i i Si?m ?s *? JA¿.^ ......Í ,^^, ..._..:. para modular la interacción entre B7-4 o PD-l y su molécula blanco, sin el etiquetado de ninguno de los elementos que interactúan. Por ejemplo, un microfisiómetro puede utilizarse para detectar la interacción de B7-4 o PD-l con su molécula blanco sin el etiquetado de B7-4 ni de PD-l ni de la molécula blanco (McConnell, H.M. et al. (1992) Sci ence 257 : 1906-1912) . Como se emplea aquí, un "microfisiómetro" (por ejemplo, Citosensor) es un instrumento analítico que mide la velocidad con la cual una célula acidifica su entorno utilizando un sensor potencio étrico dirigible por luz (LAPS) . Cambios en esta velocidad de acidificación pueden utilizarse como un indicador de la interacción entre el compuesto y el receptor. En una modalidad preferida, la determinación de la capacidad de la proteína de B7-4 o PD-l para unirse o interactuar con una molécula blanco de B7-4 o PD-l puede lograse mediante la determinación de la actividad de B7-4 o PD-l o una molécula blanco apropiada. Por ejemplo, la actividad de B7-4 o PD-l o la molécula blanco apropiada puede determinarse mediante la detección de la inducción de un segundo mensajero celular (por ejemplo, actividad tirosinquinasa) , mediante la detección de la actividad catalítica/enzimática de un sustrato apropiado, mediante la detección de la inducción de un gen reportero (que comprende un elemento regulador que responde al blanco operativamente unido a un ácido nucleico que codifica un marcador detectable, por ejemplo, cloranfenicol acetiltransferasa) , o cien mediante la detección de una respuesta celular regulada por B7-4 o PD-l o una molécula blanco apropiada. Por ejemplo, la determinación de la capacidad de la proteína de B7-4 o PD-l para unirse o interactuar con una molécula blanco de B7-4 o PD-l puede lograrse, mediante la medición de la capacidad de un compuesto para modular la co-estimulación c inhibición de células inmunológicas en un ensayo de proliferación, o bien mediante la interferencia con la capacidad de un polipéptido de B7-4 o PD-l para unirse con anticuerpos que reconocen la porción del polipéptido de B7-4 o PD-l . En otra modalidad, un ensayo de la presente invención, es un ensayo sin células en donde una proteína ce B7-4 o PD-l o una porción biológicamente activa de la misma entra en contacto con un compuesto de prueba y se determina la capacidad del compuesto de prueba para unirse a la proteína de B7-4 o PD-l o una porción biológicamente activa de la misma. La unión del compuesto de prueba con la proteína de B7-4 o PD-l puede determinarse ya sea directa o indirectamente de conformidad con lo descrito arriba. En una modalidad preferida, el ensayo incluye la puesta en contacto de la proteína de B7-4 o PD-l o una porción biológicamente activa de la misma con un compuesto conocido que se une a B7-4 o PD-l para formar una mezcla de ensayo, la puesta en contacto de la mezcla de ensayo con un compuesto de prueba, y la determinación de la capacidad del compuesto de prueba para interactuar con una proteína de B7-4 o PD-l, en donde la determinación de la capacidad del compuesto de prueba para interactuar con una proteína de B7-4 o PD-l comprende la determinación de la capacidad del compuesto de prueba para unirse de manera preferente con un polipéptido de B7-4 o PD-l o una porción biológicamente activa del mismo en comparación con el compuesto conocido. En otra modalidad, el ensayo es un ensayo sin células en donde una proteína de B7-4 o PD-l o una porción biológicamente activa de la misma esta en contacto con un compuesto de prueba y la capacidad del compuesto de prueba para modular (por ejemplo, estimular o inhibir) la actividad de la proteína de B7-4 o PD-l o una porción biológicamente activa de la misma se determina. La determinación de la capacidad del compuesto de prueba para modular la actividad de una proteína de B7-4 o PD-l puede lograrse, por ejemplo, mediante la determinación de la capacidad de la proteína de B7-4 o PD-l para unirse con una molécula blanco de B7-4 o PD-1 a través de uno de los métodos descritos arriba para determinar la unión directa. La determinación de la capacidad de la proteína de B7-4 o PD-l para unirse con una molécula blanco de B7-4 o PD-l puede también lograrse empleando una tecnología como por ejemplo Biomolecular Interaction Analysis (BIA) en tiempo real (BIA) (Sjolander, S. y Urbaniczky, C. (1991) Anal . Chem. 63:2338-2345 y Szabo et al. (1995) Cvrr. Opin . Struct . Bi ol . 5:699-705). Como se emplea aquí, "BIA" es una tecnología para estudiar interacciones bioespecíficas en tiempo real sin etiquetar ninguno de los elementos que interactúan (por ejemplo, BIAcore) . Cambios en el fenómeno óptico de resonancia de plasmón superficial (SPR) puede utilizarse como una indicación de reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas. En otra modalidad, el ensayo sin células incluye la puesta en contacto de una proteína de B7-4 o PD-l o una porción biológicamente activa de la misma con un compuesto conocido que se une a la proteína de B7-4 o PD-l para formar una mezcla de ensayo, ponen en contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de prueba y determinar la capacidad del compuesto de prueba para interactuar con la proteína de B7-4 o PD-l, en donde la determinación de la capacidad del compuesto de prueba para interactuar con la proteína de B7-4 o PD-l comprende la determinación de la capacidad de la proteína de B7-4 o PD-l para unirse de manera preferente o para modular la actividad de una molécula blanco de B7-4 o PD-l. Los ensayos sin células de la presente invención se prestan para utilizar formas solubles y/o unidas a membrana de proteínas (por ejemplo, proteínas de B7-4 o PD-l o porciones biológicamente activas de las mismas, o bien socios de enlace con los cuales se une B7-4 o PD-l) . En el case de ensayos sin células en donde se utiliza una forma de proteína unida a membrana (por ejemplo, un receptor de B7-4 o PD-l de superficie celular) , puede ser deseable utilizar un agente de solubilización de tal manera que la forma unida a membrana de la proteína se mantenga en solución. Ejemplos de tales agentes de solubilización incluyen detergentes no-iónicos tales como n-octilglucósido, n-dodecilglucósido, n- dodecilmaltósido, octanoil-N-metilglucamida, decanoil-N- metilglucamida, Tritón® X-100, Tritón® X-114, Thesit®, Isotridecilpoli (etilenglicoléter) n, sulfonato de 3-[(3- colamidopropil) dimetilaminio] -1-propano (CHAPS), sulfonato de 3- [ (3-colamidopropil) dimetilaminio] -2-hidroxi-i-propano (CHAPSO), o bien sulfonato de N-dodecil=N,N-d?metil-3-amonio- 1-propano. En varias de las modalidades de los métodos de ensayo presentados arriba de la presente invención, puede ser deseable inmovilizar ya sea B7-4 o PD-l en una molécula blanco apropiada con el objeto de facilitar la separación de las formas complejas de las formas no complejas de una o varias de las proteínas, así como para permitir la automatización del ensayo. La unión de un compuesto de prueba con una proteína de B7-4 o PD-l, o la interacción de una proteína de B7-4 o PD-l con una molécula blanco en presencia y ausencia de un compuesto candidato, puede lograrse en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Ejemplos de tales recipientes incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo, tubos de micro- centrifugación. En una modalidad, se puede proporcionar una proteína de fusión que agrega un dominio que permite una o ambas proteínas estén unidas a una matriz. Por ejemplo, proteínas de fusión, glutationa-S-transferasa/ B7-4 o PD-l o bien proteínas de fusión glutat?ona-3-transferasa/blanco pueden ser adsorbida en perlas de glutationa sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o bien placas de microtitulación derivadas de glutationa, que son después combinadas con el compuesto de prueba y o bien la proteína blanca no adsorbida o bien la proteína de B7-4 o PD-l, y la mezcla es incubada en condiciones que producen la formación de complejos (por ejemplo, en condiciones fisiológicas para sal y pH) . Después de la incubación, las perlas o pozos de placa de microtitulación son lavados para remover cualquier componente no unido, la matriz es inmovilizada en el caso de perlas, los complejos son determinados ya sea directa o indirectamente, por ejemplo, de conformidad con lc descrito arriba. Alternativamente, los complejos pueden ser disociados de la matriz y el nivel de unión o actividad de B7-4 o PD-l es determinado utilizando técnicas estándares. Otras técnicas para inmovilizar proteínas en matrices pueden también utilizarse en los ensayos de tamizados de la invención. Por ejemplo, ya sea una proteína de B7-4 o PD-l o bien una molécula blanco de B7-4 o PD-l puede ser inmovilizada utilizando una conjugación de biotina y estreptavidina. Moléculas blanco o proteína de B7-4 o PD-l biotiniladas pueden ser preparadas a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida) utilizando técnicas bien conocidas (por ejemplo, conjunto de elementos de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, IL) , e inmovilizadas en los pozos de placas de 96 pozos revestidos con estreptavidina (Pierce Chemical) . Alternativamente, anticuerpos que reaccionan con proteína de B7-4 o PD-l o moléculas blanco pero que no interfieren con la unión de la proteína de B7-4 o PD-l con su molécula blanco puede ser derivadas hacia los pozos de la placa, y el blanco no unido o bien la proteína de B7-4 o PD-l atrapada en los pozos por conjugación de anticuerpos. Métodos para detectar tales complejos, además de los descritos arriba para los complejos inmovilizados de GST, incluyen la inmunodetección de complejos empleando anticuerpos reactivos con la molécula blanco o proteína de B7-4 o PD-l, así como ensayos enlazados con enzimas que se basan en la detección de una actividad enzimática relacionada con la proteína de B7-4 o PD-l o la molécula blanco. En una modalidad alternativa, La determinación de la capacidad del compuesto de prueba para modular la actividad de una proteína de B7-4 o PD-l puede lograrse mediante la tu J.-j-l-t-i determinación de la capacidad del compuesto de prueba para modular la actividad de una molécula que funciona corriente debajo de B7-4, por ejemplo, una molécula que interactúa con B7-4 o una molécula que funciona corriente debajo de PD-l, por ejemplo, mediante interacción con el dominio citoplásmico de PD-l. Por ejemplo, se pueden determinar niveles de segundos mensajeros, la actividad de la molécula que interactúa en un blanco apropiado puede ser determinada, o bien se puede determinar a unión del interactor con un blanco apropiado de conformidad con lo descrito previamente. En otra modalidad, moduladores de la expresión de B7-4 o PD-l se identifican en un método en donde una célula es puesta en contacto con un compuesto candidato y se determina la expresión de ARNm de B7-4 o PD-l o proteína en la célula. El nivel de expresión de ARNm de B7-4 o PD-l o proteína en presencia del compuesto candidato se compara con el nivel de expresión de ARNm de B7-4 o PD-l o proteína en ausencia del compuesto candidato. El compuesto candidato puede ser identificado como un modulador de la expresión B7-4 o PD-l con base en esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión de ARNm de B7-4 o PD-l o proteína es mayor (por ejemplo, estadísticamente significativamente mayor) en presencia del compuesto candidato que en ausencia de dicho compuesto, el compuesto candidato es identificado como un estimulador de ARNm de B7-4 o PD-l o expresión de proteína.

Alternativamente, cuando la expresión de ARNm de B7-4 o PD-l o proteína es menor (por ejemplo, estadísticamente significativamente menor) en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato es identificado como inhibidor de ARNn de B7-4 o PD-l o expresión de proteína. El nivel de ARNm de B7-4 o PD-l o expresión de proteína en las células puede ser determinado por métodos descritos aquí para detectar ARNm de B7-4 o PD-l o proteína. En otro aspecto de la invención, las proteínas de B7-4 o PD- 1, de preferencia en forma unida a membrana pueden emplearse como "proteínas carnadas" en un ensayo de dos híbridos o en un ensayo de tres híbridos (véase, por ejemplo, Patente Norteamericana 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223- 232; Madura et al. (1993) J. Biol . Chem. 268:12046-12054; Bartel et al. (1993), Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696; y Brent WO94/10300) , para identificar otras proteínas ("proteínas de unión de B7-4 o PD-l" o bien "bp de PD-l"), que se unen o interactúan con B7- 4 o PD-l y están involucradas en la actividad de B7-4 o PD-l. Tales proteínas de unión con B7-4 o PD-l están también probablemente involucradas en la propagación de señales desde las proteínas de B7-4 o PD-l o blancos de B7-4 o PD-l, por ejemplo, elementos corriente arriba o corriente debajo de una vía de señalización mediada por B7-4 o PD-l.

Alternativamente, tales proteínas de unión de B7-4 o PD-l pueden ser inhibidores de B7-4 o PD-l. El sistema de dos híbridos se basa en la naturaleza modular de la mayoría de los factores de transcripción, que consisten de dominios de unión de ADN y activación separables. En resumen, el ensayo utiliza dos constructos de ADN diferentes. En un constructo, el gen que codifica para una proteína de B7-4 o PD-l es fusionado sobre un gen que codifica el dominio de unión de ADN de un factor de transcripción conocido (por ejemplo, GAL-4) . En otro constructo, la secuencia de ADN, a partir de una biblioteca de secuencias de ADN, que codifica una proteína no identificada ("presa" o "muestra") fusionada con un gen que codifica para el dominio de activación del factor de transcripción conocido. Si las proteínas "carnada" y "presa" pueden interactuar in vivo, formando un complejo dependiente de B7-4, los dominios de unión de ADN y activación del factor de transcripción se llevan a una cercanía estrecha. Esta cercanía permite la transcripción de un gen reportero (por ejemplo, LacZ5 unido operativamente con una sitio regulador de transcripción que responde al factor de transcripción. La expresión del gen reportero puede ser detectada y colonias de células que contienen el factor de transcripción funcional pueden ser aisladas y utilizadas para obtener el gen clonado que codifica la proteína que interactúa con la proteína de B7-4 o PD-l.

Esta invención se refiere además a agentes novedosos identificados por los ensayos de tamizado descritos arriba. Por consiguiente, dentro del alcance de esta invención se contempla el uso adicional de un agente identificado de conformidad con lo descrito aquí en un modelo de animal apropiado. Por ejemplo, un agente identificado de conformidad con lo descrito aquí (por ejemplo, un agente modulador de B7- 4 o PD-l, una molécula de ácido nucleico de B7-4 o PD-l de anti-sentido, un anticuerpo específico para B7-4 o PD-l, o un socio de enlace de B7-4 o PD-l) puede emplearse en un modelo de animal para determinar la eficacia, toxicidad o los efectos colaterales de un tratamiento con este agente. Alternativamente, un agente identificado de conformidad con lo descrito aquí puede ser utilizado en un modelo de animal con el objeto de determinar el mecanismo de acción de dicho agente. Además, esta invención se refiere al uso de agentes novedosos identificados por los ensayos de tamizado descritos arriba para tratamientos de conformidad con lo descrito aquí. F. Ensayos de detección Porciones o fragmentos de las secuencias de ADNc identificadas aquí (y las secuencias correspondientes de gen completo) pueden emplearse de numerosas maneras como reactivos de polinucleótidos. Por ejemplo, estas secuencias pueden emplearse para: (i) cartografiar sus genes respectivos en un cromosoma; y, por consiguiente, localizar regiones génicas asociadas con una enfermedaa genética; (íi) identificar un individuo a partir de una muestra biológica diminuta (tipificación de tejidos); y ni) ayudar a la identificación forense de una muestra biológica. Estas aplicaciones se describen en las subseccicr.es siguientes. 1. Cartografiado de cromosomas Una vez que la secuencia (o bien una parte de la secuencia) de un gen ha sido aislada, esta secuencia puede ser empleada para cartografiar la localización del gen en un cromosoma. Este proceso se conoce como cartografiado de cromosomas. Por consiguiente, porciones o fragmentos de secuencias de nucleótidos de B7-4 descritas aquí, pueden emplearse para cartografiar la localización de genes de B7-4 en un cromosoma. El cartografiado de las secuencias de B7-4 en cromosomas es un primer paso importante para correlacionar estas secuencias con genes asociados con una enfermedad. En resumen, genes de B7-4 pueden ser mapeados en cromosomas mediante la preparación de cebadores de reacción en cadena de polimerasa (de preferencia de 15-25 pares de bases de longitud) a partir de secuencias de nucleótidos de B7-4. Un análisis por computo de las secuencias de B7-4 puede emplearse para predecir cebadores que nc abarcan más que un exón en el ADN genómico, complicando así el proceso de amplificación. Estos cebadores pueden ser utilizados después para tamizado por reacción en cadena de polimerasa de Ít H»---l-i~-toL----».-. t-*fc--*-. híbridos de células somáticas que contienen cromosomas humanos individuales. Solamente los híbridos que contienen el gen humano que corresponde a las secuencias de B7-4 proporcionará un fragmento amplificado. Híbridos de células somáticas se preparan mediante la fusión de células somáticas de mamíferos diferentes (por ejemplo, células de ser humano y de ratón) . Conforme híbridos de ser humano y de ratón crecen y se dividen, gradualmente pierden cromosomas humanos de manera aleatoria, pero conservan los cromosomas de ratón. Mediante la utilización de medio en donde las células de ratón no pueden crecer, puesto que no tienen una enzima particular, pero en donde las células humanas si pueden crecer, el cromosoma humano que contiene gen que codifica la enzima requerida será conservado. Mediante la utilización de varios medios, se pueden establecer paneles de líneas e células híbridas. Cada línea de células en un panel contiene ya sea un cromosoma humano único o un pequeño número de cromosomas humanos, y un conjunto completo de cromosomas de ratón, permitiendo un cartografiado fácil de genes individuales en cromosomas humanos específicos. (D'Eustachio, P. Et al. (1983) Sci ence 220:919-924). Híbrido de células somáticas que contienen solamente fragmentos de cromosomas humanos pueden también ser producidos mediante la utilización de cromosomas humanos con translocaciones y remociones.

-«A-A-fcant-i El cartografiado por reacción en cadena de polimerasa de híbridos de células somáticas es un procedimiento rápido para asignar una secuencia particular a un cromosoma particular. Tres o más secuencias pueden ser asignadas por día empleando un solo ciclador térmico. Empleando secuencias de nucleótidos de B7-4 para diseñar cebadores de oligonucleótidos, se puede lograr una sublocalización con paneles de fragmentos de cromosomas específicos. Otras estrategias de cartografiado que pueden ser utilizadas de manera similar para cartografiar una secuencia sobre su cromosoma incluyen la hibridación in si tu (descrita en Fan, Y. et al. (1990) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA, 87 : 6223-27) , el pre-tamizado con cromosomas marcados clasificados por flujo, y la preselección por hibridación en bibliotecas de ADNc especificas para cromosomas. La hibridación in si tu con fluorescencia (FISH) de una secuencia ADN con una expansión cromosómica de etafase puede ser utilizada adicionalmente para proporcionar una ubicación cromosómica precisa en una etapa. Una expansión cromosómica puede efectuarse utilizando células cuya división ha sido bloqueada en metafase por una sustancia química como por ejemplo colcemida que desorganiza el huso itótico. Los cromosomas pueden ser tratados previamente con tripsina, y después teñidos con Giemsa. Un patrón de manchas claras y oscuras se desarrolla en cada cromosoma de tal manera que los ^ , * ^^'.^¡^k^s^^ íí ^^^^ke- Bá^ cromosomas puedan ser identificados individualmente. La técnica FISH puede ser utilizada con una secuencia ADN desde 500 o 600 bases de longitud. Sin embargo, clones mayores de 1000 bases tienen una mayor probabilidad de unirse con una ubicación cromosómica única con una intensidad de señal suficiente para una detección simple. De preferencia, 1000 bases, y con mayor preferencia 2000 bases serán suficientes para lograr buenos resultados en un tiempo razonable. Para una reseña de esta técnica véase Verma et al . , Human Chromosomes. A Manual of Basis Techniques (Pergamon Press, New York 1988) . Reactivos para el cartografiado de cromosomas pueden utilizarse para marcar un cromosoma único c un sitio único en este cromosoma, o paneles radiactivos pueden utilizarse para marcas sitios múltiples/cromosomas múltiples. Reactivos que corresponden a regiones no codificadoras de los genes se prefieren de hecho para propósitos de cartografiado. Las secuencias codificadoras presentan una mayor probabilidad de ser conservadas dentro de familias de genes, incrementando así la probabilidad de hibridaciones cruzadas durante el cartografiado cromosómico. Una vez que una secuencia ha sido cartografiada en una ubicación cromosómica precisa, la posición física de la secuencia en el cromosoma puede ser correlacionada con datos de mapa genético. (Tales datos se encuentran, por ejemplo en j* **21CT.' McKusick, V., Mendelian Inheritance in Man, disponible en línea a través de la Biblioteca Médica Welch de la Universidad Johns Hopkins) . La relación entre un gen y una enfermedad, cartografiados en la misma región cromosómica, puede ser entonces identificada a través de análisis de enlace (coherencia de genes físicamente adyacentes) , como se describe por ejemplo en Egeland, J. Et al (1987) Nature 325:783-787. Además, diferencias en las secuencias ADN entre individuos afectados y no afectados por la enfermedad asociada con el gen de B7-4 pueden determinarse. Si se observa una mutación en algunos o en la totalidad de los individuos afectados pero no en los individuos no afectados, entonces es probable que la mutación sea el agente causante de la enfermedad particular. La comparación entre individuos afectados y no afectados involucra generalmente ver primero alteraciones estructurales en los cromosomas, por ejemplo remociones o translocaciones que son visibles a partir de las expansiones cromosómicas o bien detectables empleando reacciones en cadena de polimerasa basadas en esta secuencia de ADN. Finalmente, un secuenciamiento completo de genes a partir de varios individuos puede efectuarse con el objeto de confirmar la presencia de una mutación y para distinguir mutaciones de polimorfismos. 2. Tipificado de tejido : .. . . .n , . .M«? , -fcwh ?>t -4«m , *?? Jií ákS*m.

La secuencia B7-4 de la presente mención puede también ser utilizadas para identificar individuos a partir de muestras biológicas diminutas. El ejército norteamericano, por ejemplo, está considerando el uso de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) para identificar su personal. En esta técnica, el ADN genómico de un individuo, es ingerido con una o varias enzimas de restricción, y probado en un Southern blot para proporcionas bandas únicas para identificación. Este método no adolece de las limitaciones actuales de las "placas de identificación", que pueden ser perdidos, intercambiados, o robados, haciendo difícil una identificación positiva. Las secuencias de la presente invención son útiles como marcadores de ADN adicionales para nuestra RFLP (se describe en la patente norteamericana 5,272,057). Además, las secuencias de la presente invención pueden ser utilizadas para proporcionar una técnica alternativa que determina una secuencia real de ADN base por base de porciones seleccionadas del genoma de un individuo. Así como en las secuencias de nucleótidos B7-4 descritas aquí pueden emplearse para preparar dos cebadores de reacción en cadena de polimerasa a partir de los extremos 5' y 3' de las secuencias. Estos cebadores pueden ser utilizados para amplificar el ADN de un individuo y para secuenciarlo subsecuentemente.

Paneles de secuencia de ADN correspondientes a partir de individuos, preparados de esta forma pueden ofrecer identificaciones individuales únicas, puesto que cada individuo tendrá un grupo único de tales secuencias de ADN debido a diferencias alélicas. La secuencias de la presente invención pueden utilizarse para obtener dichas secuencias de identificación a partir de individuos y partir de tejido. Las secuencias de nucleótidos de B7-4 representa de manera única proporciones del genoma humano. Variaciones alélicas ocurren hasta cierto punto en las regiones codificadoras de estas secuencias y en mayor medida en las regiones no codificadoras. Se estima que una variación alélica entre seres humanos individuales ocurre con una frecuencia de aproximadamente 1 vez por cada 500 bases. Cada una de las secuencias descritas puede, hasta cierto punto, utilizarse como un estándar contra el cual se puede comparar ADN de un individuo para propósitos de identificación. Puesto que mayores números de polimorfismos ocurren en las regiones no codificadoras, se requieren de un número menor de secuencias para diferenciar individuos. Las secuencias no codificadoras SEQ ID NO: l o 3 pueden proporcionar cómodamente identificación individual positiva con un panel de tal vez 10 a 1000 cebadores cada uno proporcionando una secuencia no codificadora amplificada de 100 bases. Si se emplean secuencias codificadoras predichas, un número más propio de cebadores para una identificación individual positiva sería entre 500 y 2000. Si un panel de ' reactivos a partir de secuencias de nucleótidos de B7-4 descritos aquí se emplea para generar una base de datos de identificación única a partir de un individuo, estos mismos reactivos pueden ser utilizados posteriormente para identificar tejido a partir de este individuo. Utilizando la base de datos de identificación única, se puede efectuar una identificación positiva del individuo, vivo o muerto, a partir de muestras extremadamente pequeñas de tejido. 3. Uso de secuencias parciales de B7-4 en Biología Forense Técnicas de identificación basadas en ADN pueden también utilizarse en biología forense. La biología forense es un - campo científico que emplea el tipificado genético de evidencia biológica encontrada en el escenario de un crimen como un medio para identificar positivamente, por ejemplo, en la persona que cometió un crimen, para efectuar dicha identificación se puede emplear una tecnología de reacción en cadena de polimerasa para amplificar secuencias de ADN tomadas de muestras biológicas muy pequeñas, por ejemplo, tejidos, por ejemplo cabello o piel, o bien fluidos corporales, por ejemplo, sangre, saliva, o semen encontrados en el escenario de un crimen. La secuencia amplificada puede ser después comparada con un estándar permitiendo por ill-.'.j l¡.A¡'JJ»(i. i.. -- .' , r i"<m~?.'tfiyiw,m.? i -Í.ÜÜ ilX.M ?? -in uní ?.irl? I,trt?.'~ consiguiente la identificación del origen de la muestra biológica. Las secuencias de la presente invención pueden ser utilizadas para proporcionar reactivos de polinucleótidos cebadores de reacción en cadena de polimerasa, enfocados a loci en el genoma humano, que pueden incrementar la confiabilidad de las investigaciones forenses basadas en ADN proporcionando por ejemplo, otro "marcador de identificación" (es decir, otra secuencia de ADN que es única para un individuo particular) . Como se mencionó arriba, la información real de secuencia de bases puede utilizarse para identificación como una alternativa precisa por patrones formados por fragmentos generados por enzimas de restricción. Las secuencias enfocadas a regiones no codificadoras son especialmente apropiadas para este uso puesto que ocurre un gran número de polimorfismos en las regiones no codificadoras, haciendo más fácil diferenciar individuos utilizando esta técnica. Ejemplos de reactivos de polinucleótidos que incluyen las secuencias de nucleótidos de B7-4 proporciones de las mismas que tienen una longitud de por lo menos de 20 bases, de preferencia por lo menos 30 bases. Las secuencias de nucleótidos de B7-4 descritos aquí pueden emplearse además para proporcionar reactivos de polinucleótidos, por ejemplo, etiquetados o que pueden ser etiquetados que pueden emplearse por ejemplo en la técnica de .Jetii. ii - i, .11til n jj.J.t M t ^ 0ü*i hibridación in si tu para identificar un tejido específico, por ejemplo, tejido cerebral. Esto puede ser muy útil en casos en los cuales un patólogo forense recibe un tejido de origen desconocido. Paneles de tales son B7-4 pueden ser utilizados para identificar tejidos por especie o por tipo de órgano. De manera similar, estos reactivos, por ejemplo, cebadores de B7-4 pueden emplearse para tamizar cultivo de tejido para contaminación (es decir, tamizar para determinar la presencia de un mezcla ce tipos diferentes de células en un cultivo) . G. Medicina Predictiva La presente invención se refiere también al ámbito de la medicina predictiva en donde ensayos de diagnóstico, ensayos de pronóstico, y el monitoreo de ensayos clínicos se emplean para propósitos de pronóstico (predictivos) con el objeto de tratar a una persona de manera profiláctica. Por lo siguiente, un aspecto de la presente invención se refiere a ensayos de diagnóstico para determinar la expresión de proteína y/o ácido nucleico de B7-4 o PD-l así como actividad de B7-4 o PD-l, en el contexto de una muestra biológica (por ejemplo, sangre, suero, células, tejido) para determinar de esta forma si un individuo presenta una enfermedad o un trastorno o bien si esta en riesgo de desarrollar un trastorno, asociado con expresión o actividad aberrante de B7-4 o PD-l. La invención ofrece también ensayos de pronostico (o bien predictivos) para determinar si un individuo esta en riesgo de desarrollar trastornos asociados con una actividad de expresión de ácidos nucleicos o proteína de B7-4 o PD-l. Por ejemplo, mutaciones en un gen de B7-4 o PD-l pueden ser ensayadas en una muestra biológica. Tales ensayos pueden ser utilizados para propósito de pronostico o predictivo con el objeto de tratar de esta forma profilácticamente a un individuo antes del inicio de un trastorno caracterizado o asociado con proteína de B7-4 o PD- 1, expresión de ácido nucleico o actividad. Los ensayos descritos aquí, tales como los ensayos de diagnóstico anteriores o en los ensayos siguientes pueden también utilizarse para detectar una tendencia a tener abortos espontáneos. Otro aspecto de la invención se refiere al monitoreo de la influencia de agentes, (por ejemplo, fármacos, compuestos) sobre la expresión de actividad de B7-4 o PD-l en ensayos clínicos. Estos y otros agentes son descritos con mayores detalles en las secciones siguientes. 1.Ensayos de Diagnóstico Un método ejemplar para detectar la presencia o ausencia de ácido nucleico o proteína de B7-4 o PD-l en una muestra biológica incluye la obtención de una muestra biológica a partir de un sujeto de prueba que se ha puesto en contacto de la muestra biológica con un compuesto o un agente capaz de detectar proteína o ácido nucleico de B7-4 o PD-l (por ejemplo, ARNm, ADN genómico) que codifica proteínas de B7-4 o PD-l, de tal manera que la presencia de proteína de B7-4 o PD-l o ácido nucleico es detectada en la muestra biológica. Un agente preferido para detectar ARNm de B7-4 o PD-l o ADN genómica es una sonda de ácido nucleico etiquetada capaz de hibridarse con ARNm de B7-4 o PD-l o bien ADN genómico. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico de B7-4 o PD-l de ser humano, por ejemplo, el ácido nucleico de SEQ ID N0:1, 3, 10, o bien 11 o una porción del mismo, por ejemplo un oligonucleótido de por lo menos 15, 30, 50, 100, 250 o bien 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridarse de manera específica en condiciones estrictas con ARNm de B7-4 o PD-l o ADN genómico. Otras son las adecuadas para su uso en los ensayos de diagnóstico de la presente invención se describen aquí. Un agente preferido para detectar una proteína de B7-4 o PD-l es un anticuerpo capaz de unirse con una proteína de B7-4 o PD-l, de preferencia un anticuerpo con un marcador detectable. Anticuerpos pueden ser policlonales, o con mayor preferencia, monoclonal. Un anticuerpo intacto o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab, o F(ab')2) puede emplearse. El término "etiquetado" con el relación a la sonda o al anticuerpo, tiene el propósito de abarcar el etiquetado directo de la sonda o anticuerpo mediante el acoplamiento (es decir, el enlace físico) de una sustancia detectable sobre la sonda o anticuerpo, así como un etiquetado indirecto de la sonda o anticuerpo mediante reactividad con otro reactivo etiquetado directamente. Ejemplos de etiquetado directo incluyen la detección de un cuerpo primario utilizando un anticuerpo secundario etiquetado de manera fluorescente y el etiquetado final de una sonda de ADN con biotina de manera que pueda ser detectada con estreptavidina etiquetada de manera fluorescente. El término "muestra biológica" tiene el propósito de incluir tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un sujeto, así como, tejidos, células y fluidos presentes en un sujeto. Es decir, el método de detección de la presente invención puede emplearse para detectar ARNm de B7-4 o PD-l, proteína, ADN genómico en una muestra biológica in vi tro así como in vi vo. Por ejemplo, técnicas in vi tro para detectar ARNm de B7-4 o PD-l incluyen hibridaciones Northern así como hibridaciones in si tu . Técnicas in vi tro para la detectar proteína de B7-4 o PD-l incluyen ensayos de ínmunoabsorbencia enlazados a enzimas (ELISAs) , Western Blots, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencias . Técnicas in vi tro para detectar ADN genómico de B7-4 o PD-l incluyen hibridaciones Southern. Además, técnicas in vi vo, para detectar proteínas de B7-4 o PD-l incluyen la introducción en un sujeto de un anticuerpo anti-B7-4 o PD-l etiquetado. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser etiquetado con un marcador radioactivo cuya presencia y ubicación en un sujeto pueden ser detectadas por técnicas estándares de formación de imágenes . En una modalidad, la muestra biológica contiene moléculas de proteína a partir del sujeto de prueba. Alternativamente, la muestra biológica puede contener moléculas de ARNm a partir del sujeto de prueba o bien moléculas de ADN genómico a partir del sujeto de prueba. Una muestra biológica preferida, es una muestra de suero aislada por medios convencionales a partir un sujeto. En otra modalidad, los métodos incluyen además la obtención de una muestra biológica de control a partir de un sujeto de control, la puesta en contacto de la muestra de control con un compuesto agente capaz de detectar proteína de B7-4 o PD-1, ARNm, o bien ADN genómico, de tal manera que la presencia de proteína de B7-4 o PD-l, ARNm, ADN genómico, es detectada en la muestra biológica, y la comparación de la presencia de proteína de B7-4 o PD-l, ARNm, ADN genómico, en la muestra de prueba . La invención abarca también conj untos de elementos para detectar la presencia de B7-4 o PD-l en una muestra biológica . Por ej emplo, el conj unto puede comprender un compuesto etiquetado o un agente capaz de detectar una proteína de B7-4 o PD- l , ARNm, en una muestra biológica; .>. -..*„^ **M * ¿b**0 *&¡ *^-'-*-~ rtf H -tt^-Nl medios para determinar la cantidad de B7-4 o PD-l en la muestra; y medios para comparar la cantidad de B7-4 o PD-l en la muestra con un estándar. El compuesto o agente puede ser empacado en un recipiente adecuado. El conjunto de elementos puede comprender además instrucciones para la utilización del conjunto de elementos con el objeto de detectar proteína de B7-4 o PD-l o bien ácido nucleico. 2.Ensayos de Pronóstico Los métodos de diagnóstico descritos aquí pueden ser utilizados además para identificar sujetos que tienen una enfermedad o un trastorno asociado con expresión o actividad aberrante de B7-4 o PD-l o bien que están en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante de B7-4 o PD-l. Por ejemplo, los ensayos descritos aquí, tales como los ensayos de diagnóstico precedentes o bien los ensayos siguientes, pueden ser utilizados para identificar un sujeto que tiene un trastorno asociado con proteína de B7-4 o PD-l, expresión o actividad, o bien, que esta en riesgo de desarrollar un trastorno de este tipo. Así como la presente invención le ofrece un método para identificar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante de B7-4 o PD-1 en donde una muestra de prueba es obtenida de un sujeto y se detecta proteína o ácido nucleico de B7-4 o PD-l (por ejemplo, ARNm, ADN genómico), en donde la presencia de proteína de B7-4 o PD-l o ácido nucleico es un diagnóstico para un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno asociado con expresión o actividad aberrante de B7-4 o PD-l o bien que esta en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno de este tipo. Como se emplea aquí una "muestra" se refiere a una muestra biológica obtenida a partir de un sujeto de interés. Por ejemplo, una muestra de prueba puede ser un fluido biológico (por ejemplo, suero), una muestra de células, o tejido. Además, los ensayos de pronóstico descritos aquí pueden ser utilizados para determinar si el sujeto puede recibir un agente (por ejemplo, un agonista, antagonista, peptidomimético, proteína, péptido, ácido nucleico, moléculas pequeñas, o bien otro fármaco candidato) para tratar una enfermad o trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante de B7-4 o PD-l. Por consiguiente la presente invención ofrece métodos para determinar si un sujeto puede ser efectivamente tratado por un agente para un trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante de B7-4 o PD-1 en donde una muestra de prueba es obtenida y se detecta la actividad o expresión de proteína o ácido nucleico B7-4 o PD-1, (en donde la abundancia de expresión o actividad de proteína o ácido nucleico de B7-4 o PD-l es un diagnóstico para un sujeto para el cual se le puede administrar el agente para tratar una enfermedad asociada con la expresión o Ai^á actividad aberrante de B7-4 o PD-l) . Los métodos de la presente invención pueden también ser utilizados para detectar alteraciones genéticas en un gen de B7-4 o PD-l, determinando así si un sujeto con el gen alterado se encuentra en riesgo de un trastorno asociado con el gen de B7-4 o PD-l. En modalidades preferidas, los métodos incluyen la detección en la muestra de células de un sujeto, de la presencia o ausencia de una alteración genética caracterizada por lo menos por una de una alteración que afecta la integridad de un gen que codifica una proteína de B7-4 o PD-l, o bien la expresión errónea del gen de B7-4 o PD-l. Por ejemplo, tales alteraciones genéticas pueden ser detectadas mediante la determinación de la existencia de por lo menos una de 1) una remoción de uno o varios nucleótidos de un gen de B7-4 o PD-l; 2) una adición de uno o varios nucleótidos de un gen de B7-4 o PD-l; 3) una sustitución de uno o varios nucleótidos de un gen de B7-4 o PD-l, 4) un arreglo cromosómico de un gen de B7-4 o PD-l; 5) una alteración en cuanto al nivel de un transcripto de ARN mensajero de un gen de B7-4 o PD-l, 6) una modificación aberrante de un gen de B7-4 o PD-l, como por ejemplo el patrón de metilación de ADN genómico, 7) la presencia de un patrón de empalme no de tipo silvestre de un transcripto de ARN mensajero de un gen de B7-4 o PD-l, 8) un nivel no de tipo silvestre de una proteína de B7-4 o PD-l, 9) una perdida alélica de un gen de B7-4 o PD-l, 10) modificación post-translacional inapropiada de una proteína de B7-4 o PD-l. De conformidad con o descrito aquí, existe un gran número de técnicas de ensayo conocidas que pueden ser empleadas para detectar alteraciones en un gen de B7-4 o PD-l. Una muestra biológica preferida es una muestra de tejido o de suero aislada por medios convencionales de un sujeto, por ejemplo, una muestra de tejido cardiaco. En ciertas modalidades, la detección de la alteración incluye el uso de una sonda/cebador en una reacción en cadena de polimerasa (PCR) (véase, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 4,683,195 y 4,683,202), por ejemplo PCR de ancla o RACE PCR, o bien alternativamente, en una reacción de cadena de ligación (LCR) (véase, por ejemplo, Landegran et al. (1988) Science 241:1077-1080; y Nakazawa et al. (1994) Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 91:360-364), esta última puede ser particularmente útil para detectar mutaciones de puntos en el gen de B7-4 o PD-l (véase Abravaya et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:675-682). Este método puede incluir los pasos de recoger una muestra de células de un paciente, aislar ácido nucleico (por ejemplo, ARNm, genómico o ambos) de las células de la muestra, ponen en contacto la muestra de ácido nucleico con uno o varios cebadores que se hibridan específicamente con un gen de B7-4 o PD-l en condiciones tales que ocurra dicha hibridación y amplificación del gen de B7-4 o PD-l (si está presente) y detectar la presencia o ausencia de un producto de amplificación, o bien detectar el tamaño del producto de amplificación y comparar la longitud con una muestra de control. Se anticipa que PCR y/o LCR pueden ser deseables para utilizarse como un paso de amplificación preliminar en combinación con cualesquiera de las técnicas utilizadas para detectar mutaciones descritas aquí. Métodos alternativos de amplificación incluyen: replicación autosostenida de secuencias (Guatelli, J.C. et al., (1990) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 87:1874-1878), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh, D.Y. et al. (1989) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 86:1173-1177), Q-Beta Replicasa (Liazardi, P. M. et al (1988) Biotechnology 6:1197), o bien cualquier otro método de amplificación de ácido nucleico, seguido por la detección de las moléculas amplificadas utilizando técnicas bien conocidas por parte de los expertos en la materia. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico si tales moléculas están presentes en números muy bajos. En una modalidad alternativa, mutaciones en un gen de B7-4 o PD-l a partir de una célula de muestra pueden ser identificadas por alteraciones en cuanto a patrones de disociación por enzimas de restricción. Por ejemplo, ADN de muestra y de control es aislado, amplificado (opcionalmente), digerido con una o varias endonucleasas de restricción, y se determinan los tamaños longitudinales de fragmento por electroforesis en gel y se comparan dichos tamaños. Las diferencias en cuanto a tamaños longitudinales de fragmento entre el ADN de muestra y el ADN de control indican mutaciones en el ADN de muestra. Además, el uso de ribozimas específicas para secuencias (véase, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,498,531) puede emplearse para calificar la presencia de mutaciones específicas mediante el desarrollo o la perdida de un sitio de disociación de ribozoma. En otras modalidades, mutaciones genéticas en B7-4 o PD-l pueden ser identificadas entre la hibridación de ácidos nucleicos de muestra y de control, por ejemplo, ADN o ARN, con conjuntos de alta densidad que contienen cientos o miles de sondas de oligonucleótidos (Cronin, M.T. et al. (1996) Hum. Mutat . 7:244-255; Kozal, M.J. et al. (1996) Nat . Med. 2:753-759). Por ejemplo, mutaciones genéticas en B7-4 o PD-l puede ser identificadas en dos grupos dimensionales que contienen sondas de ADN generadas por luz de conformidad con lo descrito en Cronin, M.T. et al. (1996) supra . En resumen, un primer conjunto de sondas de hibridación puede ser utilizado para explorar largos segmentos de ADN en una muestra y controlar con el objeto de identificar cambios de bases entre las secuencias mediante la realización de ensayes lineales de sondas de empalme secuencial. Este paso permite la identificación de mutaciones de puntos. Este paso es seguido por un segundo grupo de hibridación que permite la caracterización de mutaciones específicas utilizando grupos de sondas especializadas, más pequeños complementarios de todas las variantes o mutaciones detectadas. Cada grupo de mutación consiste de conjuntos paralelos de sondas, un conjunto complementario del gen de tipo silvestre y el otro complementario del gen mutante. En otra modalidad, cualesquiera de varias reacciones de secuenciamiento conocidos en la técnica puede emplearse para secuencia directamente el gen de B7-4 o PD-l y detectar mutaciones mediante la comparación de la secuencia de B7-4 o PD-l de muestra con secuencia de tipo silvestre correspondiente (control) . Ejemplos de reacciones de secuenciamiento incluyen las reacciones basadas en técnicas desarrolladas por Maxam y Gilbert ((1977) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 74:560) o bien Sanger ((1977) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 74:5463). Se contempla también que cualesquiera de varios procedimientos de secuenciamiento automatizado pueden emplearse cuando se efectúa los ensayos de diagnóstico ((1995) Biotechniques 19:448), incluyendo secuenciamiento por espectrometría de masa (véase, por ejemplo, Solicitud Internacional PCT No. 94/16101; Cohén et al. (1996) Adv. Chromatogr. 36:127-162; y Griffin et al. (1993) Appl . Biochem. Biotechnol . 38:147-159).

Otros métodos para detectar mutaciones en el gen de B7-4 o PD-l incluyen métodos en donde la protección contra agentes de disociación es utilizada para detectar bases que presentan una falta de correspondencia en heterodúplexes ARN/ARN o ARN/ADN (Myers et al. (1985) Science 230:1242). En general, la técnica de "disociación de falta de correspondencia" empieza proporcionando heterodúplexes formados por hibridación de ARN o ADN (etiquetados) que contiene la secuencia de B7-4 o PD-l de tipo silvestre con ARN o ADN potencialmente mutante obtenido de una muestra de tejido. Los dúplexes de doble cadena son tratados con un agente que disocia regiones de cadena única de dúplex tales como las que existen debido a faltas de correspondencia entre pares de bases ente la cadena de control y la cadena de muestra. Por ejemplo, dúplexes ARN/ADN pueden ser tratados con RNasa e híbridos ADN/ADN pueden ser tratados con SI nucleasa para digerir enzimáticamente las regiones con una falta de correspondencia. En otras modalidades, ya sea dúplexes de ADN/ADN o ARN/ADN pueden ser tratados ccn hidroxilamina o bien tetróxido de osmio y con piperidina con el objeto de digerir regiones que presentan faltas de correspondencia. Después de la digestión de las funciones que presentan falta de correspondencia, el material resultante es separado por tamaño en geles de poliacrilamida desnaturalizantes con el objeto de determinar el sitio de la mutación. Véase, por ejemplo, Cotton et al. (1988) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 85:4397; Saleeba et al. (1992) Methods Enzymol . 217:286-295. En una modalidad preferida, el ADN o ARN de control puede ser etiquetado para su detección. En otra modalidad, la reacción de disociación de falta de correspondencia emplea una o varias proteínas que reconocen los pares de bases que presentan una falta de correspondencia en ADN de cadena doble (se conoce como enzimas de "reparación de falta de correspondencia de ADN") en sistemas definidos para detectar y cartografiar mutaciones de puntos en ADNs de B7-4 o PD-l obtenidos de muestras de células. Por ejemplo, la enzima utY de E. coli disocia A en las faltas de correspondencias G/A y la timidina ADN glicosilasa de las células HeLa disocia T en faltas de correspondencias G/T (Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15:1657-1662). De conformidad con una modalidad ejemplar, una sonda basada en una secuencia de B7-4, por ejemplo, una secuencia de B7-4 o PD-l de tipo silvestre, es hibridada en un ADNc o bien otro producto de ADN a partir de la(s) célula (s) de prueba. Este dúplex es tratado con una enzima de reparación de falta de correspondencia de ADN, y los productos de disociación, si existen, pueden ser detectados a partir de protocolos de electroforesis o similares. Véase, por ejemplo, Patente Norteamericana No.5, 459, 039. En otras modalidades, alteraciones en cuanto a la movilidad ra-f^t electroforética pueden emplearse para identificar mutaciones en genes de B7-4 o PD-l. Por ejemplo, se puede utilizar el polimorfismo de conformación de cadena única (SSCP) para detectar diferencias en cuanto a movilidad electroforética entre ácidos nucleicos de tipo silvestre y mutantes (Orita et al. (1989) Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 86:2766, véase también Cotton (1993) Mutat Res . 285:125-144; y Hayashi (1992) Genet . Anal . Tech. Appl . 9:73-79) . Fragmentos de ADN de cadena única de ácidos nucleicos de B7-4 o PD-l de muestra y de control pueden ser desnaturalizados y se puede permitir su renaturalización. La estructura secundaria de ácidos nucleicos de cadena única varia según la secuencia, la alteración resultante en la movilidad electroforética permite la detección de hasta un solo cambio de base. Los fragmentos de ADN pueden ser etiquetados o detectados con sondas etiquetadas. La sensibilidad del ensayo puede ser incrementada utilizando ARN (en lugar de ADN) , en donde la estructura secundaria es más sensible a un cambio de secuencia. En una modalidad preferida, el método de la presente invención utiliza un análisis de heterodúplex para separar moléculas de heterodúplex de doble cadena con base en cambios en cuanto a la movilidad electroforética (Keen et al. (1991) Trends Genet . 7:5). En otra modalidad, el movimiento de fragmentos mutantes o de tipo silvestre en geles de poliacrilamida que contienen un ?i.i,- gradiente de agente de desnaturalización es ensayado empleando electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (DGGE) (Myers et al. (1985) Nature 313:495). Cuando se utiliza DGGE como método de análisis, el ADN puede ser modificado para asegurar que no se desnaturaliza completamente, por ejemplo, agregando una grapa GC de aproximadamente 40 pares de bases de ADN rico en GC de alto punto de fusión por reacción en cadena de polimerasa. En una modalidad adicional, un gradiente de temperatura es utilizado en lugar de un gradiente de desnaturalización con el objeto de identificar diferencias en la movilidad de ADN de control y ADN de muestra (Rosenbaum y Reissner (1987) Biophys Chem. 265:12753). Ejemplos de otras técnicas para detectar mutaciones de punto incluyen, sin limitarse a estas técnicas, la hibridación selectiva de oligonucleótidos, la amplificación selectiva o bien la extensión selectiva de cebadores. Por ejemplo, cebadores de oligonucleótidos pueden ser preparados en donde se coloca la mutación conocida centralmente y después se híbrida sobre ADN blanco en condiciones que permiten la hibridación solamente si se encuentra una correspondencia perfecta (Saiki et al. (1986) Na ture 324:163); Saiki et al. (1989) Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 86:6230). Tales oligonucleótidos específicos para alelos son hibridados con ADN blanco amplificado por reacción en cadena de polimerasa o bien numerosas mutaciones diferentes cuando los oligonucleótidos están unidos a la membrana hibridante e hibridados con ADN blanco etiquetado. Alternativamente, se puede utilizar una tecnología de amplificación específica para alelo que dependen de amplificación selectiva por reacción en cadena de polimerasa en combinación con la presente invención. Oligonucleótidos utilizados como cebadores para amplificación específica pueden llevar la mutación de interés en el centro de la molécula (de tal manera que la amplificación dependa de hibridación diferencial) (Gibbs et al. (1989) Nucleic Acids Res . 17:2437-2448) o bien en el extremo 3' terminal de un cebador cuando, en condiciones apropiadas, se puede evitar una falta de correspondencia, o bien reducir la extensión de polimerasa (Prossner et al. (1993) Tibtech 11:238). Además puede ser deseable introducir un sitio de restricción novedoso en una región de la mutación con el objeto de crear una detección basada en disociación (Gasparini et al. (1992) Mol . Cell . Probes 6:1). Se anticipa que en ciertas modalidades, la amplificación puede también ser utilizada empleando Tag ligasa para amplificación (Barany (1991) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 88:189). En tales casos, la ligación ocurre solamente si existe una correspondencia perfecta en el extremo 3' de la secuencia 5' haciendo posible la detección de la presencia de una mutación conocida en un sitio específico buscando la presencia o ausencia de amplificación. Los métodos descritos aquí pueden ser efectuados, por ejemplo, mediante la utilización de conjuntos de elementos de diagnóstico pre-empacado que comprenden por lo menos un ácido nucleico de sonda o bien reactivos de anticuerpos descritos aquí, que pueden ser utilizado convenientemente, por ejemplo, en entornos clínicos con el objeto de diagnosticar síntomas que presentan los pacientes o bien historia familiar de una enfermedad que involucra un gen de B7-4 o PD-l. Además, cualquier tipo de célula o tejido en donde B7-4 o PD-1 es expresada puede ser utilizada en los ensayos de diagnóstico descritos aquí. VII. Administración de agentes que modulan B7-4 o PD-l Agentes que modulan B7-4 o PD-l de la presente invención son administrados a sujetos en una forma biológicamente compatible adecuada para administración farmacéutica in vivo ya sea para incrementar o para suprimir respuestas inmunológicas mediadas por células inmunológicas. La expresión "forma biológicamente compatible adecuada para administración in vivo" se refiere a una forma de la proteína que es administrada en donde los efectos tóxicos son superados por los efectos terapéuticos de la proteína. El término sujeto incluye organismos vivos en donde se puede provocar una respuesta inmunológica, por ejemplo, mamíferos. Ejemplos de sujetos incluyen seres humanos, perros, gatos, * ratones, ratas, y especies transgénicas de los mismos. La administración en un agente de conformidad con lo descrito aquí puede ser en cualquier forma farmacéutica incluyendo una cantidad farmacéuticamente activa de un agente, sola o en combinación con una vehículo farmacéuticamente aceptable. La administración de una cantidad terapéuticamente activa de las composiciones terapéuticas de la presente invención se define como una cantidad efectiva, en dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios para lograr el resultado deseado. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente activa de un polipéptido de B7-4 o PD-l puede variar según factores tales como estado de la enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y la posibilidad del péptido para provocar una respuesta deseada en el individuo. Regímenes de dosificación pueden ser ajustados con el objeto de proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, varias dosis divididas pueden ser administradas diariamente o bien la dosis puede ser reducida proporcionalmente de conformidad con lo indicado por las exigencias de la situación terapéutica. El agente modulador de B7-4 o PD-l (por ejemplo, un péptido, una molécula de ácido nucleico, anticuerpo, péptido mimético, o bien pequeña molécula) puede ser administrado de manera conveniente, por ejemplo, inyección (subcutánea, intravenosa, etc), administración oral, inhalación, aplicación transdérmica, o bien administración rectal. Según la vía de administración, el compuesto activo puede ser revestido en un material para proteger el compuesto contra la acción de enzimas, ácidos y otras condiciones naturales que pueden desactivar el compuesto. Por ejemplo, para administrar un agente modulador de B7-4 o PD-l por administración otra que por administración parenteral, puede ser deseable revestir el péptido con un material para evitar su desactivación o bien co-administrar dicho péptido con un material para prevenir su desactivación. Un agente modulador de B7-4 o PD-l puede ser administrado a un individuo en un vehículo apropiado, diluyente apropiado o adyuvante apropiado, co-administrado con inhibidores de enzima o bien en un vehículo apropiado, por ejemplo, liposomas. Diluyente farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones salinas y soluciones amortiguadoras acuosas. El término "adyuvante" se utiliza en el sentido más amplio de la palabra e incluye un compuesto estimulador del sistema inmunológico, por ejemplo, interferón. Adyuvantes contemplados aquí incluyen resorcmoles, surfactantes no iónicos tales como polioxietilenoleiléter y n-hexadecilpolietilenéter. Inhibidores de enzimas incluyen inhibidor de tripsina pancreática, diisopropilfluorofosfato (DEEP) y trasilol. Liposomas incluyen emulsiones de agua en aceite en agua así como liposomas convencionales (Sterna et •^-¿-.Üa al. (1984) J. Neuroimmunol . 7:27). El compuesto activo puede ser administrado también de manera parenteral o bien intraperitoneal. Dispersiones pueden ser preparadas también en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones pueden contener un conservador para evitar el crecimiento de microorganismos . Composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando están solubles en agua) o bien dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe encontrarse en estado fluido en la mediad en que existe una capacidad de aplicación fácil a través de una jeringa. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe estar protegida contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un solvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, por ejemplo, lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño requerido de Íü??í&-i?4 £A t? partícula en el caso de dispersión y mediante el uso de surfactantes. La prevención de la acción de microorganismos puede lograrse por varios agentes antibacterianos y antifungales, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. Una absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser provocada mediante la inclusión en la composición de un agente que retarda la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Soluciones inyectables estériles pueden ser preparadas mediante la incorporación de un compuesto activo (por ejemplo, polipéptido de B7-4 o PD-l) en la cantidad requerida en un solvente apropiado por uno de los ingredientes mencionados arriba o una combinación de dichos ingredientes, según se requiere, seguido por esterilización filtrada. En general, se preparan dispersiones mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos ente los enumerados arriba. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secados en vacío y liofilización que proporciona un polvo del ingrediente activo (por ejemplo, péptidos) más cualquier Í -C4É ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente filtrada de manera estéril del mismo. Cuando el compuesto activo es protegido adecuadamente, de conformidad con lo descrito arriba, la proteína puede ser administrada oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o bien con un vehículo comestible asimilable. Como se emplea aquí, la expresión "vehículo farmacéuticamente activo" incluye todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungales, agentes isotónicos y de retardo de absorción y similares. El uso de tales medios y agentes y sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica excepto en la medida en que el medio convencional o agente es incompatible con el compuesto activo se contempla en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Compuestos activos complementarios pueden también ser incorporados en las composiciones. Es especialmente provechoso formular composiciones parenterales en forma unitaria de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de dosificación. La expresión "forma unitaria de dosificación" como se emplea aquí, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo que se calcula para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación de las formas unitarias de dosificación de la invención depende directamente de: (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico a lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de formación de compuestos tales como compuesto activo para el tratamiento activo de la sensibilidad de individuos. En una modalidad de la presente invención, se administra a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo para una proteína de B7-4 o PD-l. De conformidad con lo definido aquí una cantidad terapéuticamente efectiva de anticuerpo (es decir, una dosificación efectiva) se ubica dentro de un rango de aproximadamente 0.001 a 30 mg/kg de peso corporal, de preferencia de aproximadamente 0.01 a 25 mg/kg de peso corporal, con mayor preferencia de aproximadamente 0.1 a 20 mg/kg de peso corporal, y con preferencia aún mayor de aproximadamente 1 a 10 mg/kg, de aproximadamente 2 a 9 mg/kg, de aproximadamente de 3 a 8 mg/kg, de aproximadamente 4 a 7 mg/kg, o de aproximadamente 5 a 6 kg/mg de peso corporal, la persona con conocimientos en la materia observará que ciertos factores pueden influenciar la dosificación requerida para tratar efectivamente un sujeto, incluyendo, sin limitación, la severidad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, la salud' general y/o la edad del sujeto, y otras enfermedades t*Á„i-&¡Á .*í?..??-ÍJk*i*í .t -..---^ - .-, . , > . --sí,*, .-j. ;...^ - . . _.-._ . . .^a..-,._.:_^.--J.„ui! presentes, además el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo puede incluir un tratamiento único o bien de preferencia puede incluir una serie de tratamientos, en un ejemplo preferido, un sujeto es tratado con un anticuerpo dentro de un rango comprendido entre aproximadamente 0.1 y 20 mg/kg de peso corporal, una vez por semana durante aproximadamente 1 semana y 10 semanas, de preferencia 2 y 8 semanas, con mayor preferencia entre aproximadamente 3 y 7 semanas, con preferencia aún mayor durante aproximadamente 4, 5 o 6 semanas. Se observará que la dosificación efectiva de anticuerpo que se utiliza para el tratamiento puede incrementarse o disminuir durante el transcurso de un tratamiento particular. Cambios de dosificación pueden resultar de los resultados de ensayos de diagnóstico de conformidad con lo descrito aquí. El monitoreo de la influencia de agentes (por ejemplo fármacos o compuestos) sobre la expresión o actividad de una proteína de B7-4, PD-l puede aplicarse no solamente en tamizado de fármaco básico, sino también en ensayos clínicos, por ejemplo, la efectividad de un agente determinada por un ensayo de tamizado de conformidad con lo descrito aquí para incrementar la expresión de gen de B7-4 PD-l, niveles de proteína o bien para regular de manera ascendente la actividad de B7-4 PD-l, puede ser monitoreada en ensayos g&É^&<^* jj*--j*.^?¿¡ - feÉ.b clínicos de sujetos que presentan una expresión disminuida de gen de B7-4 a PD-4, niveles de proteína o bien una actividad B7-4 PD-l regulada de manera descendente, alternativamente, la efectividad de un agente determinada por un ensayo de tamizado para disminuir la expresión de gen de B7-4 PD-l, niveles de proteína o bien para regular de manera descendente la actividad B7-4 PD-l puede ser monitoreada en ensayos clínicos de sujetos que presentan una expresión incrementada de gen de B7-4 a PD-l, niveles de proteína o bien una actividad regulada de manera ascendente de B7-4 o PD-l. En tales ensayos clínicos, la expresión o actividad de un gen de B7-4 a PD-l y de preferencia otros genes que han sido implicados en un trastorno puede emplearse como "lectura" o marcadores del fenotipo de una célula particular. A título de ejemplo y de ninguna manera para limitar la presente invención, genes incluyendo B7-4 PD-l que son modulados por células por tratamiento con un agente (por ejemplo, compuesto, fármaco o pequeña molécula) que modulan la actividad B7-4 PD-l (por ejemplo, identificada en un ensayo de tamizado de conformicad con lo descrito aquí) pueden ser identificados. Así, para estudiar el efecto de agentes sobre un trastorno asociado pon B7-4 o PD-l, por ejemplo, en un ensayo clínico, células pueden ser aisladas y se puede analizar ARN para determinar los niveles de expresión de B7-4 o PD-l y otros genes implicados en el trastorno asociado con B7-4 o PD-l, respectivamente. Los niveles de expresión génica (es decir, el patrón de expresión de gen pueden ser cuantificados por análisis Northern blot o RT-PCR, de conformidad con lo descrito aquí, o bien alternativamente mediante la medición de la cantidad de proteína producida por uno de los métodos de conformidad con lo descrito aquí, o bien mediante la medición de los niveles de actividad de B7-4 o PD-l o bien otros genes. De esta formar, el patrón de expresión de genes puede servir de marcador, indicador de las respuestas fisiológicas de las células al agente. Por consiguiente, este estado de respuesta puede ser determinado antes y en varios puntos durante el tratamiento del individuo con el agente. En una modalidad preferida, la presente invención ofrece un método para monitorear la efectividad del tratamiento de un sujeto con un agente (por ejemplo un agonista, un antagonista, péptido mimético, proteína, péptido, ácido nucleico, pequeña molécula, o bien otro fármaco candidato identificado por los ensayos de tamizado descritos aquí) que comprende los pasos de (i) obtener una muestra previa antes de la administración del agente, (ii) detectar el nivel de expresión de la proteína de B7-4 o PD-l ARNm o ADN genómico en la muestra previa a la administración; (iii) obtener una o varias muestras posteriores a la administración a partir del sujeto; (iv) detectar el nivel de expresión o actividad de proteína, ARNm o bien ADN genómico de B7-4 o PD-l en las muestras tomadas después de la administración; (v) comparar el nivel de expresión o actividad de la proteína ARNm o ADN genómico de B7-4 PD-l en la muestra o las varias muestras tomada (s) después de la administración; (vi) alterar la administración del agente al sujeto de manera correspondiente, por ejemplo, una administración incrementada del agente puede ser deseable con el objeto de incrementar la expresión o actividad de B7-4 o PD-l a niveles más altos que los detectados, es decir, para incrementar la efectividad del agente. Alternativamente, una administración disminuida del agente puede ser deseable con el objeto de disminuir la expresión o actividad de B7-4 o PD-l a niveles menores a los niveles detectados, es decir, para disminuir la efectividad del agente. De conformidad con una modalidad de este tipo, la expresión o actividad de B7-4 o PD-l puede ser utilizada como un indicador de la efectividad de un agente aún en ausencia de una respuesta fenotípica observable. Esta invención se ilustra adicionalmente a través de los siguientes ejemplos que no deben considerarse como limitativos de la presente invención. Los contenidos de todas las referencias, patentes, y solicitudes de patente publicadas mencionadas en esta solicitud, así como las figuras y la Lista de Secuencias se incorporan aquí por referencia.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Aislamiento de molécula ADNc de B7-4 La secuencia de proteínas del dominio extracelular de B7-1 humano fue utilizada para buscar las bases de datos públicas 5 para moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos homólogos. Dos secuencias que se empalman en la base de datos EST AA292201 y AA399416, fueron identificadas estas secuencias fueron utilizadas para aislar ADNc de B7-4 de longitud completa a partir de bibliotecas activadas humanas 0 de ADNc placental y de queratinocitos. Se sintetizaron oligonucleótidos con la secuencia 5'- CAGCTATGGTGGTGCCGACTACAA-3' (SEQ ID No: 5) y 5'- AGGTGCTAGGGGACAGTGTTAGACA-3' (SEQ ID No: 6) a partir de estos hallazgos EST. Estos oligonucleótidos fueron utilizados para 5 iniciar una reacción en cadena de polimerasa empleando como templado ADNc preparado por transcripción reversa de ARNm a partir del bazo de un caso de linfoma folicular, células B activadas, queratinocitos activados con INF-gama, bazo normal y placenta. Las condiciones fueron las siguientes: 94°C, un 0 minuto; 94°C, 30 segundos, 56°C, 30 segundos, 68°C, 1 minuto durante 35 ciclos; 68°C, 3 minutos, mantenimiento a 4°C. Todos los templados proporcionaron una banda del tamaño esperado de 389 pares de bases. El producto de 389 pares de bases a partir de la reacción en cadena de polimerasa de los 5 queratinocitos con INF-gama fue purificado por electroforesis en gel de agarosa y se utilizó 0.12 mg como templado en una reacción de cadena de polimerasa que contiene biotina-21-Dutp 0.05 mM y los cebadores antes mencionados. Las condiciones fueron las siguientes: 94°C, 1 minuto; 94°C, 30 segundos, 56°C, 30 segundos, 56°C, 30 segundos, 68°C, 2 segundos durante 20 ciclos, 68°C, 5 minutos, mantenimiento a 4°C. El producto biotinilado obtenido por reacción en cadena de polimerasa fue purificado en una columna Nucleospin (Clontech) y se utilizó como sonda en el procedimiento de selección de ADNc ClonCapture (Clontech) . 60 ng de producto biotinilado, desnaturalizado obtenido por reacción en cadena de polimerasa fueron incubados con CoCl2 2mM, amortiguador RecA IX, 1 µg de proteína RecA, IX ATP en un volumen final de 30 µl. La reacción fue incubada a una temperatura de 37°C durante 15 minutos. A esta mezcla, se agregó 0.7 µg de ADN de plásmido de una biblioteca activada de ADNc de queratinocito y 0.4 µg de una biblioteca de ADNc de placenta humana, y la incubación prosiguió durante 20 minutos. Se agregó 50 mg de lambda ADN digerido con EcorRV a la reacción y se incubó durante 5 minutos. Se agregaron 0.6 µl de SDS al 10% y 5.6 µg de proteinasa K y se incubó a una temperatura de 37°C durante 10 minutos. La proteinasa K fue desactivada por adición de 1 micro 1 de PMSF 0.1 M. Perlas magnéticas de estreptavidina fueron incubadas con 5 µg de ADN de esperma de salmón cortado durante 10 minutos y las perlas fueron capturadas con un j & liüJ, imán, el sobrenadante fue removido y las perlas fueron resuspendidas en 30 µl de amortiguador de enlace (EDTA 1 mM, NaCl 1M, Tris-HCl, 10 mM, pH 7.5) . Las perlas fueron agregadas a la reacción y la reacción fue incubada durante 30 minutos a temperatura ambiente con mezclado suave. Las perlas fueron capturadas con un imán y el sobrenadante removido. El procedimiento de lavado fue repetido tres veces. 1 ml de H20 estéril fue agregado a las perlas lavadas, se incubo durante 5 minutos a una temperatura de 37 °C, las perlas fueron capturadas en un imán y el sobrenadante fue removido. El ADN capturado fue eluído por adición de 0.1 ml de amortiguador de elusión (EDTA 1 mM, NAOH 0.1 N) , incubando durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las perlas fueron capturadas por un imán y el sobrenadante fue removido y guardado en un nuevo tubo. Se agregaron 22.5 µl de mezcla de precipitación que contenía vehículo y neutralizadores de pH junto con 2.5 volúmenes de etanol. El ADN de plásmido fue concentrado por centrifugación y disuelto en H20. El ADN de plásmido fue reintroducido en E. coli DH10B/P3 por electroporación y seleccionado en placas de LB-agar que contenía 7.5 µg/ml de tetraciclina y 25 µg/ml de ampicilina. Las colonias fueron levantadas en filtros Nytran e hibridadas con oligonucleótidos etiquetados con azúcares de 32P con la secuencia 5'-CAGCTATGGTGGTGCCGACTACAA-3' (SEQ ID NO: 7), 5'-AGGTGCTAGGGGACAGTGTTAGACA-3' (SEQ ID NO: 8), y 5'- t--.a¿fai.j.

TCGCTTGTAGTCGGCACCACCATA-3' (SEQ ID NO: 9) . Todos los oligos provienen de la secuencia AA292201. Condiciones finales de lavado fueron 2 X SSC, 0.1% SDS a 55°C durante 20 minutos. Las dos colonias de hibridación y se determinó la secuencia de los insertos de ADNc. El secuenciamiento reveló dos formas de moléculas de B7-4. De manera formal B7-4 secretado (B7-4S) codifica una proteína que tiene un dominio hidrofílico corto sin un anca de membrana. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de esta forma se muestran en SEQ ID N0:1 y 2, respectivamente. La segunda forma B7-4 de membrana (B7-4M) codifica una proteína que tiene una transmembrana y un dominio citoplásmico corto. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de esta forma se muestran en SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente. Ambos miembros de la familia B7-4 y identificados tienen dominios de señal, IgV e IgC, de conformidad con lo ilustrado en las figuras 3 y 4. La forma B7-4M tiene aproximadamente una identidad de aminoácidos del 21% con relación con B7-1 de ser humano y una identidad de aminoácidos de aproximadamente el 20% con B7-2 de ser humano según lo calculado empleando la matriz Blosum62 por omisión con penalidades de espacios establecidas en existencia 11 y extensión 1 (véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov) en condiciones de B7-1 y B7-2 tienen una identidad de aproximadamente el 26%. Ejemplo 2. Expresión de ARNm de B7-4 : Análisis de Northern Blot Un ARNm de la forma soluble de B7-4 es predicho por tener aproximadamente 1.2kb aún cuando otros tamaños son posibles. El ARNm de la segunda forma es de aproximadamente 3.8 kb, con ARNm menores de 1.6 y 6.5 kb . Se analizó polipéptidos de B7-4. Se preparó ARN por homogeneización de tiosanato de guanidina y centrifugación de cloruro de cesio. Cantidades iguales de ARN (Aproximadamente 2 µg de poli (A) + ARN) fueron sometidas a electroforesis en un gel de agarosa, secadas e hibridadas en una porción de- ADNc de B7-4 etiquetado con 32P común tanto a la forma B7-4s como a la forma B7-4M. Estos ARNm de B7-4 son expresados altamente en placenta de sangre periférica. Se encuentran también expresados de manera muy débil en hígado o cerebro. Los ARNm de B7-4 no fueron expresados en monocitos no estimulados, pero fueron fuertemente inducidos por INF-? de manera similar la expresión de estos polipéptidos fue inducida en queratinocitos por TPA/IFN-? y en células dendríticas por IFN-?. Estos ARNm de B7-4 no fueron expresados en células B no estimuladas, sino que fueron inducidos por reticulación de Ig. La expresión de estos ARNm de B7-4 fue también examinada en varias líneas de células, no se encontraron expresados en líneas de células P tales como Raji, Ramos, LBL, Nalm 6, y DHL-4. Tampoco fueron expresados en líneas de células T como por ejemplo Jurkat, Rex, CEM, HPB-ALL, Peer4 y H9 ni en líneas de células T transformadas por HTLV-1 tales como SPP y MT2 ni en línea de mieloide U937. Ejemplo 3. Caracterización adicional de expresión de ARNm de B7-4: análisis Northern Blot Múltiples Northern Blots de tejido de ratón y ser humano (Clontech, Palo Alto, CA) fueron sondeados con sondas de ADN de radioetiquetada con 32P-dCTP en QuinkHyb (Stratagene, La Jolla, CA) según las instrucciones del fabricante. La sonda de B7-4 de ser humano consistían de un fragmento BamHI/Notl de 1 kb del ADNc que abarca la región codificada y región no traducida 3' de SEQ ID N0:1 la sonda de B7-4 de ratón consistía de un fragmento de ADNc de 300 pares de bases proveniente de la región codificadora. Sondas de actina de control fueron suministradas por Clontech. Blots fueron lavados 2 veces a temperatura ambiente en 2X SSC, 0.1% seguido por 0.2 X SSC, SDS 0.1% a una temperatura de 65°C, y examinados por autoradiografía. Se expresó ARNm de B7-4 en niveles altos en el corazón, placenta humana e hígado fetal humano, y a niveles más bajos en el bazo, nodulos linfáticos, timo e hígado de ratón. ARNm de B7-4 fue expresado en varias líneas de célula de ratón trasformadas, incluyendo PU5-1.8, RAW 264.7, K-Balb, M-MSV-Balb/3T3, Hepa 1-6, Rl.l, L1210, P38DI, P815, y células NB41A3.

Ejemplo 4. Caracterización adicional de expresión de ARNm de B7-4: Reacción en cadena de polimerasa cuantitativa, hibridación Genechip así como análisis de Blot de ARN La expresión de ARNm de B7-4 en células de presentación de antígeno fue examina y comparada con la expresión de B7-1 y B7-2 en estas células. Para un análisis cuantitativo por reacción en cadena de polimerasa, ARN celular fue tratado con desoxiribonucleasa, re-extraído y convertido en ADNc de primera cadena. Se compraron sondas B7-4, B7-1 y B7-2 y GAPDH humanas etiquetadas con FAM (6-caroxifluoresceina) en PE Biosystems (B7-4 cebadores 5' -GCCGAAGTCATCTGGACAAG-3' (SEQ IDE NO: 13) y 5'-TCTCAGTGTGCTGGTCACAT-3' ( SEQ ID N0:14), probé 5'-FAM-CACCACCACCAATTCCAAGA-3' (SEQ ID NO: 15); B7-1: primers 5'-ACGTGACCAAGGAAGTGAAAGAA-3' (SEQ ID NO: 16) y 5' - TGCCAGCTCTTCAACAGAAACAT-3' (SEQ ID NO: 17), probé 5' -FAM- TGGCAACGCTGTCCTGTGGTCAC-3' (SEQ ID NO: 18); B7-2, primers 5' - GGGCCGCACAAGTTTTGAT-3' (SEQ ID NO: 19) y 5'- GCCCTTGTCCTTGATCTGAAGA-3' (SEQ ID NO: 20), probé 5'- FAMCGGACAGTTGGACCCTGAGACTTCACA-3' (SEQ ID NO:21). Reacciones en cadena de polimerasa fueron establecidas en placas de 96 pozos emplean reactivos del conjunto de elementos de EZ de Perkin Elmer TaqMan®, según las instrucciones del fabricante. Curvas estándares fueron establecidas para cada uno de los cuatro genes analizados. 40 ciclos de reacción en cadena de polimerasa fueron efectuados I -»A»-A-L«-M- ¿l?-- ^^*fi^«^rt..-,.J.-j...»»....».J»... . -_.-t --.--«_-. ,- - J--^-.«--a85.i-¿---«--i.-^..?A1l¿,--í... ~ix* ¿* en un detector de secuencias ABI Prism 7700 y se utilizó GAPDH para normalizar los resultados de B7-4, B7-1, y B7-2. El chip Affy etrix Mul9KsubA fue utilizado para análisis de hibridación de Genechip. La secuencia de una porción de B7-4 de murino es representada por la etiqueta de secuencia expresada TC17781 del Institute For Genomic Research en este chip. Se efectuó aislamiento de ARN, hibridación de chip y exploración de conformidad con lo descrito en Byrne, M.C. et al. (2000) Curr. Prot. Mol. Biol. Suppl. 49: 22.2.1-22.2.13. En el caso de la hibridación de Blot de ARN, se removieron por digestión con Xba I los ADNc de B7-4 de ser humano de 1.6 kb y de murino de 3.6 kb y dichos ADNc fueron marcados por cebado aleatoria con ?-32P-ATP y el fragmento de Klenow de ADN polimerasa I. Los blots de ARN fueron hibridados de conformidad con lo descrito en Freeman, G.J. et al. (1992) J. Immunol, 149:3795-3801. Células dendríticas humanas fueron derivadas de sangre periférica, células mononucleares fueron aisladas después de fraccionamiento en un gradiente Ficoll. Células no adherentes fueron removidas y las células restantes cultivadas en 150 ng/ml de GM-CSF de ser humano (R&D Systems) y 100 mg/ml de IL-4 de ser humano (R&D Systems) durante 2 días. Las células dendríticas no adherentes fueron aisladas (C80+CD86+HLA-DR+CD54+CD58+CDla+) y cultivadas en GM-CSF solas o bien activadas con GM-CSF, 2.5 µg/ml LPS (Sigma Chemicals), y 10 ,.», > .a sfa ng/ml de Interferon-? de ser humano. Las 4 horas y 20 horas después de activación, las células fueron cosechadas el ARN fue aislado empleando el conjunto de elementos de RNeasy kit (Qiagen) . Células mononucleares de médula ósea de murino fueron in unoagotadas de granulocitos, linfocitos y células Ia+ por identificación magnética de células activadas y cultivadas en cajas de petri con GM-CSF e IL-4. Células dendríticas fueron cosechadas como la población no adherente después de 7 días de cultivo, y demostraron ser 75-80% CDllc+, células IA+ altas. Las células fueron activadas con LPS e interferón-? de ser humano. El análisis de la expresión de monocitos de sangre humana por hibridación de blot de ARN demostró que B7-2 no es expresado por monocitos no estimulados, sino que es rápidamente regulado de manera ascendente con tratamiento con interferón ?. El tratamiento de monocitos con otra citocina proinflaatoria, factor de necrosis tumoral (TNF)-a provocó una inducción de bajo nivel similar a la inducción encontrada con medio solo, probablemente como resultado de la activación por adherencia sobre plástico, además del ARNm de B7-4 mayor de 4.2 kb, se observó también una especie de ARNm de B7-4 menor de 1.8 kb en monocitos tratados con interferón-a. La expresión de B7-4 por células B humanas activadas por reticulación de inmunoglobulina de superficie celular, pero . ^«A- lj no por la línea de células Raji, se observó también. De manera similar, B7-1 no es expresado por monocitos no estimulados, sino que es regulado de manera ascendente en respuesta a interferón-? con características cinéticas similares a la expresión de B7-4. En contraste con ARNm de B7-2 es expresado de manera constitutiva en monocitos y los niveles no son afectados por el tratamiento con interferón-? o bien TNF-a. La expresión de ARNm de B7-4, B7-1, y B7-2, por células dendríticas humanas fue también examinada por reacción en cadena de polimerasa cuantitativa. Células dendríticas derivadas de sangre periférica humana fueron tratadas por factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) solo o bien activado con GM-CSF, lipopolisacáridc (LPS) e interferón-?. Como resultado de la activación por LPS e interferón-?, el ARNm de B7-4 fue rápidamente inducido con un incremento de 16 veces a las 4 horas y 34 veces a las 2C horas, en comparación con células no inducidas. Se indujeron también ARNm de B7-1 y B7-2 al efectuarse la activación: B7-1 fue inducido 21 veces a las 4 horas y 22 veces a las 20 horas. B7-2 mostró poca inducción a las 4 horas. Sin embargo, la expresión fue inducida 5 veces a las 20 horas. La expresión de B7-4 por células dendríticas derivadas de médula ósea de murino tratadas con LPS e interferón-? fue examinada utilizando hibridación Genechip®. La expresión de B7-4 en estas células es un patrón similar al patrón observado en células dendríticas humanas. Una inducción 5 veces del ARNm de B7-4 con relación a las células no inducidas a las 6:20 horas después de la inducción estos datos muestran que B7-4 es expresado por células de presentación de antígeno y linfocitos y es inducido en células dendríticas de una manera similar de B7-1 y B7-2. ?l tratamiento de queratinocitos humanos con formol éster e interferón-? indujo también B7-4. En tejidos de murino, un transcrito de ARNm de B7-4 de aproximadamente 3.7 kb fue detectado por hibridación Northern blot. La distribución del ARNm de B7-4 de murino tuvo un parecido cercano con la distribución del ARNm de B7-4 de ser humano, con niveles altos en el corazón, timo y pulmón, y niveles bajos en riñon, bazo e hígado. Ejemplo 5. Localización cromosómica de B7-4 La localización cromosómica de los genes de B7-4 fue determinada empleando un conjunto de elementos de blot monocromosómico comercialmente disponible en Quantum (Toronto, Canadá) . Los bíots fueron sondeados con una secuencia que reconoce tanto B7-4S como B7-4M. Utilizando este método, los polipéptidcs de B7-4 han sido localizados en el cromosoma humano 9, mientras que B7-1 y B7-2 han sido localizados en el cromosoma humano 3. Las butirofilinas, que comparten también una identidad limitada de secuencias de aminoácidos con la familia de B7-4 han sido localizadas en el complejo de histocompatibilidad mayor en el cromosoma 6. La ubicación cromosómica de B7-4 fue confirmada empelando cebadores específicos para B7-4 en amplificación por reacción en cadena de polimerasa de templado de ALN híbridos de células somáticas monocromosómicas disponibles en Quantum Technologies (Canadá) . Ejemplo 6. Unión de moléculas de B7-4 con ligandos de células T o anticuerpos Células COS fueron transfectadas ya sea con ADN vector (pcADNI) o bien un plásmido de expresión que contiene el ADNc de B7-4M. Después de 72 horas, las células COS transfectadas fueron desprendidas por incubación de PBS que contenía EDTA 0.5 mM durante 30 minutos a una temperatura de 37°C. La capacidad de las células COS que expresan B7-4M para unirse a varios receptores de células T y anticuerpos fue probada. Un análisis FACS de unión de CD28Ig CTLA4-Ig, así como Ig de control por células COS transfectadas con B7-4 mostró que ni CD28Ig ni CDLA4-Ig estaban unidos por B7-4 (figura 8). La capacidad de células COS que expresan B7-4M para unirse sobre IgG y proteína de fusión ICOS de murino-his también fue probada. No se detectó unión de B7-4 de ser humano con ICOS de murino (figura 9) . Como se muestra en la figura 10 un análisis FACS reveló la unión de 3B1 (anti B7-1 y anti B7-3) , pero de no de anticuerpos IgM c 133 (anti-B7) sobre células COS transfectadas con B7-4.

Ejemplo 7. Coestimulación de la proliferación de células T por moléculas B7-4 La capacidad de polipéptidos de B7-4 para co-estimular la proliferación de células T humanas fue probada. Células T CD28+ de ser humano fueron aisladas por depleción de perlas inmunomagnéticas empleando anticuerpos monoclonales enfocados contra células B, células asesinas naturales y macrófagos de conformidad con lo descrito (Gimmi, C.D., et al. (1993) Proc. Nati . Acad. Sci : USA 90, 6586-6590). B7-4 y células COS transfectadas con vector fueron cosechadas 72 horas después de la transfección incubadas con 25 µg/ml de mitomicina-C durante 1 hora, y después lavada de manera extensa. 10s células T naives fueron estimuladas con mAb anti CD3 unido a placa más 20,000 células COS tratadas con mitomicina-C transfectadas con el constructo de ADN indicado. La proliferación de células T fue medida por 3H-timidina (1 µCi) incorporada durante por lo menos 12 horas de una incubación de 72 horas. Como se muestra en las figuras 11 y 12, células COS que expresan B7-4 pueden co-estimular la proliferación de células T. Ejemplo 8. Generación de anticuerpos de murino para B7-4 Vectores de expresión de mamíferos (pEF6 o pcDNA3.1 (Invitrogen)) fueron preparados los cuales comprenden el ADNc de B7-4 de murino o ser humano. El constructo ADNc/vector fue disuelto en solución salina al 0.9% a 1 mg/ml (no TE ni PBS).

- •~ . JÉ ?.4 í. J, Í?&ÉÁ?Í i*- - - J- -s-J-8-*-. "~---- y , _______ -m-»----»--- -a-»----*-.-J-S-toS Antes de la inmunización, 78 µl de 1 mg/ml de cardiotoxina (Sigma #C-1777) en solución salina al 0.9% fueron inyectados en el músculo anterior tibialis de cada posterior del ratón en proceso de inmunización. Cada ratón fue dejado durante 5 días. Después de anestesiar los ratones, se inyectaron 50 µl de 1 mg/ml de constructo purificado de ADNc de B7-4/vector (en solución salina al 0.9%) en cada músculo anterior tibialis en regeneración. Títulos de anticuerpos fueron medidos aproximadamente 6 días después de la inmunización utilizando métodos estándares, por ejemplo, un ensayo ELISA. La inmunización de ADNc fue repetida cada 2-4 semanas durante 3 ciclos (hasta que el peso corporal fuera de > 1:10,000). Ratones recibieron un refuerzo con células CHO transfectadas con PDL-1. Células de bazo aisladas de ratones que tienen título de anticuerpo apropiados fueron cosechadas. Las células de bazo fueron fusionadas con socios de fusión SP2-0 para formar hibridomas. Hibridomas y anticuerpos fueron manipulados empleando métodos estándares (véase, por ejemplo, "Antibodies: A Laboratory Manual", Harlow E. y Lañe, D., Cold Spring Harbor Laboratory (1988), que se incorpora aquí por referencia. Anticuerpos 2A3, 10D9, 5A9, y IID12 estuvieron entre los seleccionados en ensayos de tamizado. Se encontró que estos anticuerpos se unían a células COS o CHO transfectadas con B7-4 de ser humano y no a células transfectadas de manera ficticia o bien a células transfectadas con B7-4 de ratón. Los anticuerpos fueron utilizados para detectar la presencia 5 de B7-4 en varias poblaciones de células. La expresión de B7- 4 fue observada, inter alia en tejido del corazón, células tumorales, (incluyendo algunas células de tumor de pulmón, algunas células de tumor de ovario, algunas célula de tumor de mama, algunas células de tumor epitelial, y algunos 10 carcinomas de células escamosas) , placenta, así como epitelio químico. Ejemplo 9. Generación de anticuerpo totalmente humanos contra B7-4 En este ejemplo, anticuerpos totalmente humanos contra B7-4 15 de PD-l son elaborados en ratones que son transgénicos para genes de inmunoglobulina humana. Ratones transgénicos son preparados utilizando métodos estándares, por ejemplo, de conformidad con Hogan et al., "Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, que se 20 incorpora aquí por referencia, o bien se adquieren en el comercio, células madres embriónicas son manipuladas de conformidad con procedimientos publicados (Teratocarcinomas and embryonic stem cells: a practical approach, Robertson, E. J. ed., IRL Press, Washington, D.C., 1987; Zjilstra et al 25 (1989) Nature 342:435-438; y Schwartzberg et al. (1989) sís- ?¡LÁÁ*Aí i..-M-fea-.i'. i JMfcS-Bt.. . ...aa-*ja*-_. - » -. -- ** - » ---. i---.--».--*-*--"--»-----»-- Science 246:799-803, que se incorporan a ií por referencia). Procedimientos de clonación de ADN se efectúan de conformidad con Sambrook J. et al. en Molecular Cloning: A Laboratory Manual segunda edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., que se incorpora aquí por referencia, oligonucleótidos son sintetizados, por ejemplo, en un sintetizador de oligonucleótidos de Applied Bio Systems oligonucleotide synthesizer de conformidad con las especificaciones proporcionadas por el fabricante o bien se adquieren en el comercio. Ratones transgénicos son inmunizados utilizando un B7-4 o PD-1 purificado o recombinante o una proteína de fusión que comprende por lo menos una porción inmunogénica del dominio extracelular de B7-4 o PD-l. Aproximadamente 400 µg de B7-4 o PD-l en 100 ml de solución salina amortiguada con fosfato PBS se inyectan de manera intraperitoneal en cada ratón. Muestras de suero son recogidas aproximadamente 6 días después por sangrado de seno retro-orbital. Reactividad de anticuerpo y especificiaad para B7-4 o PD-l son evaluados empleando un ensayo inmunoaosorbente enlazo con enzima (ELISA) indirecto. Varias moléculas de superfamilia de inmunoglobulina son probadas como control (como por ejemplo CTLA4 y CD28) para analizar la especificidad de anticuerpo del anticuerpo para B7-4 o PD-l. Anticuerpos que tienen regiones humanas variables que se unen con B7-4 o PD-l son detectados por conjugados enzimáticos específicos para subclases de IgM humana IgG humana sin reactividad cruzada con inmunoglobulina de ratón. En resumen placas de microtitulación son revestidas con B7-4 o PD-l revistiendo los pozos durante la noche a una temperatura de 37°C con 5 µg/ml de B7-4 en PBS. Muestras de suero son diluidas en PBS, suero al 51, Tween-20 al 0.5% y son incubadas en los pozos durante 1 hora, seguido por Fe de IgG antihumana IgG F(ab')- peroxidasa de rábano picante o Fe de IgM antihumana- peroxidasa de rábano picante en el mismo diluyente. Después de 1 hora a temperatura ambiente, se evalúa la actividad enzimática mediante adición de sustrato ABTS (Sigma, St Louis Mo) y se lee después de 30 minutos a 415-490 nm. En muestras de suero recogidas antes de la inmunización de los mismos ratones, se probaron también títulos de anticuerpos humanos para los mismos antígenos blanco. Células de bazo aisladas de ratones que tienen títulos de anticuerpo apropiados son cosechadas, las células de bazo son fusionadas en socios de fusión apropiados (por ejemplo células de mieloma) para formar hibridomas. Hibridomas y anticuerpos son manipulados de conformidad con "Antibodies: A Laboratory Manual", Ed Harlow and David Lañe, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), que se incorpora aquí por referencia. Las secuencias de determinación de complementaridad de los i_i--i¿.i-fc.A-&--fel,i' «..¿--fot--,. ^Já_____ l dominios VH y VL de murina de un anticuerpo de murino pueden utilizarse para injertarse en la estructura de inmunoglobulina con el objeto de generar un anticuerpo humanizado contra B7-4 o PD-l (Riechmann et al. 1988 Nature 5 332-323; Verhoeyen et al. 1988. Science 239:1534) Ejemplo 10. Generación de cadenas individuales humanas Fvs que reaccionan con B7-4 o PD-l Como alternativo a la preparación de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales, anticuerpos anti-B7-4 o anti-PD-1 10 (porciones de tipo Fv de cadena única de anticuerpo) fueron identificados y aislados de una biblioteca de combinación de secuencias de inmunoglubulina humana presentada bacteriófago M13 de Cambridge Antibody Technology, Ltd. Melbourn, Reyno Unido (Winter et al., 1994 Annu, Rev. Im unol 1994 12:433; 15 Hoogenboom et al., 1998, Immunotechnology 4:1) ?D-1, Fe o B7- 4. Fe fue utilizado para aislar de esta manera miembros de biblioteca de inmunoglobulina que están unidos a polipéptido de B7-4 o PD-l. Con elementos para generar y tamizar bibliotecas de presentación de fagos están comercialmente 20 disponibles y métodos estándares fueron empleados para generar el scFV (Helfrich et al., J. Immunol Methods 2000, 237: -45; Cardoso et al., Scand J. I munol 2000 51:337-44) PD- l.Fc o bien B7-4.Fc fueron inmovilizados en plástico en fagos que expresan scFv específico fueron seleccionado por lavado y 25 múltiples rondas de enriquecimiento (Griffiths et al. 1993 <^ lat-JA-lA-AlBA-ij* * *----«-i.---~.->..-• ••*-»•- - -__.. U-J-.-U . —_-m l¿ z?*a*a -^_^-_fe-.----<l-i---A-fct EMBO J. 12:725) . Ejemplo 11. Identificación de un receptor para B7-4 Proteínas de fusión que consisten de la región extracelular de PD-l de ser humano fusionadas sobre los dominios de bisagra CH2-CH3 ya sea de inmunoglobulina gama 1 de ser humano o Ig gamma 2a de murino (con mutaciones que bloquean FcR e interacción con complemento) fueron utilizadas para buscar un ligando que se une a PD-l. Como parte de esta búsqueda se encontró tinción de la superficie de células de monocitos estimulados con gamma-interfercn. B7-4 es inducido en monocitos después de estimulación ccn gamma-interferón, como se observa por hibridación northern rlot. La unión de PD-l-Fc (Ig gamma 1 de ser humano) sobre la superficie de células COS transfectadas ce manera transiente con un vector de expresión de B7-4 fue probada. Células COS fueron transfectadas ya sea con B7-4M o ríen B7-1 utilizando un reactivo de transfección LipofectAMNE. Después de 48 horas las células fueron teñidas con PD-l Te de ser humano con PD-l-Fc de murino, CTLA4-Fc, Flt4-Fc, c bien IgG anti-IgG conjugada con ficoeritrina (PE) . Las células fueron después analizadas por citometría de flujo. Como se muestra en la figura 13, células COS que expresan B7-4 se unieron tanto a PD-l-FC de ser humano como PD-l-Fc de murino, pero no se unieron CTLA4-Fc. Flt4-Fc, ni a IgG de ser humano. Como control positivo se demostró B7-1 que expresa células COS se unieron a CTLA4-Fc pero no a PD-l- Fe ni a IgG . Además, un ensayo in situ monocapas de células COS transfectadas fue efectuado . Monocapas fueron sondeadas con PD-lFc, CTLA4Fc o bien IgGl de ser humano y se detectó unión con un anticuerpo secundario dirigido contra una porción de Fe conjugado con fosfatasa alcalina , la unión fue visualizada con sustratos cromogénicos 5-bromo-4-cloro-3- indolil fosfato y nitro azul tetrazolio y microscopía de luz . En paralelo, se encontró que células transfectadas con B7-4 se unen a PD-lFc, y no a CTLA4-Fc ( Ig gamma 1 de ser humano) ni a Flt4-Fc, la región extracelular de Flt4 de murino unida a Ig gama 1 de ser humano . En paralelo, PD-l Fe no se unió a la superficie de células COS transfectadas de manera ficticia transfectadas con B7-1 o transfectadas con B7-2 . En otro experimento, empleando un ensayo basado en BIACORE, no se detectó unión de PD-l-Fc sobre formas solubles de B7-1 o B7-2 y se detecto unión con B7-4 . En paralelo se mostró que hCTLA4 se unía a B7-1 pero no a B7-4 . PD-l-Fc o CTLA-4-Fc fue inmovilizado y las condiciones fueron esencialmente las descritas por Fitz et al . ( 1997 ) Oncogene 15 : 163 . Medio de células COS concentrado proveniente de células que habían sido transfectadas con B7-4M o B7-4-Fc de longitud completa fue inyectado y las interacciones fueron medidas empleando un Biomolecular Interaction Analysis (BIA) [Análisis de Interacción Biomolecular] de tiempo real (Sj olander, S . Y Urbaniczky, C. (1991) Anal . Chem. 63:2338-2345 y Szabo et al . (199) Curr. Opin. Struct . Biol . 5:699-705). Se encontró que B7-4 de ser humano se unía a PD-l de humano y de ratón y esta unión fue inhibida por competición con un PD-l-Fc, co-inyectado, pero no con CTLA4-Fc. Estos experimentos demuestran no solamente la unión de proteína de fusión de B7-4-Fc soluble sobre PD-l-Fc, inmovilizado si no demuestran también la presencia de una forma soluble de B7-4 en el medio acondicionado de células transfectadas con ADNc de B7-4M, probablemente como resultado de un cambio. La figura 14 ilustra la capacidad de PD-l y no de Flt4 (el receptor para el factor de crecimiento endotelial vascular C) para inhibir de manera competitiva la unión de PD-l con B7-4. La unión de la proteína de fusión gamma 2 a de PD-l humana con células COS que expresan B7-4M se muestra en el panel A. La unión fue detectada con reactivos específicos para antigamma 2a unidos a PE. PD-l de ser humano unido a IgGl fue agregado a: 50 µg/ml, 6.25 µg/ml, 100 µg/ml, o bien 25 µg/ml y se encontró que competía para unión. Como control, no se encontró que Flt4IgGl a 100 µg/ml compitiera para unión de PD-l con B7-4. En otro experimento la capacidad de B7-4 para unirse con PD-l fue determinada por citometría de flujo y ensayos de unión de BIACORE. Proteínas de fusión de PD-l.Ig de ser humano y de murino unidas tanto a B7-4 de ser humano como B7-4 de murino se expresaron en células CHO, de conformidad con lo detectado por citometría de flujo (Figura 15) . Sin embargo, ni CTLA- 4.1g de ser humano, CD28.Ig de ser humano, ni ICOS.Ig de ser humano se unieron a ninguna de las líneas de células que expresan B7-4. Las proteínas de fusión de PD-l no se unieron a células CHO transfectadas por el vector solo. Una confirmación adicional de la interacción de PD-l:B7-4 fue obtenida utilizando resonancia de plasmón superficial con un instrumento BIACORE. Las proteínas PD-l.Ig de ser humano y de murino y CTLA-4.Ig fueron inmovilizadas en las superficies de flujo de un chip de dextrano y probadas para unión de B7-4.Ig de ser humano soluble. B7-4.Ig se unió tanto a PD-l.Ig de ser humano como PD-l.Ig de murino, pero no a CTLA-4.Ig de ser humano (Figura 16) . Esta unión fue bloqueada por competencia de PD-l.Ig soluble co-inyectada pero no CTLA-4.Ig. Formas solubles de B7-1 de ser humano y B7-2 de ser humano no se unieron con PD-l de ser umano inmovilizado. Estos datos demuestran que PD-l se une con B7-4, y que esta interacción puede regular la acción de PD-l. Ejemplo 12. B7-4 Puede Transmitir una señal negativa a células inmunológicas En este ejemplo, 5x10" células T Jurkat por pozo fueron estimuladas con perlas revestidas anti-CD3 (en una proporción 1:1) y anti-CD28 soluble. Células COS que expresan B7-4 o un control negativo, conocido como EZZ, fueron tituladas en los ?UA htk& á?iijá?i* -«-_V.,. pozos. Sobrenadantes fueron cosechados a las 48 horas y ensayados por ELISA para IL-2 de ser humano. La Figura 17 muestra que el incremento del número de células B7-4 de COS (barras en la derecha en la figura) provoca una disminución de la producción de IL-2. Empleando formatos de ensayo similares, por ejemplo, en donde PHA-blasts de ser humano a partir PBMCs fueron estimulados con anti-CD3 inmovilizado con anti-CD28, se observó una disminución en la proliferación de las células T por titulación en células COS que expresan B7-4. Ejemplo 13. La interacción PD-l:B7-4 inhibe la proliferación de células T mediada por CD3 Para examinar la importancia funcional de la interacción PD-l:B7-4, se examinaron también las consecuencias funcionales de la interacción B7-4 con su receptor, utilizando células T de ser humano. Células mononucleares de sangre periférica fueron aisladas por centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque. Poblaciones de células CD4+T (pureza de 85 a 90%) fueron purificadas por selección negativa empleando un conjunto de anticuerpos monoclonales y perlas inmunomagnéticas (PerspectiveBiosystems) . Proteína de fusión, IgG de control Anti-CD3 fueron covalentemente unidas a perlas Dynabeads (Dynal) activadas con tosilo revestidas con poliuretano, de conformidad con las instrucciones del fabricante y según lo descrito previamente (Blair, P. J. Et -fe-* -* al . (1998) J. Immunol . 160:12-15). Anticuerpo anti-CD3 (UCHT1, Pharmingen) en la concentración indicada fue agregado a lxlO7 perlas/ml, amortiguador de fosfato pH 7.4. Se agregó IgG de control a la suspensión de perlas con el objeto de mantener una concentración de Ig constante de 5 µg/ml durante la unión. De manera similar, perlas anti-CD3/B7-4.Ig (?2a) fueron preparadas con la concentración de anticuerpo anti-CD3 indicada, una concentración constante de B7-4.Ig representando 40% de la proteína unida total (2 µg/107 perlas), IgG de control para conformar la proteína unida total restante. 105 células T fueron cultivadas en placas de fondo plano de 96 pozos, y perlas fueron agregadas en la proporción de 1 perla por 1 célula en presencia o ausencia de las concentraciones indicadas de anticuerpo anti-CD28 (CD28.2, Pharmingen) . La proliferación fue determinada por etiquetados de cultivos durante por lo menos 6 horas de un ensayo de 4 días con un µCi3H-timidina/pozo. Para actualizar los ELISAs de citocina, cultivos fueron preparados de conformidad con lo escrito arriba y sobrenadantes cosechados a las horas indicadas. Se determinaron las concentraciones de interferón-?, IL-10 e IL-2 empleando conjunto de elementos para ELISA comercialmente disponibles (Genzyme) . Células T CD4+ pueden ser mas purificadas obtenidas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) fueron activadas con perlas revestidas con mAb anti-CD3 y ya sea B7- 4.1g de ser humano Ig de control. La prol feración y la producción de citocina fue evaluada 96 horas después del estímulo. Como se muestra en la Figura 18, células activadas con perlas revestidas con mAb/B7-4.Ig anti-CD3 presentaron una disminución del 69% de la proliferación en comparación con las células activadas de mAB anti-CD3/lg de control. Además, la activación de las células en presencia de B7-4 afectó también la secreción de citocinas. En presencia de B7- 4, las secreciones de interferón-?, IL-10 e IL-2 disminuyeron en aproximadamente 80% y 60% respectivamente (Figura 18) . La producción de IL-2 fue por debajo de la detección en estas condiciones de activación tanto a las 24 horas como a las 96 horas. Sin embargo, en condiciones en las cuales la coestimulación de la forma de anti-CD28 soluble fue proporcionada, la activación de células en presencia de B7-4 provocó una disminución de la producción de IL-2. Así, la activación de células T de murino y de ser humano en presencia de B7-4 provoca la inhibición tanto de la proliferación como de la secreción de citccinas. Ejemplo 14. El resultado de la interacción PD-l:B7-4 depende de la fuerza de las señales CD28 y el receptor de células T Para examinar la relación entre células señales mediadas por CD28 y PD-l, receptores de células T, células CD4+T humanas fueron estimuladas con concentraciones óptimas y subóptimas de mAb anti-CD3, una concentración fija de B7-4.Ig y t .A^.- ^'^?^.-i-t;.----8-»-^-.-- .-.-.--...c .-...A.., ..—_ .,. .»it?i...-..-.----» -.---»;-i--t-^ concentraciones crecientes de mAb anti-CD28 soluble. Utilizando perlas revestidas mAb anti-CD3, las concentraciones requeridas para estimulación subóptima y óptima de células T fueron establecidos. En condiciones que el enganchamiento subóptimo con el receptor de células T (mAb anti-CD3 µg/ml) , se observó una proliferación mínima en ausencia de co-estimulación (Figura 19 A) . La adición de concentraciones crecientes de mAb anti-CD28 soluble provocó un incremento de hasta 30 veces de la proliferación. En estas condiciones, la activación de células T en presencia de B7-4 resultó en una reducción del 80% de la proliferación (figura 19A) . Un nivel máximo de co-estimulación (anti-Cd28 a 250 n g/ml) fue requerido para rescatar la inhibición de la proliferación mediada por estimulación de B7-4. En contraste, en condiciones de saturación de la activación de receptor de células T (mAb de anti-CD3 a 2 µg/ml), la inhibición mediada por B7-4 de la proliferación de células T se observó solamente en ausencia de co-estimulación de CD28 (figura 19B) . Ejemplo 15. Habilidad de B7-4 para inhibir las señales de CD28 y producción de citocinas Los efectos inhibidores de la vía PD-l:B7-4 parecen ser determinados por la fuerza de la señal a través de TCR y CD28 (véase ejemplo previo) , en donde respuestas mediadas por CD3/CD28 débiles son fácilmente reguladas de manera ,. , descendente. Para estudiar la interacción de la señal de CD28 y la vía PD-l:B7-4, células de DO11.10 CD4+T previamente activadas fueron activadas con péptido OVA presentado por CHO-IAd/B7.2 o bien CHO-IAd/B7.2/B7-4. Para detectar B7-4, 5 x 10" células transfectantes de CHO fueron incubadas con 5 µg/ml de PD-lIg de ser humano (hPD-1-Ig) (Genetics Institute, Cambridge, MA) y desarrolladas con ficoeritrina (PE) anti IgG2a de murino de cabra (Southern Biotechnology Associates Inc., Birmingham, AL). Además, células fueron teñidas separadamente con 5µg/ml de anti-IAd-PE o bien B7.2-PE (Pharmingen, San Diego, CA) . Después de cada paso, células fueron lavadas tres veces con PBS/1% BSA/0.02% azida de sodio. Después de la incubación final, células fueron fijadas con paraformaldehído al 1%. Diez mil eventos fueron analizados en un FACSCalibar (Becton Dickinson, Mountain View, CA) . Todos los controles de isótopos fueron obtenidos todos de Pharmingen. Esplenocitos fueron preparados a partir de ratones DO11.10 y tratados con Tris-NH4C1 para agotar los eritrocitos. Células fueron cultivadas con lµg/ml de péptido OVA durante 74 horas (Analytical Biotechnology Services, Boston, MA) en RPMl 1640 (Life Technologies, Grand Island, Nueva York) complementado con FCS al 10% (Sigma, St Louis, MO) , L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, 250 ng/ml de anfotericina B, HEPES 10 mM, 50 µM de 2-ME (todos de Life Technologies) y 15 mg/ml de gentamicma (BioWhittaker, Walkersville, MD) . Células CD4+T fueron purificadas por selección positiva empleando columnas de separación de clasificación de células activadas magnéticamente (Miltenyy Biotec, Auburn, CA) con una pureza resultante mayor al 98%. Las células fueron mantenidas en reposo durante la noche antes de una nueva estimulación. La proliferación de células CHO fue inhibida por inoculación con 50 µg/ml de mitomicina C (Bristol Laboratories, Princeton, NJ) durante 16 horas a una temperatura de 37° C. Al final del período de incubación, las células fueron cosechadas con EDTA 10 mM en PBS, lavadas dos veces y dejadas en hielo durante 1 hora. Las células fueron subsecuentemente lavadas tres veces y resuspendidas en medio de cultivo. 105 células CD4+T previamente activadas fueron cultivadas con varias concentraciones de péptido OVA y 10 transfectantes de CHO tratados con mitomicina C en placas de 96 pozos. Para ensayar la proliferación, cultivos fueron incubados durante 48 horas y pulsados con 1 µCi/pozo de [3H] timidma (New England Nuclear, Boston, MA) durante por lo menos 6 horas del período de incubación. La expresión de B7 y LAd fue similar en todos los transfectantes de CHO (figura 20) . Como se esperaba, la introducción de B7.2 provocó un incremento de las respuestas proliferativas por células T en todas las concentraciones de antígeno (figura 21) . Sin embargo, B7-4 inhibió respuestas en concentraciones más bajas de péptidos (0.01 µg/ml y 0.001 µg/ml) (figura 21) . Para enfocarse a la capacidad de la vía PD-l:B7-4 para inhibir la producción de citocinas, sobrenadantes de células CD4+T de DO11.10 activadas con péptido OVA presentadas por transfectantes de células CHO fueron analizados. Alícuotas y sobrenadantes fueron cosechados en varios momentos después del inicio de los cultivos. Los niveles de IL-2, IL-4, IFN-? y IL-10 fueron analizados empleando mAbs y estándares de citocina recombinantes de Pharmingen. Los límites de detección fueron los siguientes: IL-2, 20 pg/ml, IL-4, 40 pg/ml, IFN-?, 100 pg/ml y IL-10, 200 pg /ml . La producción de IL-2, IL-4, IFN-? y IL-10 fue inhibida significativamente cuando células CD4+T de DO11.10 fueron cultivadas con 0.1 µg/ml de péptido y B7-4 (figura 22) . En esta concentración, se observó solamente una inhibición débil de la proliferación. Sin embargo, B7-4 inhibió significativamente la producción de citocinas a 0.01 µg/ml de péptido, lo que es consistente con la inhibición de la proliferación (figura 23) . IL-10 no fue detectada en estas condiciones de activación. Por consiguiente, el enganchamiento de PD-l por B7-4 puede regular de manera descendente la producción de citocinas aun cuando la producción de células T no es afectada. Í.LAJ.JÍAÍ fc-k-...-.-. JMfk-b ,».-- .. UtiuJúmiJiti ?i A, Para determinar si la producción disminuida de citocinas de debía a niveles reducidos de ARNm, se utilizó un ensayo de protección de RNasa. Células CD4+T fueron reestimuladas con varios transfectantes de células CHO y 0.01 µg/ml de péptido OVA. Después de 48 horas, las células fueron cosechadas y ARNm fue aislado empleando un reactivo TRIzol® (Life Technologies) . 5 µg de ARNm fueron analizados para determinar los niveles de citocinas por ensayo de protección de RNasa utilizando un conjunto de elementos de pruebas múltiples RiboQuant CKl de conformidad con las instrucciones del fabricante (Pharmingen) . Niveles de transcriptos de ARNm de IL-4, IL-10, IL-13, IL-2, IL-6 e IFN-? fueron detectados en células CD4+T de DO11-10 previamente activadas después de estimulación con 0.01 µg/ml de péptido OVA presentado por CHO-IAd/B7.2. Sin embargo, la introducción de B7-4 reduje significativamente los niveles de ARNm de citocinas. Se observó una regulación ascendente mínima del ARNm en el caso de las citocinas en cultivos de células T no estimuladas o células T activadas con péptido presentado por CHO-IA . Estos resultados demuestran adicionalmente la capacidad de la vía PD-l:B7-4 para antagonizar una señal B7/CD28 fuerte por lo menos una estimulación antigénica es débil o limitante, y la inhibición de por lo menos la producción de citocinas en condiciones de estimulación antigénica fuerte. Ejemplo 16. Mecanismo de acción de la via PD-l:B7-4 -» A j,.- . ^-.-í.?..k.?i..j-aM.:.....

La reticulación de CTLA-4 inhibe la progresión del ciclo celular en células T naives (Krummel, M.F. y Allison, J.P. (1996) J. Exp. Med. 183:2533-2540; Walunas, T.L. et al. (1996) J. Exp. Med. 183:2541-2550). Puestc que PD-l fue aislado de líneas de células de murino sometidas a apóptosis, un posible mecanismo de acción de la vía PD-l:B7-4 puede ser el incremento de la muerte celular programada. Para resolver este asunto, células CD4+T de DO11.10 fueron estimuladas de nuevo con 0.01 µg/ml de péptido y varios transfectantes de CHO y se analizó la progresión del ciclo celular. Células CD4+T fueron estimuladas de nuevo con 0.01 µg/ml de péptido de conformidad con lo descrito previamente. Después de 36 horas de cultivo, las células fueron recuperadas y teñidas con anti CD4-FITC. Las células fueron lavadas en PBS, fijadas en etanol al 70% durante 1 hora en hielo, y después suspendidas de nuevo en PBS que contenía 10 µg/ml de RNasa (Sigma) y 50 µg/ml de yoduro de propidio (Sigma) . Se efectuó un análisis una hora después de la tinción. Después de #8 horas, células fueron recuperadas y teñidas con CD4-FITC. Después de permeabilización, las células fueron incubadas con yoduro de propidio con el objeto de analizar las poblaciones G0/G?, S/G2 y subdiploides. Células CD4+T estimuladas de nuevo con péptido presentado por CHO-IAd tienen una gran proporción de células en la población subdiploide, lo que indica apóptosis (figura 24) . En cultivos en los ÍAJL3Í.Í J Í l¿?& -rt ? AtUSm^-^ tL. ^M^... . ._ .. * . *. , *-. hju * cuales células CD4+T fueron estimuladas por péptido presentado por CHO-IAd/B7-2, se observó un número incrementado de células en la fase S/G2, y un número disminuido de población subdiploide, lo que indica que las células estaban en ciclo y rescatadas de la apóptosis por coestimulación de B7/CD28. La introducción de B7-4 provocó un número incrementado de células en la fase G0/G1 (figura 24) . Se observaron niveles comparables de apóptosis en los cultivos de B7-4 en comparación con los cultivos CHO-IAd/B7. Esto fue confirmado por tinción con anexina. La inhibición de la progresión celular por la vía PD-l:B7-4 confirma su función en la regulación descendente de la activación de células T. Ejemplo 17. Inhibición de unión de B7-4 Fe de ser humano biotinilado con PD-lFc de ser humano Proteínas de fusión de Fe fueron generadas mediante la unión de la región extracelular de PD-l o B7-4 con dominios de bisagra-CH2-CH3 de Ig?2a de murino. Proteínas recombinantes fueron producidas en células COS transientemente transfectadas con LipofectAMINE (Gibco-BRL) o bien líneas de células CHO transfectadas de manera estable y purificadas a partir de medio acondicionado utilizando proteína A- Sepharose. La capacidad de anticuerpos contra B7-4 o PD-l para inhibir la interacción de B7-4Fc de ser humano y PD-l Fe de ser Í?-A J Í á.? üa-al-i f - f i-JÉ-Wf f . .?^^ --_t--_-- .»_ ^ -, _..» 4-..-1. . j-Mi. i. i-..- i -- j-i-^*-^ — ... A--.--- .>,. ¡>fc<-_M>-a -Mhlit humano fue probada utilizando métodos ELISA estándares. En resumen, moléculas de PD-lFe de ser humano fueron inmovilizadas en placas de 96 pozos, bloqueadas, y lavadas. Moléculas de B7-4Fc biotiniladas (100 ng/ml) fueron agregadas 5 a pozos en concentraciones de aproximadamente 2000, 700, 200, 70, 25, 8, y 1.18 ng/ml (figura 25). Los pozos fueron incubados con peroxidasa de rábano picante conjugada con StrepAvidin, lavados, y el color fue revelado utilizando métodos estándares. Se encontró que la ED50 de B7-4Fc era 10 108ng/ml. La capacidad de anticuerpos de murino contra B7-4 de ser humano (10D9 y 11D12) o bien porciones scFv de inmunoglobulinas humanas (B7-4-1, B7-4-6, y B7-4-12) para inhibir la unión de B7-4Fc humano biotinilado con PD-lFc 15 humano fue probada en 7 concentraciones de inhibidores. La IC50 fue encontrada dentro de un rango de 0.5 nM a 24 nM y los datos se presentan en la figura 25. Los scFv específicos para PD-l fueron también probados para determinar su capacidad de inhibir la unión de B7-4 Fe con 20 PD-lFc utilizando los mismos métodos ELISA descritos arriba. Se encontró que scFv humanos reactivos con PD-l (PD1-17 scFv) inhiben la unión específica (EC50 entre 10"7 y 10"8) como se muestra en la figura 26. Dominios VL y VH de PDl-17scFv fueron utilizados para generar una IgG completa. En resumen, las 25 regiones codificadoras de VH y VL fueron enlazadas con secuencias de genes de CH y CL genómicos en vectores de expresión. Los vectores de expresión resultantes fueron transfectados de manera transiente en 293 células de ser humano y la IgG fue cosechada del medio acondicionado. La potencia de la molécula de IgG entera injertada fue mayor que para el anticuerpo scFv (EC 50 entre 10"8 M y 10_9M) . Ejemplo 18. Administración de B7-4Fc soluble exacerba la enfermedad en un modelo de murino Para determinar si la modulación de la vía B7-4/PD-1 tiene una actividad inmunoreguladora in vivo, la proteína fue evaluada en un modelo de murino de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) que comparte muchas características clínicas y patológicas con la enfermedad humana, esclerosis múltiple. Ratones SJL/J de sexo femenino fueron inmunizados con 100 µg de proteína de proteolípido (PLP) en adyuvante completo de Freund. Diez días después, bazos fueron cosechados, procesados en suspensiones de células individuales y después re-estimulados in vitro con 5 µg de PLP durante 96 horas. Las células fueron lavadas tres veces en PBS y después 15xl06 células fueron transferidas a ratones SJL/J naivos por inyección intraperitoneal. La transferencia adoptiva de las células T autoreactivas resulta en una parálisis aguda de los ratones receptores que se manifiesta como una pérdida del tono de la cola con progresión subsecuente hasta una parálisis completa de las t--fc-út^.-it¿--..-.-t._fc&t« _¿ * patas traseras. Este episodio paralítico coincide con una infiltración notable de células T activadas y macrófagos en el sistema nervioso central. En la mayoría de las condiciones, se trata de un modelo agudo de enfermedad con recuperación espontánea ocurriendo después de un corto período de parálisis. Para la evaluación de B7-4Fc, ratones recibieron inyecciones subcutáneas de 20C µg de la proteína en 100 µl de solución salina estéril los cías 0, 2, 4, 7 y 11 después de la transferencia de células (n=10) . Ratones de control (n=10) recibieron un volumen igual de solución salina solamente. Todos los animales fueron monitoreados regularmente para signos clínicos de enfermedad que fueron calificados de la siguiente manera: 1. Pérdida del tono de la cola; 2. Debilidad de las patas posteriores/parálisis parcial de las patas posteriores; 3. Parálisis completa de las patas posteriores; 4. Parálisis de las patas posteriores y delanteras; 5. Moribundo. En el experimento mostrado en la figura 27, la incidencia y el inicio de la enfermedad clínica fueron similares en ambos grupos. Ratones tratados con B7-4Fc sin embargo, desarrollaron una enfermedad severa con la mayoría de los animales avanzando rápidamente hacia una parálisis completa de las patas posteriores y de las patas delanteras (9/10 y 1/10 para ratones B7-4Fc y ratones de control respectivamente) . La mortalidad asociada con signos clínicos a.. de enfermedad fue del 10% en el grupo de control y del 70% en el grupo de ratones tratados con B7- Fc. Además, la recuperación de la enfermedad clínica fue sustancialmente retardada en los ratones tratados con B7-4Fc que sobrevivieron a pesar del hecho que el tratamiento fue suspendido el día 11. En conclusión, utilizando un modelo de transferencia adoptivo de autoinmunidad mediada por células T, la administración de B7-4Fc soluble exacerba los signos clínicos de enfermedad lo que resulta en una mortalidad incrementada y una recuperación retardada de la parálisis. Estos hallazgos son consistentes con una activación/infiltración incrementada de células inflamatorias en el sistema nervioso central y esto demuestra claramente el potencial inmunoregulador para la proteína de B7-4Fc in vivo. Equivalentes Los expertos en la materia reconocerán o bien podrán determinar utilizando solamente experimentos de rutina, muchos equivalentes a las modalidades específicas de la invención descrita aquí. Tales equivalentes están abarcados en las reivindicaciones siguientes.

LISTA DE SECUENCIAS <110> Dana-Farber Cáncer Institute, Inc. Genetics Institute, Inc. <120> PD-l, UN RECEPTOR PARA B7-4, Y USOS DEL MISMO <130> GNN-004BPC <140> PCT/USOO/23347 <141> 2000-08-23 <150> 60/164,897 <151> 1999-11-10 <150> 60/150,390 <151> 1999-08-23 <160> 23 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 968 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (59) .. (793) <400> 1 ?-tt'-c gag gel i '.-eic aac -gcgct . ctc.ccgcc- gcac g-ati ccsgaaag aa- c a ttt act q\.c acc s-t aag gac cta tat ctg gta sag :5< r, A.? Phe » v3J Tr.r Val Pro Ly¿ Ásp Leu ?yr Ve Val G]. Tyr 2Z 25 30 gq'- a -- 3at o' -} a ,a d t ga -i -9" áí. ttc c a gta C8-- = - C? j t a Gly S r Asi. X«. • Tr.r I Giu Ly:» P-.c Prc Val CJ -*. - Glr Le 35 45 gnc ctg gct a cía att gt> at qj caá ate 9 « ce* *=~) ai " ? l 25H As: J eu A ß A- a Le i llf Va] • yi T-: 3. Met Glu Ai? -^ Asi. lie 5C 55 6" ?- c?.a f gtn rat a gag gaa _ <~t c aac g-r c-?; Je*. ag' 3 - '96 r.e &.r. ? c V?1 .-> Glu o', u As; le. Lys Val Gl' -i.5 Str Ser 65 70 75 80 ti,- óOp Ca d'-J'j ge cgg ct g ttg aac ga? cog c tCi c: J g r. aat 346 Tyr Arg &"p Arg Ala Ar-j Le>.. L«c Lys. Asp Gl p Leu Ser '. e. 3. y As -i 65 90 9: g'- f g-a ctt ca acá g<-.t gtg día ttg ca gat C. c 3t *. A' Ala l.c.. Gir. ~.rr AS? Val -,6 Leu Gln Asp Alé •>- ICC eg g^. atg a c a - c g C - gee ga<- tac aag cg = at act gtg Arg Cys Met II c Fcr ?y. Gly c--y Ala Asp "y* Lys Arg Tb- Val 115 12C í ?5 a=a gtc aat g-.c c a tac aac óíc ate aa~ caá a;= att •5 3-- 9'-J 490 Lys Val ^n A1 a PÍO T . Asr. l\s I ?e As~ Glr. A-g Jle ". V ? 1 V l " n 135 140 qat c a gtc a -... t t ga.. Cc*. gaa c-g 3C- tgt s PÍJ Va) l.-r Se: H:<? Gl_ J Tnr Cys Cl- ? _ 3 - » J GU : 145 15 155 gtc a - tgg a - a g c ají q^c Ca t i C * - ct 3 "T .?€ Frc Iys AJ3 vr. Trp 7 r Sci Ser A-,: FJS G.i . a - e*. Cc . lr 1"O " cTt aag acc . a c aat t c a ^ ". aga gag c a* ct: ttc aa1" 6.? G y Lys '. r 1\¡: ."tu Tn: As-. Se: .5 Are Glu G.u L¿s _Í- Fhe -\s'. 18 gtg acc je --H dj.? tí*_C ? c¡ C ¿I-e 3 c. act a'- g-i; tte tac 68? Val Thr Ser Trn Ar He A i. Ir.: Ir.: Tnr Asn GiFne Tyr 195 210 tgc act tlt a J "i tt g <¡ t cect gag qaa aac cat a a -K t gaa ttg 730 Cys l'.r Pre A-q A- 3 Le>. Asp Pro G ? Gl? Asr. Fis Thr -la Gl- Le.. 210 215 220 ?tc at cea gg e^t att ctc aat gtc tc<- att aaa ata te' eta acs ¡tí Val He Fio G". y Asn i]e le- A?n Val Ser l e L-,5 He Cys Leu Thr 225 230 235 240 ctg tcc ect age a^-- tagcatgatg t^iucctotc atagtcatt agtgattgtt 333 Leu Se: Pro S r l-.i 2<5 a..- a *?: 'jia aa-ac atgt :tac~¿c-ata tatccte-'t ect <-.a ~t •-. t:»3 a*, tca ccdri aca it g tacttaata-. ac ttcccra gatnt* -.tg gaata.jria .- 95i aada aaaai a.i-i-u 906 <210> 2 <211> 245 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Are He 1-h Ala Val Pne He Pr.e et Thr lyr Trp His Leu Leu ] 5 ir 15 Asr: Ala Fr.e lr.r Val T'm Val Pro Lys As? Leu Tyr Val Va] Glu Tyr 20 25 30 Gly Ser Asr Het Irr He Glu Cys I.y= P e Prc Val G-u Lys Glr Leu 35 4C 45 Asi- Leu ?la Ala LC He Val Tyr Trp GJ u Xet Glu Asp Lys Asn He 50 55 ec He Gln Fne Val His Gh Cl Glu Asi L?_ Lvs Ve i Gl'. H:s Ser Ser 65 7C " ~>b bC T r Aro Glr. A* g Ala Arg Le.: Leu Lv= Asr Glr, Leu ¿r Leu ly As-. 85 3 95 Ala Ala Leu G r. He Tnr Asp Val Lys le. Gl', Ase Ala Gly Val T\t ice :o5 '-if' Arg Cvs Ket H Ser Tyr C-ly Gly A - Asj. ?y? ^s Arg l e Thr Val 115 120 125 Lys Val Asn A1 a Pro Tyr As- Lys He As'. Glr. Arg He Leu Val Val 130 135 14C Asr Pro Va) Ir.i Ser Gl. His Gl u Leu 1-. Cys Glr? A. a Glu Gly Tyi 14*5 -53 155 160 Pro lys Ala Gi . Val He Trp Thr Ser Ser Asp Kis G n Val Let. Ser 165 1">0 ^S Gly lys Tr.r Irr 7h? Thr Asn Ser Lys Arg Glu Gl; Lys Le- Phc Asi: 1?0 181 19C • - ta&j »? i *? -?¿^* r&tí-** ??t&?^*¿i&¡s ^.i. -?-&mi-«to»M->i Val 7t Ser I-- :ie A-s: T.i Thi Th: As: Glu I Je ? e 7y IV 200 21: lys Th: Phe Arg -ej Asp Pro Gl Gl . Asi. ilis 1; i . a - - 1: HO ,eu 215 22C ;e Pro Gly A?>. He Leu As: Se: He ys I. 22í Cys Le 30 23. 240 Le. ?tr Pro Ser Tr.r <210> 3 <211> 1553 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (53)..(922) <400> 3 a éc^-nc r g:t c- g -. tgeaggg cottccajác ag a?g a g 5^ Me Arg a'., ttt gct gtc ttt ata ttc atg -c tac tgg cat ttg etg aac gca 136 He Phe A1 a Vai Prn He Phe Ket T- : Tyr Trp His l€S As-, M- c 5 10 t act ?» - ó.:g c* t c. r aag gac cta tst gtg gta cig tat ggt a e Phe T^. Val T'.: Va' rc Lys Asp Le. Tyr Val Val •33. " - Gly Ser 20 25 30 aat ate acá att ge-, tgc aaa ttc cea gta caá aaa caá tla aac ctg 2C2 Asn Het Thr líe G!J Cys lys Phe Prc Val Glu Lys GJ- Leu Asp ? 35 45 5C qct gca cta at gtc tat tgg gaa atg gag gar aag a; att att ca 250 Ala Ala les l e V l Tyr Trp Glu Xet Glu Ase Lys Asr. He lie Gln 55 6C 65 ttt gtg cat gg-i gac gaa gac ctg aag gtt cag cat agt a e tac aga 293 Phe Val Hls Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Glr. His Ser Ser Tyr Arg 70 75 30 -.JÍ ....J..-Í.- .t 1 t-iÍ¿|-H-ji , ? t ±*~j* **~*. ^-.^ ^^íf1^ •*"*»••"«. - -.i*a>A» é&?? Cag agg 9- ; ec. ct ttg aag gac ed ete tec ctc gq aat get gea 346 Gln Arg Ala Ar'g lej Leí Lys Asp G.r. le. Ser Leu Gly A?-. Ala Ala 85 9C 95 ct cag ato ac gat ?-s a d ttg r.C] ca g: J 993 gtg . ? cgc tge ? 4 Lee C.r- 1 le Th ?sj. Val Lys Leu Gl- Asp A' rl Giy Val ? 'i- Arg Cys 100 105 - i c. atg ate ago d t ggt gec ge tae aae cga att act ctg aaa gtc 441 M t He Se; Tyr 5- y G.y Ala Asp Tyr Lys Arg He Thr Vaí Lys Val 115 120 125 130 aat ge: cea tdC ad - aan ate aae Caí aga ¿tt ttg gtt etg g¿.t cea 4 aC Asn Ala Pío Tyr HGG. Lys He Asr. Gl' Arg He Le. Val Val Asp Pro 135 1 C ' 1 5 gtc ace et a ca- gaa ctg aCd t-r. a^ get gag ggc tac aag 538 Val r.r Se: G u Hi-> Glu leu Thr Cys 31r Ala Glu CJ y Tyr r'rc Lys 1 0 155 160 gee gaa g e ate tgg aea age agt gee cat caá gtc ctg agt ggt aag 5bo Aia Ji Val 1 Tr{. Tr.i Ser Ser Asr has Glr. Val lee Ser G:y Lys 165 17C 175 acc acc acc ac aat tee aag aga aag gag a=?g ctt ttc eat gtg acc 63¿ Thr Tr.r T r Tn; Asr Ser Lys Arg GJ '. Gl s. Ly s Leu I-ne Asn Val Tm 180 185 19C age acá etc ag.i ate 3r c acá BCr art aat gag att *tc tac t ' act 63.

Ser Thr leu Arg He A?- Thr l.-.t Tr.r ?sr. Giu He Phe Tyr Cys Th: 1 r 200 -?- 210 5 : t aJ j a ja f a gat ect gag gaa aa- cat a;a gct qáa rtg gtc ate Phe Are Arg Leu Asp Prc Gl ¡ Glu As- .-.is T-r Ala Glu Le. Val He 215 ?25 cea g a cía Cv.t etg gea ca. ect ce-, jj ca¿ agg =ct cae ttg gta Prc Glu Leu Pro 1<=J Ala His Prc Pr.. As-. Glu Arg Tnr H:s Le.. Va i. 230 23: ' 24'.' att etc ?e= g-c ate tta tta tge cf ag g-.d gca etg aea ttc ate 0 He leu Gly Al He le-. Leu Cys Leu Giy V3. Ala Leu Tnr Pr.e He 245 250 255 ttc cgt tta aga a.j ggg aga atg atg ga' gtg aaa aaa tgt ggc ate k' Phe Arg Leu A- Lys Gly Arg Met Mct Asp Val Lys ys Cys Gly He 260 265 270 caá gat acá aae c a aag aag caá egt cat a-a cat ttg gag gac acg Gln Aso Thr Asr. Ser Lys Lys Gln Ser Asp Tr.r H^s les Glu GJ u Tr.r 275 ' 260 265 290 5 JMi-t-tij-. * ** •í-'**- £&. ¿aajfoü- ..-«» .Aíiplt&k. ** ^*í* *-~*-i-Í-? *r*-* ,fH ??aÁÁ taatccagca tt ;g i-iett o tgatctteaa geagggatte traa.e'gtg gttraggggt á2 tcatcggg?c ^y gtgßc aagagga=gg aatgggeecg t g ^ J :.-»g geaatgtggg 1042 acttaaa gg ccca? ;^aot ? aaatggaa cctcgcgaaa ?:ae..gj-gg aga-it saga 1102 aagatggagt ccee -a ggd gcetggaggg agaccttgat oe t e.-iáo gcctgagggg 1162 ctcategacg cetg.ga-ag qgagaaagga tacttctgaa caagcage-t 122? tra -r-ta aagaegggtt gagaatccct a.ttt aggg tcagttcctg 1282 cagaagtgc. ctf gcctcc actcaat?cc tcaatttgtt ttctgcaigo ctgcgagtct 1342 cagtgttgga acggeao.act atttatgtat gagtttttcc tattt a ttt gagtctgtga 1402 ggtcttcttg tcatjtgagt gtgg tgtga atgatttctt attgtagtag 1462 atgttacaat tttg-o.ycca aactaaaett getgcttaat gatf gc-ca eetetogtaa 1522 0 aaca'-ggagt atttgtaaaa aaaaaaaaaa a 1553 <210> 4 <211> 290 <212> PRT 5 <213> Homo sapiens <400> 4 Ket Arg He Fr.e Alá VaJ Phe He Phe Met Trr Tyr Tro K.s Le. Le. i ?c :--. Asr. Ala ?r Thr Val Thr Val Pro lys Asp Le. Tyr al Val Glu Tyr 2C 25 3C Gly Ser Asr Ket Thr He Glu Cys 1 y* Phe Pro Val 31 J lys Sin Leu 0 35 40 45 Asp Leu Ala A-a Leu He VaJ Tyr Trp Glu Met Glu As: Lys As-. He 50 55 60 lie Gln Phe Val Fi.s Gly C-lu Glu Asp Leu Lys Val GJr. H. s Ser Sci 65 70 ' 75 80 Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp G1-. Leu Se: Leu Gly As:. B5 90 95 5 Ala Ala Leu Gln He Thr Aep Val Lys Leu Glr. Ase Ala G.y Val Tyi "-00 105 11C JÚ &¿*J •* * i -fa¿TJ- -J-«t .fc.^-»*..-. ....-¡-«-.-^t»**««. ^^^^? jiti?? Arg Cys Met lie Ser Tyr Gly Gly A ..- As: Tyr Lys Arg He Thr Val 115 120 1 5 Lys Val Asn Al¿. Pro Tyr Asr. Lys He Asn Gl:. Arg Ue Leu Val Val 13C 135 140 Asp Pro Val Thr S*e? Gl. His Glu Lej Tr.r Cys G.n Ala Glu Gly Tyr 145 15 O 155 160 Prc ys Ala Glu Val He Trp Thr Ser Se: Aso H.s Glr Val Leti Ser 165 170 175 Gly Lys Thr Tnr Tr.r Th: Asn Ser lys Arg GJ u Glu Lys Leu Pnc Asr 180 1S5 Í90 Val Thr Ser Trr Le". Arg He Asr. Thr Th: Tr r As- Glu Ue Pho Tyr 195 200 2C5 10 Cys Tr.r Phe Aro Arq Leu Asp Prc Gi . Gl J Asn His Thr Ala Glu Leu 210 215 22C VaJ I Je Pie 31 u Leu Pro eu Ala k;s Pro Pro Asn Glu Aru Thr His 225 230 235 ' 240 Leu Val lie Leu GJy Ala He Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Tnr 245 250 255 Phe He Fne Arg Le. Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys 260 6^ 270 15 Gly lie Glr, Asp Tr.r Asi Ser Lys Lys Cl:. Ser Asp Thr His Leu C-v. 275 2d0 265 C-lu 1p 290 20 <210> 5 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 5 cagctatggt ggtgccgact acaa 24 <210> 6 <211> 25 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 6 aggtgctagg ggacagtgtt agaca 25 <210> 7 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 7 cagctatggt ggtgccgact acaa 24 <210> 8 <211> 25 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 8 aggtgctagg ggacagtgtt agaca 25 <210> 9 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 9 tcgcttgtag tcggcaccac cata 24 <210> 10 IfcÁA&i ¿.-*í..-k.-¿* :.L.i.i*j* ?i¿*a.i-., *'*L-* %^.*, ¿t?et . <211> 864 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 10 atgeagatcc aca g j 3 - ; -tggccagr; gtctgggojg t.-.'í aact ugjcr cgg 60 ecaggatggt- tctt a g^-e -;-aga agg ccctggaccc -. -v;ett c .-c~cagcc 120 ctgetogtgg tgac: j-.aag gg-icaacgcc accttcacct ge-igette c ca 'a-at-g 180 gsjagcttcg tgc'' 1 a .ctg jta«ucg>-atg ag<~cccagca ac agacjga ea ge ggcc 24C gcct-cceeg agg :cg:ag c:agc..-ggc caggactgcc g-tteegtgt earaeaactg 300 cccaa;ggg'- tgacrr.cca -atgag-gtg gtcagggccc ggrgea tra caqcggra.-c 360 0 tócctctgtg gggcc-a ctc cetggeeccc aaggcgcaga teaaa acag ectgcggg- a 420 gagctcaggg t ^-ag g acjj ca aa gtgcceacag e.:a: :cag cccctcaccc ^0 aggtcagccg gci-ag* t ~ a aaeeetggtg g'tggtgtcg tggg-ogeet getgggcagc 540 ctggtgctgo tag* e' ggg' cetgge-gto a-otgctece gg'-eueaeo agggaeaata 60 g a ccd gc O »~:;C-.-C g-e ctgaag gaggacecct caeeegtgec tg gttctct 66C 5 g ggaetatg gqg-.g tgg-. ttteeagtgg cyagacaaga eecrggagcc ceee tgece ¿0 tgtgtccctg g--<tg gg= gtatgccacc at gtctttc etagegga^t gggeacccca.760 tceeccgcoc gcoce-.-.r a etgacgge ceteggagtg cceagee-ict gaggcctgag 84C ?at gacact cet ;_ggc~ rete 364 <210> 11 0 <211> 921 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS 5 <222> (25).. (888) <400> 11 cact o'. gg g gH g^' cc a g? e a tg c g a t e cag g:g eco tgg cea 5 Met G'n pe Pr. Glr. Ala Fro Trr. Pro ate gtc tag geg gtg cta caá ctg ggc tgg egg cea gga tgg ttc tta 99 VaJ VaJ Trµ Ala Val Leu G'n Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp P e Leu 10 15 20 25 gae tcc cea ga- agg ecc tgg aac cce ecc aee ttc tcc cea gcc ctg 14' Asp Ser Fre As Arg ?: o Trp Asn Fro Pro T'r: Fne Ser Pro Ala Leu 30 35 40 c-(. gtg gtg acc. aa sgg gae aac gee ace tte acc tge age tto tce 19: Le Val Va' Thr Glu Gly Asp Asp Ala Tnr Phe Tpr Cys Se Phe Ser 45 50 55 aac acá trg ^ age ttc g-g cta aac tgg tac cge ¿tg age cee age 243 Asr Thr Ser Glu Ser Pne VaJ Leu Asr: Trp Tyr Arg Met Ser Fre> Ser €0 65 1 aac cag aeg gae aag ctg gcc gcc .<. ere eaa gac cgc age cae 291 As Gln Tr.r Asp Lys Le: Ala Ala P .e Prc Glu Asp Ar? Ser Glr. Prc 75 8C 85 ?gc cag c e tgc cgc ttc cgt gtc aea caá etg ecc aac ggg cgt gac 339 Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Tr.i Gln Leu Prc Asn Gly Aro Ase 90 95 10C ' 1C: t c cae atg age glg gtc agg gco cgg cgc aat gac age ggc ac. tac 3 Pne H.s Kct Ser Val V l Arg Ala A*g Arg As- Asp Ser Gly Thr Tyr -'-0 U5 120 cte tgt 939 gee ate tcc ctg gee ec- aag ctC aaa cag age 435 Leu Cys Gly A . I léSer Leo Ala Fro Lys r Gl He Lys Gl u Ser 125 130 135 ctg cgg gca g3g ele agg g-g aea g? aga agg gca Cs 6 gtg cee aza Leu Arg A « G" •- L -: Arg Val Trr Gl. Arg A: g Ai a GL Val Prc Tr.r T,C 145 15C gcc cae cce age eco tea cec agg tea gee gge cag ttc ca acc etc 531 Ala His Pío Se: Prc. Ser Pro Are Ser Ala C-.y Glr. ?hc Glr. Thr Leu 355 160 165 g-g g*-*- gg*- gtc gt gge ggc ctg ctg gge age ctg ?^g ctg cta gte 579 Val Val Gly Val Val 5'y GJy Leu le. Gly Se: Leu Val Leu Leu VaJ 170 175 13C 165 tgg gtc ctg guc gl e ate tgc tcc cgg C? 3*c cga « acá ata gga 627 p Val Leu Ala Vul l i e Cys Ser ? Ala Á'a Arg GJy Thr He Gj'y 19C 195 2CC ÍÁÁ?djÍ^*?? M?^...*,Mí^? a^i^»?¡i?..^ -.. .* -j- .......->.-. a- . „„J^^^^A ?-£*ML . -.-^aü^?^A^?áikA g-> agg c " a o o gg._ ea ece c j ?- g-j : ga: cc-c te-, ge. q' e«. I -: A a Ai v: Are T: • G.\ G n Fro L-" . : >« Gl„ A ;p. Prc Se: Al . Fio ' S"*- ' 1') 2.5 gtg tte tt 9" gc.e t . gg gag ctg gat ttc Cag '. g- eja g. a I.J 72 J Val Pne Sf r V l A<=: - i r Gly Gl. I •- u Asp Pr Glr. 1 rp Arg Gj 2/0 aec eeg 9p9 ecc C1 *e gt ce 1» ;t e ecl g g ce. g a. ; = .-! ta' 77 j r. i Pi o Cítr'.0 -'- Val Fro Cy--. 'al Fi Glu Glr. ?t,¡' Gl Ty: 235 240 245 acc att ate ce age gga ¿ q gge ae: ec tec c . • er- c e aqe 81? Tr.r He Val r.'.e ? • t Se: GJy M-t Gly Thr Ser Sc-r rr - 1 ? Ar 3 250 255 260 . :> ggc tCc. gct ga: 3Í-- eet egg ó 5'- eag cea ctg « = 21 y Ser Ala A^p Gly Pro Arg F^J Ald Prc Leu 2/C 2c. gga CdC tgc L l e.-e Ct' * ;e =a .C'- o; ctt ggcc-. gtgttet. -=g G-y His Cys Sc r Trp P o Leu 2r5 <210> 12 <211> 288 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 K t GJr. I r ?: c ó.i. V> F:. T:? P:c Val Val Tr- Alá Vi Lej GJ-. 5 0 1 Leu Gly Tip Ai g Pre. G y Tr. Pl -• Lt _ Asp Ser Pr: Asp Arg ?r._ T: ¿ 2. 3 Asn Prc Prc Tr.r F .-- Ser Pr: Ala Ice le. Vai tal Tr.: Gp 1-iy Asp '- 40 4 - Asr. Ala T-.i Phe T .- r Cys Ser Pne Ser Asn T .r Ser Glu Sei Phe Val 50 5: e: e. Ase T.-r Ty: --g "et Ser Pro Ser Asr. Glr. T r As; Lys Leu AJa 65 70 75 90 Ala Pr.e Pro Gi... Asp Aro Ser Glr. Pro Gly Gir. Asp Cys Arg P.-.e Arg DC ar, (-c Val Tr.i Glr. :.ev Prc Asr. GJy Arg Asp Phe .Hrs Mct Sei Val Val Arg íes p: *^»^^^,^ -.-^-^-¿^-4-*.. ,->«.a&t...i.

Ala Arg Arg A- Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys GJ y Al a He Ser Leu i : o 12- 125 Ala Pro Lys ? a GJn Ilf Lys G_ .. Ser Leu A-g AJ Gl. Leu Arg VaJ 130 135 140 lnr Glu Arg A: ; ?la Glu Val ?? . T.\: Ala His Pro Ser Pro Ser Pro 145 15C 155 16C Arg Ser Ala G"\ GV. Phe Gln Tr.: LPÜ Val Va" Gly Val VaJ G y Gl y 165 170 175 Leu Leu Gly Ser Je.. Val Leu Le. Val Trp Val Leu Ala Val He Cys 161 185 190 Ser Arg Ala A.V Arq Gly Thr He Gly Ala Arg Arg Tni Gly Gln Pro 195 ' 20. 2C5 Leu Lys Glu Asr Fro Ser Ala Va. Pro VaJ Phe Ser Val ?s Tyr Gly 210 ' 215 220 Gl? Leu Asp Fr,- Glr. Trp Arg Gl _ Lys Thr Fro Glu Prc Prc Val Pro 225 230 235 240 Cys Val Pro C-l. G-r T r Glu T r Ala Thr He Val Phe Pro Ser Gly 245 25C 255 Met Gly Thr Se- Se: Prc Ala Arg Arg GJy Se: Ala Asp Gly Pro Arg 2C" 265 2 Q Ser AJa Glr. PJ : Le. Aro Pro Gl Aso Gly Hl? Cys Ser Trp Pro Let 275 26 235 <210> 13 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 13 gccgaagtca tctggacaag 20 <210> 14 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 14 .^éí^^^ ^ ^i k^s?i tctcagtgtg ctggtcacat 20 <210> 15 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 15 caccaccacc aattccaaga 20 <210> 16 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 16 acgtgaccaa ggaagtgaaa gaa 23 <210> 17 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 17 tgccagctct tcaacagaaa cat 23 <210> 18 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 18 tggcaacgct gtcctgtggt cae 23 <210> 19 <211> 19 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 19 gggccgcaca agttttgat 19 <210> 20 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 20 gcccttgtcc ttgatctgaa ga 22 <210> 21 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 21 cggacagttg gaccctgaga cttcaca 27 <210> 22 <211> 3593 <212> ADN <213> Mus ßusculus <220> <221> CDS <222> (17) .. (889 ) <400> 22 agatag*"tcc c?aa.ic atg agg ata ttt gct ggc att. ata ttt acá gcc -gc 52 Met ~i He The Ala Glv l o He Fhe ?"~r Ala Cys 1 5 10 tgt cae ttg cta cgg g;g ttt act ate acg gct cea aa? gac ttg tac 100 Cys His leu Leu Arg Ala Phe 'hr He Thr Ala Pro Lys -sp Leu ?yr 15 20 25 gtg gtg gag tat ggc age aac gtc acg atg gag tgc aga ttc ect gta 14* Val Val Glu Tyr Gly Ser Asr. Val VT Met Glu Cys Arg Fhe Pro Va, 30 35 40 gaa cgg gag ctg gac etg ctt j g tta gtg gtg c tgg gaa aag gaa 196 Glu Arg GH Leu ?sp "ej L« . Ala Leu Val Val Tyr Tcp T u Lys Glu 45 ' 51 55 6C gat gag caá gtg <itt cag ttt gtg gca gga gag gag gae ett aag ect 244 Asp Glu Gln Val "le ln Fpe "a. Ala Gly Glu Gl s Asp leu Lys ?t 65 ?C ^5 cag cae age aac ttc agg ggg aga gcc teg ctg cea aag gac eag 292 Gln His Ser ?sn Fne •i g Giy ^r r* Al a Ser leu :ro Lys .-sp Gl-i Le - 30 85 00 ttg aag gga ^a gct gec -tt cag ate acá gac gtc aag etg cag gac 340 Lej Lys Gly Asr. Ala A-a Leu Glr. He Thi Asp Val Lys ' e s -lr. Aso 95 100 * 105 cea gge gtt rae tgc gc ita tc age tac ggt ggt geg rae tac aag 383 .Va Gly V-ii -"yr C/s ^ s He He Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys 110 115 120 cja ate acg ctg a gtc . t ;c- cea tac cgc aaa ate 3ac :ag ega 4 ;6 Arg lie Tr.r feu Lys Vñi Asn Ala Pro Tyr Arg Lys He Asn Gln Arg 125 13C 135 140 a-" tcc acó sat cea gc; <?e tet gag eat gaa cta a-a tgt ;ag gee 484 "-» Ser Val Asp Pro .a Thr Ser GH His Glu Leu He Cys C-.n. A. a 145 150 -=5 gag ggt tat cea gao get cag gta ate tgg aea aac ag- gao cae á 5 i¿ Gi s Gly Tyr Fro GJ j Ala Glu Val He Trp Tnr Asn Se; A^c Kas Gl- 160 165 " 17C ecc gtg agt ggg aag aga agt gtc acc act tcc cgg acá gag ggg atg 580 Prc Val Ser Gly Lys A g Ser Val Thr Thr Ser Arg Cnr Glu Gly Ket 175 18" 161 ctt ctc aal gtg aee age agt ctc agg gtc aac gcc aea geg aat ga* 6?e Le- Leu Asr¡ Val "l.-.r Ser Ser Le, Ar.g Val Asr. Ala Tr.- Ala As-i Asp 190 195 200 i»* alitt. JJü u -"*-*** <••-- - gtt ttc tac tet -jc ttt tgg aga ten cag cea ggg =ac cae acá 6 ' C Val Phe Tyr Cys 1 : x Pr.e Trp Arg Ser Glr, Pro Gly Gl: A n Kis Thr 205 210 215 220 gcg gag ctg a' ate cea gaa ctg ect gca acá cst cet zca cag aac 724 Ala Giu Leu ! He Fro Glu Leu Pro Ala Thr H: s Pro Prc Gl n Asi. 225 230 235 agg act ce- tgg gtg ctt ctg g d tec ate ctg ttg ttc :*c att gta 772 Arg "lhí H s ""-p Va' Leu Leu Gly Ser He Leu Leu Fhe Le- Ilr Val 24' 245 250 gtg tcc acg g_e ctc ctc ttc ttg aga aaa caá gtc aga atg cta gat 20 Val Ser 1 >- Val Leu Leu Phe Lej Arg Lys Gln VaJ Arg Mct Leu Asp 255 260 265 gtg gag aaa t'j. gee gtt gaa gat acc age tea aaa a e cga aat gat 868 VaJ GJ Lys Cy* Gly Val Glu Asp Thr Ser Ser Lys Asr. Arg As:, Asp 270 275 260 acá C á tte cej gcg aeg taa gcagtgttga aeectctgat cgtegattgg 919 Thr GJ . Pre C-.u Glu Thr 285 29C cagcttgtge te.g.g-eeg aaagggcccd tgggac tga gtecaaagae tcaogatgga 979 aectgaggc:. gá (-;aeg aaagtgttgg gagaggagee tggaae=ccg gacotttttt 1039 ceaggoaga: ae-<g aagttgcccs tcagtcgtct tgggaaatgg att?agggtt 1099 eet g JL ttc-g ca; gp-.e- ttgcaeagtg ac^tUtcct ctg -caet. cegggatgag 1159 agatggcgte atg-g-g'tg aagaataagt geettet^tt tattttg=gt ctgtgtgttc 1219 tcaetttggy cr.-j'u, tta tgactggtga attctgaega cteaagatgt 1279 agteaecaa? r ji.tg L gettagea e etccgtaact ac ct-?:= ; gcagggaaca 1339 cagaggtcac ctgcttcglt tgaeaggct^ ttgctgtctg =ctcaaat=c tctttatttt 1399 tcagtcctca agg-f-ttec atagcagttg ttctgtatca geettat=gg tgtcagatat 1459 agcactcaac ai - t atete attacaatag caaccctcat caccatag-^ aea etaace 3519 tetgttalee •->-=-- -cata gccaggaagc t agcgaet agtcacttge ccacagagta 1579 teagetetca gatUetgtt etteagecae tgtcetttcc ggatagaa-t tgtcgttaag 1639 aaattaattt aaaaa tgal tattgagtag ca'-tgtatat caatcaca?.e atgccttgtg 1699 caet tgetg geete-gage ataaagatgt aegccggagt aecggtcgga catgtttatg 1759 tgtgttaaat a fagagaa atgt catta acnaggagcr tgcatttt^g agacactgga 1819 agtaactec agttcattgt etageattae atttacetca tttgctate: ctgccataca 1879 U liA^á.*^^'1 ' ¿&A???. • -•-. A¿&lAj,lii? *B;-&¡^* *.'-*- ...... XI.-. t - ct cca' uaag tgt gttctttta ttttttaaat 39 gtctettg catgaat cttgttgaat a 11 gdcatctga gee--tagcte agttggtaaa acectttcct 9 9 gtttctattt a a a * g -J t a cac agt gtg aaac : eugag tettatceet aga^cccaca taaaaaacag ttgegtatgt 2 5 t tgtgr-atgc ttt t ^t c~-c agcactaggq ag edgagge aggcagatcc tg<=gctctca 2119 ttgaccácor agccl dgcct acatggttag ctecaggect acaggagctg gcagagcdg 2179 aaaaocgat g cct g-icaca cacaeacaea caeaeacaca cacaeac ea cacacacace 2239 atgtactcat aegt gcaccctcct ae eatgcae acacatacaa ttcaaacaca 2299 aatcaaoagg g a tgt c c agaatggtec cccagacaad gaag agaaa aacaccaaoc 2359 cagctc tat 1. cee i acec atcctctcta ctccttccta gaagcaacta ctattgtttt 2419 t gta ataaa t i recaac gacagttaat atgtagaata tataMaaa? tgtctgtcaa ^9 tatcitat tat e ettt ct ctttcttcet ttctttcttt ctttctttct ttctttcttt 2539 ctttetttct UcUlc Lt cttccttcct tcettccttc cttccttcct tccttccttt 2599 ctt et tct ttr ' tt tt ctgtctatct gtcect aet ggttgctcae tatgcatttt 2659 et t g-tct t cg c ¡.ittt atútaateta tggatattta tgctccttce agaatgge.te 2^1 taaagclctt tgi L 1 t acg ttttctcec- cateetteta ggcatctctc acactgtct 27 T ggccagacdC eal » '-i gct geetcaatet gtagacaeca tttdta-iace acgtdctcae 2339 cgagi. ttgta tt- q. etgt tctgtgtctg attaaaggga gaccatgagt ecccaggg* a 2399 Cd.~tgagtta c*. c a are aagggggagc cttgtttgtg tctc^atggc agaageaggc 2959 ct gagccat i ,j' t tet tccttcoett etetcaaaea caga:g^ete aettgctcat 3019 t caggttet ce*.11 gygaa tgtcageatt getecttgac t etggctge cc gaagga 3079 geecat tage tct t gtgog cccttgaeag ctactgectc teettaeca: aggggcctct 3139 aagat aetgt taect?gagg tcttgaggat ctgtgttetc tggggggagg aaa gaggag 3199 gdáCCCagaa ct te cá gttttccttg ttctgtcaca tgteaagact gaaggaavag 3259 getgggctac gtag gagat cctgtcteaa aggaaagaeg agcatagceg aacccecggt 33 ggaacccect et gt tf ctg ttcacacaag cttattgatg agtctcatgt taatgtcttg 337 tttg al aa gtttat.-jaaa atatcgggtt gggcaaeaca ttctatttat tcatt tatt 3439 tgaaatctta at g" cntcLc atggtgttgg attggtgegg caetttatte ttttgtgttg 3499 tgtataacea taadt t . tat tttgcatcag attgtc atg tattgeatta atttaataaa 3559 tatttttatt ta aa aaa aaaaaaaaaa aaaa 3593 <210> 23 <211> 290 <212> PRT <213> Mus usculus <400> 23 Met Arg lie Pr.c Al« Gly He lie Pr.c Tnr Ala Cys Cys His Leu Le 1 5 10 15 Arg Ala Phe Thi He Thr Ala Pro lys Asp Leu "lyr Val Val Glu Tyr 20 25 30 GJy Ser Asr. Val Th- Met Glu Cys Are Phe Pro Val Glu Arg Glu Leu 35 40 45 Asp -eu JCJ Al L Val Val ?y? Trc Glu lys Glu As u Gln Val 55 60 He Gln Pho Val ?l GJy Glu Glu Ase Leu Lys Pr.-. Glr, H.s Ser As-, 65 70 ' 75 60 Phe Arg G?y A^y A. a Ser Leu Pro lys Asp Crn Le- Leu l s Gly Asr. ßl 90 95 Al Ala Le; G?- Asr Val Lys Leu Glr Asp A a Gly Val lyi 101' JC5 113 Cys Cys IJe JJe Ser lyr Gly Gly h- - Asp Tyr Lys Arg He Tnr Le- 115 120 Lys Val Asr. ?'a P lyr Arg Lys J Ir Asr. Gin Arg He Ser Val Asr 13C 135 14C Pro Ala Trr Se-r Glu His GH' Leu He Cys G.n Ala Glu GJy Tyr Pro 145 150 155 160 Glu Ala GJu Va 1 e Trp Thr As:. Ser Ase hxs Gl Prc '.al Ser Gly If"- 170 175 lys Arg Sei As-. Val Thi Ser Ser Lee Are Va1 Asn Ala Thi A. a As.-, Asp Val Phe Tyr Cys 195 200 205 Tr.r Phe Trp Arg Ser Glr. Pro Gly Glr Asr. Kis Thr Ala Glu Leu He 210 215 22C He Pro Giu LGJ P o Ala Thr H;s Prc Pro Gln Asn Are Trr rLs Trp 225 230 235 240 ÍltríÍA*<Í*¿ * s-fei&fc j. raa-aa_a-.J**«*fc -•í.i^.-^.^*?^*! t *ja?--**?-l£l?*tilí&*£ Val Leu ^U U>. J Ser He Lej Leu Phe _e- HP Va, V¡ Ser Th: 245 250 25: Leu Leu Phe H J Arg Lys Glr. Val Arg Met Le Asp Val Glu y« Cy£ 2 0 265 270 Gly Val G.? Asp hr Ser Ser I.ys Asn Are Asr. Asp Thj GJ r Phe Gr? 275 ' 280 ' 261 Glu Thr 290 : ÍAÚ*?íá*.* S??-?* -S^¿=:í.-.,* . ,.^- ^. . ^,-.^?.:¿ „:......... ¿:>-.i_.J-._^. Hi?aJA

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para modular una respuesta inmunológica, que comprende la puesta en contacto de una célula q e expresa B7-4 o una célula inmunológica que expresa PD-l con un agente que modula la interacción de B7-4 con PD- 1 para modular de esta forma la respuesta inmunológica. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la respuesta inmunológica es regulada de manera descendente . 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la señalización a través de PD-l es estimulada empleando un agente seleccionado dentro del grupo que consiste de: un anticuerpo activador que reconoce PD-l, una forma de B7-4 que se une ccn un receptor inhibidor, y una pequeña molécula que se une con PD-l. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la célula inmunológica se selecciona dentro del grupo que consiste de: una célula T, una célula B, y una célula mieloide. 5. El método de conformidad con la reivindicación 2, en donde se induce anergia en la célula inmunológica. 6. El método de conformidad con la reivindicación 2, que comprende además la puesta en contacto de la célula inmunológica con un agente adicional que regula de manera descendente una respuesta inmunológica. .,?rt¡-BÉ? ^ ^ MMítJí? ,_¿jtu_?.A&Éí--t-»t.fc a .- i?S-fc.fct-gA.__>a*-- «a-*»».*.m¿¿, El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la respuesta inmunológica es regulada de manera ascendente . El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la señalización a través de PD-l es inhibida empleando un agente seleccionado dentro del grupo que consiste de: un anticuerpo de bloqueo que reconoce PD-1, una forma no activadora de B7-4, un anticuerpo que reconoce B7-4, y una forma soluble de PD-l. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el paso de poner en contacto ocurre in vivo . El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el paso de poner en contacto ocurre in vi tro. Un método para modular la interacción de B7-4 con un receptor inhibidor en una célula inmunológica, que comprende la puesta en contacto de una célula de presentación de antigeno que expresa B7-4 con un agente seleccionado dentro del grupo que consiste de: una forma de B7-4, una forma de PD-l, o bien un agente que modula la interacción de B7-4 y PD-l de tal manera que se module la interacción de B7-4 con un receptor inhibidor en una célula inmunológica. El método de conformidad con la reivindicación 11, que comprende además la puesta en contacto de la célula inmunológica o de la célula de presentación de antigeno con un agente adicional que modula una respuesta inmunológica. 13. El método de conformidad con la reivindicación 11, en donde el paso de poner en contacto se efectúa in vi tro. 14. El método de conformidad con la reivindicación 11, en donde el paso de poner en contacto se efectúa in vi vo . 15. El método de conformidad con la reivindicación 11, en donde la célula inmunológica es seleccionada dentro del grupo que consiste de: una célula T, una célula B, y una célula mieloide. 16. Una vacuna que comprende un antigeno y un agente que inhibe la interacción de B7-4 y PD-l. 17. Una composición que comprende un ar.tigeno y un agente que promueve la interacción de B7-4 y PD-l. 18. Un método para tratar un sujeto que tiene una condición que puede beneficiarse de la regulación ascendente de una respuesta inmunológica, ?ue comprende la administración al sujeto de un agente que inhibe la interacción de PD-l y B7-4 de tal manera que se trata una condición que puede beneficiarse de la regulación ascendente de una respuesta inmunológica. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, en donde dicho agente comprende una forma soluble de PD-l o B7-4. 20. El método de conformidad con la reivindicación 18, que comprende además la administración de un segundo agente que regula de manera ascendente una respuesta inmunológica en el sujeto. 21. El método de conformidad con la reivindicación 18, en donde la condición es seleccionada dentro del grupo que consiste de: un tumor, una enfermedad neurológica o una enfermedad inmunosupresora. 22. Un método para tratar un sujeto que tiene una condición que puede beneficiarse de una regulación descendente de una respuesta inmunológica, que comprende la administración al sujeto de un agente que estimula una señalización mediada por B7-4 a través de PD-l en una célula inmunológica del sujeto de tal manera que se trata una condición que puede beneficiarse de la regulación descendente de una respuesta inmunológica. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, en donde dicho agente se selecciona dentro del grupo que consiste de: un anticuerpo biespecifico, y B7-4 soluble. 24. El método de conformidad con la reivindicación 22, que comprende además la administración de un segundo agente que regula de manera descendente una respuesta inmunológica en el sujeto. 25. El método de conformidad con la reivindicación 22, en donde la condición se selecciona dentro del grupo que consiste de: un transplante, una alergia, y un trastorno autoinmunológico. 26. Un ensayo basado en célula para tamizar compuestos que modulan la actividad de B7-4 o PD-l, que comprende poner en contacto una célula que expresa una molécula blanco de B7-4 o una molécula blanco de PD-l con un compuesto de prueba y determinar la capacidad del compuesto de prueba para modular la actividad de la molécula blanco de B7-4 o PD-l. 27. Un ensayo sin células para tamizar compuestos que modulan la unión de B7-4 o PD-l sobre una molécula blanco, que comprende poner en contacto de una proteina de B7-4 o PD-l o una porción biológicamente activa de la misma con un compuesto de prueba y determinar la capacidad del compuesto de prueba para unirse con la proteina de B7-4 o PD-l o una porción biológicamente activa de la misma.